MX2010012592A

MX2010012592A - Vectores para la administracion de proteinas sensibles a la luz y metodos de uso de las mismas.

Info

Publication number: MX2010012592A
Application number: MX2010012592A
Authority: MX
Inventors: Alan Horsager; William Hauswirth; Jianwen Liu
Original assignee: Eos Neuroscience Inc
Priority date: 2008-05-20
Filing date: 2009-05-20
Publication date: 2011-05-05
Also published as: GB201021748D0; ES2538468T3; US20120093772A1; AU2016200923A1; HK1213940A1; GB2472964B; EP2315833B1; WO2010011404A2; US20160361439A1; GB2472964A; US20150225741A1; CN102159713A; AU2009274482A1; WO2010011404A3; CA2762118A1; EP2910637A1; US10426844B2; EP2315833A2; EP2315833A4; EP2315833B8

Abstract

Se proveen en la presente métodos y composiciones para el tratamiento genético y no específico etiología y específico de circuito de enfermedades, utilizando vectores para la administración de proteínas sensibles a la luz a células y tejidos enfermos y normales de interés.

Description

VECTORES PARA LA ADMINISTRACION DE PROTEINAS SENSIBLES A LA LUZ Y METODOS DE USO DE LAS MISMAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una terapia de administración genética para tratar una enfermedad o alteración independientemente del tratamiento de una mutación subyacente podría tener valor potencial. Métodos capaces de controlar, regular y/o impulsar circuitos neurales específicos para moderar respuestas neurales naturales y percepción de alta resolución y control podrían también ser de valor terapéutico potencial enorme. Las neuronas son un ejemplo de un tipo de célula que usa las corrientes eléctricas creadas por despolarización para generar señales de comunicación (por ejemplo, impulsos 'de nervio). Otras células excitables eléctricamente incluyen células de músculo esqueletal, de músculo cardiaco y células endocrinas. Las neuronas utilizan la despolarización rápida para transmitir señales en todo el cuerpo y para varios propósitos, tales como control motriz (por ejemplo, contracciones musculares), respuestas sensoriales (por ejemplo, toque, audición y otro sentidos) y funciones de cálculo (por ejemplo, funciones del cerebro) . Al facilitar o inhibir el flujo de iones positivos o negativos a través de las membranas celulares, la célula puede ser brevemente despolarizada, despolarizada y mantenida en aquel estado o hiperpolarizada . Así, el control de la despolarización de las células puede ser benéfico para un número de propósitos diferentes, en los que se incluyen control visual, muscular y sensorial. Los canales de proteínas sensibles a la luz, bombas y receptores pueden permitir el control óptico de precisión de milisegundos de células. Aunque las proteínas sensibles a la luz en combinación con luz pueden ser usadas para controlar el flujo de iones a través de las membranas celulares, el apuntamiento y administración todavía sigue a ser tratado para enfermedades, alteraciones y circuitos específicos .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención provee un ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína sensible a la luz enlazada operativamente a una secuencia reguladora del receptor 6 de glutamato metabotrópico (mGluR6) o fragmento del mismo. En una modalidad, la proteína sensible a la luz puede ser seleccionada del grupo que consiste de ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos. En otra modalidad, la proteína sensible a la luz es ChR2 o una proteína sensible a la luz que es por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% idéntica a o ChR2. En otra modalidad el fragmento de secuencia regulatoria de mGluR6 comprende menos de aproximadamente 1000, menos de aproximadamente 750, menos de aproximadamente 500, menos de aproximadamente 250 o menos de aproximadamente 100 pares de bases. En una modalidad relacionada la secuencia regulatoria de mGluR6 o fragmento del mismo es un promotor o mej orador de mGluR6. En una modalidad relacionada especifica, el ácido nucleico comprende además una proteina fluorescente verde. En otra modalidad el ácido nucleico es encapsidado dentro de un virus adeno-asociado recombinante (AAV) . En ciertas modalidades, el AAV recombinante es un híbrido combinatorial de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más serotipos o mutantes del mismo. En ciertas modalidades, el virus adeno-asociado recombinante es de un serotipo seleccionado del grupo que consiste de AAVl, AAV2 , AAV3, AAV4 , AAV5, AAV6, AAV7 , AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, e híbridos de los mismos. En una modalidad relacionada, el ácido nucleico es encapsidado dentro de un virus recombinante seleccionado del grupo que consiste de virus adeno-asociado recombinante (AAV) , retrovirus recombinante, lentivirus recombinante y. poxvirus recombinante.

En otro aspecto, la invención provee un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína sensible a la luz, el ácido nucleico enlazado operativamente a una secuencia reguladora del receptor 6 de glutamato metabotrópico (mGluR6) o fragmento del mismo. En una modalidad, la proteína sensible a la luz es seleccionada del grupo que consiste de ChRl, ChR2, VChRl, ChR2, C128A, ChR2, C128S, ChR2, C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChlEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos. En una modalidad relacionada, la proteina sensible a la luz es ChR2 o una proteina sensible a la luz que es por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% idéntico a ChR2. En otra modalidad, el fragmento de secuencia regulatoria de mGluR6 es menos de aproximadamente 1000, menos de aproximadamente 750, menos de aproximadamente 500, menos de aproximadamente 250 o menos de aproximadamente 100 pares de bases. En una modalidad relacionada, el fragmento de secuencia regulatoria de mGluR6 es representado por la secuencia de la Figura 6. En otra modalidad, el vector comprende un virus adeno-asociado recombinante (AAV) . En una modalidad relacionada, el vector comprende un virus recombinante seleccionado del grupo que consiste de virus adeno-asociado recombinante (AAV) , retrovirus recombinante, lentivirus recombinante y poxvirus recombinante. En una modalidad especifica, el AAV es de un serotipo seleccionado del grupo que consiste de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4 , AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, e híbridos de los mismos. En otras modalidades específicas, el AAV recombinante es de un híbrido combinatorial de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más serotipos o mutantes de los mismos. En una modalidad relacionada, el AAV comprende proteina de cápsido mutada. En una modalidad especifica, la proteina de cápsido comprende un residuo de tirosina mutado. El residuo de tirosina mutado puede ser seleccionado del grupo que consiste de Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F y Y720F. En una modalidad especifica, la proteina de cápsido mutada comprende un residuo de tirosina mutado a una fenilalanina .

En otro aspecto, la presente invención provee un método de tratamiento de un sujeto que sufre de una enfermedad o alteración del ojo que comprende introducir a un. ojo afectado un virus adeno-asociado recombinante (AAV) que comprende una proteina sensible a la luz enlazada operativamente a una secuencia regulatoria de receptor 6 de glutamato metabotrópico (mGluR6) o fragmento del mismo. En una modalidad, la enfermedad o alteración del ojo es provocada or degeneración celular del fotoreceptor . En otra modalidad, .la proteina sensible a la luz es seleccionada del grupo que consiste de ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos. En una modalidad relacionada, la proteina sensible a la luz es ChR2 o una proteina sensible a la luz que es por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% idéntica a ChR2. En otra modalidad, el fragmento de promotor de mGluR6 es menor de aproximadamente 1000, menor de aproximadamente 750, menor de aproximadamente 500, menor de aproximadamente 250 o menor de aproximadamente 100 pares de bases. En una modalidad relacionada, el fragmento del promotor de mGluR6 es representado por la secuencia de la Figura 6. En otra modalidad, el AAV es de un serotipo seleccionado del grupo que consiste de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4 , AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 , AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, e híbridos de los mismos. En otras modalidades, el AAV recombinante es de un híbrido combinatorial de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más serotipos o mutantes de los mismos. En una modalidad relacionada, el AAV comprende una proteína de cápsido mutada. ,En otra modalidad relacionada, la proteína de cápsido comprende un residuo de tirosina mutado. En una modalidad específica, el residuo de tirosina mutado es seleccionado del grupo que consiste de Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F y Y720F. En una modalidad relacionada, la proteína de cápsido mutada comprende un residuo de tirosina mutado a una fenilalanina . En otra modalidad, el AAV es introducido utilizando inyección intravítrea, inyección subretinal y/o pelado de ILM. En una modalidad específica, el AAV es introducido a una célula bipolar retinal (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) . En otra modalidad, el método comprende además usar un dispositivo generador de luz externo al ojo.

En otro aspecto, la presente invención provee un método para expresar un ácido nucleico exógeno en una célula bipolar retinal (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) que comprende introducir a una retina un vector que comprende el ácido nucleico exógeno enlazado operativamente a una secuencia regulatoria específica de célula bipolar retinal (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) , en donde el método da como resultado por lo menos aproximadamente una eficiencia de transducción de 25%-30%. En otra modalidad, tal método da como resultado en por lo menos aproximadamente una eficiencia de transducción del 10%. En una modalidad, el método da como resultado en por lo menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de eficiencia de transducción. En una modalidad relacionada, la eficiencia de transducción es medida al cuantificar el número total de células bipolares retínales (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) infectadas. En otra modalidad, el ácido nucleico exógeno comprende una proteína sensible a la luz. En una modalidad relacionada, la proteína sensible a la luz es seleccionada del grupo que consiste de ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras ' de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos. En una modalidad especifica, la proteina sensible a la luz es ChR2 o una proteina sensible a la luz que es por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% idéntica a ChR2. En otra modalidad, la secuencia reguladora comprende una secuencia regulatoria del receptor 6 de glutamato metabotrópico (mGluR6) o un fragmento del mismo. En una modalidad relacionada, el fragmento de secuencia regulatoria de mGluR6 es menor de aproximadamente 1000, menor de aproximadamente 750, menor de aproximadamente 500, menor de aproximadamente 250 o menor de aproximadamente 100 pares de bases. En una modalidad especifica, el fragmento de secuencia regulatoria de mGluR6 es representado por la secuencia de la Figura 6. En otra modalidad, el ácido nucleico exógeno es introducido utilizando un vector viral adeno-asociado recombinante (AAV) . En una modalidad relacionada, el AAV comprende una proteina de cápsido mutada. En una modalidad especifica, la proteina de cápsido comprende un residuo de tirosina mutado. En una modalidad relacionada, el residuo de tirosina mutado es seleccionado del grupo que consiste de Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F y Y720F. En otra modalidad, la proteina de cápsido mutada comprende un residuo de tirosina mutado a una fenilalanina . En otra modalidad, el ácido nucleico exógeno es introducido utilizando inyección intravitrea, inyección subretinal, y/o pelado de ILM. En otra modalidad, el AAV es de un serotipo seleccionado del grupo que consiste de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4 , AAV5, AAV6, AAV7 , AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, e híbridos de los mismos. En todavía otras modalidades, el AAV recombinante es de un híbrido combinatorial de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más serotipos o mutantes de los mismos.

En todavía otro aspecto, la presente invención provee un método para introducir un ácido nucleico exógeno al núcleo de una célula retinal que comprende introducir un vector que comprende un ácido nucleico exógeno enlazado operativamente a una secuencia reguladora célula retinal-específica a una célula retinal, en donde el vector está diseñado específicamente para evitar la liberación de proteína moderada por ubiquitina. En una modalidad, la degradación es moderada por proteasoma. En otra modalidad, el ácido nucleico exógeno comprende una proteína sensible a la luz. En una modalidad relacionada la proteína sensible a la luz es seleccionada del grupo que consiste de ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos. En otra modalidad relacionada, la proteína sensible a la luz es ChR2 o una proteína sensible a la luz que es por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% idéntica a ChR2. En otra modalidad, la célula retinal es una célula bipolar retinal (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) . En una modalidad relacionada, la secuencia reguladora comprende un promotor de receptor 6 de glutamato metabotrópico (promotor de mGluR6) o fragmento del mismo. En otra modalidad, el fragmento de mGluR6 es menos de 1000, 750, 500, 250 ó 100 pares de bases. En otra modalidad, el fragmento del promotor de mGluR6 es representado por la secuencia de la Figura 6. En otra modalidad, el vector es seleccionado del grupo que consiste de virus adeno-asociado recombinante (AAV) , retrovirus recombinante, lentivirus recombinante y poxvirus recombinante. En una modalidad relacionada, el vector es un vector viral adeno-asociado recombinante (AAV) . En otra modalidad, el AAV es de un serotipo seleccionado del grupo que consiste de AAV1, AAV2) AAV3, AAV4 , AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, e híbridos de los mismos. En otras modalidades, el AAV recombinante es de un híbrido combinatorial de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más serotipos o mutantes de los mismos. En otra modalidad, el AAV comprende una proteína de cápsido mutada. En otra modalidad, la proteína de cápsido comprende un residuo de tirosina mutado. En otra modalidad, el residuo de tirosina mutado es seleccionado del grupo que consiste de Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F y Y720F. En otra modalidad, la proteina de cápsido mutada comprende un residuo de tirosina mutado a una fenilalanina . En otra modalidad, el vector es introducido utilizando inyección intravitrea, inyección subretinal y/o pelado de ILM.

En otro aspecto, la presente invención provee un método de transducción de una célula bipolar retinal (por ejemplo, . células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) que comprende introducir a una retina un vector que comprende un ácido nucleico exógeno enlazado operativamente a una secuencia reguladora. En una modalidad, la secuencia reguladora es un promotor específico tipo sin célula. En otra modalidad, la secuencia reguladora es un promotor de polipéptido 0 de actividad activadora de proteína alfa de enlace de nucleótido de guanina (GNAOl) o una fusión mejorador prematuro inmediato de citomegalovirus (CMV) y la unión de promotor de ß-actina bovino más intronl-exonl (CBA, smCBA) . En otra modalidad, el ácido nucleico exógeno comprende una proteína sensible a la luz. En una modalidad relacionada, la proteína sensible a la luz es seleccionada del grupo que consiste de ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos. En otra modalidad relacionada, la proteína sensible a la luz es ChR2 o una proteína sensible a la luz que es por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% idéntica a ChR2. En otra modalidad, el vector es seleccionado del grupo que consiste de virus adeno-asociado recombinante (AAV) , retrovirus recombinante, lentivirus recombinante y poxvirus recombinante. En una modalidad relacionada, el vector es un vector viral adeno-asociado recombinante (AAV) . En otra modalidad, el AAV es de un serotipo seleccionado del grupo que consiste de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, e híbrido de los mismos. En ciertas modalidades, el AAV recombinante es de un híbrido combinatorial de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más serotipos o mutantes de los mismos. En una modalidad relacionada, el AAV comprende una proteína de cápsido mutada. En otra modalidad, la proteína de cápsido comprende un residuo de tirosina mutado. En otra modalidad, el residuo de tirosina mutado es seleccionado del grupo que consiste de Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F y Y720F. En otra modalidad, la proteína de cápsido mutada comprende un residuo de tirosina mutado a una fenilalanina . En otra modalidad, el vector es introducido utilizando inyección intravítrea, inyección subretinal y/o pelado de ILM.

INCORPORACIÓN POR REFERENCIA Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación son incorporadas en la presente por referencia a la misma extensión como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fuera indicada especifica e individualmente para ser incorporada por referencia .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Los nuevos elementos de la invención son resumidos con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Un mejor entendimiento de los elementos y ventajas de la presente invención será obtenido por referencia a la siguiente descripción detallada que resume modalidades ilustrativas, en las cuales se utilizan los principios de la invención, y las figuras adjuntas de las cuales: La Figura 1 ilustra la secuencia de ácido nucleico de ChRl.

La Figura 2 ilustra la secuencia de ácido nucleico de ChR2.

La Figura 3 ilustra la secuencia de ácido nucleico de NpHR.

La Figura 4 ilustra la secuencia de ácido nucleico de melanopsina .

La Figura 5 ilustra la secuencia de ácido nucleico de ChR2 que es codón-optimizado mamífero y que codifica un ChR2 fusionado con proteína fluorescente verde (GFP) .

La Figura 6 ilustra un fragmento de la secuencia de ácido nucleico reguladora de GRM6 (receptor 6 de glutamato metabotrópico) capaz de regular la expresión de manera específica de célula bipolar.

La Figura 7 ilustra una secuencia de ácido nucleico reguladora de smCBA.

La Figura 8 ilustra: neuronas que expresan ChR2 y disparo. (A) Neuronas que expresan ChR2 con estimulación de luz; (B) Neuronas que disparan en respuesta a trenes rápidos de impulsos de luz azul.

La Figura 9 ilustra: La administración de AAV a células bipolares retínales. La columna 1 muestra la expresión de GFP en células bipolares retínales después de una inyección subretinal con el vector de AAV7-CBA-GFP después de 8 semanas de edad. La columna 2 muestra un teñido de PKC (un anticuerpo que es específico a células bipolares) , la columna 3 muestra teñido de DAPI para núcleos de células y la columna 4 muestra imágenes fusionadas de expresión de GFP, teñido de PKCa y DAPI. La primera hilera es una amplificación 20X y la segunda hilera es una amplificación 40X.

La Figura 10 ilustra: Expresión de proteína fusionada ChR2-GFP en rdl, rho -/-, y rdl6 de células bipolares retínales. En cada imagen, el epitelio de pigmento retinal (RPE) , células bipolares o capa nuclear interna (INL) , capa plexiforme interna (IPL), y capa de célula de ganglio (GCL) son indicados. Las áreas blancas más brillantes muestran la expresión de GFP . Hay ringuletes de expresión en las células bipolares del INL (excepto para la inyección intravitrea de AAV5) . ' La Figura 11 ilustra: análisis de expresión de EGFP en secciones retínales congeladas mediante inmunohistoquímica a 1 mes enseguida de inyecciones subretinales con los vectores AAV imitantes de tirosina. Secciones ejemplares que ilustran el esparcimiento e intensidad de fluorescencia de EGFP en toda la retina después de la transducción con serotipo 2 Y444 (a) o serotipo 8 Y733 (b) . Las imágenes están orientadas con el vitreo hacia el fondo y la capa fotoreceptora hacia la parte superior. La fluorescencia de EGFP en fotoreceptores, RPE y células de ganglios de ojos de ratón inyectados subretinalmente con el serotipo 2 Y444 (c) fluorescencia de EGFP en fotoreceptores, RPE y células de Müller después de administración de serotipo 8 Y733; (d) Detección de proceso de células de Müller (rojo) mediante inmunoteñido con un anticuerpo de glutamina-sintetasa (GS); (e) Imagen fusionada que muestra la co-localización de fluorescencia de EGFP (verde) y teñido de GS (rojo) en secciones retínales de ojos tratados con serotipo 8 Y733; (f) Barra de calibración 100 µ? gcl, capa de célula de ganglio; ipl, capa flexiforme interna; inl, capa nuclear interna; onl, nuclear externo; os, segmento externo; rpe, epitelio de pigmento retinal.

La Figura 12 ilustra: Entrenamiento de ratones en una tarea de laberinto de agua. (A) un esquema del laberinto de agua usado para medir el Umbral escotópico (Hayes y Balkema, 1993) . (B) Tiempo que toma a cada grupo de ratones (retinal degenerado - tratado, retinal degenerado - sin tratado, y tipo silvestre) encontrar el objetivo (plataforma negra + arreglo de LED) como función de sesiones de entrenamiento. (C) Tiempo que toma a cada grupo de ratones (tratado rdl, tratado rdl6, tratado . rho -/-, sin tratar retinal degenerado, y tipo silvestre) encontrar el objetivo (plataforma negra + arreglo de LED) como función de diferentes intensidades de luz.

La Figura 13 ilustra: un dispositivo semejante a gafas con un elemento de generación/producción de luz asociado (sistema de arreglo de LED/láser) que puede disparar la expresión de proteínas sensibles a la luz.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Proteínas Sensibles a la Luz La presente invención provee ácidos nucleicos recombinantes que codifican proteínas sensibles a la luz, vectores virales y vectores no virales para la administración de ácidos nucleicos recombinantes que codifican proteínas sensibles a la luz, y métodos para la administración de proteínas sensibles a la luz.

Las proteínas sensibles a la luz son proteínas que pertenecen a la familia de opsina e incluyen rodopsinas de vertebrados (animales) e invertebrados. Las opsinas animales, rodopsinas, son receptores acoplados a proteína G (GPCR) con hélices de 7-transmembrana que pueden regular la actividad de canales de ion. Las rodopsinas de invertebrados usualmente no son GPCR, pero son sensibles a la luz o bombas de ion activadas por luz o canales de ion.

Una opsina de algas tal como rodopsina de canal (ChR2) de Chlamydomonas reinhardtii permite que potenciales de acción inducidos por luz azul sean disparados con precisión de milisegundos en células debido a la despolarización de flujo de cationes a través de un poro de luz recortada o compuerta de luz. Una opsina arqueal tal como halorodopsina Natzonomonas pharaonis permite el bombeo de cloruro activado por luz; la bomba puede ser hiperpolarizada e inhibida de potenciales de acción de disparo cuando es expuesta a luz amarilla. El uso de tales opsinas sensibles a la luz permite la regulación temporal y espacial de la actividad de disparo neuronal.

Como se hace referencia en la presente, una proteína "sensible a la luz" incluye canal rodopsinas (ChRl, ChR2), halorodopsinas (NpHR) , melanopsinas, opsinas pineales, bacteriorodopsina y variantes de los mismos. Una proteína sensible a la luz de esta invención se puede presentar de manera natural en células de plantas, animales, arqueobacteriana, algas o bacterianas, o pueden alternativamente ser creadas por medio de técnicas de laboratorio .

Las canalrodopsinas ChRl (número de acceso de GenBank AB058890/AF385748; Figura 1) y ChR2 (número de acceso de GenBank AB058891/AF461397 ; Figura 2) son dos rodopsinas del alga verde Chlamydomoñas reinhardtii (Nagel, 2002; Nagel, 2003) . Ambos son canales sensibles a la luz que, cuando son expresados y activados en tejido neural, permiten que una célula sea despolarizada cuando es estimulada con luz (Boyden, 2005) .

En algunas modalidades, canalrodopsinas híbridas o quiméricas pueden ser creadas y usadas al combinar diferentes porciones de las proteínas ChRl y ChR2.

En una modalidad, una canalrodopsina híbrida o quimérica puede ser creada y usada al reemplazar los segmentos N-terminal de ChR2 con las contrapartes homologas de ChRl (y viceversa) . En algunas modalidades, las canalrodopsinas híbridas dan como resultado un desplazamiento de sensibilidad a un espectro de longitud de onda diferente (por ejemplo, al espectro de longitud de onda rojo) con desensibilización despreciable y cinéticas de encendido y apagado disminuidas.

En otra modalidad, se puede crear y usar un híbrido/quimera de ChRl (aminoácidos 1-345) y ChR2 (aminoácidos 1-315) .

En todavía otra modalidad, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2 que retienen la porción N-terminal de ChRl y reemplazan la porción C-terminal con el segmento de ChR2 correspondiente pueden ser creados y utilizados. En modalidades específicas, híbridos/quimeras de ChRl y ChR2 pueden ser construidos y utilizados en los que se incluyen residuos mutantes alrededor de las cavidades de enlace retínales de las quimeras. En modalidades ejemplares, las siguientes quimeras pueden ser creadas y usadas: a. ChD: un híbrido/chimera de una porción N-terminal de ChRl y una porción C-terminal de ChR2, en donde el sitio de cruce está en un punto de homología en la héliceD de las dos canalrodopsinas , b. ChEF: un híbrido/chimera de una porción N-terminal de ChRl y una porción C-terminal de ChR2, en donde el sitio de cruce está en el bucle entre las hélices E y F de las dos canalrodopsinas, c. ChIEF: una variante de la quimera ChEF con isoleucina 170 mutada a valina, d. ChF: un híbrido/chimera de una porción N-terminal de ChRl y una porción C-terminal de ChR2, en donde el sitio de cruce está en el extremo de la hélice F de las dos canalrodopsinas .

En algunas modalidades, las quimeras retienen la desactivación reducida de ChRl en presencia de luz persistente, pero pueden permitir la permeación de iones de sodio y potasio además de protones. En otras modalidades, las quimeras pueden mejorar la cinética del canal al mejorar la velocidad de cierre del canal después de la estimulación.' En algunas modalidades otras variantes de ChRl y ChR2 pueden ser diseñadas. En modalidades especificas, una sola mutación o múltiples mutaciones puntuales a la proteína de ChR2 pueden dar como resultado en variantes de ChR2. En modalidades ejemplares, mutaciones en la ubicación C128 de ChR2 pueden dar como resultado propiedades de canal alteradas. En modalidades relacionadas, las mutaciones de ChR2 de C128A, C128S y C128T pueden dar como resultado mayores tiempos de apertura promedio globales (Berndt, 2009) . En otras modalidades relacionadas, las variantes de ChR2 pueden dar como resultado cinética alterada.

En otra modalidad, se puede usar un VChRl (número de acceso de GenBank EU622855).

En modalidades específicas, una versión codón-optimizada 'mamífera de ChR2 es utilizada (Figura 5) .

NpHR (Halorodopsina) (número de acceso GenBank EF474018; Figura 3) es del Natronomonas pharaonis arqueon haloalcalifílico. En ciertas modalidades, se pueden crear variantes de NpHR. En modalidades específicas, una sola mutación o múltiples mutaciones puntuales a la proteína de NpHR pueden dar como resultado variantes de NpHR. En modalidades específicas, se puede utilizar una versión codón-optimizada mamífera de NpHR.

En una modalidad, variantes de NpHR son utilizadas.

En una modalidad especifica, se utiliza eNpHR (NpHR mejorado) . Además de los aminoácidos FCYENEV al término C de NpHR junto con el péptido de señal' de la subunidad ß del receptor de acetilcolina nicotinico al término N de NpHR da como resultado la construcción de eNpHR.

La melanopsina (número de acceso GenBank 6693702; Figura 4) es un fotopigmento encontrado en células de ganglios fotosensibles especializadas de la retina que están involucrados en la regulación de ritmos circadianos, reflejo de luz pupilar y otras respuestas no visuales a la luz. En estructura, la melanopsina es una opsina, una variedad de proteina de retinilideno del receptor acoplado a proteina G.. la melanopsina se asemeja a opsinas de invertebrados en muchos aspectos, incluyendo su secuencia de aminoácidos y cascada de señalización corriente abajo. Como las opsionas de invertebrados, la melanopsina parece ser un fotopigmento biestable, con actividad de fotoisomerasa intrínseca. En ciertas modalidades, se pueden crear variantes de melanopsina. En modalidades específicas, una sola mutación o múltiples mutaciones puntuales a la proteína de melanopsina pueden dar como resultado variantes de melanopsina.

Las proteínas sensibles a la luz pueden también incluir proteínas que son por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95% o por lo menos aproximadamente 99% idénticos a las proteínas sensibles a la luz ChRl, ChR2, NpHR y melanopsina. Por ejemplo, la proteína de ChR2 puede incluir proteínas que son por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% idénticas a ChR2. Además, estas proteínas pueden incluir ChR2 que es fotosensible y puede ser activado por longitudes de onda específicas de luz de alta intensidad.

En algunas modalidades, las proteínas sensibles a la luz pueden modular la señalización dentro de circuitos neurales y controlar bidireccionalmente el comportamiento de conductancia iónica al nivel de una sola neurona. En algunas modalidades, la neurona es una neurona retinal, una célula bipolar retinal (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) , una célula de ganglio retinal, una célula fotoreceptora, o una célula amacrina retinal.

Vectores Virales Adeno-Asociados La presente invención provee vectores virales que comprenden ácidos nucleicos que codifican proteínas sensibles a la luz y métodos de uso, como se describe en la presente.

El virus adeno-asociado (AAV) es un virus pequeño (25 nm) , no envuelto que empaca un genoma de ADN de una sola hebra lineal de 4.7 Kb. El tamaño pequeño del genoma de AAV y preocupaciones acerca de efectos potenciales de Rep sobre la expresión de genes celulares condujo a la construcción de vectores de AAV que no codifican Rep y que carecen del IEE cis-activo, que es requerido para la integración específica del sitio frecuente. Los ITR son mantenidos debido a que son la señal de cis requeridas para el empaque. Así, los vectores AAV recombinantes actuales (rAAV) persisten principalmente como elementos extracromosomales .

Una variedad de vectores virales adeno-asociados recombinantes (rAAV) pueden ser usados para administrar genes de interés a una célula y efectuar la expresión de un gen de interés, por ejemplo, un gen que codifica una proteína sensible a la luz. Por ejemplo, rAAV puede ser usado para expresar proteínas sensibles a la luz, por ejemplo ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos o cualquier proteina sensible a la luz descrita en la presente, en una célula objetivo. En todos los tiempos en la presente, "trans-gen" es usado para referirse a un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés, en donde el polinucleótido es encapsidado en un vector viral (por ejemplo, rAAV) .

Los virus adeno-asociados son virus de ADN pequeños, de una sola hebra, que requieren virus auxiliar para facilitar la replicación eficiente. El genoma de 4.7 kb de AAV está caracterizado por dos repeticiones terminales invertidas (ITR) y dos cuadros de lectura abierta que codifican las proteínas Rep y Cap, respectivamente. El cuadro de lectura de Rep codifica cuatro proteínas de peso molecular 78 kD, 68 kD, 52 kD y 40 kD. Estas proteínas funcionan principalmente para regular la replicación de AAV y rescate e integración del AAV a los cromosomas de la célula huésped. El cuadro de lectura de Cap codifica tres proteínas estructurales de peso molecular 85 kD (VP 1), 72 kD (VP2) y 61 kD (VP3) (Berns, citado anteriormente) que forman el cápsidó de virion. Más del 80% de las proteínas totalés en el virión de AAV comprenden VP3.

El genoma de rAAV está en general comprendido de: (1) un ITR de virus adeno-asociados 5', (2) una secuencia de codificación (por ejemplo, transgen) para el producto genético deseado (por ejemplo, una proteína sensible a la luz) enlazado operativamente a una secuencia que regula su expresión .en una célula (por ejemplo, una secuencia de promotor tal como un mGluR6 o fragmento del mismo) , y (3) una repetición terminal invertida del virus adeno-asociado 3' . Además, el vector rAAV puede contener preferiblemente una secuencia de poliadenilación .

En general, los vectores de rAAV tienen una copia de la ITR de AAV en cada extremo del transgen o gen de interés, con el fin de permitir la replicación, empaque e integración eficiente a cromosomas celulares. La ITR consiste de los nucleótidos 1 a 145 a el extremo 5' del genoma de ADN de AAV, y los nucleótidos 4681 a 4536 (esto es, la misma secuencia) en el extremo 3' del genoma de ADN de AAV. El vector de rAAV puede también incluir por lo menos 10 nucleótidos enseguida del extremo de la ITR (esto es, una porción de la "región D") .

La secuencia de transgen (por ejemplo, el polinucleótido que codifica una proteina sensible a la luz) puede ser de aproximadamente 2 a 5 kb de longitud (o alternativamente, el transgen puede contener adicionalmente una secuencia de "estopa" o "relleno" para traer al total tamaño de la secuencia de ácido nucleico entre las dos ITR a entre 2 y 5 kb) . Alternativamente, el transgen puede estar compuesto de copias .repetidas de la misma o similar secuencia heteróloga varias veces (por ejemplo, dos moléculas de ácido nucleico que codifican una o más proteínas sensibles a la luz separadas por una lectura pasante de ribosoma o alternativamente, por un Sitio de Entrada de Ribosoma Interno o "IRES") , o varias diferentes secuencias heterólogas (esto es, ChR2 y NpHR separadas por una lectura pasante de ribosoma o un IRES; o cualquiera de dos o más de las proteínas sensibles a la luz descritas en la presente en las que se incluyen pero no limitadas a ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos) .

Los vectores de AAV recombinante de la presente invención pueden ser generados de una variedad de virus adeno-asociados, en los que se incluyen, por ejemplo, cualquiera de los serotipos 1 a 12, como" se describe en la presente. Por ejemplo, ITR de cualquier serotipo de AAV se espera que tengan estructuras y funciones similares con respecto a mecanismos de replicación, integración, extirpación y transcripcionales .

En algunas modalidades, se emplea un promotor específico del tipo de célula (u otra secuencia reguladora tal como un mejorador) para impulsar la expresión de un gen.de interés, por ejemplo, una proteína sensible a la luz, ChR2, etc., en uno o más tipos de células específicos. En otros casos, dentro de ciertas modalidades de la invención, la expresión del transgen sensible a la luz se puede efectuar por un promotor separado (por ejemplo, un promotor viral, eucarióntico u otro promotor que facilita la expresión de una secuencia enlazada operativamente en una célula eucarióntica, particularmente una célula mamifera) . Ejemplos representativos de promotores apropiados a este respecto incluyen un promotor de mGluR6, un promotor de GNA01, un promotor de CBA/smCBA (fusión del mej orador prematuro inmediato de CMV y promotor de beta-actina bovino más unión introl-exonl ) promotor de CBA (beta actina de pollo) , promotor de CMV, promotor de RSV, promotor de SV40, promotor de MoMLV, o derivados, mutantes y/o fragmentos de los mismos. Promotores y otras secuencias reguladoras son descritos adicionalmente en la presente.

Otros promotores que pueden ser utilizados similarmente en el contexto de la presente invención incluyen promotores específicos de célula o tejido (por ejemplo, un promotor derivado de bastón, cono o ganglios) , o promotores inducibles. Ejemplos representativos de promotores inducibles apropiados incluyen promotores inducibles sensibles a un antibiótico, por ejemplo, promotores sensibles a tetraciclina tales como promotores de "tet-encendido" y/o "tet-apagado" . Promotores inducibles pueden también incluir promotores sensibles a campos químicos diferentes a antibióticos.

El vector de rAAV puede también contener secuencias adicionales, por ejemplo de un adenovirus, que ayudan a efectuar una función deseada para el vector. Tales secuencias incluyen, por ejemplo, aquellas que ayudan en el empaque del vector de rAAV a partículas de virus.

El empaque de líneas celulares apropiadas para la I 28 producción de vectores virales adeno-asociados se pueden llevar a cabo dadas técnicas disponibles (véase, por ejemplo, patente estadounidense No. 5,872,005). Métodos para construir y empacar vectores de rAA7I son descritos en, por ejemplo, WO 00/54813.

El flanqueo de los cuadros de lectura abierta rep y cap en los extremos 5' y 3' son repeticiones terminales invertidas de 145 pares de bases (ITR) , las primeras 125 pares de bases de las cuales son capaces de formar estructuras dúplex en forma de Y o T. Las dos ITR son los únicos elementos cis esenciales para la replicación de AAV, rescate, empaque e integración del genoma de AAV. Hay dos conformaciones de las ITR de AAV llamadas "flip" y "flop". Estos diferencias en conformación originadas del modelo de replicación del virus adeno-asociado que usa la ITR para iniciar y reiniciar la replicación (R. O. Snyder et al., 1993, J. Virol., 67:6096-6104 (1993); K.I. Berns, 1990 Microbiological Reviews, 54:316-329). Todos los dominios de rep y cap pueden ser extirpados y reemplazados con un transgen terapéutico o transgen reportero.

En algunas modalidades se usan vectores de AAV auto-complementarios. Los vectores auto-complementarios han sido desarrollados para superar la síntesis de segunda hebra limitantes de la velocidad en genomas de vector de AAV de una sola hebra y para facilitar la expresión de transgen robusta a una misma dosis. En modalidades específicas un AAV auto-complementario de cualquier serotipo o serotipo híbrido o serotipo mutante, o serotipo híbrido mutante incrementa la expresión de una proteína sensible a la luz tal como ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, de híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de -los mismos por lo menos 10%, por ' lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 100%, por lo menos 125%, por lo menos 150%, por lo menos 175%, por lo menos 200%, o más de 200%, cuando se compara comparación con un rAAV no auto-complementario del mismo serotipo.

Serotipos Virales Adeno-Asociados En una modalidad, el vector comprende un AAV recombinante de un serotipo particular, ya sea que se presenta de manera estable en la naturaleza o diseñado.

Los AAV han sido encontrados en muchas especies animales, en los que es incluyen^ primates, caninos, aves de corral y humanos.

Los serotipos virales son cepas de microorganismos que tienen un conjunto de antígenos reconocibles en común. Hay varios serotipos conocidos de AAV , y la eficacia de transfección o transducción dentro de la retina puede variar como función del serotipo especifico y la naturaleza de las células objetivo. rAAV o un serotipo especifico de rAAV o AAV, pueden proveer tropismo especifico de tejido o especifico de célula para la administración de genes a células bipolares retínales (por ejemplo, células ' bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) . Mientras que rAAV y/o AAV es probablemente un método relativamente seguro para administrar un transgen a un tejido objetivo, la eficacia de administración y posiblemente la seguridad de administración, puede depender de las proteínas de recubrimiento del AAV. El recubrimiento de proteína o cápsido, determina cuales células pueden tomar la carga viral. Diferentes serotipos de AAV, esto es, virus que difieren en sus recubrimientos de proteína o cápsidos, pueden diferir en su tropismo de tejido y habilidad para transducir células objetivo. Los transgenes pueden ser empacados dentro de partículas de AAV con muchas proteínas de recubrimiento funcionalmente diferentes o cápsidos. Estos cápsidos diferentes son lo que definen el serotipo y pueden contribuir (completamente o en parte) en su habilidad para transducir tipos de células particulares. La entrada del vector viral comienza con la interacción del cápsido y la proteína de superficie celular objetivo. Sin desear estar limitados por la teoría, es en este punto en . la ruta de transducción que diferentes serotipos pueden influenciar significativamente la eficiencia de administración del transgen.

En ciertas modalidades el vector de AAV es de un serotipo o variante/mutante del mismo en los que se incluyen pero no limitados a: AAV1 (número de acceso GenBank AY724675) , AAV2 (número de acceso GenBank AF043303) , AAV3, AAV4, AAV5 (número de acceso GenBank M61166) , AAV6, AAV7 (número de acceso GenBank AF513851), AAV8 (número de acceso GenBank AF513852), AAV9 (número de acceso GenBank AX753250) , AAV10, AAV11 (número de acceso GenBank AY631966) , o AAV12 (número de acceso GenBank DQ813647), o mutantes, híbridos o fragmentos de los mismos. En ciertas modalidades el vector de AAV comprende uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más de los siguientes serotipos: AAV1 (número de acceso GenBank AY724675), AAV2 (número de acceso GenBank AF043303) , AAV3, AAV4, AAV5 (número de acceso GenBank M61166) , AAV6, AAV7 (número de acceso GenBank AF513851), AAV8 (número de acceso GenBank AF513852), AAV9 (húmero de acceso GenBank AX753250), AAV10, AAV11 (número de acceso GenBank AY631966) , o AAV12 (número de acceso GenBank DQ813647), o mutantes, híbridos o fragmentos de los mismos. En otras modalidades, el vector de AAV es de un serotipo natural o variante/mutante del mismo, hasta ahora sin descubrir y sin caracterizar .

En ciertas modalidades, el AAV recombinante es de un híbrido combinatorial de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más serotipos o mutantes de los mismos.

En algunas modalidades, el vector de AAV puede ser usado para transducir específicamente un tipo de célula específico, por ejemplo, células retínales o células bipolares retínales (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) . En algunos casos, un serotipo específico, por ejemplo, AAV2, AAV5, AAV7 o AAV8, puede ser mejor que otros serotipos para transducir un tipo de célula particular (por ejemplo, células bipolares retínales (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) , neuronas) o tejido. Por ejemplo, un serotipo de AAV específico tal como AAV2, AAV5, AAV7 o AAV8 puede transducir un tipo de célula específico, por ejemplo, células bipolares retínales (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) , con una eficiencia de transducción incrementa de por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 100%, por lo menos 125%, por lo menos 150%, por lo menos 175%, por lo menos 200% o más de 200%, cuando se compara con un serotipo de AAV diferente. En algunos casos, un serotipo específico por ejemplo, AAV2, AAV5, AAV7 o AAV8, puede permitir la transducción de . por lo menos 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de células de un tipo de célula particular, por ejemplo, células bipolares retínales (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) , o de células dentro de un tejido particular, por ejemplo, tejido retinal.

Hay necesidad en el arte por serotipos de AAV que puedan transducir efectivamente células bipolares retínales (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) , particularmente cuando tal transducción permite la administración y expresión de una proteína sensible a la luz, por ejemplo, ChR2. Una terapia importante para tratar alteraciones o enfermedades del ojo (por ejemplo, deterioro visual, ceguera) , pueden involucrar un serotipo de AAV particular para expresa proteínas sensibles a la luz tal como ChR2 en células bipolares retínales (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) . Por ejemplo, en una modalidad preferida, se usan serotipos de AAV5 o AAV7 para apuntar la expresión de un gen de interés (por ejemplo, una proteína sensible a la luz, ChR2, etc.) en célula retínales, por ejemplo, células bipolares retínales (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) . En algunos casos, AAV5 y/o AAV7 pueden transducir más eficientemente células retínales, por ejemplo, células bipolares retínales (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) , que otros serotipos de AAV. Por ejemplo, en algunas modalidades, los serotipos de AAV5 y/o AAV7, pero no el serotipo de AAV1, son usados para transducir células bipolares retínales (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) . En otros casos se usan serotipos de AAV2 y/o AAV8 para transducir células bipolares retínales (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) . En algunos casos, un serotipo específico, por ejemplo, AAV2, AAV5, AAV7 o AAV8 , puede ser aplicado en general a un tejido, por ejemplo, tejido retinal, pero luego transduce preferiblemente un tipo de célula específico con respecto a otro tipo de célula.

En algunos casos, un AAV por ejemplo, AAV2 , AAV5, AAV7 o AAV8, que es introducido a la retina puede transducir preferiblemente células bipolares retínales (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) de tal manera que el transgen es expresado más altamente en células bipolares retínales en comparación con otras células retínales. En algunos casos, el serotipo particular, por ejemplo, AAV2, AAV5, AAV7 o AAV8, del AAV pueden ser la causa o contribuir a la causa de tal transducción preferencia. En algunos casos, solamente un subconjunto pequeño de células bipolares son transducidas .

En algunas modalidades, un serotipo especifico de AAV, por ejemplo, AAV5 y/o AAV7 (o cualquier otro serotipo de AAV o mutante descrito en la presente) que comprende un promotor especifico del tipo sin célula es usado para impulsar la expresión de una proteina sensible a la luz en un tipo de célula particular. En algunos casos, un serotipo especifico de AAV que ha sido demostrado que transduce preferiblemente un tipo ' de célula particular es usado junto con un promotor especifico del tipo de célula para impulsar la expresión de una proteina de interés, por ejemplo, una proteina sensible a la luz, en un tipo de célula especifico.

Las secuencias de ITR de AAV y otras secuencias de AAV empleadas en la generación de los minigenes, vectores y cápsidos y otros constructos usados en ciertas modalidades pueden ser obtenidas de una variedad de fuentes. Por ejemplo, las secuencias pueden ser provistas por tipos de AAV humanos presentemente identificados y serotipos de AAV todavía a ser identificados. Similarmente, los AAV conocidos que infectan otros animales pueden también proveer estas ITRs empleadas en los módulos o constructos de esta invención. Similarmente, los cápsidos de una variedad de serotipos de AAV pueden ser "mezclados y hacerse coincidir" con los otros componentes del vector. Véase, por ejemplo, publicación de patente internacional No. WO01/83692, publicada el 8 de noviembre de 2001, e incorporada en la presente por referencia. Una variedad de estos serotipos virales y cepas están disponibles de la American Type Culture Collection, Manassas, Va., o están disponibles de una variedad de fuentes académicas o comerciales. Alternativamente, puede ser deseable sintetizar las secuencias usadas en la preparación de los vectores y virus de la invención utilizando técnicas conocidas, que pueden utilizar secuencias de AAV que están publicadas y/o disponibles de una variedad de bases de datos.

Virus Adeno-Asociados y Mutaciones de Residuos Superficie-Expuestos Los vectores de virus adeno-asociados recombinantes están en uso en varios estudios clínicos, pero dosis de vector relativamente grandes son necesarias para obtener beneficios terapéuticos. Las dosis de vector grandes pueden también disparar una respuesta inmune ya que una fracción significativa de los vectores pueden fracasar en traficar eficientemente al núcleo y pueden ser apuntados por degradación por la maquinaria de proteasoma de la célula huésped. Se ha reportado que la señalización de cinasa de tirosina de proteína de receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR-PTK) afecta negativamente la transduccion por vectores serotipo 2 de AAV al deteriorar el transporte nuclear de los vectores (Zhong 2007) .

Los vectores de AAV2 tirosina-fosforilado entran pero no transducen efectivamente, en parte debido a la ubiquitinación de los cápsidos de AAV seguido por la degradación moderada por proteasoma. Las mutaciones puntuales en tirosinas en AAV2 puede conducir a transducción de alta eficiencia a títulos de virus más bajos (Zhong 2008). En una modalidad, los AAV tirosina-mutados, por ejemplo, AAV2 o AAV8, son usados con el fin de mejorar la eficiencia de transducción de células retínales, por ejemplo, células bipolares retínales (Figuras 9-12). En una modalidad, mutaciones de los residuos de tirosina superficie-expuestos del cápsido de rAAV permite que los vectores evadan la fosforilación y subsecuente ubiquitinación y así, impiden la degradación moderada por proteasoma, conduciendo a mayor transducción y subsecuente expresión genética de proteínas sensibles a la luz.

En una modalidad relacionada, cualquiera de uno o más de los residuos superficie-expuestos diferentes a tirosina pueden ser mutados para mejorar la eficiencia de transducción, el tropismo del tipo de tejido/célula, características de expresión y títulos necesarios para la infección efectiva.

Como se describe en la presente, la modificación y cambios a la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de vectores de rAAV tipo silvestre puede dar como resultado viriones de rAAV mejorados que poseen características deseables. Por ejemplo, los vectores de rAAV mutados pueden mejorar la administración de constructos genéticos sensibles a la luz a células, tejidos y órganos mamíferos seleccionados para el tratamiento, prevención y profilaxis de varias enfermedades y alteraciones. Tal procedimiento puede también proveer un medio para la mejora de síntomas de tales enfermedades, y para facilitar la expresión de polipéptidos terapéuticos y/o profilácticos exógenos de interés vía terapia genética moderada por vector de rAAV. Los vectores de rAAV mutados pueden codificar una o más proteínas, por ejemplo, proteínas sensibles- a la luz, por ejemplo, ChR2, descritas en la presente. La creación (o inserción) de una o más mutaciones a secuencias de polinucleótido específicas que codifican una o más de las proteínas sensibles a la luz codificadas por los constructos de rAAV revelados en la presente. En ciertas circunstancias, la secuencia de polipéptidos sensible a la luz resultante es alterada por estas mutaciones, o en otros casos, la secuencia del polipéptido está sin cambiar por una o más mutaciones en el polinucleótido de codificación para producir vectores modificados con propiedades mejoradas para efectuar la terapia genética en sistemas mamíferos. Como se describe en la presente, la optimización del codón del polinucleótido que codifica la proteína sensible a la luz puede también mejorar la eficiencia de transducción .

La ruta de ubiquitina-proteasoma juega un papel en el tráfico intracelular de AAV. La sustitución de residuos de tirosina superficie-expuestos sobre, por ejemplo, cápsidos de AAV2 o AAV8 permite que los vectores ya sea tengan ubiquitinación limitada o que escapen a la ubiquitinación por completo. La reducción de o ausencia de ubiquitinación puede ayudar a impedir que el cápsido sufra degradación moderada por proteasoma. Los cápsidos de AAV o rAAV pueden ser fosforilados en residuos de tirosina por EGFR-PTK en un análisis de fosforilación in vitro, y los cápsidos de AAV fosforilados retienen su integridad estructural. Aunque los vectores de AAV fosforilados pueden entrar a las células tan eficientemente como sus contrapartes sin fosforilar, su eficiencia de transduccion puede ser deteriorada significativamente.

En algunos casos, un vector viral adeno-asociado recombinante (rAAV) comprende una proteina de cápsido con un residuo de tirosina mutado que permite que el vector tenga eficiencia de transduccion mejorada de una célula objetivo, por ejemplo, una célula bipolar retinal (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) . En algunos casos, el rAAV comprende además un promotor (por ejemplo, mGluR6 o fragmento del mismo) apto de impulsar la expresión de una proteína de interés en la célula objetivo.

En algunos casos, la expresión en un tipo de célula específico es obtenida adicionalmente al incluir un promotor específico del tipo de célula descrito en la presente dentro del vector de rAAV.

En una modalidad, un vector viral adeno-asociado recombinante (rAAV) comprende por lo menos una primera proteína de cápsido que comprende por lo menos un primer residuo de aminoácido de tirosina fosforilado y en donde dicho vector comprende además por lo menos un primer segmento de ácido nucleico que codifica una proteína sensible a la luz enlazada operativamente a un promotor capaz de expresar dicho segmento en una célula huésped.

En una modalidad, una mutación puede ser efectuada en cualquiera de uno o más de residuos de tirosina de la proteína de cápsido de AAV 1-12 o AAV híbridos. En modalidades específicas, estos son residuos de tirosina superficie- expuestos. En una modalidad relacionada, los residuos de tirosina son parte de la proteína de cápsido de VPl, VP2 ó VP3. En modalidades ejemplares, la mutación puede ser efectuada en uno o más de los siguientes residuos de aminoácido de una proteína de cápsido de AAV-VP3 : Tyr252, Tyr272, Tyr444, Tyr500, Tyr700, Tyr704, Tyr730; Tyr275, Tyr281, Tyr508, Tyr576, Tyr612, Tyr673 o Tyr720. Mutaciones ejemplares son mutaciones de tirosina a fenilalanina en las que se incluyen pero no limitadas a, Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F y Y720F. En una modalidad específica, estas mutaciones son efectuadas en el - serotipo de AAV2. En algunos casos, un serotipo de AAV2 comprende una mutación de Y444F y/o un serotipo de AAV8 comprende una mutación de Y733F, en donde 444 y 733 indican la ubicación de una mutación de tirosina puntual del cápsido viral. En modalidades adicionales, tales serotipos de AAV2 y AAV8 mutados codifican una proteina sensible a la luz, por ejemplo, ChR2 y pueden también comprender una secuencia reguladora (por ejemplo, mGluR6) para impulsar la expresión de tal proteina sensible a la luz.

En una modalidad relacionada, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 mutaciones son efectuadas al residuo de tirosina en un serotipo AAV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o serotipo híbrido. En una modalidad ejemplar, 3 tirosinas son mutadas para crear un serotipo de AAV con una triple mutación que consiste de de: Y444F, Y500F y Y730F.

Los vectores de rAAV de la presente invención pueden estar comprendidos dentro de una partícula viral adeno-asociada o virión de rAAV infeccioso, en los que se incluyen por ejemplo, viriones seleccionados del grupo que consiste de un serotipo de 1 de AAV, un serotipo 2 de AAV, un serotipo 3 de AAV, un serotipo 4 de AAV, un serotipo 5 de AAV y un serotipo 6 de AAV, un serotipo 7 de AAV, un serotipo 8 de AAV, un serotipo 9 de AAV, un serotipo 10 de AAV, un serotipo 11 de AAV, un serotipo 12 de AAV o un serotipo de AAV híbrido.

Los vectores de rAAV de la presente invención pueden también estar comprendidos dentro de una célula huésped mamifera aislada, en las que se incluyen por ejemplo, células huésped humanas, de primate, murinos, felinos, caninos, porcinos, ovinos, bovinos, equinos, epinos, caprinos y lupinos. Los vectores de rAAV pueden estar comprendidos dentro de una célula huésped mamifera aislada tal como una célula endotelial humana, epitelial, vascular, de hígado, pulmón, corazón, páncreas, intestinal, de riñon, músculo, hueso, neural, sangre, o cerebro.

En ciertas modalidades, la eficiencia de transducción de un AAV que comprende una proteína de cápsido mutada (por ejemplo, una mutación de un residuo de tirosina descrito en la presente) que expresa una proteína sensible a la luz tal como ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos es incrementada por al menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 100%, por lo menos 125%, por lo menos 150%, por lo menos 175%, por lo menos 200%, o más de 200%, cuando se compara con un AAV tipo silvestre que expresa una proteína sensible a la luz. La presente revelación también provee vectores de rAAV mutados (por ejemplo, el vector, AAV2 Y444F o el vector AAV8Y733F) aptos de transducir por lo menos 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) células bipolares. La mejora en transducción creada por el cápsido mutado puede permitir la transducción de células bipolares mediante inyección intravítrea. Por ejemplo, en algunas modalidades, un vector de rAAV mutado o un vector híbrido de serotipo combinatorial de rAAV o un vector de rAAV híbrido de serotipo combinatorial mutado puede ser apto de transducir por lo menos 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de células bipolares retínales (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) es introducido a la retina mediante inyección intravítrea. En una modalidad específica, solamente un subconjunto de la células bipolares retínales es transducido. En otra modalidad específica, solamente las células bipolares altamente sensibles son transducidas .

En ciertas modalidades, la degradación moderada por ubiquitina o proteasoma de un AAV que comprende una proteína de cápsido con una mutación que expresa una proteína sensible a la luz, tal como ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos, es disminuida por al menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85% o por lo menos 90%, cuando se compara con un AAV tipo silvestre que expresa una proteina sensible a la luz.

Otros Vectores de Administración Genética Cualquiera de una variedad de otros vectores aptos para la expresión de ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, . NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos o cualquier proteina sensible a la luz en una célula del ojo, particularmente dentro de una célula retinal, más particularmente dentro de una célula sin fotoreceptor (por ejemplo, células de amacrina, células de ganglio retinal, células bipolares retínales, (células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) ) , están dentro del alcance de la presente invención. La administración genética de vectores puede ser viral (por ejemplo, derivada de o que contiene secuencias de ADN o ARN viral, preferiblemente empacados dentro de una partícula viral), o no viral (por ejemplo, no empacado dentro de una partícula viral, en los que se incluyen polinucleótidos "descubierto", ácido nucleico asociado con una partícula portadora tal como un liposoma o molécula de apuntamiento y los semej antes ) .

Otros vectores de administración genérica ejemplares son descritos a continuación Vectores Adenovirales Recombinantes (Ad) : En otras modalidades, el vector de administración genética es un vector adenoviral recombinante . La patente estadounidense No. 6,245,330 describe adenovirus recombinantes que pueden ser apropiados para uso en la invención. Los vectores de Ad no se integran al genoma de célula huésped, particularmente preferidos cuando se requiere un gen a corto plazo, comúnmente alrededor de 14 días. Asi, el uso de los vectores de Ad puede requerir inyecciones intraocul'ares repetidas para tratar una enfermedad retinal que continúa durante décadas en el paciente promedio.

El tropismo viral de Ad y AAV en la retina puede ser diferente. El subconjunto de células que son transducidas por el vector es usualmente un evento moderado por receptor. Se ha demostrado que los vectores de Ad transducen principalmente células de Muller retínales y células epiteliales de pigmento retinal enseguida de la inyección. Los vectores de AAV son muy eficientes para transferir su carga génética a células fotoreceptoras retínales y células sin fotoreceptor cuando son inyectados al ojo.

Vectores de administración genética retroviral: los vectores de administración genética de la invención pueden ser un vector de administración genética retroviral apto para expresar un (os) gen (es) o secuencia (s) seleccionado ( s ) de interés (por ejemplo, ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos) . Los vectores de administración genética retrovirales de la presente invención pueden ser construidos fácilmente a partir de una amplia variedad de retrovirus, en los que se incluyen, por ejemplo, retrovirus tipo B, C y D también como espumavirus y lentivirus. Por ejemplo, en algunos casos, un retrovirus, por ejemplo, un lentivirus, es pseudotipado con una proteina de envolvente u otra proteina .viral para facilitar la entrada a células objetivo. En algunos casos, un lentivirus es pseudotipado con proteina de virus g vesicular-estomatitis . (véase RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985) . Tales retrovirus pueden ser obtenidos fácilmente de depósitos o colecciones tales como la American Type Culture Collection ("ATCC"; Rockville, Maryland) , o aislados como se estipula en la presente y técnicas recombinantes estándar (por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Kunkel, PNAS 52: 488,1985).

Además, en ciertas modalidades de la invención, porciones de los vectores de administración genética retroviral pueden ser derivados de diferentes retrovirus. Por ejemplo, en una modalidad de la invención, LTR de retrovirus pueden ser derivados de un virus de sarcoma murino, un sitio de enlace de tARN de un virus de sarcoma de Rous, una señal de empaque de un virus de leucemia murino, y un origen de síntesis de segunda hebra de un virus de leukosis aviar.

Dentro de un aspecto de la presente invención, se proveen constructos de vector retroviral que comprenden un 5' LTR, un sitio de enlace de tARN, una señal de empaque, una o más secuencias heterólogas, un origen de síntesis de ADN de segunda hebra y un 3' LTR, en donde el constructo de vector carece de secuencias de codificación de gag, pol o env.

Otros vectores de administración genética retrovirales pueden ser utilizados asimismo dentro del contexto de la presente invención, y son bien conocidos en el arte.

Líneas de células de empaque apropiadas para uso con los constructos de vector retroviral descritos anteriormente pueden ser preparadas fácilmente de acuerdo con métodos bien conocidos en el arte y utilizados para crear líneas de células productoras para la producción de partículas de vector recombinantes .

Vectores de administración de alfavirus: Vectores de administración genética apropiados para uso en la invención pueden también estar basados en vectores de alfavirus. Por ejemplo, el virus de Sindbis es el miembro prototipo del género de alfavirus de la familia de togavirus. El ARN genómico sin segmentar (ARN de 49S) del virus de Sindbis es de aproximadamente 11,703 nucleótidos de longitud, contiene una tapa 5' y una cola 3' poli-adenilada y exhibe polaridad positiva. El virus de Sindbis envuelto infeccioso es producido mediante el ensamble de las proteínas de nucleocápsido virales sobre el ARN genómico viral en el citoplasma y gemación a través de la membrana celular embebida con glucoproteínas codificadas virales. La entrada de virus a las células es mediante endocitosis a través de pozos recubiertos de clatarina, fusión de la membrana viral con el endosoma, liberación del nucleocápsido y desrecubrimiento del genoma viral. Durante la replicación viral el ARN 49S genómico sirve como plantilla para la síntesis de la hebra negativa complementaria. Esta hebra negativa a su vez sirve como plantilla para ARN genómico y un ARN sub-genómico 26S iniciado internamente .

Las proteínas no estructurales virales de Sindbis son traducidas del ARN genómico en tanto que las proteínas estructurales son traducidas del ARN 26S sub-genómico. Todos los genes virales son expresados como poliproteína y procesadas a proteínas individuales mediante escisión proteolítica post-traduccional . La secuencia de empaque reside dentro de la región de codificación .no estructural, por consiguiente, solo el ARN 49S genómico es empacado en viriones.

Varios sistemas de vector de Sindbis diferentes pueden ser construidos y utilizados en la presente invención. Ejemplos representativos de tales sistemas incluyen aquellos descritos en las patentes estadounidenses Nos. 5,091,309 y 5,217,879, y publicación de PCT No. WO 95/07994.

Otros vectores de . administración genética virales además de vectores retrovirales y vectores de alfavirus, numerosos otros sistemas vectores virales pueden también ser utilizados como un vector de administración genética. Ejemplos representativos de tales vectores de administración de genes incluyen virus tales como poxvirus, tales como poxvirus canario o virus de vacuna.

Vectores de administración genética no virales: Además de los vectores virales anteriores, numerosos vectores de administración genética no virales pueden asimismo ser utilizados en el contexto de la presente invención. Ejemplos representativos de tales vectores de administración genética incluyen administración directa de vectores de expresión de ácido nucleico, ADN descubierto (por ejemplo, ADN no contenido en un vector viral) (WO 90/11092), ADN condensado de policatión enlazado o sin revestir a adenovirus asesinados (Curiel et al., Hum. Gen Ther. 3: 147-154, 1992), ligando de ADN enlazado a un ligando con o sin uno de los pares de alta afinidad descritos above (Wu et al., R de Biol. Chem (264: 16985-16987, 1989), liposomas que contienen ácido nucleico (por ejemplo, WO 95/24929 y WO 95/12387) y ciertas células eucariónticas .

Secuencia reguladoras En algunas modalidades, secuencias o elementos reguladores son utilizados, para permitir el apuntamiento especifico del tipo de célula o tipo de tejido de ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C1.28S, ChR2 C128T, de híbridos/quimeras ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos. En modalidades relacionadas, los elementos reguladores son usados para apuntar específicamente neuronas retínales o células bipolares retínales (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) , o células de ganglio retínales, o células fotoreceptoras , o células amacrinas. Ejemplos de secuencia o elementos reguladores incluyen pero no están limitados a secuencias de promotor, silenciador, mej orador y aislante.

En algunas modalidades, secuencias reguladoras tales como promotores apropiados para uso en la presente invención incluyen promotores constitutivos, promotores fuertes (por ejemplo, promotores de CMV) , promotores inducibles y promotores específicos de tejido o específicos de célula (por ejemplo, promotores que preferiblemente facilitan la expresión en un número limitado de tipos de tejidos o células (por ejemplo, tejidos del ojo, retina, células retínales, células fotoreceptoras y los semejantes) .

Cualquiera de una variedad de secuencias reguladoras pueden ser usadas en los vectores de administración genética de la invención para proveer un nivel o patrón apropiado de expresión de la proteina sensible a la luz de interés. Las secuencias reguladoras son en general derivadas de secuencias reguladoras eucariónticas .

En algunas modalidades, se usan elemento reguladores no específicos de célula. En una modalidad, el promotor comprende (de 5' a 3' ) un mejorador viral (un mejorador prematuro inmediato de CMV) , y un promotor de beta-actina (un elemento de promotor-exonl-intronl de beta-actina de bovino o de pollo) . En una modalidad específica, el promotor comprende (de 5' a 3' ) un elemento de mejorador prematuro inmediato de CMV de (381 bp) /elemento de promotor-exonl-intronl (1352 pares de bases) de beta-actina (CBA) bovino o de pollo, que conjuntamente son denominados en la presente el "promotor de CBA" (Figura 7). En algunas modalidades, un ácido nucleico que codifica una proteína sensible a la luz es administrado a una célula utilizando un vector viral tal como AAV que porta un ADN de codificación de transgen sensible a la luz seleccionado regulado por un promotor no específico de célula y/u otras secuencias reguladoras que expresan el producto del ADN. En algunas modalidades relacionadas, el promotor no específico de célula es promotor general tal como un promotor a base de ubiquitina, por ejemplo un promotor de ubiquitina C.

En otras modalidades, una proteína sensible a la luz es administrada a un tipo de célula o tipo de tejido de interés utilizando un vector viral tal como AAV que porta un ADN de codificación de transgen sensible a la luz seleccionado regulado por un promotor y/u otras secuencias reguladoras que expresan el producto del ADN en células retínales seleccionadas de un sujeto. En modalidades específicas, la expresión es apuntada a tipos particulares de células dentro de la retina por medio del uso de una secuencia de nucleótidos promotora específica y/u otras regiones reguladoras tales como secuencias de silenciador, mejorador o aislante que son diseñadas al vector. En algunas modalidades, se usan diferentes secuencias reguladoras para impulsar la expresión de diferentes genes diseñados en diferentes poblaciones de células.

En otras modalidades, secuencias reguladoras específicas de células bipolares retínales tales como secuencias de promotor, mejorador, silenciador y aislante son utilizadas. En modalidades específicas, las células bipolares de Encendido son apuntadas. En otras modalidades, las células bipolares de Apagado son apuntadas. En otras modalidades, las células bipolares de bastón son apuntadas. En otras modalidades, las células bipolares de cono son apuntadas.

En una modalidad, la expresión específica de proteínas sensibles a la luz en células bipolares de Encendido es apuntada utilizando una proteína sensible a la luz tal como ChRl, ChR2, VChRl , ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos enlazados operativamente a una secuencia reguladora de GR 6 (receptor 6 de glutamato metabotrópico, mGluR6) o un fragmento de la misma. En una modalidad, se utiliza la secuencia reguladora de mGluR6 de plena longitud.

En otra modalidad, la expresión específica de proteínas sensibles a la luz en células bipolares de Encendido es apuntada utilizando una proteína sensible a la luz tal como ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos enlazados operativamente a un fragmento de secuencia reguladora de mGluR6. En una modalidad específica, el fragmento de secuencia reguladora de mGluR6 es la secuencia presentada en la Figura 6. En una modalidad relacionada, el fragmento de secuencia reguladora de mGluR6 es sustancialmente el mismo como la secuencia presentada en la Figura 6 o es aproximadamente 60% idéntico, o es aproximadamente 70% idéntico, o es aproximadamente 80% idéntico, o es aproximadamente 90% idéntico, o es aproximadamente 95% idéntico a la secuencia presentada en la Figura 6.

Muchos promotores conocidos son demasiado grandes para ajustar al genoma del AAV . Por supuesto, la secuencia reguladora especifica de célula original para mGluR6 (Dhingra, 2008) fue bastante demasiado grande (aproximadamente 10.5 Kb) para ser usada en AAV. En una modalidad preferida de la presente invención, se usa un fragmento de secuencia reguladora de mGluR6, uno que es suficientemente pequeño para ser usado en la administración moderada por AAV. En modalidades relacionadas, el fragmento de secuencia reguladora de mGluR6 es menor de aproximadamente 2000 pares de bases, menor de aproximadamente 1000 pares de bases, menor de aproximadamente 750 pares de bases, menor de aproximadamente 500 pares de bases, menor de aproximadamente 250 pares de bases, o menos de aproximadamente 100 pares de bases en longitud. En otra modalidad relacionada, el fragmento de secuencia reguladora de mGluR6 es una variante de la secuencia presentada en la Figura 6.

En otra modalidad, la expresión especifica de proteínas sensibles a la luz en células bipolares de Encendido es apuntada utilizando una proteína sensible a la luz tal como ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos enlazados operativamente a una secuencia reguladora de GNA01 (proteína de enlace de nucleótido de guanina (proteína G) ) , polipéptido O 'de actividad alfa activante) . En una modalidad relacionada, la secuencia reguladora es sustancialmente la misma como la secuencia de GNA01, o es aproximadamente 60% idéntica, o es aproximadamente 70% idéntica, o es aproximadamente 80% idéntica, o es aproximadamente 90% idéntica, o es aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de GNA01.

Células Bipolares Retínales y Apuntamiento Aunque solamente una fracción del sistema visual humano, la retina es un sistema complejo que filtra, amplifica y modula la señal visual antes de que sea enviada al resto del sistema visual (Wassle 2004) . La vasta mayoría de este procesamiento sucede dentro de, la capa plexiforme interna (IPL) en donde un sistema de células bipolares y amacrinas refinan la señal visual en sus componentes primarios (por ejemplo, movimiento, contraste, resolución) (Mills 1999; Roska 2001) . Algunos grupos están apuntando actualmente ChR2 a la capa celular de ganglios, que desvía el poder de procesamiento del IPL y sistema de células amacrinas (Bi 2006; Greenberg 2007; Tomita 2007) . Estos grupos han reportado muy pocos cambios conductuales .

La mayoría de células retínales son ya sea del tipo Encendido-central (velocidad de disparo incrementado como resultado de un incremento gradual en contraste dentro del centro del campo receptor) o tipo centro apagado (velocidad de disparo incrementada como resultado de una disminución gradual i en contraste en el centro del campo receptivo), trabajando de manera inhibidora de impulso-tracción (Wassle 2004). Con el fin de mantener esta relación entre las dos rutas, estas dos rutas pueden ser impulsadas independientemente. Los canales de Encendido y Apagado de información que viaja de células bipolares a células de ganglio son parcialmente moduladas por medio de una red de células amacrinas inhibidoras dentro de la capa nuclear interna (Roska 2001) . Esta rede bipolar-amacrina produce canales de información paralelos temporalmente distintos: neuronas de actividad sostenidas, por ejemplo, mantienen la actividad en toda la etapa de luz, mientras que las neuronas de actividad transitoria tienen actividad solamente en el inicio o desplazamiento. Estos patrones distintos de respuesta codifican para información visual de luminancia, forma, bordes y movimiento (Wassle 2004). En algunas modalidades, las células que son pre-sinápticas a las células de ganglio retínales son apuntadas genéticamente para mantener el naturalismo de estas rutas y producir proyección de células de ganglios natural.

En algunas modalidades, las células bipolares retínales (por ejemplo, células bipolares retínales de Encendido o Apagado; células bipolares de bastón y cono) son apuntadas genéticamente. El apuntamiento de las células bipolares retínales puede permitir que la retina responda a la luz externa y más importantemente, transporte información de imagen significa al cerebro aún en ausencia de fotoreceptores naturales .

Condiciones susceptibles a Tratamiento En algunas modalidades, la presente invención provee métodos de tratamiento de un sujeto que sufre de una alteración o enfermedad. Las composiciones y métodos descritos en la presente pueden ser utilizados para tratar enfermedades y alteraciones del sistema nervioso central y periférico.

En un aspecto, las composiciones y métodos de esta invención son utilizados para tratar enfermedades de fotoreceptor . Las enfermedades de fotoreceptor tales como retinitis pigmentosa (RP) y degeneración macular relacionada con la edad (ARMD) provocan ceguera (Congdon 2004) en 15 millones gente a nivel mundial (Chader 2002), un número que se está incrementando con la edad de la población. Ha habido intentos por restaurar la función visual básica por medio de terapia de reemplazo de genes o transplante celular (Acland 2001, Acland 2005, Batten 2005, Pawlyk 2005, Aguirre 2007, MacLaren 2006) . Sin embargo, los procedimientos actuales están fundamentalmente limitados en alcance y extensión de impacto potencial, ya que intentan corregir mecánicamente distintas rutas genéticas en una base de uno a la vez (Punzo 2007) . Las enfermedades de fotoreceptor son genéticamente diversas, con más de 160 mutaciones diferentes que conducen a degeneración (Punzo 2007). Ha habido también esfuerzos en utilizar estimulación eléctrica con prótesis retínales agudas implantadas, semi-agudas y de largo plazo en sujetos humanos (de Balthasar, 2008; Horsager, 2009). Han demostrado avance elemental pero son no especificas; la estimulación eléctrica ofrece solamente especificidad burda e impulsa indiscriminadamente los canales de información visual moderados por tipos de células únicos. La activación de neuronas retínales requiere electrodos de disco grande (por lo menos 20 veces el diámetro de una célula de ganglio retinal), . conduciendo a estimulación de áreas amplias de retina de manera no selectiva, limitando extensamente la resolución visual obtenible (Winter 2007). En este aspecto, las composiciones y métodos de esta invención consisten de introducir un gen que codifica una proteína sensible a la luz (por ejemplo, ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos) para inducir sensibilidad a la luz en neuronas de segundo orden (por ejemplo, células bipolares) administradas utilizando un vector viral tal como un AAV8 con una sola mutación de tirosina a fenilalanina, bajo el control de un elemento regulador (por ejemplo, GRM6) . La activación de estas proteínas sensibles a la luz podría ser controlada por la luz ambiental o por medio de un dispositivo de administración de luz tal como las gafas I descritas en la Figura 13.

Los métodos de la invención pueden ser usados para tratar (por ejemplo, antes de o después del inicio de síntomas) en un sujeto susceptible o sujeto diagnosticado con una variedad de enfermedades de los ojos. La enfermedad del ojo puede ser el resultado de condiciones ambientales (por ejemplo, ataque químico, ataque térmico y los semejantes) , ataque mecánico (por ejemplo, lesión debido a accidente o cirugía) , o factores genéticos. El sujeto que tiene la condición puede tener uno o ambos ojos afectados, y la terapia puede ser administrada de acuerdo con la invención al ojo afectado o a un ojo en riesgo de degeneración de fotoreceptor debido a la presencia de tal condición en el otro ojo afectado del sujeto.

La presente invención provee métodos que comprenden en general la etapa de administrar intraocularmente (por ejemplo, mediante inyección sub-retinal o mediante inyección intravítrea) un vector de administración de gen que dirige la expresión de una proteína sensible a la luz al ojo para tratar, impedir o inhibir el inicio o avance de una enfermedad del ojo. Como se utiliza en la presente, se debe entender que los términos "tratar, impedir o inhibir" se refieren a la alteración de inicio, curso o avance de una enfermedad de una manera estadísticamente significativa.

Otra condición propensa a tratamiento de acuerdo con la invención es degeneración macular relacionada con la edad (AMD) . La mácula es una estructura cerca del centro de la retina que contiene la fóvea. Esta porción especializada de la retina es responsable de la visión de alta resolución que permite actividades tales como lectura. La pérdida de la visión central en AMD es "devastadora. Los cambios degenerativos a la mácula (maculopatia) pueden ocurrir en casi cualquier tiempo en vida pero son mucho más prevalecientes con la edad avanzada. Los tratamientos convencionales son de vida corta, debido a la neovascularización coroidal recurrente. La AMD tiene dos procesos patológicos primarios, neovascularización coroidal (CNV) y muerte de célula fotoreceptora macular.

Condiciones ejemplares de interés particular que son propensas a tratamiento de acuerdo con los métodos de la invención incluyen pero no están limitadas necesariamente a retinitis pigmentosa (RP) , retinopatia diabética y glaucoma, incluyendo glaucoma de ángulo abierto (por ejemplo, glaucoma de ángulo abierto primario) , glaucoma de ángulo cerrado y glaucomas secundarios (por ejemplo, glaucoma pigmentaria, glaucoma pseudoexfoliativa y glaucomas resultantes de trauma y enfermedades inflamatorias).

Condiciones ejemplares adicionales propensas a tratamiento de acuerdo con la invención incluyen, pero no están limitadas necesariamente a · desprendimiento retinal, maculopatias relacionadas con la edad u otras maculopatias, retinopatias fóticas, retinopatias cirugía-inducidas, retinopatías tóxicas, retinopatia de premadurez, retinopatías debidas a trauma o lesiones penetrantes del ojo, degeneración retínales heredadas, retinopatías cirugía-inducidas, retinopatías tóxicas, retinopatías debidas a trauma o lesiones penetrantes del ojo.

Condiciones heredadas ejemplares específicas de interés para tratamiento de acuerdo con la invención incluyen, pero son están limitadas necesariamente a síndrome de Bardet-Biedl (autosomal recesiva) ; amaurosis congenital (autosomal recesiva) ; distrofia de cono o cono-bastón (autosomal dominante y 'formas X-enlazadas) ; ceguera nocturna estacionaria congenital (autosomal dominante, autosomal recesiva y formas X-enlazadas) ; degeneración macular (formas de autosomal dominante y autosomal recesiva) ; atrofia óptica, autosomal dominante y formas X-enlazadas) ; retinitis pigmentosa (autosomal dominante, autosomal recesiva y formas X-enlazadas) ; retinopatia sindrómica o sistémica (autosomal dominante, autosomal recesiva y formas X-enlazadas); y síndrome de Usher (autosomal recesiva) .

En otro aspecto, las composiciones y métodos de esta invención son utilizados para tratar lesión periférica, nocicepción o. dolor crónico. La nocicepción (dolor) por períodos de tiempo prolongados puede dar surgimiento a dolor crónico y puede surgir de lesión o enfermedad a estructuras viscerales, somáticas y neurales en el cuerpo. Aunque el intervalo de tratamientos farmacológicos para dolor neuropático ha mejorado en la década pasada, muchos pacientes no obtienen analgesia efectiva y aún las medicaciones efectivas frecuentemente producen efectos secundarios indeseables. La Sustancia P (SP) está involucrada en la nocicepción, transmitiendo información acerca de daños del tejido de receptores periféricos al sistema nervioso central para ser convertidos a la sensación de dolor. Se ha tenido la teoría de que juega una parte en el papel de fibromialgia A de sustancia P en nocicepción es sugerido por la reducción en umbrales de respuesta a estímulos nocivos mediante la administración central de agonistas de NKl y NK2. Los comportamientos de dolor inducidos por estimulación mecánica, térmica y química de tejidos somáticos y viscerales fueron reducidos en ratones imitantes que carecen de SP/NKA. En una modalidad, proteínas sensibles a la luz pueden silenciar la actividad de neuronas sobreactivas (esto es, neuronas periféricas que expresan sustancia P) debido a lesión periférica o dolor crónico utilizando NpHR o eNpHR. NpHR/eNpHR pueden apuntados genéticamente a células que expresan sustancia P que usan la secuencia de promotor de sustancia P. En otra modalidad, las proteínas sensibles a la luz mejoran la actividad de neuronas que están inactivas debido a lesión periférica o dolor crónico.

En otro aspecto, las composiciones y métodos de esta invención son utilizados para tratar lesión de médula espinal y/o enfermedades neuromotrices . La lesión de la médula espinal puede provocar mielopatía o daños a materia blanca y sistemas de fibras mielinados que transportan señales de sensación y motrices a y del cerebro. Pueden también dañar la materia gris en la parte central de la espina, provocando pérdidas segméntales de interneuronas y neuronas motrices. La lesión de médula espinal puede ocurrir de muchas causas, en las que se incluyen pero no limitadas a trauma, tumores, isquemia, ¦ desarrollo anormal, neurodesarrollo, alteraciones neurodegenerativas o malformaciones vasculares. En una modalidad, las proteínas sensibles a la luz activan circuitos neurales dañados para restaurar la función motriz o sensorial. En una modalidad específica, el elemento actúa para permitir el control de funciones autonómicas y viscerales. En otras modalidades, los elementos actúan para permitir el control de función esqueletal somática. El control neural de almacenamiento y vaciado de orina es complejo y la disfunción puede ser difícil de tratar. Un tratamiento para la gente con síntomas refractarios es estimulación de nervio eléctrico continuo de las raíces del nervio sacral utilizando electrodos implantados y un generador de impulsos implantado. Sin embargo, la estimulación de esta raíz del nervio puede dar como resultado un número de diferentes complicaciones o efectos secundarios. Al ser aptos de controlar directamente el nervio sacral por medio de herramientas apuntadas genéticamente sería altamente benéfico. En una modalidad, tanto ChR2 como NpHR podrían ser expresados en este nervio para controlar el almacenamiento y vaciado de la vejiga.

En otro aspecto, las composiciones y métodos de esta invención son utilizados para tratar enfermedad de Parkinson. La enfermedad de Parkinson pertenece a un grupo de condiciones llamadas alteraciones del movimiento. Son caracterizadas por rigidez muscular, temblor, una disminución del movimiento físico (bradiquinesia) y, en casos extremos, una pérdida de movimiento físico (akinesia) . Los síntomas primarios son los resultados de estimulación disminuida de la corteza motriz por los ganglios básales, normalmente provocados por formación insuficiente y acción de dopamina, que es producida en las neuronas dopaminérgicas del cerebro. La enfermedad de Parkinson es tanto crónica como progresiva. La estimulación del cerebro intensa (DBS) es un tratamiento quirúrgico efectivo para enfermedad de Parkinson (PD) avanzada, con avances significativos en morbidez-mortandad y calidad de vida cuando se compara con técnicas de lesión tales como talamotomía y/o palidotomía. El procedimiento es indicado en pacientes con temblor en reposo severo, no sensible a tratamiento médico convencional o con complicaciones motrices. Las complicaciones más comúnmente reportadas en el período intra- y post-quirúrgico son procedimiento abortado, conductores mal colocados, hemorragia intracraneal, ataques y complicaciones de elementos físicos, mientras que en el período a largo plazo, los síntomas pueden incluir disfunción cognoscitiva de alto nivel, problemas psiquiátricos y problemas de lenguaje sutiles. Por supuesto, este método de terapia sería mejorado al ser aptos de apuntar a tipos de células específicas dentro de una región dada para evitar estos efectos secundarios. En una modalidad, las proteínas sensibles a la luz activan específicamente circuitos dopaminérgicos .

En otro aspecto específico, las composiciones y métodos de esta invención son utilizados para tratar epilepsia y ataques. La epilepsia es una alteración neurológica que es frecuentemente caracterizada por ataques. Estos ataques son signos y/o síntomas transitorios debido a la actividad neuronal anormal, excesiva o asincrona en el cerebro. Más del 30% de gente con epilepsia no tienen control de ataques aún con las mejores medicaciones disponibles. La epilepsia no es una alteración individual, sino más bien como un grupo de síndromes con síntomas vastamente divergentes pero todos involucran actividad eléctrica anormal episódica en el cerebro. La estimulación del cerebro profunda aguda (DBS) en varios núcleos talámicos y estructuras de lóbulo temporal medias han mostrado recientemente ser eficaz en estudios piloto pequeños. Hay poca información basada en la evidencia en cuanto a los objetivos racionales y parámetros de estimulación. DBS amigdalohipocampal ha producido una disminución significativa de conteos de ataques y anormalidades de EEG interictales durante el seguimiento a largo plazo. Los datos estudios piloto sugieren que DBS crónico para epilepsia puede ser un procedimiento factible, efectivo y seguro. Otra vez, al ser aptos de apuntar genéticamente la activación a subconjuntos específicos de células mejoraría la calidad de la terapia también como minimizaría efectos secundarios globales. En modalidades específicas, las proteínas sensibles a la luz son utilizadas para alterar la actividad eléctrica asincrona que conduce a ataques en estas áreas del cerebro profundas.

En otro aspecto, las composiciones y métodos de esta invención son utilizados para efectuar la liberación estimulada por la luz de depósitos de fármaco o vacuna implantados para la prevención, tratamiento y mejora de enfermedades.

En otro aspecto, las composiciones y métodos de esta invención son utilizados para tratar enfermedad neurodegenerativa seleccionada de pero no limitada a alcoholismo, enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, ataxia telangiectasia, enfermedad de Batten (también conocida como enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten) , encefalopatía espongiforme bovina (BSE) , dolor crónico, enfermedad de Canavan, síndrome de Cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Huntington, demencia asociada a HIV, enfermedad de Kennedy, enfermedad de Krabbe, demencia de cuerpo de Lewy, enfermedad de Machado-Joseph (ataxia espinocerebelar tipo 3), esclerosis múltiple, atrofia sistémico múltiple, narcolepsia, neuroborreliosis, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher , enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedades de Prion, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Schilder, degeneración combinada subaguda de médula espinal secundaria a anemia perniciosa, esquizofrenia, enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sj ogren-Batten (también conocida como enfermedad de Batten) , ataxia espinocerebelar (múltiples tipos con características variadas) , atrofia muscular espinal, enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski y Tables dorsalis.

En otro aspecto, las composiciones y métodos de esta invención son utilizados para tratar una enfermedad de neurodesarrollo seleccionada de pero no limitada a alteración de hiperactividad de déficit de atención (ADHD) , alteración de déficit de atención (ADD) , esquizofrenia, alteración obsesivo-compulsiva (OCD) , retardo mental, alteraciones de espectro autístico (ASD) , perlesía cerebral, síndrome de Fragile-X, síndrome de Down, Síndrome de Rett, síndrome de Asperger, síndrome de Williams-Beuren, alteración desintegrativa de la niñez, alteración de articulación, discapacidades de aprendizaje (esto es, lectura o aritmética) , dislexia, alteración de lenguaje expresivo y alteración de lenguaje receptor-expresivo mezclado, aptitud verbal o de desempeño.

Enfermedades que pueden resultar de procesos de neurodesarrollo aberrantes pueden también incluir, pero no están limitadas a: alteraciones bipolares, anorexia, depresión general, ataques, alteración obsesiva compulsiva (OCD) , ansiedad, bruixismo, síndrome de Angleman, agresión, ira explosiva, auto-lesión, estrés post-traumático, alteraciones de conducta, alteración de Tourette, alteración de movimiento estereotípico, alteración del estado de ánimo, apnea de sueño, síndrome de piernas sin reposo, tartamudez, alteración de personalidad paranoide, alteración de personalidad esquizoide, alteración de personalidad esquizotipal, alteración de personalidad antisocial, alteración de personalidad de línea de frontera, alteración de personalidad histriónica, alteración de personalidad narcisista, alteración de personalidad esquiva, alteración de personalidad dependiente, alteración de anexión reactiva; alteración de ansiedad de separación; alteración desafiante oposicional; dispareunia, piromanía, cleptomanía, tricotilomanía, juego, pica, alteraciones neuróticas, alteraciones relacionadas con el alcohol, alteraciones relacionadas con anfetamina, alteraciones relacionadas con cocaína, abuso de - marihuana, alteraciones relacionadas con opioides, abuso de penicilina, alteración de uso de tabaco, bulimia nervosa, alteración delusional, alteraciones sexuales, fobias, alteración de somatización, enuresis, encopresis, alteración de expresión escrita, alteración de lenguaje expresivo, retardo mental, alteración de matemáticas, alteración de tic transitorio, marcha lenta, mutismo selectivo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome de sobrecrecimiento bacteriano, intolerancia a carbohidratos, psilosis celiaca, infección e infestación, linfangiectasia intestinal, síndrome de intestino corto, psilosis tropical, enfermedad de Whipple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, ALS, atrofias musculares espinales y enfermedad de Huntington. Ejemplos adicionales, discusión e información en cuanto a alteraciones de neurodesarrollo se pueden encontrar, por ejemplo, a través de la Rama de alteraciones de neurodesarrollo del Instituto Nacional de Salud Mental (dirección de sitio web mundial nihm.nih.gov/dptr/b2-nd.cfm). Información adicional en cuanto a alteraciones de neurodesarrollo también se puede encontrar, por ejemplo, en Developmental Disabilities in Infancy and Childhood: Neurodevelopmental Diagnosis and Treatment, Capute and Accardo, eds . 1996, Paul H Brookes Pub Co.; Hagerman, Neurodevelopmental Disorders: Diagnosis and Treatment, 1999, Oxford Univ Press; Handbook of Neurodevelopmental and Genetic Disorders in Children, Goldstein and Reynolds, eds., 1999, Guilford Press; Handbook of Neurodevelopmental and Genetic Disorders in Adults, Reynolds and Goldstein, eds., 2005, Guilford Press; y Neurodevelopmental Disorders, Tager-Flusberg, ed., 1999, MIT Press.

Determinación de Terapia Los efectos de terapia de acuerdo con la invención como se describe en la presente pueden ser determinados de una variedad de maneras, utilizando métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, la visión del sujeto puede ser probada de acuerdo con métodos convencionales. Tales métodos convencionales incluyen, pero son están limitados necesariamente a electroretinograma (ERG) , ERG focal, pruebas de campos visuales, pruebas de agudeza visual, tomografia de coherencia ocular (OCT) , fotografía de fondo, potenciales evocados visuales (VEP) y pupilometría . En otras modalidades, el sujeto puede ser determinado conductualmente. En general, la invención provee el mantenimiento de la visión de un sujeto (por ejemplo, prevención o inhibición de pérdida de visión de pérdida de visión adicional debido a degeneración de fotoreceptor ) , disminuye el inicio o avance de pérdida de visión, o en algunas modalidades, provee visión mejorada en relación con la visión del sujeto antes de la terapia.

Métodos de Administración Los vectores de administración genética de la presente invención pueden ser administrados al ojo a través de una variedad de rutas. Pueden ser administrados intraocularmente, mediante aplicación tópica al ojo o mediante inyección intraocular a, por ejemplo el espacio ínter-fotoreceptor vitreo (inyección intravitrea) o sub-retinal (inyección sub-retinal) . Alternativamente, pueden ser administrados localmente mediante inserción o inyección al tejido que rodea el ojo. Pueden ser administrados sistémicamente por medio de una ruta oral o mediante inyección subcutánea, intravenosa o intramuscular. Alternativamente, pueden ser administrados por medio de un catéter o por medio de un implante, en donde tal implante es fabricado de un material poroso, no poroso o gelatinoso, en los que se incluyen membranas tales como membranas silásticas o fibras, polímeros biodegradables o material proteináceo. El vector de administración genético puede ser administrado antes del inicio de la condición, para impedir su presencia, por ejemplo, durante cirugía en el ojo o inmediatamente después del inicio de la condición patológica o durante la presencia de una condición aguda o protractada.

En otra modalidad la membrana limitante interna (ILM) es rota para efectuar la administración. La ILM es la frontera entre la retina y el cuerpo vitreo, formada por astrocitos y la pata del extremo de células de uller. Tanto en primates no humanos y humanos, la ILM es gruesa y provee una barrera sustancial a la retina. Por supuesto, utilizando inyecciones intravítreas , la mayoría de las partículas virales son incapaces de transducir células retínales. En una modalidad, para mejorar la eficiencia de transducción, se lleva a cabo un I pelado de ILM que comprende llevar a cabo un procedimiento quirúrgico que comprende el pelado de una parte pequeña de la ILM. En otra modalidad, para mejorar la eficiencia de transducción, la barrera de ILM puede ser parcial o completamente rota que comprende utilizando técnicas enzimáticas y una o más enzimas.

En una modalidad, la ILM es mantenida para limitar el efecto terapéutico de la proteina sensible a la luz a la mácula. En otra modalidad, el procedimiento de pelado de ILM y/o el procedimiento de digestión enzimática de ILM, ambos descritos en la presente, es usado para obtener una distribución más amplia de la proteina sensible a la luz.

El vector de administración genética puede ser ' modificado para mejorar la penetración de la barrera sangre- retinal. Tales modificaciones pueden incluir incrementar la lipofilicidad de la formulación farmacéutica en la cual se provee el vector de administración genética.

El vector de administración genética puede ser administrado solo o en combinación, y puede ser administrado junto con un ^vehículo aceptable farmacéuticamente. Idealmente, tal vehículo mejoraría la estabilidad y/o propiedades de administración. La invención también provee composiciones farmacéuticas que contienen el factor o fragmento activo o derivado del mismo, que puede ser administrado utilizando un vehículo apropiado tal como liposomas, micropartículas o microcápsulas . En varias modalidades de la invención, puede ser útil usar tales composiciones para obtener la liberación sostenida del componente activo.

La cantidad de vector de administración genética (por ejemplo, el número de partículas virales), y la cantidad de proteina sensible a la luz expresada, efectiva en el tratamiento de una alteración o condición particular puede depender de la naturaleza de la alteración o condición y una variedad de factores específicos del paciente, y puede ser determinada mediante técnicas clínicas estándar.

En una modalidad, los vectores de administración genética son administrados al ojo intraocularmente a una variedad de sitios dentro del ojo dependiendo del tipo de enfermedad a ser tratada, impedida o inhibida y la extensión de la enfermedad. Ejemplos de sitios apropiados incluyen la retina (por ejemplo, para enfermedades retínales) , el vitreo u otros sitios en o adyacentes a la retina o en o adyacentes al ojo.

La retina- humana está organizada en un mosaico bastante exacto. En la fóvea, el mosaico es un empaque hexagonal de conos. Fuera de la fóvea, los bastones rompen el empaque hexagonal estrecho de los conos pero todavía permiten una arquitectura organizada con conos en lugar de rodeados espaciados igualmente por anillos de bastones. Así, en términos de densidades de las diferentes poblaciones de fotoreceptor en la retina humana, es claro que la densidad de cono es más alta en el fozo foveal y cae rápidamente fuera de la fóvea a una densidad bastante igual a la retina periférica (véase Osterberg, G. (1935) Topography of the layer of rods and cones in the human retina. Acta Ophthal. (suppl. ) 6,1-103 ; véase también Curcio, C. A. , Sloan, K. R., Packer, 0., Hendrickson, A. E. and Kalina, R. E. (1987) Distribution of cones in human and monkey retina: individual variability and radial asymmetry. Science 236,579-582).

El acceso a porciones deseadas de la retina, o a otras partes del ojo se puede llevar a cabo fácilmente por aquel de habilidad en el arte (véase, en general Medical and Surgical Retina: Advances, Controversies , and Management, Hilel Lewis, Stephen J. Ryan, Eds . , medical- "illustrator, Timothy C. Hengst. St . Louis: Mosby, cl994. xix, 534; see also Retina, Stephen J. Ryan, editor in chief, . 2nd ed. , St. Louis, Mo.: Mosby, cl994. 3 v. (xxix, 2559).

En una modalidad, la cantidad del vector viral especifico aplicado a la retina es uniformemente pequeño ya que el ojo es una estructura relativamente contenida y el agente es inyectado directamente al mismo. La cantidad de vector que necesita ser inyectado es determinada por la ubicación infraocular de las células escogidas apuntadas para tratamiento. El tipo de célula a ser transducida puede ser determinada por la entidad de enfermedad particular que es tratada.

Por ejemplo, un solo volumen de 20 microlitros (por ejemplo, que contiene aproximadamente 1013 títulos de partículas físicas/ml de rAAV) puede ser usado en una inyección sub-retinal para tratar la mácula y fóvea de un humano ojo. Una inyección más grande de 50 a 100 microlitros puede ser usada para administrar el rAAV a una fracción sustancial del área retinal, quizás a toda la retina dependiendo de la extensión del esparcimiento lateral de las partículas.

Una inyección de 100 microlitros puede proveer varios millones de partículas de rAAV activas en el espacio sub-retinal. Este cálculo está basado en un título de 1013 partículas físicas por mililitro. De este título, se estima que 1/1000 a 1/10,000 de las partículas de AAV son infecciosas. La anatomía retinal restringe el volumen de inyección posible en el espacio sub-retinal (SRS) . Suponiendo un máximo de inyección máximo de 100 microlitros, esto podría proveer un título infeccioso de 105 a 109 rAAV en el SRS. Esto tendría el potencial de infectar todos de los aproximadamente 150 x 106 fotoreceptores en toda la retina humana con una sola inyección.

Volúmenes de inyección más pequeños aplicados focalmente a la fóvea o mácula pueden transfectar apropiadamente toda la región afectada por la enfermedad en el caso de degeneración macular u otras retinopatías regionales.

Dependiendo de la aplicación, por lo menos 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, o más í partículas pueden ser administradas al tejido de- interés.

Los vectores de administración genética pueden alternativamente ser administrados al ojo mediante inyección intraocular al vitreo, por ejemplo, para tratar pérdida glaucomatosa de células de ganglio retinal por medio de apoptosis. En el tratamiento de glaucoma, las células objetivo primarias a ser transducidas son las células de ganglio retinal, la células retínales principalmente afectadas. En tal modalidad, el volumen de inyección del vector de administración genética podría ser sustancialmente más grande, ya que el volumen no es restringido por la anatomía del espacio sub-retinal. Dosificaciones aceptables en esta instancia puede fluctuar de aproximadamente 25 microlitros a 1000 microlitros.

Composiciones Farmacéuticas Los vectores de administración genética pueden ser preparados como una composición aceptable farmacéuticamente apropiada para administración. En general, tales composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad de un vector de administración genética apropiado para administración del polinucleótido que codifica proteína sensible a la luz a una célula del ojo para expresión de una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína sensible a la luz, combinada con un portador o excipiente aceptable farmacéuticamente. Preferiblemente,- el portador aceptable farmacéuticamente es I apropiado para administración intraocular. Portadores aceptables farmacéuticamente ejemplares incluyen, pero no están limitados necesariamente a solución salina o una solución salina de pH regulado (por' ejemplo, solución salina de pH regulado de fosfato.

Varios excipientes aceptables farmacéuticamente son bien conocidos en el arte. Como se usa en la presente, "excipiente aceptable farmacéuticamente" incluye cualquier material que, cuando es combinado con un ingrediente activo de una composición, permite que el ingrediente retenga actividad biológica, preferiblemente sin provocar reacciones disruptivas con el sistema inmune del sujeto o afectar adversamente los tejidos que rodean al sitio de administración (por ejemplo, dentro del ojo) .

Portadores farmacéuticamente ejemplares incluyen soluciones acuosas estériles de soluciones no acuosas, suspensiones y emulsiones. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a cualquiera de los excipientes farmacéuticos estándar tales como una solución salina, solución salina de pH regulado (por ejemplo, solución salina de pH regulado de fosfato) , agua, emulsiones tales como emulsión aceite/agua y varios tipos de agentes humectantes.

Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, ácido hialurónico, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo.

Portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, en los que se incluyen solución salina y medios de pH regulado. Vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer lactada o aceites fijos. Vehículos intravenosos pueden incluir fluido y reabastecedores de nutrientes, reabastecedores de electrolitos (tales como aquellos a base de dextrosa de Ringer) y los semejantes.

Una composición del vector de administración genética de la invención puede también ser liofilizada utilizando medios bien conocidos en el arte, para reconstitución subsecuente y uso de acuerdo con la invención. En donde el vector va a ser administrado sin ser encapsulado en una partícula viral (por ejemplo, como polinucleótido "descubierto") , las formulaciones para administración liposomal y formulaciones que comprenden polinucleótidos microencapsulados pueden también ser de interés .

Composiciones que comprenden excipientes son formuladas mediante métodos convencionales bien conocidos (véase, por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, Chapter 43, 14th Ed., Mack Publishing Col, Easton PA 18042, USA) .

En general, las composiciones farmacéuticas pueden ser preparadas en varias formas, preferiblemente una forma compatible con la administración intraocular. Agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsificantes, sales para hacer variar la presión osmótica o soluciones reguladoras para asegurar un valor de pH apropiado pueden también opcionalmente estar presentes en la composición farmacéutica.

La cantidad de vector de administración genética en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, esto es, de menos de aproximadamente 0.1%, usualmente en o por lo menos aproximadamente 2% a tanto como 20% a 50% o más en peso, y puede ser seleccionado principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado.

La composición farmacéutica puede comprender otros agentes apropiados para administración, tales agentes pueden tener actividades farmacológicas similares o adicionales a la proteina sensible a la luz a ser administrada (por ejemplo, ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos) .

Kits La invención también provee kits que comprenden varios materiales para llevar a cabo los métodos de la invención. En una modalidad, el kit comprende un vector que codifica un polipéptido de proteina sensible a la luz (por ejemplo, ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos) , tal vector es apto para administración a un sujeto, particularmente el ojo del sujeto, y apto para proveer la expresión del polipéptido sensible a la luz en una célula del ojo, particularmente una célula mamifera. El kit puede comprender el vector, en un frasco estéril, que puede ser marcado para uso. El vector puede ser provisto en una composición farmacéutica. En una modalidad, el vector es empacado en un virus . El kit puede comprender además una aguja y/o jeringa apropiado para uso con el frasco o, alternativamente, que contiene el vector, tal aguja y/o jeringa son preferiblemente estériles. En otra modalidad, el kit comprende un catéter apropiado para administración de un vector al ojo, tal catéter puede ser anexado opcionalmente a una jeringa para administración del vector. Los equipos pueden comprender además instrucciones para uso, por ejemplo instrucciones con respecto a la ruta de administración, dosis, régimen de dosificación, sitio de administración y los semej antes .

Dispositivos Los datos de la Figura 12C demuestran que la administración de proteínas sensibles a la luz puede funcionar I en el intervalo de visión normal. En algunas modalidades, para mayor eficacia, se puede usar un dispositivo interno o externo. En una modalidad, un dispositivo externo, tales como gafas, pueden ser usados para la generación y/o amplificación de luz. En modalidades en donde un sujeto que tiene visión parcial es tratado, esto es, tratamiento de un sujeto cuyos fotoreceptores están solo parcialmente dañados y una proteina sensible a la luz tal como ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos va a ser administrada, la estimulación puede ser ajustada de tal manera que los fotoreceptores sobrevivientes y/o saludables no sean cancelados por el dispositivo de generación/amplificación de luz. En varias modalidades, la cancelación limitante del dispositivo dé generación/amplificación de luz puede ser obtenida al i) estimular igualmente, pero protegiendo a las células fotoreceptores sobrevivientes o saludables de la luz brillante por medio de lentes para el sol parciales tipo lentes de contacto implantados o externos (tinte sobre fotoreceptores, área clara sobre traducción de proteina sensible a la luz); ii) ajuste de la intensidad de estimulación para coincidir con el tipo de células que son estimuladas; o iii) ajuste de la estimulación para estar cerca de la parte .superior del intervalo dinámico visual.

En una modalidad, un dispositivo generador de luz I interno es implantado.

En otra modalidad, un elemento óptico protector o una barra tipo lente de contacto es implantada ya sea en conjunción con o independiente del dispositivo. En una. modalidad especifica, tal elemento óptico o lente de contacto protege los fotoreceptores de la estimulación de luz. En una modalidad especifica, la lente comprende tinte sobre fotoreceptores , y área clara sobre transducción de proteína sensible a la luz.

En algunas modalidades, se utiliza un dispositivo o aparato para los ojos externo montado en la cabeza. En ciertas modalidades, en donde el elemento sensible a la luz no es disparado a la extensión deseada por la luz natural o luz ambiental, una fuente de producción o generación de luz adicional tal como un sistema de arreglo de LED/láser es provisto. En ciertas modalidades, el aparato para los ojos externo puede incluir adicionalmente una cámara y una unidad de procesamiento de imagen para la filtración, mejora, procesamiento y resolución de las imágenes presentadas. La Figura 13 ilustra un dispositivo semejante a gafas con un elemento de protección de luz asociado (sistema de arreglo de LED/láser) que puede disparar la expresión de proteínas sensibles a la luz.

En una modalidad, un sistema de cámara ejemplar comprendería por lo menos tres componentes principales: 1) Una cámara pequeña integrada a las gafas, 2) una unidad de procesamiento de imagen, y 3) un sistema de administración de luz que incluye ya sea uno u otro o ambos del sistema de LED o sistema de láser. La cámara podría ser ya sea una cámara de una sola lente o un sistema de cámara doble que podría proveer potencialmente formación de imagen binocular e información de profundidad. La cámara podría capturar ya sea luz visual o luz infrarroja. La cámara podría ser ya sea adaptable a varias condiciones de iluminación o podría ser fija. La unidad de procesamiento de imagen (IPU) podría proveer cualquier número de transformaciones de señal en las que se incluyen amplificación, contraste incrementado o disminuido, estructura de movimiento, mejora de borde o filtración temporal (esto es, integración) . Adicionalmente, algoritmos de saliencia podrían ser empleados de tal manera que solamente ciertos objetos dentro del campo de visión son mejorados (por ejemplo, carros móviles, puertas) y objetos menos importantes (por ejemplo, nubes), son filtradas. El sistema de LED y/o sistema de arreglo de iluminación de láser podría contener un arreglo de LED de alta densidad o un sistema de láser de barrido que consiste ya sea de uno u otro (1) o más láseres. La posición de la luces podría ser ya sea fija o se podría mover. Por ejemplo, la orientación de las luces en relación con el ojo se podría mover como función del movimiento del ojo, utilizando un dispositivo de rastreo de movimiento del ojo como entrada. Esto es ilustrado en la Figura 13.

En otra modalidad ejemplar relacionada, un dispositivo de intensificación de imagen, tales como aquellos provistos por Telesensory (http://www.telesensory.com), puede ser combinado con un dispositivo de exploración retinal (RSD) tal como es desarrollado por Microvision (http://www.microvision.com/milprod.html), para proveer un aparato usado en la cabeza apto de administrar una imagen brillante, intensificada, directamente a la retina de un paciente con visión deteriorada. Brevemente, un RSD proyecta imágenes sobre la retina, de tal manera que el individuo puede ver una imagen de pleno movimiento grande, sin la necesidad de pantallas o monitores adicionales. Asi, al proyectar una imagen intensificada directamente sobre la retina de un individuo con visión deteriorada, puede ser posible mejorar la visión en aquellos considerados ciegos o casi ciegos.

En tanto que algunas modalidades de la presente invención han sido mostradas y descritas en la presente, será obvio para aquellos experimentados en el arte que tales modalidades son provistas a manera de ejemplo solamente. Numerosas variaciones, cambios y sustituciones se les presentarán ahora a aquellos experimentados en el arte sin desviarse de la invención. Se debe entender que varias alternativas a las modalidades de la invención descritas en la presente pueden ser empleadas en la práctica de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Métodos de Inyección Todos los procedimientos- en animales fueron manipulados de acuerdo con la declaración para el uso de , animales en investigación oftálmica y de visión de la Asociación de Investigación en Visión y Oftalmología y las directrices del Comité del Cuidado y Uso de Animales Institucional en la Universidad de Florida.

Para las inyecciones intravítreas, los ratones fueron anestesiados con quetamina (72 mg/kg) /xilazina (4 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal . Enseguida de la anestesia, una jeringa de Hamilton equipada con una aguja biselada calibre 33 fue utilizada. La aguja se hizo pasar a través de la esclera, en el ecuador, próximo al limbo, a la cavidad vitrea. La inyección ocurrió con observación directa de la aguja en el centro de la cavidad vitrea. El volumen total administrado fue de 1.5 µ?, que contiene diferentes concentraciones de los vectores de AAV probados.

Para inyecciones sub-retinales, una hora antes de la anestesia, los ojos de ratones fueron dilatados con gotas para los ojos de atropina al 1%, seguido por administración tópica de fenilefrina al 2.5%. Luego los ratones fueron anestesiados con quetamina (72 mg/kg) /xilazina (4 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal. Se hizo una abertura dentro de la pupila a través de la córnea con una aguja desechable de calibre 30 1/2 i y una aguja embotada sin biselar calibre 33 en una jeringa de Hamilton fue introducida a través de la abertura corneal al espacio sub-retinal y 1.5 µ? de AAV fueron administrado.

Los títulos típicos de los vectores de AAV fueron de entre 1.3xl012 y 3.0xl013.

Ejemplo 2: Selección en cuanto a Serotipos de AAV 1, 2, 5, 7, 8, y 9 para Transducción de Células Bipolares Retínales La selección de vectores virales conocidos y caracterizados para transducción óptima de células bipolares retínales se llevó a cabo. Los serotipos de AAV 1, 2, 5, 7, 8 y 9 que portan proteína fluorescente verde (GFP) fueron inyectados subretinalmente de manera individual en ratones rdl de 4 semana de edad. Los ratones homozigos rdl portan una mutación rdl y degeneración de fotoreceptor. de bastón en estos ratones comienza alrededor del día postnatal (P)10 y es casi completa por P21. GFP fue colocado bajo el control del promotor específico de tipo sin célula fuerte CBA (fusión del mejorador prematuro inmediato CMV y el promotor de beta-actina bovino más unión de intronl-exonl ) . 1 mes más tarde, los ratones fueron probados en cuanto a expresión de GFP. La doble marcación con el anticuerpo PKC de ratones inyectado con AAV7 demostró que las células transducidas fueron más probablemente fotoreceptores residuales (sin segmento externo) en lugar de células bipolares. Inyecciones subretinales con AAV7 fueron luego efectuadas en ratones en 8 semana de edad, en donde hubo menos probabilidad de fotoreceptores residuales. Se encontró que AAV7 fue altamente efectivo en la transducción de células bipolares retínales, conduciendo a expresión de GFP en por lo menos 75% de todas las células bipolares después de una sola inyección (Figura 9) . Estas imágenes fueron obtenidas 16 semanas después de la inyección, que muestran adicionalmente que la expresión de GFP utilizando un mecanismo de administración de AAV7 es estable por al menos 4 meses. AA7 es un serotipo que puede ser utilizado para transducir células bipolares de una manera efectiva y estable.

Ejemplo 3 : Transducción de Células Bipolares Retínales con Serotipos AAV5 , AAV2 Y444F Mutante, y AAV8 Y733F Mutante Como se ilustra en la Figura 10, los ratones fueron inyectados subretinalmente (ojo derecho) e intravitreamente (ojo izquierdo) con 1.5 µ? de virus adeno-asociado (AAV) de serotipos diferentes. Los serotipos probados incluía AAV2, AAV5, y AAV8, todos los cuales son serotipos tipo silvestre tradicionales. Adicionalmente, serotipos mutados de tirosina a fenilalanina individuales AAV2 Y444F mutante y AAV8 Y733F mutante, en donde 444 y 733 indican la ubicación de la mutación de tirosina puntual del cápsido viral, respectivamente. El virus contenía el constructo de ADN auto-complementario GRM6-ChR2-GFP, en donde GRM6 es la secuencia reguladora del receptor 6 de glutamato metabotrópico que impulsa la expresión especifica de célula en las células bipolares de Encendido (incluyendo bastón bipolar), ChR2 es el gen de proteina sensible a la luz terapéutica y GFP es el gen reportero.

Las imágenes en la Figura 10 muestran la expresión global de GFP (el gen reportero) . Esta expresión es mostrada como blanco en las imágenes en negro y blanco. Esto es indicador de la expresión global de ChR2 ya que el complejo de ChR2-GFP es una proteina fusionada. Nótese los ringuletes de expresión de GFP en la INL, que muestran la expresión del complejo de proteina ChR2-GFP es limitado por membrana. Estos datos muestran que la administración del constructo con un virus adeno-asociado conduce a la expresión robusta de ChR2-GFP en todos los 3 modelos de ratón de ceguera (rdl, rdl6, y rho -/-) . Esto es llevado a cabo con 3 serotipos diferentes utilizando una inyección sub-retinal (columna 1) . Cuando se usa un serotipo mutante de tirosina a fenilalanina, es posible obtener una buena expresión en células bipolares (INL) utilizando ya sea una inyección sub-retinal o intravitrea. Sin embargo, los serotipos tipo libre requieren una inyección sub-retinal para obtener la transducción razonable de células bipolares; las inyecciones intravitreas utilizando serotipos tipo silvestre no transducen efectivamente células bipolares (columna 2) .

Ejemplo 4: Creación de AAV7-GKM6-ChR2 para establecer Sensibilidad a la Luz en Células Bipolares de Encendido Retínales mGluR6 es un receptor de glutamato metabotrópico acoplado a proteína G que es, en la retina, expresado específicamente en células bipolares de Encendido (Tian 2006) . El virus adeno-asociado, serotipo 7 (AAV7), una secuencia de gen de fragmento de secuencia reguladora de mGluR6 (presentado en la Figura 6), GRM6, una canalrodopsina-2 , ChR2 fue construido para formar el constructo de AAV7-GRM6-ChR2. El cDNA que codifica ChR2 con eGFP fue clonado corriente abajo (esto es, 3' ) del promotor mínimo de fragmento-SV40 de secuencia reguladora de mGluR6. No se usó ningún IRES; ChR2 y GFP fueron fusionados. Este constructo de vector viral una vez administrado utilizando un mecanismo de administración viral, y expresado, puede establecer fotosensibilidad en células bipolares de Encendido retínales con alta resolución espacial y temporal. Este método puede restaurar la sensibilidad retinal a información óptica, utilizando la clase de ChR2 de moléculas activadas por luz para sensibilizar directamente neuronas retínales de repuesto a la luz.

I Ejemplo 5: AAV8 mutante Y733F-GRM6-ChR2 y AAV8 mutante Y446F-CBA-ChR2 para establecer Sensibilidad a la Luz en Células Bipolares de Encendido Retínales Utilizando una versión tirosina-mutada de AAV8 (en el sitio 733), bajo el control del promotor especifico de célula bipolar GRM6, en la configuración de auto-complementaria, fue posible restablecer la eficacia de comportamiento visual en ratones rdl, como se ilustra en las Figuras 11 y 12. La Figura 11 ilustra el análisis de la expresión de EGFP en secciones retínales congeladas mediante inmunohistoquímica a 1 mes enseguida de inyecciones sub-retinales con los vectores de AAV mutantes de tirosina. Secciones ejemplares que ilustran el esparcimiento e intensidad de fluorescencia de EGFP en toda la retina después de la transducción con serotipo 2 Y444 (a) o serotipo 8 Y733 (b) . Las imágenes están orientadas con el vitreo hacia el fondo y la capa fotoreceptora hacia la parte superior. La fluorescencia de EGFP en fotoreceptores, RPE y células de ganglios de células de ratón inyectadas subretinalmente con serotipo 2 Y444 (c) fluorescencia de EGFP en fotoreceptores, RPE y células de Müller después de la administración del serotipo 8 Y733; (d) Detección de proceso de células de Müller (rojo) mediante inmunoteñido ¦ con un anticuerpo de glutamina-sintetasa (GS); (e) imagen fusionada que muestra la co-localización de fluorescencia de EGFP (verde) y teñido de GS (rojo) en secciones retínales de ojos tratados con el serotipo 8 Y733; (f) Barra de calibración 100 µ?. gcl, capa de célula de ganglio; ipl, capa plexiforme interna; inl, capa nuclear interna; onl, núcleo externo; os, segmento externo; rpe, epitelio de pigmento retinal.

Utilizando una versión tirosina-mutada de AAV8 (en el sitio 446), bajo el control del promotor especifico sin células CBA (fusión del mej orador prematuro inmediato de CMV y el promotor de ß-actina bovino más unión de intronl-exonl , y ChR2), en la configuración auto-complementaria, la mayoría o todas las células bipolares pueden ser apuntadas y la función visual es restaurada como se ilustra en la Figura 12.

Ejemplo 6: AAV5-CBA-ChR2 para establecer Sensibilidad a la Luz en Células Bipolares de Encendido Retínales Utilizando el AAV5, el promotor no específico de tipo de célula CBA (fusión del mejorador prematuro inmediato de CMV y el promotor de ß-actina bovino más unión de intronl-exonl, y ChR2, en la configuración auto-complementaria, todas las células bipolares pueden ser apuntadas y la función y comportamiento visual es restaurada (Figura 12). Los ratones tratados fueron inyectados subretinalmente (ojo derecho) e intravítreamente (ojo izquierdo) con 1.5 µ? de virus adeno-asociados (AAV) de diferentes serotipos. Los serotipos probados incluían AAV2, AAV5, y AAV7, todos los cuales son serotipos tipo silvestres tradicionales. Adicionalmente, los serotipos mutados de tirosina a fenilalanina individuales AAV2 Y444F mutante y AAV8 Y733F mutante, en donde 444 y 733 indican la ubicación de la mutación de tirosina puntual del cápsido viral, respectivamente. El virus contenia el constructo de ADN auto-complementario GRM6-ChR2-GFP, en donde GRM6 es la secuencia reguladora que impulsa la expresión especifica de célula en las células bipolares de Encendido (incluyendo bastón bipolar), ChR2 es el gen de proteina sensible a la luz terapéutico, y GFP es el gen reportero.

Estos ratones fueron luego entrenados en una tarea de laberinto de agua. Figura 12A por 14 días (7 días para los ratones tipo silvestre) y el tiempo para encontrar el objetivo (una plataforma negra con una fuente de 4x6 LED) fue registrado. La Figura 12B muestra el tiempo promedio que tomó para que los ratones tratados, sin tratar y tipo silvestre encuentren el objetivo, como función de la sesión de entrenamiento. Ambos grupos sin tratar y tratados contenían muestras de los grupos rdl, rdl6, y rho -/- (diferentes modelos de ratón de ceguera que tienen diferentes tipos de mutaciones genéticas que conducen a una enfermedad de fotoreceptor) . Estos datos demuestran que los ratones tratados con ChR2 son aptos de aprender una tarea de comportamiento al utilizar información visual, sugiriendo que una proteína sensible a la luz tal como ChR2 tiene la habilidad para restaurar por lo menos alguna función visual. i El desempeño de los animales en la tarea fue luego evaluado a diferentes niveles de luz. La Figura 12C muestra el tiempo promedio que tomó para que los ratones rdl, rdl6, y rho -/- tratados, sham inyectados (los ratones sham inyectados representan un promedio de rdl, rdl6, y rho -/- sin tratar) , y ratones tipo silvestre para encontrar el objetivo, como función de la intensidad de luz. Estos datos muestran que los ratones tratados pueden efectuar la tarea a múltiples niveles de luz y su desempeño es dependiente de la cantidad de luz presentada.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ácido nucleico recombinante caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica una proteina sensible a la luz enlazada operativamente a una secuencia reguladora del receptor 6 de glutamato metabotrópico (mGluR6) o fragmento del mismo.

2. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteina sensible a la luz es seleccionada del grupo que consiste de ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos.

3. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteina sensible a la luz es ChR2 o una proteina sensible a la luz que es por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% idéntica a ChR2.

4. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento de secuencia reguladora de mGluR6 comprende menos de aproximadamente 1000, menos de aproximadamente 750, menos de aproximadamente 500, menos de aproximadamente 250 o menos de aproximadamente 100 pares de bases.

5. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia reguladora de mGluR6 o fragmento del mismo es un promotor o mejorador de mGluR6.

6. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado que comprende además una proteina fluorescente verde.

7. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico es encapsidado dentro de un virus adeno-asociado recombinante (AAV) .

8. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el virus adeno-asociado recombinante es de un serotipo seleccionado del grupo que -consiste de AAV1, AAV2, AAV3 , AAV4, AAV5, AAV6 , AAV7, AAV8 , AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 , e híbridos de los mismos.

9. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el virus adeno-asociado recombinante es de un serotipo seleccionado del grupo que consiste de AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, e híbridos de los mismos.

10. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1,. caracterizado porque el ácido nucleico es encapsidado dentro de un virus recombinante seleccionado del grupo que consiste de virus adeno-asociado recombinante (AAV) , retrovirus recombinante, lentivirus recombinante y poxvirus recombinante.

11. Un vector caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica una proteina sensible a la luz, el ácido nucleico es enlazado operativamente a una secuencia reguladora de receptor 6 de glutamato metabotrópico (mGluR6) o fragmento del mismo.

12. El vector de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la proteina sensible a la luz es seleccionada del grupo que consiste de ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos.

13. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la proteina sensible a la luz es ChR2 o una proteina sensible a la luz que es por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% idéntica a ChR2.

1 . El vector de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el fragmento de secuencia reguladora de mGluR6 es menor de aproximadamente 1000, menor de aproximadamente 750, menor de aproximadamente 500, menor de aproximadamente 250 o menor de aproximadamente 100 pares de bases.

15. El vector de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el fragmento de secuencia reguladora de mGluR6 es representado por la secuencia de la Figura 6.

16. El vector de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el vector comprende un virus adeno-asociado recombinante (AAV) .

17. El vector de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el vector comprende un virus recombinante seleccionado del grupo que consiste de virus adeno-asociado recombinante (AAV) , retrovirus recombinante, lentivirus recombinante y poxvirus recombinante.

18. El vector de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el AAV es de un serotipo seleccionado del grupo que consiste de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, e híbridos de los mismos .

19. El vector de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el AAV comprende proteína de cápsido mutada.

20. El vector de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la proteína de cápsido comprende un residuo de tirosina mutado.

21. El vector de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el residuo de tirosina mutado es seleccionado del grupo que consiste de Y252F, Y272F, Y444F, Y500F,' Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F y Y720F.

22. El vector de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la proteina de cápsido mutada comprende un residuo de tirosina mutado a una fenilalanina.

23. Un método para el tratamiento un sujeto que sufre de una enfermedad o alteración del ojo, caracterizado porque comprende introducir a un ojo afectado un virus adeno-asociado recombinante (AAV) que comprende una proteina sensible a la luz enlazada operativamente a una secuencia reguladora de receptor 6 de glutamato metabotrópico (secuencia reguladora de mGluR6) o fragmento del mismo.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la enfermedad o alteración del ojo es provocada por la degeneración de la célula del fotoreceptor.

25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la proteina sensible a la luz es seleccionada del grupo que consiste de ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos.

26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la proteina sensible a la luz es ChR2 o una proteina sensible a la luz que es por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% idéntica a ChR2.

27. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el fragmento de secuencia reguladora de mGluR6 es menor de aproximadamente 1000, menor de aproximadamente 750, menor de aproximadamente 500, menor de aproximadamente 250 o menor de aproximadamente 100 pares de bases .

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el fragmento de secuencia reguladora de mGluR6 es representado por la secuencia de la Figura 6.

29. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el AAV es de un serotipo seleccionado del grupo que consiste de AAVl, AAV2, AAV3, AAV , AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 , AAV10, AAV11, AAVl2 , e híbridos de los mismos.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el AAV comprende una proteína de cápsido mutada.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la proteína de cápsido comprende un residuo de tirosina mutado.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el residuo de tirosina mutado es seleccionado del grupo que consiste de Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F y Y720F.

33. El vector de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la proteina de cápsido mutada comprende un residuo de tirosina mutado a una fenilalanina .

34. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el AAV es introducido utilizando inyección intravitrea, inyección sub-retinal y/o pelado de ILM.

35. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el AAV es introducido a una célula bipolar retinal.

36. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el método comprende además utilizar un dispositivo generador de luz externo ai ojo.

37. Un método para expresar un ácido nucleico exógeno en una célula bipolar retinal, caracterizado porque comprende introducir a una retina un vector que comprende el ácido nucleico exógeno enlazado operativamente a una secuencia reguladora especifica de célula bipolar retinal, en donde el método da como resultado por lo menos aproximadamente una eficiencia de transducción de 25-30%.

38. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el método da como resultado en por lo menos aproximadamente una eficiencia de transducción de 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%.

39. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la eficiencia de transducción es I medida al cuantificar el número total de células bipolares retínales infectadas.

40. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el ácido nucleico exógeno comprende una proteína sensible á la luz.

41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la proteína sensible a la luz es seleccionada del grupo que consiste de ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos .

42. El ácido nucleico de conformidad . con la reivindicación 40, caracterizado porque la proteína sensible a la luz es- ChR2 o una proteína sensible a la luz que es por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% idéntica a ChR2.

43. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la secuencia reguladora comprende una secuencia reguladora de receptor 6 de glutamato metabotrópico (mGluR6) o un fragmento del mismo.

44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el fragmento de secuencia reguladora de mGluR6 es menor de aproximadamente 1000, menor de aproximadamente 750, menor de aproximadamente 500, menor de aproximadamente 250 o menor de aproximadamente 100 pares de bases .

45. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el fragmento de secuencia reguladora de mGluR6 es representado por la secuencia de la Figura 6.

46. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el ácido nucleico exógeno es introducido utilizando un vector viral adeno-asociado recombinante (AAV) .

47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el AAV comprende una proteina de cápsido mutada .

48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la proteina de cápsido comprende un residuo de tirosina mutado.

49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el residuo de tirosina mutado es seleccionado del grupo que consiste de Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F y Y720F.

50. El vector de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la proteina de cápsido mutada comprende un residuo de tirosina mutado a una fenilalanina .

51. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el ácido nucleico exógeno es introducido utilizando inyección intravitrea, inyección sub-retinal y/o pelado de ILM.

52. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el AAV es de un serotipo seleccionado del grupo que consiste de AAV1, AAV2 , AAV3, AAV , AAV5 , AAV6, AAV7, AAV8 , AAV9 , AAV10, AAV11, AAV12, e híbridos de los mismos .

53. Un método para introducir un ácido nucleico exógeno al núcleo de una célula retinal, caracterizado porque comprende introducir un vector que comprende un ácido nucleico exógeno enlazado operativamente a una secuencia reguladora específica de célula retinal a una célula retinal, en donde el vector está diseñado específicamente para evitar la degradación de proteína moderada por ubiquitina.

54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la degradación es moderada por proteasoma.

55. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el ácido nucleico exógeno comprende una proteína sensible a la luz.

56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la proteína sensible a la luz es seleccionada del grupo que consiste de ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de I los mismos .

57. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la proteina sensible a la luz es ChR2 o una proteina sensible a la luz que es por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% idéntica a ChR2.

58. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la célula retinal es una célula bipolar retinal.

59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la secuencia reguladora comprende una secuencia reguladora de receptor 6 de glutamato metabotrópico (mGluR6) o fragmento del mismo.

60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el. fragmento de mGluR6 es menor de 1000, 750, 500, 250 ó 100 pares de bases.

61. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el fragmento de secuencia reguladora de mGluR6 es representado por la secuencia de la Figura 6.

62. El método de conformidad con la · reivindicación 53, caracterizado porque el vector es seleccionado del grupo que consiste de virus adeno-asociado recombinante (AAV) , retrovirus recombinante, lentivirus recombinante y poxvirus recombinante.

63. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el vector es un vector viral adeno-asociado recombinante (AAV) .

64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el AAV es de un serotipo seleccionado del grupo que consiste de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4 , AAV5 , AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, e híbridos de los mismos .

65. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el AAV comprende una proteína de cápsido mutada.

66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la proteína de cápsido comprende un residuo de tirosina mutado.

67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque el residuo de tirosina mutado es seleccionado del grupo que consiste de Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F y Y720F.

68. El vector de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la proteína de cápsido mutada comprende un residuo de tirosina mutado a una fenilalanina .

69. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el vector es introducido utilizando inyección intravítrea, inyección sub-retinal y/o pelado de ILM.

70. Un método para la transducción de una célula bipolar retinal caracterizado porque comprende introducir a una retina un vector que comprende un ácido nucleico exógeno enlazado operativamente a una secuencia reguladora.

71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la secuencia reguladora es un promotor no especifico de tipo de célula.

72. El método . de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la secuencia reguladora es un promotor de polipéptido O de actividad activadora de proteina alfa de enlace de nucleótido de guanina (GNAOl) o una fusión de un mej orador prematuro inmediato de citomegalovirus (C V) y el promotor de ß-actina bovino más la unión de intronl-exonl (CBA, smCBA) .

73. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el ácido nucleico exógeno comprende una proteina sensible a la luz.

74. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque la proteina sensible a la luz es seleccionada del grupo que consiste de ChRl, ChR2, VChRl, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos/quimeras de ChRl-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina y variantes de los mismos.

75. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque la proteina sensible a i la luz es ChR2 o una proteina sensible a la luz que es por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% idéntica a ChR2.

76. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el vector es seleccionado del grupo que consiste de virus adeno-asociado recombinante (AAV) , retrovirus recombinante, lentivirus recombinante y poxvirus recombinante .

77. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el vector es un vector viral adeno-asociado recombinante (AAV) .

78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el AAV es de un serotipo seleccionado del grupo que consiste de AAV1, AAV2, AAV3 , AAV4 , AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, e híbridos de los mismos .

79. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el AAV comprende una proteína de cápsido mutada.

80. El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque la proteína de cápsido comprende un residuo de tirosina mutado.

81. El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque el residuo de tirosina mutado es seleccionado del grupo que consiste de Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F y Y720F.

82. El vector de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la proteina de cápsido mutada comprende un residuo de tirosina mutado a una fenilalanina .

83. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el vector es introducido utilizando inyección intravitrea, inyección sub-retinal y/o pelado de ILM.