ES2150595T5 - Procedimiento de preparacion de un vector viral de por lo menos 20 kb por recombinacion homologa intermolecular en una celula procariota. - Google Patents
Procedimiento de preparacion de un vector viral de por lo menos 20 kb por recombinacion homologa intermolecular en una celula procariota.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR EN UNA CELULA PROCARIOTICA UN VECTOR VIRAL RECOMBINANTE POR RECOMBINACION HOMOLOGA INTERMOLECULAR, UN PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR UNA PARTICULA INFECCIOSA QUE CONTIENE TAL VECTOR, ASI COMO UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE LOS COMPRENDE. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A SU USO TERAPEUTICO, PARTICULARMENTE EN EL MARCO DE LA TERAPIA GENICA APLICADA AL HOMBRE.
Description
Procedimiento de preparación de un vector viral
de por lo menos 20 KB por recombinación homóloga intermolecular en
una célula procariota.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para preparar un vector viral in vitro en una
célula procariota y su aplicación para producir una partícula viral
infecciosa destinada a un uso terapéutico y, en particular, a un uso
en terapia génica.
La posibilidad de tratar las enfermedades humanas
por terapia génica ha pasado en algunos años del estado de las
consideraciones teóricas al de las aplicaciones clínicas. El primer
protocolo aplicado al hombre ha sido iniciado de los Estados Unidos
en septiembre de 1990 sobre un paciente genéticamente
inmunodeficiente en razón de una mutación que afecta el gen que
codifica para la Adenina Desaminasa (ADA). El éxito relativo de
esta primera experimentación ha animado al desarrollo de nuevos
protocolos de terapia génica para diversas enfermedades genéticas o
adquiridas (enfermedades infecciosas y en particular virales como
el SIDA o cánceres). La gran mayoría de los protocolos descritos
hasta el presente utiliza unos vectores virales para transferir y
expresar el gen terapéutico en las células a tratar.
Actualmente, los vectores retrovirales están
entre los más utilizados debido a la simplicidad de su genoma. Sin
embargo, además de su capacidad restringida de clonado, presentan
dos inconvenientes principales que limitan su utilización
sistemática: por una parte, infectan mayoritariamente las células
en división y por otra parte, debido a su integración al azar en el
genoma de la célula huésped, el riesgo de mutagénesis de inserción
no es despreciable. Es por lo que numerosos equipos científicos se
han aplicado a desarrollar otros tipos de vectores, entre los
cuales se pueden citar los salidos de los adenovirus, virus
asociados a los adenovirus (AAV), poxvirus y virus del herpes. De
manera general, su organización y su ciclo de infección están
ampliamente descritos en la literatura accesible para el experto en
la materia.
A este respecto, el empleo de los vectores
adenovirales ha aparecido como una alternativa prometedora. Los
adenovirus han sido puestos en evidencia en numerosas especies
animales, tienen un amplio espectro de huésped, son poco patógenos y
no presentan los inconvenientes ligados a los retrovirus puesto que
se replican en las células quiescentes y son no integrativos. A
título indicativo, su genoma está constituido por una molécula de
ADN lineal y bicatenario de aproximadamente 36 kb que soportan más
de una treintena de genes, a la vez unos genes precoces necesarios
para la réplica viral (E1 a E4) y unos genes tardíos de estructura
(L1 a L5) (ver figura 1).
De manera general, los vectores adenovirales se
obtienen por deleción de por lo menos una parte de los genes
virales (en particular de la región E1 esencial para la réplica
viral) que son reemplazados por los genes terapéuticos. En
consecuencia, son propagados en una progenie celular, llamada de
complementación, que proporciona en trans las funciones
virales delecionadas para generar una partícula de vector viral
defectiva para la réplica pero capaz de infectar una célula
huésped. Se utiliza corrientemente la progenie 293, establecida a
partir de células de riñón embrionario humano, que complementa los
adenovirus defectivos para la función E1 (Graham et al.,
1977, J. Gen. Virol., 36, 59-72).
Las técnicas de preparación de los vectores
adenovirales están ampliamente descritas en la literatura (ver en
particular Graham y Prevec, Methods in Molecular Biology, Vol. 7;
Gene Transfer and Expression Protocols; Ed: E. J. Murray, 1991, The
Human Press Inc., Clinton, NJ). Uno de los procedimientos más
empleados consiste en generar el vector adenoviral recombinante en
las células de complementación transfectadas con un plásmido
bacteriano que soporta el gen de interés subclonado en el seno de su
región de inserción adenoviral y el genoma adenoviral.
Generalmente, este último es escindido por una enzima de
restricción apropiada a fin de reducir la infectividad del ADN viral
parental y aumentar la eficacia de aislamiento de los adenovirus
recombinantes. Sin embargo, se observa de todas maneras un ruido de
fondo importante de partículas virales infecciosas de origen
parental, lo que necesita un trabajo de análisis de las zonas
obtenidas particularmente pesado (desde un punto de vista de tiempo
y coste puesto que cada zona debe ser amplificada y analizada
individualmente). Esto es problemático cuando el virus parental
presenta una ventaja selectiva sobre el adenovirus recombinante,
por ejemplo cuando este último se replica más lentamente que el
virus parental, debido a la inserción de un gen de interés de gran
tamaño (Factor VIII, distrofina), que reduce por tanto su
probabilidad de obtención.
Puede emplearse también la ligadura entre dos
fragmentos de ADN generados por las técnicas clásicas de biología
molecular y que soportan respectivamente las partes 5' y 3' del
vector adenoviral recombinante. La transfección de la mezcla de
ligadura en las células de complementación permite en teoría
encapsidar el genoma del adenovirus recombinante para formar una
partícula infecciosa. Esta tecnología es poco eficaz y su aplicación
limitada por el número restringido de lugares de restricción
apropiados y únicos.
Se ha demostrado ahora que es posible generar en
Escherichia coli (E. coli) recBC sbcBC un vector adenoviral
recombinante por recombinación homóloga intermolecular entre un
plásmido que contiene el genoma de un adenovirus de tipo 5 y una
inserción que lleva una secuencia de ADN exógena rodeada de
secuencias adenovirales A y B (Figura 2). Este procedimiento
conduce al reemplazado en el genoma adenoviral de la región
apuntada situada entre A y B por la secuencia exógena. La
transfección del vector adenoviral recombinante así generada en una
progenie de complementación adecuada da lugar a una partícula viral
infecciosa que puede ser utilizada sin etapa previa de purificación
para infectar una célula huésped. El ruido de fondo (contaminación
por partículas virales parentales) está reducido, incluso
suprimido. Se ha encontrado de forma sorprendente que el uso de las
cepas de E. coli recBC sbcBC es particularmente ventajoso
para favorecer la recombinación intermolecular entre dos fragmentos
cualesquiera de ADN.
El procedimiento de la presente invención
descansa sobre la explotación de las actividades enzimáticas
endógenas de las células procariotas implicadas en la recombinación
homóloga, esta técnica de recombinación intermolecular había sido ya
descrita para el clonado de pequeñas inserciones en los vectores
bacterianos (Bubeck et al., 1993, Nucleic Acids Research,
21, 3601-3602) o para generar por
recombinación intramolecular unos genes híbridos (Calogero et
al., 1992, FEMS Microbiology Letters, 97,
41-44; Caramori et al., 1991, Gene.
98, 37-44). Sin embargo, esta tecnología de
recombinación no había nunca sido utilizada en unas células
procariotas para generar unos vectores virales infecciosos (capaces
de ser encapsidados en partículas virales infecciosas).
El procedimiento de la invención presenta la
ventaja sobre las técnicas anteriores de ser rápido,
particularmente eficaz y requerir pocas manipulaciones in
vitro. Además, puede ser utilizado con unos fragmentos de ADN
generados por PCR (Polymerase Chain Reaction) evitando así las
etapas de subclonado de la secuencia de ADN exógena en la región de
inserción del genoma viral. Finalmente, aporta una solución
ventajosa al problema de ruido de fondo claramente identificado en
la literatura. Por consiguiente, resulta particularmente rendible
para los vectores salidos de virus de gran tamaño o en los cuales se
prevé insertar una secuencia de ADN exógena de gran tamaño.
Es por lo que la presente invención tiene por
objeto un procedimiento para preparar en una célula procariota un
vector viral recombinante de por lo menos 20 kb, derivado de un
virus parental en el genoma el cual está insertada una secuencia de
ADN exógena, por recombinación intermolecular entre (i) un primer
fragmento de ADN que comprende todo o parte de dicho genoma del
virus parental y (ii) un segundo fragmento de ADN que comprende
dicha secuencia de ADN exógena rodeada de secuencias flanqueantes A
y B homólogas de (i), caracterizado porque la célula procariota se
deriva de una cepa de Escherichia coli recBC sbcBC.
Buckeck et al., Nucleic Acids Research,
vol. 21, nº 15, 25 julio 1993, páginas
3601-3602: "Rapid cloning by homologous
recombination in vivo", describen unas técnicas de
clonado que permiten obtener unos plásmidos recombinantes (vectores
de clonado) utilizables en el marco de técnicas de biología
molecular y que descansan en particular en la introducción en
dichos plásmidos de fragmentos de ADN de pequeños tamaños (que
varían de 0,3 a 1,8 kb). En la misma época, Oliver et al.,
Nucleic Acids Research, vol. 21, 1993, páginas
5192-5197 publicaban unos trabajos comparables y
reconocían que la eficacia del clonado de fragmentos de ADN salidos
de PCR era inversamente proporcional al tamaño de dichos
fragmentos.
La presente invención resulta particularmente
ventajosa cuando se trata de preparar un vector viral recombinante
de por lo menos 20 kb y más particularmente un vector que tiene un
genoma de una longitud de 80 a 120% de la del genoma del virus
salvaje correspondiente, en particular de 90 a 110% y,
preferentemente, de 95 a 105%.
En el sentido de la presente invención un vector
viral recombinante se obtiene a partir de un virus parental
modificado de manera para llevar en un lugar apropiado del genoma
viral y expresar una secuencia de ADN exógena. Los virus parentales
susceptibles de ser utilizados en el marco de la invención son, por
ejemplo, los alfavirus, los retrovirus, los poxvirus y en
particular los virus de la vacuna o el canaripox, los virus del
herpes, los virus asociados a los adenovirus (AAV) y muy
particularmente los adenovirus.
A este respecto, la elección del adenovirus
parental es muy amplia. Puede tratarse de un adenovirus de origen
humano, canino aviar, bovino, murino, ovino, porcino o de simio o
también de un adenovirus híbrido, que comprende unos fragmentos de
genoma adenoviral de diferentes orígenes. Se preferirán muy
particularmente un adenovirus de origen humano de serotipo C y
preferentemente un adenovirus de tipo 2 ó 5 o también un adenovirus
de origen animal de tipo CAV-1 ó
CAV-2 (canino), DAV (aviar) o también BAd (bovino).
Estos virus y sus genomas están descritos en la literatura (ver por
ejemplo Zakharchuk et al., 1993, Arch. Virol., 128,
171-176; Spibey y Cavanagh, 1989, J. Gen. Virol.,
70, 165-172; Jouvenne et al., 1987,
Gene, 60, 21-28; Mittal et al., 1995,
J. Gen. Virol., 76, 93-102).
Un procedimiento según la invención tiene por
objeto la preparación de un vector viral recombinante para la
transferencia y la expresión de una secuencia de ADN exógena en una
célula huésped. Por "secuencia de ADN exógena", se entiende un
ácido nucleico que comprende unas secuencias codificantes y unas
secuencias reguladoras que permiten la expresión de dichas
secuencias codificantes y en el cual las secuencias codificantes
son unas secuencias que no están normalmente presentes en el genoma
de un virus parental en uso en la presente invención o si lo están
en un contexto genómico diferente. En el marco de la invención, la
secuencia de ADN exógena puede estar constituida por uno o varios
genes. Las secuencias reguladoras pueden ser de orígenes
cualesquiera.
De manera preferida, la secuencia de ADN exógena
puede codificar para un ARN antisentido y/o un ARNm que será a
continuación traducido a proteína de interés. La misma puede ser de
tipo genómico, de tipo ADN complementario (ADNc) o de tipo mixto
(minigen, en el cual por lo menos un intrón está delecionado). La
misma puede codificar para una proteína madura, un precursor de una
proteína madura, en particular un precursor destinado a ser
secretado y que comprende por este hecho un péptido señal, una
proteína quimérica que proviene de la fusión de secuencias de
orígenes diversos o un mutante de una proteína natural que presenta
propiedades biológicas mejoradas o modificadas. Dicho mutante puede
obtenerse por mutación, deleción, substitución y/o adición de uno o
varios nucleótido(s) del gen codificante para la proteína
natural.
En el marco de la presente invención, puede ser
ventajoso utilizar:
- -
- los genes que codifican para unas citoquinas o unas limfoquinas, como los interferones \alpha, \beta y \gamma, las interleuquinas y en particular la IL-2, la IL-6 ó IL-10, los factores que necrosan unos tumores (TNF) y los factores estimuladores de colonias (CSF);
- -
- los genes que codifican para unos receptores celulares, como los receptores reconocidos por unos organismos patógenos (virus, bacterias, o parásitos), preferentemente por el virus VIH (Virus de la Inmunodeficiencia Humana), o los ligantes de receptores celulares;
- -
- los genes que codifican para las hormonas de crecimiento (HGF);
- -
- los genes que codifican para unos factores de coagulación, como el factor VIII y el factor IX;
- -
- el gen que codifica para la distrofina o la minidistrofina;
- -
- el gen que codifica para la insulina;
- -
- los genes que codifican para unos polipéptidos que intervienen directamente o indirectamente en los canales iónicos celulares, como la proteína CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator);
- -
- los genes que codifican para unos ARN antisentido o unas proteínas capaces de inhibir la actividad de una proteína producida por un gen patógeno, presente en el genoma de un organismo patógeno, o por un gen celular, cuya expresión esta desregulada, por ejemplo un oncógeno;
- -
- los genes que codifican para un inhibidor de proteasa como la \alpha 1-antitripsina o un inhibidor de una proteasa viral;
- -
- los genes que codifican para unas variantes de proteínas patógenas que han sido mutadas de manera que alteren su función biológica, como por ejemplo unas variantes transdominantes de la proteína TAT del virus VIH capaces de competición con la proteína natural para el enlace con la secuencia diana, impidiendo así la réplica del VIH;
- -
- los genes que codifican para unos epítopos antigénicos a fin de incrementar la inmunidad de la célula huésped;
- -
- los genes que codifican para unos polipéptidos que tienen propiedades anticancerosas y en particular unos supresores de tumores como la proteína p53;
- -
- los genes que codifican para las proteínas del complejo principal de histocompatibilidad de las clases I y II, así como los genes que codifican para las proteínas reguladoras de la expresión de estos genes;
- -
- los genes que codifican para unas enzimas celulares o producidas por unos organismos patógenos; y
- -
- los genes suicidas. Se puede citar más particularmente el gen de TK-HSV-1. La enzima TK viral presenta una afinidad netamente superior con respecto a la enzima TK celular para ciertos análogos de nucleósidos (como el aciclovir o el ganciclovir). La misma los convierte en moléculas monofosfatadas, a su vez convertibles por las enzimas celulares, en precursores de nucleótidos, que son tóxicos. Estos análogos de nucleótidos son incorporables en las moléculas de ADN en vía de síntesis, por tanto principalmente en el ADN de las células en estado de réplica. Esta incorporación permite destruir específicamente las células en división como las células cancerosas;
- -
- los genes que codifican para un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o una inmunotoxina,
- -
- los genes informadores como el gen Lac-Z, que codifica para la \beta-galactosidasa, o el gen luciferasa.
Esta lista no es limitativa y desde luego pueden
emplearse también otros genes.
Por otra parte, una secuencia de ADN exógena en
uso en la presente invención puede además comprender un gen no
terapéutico, por ejemplo un gen que codifica para un marcador de
selección que permite seleccionar o identificar las células
huéspedes transfectadas. Se puede citar el gen neo (que
codifica para la neomicina fosfotransferasa) que confiere
resistencia al antibiótico G418, el gen dhfr (Dihydrofolate
Réductase), el gen CAT (Chloramphenicol Acetyl transférase), el gen
pac (Puromycine Acétyl-Transferase) o también el
gen gpt (Xanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase).
Desde luego, un gen en uso en la presente
invención puede ser puesto bajo el control de elementos apropiados
para su expresión en una célula huésped. Por "elementos
apropiados", se entiende el conjunto de los elementos necesarios
para su transcripción en ARN (ARN antisentido o ARNm) y para la
traducción de un ARNm en proteína. Entre los elementos necesarios
para la transcripción, el promotor reviste una importancia
particular. Puede tratarse de un promotor constitutivo o de un
promotor regulable y puede ser aislado de un gen cualquiera de
origen eucariota o incluso viral. Alternativamente, puede tratarse
del promotor natural del gen en cuestión. De manera general, un
promotor en uso en la presente invención, puede ser modificado de
manera que contenga unas secuencias reguladoras. A título de
ejemplo de promotores tejidos-específicos, se pueden
citar los de los genes de inmunoglobulinas cuando se busca apuntar
la expresión en unas células de huéspedes limfocitarias y del gen
\alpha 1-antitripsina para una expresión
hígado-específica. Se pueden también mencionar los
promotores constitutivos del gen
TK-HSV-1 (thymidine kinase del
virus del herpes de tipo 1), del gen PGK (Phospho Glycerate kinase)
murino o humano, el promotor precoz del virus SV40 (Simian Virus
40), un LTR retroviral, o también el promotor adenoviral MLP, en
particular del adenovirus humano de tipo 2.
El procedimiento según la invención utiliza un
mecanismo de recombinación homóloga intermolecular. De manera
general, consiste en el intercambio de secuencias homólogas entre
dos fragmentos de ADN. Estas secuencias pueden ser idénticas o
substancialmente homólogas. En otros términos, el grado de homología
de las secuencias A y B con la parte correspondiente del primer
fragmento de ADN puede ser variable pero debe ser suficiente para
permitir la recombinación intermolecular. A los fines de la presente
invención, es preferible que sea superior a 70%, ventajosamente
superior a 80%, preferentemente superior a 90% y de manera
totalmente preferida en los alrededores del 100%. Además, una corta
región de homología puede ser suficiente (por lo menos 10
nucleótidos consecutivos comunes entre las secuencias A y B y sus
secuencias homólogas en el primer fragmento de ADN). En el marco de
la presente invención, la longitud de las secuencias A y B está
preferentemente comprendida entre 10 pb y 10 kb, ventajosamente 20
pb y 5 kb, preferentemente 30 pb y 2 kb y, de manera totalmente
preferida 40 pb y 1 kb.
Según un modo ventajoso, un procedimiento según
la invención conduce al reemplazado del material genético
localizado entre las secuencias del primer fragmento de ADN
homólogas de las secuencias A y B por la secuencia exógena. Este
intercambio intermolecular permite generar un vector viral
recombinante circular en forma de un vector procariota (plásmido,
cósmido o fago) que permite su manipulación y/o su propagación en la
célula procariota. Un modo de realización del mecanismo utilizado
en el marco de la presente invención se ilustra en la figura 2.
Aunque la región de inserción de la secuencia
exógena pueda estar situada en cualquier posición del genoma viral,
se prefieren evitar las regiones que actúan en cis
necesarias para la réplica. Estas últimas comprenden en particular
los LTRs 5' y 3' así como la señal de encapsidación en el caso de
los retrovirus y los ITRs 5' y 3' y la región de encapsidación
tratándose de los adenovirus. Se indica que la región de inserción
puede estar dirigida hacia unas posiciones variadas en función de
las secuencias homólogas A y B elegidas.
Como se ha indicado anteriormente, el primer
fragmento de ADN comprende todo o parte del genoma del virus
parental en uso en el marco de la invención. Puede tratarse del
genoma de un virus salvaje o del genoma de un virus derivante
modificado por deleción, adición y/o substitución de uno o varios
nucleótidos. En particular, puede ser delecionado de uno o varios
genes en totalidad o en parte.
El primer fragmento de ADN está preferentemente
incluido en un vector convencional. La elección de éste es muy
amplia, pero se puede citar más particularmente el pBR322, el p
poli II o también el p poli III*I (Lathe et al., 1987, Gene
57, 193-201). Según un modo de realización
ventajoso del procedimiento según la invención, el primer fragmento
de ADN está preferentemente linealizado a nivel de la región en la
cual se prevé apuntar la inserción. En particular, puede ser
escindido por una o varias enzimas de restricción cuyos lugares
están localizados entre las secuencias del primer fragmento de ADN
homólogas a las secuencias A y B, pero también a nivel de estas
últimas aunque este modo de realización no sea preferido. La
elección de los lugares de restricción a utilizar según el virus
parental considerado está al alcance del experto en la materia.
Ventajosamente, se preferirán utilizar unos lugares poco
representados en el primer fragmento de ADN y en particular únicos.
Por otra parte, dichos lugares pueden también ser creados por las
técnicas clásicas de mutagénesis dirigida.
El segundo fragmento de ADN en uso en la presente
invención lleva en particular la secuencia de ADN exógena rodeada
de las secuencias A y B implicadas en la recombinación
intermolecular. Se prefiere emplear un fragmento de ADN lineal.
Puede ser generado por PCR, cortado de un vector cualquiera o
producido por vía sintética o cualquier procedimiento convencional
en la técnica. A título de ejemplo, un segundo fragmento de ADN en
uso en el marco de la presente invención puede obtenerse por
amplificación de la secuencia de ADN exógena a partir de un vector
de la técnica anterior o de un banco genómico o de un ADNc adecuado
con la ayuda de iniciadores apropiados provistos en sus extremos 5'
de las secuencias A y B. Además, un segundo fragmento de ADN puede
también comprender unas secuencias plasmídicas en sus extremos 5' y
3', que puede eventualmente ser utilizadas a título de secuencias A
y B en la medida en que son homólogas de las secuencias plasmídicas
contenidas en el primer fragmento de ADN.
Según un modo de realización particular, un
procedimiento según la invención se utiliza para la preparación de
un vector viral recombinante defectivo para la réplica. Este
término designa un vector incapaz de acabar un ciclo infeccioso
autónomo en una célula huésped. Generalmente, el genoma de estos
vectores defectivos está desprovisto de uno o varios genes
esenciales para la réplica, genes precoces y/o genes tardíos. Pueden
ser delecionados en totalidad o en parte o hechos no funcionales
por mutación (adición, deleción y/o substitución de uno o varios
nucleótidos). A este respecto, un procedimiento según la invención
puede permitir la preparación de un vector adenoviral recombinante
desprovisto de todas o parte de las regiones E1, E2, E3 y/ó E4.
A título ilustrativo, se pueden citar los modos
de realización siguientes. Cuando se trata de preparar en una
célula procariota un vector adenoviral recombinante que deriva de
un adenovirus humano del tipo 5(Ad5) en el cual se prevé
insertar una secuencia de ADN exógena en lugar de la región E1, se
puede utilizar (i) un vector que comprende el genoma del Ad5
escindido por la enzima ClaI (lugar de restricción situado en
posición 918 del genoma Ad5 tal como el divulgado en el banco de
datos Genebank bajo la referencia M73260) y (ii) un fragmento de
ADN que comprende una secuencia A homóloga de la región de
encapsidación adenoviral, la secuencia de ADN exógena seguida de una
secuencia B homóloga de la secuencia que codifica para la proteína
pIX. Por otra parte, el uso de un vector que lleva el genoma
adenoviral escindido por la enzima SpeI (posición 27082 del
genoma Ad5) y de un fragmento de ADN que comprende una secuencia A
homóloga en el extremo 5' de la región E2, la secuencia de ADN
exógena y una secuencia B homóloga en el extremo 3' de la región E4
permitirá preparar un vector adenoviral recombinante en el cual la
secuencia de ADN exógena está insertada en el lugar de una región
E3. Desde luego, estos modos de realización particulares sólo se
citan a título de ejemplos. Finalmente, el procedimiento según la
invención puede ser utilizado para introducir unas deleciones,
mutaciones y/o substituciones en una región particular de un genoma
viral.
Según otro modo de realización, un procedimiento
según la invención puede también emplearse para insertar por lo
menos dos fragmentos de ADN en el seno del genoma viral, por
recombinación intermolecular entre (i) un primer fragmento de ADN
que comprende todo o parte de dicho genoma del virus parental, (ii)
un segundo fragmento de ADN que comprende una primera parte de dicha
secuencia de ADN exógena provista en su extremo 5' de dicha
secuencia flanqueante A y (iii) un tercer fragmento de ADN que
comprende una segunda parte de dicha secuencia de ADN exógena
provista en su extremo 3' de dicha secuencia flanqueante B; dichos
segundos y terceros fragmentos de ADN comprenden una secuencia
homóloga que se recubren en sus extremos 3' y 5' respectivos. A
título indicativo, estas secuencias homólogas entre los segundos y
terceros fragmentos de ADN responden a los mismos criterios de
homología y de longitud que las secuencias A y B. Este modo de
realización específico es particularmente ventajoso para el clonado
de las secuencias exógenas de gran tamaño.
El procedimiento según la invención se utiliza en
una bacteria derivada de una cepa de Escherichia coli recBC
sbcBC como por ejemplo las cepas CES200, CES201, W5449 y BJ5183
(Hanahan, 1983, J. Mol. Biol., 166,
557-580).
Un proceso típico de un procedimiento según la
invención comprende las etapas siguientes:
- (a)
- se cointroduce o se introduce de forma separada en una célula de Escherichia Coli recBC sbcBC un primer fragmento de ADN y (ii) un segundo fragmento de ADN tales como los definidos anteriormente,
- (b)
- se cultiva la célula de Escherichia Coli recBC sbcBC obtenida en la etapa (a) en unas condiciones apropiadas para permitir la generación del vector viral recombinante por recombinación intermolecular, y
- (c)
- se recupera el vector viral recombinante.
En el marco de un procedimiento según la
invención, las cantidades de los primeros y segundos fragmentos de
ADN pueden variar. Se prefiere emplear una concentración 10 veces
más importante de segundo fragmento con respecto al primero. La
introducción de los fragmentos de ADN en una célula de
Escherichia Coli recBC sbcBC y la recuperación del vector de
estas mismas células se realizan según las técnicas generales de
ingeniería genética y de clonado molecular detalladas en Maniatis
et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Una partícula viral infecciosa que contiene un
vector viral recombinante puede ser obtenida utilizando un
procedimiento según el cual:
- (a)
- se introduce dicho vector viral recombinante en una célula mamífera para generar una célula de mamífero transfectada,
- (b)
- se cultiva dicha célula de mamífero transfectada en unas condiciones apropiadas para permitir la producción de dicha partícula viral, y
- (c)
- se recupera dicha partícula viral del cultivo celular obtenido en la etapa (b).
Las células pueden ser transfectadas según las
técnicas estándar bien conocidas por el experto en la materia. Se
pueden citar en particular la técnica al fosfato de calcio, la
técnica al DEAE dextrano, la electroporación, los procedimientos
basados en los choques osmóticos, la microinyección o los
procedimientos basados en el empleo de liposomas. Según un modo de
realización preferido, la célula mamífera es ventajosamente una
célula de complementación y en particular la célula 293 en el marco
de un vector que deriva de un adenovirus. Las partículas virales
pueden ser recuperadas del sobrenadante de cultivo, pero también de
las células según los protocolos convencionales.
Se puede utilizar una partícula viral infecciosa
o un vector viral recombinante preparado según un procedimiento
según la invención para el tratamiento terapéutico o quirúrgico del
cuerpo humano y en particular por terapia génica. Dicho tratamiento
es más particularmente un tratamiento preventivo o curativo de
enfermedades tales como enfermedades genéticas (hemofilia;
talasemias, enfisema, enfermedad de Gaucher, mucoviscidiosis,
miopatia de Duchêne o de Becker...) los cánceres, las enfermedades
virales (SIDA, infecciones herpéticas o debidas al citomegalovirus
o al papilomavirus). Los vectores y partículas virales pueden ser
introducidos o bien in vitro en una célula huésped extraída
del paciente, o bien directamente in vivo en el organismo a
tratar. Preferentemente, la célula huésped es una célula humana y,
de manera preferida una célula pulmonar, fibroblástica, muscular,
hepática, limfocitaria o una célula de la progenie
hematopoyética.
Una composición farmacéutica que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula viral infecciosa
o de un vector viral recombinante preparado según un procedimiento
según la invención se puede preparar en asociación con un vehículo
aceptable desde un punto de vista farmacéutico. Dicha composición
farmacéutica puede prepararse según las técnicas comúnmente en uso
y administrada por cualquier vía de administración conocida, por
ejemplo por vía sistémica (en particular intravenosa,
intratraqueal, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea,
intratumoral o intracraneana) o por aerosolización o instilación
intrapulmonar.
Se puede utilizar una partícula viral infecciosa
o un vector viral recombinante preparado según un procedimiento
según la invención para la expresión de una secuencia de ADN de
interés en un sistema celular.
La presente invención se describe más
completamente con referencia a las figuras siguientes y con la ayuda
de los ejemplos siguientes.
La Figura 1 es una representación esquemática del
genoma del adenovirus humano de tipo 5 (representado en unidades
arbitrarias de 0 a 100), que indica el emplazamiento de los
diferentes genes.
La Figura 2 ilustra un procedimiento de
recombinación intermolecular entre dos fragmentos de ADN, las
secuencias plasmídicas están representadas por un trazo fino, las
secuencias virales por un trazo grueso y la secuencia exógena por un
recuadro rallado.
La Figura 3 es una representación esquemática del
vector pTG3614 que corresponde al p poliII en el cual está clonado
el genoma de un adenovirus recombinante modificado en la región E1
por inserción de un cassette de expresión del gen FIX humano.
La Figura 4 es una representación esquemática del
vector pTG4652 que corresponde al p poliII en el cual está clonado
el genoma de un adenovirus recombinante modificado en las regiones
E1, E3 y E4 por inserción de un cassette de expresión del gen CF
humano y deleciones parciales.
Los ejemplos siguientes ilustran solamente un
modo de realización de la presente invención.
Las construcciones descritas a continuación se
realizan según las técnicas generales de ingeniería genética y de
biología molecular detalladas en Maniatis et al., (1989,
supra). Los lugares de restricción protuberantes en 5' pueden
ser convertidos en lugares francos por tratamiento por el gran
fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. coli mientras
que los lugares protuberantes en 3' son tratados por la T4
polimerasa. En lo que concierne a las etapas de amplificación por
PCR, se aplica el protocolo tal como se describe en PCR
Protocols-A guide to methods and applications (1990,
ed Innis. Gelfand, Sninsky et White, Academic Press Inc.). Las
células son transfectadas por los procedimientos convencionales y
se cultivan según las recomendaciones del proveedor. Los fragmentos
insertados en las diferentes construcciones descritas a
continuación están indicados precisamente según su posición en el
genoma del Ad5 tal como se ha divulgado en el banco de datos
Genebank bajo la referencia M73260.
Se sintetiza el extremo izquierdo del genoma de
Ad5 (nucleótidos 1 a 935) por PCR con la ayuda de los iniciadores
oligonucleotídicos oTG6597 (SEC ID nº:1) y oTG6598 (SEC ID nº: 2).
La primera se híbrida en los 21 primeros nucleótidos del ITR 5' y
presenta un lugar PacI, inmediatamente corriente arriba de
las secuencias virales, y un lugar EcoRI utilizado para el
clonado. El segundo iniciador permite la introducción de los lugares
SalI y después BglII corriente abajo de las
secuencias virales. La matriz utilizada en esta reacción es el ADN
genómico de Ad5 preparado según los métodos convencionales. Se
digiere el fragmento así amplificado por EcoRI y
BglII y se clona en el plásmido p poliII (Lathe et
al., 1987, supra) previamente escindido por estas dos
mismas enzimas de restricción para obtener el pTG1692.
Se prepara el fragmento de ADN correspondiente al
extremo derecho del genoma de Ad5 (nucleótidos 35103 a 35935) según
el mismo principio utilizando el par de oligonucleótidos oTG6599
(SEC ID nº: 3) y oTG6597 (SEC ID nº: 1). Se construye el pTG1693
insertando el fragmento amplificado digerido por EcoRI y
BglII en los mismos lugares de p poliII. Se corta de pTG1693
un fragmento BglII-BamHI que lleva las secuencias
amplificadas de forma que se introduzca en el lugar Bglll de
pTG1692 corriente abajo de la secuencia 5' adenovirales. El pTG3601
así obtenido es linealizado entre los extremos izquierdo y derecho
del genoma de Ad5 por digestión con las enzimas de restricción
Bglll ó Sall. Los extremos así generados se hacen
francos por la acción del fragmento klenow de la ADN polimerasa I
de E. coli. Unas bacterias BJ5183 (Hanahan, 1983
supra) hechas competentes por un tratamiento al cloruro de
calcio son cotransformadas con la preparación anterior y el ADN
genómico de Ad5. Las colonias obtenidas son analizadas por
cartografía de restricción. Se selecciona un clon designado pTG3602
generado por recombinación homóloga intermolecular en el cual las
secuencias adenovirales (nucleótidos 936 a 35102) han sido
insertadas entre los dos fragmentos producidos por PCR, de manera
que generen un vector plasmídico que comprende el genoma completo
del Ad5 - pTG3602 que es producido en las bacterias C600 (Huynh
et al., 1985 DNA cloning, Volumen I, ed. Glover, IRL Press
Limited: Oxford, Inglaterra p56-110).
Se libera el genoma viral por la acción de la
enzima de restricción PacI. Unas células 293 cultivadas en
monocapa son transfectadas con el producto de esta digestión por la
técnica de precipitación al fosfato de calcio. Se pueden utilizar
también otras células sensibles, por ejemplo las células A549 (ATCC
CCL185). Se hacen crecer las células bajo agar durante 9 a 14 días,
período durante el cual la aparición de zonas de lisis sobre el
tapiz celular atestigua la producción de partículas virales
infecciosas y, por tanto, la capacidad del genoma de Ad5 salido de
pTG3602 para replicarse.
Se utiliza un plásmido en el cual el gen
informador Lac Z que codifica para la la
\beta-galactosidasa es colocado en un contexto
viral; por ejemplo un plásmido derivado del
pMLP-Adk7 (Stratford-Perricaudet y
Perricaudet 1991, Human Gene Transfer, 219, 51-61)
que comprende las secuencias 5' del Ad5 (nucleótidos 1 a 458), el
promotor MLP Ad2, el gen Lac Z, la señal de poliadenilación del
virus SV40 y las secuencias Ad5 comprendidas entre los nucleótidos
3329 a 6241.
El cassette de expresión del gen Lac Z rodeado de
secuencias adenovirales es cortado por la acción de las enzimas de
restricción BsrGI (posición 192 sobre el genoma de Ad5) y
PstI (posición 3788) y después purificado. El pTG3602 es
linealizado a nivel del lugar ClaI (posición 918) y después
tratado con la klenow. Los dos fragmentos obtenidos son
cotransformados en unas bacterias BJ5183 competentes. Una
recombinación a nivel de las secuencias adenovirales homólogas
provoca el reemplazado de la región E1 de Ad5 (nucleótidos 459 a
3328) por el cassette de expresión del gen informador en el
plásmido pTG3603.
Su poder infeccioso es verificado por
transfección de un tapiz de células 293 transfectadas con pTG3603
previamente digerido por PacI. Las zonas de lisis formadas
son entonces pinchadas y las partículas virales puestas de nuevo en
suspensión y utilizadas para infectar una monocapa de células 293.
La coloración de las células en azul después de adición de
X-Gal atestigua la expresión del gen Lac Z.
Un cassette de expresión del gen que codifica
para la proteína gp19 de la región E3 de Ad5 (nucleótidos 28731 a
29217) es ensamblado en el bacteriófago M13 mp18 (Gibco BRL) por
clonado de dos fragmentos PCR correspondiendo uno al LTR 3' de RSV
(Rous Sarcoma Virus) (iniciadores oligonucleotídicos
oTG5892-SEC ID nº: 4 y 5893-SEC ID
nº: 5) y el otro a la secuencia que codifica para la gp19
(oTG5455-SEC ID nº: 6 y 5456-SEC ID
nº. 7). Se obtiene el vector M13TG1683, del cual se corta el
cassette de expresión por una digestión XbaI. Después de
tratamiento con la klenow, se introduce en el lugar BsmI
(hecho franco por acción de la ADN polimerasa del fago T4) de
pTG8519. Este deriva del plásmido puc19 (Gibco BRL), en el
cual se han insertado las secuencias adenovirales comprendidas
entre el lugar SpeI y el extremo derecho del genoma
(nucleótidos 27082 a 35935) pero desprovistas de la mayoría de la
región E3 (nucleótidos 27871 a 30758). Se obtiene el pTG1695 del
cual se reemplaza el fragmento ScaI-SpeI, portador de
las secuencias plasmídicas, por un fragmento equivalente purificado
de pTG1659. Este corresponde al puc19 que comprende las secuencias
del Ad5 que se extienden de los nucleótidos 21562 a 35826. El
pTG1697 así obtenido presenta unas secuencias adenovirales que se
extienden del lugar BamHI (posición 21562) al ITR 3'
(posición 35935) en las cuales la región E3 está reemplazada por un
cassette de expresión de la gp19 bajo control del promotor
constitutivo RSV. El fragmento DraI (posición 22444 y 35142
sobre el genoma de Ad5) es purificado, y cointroducido en las
bacterias BJ-5183 competentes con pTG3602
linealizado por SpeI y tratado con la klenow. Los
recombinantes portadores de un plásmido generado por recombinación
son cribados para la presencia del promotor RSV. El pTG3605, vector
plasmídico portador del genoma de Ad-gp 19+, es así
puesto en evidencia.
El poder infeccioso genoma viral cortado del
plásmido pTG3605 es ensayado según el protocolo ya descrito
anteriormente. La producción de una proteína gp19 funcional está
seguida por la coinmunoprecipitación de los antígenos del complejo
principal de histocompatibilidad de clase I y de ésta (Burgert y
Kvist, 1985, Cell, 41, 987-997).
Las células BJ-5183 son
cotransformadas por el fragmento DraI aislado de pTG1697
mencionado anteriormente y el fragmento SpeI (Klenow) aislado
de pTG3603. El plásmido resultante es ensayado en las mismas
condiciones que anteriormente.
El cADN que codifica para el FIX humano ha sido
clonado en forma de un fragmento BamHI en el plásmido pTG381.
En este último, el extremo 5' no codificante del gen FIX ha sido
modificado de forma que esté conforme con las reglas de Kozak. El
plásmido pTG381 se describe en la publicación de la patente FR 2
600 334. El gen FIX es clonado de nuevo en el lugar BamHI de
pTG6512, para dar pTG4375. pTG6512 deriva del vector pTG6511
después de deleción del promotor tardío principal (MLP) del Ad2 y
reemplazado por un polylinker. A título indicativo, la construcción
del pTG6511 está detallada en el ejemplo 1 de la solicitud
internacional WO 94/28152. El promotor PGK murino es aislado por
los procedimientos convencionales a partir de ADN genómico de rata
según Adra et al., (1987, Gen 60,
65-74) o con la ayuda de iniciadores adecuados
creados a partir de los datos de secuencia divulgados en el banco
de datos Genebank bajo la referencia X15339. Unos lugares de
restricción Pst1, están incluidos en los extremos 5' de los
iniciadores a fin de facilitar las etapas de clonado ulteriores. El
fragmento que lleva el promotor PGK es tratado con la T4 polimerasa
y después introducido corriente arriba del gen humano FIX en el
lugar HpaI de pTG4375 del cual se corta por digestión
MscI un fragmento llamado "de reemplazado" que
comprende el cassette FIX rodeado de secuencias adenovirales E1
(185pb en 5' y 2045pb en 3').
Este es cotransformado en la bacteria BJ5183 en
presencia del vector pTG3602 digerido por ClaI (posición
918). Los transformantes son seleccionados sobre ampicilina y
analizados por cartografía de restricción. Se retiene el clon
designado pTG3614 correspondiente a un vector adenoviral que
comprende el gen terapéutico FIX en lugar de la región E1 (Figura
3). Un stock viral está constituido de forma convencional por
transfección del genoma adenoviral liberado por digestión
PacI en la progenie 293. Después de una etapa de
amplificación, las células son lisadas y las partículas virales
AdTG3614 purificadas por centrifugación sobre cloruro de cesio.
La capacidad para transferir y expresar el gen
FIX es evaluada en modelo animal rata. Para ello, 1,5 x 10^{9}
ufp son inyectadas en la vena caudal de ratas hembras C57 Black 6
de 5 a 6 semanas de edad. Se extraen muestras de sangre regularmente
en las cuales se dosifica la cantidad de FIX humano por ELISA (Kit
Diagnostica Stago, Asnières, Francia; Asserachirom® IX: Ag 00564).
El FIX es detectado en el suero de rata durante varias semanas con
un máximo a 5 días.
Cuando tiene lugar el ciclo viral normal, la
expresión de los genes de región E2 es inducida por los productos
precoces de E1 y E4 y se observa una producción abundante de las
proteínas codificadas por E2 y, en particular, de la proteína DBP
(para DNA Binding Protein). Ahora bien, esta elevada expresión
puede ser problemática in vivo (inducción de respuestas
inflamatorias o interferencia con la expresión del transgen). Es por
lo que, unos vectores adenovirales defectivos para la función E2A
han sido construídos o bien por introducción de una mutación
termosensible en E2A (posición 22795; C en T resultante de un
cambio Pro en Ser) o por una deleción parial del gen DBP.
El vector pTG9551 que lleva la mutación
termosensible es generado por recombinación homóloga en las células
BJ entre pTG3601 digerido por BglII y el ADN genómico
purificado del virus Ad5Hts 125 (Ensinger y Ginsberg, 1972, J.
Virol. 10, 328 - 339). El genoma así reconstituido es
liberado por digestión PacI y transfectado a las células 293
que son incubadas a 32ºC para la producción de las partículas
virales (la temperatura no permisiva es 39ºC).
La defectuosidad de E2A puede también ser
generada por deleción parcial de las regiones codificantes del gen
DBP evitando las regiones que recurren otros marcos de lectura. La
construcción se realiza por recombinación homóloga entre pTG3601
BglII y el ADN viral preparado a partir del virus H5dl802
(Rice y Klessig. 1985, J. Virol. 56,
767-778). Los virus pueden ser producidos en una
progenie de complementación apropiada transcomplementando la
función DBP, por ejemplo la progenie 293 transfectada por un vector
que permite la expresión constitutiva o regulada del gen DBP.
En un primer tiempo, se construye un vector
llamado "de reemplazado" que comprende un cassette de
expresión del gen que codifica para la proteína CFTR colocada en el
seno de la región adenoviral E1. Este vector, designado pTG8585,
contiene los elementos siguientes, descritos todos en la
literatura:
- -
- el ITR 5' Ad5 (posiciones 1 a 458),
- -
- el promotor MLP Ad2,
- -
- el cADN CFTR humano,
- -
- la señal de poliadenilación del gen de la \beta-globina de conejo,
- -
- el LTR 3' del virus RSV (Rous Sarcoma Virus),
- -
- las secuencias adenovirales que codifican para la proteína gp19 (posiciones 28731 a 29217 del Ad5), y
- -
- la parte 3' de la región E1B (posición 3329 a 6241).
En paralelo, las secuencias adenovirales que
recubren las regiones E3 y E4 son subclonadas en el vector p poliII
y delecionadas por las técnicas clásicas de biología molecular. Se
eliminan las secuencias E3 (posiciones 28592 a 30470) por digestión
XbaI y las secuencias E4 (posiciones 32994 a 34998). El
genoma adenoviral así modificado es reconstituido por recombinación
homóloga entre un fragmento de reemplazado que lleva estas
modificaciones aislado del vector precedente y pTG3603 digerido por
SpeI. Se obtiene pTG8595 que lleva un genoma adenoviral
recombinante (gen Lac Z en lugar de la región E1) y defectivo para
las funciones E3 y E4.
Los cassettes de expresión de los genes CFTR y
gp19 indicados a continuación se introducen en pTG8595 reemplazando
al gen Lac Z por cotransformación de las células BJ5183 por el
fragmento PacI - BstEII aislado de pTG8585 y el vector
pTG8595 linealizado por ClaI. Se genera pTG4652 (Figura 4)
que puede ser propagado en una progenie celular que complementa las
funciones E1 y E4 defectivas tales como las descritas en la
solicitud internacional WO94/28152.
Las partículas virales son amplificadas, las
células lisadas y los extractos celulares totales son analizados
para la expresión del gen CFTR por Western blot (gel
SDS-PAGE 8%). Los filtros son incubados en
presencia de una dilución al 1/5000 del anticuerpo monoclonal MAB
1104 dirigido contra un péptido sintético que corresponde a los
ácidos aminados 722 a 734 de la proteína CFTR humana. La deteccción
se realiza por el método ECL (Enhanced ChemiLuminiscence; kit
Amersham). Se observa en los extractos de células infectadas por
AdTG4652 una banda de gran intensidad y bastante difundida que
corresponde a un producto de peso molecular elevado coemigrante con
un testigo CFTR. Esta banda no está presente en los extractos
salidos del virus parental pTG8595 que no contiene el cassette de
expresión CFTR.
El genoma de CAV2 es clonado en ppoliII
Sfil-NotI 14 (Lathe et al., 1987,
supra) y modificado para generar unos vectores recombinantes
utilizando los lugares adecuados según los mismos procedimientos
que los utilizados en el caso de la manipulación de Ad5. Los
extremos izquierdo (nucleótidos 1 a 810 según la numeración de la
secuencia D04368 de Genebank) y derecho (nucleótidos \sim 27600
al final) son sintetizados por PCR entre los pares de iniciadores
oligonucleotídicos oTG6974 (SEC ID nº: 8) y oTG6975 (SEC ID nº: 9)
y oTG6976 (SEC ID nº: 10) y oTG6974, respectivamente. Los mismos son
unidos por medio del lugar PstI introducido cuando tiene
lugar la PCR a continuación de las secuencias virales, en el caso
del extremo izquierdo, y cartografiado a aproximadamente 1200 pb
del final del genoma, en el caso del extremo derecho. Unas bacterías
competentes BJ5183 son cotransformadas con el plásmido obtenido
linealizado por PstI y el ADN de CAV2. La introducción de
las secuencias virales que faltan (nucleótidos 811 a 27600) se
realiza por recombinación homóloga. El genoma de CAV2 soportado por
el plásmido resultante es cortado por medio de los lugares
NotI introducidos cuando tiene lugar la PCR y después
transfectado a una monocapa de células MDCK (ATCC CCL34). Las etapas
siguientes están descritas en el ejemplo 1.
El ADN genómico del virus CAV2 (cepa Toronto A
26/61; ATCC VR-800) se prepara por la técnica
clásica (amplificación sobre progenie renal de perro MDCK GHK....,
lisis de las células, purificación de los virus por centrifugación
sobre el cloruro de cesio, tratamiento con la proteinasa k y
finalmente extracción al fenol / cloroformo). El genoma CAV2, que
tiene una longitud de 31 kpb es introducido en un vector plasmídico
por recombinación homóloga. Para ello, se aíslan los extremos
izquierdo y derecho del genoma CAV2 por PCR y digestión enzimática
incorporando un lugar NotI inmediatamente más allá de los
ITRs 5' y 3'. El vector pTG4457 se obtiene por introducción en p
poliII de la parte 5' del genoma viral hasta el lugar BstBI
(posición 870) seguida de la parte 3' a partir del lugar Sal1
(posición 27800). El genoma completo puede ser reconstituido por la
contransformación entre el ADN genómico (100 a 500 ng) y pTG4457
digerido por BstBI (10 a 100 ng). El genoma viral puede ser
cortado del vector anterior pTG5406 por digestión NotI. Se
verifica que el ADN es infeccioso por transfección de 1 a 5 \mug
en las células de perro MDCK ó GHK. Se observa la producción de
zonas.
El vector recombinante se obtiene de la forma
siguiente:
El extremo izquierdo del CAV2 es subclonado y
modificado de manera que deleciones las secuencias codificantes E1A
en su totalidad y E1B parcialmente. Esto se efectúa por digestión
NarI y después reintroducción de un fragmento amplificado por
PCR que recubre la región de encapsidación, la región promotora E1A
y el lugar de iniciación de la transcripción. Los iniciadores están
ideados de manera que integren también un lugar de restricción
único XbaI. Se obtiene pTG5407 en el cual se introduce, a
nivel del lugar XbaI, el gen CAT o Lac Z (pTG5408). Este
último es digerido por XhoI y se inserta la parte 3' del
genoma viral en forma de un fragmento SalI (posición 27800 al
final del ITR 3'). El vector pTG5409 así obtenido es linealizado
por SalI y cotransformado en E. coli BJ5183 con el
genoma CAV-2 digerido por SwaI. Se obtiene
un vector adenoviral de origen canino que lleva el gen informador
CAT en lugar de la región E1.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Transgene S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 11 rue de Molsheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Strasbourg
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 67082
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (33) 88 27 91 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (33) 88 22 58 07
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo procedimiento de preparación de un vector
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipviral
\hfill
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- LÓGICA: PatentIn Release #1.0, Versión # 1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: adenovirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: serotipo 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis OTG6597
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC. ID nº. 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCGAATTCT TAATTAACAT CATCAATAAT ATACCTTA
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: adenovirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: serotipo 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis OTG6598
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACAGATCTG TCGACGTGGC AGGTAAGATC GATCA
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: adenovirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: serotipo 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis OTG6599
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGAGATCTG TCGACTCTCA AACATGTCTG CGGGT
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Rous sarcoma virus
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis OTG5892
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGTAGGAT CCAGCTGCTC CCTGCTTGTG TGTTGGAGGT CGCTGAG
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Rous sarcoma virus
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis OTG5893
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTAGCTGACG TCCCAGGTGC ACACCAATGT GGTGAATGGT CAAATGG
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: adenovirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: serotipo 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis OTG5455
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCGGAATTC AAGATGATTA GGTAC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: adenovirus humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: serotipo 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis OTG5456
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCGTCTAGA TTAAGGCATT TTCTTTTC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: adenovirus canino
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: CAV-2
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis OTG6974
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGGGATCCG CGGCCGCATC ATCAATAATA TACAGG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: adenovirus canino
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: CAV-2
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis OTG6975
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCTGCAGT CAGAAATGCT AGCAGGAGA
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: adenovirus canino
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: CAV-2
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- INDIVIDUAL AISLADO: oligonucleótido de síntesis OTG6976
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCGGATCCA CAGACTAAGC GGAGGTA
\hfill27
Claims (16)
1. Procedimiento para preparar en una célula
procariota un vector viral recombinante de por lo menos 20 kb
derivado de un virus parental en el genoma del cual está insertada
una secuencia de ADN exógena, por recombinación intermolecular entre
(i) un primer fragmento de ADN que comprende todo o parte de dicho
genoma del virus parental y (ii) un segundo fragmento de ADN que
comprende dicha secuencia de ADN exógena rodeada de secuencias
flanquentes A y B homólogas de (i), caracterizado porque
dicha célula procariota se deriva de una cepa de Escherichia
Coli recBC sbcBC.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el virus parental se selecciona entre
el grupo constituido por los adenovirus, los retrovirus, los virus
asociados a los adenovirus, los poxvirus y los virus del herpes.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque el virus parental es un adenovirus de
origen humano, canino, aviar, bovino, murino, ovino, porcino o de
simio o también un adenovirus híbrido.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque el virus parental es un adenovirus de
origen canino de tipo CAV-2.
5. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque el virus parental es un adenovirus de
origen humano de serotipo C.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque el virus parental es un adenovirus de
origen humano de tipo 5.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicha secuencia
de ADN exógena codifica para un polipéptido de interés terapéutico
seleccionado entre el grupo constituido por los factores de
coagulación, las hormonas de crecimiento, las citoquinas, la
limfoquinas, los polipéptidos supresores de tumores, los receptores
celulares, los ligantes de receptores celulares, los inhibidores de
proteasas, los anticuerpos, las toxinas, las inmunotoxinas, la
distrofina y los polipéptidos que intervienen en los canales
iónicos celulares tales como la proteína CFTR.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque las secuencias
flanqueantes homólogas A y B tienen una longitud de 10pb a 10 kb,
ventajosamente de 20 pb a 5 kb, preferentemente de 30 pb a 2 kb y de
manera totalmente preferida de 40 pb a 1 kb.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el primer
fragmento de ADN es linealizado a nivel de la región de inserción de
la secuencia exógena.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, para la preparación de un vector viral
recombinante defectivo para la réplica.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
para la preparación de un vector adenoviral recombinante desprovisto
de toda o parte de por lo menos una región esencial para la réplica
seleccionada entre las regiones E1, E2 y E4.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque el vector adenoviral recombinante está
además desprovisto de toda o parte de la región E3.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 12, para la preparación de un vector viral
recombinante de por lo menos 30 kb.
14. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
13, por recombinación intermolecular entre (i) un primer fragmento
de ADN que comprende todo o parte dicho genoma del virus parental,
(ii) un segundo fragmento de ADN que comprende una primera parte de
dicha secuencia de ADN de interés provista en su extremo 5' de dicha
secuencia flanqueante A y (iii) un tercer fragmento de ADN que
comprende una segunda parte de dicha secuencia de ADN de interés
provista en su extremo 3' de dicha secuencia flanqueante B;
comprendiendo dichos segundo y tercer fragmentos de ADN una
secuencia homóloga en sus extremos 3' y 5' respectivos.
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 14, para introducir una modificación por
deleción, mutación y/o substitución de uno o varios nucleótidos o
una secuencia de ADN exógena en un genoma viral.
16. Uso de una cepa de E. coli recBC sbcBC
para el clonado de fragmentos de ADN en un vector según la
reivindicación 1 por recombinación homóloga intermolecular.
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|---|---|---|---|
| FR9414470A FR2727689A1 (fr) | 1994-12-01 | 1994-12-01 | Nouveau procede de preparation d'un vecteur viral |
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