ES2151310T5 - Nuevos vectores adenovirales defectivos y lineas celulares de complementacion correspondientes. - Google Patents

Nuevos vectores adenovirales defectivos y lineas celulares de complementacion correspondientes. Download PDF

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA LINEA DE COMPLEMENTACION QIE COMPRENDE UN ELEMENTO DE COMPLEMENTACION, QUE COMPRENDE PARTICULARMENTE UNA PARTE DE LA REGION E1 DEL GENOMA DE UN ADENOVIRUS CON LA EXCLUSION DE ITR5''; SIENDO DICHO ELEMENTO DE COMPLEMENTACION CAPAZ DE COMPLEMENTAR EN TRANS UN VECTOR ADENOVIRAL DEFECTIVO Y ESTANDO INTEGRADO EN EL GENOMA DE DICHA LINEA DE COMPLEMENTACION O INSERTADO EN UN VECTOR DE EXPRESION.

Description

Nuevos vectores adenovirales defectivos y líneas celulares de complementación correspondientes.
La invención tiene por objeto nuevas líneas celulares de complementación, que complementan en trans las funciones virales esenciales que se encuentran delecionadas en el genoma de vectores adenovirales defectivos, permitiendo así la transferencia y la expresión de genes de interés dentro de una célula de un organismo eucariota huésped. La invención presenta un interés especial por las perspectivas en terapia génica, especialmente en humanos.
Los adenovirus son los virus de ADN que presentan un mayor espectro de huésped. Esto queda en evidencia por las numerosas especies animales y por los numerosos tipos celulares. Existen algunos serotipos que difieren especialmente a nivel de secuencia de sus genomas. La mayoría de los adenovirus humanos son poco patógenos y no producen generalmente más que síntomas benignos.
El adenovirus penetra dentro de la célula huésped permisiva por el intermediario de un receptor específico, tras lo cual es internalizado y situado dentro de los endosomas. Su acidificación contribuye a un cambio de conformación del virus y a su salida hacia el citoplasma. Posteriormente, el ADN viral se asocia con determinadas proteínas virales necesarias para llevar a cabo las primeras etapas del ciclo replicativo y penetra dentro del núcleo de las células infectadas, donde las enzimas celulares inician su transcripción. La replicación del ADN adenoviral tiene lugar dentro del núcleo de las células infectadas y no necesita la replicación celular. El ensamblaje de los nuevos viriones tiene lugar igualmente dentro del núcleo. Al principio las proteínas virales se ensamblan, de manera que forman las cápsides vacías que presentan una estructura icosaédrica, dentro de las cuales el ADN adenoviral es posteriormente encapsidado. Las partículas virales o viriones son liberados de las células infectadas y son susceptibles de infectar a otras células permisivas.
El ciclo infectivo del adenovirus se lleva a cabo en 2 etapas:
- la fase temprana que precede a la iniciación de la replicación del genoma adenoviral y que permite la producción de las proteínas reguladoras que intervienen a nivel de la replicación y de la transcripción del ADN viral, y
- la fase tardía que conduce a la síntesis de las proteínas estructurales.
De manera general, el genoma adenoviral está formado por una molécula de ADN lineal, bicatenaria y de alrededor de 36 kb de longitud que contiene las secuencias codificantes para más de 30 proteínas. En cada uno de sus extremos presenta una pequeña secuencia de 100 a 150 nucleótidos según los serotipos, invertida y denominada ITR (Inverted Terminal Region). Las ITRs están involucradas en la replicación del genoma adenoviral. La región de encapsidación, de alrededor de 300 nucleótidos, está situada en el extremo 5' del genoma justo después del ITR 5'.
Los genes tempranos se encuentran repartidos en 4 regiones que se encuentran dispersadas dentro del genoma adenoviral, denominadas E1 a E4 (E debido a que "Early" significa temprano en inglés). Las regiones tempranas comprenden al menos seis unidades transcripcionales que poseen sus propios promotores. La expresión de los genes tempranos a su vez está regulada, expresándose algunos genes antes que otros. Tres regiones, respectivamente E1, E2 y E4, son esenciales para la replicación viral. Así, si un adenovirus es defectivo para una de estas funciones, es decir si no puede producir al menos una proteína codificada por una de estas regiones, éstas deberán ser proporcionadas en trans.
La región temprana E1 está situada en el extremo 5' del genoma adenoviral y contiene 2 unidades de transcripción virales, respectivamente E1A y E1B. Dicha región codifica para las proteínas que intervienen de forma muy temprana en el ciclo viral y son esenciales para la expresión de casi todos los otros genes del adenovirus. En particular, la unidad de transcripción E1A codifica una proteína activadora en trans de la transcripción de los otros genes virales, que induce la transcripción a partir de los promotores de las regiones E1B, E2A, E2B y E4.
Los productos de la región E2, que comprende las unidades de transcripción E2A y E2B, están directamente implicados en la replicación del ADN viral. Dicha región dirige especialmente la síntesis de una proteína de 72 kDa, que presenta una gran afinidad por el ADN de cadena sencilla y por una ADN polimerasa.
La región E3 no es esencial para la replicación del virus. Ésta codifica al menos seis proteínas que son responsables de la inhibición de la respuesta inmune del huésped frente a una infección por el adenovirus. En particular, la glicoproteína gp19kDa induce la respuesta CTL, responsable de la citólisis de las células infectadas por las células T citotóxicas del huésped.
La región E4 se encuentra situada en el extremo 3' del genoma adenoviral. Ésta codifica numerosos polipéptidos que se encuentran implicados en la expresión de los genes tardíos, en la estabilización de los mensajeros (ARNm) tardíos, en el tránsito de la fase temprana a la fase tardía, así como en la inhibición de la síntesis proteica celular.
Una vez que se ha iniciado la replicación del ADN viral, comienza la transcripción de los genes tardíos. Éstos ocupan la mayoría del genoma adenoviral y recubren en parte las unidades de transcripción de los genes tempranos. Pero son transcritos a partir de promotores diferentes y según un modo alternativo, de modo que las mismas secuencias son utilizadas para fines diferentes. La mayoría de genes tardíos son transcritos a partir del promotor mayor tardío MLP (Major Late Promoter). Este promotor permite la síntesis de una largo tránscrito primario que posteriormente es madurado en una veintena de ARN mensajeros (ARNm), a partir de los cuales se producen las proteínas que forman la cápside del virión. El gen que codifica la proteína estructural IX que compone la cápside se encuentra situado en el extremo 5' del genoma adenoviral y recubre la región E1B en su extremo 3'. La unidad transcripcional de la proteína IX utiliza la misma señal de terminación de la transcripción que la unidad transcripcional E1B.
Se dispone de un cierto número de adenovirus bien caracterizados genética y bioquímicamente. Tal es el caso del adenovirus humano de tipo 5 (Ad5), cuya secuencia está accesible en el banco de donación Genebank bajo la referencia M73260. Los diferentes genes se pueden localizar de forma precisa en el genoma adenoviral que comprende de 5' a 3' el ITR 5' de 103 pb seguido de la región de encapsidación (Hearing et al., 1987, J. Virol., 61, 2555-2558) de alrededor de 300 pb, posteriormente las regiones tempranas y tardías cuya situación se encuentra representada de forma esquemática en la Figura 1, y por último el ITR 3'.
El hecho de que los adenovirus posean estas características tan interesantes, hizo que fuesen éstos los vectores de elección para la transferencia de genes de interés. Hay numerosos adenovirus recombinantes descritos en la literatura (Rosenfeld et al., 1991, Science, 252, 431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell, 68, 143-155). De forma general, derivan del Ad5 y son defectivos para la función E1, con el objetivo de evitar su diseminación en el ambiente y en el organismo huésped. En otros, la región E3 no esencial puede igualmente encontrarse delecionada. Las secuencias exógenas se integran en el lugar de la región E1 o E3.
Así, los adenovirus defectivos no se pueden propagar más que en una línea celular que complementa en trans la función E1 esencial para la replicación viral. Actualmente, la única línea celular de complementación que se utiliza es la línea de riñón embrionaria 293 (Graham et al., 1977, J. Gen Virol., 36, 59-72), que resulta de la integración en sus cromosomas de un fragmento del genoma del Ad5 que comprende principalmente el extremo 5' del genoma viral; de modo que la línea 293 complementa los adenovirus defectivos para la función E1. Las células 293 contienen las secuencias que se encuentran dentro del adenovirus recombinante defectivo, como ITR 5', la región de encapsidación y la parte del extremo 3' de la región E1B que comprende las secuencias que codifican las proteínas tempranas.
La facilidad de transferencia de genes al utilizar los adenovirus se mantiene estable. Pero todavía existe la duda sobre su inocuidad. En efecto, ellos son capaces de transformar ciertas líneas celulares en cultivo, lo que refleja el poder potencialmente oncogénico de algunos de los productos de expresión del genoma adenoviral, esencialmente de la región E1 y probablemente E4, al menos para ciertos serotipos. Además, la probabilidad de recombinación genética entre un adenovirus defectivo del campo anterior, especialmente un adenovirus recombinante, y o bien un adenovirus natural o salvaje (producto de una contaminación accidental o de una infección oportunista de un organismo huésped), o bien un fragmento de genoma adenoviral integrado en la línea de complementación 293 no es nada despreciable. En efecto, es suficiente un evento de recombinación para restaurar la función E1 y generar un adenovirus recombinante no defectivo, capaz de diseminarse en el ambiente. Así es factible que un adenovirus natural salvaje que coinfecte la misma célula que un adenovirus defectivo, pueda complementar a éste último en lo referente a la función E1, provocando una codiseminación de los virus. Por último, ciertos tipos de células eucariotas producen proteínas que presentan una actividad del tipo E1A igualmente susceptibles de complementar de forma parcial los adenovirus defectivos que las infectan.
Por lo tanto, es conveniente disponer de vectores adenovirales muy eficientes que presenten el mínimo riesgo, con el objeto de utilizarlos en terapia génica para corregir in vivo los defectos genéticos graves y tratar ciertas enfermedades para las que no se dispone de tratamientos terapéuticos eficaces. De su obtención depende el éxito de la terapia génica aplicada a humanos.
Además, existen ciertas cuestiones referentes a la obtención de la línea 293. Dichas cuestiones pueden referirse a la aceptabilidad de los productos destinados al uso humano que se derivarán. Será útil disponer de líneas de complementación en las que su origen e historia sean completamente adecuados para llevar a cabo la producción de partículas de adenovirus recombinantes destinadas al uso humano.
Se han descubierto (1) nuevos vectores adenovirales defectivos con ciertas regiones específicas del genoma adenoviral delecionadas y más adaptados a la transferencia de una secuencia nucleotídica exógena in vivo y (2) nuevas líneas de complementación caracterizadas, aceptables desde un punto de vista farmacéutico y que ofrecen por tanto todas las características de seguridad necesarias para la producción de productos destinados al uso humano.
El interés de los nuevos vectores es que presentan una capacidad de clonaje que permite la inserción de uno o más genes de interés de gran tamaño y una seguridad de utilización máxima. Dichas mutaciones deletéreas hacen que los adenovirus no sean capaces de llevar a cabo replicación autónoma y transformación celular, sin alterar por ello la capacidad de transferencia y expresión de un gen de interés.
Los vectores adenovirales son defectivos para la replicación, son capaces de estar encapsidados dentro de una célula de complementación y son derivados de un genoma de una adenovirus que comprende de 5' a 3', un ITR 5', una región de encapsidación, una región E1A, una región E1B, una región E2, una región E3, una región E4 y un ITR 3' por la deleción:
(i) de toda o parte de la región E1A y de la totalidad de la parte de la región E1B que codifica las proteínas tempranas.
En la presente invención, la expresión "deleción" o "desprovisto" se refiere a la supresión de al menos un nucleótido dentro de la región diana y puede tratarse de una deleción continua o discontinua. Por toda o parte, se entiende la totalidad o bien solamente una parte de la región considerada. Se prefieren las deleciones que impiden la producción de al menos un producto de expresión codificado por dicha región. Éstas se pueden encontrar en una región codificante o en una región reguladora como la región promotora y concierne al menos a un nucleótido de forma que destruye la pauta de lectura de un gen o restaura una región promotora no funcional. Se puede referir igualmente a las deleciones parciales de uno o más genes de dicha región o del ensamblaje de la región.
Un vector adenoviral como se ha descrito anteriormente es defectivo para la replicación, pero es capaz de replicar y encapsidarse dentro de una célula de complementación que proporciona en trans el producto o los productos para los cuales es defectivo, con el objetivo de generar una partícula adenoviral (todavía denominada adenovirus defectivo) incapaz de llevar a cabo una replicación autónoma dentro de una célula huésped, pero que sin embargo es infectivo porque mantiene la capacidad de liberar el vector en una célula huésped.
Según una primera variante, el vector adenoviral derivado del genoma de un adenovirus natural o salvaje por la deleción de toda o parte de la región E1A y de parte de la región E1B, comprende la totalidad de las secuencias codificantes para las proteínas tempranas. Un modo preferido hace referencia al promotor y a las secuencias que codifican los productos de expresión de la región E1B, es decir, las proteínas tempranas y no incluyen ni todo ni parte de la señal de terminación de la transcripción que recubre las secuencias que codifican la proteína tardía IX. Referente a un vector adenoviral derivado de un adenovirus humano de tipo 5, dicha deleción comprende al menos las secuencias comprendidas entre los nucleótidos 1634 y 3509 del genoma adenoviral cuya secuencia está accesible en el banco de donación Genebank bajo la referencia M73260. Dicha deleción tiene como objetivo reducir o suprimir las secuencias comunes entre un vector adenoviral como el descrito anteriormente y el fragmento de genoma adenoviral integrado en una línea celular de complementación, por ejemplo la línea 293. Además, elimina de un vector adenoviral según la invención, las secuencias cuyos productos de expresión son potencialmente oncogénicos, al menos en conjunción con los productos de expresión de la región E1A.
Por otra parte, el vector adenoviral deriva además de genoma de un adenovirus natural o salvaje por la deleción de toda o parte:
- de la región E3.
Por sí mismo, el vector adenoviral puede conllevar una de las tres deleciones anteriormente mencionadas o dos de entre ellas si no importa las combinaciones o incluso el conjunto de las deleciones.
Según un modo particularmente ventajoso, el vector adenoviral se encuentra delecionado por una parte, solamente en la región E3 y preferentemente, en la parte que no comprende las secuencias que codifican la proteína gp19kDa. La presencia de la secuencia que codifica la proteína gp19kDa en el vector adenoviral permite a las células infectadas escapar al sistema inmunológico del huésped; un criterio importante cuando el protocolo terapéutico necesita administraciones adicionales repetidas. Se prefiere situar las secuencias que codifican la gp19kDa bajo el control de elementos apropiados que permitan su expresión en la célula huésped, como son los elementos necesarios para la transcripción de las secuencias de ARNm y para la traducción de éste último a proteína. Estos elementos comprenden en particular un promotor. Tales promotores son bien conocidos para el experto en el campo y son insertados corriente arriba de dicha secuencia codificante por técnicas convencionales de ingeniería genética. El promotor reprimido será, preferentemente, un promotor constitutivo no activable por uno de los productos de expresión de la región E1A. A título de ejemplos, se puede citar el promotor del gen de la HMG (Hidroxi-Metil-Glutaril coenzima A reductasa), el promotor temprano del virus SV40 (Simian Virus 40), el LTR (Long Terminal Repeat) de RSV (Rous Sarcoma Virus) o el promotor del gen de la PGK (phospho-glicerate kinase) de eucariotas
superiores.
Por otra parte, el vector adenoviral puede, de forma opcional, estar delecionado en la parte de la región E3 correspondiente a la región promotora, la cual será substituida por una región promotora heteróloga, tal como una de las mencionadas anteriormente.
Como se ha descrito anteriormente, el vector adenoviral puede, además estar desprovisto de toda o parte de las regiones E1B y/o E3 y, en particular, según un modo de realización tal como el mencionado anteriormente (como la deleción de la parte de la región E1B que comprende la totalidad de las secuencias que codifican las proteínas tempranas y de la parte de la región E3 que no codifica la proteína gp 19 kDa).
Por último según una cuarta variante, el vector adenoviral deriva del genoma de un adenovirus por la deleción de toda o parte de la región E1A y de una parte de la región de encapsidación.
Una deleción parcial de la región de encapsidación permite reducir especialmente la probabilidad de diseminación incontrolada de un vector adenoviral, cuando éste último está en presencia de un adenovirus salvaje. Tal deleción permite afectar a sus funciones de encapsidación de tal modo que en caso de complementación en trans de la función defectiva por un adenovirus salvaje, no podrá encapsidarse eficazmente cuando ésta sea proporcionada por el genoma del adenovirus salvaje competidor.
Las deleciones de la región de encapsidación serán elegidas en función de 2 criterios: una menor capacidad a estar encapsidado pero a la vez una eficacia residual compatible con una producción industrial. En otros términos, la función de encapsidación de un vector adenoviral según la invención es substancialmente mantenida aunque a un grado menor. La atenuación puede determinarse por las técnicas convencionales de titulación por infección de una línea adecuada y evaluación de un número de calvas de lisado. Dichas técnicas son conocidas por el experto en el campo. Dentro del ámbito de la invención, la eficacia de la encapsidación se ve reducida en un factor de 2 a 50, beneficiosamente de 3 a 20 y preferentemente de 5 a 10 por la suministración a un adenovirus que muestra una región de encapsidación de tipo salvaje.
Por supuesto, el vector adenoviral atenuado puede también comprender al menos uno o cualquier combinación de las deleciones citadas anteriormente.
El vector adenoviral deriva del genoma de un adenovirus natural o salvaje, de modo beneficioso de un adenovirus canino, de ave o humano, preferentemente de un adenovirus humano de tipo 2, 3, 4, 5 o 7 y de manera más preferente, de un adenovirus humano de tipo 5 (Ad5). En este último caso, las deleciones del vector adenoviral se indican por referencia a la posición de los nucleótidos del genoma del Ad5, especificado en el banco de donación Genebank bajo la referencia M73260.
Particularmente se prefiere un vector adenoviral derivado del genoma de un adenovirus humano de tipo 5, por la deleción:
(i) de la totalidad de la parte que codifica las proteínas tempranas de la región E1B y que comprende desde el nucleótido 1634 hasta el nucleótido 4047; y/o
(ii) de la parte de la región E3 que comprende de los nucleótidos 27871 a 30748.
Dentro del ámbito de la presente invención, el vector adenoviral tiene por objeto la transferencia y la expresión de una secuencia nucleotídica exógena dentro de una célula huésped. Por "secuencia nucleotídica exógena" se entiende un ácido nucléico que comprende las secuencias codificantes y las secuencias reguladoras que permiten la expresión de dichas secuencias codificantes y dentro de las cuales, las secuencias codificantes son las secuencias que normalmente no están presentes dentro del genoma de un adenovirus. Las secuencias reguladores ser de cualquier origen. La secuencia nucleotídica exógena se introduce dentro del vector adenoviral por técnicas clásicas de ingeniería genética, entre la región de encapsidación y el ITR 3'.
Una secuencia nucleotídica exógena puede estar constituida por uno o más genes de interés y de manera preferente, de interés terapéutico. Dentro del ámbito de la presente invención, un gen de interés puede codificar sólo un ARN antisentido, sólo un ARNm que será traducido en proteína de interés. Un gen de interés puede ser de tipo genómico, de tipo ADN complementario (ADNc) o de tipo mixto (minigen, dentro del cual al menos está delecionado un intrón). Puede codificar un proteína madura, un precursor de una proteína madura, especialmente un precursor destinado a ser secretado y que comprende un péptido señal, una proteína quimérica proveniente de la fusión de secuencia de origen diverso o un mutante de una proteína natural presentando unas propiedades biológicas mejoradas o modificadas. Se puede obtener un dicho mutante por mutación, deleción, substitución y/o adición de uno o más nucleótidos de un gen que codifica la proteína natural.
Un gen de interés puede estar situado bajo el control de elementos apropiados para la expresión dentro de una célula huésped. Por "elementos apropiados" se entiende el ensamblaje de los elementos necesarios para su transcripción en ARN (ARN antisentido ARNm) y para la traducción de un ARNm en proteína. Entre los elementos necesarios para la transcripción, el promotor tiene gran importancia. Puede tratarse de un promotor constitutivo o de un promotor regulable y puede haber sido aislado de cualquier gen de origen eucariota o viral e incluso adenoviral. De forma alternativa, puede tratarse de un promotor natural del gen de interés en cuestión. De forma general, un promotor que se utiliza en la presente invención, puede ser modificado de manera que contenga las secuencias reguladoras. A modo de ejemplos, un gen de interés que se utiliza en la presente invención está situado bajo el control del promotor de los genes de inmunoglobulina cuando son transferidos dentro de células huéspedes linfocitarias. Análogamente se puede citar el promotor del gen de la TK-HSV-1 [timidina quinasa (thymidine kinase) del virus del herpes de tipo 1] o incluso el promotor adenoviral MLP, especialmente del adenovirus humano de tipo 2, que permite una expresión dentro de un gran número de tipos celulares.
Entre los genes de interés que se pueden utilizar dentro del ámbito de la presente invención, se pueden citar:
- los genes que codifican las citoquinas, como el interferón alfa, el interferón gamma, las interleuquinas;
- los genes que codifican los receptores de membrana, como los receptores reconocidos por organismos patógenos (virus, bacterias o parásitos), con preferencia por los virus VIH (Virus de la Inmunodeficiencia Humana);
- los genes que codifican los factores de coagulación, como el factor VIII y el factor IX;
- el gen que codifica la distrofina;
- el gen que codifica la insulina;
- los genes que codifican las proteínas que participan directa o indirectamente en los canales iónicos celulares, como la proteína CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator);
- los genes que codifican los ARN antisentidos o las proteína capaces de inhibir la actividad de una proteína producida por un gen patógeno presente dentro del genoma de un organismo patógeno, o por un gen celular, donde la expresión está desregulada, por ejemplo un oncogen;
- los genes que codifican una proteína inhibidora de una actividad enzimática, como la \alpha1-antitripsina o un inhibidor de una proteasa viral;
- los genes que codifican las variantes de las proteínas patógenas que están mutadas con el objetivo de alterar la función biológica, como por ejemplo las variantes trans-dominantes de la proteína TAT del virus VIH capaces de competir contra la proteína natural por la unión con la secuencia diana, impidiendo así la activación del VIH;
- los genes que codifican los epítopos antigénicos con la finalidad de incrementar la inmunidad de la célula huésped;
- los genes que codifican las proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad de las clases I y II, así como los genes que codifican las proteínas activadoras de dichos genes;
- los genes que codifican los enzimas celulares o productos por los organismos patógenos; y
- los genes suicidas. Se puede citar particularmente el gen suicida TK-HSV-1. El enzima TK viral presenta una afinidad netamente superior con respecto al enzima TK celular por ciertos análogos de nucleósidos (como el aciclovir o el ganciclovir). Los convierte en moléculas monofosfatos, así mismas convertibles por los enzimas celulares, en precursores de nucleótidos que son tóxicos. Los análogos de nucleótidos se pueden incorporar en las moléculas de ADN en vía de síntesis, principalmente dentro del ADN de las células en estado de replicación. Dicha incorporación permite destruir específicamente las células en división, como las células cancerosas.
Esta lista no limita otros genes de interés, pudiendo ser utilizados dentro del ámbito de la presente invención.
Por otra parte, según otro modo de la invención, el vector adenoviral puede comprender un gen no terapéutico que codifica una proteína activadora en trans de la transcripción no adenoviral. Por supuesto, se evitarán el o los genes de la región E1A que codifica una proteína trans-activadora, cuya expresión puede restaurar el adenovirus no defectivo. Se elegirá preferentemente el gen que codifica la proteína Gal4 de Saccharomyces cerevisiae. Su expresión permite la propagación del vector dentro de una línea de complementación tal como la descrita a continuación. Dicha línea es más sofisticada y permite paliar los eventuales problemas de toxicidad debido a la producción en continuo de las proteínas adenovirales de complementación. El gen que codifica una proteína activadora en trans de la transcripción puede estar situado, si es necesario, bajo el control de elementos apropiados para su expresión; por ejemplo los que permiten la expresión de un gen de interés.
El vector adenoviral puede estar comprendido en una célula eucariota huésped bajo la forma de un vector adenoviral o bajo la forma de un vector adenoviral o bajo la forma de una partícula adenoviral. Dicha célula es de modo beneficioso una célula de mamífero y, preferentemente, una célula humana y puede comprender dicho vector bajo la forma integrada en el genoma o, preferentemente, bajo la forma no integrada (episoma).
La partícula adenoviral se puede preparar pasándola en cualquier línea celular de complementación que proporcione en trans las funciones para las cuales el vector adenoviral como el descrito anteriormente es defectivo, por ejemplo la línea 293 del campo anterior. Tales técnicas de preparación son conocidas por el experto en el campo (Graham et Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, vol 7, 109-128, Ed: E.J. Murey, The Human Press Inc.). De forma opcional, la partícula adenoviral puede estar generada dentro de una línea celular de complementación según la invención, tal como la descrita a continuación.
Por esta razón la presente invención se refiere a una línea de complementación propia de la producción de partículas de adenovirus destinadas a un uso terapéutico o profiláctico en humanos y que dicha línea celular de complementación conlleva un elemento de complementación; dicho elemento de complementación está caracterizado por el hecho de que comprende como único ADN adenoviral en la parte de la región E1A que codifica las proteínas tempranas de la región E1A y la totalidad de las secuencias que codifican las proteínas tempranas de la región E1B situada bajo el control de su propio promotor, y por el hecho de que la expresión de la parte de la región E1A está situada bajo el control de un promotor heterólogo; y dicho elemento de complementación:
(a) es capaz de complementar en trans un vector adenoviral que procede de un adenovirus humano y que es defectuoso para la función E1; y
(b) está integrado en el genoma de dicha línea celular de complementación.
Dentro del ámbito de la presente invención, el término "línea celular de complementación" se refiere a una célula eucariota capaz de proporcionar en trans la o las funciones para las cuales un vector adenoviral es defectivo. En otros términos, es capaz de producir las proteínas tempranas de la región E1A y las proteínas tempranas de la región E1B necesarias para la replicación de dicho vector adenoviral, proteínas tempranas que él no puede producir por sí mismo y que son necesarias para la constitución de una partícula viral. Así, un vector adenoviral humano defectivo para la función E1 deberá propagarse dentro de una línea celular de complementación para E1 (capaz de proporcionar en trans la proteína o el ensamblaje de las proteínas que codifican la región E1 que el vector no puede producir). Como se ha indicado en la introducción, la región E3 no es esencial, y no necesita estar específicamente completada.
Una línea celular de complementación según la invención, puede derivarse o bien de una línea celular inmortalizada, capaz de dividirse indefinidamente, o bien de una línea primaria. De acuerdo con los objetivos pretendidos por la presente invención, una línea celular de complementación según la invención, es útil para la encapsidación de cualquier vector adenoviral defectivo y en particular, de un vector adenoviral defectivo como el descrito anteriormente. Así, el motivo por el que se utiliza a continuación el término "vector adenoviral defectivo", es para que se entienda que hace referencia a un vector defectivo cualquiera, del campo anterior o como se ha descrito anteriormente.
El "elemento de complementación" está integrado en el genoma de una línea celular de complementación según la invención. Los métodos para introducir un vector o un ácido nucléico dentro de una línea celular y eventualmente integrarlo dentro del genoma de una célula constituyen las técnicas convencionales bien conocidas por el experto del campo, igual que los vectores que se pueden utilizar con dichos fines. El elemento de complementación puede estar introducido dentro de una línea de complementación según la invención, de forma previa o concomitante con un vector adenoviral defectivo.
Una línea celular de complementación según la invención está destinada a complementar en trans un vector adenoviral que proviene de un adenovirus humano y que es defectivo para la función E1. Dicha línea presenta la ventaja de que se disminuyen los riesgos de recombinación porque, contrariamente a la línea convencional 293, está desprovista del ITR 5' presente dentro de los vectores.
Una línea celular de complementación según la invención está desprovista de la región promotora de la región E1A. La parte de genoma adenoviral que codifica las proteínas tempranas de dicha región E1A está bajo el control de un promotor heterólogo apropiado y funcional dentro de dicha línea celular de complementación. Se puede aislar a partir de cualquier gen eucariota o viral. Se evitará, sin embargo, recurrir a un promotor adenoviral de una región temprana. Se puede tratar de un promotor constitutivo. A título de ejemplo, se pueden citar los promotores del virus SV40, del gen de la TK-HSV-1 y del gen murino de la PGK.
De forma alternativa, el promotor reprimido puede estar regulado y de modo beneficioso, puede estar activado por una proteína activable en trans de transcripción no adenoviral. Puede tratarse de un promotor aislado de un gen naturalmente activable o de cualquier promotor modificado por la adición de secuencias de activación (o UAS, por Upstream Activating Sequence en inglés) sometido a dicha proteína activadora en trans. De manera más particular, se prefiere utilizar un promotor que se puede activar por la proteína Gal4 de Saccharomyces cerevisiae y, preferentemente, un promotor híbrido constituido por un promotor denominado "mínimo" que contiene únicamente las secuencias de iniciación de la transcripción (TATA box y sitio de iniciación) de cualquier gen (por ejemplo del gen TGK-HSV-1) corriente arriba del cual se ha insertado al menos una secuencia de activación del gen de Gal10 de Saccharomyces cerevisiae (Webster et al., 1988, Cell, 52, 169-178). Éste último puede estar sintetizado químicamente o aislado del gen de Gal10, según las técnicas clásicas de ingeniería genética. Así, el promotor híbrido no será activado y no inducirá la expresión de los genes que codifican la región E1A situada bajo su control, en presencia de la proteína Gal4.
Así, la inducción puede estar disparada en presencia de un vector adenoviral defectivo como el descrito anteriormente expresando la proteína Gal4. Sin embargo dicha línea puede igualmente ser utilizada para preparar cualquier vector adenoviral defectivo, con la condición de que proporcione en trans la proteína Gal4. Los medios de proporcionar en trans una proteína son conocidos por el experto en la materia.
Una línea celular de complementación comprende una parte del genoma de un adenovirus humano que deriva de forma ventajosa de un adenovirus humano de tipo 2 o 5.
Según un modo preferido, una línea celular de complementación según la invención puede comportar un elemento de complementación que comprende, entre otros, un gen que codifica un marcador de selección que permite la detección y aislamiento de las células que comporta. Dentro del contexto de la presente invención, no importa qué gen codifica un marcador de selección, siendo generalmente conocido por el experto en el campo, de modo beneficioso de un gen de resistencia a un antibiótico y preferentemente, de un gen que codifica la puromicina acetil-transferasa (gen pac) confiriendo la resistencia a la puromicina.
En el ámbito de la presente invención, el gen que codifica un marcador de selección puede estar situado bajo el control de los elementos apropiados permitiendo su expresión. Se puede tratar de un promotor constitutivo, como el promotor temprano del virus SV40. Dicha combinación introducirá una presión selectiva para mantener la expresión de los genes de la región E1A dentro de una línea celular de complementación según la invención. Con los fines de la presente invención el promotor reprimido puede estar modificado por deleción, mutación, substitución y/o adición de nucleótidos.
Según un modo de realización más preferido, una línea celular de complementación según la invención se deriva de una línea celular aceptable desde un punto de vista farmacéutico. Por "línea celular aceptable desde un punto de vista farmacéutico" se entiende una línea celular caracterizada (de la que se conoce el origen y la historia (y/o que deja de ser utilizada para la producción a gran escala de productos destinados al uso humano (constitución de lotes para los ensayos clínicos avanzados o de lotes destinados a la venta). Tales líneas están disponibles en organismos tales como la ATCC. Se pueden mencionar las líneas de riñón de mono verde de Africa Vero, humana derivada de un carcinoma de pulmón A549, humana pulmonar MRC5 y humana pulmonar W138.
De forma alternativa, una línea celular de complementación según la invención puede derivar de células primarias y especialmente de células de retina prelavadas de embrión humano.
La invención también tiene como objeto utilizar una línea celular de complementación según la invención, para la preparación de una composición farmacéutica para transferir las moléculas de ADN a una célula de un organismo eucariota.
La presente invención se refiere por último a una composición farmacéutica que comprende como agente terapéutico o profiláctico una célula de complementación según la invención, en asociación con un soporte aceptable desde un punto de vista farmacéutico.
La composición según la invención, está en particular destinada al tratamiento preventivo o curativo de enfermedades tales como:
- enfermedades genéticas, como hemofilia, mucoviscidosa o miopatía, como la de Duchene o de Becker,
- cánceres, como los inducidos por oncogenes o virus,
- enfermedades retrovirales, como el SIDA (síndrome de la inmunodeficiencia adquirida resultante de la infección por el VIH), y
- enfermedades virales recurrentes, como las infecciones virales provocadas por el virus del herpes.
Una composición farmacéutica según la invención se puede preparar de manera convencional. Concretamente, se asocia una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico o profiláctico con un soporte, tal como un diluyente. Una composición según la invención se puede administrar por aerosol o por cualquier vía convencional utilizada en este campo, en particular por vía oral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intrapulmonar o intratraqueal. La administración puede llevarse a cabo en dosis única o repetida una o más veces tras un determinado intervalo. La vía de administración y la dosis apropiadas varía en función de diversos parámetros, como por ejemplo, en función del individuo tratado o de la enfermedad a tratar o incluso de los genes de interés a transferir. De forma general, una composición farmacéutica según la invención comprende una dosis de adenovirus según la invención, comprendida entre 10^{4} y 10^{14}, de modo beneficioso 10^{5} y 10^{13} y preferentemente 10^{6} y 10^{11}. Una composición farmacéutica, en particular con finalidad profiláctica, puede comprender también un adyuvante aceptable desde un punto de vista farmacéutico.
La Figura 1 es una representación esquemática del genoma del adenovirus humano de tipo 5 (representado en unidades arbitrarias de 0 a 100), indicando la localización de los diferentes genes.
La Figura 2 es una representación esquemática del vector pTG6546.
La Figura 3 es una representación esquemática del vector pTG6581.
La Figura 4 es una representación esquemática del vector pTG6303.
La Figura 5 es una representación esquemática de los vectores pTG1660 y pTG1661.
La Figura 6 es una representación esquemática de los vectores pTG1653, pTG1654 y pTG1655.
La Figura 7 es una representación esquemática del vector pTG5913.
La Figura 8 es una representación esquemática del vector pTG8512.
La Figura 9 es una representación esquemática del vector pTG8513.
La Figura 10 es una representación esquemática del vector pTG8514.
La Figura 11 es una representación esquemática del vector pTG8515.
Ejemplos de referencia
Los ejemplos siguientes no ilustran la invención tal como se expone en las reivindicaciones.
Las construcciones descritas anteriormente se han realizado siguiendo las técnicas generales de ingeniería genética y de clonaje molecular, detalladas en Maniatis et al., (1989, Laboratoy Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). El conjunto de etapas de clonaje que se llevó a cabo con los plásmidos bacterianos se realizó en la cepa Escherichia coli (E. Coli) 5K o BJ, mientras que aquéllas que las que se llevaron a cabo con los vectores derivados del fago M13 se realizaron en E. Coli NM522. En lo que concierne a las etapas de amplificación por PCR, se aplicó el protocolo que se describe en PCR Protocolos-A guide to methods and applications, (1990, editado por Innis, Gelfand, Sninsky and White, Academic Press Inc.).
Por otra parte, las células se transfectaron según las técnicas estándares bien conocidas por el experto en la materia. Se puede citar la técnica de fosfato de calcio (Maniatis et al., supra). Pero otros protocolos permiten la introducción de un ácido nucléico dentro de una célula, pudiendo ser igualmente utilizados, tales como la técnica del DEAE dextrano, la electroporación, los métodos basados en los choques osmóticos, la microinyección de una célula seleccionada o los métodos basados en la utilización de liposomas.
Los fragmentos insertados dentro de las diferentes construcciones descritas anteriormente, son indicados de forma precisa según su posición en la secuencia nucleotídica:
- del genoma del Ad5, tal como está divulgado en el banco de donaciones Genebank bajo la referencia M73260,
- del genoma del adenovirus de tipo 2 (Ad2), tal como está divulgado en el banco de donaciones Genebank bajo la referencia J01949,
- del genoma del virus SV40 tal como está divulgado en el banco de donaciones Genebank bajo la referencia J020400.
Ejemplo 1
Generación de un adenovirus "atenuado" que comprende una deleción de una parte de la región de encapsidación 1. Construcción de un vector "atenuado" que comprende una deleción desde el nucleótido 184 al nucleótido 273 de la región de encapsidación
La construcción de un vector que comprende
- el ITR 5' del genoma del Ad5 (desde el nucleótido 1 al nucleótido 103),
- dentro de la región de encapsidación del Ad5 comprendida entre los nucleótidos 104 y 458, la porción que va desde el nucleótido 184 al nucleótido 273 está delecionada y la timina (T)en posición 176 está modificada por una citosina (C) con el objetivo de crear un sitio de restricción AatII,
- un cassette de expresión de un gen de interés que comprende del extremo 5' al 3' el MLP del Ad2 (nucleótidos 5779 al 6038), los sitios de restricción KpnI-XbaI-HindIII y BamHI, el ADNc humano que codifica la proteína CFTR, (la composición en aminoácidos corresponde a la secuencia publicada por Riordan et al, 1989, Science, 245, 1066-1073; a excepción de una valina en lugar de la metionina en posición 470), los sitios PstI, XhoI y SalI y por último la señal de terminación de la transcripción del virus SV40 (nucleótidos 2665 a 2538), y
- el fragmento del genoma del Ad5 que comprende desde el nucleótido 3329 al nucleótido 6241.
Al principio, entre los sitios EcoRI y EcoRV del vector M13TG131 (Kieny et al., 1983, Gene, 26, 91-99) se clonó el fragmento EcoRI SmaI aislado de pMLP11. Dicha construcción es producto de pMLP10 (levrero et al., 1991, Gene 101, 195-202) y difiere del vector parental por la introducción de un sitio SmaI a nivel del sitio HindIII. Así se obtuvo el vector M13TG6501. Éste se sometió a mutagénesis dirigida con la finalidad de delecionar las secuencias comprendidas entre los nucleótidos 184 y 273 de la región de encapsidación. La mutagénesis dirigida se realizó con la ayuda de un kit comercial (Amersham) según las recomendaciones del fabricante, y se utilizó el oligonucleótido OTG4174 descrito con el identificador de secuencia nº 1(SEQ ID Nº 1). El vector mutado se denominó M13TG6502. La región de encapsidación así delecionada se reintrodujo bajo la forma de un fragmento EcoRI-BglII, el sitio BglII con extremo romo por tratamiento con la ADN polimerasa Klenow, dentro del vector pMLP11 digerido con EcoRI y SmaI.
El vector obtenido, pTG6500, se digerió parcialmente con PstI, se trató con la ADN polimerasa del fago T4 y además se digerió con PvuI. En el vector se insertó el fragmento PvuI-HpaI aislado de pTG5955 (derivado de pMLP11). Este fragmento comprende la señal de terminación de la transcripción del virus SV40 y la parte de genoma del Ad5 que se extiende desde el nucleótido 3329 al nucleótido 6241. El vector pTG6505 así generado se digerió parcialmente con SphI, se trató con la ADN polimeras del fago T4 y se religó, con la finalidad de destruir el sitio SphI situado en el extremo 5' del sitio de clonaje. Así resultó el pTG6511, dentro del cual se clonó, tras la digestión con BamHI y tratamiento con la ADN polimerasa Klenow, el ADNc de CFTR humano formado por un fragmento con extremos romos generados por digestión con XhoI y AvaI y tratado con la ADN polimerasa Klenow. Así se obtuvo pTG6526. A título indicativo, el ADNc de CFTR se aisló de un plásmido del campo anterior, pTG960 (Dalemans et al 1991, Nature, 354, 526-528).
2. Construcción de un vector "atenuado" que comprende una deleción desde el nucleótido 270 al nucleótido 346 de la región de encapsidación
El vector M13TG6501 se sometió a mutagénesis dirigida utilizando el oligonucleótido OTG4173 (SEQ ID Nº: 2). Después el fragmento mutado se reintrodujo en pMLP11, como se indicó anteriormente, para generar el vector pTG6501. Éste último se digerió con SphI, se trató con la ADN polimerasa del fago T4, y después con PvuI. Se obtuvo pTG6546 (Figura 2) por clonaje del fragmento PvuI-KpnI (el sitio KpnI quedando romo) aislado de pTG6525 y que comprende el ADNc de CFTR humano.
3. Construcción de un vector "atenuado" que comprende una deleción desde el nucleótido 287 hasta el nucleótido 358 de la región de encapsidación
El vector M13TG6501 se sometió a mutagénesis dirigida con la finalidad de delecionar las secuencias comprendidas entre los nucleótidos 287 y 358 de la región de encapsidación y de modificar las timinas en posición 275 y 276 con guaninas para introducir un sitio NcoI. La mutagénesis se realizó con la ayuda del oligonucleótido OTG4191 (SEQ ID Nº: 3) para dar M13TG6507. Éste último se cortó con BglII, se trató con ADN polimerasa Klenow y después se digerió con EcoRI y se purificó el fragmento correspondiente mutado, que se introdujo en pMLP11 digerido con EcoRI y SmaI. Se generó pTG6504, del que se aisló el fragmento SphI (sitio romo por tratamiento con ADN polimerasa del fago T4)-PvuI que se insertó entre los sitios KpnI (romo por tratamiento con la T4 polimeras) y PvuI de pTG6511. Se obtuvo pTG6513 que se trató con BamHI y ADN polimerasa Klenow antes de insertar el fragmento AvaI y XhoI de pTG5960 para dar pTG6526.
4. Generación de un adenovirus recombinante defectivo y atenuado
Los adenovirus defectivos recombinantes se generaron por co-transfección dentro de células 293 de pTG6525, pTG6526 o pTG6546 linearizados por ClaI y ADN genómico del Ad-dl324 (Thimmappaya et al., 1982, Cell, 31, 543-551) también digerido por ClaI, de manera que se genere un virus recombinante por recombinación homóloga. Tras entre 8 y 10 rondas, se aislaron las calvas individuales, se amplificaron dentro de las células 293 y se analizaron por mapa de restricción. Se obtuvieron los stocks virales (AdTG6525, AdTG6526 y AdTG6546) y se determinó su título según las técnicas convencionales.
El virus AdTG6546 se situó en competición por co-infección con el Ad-CFTR (Rosenfeld et al., 1992, Cell, 68, 143-155) que comprende una región de encapsidación de tipo salvaje. Se infectaron las células 293 con 5 ufp (unidades formadoras de calvas) de Ad-CFTR y con 5 upf de AdTG6546 por célula. Se aisló en paralelo el ADN viral total por el método de Hirt (Gluzman et Van Doren, 1983, J. Virol., 45, 91-103) y el ADN viral se encapsidó tras el tratamiento de las células con 0,2% de deoxidrolato y después con 10 \mug/ml de deoxiribonucleasa (DNasa)I, para eliminar los ADN no protegidos dentro de los viriones. Con la misma cantidad de ADN total de AD-CFTR y de AdTG6546, se encapsidó alrededor de 3 veces más de ADN de AdTG6546 que de ADN de Ad-CFTR.
Se midió el nivel de expresión de la proteína CFTR dentro de los extractos celulares de las células 293 infectadas con AdTG6546. El análisis se llevó a cabo por Western blot según la técnica descrita en Dalemans et al. (1991, Nature, supra) utilizando los anticuerpos monoclonales MATG1031. Pero también se puede utilizar cualquier otro anticuerpo que reconozca los epítopos antigénicos de la proteína CFTR. Se reveló un producto de un peso molecular de alrededor de 170 kDa. A título indicativo, el nivel de producción puede ser equivalente al anteriormente obtenido en los extractos celulares infectados con el virus no atenuado Ad-CFTR.
Ejemplo 2
Generación de una adenovirus defectivo con la región E1A y la totalidad de las secuencias que codifican las proteínas tempranas de la región E1B deleccionadas 1. Obtención de un adenovirus recombinante para la expresión de la proteína CFTR (AdTG6581)
Dicho adenovirus se generó a partir del vector plasmídico pTG6581 que comprende de 5' a 3':
- el ITR 5' del Ad5 (desde el nucleótido 1 al nucleótido 103),
- la región de encapsidación del Ad5 (desde el nucleótido 104 al 458),
- una secuencia nucleotídica exógena que comprende un cassette de expresión, que comprende los elementos siguientes:
\bullet
el MLP del Ad2 (nucleótidos 5779 a 6038), seguido de tres secuencias tripartitas también del Ad2 (nucleótidos 6039-6079; nucleótidos 7101-7175; nucleótidos 9637-9712); dichas secuencias están incluidos con el objetivo de incrementar la eficacia de traducción de las secuencias insertadas corriente abajo,
\bullet
un sitio de clonaje que comprende de 5' a 3' los sitios de restricción XbaI, HindIII, BamHI, EcoRV, HpaI y NotI útiles para el clonaje de un gen de interés,
\bullet
un gen de interés, como el gen que codifica la proteína CFTR,
\bullet
la señal de terminación de la transcripción aislada del virus SV40 (nucleótidos 2543 a 2618),
- la porción de genoma adenoviral del Ad5 que va desde el nucleótido 4047 al 6241.
El fragmento de genoma del Ad5 comprendido entre el nucleótido 4047 y el nucleótido 4614 se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de Ad5. En la reacción de PCR se utilizó el cebador sentido OTG5021 (SEQ ID Nº: 4), que comprende en su extremo 5' un sitio BamHI destinado a facilitar las últimas etapas de clonaje, y el cebador anti-sentido OTG5157 (SEQ ID Nº:5). El fragmento así generado se trató con ADN polimerasa Klenow, antes de ser clonado en el sitio SmaI de M13mp18 (Gibco BRL), dando el M13TG6517. La secuencia del fragmento generada por PCR se verificó según el método enzimático clásico (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 54633).
Por otra parte, el fragmento PvuI-SmaI se aisló de pMLP11. Éste se clonó entre los sitios PvuI y KpnI de pTG6511 (ejemplo 1.1), el sitio KpnI quedando romo por tratamiento con ADN polimerasa del fago T4 según los métodos estándares. Se generó así el vector pTG6547.
Éste último se digerió con los enzimas SalI y BstXI y se ligó a dos fragmentos, por una parte el fragmento BamHI-BstXI purificado de M13TG6517 y por otra parte, el fragmento XhoI-BglII de pTG6185. Éste último comprende especialmente la señal de terminación de la transcripción del virus SV40 enmarcada por los sitios de restricción XhoI y BglII. Pero se podrá utilizar cualquier otro plásmido que lleve la misma secuencia de terminación y los sitios de restricción adecuados. Así se obtuvo el vector pTG6555, dentro del cual se insertó en el sitio único BamHI un adaptador que contiene dos sitios de restricción generando dos extremos romos, EcoRV y HpaI. El adaptador proviene de la reasociación de los oligonucleótidos OTG5564 y OTG5565 (SEQ ID Nº: 6 y 7). Se obtuvo pTG6580. Por último, el fragmento SacI-PstI de pTG6525 con extremos romos y que comprende el ADNc CFTR humano, se clonó en el sitio EcoRV de pTG6580. Se generó pTG6581 (Figura 3).
El adenovirus recombinante correspondiente AdTG6581 se generó por co-transfección de pTG6581 y Ad dl324 cortados con ClaI en una línea de complementación para la función E1, como la línea 293 o una línea del ejemplo 6, según el protocolo clásico.
2. Obtención de un adenovirus recombinante para la expresión del IFN\gamma
El vector pTG6303 (Figura 4) se obtuvo por clonaje dentro del sitio HpaI de pTG6580 del fragmento HpaI-SmaI de M13TG2437. Éste último proviene del clonaje en el vector M13TG130 (Kieny et al., 1983, supra) del gen que codifica el interferón gama (IFN\gamma) en el que la secuencia es la que se especifica en Gray et al. (1982, Nature, 295, 503-508). El adenovirus recombinante AdTG6303 se obtuvo según las técnicas clásicas por recombinación homóloga resultante de la co-transfección de pTG6303 y del Ad dl324 linearizado con ClaI en una línea de complementación para la función E1.
3. Construcción de un adenovirus con la región E1 delecionada, dentro de la cual la región E3 se encuentra bajo el control de un promotor constitutivo
El vector pTG1670 se obtuvo por clonaje entre los sitios AatII y BamHI del vector ppolyII (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201), de un fragmento de PCR que contiene el LTR3' (Long Terminal Repeat) del virus RSV (Rous Sarcoma Virus). En la reacción de PCR se utilizó el vector pRSV/L (De Wet et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 725-737) como molde y los cebadores OTG5892 y OTG5893 (SEQ ID Nº: 8 y 9).
Por otro lado, la parte 5' de la región E3 (nucleótidos 27588 a 28607) se amplificó por PCR a partir del vector pTG1659 con la ayuda de los cebadores OTG5920 y OTG5891 (SEQ ID Nº: 10 y 11). Éste último se construyó en varias etapas. El fragmento BamHI-AvrII (nucleótidos 21562 a 28752) se obtuvo del ADN genómico de Ad5 y después se clonó entre los mismos sitios de pTG7457 para generar pTG1649. El vector pTG7457 es un pUC19 (Gibco BRL) modificado a nivel del sitio de clonaje de manera que contiene especialmente un sitio AvrII. Después se introdujo el fragmento EcoRI (Klenow)-AvrII de M13TG1646 (ejemplo 8) dentro de pTG1649 cortado con AvrII-NdeI (Klenow), dando el vector pTG1651. Por último, pTG1659 se generó por la inserción del fragmento AvrII (nucleótidos 28752 a 35463) purificado del ADN genómico de Ad5, dentro de pTG1651 linearizado con AvrII. El fragmento de PCR se integró entre los sitios XbaI y BamHI de p poly II, para dar pTG1671. En el sitio AatII de éste último, se insertó a continuación un fragmento EcoRV-AatII obtenido de pTG1670, para dar pTG1676.
El fragmento EcoRI de Ad5 correspondiente a los nucleótidos 27331 a 30049, se aisló a partir de una preparación de ADN genómico y se subclonó dentro de pBluescript-Sk+ (Stratagène) previamente cortado con EcoRI. Se obtuvo pTG1669. Éste se mutó (kit Amersham) por la introducción de un sitio BamHI en la posición 27867 (oligonucleótido mutágeno OTG6079; SEQ ID Nº: 12) o en la posición 28249 (oligonucleótido mutágeno OTG6080; SEQ ID Nº: 13). Se obtuvo respectivamente pTG1672 y pTG1673. Del vector pTG1676 se aisló el fragmento BamHI-BsiWI comprendiendo el LTR 3' de RSV seguido de la parte 5' de la región E3 el cual se insertó entre los sitios BamHI (posición 27331 ó 30049) y BsiW (posición 28390) de los vectores obtenidos en la etapa anterior para generar pTG1977 y pTG1978. Después el fragmento EcoRI obtenido de cada uno de los dos vectores se integró dentro de pTG1679, en sustitución del fragmento EcoRI salvaje. Se obtuvo pTG1679-E3+. A título indicativo, el vector pTG1679 resultó del clonaje del fragmento BstEII-KpnI (sitio romo por tratamiento con la T4 polimerasa) de pTG6590 (ejemplo 3.1) entre los sitios BstEII-BamHI (sitio romo por tratamiento con la Klenow polimerasa) de pTG6584 (ejemplo
3.1).
Se generó una partícula de adenovirus por recombinación homóloga dentro de una línea de complementación para la función E1, entre el fragmento AatII de pTG1679-E3+ y un vector adenoviral como el Ad dl324 o Ad-RSV\beta-gal. Éste último contiene el gen de la \beta-galactosidasa situado en la región E1 (Stratford-Perricauder et al., 1992, J.Clin. Invest., 90, 626-630).
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Ejemplo 3
Construcción de un vector adenoviral recombinante con menor capacidad de clonaje por deleción parcial de las regiones E1 y E3 1. Construcción de pTG6590DE3
El fragmento con la parte del genoma de Ad5 comprendida entre los nucleótidos 27325 y 27871 se amplificó por PCR a partir de una preparación de ADN genómico de Ad5 y con la ayuda de los cebadores OTG6064 y OTG6065 (SEQ ID Nº: 14 y 15). OTG6065 comprende en su extremo 5' un sitio BsmI, también presente dentro de la región E3 (en posición 30750).
El fragmento amplificado se clonó dentro del sitio SmaI de M13mp18, para dar M13TG6523. El fragmento EcoRI-BsmI se aisló de éste último para ser introducido dentro del vector pTG6590 cortado con los mismos enzimas. Se obtuvo pTG6590\Delta3, el cual contiene la parte 3' del genoma adenoviral (de los nucleótidos 27082 a 35935) con la región E3 comprendida entre los nucleótidos 27872 a 30740 delecionada, mientras que pTG6590 presenta delecionada una parte más pequeña de la región E3 (posición 28592 a 30470). El vector pTG6590 se obtuvo de la forma siguiente: por PCR se generó un fragmento que se extiende desde el nucleótido 35228 al 35935 (comprendiendo el ITR 3') a partir de una preparación genómica de Ad5 y con la ayuda de los cebadores OTG5481 y OTG5482 (SEQ ID Nº: 16 y 17). Éste es, posteriormente, clonado dentro del sitio SmaI de M13mp18 para dar M13TG6519. Por otra parte, el vector pTG6584 se digerió con XbaI y después se religó con el objetivo de eliminar el fragmento correspondiente de la región E3. Se obtuvo pTG6589, el cual se cortó con BamHI, se trató con la Klenow y después se digerió con BstEII. Dentro del vector así tratado se introdujo el fragmento EcoRI (Klenow)-BstEII purificado de M13TG6519, para generar pTG6590.
A título indicativo, el vector pTG6584 es un vector pUC19 (Gibco BRL) que contiene las secuencias de Ad5 que van desde el sitio único SpeI (posición 27082) hasta justo antes de la región promotora de la región E4 (posición 35826). Se obtuvo por digestión de pTG1659 (ejemplo 2.3) por SalI y SpeI, tratamiento con ADN polimerasa Klenow y religación.
2. Construcción de un vector adenoviral con la región E1 y la parte de E3 que no expresa la proteína gp19kDa delecionadas
La parte de la región E3 del Ad5 que codifica la gp19kDa (nucleótidos 28731 a 29217) se obtuvo por PCR a partir de una preparación de ADN genómico de Ad5 y utilizando los cebadores OTG5455 y OTG5456 (SEQ ID Nº: 18 y 19). El fragmento generado se introdujo dentro del sitio SmaI de M13mp18 para dar M13TG6520. Se aisló el fragmento EcoRI-XbaI de éste último, que se clonó en el sitio AatII de pTG1670 (ejemplo 2.3), quedando los extremos romos por tratamiento con la ADN polimerasa Klenow. Así, el fragmento XbaI purificado del vector de la etapa anterior se insertó dentro del sitio XbaI del vector pTG6590\DeltaE3 (ejemplo 3.1.).
3. Obtención de partículas adenovirales
Las partículas virales recombinantes se obtuvieron por ligación de los fragmentos SpeI aislados del ADN genómico de AdTG6303 o AdTG6581 y de uno u otro de los vectores de los ejemplos 3.1 y 3.2. Después la mezcla de ligación se transfectó dentro de una línea de complementación para la función E1.
\newpage
Ejemplo 4
Construcción de un adenovirus con las regiones E1 y E4 delecionadas
Se amplificaron las partes del genoma adenoviral que comprenden de los nucleótidos 31803 a 32799 y 35827 a 35935 a partir de una preparación de ADN genómico de Ad5 y de los cebadores OTG5728 y OTG5729 (SEQ ID Nº: 20 y 21) y OTG5730 y OTG5481 (SEQ ID Nº: 22 y 16) respectivamente. Tras una decena de ciclos de amplificación, la reacción se siguió a partir de una alícuota de dos mezclas de reacción utilizando los oligonucleótidos OTG5728 y OTG5781. El fragmento amplificado se extiende desde el nucleótido 31803 al 35935 con una deleción de la totalidad de la región E4 (posiciones 32800 a 35826). Tras la digestión con EcoRI y HindIII, se clonó entre los mismos sitios de M13mp18 para dar M13TG6521.
M13TG6521 se digerió con EcoRI, se trató con la ADN polimerasa klenow y se cortó con BstXI. El fragmento de 0,46 kb que lleva el ITR 3' se insertó entre el sitio BamHI romo por tratamiento con la ADN polimerasa klenow y el sitio de pTG6584 (ejemplo 3.1). Se obtuvo pTG6587, que se digerió con XbaI y se religó consigo mismo, para dar pTG6588 (deleción de E3).
En el sitio PacI de pTG6588 se introdujo un fragmento de ADN sintético proveniente de la reasociación de los oligonucleótidos OTG6060, OTG6061, OTG6062 y OTG6063 (SEQ ID Nº: 23 a 26). Resultó pTG8500 dentro del cual las señales de terminación de la transcripción de los genes tardíos L5 están menguadas.
Se generó una partícula adenoviral (Ad\DeltaE4), en la que el genoma tiene delecionada la totalidad de la región E4 (nucleótidos 32800 a 35826) y el fragmento XbaI de la región E3 (nucleótidos 28592 a 30470), por ligación de los fragmentos SpeI aislados de pTG8500 o pTG6588 y del Ad5. La mezcla de ligación se transfectó en una línea celular de complementación para la función E4, por ejemplo la línea W162 (Winberg et Ketner, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5383-5386). Se obtuvo un adenovirus defectivo para las funciones E1 a E4 (\DeltaE1, \DeltaE4) por transfección en una línea de complementación para E1 y E4 (por ejemplo la línea del ejemplo 8) de la mezcla de ligación entre el genoma del Ad dl324 y el plásmido pTG8500 o pTG6588 linearizado con SpeI.
Por otra parte, se puede proceder también de la manera siguiente. Se clona el fragmento SpeI-ScaI aislado de pTG1659 (ejemplo 2.3) en el vector pTG6588 digerido con los mismos enzimas para obtener pTG6591. Este último comprende las secuencias del Ad5 de los nucleótidos 21062 a 35935 pero, como anteriormente, con la totalidad de la región E4 y el fragmento XbaI de la región E3 delecionados. En el vector pTG6591 digerido por PacI se introdujo el fragmento de ADN sintético descrito anteriormente y se generó pTG6597. Las partículas adenovirales se pueden obtener por recombinación homóloga entre el ADN genómico del Ad dl324 digerido con SpeI y los plásmidos pTG6591 o pTG6597 digerido con BamHI.
Ejemplo 5
Construcción de un virus "mínimo"
Un vector adenoviral denominado "mínimo" está constituido por el clonaje en un plásmido de los elementos siguientes:
- el ITR 5' del Ad5 (de los nucleótidos 1 a 103);
- la región de encapsidación del Ad5 (de los nucleótidos 104 a 458);
- una secuencia nucleotídica exógena comprendiendo:
\text{*}
un primer gen de interés terapéutico situado preferentemente bajo el control de su propio promotor con el objetivo de obtener una regulación de la expresión lo más parecida posible a la regulación natural,
\text{*}
un segundo gen de interés constituido por un gen de la TK-HSV-1, y
\text{*}
de manera facultativa, las secuencias nucleotídicas que se añaden por razones de eficacia de replicación o de encapsidación, de manera que el tamaño total del genoma a encapsidar suele comprender entre 30 y 36 kb;
\text{*}
las secuencias que codifican la proteína Gal4 de Saccharomyces cerevisiae (Laughon et Gestelandk, 1984, Mol. Cell. Biol., 4, 260-267) situado bajo el control de un promotor funcional dentro de una célula eucariota superior; y
- el ITR del Ad5 (de los nucleótidos 35833 a 35935).
El ensamblaje de los diferentes elementos se realizó siguiendo técnicas estándares de biología molecular. La obtención de viriones infectivos que presentan dicho vector se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente en una línea de complementación del ejemplo 7.
Ejemplo 6
Constitución de una célula de complementación capaz de complementar en trans la función E1 1. Constitución de una célula de complementación que comprende la región E1 de los nucleótidos 100 a 5297 (pTG6533)
Ésta presenta:
- un cassette de expresión del gen pac, el cual se encuentra situado bajo el control del promotor temprano del virus SV40 (nucleótidos 5171 a 5243) y presenta en el extremo 3' la señal de terminación de la transcripción de SV40 (nucleótidos 2543 a 2618). El gen pac utilizado corresponde a un fragmento que va desde el nucleótido 252 al nucleótido 905 de la secuencia publicada por Lacalle et al. (1989, Gene, 79, 375-380) y presenta 4 mutaciones en la secuencia publicada (C en posición 305 sustituida por A; C en posición 367 sustituida por T; inserción de una G en la posición 804; deleción de una G en la posición 820),
- un fragmento del genoma de Ad5 que va de los nucleótidos 100 a 5297. El fragmento presenta las regiones E1A y E1B con su propio promotor y su señal de terminación de la transcripción, así que una fracción de la región E2, recobra así las secuencias que codifican la proteína IX - A título indicativo, parece que la línea 293 no es capaz de producir una proteína IX funcional.
La construcción se realizó en varias etapas detalladas a continuación. El vector p poliIII-I* (Lathe et al., 19877, Gene, 57, 193-201) se sometió a una digestión con los enzimas AccI y EcoRI. En el vector así tratado se clonó el fragmento EcoRI-ClaI aislado del plásmido pTG6164. Así se obtuvo el vector pTG6528.
El plásmido pTG6164 es producto de pLXSN (Miller D, 1989, Bio/Techniques, 7, 980) y comprende el gen pac situado bajo el control del promotor temprano del virus SV40. Brevemente, el fragmento HindIII-KpnI de pLXSN se introdujo dentro de M13TG131 para producir M13TG4194. En éste último se insertó, digerido por NheI y KpnI, el fragmento NheI-KpnI de pMPSV H2 K IL2R (Takeda et al., 1988, Grow Factors, 1, 59-66) para producir M13TG4196. Éste se digerió con HindIII-KpnI, se clonó el fragmento producto de una digestión con HindIII y de una digestión parcial con KpnI y se purificó de pLXSN. Se obtuvo pTG5192. Éste último se digerió con HindIII y parcialmente con NheI y se introdujo el fragmento HindIII-NheI de pBabe Puro (Land et al, 1990, Nucleic Acids Res., 18, 3587), dando lugar a pTG6164.
El vector pTG6528 se digerió con PstI y se introdujo a nivel del fragmento PstI aislado de pTG6185 (ejemplo 2.1) presentando la señal de terminación de la transcripción de SV40. Se obtuvo pTG6529. Este último se sometió a una digestión EcoRI-HpaI y se ligó a dos fragmentos, por una parte un fragmento BspEI-BcgI (posiciones 826 a 5297) purificado del ADN genómico de Ad5 y por otra parte un fragmento generado por PCR con los extremos EcoRI y BspEI, para dar pTG6531. El fragmento de PCR se generó por amplificación génica a partir del ADN genómico del Ad5 y de los cebadores OTG4564 y OTG4565 (descrito en las SEQ ID Nº: 27 y 28). El fragmento amplificado se digerió con los enzimas EcoRI y BspEI y se dejó en ligación como se indica dentro del parágrafo anterior.
El vector pTG6531 comprende las 2 unidades de transcripción (la de la región E1 y la del gen pac) con la misma orientación. Para evitar las interferencias a nivel de transcripción, se sitúan en una orientación cabeza-cola (opuesta una con respecto a la otra) al tratar el pTG6531 con BamHI y al religar. El vector pTG6533 corresponde a un clon que presenta la orientación opuesta de las dos unidades.
El vector pTG6533 se transfectó en una línea celular de mamífero, por ejemplo la línea Vero (ATCC, CCL81) o A549 (ATCC, CCL185) por la técnica de fosfato de calcio. Las células transfectadas son cultivadas según las recomendaciones del fabricante y se dejan 24 horas tras la transfección en medio selectivo que contiene puromicina (concentración 6 \mug/ml). Se seleccionaron los clones resistentes sobre los cuales se evaluó la expresión de los genes de la región E1, con el objetivo de determinar el clon capaz de llevar a cabo una mayor producción, para poder ser utilizado como línea de complementación para la preparación de un adenovirus defectivo para la función E1, tal como el que se detalla en el ejemplo 2.
Se analizó la expresión de las secuencias que codifican las proteínas tempranas de la región E1 por Northern Blot, utilizando las sondas apropiadas marcadas con el isótopo ^{32}P. La producción de las proteínas codificadas por la región E1A se detectó por inmunoprecipitación tras el marcaje de las células con el isótopo ^{35}S y con la ayuda de un anticuerpo comercial (Oncogène Science Inc., referencia DP11).
También se puede verificar la capacidad de los productos de expresión de la región E1A para activar el promotor de la región E1B (mediante el análisis de los ARNm E1B por Northern blot) o para activar el promotor de la región E2 (por cuantificación de la actividad enzimática tras la transfección transitoria con un plásmido "reporteur" que presenta el gen de la CAT (Cloranfenicol Acetil Transferasa) situado bajo el control del promotor E2).
Por último, las células se pueden infectar con el Ad-RSV-\betagal (Stratford-Perricaudet et al., 1992, supra) y se puede titular el virus por la técnica del agar cuando se observe un efecto citopático. En general, se procede del modo siguiente: las células son infectadas a una moi (multiplicidad de infección) de 10. Alrededor de 48 horas tras la infección, el efecto citopático es visible, entonces se lisan las células y se cuantifica la actividad \beta-galactosidasa según el protocolo convencional (ver por ejemplo Maniatis et al., 1989, supra). Los clones positivos son reinfectados a una moi más pequeña. 48 horas tras la infección, se recoge el sobrenadante y las células, según las técnicas clásicas. Se determina el título viral por el método del agar utilizando las células 293. El resultado del título obtenido en el título de partida constituye el factor de amplificación.
2. Construcción de una línea celular de complementación que presenta la región E1 desde el nucleótido 505 al 4034 (pTG6557, pTG6558, pTG6559, pTG6564 y pTG6565)
Los vectores pTG6557, pTG6558 y pTG6559 comprenden:
(i) un cassette de expresión del gen pac (nucleótidos 252 a 905 como anteriormente) bajo el control:
-
del promotor E2A del Ad2 (nucleótidos 27341 a 27030) (dentro de pTG6558)
-
del promotor E2A del Ad2 con las secuencias comprendidas entre los nucleótidos 27163 a 27182 delecionadas (para pTG6557). Dicha mutación permite disminuir el nivel basal del promotor E2A, sin afectar la inductibilidad por parte de la proteína activadora en trans codificada por E1A, o
-
del promotor temprano SV40 para pTG6559.
En el tercer caso, comprende igualmente en 3' la señal de terminación de la transcripción del virus SV40 (nucleótidos 2543 a 2618); y
(ii) un cassette de expresión que presenta la parte de la región E1 del Ad5 que comprende desde el nucleótido 505 al 4034. Dicha porción del genoma adenoviral contiene la totalidad de las secuencias que codifican las proteínas tempranas de la región E1A, la señal de terminación de la transcripción de la unidad E1A, el promotor E1B (inducible por la proteína activadora en trans codificada por E1A) y la totalidad de las secuencias codificantes de la región E1B. También incluye las secuencias que codifican la proteína IX, que se solapa con la región E1B. Sin embargo, se encuentra desprovista del promotor de la región E1A y de la señal de terminación de la transcripción de las unidades transcripcionales E1B y IX. Con el objetivo de permitir la expresión de las secuencias de la región E1, en el extremo 5' del fragmento adenoviral se introdujo el promotor del gen de la pGK murina y en el extremo 3' la señal de terminación de la transcripción del gen de la \beta-globina de conejo (nucleótidos 1542 a 2064 de la secuencia publicada en el banco de donación Genebank bajo la referencia K03256).
De manera facultativa, también se puede introducir cualquier secuencia nucleotídica, por ejemplo las aisladas de pBR322 (Bolivar et al., 1977, Gene, 2, 95-113), entre los cassettes de expresión del gen pac y de la región E1; con el objetivo de evitar eventuales interferencias transcripcionales.
La construcción de dichos vectores se efectúa en varias etapas descritas a continuación.
En primer lugar, se amplificó por PCR la parte del genoma de Ad5 que comprende desde el nucleótido 505 hasta el nucleótido 826 a partir de una preparación genómica y de los cebadores OTG5013 que presenta en el extremo 5' un sitio PstI útil para las últimas etapas de clonaje (SEQ ID Nº: 29) y OTG4565 solapando el sitio BspE1 (SEQ ID Nº: 28). El fragmento generado por PCR se trató con ADN Polimerasa Klenow y se introdujo dentro del sitio SmaI de M13mp18, dando lugar a M13TG6512. La secuencia de fragmento de PCR se verificó.
El vector pTG6533 (ejemplo 6.1) se digerió con los enzimas EcoRI y BspE1. El vector así tratado se ligó con, por una parte, el fragmento PstI-BspE1 aislado de M13TG6512 y por otra parte, el fragmento EcoRI-PstI aislado de pKJ-1. Éste último comprende la porción del promotor del gen de la PGK murina, situado entre los nucleótidos -524 y -19, dando la secuencia que está descrita en Adra et al. (1987, Gene, 60, 65-74). Dicha etapa da lugar a pTG6552 y permite la inserción del promotor del gen de la PGK murina corriente arriba de la región E1 del Ad5, que se inicia en el nucleótido 505.
Por otra parte, el fragmento XhoI-BamHI, en el que el extremo generado por XhoI es romo debido al tratamiento con ADN polimerasa Klenow, es purificado de pBCMG Neo (Karasuyama et al., 1989, J. Exp. Med., 169, 13-25). Dicho fragmento, que comprende la señal de terminación de la transcripción del gen de la \beta-globina de conejo, se introdujo entre los sitio SmaI y BamHI del vector p polyII-Sfi/Not-14* (Lathe et al., 1987, Gene, 57, 193-201). El vector pTG6551 resultante, es digerido con los enzimas SphI y EcoRV con el objetivo de insertar un fragmento del genoma de Ad5 que comprende desde el nucleótido 3665 al nucleótido 4034. Dicho fragmento es generado por PCR según el protocolo estándar. Para ello, se utiliza una preparación de ADN genómico de Ad5 como molde y los cebadores OTG5015 que recupera el sitio interno SphI en posición 3665 (SEQ ID Nº: 30) y OTG 5014 que comprende en el extremo 5' un sitio BglII (SEQ ID Nº: 31).
El fragmento de PCR se trató con la ADN polimerasa Klenow antes de ser clonado en el sitio SmaI de M13mp18, generando así M13TG6516. Tras la verificación de su secuencia, el fragmento de PCR se digerió con BglII, se trató con ADN polimeraa Klenow y se digerió con SphI. Éste se insertó entre los sitios SphI y EcoRV de pTG6551. Así resultó pTG6554.
Por otra parte, el vector pTG6529 (ejemplo 6.1) se sometió a una digestión con los enzimas HpaI y HindIII. Se purificó el fragmento de 2,9 kb que comprende el gen pac, seguido de la señal de terminación de la transcripción del virus SV40. Éste se ligó al fragmento SmaI-HindIII aislado de pE2 Lac (Boeuf et al., 1990, Oncogene, 5, 691-699) que presenta el promotor E2A del Ad2. Así se obtuvo el vector pTG6556. De forma alternativa, puede estar ligado al fragmento SmaI-HindIII aislado de pE2 Lac D9170 (Zajchowski et al., 1985, EMBO J., 4, 1293-1300) que presenta el promotor E2A mutado del Ad2. En ese caso se obtuvo pTG6550.
pTG6556 se digerió con los enzimas EcoRI y BamHI. Entre dichos sitios se insertó el fragmento EcoRI-SacII, aislado de pTG6552 y el fragmento SacII-BamHI aislado de pTG6554. Así se obtuvo el vector pTG6558. La misma etapa se realizó con pTG6550 y pTG1643 (ejemplo 7.1), generando pTG6557 y pTG6559 respectivamente.
Los vectores pTG6557 y pTG6558 se digirieron con EcoRV, sitio único situado entre los dos cassettes de expresión (gen pac y región E1). En este sitio se clonó un fragmento EcoRV-PvuII de 1,88 kb aislado de pBR322 (Bolivar et al., supra), con el objetivo de elongar los dos promotores. Así se generó respectivamente pTG6564 y pTG6565.
Los vectores pTG6557, pTG6558, pTG6559, pTG6564 y pTG6565 fueron transfectados en la línea celular A549. Tal como se ha descrito anteriormente, se seleccionaron los clones resistentes a la puromicina y se verificó la expresión de la región E1. Los clones que expresaban E1 se destinaron a amplificar y propagar los adenovirus defectivos para la función E1. La producción de los productos de expresión de E1 se acompaña de un efecto citotóxico, pero el análisis por Southern no permite detectar las modificaciones de los vectores. Tras la infección por el Ad-RSV-\betagal, los clones positivos fueron capaces de amplificar el virus con un factor superior a 100.
3. Construcción de una célula de complementación inducible por la proteína Gal4 de Saccharomyces cerevisiae
Estos vectores comprenden como anteriormente la parte de la región E1 del Ad5 que va desde el nucleótido 505 al 4034. Sin embargo, la expresión de las secuencias de la región E1A se encuentra bajo el control de un promotor inducible constitutivo de una parte del promotor mínimo MLP de Ad2 (TATA box y señal de iniciación de la transcripción; nucleótidos -34 a +33) y por otra parte de una secuencia de activación del gen de Gal 10 activable por la proteína Gal4. La secuencia consenso de activación de 17 nucleótidos (17MX), que corresponde al sitio de fijación de Gal4 está especificado en Webster et al., (1988, Cell, 52, 169). La señal de terminación de la transcripción del gen de la \beta-globina de conejo está situado en el extremo 3' de la unidad transcripcional E1B.
Se sintetizó un primer fragmento de ADN que comprende un dímero de la secuencia 17MX (SEQ ID Nº: 32 y 33) seguido del promotor mínimo MLP de Ad2, en su extremo 5' de un sitio SalI y en su extremo 3' de un sitio BamHI. El sitio SalI es romo por tratamiento con la ADN polimerasa klenow. Por otra parte, se sintetizó un segundo fragmento de ADN que comprende un pentámero de la secuencia seguido del mismo promotor y en los extremos 5' y 3' de los sitios XbaI y BamHI. Tras la digestión con XbaI, el extremo es romo por tratamiento con la Klenow
polimerasa.
Cada uno de estos fragmentos se introduce dentro del sitio BglII de p poly II para generar respectivamente pTG1656 y pTG1657. Después se introdujo en cada uno de los vectores previamente digeridos con PstI-BamHI, los dos fragmentos siguientes: el fragmento PstI-XbaI aislado de pTG6552 (Ejemplo 6.2) y el fragmento XbaI-BamHI aislado de pTG6559 (ejemplo 6.2). Así se obtuvo pTG1660 y pTG1661 respectivamente (Figura 5).
Las células A549 se co-transfectaron con pTG1643 (vector de expresión del gen pac) y o bien con pTG1660 o bien con pTG1661. Los clones se seleccionaron por la resistencia a puromicina y se estudió tal como se ha indicado anteriormente. Alrededor del 50% de los clones A549-1660 y A549-1661 produjeron los productos de expresión de la región E1. Sin embargo, la producción se acompaña de un efecto citotóxico, modificando el aspecto morfológico de las células.
La integración y la no modificación de los plásmidos dentro del genoma celular se verificó por Southern. Ninguna modificación substancial de los plásmidos integrados (pTG1643, pTG1660 y pTG1661) se pudo poner en evidencia en los clones productores analizados. También se pudo verificar la inductibilidad de la expresión de las secuencias que codifican la región E1A en presencia de Gal4 (por transformación por un plásmido, permitiendo la expresión constitutiva de la proteína Gal4).
Tras la infección de los clones positivos productores por el Ad-RSV-Bgal a una moi de alrededor de 2, diez clones A549-1660 fueron capaces de amplificar el stock viral en un factor superior a 100.
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Ejemplo 7
Constitución de una línea celular de complementación para el ensamblaje de las funciones esenciales para la replicación de un adenovirus
Se construyó un vector que comprendía el ensamblaje del genoma adenoviral del Ad5 a excepción del ITR 5', el ITR 3' y la región de encapsidación.
El vector pTG6528 (ejemplo 6.1) se digerió con los enzimas PstI y BglII, entre los cuales se insertó un fragmento de ADN sintetizado químicamente según el protocolo estándar, constituido por los oligonucleótidos de OTG5039 y OTG5040 (SEQ ID Nº: 34 y 35). La secuencia de estos oligonucleótidos no reconstituye el sitio de clonaje PstI y se introduce un sitio EcoRV. Se obtuvo pTG1639, el cual se linearizó por digestión con EcoRV y se ligó a un fragmento XbaI-BamHI en el que los extremos son romos por tratamiento con la ADN polimerasa Klenow. El fragmento presenta una señal de terminación de la transcripción del virus SV40. En esta etapa también se puede utilizar cualquier plásmido que presenta una señal enmarcada por los sitios de restricción adecuados.
El vector pTG1640 generado de este modo, se digerió con BamHI y BglII y el fragmento portador del cassette de expresión del gen pac se introdujo dentro del sitio BglII del vector pPolyII-Sfi/Not-14. Así se obtuvo el pTG1641. Éste se linearizó con NotI y se trató con la ADN Polimerasa Klenow. Se introdujo el fragmento BamHI-SalI de 0,276 kb aislado de pBR322 (Bolivar et al., supra), también tratado con la ADN polimerasa Klenow. Éste dió lugar al pTG1643.
El pTG1643 se linearizó con XhoI, en cuyo sitio se insertó un fragmento híbrido XhoI que comprende un dímero 17MX seguido del promotor mínimo del gen de la TK-HSV-1 (nucleótidos 303 a 450 de la secuencia publicada en el banco de donación Genebank bajo la referencia V00467 y completado en el extremo 3' con un sitio XhoI). Así se obtuvo el pTG1647, dentro del cual el promotor híbrido 2x17MX-TK-HSV-1 está insertado con la misma orientación que el cassette de expresión del gen pac.
Dicha construcción, pTG1647, sirve de vector de base para introducir entre los sitios PstI y BamHI un fragmento de genoma del Ad5, que comprende desde el nucleótido 505 al nucleótido 35826. Al principio, el pTG1647 se digerió con PstI y BamHI y se ligó, de una parte, con el fragmento PstI-ClaI de pTG6552 (ejemplo 6.2) comprendido por la parte del genoma del Ad5 de los nucleótidos 505 a 918 y, por otra parte, con el fragmento ClaI-BamHI (posiciones 918 a 21562) preparado a partir del ADN genómico del Ad5. El vector así obtenido, comprende la parte 5' del Ad5 a excepción del ITR5' y de la región de encapsidación.
Por otro lado, la parte 3' del genoma del Ad5 se ensambló en el vector ppolyII-Sfi/Not-14*. Éste último se linearizó con BamHI y se introdujo el fragmento BamHI-AvrII (nucleótidos 21562 a 28752) del genoma del Ad5 y un fragmento de PCR correspondiente a los nucleótidos 35463 a 35826 del Ad5. Éste último se generó a partir del ADN genómico del Ad5 y de los cebadores OTG5024 (SEQ ID Nº: 36) y OTG5025 (SEQ ID Nº: 37) y presenta en el extremo 5' un sitio BamHI. El vector obtenido se digerió con AvrII y se insertó el fragmento AvrII aislado del ADN genómico del Ad5 que comprende de las posiciones 28753 a 35462.
El fragmento BamHI que comprende las secuencias adenovirales se introdujo en el sitio BamHI del vector de la etapa anterior que comprende el extremo 5' del genoma adenoviral desprovisto del ITR 5' y la región de encapsidación.
Una línea celular de complementación capaz de complementar el ensamblaje de las funciones de un adenovirus defectivo, se generó por transfección en una línea celular como A549, según el protocolo descrito en los ejemplos anteriores.
Se puede proceder igualmente en la construcción de cuatro vectores que comprenden la casi totalidad del genoma adenoviral, que será reensamblado en su vector en la etapa final.
- pTG1665 corresponde al clonaje del fragmento BspE1 (nucleótidos 826 a 7269) aislado de una preparación de ADN genómico de Ad5, en el sitio XmaI de p poly II-Sfi/Not-14*;
- pTG1664 se generó por la inserción del fragmento NotI (nucleótidos 6503 a 1504) aislado de una preparación de ADN genómico de Ad5, en el sitio NotI del mismo vector.
- pTG1662 se obtuvo por la introducción del fragmento AatII (nucleótidos 10754 a 23970) aislado de una preparación de ADN genómico de Ad5 en el sitio AatII de p polyII.
- pTG1659 comprende la parte 3' del genoma de Ad5 (ejemplo 2.3).
Después se introdujo un fragmento que comprende un sistema de expresión inducible, como el promotor descrito en el ejemplo 6.3 o 7 inducible por Gal4 o un promotor del campo anterior, como el promotor metalotioneína o tetraciclina. Dicho fragmento se sitúa corriente arriba de las secuencias 5' del Ad5 (nucleótidos 505 a 918) dentro del vector pTG1665 digerido por AatII y ClaI. Finalmente, se clonó sucesivamente en el vector precedente y en los sitios correspondientes los fragmentos NotI de pTG1664, AatII de pTG1662 y por último BamHI de pTG1659.
Una línea celular de complementación se generó por co-transfección del vector precedente y de PTG1643 y se aislaron los clones resistentes a la puromicina. Dicha línea se destina más concretamente a amplificar y encapsidar los vectores adenovirales del ejemplo 5 defectivos para las funciones E1, E2 y E4 y las funciones tardías.
\newpage
Ejemplo 8
Constitución de una línea celular de complementación para las funciones E1 y E4
El vector pTG1647 (ejemplo 7) se digerió con los enzimas PstI-BamHI, en el que se introdujo 3 fragmentos:
- el fragmento PstI-XbaI de pTG6552 (ejemplo 6.2) comprendiendo las secuencias de Ad5 desde el nucleótido 505 al nucleótido 1339,
- el fragmento XbaI-SphI de pTG6552 que lleva las secuencias de Ad5 desde el nucleótido 1340 al nucleótido 3665, y
- el fragmento SphI-BamHI de pTG6554 (ejemplo 6.2) comprendiendo las secuencias de Ad5 desde el nucleótido 3665 al 4034 y una señal de terminación de la transcripción.
El vector así obtenido se digerió con BamHI y se introdujo en dicho sitio tres fragmentos que son los siguientes:
- un fragmento digerido con BamHI-AflII generado por PCR, correspondiente a la secuencia del Ad5 situado entre las posiciones 32800 a 33104. Se utilizó el ADN genómico del Ad5 como molde y los cebadores OTG5078 (SEQ ID Nº: 38) y OTG5079 (SEQ ID Nº: 39),
- el fragmento AflII-AvrII aislado del ADN genómico de Ad5 (nucleótidos 33105 a 35463),
- el fragmento AvrII-BamHI generado por PCR con la ayuda de los cebadores OTG5024 y OTG5025 (ver el ejemplo 7).
El vector así generado se introdujo en una línea celular siguiendo el protocolo descrito anteriormente, para constituir una línea de complementación para las funciones E1 y E4.
Por otra parte, también se puede obtener dicha línea siguiendo el protocolo siguiente:
La región E4 del genoma del Ad5 (nucleótidos 32800 a 35826) se reconstituyó en varias etapas. La parte comprendida entre el nucleótido 33116 al 32800 se sintetizó por PCR a partir del ADN genómico de Ad5 con la pareja de cebadores OTG5078 y OTG5079 (SEQ ID Nº: 38 y 39), y después se insertó en el sitio EcoRV de M13TG130 para generar M13TG1645.
Se llevó a cabo una reacción de ligación entre el fragmento BamHI-AflII, el fragmento AflII-AvrII de Ad5 (nucleótidos 33104 a 35463) y el vector pTG7457 digerido con BamHI y AvrII. Así se obtuvo pTG1650.
Y después se completó la región E4 para obtener el fragmento que comprende desde el nucleótido 35826 al 35457 por PCR, a partir de una preparación de ADN genómico de Ad5 y de los cebadores OTG5024 y OTG5025 (SEQ ID Nº: 36 y 37). Ésta se insertó en el sitio SmaI de M13mp18 para dar M13TG1646. El fragmento AvrII-EcoRI se aisló de éste último y se clonó entre los sitios AvrII y EcoRI de pTG1650. Así se obtuvo pTG1652.
El fragmento BamHI que comprende la región E4 de Ad5 se aisló de pTG1652 y se clonó en el sitio BamHI de pTG1643, de pTG6559 (ejemplo 6.2) o en el sitio SspI de pTG6564 (ejemplo 6.2) para, tras conseguir los extremos romos, generar pTG1653, pTG1654 y pTG1655 (Figura 6) respectivamente.
Por las técnicas convencionales se generó una célula de complementación capaz de complementar en trans las funciones E1 y E4, por:
(1) transformación de pTG1653 dentro de la línea celular 293, o
(2) transformación de pTG1654 o pTG1655 en la línea celular A549.
De forma general, la expresión de los productos de las regiones E1 y E4 se acompaña de un efecto citotóxico. Un cierto número de clones 293-1653 es capaz de complementar a la vez los adenovirus con la E1 delecionada y los adenovirus con la E4 delecionada.
Otra alternativa consiste en proceder del siguiente modo.
El vector M13TG1646 se sometió a mutagénesis dirigida con el oligonucleótido mutágeno OTG5991 (SEQ ID Nº:40) con el objetivo de delecionar el promotor de la región E4 y de insertar un sitio HpaI. El vector mutado se denominó M13TG6522. Se digerió por PstI, se trató con ADN polimerasa del fago T4 y después por AvrII y se dejó en la mezcla de ligación con un fragmento EcoRI (Klenow)-AvrII purificado de pTG1652 (ejemplo 8), para dar pTG6595. Éste último se cortó con HpaI y en él se intodujo el fragmento de 0,8 kb obtenido de pTG5913 (Figura 7) tras la digestión con BglII y BamHI y posterior tratamiento con la Klenow. Se generó pTG6596 dentro del cual la región E4 (posiciones 32800 a 35826) se situó bajo el control del promotor TK. A título indicativo, pTG5913 presenta el gen de la TK-HSV-1 y el fragmento BglII-BamHI correspondiente a un promotor de dicho gen (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 1441-1445).
Paralelamente, los vectores pTG1643 y pTG6559 (ejemplo 6) se linearizan con BamHI y en ellos se insertó un fragmento sintético producto de la reasociación de los oligonucleótidos OTG6141 y OTG6142 (SEQ ID Nº: 41 y 42), para obtener respectivamente pTG8508 y pTG8507. Éstos últimos son digeridos con BamHI antes de serles introducidos el fragmento BamHI purificado de PTG6596 que comprende el cassette de expresión de E4. Se generaron los vectores pTG8512 (Figura 8) y pTG8513 (Figura 9).
Por otra parte, la introducción del fragmento BamHI de pTG1652 en el vector pTG8508 o pTG8507 linearizado con el mismo enzima dió lugar a pTG8514 y pTG8515 respectivamente (Figuras 10 y 11).
Las líneas celulares transfectadas por pTG8512 o pTG8515 permitieron complementar un adenovirus defectivo para la función E4, mientras que las resultantes de la transfección de pTG8513 o pTG8514 se destinan a amplificar y propagar los adenovirus defectivos para las funciones E1 y E4. De forma análoga, la transfección de pTG8512 o pTG8515 dentro de las células 293 permitieron complementar los adenovirus defectivos para E1 y E4.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: TRANSGENE
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 11, rue de Molsheim
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: ESTRASBURGO
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 67082
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: (33) 88.27.91.00
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
FAX: (33) 88.22.58.07
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos adenovirus defectivos y líneas de complementación correspondientes
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 42
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR COMPUTADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release X1.0, Version #1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG4174)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGACGTCTT TGGTGTTTTC GCGGGAAAAC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG4173)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCGAGTAAG ATTTGTCTAG GGCCGCGGGG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG4131)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCCATGGTC GCGGGAAAGG GACTTTGACC GTT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5021)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAACGGATCC CCAGACTCTG TTTGGATTTG G 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5157)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAGAAATAT CTTCGCCCAG GCCGCCGCCC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5564)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCCGATAT CCCGTTAACC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTGS565)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCGGTTAA CGGGATATCG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5892)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCGTAGGAT CCAGCTGCTC CCTGCTTGTG TGTTGGAGGT CGCTGAG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5893)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTAGCTGACG TCCCAGGTGC ACACCAATGT GGTGAATGGT CAAATGG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5920)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACGGTAGGAT CCGACGTCGG TGAGCTCCTC GCTTGGTCTC CGTCCG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5891)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAACCCCGAT TCTAGAGAAA CCTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de secuencia (OTG6079)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGCAGTTGC TCTGCGGATC CACTTAACAT TCAGT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG6080)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAAAAGTACC AGGTAAGGAT CCCCTTGGTT TGCTTGGG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG6064)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAACCGAAT TCTCTTGGAA C 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG6065)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACGAATGCAG CTCTCCACTT AACATTCAGT CG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5481)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTGAATTC ATCATCAATA ATATACC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5482)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAACTGGTCA CCGTGATTAA AAAG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5455)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCGGAATTC AAGATGATTA GGTAC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5456)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCGTCTAGA TTAAGGCATT TTCTTTTC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5728)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTAGCAGGA GGACTAAG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5729)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGCATTAAT TAACCGCGAC AAACGATTCT TTATTCTTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (5730)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCGGTTAAT TAATGCGGTA AAACCTACGT CACCCG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG6060)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATAAAAGAT CATTATTTTC ATTAGAACTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG6061)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTGTTGGTT TTTTGTGTGT TAAT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG6062)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAACACACAA AAAACCAACA CACAGTTCTA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG6063)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGAAAATAA TGATCTTTTA TTAT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG4564)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCGTGAATT CTAGTAGTGT GGCGGAAGTG TG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG4565)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCAGTCCGG AGAACCGGGC GCC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5013)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAACCTGCAG GAGTGCCAGC GAGTAGAG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5015)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAACGCGCAT GCCCCCATGG G 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5014)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGGAGATCT GTTTTAAACC GCATTGGGAG G 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGAGTACTG TCCTCCGCGG AGTACTGTCC TCCG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGAGGACAG TACTCCGCGG AGGACAGTAC TCCG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5039)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCTGGATAT CAGTCA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5040)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCTGACTG ATATCCAGCA TGCA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 36
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5024)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCCTGCCTA GGCAAAATAG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5025)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCAGATGGAT CCGGGCGGAG TAACTTGTAT GT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5078)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCGCGGATC CGTTATGTTT CAACGTGTTT A 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5079)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACATGAACTT AAGCGAGCTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG5931)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACGGCACCA GCTCAAGTTA ACGGATCCAT CTGCGGGT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG6141)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCCTGTGT GTTGGTTTTT TGTGTGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido de síntesis (OTG6142)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCGCACAC AAAAAACCAA CACACAG 
\hfill

Claims (15)

1. Una línea celular de complementación propia de la producción de partículas de adenovirus destinadas a un uso terapéutico o profiláctico en humanos y que dicha línea celular de complementación conlleva un elemento de complementación; dicho elemento de complementación está caracterizado por el hecho de que comprende como único ADN adenoviral la parte de la región E1A que codifica las proteínas tempranas de la región E1A y la totalidad de las secuencias que codifican las proteínas tempranas de la región E1B situada bajo el control de su propio promotor, y por el hecho de que la expresión de la parte de la región E1A está situada bajo el control de un promotor heterólogo; y dicho elemento de complementación:
(a) es capaz de complementar en trans un vector adenoviral que procede de un adenovirus humano y que es defectuoso para la función E1; y
(b) está integrado en el genoma de dicha línea celular de complementación.
2. La línea celular de complementación según la reivindicación 1, en la que el adenovirus es un adenovirus humano de tipo 5.
3. La línea celular de complementación según la reivindicación 1 ó 2, en la que la región E1A se encuentra bajo el control de un promotor inducible por una proteína activadora en trans de la transcripción no adenoviral.
4. La línea celular de complementación según la reivindicación 3, en la que dicha proteína activadora en trans de la transcripción no adenoviral está codificada por un vector adenoviral recombinante; dicho vector adenoviral se encuentra bajo el control de elementos necesarios para su expresión en una célula hospedadora y comprende un gen que puede codificar especialmente una proteína activadora en trans de transcripción Gal4 de Saccharomyces cerevisiae.
5. La línea celular de complementación según la reivindicación 3 ó 4, en la que la región E1A se encuentra bajo el control de un promotor inducible por una proteína activadora en trans de transcripción Gal4 de Saccharomyces cerevisiae.
6. La línea celular de complementación según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, que comprende además un gen que codifica un marcador de selección.
7. La línea celular de complementación según la reivindicación 6, en la que el gen de selección codifica la puromicina acetil-transferasa.
8. La línea celular de complementación según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, derivada de una línea celular aceptable desde un punto de vista farmacéutico.
9. La línea celular de complementación según la reivindicación 8, derivada de una línea celular seleccionada entre las líneas Vero, BHK, A549, MRC5 y W138.
10. La línea celular de complementación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, derivada de una célula de la retina de un embrión humano.
11. La línea celular de complementación según las reivindicaciones de la 1 a la 10, que se caracteriza porque dicho promotor heterólogo es el promotor del gen de la PGK murina.
12. La línea celular de complementación según la reivindicación 11, que se caracteriza porque dicho elemento de complementación de la función E1 se encuentra bajo el control de una señal de terminación de la transcripción heteróloga, especialmente la del gen de la \beta-globina de conejo.
13. Una composición farmacéutica que comprende como agente terapéutico o profiláctico una línea celular de complementación según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, en asociación con un soporte aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
14. El uso de una línea celular de complementación según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12 para la preparación de una composición farmacéutica para la transferencia de moléculas de ADN en una célula u organismo eucariota.
15. Un procedimiento para la preparación de una partícula de adenovirus que comprende un vector adenoviral defectivo para la replicación, derivado del genoma de un adenovirus por deleción de al menos toda o parte de la región E1A, según la cual:
(i)
se introduce dicho vector adenoviral en una línea celular de complementación según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, capaz de complementar en trans dicho vector adenoviral para obtener una línea celular de complementación transfectada;
(ii)
se hace crecer dicha línea celular de complementación transfectada en las condiciones apropiadas para permitir la producción de dicha partícula de adenovirus; y
(iii)
se recupera dicha partícula de adenovirus del cultivo celular.
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