PT652968E - Adenovirus defectivos - Google Patents

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Jean-Luc Imler
Majid Methali
Andrea Pavirani
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Transgene Sa
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Description

1 DESCRIÇÃO
TV P
“ADENOVÍRUS DEFECTIVOS” A presente invenção tem por objecto novos vectores adenovirais defectivos que permitem a transferência e a expressão de genes de interesse numa célula ou num organismo eucariota hospedeiro. A invenção apresenta um interesse muito particular no tocante a perspectivas de terapia génica, em especial no homem.
Os adenovírus são vírus com ADN que apresentam um largo espectro de hospedeiro. Eles foram evidenciados em numerosas espécies animais e em numerosos tipos celulares. Existem diversos serotipos que diferem em especial ao nível da sequência dos seus genomas. A maior parte dos adenovírus humanos são pouco patogénicos e só produzem geralmente sintomas benignos. O adenovírus penetra na célula hospedeira permissiva por intermédio de um receptor específico e depois ele é intemalizado e passa em endosomas. A sua acidificação contribui para uma alteração de conformação do vírus e à sua saída do citoplasma. Depois, o ADN virai associado a determinadas proteínas virais necessárias para as primeiras etapas do ciclo replicativo, penetra no núcleo das células infectadas onde a sua transcrição é iniciada por enzimas celulares. A replicação do ADN adenoviral tem lugar no núcleo das células infectadas e não necessita da replicação celular. A associação dos novos viriões tem igualmente lugar no núcleo. Num primeiro tempo, as proteínas virais associam-se de maneira a formar cápsides vazias com estrutura icosaédnca, nas quais o ADN adenoviral é em seguida encapsulado. As partículas virais ou viriões são libertados das células infectadas e são susceptíveis de infectar outras células permissivas. O ciclo infeccioso do adenovíms efectua-se em duas etapas : - a fase precoce que precede a iniciação da replicação do genoma adenoviral e que permite a produção das proteínas reguladoras que intervêm ao nível da replicação e da transcrição do ADN virai, e - a fase tardia que conduz à síntese das proteínas estruturais.
De uma maneira geral, o genoma adenoviral é constituído por uma molécula de ADN linear, bicatenária e com cerca de 36 kb de comprimento que contém as sequências que codificam para mais de 30 proteínas. Em cada uma das suas extremidades, encontra-se presente uma curta sequência com 100 a 150 nucleotidos consoante os serotipos, invertida e designada por ITR (Inverted Terminal Repeat). As ITRs encontram-se implicadas na replicação do genoma adenoviral. A região de encapsidação, com cerca de 300 nucleotidos, encontra-se situada na extremidade 5’ do genoma imediatamente após a ITR 5’.
Os genes precoces são repartidos em quatro regiões que são dispersas no genoma adenoviral, designadas por EI a E4 (E para “Early” que significa precoce em inglês). As regiões precoces compreendem pelo menos seis unidades transcricionais que possuem os seus próprios promotores. A expressão dos genes precoces é, por sua vez, regulada, sendo alguns genes expressos antes de outros. Três regiões, respectivamente El, E2 e E4, são essenciais para a replicação virai. Assim, se um adenovírus for defectivo quanto a uma das suas funções, ou seja se ele não puder produzir pelo menos uma proteína codificada por uma dessas regiões, essa deverá ser fornecida em trans. A região precoce EI encontra-se situada na extremidade 5’ do genoma adenoviral e contém duas unidades de transcrição virais, respectivamente EIA e E1B. Esta região codifica para proteínas que intervêm muito precocemente no ciclo virai e são essenciais para a expressão de quase todos os outros genes do adenovírus. Em particular, a unidade de transcrição EIA codifica para uma proteína trans-activadora da transcrição dos outros genes virais, que induz a transcrição a partir dos promotores das regiões E1B, E2A, E2B e E4.
Os produtos da região E2, a qual compreende igualmente duas unidades de transcrição E2A e E2B, encontram-se directamente implicados na replicação do ADN virai. Esta região governa em especial a síntese de uma proteína de 72kDa, que apresenta uma forte afinidade para o ADN de cordão simples e de uma ADN polimerase. A região E3 não é essencial para a replicação do vírus. Ela codifica para por menos seis proteínas que seriam responsáveis pela inibição da resposta imune do hospedeiro relativamente a uma infecção por adenovírus. Em particular, a glicoproteína gpl9kDa impediria a resposta CTL, responsável pela citólise das células infectadas pelas células T citotóxicas do hospedeiro. A região E4 encontra-se situada na extremidade 3’ do genoma adenoviral. Ela codifica para numerosos polipeptidos que se encontram implicados na expressão de genes tardios, na estabilidade dos mensageiros (ARNm) tardios, na passagem da fase precoce para a fase tardia, assim como na inibição da síntese / >Λ
/ 4' ,J proteica celular
Uma vez iniciada a replicação do ADN virai, a transcrição dos genes tardios começa a ter lugar. Estes ocupam a maior parte do genoma adenoviral e recobrem em parte as unidades de transcrição dos genes precoces. Mas eles são transcritos a partir de promotores diferentes e segundo um modo de entrançagem alternativo, de modo que as mesmas sequências são utilizadas para fins diferentes. A maior parte dos genes tardios são transcritos a partir do promotor principal tardio MLP (Major Late Promoter). Este promotor permite a síntese de um longo transcrito primário que é em seguida amadurecido numa vintena de ARN mensageiros (ARNm) a partir dos quais são produzidas as proteínas capsidárias do virião. O gene que codifica para a proteína estrutural IX que compõe a cápside encontra-se situado na extremidade 5’ do genoma adenoviral e reveste a região E1B na sua extremidade 3’. A unidade transcricional da proteína IX utiliza o mesmo sinal de terminação da transcrição que a unidade transcricional E1B.
Um certo número de adenovírus são agora bem caracterizados geneticamente e bioquimicamente. Tal acontece com o adenovírus humano de tipo 5 (Ad5) cuja sequência se encontra divulgada no banco de dados Genebank sob a referência M73260. Foi possível localizar precisamente os diferentes genes no genoma adenoviral que compreende de 5’ até 3’ o ITR 5’ de 103 bp seguido pela região de encapsidação (Hearing et al., 1987, J. Virol., 61, 2555 - 2558) de cerca de 300 pb, depois regiões precoces e tardias cuja localização se encontra representada esquematicamente na figura 1 e, fínalmente, ITR 3’.
Sobressai do que antecede que os adenovírus possuem características
interessantes que fazem deles vectores de eleição para a transferência de genes de interesse. Numerosos adenovírus recombinantes encontram-se descritos na literatura (Rosenfeld et al., 1991, Science, 252, 431 - 434; Rosenfeld et al., 1992, Cell, 68, 143 - 155). De uma maneira geral, eles derivam do Ad5 e são defectivos quanto à função El, a fim de evitar a sua disseminação no ambiente e no organismo hospedeiro. Além disso, a região E3 não essencial pode ser igualmente eliminada. As sequências exógenas são integradas em vez da região El ou E3.
Assim, estes adenovírus defectivos só podem ser propagados numa linha celular que complemente em trans a função El essencial para a replicação virai. Presentemente, a única linha celular de complementação utilizável é a linha de rim embrionário 293 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol, 36, 59 - 72), que resulta da integração nos seus cromossomas de um fragmento do genoma do Ad5 que compreende em especial a extremidade 5 ’ do genoma virai, de modo que a linha 293 complementa os adenovírus defectivos para a função El. As células 293 contêm sequências que se encontram igualmente no adenovírus recombinante defectivo, como o ITR 5’, comportando a região de encapsidação e a parte em 3’ da região E1B sequências que codificam para as proteínas precoces. A possibilidade de transferência de genes mediante utilização de adenovírus encontra-se agora estabelecida. No entanto, a questão da sua inocuidade mantém-se em aberto. Com efeito, eles são susceptíveis de transformar determinadas linhas celulares em cultura, o que reflecte o poder potencialmente oncogénico de determinados produtos de expressão do genoma adenoviral, essencialmente da região El e provavelmente E4, pelo menos para determinados serotipos. Além disso, a probabilidade de recombinação genética entre um adenovírus defectivo da técnica anterior, em especial um adenovírus recombinante e/ou um adenovírus natural ou selvagem (resultante de uma contaminação acidental ou de uma infecção oportunista de um organismo hospedeiro), ou um fragmento de genoma adenoviral integrado na linha de complementação 293 não é desprezável. Com efeito, basta um evento de recombinação para restaurar a função EI e gerar um adenovírus recombinante não defectivo capaz de se dessiminar no ambiente. È também de prever que um adenovírus natural selvagem que co-infecta a mesma célula que um adenovírus defectivo possa complementar este último para a função EI que provoca uma co-disseminação dos dois vírus. Finalmente, certos tipos de células eucariotas produzem proteínas que apresentam uma actividade ElA-like igualmente susceptíveis de complementar parcialmente os adenovírus defectivos que as infectam. É portanto aconselhável dispor de vectores adenovirais performantes que apresentem o mínimo de risco, com vista à sua utilização em terapia génica para corrigir in vivo defeitos genéticos graves e tratar determinadas doenças para as quais não se dispõe de vias terapêuticas eficazes. E da sua obtenção que depende o sucesso da terapia génica aplicada ao homem.
Além disso, existem interrogações a propósito da obtenção da linha 293. Essas interrogações podem ser de natureza a comprometer a aceitabilidade dos produtos destinados a um uso humano que dela são derivados. Seria útil dispor de linhas de complementação cuja origem e história fossem exactamente conhecidas para produzir partículas de adenovírus recombmantes destinadas a uma utilização r humana
Descobriu-se agora novos vectores adenovirais defectivos eliminados de certas regiões especificas do genoma adenoviral e mais adaptados à transferência de uma sequência nucleotídica exógena in vivo. O interesse destes novos vectores é que eles apresentam uma capacidade de clonagem acrescida que permite a inserção de um ou mais genes de interesse de grande tamanho e uma segurança de emprego máxima. Estas mutações deletérias tomam esses adenovírus insusceptíveis de replicação autónoma e de transformação celular e isto sem alterar a sua capacidade para transferir e exprimir um gene de interesse. É por isso que a presente invenção tem por objecto um vector adenoviral defectivo para a replicação, susceptível de ser encapsidado numa célula de complementação, que deriva do genoma de um adenovírus que compreende de 5’ em 3’, uma ITR 5’, uma região de encapsidação, uma região EIA, uma região E1B, uma região E2, uma região E3, uma região E4 e uma ITR 3 ’, por eliminação : (i) na região EI A e na região E1B; ou (ii) naregiãoElA, naregiãoE2 enaregião 1B; ou (iii) na região E1 A, na região E2 e na região E3; ou (iv) na região E1 A, na região E2, na região E1B e na região E3; ou (v) na região EI A, na região E2 e na região E4; ou (vi) na região R1 A, na região E2, na região E1B e na região E4; ou (vii) na região EI A, na região E2, na região E3 e na região E4; ou (viii) na região EIA, na região E2, na região E1B, na região E3 e na
8 região Ε4, impedindo as referidas eliminações a produção de pelo menos um produto de expressão codificado pelas referidas regões, entendendo-se que o vector não é um vector adenoviral que compreende apenas os iTR 5’ e 3’ e a região situada na extremidade 5’ do genoma, imediatamente após o ITR 5’ que encerra a sequência de encapsidação e a sequência promotora de EI A.
No sentido da presente invenção, o termo “eliminação” ou “desprovido” refere-se à supressão de pelo menos um nucleotido na região alvo e como é evidente pode tratar-se de uma eliminação contínua ou descontínua. Por toda ou parte, entende-se quer a totalidade ou uma parte apenas da região considerada Preferem-se as eliminações que impedem a produção de pelo menos um produto de expressão codificado pela referida região. Eles podem portanto situar-se numa região codifícante ou numa região reguladora como a região promotora e respeitar pelo menos um nucleodito de maneira a destruir o quadro de leitura de um gene ou tomar uma região promotora não funcional. Podem tratar-se igualmente de eliminações parciais de um ou mais genes da referida região ou do conjunto da região.
Um vector adenoviral conforme descrito anteriormente é defectivo para a replicação mas é susceptível de ser replicado e encapsidado numa célula de complementação que lhe fornece em trans o ou os produto(s) para os quais ele é defectivo a fim de gerar uma partícula adenoviral (ainda designada adenovírus defectivo) e susceptível de replicação autónoma numa célula hospedeiro mas, no entanto, infecciosa uma vez que tem a capacidade de fornecer o vector numa célula hospedeira.
De acordo com uma primeira variante, um vector adenoviral de acordo com a presente invenção deriva do genoma do adenovírus natural ou selvagem por delecção continua ou descontínua na região EIA e na região E2 e E4. Uma tal delecção premite aumentar as possibilidades de clonagem de genes de interesse. Por outro lado, eliminar toda ou parte da região E4 permite igualmente reduzir ou suprimir sequências que codificam para os produtos potencialmente oncogénicos.
Numa outra variante, um vector adenovirasl de acordo com a presente invenção é delectado na região EIA, na região E2 e na região E1B e/ou E3 e, em particular, de acordo com um modo de realização tal como mencionado mais abaixo (como a delecção da parte da região E1B que compreende a totalidade das sequências que codificam para as proteínas precoses e a parte da região E3 que não codifica para a proteína gp 19kDA).
De acordo com uma outra variante, um vector adenoviral de acordo com a presente invenção deriva do genoma de um adenovírus natural ou selvagem por eliminação de toda ou parte da região EI A, na região E2, e da parte da região E1B que compreende a totalidade das sequências que codificam para as proteínas precoces. De acordo com um modo preferido, ela diz respeito ao promotor e às sequências que codificam para os produtos de expressão da região E1B ou seja as proteínas precoces e não inclui toda ou parte do sinal de terminação da transcrição que reveste as sequências que codificam para a proteína tardia IX. Tratando-se de um vector adenoviral que deriva de um adenovírus humano de tipo 5, a referida eliminação compreende pelo menos as sequências compreendidas entre os nucleotidos 1634 e 3509 do genoma adenoviral cuja sequência é tal como divulgada no bancc objectiv conform
HMG (Hidroxi-Metil-Glutaril coenzima A redutase), o promotor precoce do vinis SV40 (Simian Vírus 40 = vírus de símio 40), o LTR (Long Terminal Repeat) do RSV (Rous Sarcoma Vírus) ou o promotor de um gene PGK (fosfo-glicerato--quinase) de eucariota superior.
Além disso, um vector adenoviral de acordo com a presente invenção pode, de maneira opcional, ser eliminado da parte da região E3 que corresponde à região promotora, a qual será substituída por uma região promotora heteróloga, tal como uma das mencionadas anteriormente.
Um vector adenoviral de acordo com a presente invenção derivado do genoma de um adenovírus natural ou selvagem, vantajosamente de um adenovírus canino, aviário ou humano, de preferência de um adenovírus humano de tipo 2, 3, 4, 5 ou 7 e, de maneira absolutamente preferida, de um adenovírus humano de tipo 5 (Ad5). Neste último caso, as eliminações do vector adenoviral são indicadas por referência à posição dos nucleótidos do genoma do Ad5 especificada no banco de dados Genebank com a referência M73260.
Prefere-se muito particularmente um vector adenoviral de acordo com a presente invenção que deriva do genoma de um adenovírus humano de tipo 5, por eliminação na região EI A e na região E2 e por eliminação : (i) da totalidade da parte que codifica para as proteínas precoces da região E1B e que se estende do nucleotido 1634 e que termina no nucleotido 4047; e/ou (ii) da região E4 que se estende dos nucleotidos 32800 a 35826; e/ou (iií) da parte da região E3 que se estende dos nucleotidos 27871 a 30748.
De preferência, um vector adenoviral de acordo com a presente invenção deriva de um genoma de um adenovírus selvagem ou natural por eliminação de pelo menos 18 % do dilo genoma, de pelo menos 22 %, dc pelo menos 25 %, de pelo menos 30 %, de pelo menos 40 %, de pelo menos 50 %, de pelo menos 60 %, de pelo menos 70 %, de pelo menos 80 %, de pelo menos 90 % ou ainda de pelo menos 95 %.
Um vector adenoviral preferido de acordo com a invenção deriva de um adenovírus humano de tipo 5 por eliminação da parte do genoma virai que se estende dos nucleotidos 459 a 35832.
No quadro da presente invenção, o vector adenoviral tem por objecto a transferência e a expressão de uma sequência nucleotídica exógena numa célula hospedeira. Por “sequência nucleotídica exógena”, entende-se um ácido nucleico que compreende sequências codificadoras e sequências reguladoras que permitem a expressão das referidas sequências codificadoras e no qual as sequências codificadoras são sequências que não se encontram normalmente presentes no genoma de um adenovírus. As sequências reguladoras podem ser de origem qualquer. A sequência nucleotídica exógena é introduzida no vector adenoviral pelas técnicas clássicas de engenharia genética, entre a região de encapsidaçao e a ITR 3’.
Uma sequência nucleotídica exógena pode ser constituída por um ou mais gene(s) de interesse e, de uma maneira preferida, de interesse terapêutico. No quadro da presente invenção, um gene de interesse pode codificar quer para um ARN anti sentido, quer para um ARNm que será em seguida traduzido em proteína de interesse. Um gene de interesse pode ser de tipo genómico, de tipo ADN complementar (ADNc) ou de tipo misto (minigene, no qual pelo menos um intrão foi eliminado). Ele pode codificar para uma proteína madura, um precursor de uma proteína madura, em especial um precursor destinado a ser segregado e que compreende por essa razão um péptido sinal, uma proteína quimérica que provém da fusão de sequência de origem diversa ou um mutante de uma proteína natural que apresenta propriedades biológicas melhoradas ou modificadas. Um tal mutante pode ser obtido através da mutação, eliminação, substituição e/ou adição de um ou mais nucleotido(s) do gene que codifica para a proteína natural.
Um gene de interesse pode ser colocado sob o controlo de elementos apropriados à sua expressão numa célula hospedeira. Por “elementos apropriados”, entende-se o conjunto dos elementos necessários à sua transcrição em ARN (ARN anti-sentido ou ARNm) e à tradução de um ARNm em proteína. Entre os elementos necessários para transcrição, o promotor reveste-se de uma importância particular. Pode tratar-se de um promotor constitutivo ou de um promotor regulável e pode ser isolado de um gene qualquer de origem eucariota ou virai e mesmo adenoviral. Como alternativa, pode tratar-se do promotor natural do gene de interesse em questão. De uma maneira geral, um promotor em uso na presente invenção, pode ser modificado de maneira a conter sequências reguladoras. A título de exemplo, um gene de interesse em uso na presente invenção, é colocado sob o controlo do promotor dos genes de imunoglobulina quando se procura alvejar a sua transferência em células hospedeiras linfocitárias. Pode-se citar igualmente o promotor do gene
TK-HSV-1 (timidina quinase do vírus da herpes de tipo 1) ou ainda o promotor adenoviral MLP, em especial o adenovírus humano do tipo 2, que permite uma expressão num grande número de tipos celulares.
Entre os genes dc interesse utilizados no quadro da presente invenção, pode-se citar. - os genes que codificam para as citoquinas, como o interferão alfa, o interferão gama, as interleucinas; os genes que codificam para receptores membranários, como os receptores reconhecidos por organismos patogénicos (vírus, bactérias ou parasitas), de preferência pelo vírus VIH (Vírus da Imunodeficiência Humana); - os genes que codificam para factores de coagulação, como o factor VIII e o factor IX; - o gene que codifica para a distrofina; - o gene que codifica para a insulina; - os genes que codificam para proteínas que participam directamente ou indirectamente nos canais iónicos celulares, como a proteína CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator); - os genes que codificam para ARN anti-sentido ou proteínas susceptíveis de inibir a actividade de uma proteína produzida por um gene patogénico, presente no genoma de um organismo patogénico, ou por um gene celular, cuja expressão se encontra desregulada, por exemplo um oncogene; —se*. / 1-5 os genes que codificam para uma proteína que inibe uma actividade enzimática, como a al-antitripsina ou um inibidor de uma protease virai; os genes que codificam para variantes de proteínas patogémcas, que foram mutadas de modo a alterar a sua função biológica, como por exemplo variantes trans-dominates da proteína TAT do vírus VIH susceptíveis de competição com a proteína natural para a ligação à sequência alvo, impedindo assim a activação do VIH; os genes que codificam para os epitopes antigenéticos a fim de aumentar a imunidade da célula hospedeira; os genes que codificam para as proteínas de complexo principal de histocompatibilidade das classes I e II, assim como os genes que codificam para as proteínas indutoras desses genes; os genes que codificam para enzimas celulares ou produzidas por organismos patogénicos; e os genes suicidas. Pode-se citar mais particularmente o gene suicida TK-HSV-1. A enzima TK virai apresenta uma afinidade nitidamente superior em relação à enzima TK celular para determinados análogos de nucleosidos (como o aciclovir ou o ganciclovir). Ela converte-os em moléculas monofosfatadas, por sua vez convertíveis, pelas enzimas celulares, em precursores de nucleotidos, que são tóxicos. Esses análogos de nucleotidos são incorporáveis nas moléculas de ADN em via de síntese, portanto principalmente no ADN das células em estado de replicação. Esta incorporação permite destruir especificamente as células em divisão como as células cancerosas.
Esta lista não é limitativa e podem ser utilizados outros genes de interesse no quadro da presente invenção.
Além disso, de acordo com um outro modo de realização da invenção, o vector adenoviral pode ainda compreender um gene não-terapêutico que codifica para uma proteína trans-activadora da transcrição não-adenoviral. Como é evidente, evitar-se-á o ou os gene(s) da região EI A que codificam para uma proteína trans--activadora, cuja expressão correria o risco de tomar o adenovírus não-defectivo. Escolher-se-á, de preferência, o gene que codifica para a proteína Gal4 de Saccharomyces cerevisiae. A sua expressão permitirá a propagação do vector numa linha de complementação tal como a descrita a seguir. Uma tal linha é mais sofisticada e permite remediar eventuais problemas de toxicidade devidos à produção em contínuo das proteínas adenovirais de complementação. O gene que codifica para uma proteína trans-activadora da transcrição pode ser colocado, se necessário, sob o controlo de elementos apropriados para a sua expressão; por exemplo os que permitem a expressão de um gene de interesse. A presente invenção diz igualmente respeito a uma partícula adenoviral assim como a uma célula eucariota hospedeira que compreende um vector adenoviral de acordo com a invenção. A referida célula é, com vantagem, uma célula de mamífero e, de preferência, uma célula humana e pode compreender o referido vector sob forma integrada no genoma ou, de preferência, sob forma não-integrada (episoma).
Uma partícula adenoviral pode ser preparada mediante passagem em qualquer linha celular de complementação que fornece en trans as funções para as quais o vector adenoviral tal como descrito anteriormente é defectivo, por exemplo a linha 293 da técnica anterior. Essas técnicas dc preparação 3ão conhecidas do especialista na matéria (Graham et Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology, vol 7, 109-128, Ed: E.J. Murey, The Human Press Inc.). De uma maneira opcional, a partícula adenoviral pode ser gerada numa linha celular de complementação tal como se descreve a seguir. É por essa razão que a presente descreve igualmente a uma linha celular de complementação que comporta um elemento de complementação, que compreende em particular uma parte da região EI do genoma de um adenovírus com exclusão da ITR 5’; sendo o referido elemento de complementação suseeptível de complementar en trans um vector adenoviral defectivo e sendo integrado no genoma da referida linha celular de complementação ou inserido num vector de expressão.
No quadro da presente invenção, a expressão “linha celular de complementação” refere-se a uma célula eucariota suseeptível de fornecer en trans a ou as função (funções) para a qual (quais) um vector adenoviral é defectivo. Por outras palavras, ela é suseeptível de produzir uma ou as proteína(s) necessária(s) à replicação e à encapsidação do referido vector adenoviral, proteínas precoces e/ou tardias que não foi possível por si mesmo produzir e que são necessárias à constituição de uma partícula virai. Como é evidente, a referida parte pode ser modificada por mutação, eliminação e/ou adição de nucleotidos, desde que essas modificações não alterem a sua capacidade de complementação. Assim, um vector /7 /7 £ V( 18- adenoviral defectivo para a função EI deverá ser propagado numa linha celular de complementação para EI (susceptível de fornecer en trans a proteína ou o conjunto das proteínas codificadas pela região EI que o vector não pode produzir), um vector defectivo para as funções EI e Et sê-lo-á numa linha celular de complementação para EI e E4 (fornecendo as proteínas necessárias codificadas pelas regiões Ele E4) e, finalmente, um vector defectivo para as funções El, E2 e E4 sê-lo-á numa linha celular de complementação para as três funções. Tal como indicado na introdução, a região E3 é não essencial, e não necessita de ser especificamente completada.
Uma linha celular de complementação, tal como descrita anteriormente, pode ser derivada quer de uma linha celular imortalizada, susceptível de se dividir indefinidamente, ou de uma linha primária. Consoante os objectivos pretendidos pela presente invenção, uma linha celular de complementação de acordo com a invenção é útil para a encapsidação de qualquer vector adenoviral defectivo e, em particular, de um vector adenoviral defectivo tal como descrito anteriormente. Assim, quando se utilizar no seguimento a expressão “vector adenoviral defectivo”, deve entender-se que se faz referência a um vector defectivo qualquer, da técnica anterior ou conforme descrito anteriormente.
Por “elemento de complementação”, entende-se um ácido nucleico que compreende pelo menos a parte do genoma adenoviral em uso no quadro da presente invenção. Ele pode ser inserido num vector, por exemplo de tipo plasmídico ou virai, por exemplo retroviral, adenoviral ou derivado de um pox-vírus. Prefere-se, no entanto, o caso em que ele é integrado no genoma de uma linha celular de complementação de acordo com a invenção. Os métodos para introduzir um vector ou um ácido nucleico numa linha celular e eventualmente integrá-lo no genoma de uma célula constituem técnicas convencionais bem conhecidas do perito na especialidade, do mesmo modo que os vectores utilizáveis para tais fins. O elemento de complementação pode ser introduzido numa linha de complementação de maneira prévia ou concomitante com um vector adenoviral defectivo.
De acordo com um modo de realização específico, a linha celular de complementação é destinada a complementar en trans um vector adenoviral defectivo para a função El. Uma tal linha apresenta a vantagem de diminuir os riscos de recombinação uma vez que, ao contrário da linha convencional 293, ela encontra-se desprovida da ITR 5’ presente nos vectores.
No quadro da presente invenção, a linha celular de complementação pode compreender toda ou parte da região EIA do genoma de um adenovírus e: (i) toda ou parte de pelo menos uma região do genoma adenoviral escolhida entre as regiões E1B, E2 e E4, ou (ii) toda ou parte de pelo menos duas das regiões E1B, E2 e E4 do referido genoma, ou (iii) toda ou parte das regiões E1B, E2 e E4 do referido genoma.
No quadro da invenção, as referidas regiões podem ser colocadas, se necessário, sob o controlo de elementos apropriados que permitem a sua expressão, mas, prefere-se colocá-los sob o controlo do seu próprio promotor, induzível pela proteína trans-activadora de transcrição codificada pela região EIA. A título indicativo, uma Unha celular de complementação de acordo com a variante (ii) que compreende as regiões F,1 A, E1B e E4 destina-se à preparação de um adenovírus defectivo para as funções EI e E4 eliminada de toda ou parte das regiões correspondentes.
De acordo com um modo vantajoso, a linha celular de complementação compreende em particular toda ou parte da região EI A e a totalidade das sequências que codificam para as proteínas precoces da região E1B.
Além disso, de acordo com uma variante deste modo de realização, a linha celular de complementação pode, além disso, ser desprovida da região promotora da região EI A. Neste caso, a parte do genoma adenoviral que codifica para as proteínas precoces da referida região EIA será colocada sob o controlo de um promotor heterólogo apropriado e funcional na referida linha celular de complementação. Pode ser isolado a partir de qualquer gene eucariota ou virai. Evitar-se-á, no entanto, o recurso a um promotor adenoviral de uma região precoce. Pode tratar-se de um promotor constitutivo. A título de exemplos, pode-se citar os promotores do vírus SV40, do gene TK-HSV-1 e do gene murino PGK.
De uma maneira alternativa, o promotor retido pode ser regulável e, vantajosamente, indutível por uma proteína trans-activadora de transcrição não adenoviral. Pode tratar-se de um promotor isolado de um gene naturalmente indutível ou de um promotor qualquer modificado pela adição de sequências de activação (ou UAS, para Upstream Activating Sequence, em inglês) que respondem à referida proteína trans-activadora. De maneira mais particular, prefere-se utilizar um promotor indutível pela proteína Gal4 de Saccharomyces cerevisiae e, de preferência, um promotor híbrido constituído por um promotor dito “mínimo” que contém unicamente as sequências de iniciação da transcrição (TATA box e sítio de iniciação) de um gcnc qualquer (por exemplo do gene TK-HSV-1 ou MLP de Ad2), a montante do qual se inseriu pelo menos uma sequência de activação do gene GallO de Saccharomyces cerevisiae (Webster et al., 1988, Cell, 52, 169-178). Esta última pode ser sintetizada quimicamente ou isolada a partir do gcnc GallO, de acordo com as técnicas clássicas de engenharia genética. Assim, o promotor híbrido não será activado e só induzirá a expressão dos genes codificados pela região EIA, colocados sob o seu controlo, na presença da proteína Gall4. Depois, os produtos de expressão da região EIA poderão, por sua vez, induzir a expressão das outras regiões precoces E1B, E2 e/ou E4 eventualmente compreendidas numa linha celular de complementação de acordo com a invenção. Esse modo de realização particular dii invenção, evita a produção de uma maneira constitutiva (eventualmente tóxica) de proteínas adenovirais necessárias à complementação. Assim, a indução pode ser desencadeada na presença de um vector adenoviral defectivo tal como descrito aiiteriormente que exprime a proteína Gal4. No entanto, uma tal linha pode igualmente ser utilizada para preparar qualquer vector adenoviral defectivo, com a condição, no entanto, de fornecer en trans a proteína Gal4. Os meios de fornecer en trans uma proteína são conhecidos do perito na matéria.
De uma maneira geral, a linha celular de complementação compreende uma parte do genoma de um adenovírus que deriva vantajosamente de um adenovírus animal, como um adenovírus canino ou aviário ou, de preferência, de um adenovírus humano e, muito particularmente, do tipo 2 ou 5. A linha celular de complementação compreende em especial a parte do genoma de um adenovírus humano de tipo 5 que se estende: (i) do nucleotido 100 ao nucleotido 5297 da sequência tal como divulgada no banco de dados Genebank sob a referência M73260, ou (ii) do nucleotido 100 ao nucleotido 4034, ou (iii) do nucleotido 505 ao nucleotido 4034.
Vantajosamente, a parte do genoma de acordo com (ii) é inserida a montante de um sinal de terminação da transcrição, como por exemplo o sinal de poliadenilação do vírus SV40 (Simian Vírus 40) ou do gene β-globina de coelho. Muito embora a parte de acordo com (iii) que não compreende nem as sequências promotoras da região EIA, nem o sinal de terminação da transcrição da região E1B se encontre colocada sob o controlo de um promotor apropriado, em especial de um promotor induzivel pela proteína Gal4, e de um sinal de terminação da transcrição, por exemplo o do gene β-globina de coelho. Uma tal linha celular de complementação é considerada como particularmente segura pois é desprovida da maior parte das sequências comuns com um adenovírus defectivo.
Por outro lado, a linha celular de complementação pode comportar a parte da região E4 de um adenovírus humano de tipo 5 que vai do nucleotido 32800 e que termina no nucleotido 35826 da sequência tal como divulgado no banco de dados Genebank sob a referência M73260.
Além disso, a linha celular de complementação pode comportar o conjunto do genoma de um adenovírus natural, com excepção da região de encapsidação e das ITRs 5’ e 3' e, de maneira absolutamente preferida, a parte do genoma de um adenovírus humano dc tipo 5 que vai do nucleotido 505 e que termina no nucleotido 35826 da sequência tal como divulgada no banco de dados Genebank sob a referência M73260. Para as finalidades da presente invenção, aquela encontra-se colocada sob o controlo de um promotor apropriado. Recorre-se, de preferência, a um promotor induzível pela proteína Gal4 de Saccharomyces cerevisae. Uma tal linha permitirá complementar en írans o conjunto das funções essenciais para a replicação e a encapsidação de um vector adenoviral defectivo para as funções El, E2 e E4, em especial de um vector adenoviral mínimo de acordo com a invenção.
De acordo com um modo preferido, a linha celular de complementação pode comportar um elemento de complementação que compreende, além disso, um gene que codifica para um marcador de selecção que permite a detecção e o isolamento das células que o comportam. No contexto da presente invenção, pode tratar-se de qualquer gene que codifique para um marcador de selecção, sendo estes geralmente conhecidos do perito na matéria, vantajosamente de um gene de resistência a um antibiótico e, de preferência, do gene que codifica para a puromicina acetil-transferase (gene pac) que confere a resistência à puromicina.
No quadro da presente invenção, o gene que codifica para um marcador de selecção pode ser colocado sob σ controlo de elementos apropriados que permitem a sua expressão. Pode tratar-se de um promotor constitutivo, tal como o promotor precoce do vírus SV40. No entanto, prefere-se um promotor induzível pela proteína trans-activadora codificada pela região EIA, em particular o promotor adenoviral E2A. Uma tal combinação introduzirá uma pressão de selecção para manter a expressão dos genes da região EIA na linha celular de complementação.
Para os objectivos da presente invenção, o promotor retido pode ser modificado por eliminação, mutação, substituição e/ou adição de nucleotidos.
De acordo com um modo de realização absolutamente preferido, a linha celular dc complementação é derivada de uma linha celular aceitável de um ponto de vista farmacêutico. Por “linha celular aceitável de um ponto de vista farmacêutico”, entende-se uma linha celular caracterizada (de que se conhece a origem e a história) e/ou tendo já sido utilizada para a produção em grande escala de produtos destinados a uso humano (constituição de lotes para ensaios clínicos avançados ou lotes destinados à venda). Tais linhas encontram-se disponíveis em organismos tais como a ATCC. A este respeito, podem-se mencionar as linhas de rim de macaco verde de África Vero, de rim de criceto dourado ou sírio BHK, humano derivado de um carcinoma de pulmão A549, humana-pulmonar MRC5, humana-pulmunar W138 e de ovário de criceto chinês CHO.
De uma maneira alternativa, a linha celular de complementação pode derivar de células primárias e em especial de células de retina recolhidas de um embrião humano. A invenção refere-se igualmente a um processo de preparação de uma partícula adenoviral segundo o qual: se introduz um vector adenoviral tal como descrito anteriormente numa linha celular de complementação susceptível de complementar en trans o referido vector, de modo a obter-se uma linha celular de complementação transfectada, - se cultiva a referida linha celular de complementação de acordo com
condições apropriadas para permitir a produção da referida partícula adenoviral, e - se recupera a referida partícula na cultura celular.
Como c evidente, a partícula adenoviral pode ser recuperada do sobrenadante de cultura mas, igualmente, das culturas de acordo com os protocolos convencionais.
De uma maneira preferida, um processo de acordo com a presente invenção utiliza uma linha celular de complementação conforme descrita anteriormente. A invenção tem igualmente por objecto a utilização de um vector de acordo com a presente invenção, de uma partícula de adenovírus de acordo com a presente invenção ou de uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para transferir moléculas de ADN numa célula ou num organismo eucariota. A presente invenção diz finalmente respeito a uma composição farmacêutica que compreende, a título de agente terapêutico ou profiláctico, um vector adenoviral, uma partícula de adenovírus, uma célula eucariota de acordo com a invenção, em associação com um suporte aceitável de um ponto de vista farmacêutico. A composição de acordo com a invenção é, em particular, destinada ao tratamento preventivo ou curativo de doenças tais como: - doenças genéticas, tais como a hemofilia, a mucoviscidose ou a miopatia, a de Duchêne e de Becher, s / *· 26 'j cancros, como os induzidos por cmcogenes ou vírus, - doenças retrovirais, como o SIDA (síndroma da imunodeficiência adquirida que resulta da infecção pelo VIH), e doenças virais recorrentes, tais como as mfecções virais provocadas pelo vírus da herpes.
Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser fabricada de maneira convencional. Em particular, associa-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico ou profiláctico com um suporte tal como um diluente. Uma composição de acordo com a invenção pode ser administrada por aerosol ou por qualquer via convencional em uso no domínio da especialidade, em especial por via oral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intrapulmonar ou intratraqueal. A administração pode ter lugar em dose única ou repetida uma ou mais vezes após um certo intervalo de tempo. A via de administração e a dosagem apropriadas variam em ftmção de diversos parâmetros, por exemplo, do indivíduo tratado ou da doença a tratar ou ainda do ou dos gene(s) de interesse a transferir. De uma maneira geral, uma composição farmacêutica de acordo com a invenção compreende uma dose de adenovírus de acordo com a invenção compreendida entre 104 e 10i4, vantajosamente entre IO5 e 1013 e de preferência entre 106 e 1011. Uma composição farmacêutica, em particular para fins profilácticos, pode compreender ainda um adjuvante aceitável de um ponto de vista farmacêutico. A presente invenção encontra-se mais completamente descrita com referência às figuras seguintes e por meio dos exemplos seguintes. A figura 1 é uma representação esquemática do genoma do adenovírus humano de tipo 5 (representado em unidades arbitrárias de 0 a 100) que indica a localização dos diferentes genes. Λ Figura 2 c uma representação esquemática do vector pTG6546. A Figura 3 é uma representação esquemática do vector pTG6581. A Figura 4 é uma representação esquemática do vector pTG6303. A Figura 5 é uma representação esquemática dos vectores pTG1660 e pTG1661. A Figura 6 é uma representação esquemática dos vectores pTG1653, pTGl 654 e pTGl 655. A Figura 7 é uma representação esquemática do vector pTG5913. A Figura 8 é uma representação esquemática do vector pTG8512. A Figura 9 é uma representação esquemática do vector pTG8513. A Figura 10 é uma representação esquemática do vector pTG8514.
A Figura 11 é uma representação esquemática do vector pTG8515. EXEMPLOS
Os exemplos seguintes limitam-se a ilustrar um modo de realização da presente invenção.
As construções descritas a seguir são realizadas de acordo com as técnicas gerais de engenharia genética e de clonagem molecular, pormenorizadas em Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). O conjunto das etapas de clonagem que utilizam plasmídeos bacterianos realiza-se mediante passagem na estirpe Escherichia coli (E. 7/ / η ff.Λ
Coli) 5Κ ou BJ, enquanto que as que utilizam vectores derivados do fago Ml3 são realizadas por passagem em E. coli NM 522. No que diz respeito às etapas de ampliação por PCR, aplica-se o protocolo tal como descrito no PCR Protocols-A guia de métodos c aplicações, (1990, editado por Innis, Gelfànd, Sninsky e White, Academic Press Inc.).
Por outro lado, as células são transfectadas de acordo com as técnicas convencionais bem conhecidas do perito na especialidade. Pode-se citar a técnica do fosfato de cálcio (Maniatis et al., supra). Mas outros protocolos que permitem introduzir um ácido nucleico numa célula podem igualmente ser utilizados, tais como a técnica do DEAE dextrano, a electroporação, os métodos baseados em choques osmóticos, a microinjecção de uma célula seleccionada ou os métodos baseados no emprego de liposomas.
Os fragmentos inseridos nas diferentes construções descritas a seguir, são indicados precisamente de acordo com a sua posição na sequência nucleotídica: - do genoma do Ad5 tal como divulgado no banco de dados Genebank sob a referência M73260, - do genoma do adenovírus de tipo 2 (Ad2) tal como divulgado no banco de dados Genebank sob a referência J01949, do genoma do vírus SV40 tal como divulgado no banco de dados Genebank sob a referência J02400.
Exemplo de comparação 1: Geração de um adenovírus “atenuado” que compreende uma eliminação de uma parte da região de encapsidacão. 1 Construção de um vector “atenuado” aue compreende uma ç é' '29' eliminação do nucleotido 184 ao nudeotido 275 da resino de. pncnnxidaçnn Constroi-se um vector que compreende - a ITR 5’ do genoma do Ad5 (do nucleotido 1 ao nucleotido 103), a região do cncapsidação do Ad5 compreendida entre os nucleotidos 104 a 458 na qual a porção que vai do nucleotido 184 ao nucleotido 273 é eliminada e a timina (T) em posição 176 é modificada numa citosina (C) a fim de criar um sítio de restrição (AatU), uma cassete de expressão de um gene de interesse que compreende de 5’ para 3’ o MLP do Ad2 (nucleotidos 5779 a 6038), os sítios de restrição Kpnl-Xbal-Hindlll e BamHl, o ADNc humano que codifica para a proteína CFTR, (a composição em ácidos amimados corresponde à sequência publicada por Riordan et al., 1989, Science, 245, 1066-1073; com excepção de uma valina em vez da metionina em posição 470), os sítios Psíl, Xhol e Sali e , finalmente, o sinal de terminação da transcrição do vírus SV40 (nucleotidos 2665 a 2538), e - o fragmento do genoma do Ad5 que se estende do nucleotido 3329 ao nucleotido 6241.
Num primeiro tempo, clona-se entre os sítios AcoRI e EcoRV do vector M13TG131 (Kieny et al., 1983, Gene, 26, 91-99) o fragmento EcoRl Smal isolado de pMLPll. Esta construção é resultante de pMLPIO (Levrero et al., 1991, Gene, 101, 195-202) e difere do vector principal pela introdução de um sítio .Smal ao nível do sítio HindíR. Obtém-se o vector M13TG6501. Submete-se este último a uma mutagénese dirigida a fim de eliminar as sequências compreendidas entre os κ·- 30 ; nucleotidos 184 a 273 da região de encapsidação Realiza-se a rrmtagénese dirigida por meio de um estojo comercial (Amersham) de acordo com as recomendações do fornecedor, e utiliza-se o oligonucleotido OTG4174 referido no identificador de sequência n° 1 (SEQ ID NO: 1). O vector mutado é designado por M13TG6502. Reintroduz-se a região de encapsidação assim eliminada sob a forma de um fragmento EcoBl-Bglíl, encontrando-se o sítio Bgfíl franqueado por tratamento com ADN polimerase de Klenow, no vector pMLPl 1 digerido por EcoKl e Smal. O vector obtido, pTG6500, é digerido parcialmente por Pstl, tratado com a ADN polimerase do fago T4 e depois digerido por Pvul. Insere-se neste vector o fragmento Pvul-Hpal isolado de pTG5955 (derivado de pMLPl 1). Este fragmento comporta o sinal de terminação da transcrição do vírus SV40 e a parte do genoma do Ad5 que se estende do nucleotido 3329 ao nucleotido 6241, O vector pTG6505 assim gerado é digerido parcialmente por Sphl, tratado com a ADN polimerase do fago T4 e religado, isto a fim de destruir o sítio Sphl situado em 5’ do poliligador. Daí resulta o pTG6511, no qual se clona, após digestão com BamHl e tratamento com a ADN polimerase de Klenow, o ADNc CFTR humano sob a forma de um fragmento com extremidades franqueadas gerado por digestão Xhol e Aval e tratamento com a ADN polimerase de Klenow. Obtém-se o pTG6525. A título indicativo, isola-se o ADNc CFTR de um plasmídeo da técnica anterior, tal como o pTG5960 (Dalemans e al.„ 1991, Nature, 354, 526-528). 2. Construção de um vector “atenuado” que compreende uma eliminação do nucleotido 270 ao nucleotido 346 da resião de encapsidação.
Suhmete-se o vector M13TG6501 a uma mutagénese dirigida que utiliza o oligonucleotido OTG4173 (SEQ ID NO: 2). Volta a introduzir-se depois o fragmento mutado em pMLPll, tal como indicado anteriormente, para gerar o vector pTG6501. Este último é digerido por Sphl, tratado com a ADN polimerase do fago T4 e depois com Pvul. Obtém-se o pTG6546 (Figura 2) por clonagem do fragmento Pvul-Kpnl (tendo o sítio Kpnl sido tomado franco) isolado de pTG6525 e comportando o ADNc CFTR humano. 3. Construção de um vector “atenuado” que compreende uma eliminação do nucleotido 287 ao nucleotido 358 da rezião de encavsidacão.
Submete-se o vector M13TG6501 a uma mutagénese dirigida a fim de eliminar as sequências compreendidas entre os nucleotidos 287 e 358 da região de encapsidação e modificar as timinas em posição 275 e 276 em guaninas para introduzir um sítio Ncol. Realiza-se a mutagénese por meio do oligonucleotido OTG4191 (SEQ ID NO. 3) para se obter o M13TG6507. Cinde-se este último com Bhlíl, trata-se com a ADN polimerase de Klenow, depois digere-se com EcóRl e purifica-se o fragmento correspondente mutado que se introduz em pMLPll digerido com EcoRI e Smal Gera-se o pTG6504, do qual se isola o fragmento Sphl (sítio tomado franco por tratamento com a ADN polimerase do fago T4)-PvmI que se insere entre os sítios Kpnl (tomado franco por tratamento com a T4 polimerase) e Pvul de pTG6511. Obtém-se o pTG6513 que é tratado com BamUl e a ADN polimerase de Klenow antes de inserir o fragmento Aval e Xhól de pTG5960 para se obter o pTG6526. 4. Geração de um adenovírus recombinante defectivo e atenuado.
Geram-se os adenovírus defectivos recombinantes por co-transfecção nas cclula3 293 de ou pTG6525, pTG6526 ou pTG6546 linearizado por Clal e de ADN genómico do Ad-dl324 (Thimmappaya et al., 1982, Cell, 31, 543-551) igualmente digerido por Clal, de maneira a gerar um vírus recombinante por recombinaçãu homóloga. Decorridos 8 a 10 dias, isolam-se as regiões individuais, ampliam-se nas células 293 e analisam-se por cartografia de restrição. Constituem-se lotes virais (AdTG6525, AdTG6526 e AdTG6546) e determina-se o seu título de acordo com técnicas convencionais.
Coloca-se o vírus AdTG6546 em situação de competição por co-infecção com o AdCFTR (Rosenfeld et al., 1992, Cell, 68, 143-155) que comporta uma região de encapsidação de tipo selvagem. Infectam-se as células 293 com 5 ufp (unidade que forma regiões) de Ad-CFTR e 5 uip de AdTG6546 por célula. Isola-se em paralelo o ADN virai total pelo método de Hrrt (Gluzman et Van Doren, 1983, J. Virol., 45, 91-103) e encapsida-se o ADN virai após tratamento das células com 0,2% de desoxidrolato e depois com 10 pg/ml de desoxiribonuclease (DNase) I, para eliminar os ADN não protegidos nos viriões. Muito embora a quantidade de ADN total de Ad-CFTR e de AdTG6546 seja idêntica, há cerca de 3 vezes menos de ADN de AdTG6546 do que de ADN de Ad-CFTR encapsitado.
Mede-se o nível de expressão da proteína CFTR nos extractos celulares de células 293 infectadas com AdTG6546. Efectua-se a análise por Western blot (mancha de western) de acordo com a técnica descrita em Dalemans et al., (1991, Nature, supra) utilizando o anticorpo monoclonal MATG1031. No entanto, pode utilizar-se qualquer outro anticorpo que reconheça epitopes antígénicos da proteína CFTR. Recolhc-sc um produto com uma massa molecular esperada de cerca de 170
kDA. A título indicativo, o nível de produção é aproximadamente equivalente ao obtido nos extractos celulares infectados com o vírus não atenuado Ad-CFTR. Exemplo de Comparação 2 : Geração de um adenovírus defectivo eliminado da região EI A e da totalidade das sequências que codificam para as proteínas precoces da região EIB. 1. Obtenção de um adenovírus recombimnte vara a expressão da proteína CFTR (AdTG6581).
Gera-se um tal adenovírus a partir de um vector plasmídico pTG6581 que compreende de 5’ para 3’: a ITR 5’ do Ad5 (dos nucleotidos 1 a 103), a região de encapsidação do Ad5 (dos nucleotidos 104 a 458), - uma sequência nucleotídica exógena que comporta uma cassete de expressão, a qual compreende os elementos seguintes: • o MLP do Ad2 (nucleotidos 5779 a 6038), seguido por três líderes tripartidos igualmente do Ad2 (nucleotidos 6039-6079; nucleotidos 7101-7175, nucleotidos 9637-9712); estes líderes são incluídos a fim de aumentar a eficácia de tradução das sequências inseridas a jusante, • um poliligador que compreende de 5’ para 3’ os sítios de restrições Xbal, HindíU, BaníHl, EcoRV, Hpal e Notl utilizáveis para a clonagem de um gene de interesse, • um gene de interesse, como o gene que codifica para a proteína CFTR, • o sinal de terminação da transcrição isolado do vinis SV40 (nucleotidos 2543 a 2618), - a porção do genoma adenoviral do Ad5 que vai dos nucleotidos 4047 a 6241. O fragmento do genoma do Ad5 que se estende do nucleotido 4047 ao nucleotido 4614 é amplificado por PCR a partir do ADN genómico do Ad5. A reacção PCR utiliza o iniciador de sentido OTG5021 (SEQ ID NO: 4) que compreende na sua extremidade 5’ um sítio BamHl destinado a facilitar as etapas de clonagem ulteriores, e o iniciador anti-sentido OTG5157 (SEQ ID NO: 5). Trata-se o fragmento assim gerado com ADN polimerase de Klenow, antes de ser clonado no sítio Smal de M13mpl8 (Gibco BRL), dando lugar ao M13TG6517. A sequência do fragmento gerado por PCR é verificada de acordo com o método enzimático clássico (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 5463).
Por outro lado, isola-se o fragmento Pvwl-Smal a partir de pMLPll. Clona-se entre os sítios Pvul e Kpnl de pTG6511 (exemplo 1.1), tendo o sítio Kpnl sido franqueado por um tratamento com ADN polimerase do fago T4, de acordo com métodos convencionais. Gera-se assim o vector pTG6547.
Digere-se este último pelas enzimas Salí e BstXl e liga-se a dois fragmentos, por um lado o fragmento Bamlll-BsiXl purificado de M13TG6517 e, por outro lado, o fragmento Xhní-BglU de pTG6185. Este último compreende em especial o sinal de terminação da transcrição do vírus SV40 enquadrado pelos sítios de restrição Xhol e Bglll No entanto, poderia ser utilizado qualquer outro plasmídeo que comportasse a mesma sequência de terminação e sítios de restrição '35.....* adequados. Obtém-se o vector pTG6555, no qual se insere no sítio único BamHl um adaptador que contém dois sítios de restrição que geram extremidades franqueadas, EcoKV e Hpal. Este adaptador provém da reassociação dos oiligonucleotidos OTG5564 e OTG5565 (SEQ ID NO: 6 e 7). Obtém-se o pTG6580. Finalmente, n fragmento Sacl-Psll de pTG6525 cujas extremidades foram franqueadas e que comportam o ADNc CGTR humano, é clonado no sítio EcoRV de pTG6580. Gera-se o pTG6581 (Figura 3). O adenovírus recombinante correspondente ao AdTG6581 é gerado por co-transfecção de pRG6581 e Ad dl324 cindidos por CM numa linha de complementação para a função El, como a linha 293 ou uma linha do exemplo 6, de acordo com o protocolo clássico. 2. Obtenção de um adenovírus recombinante vara a expressão do IENr.
Obtém-se o vector pTG6303 (Figura 4) por clonagem no sítio Hpal de pTG6580 do fragmento Hpal-Smal de M13TG2437. Este último provém da clonagem num vector M13TG130 (Kieny et al., 1983, supra) do gene que codifica para o interferão gama (IFNy) cuja sequência é tal como especificada em Gray et al. (1982, Nature, 295, 503-508). Obtém-se o adenovírus recombinante AdTG6303 de acordo com as técnicas clássicas por recombinação homóloga que resulta da co-transfccção de pTG6303 e do Ad dl324 linearizado por CM numa linha de complementação para a função El. 3. Construção de um adenovírus de que foi eliminada a reeião El e no qual a região E3 se encontra colocada sob o controlo de. um promotor constitutivo.
Obtém-se o vector pTG1670 mediante clonagem entre os sítios AatlY e BamYW do vector polill (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201) de um fragmento PCR que comporta o LTR3’ (Long Terminal Repeat) do vírus RSV (Rous Sarcoma Vírus). A reacção PCR utiliza o vector pRSV/L (De Wet at al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 725-737) a título de matriz e os iniciadores OTG5892 e OTG5893 (SEQ ID NO: 8 e 9).
Além disso, a parte 5’ da região E3 (nucleotidos 27588 a 28607) é amplificada por PCR a partir do vector pTG1659 e por meio dos iniciadores OTG5920 e OTG5891 (SEQ ID NO: 10 e 11). Este último é construído em várias etapas. Obtém-se o fragmento BamlAl-Avrll (nucleotidos 21562 a 28752) do ADN genómico de Ad5 e depois clona-se entre os mesmos sítios de pTG7457 para gerar o pTG1649. O vector pTG7457 é um pUCl9 (Gibco BRL) modificado ao nível do poliligador de modo a conter em especial um sítio Avrll. Depois introduz-se o fragmento EcoRl (Klenow)-dwII de M13TG1646 (exemplo 8) em pTG1649 cindido por AvrU-Ndel (Klenow), o que dá o vector pTGl 651. Finalmente, gera-se o pTG1659 pela inserção do fragmento Avrll (nucleotidos 28752 a 35463) purificado do ADN genómico de Ad5 em pTG1651 linearizado por AvrW. O fragmento PCR é integrado entre os sítios Xbal e Bamífl e p poli Π, para se obter o pTG1671. Insere-se em seguida no sítio AatW deste último, um fragmento EcoKV-AatM obtido a partir de pTGl 670, para se obter o pTG1676.
Isola-se o fragmento £coRI do Ad5 que corresponde aos nucleotidos 27331 a 30049, a partir de uma preparação de ADN genómico e sub-clona-se em pBluescript-Sk+ (Stratagene) previamente cindido por R?oRT Obtém-se o pTG1669. Muta-se esta último (estojo de Amersham) mediante introdução de um sítio BamHl quer em posição 27867 (oligonucleotido mutagénico OTG6079; SEQ ID NO: 12) ou em posição 28249 (oligonucleotido mutagénico OTG6080; SEQ ID NO: 13). Obtém-se respectivamente pTG1672 e pTG1673. Isola-se o vector pTG1676, o fragmento BamHí-BsiWl que comporta o LTR 3’ de RSV, seguido pela parte 5’ da região E3 e insere-se entre os sítios BamHÍ (posição 27331 ou 30049) e BsiW (posição 28390) dos vectores obtidos na etapa anterior para gerar pTG1977 e pTG1978. Depois, integra-se o fragmento EcoRl obtido de cada um destes dois vectores em pTG1679, substituindo o fragmento EcoRl selvagem. Obtém-se pTG1679-E3+. A título indicativo, o vector pTG1679 resulta da clonagem do fragmento BsíEíl-Kpnl (sítio tomado franco por tratamento com a T4 polimerase) de pTG6590 (exemplo 3.1) entre os sítios BstEU-BamHl (sítio tomado franco por tratamento com a Klenow polimerase) de pTG6584 (exemplo 3.1).
Produz-se uma partícula de adenovírus mediante recombinação homóloga numa linha de complementação para a função E1, entre o fragmento Aaíll de pTG1679-E3+ e um vector adenoviral tal como o Ad dl324 ou Ad-RSVP-gal. Este último contém o gene da β-galactosidase em vez da região EI (Stratford-Perricaudet et al., 1992, J. Clin. Invest., 90, 626-630).
Exemplo dc comparação 3 : Construção de um vector adenoviral recombinante com capacidade de clonagem melhorada por eliminação parcial das regiões EI e E3. 1. Construção de pTG6590AE3
Amplifica-se o fragmento que comporta a parte do genoma do Ad5 38 compreendida entre os nucleotidos 27325 e 27871 por PCR a partir de uma preparação de ADN genómico de Ad5 e por meio dos iniciadores OTG6064 e OTG6065 (SEQ ID NO: 14 e 15). O OTG6065 compreende na sua extremidade 5’ um sítio Bsml, igualmcntc presente na região E3 (em posição 30750).
Clona-se o fragmento amplificado no sítio Smal de M13mpl8, para se obter o M13TG6523. Isola-se o fragmento EcoRl-Bsml a partir deste último para ser introduzido no vector pTG6590 cindido pelas mesmas enzimas. Obtém-se o pTG6590A3, o quai contém a parte 3’ do genoma adenoviral (nucleotidos 27082 a 35935) de que foi eliminada a região E3 compreendida entre os nucleotidos 27872 e 30740, enquanto que do pTG6590 se eliminou uma parte mais pequena da região E3 (posição 28592 a 30470). Obtém-se o vector pTG6590 da maneira seguinte: produz-se por PCR um fragmento que se estende dos nucleotidos 35228 a 35935 (comportando a ITR 3 ’) a partir de uma preparação genómica de Ad5 e por meio dos iniciadores OTG5481 e OTG5482 (SEQ ID NO: 16 e 17). Este último é, seguidamente, clonado no sítio Smal de M13mpl8 para se obter o M13TG6519. Por outro lado, vector pTG6584 é digerido por Xbal e depois religado a fim de eliminar o fragmento correspondente da região E3. Obtém-se o pTG6589, que é cindido por BamHl, tratado com Klenow e depois digerido por ZfcíEII. Introduz-se no vector assim tratado o fragmento £coRI (Klenow)-Ãs/EII purificado de M13TG6519, para gerar pTG6590. A título indicativo, o vector pTG6584 é um vector pUC19 (Gíbco BRL) que contém as sequências de Ad5 que se estendem do sítio único SpeI (posição 27082) até ao início da região promotora da região F.4 (posição 35826). E obtido ,- 39' s. ' .- mediante digestão de pTG1659 (exemplo 2.3) por Sall e SpeI, tratado com ADN polimerase de Klenow e depois religação. 2. Construção de um vector adenoviral de que foi eliminada a região EI e a parte de E3 que não exprime a nrnteínn pplOlcDa
Obtém-se a parte da região E3 do Ad5 que codifica para a gpl9kDa (nucleotidos 28731 a 29217) por PCR a partir de uma preparação de ADN genómico de Ad5 utilizando os iniciadores OTG5455 e OTG5456 (SEQ ID NO: 18 e 19). Introduz-se o fragmento gerado no sítio Smal de M13mpl8 para se obter o M13TG6520. Isola-se o fragmento EcòRí-Xbal a partir deste último, que se clona no sítio Aatll de pTG1670 (exemplo 2.3), tendo os sítios sido tomados francos por tratamento com ADN polimerase de Klenow. Em seguida, insere-se o fragmento Xbal purificado do vector da etapa anterior no sítio Xbal do vector pTG6590AE3 (exemplo 3.1) 3. Obtenção de partículas adenovirais.
Obtêm-se as partículas virais recombinantes mediante ligação dos fragmentos SpeI isolados do ADN genómico de AdTG6303 ou AdTCr6581 e de um ou de outro dos vectores dos exemplos 3.1 e 3.2. Em seguida, transfecta-se a mistura de ligação numa linha de complementação para a função EI. EXEMPLO 4: Construção de um adenovírus de que se eliminaram as regiões Ele E4,
Amplifícam-se as partes do genoma adenoviral que se estendem dos nucleotidos 31803 a 32799 e 35827 a 35935 a partir de uma preparação de ADN genómico de Ad5 e de iniciadores OTG5728 e OTG5729 (SEQ ID NO: 20 e 21) e -“Tv' f / 40''' OTG5730 e OTG 5481 (SEQ ID IMO: 22 e 16) respectivamente. Após uma dezena de ciclos de ampliação, prossegue-se a reacção a partir de uma alíquota das duas misturas reaccionais e utilizando os oligonucleotidos OTG5728 e OTG5781. O fragmento amplificado estende se dos nucleotidos 31803 a 35935 com uma eliminação da totalidade da região E4 (posições 32800 a 35826). Após digestão com £coRI e HindíU, clona-se entre os mesmos sítios de M13mpl8 para se obter M13TG6521.
Digere-se o M13TG6521 com EcóRl, trata-se com a ADN polimerase de Klenow e depois cinde-se com BstXl. Insere-se o fragmento de 0,46 kb que comporta a ITR 3’ entre o sítio BamWl franqueado por tratamento com ADN polimerase de Klenow e o sítio BstXl de pTG6584 (exemplo 3.1). Obtém-se o pTG6587, que se digere com Xbal e depois se religa sobre si mesmo, para depois se obter o pTG6588 (eliminação de E3).
Introduz-se no sítio Pacl de pTG6588 um fragmento de ADN sintético que provém da reassociação dos oligonucleotidos OTG6060, OTG6061, OTG6062 e OTG6063 (SEQ ID NO: 23 a 26). Daí resulta o pTG8500 no qual os sinais de terminação de transcrição dos genes tardios L5 são melhorados.
Gera-se uma partícula adenoviral (AdAF,4) cujo genoma é eliminado da totalidade da região E4 (nucleotidos 32800 a 35826) e do fragmento Xbal da região E3 (nucleotidos 28592 a 30470), por ligação dos fragmentos SpeI isolados de pTG8500 ou pTG6588 do Ad5. Transfecta-se a mistura de ligação numa linha celular de complementação para a função E4, por exemplo a linha W162 (Weinberg c Ketner, 1983, Proc. Natl. Acad. Sei USA, 80, 5383-5386). Obtém-se um adenovírus dcfectivo para as funções EI e E4 (ΔΕΙ, ΔΕ4) por transfecção numa linha de complementação para EI e E4 (por exemplo a linha do exemplo 8) da mistura de ligação entre o genoma do Ad dl324 e o plasmídeo pTG8500 ou pTG6588 linearizado por Spel.
Por outro lado, pode-se proceder igualmente da maneira seguinte. Clona-se o fragmento Spel-Scal isolado de pTG1659 (exemplo 2,3) no vector pTG6588 cindido por essas mesmas enzimas, para se obter o pTG6591. Este último comporta as sequências do Ad5 dos nucleótidos 21062 a 35935 mas, tal como anteriormente, de que foram eliminadas a totalidade da região E4 e do fragmento Xbal da região E3. Introduz-se no vector pTG6591 digerido por Pacl, o fragmento de ADN sintético descrito anteriormente e gera-se o pTG6597. As partículas adenovirais podem ser obtidas por recombinação homóloga entre o ADN genómico do Ad dl324 cindido por Spel e os plasmídeos pTG6591 ou pTG6597 cindido por BarnHl.
Exemplo 5: Construção de um vírus “mínimo”
Um vector adenoviral dito “mínimo” é constituído por clonagem num plasmídeo dos elementos seguintes: - a ITR 5’ do Ad5 (dos nucleotidos 1 a 103); - a região de encapsidação do Ad5 (dos nucleotidos 104 a 458); - uma sequência nucleotídica exógena que compreende: • um primeiro gene de interesse terapêutico colocado de preferência sob o controlo do seu próprio promotor para se obter uma regulação da expressão mais próxima possível da regulação natural, • um segundo gene de interesse constituído pelo gene TK-HSV-1, e • de maneira facultativa, sequências nucleotídicas quaisquer adicionadas por razões de eficácia de replicação ou de encapsidação de maneira que o tamanho total do genoma a encapsidar se encontre compreendido entre 30 e 36kb; • as sequências que codificam para a proteína Gal4 de Saccharomyces cerevisiae (Laughon e Gesteland, 1984, Mol. Cell. Biol., 4, 260-267) colocadas sob o controlo de um promotor funcional numa célula eucariota superior; e - a ITR 3’ do Ad5 (dos nucleotidos 35833 a 35935).
Realiza-se a associação destes diferentes elementos de acordo com as técnicas convencionais de biologia molecular. A obtenção de viriões infecciosos que compreendem um tal vector tem lugar conforme descrito anteriormente numa linha de complementação do exemplo 7.
Exemplo de comparação 6: Constituição de uma célula de complemetacão susceptível de complementar en trans a função EI. 1. Constituição de uma célula de complementação que compreende a resido Kl dos nucleotidos 100 a 5297 (t>TG6533)
Esta comporta: - uma cassete de expressão do gene pac, o qual se encontra colocado sob o controlo do promotor precoce do vírus SV40 (nucleotidos 5171 a 5243) e compreende em 3’ o sinal de terminação da transcrição de SV40 (nucleotidos 2543 a 2618). O gene pac utilizado corresponde a um fragmento que vai do nucleotido 252 ao nucleotido 905 da sequência divulgada por Lacalle et al. (1989, Gene, 79, 375-380) e que comporta quatro mutações em relação à sequência publicada (C em posição 305 substituído por A; C em posição 367 substituído por T; inserção de um G em posição 804; eliminação de um G em posição 820), - um fragmento do genoma do Ad5 que vai dos nucleotidos 100 a 5297. Este fragmento compreende as regiões EI A e E1B munidas do seu próprio promotor e do seu sinal de terminação da transcrição assim como de uma fracção da região E2, cobrindo assim as sequências que codificam para a proteína IX - A título indicativo, parece que a linha 293 não é capaz de produzir uma proteína IX funcional.
Realiza-se a construção em diversas etapas pormenorizadas a seguir. Submete-se o vector p poliIII-I* (Lathe et al., 1987, Gene, 57, 193-201) a uma digestão pelas enzimas v4ccl e £coRI. Clona-se no vector assim tratado o fragmento EcoBl-Clal isolado do plasmídeo pTG6164. Obtém-se o vector pTG6528. O plasmídeo pTG6164 é resultante de pLXSN (Miller D, 1989, Bio/Techniques, 7, 980) e compreende o gene pac colocado sob o controlo do promotor precoce do vírus SV40. Resumidamente, introduz-se o fragmento HindiII-Kpnl de pLXSN em M13TG131 para produzir M13TG4194. Insere-se neste último, digerido por Nhél e Kpril, o fragmento Nhel-Kpnl de pMPSV H2 K IL2R (Takeda et al., 1988, Growth Factors, 1, 59-66) para produzir M13TG4196. Digere-se este último com i/útt/III-Kpnl e clona-se o fragmento resultante de uma digestão HindiII e de uma digestão parcial Kpni e purifica-se a partir de pLXSN. Obtém-se o pTG5192. Digere-se este último com Hindlll e parcialmente com Nhel e introduz-se o fragmento Hindlll-Nhel de pBabe Puro (Land et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18, 3587), dando lugar ao pTG6164.
Digere-se o vector pTG6528 com Pstl e introduz-se ao nível deste sítio o fragmento Pstl isolado de Ptg6185 (exemplo 2.1) que comporta o sinal de terminação da transcrição de SV40. Obtém-se o pTG6529. Submete-se este último a uma digestão EcoBl-Hpal e liga-se com dois fragmentos, por um lado um fragmento BspEl-Bcgl (posições 826 a 5297) purificado do ADN genómico de Ad5 e por outro lado um fragmento gerado por PCR nas extremidades £coRI e BspEl, para se obter o pTG6531. Gera-se o fragmento PCR mediante amplificação genética a partir de ADN genómico do Ad5 e de iniciadores OTG4564 e OTG4565 (referido nas SEQ 1D NO: 27 e 28). O fragmento amplificado é digerido pelos enzimas £coRI e BspEl e posto em ligação conforme indicado no parágrafo anterior. O vector pTG6531 compreende as duas unidades de transcrição (a da região EI e a do gene pac) na mesma orientação. Para evitar interferências ao nível da transcrição, coloca-se numa orientação de cabeça para baixo (inverso um em relação ao outro) tratando o pTG6531 com BamHl e religando-os. O vector pTG6533 corresponde a um clone que apresenta a orientação inversa das duas unidades. < f 45
Transfecía-se o vector pTG6533 numa linha celular mamífera, por exemplo a linha Vero (ATCC, CCL81) ou A549 (ATCC, CCL185) pela tecnologia do fosfato de cálcio. Cultivam-se as células transfectadas de acordo com as recomendações do fornecedor e colocam-se 24 horas após a transfecção em meio selectivo que contém puromicina (concentração 6 pg/ml). Escolhe-se os clones resistentes sobre os quais se avalia a expressão do genes da região EI a fim de determinar o clone mais produtor, que poderá ser utilizado a título de linha de complementação para a preparação de um adenovírus defectivo para a função El, tal como o pormenorizado no exemplo 2.
Analisa-se a expressão das sequências que codificam para as proteínas precoces da região El por Northern blot (mancha de Northern) utilizando sondas apropriadas marcadas com o isotópo 32P. Detecta-se a produção de proteínas codificadas pela região EIA mediante imunoprecipitação após marcação das células com o isotópo 35S e por meio de um anticorpo comercial (Oncogene Science Inc., referência DP 11).
Pode-se verificar igualmente a capacidade dos produtos de expressão da região EIA para activar o promotor da região E1B (por análise dos ARNm E1B por Northern blot) ou para activar o promotor da região E2 (por dosagem da actividade enzimática após transfecção transitória de um plasmídeo “relator” que compreende o gene CAT (Cloranfenicol Acetil Transferase) colocado sob o controlo do promotor E2).
Finalmente, pode-se infectar essas células pelo Ad-RSV-Pgal (Stratford-Perricaudet et al., 1992, supra) e titular o vinis pela técnica agar logo que -7< ri 46 se observa um efeito citopático. De uma maneira geral, procede-se da maneira seguinte: infectam-se as células com uma taxa (multiplicidade de infecção) igual a 10. Cerca de 48 horas após a infecção, sendo o efeito citopático visível, cinde-se as células e doseia-se a actividade da β-galactosidade de acordo com o protocolo convencional (veja-se por exemplo Maniatis et al., 1989, supra). Os clones positivos são reinfectados com uma taxa mais baixa 48 horas após a infecção, recolhe-se o sobrenadante e as células de acordo com as técnicas clássicas. Determina-se o título virai pelo método sob agar utilizando células 293. A razão do título obtido para o título inicial constitui o factor de amplificação. 2. Construção de uma linha celular de complementacão que compreende a região EI dos nucleotidos 505 a 4034 (pTG6557, pTG6558. vTG6559. dTG6564 e dTG6565)
Os vectores pTG6557, pTG6558 e pTG6559 compreendem: (i) uma cassete de expressão do gene pac (nucleotidos 252 a 905 como anteriormente) sob o controlo: - do promotor E2A do Ad2 (nucleotidos 27341 a 27030) (em pTG6558), - do promotor E2A do Ad2 de que eliminaram sequências compreendidas entre os nucleotidos 27163 a 27182 (para pTG6557). IJma tal mutação permite diminuir o nível de base do promotor E2A, sem afectar a indutibilidade pela proteína trans-activadora codificada por EIA, ou do promotor precoce SV40 para pTG6559.
Nos três casos, ela comporta igualmente em 3’ n sinal de terminação da transcrição do vírus SV40 (nucleotidos 2543 a 2618); e (ii) uma cassete de expressão que comporta a parte da região EI do Ad5 que vai dos nucleotidos 505 a 4034. Esta porção do genoma adenoviral contém a totalidade das sequências que codificam para as proteínas precoces da região EIA, o sinal de terminação da transcrição da unidade EIA, o promotor E1B (induzivel pela proteína trans-activadora codificada por EIA) e a totalidade das sequências codificadoras da região E1B. Ela inclui igualmente as sequências que codificam para a proteína IX, que se sobrepõem à região E1B. No entanto, ela encontra-se desprovida do promotor da região EIA e do sinal de terminação da transcrição das unidades transcripcionais E1B e IX. A fim de permitir a expressão das sequências da região El, introduz-se 5'do fragmento adenoviral, o promotor do gene murino PGK e em 3’ o sinal de terminação da transcrição do gene β-globina de coelho (nucleotidos 1542 a 2064 da sequência divulgada no banco de dados Genebank sob a referência K03256).
De maneira facultativa, pode-se igualmente introduzir sequências nucleotídicas quaisquer, por exemplo isoladas de pBR322 (Bolívar et al., 1977, Gene, 2, 95-113), entre as cassetes de expressão do gene pac e da região El, a fim de evitar eventuais interferências transcrícionais. A construção desses vectores efectua-se em diversas etapas referidas 48- abaixo.
Em primeiro lugar, amplifica-se por PCR a parte do genoma do Ad5 que vai do nucleotido 505 ao nucleotido 826 a partir de uma preparação genómica e dos iniciadores OTG5013 que compreende em 5’ um sítio Pstl útil para as etapas de clonagem ulteriores (SEQID NO: 29) e OTG4565 que se sobrepõem ao sítio BspE 1 (SEQ ID NO: 28). Trata-se o fragmento gerado pof PCR com ADN polimerase de Klenow, e depois introduz-se no sítio Smál de M13mpl8 dando lugar ao Ml 3TG6512. Verifica-se a sequência do fragmento PCR.
Digere-se o vector pTG6533 (exemplo 6.1) pelas enzimas £coRI e BspEl. Liga-se o vector assim tratado com, por um lado, o fragmento Pstl-BspEl isolado de M13TG6512 e, por outro lado, o fragmento EcóRl-Pstl isolado de pKJ-1. Este último compreende a porção do promotor do gene murino PGK, entre os nucleótidos -524 e -19, cuja sequência se encontra referida em Adra et al. (1987, Gene, 60, 65-74). Esta etapa dá lugar ao pTG6552 e permite inserir o promotor do gene murino PGK a montante da região EI do Ad5 com início no nucleotido 505.
Além disso, purifica-se o fragmento Xho\-BamWi, cuja extremidade gerada por Xhol foi franqueada a seguir ao tratamento com a ADN polimerase de Klenow, a partir de pBCMG Neo (Karasuyama et al., 1989, J. Exp. Med., 169, 13-25). Introduz-se este fragmento, que compreende o sinal de terminação da transcrição do gene β-globina de coelho entre os sítios Smal e ΒατηΆ do vector p poliII-Sfi/Not-14* (Lathe et al., 1987, Gene, 57, 193-201). O vector pTG6551 que resulta, é por sua vez, digerido pelas enzimas Sphl 6 EcoRV a fim de aí inserir um fragmento do genoma do Ad5 que vai do nucleotido 3665 ao nucleotido 4034 Este 49 fragmento é gerado por PCR de acordo com o protocolo convencional. Utiliza-se uma preparação de ADN genómico de Ad5 a título de matriz e os iniciadores OTG5015 que cobrem o sítio interno Sphl em posição 3665 (SEQ ID NO: 30) e OTG 5014 que compreende em 5’ um «sítio RglN (SF.Q ID NO: 11)
Trata-se o fragmento PCR com ADN polimerase de Klenow antes de ser clonado num sítio Amai de Ml 3mpl 8, que gera o Ml 3TG6516. Após verificação da sua sequência, o fragmento PCR é isolado por digestão com BgRI, tratamento com ADN polimerase de Klenow e digestão com Sphl. Insere-se entre os sítios Sphl e EcoRV de pTG6551. Daí resulta o pTG6554.
Por outro lado, submete-se o vector pTG6529 (exemplo 6.1) a uma digestão com as enzimas Hpal e Hindill. Purifica-se o fragmento de 2,9 kb que comporta o gene pac seguido pelo sinal de terminação da transcrição do vírus SV40. Liga-se este último ao fragmento Smal-Hindlll isolado de pE2 Lac (Boeuf et al., 1990, Oncogene, 5, 691-699) que suporta o promotor E2A do Ad2. Obtém-se o vector pTG6556. De maneira alternativa, pode ser ligado ao fragmento Smal-Hindlll isolado de pE2 Lac D9170 (Zajchowski et al., 1985, EMBO J., 4, 1293-1300) que comporta o promotor E2A mutado do Ad2. Obtém-se, nesse caso, o pTG6550.
Digere-se o pTG6556 pelas enzimas AcoRI e BamYll. Insere-se entre estes sítios o fragmento LcoRI-AacII isolado de pTG6552 e o fragmento Sacll-BamHl isolado de pTG6554. Obtém-se o vector pTG6558. A mesma etapa realizada sobre pTG6550 e pTG1643 (exemplo 7.1) gera pTG6557 e pTG6559, respectivamente.
•/V
Digerem-se pTG6557 e pTG6558 com EcoKV, sítio único situado entre as duas cassetes de expressão (gene pac e região El). Clona-se nesse sítio um fragmento £coRV-,PvtdI de l,88kb isolado de pBR322 (Bolívar et al., supra) a fim de afastar os dois promotores Geram-se respectivamente pTG6554 e pTG6565.
Os vectores pTG6557, pTG6558, pTG6559, pTG6564 e pTG6565 são transfectados na linha celular A549. Tal como anteriormente, escolhem-se os clones que resistem a puromicina e verifica-se a expressão da região El. Os clones que exprimem El destinam-se a amplificar e propagar adenovírus defectivos para a função El. A produção dos produtos de expressão El é acompanhada por um efeito citotóxico mas a análise de Southern não permite evidenciar rearranjos de vectores. Após transfecção pelo Ad-RSV—ββ8ΐ, vários clones são susceptíveis de amplificar o vírus de um factor superior a 100. 3. Construção de uma célula de complementação induzível pela proteína Gal4 de Saccharomyces cerevisiae.
Estes vectores compreendem, tal como anteriormente, a parte da região El do Ad5 que vai do nucleotido 505 ao 4034. No entanto, a expressão das sequências da região EIA é colocada sob o controlo de um promotor induzível constituído por um lado pelo promotor mínimo MLP de Ad2 (TATA box e sinal de iniciação de transcrição; nucleotidos -34 ao +33) e por outro lado por uma sequência de activação do gene Gal 10 activável pela proteína Gal4. A sequência de consenso de activação de 17 nucleotidos (17MX), que corresponde ao sítio de fixação de Gal4 é especificada em Webster et al. (1988, Cell, 52, 169). O sinal de terminação da transcrição do gene da β-globina de eoelbo é colocado em 3’ da unidade transcricional E1B.
Sintetiza-se um primeiro fragmento de ADN que compreende um dímero da sequência 17MX (SEQ ID NO: 32 e 33) seguida do promotor mínimo MLP de Ad2 e munido na sua extremidade 5’ de um sítio SaK e na sua extremidade 3’ de um sítio ΒατηΐΏ.. Franqueia-se o sítio Sd/I mediante tratamento com ADN polimerase de Klenow. Além disso, sintetiza-se um segundo fragmento de ADN que compreende um pentâmero da sequência seguido do mesmo promotor e munido em 5’ e 3’ dos sítios Xbal e BamiU. Após digestão com Xbal, franqueia-se a extremidade por tratamento com a polimerase de Klenow.
Introduz-se cada um destes fragmentos no sítio BglíI de p poli II para produzir respectivamente pTG1656 e pTGl657. Em seguida, introduzem-se em cada um dos vectores previamente digeridos com PstI-BamHl, os dois fragmentos seguintes: o fragmento Pstl-Xbal isolado de pTG6552 (Exemplo 6.2) e o fragmento Xbal-BamHl isolado de pTG6559 (exemplo 6.2). Obtém-se pTG1660 e pTG1661 respectivamente (Figura 5).
Co-transfectam-se as células A549 com pTG1643 (vector de expressão do gene pac) e quer pTG1660 ou pTG1661. Seleccionam-se os clones quanto à sua resistência à puromicina e estudam-se conforme indicado anteriormente. Cerca de 50% dos clones A549-1660 e A549-1661 produzem produtos de expressão da região EI. No entanto, a produção é acompanhada por um efeito citotóxico , que modifica o aspecto morfológico das células.
Verifíca-se a integração e o não rearranjo dos plasmídeos no genoma celular por Southern. Não se pôde evidenciar qualquer modificação substancial dos plasmídeos integrados (pTG1643, pTGlfifiO e pTGlóól) nos clones produtores analisados. Pode-se verificar igualmente a capacidade de indução da expressão das sequências codificadas pela região EIA na presença de Gal4 (por transformação com um plasmídeo que permita a expressão constitutiva da proteína Gal4)
Após a infecção de diversos clones produtores por Ad-RSV-Bgal numa razão de cerca de 2, os dois clones A549-1660 são susceptíveis de amplificar o lote virai de um factor superior a 100.
Exemplo de comparação 7: Constituição de uma linha celular de comnlementacão para o conjunto das funções essenciais para a replicacão de um adenovírus.
Construiu-se um vector que compreende o conjunto do genoma adenoviral do Ad5 com a excepção da ITR 5’, da ITR 35 e da região de encapsidação.
Digere-se o vector pTG6528 (exemplo 6.1) com as enzimas Pstl e BglII entre as quais se insere um fragmento de ADN sintetizado quimicamente de acordo com o protocolo convencional constituído pelos oligonucleotidos dos OTG5039 e OTG5040 (SEQID NO: 34 e 35). A sequência dos oligonucleotidos é concebida de maneira a não reconstituir o sítio de clonagem Pstl e introduzir um sítio EcoRV. Obtém-se o pTG1639, o qual é linearizado mediante digestão com EcoRV e ligado a um fragmento Xbal-BamHl cujas extremidades são franqueadas mediante tratamento com a ADN polimerase de Klenow. Este fragmento é portador do sinal de terminação da transcrição do vírus SV40. Pode utilizar-se nesta etapa qualquer plasmídeo que comporte um sinal rodeado pelos sítios de restrição adequados. O vector pTG1640 assim produzido, é digerido por fiam Hl e Bhlll e ,/ 53' introduz-se ο fragmento portador da cassete de expressão do gene pac no sítio BglII do vector pPoliII-Sfí/Not-14*. Obtém-se o pTGl 641. Lineariza-se este último com Notl e trata-se com a ADN polimerase de Klenow. Introduz-se o fragmento RamHí-Sall de 0,276 lcb isolado de pBR322 (Rolivar et al , supra) igualmente tratado com a ADN polimerase de Klenow. Isto dá lugar ao pTG1643.
Lineariza-se o pTG1643 com Xhol e insere-se neste sítio um fragmento híbrido Xhol que comporta um dímero 17MX seguido pelo produtor mínimo do gene TK-HSV-1 (nucleotidos 303 a 450 da sequência divulgada no banco de dados Genebank sob a referência V00467 e completada em 3’ por um sítio Xhol). Obtém-se o pTG1647 no qual se insere o promotor híbrido 2xl7MX-TK-HSV-l com a mesma orientação que a cassete de expressão do gene pac.
Esta construção, pTG1647, serve de vector de base para introduzir entre os sítios Pstl e BamHl um fragmento do genoma do Ad5 que vai do nucleotido 505 ao nucleotido 35826. Num primeiro tempo, digere-se o pTG1647 com Pstl e BamHl e depois liga-se, por um lado, ao fragmento Pstl-Clal de pTG6552 (exemplo 6.2) que comporta a parte do genoma de Ad5 dos nucleotidos 505 a 918 e, por outro lado, ao fragmento Clal-Bamll (posições 918 a 21562) preparado a partir do ADN genómico do Ad5. 0 vector assim obtido comporta a parte 5’ do Ad5 com excepção da ITR5’ e da região de encapsidação.
Além disso, a parte 3 ’ do genoma do Ad5 é associado no vector ppolill-Sfi/Not-14*. Lmeariza-se este último com BamHl e introduz-se o fragmento BamHl-Avrll (nucleotidos 21562 a 28752) do genoma do Ad5 e um fragmento PCR que corresponde aos nucleotidos 35463 a 35826 do Ad5. Produz-se este último a partir do ADN genómico do Ad5 e dos iniciadores OTG5024 (SRQ TD NO: 36) e OTG5025 (SEQ ID NO: 37) e comporta em 5’ um sítio ΒατηΥΰ.. Digere-se o vector obtido com Avrll e insere-se o fragmento Avrll isolado do ADN genómico do Ad5 que se estende das posições 28753 a 35462.
Introduz-se o fragmento BamHl que comporta as sequências adenovirais no sítio BamHl do vector da etapa anterior que comporta a parte 5’ do genoma adenoviral desprovido da ITR 5 e da região de encapsidação.
Uma linha celular de complementação susceptível de complementar o conjunto das funções de um adenovírus defectivo é gerada por transfecção numa linha celular, tal como A549, de acordo com o protocolo descrito nos exemplos anteriores.
Pode-se proceder igualmente mediante construção de quatro vectores que comportam a quase totalidade do genoma adenoviral que será reunido num único vector quando da etapa final. - pTG1665 corresponde à clonagem do fragmento BspEl (nucleotidos 826 a 7269) isolado de uma preparação de ADN genómico de Ad5, no sítio Xmal de p poli II-Sfi/Not-14*; - pTG1664 é gerado pela inserção do fragmento Notl (nucleotidos 6503 a 1504) isolado de uma preparação de ADN genómico de Ad5, no sítio Notl do mesmo vector; - pTG1662 é obtido por introdução do fragmento AatlA (nucleotidos 10754 a 23970) isolado de uma preparação de ADN genómico de Ad5 no sítio Aatll de ppolill; pTG1659 que comporta aparte 3’ do genoma de AdS (exemplo 2 3)
Introduz-se depois um fragmento que comporta um sistema de expressão induzível como o promotor descrito no exemplo 6.3 ou 7 induzível por Gal4 ou um promotor de técnica anterior como o promotor metalotionina ou tetraciclina. Coloca-se um tal fragmento a montante das sequências 5’ do Ad5 (nucleotidos 505 a 918) no vector pTG1665 digerido por Aatll e Clal. Finalmente, clona-se sucessivamente no vector anterior e nos sítios correspondentes dos fragmentos Notl de pTG1664, Aatll de pTG1662 e fínalmente Bamlll de pTG1659.
Uma linha celular de complementação é gerada por co-transfecção do vector anterior e de pTGl 643 e isolam-se os clones resistentes à puromicina. Esta linha é mais particularmente destinada a ampliar e encapsidar os vectores adenovirais do exemplo 5 defectivos para as funções El, E2 e E4 e as funções tardias.
Exemplo de comparação 8: Constituição de uma linha celular de complementação para as funções Ele E4.
Digere-se o vector pTG1647 (exemplo 7) pelas enzimas Pstl-BamHÍ e introduzem-se no vector assim tratado três fragmentos: - o fragmento Pstl-Xbál de pTG6552 (exemplo 6.2) que comporta as sequências de Ad5 do nucleotido 505 ao nucleotido 1339, - o fragmento Xbal-Pshl de pTG6552 que comporta as sequências de Ad5 do nucleotido 1340 ao nucleotido 3665, e - o fragmento Sphl-BamHl de pTG6554 (exemplo 6.2) que comporta as sequências de AdS do nucleotido 3665 ao 4034 e um sinal de terminação da transcrição.
Corta-se o vector assim obtido mediante BamHl e introduzem-se nesse sítio três fragmentos que são os seguintes: - um fragmento digerido por BamHl-ΑβΙΙ produzido por PCR que corresponde à sequência do Ad5 situada entre as posições 32800 a 33104. Utiliza-se o ADN genómico de Ad5 como matriz e os iniciadores OTG5078 (SEQ ID NO: 38) e OTG5079 (SEQ ID NO: 39), - o fragmento ÂflQrAvrYL isolado do ADN genómico de Ad5 (nucleotidos 33105 a 35463), - o fragmento AvrW-BamHl produzido pelo PCR por intermédio dos iniciadores OTG5024 e OTG5025 (ver exemplo 7).
Introduz-se o vector assim produzido numa linha celular de acordo com o protocolo descrito anteriormente, para constituir uma linha de complementação para as funções E1 eE4.
Além disso, uma tal linha pode ser igualmente obtida de acordo com o protocolo seguinte:
Reconstitui-se a região E4 do genoma do Ad5 (nucleotidos 32800 a 35826) em diversas etapas. Sintetiza-se a parte que vai dos nucleotidos 33116 a 32800 mediante PCR a partir do ADN genómico de Ad5 com o par de iniciadores OTG5078 e OTG5079 /SEQ ID NO: 38 e 39) e depois insere-se no sítio EcoRV de M13TG130, para gerar Ml 3TG1645. O fragmento BamHl AflYl deste último é utilizado numa reacção de ligação com o fragmento Λ/ΤΠ-ΛντΙΙ de Ad5 (nucleotidos 33104 a 35463) e o vector pTG7457 digerido por BamYO. tAvrW Obtém-se o pTG1650.
Depois completa-se a região E4 por obtenção do fragmento que corresponde aos nucleotidos 35826 a 35457 por PCR a partir dc uma preparação de ADN genómico de Ad5 e dos iniciadores OTG5024 e OTG5025 (SEQ ID NO: 36 e 37). Insere-se este último no sítio Smal de M13mpl8 para se obter M13TG1646. Isola-se o fragmento AvrR-EcoBA a partir deste último e clona-se entre os sítios AvrW e EcoBA de pTG1650. Obtém-se pTG1652.
Isola-se o fragmento ZfcwwHI que comporta a região E4 de Ad5 de pTG1652 e clona-se no sítio BamYB de pTG1643, de pTG6559 (exemplo 6.2) ou no sítio Sspl de pTG6564 (exemplo 6.2) após ter franqueado os sítios, para produzir pTG1653, pTG1654 e pTG1655, (figura 6) respectivamente.
Gera-se por técnicas convencionais uma célula de complementação susceptível de complementar en trans as funções EI e E4, por: (1) transformação de pTG1653 na linha celular 293, ou (2) transformação de pTG1654 ou pTG1655 na linha celular A549.
De uma maneira geral, a expressão dos produtos das regiões EI e E4 é acompanhada por um efeito citotóxico. Um certo número de clones 293-1653 é susceptível de complementar simultaneamente adenovírus eliminados de EI e adenovínis eliminados de E4.
Uma outra alternativa consiste em proceder da maneira seguinte.
Submete-se o vector M13TG1646 a uma mutagénese dirigida com o oligonucleotido mutagénico OTG5991 (SF.Q TD NO: 40) com o objectivo de
eliminar o promotor da região E4 e de inserir um sítio Hpal. O vector mutado é designado por M13TG6522. É digerido por Pstl, tratado com ADN de polimerase do fago T4 e depois com AvrW e posto em ligação com um fragmento £coRI (Klenow)-dv/-II purificado de pTG1652 (exemplo 8), para se obter pTG6595. Cinde-se este último com Hpal e introduz-se o fragmento de 0,8 kb obtido de pTG5913 (figura 7) após digestão Bglll e BamHl e tratamento com a Klenow. Produz-se o pTG6596 no qual a região E4 (posições 32800 a 35826) se encontra colocada sob o controlo do promotor TK. A título indicativo, o pTG5913 suporta o gene TK-HSV-1 e o fragmento Bglll-BamHl corresponde ao promotor desse gene (Wagner at al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 78, 1441-1445).
Paralelamente, linearizam-se os vectores pTG1643 e pTG6559 (exemplo 6) com BamHl e insere-se um fragmento sintético resultante da reassociação dos oligonucleotidos OTG6141 e OTG6142 (SEQ ID NO: 41 e 42), para se obter respectivamente pTG8508 e pTG8507. Cindem-se estes últimos com BamHl antes de introduzir o fragmento BamHl purificado de pTG6596 que comporta a cassete de expressão de E4. Geram-se os vectores pTG8512 (figura 8) e pTG8513 (figura 9).
Por outro lado, a introdução do fragmento BamHl de pTG1652 no vector pTG8508 ou pTG8507 linearizado pela mesma enzima conduz a pTG8514 e pTG8515 respectivamente (figuras 10 e 11).
As linhas celulares transfectadas com pTG8512 ou pTG8515 permitirão complementar um adenovírus defectivo para a função E4, enquanto que aquelas que resultam da transfecção de pTG8513 ou pTG8514 se destinam a ampliar e a propagar adenovírus defectivos para as funções EI e E4. De igual modo, a 59 transfecção de pTG8512 ou pTG8515 nos células 293 permitirá complementar adenovírus defectivos para Ele E4.
LISTA DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL : (i) DEPOSITANTE:
(A) NOME : TRANSGENE (B) RUA : 11, rue de Molsheim
(C) CIDADE : STRASBOURG
(E) PAÍS: FRANÇA (F) CÓDIGO POSTAL : 67082 (G) TELEFONE : (33) 88.27.91.00 (H) TELECÓPIA : (33) 88.22.58.07 (ii) TITULO DA INVENÇÃO . Novos adenovírus defectivos e linhas de complementação correspondentes (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS : 42 (iv) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR . (A) ΉΡΟ DE SUPORTE : Fita (B) COMPUTADOR : IBM PC compatível
(C) SISTEMA D’ EXPLORAÇÃO : PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA PatentTn Release #1.0, Versão #1.25 (OEB) (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID N° . 1 . (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 30 pares de bases 60 (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDOES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (11) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ni) ANTI-SENTIDO : NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG4174) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° . 1 : GTGACGTCTT TGGTGTTTTC GCGGGAAAAC 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° . 2 . (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 30 pares de bases (B) ΉΡΟ : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO . Oligonucleotido de síntese (OTG4173) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 2 : 30
AC.CGAGTA AG ATTTGTCTAG GGCCGCGGGG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° . 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 33 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómíco) (iii) HIPOTÉTICA : NÃO (ui) ANTI-SENTIDO : NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO . Oligonucleotido de síntese (OTG4191) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° . 3 : GGCCATGGTC GCGGGAAAGG GACTTTGACC GTT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° . 4 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 31 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ΑΝΠ-SENTIDO : NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTGS021) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQID N° : 4 : GAACGGATCC CCAGACTCTG TTTGGATTTG G (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 5 : (i) CARACTERÍSTIC AS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 30 pares de bases (B) TIPO . ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO . Imear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA : NÃO (iii) ANTÍ-SENTIDO: SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5157) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 5 : CCAGAAATAT CTTCGCCCAG GCCGCCGCCC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 6 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 20 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES . simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ΑΝΤΙ-SENTI DO : NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5564) («) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQID N° : 6 : GATCCGATAT CCCGTTAACC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 7 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 20 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA ; ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5565) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 6 : GATCGGTTAA CGGATATCG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 8 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 47 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (íi) ΊΊΡΟ DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (xii) HIPOTÉTICA : NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5892) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA . SEQID N° . 8 . GTCGTAGGAT CCAGCTGCTC CCTGCITGTGTGTrGGAGGl CGCTGAG 47 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 9 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 47 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : lmear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA : NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5893) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 9 : GTAGCTGACG TCCCAGGTGC ACACCAATCrT GGIGAATGGT CAAATGG 47 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° . 10 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA . (A) COMPRIMENTO : 46 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTTDO : NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5920) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 10 : ACGGTAGGAT CCGACGTOGG TGAGCTCCTC GCTTGGTCTC CGTCCG 46 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 11 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 24 pares de bases (B) TIPO . ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) ΉΡΟ DE MOLÉCULA : ADN (genómico)
(ui) HIPOTÉTICA : NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO . Oligonucleotido de síntese (OTG5891) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA . SEQ ID N° : 11 : CAACCCCGAT TCTAGAGAAA CCTG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 12 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO . 35 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) ΉΡΟ DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG6079) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 12 : GCGCAGTTGC TCTGCGGATC CACTTAACAT TCAGT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 13 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO ; 38 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES . simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) ΉΡΟ DE MOLÉCULA : ADN (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA : NÃO (iii)
ANTI-SENTIDO : SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO . Oligonucleotido de síntese (OTG6080) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 13 : TAAAAGTACC AGGTAAGGAT CCCCTTGGTT TGCTTGGG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 14 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 21 pares de bases (B) TIPO . ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG6064) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 14 : GAAACCGAAT TCTCTTGGAA C (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 15 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 32 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples
6R (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG6065) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 15 : ACGAATGCAG CTCTCCACTT AACATTCAGT CG 32 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 16 : (i) C ARACTERT STIC AS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO . 27 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5481) (xi) DESCRIÇÃO DA SF.QI ÍÊNCIA : SEQ ID N° : 16 : CAGTGAATTC ATCATCAATA ATATACC 27 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 17 : (i) CARACTERÍSTTCAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 24 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES . simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA. NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5482) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 17 : AAACTGGTCA CCGTGATT A A AAAG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° 18 . (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 25 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5455) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° . 18 :
ATCGGAATTC AAGATGATTA GGTAC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID N° : 19 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) CUMPRIMENTO : 28 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES ; simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (íi) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5456) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 19 : ATCGTCT AG A TTAAGGCATT TTCTTTTC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° . 20 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 18 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (íi) TIPO DE MOLÉCULA . ADN (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO . NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5728) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQID N° : 20 : TGTAGCAGGA GGACTAAG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° . 21 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 39 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) ΉΡΟ DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (íii) ANTI-SENT1DO : SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5729) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 21 : CCGCATTAAT TAACCGCGAC AAACGATTCT TTATTCTTG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 22 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 36 pores de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genónuco) (iii) HIPOTÉTICA : NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (5730) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA . SEQ ID N° : 22 : CGCGGTTAAT TAATGCGGTA AAACCTACGT CACCCG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 23 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA . (A) COMPRIMENTO : 30 pares de bases (B) TIPO . ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA . ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA. NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG6060) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 23 : AATAAAAGAT CATTATTTTC ATTAGAACTG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 24 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 24 pores de bases 73 (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES . simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (gcnómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO . Oligonucleotido de síntese (OTG6061) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 24 : TGTGTTGGTT TTTTGTGTGT TAAT 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 25 . (!) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 30 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES . simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO . Oligonucleotido de síntese (OTG6062) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 25 : 30
TAACACACAA AAAACCAACA CACAGTTCTA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 26 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO . 24 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genórmco) (iii) HIPOTÉTICA : NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG6063) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 26 ; ATGAAAATAA TGATCTTTTA TTAT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° . 27 : (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 32 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA : NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO . Oligonucleotido de síntese (OTG4564) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQID N° : 27 . TCCGTGAATT CTAGTAGTGT GGCGGAAGTG TG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 28 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 23 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO . linear (u) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA : NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG4565) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA . SEQ ID N° : 28 . TCCAGTCCGG AGAACCGGGC GCC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 29 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 28 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA : ΝΑΟ (lii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO Oligonucleotido de síntese (OTG5013) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA . SEQID N° . 29 : TAACCTGCAG GAGTGCCAGC GAGTAGAG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 30 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 21 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5015) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 30 . CAACGCGCAT GCCCCCATGG G (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 31 . (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 31 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (11) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA : NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5014) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQID N° : 31 : TAGGAGATCT GTTTTAAACC GCATTGGGAG G (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 32 : (i) C ARACTERÍST1C AS DA SEQUÊNCIA . (A) COMPRIMENTO : 34 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : NÃO (vi) ORIGEM. (A) QRGANTSMO Oligonucleotido de síntese (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID Ν’: 32 : CGGAGTACTG TCCTCCGCGG AGTACTGTCC TCCG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 33 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 34 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES . simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° . 33 : CGGAGGACAG TACTCCGCGG AGGACAGTAC TCCG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 34 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 16 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES . simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) ΉΡΟ DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA : NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5039) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQID N° : 34 : TGCTGGATAT CAGTCA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 35 : (i) CARACTERiSΉCAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 24 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5040) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 35 : GATCTGACTG ATATCCAGCA TGCA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 36 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 20 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico)
(iii) HIPOTÉTICA ; NÃO (iii) ΑΝΤΙ SENTIDO : NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5024) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA . SEQ ID N° : 36 : CTCCTGCCTA GGCAAAATAG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 37 : (x) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 32 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5025)
(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 37 : GCAGATGGAT CCGGGCGGAG TAACTTGTAT GT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 38 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 31 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) ΊΠΡΟ DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO ; Oligonucleotido de síntese (OTG5078) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQID N° : 38 : GTCGCGGATC CGTTATGTTT CAACGTGTTT A (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 39 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 20 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES . simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA : NÃO (ui) ANTI-SENTIDO . SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5079) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA SEQ ID N° 39 ACATGAACTT AAGCGAGCTG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 40 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (Λ) COMPRIMENTO : 38 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA . ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA. NÃO (iii) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG5991) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQID N° : 40 : CACGGCACCA GCTCAAGTTA ACGGATCCAT CTGCGGGT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 41 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO . 27 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTI-SENTIDO : NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG6141) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° : 41 . 83 ν 27 GATCCTGTGT GTTGGTTTTT TGTGTGC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID N° : 42 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 27 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) NÚMERO DE CORDÕES : simples (D) CONFIGURAÇÃO : linear (íi) ΉΡΟ DE MOLÉCULA : ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (m) ANTI-SENTIDO . SIM (vi) ORIGEM: 27
(A) ORGANISMO : Oligonucleotido de síntese (OTG6142) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° 42 : GATCGCACAC AAAAAACCAA CACACAG
Lisboa, 7 de Maio de 2001 /

Claims (31)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Vector adenoviral defectivo para a replicação, susceptível de ser encapsulado numa célula dc complementação, que deriva do genoma de um adenovírus que compreende de 5’ em 3’, uma ITR S\ uma região de encapsulação, uma região EI A, uma região E1B, uma região E2, uma região E3, uma região E4 e uma ITR 3’, por deleção (i) na região E1A e na região E1B; ou (ii) na região E1 A, na região E2 e na região 1B; ou (iii) na região EI A, na região E2 e na região E3; ou (iv) na região E1 A, na região E2, na região EI B e na região E3; ou (v) na região E1 A, na região E2 e na região E4; ou (vi) na região R1 A, na região E2, na região E1B e na região E4; ou (vii) na região E1 A, na região E2, na região E3 e na região E4; ou (viii) na região EIA, na região E2, na região E1B, na região E3 e na região E4, impedindo as referidas eliminações a produção de pelo monos um produto de expressão codificado pelas referidas regiões, entendendo-se que o vector não é um vector adenoviral que compreende apenas as ITR 5’ e 3’ e a região situada na extremidade 5’ do genoma, logo após a ITR 5’ que encerra a sequência de encapsulação e a sequência promotora de EI A.
2. Vector adenoviral de acordo com a reivindicação 1 (iii), (iv), (vii) ou (viii) que deriva de um genoma de um adenovírus por deleção parcial da região E3 do referido genoma mantendo α parte da referida região E3 que codifica para a proteína gpl9kDA.
3. Vector adenoviral de acordo com a reivindicação 2, no qual a parte da região E3 que codifica para a proteína gpl9kDA se encontra colocada sob o controlo de elementos apropriados para a expressão da referida proteína na célula hospedeira.
4. Vector adenoviral de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, que deriva do genoma de um adenovírus escolhido de entre os adenovírus caninos, aviários e humanos.
5. Vector adenoviral de acordo com a reivindicação 4, que deriva do genoma de um adenovírus humano de tipo 5.
6. Vector adenoviral de acordo com a reivindicação 5, no qual a deleção da parte da região E3 se estende do nucleotído 27871 até ao nucleotído 30748.
7. Vector adenoviral de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, que deriva do genoma de um adenovírus por deleção de pelo menos 18 % do genoma do referido vírus.
8. Vector adenoviral de acordo com a reivindicação 7, que deriva do genoma de um adenovírus por deleção de pelo menos 22 % do genoma do referido vírus.
9. Vector adenoviral de acordo com a reivindicação 8, que derivado do genoma de um adenovírus por deleção de pelo menos 40 % do genoma do referido vírus.
10. Vector adenoviral de acordo com a reivindicação 9, que deriva do genoma de um adenovírus por deleção de pelo menos 95 % do genoma do referido vírus.
11. Vector adeno virai que deriva do genoma de um adenovírus humano de tipo 5 por deleção da parte do genoma que se estende dos nucleotídos 459 a 35832.
12. Vector adeno virai de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, que compreende ainda uma sequência nucleotídica exógena.
13. Vector adenoviral de acordo com a reivindicação 12, que compreende ainda um gene de interesse colocado sob o controlo dos elementos necessários à sua expressão.
14. Vector adenoviral de acordo com uma das reivindicações 12 a 13, que compreende ainda um gene que codifica para uma proteína trans-activadora de transcrição não adenoviral; encontrando-se o referido gene colocado sob o controlo dos elementos necessários para a expressão da referida proteína numa célula hospedeira.
15. Vector adenoviral de acordo com a reivindicação 14, que compreende o gene que codifica para a proteína transactivadora de transcrição Gal4 de Saccharomyces cerevisiae.
16. Partícula de adenovírus que compreende um vector adenoviral de acordo com uma das reivindicações 1 a 15.
17. Célula hospedeira eucariota que compreende um vector adenoviral de acordo com uma das reivindicações 1 a 15 ou uma partícula de adenovírus de acordo com a reivindicação 16.
18. Processo para a preparação de uma partícula de adenovírus de acordo com a reivindicação 16, de acordo com o qual : (i) sc introduz um vector adenoviral de acordo com uma das reivindicações 1 a 15 numa linha de complementação susceptível de complementar em trans o referido vector adenoviral para se obter uma linha de complementação transfeelada, (ii) se cultiva a referida linha de complementação transfectada em condições apropriadas para permitir a produção da referida partícula de adenovírus; e (iii) se recupera a referida partícula de adenovírus na cultura celular.
19. Processo de acordo com a reivindicação 18, de acordo com o qual a referida linha de complementação comporta um elemento de complementação, que compreende em particular uma parte da região EI do genoma de um adenovírus com exclução da ITR 5’; sendo o referido elemento de complementação susceptível de complementar em trans um vector adenoviral defectivo e encontrando-se integrado no genoma da referida linha de complementação ou inserido num vector de expressão; compreendendo a referida linha de complementação, em especial: (i) toda ou parte da região EI A do genoma do adenovírus; e (ii) toda ou parte da região E2 do referido genoma; e (iii) toda ou parte de pelo menos uma região do referido genoma escolhida de entre as regiões E1B e E4,
20. Processo de acordo com a reivindicação 19, de acordo com o qual a referida linha de complementação compreende em particular . (i) toda ou parte da região E1A do genoma de um adenovírus; (ii) toda ou parte da região E2 do referido genoma; e (iii) toda ou parte das regiões F.lBe E4 do referido genoma.
21. Processo de acordo com a reivindicação 19 ou 20, de acordo com o qual a referida linha de complementação compreende em especial toda ou parte da região EIA e a integralidade da região E1B do genoma de um adenovírus que codifica para as proteínas precoces.
22. Processo de acordo com uma das reivindicações 19 a 21, de acordo com o qual a referida linha de complementação compreende em particular uma parte do genoma de um adenovírus escolhido de entre os adenovírus caninos, aviários e humanos.
23. Processo de acordo com a reivindicação 22, de acordo com o qual a referida linha de complementação compreende em particular uma parte do genoma de um adenovírus humano de tipo 5.
24. Processo de acordo com a reivindicação 23, de acordo com o qual a referida linha de complementação compreende em particular a parte do genoma de um adenovírus humano de tipo 5 : (i) que se estende do nucleotido 100 ao nucleotido 5297; (ii) que se estende do nucleotido 100 ao nucleotido 4034; ou (iii) que se estende do nucleotido 505 ao nucleotido 4034.
25. Processo de acordo com uma das reivindicações 19 a 24, de acordo com o qual a referida linha de complementação compreende uma parte da região EIA do genoma de um adenovírus desprovida do seu promotor natural; encontrando-se a referida parte colocada sob o controlo de um promotor apropriado.
26. Processo de acordo com a reivindicação 25, de acordo com o qual a referida parte da região F.1 A se encontra colocada sob o controlo de um promotor 6 induzível por uma proteína trans-activadora de transcrição não-adenoviral
27. Processo de acordo com uma das reivindicações 19 a 26, de acordo com o qual a referida linha de complementação deriva de uma linha celular aceitável de um ponto de vista farmacêutico.
28. Processo de acordo com a reivindicação 27, de acordo com o qual a referida linha de complementação deriva de uma linha celular escolhida de entre as linhas Vero, ΒΗΚ, A549, MRC5, W138 e CHO.
29. Processo de acordo com uma das reivindicações 19 a 26, de acordo com o qual a referida linha de complementação deriva de uma célula da retina de um embrião humano.
30. Composição farmacêutica que compreende, a título de agente terapêutico ou profiláctico, um vector adenoviral de acordo com uma das reivindicações 1 a 15, uma partícula de adenovírus de acordo com a reivindicação 16 ou obtida realizando um processo de acordo com uma das reivindicações 18 a 29 ou uma célula encariota de acordo com a reivindicação 17, em associação com um suporte aceitável de um ponto de vista farmacêutico.
31. Utilização de um vector adenoviral de acordo com uma das reivindicações 1 a 15, de uma partícula de adenovírus de acordo com a reivindicação 16 ou obtida mediante realização de um processo de acordo com uma das reivindicações 18 a 29 ou de uma célula hospedeira encariota de acordo com a reivindicação 17 para a preparação de uma composição farmacêutica para transferir moléculas de ADN numa célula ou num organismo eucariota. Lisboa, 7 de Maio de 2001 O Acjc-r;'! : Cíl·::
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