ES2253270T3 - Lineas celulares y construcciones utiles en la produccion de adenovirus a los cuales de les ha suprimido e1 en ausencia de un adenovirus de replicacion competente. - Google Patents
Lineas celulares y construcciones utiles en la produccion de adenovirus a los cuales de les ha suprimido e1 en ausencia de un adenovirus de replicacion competente.Info
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Abstract
Una línea celular de complementación de E1 útil para la producción de adenovirus recombinante deficiente en E1 en ausencia de adenovirus detectable competente para replicación, dicha líneas celular que complementa a E1 comprendiendo una línea celular aneuploide transformada en forma estable con una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican al marco de lectura abierta (ORF) de E1a del adenovirus y E1b del adenovirus bajo el control de un promotor fosfoglicerato quinasa (PGK), en donde las secuencias de ácido nucleico comprenden además una supresión de todas las secuencias de adenovirus 5¿ de las secuencias que codifican al ORF de E1a de adenovirus, y en donde la línea celular aneuploide es una línea celular HeLa.
Description
Líneas celulares y construcciones útiles en la
producción de adenovirus a los cuales se les ha suprimido E1 en
ausencia de un adenovirus de replicación competente.
Este trabajo contó con el apoyo de NIDDK
(DK47757-06 & DK49136-05), NHLBI
(HL49040-08) y NICHD (HD32649-05) de
los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno de los Estados
Unidos puede tener ciertos derechos sobre esta invención.
Esta invención se relaciona generalmente con el
campo de las construcciones y los métodos para producir vectores
virales, y más particularmente, para la producción de
adenovirus.
Los adenovirus recombinantes han sido descritos
como útiles para el suministro de transgenes a células para una
variedad de propósitos, incluidos tanto usos terapéuticos como
profilácticos (vacunas). Sin embargo, la comercialización exitosa de
adenovirus a los cuales se les ha suprimido E1, requerirá de
procesos de fabricación adecuados que tienen aún que ser
desarrollados. La infección de una línea celular transcomplementaria
de E1 con el vector y la purificación del lisado resultante es un
proceso simple y escalable que produce suficientes cantidades de
producto. Infortunadamente, la producción de vectores de adenovirus
a los cuales se les ha suprimido E1 para terapia génica ha estado
plagado por la aparición de adenovirus de replicación competente
(RCA) causada por la recombinación homóloga entre el vector y el gen
transfectado E1.
Se han descrito diferentes estrategias para
evitar la RCA. Sin embargo, hasta la fecha ninguna de estas
aproximaciones ha resultado en una línea celular complementaria de
E1 que sea estable y produzca altos rendimientos de adenovirus
deficiente en E1 en ausencia de RCA detectable.
J. -L. Imler y colaboradores, Gene Ther.,
3:75-84 (1996) describe una célula A549
transfectada en forma estable con marcos de lectura abierta (ORF) de
E1a y E1b y contiguos al gen pIX. El E1a fue estimulado por el
promotor de la fosfoglicerato quinasa y el RCA fue eliminado según
se dice. Sin embargo, publicaciones más recientes que describen este
sistema revelan que Imler fue incapaz de detectar la expresión de la
proteína de E1b. Ver, Introgene, WO 97/00326, publicada en enero 3
de 1997.
Esta solicitud de Introgene describe un sistema
alternativo a aquel de Imler, citado anteriormente. Esta solicitud
describe líneas celulares derivadas de ciertas células diploides
humanas expresadas con E1a y E1b, pero no con pIX (ECACC No.
96022940). Las células fueron producidas por medio de transfección
de células de retinoblasto embriónico humano (HER) con un vector que
contiene nt 459 - 3510 de Ad, que corresponde a E1a, E1b, pero
excluye al promotor de E1a, una porción del gen E1b que codifica a
la proteína de 8,3 kb de E1b, y a cualquier secuencia de pIX.
Se describe otro sistema para librarse del RCA en
Massie, en la patente estadounidense No. 5.891.690. La patente
describe una línea celular que complementa a Ad E1 que tiene un
elemento de complementación integrado en forma estable que
comprende una porción de la región Ad E1 que cubre al gen E1a y al
gen E1b, pero que carece del ITR 5', la secuencia de
empaquetamiento, y el promotor de E1a. Además, el gen E1a está bajo
el control de un primer elemento promotor, y el gen E1b está bajo el
control de un segundo promotor. Una línea celular específica
descrita y reivindicada por Massie contiene nt 532 - 3525 de Ad5,
que incluye a E1a, al promotor de E1b, y una porción del gen E1b.
Esta línea celular no contiene al carboxi terminal del gen E1b, que
codifica al producto de 8,3 kb, ni tampoco contiene las secuencias
del gen pIX.
Lo que se necesita en el estado del arte es una
línea celular que complemente a E1, que exprese a todos los
productos adenovirales de los genes E1a y E1b, y que produce altos
rendimientos de los adenovirus deficientes en E1, en ausencia de RCA
detectable.
Convenientemente, la presente invención provee
líneas celulares que expresan a E1 que son estables, que pueden ser
adaptadas a un cultivo en suspensión en un medio libre de suero, y
que produce una gran cantidad del vector. En forma muy
significativa, las líneas celulares permiten al aislamiento y el
subcultivo de adenovirus recombinantes a los cuales se les ha
suprimido E1 en un ambiente libre de adenovirus de replicación
competente (RCA). Además, las líneas celulares de la invención
aplacan efectivamente al vector para permitir el aislamiento y el
subcultivo de nuevos recombinantes en un ambiente libre de RCA.
De este modo, en un aspecto, la invención provee
una línea celular que complementa a E1, útil para la producción de
adenovirus deficientes en E1 en ausencia de adenovirus de
replicación competente. La línea celular que complementa a E1
comprende una línea celular aneuploide transformada en forma estable
con una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de ácido
nucleico que codifican al Marco de Lectura Abierta (ORF) de E1a del
adenovirus y al E1b del adenovirus bajo el control de un promotor de
fosfoglicerato quinasa (PGK). Las secuencias de ácido nucleico
comprenden además una supresión de todas las secuencias 5' del
adenovirus de las secuencias que codifican al ORF de E1a del
adenovirus. La línea celular aneuploide es una línea celular
Hela.
En otro aspecto, la invención provee un método
para el empaquetamiento de partículas adenovirales deficientes en E1
en ausencia de adenovirus de replicación competente. El método es
definido aquí más adelante en la reivindicación 7. Involucra la
introducción de un vector recombinante dentro de células de la línea
celular de la invención que complementa a E1, donde el vector
contiene un defecto en la región E1 del adenovirus, elementos cis 5'
y 3' del adenovirus necesarios para la replicación y el
empaquetamiento, adenovirus pIX, y secuencias reguladoras necesarias
para la expresión de los genes adenovirales y donde sea apropiado un
transgén.
En otro aspecto, la invención provee un método de
amplificación de partículas adenovirales deficientes en E1 en
ausencia de adenovirus de replicación competente detectable. El
método es definido aquí más adelante en la reivindicación 15.
Involucra la infección de células de la línea celular de la
invención que complementa a E1 con un adenovirus deficiente en E1 y
cultivando bajo condiciones que permiten a la célula expresar a las
proteínas de E1a y E1b.
Otros aspectos y ventajas de la invención serán
claras fácilmente a partir de la siguiente descripción detallada de
la invención.
La Figura 1 es una representación esquemática de
las estructuras del vector adenoviral recombinante al cual se le ha
suprimido E1, de la secuencia de ADN de Ad5 en células 293 y del
fragmento AD5E1 de PGK en la nueva línea celular de E1.
La Figura 2A es una gráfica de la cinética de
crecimiento de un adenovirus recombinante al cual se le ha suprimido
E1, H5.CBlacZ, en la línea celular 293 y en la nueva E1. Ver el
Ejemplo 2C para detalles del estudio. La producción del virus
H5.CBlacZ en cada línea celular se muestra sobre el eje y en una
escala larga. La escala de tiempo se muestra sobre el eje x.
La Figura 2B es un diagrama de barras que muestra
la eficiencia relativa de formación de placa (RPE) para el virus
H5.CBlacZ sobre las nuevas líneas celulares E1 que fueron comparadas
con las células 293. Ver el Ejemplo 2D para detalles del estudio.
Las RPE fueron computadas como el porcentaje del título del virus
H5.CBlacZ. Las barras sólidas, la media de la RPE de cada línea
celular de tres diferentes experimentos; las barras de error
representan desviaciones estándar.
La presente invención provee un método de
producción de adenovirus a los cuales se les ha suprimido E1 en
ausencia de adenovirus detectable de replicación competente (RCA),
así como de líneas celulares y vectores útiles en este método. Los
adenovirus resultantes a los cuales se les ha suprimido E1 son
particularmente muy adecuados para ser usados en el suministro de
genes a un mamífero, debido a que estos adenovirus están
sustancialmente libres de RCA contaminante.
En una modalidad deseable, la invención provee
líneas celulares basadas en HeLa que expresan en forma estable al
locus de E1 de un promotor derivado del gen de la
fosfoglicerato quinasa (PGK). Estas líneas celulares no tienen
secuencias adenovirales 5' del marco de lectura abierta (ORF) de E1
y homología reducida (o inexistente) 3' de E1. Estas líneas
celulares soportan aplacamiento y amplificación de los vectores a
los cuales se les ha suprimido E1 en niveles iguales o mejores que
los de las células 293 sin la aparición de RCA.
Un ejemplo de tales líneas celulares es la línea
celular GH329, que ha sido depositada en la American Type Culture
Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209, Estados Unidos, en septiembre 29, 1999,
y se le ha asignado el número de acceso PTA-803.
Este depósito ha sido realizado conforme a las provisiones del
Tratado de Budapest y de conformidad con los requerimientos
estipulados en 37 CFR \NAK\NAK 1.801 y siguientes. Se encontró
que las células GH329 complementan (y permiten la replicación de)
los vectores virales a los cuales se les ha suprimido E1 en ausencia
de adenovirus detectables de replicación competente (RCA) al menos
sobre 20 pasadas. Actualmente, se cree que GH329 expresa una copia
única de cada una de las proteínas E1a y E1b. Sin embargo, los
rendimientos obtenidos utilizando la línea celular GH329 son al
menos equivalentes con aquellas obtenidas en células 293, en las
cuales se observa RCA después de 5 a 10 pasadas.
Otra línea celular apropiada es la línea celular
GH364 que expresa entre 5 y 10 copias de las proteínas E1a y E1b.
Aún otra línea celular de la invención es la línea celular GH354. Se
ha encontrado que las células GH354 complementan (y permiten la
replicación de) los vectores virales a los cuales se les ha
suprimido E1 en ausencia de RCA detectable al menos durante 20
pasadas. Además, como con la línea celular GH354, el rendimiento
obtenido utilizando a la línea celular GH354 es al menos equivalente
a aquella obtenida en células 293.
Las líneas celulares de la invención son
particularmente apropiadas para la producción de adenovirus al cual
se le ha suprimido E1 para uso clínico y preclínico, ya que se
adaptan fácilmente al crecimiento en medio libre de suero. Las
líneas celulares de la invención, por ejemplo, GH329, pueden ser
adaptadas para crecer en medio libre de suero, utilizando técnicas
bien conocidas por aquellos capacitados en la técnica. Estas líneas
celulares adaptadas al medio libre de suero, son abarcadas por la
presente invención.
Opcionalmente, otras líneas celulares útiles
pueden derivarse de una línea celular de la invención. Por ejemplo,
la línea celular GH329 (o GH354 o GH364) puede modificarse para
expresar en forma estable a otra(s) proteína(s)
deseadas, utilizando las técnicas descritas aquí, así como técnicas
conocidas en el arte. En una modalidad deseable, puede producirse un
derivado de la línea celular GH329, transformando en forma estable a
las células GH329 de tal manera que contengan una o más secuencias
que expresen proteínas adenovirales (o fragmentos funcionales de las
mismas) requeridas para la replicación del virus al cual se le ha
suprimido E1. Además de las funciones adenovirales de E1a y E1b
proveídas por la línea celular, las funciones adenovirales incluyen
E2a y E4 ORF6. De esta forma, en una modalidad, puede producirse
una línea celular derivada de GH329 que exprese las funciones
requeridas de la región E2 o de la región E4, o combinaciones de las
mismas. En forma conveniente, la(s) molécula(s) de
ácido nucleico utilizada(s) para producir a la línea celular
derivada de GH329, no contiene a la secuencia adenoviral 5' de la
región de codificación E1, y solamente las secuencias adenovirales
mínimas requeridas para expresar a las proteínas funcionales
deseadas en la célula huésped. Dada esta información, alguien
entrenado en la materia puede fácilmente modificar genéticamente a
otras líneas celulares derivadas de Gh329.
El vector utilizado para transformar a las
células HeLa y producir la línea celular GH329 de la invención,
puede ser utilizado para desarrollar otras líneas celulares
transcomplementarias de E1. Tales otras líneas celulares se derivan
de las células HeLa, una célula aneuploide como la epitelial,
derivada de carcinoma cervical [ATCC CCL2]. La selección de especies
de mamíferos que provean las células, no es una limitación de esta
invención.
Apropiadamente, las células objetivo se
transforman con una molécula de ADN que transporta, por lo menos,
secuencias de ADN que codifican a E1a y E1b del adenovirus bajo el
control de un promotor PGK. Esta molécula carece de secuencias 5'
adenovirales de la región E1, preferiblemente excluyendo al promotor
nativo de E1a y contiene secuencias mínimas 3' a la región E1 (esto
es, opcionalmente contiene secuencias parciales pIX).
Las secuencias de ADN que codifican a los genes
E1a y E1b del adenovirus útiles en esta invención, pueden
seleccionarse entre cualquier tipo de adenovirus conocido,
incluyendo a los actuales 41 tipos humanos identificados. En forma
similar, los adenovirus que se sabe que infectan a otros animales
pueden suministrar las secuencias del gen. La selección del tipo de
adenovirus para cada secuencia del gen E1a y E1b no limita a esta
invención. Las secuencias para un número de serotipos de adenovirus,
incluida aquella del serotipo Ad5, se encuentran disponibles en el
Banco de Genes. Una variedad de cepas de adenovirus están
disponibles en el ATCC, o se encuentran disponibles por solicitud a
partir de una variedad fuentes comerciales e institucionales. En el
siguiente ejemplo de modalidad, las secuencias de los genes E1a y
E1b son aquellas del serotipo 5 (Ad5) de adenovirus.
Por "ADN adenoviral que expresa al producto del
gen E1A" se entiende cualquier gen de adenovirus que codifica a
E1a o a cualquier porción funcional de E1a. En forma similar están
incluidos cualquier alelo u otras modificaciones del gen E1a o
porción funcional. Tales modificaciones pueden ser introducidas en
forma deliberada echando mano de modificaciones genéticas
convencionales o técnicas mutagénicas para mejorar de alguna manera
la expresión o la función de E1a, así como las variantes alélicas
del mismo que se presentan en forma natural.
Por "ADN adenoviral que expresa al producto del
gen E1b", se entiende cualquier gen de adenovirus que codifica a
E1b o a cualquier porción funcional de E1b. En forma similar están
incluidos cualquier alelo u otras modificaciones del gen E1b o
porción funcional. Tales modificaciones pueden ser introducidas en
forma deliberada echando mano de modificaciones genéticas
convencionales o técnicas mutagénicas para mejorar de alguna manera
la expresión o la función de E1b, así como las variantes alélicas
del mismo que se presentan en forma natural.
La molécula de ácido nucleico que transporta a Ad
E1a y Ad E1b puede estar en cualquier forma que transfiera estos
componentes a la célula huésped. Más convenientemente, estas
secuencias están contenidas dentro de un vector. Un "vector"
incluye, sin limitación, a cualquier elemento genético, tal como un
plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, virus, virión, etc.
En una modalidad particularmente adecuada, la molécula de ácido
nucleico es un plásmido que transporta Ad E1a, Ad E1b, secuencias
parciales de pIX, y al promotor de PGK.
La molécula de ácido nucleico puede contener
otras secuencias no virales, tales como aquellas que codifican a
ciertos reporteros seleccionables o genes marcadores, por ejemplo,
secuencias que codifican higromicina o purimicina, o el gen de
resistencia a la neomicina para selección de G418, entre otros. La
molécula puede contener además otros componentes.
Pueden utilizarse técnicas convencionales para la
construcción de las moléculas de ácido nucleico de la invención.
Ver, generalmente, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring
Harbor, New York.
Una vez que la molécula de ácido nucleico deseada
se modifica genéticamente, puede ser transferida a la célula
objetivo por cualquier método adecuado. Tales métodos incluye, por
ejemplo, transfección, electroporación, suministro por liposoma,
técnicas de fusión de membrana, píldoras recubiertas de ADN de alta
velocidad, infección viral y fusión del protoplasto. Después de eso,
las células se cultivan de acuerdo con métodos estándar y,
opcionalmente, se siembran en un medio que contiene un antibiótico
para seleccionar las células que contienen a las células que
expresan al gen de resistencia. Después de un período de selección,
las colonias resistentes se aíslan, se expanden, y se hace un
muestreo para la expresión de E1. Ver, Sambrook y colaboradores,
citado más arriba.
Las células de complementación de E1 de la
invención son útiles para una variedad de propósitos. Más
convenientemente, las células (por ejemplo, GH329) se utilizan en el
empaquetamiento de virus recombinante (esto es, partículas virales)
de vectores deficientes en E1 y en la producción de alto rendimiento
de adenovirus deficientes en E1, en ausencia de RCA detectable.
Las células de la invención que expresan Ad5 E1a
y E1b son adecuadas para el uso en el empaquetamiento del virus
recombinante de los vectores deficientes en E1 (por ejemplo,
plásmidos) que contienen secuencias de Ad5 y Ad2. Además, estas
células se anticipan útiles en la producción de virus recombinante
de otros serotipos de Ad, que son conocidos por aquellos entrenados
en la técnica.
En una modalidad preferida, este método de la
invención involucra el empaquetamiento de un vector con E1 suprimido
que contiene un transgén dentro de una partícula adenoviral con E1
suprimido útil para el suministro transgénico a una célula huésped.
En una modalidad preferida, e vector en E1 suprimido contiene todos
los genes adenovirales necesarios para producir y empacar una
partícula adenoviral infecciosa que se repica únicamente en
presencia de proteínas complementarias de E1, por ejemplo, como
aquellas suministradas por la línea celular de la invención. El
vector contiene defectos en ambas secuencias E1a y E1b, y en forma
más deseable, se le han suprimido todas, o la mayoría de las
secuencias que codifican estas proteínas.
Como mínimo, el vector con E1 suprimido que va a
ser empacado contiene a los elementos cis adenovirales 5' y 3'
necesarios para la replicación y el empaquetamiento, un transgén, y
un gen pIX o un fragmento funcional del mismo. El vector contiene
además secuencias reguladoras que permiten la expresión del producto
transgénico codificado en una célula huésped, cuyas secuencias
reguladoras están operativamente enlazadas al transgén. Como se lo
utiliza aquí, secuencias "operativamente enlazadas" incluyen
tanto secuencias de control de expresión que son contiguas con gen
de interés, como secuencias de control de expresión que actúan en
trans o a una distancia para controlar al gen de interés. También se
encuentran incluidas en el vector las secuencias reguladoras
operativamente enlazadas a otros productos génicos, por ejemplo, al
gen pIX, transportado por el vector.
El vector para ser empacado deficiente en E1
incluye, como mínimo, secuencias de adenovirus de repetición
terminal invertida (ITR) 5' y 3' que actúan en forma cis, de un
adenovirus (que funcionan como los orígenes de replicación) y el
dominio nativo de empaquetamiento/potenciador 5'. Estos son
elementos cis 5' y 3' necesarios para el empaquetamiento lineal de
genomas Ad y además contienen los elementos potenciadores para el
promotor
E1.
E1.
El vector con E1 suprimido que va a ser empacado
dentro de la partícula viral, se modifica genéticamente además para
que exprese al producto génico pIX. Más convenientemente, el gen pIX
está intacto, contiene al promotor nativo y codifica a la proteína
de longitud completa. Sin embargo, cuando se lo desee, el promotor
nativo pIX puede ser sustituido por otro promotor deseado.
Alternativamente, las secuencias que codifican un fragmento
funcional de pIX, pueden seleccionarse para ser utilizadas en el
vector. En aún otra modalidad alternativa, las secuencia nativas
codifican a pIX, o puede modificarse un fragmento funcional del
mismo para mejorar la expresión. Por ejemplo, las secuencias pueden
modificarse, por ejemplo, por medio de mutagénesis dirigida al sitio
u otras técnicas adecuadas, para insertar codones preferenciales
para mejorar la expresión en una célula huésped seleccionada.
Opcionalmente, el pIX puede ser suministrado a la línea celular que
complementa a E1 en una molécula separa-
da.
da.
Un ejemplo de vector que contiene solamente las
secuencias adenovirales mínimas es llamado el vector
Ad\DeltaE1-E4, y carece de todos los genes
adenovirales funcionales incluidos E1, E2, E3, E4, el gen intermedio
IXa y los genes tardíos L1, L2, L3, L4 y L5 con la excepción del gen
intermedio IX que está presente. Sin embargo, en una modalidad
preferida, el vector con E1 suprimido contiene, además de las
secuencias adenovirales mínimas descritas anteriormente, las
regiones adenovirales funcionales E2 y E4. En otra modalidad
adecuada, las secuencias adenovirales en el vector con E1 suprimido
incluyen a los elementos cis 5' y 3', a las regiones funcionales E2
y E4, a los genes intermedios IX y IXa, y a los genes tardíos L1 a
L5. Sin embargo, el vector con E1 suprimido puede ser genéticamente
modificado fácilmente por alguien entrenado en la técnica, tomando
en consideración el número de secuencias requeridas, y no se limita
a aquellas modalidades como ejemplo.
El vector se construye de tal manera que el
transgén y las secuencias que codifican a pIX se localizan secuencia
debajo de las ITR 5' y secuencia arriba de las ITR 3'. El transgén
es una secuencia de ácido nucleico, heteróloga a la secuencia del
adenovirus, que codifica un polipéptido, una proteína, u otro
producto de interés. El transgén está operativamente enlazado a los
componentes reguladores en una forma que permite la transcripción
transgénica.
La composición de la secuencia transgénica
dependerá del uso que se de al virus resultante. Por ejemplo, un
tipo de secuencia transgénica incluye un gen reportero, que por
expresión produce una señal detectable. Tales secuencias reporteras
incluyen sin limitación, secuencias de ADN que codifican
\beta-lactamasa,
\beta-galactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina,
timidina quinasa, proteína verde fluorescente (GFP), cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT), luciferaza, proteínas que se enlazan a la
membrana que incluyen, por ejemplo, CD2, CD4, CD8, la proteína
hemaglutinina de la influenza, y otras bien conocidas en el estado
de la técnica para las cuales existen o pueden producirse por
medios convencionales, anticuerpos de alta afinidad dirigidos a
ellas, y proteínas de fusión que comprenden una proteína de enlace a
la membrana apropiadamente fusionada a un dominio de etiqueta de
antígeno, entre otros de hemaglutinina o Myc.
Sin embargo, en forma deseable, el transgén es
una secuencia no marcadora que codifica un producto que es útil en
biología y en medicina, tale como proteínas, péptidos, ácidos
nucleicos antisentido (por ejemplo, ARN), enzimas, o ARN catalítico.
El transgén puede ser utilizado para corregir o mejorar deficiencias
génicas, que pueden incluir deficiencias en las cuales los genes
normales se expresan al menos en niveles normales o deficiencias en
las cuales el producto del gen funcional no se expresa. Un tipo
deseable de secuencia transgénica codifica una proteína terapéutica
o polipéptido que se expresa en una célula huésped. La invención
incluye además el uso de transgenes múltiples, por ejemplo, para
corregir o mejorar un defecto génico causado por una proteína
multisubunidad. En ciertas situaciones, puede utilizarse un transgén
diferente para codificar cada subunidad de una proteína, o para
codificar diferentes péptidos o proteínas. Esto es deseable cuando
el tamaño del ADN que codifica a la subunidad de proteína es grande,
por ejemplo, para una inmunoglobulina, el factor de crecimiento
derivado de plaquetas, o una proteína distrofina. Con el propósito
de que la célula produzca la proteína multisubunidad, se infecta una
célula con el virus recombinante que contiene cada una de las
diferentes subunidades. Alternativamente, diferentes subunidades de
proteína pueden ser codificadas por el mismo transgén. En este caso,
un transgén único incluye al ADN que codifica a cada una de las
subunidades, con el ADN para cada subunidad separado por un sitio
interno de entrada de la ribozima (IRES). Esto es deseable cuando
el tamaño del ADN que codifica a cada una de las subunidades es
pequeño, esto es, el total del ADN que codifica a las subunidades y
al IRES es menor a 5 kilobases. Otros productos génicos útiles
incluyen a moléculas que inducen una respuesta inmune, polipéptidos
que no se presenta en forma natural, tales como polipéptidos
quiméricos o híbridos que tienen una secuencia de aminoácidos que no
se presenta en forma natural, que contienen inserciones, supresiones
o sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de
una sola cadena modificadas genéticamente podrían ser útiles en
ciertos pacientes inmunocomprometidos. Otros tipos de secuencias
génicas de ocurrencia no natural incluyen a las moléculas
antisentido y a los ácidos nucleicos catalíticos, tales como
ribozimas, que podrían ser utilizadas para reducir la sobrexpresión
de un gen. Sin embargo, el transgén seleccionado puede codificar a
cualquier producto deseable para ser suministrado a un huésped, o
deseable para estudio. La selección de la secuencia transgénica no
es una limitación de esta invención.
Adicional a los elementos principales
identificados antes para el vector, (por ejemplo, las secuencias de
adenovirus y el transgén), el vector también incluye elementos
convencionales de control necesarios para conducir la expresión del
transgén en una célula huésped contando con el transgén. De esta
forma, el vector contiene un promotor seleccionado que se enlaza al
transgén y se localiza, con el transgén, entre las secuencias
virales del vector. Los promotores adecuados pueden seleccionarse
fácilmente entre los promotores constitutivos y los inducibles. La
selección de estos y de otros elementos comunes del vector es
convencional y muchas de tales secuencias están disponibles [ver,
por ejemplo, Sambrook y colaboradores, y las referencias citadas
aquí].
Ejemplos de promotores constitutivos incluyen,
sin limitación, al promotor LTR del virus del sarcoma de Rous
retroviral (RSV), (opcionalmente con el potenciador RSV), al
promotor citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador
CMV) [ver, por ejemplo, Boshart y colaboradores, Cell,
41: 521-530 (1985)], al promotor SV40, al
promotor dihidrofolato reductasa, al promotor
\beta-actina, al promotor fosfoglicerol quinasa
(PGK), y al promotor EF1\alpha [Invitrogen]. Los promotores
inducibles están regulados por medio de compuestos suministrados en
forma exógena, que incluyen, al promotor metalotionina (MT) de oveja
inducible por zinc, al promotor del virus de tumor mamario de ratón
(MMTV) inducible por dexametasona (Dex), al sistema promotor T7
polimerasa [WO 98/10088]; el promotor del insecto ecdysone [No y
colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
93:3346-3351 (1996)], al sistema reprimible
con tetraciclina [Gossen y colaboradores, Proc. Natl. Acad Sci.
USA, 89:5547-5551 (1992)], al sistema
inducible con tetraciclina [Gossen y colaboradores, Science,
268:1766-1769 (1995), ver también Harvey y
colaboradores, Curr.Opin. Chem. Biol.,
2:512-518 (1998)], al sistema inducible por
RU486 [Wang y colaboradores, Nat. Biotech.,
15:239-243 (1997) y Wang y colaboradores,
Gene Ther., 4:432-441 (1997)] y al
sistema inducible por rapamicina [Magari y colaboradores, J.
Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)].
El vector que transporta a los Ad ITR que
flanquean al transgén y a las secuencias reguladoras (por ejemplo,
promotores, secuencias poliA, etc.) puede estar en cualquier forma
que transfiera estos componentes a la célula huésped.
Preferiblemente, para evitar una recombinación homóloga, el plásmido
no contiene ninguna secuencia de adenovirus en la región E1 o la
región 5' a la región E1. Puede contener secuencias no virales,
tales como aquellas que codifican a ciertos reporteros
seleccionables o genes marcadores, por ejemplo, secuencias que
codifican higromicina o purimicina, entre otros. Otros componentes
del plásmido pueden incluir un origen de replicación y un amplicón,
tal como el sistema amplicón, empleando al antígeno nuclear del
virus Epstein Barr, por ejemplo, los componentes del vector en pCEP4
(Invitrogen). Ver, también, J. Horvath y colaboradores,
Virology, 184:141-148 (1991). Este
sistema amplicón o componentes similares de amplicón permiten una
alta replicación episomal de copia en las células.
Otras secuencias de ácido nucleico heterólogo
presentes opcionalmente en este vector incluyen secuencias que
proveen señales requeridas para una poliadenilación eficiente del
transcripto de ARN, e intrones con un donador de empalme funcional
y sitios aceptores. Una secuencia común poli-A que
se emplea en los vectores útiles en esta invención es la que se
deriva del papovavirus SV-40. La secuencia de
poli-A generalmente se inserta después de las
secuencias del transgén y antes de la secuencia ITR 3'. Un vector
útil en la presente invención puede contener también un intrón,
deseablemente localizado entre la secuencia del promotor/potenciador
y el transgén. Una posible secuencia de intrón se deriva también de
SV-40, y es mencionada como la secuencia de intrón
SV-40 T. La selección de estos y de otros elementos
comunes del vector son convencionales y muchas de tales secuencias
se encuentran disponibles [ver, por ejemplo, Sambrook y
colaboradores, y las referencias citadas allí, por ejemplo en las
páginas 3.18-3.26 y
16.17-16.27].
Preferiblemente, el vector con E1 suprimido
contiene todas las secuencias adenovirales funcionales requeridas
para el empaquetamiento y la replicación en presencia de la línea
celular que complementa a E1 de la invención. Además, de las
funciones E1a y E1b suministradas por la línea celular de
transcomplementación, se requiere las regiones E2a y E4 ORF 6
adenovirales funcionales. Sin embargo, donde faltan las funciones
requeridas del vector con E1 suprimido (esto es, el vector con E1
suprimido que contiene además supresiones funcionales en E2a y /E4
ORF6), estas funciones pueden ser suministradas por otras fuentes.
En una modalidad, estas fuentes pueden ser suministradas por una
cotranfección de la línea celular que complementa a E1 con una o más
moléculas de ácido nucleico capaces de dirigir la expresión de la
función adenoviral requerida. Alternativamente, puede utilizarse una
línea celular modificada GH329 de la invención que ha sido
transformada para suministrar las funciones adenovirales
reque-
ridas.
ridas.
Por ejemplo, un vector suprimido de E1 y que
tiene una región E2 defectuosa, puede ser complementada en células
GH329 de la invención por medio de la transfección de las células
con una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido) que
expresa las funciones E2 requeridas (por ejemplo, E2a). Como otro
ejemplo, un vector que carece de las funciones E1 hasta E4 puede ser
complementado en células GH329 por medio de la transfección de las
células con una molécula de ácido nucleico que expresa a E2, E3 y E4
funcionales (por ejemplo, E4 ORF6). En donde una molécula de ácido
nucleico es cotransfectada dentro de las células de la invención,
tal molécula de ácido nucleico contiene secuencias E1 no
adenovirales; ni contiene ninguna secuencia 5' a la región E1. La
construcción de estas moléculas de ácido nucleico está dentro de las
capacidades de aquellos entrenados en la técnica.
Convenientemente, un vector recombinante
seleccionado, como se describió antes, se introduce dentro de
células que complementan a E1 a partir de una línea celular de la
invención, utilizando técnicas convencionales, tales como las
técnicas de transfección conocidas en el arte [ver, K. Kozarsky y
colaboradores Som. Cell and Molec. Genet.,
19(5):449-458 (1993)]. Después de eso, los
adenovirus recombinantes con E1 suprimido se aíslan y se purifican
después de la transfección. Los métodos de purificación son bien
conocidos por aquellos entrenados en la técnica, y pueden
seleccionarse fácilmente. Por ejemplo, los virus pueden ser
sometidos a purificación por placa y los lisados sometidos a
centrifugación en cloruro de cesio para obtener virus
purificado.
La línea celular transcomplementaria de E1 de la
invención (o una derivada de la misma) puede ser utilizada para
amplificar un adenovirus con E1 defectuoso. Convenientemente, el
adenovirus con E1 defectuoso habrá sido aislado y purificado de
residuos celulares y de otros materiales virales antes de ser usado
en este método. Esto es particularmente deseable donde el adenovirus
con E1 defectuoso para ser amplificado se produce por otros métodos
diferentes a aquellos de la presente invención. Los métodos
adecuados de purificación, por ejemplo, purificación por placa, son
bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica.
Un cultivo, o preferiblemente, una suspensión de
células de una línea celular de transcomplementación de E1 de la
invención, por ejemplo, GH329, se infecta con el adenovirus con E1
defectuoso, utilizando métodos convencionales. Una multiplicidad de
infección (MOI) adecuada puede ser fácilmente seleccionada. Sin
embargo, es deseable una MOI en el rango aproximadamente entre 0,1 y
100, aproximadamente entre 0,5 y 20, y/o aproximadamente entre 1 y
5. Las células se cultivan entonces bajo condiciones que permitan el
crecimiento de las células y la replicación del adenovirus con E1
defectuoso en presencia de E1 expresado por la línea celular de la
invención. Convenientemente, los virus son sometidos a pasadas
continuas hasta de 5, 10 ó 20 pasadas. Sin embargo, donde se desee,
los virus pueden ser sometidos a menos o a más pasadas.
Las células son sometidas entre dos y tres ciclos
de congelación-descongelación; el lisado resultante
es sometido entonces a centrifugación para recolección, y se
recolecta el sobrenadante. Se utilizan técnicas de purificación
convencionales tales como la centrifugación en gradiente de cloruro
o cromatografía en columna, para concentrar al
rAd-DE1 de las proteínas celulares en el lisado.
Convenientemente, sin embargo, el método de la invención a través
del uso de líneas celulares de la invención, evita los problemas de
RCA contaminante que plagan a las técnicas convencionales de
producción.
Los adenovirus con E1 suprimido producidos de
acuerdo con la presente invención, son adecuados para una variedad
de usos, y son particularmente convenientes para usos in
vivo, ya que la presente invención permite que estos adenovirus
sean producidos en medio libre de suero, y en ausencia de RCA
detectable. De este modo, los adenovirus con E1 suprimido producidos
de acuerdo con la invención están sustancialmente libres de
contaminación con RCA.
En una modalidad, los virus con E1 suprimido han
sido estimados como adecuados para aplicaciones en las cuales la
expresión transgénica transciente es terapéutica (por ejemplo, el
gen p53 se transferir en el cáncer y el gen VEGF se transfiere en
enfermedades del corazón). Sin embargo, los adenovirus con E1
suprimido no están limitados a los usos en donde la expresión
transgénica transciente es deseada. Los adenovirus con E1 suprimido
son útiles en una variedad de situaciones en las cuales el
suministro y la expresión de un transgén seleccionado es
deseada.
Las dosis adecuadas de adenovirus con E1
suprimido pueden ser determinadas fácilmente por alguien entrenado
en la técnica, dependiendo de la condición que está siendo tratada,
el estado de salud, la edad y el peso del paciente veterinario o
humano, y de otros factores relacionados. Sin embargo, generalmente,
una dosis adecuada puede estar en el rango de 10^{10} a
10^{18}, y preferiblemente aproximadamente entre 10^{14} y
10^{16} partículas virales por dosis, para un adulto humano que
tenga un peso aproximadamente de 80 kg. Esta dosis puede suspenderse
aproximadamente entre 0,01 mL a 1 mL de un portador
fisiológicamente compatible y suministrado por cualquier medio
adecuado. La dosis puede repetirse, como se necesite o se desee,
diariamente, semanalmente, mensualmente, o en otros intervalos
seleccionados.
Los siguientes ejemplos se suministran para
ilustrar la producción de ejemplos de líneas celulares de la
invención y sus usos en la producción de adenovirus con E1 suprimido
que están libres de RCA detectable después de 20 pasadas. Estos
ejemplos no limitan el alcance de la invención. Alguien entrenado en
la técnica apreciará que aunque los reactivos y las condiciones
específicas están reseñadas en los siguiente ejemplos, pueden
hacerse modificaciones que se encuentren dentro del alcance de la
invención.
Como se describe en este ejemplo, las células
Vero, A549 y HeLa fueron transfectadas en forma estable con
construcciones de plásmido que portaban un fragmento de ADN de 3,4
kb de genoma de Ad 5 con una extensión de 511 a 3924 bp (marcos de
lectura abierta de E1a y E1b, y parte del gen pIX). La Figura 1
provee una representación esquemática de las construcciones
relevantes. En estas construcciones, el promotor nativo E1a fue
reemplazado o bien con secuencias del gen temprano de
citomegalovirus (CMV) o el gen de la fosfoglicerato quinasa humana
(PGK). No existe un sobrelapamiento con la región 5' del vector E1
suprimido (0-360 bp) descrito más adelante y el
sobrelapamiento se reduce a la región 3' (el vector comienza en 3312
bp mientras que la secuencia del adenovirus en 293 se extiende hasta
4300 bp).
La región Ad5 E1 (m.u.1,42-10,9)
fue clonada dentro del vector pBluescript SK(-). El fragmento E1 de
3,4 kb fue subclonado adicionalmente dentro de un plásmido que
permitió la expresión de promotores derivados del gen de la
fosfoglicerato quinasa [PGK] [Adra y colaboradores, Gene,
60:65-74 (1987)] o del gen temprano inmediato
de citomegalovirus [CMV] [Thomsen y colaboradores, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 81:659-663 (1984)]. Ambos
contenían el gen de resistencia a la neomicina para selección de
G418.
Las células HeLa, A549 y Vero fueron obtenidas a
partir de ATCC y mantenidas como monocapas en medio esencial mínimo
de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal
bovino al 10%. Los plásmidos fueron transfectados por medio de
precipitación en fosfato de calcio sobre las semillas cultivadas en
placas de 100 mm, utilizando 10 \mug de ADN de plásmido por cada
placa. Veinticuatro horas después de la transfección; las células
fueron tripsinizadas y sembradas en medio que contenía G418 a
diferentes rangos de diluciones desde 1:5 hasta 1:40. Después de 2
semanas de selección, las colonias resistentes de G418 fueron
aisladas, expandidas y muestreadas para expresión de E1.
Solamente un clon estable formado a partir de
células transfectantes de A549, mientras que por encima de 70 clones
de células transfectantes de HeLa y 50 clones de células
transfectantes de Vero fueron aisladas (no se muestran los
datos).
Los clones estables resistentes de G418 fueron
primeros muestreados con un ensayo de formación de cometa azul en el
cual 1 x 10^{6} células en placas de 6 pozos fueron infectadas con
200 Unidades Formadoras LacZ (LFU) de H5 CBLacZ [expresión LacZ de
adenovirus con E1 suprimido del promotor
\beta-actina] [Gao y colaboradores, J.
Virol., 70:8934-8943 (1996)]. Seis días
después de la infección, las células fueron coloreadas
histoquímicamente con
5-Bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido
(X-gal) y contabilizadas las cometas de células
azules en cada pozo. Posteriormente, los clones fuertemente
positivos fueron sembrados en portaobjetos de las cámaras de vidrio
de 4 pozos durante 24 horas. El nivel de expresión de las proteínas
E1a y E1b en las células se evaluó por medio de coloración de
inmunofluorescencia, utilizando anticuerpos monoclonales de ratón
(Oncogene Science).
Los clones resistentes de G418 fueron expandidos
y muestreados inicialmente por su habilidad para soportar la
propagación de un vector de adenovirus con E1 suprimido que hospeda
al transgén LacZ; los únicos clones capaces de mantener la
replicación del adenovirus con E1 suprimido fueron los derivados de
HeLa.
Los ADN genómicos fueron aislados de cada clon
que complementa a E1, digeridos con endonucleasas de restricción
apropiadas para la liberación de un fragmento interno de plásmido
que contenía a E1, y evaluados por medio de hibridación con ADN
después de electroforesis. Más particularmente, los ADN fueron
fraccionados sobre geles de agarosa al 1%, transferidos a filtros de
nylon e hibridados con un fragmento de 1,1 kb de E1 Hind III/Sma
I.
Todas las líneas celulares ensayadas tienen al
menos una copia del gen E1 integrada dentro del genoma de HeLa. Un
clon PGK-E1 (GH364) y una línea celular
CMV-E1 (GH414) hospedan 5-10 copias
del gen E1.
Los precipitados de célula de cada clon fueron
recogidos en placas de 60 mm y resuspendidos en 200 \mul de búfer
de lisis (Tris-Cl 20 mM, pH 8,0, NaCl 140 mM,
NP-40 al 1% v/v, PMSF 1 mM, 1 \mug/ml de cada
inhibidor de tripsina de leupeptina, de antipaina, de chimostatina,
de soya). Los lisados fueron incubados sobre hielo durante una hora
y microcentrifugados a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4ºC. los
sobrenadantes fueron recogidos y las concentraciones de proteína
total se determinaron por medio del método de Lowry. Las muestras
(50 \mug) se fraccionaron sobre geles SDS-PAGE al
10% y se electrotransfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las
proteínas E1a y E1b fueron detectadas utilizando el sistema mejorado
de quimioluminiscencia (ECL) (Amersham Life Science, Arlington
Heights, IL) con un anticuerpo policlonal de ratón (PharmMingen, San
Diego, CA) y anticuerpos monoclonales de rata (Oncogene Science),
respectivamente. Las proteínas celulares totales de las células 293
fueron utilizadas como
controles.
controles.
El análisis de Western blot reveló los perfiles
variables de expresión de proteína E1 entre diferentes clones, en
términos de la expresión total y de las proporciones de proteínas
E1a y E1b. El anticuerpo anti-Ad5 identificó a la
proteína E1a como un doblete aproximadamente de
35-46 kDa.
HeLa, 293 y las células de las nuevas líneas
celulares E1 fueron infectadas con H5.CBLacZ con una multiplicidad
de infección (MOI) igual a 0,5. Las células infectadas fueron
recolectadas a las 24, 48, 72, 96 y 120 horas después de la
infección. Las células fueron lisadas en el medio de infección por
medio de 3 ciclos de congelamiento/descongelamiento y se determinó
el título del virus por medio de infecciones en dilución serial
sobre células 293 seguido por coloración histoquímica con
X-gal. Las células fueron coloreadas
histoquímicamente con X-gal después de 20 horas, y
se contaron las células azules. Los títulos se expresaron como
unidades de formación LacZ (LFU/ml) donde un LFU se define como la
cantidad de virus suficiente para causar una expresión LacZ
detectable en forma visible en una célula, 24 horas después de la
infección.
El rendimiento del virus H5 CBLacZ en cada línea
celular se muestra en la Figura 2A, donde el eje y es una escala
logarítmica y los valores de tiempo se muestran sobre el eje x. Dos
líneas celulares, GH329 y GH354, fueron equivalentes, sino mejores
que las células 293 en términos de producción (Figura 2A) del virus
con E1 suprimi-
do.
do.
Las nuevas líneas celulares E1 fueron comparadas
con las células 293 en su capacidad para soportar la formación de
placa del virus H5 CBLacZ. Las células fueron infectadas con H5
CBLacZ con un rango de diluciones seriales y cubiertas en la parte
superior con agar después de 20 horas. Las placas fueron detectadas
por medio de coloración con rojo neutro el día 10 después de la
infección. Las RPE fueron computadas como el porcentaje del título
del virus H5 CBLacZ comparado con aquel de las células 293. Las
células fueron infectadas con H5 CBLacZ en un rango de diluciones
seriales y cubiertas en la parte superior con agar después de 20
horas.
Las placas fueron detectadas por medio de
coloración con rojo neutro el día 10 después de la infección. Las
RPE fueron computadas como el porcentaje del título del virus H5
CBLacZ. Las barras sólidas son la media de la RPE de cada línea
celular de tres diferentes experimentos; las barras de error son las
desviaciones estándar. Dos líneas celulares, GH329 y GH354, fueron
equivalentes sino mejores que las células 293 en términos de la
eficiencia de formación de placa (Figura 2B) del virus con E1
suprimido.
La propensión a generar RCA fue estudiada pasando
en forma serial un virus LacZ con E1 suprimido (inicialmente aislado
sobre GH329) y ambas células GH329 y 293. Una porción de cada lisado
fue utilizada para infectar una línea celular que no expresa E1
(A549) para evaluar la RCA, que se presentó por sí misma como una
citopatología sobre el paso serial y fue confirmada por medio de
análisis de hibridación de ADN, como sigue. Sin embargo, ya que se
utilizaron ADN crudos de Hirt para el análisis de Southern blot,
sería difícil utilizar el ensayo para cuantificar la cantidad de
RCA en cada muestra.
El virus H5 CBLacZ fue purificado dos veces en
placa sobre células GH329 siguiendo el protocolo estándar (Gao y
colaboradores, J. Virol.,
70:8934-8943 1996)]. Se seleccionaron las
placas azules identificadas por medio de coloración histoquímica con
X-gal, expandida a una preparación grande, en
células GH329 y purificadas por medio de centrifugación en gradiente
de CsCl. El virus H5 CBLacZ purificado fue designado como paso cero
(P0) y utilizado para pasadas continuas sobre células 293 y GH329,
simultáneamente hasta para 20 pasadas. Los virus en preparación
grande que crecieron en cada línea celular fueron purificadas en
gradiente de CsCl a partir de 5, 10, 15, y 20 pasadas. Las células
A549 fueron obtenidas a partir de ATCC y cultivadas en medio
F-12K suplementado con FBS al 10%. Para el ensayo de
RCA, las células fueron cultivadas con una densidad de 1 x 10^{7}
células por placa de 150 mm, 24 horas antes de la infección por el
virus. Se diluyeron un total de 1 x 10^{8} PFU de cada uno de los
virus de prueba en 80 ml de medio F-12K con suero
fetal bovino (FBS) al 2% y penicilina/estreptomicina (P/S) al 1% y
se añadieron a cuatro placas de 150 mm de células A549 después de la
remoción del medio de cultivo de cada placa. 24 horas después de la
infección, se añadieron 1,6 ml de FBS dentro de cada placa. Como
control positivo se colocó 1 PFU del virus tipo silvestre Ad5 dentro
de cada uno de los artículos para ensayo de 1 x 10^{8} PFU para el
procedimiento de infección descrito anteriormente. Las placas de
control negativo también fueron analizadas en paralelo. Las células
infectadas de cada placa fueron recogidas 14 días después y lisadas
en medio de infección por medio de tres ciclos de congelación
-descongelación-. Veinte por ciento del lisado total de células de
cada placa fue utilizado para infectar una placa de células A549
siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Siete días después de
la infección, las placas fueron examinadas bajo un microscopio de
luz por los efectos citopáticos. El ensayo RCA utilizado en este
estudio puede detectar 1 PFU de RCA en 10^{8} PFU de virus
recombinantes. Las células infectadas de cada placa fueron
recolectadas con el medio y centrifugadas para recolección del
precipitado de células. Cada precipitado celular fue resuspendido en
0,5 ml de Tris-Cl 10 mM, pH 8,0 y lisado por medio
de tres ciclos de congelación- descongelación. Después de
centrifugación en una Sorvall-26 a 3200 rpm durante
15 minutos, se recolecto el sobrenadante de cada muestra. Un tercio
de cada sobrenadante se mezcló con un volumen igual 2x solución de
pronasa (2 mg/ml de pronasa, Tris-Cl 100 mM, pH
7,6, EDTA 2 mM, SDS al 1%, se incubó la solución a 37ºC durante 45
minutos), se incubó a 37ºC durante 4 horas, se extrajo con
fenol-cloroformo y se precipitó en etanol. Las
muestras crudas de ADN viral se resuspendieron en un volumen igual
de búfer TE y se sometieron a digestión con Nsi Iendonucleasa y se
analizó por Southern blot. Los manchones fueron hibridados con una
sonda de ADN E1-Xba I/Cla I de 420 bp.
Los resultados mostraron que emergió RCA
significativo entre las pasadas 5 y 10 sobre células 293 mientras
que no se detectó RCA después de 20 pasadas sobre GH329. La
sensibilidad del ensayo RCA fue confirmada colocando células GH329
de paso cero en presencia del vector con 1pfu de Ad tipo
silvestre.
Mientras que la invención ha sido descrita con
referencia a una modalidad particularmente preferida, se apreciará
que pueden hacerse modificaciones dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
Claims (16)
1. Una línea celular de complementación de E1
útil para la producción de adenovirus recombinante deficiente en E1
en ausencia de adenovirus detectable competente para replicación,
dicha líneas celular que complementa a E1 comprendiendo una línea
celular aneuploide transformada en forma estable con una molécula de
ácido nucleico que comprende secuencias de ácido nucleico que
codifican al marco de lectura abierta (ORF) de E1a del adenovirus y
E1b del adenovirus bajo el control de un promotor fosfoglicerato
quinasa (PGK), en donde las secuencias de ácido nucleico comprenden
además una supresión de todas las secuencias de adenovirus 5' de las
secuencias que codifican al ORF de E1a de adenovirus, y en donde la
línea celular aneuploide es una línea celular HeLa.
2. Una línea celular de complementación de E1 de
acuerdo con la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido
nucleico es un vector plásmido.
3. Una línea celular de complementación de E1 de
acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la
molécula de ácido nucleico comprende copias múltiples de las
secuencias que codifican al E1a del adenovirus y al E1b del
adenovirus.
4. Una línea celular de complementación de E1 de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la
línea celular de complementación de E1 comprende múltiples copias de
dicha molécula de ácido nucleico.
5. Una línea celular de complementación de E1 de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las
secuencias que codifican al E1a del adenovirus y las secuencias que
codifican a E1b se seleccionan independientemente del adenovirus
tipo 5.
6. Un adenovirus de la línea celular de
complementación de E1 designada como GH329, depositada con el ATCC
bajo el número de acceso PTA-803.
7. Un método para el empaquetamiento de las
partículas adenovirales deficientes en E1 en ausencia de adenovirus
competente para replicación, dicho método comprendiendo las etapas
de:
- (a)
- proveer células de una línea celular de complementación de E1 que comprende una célula aneuploide transformada en forma estable con una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un marco de lectura abierta (ORF) de E1a del adenovirus y E1b del adenovirus bajo el control de un promotor fosfoglicerato quinasa (PGK), en donde las secuencias de ácido nucleico comprenden además una supresión de todas las secuencias 5' de adenovirus de las secuencias que codifican al ORF de E1a del adenovirus, y en donde dicha línea celular aneuploide es una línea celular HeLa;
- (b)
- transfectar dichas células con un vector recombinante que comprende, desde 5' hasta 3', secuencias de adenovirus de repetición terminal invertida (ITR) 5', secuencias de ácido nucleico que codifican pIX de adenovirus bajo el control de secuencias que dirigen la expresión de pIX de adenovirus en dichas células, un defecto en la región E1 del adenovirus, y en los ITR 3' de adenovirus; y
- (c)
- cultivar dichas células transfectadas bajo condiciones que permitan el empaquetamiento del vector con E1 defectuoso dentro de una partícula adenoviral recombinante con E1 defectuoso.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7,
en donde dicho vector recombinante comprende además un transgén
seleccionado.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8,
en donde dicho transgén se localiza entre los ITR 5' y 3'.
10. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, comprendiendo además la etapa de
transfección de dichas células con un segundo vector recombinante
que comprende secuencias de adenovirus que codifican al menos un gen
adenoviral y un defecto en la región E1 del adenovirus.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación
10, en donde dicho segundo vector recombinante codifica adenovirus
E2a.
- (ii)
- transfectando dichas células con un vector recombinante que comprende secuencias de adenovirus de repetición terminal invertida 5' y 3', secuencias de ácido nucleico que codifican pIX de adenovirus bajo el control de secuencias que dirigen la expresión de pIX de adenovirus en dichas células, y un defecto en la región E1 del adenovirus;
- (iii)
- cultivando dichas células transfectadas bajo condiciones que permitan el empacamiento del vector con E1 defectuoso dentro de una partícula adenoviral recombinante con E1 defectuoso; y
- (iv)
- purificando la partícula adenoviral recombinante con E1 defectuoso a partir de residuos celulares.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10
o la reivindicación 11, en donde dicho segundo vector recombinante
codifica adenovirus E4 o E4 ORF6.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación
12, en donde el segundo vector recombinante codifica E4 ORF6.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación 7,
en donde la línea celular que complementa a E1 es GH329, ATCC
PTA803.
15. Un método de amplificación de partículas
adenovirales con E1 defectuoso en ausencia de adenovirus competente
para replicación, el método comprendiendo las etapas de:
- (a)
- infectar una línea celular que complementa a E1 con adenovirus con E1 defectuoso que comprenden secuencias de adenovirus con repetición terminal invertida (ITR) 5' y 3', secuencias de ácido nucleico que codifican pIX de adenovirus bajo el control de secuencias que dirigen la expresión de pIX de adenovirus en dicha línea celular, y un defecto en las regiones del E1 del adenovirus en donde dicha línea celular comprende una línea celular aneuploide transformada en forma estable con una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un marco de lectura abierta (ORF) de E1a del adenovirus y E1b del adenovirus bajo el control de un promotor fosfoglicerato quinasa (PGK), en donde las secuencias de ácido nucleico comprenden además una supresión de todas las secuencias 5'de adenovirus de las secuencias que codifican al ORF de E1a del adenovirus, y en donde dicha línea celular aneuploide es una línea celular HeLa;
- (b)
- pasar las partículas adenovirales con E1 defectuoso sobre la línea celular de complementación de E1 para 2 a 20 pasadas, y
- (c)
- recolectar las partículas adenovirales con E1 defectuoso.
16. Un método de acuerdo con la reivindicación
15, en donde los adenovirus con E1 defectuoso de (a) se preparan por
medio de las etapas que comprenden:
- (i)
- proveer células de una línea celular de complementación de E1 que comprenden una línea celular aneuploide transformada en forma estable con una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un marco de lectura abierta (ORF) de E1a del adenovirus y E1b del adenovirus bajo el control de un promotor fosfoglicerato quinasa (PGK),
donde las secuencias de ácido
nucleico comprenden además una supresión, de todas las secuencias 5'
de adenovirus de las secuencias que codifican al ORF de E1a del
adenovirus y en donde dicha líneas celular aneuploide es una línea
celular
HeLa.
- ii)
- transfectar dichas células con un vector recombinante que comprende secuencias repetidas terminales invertidas de adenovirus 5' y 3' /OTRs), secuencias de ácidos nucleicos que codifican adenovirus pIX bajo el control de secuencias que dirigen la expresión del adenovirus pIX en dichas células, y un defecto en la región E1 del adenovirus;
- iii)
- cultivar dichas células transfectadas bajo condiciones que permitan el empaquetamiento del vector E1 defectuosos en una partícula adenoviral E1 defectuosa; y
- iv)
- purifical la partícula adenoviral E1 defectuosa de residuos celulares.
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