JP2000509614A - アデノウイルスｅ１−相補性細胞系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明では、Ｅ１欠失アデノウイルスの相補、増幅及び調節された転写減衰を行うための新規シリーズのヘルパー細胞系が開示される。これらの細胞系は、複製適応アデノウイルス（ＲＣＡ）の産生を生じることなく、アデノウイルスＥ１遺伝質欠失を相補できるので、従ってヒト遺伝子療法臨床試験に使用するためのアデノウイルス株を大規模生産するためにより安全に作製できるので有益である。好ましい実施態様は、アデノウイルスベクターと重複する配列を持たないＥ１欠失アデノウイルスベクターを相補するために十分なＡｄ５ Ｅ１ ＤＮＡ配列だけを含有するＡ５４９Ｅ１細胞系である。もう１つの態様では、本発明はＥ１を産生することに加えて、アデノウイルスベクターをさらに操作するために必要とされるタンパク質を産生する第二世代Ａ５４９−Ｅ１相補的細胞系を産生するための方法を具体化する。好ましい実施態様は、ミニアデノウイルスのパッケージングを強化するためにＥ１欠失ヘルパーウイルスのパッケージング転写減衰のために十分なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有するＡ５４９Ｅ１細胞系である。

Description

【発明の詳細な説明】 アデノウイルスＥ１−相補性細胞系 発明の分野 本発明は、Ｅ１欠失アデノウイルスを増殖させるために使用する、新規の細胞 及び方法に関する。 相互参照 本出願は、１９９６年５月３１日に提出された出願番号第０８／６５８，９６ １号の一部継続出願である。 発明の背景 遺伝子療法アプリケーションに使用されるアデノウイルスベクターの大多数は 、アデノウイルス５型（Ａｄ５）ゲノムのＥ１領域に欠失を有するようにデザイ ンされた。領域IXを含有しないＥ１領域は、Ａｄ５の左方末端の９％（１．２〜 ９．８マップ単位）から構成され、各々が数種のタンパク質をコードするＥ１Ａ 及びＥ１Ｂという２つの領域に小分割されている。ウイルス複製及び他の全ての Ａｄ５タンパク質類の発現には、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂの発現が必要とされる（Ｅ２− Ｅ４、後期タンパタ質（E2-E4,Late Proteins）；Ginsberg，H.S．The Adenovir uses ．Plenum Press，New York．p.46-67(1984)）。このため、Ｅ１の欠失は、 理論上では全てのＡｄ５タン パク質の発現に対して休止状態であって興味の対象である外来遺伝子（トランス ジーン）しか発現しない複製不全ウイルスを作り出す。Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂの欠失 はさらに又、これらの２種のタンパク質が結合して哺乳類細胞の腫瘍原性トラン スフォーメーションに結び付けられてきたので、安全性の理由から極めて重要で ある（Graham ら、In Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．39，p.637-650( 1974)；Van Der Ebら、Gene 2，p.115-132(1977)；McKinnonら、Gene 19，p.33- 42(1982)）。現在までにヒトを対象とする臨床試験で使用されたクラスＩの全て のアデノウイルスベクターはＥ１が欠失している。 Ｅ１欠失アデノウイルスベクターは、２９３と呼ばれるＡｄ５ヘルパー細胞系 で増殖させられる（Graham，F．L．and Smiley，J，J．Gen．Virol．36，p.５4- 72(1977)）。２９３細胞は、Ａｄ５ ＤＮＡから切り取ったフラグメントを用い てヒト胚腎細胞をトランスフォームさせることによって誘導される。ゲノム解析 によって、２９３細胞は、（全Ｅ１領域を含む）ウイルスゲノムの左方末端１２ ％の、細胞１個あたり４〜５個のコピーと、Ｅ４領域である右方末端９％の、細 胞１個あたり約１個のコピーとを含有していることが判明した（Aiello，L．ら 、Virology 94，p.460-469(1979)）。２９３細胞は高力価でＥ１欠失アデノウイ ルスを産生させることにおいては極めて効率的であるが、２９３ゲノム内にはＥ １以外に統合されているＡｄ５の配列が存在するために、Ｅ １欠失アデノウイルスベクター内の配列との組換えが発生してＥ１を含有する複 製適応アデノウイルス（ＲＣＡ）の産生を惹起する可能性があるという欠点を有 している。どの程度早期の継代で、Ｅ１欠失アデノウイルスの増幅及び増殖中に 異常な組換えが起こるか、そしてどの継代がアデノウイルス株を大規模生産する ために使用されるのかに依存して、２９３細胞におけるＲＣＡ産生はヒトを対象 とする遺伝子療法の臨床試験の安全性に対して重篤な結果を提示することがある （Lochmuller，H．ら、Human Gene Therapy 5，p.1485-1491(1994)）。ＲＣＡの 産生に加えて、２９３細胞における組換えはさらに又、外来遺伝子発現に影響を 及ぼす欠失及び転位を誘発し、それによって機能的アデノウイルス粒子の力価が 低下することがある。近年、Ｅ１領域を含む確定されたＡｄ５ ＤＮＡフラグメ ントを使用して細胞系が開発されてきた。しかし、これらの細胞系はＥ１欠失ア デノウイルスベクターにおける相同的配列との有意な配列重複を含有しているの で、従って望ましくない相同組換え及びＲＣＡ産生の可能性がある（Fallauxら 、Human Gene Therapy 7，p.215-222(1996)；Imlerら、Gene Therapy 3，p.75-8 4(1996)）。 本発明では、ＲＣＡの不在下でＥ１欠失アデノウイルスベクターを相補するた めの最小Ｅ１遺伝子領域だけを含有する一連の細胞系が作り出された。発明の概要 本発明は、Ｅ１欠失アデノウイルスの相補、増幅、及び調節された転写減衰（ アテニュエーション）を行うための一連のヘルパー細胞系を含む。これらの細胞 系は、複製適応アデノウイルス（ＲＣＡ）を産生することなくアデノウイルスＥ １遺伝子欠失を相補できるので有益である。ある好ましい実施態様は、アデノウ イルスベクターと重複する配列をもたないＥ１欠失アデノウイルスベクターを相 補するために十分なＡｄ５ Ｅ１ ＤＮＡ配列だけを含有するＡ５４９Ｅ１細胞 系である。ある好ましい実施態様では、Ｅ１ ＤＮＡ配列はＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺 伝子を含む。 もう１つの態様では、本発明は、Ｅ１欠失ヘルパーウイルスのパッケージング を転写減衰させるために十分なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を備えたＡ ５４９Ｅ１細胞系をトランスフェクトすることによって、ＲＣＡを産生すること なくミニアデノウイルスを選択的に増殖させるための方法である。ある好ましい 実施態様では、ポリペプチドはＣｒｅリコンビナーゼを含む。もう１つの好まし い実施態様では、ポリペプチドはＴｅｔＲ−ＫＲＡＢを含む。 図面の簡単な説明 図１は、典型的なＥ１欠失Ａｄヘルパーウイルス（一番上）、２９３細胞（引 用文献５）、及び９１１細胞 （引用文献８）とＡ５４９Ｅ１−６８細胞（本発明）とを含むその他のＥ１含有 細胞系におけるアデノウイルス配列の構造を示し；さらに相同的アデノウイルス 配列間の組換えがどのように発生して複製適応アデノウイルス（ＲＣＡ）を産生 するのかを示した図である。 図２は、ＣＭＶ−Ｅ１哺乳類発現ベクターの図である。 図３は、Ｇ４１８^r Ａ５４９Ｅ１クローンのサザンブロット分析である。 図４Ａは、Ａ５４９細胞、２９３細胞、及びＡ５４９Ｅ１−６８におけるＥ１ Ａタンパク質発現についてのウエスタンブロット分析である。 図４Ｂは、Ａ５４９細胞、２９３細胞、及びＡ５４９Ｅ１−６８から誘導され た４個の単一個細胞クローンにおけるＥ１Ｂタンパク質の代謝性³⁵Ｓ標識及び免 疫沈降反応である。 図５は、Ｅ１欠失アデノウイルスベクターであるＡｄ５−ＣＡ−ＧＦＰを示す 図である。 図６は、ＲＣＡを検出するためのＥ１Ａ特異的プライマーを使用した４０回の ＰＣＲ反応のアガロースゲル分析である。 図７は、ｌｏｘＰ修飾パッケージングシグナルを用いてヘルパーウイルスを転 写減衰させるためのシステムの図である。 図８は、ｐＣＭＶ−Ｃｒｅ−Ｐｕｒｏベクターの図である。図９は、ｐＢＳ／ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ／ＭＣＬｐＡベクターの図である。 図１０は、ｐＴｅｔＯ７−ＣＭＶ−Ｌ試験ベクターを用いた一過性トランスフ ェクション後の、コントロール細胞（Ａ５４９Ｅ１−６８）とＴｅｔＲ−ＫＲＡ Ｂタンパク質を発現する細胞系との両細胞におけるルシフェラーゼ発現を示す棒 グラフである。 発明の詳細な説明 本発明は、望ましくない組換え及びＲＣＡの短所を伴わずにＥ１欠失アデノウ イルスを相補できる細胞系を提供する。これらの細胞系はＡ５４９細胞系におい てＥ１相補のために必要とされる配列だけをクローニングして発現させ、さらに ベクターに対して相同性を有してＲＣＡを産生する組換えを惹起する可能性のあ るその他全てのＡｄ５配列をその細胞系から排除することによって得られる。 現在は、２９３細胞を用いて、Ｅ１欠失アデノウイルスを増殖している。しか し、２９３細胞はＡｄ５ゲノムの２１％までを構成するＤＮＡフラグメントを含 んでいる。このため２９３細胞はアデノウイルスベクター内の配列と重複する有 意な配列相同性（Ｅ１領域の外側）を有しており、これは野生型アデノウイルス 粒子を産生する相同組換えイベントを引き起こす可能性がある。図１は、他のＥ １含有細胞系（Ａ５４９Ｅ１細胞を含む）に 比較した２９３細胞におけるアデノウイルス配列の構造と、相同アデノウイルス 配列間で組換えがどのように発生して複製適応アデノウイルス（ＲＣＡ）を産生 するのかを示している。従来型アデノウイルスベクターにおける３’からＥ１領 域までのＡｄ配列と２９３細胞ならびに９１１細胞のヘルパー細胞ゲノム内に統 合された配列との間には有意な相同性（１，０００塩基対以上）が存在する。こ れらの相同領域に渡る相互的組換えは、野生型のＥ１（＋）、すなわち複製適応 アデノウイルス（ＲＣＡ）の産生を生じさせることがある。 本発明は、Ａｄ５から哺乳類発現ベクター内へのＥ１Ａ及びＥ１Ｂをコードす るＤＮＡフラグメントのクローニングを実施する。このＥ１ベクターは安定的に ヒトＡ５４９細胞にトランスフェクトされ、Ｅ１発現細胞系を産生した。代表的 細胞系であるＡ５４９Ｅ１−６８のゲノムは、Ｅ１欠失Ａｄヘルパーウイルス中 に存在する配列との配列重複を含有していないので、ＲＣＡを産生する組換えは あり得ない（図１）。このＡ５４９Ｅ１細胞系のキャラクタリゼーション（特性 付け）では、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂタンパク質の産生、アデノウイルスベクターによ る高い感染性、高力価のウイルス株を産生するためのＥ１欠失アデノウイルスの 相補、並びに複製適応アデノウイルス（ＲＣＡ）の産生がないことが証明された 。 本発明のもう１つの実施態様には、Ｅ１を産生することに加えて、さらにアデ ノウイルスベクターの別の操作 に必要とされるタンパク質も産生し、従って新規のウイルスを産生するためのツ ールとしてＲＣＡを含まないアデノウイルスヘルパー細胞系の新規シリーズを提 供する第二世代のＡ５４９−Ｅ１相補性細胞系の生成について記載されている。 第１の実施例は、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するＡ５４９Ｅ１細胞系である。 本発明は、Ｅ１欠失ヘルパーウイルスのパッケージングシグナルがｌｏｘＰ部位 に隣接され、Ｃｒｅを発現するＡ５４９Ｅ１細胞系内でこのヘルパーウイルスが 増殖すると、パッケージングシグナルが切り出しによって欠失し、従ってヘルパ ーウイルスのパッケージングを転写減衰させ、ミニアデノウイルス（全てのウイ ルスタンパク質のコード配列が欠けているＡｄ５ウイルス）のパッケージングを 強化する、新規なＥ１欠失ヘルパーウイルスを提供する。ヘルパー依存性ミニア デノウイルスの生成中には、ミニウイルスを強化するためにヘルパーウイルスパ ッケージングを転写減衰させることが必要になるので、このことは有益である。 この目的で、２９３−Ｃｒｅ細胞は生成されてきたのだが（Prks，R.ら、P.N.A. S．93，p.13565-13570(1996)）、しかしＡ５４９Ｅ１−Ｃｒｅ細胞は、それらが ＲＣＡを含まない環境においてこの作業を遂行するであろうという長所を持って いる。 本発明のさらにもう１つの実施態様は、Ｅ１欠失ヘルパーウイルスのパッケー ジングシグナルが複数のテトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）部位を含む ように 修飾されているＥ１欠失ヘルパーウイルスを増幅させ、パッケージング効率を調 節するために使用されるであろう、ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ融合タンパク質を発現す るＡ５４９−Ｅ１相補性細胞系を含む。ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢを発現しているＡ５ ４９−Ｅ１細胞系においてこのヘルパーウイルスが増殖すると、リプレッサーは ｔｅｔＯ配列に結合し、特異的にヘルパーウイルスパッケージングを転写減衰さ せ、従って正常な野生型パッケージングシグナルを有するミニアデノウイルスの パッケージングを強化する。ヘルパーウイルスのパッケージングは、ｔｅｔ−Ｋ ＲＡＢリプレッサーと結合してｔｅｔＯ／パッケージングシグナルからの解離と 、パッケージング抑制の逆転とを引き起こすテトラサイクリンの存在下で、細胞 およびウイルスを増殖させることによって回復させることができる。これらのＥ １相補性ヘルパー細胞系の誘導、キャラクタリゼーション、及びアプリケーショ ンを含む詳細な実施例を下記で説明する。 実施例１ Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂベクターの構成 相補のために必要とされるＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ配列だけを含有する発現ベクターを 生成するために、Ａｄ５ Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子をコードする３．１ｋｂ Ｄ ＮＡフラグメントをスーパーリンカーベクターｐＳＬ３０１（Invitrogen社）内 に２ピースで連続的にクローンニン グした。まず最初に、８８１ｂｐのＡｆｌIIIからＸｂａＩのフラグメント（Ａ ｄ５塩基対４６２−１３４３）をｐＢＲＸａｄ５ＫｐｎＩＣｌ（ｐＪＭ１７のサ ブクローン）からｐＳＬ３０１（ＡｆｌIII／ＸｂａＩ）内にクローニングした 。第２に、近接２１９４ｂｐのＸｂａＩからＡｆｌII（Ａｄ塩基対１３４３−３ ５３７）をｐＢＲＸａｄ５ＸｈｏＩＣｌから同一ベクター内にクローニングした 。生じた３０７５ｂｐのＥ１フラグメント（ｐＳＬ３０１中の）は、Ｅ１Ａに対 するＴＡＴＡボックス及びＲＮＡキャップ部位と、Ｅ１Ａコード配列と、完全な Ｅ１Ｂプロモーターと、及び、Ｅ１Ｂ ｐ５５タンパク質に対する停止コドンは 含むが領域IXを含まないＥ１Ｂコーディング配列とを含んでいる。３０７５のｂ ｐのＡｆｌIII−ＡｆｌII Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂフラグメント（Ａｄ５塩基対４６２ −３５３７）を単離し、クレノウ酵素を用いて末端を平滑化し、平滑末端をＣＭ Ｖプロモーター／エンハンサーの制御下で哺乳類発現ベクターであるｐＣＤＮＡ ３（Invitrogen社）のＥｃｏＲＶ部位に連結させた。このプロセスはＡｄ５−Ｅ １発現ベクターであるｐＣＭＶ−Ｅ１を産生した（図２）。 実施例２ Ｅ１細胞系の生成及びキャラクタリゼーション このＣＭＶ−Ｅ１発現プラスミド（図２）は、リポフェクタミン（GIbco/BRL 社）を使用してＡ５４９ヒト肺 癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １８５）にトランスフェクトし、Ｇ４１８^Rコロニ ーを単離した。単一個細胞クローンを機能的なＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ発現についてスク リーニングした。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現カセットを含有するＥ１欠 失アデノウイルス、Ａｄ５ ＣＡ−ＧＦＰを使用して、Ａ５４９−Ｅ１クローン に感染させた。感染の３日後、細胞変性効果（ＣＰＥ）についての視覚的検査に よってクローンをＥ１相補性Ａｄ５ ＣＡ−ＧＦＰアデノウイルスの産生につい てスクリーニングした。１個のクローンＡ５４９Ｅ１−６８が２３９細胞につい て観察されたものと同様、３日間で１００％のＣＰＥを示した。プラークの中心 にある透明な領域がＥ１相補性ウイルス増幅により惹起されたＣＰＥの証拠であ る。このクローンはさらに、実質的に細胞の１００％が感染２４時間後に緑色蛍 光を発し、高い感染性を示した。この細胞系において誘発された高い感染率とＣ ＰＥの迅速な生成とはＥ１欠失Ａｄ５−ＣＡ−ＧＦＰウイルスの複製及び増幅を 促進することのできる機能的なＥ１Ａ／Ｅ１Ｂタンパク質を産生しつつあること の強力な証拠である。Ａ４５９Ｅ１細胞は、ＡＴＣＣ名称ＣＲＬ−１２４５８と して１９９８年１月１５日にブダペスト条約の下でアメリカン タイプ ティッ シュー コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された（１９９８年１月２０日に生存 性が確証された）。 図３は、Ｅ１配列特異的ＤＮＡプローブを使用したサ ザンブロットを示している。このアッセイは、Ａ５４９Ｅ１−６８（レーン４） におけるＣＭＶ−Ｅ１外来遺伝子と、Ａ５４９Ｅ１−６８のサブクローン（Ｅ１ −６８．３）の存在とを証明したが、親のＡ５４９細胞系（レーン２）には存在 していないことを証明している。また、Ｅ１特異的プローブとハイブリダイズし ている配列が２９３細胞に予想通り観察されたが、これはそれらがＥ１欠失アデ ノウイルスを相補するものであるからである（レーン３）。Ｅ１トランスフェク ト細胞の形態は親のＡ５４９細胞系とは有意に相違していた。サブコンフルエン トな細胞密度でのＡ５４９細胞は伸長した線維芽細胞様の形態を有する明確な単 一個の細胞として増殖するが、他方、Ｅ１細胞系Ａ５４９Ｅ１−６８はより立方 体様的な形態を持つ細胞のコロニーとして増殖する。プラークアッセイによって 、Ａ５４９Ｅ１−６８をＥ１欠失アデノウイルス（Ａｄ５ ＣＡ−ＧＦＰ）の産 生について２９３細胞と比較し、Ａ５４９Ｅ１−６８が相補されたウイルスと等 価の力価で産生することを見出した（Ａ５４９Ｅ１−６８の７×１０⁹ｐｆｕに 対して２９３の９×１０⁹ｐｆｕ）。 図４Ａは、Ｅ１Ａ特異的抗体（Ｍ７３、Oncogene Science社）を使用したウェ スタンブロット分析を示している。この抗体は、Ａ５４９Ｅ１−６８細胞系にお いて４６ｋｄ及び４２ｋｄの見掛け分子量を有する２つのＥ１Ａ特異的バンドを 検出し、これらはＥ１Ａ １３Ｓ及び １２Ｓ ｍＲＮＡ（Ginsberg、1984）から予想される産物に対応し、２９３細胞 （レーン２）において観察されたものとサイズが同一であった。これらのＥ１Ａ 特異的バンドは親のＡ５４９細胞においては検出されなかった（レーン１）。図 ４Ｂは、Ｅ１Ｂ ｐ５５に対して特異的なモノクローナル抗体による、代謝的に 放射標識されたタンパク質の免疫沈降反応を示している。Ａ５４９Ｅ１−６８は 、親のＡ５４９細胞において検出されなかった約５５ｋｄ（レーン３）の免疫反 応性バンドを産生した。この５５ｋｄのＥ１Ｂ特異的バンド、並びに第二バック グラウンドバンドは２９３細胞でも観察された（レーン２）。実験とコントロー ルとの両方のレーンで見いだされた余分な「バックグラウンド」バンドは他の研 究者らによっても観察されており、その原因はサイクリン、ｐ５３、及びＲｂを 含む様々なタンパク質の共免疫沈降反応に帰することができる。Ａ５４９Ｅ１− ６８は、高力価のＥ１欠失組換えアデノウイルスの産生を相補できるので、この 細胞系がＥ１Ａ及びＥ１Ｂを発現するだけではなく、それらが機能的であること は明白である。 実施例３ Ａ５４９Ｅ１細胞内で産生される Ｅ１欠失アデノウイルスはＲＣＡがない この新規Ａｄ５ヘルパー細胞系がＲＣＡを産生するこ となく相補できることを証明するために、Ａ５４９Ｅ１細胞におけるＥ１欠失Ａ ｄ５−ＣＡ−ＧＦＰアデノウイルスベクターの増幅後に一連のＰＣＲ ＲＣＡア ッセイを実施した。Ａｄ５−ＣＡ−ＧＦＰベクターは図５に図解されている。こ のベクターはＣＭＶエンハンサー及びβ−アクチンプロモーターから構成される 転写調節エレメントを含んでおり、Ｅ１配列の欠失は塩基対３５５０のＡｄ５ ＤＮＡの欠如を含んでいる。Ａ５４９Ｅ１細胞に含まれるＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ相補領 域は塩基対３５３７までしか伸長しないので、ＲＣＡ産生を許容する重複してい る配列相同性がない。もっと小さな欠失を有するＥ１欠失ベクターはまだ幾らか のＥ１ ＤＮＡを含有している可能性があり、それらは低頻度でＲＣＡの発生を 許容する場合があるので、回避すべきである。 ＰＣＲ ＲＣＡアッセイを実施するために、Ａｄ５−ＣＡ−ＧＦＰウイルスを Ａ５４９Ｅ１−６８細胞上で２０継代まで連続的に増殖させた。連続的な増殖及 びウイルス増幅に続いて、凍結−解凍（freeze-thaw）溶解法によってＡｄ５− ＣＡ−ＧＦＰウイルスＤＮＡを単離し、Ｅ１Ａ領域若しくはＥ２Ｂ領域のどちら かに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを実施した。８８０ｂｐＥ２Ｂ産物の増 幅はＰＣＲ陽性コントロールとして役立ち、１０８６ｂｐ Ｅ１Ａ−特異的産物 の存在はＥ１（＋）複製適応アデノウイルス（ＲＣＡ）がＥ１（−）Ａｄ５−Ｃ Ａ−ＧＦＰの増幅中に産生したという証拠となる。Ａ ５４９Ｅ１細胞における増幅から入手した２０μｇのＡｄ５−ＣＡ−ＧＦＰウイ ルスＤＮＡ（１×１０¹⁰ウイルス粒子に等価）を４０回のＰＣＲ反応に分割し、 Ｅ１Ａプライマーを用いてＲＣＡについて試験した（図６）。図６の一番上と下 のパネルでは、レーン１は１ｋｂのＤＮＡマーカー、レーン２は野生型Ａｄ５ウ イルスＤＮＡを含んでおり、レーン３はＥ１Ａ及びＥ２Ｂ特異的プライマー（陽 性コントロール）を用いてＡ５４９Ｅ１−６８細胞上での２０回以上の継代から 単離されたＡｄ５−ＣＡ−ＧＦＰウイルスＤＮＡ（Ｅ１−）のＰＣＲから構成さ れ、そしてレーン４−２０はＥ１Ａ特異的プライマーだけを用いてＡ５４９Ｅ１ −６８細胞上での２０回以上の継代から単離されたＡｄ５−ＣＡ−ＧＦＰウイル スＤＮＡ（Ｅ１−）のＰＣＲから構成されている。どの反応においても１０８６ ｂｐのＥ１特異的ＰＣＲフラグメントが検出されなかったという事実は、ウイル ス標本中にＲＣＡが存在しなかったことを示している。 Ａ５４９Ｅ１−６８細胞上でＥ１欠失アデノウイルス（Ａｄ５−ＣＡ−ＧＦＰ ）を増幅させ、Ｅ１を含むＲＣＡの産生について正常のＡ５４９細胞（Ｅ１をつ くらない）上で継代培養により増幅させたウイルスを試験することによって、Ｃ ＰＥに基づく第２のＲＣＡアッセイを実施した。正常Ａ５４９細胞の単層上のプ ラーク形成（ＣＰＥ）はＥ１ヘルパー細胞系であるＡ５４９Ｅ１−６８上での増 幅中における野生型（Ｅ１＋）ウイルスの 産生の証拠を提供するであろう。２×１０¹⁰のＥ１（−）ウイルス粒子（Ａ５４ ９Ｅ１−６８を使用して増幅された）を用いて正常Ａ５４９細胞の５枚の１５０ ｍｍプレート各々を感染させた（合計１×１０¹¹個の粒子）。Ａ５４９プレート のいずれにおいても８日後にＣＰＥ又は単一プラークは検出されなかったので、 これはＡ５４９Ｅ１−６８増幅ウイルス標本中にどのＥ１（＋）ＲＣＡウイルス も存在しないことを示していた。つまり、ＲＣＡを検出するための２種類の高感 度なアッセイを用いても野生型組換えＥ１（＋）ウイルスは検出されなかったの で、これはＲＣＡがないＥ１欠失アデノウイルスベクターの増幅及び大規模調製 に対するこの細胞系の有用性を指示している。 実施例４ Ａ５４９Ｅ１ Ｃｒｅ細胞系の生成 ＣｃｒｅリコンビナーゼをトランスフェクションするためにＡ５４９Ｅ１−６ ８．３クローン系を用いて第二世代Ｅ１相補性細胞系を生成させた。この細胞系 はＥ１欠失アデノウイルスベクターを相補し、ｌｏｘＰ部位に取り囲まれている 配列の切り出しを媒介するであろう。この細胞系についての我々の主要な使用は 、必要なＥ１欠損ミニアデノウイルスベクターのパッケージングを強化するため に、そのパッケージングシグナルが２つのｌｏｘＰ部位に隣接しているＡｄ５ヘ ルパーウイルス（図 ７）のパッケージングをさらに転写減衰させることである。Ｃｒｅリコンビナー ゼを発現する２９３細胞は、同様の目的でパークス（Parks）ら、（P.N.A.S．93 :13565-13570）によって産生され、Ｅ１欠失ベクターウイルスの力価を１継代に つき１０倍増加させることが証明されているが、これはヘルパーウイルスを除去 するためのこの細胞系の総合的有用性を証明した。本発明で記載されるＡ５４９ Ｅ１−Ｃｒｅ細胞系は同様の方法でヘルパーウイルスパッケージングを転写減衰 させるだけではなく、産生するあらゆるアデノウイルスが有害なＲＣＡを含まな いであろうという長所も備えている。 Ａ５４９Ｅ１−Ｃｒｅ細胞系の産生を目指す第１工程として、Ｃｒｅ発現ベク ターを構成した。１４４０ｂｐ ＳＶ４０プロモーター−ピューロマイシン・カ セット（Ｎｅｏ^R Ａ５４９Ｅ１細胞における選択のために）をＣＭＶ−Ｃｒｅ ベクター（ｐＢＳ１８５、Gibco/BRL社）の唯一のＥｃｏＲＩ部位内にクローニ ングし、ｐＣＭＶ−Ｃｒｅ−Ｐｕｒｏを生成した（図８）。ｐＣＭＶ−Ｃｒｅ− ＰｕｒｏベクターをＡ５４９Ｅ１−６８細胞内にエレクトロポレーションにより トランスフェクトし、ピューロマィシン^R（「ピューロ^R、ｐｕｒｏ^R」）クロー ンを単離した。その後、これらのピューロ^Rクローンを機能的Ｃｒｅリコンビナ ーゼの発現についてスクリーニングした。プラスミドｐＢＳ／ｌｏｘＰ−ｓｔｏ ｐ／ＭＣＬｐＡは、停止コドンが存在するために非機能的で あるｌａｃＺカセットを含有している（図９）。この停止コドンは、Ｃｒｅを産 生する細胞系におけるこのベクターの増殖が停止シグナルを切り出してｌａｃＺ 遺伝子を活性化させるように、ｌｏｘＰ部位によって取り囲まれている。ｐＢＳ ／ｌｏｘＰ−ｓｔｏｐ／ＭＣＬｐＡベクターをＡ５４９Ｅ１−Ｃｒｅクローンの 各々に一過性的にトランスフェクトし、そして２４時間後に、トランスフェクト された細胞を固定してＸ−Ｇａｌを用いて染色した。親のＡ５４９Ｅ１−６８細 胞（Ｃｒｅなし）のｌａｃＺ発現を７種の異なるｐｕｒｏ^rＡ５４９Ｅ１−Ｃｒ ｅクローンにおけるｌａｃＺの発現と比較した。ｌａｃＺの発現（Ｃｒｅの発現 のため）は、２０／２６ｐｕｒｏ^Rクローン中で１％〜５０％の範囲内の頻度で 青色細胞として観察された。ＬａｃＺを発現している細胞のこの範囲はおそらく ｐＢＳ／ｌｏｘＰｓｔｏｐ−ＭＣＬｐＡベクターによる異なるｐｕｒｏ^Rクロー ンの一過性的なトランスフェクションの効率が反映されていると思われるが、あ るいはこれは異なる細胞系におけるＣｒｅリコンビナーゼ発現における変異種を 反映しているのかも知れない。抗−Ｃｒｅ抗体（Pharmingen社）を使用するウエ スタンブロット分析では、これらの細胞系における３５ｋｄ Ｃｒｅタンパク質 の存在が確証された。２つのｌｏｘＰ部位によって隣接されたパッケージングシ グナルを含有するＡｄヘルパーウイルスの転写減衰を評価するための実験は、現 在進行中である。実施例５ ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢを発現する Ａ５４９Ｅ１細胞系の生成 近年、クルッペル（Kruppel）−関連ボックス（ＫＲＡＢ）と呼ばれる高度に 保存された７５アミノ酸のタンパク質がマーゴリン（Margolin）ら（P.N.A.S．9 1 ,p.4509-4513(1994)）らによって単離された。ＫＲＡＢボックスはヒト亜鉛フ ィンガータンパク質のＫｏｘ−１ファミリーの一員であり、引き続いて強力な転 写リプレッサーであることが証明された。Ｋｏｘ−１からのＫＲＡＢドメインを 大腸菌のＴｎ１０から誘導されたＴｅｔリプレッサーへ融合させることにより、 ハイブリッドタンパク質、ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢが得られ、このタンパク質は真核 細胞プロモーターのテトラサイクリンで調節されたサイレンシングをするように なる（Deuschleら、Mol．and Cell．Biol．15，p.1907-1914(1995)。ＴｅｔＲ− ＫＲＡＢリプレッサーは転写調節領域に存在するｔｅｔＯ配列に結合し、３ｋｂ も下方に配置されている遺伝子の転写を抑制する。 本発明は、ヘルパーウイルスパッケージングシグナル配列に複数のｔｅｔＯ配 列を含む、ヘルパーウイルスパッケージングのテトラサイクリンで調節された阻 害を行うためのシステムと、ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢタンパク質を構造的に発現する Ｅ１ヘルパー細胞系について記載する。 それでもこのヘルパーウイルスはまだミニアデノウイルスベクターを複製するた めに必要とされる全ての必要なタンパタ質をトランスで複製し産生することがで きるが、しかし、そのパッケージングはパッケージングシグナルにおけるＴｅｔ Ｒ−ＫＲＡＢタンパク質のｔｅｔＯ部位への結合のために転写減衰させられる。 総合的目標はヘルパーウイルスのパッケージングを防止するか、あるいは阻害す ることであり、従ってベクターウイルスパッケージングを強化することである。 このパッケージング抑制は、テトラサイクリンの存在下ではＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ リプレッサーがｔｅｔＯ配列から解離し、パッケージングが修復されるので可逆 的である。このｔｅｔｏＯ調節されたヘルパーウイルスの詳細は、以前の特許出 願（１９９６年５月３１日に出願された出願番号第０８／６５８，９６１号）に 示されている。 ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ発現細胞系は、実施例２に記載のＡ５４９Ｅ１−６８ヘル パー細胞系を用いて誘導した。Ａ５４９Ｅ１−６８細胞はＣＭＶプロモーターの 制御下でＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ遺伝子でトランスフェクトされた（Deuschleら、Mo l．Cell．Biol．15 p.1907-1914(1995)）。ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢベクターはさら に哺乳類細胞において選択するためにヒグロマイシン耐性遺伝子を含有している 。ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢリプレッサーが欠如する細胞内への一過性的なトランスフ ェクションのために、ＣＭＶプロモーターの制御下でＴｅｔＯ配列へ融合され たルシフェラーゼレポーター遺伝子を有している試験ベクター（Deuschleら、Mo l．and Cell．Biol．15，p．1907-1914(1995)）を使用した。このトランスフェ クションはルシフェラーセの高いレベルの発現を生じさせるが、他方ＴｅｔＲ− ＫＲＡＢタンパク質を発現するＡ５４９Ｅ１細胞内へのトランスフェクションで は試験ベクター内のｔｅｔＯ部位へのリプレッサーの結合のためにルシフェラー ゼの抑制を生じさせるであろう。ヒグロマイシン耐性Ａ５４９Ｅ１−ＴｅｔＲ− ＫＲＡＢクローンはエレクトロポレーションによりｐＴｅｔＯ−ＣＭＶ−Ｌでト ランスフェクトされ、各クローンを６ウエル・プレートの２つのウエルに分割し た。トランスフェクションの２４時間後、重複しているウエルの一方からの細胞 にテトラサイクリンを含有する培地を再補給し、他方の重複しているウエルには テトラサイクリンを含有しない培地を補給した。さらに２４時間後、細胞を溶解 させ、プロメガ（Promega）・ルシフェラーゼアッセイキットを用いてルシフェ ラーゼ発現についてアッセイした。２個のｈｙｇｒｏ^RＡ５４９Ｅ１クローン（ ＴＫＥ−９及びＴＫＥ−１２）は、テトラサイクリンを含有する培地中で増殖し た細胞に対してテトラサイクリンの不在下で増殖させた場合に、ルシフェラーゼ レポーター活性を４〜６倍抑制することを示し、これは細胞内のＴｅｔＲ−ＫＲ ＡＢリプレッサータンパク質の発現を示している（図１０）。これらのＡ５４９ Ｅ１−ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢ細胞 系は、ＴｅｔＯで調節されたＡｄヘルパーウイルスの転写減衰を試験するために 使用されるであろう。 これらの実施例は本発明を例示することを意図しており、発明の精神又は範囲 を制限することは意図していない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アルマニー ラモン アメリカ合衆国 60030 イリノイ州 グ レイスレイク ナンバー204 カントリー ドライブ 1904 (72)発明者 ザーン、ウェイ−ウェイ アメリカ合衆国 60048 イリノイ州 リ バティーヴィル ダーネル ストリート 1915

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 複製適応アデノウイルスを生成することなくＥ１欠失アデノウイルスベ クターを相補するために十分なアデノウイルスＥ１配列の領域を発現することが できる哺乳類細胞を含む組換え細胞。 ２． さらにＥ１欠失ヘルパーウイルスの転写減衰調節のために十分なポリペ ブチドをコードするＤＮＡ配列を発現することができる前記哺乳類細胞である請 求項１に記載の組換え細胞。 ３． 前記ＤＮＡ配列がＣｒｅリコンビナーゼをコードするＤＮＡを含む請求 項２に記載の組換え細胞。 ４． 前記ＤＮＡ配列がＴｅｔＲ−ＫＲＡＢをコードするＤＮＡを含む請求項 ２に記載の組換え細胞。 ５． 複製適応アデノウイルスを生成することなくＥ１欠失アデノウイルスを 増殖させるための下記のステップを含む方法： （ａ） 複製適応アデノウイルスを生成することなく前記Ｅ１欠失アデノウイ ルスを相補するために十分なアデノウイルスＥ１配列の領域を哺乳類細胞にトラ ンスフェクトするステップ； （ｂ） 前記哺乳類細胞を前記Ｅ１欠失アデノウイルスに感染させるステップ ；及び （ｃ） Ｅ１欠失アデノウイルスの前記相補による前記哺乳類細胞の溶解に適 する条件下で前記哺乳類細胞を 増殖させるステップ。 ６． 複製適応アデノウイルスを生成することなくミニアデノウイルスを選択 的に増殖させるための下記のステップを含む方法： （ａ） 複製適応アデノウイルスを生成することなく前記Ｅ１欠失アデノウイ ルスを相補するために十分なアデノウイルスＥ１配列の領域を哺乳類細胞にトラ ンスフェクトするステップ； （ｂ） Ｅ１欠失ヘルパーウイルスの転写減衰調節のために十分なポリペプチ ドをコードするＤＮＡ配列を前記哺乳類細胞に、さらにトランスフェクトするス テップ； （ｃ） 前記ポリペプチドによって調節される修飾されたパッケージングシグ ナルを含有する前記Ｅ１欠失ヘルパーウイルスを前記哺乳類細胞に共感染するス テップ；及び （ｄ） Ｅ１欠失アデノウイルスの前記相補による前記哺乳類細胞の溶解と、 前記Ｅ１欠失ヘルパーウイルスの前記転写減衰調節とのために十分な条件下で前 記哺乳類細胞を増殖させるステップ。 ７． （ａ） Ｅ１欠失ヘルパーウイルスの転写減衰調節のために十分なポリ ペブチドをコードする前記ＤＮＡ配列がＣｒｅリコンビナーゼをコードするＤＮ Ａであり; （ｂ） Ｅ１欠失ヘルパーウイルスの転写減衰のため に十分な前記ポリペプチドにより調節される前記修飾されたパッケージングシグ ナルが前記パッケージングシグナルに隣接するｌｏｘＰ部位を含む、請求項６に 記載の方法。 ８． （ａ） Ｅ１欠失ヘルパーウイルスの転写減衰調節のために十分なポリ ペプチドをコードする前記ＤＮＡ配列がＴｅｔＲ−ＫＲＡＢをコードするＤＮＡ であり （ｂ） Ｅ１欠失ヘルパーウイルスの転写減衰のために十分な前記タンパク質 により調節される前記修飾されたパッケージングシグナルが前記修飾パッケージ ングシグナルにおけるｔｅｔＯ ＤＮＡ配列を含む、請求項６に記載の方法。 ９． 組換え細胞を作製するための下記のステップを含む方法： （ａ） 複製適応アデノウイルスを生成することなく前記Ｅ１欠失アデノウイ ルスベクターを相補するために十分なアデノウイルスＥ１配列の領域を哺乳類細 胞にトランスフェクトするステップ；及び （ｂ） アデノウイルスＥ１遺伝子の前記領域を発現する組換え細胞を選択す るステップ。 １０． 複製適応アデノウイルスを生成することなくＥ１欠失アデノウイルス ベクターを相補するために十分なアデノウイルスＥ１遺伝子の領域を発現するこ とのできる組換え哺乳類細胞を使用するための、下記のステッ プを含む方法： （ａ） 前記Ｅ１欠失アデノウイルスを前記組換え哺乳類細胞に感染させるス テップ；及び （ｂ） Ｅ１欠失アデノウイルスの前記相補と、前記Ｅ１欠失アデノウイルス の増殖とによって前記哺乳類細胞が溶解するのに十分な条件下で前記哺乳類細胞 を増殖させるステップ。 １１． 前記組換え哺乳類細胞がヒトの細胞である請求項１０に記載の方法。 １２． 前記組換え哺乳類細胞がＡ５４９ヒト肺癌細胞である請求項１０に記 載の方法。 １３． 前記組換え哺乳類細胞が受託番号ＣＲＬ−１２４５８でＡＴＣＣに寄 託されている請求項１０に記載の方法。 １４． 複製適応アデノウイルスを生成することなくＥ１欠失アデノウイルス を相補するために十分なアデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂ配列を発現することの できる哺乳類細胞である組換え細胞を使用する下記のステップを含む方法： （ａ） 前記組換え哺乳類細胞に前記Ｅ１欠失アデノウイルスを感染させるス テップ；及び （ｂ） Ｅ１欠失アデノウイルスの前記相補と、前記Ｅ１欠失アデノウイルス の増殖とによって前記哺乳類細胞の溶解のために十分な条件下で前記哺乳類細胞 を増殖させるステップ。 １５． 前記組換え哺乳類細胞がヒトの細胞である請求項１４に記載の方法。 １６． 前記組換え哺乳類細胞がＡ５４９ヒト肺癌細胞である請求項１４に記 載の方法。 １７． 前記組換え哺乳類細胞が受託番号ＣＲＬ−１２４５８でＡＴＣＣに寄 託されている請求項１４に記載の方法。 １８． 複製適応アデノウイルスを生成することなくＥ１欠失アデノウイルス を相補するために十分なアデノウイルスＥ１遺伝子の領域を発現することができ 、さらに前記Ｅ１欠失ヘルパーウイルスを転写減衰調節するためのタンパク質を コードするＤＮＡ配列を発現することができる組換え哺乳類細胞を使用する下記 のステップを含む方法： （ａ） 前記哺乳類細胞にＥ１欠失アデノウイルスの転写減衰についての前記 タンパク質によって調節される修飾されたパッケージングシグナルを含む前記Ｅ １欠失ヘルパーウイルスと、ミニアデノウイルスとを共感染させるステップ；及 び （ｂ） Ｅ１欠失アデノウイルスの前記相補による前記哺乳類細胞の溶解と、 前記Ｅ１欠失アデノウイルスの前記転写減衰調節とのために適合する条件下で前 記哺乳類細胞を増殖させるステップ。 １９． 前記組換え哺乳類細胞がヒトの細胞である請求項１８に記載の方法。 ２０． 前記組換え哺乳類細胞がＡ５４９ヒト肺癌細胞である請求項１８に記 載の方法。 ２１． 前記ＤＮＡ配列がＥ１欠失アデノウイルスの前記転写減衰調節のため に十分なポリペプチドをコードするＣｒｅリコンビナーゼをコードするＤＮＡを 含む請求項１８に記載の方法。 ２２． 前記組換え哺乳類細胞がヒトの細胞である請求項１８に記載の方法。 ２３． 前記組換え哺乳類細胞がＡ５４９ヒト肺癌細胞である請求項１８に記 載の方法。 ２４． 前記組換え哺乳類細胞が受託番号ＣＲＬ−１２４５８でＡＴＣＣに寄 託されている請求項１８に記載の方法。 ２５． 前記ＤＮＡ配列がＥ１欠失アデノウイルスの前記転写減衰調節のため に十分なポリペプチドをコードするＴｅｔＲ−ＫＲＡＢをコードするＤＮＡを含 む請求項１８に記載の方法。 ２６． 前記組換え哺乳類細胞がヒトの細胞である請求項２５に記載の方法。 ２７． 前記組換え哺乳類細胞がＡ５４９ヒト肺癌細胞である請求項２５に記 載の方法。 ２８． 前記組換え哺乳類細胞が受託番号ＣＲＬ−１２４５８でＡＴＣＣに寄 託されている請求項２５に記載の方法。 ２９． 複製適応アデノウイルスを生成することなく Ｅ１欠失アデノウイルスを相補するために十分なアデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１ Ｂ配列を発現することができ、さらに前記Ｅ１欠失ヘルパーウイルスの転写減衰 を調節するためのタンパク質を発現することができる組換え哺乳類細胞を使用す るための下記のステップを含む方法： （ａ） 前記哺乳類細胞にＥ１欠失アデノウイルスの転写減衰について前記タ ンパク質によって調節される修飾されたパッケージングシグナルを含む前記Ｅ１ 欠失ヘルパーウイルスと、ミニアデノウイルスとを共感染させるステップ；及び （ｂ） Ｅ１欠失アデノウイルスの前記相補による前記哺乳類細胞の溶解と、 前記Ｅ１欠失ヘルパーウイルスの前記転写減衰調節とのために適合する条件下で 前記哺乳類細胞を増殖させるステップ。 ３０． 前記組換え哺乳類細胞がヒトの細胞である請求項２９に記載の方法。 ３１． 前記組換え哺乳類細胞がＡ５４９ヒト肺癌細胞である請求項２９に記 載の方法。 ３２． 前記ＤＮＡ配列がＥ１欠失アデノウイルスの前記転写減衰調節のため に十分なポリペプチドをコードするＣｒｅリコンビナーゼをコードするＤＮＡを 含む請求項２９に記載の方法。 ３３． 前記組換え哺乳類細胞がヒトの細胞である請求項３２に記載の方法。 ３４． 前記組換え哺乳類細胞がＡ５４９ヒト肺癌細 胞である請求項３２に記載の方法。 ３５． 前記組換え哺乳類細胞が受託番号ＣＲＬ−１２４５８でＡＴＣＣに寄 託されている請求項３２に記載の方法。 ３６． 前記ＤＮＡ配列がＥ１欠失アデノウイルスの前記転写減衰調節のため に十分なポリペプチドをコードするＴｅｔＲ−ＫＲＡＢをコードするＤＮＡを含 む請求項２９に記載の方法。 ３７． 前記組換え哺乳類細胞がヒトの細胞である請求項３６に記載の方法。 ３８． 前記組換え哺乳類細胞がＡ５４９ヒト肺癌細胞である請求項３６に記 載の方法。 ３９． 前記組換え哺乳類細胞が受託番号ＣＲＬ−１２４５８でＡＴＣＣに寄 託されている請求項３８に記載の方法。