JP4686670B2 - 組換えウイルスの製造方法 - Google Patents

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Description

本発明は組換えウイルスの製造方法に関する。本発明は前記方法を実施するために使用される構築物、産生細胞及びこうして製造されたウイルスにも関する。これらのウイルスはin vitro、ex vivo又はin vivo遺伝子クローニング及び/又は発現用ベクターとして使用可能である。
ウイルス起源ベクターは(組換えタンパク質の製造、スクリーニング試験の実施、遺伝子調節研究用等に)in vitro、ex vivo又は(動物モデルの作出用又は治療アプローチで)in vivo遺伝子クローニング、導入及び発現に広く使用されている。これらのウイルスとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニアウイルスを特に挙げることができる。
アデノウイルス科は哺乳動物と鳥類に広く分布しており、正二十面体対称キャプシドをもつエンベロープなし2本鎖DNAウイルスの百種類以上の血清型を含む(Horwitz,In:Fields BN,Knipe DM,Howley PM編,Virology.第3版,Philadelpia:Raven Publishers,1996:2149−2171)。アデノウイルスは安全性に加え、非常に広い細胞親和性をもつ。細胞周期が細胞分裂に依存するレトロウイルスとは異なり、活性分裂細胞だけでなく休止細胞にも感染することができ、そのゲノムはエピソーム形態で維持される。更に、高力価(1011pfu/ml)で生産され得る。これらの主要利点により、異種遺伝子のクローニング及び発現用ベクターとして選択されている。C亜属(特に2及び5型)のアデノウイルスとCAV−2型イヌアデノウイルスは分子生物学が最もよくわかっており、実用されているベクターに利用されている。
アデノウイルスは複製起点を含む各末端の103bpの逆方向反復配列(ITR)と、左側ITRの近傍に配置されたパッケージングシグナルを含む36kbの直鎖状ゲノムをもつ(Shenk,Adenoviridae:The Viruses and Their Replication.In:Fields BN,Knipe DM,Howley PM編,Virology.Philadelpia:Raven Publishers,1996:2111−2148)。ウイルス周期中に次の3群の遺伝子群が発現される。
−細胞遺伝子の調節に関与し、特に細胞のS期導入(E1A)とアポトーシスの阻害(E1B)を可能にする極初期遺伝子(E1、E2、E3及びE4)。これらの遺伝子はメッセンジャーRNAの転写、スプライシング又は輸送のレベルで初期又は後期ウイルス遺伝子の調節にも関与している(E1A、E2A、E4)。また、複製と免疫応答エスケープにも役割を果たす。
−後初期遺伝子(pIX及びIVa2)は後期遺伝子の転写の調節(IVa2)とビリオンの組立て(pIX)に関係がある。
−後期遺伝子(L1〜L5)は強力なプロモーター(MLP)から転写される。28kbの一次転写産物は交互スプライシングと5個のポリアデニル化部位の使用により、ウイルス粒子の組立て及び成熟に関与する種々の構造(コア、ペントン、ヘキソン)及び非構造タンパク質に対応する転写産物を生成することができる。
アデノウイルスベクターはin vitro遺伝子クローニング及び発現(Gluzmanら,Cold Spring Harbor,New York 11724,p.187)、トランスジェニック動物の作出(WO95/22616)、遺伝子のex vivo細胞導入(WO95/14785;WO95/06120)又は遺伝子のin vivo細胞導入(特にWO93/19191,WO94/24297,WO94/08026参照)に使用されている。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、比較的小寸法のDNAをもつウイルスであり、これに感染する細胞のゲノムに比較的部位特異的に安定に組込まれる。アデノ随伴ウイルスは細胞増殖、形態又は分化に影響することなく広範な細胞に感染することができる。また、ヒトで疾病に関与しないと思われる。AAVのゲノムは既にクローニングされ、配列及び特性を決定されている。前記ゲノムは約4700塩基を含み、ウイルスの複製起点として機能する約145塩基の逆方向反復領域(ITR)各末端に含む。ゲノムの残余はパッケージング機能をもつ2つの主領域に分けられ、ゲノムの左側部分はウイルス複製とウイルス遺伝子の発現に関与するrep遺伝子を含み、ゲノムの右側部分はウイルスのキャプシドタンパク質をコードするcap遺伝子を含む。
AAVに由来するベクターをin vitro及びin vivo遺伝子導入に利用することは文献に記載されている(特にWO91/18088;WO93/09239;米国特許第4,797,368号、5,139,941号、ヨーロッパ特許第488528号参照)。
レトロウイルスは分裂細胞に選択的に感染する組込みウイルスである。従って、例えば癌や再発狭窄症に適用するのに有利なベクターである。レトロウイルスのゲノムは主に2つのLTRと、パッケージング配列と、3つのコーディング領域(gag、pol及びenv)を含む。組換えベクターの構築とそのin vitro又はin vivo使用については文献に広く記載されており、特にBreakfieldら,New Biologist 3(1991)203;ヨーロッパ特許第453242号及び178220号、Bernsteinら,Genet.Eng.7(1985)235;McCormick,BioTechnology 3(1985)689等を参照されたい。
組換えベクターとして使用するために、種々の目的遺伝子を組込んだ種々のウイルス由来構築物が作製されている。これらの構築物はいずれもウイルスが感染細胞で自己複製できないようにウイルスゲノムを改変している。従って、従来技術に記載されている構築物は、複製に必須のゲノムの所定領域を欠損するウイルスである。特に、アデノウイルスについては、第1世代構築物はウイルス複製に必須のE1領域に欠失があり、このレベルに異種DNA配列を挿入している(Levreroら,Gene 101(1991)195;Gosh−Choudhuryら,Gene 50(1986)161)。また、ベクターの性質を改良するために、アデノウイルスのゲノム内に他の欠失又は変異を形成することも提案されている。例えば、突然変異株ts125に感熱性点突然変異を導入し、E2領域によりコードされる72kDaのDNA結合タンパク質(DBP)を不活化している(Van der Vlietら,1975)。この他、ウイルス複製及び/又は増殖に必須の別の領域であるE4領域の欠失を含むベクターもある。E1及びE4領域を欠失するアデノウイルスベクターは転写バックグラウンドノイズとウイルス遺伝子発現が非常に低い。このようなベクターは例えば国際出願WO94/28152、WO95/02697、WO96/22378に記載されている。また、IVa2遺伝子のレベルに変異をもつベクターも記載されている(WO96/10088)。更に、ウイルス生産にシスで必要な領域(ITR及びパッケージング配列)しか含まず、全コーディングウイルス配列を欠失する「最小アデノウイルス」又は「偽アデノウイルス」(又はAdΔ)と呼ばれるベクターも記載されている(WO94/12649、WO94/28152、WO95/02697)が、以下に説明するようにそれらの製造はまだ非常に困難である。
AAVについては、記載されているベクターは一般にコーディング領域Rep及びCapを完全に除去し、目的核酸で置換している。
レトロウイルスに由来する組換えベクターでは、一般にgag、pol及びenv遺伝子を全部又は一部除去し、目的異種核酸配列で置換している。また、組換えレトロウイルスは転写活性を抑制するようにLTRのレベルに変異を加えたり、gag遺伝子の一部を含む拡張パッケージング配列にすることもできる(Benderら,J.Virol.61(1987)1639)。
これらの種々の組換えウイルスは複製欠損性であるため、ゲノムの欠失機能をトランス相補できるように製造する必要がある。これらのウイルスの製造、特にトランス相補機能の導入を非常に困難にしているのはトランス相補に他ならない。
この点では2種のアプローチが開発されている。第1はパッケージング系と呼ばれるトランス相補系の構築である。第2はヘルパーアデノウイルス又はヘルパープラスミドの使用に基づく。
種々の欠損ウイルスパッケージング系が構築されている。これらの系はウイルスベクターに欠損する機能を生成することができる。一般に、これらの系はウイルスゲノムの欠失領域(例えばアデノウイルスではE1、E2及び/又はE4、レトロウイルスではgag、pol及び/又はenv、AAVではrep及び/又はcap)をそのゲノムに組み込んでいる。
欠損アデノウイルスの製造用として知られている細胞系の1例は例えば、アデノウイルスのゲノムの一部を組み込んだ293系である。より詳細には、293系はアデノウイルス血清型5(Ad5)のゲノムの左側末端(約11〜12%)を含むヒト胎児腎細胞系であり、左側ITR、パッケージング領域、E1aとE1bを含むE1領域、pIXタンパク質をコードする領域及びpIVa2タンパク質をコードする領域の一部を含む。この系はE1領域を欠損即ちE1領域の全部又は一部を欠失する組換えアデノウイルスをトランス相補することができ、高力価をもつウイルスストックを生産することができる。この系は、感熱性E2突然変異を更に含むウイルスストックを許容温度(32℃)で生産することもできる。E1領域を相補することが可能な他の細胞系としては、特にヒト肺癌細胞A549(WO94/28152)やヒト網膜芽細胞(Hum.Gen.Ther.(1996)215)に由来するものも記載されている。また、アデノウイルスの複数の機能をトランス相補することが可能な細胞系も記載されている。特に、E1及びE4領域を相補する系(Yehら,J.Virol.70(1996)559;Cancer Gen.Ther.2(1995)322;Krougliakら,Hum.Gen.Ther.6(1995)1575)と、E1及びE2領域を相補する系(WO94/28152、WO95/02697、WO95/27071)を挙げることができる。
欠損レトロウイルスの製造用細胞系も種々のものが記載されており、一般にgag、pol及びenv遺伝子を発現することができる。このような系は例えばPA317系(米国特許第4,861,719号)、PsiCRIP系(WO90/02806)、GP+envAm−12系(WO89/07150)、BOSC系(WO94/19478)等である。目的核酸を含む組換えレトロウイルスを構築するためには、特にLTRとパッケージング配列と目的核酸を含むプラスミドを構築した後、このプラスミドを使用して、プラスミドに欠失するレトロウイルス機能をトランス導入することが可能な上記のようなパッケージング系にトランスフェクトする。生成した組換えレトロウイルスをその後、慣用技術により精製する。
しかし、細胞系の使用にはいくつかの欠点がある。例えばこのような細胞系を工業規模で構築及び評価するのは困難であり、費用がかかり、制約がある。実際に、これらの系は安定で且つ工業的利用に適合できなければならない。更に、記載されている系は汚染性複製ウイルス(RCA)の生産を避け難い。また、これらの系は現状では例えば上記最小アデノウイルスのような欠損度の非常に高いウイルスゲノムを工業的利用に十分にトランス相補することができない。実際に、アデノウイルスは空間時間的調節が非常に複雑な種々の転写単位から編成されるゲノムをもつ。細胞系から各転写単位を別々に構成的又は条件付きで発現させることにより全コーディングウイルス配列を欠失するアデノウイルスをトランス相補することはまだ十分に実施できていない。例えば細胞系から構成的に発現されているのは、E1、E4、pIX領域及びE2によりコードされる3種のタンパク質(pol、DBP及びp−TP)に対応するゲノムのごく一部に過ぎない。ゲノムの残余は28kbの一次転写産物から構造及び非構造タンパク質の全メッセンジャーを生産し、ゲノムの複製後に活性化される主要後期転写単位(MLTU)に対応する。しかし、最小アデノウイルスを作製するためには、これらの領域のトランス相補は不可欠である。これらの系から非常に高力価の組換えレトロウイルスを得ることはできない。
第2のアプローチは、相補機能を導入する構築物(プラスミド又はアデノウイルス)を欠損ウイルスゲノムと共にコトランスフェクトするものである。特に、欠損組換えAAVは一般に、ヒト補助ウイルス(例えばアデノウイルス)に感染させた細胞系に、AAVの2つの逆方向反復領域(ITR)で挟まれた目的核酸を含むプラスミドと、AAVの相補機能(rep及びcap遺伝子)をもつプラスミドを同時トランスフェクトすることにより作製される。変異体は国際出願WO95/14771、WO95/13365、WO95/13392又はWO95/06743に記載されている。ヘルパーアデノウイルスを使用する欠点は主に、アデノウイルスベクターとヘルパーアデノウイルスの組換えの危険が大きく、ウイルスストックの生産及び精製時にヘルパーの組換え体を分離しにくいという点にある。例えばRep/capプラスミド等のヘルパープラスミドを使用する欠点は、得られるトランスフェクションレベルが高力価のウイルスを生産するには不十分であるという点にある。
本願はこれらの欠点を解決することが可能な新規ウイルス製造システムに関する。本発明のシステムは相補機能を導入するためにバキュロウイルスを使用するものである。
本発明による製造システムは、樹立相補系を使用する必要がなく、RCAの問題がなく、高度欠損ゲノムをトランス相補できるという点が特に有利である。更に、本発明のシステムは所望ウイルスとバキュロウイルスにより感染可能な全細胞に適用可能であり、従って幅広い利用性を提供する。
従って、本発明の第1の目的は、欠損組換えウイルスのゲノムと、欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスをコンピテント細胞集団に導入することを特徴とする欠損組換えウイルスの製造方法にある。
従って、本発明の方法は相補機能を導入するためにバキュロウイルスを使用する。種々のアプローチが可能である。まず欠損組換えゲノムのトランス相補機能を発現しないコンピテント細胞を使用することができる。この場合には、欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な全機能を含むバキュロウイルス又は欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の1種以上を各々もつ数個のバキュロウイルスを使用することができる。欠損組換えゲノムの1種以上の機能を既にトランス相補することが可能なコンピテント細胞集団(パッケージング系)も使用できる。その場合には、使用する1種以上のバキュロウイルスは欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能のうちでコンピテント細胞によりまだトランス相補されていない機能のみを導入する。
上述のように、本発明のシステムは工業化(細胞系が不要、RCAを生産しない等)と応用性(全欠失型をもつ組換えウイルス、特に高度欠損組換えアデノウイルスの製造)に多数の利点がある。また、バキュロウイルスはヒト細胞で複製しないので、得られるウイルス調製物はバキュロウイルスに汚染されない。更に、バキュロウイルスはアデノウイルスとは系統分類的に非常に離れているため、両者間の組換え又はトランス相補の危険がない。従って、このシステムはRCAのない欠損ウイルスの濃縮ストックを生産できるという利点がある。このシステムは欠損組換えアデノウイルスの製造に特に有利である。
バキュロウイルスは脊椎動物に固有のエンベロープ付き環状2本鎖DNAウイルスである。その典型例であるAcNPVは133bkのゲノムをもつ。このウイルスは2種の強力プロモーター[多面体(Ph)及びP10]からの真核遺伝子の昆虫細胞発現ベクターとしてよく使用されている(KingとPossee,The baculovirus expression system.London:Champamn & Hall,1992)。AcNPVは所定の哺乳動物細胞に感染することができるが、ゲノムは転写も翻訳もされない。最近、Hofmannら(PNAS 92(1995)10099)は、LacZ遺伝子を発現する精製組換えバキュロウイルスにより肝細胞をin vitroで形質導入できることを示している。1000という高い感染多重度でも細胞毒性は報告されておらず、この論文に記載されているトランスフェクション効率はMOI100で約50%である。
本願出願人は、種々の細胞型に組換えバキュロウイルスを感染できることを示した。特に、本願出願人は、不死化胎児細胞等のヒト起源の細胞に組換えバキュロウイルスを感染できることを示した。本願出願人は、非常に高い導入効率(>80%)を得られることも示した。本願出願人は更に、アデノウイルスの相補機能をバキュロウイルスに導入し、コンピテント細胞集団でこれらの機能を発現できることも示した。従って本願出願人は、バキュロウイルスがウイルス相補機能の哺乳動物、特にヒト細胞導入及び発現に特に有利に使用可能な不活性ベクターであることを示すことができた。本発明のシステムの他の利点は、特に(i)完全アデノウイルスゲノムを相補可能なクローニング能が高いことと、(ii)バキュロウイルス技術の前進である。
以下の文中では、ウイルスの相補機能をもつバキュロウイルスをヘルパーバキュロウイルスとも言う。ヘルパーバキュロウイルスはウイルスの相補のための種々の機能を含むことができる。
例えば、ヘルパーバキュロウイルスはアデノウイルスのE1領域を含むことができる。第1世代アデノウイルス即ちE3状態に関係なく(即ち欠損AdΔE1,ΔE3、またはそうでない)、E1領域を欠損するアデノウイルス(AdΔE1)の製造にはBaculo−E1を使用することができる。第1世代欠損組換えアデノウイルス(E1領域と場合によりE3を欠損)の製造は本発明の方法の特に有利な第1の適用である。上述のように、E1機能をトランス相補することが可能な種々の細胞系が文献に記載されている(293細胞、A549細胞、911細胞等)。しかし、細胞系のゲノムに組み込まれたトランス相補機能をもつ領域と、製造しようとする組換えウイルスのDNAの間には相同ゾーンが存在する。このため、製造中に種々の組換えイベントが生じ、複製ウイルス粒子、特にE1+型のアデノウイルスを生成する恐れがある。例えば単純組換えイベント後に染色体が切れたり、二重組換えが生じることがある。これらの2種の変異の結果、細胞ゲノムに含まれるE1領域がアデノウイルスゲノム中の元の遺伝子座に再組み込みされる。更に、293系により製造される組換えベクターは力価が高い(>1012)ため、これらの組換えイベントが生じる確率は高い。従って、第1世代欠損組換えアデノウイルスベクターの多くのバッチは複製ウイルス粒子で汚染されていることが認められ、医薬用途に重大な欠点となっている。実際に、このような粒子が治療用組成物中に存在すると、ウイルス増殖と無制御の伝播をin vivo誘導し、炎症反応、組換え等の危険を伴う。従って、汚染したバッチはヒト治療に使用することができない。
本発明はこれらの欠点を解決することができる。実際に、本発明の方法の1実施態様によると、E1領域と場合によりE3を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムをコンピテント細胞に導入し、バキュロウイルスと欠損組換えアデノウイルスのゲノムに存在するアデノウイルスのE1領域が組換えを生じる恐れのある相同(オーバーラップ)ゾーンをもたないように、これらの細胞にE1領域をもつバキュロウイルスを同時に又は非同時に感染させる。従って、この実施態様によると、樹立細胞系を用いずにRCAのない第1世代組換えアデノウイルスストックを迅速に生産することができる。更に、後述するように、こうして生産したRCAのない組換えアデノウイルスストックは、コンピテント細胞にバキュロウイルスと共に同時インフェクトすることにより新規製造用出発材料として使用することができる。
ヘルパーバキュロウイルスは更にアデノウイルスのE2領域の全部又は一部、特にE2a及び/又はE2b領域を含んでいてもよい。E2領域(Ad−ΔE2)と場合によりE3領域(Ad−ΔE2,ΔE3)を欠損するアデノウイルスをコンピテント細胞で製造するにはbaculo−E2を使用することができる。更に、アデノウイルスのE1領域を相補することが可能なコンピテント細胞でbaculo−E2を使用すると、E1及びE2領域(Ad−ΔE1,ΔE2)と場合によりE3領域(Ad−ΔE1,ΔE2,ΔE3)を欠損する組換えアデノウイルスを製造することができる。同様に、アデノウイルスのE1及びE4領域を相補することが可能なコンピテント細胞(例えばIGRP2細胞)でbaculo−E2を使用すると、E1、E2及びE4領域(Ad−ΔE1,ΔE2,ΔE4)と場合によりE3(Ad−ΔE1,ΔE2,ΔE3,ΔE4)を欠損する組換えアデノウイルスを製造することができる。
ヘルパーバキュロウイルスは更にアデノウイルスのE4領域を(全部又は一部)含んでいてもよい。E4領域(Ad−ΔE4)と場合によりE3領域(Ad−ΔE4,ΔE3)を欠損するアデノウイルスをコンピテント細胞で製造するにはbaculo−E4を使用することができる。更に、アデノウイルスのE1領域を相補することが可能なコンピテント細胞でbaculo−E4を使用すると、E1及びE4領域(Ad−ΔE1,ΔE4)と場合によりE3領域(Ad−ΔE1,ΔE4,ΔE3)を欠損する組換えアデノウイルスを製造することができる。
ヘルパーバキュロウイルスは更にアデノウイルスのE1及びE4領域を(全部又は一部)含んでいてもよい。図1に示すように、E1及びE4領域(Ad−ΔE1,ΔE4)と場合によりE3領域(Ad−ΔE1,ΔE4,ΔE3)を欠損するアデノウイルスをコンピテント細胞で製造するにはbaculo−E1,E4を使用することができる。
更に、E1及びE4領域を欠損するウイルスを作製するためには、夫々E1機能とE4機能の全部又は一部を発現する2種のヘルパーバキュロウイルスを使用することもできる。
同様に、ヘルパーバキュロウイルスはE1、E2及びE4領域(全部又は一部)と、場合により後期遺伝子をもつ領域(L1〜L5)を含んでいてもよい。
ヘルパーバキュロウイルスは更にAAVのRep及び/又はCap領域を含んでいてもよい。例えば、baculo−Rep/Capは全コーディングウイルス配列を欠失するAAVゲノムを相補することができる(図5)。
バキュロウイルスは更にレトロウイルスのgag、pol及び/又はenv領域を含んでいてもよい。例えば、baculo−gag/pol/envは全コーディングウイルス配列を欠失するレトロウイルスゲノムをコンピテント細胞系で相補することができる。gag/pol領域を含むバキュロウイルスとenv領域を含む第2のバキュロウイルスを使用することもできる。
一般に、欠損組換えウイルスのゲノムとバキュロウイルスに存在する相補領域はオーバーラップをもたないことが好ましい。こうすると、実際に組換えとRCAの生成の危険が避けられる。これは第1世代アデノウイルス(Ad−ΔE1)の生産に特に重要である。この場合には、バキュロウイルスに導入されるE1領域は、組換えゲノムと共通配列をもたないように規定される。このためには、例えば実施例に記載するように、バキュロウイルスに挿入される相補領域よりも大きい領域を組換えゲノムから除去することができる。これはアデノウイルスAd−ΔE1,ΔE4の作製にも有利である。
このように、本発明の方法の特定実施態様では、欠損組換えウイルスのゲノムをコンピテント細胞に導入し、バキュロウイルスと欠損組換えウイルスのゲノムに存在する相補機能が組換えを生じる恐れのある相同ゾーンをもたないように、欠損ゲノムの相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスをこれらの細胞に同時又は非同時に感染させる。有利な態様では、ウイルスゲノムはE1領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムであり、バキュロウイルスはE1領域をトランス相補することが可能なアデノウイルスの領域をもつ。別の態様によると、ウイルスゲノムはE1及びE4領域を欠損する組換えアデノウイルスゲノムであり、バキュロウイルスは前記領域をトランス相補することが可能なアデノウイルスの2つの領域をもつか、又は夫々E1領域とE4領域をトランス相補することが可能なアデノウイルスの領域をもち、欠損アデノウイルスゲノムと相同ゾーンをもたない2種のバキュロウイルスを使用する。
特定実施態様によると、1個以上のヘルパーバキュロウイルスがアデノウイルスの全コーディング領域をもつ。より特定的な実施態様によると、アデノウイルスの全コーディング領域をもつ単一ヘルパーバキュロウイルスを使用する。従って、このようなヘルパーバキュロウイルスは最小組換えアデノウイルスをトランス相補するために使用可能である。このようなバキュロウイルスは実施例に示すように、パッケージング領域と場合によりITR以外は特にアデノウイルスゲノム全体を含むことができる。
相補機能の作製
ヘルパーバキュロウイルスに導入する相補機能は種々の血清型ウイルスから得られる。
アデノウイルスについては、構造と性質が少しずつ異なるが、類似の遺伝子地図をもつ種々の血清型が実際に存在する。より詳細には、本発明によりバキュロウイルスを構築するために使用される相補機能はヒト又は動物起源のアデノウイルスに由来する。
ヒト起源のアデノウイルスについては、C亜属に分類されるものを好適例として挙げることができる。種々のヒトアデノウイルス血清型のうち、本発明の範囲では特に2又は5型(Ad2又はAd5)のアデノウイルスを使用すると好ましい。A及びB亜属の7又は12型アデノウイルスに由来する領域を使用することもできる。動物起源の種々のアデノウイルスのうちでは、イヌ起源のアデノウイルス、特に全アデノウイルスCAV2株[例えばマンハッタン株又はA26/61(ATCC VR−800)]を使用すると好ましい。動物起源の他のアデノウイルスは、参考資料として本明細書の一部とする国際出願WO94/26914に特に記載されている。
本発明の1好適実施態様では、相補機能はC亜属のヒトアデノウイルスゲノムに由来する。アデノウイルスAd2又はAd5のゲノムに由来するものが特に好ましい。
種々の相補機能をもつ領域は当業者に公知の方法に従って酵素切断によりアデノウイルスゲノムから得られる。これらの領域は場合により修飾し、短縮したり、所定の調節エレメント(プロモーター、エンハンサー等)を異種エレメントで置換してもよい。一般に、これらの領域は次のように作製される。アデノウイルスのDNAは塩化セシウム勾配遠心分離により精製するか、又は原核(WO96/25506)もしくは真核(WO95/03400)プラスミドからin vitroで得られる。次にDNAを適当な制限酵素で開裂し、得られたフラグメントから所望相補機能をもつものを同定及び選択する。使用する制限酵素の選択は所望の相補機能に依存する。次に、アデノウイルスゲノムの公表されている制限地図と配列に従う。例えば、E1領域はE1Aプロモーターの下流にE1A及びE1Bの全オープンリーディングフレームをもつフラグメントとして単離することができる。E4領域はオープンリーディングフレーム全体又はその一部のみ、好ましくはORF3又はORF6又はORF−ORF6/7をもつフラグメントとして単離することができる。
同様の方法を実施して組換えAAV及びレトロウイルスの相補領域を作製する。例えば、AAVのrep及び/又はcap領域は種々のAAV血清型から単離したウイルスDNAから酵素切断により得られる。AAV−2が好ましい。レトロウイルスの場合には、gag、pol及び/又はenv領域は同様に種々のレトロウイルス、例えば特にMoMuLV(「モロニーマウス白血病ウイルス」、別称MoMLV)、MSV(「モロニーマウス肉腫ウイルス」)、HaSV(「ハーベー肉腫ウイルス」)、SNV(「脾壊死ウイルス」)、RSV(「ラウス肉腫ウイルス」)又はフレンドウイルス等のレトロウイルスから慣用分子生物学技術により得られる。
ヘルパーバキュロウイルスの構築
次に、相補領域をもつフラグメントをその操作(微細消化、PCR、調節配列付加等)が可能なプラスミドベクター、例えば原核又は真核生物にサブクローニングする。その後、相補機能をコードする得られた最終フラグメントを慣用分子生物学技術によりヘルパーバキュロウイルスに導入する。詳細には、バキュロウイルスのゲノムのある領域に相同な2つの配列の間にフラグメントをクローニングした後、得られたフラグメント又はプラスミドをバキュロウイルスのゲノムと共に昆虫細胞(一般にはspodoptera frugiperda細胞Sf9及びSf21であるが、trichopulsia ni細胞Tn−368及びHigh−Five(登録商標)BTI−TN−5B1−4(Gibco)、又はバキュロウイルスに許容可能でその製造に使用可能な他の任意の昆虫細胞でもよい)に同時トランスフェクトする。プラスミド又はフラグメントとバキュロウイルスのゲノムの相同組換えにより所望の組換えバキュロウイルスが生成され、慣用方法により回収及び精製することができる(特にKingとPossee:the baculovirus expression system.London:Chapman & Hall,1992参照)。組換えバキュロウイルスを構築するためには、シャトルベクターを含む種々のキットが市販されており、製造業者の指示に従って使用することができる。特に、Clontech社製品シャトルベクターpBAC、ベクターpAc(Vemeら,Bio/Technology 6(1988)47,Pharmingen,米国)、ベクターpBlue−Bac(Invitrogen)又はベクターpBSV(Boehringer)を使用することができる。こうして相補機能はバキュロウイルスの種々の部位に挿入することができ、特に多面体の遺伝子又は遺伝子p10の遺伝子座に挿入することができる。また、AcNPV又はBombyx mori(Maedaら,Nature 315(1988)592)等の種々のバキュロウイルス株を使用することができる。他方、使用するバキュロウイルスを変異させ、その親和性を改善/変化させてもよい。実際に、(i)ウイルスタンパク質と特異的リガンド(免疫グロブリンL鎖、ガストリン放出ペプチド)の融合により短縮するか又は(ii)異種ウイルス糖タンパク質[水疱性口内炎ウイルス(VSV)のG]との偽型の形成により拡大するように表面タンパク質を修飾することにより、ウイルスベクターの親和性を調節することができる[Liuら,J.Virol 70(4)(1996)2497;Michaelら,Gene Ther.2(1995)660]。最近では、HIVウイルスのgp120に融合したバキュロウイルスの表面糖タンパク質(gp64)はCD4レセプターに固定できることが立証されている(Boublikら,Bio/Technology 13(1995)1079)。gp64のこの修飾は昆虫細胞でバキュロウイルスの生存率に影響を与えない。VSVのGを用いて同様に構築しても、バキュロウイルスの哺乳動物細胞親和性を改善し、従ってHuh7細胞や他の細胞系のトランスダクション効率を向上できると思われる。
ヘルパーバキュロウイルスでは、コンピテント細胞中で機能的な異種(即ちバキュロウイルスとは異なる起源の)プロモーターの制御下に相補機能をおくと有利である。実際に、バキュロウイルスのプロモーターから昆虫細胞以外の細胞で相補機能の十分な発現レベルは得られないと思われる。プロモーターはまずウイルスの相補機能の固有プロモーター(同種プロモーター)であり得る(アデノウイルスにはEA1、E4、E2、MLPプロモーター、AAVにはP5又はP19プロモーター、RSVにはLTRのプロモーター等)。使用するコンピテント細胞中で機能的であれば別の起源の任意プロモーターを使用できる。この点では、例えばこの細胞で発現される遺伝子のプロモーター又は公知ユビキチンプロモーター(例えばPGK遺伝子のプロモーター、CMVの極初期プロモーター、ヘルペスウイルスのTK遺伝子のプロモーター又はRSVのLTRのプロモーター)が挙げられる。調節プロモーターでもよく、例えばMMTVウイルスのプロモーター、例えばGRE5型のホルモン応答プロモーター又はテトラサイクリン(WO)により調節されるプロモーターが挙げられる。同種、強力ユビキチン又は誘導プロモーターが有利である。
従って、本発明の別の目的は、異種プロモーターの制御下におかれたウイルスの相補機能をコードする核酸をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスに関する。より詳細には、相補機能は前記ウイルスの生産に必要なタンパク質であり、そのコーディング領域は欠損ウイルスゲノム中で不活化(突然変異、欠失等)されている。アデノウイルスでは、相補機能は特にアデノウイルスのE1、E2、E4、L1〜L5、pIX及びIVa2領域単独又はその組み合わせによりコードされる機能の全部又は一部から選択される。AAVでは、Rep及び/又はCap領域によりコードされる機能であり、レトロウイルスではgag、pol及び/又はenvである。核酸は選択された相補機能をコードする領域を含むウイルスゲノムの領域に対応するものが有利である。特に、血清型Ad2もしくはAd5のアデノウイルス、MoMLV又はAAV−2のゲノムのフラグメントが挙げられる。核酸は選択される相補機能の発現に天然に関与するプロモーター領域も含むことが特に好ましい。
特定例として、本発明はアデノウイルスのE1領域の全部又は一部を含むバキュロウイルスに関する。より詳細には、E1a、E1b又はE1aとE1b領域を含むバキュロウイルスである。アデノウイルスのE1領域はAd5のヌクレオチド104(E1aプロモーター)〜4070(ポリA E1b)のレベルに局在する。特に、E1aプロモーターのTATAボックスはヌクレオチド470のレベルに局在し、E1aのATGコドンはヌクレオチド560のレベル、E1bストップコドンはヌクレオチド3511のレベルに局在する。厳密な例として391〜3511フラグメントを含むバキュロウイルスを挙げることができる。このヘルパーバキュロウイルスはこの391〜3511フラグメントよりも大きい欠失をもつE1領域欠損組換えアデノウイルスの製造に特に適している。特に、RCAがなく、383〜3512ヌクレオチド(両端を含む)の範囲のE1領域に欠失をもつ第1世代アデノウイルスの製造に適している。
本発明によるバキュロウイルスの別の特定例は例えばアデノウイルスのE1及びE4領域の全部又は一部を含む。アデノウイルスのE4領域はORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF3/4、ORF6及びORF6/7と呼ばれる7個のオープンリーディングフレームから構成される。これらの種々のORFによりコードされるタンパク質のうちでは、ORF3とORF6により生産されるタンパク質がウイルスの「複製」を可能にし、従って、完全に欠損する場合であってもE4領域を欠損するアデノウイルスのトランス相補を可能にすると思われる。従って、本発明のヘルパーバキュロウイルスはE4領域の全部又は少なくともORF3もしくはORF6フレームを含む一部のみを含むと有利である。E4領域の種々の部分は当業者に公知の方法により酵素切断により得られ、修飾してもよい。特に、オープンリーディングフレームORF6はヌクレオチド34115〜33126に対応するBglII−PvuIIフラグメントとしてE4領域から単離することができ、オープンリーディングフレームORF6−ORF6/7はAd5のゲノムのヌクレオチド34115〜32490に対応するBglII−BglIIフラグメントとしてE4領域から単離することができる。バキュロウイルスは(例えばフラグメント32800〜35826又は32811〜35614又は32811〜35640として)オープンリーディングフレームORF1〜ORF7全体を含んでいてもよい。当然のことながら、アデノウイルスゲノムの公表配列に基づいて他のフラグメントを決定することもできる。E4領域の短い単位をもつバキュロウイルスを使用すると、E4領域のより大きい欠失をもち、従って相同ゾーンのない欠損アデノウイルスゲノムのトランス相補が可能になり、組換えの可能性が全くなくなるので有利である。
第1の実施態様によると、相補機能をコードする核酸を発現カセットの形態でヘルパーバキュロウイルスに導入する。この実施態様は最も簡単に実施できる。極初期遺伝子を欠損する組換えアデノウイルスの製造と、欠損組換えレトロウイルス及びAAVの製造に特に適している。
別の実施態様によると、相補機能をコードする核酸を切除可能なカセットの形態でヘルパーバキュロウイルスに導入し、コンピテント細胞で複製分子を生成する。細胞でカセットを複製すると、相補遺伝子のコピー数を増し、システムの生産レベルを改善できるという利点がある。この実施態様は、欠損度が高く、特に構造遺伝子を欠損する組換えアデノウイルスの製造に特に適している。特に、この実施態様は「最小」アデノウイルスの製造に特に適している。実際に、構造タンパク質の量は欠損度の高いアデノウイルス(最小アデノウイルス型)を高力価で生産するのを制限している要因である。この実施態様によると、トランス相補タンパク質、特に(L1〜L5領域によりコードされる)アデノウイルスの構造タンパクの細胞内レベルを最小アデノウイルスのトランス相補に適合可能なレベルまで大幅に増加することが初めて可能になった。
このように、本願出願人は、(エピソーム型)環状複製分子を生成するように、好ましくは誘導及び調節下に細胞で切除可能な異種領域を含む組換えバキュロウイルスを構築できることを示した。
切除は部位特異的組換えメカニズムにより実施すると有利であり、細胞内の複製は細胞分裂状態から独立した複製起源によりなし遂げられる。
より好ましくは、本発明の方法により使用される部位特異的組換えは、一般にリコンビナーゼと呼ばれる特定タンパク質の存在下に組換え可能な2種の特定配列により得られる。これらの特定配列は適当な向きに配置され、バキュロウイルス内で相補機能をコードする配列の両側に配置される。従って、本発明は部位特異的組換えを可能にする2種の配列により挟まれ、順方向に配置された少なくとも1個のDNA領域をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスにも関し、前記DNA領域はコンピテント細胞で機能的な少なくとも1個の複製起点とウイルスの相補機能をコードする核酸を含む。
本発明の範囲で使用される組換えを可能にする配列は一般に5〜100塩基対、より好ましくは50塩基対未満を含む。これらの配列は種々の構造クラス、特にP1バクテリオファージのリコンビナーゼ又はトランスポゾンのリゾルベースのファミリーに分類できる。
バクテリオファージ1のインテグラーゼのファミリーに属するリコンビナーゼとしては、特にλファージのインテグラーゼ(Landyら,Science 197(1977)1147)、P22及びF80(Leongら,J.Biol.Chem.260(1985)4468)、Haemophilus influenzaeのHP1(Hauserら,J.Biol.Chem.267(1992)6859)、P1ファージのCreインテグラーゼ、プラスミドpSAM2のインテグラーゼ(EP350341)又は酵母Saccharomyces cerevisiaeのプラスミド2μmのFLPリコンビナーゼを挙げることができる。
Tnトランスポゾンのファミリーに属するリコンビナーゼとしては、特にTnトランスポゾン又はgd、Tn21及びTn522トランスポゾンのリゾルベース(Starkら,1992)、muバクテリオファージのGinインベルターゼ又はRP4のparフラグメントのリゾルベースのようなプラスミドのリゾルベース(Abertら,Mol.Microbiol.12(1994)131)を挙げることができる。
好ましい実施態様によると、本発明の組換えバキュロウイルスにおいて部位特異的組換えを可能にする配列はバクテリオファージから誘導される。バクテリオファージの付着配列(attP及びattB配列)又は誘導配列がより好ましい。これらの配列は特にインテグラーゼと呼ばれるリコンビナーゼの存在下で相互に特異的に組換えが可能である。厳密な例としては、特にファージλ、P22、F80、P1、Haemophilus influenzaeのHP1又はプラスミドpSAM2もしくは2μmの付着配列を挙げることができる。
更に好ましくは、部位特異的組換えを可能にする配列は、P1ファージの組換え系である。P1ファージはlox P部位と呼ばれる34塩基対のヌクレオチド配列を特異的に認識するCreと呼ばれるリコンビナーゼをもつ(Sternbergら,J.Mol.Biol.150(1981)467)。この配列は8bpの保存配列に分離された2個の13bpのパリンドローム配列から構成されている。LoxP配列又は誘導配列とCreリコンビナーゼを使用することにより部位特異的組換えを得ると有利である。
誘導配列なる用語は、適当なリコンビナーゼの存在下に特異的に組換えを行う能力を維持しながら、上記組換え配列の修飾により得られる配列を意味する。例えば、これらの配列の短縮フラグメントでもよいし、逆に他の配列(制限部位等)の付加により拡張したフラグメントでもよい。また、突然変異、特に点突然変異により得られる変異体でもよい。
従って、本発明の好ましい態様によると、部位特異的組換えを可能にする配列はP1バクテリオファージのLoxP配列であり、組換えはCreタンパク質の存在下に得られる。この点では、組換えはコンピテント細胞とCreリコンビナーゼの直接接触又はコンピテント細胞におけるCreリコンビナーゼをコードする遺伝子の発現により得られる。対応する遺伝子の発現の誘導により細胞でCreリコンビナーゼを生産すると有利である。例えばリコンビナーゼをコードする遺伝子を誘導プロモーターの制御下におくか、又は調節可能な形態で構築すると有利である。この点では、CreとCreの活性を調節することが可能なステロイドホルモン(エストラジオール、プロゲステロン等)の固定ドメインの融合を使用し、組換えイベントを誘導すると有利である(Metzgerら,PNAS 92(1995)6991)。より一般には、リコンビナーゼの発現は調節下又は非調節下の任意強力プロモーターにより制御することができる。発現カセットは実施例に記載するようにコンピテント細胞にトランスフェクトしてもよいし、コンピテント細胞のゲノムに組み込んでもよい。
従って、このシステムはウイルス、特にアデノウイルスの高レベルの相補機能をコンピテント細胞で生成する複製分子を作製することができる。この種の構築物は高度欠損ゲノム、特に後期遺伝子を欠損するアデノウイルスゲノムの相補に特に適している。従って、本発明の特定構築物は、順方向に配置された2個のLoxP配列に挟まれた少なくとも1個のDNA領域をそのゲノムに挿入したバキュロウイルスであり、前記DNA領域はコンピテント細胞で機能的な少なくとも1個の複製起点と、アデノウイルスの相補機能をコードする核酸を含む。相補機能はE1、E2及びE4領域に存在する極初期遺伝子の全部又は一部を含むと有利である。より好ましくは、相補機能は極初期遺伝子と後初期遺伝子の全部又は一部を含む。好ましくは、相補機能は全コーディングウイルス配列を欠失する組換えアデノウイルスの相補を可能にする。特に、相補機能はITRとパッケージング領域を除くアデノウイルスゲノム全体から構成される。特定態様によると、相補機能はパッケージング領域を欠失する以外は完全なアデノウイルスゲノム(Ad.Psi−)から構成される。このゲノムは特に、切除後にコンピテント細胞でゲノムの複製に利用されるITRを含む。
従って、エピソーム分子の複製をなし遂げるためには、エピソーム分子は使用するコンピテント細胞で機能する複製起点を含む。この複製起点は分子の大量増幅を可能にするアデノウイルスの固有ITR配列から構成されることが好ましい。好ましくはコンピテント細胞で20倍を越えるウイルスDNA増幅を可能にする別の複製起点でもよい。例えばEBVウイルスの起点OriP/EBNA1又はパピローマウイルスのE2領域を挙げることができる。当然のことながら、アデノウイルスのITR配列は好ましい実施態様を構成する。
本発明の方法を実施するためには、一般に細胞生存率をさほど損なわずに大きな細胞集団に感染することが可能な感染多重度(MOI)でヘルパーバキュロウイルスを使用する。一般に、感染多重度は特に10〜1000である。MOIは細胞1個当たりのウイルス粒子数に対応する。MOIは、使用するコンピテント細胞に応じて主に感染効率と毒性の2つの基準に基づいて当業者により容易に調整可能である。ヘルパーバキュロウイルスに使用するMOIは20〜500が有利である。
ウイルスゲノムの導入
上述のように、本発明の方法はヘルパーバキュロウイルスと組換えウイルスゲノムをコンピテント細胞に導入するものである。この点では、欠損組換えアデノウイルスのゲノムを種々の方法でコンピテント細胞に導入することができる。
まず、有利にはRCAを除去した精製欠損組換えアデノウイルスを利用できる。この場合には、コンピテント細胞に欠損組換えアデノウイルスとヘルパーバキュロウイルスを感染させる。組換えアデノウイルスの感染により、対応するゲノムをコンピテント細胞に導入することができ、その後、増幅及びパッケージングし、RCAを含まない高力価ストックを生成する。この実施態様は第1世代のウイルス(Ad−ΔE1;Ad−ΔE1,E3)を製造するのに特に有利である。実際に、これらのウイルスはRCAの汚染なしに高力価で製造するのは難しい。本発明の方法によると、第1世代の欠損組換えアデノウイルスから出発し、E1領域を含むバキュロウイルスと共にコンピテント細胞に同時感染することにより、高品質の濃縮ストックを得ることが可能になった。この実施態様はそのゲノムの2又は3個の主要領域(特にE1、E2、E4)を欠損するウイルスの製造にも有利である。一般に、この実施態様はアデノウイルス感染効率が非常に高く(DNAトランスフェクション効率を上回る)、従って濃縮ストックを生成できるので有利である。この実施態様では、細胞生存率をさほど損なわずに大きい細胞集団に感染可能な感染多重度(MOI)で組換えアデノウイルスと組換えバキュロウイルスを使用することができる。バキュロウイルスに使用するMOIは上記の通りである(10〜1000)。アデノウイルスについては、1〜1000が有利であり、好ましくは1〜500、より好ましくは1〜100である。アデノウイルスに使用するMOIは選択する細胞型によっても異なる。MOI範囲は例えば別個のマーカー遺伝子を含むバキュロウイルスとアデノウイルスを使用して感染効率と競合を測定することにより、当業者により容易に決定することができる。より好ましくは、アデノウイルスのMOIは50未満、例えば1〜20である。
特に有利な実施態様によると、欠損組換えアデノウイルスのゲノムをDNAとして導入する。この場合には、場合によりトランスフェクションを助長する物質(脂質、リン酸カルシウム等)の存在下でトランスフェクションによりゲノムを導入する。このように導入する組換えゲノムは種々の技術によりin vitro作製することができ、特に大腸菌(WO96/25506)又は酵母(WO95/03400)で作製できる。この実施態様はRCAのない第1世代の欠損組換えウイルスを製造するのに特に有用であり、その後、前記実施態様により高力価ストックを製造するために使用することができる。
別の組換えバキュロウイルスを使用することにより欠損組換えアデノウイルスのゲノムを導入することもできる。この実施態様によると、例えば上述のように欠損組換えアデノウイルスのゲノムを作製した後、コンピテント細胞で切除可能なカセットの形態でバキュロウイルスに導入する。この実施態様によると、欠損組換えアデノウイルスのゲノムをもつバキュロウイルスと(相補機能をもつ)1個以上のヘルパーバキュロウイルスの存在下にコンピテント細胞をおく。この実施態様は高度欠損組換えアデノウイルスの製造に特に有利である。このシステムによると、実際に高度欠損組換えゲノムと対応する相補機能をコンピテント細胞集団に同時に多量に導入することができる。
従って、この点では、本発明の方法は欠損組換えアデノウイルスのゲノムをもつバキュロウイルスと、相補機能をもつ1個以上のヘルパーバキュロウイルスをコンピテント細胞に同時感染するものである。この実施態様で使用するMOIも、使用するバキュロウイルスの各々について10〜1000である。
従来技術では最小アデノウイルスの製造に、(1)ITR間にクローニングし、固有制限部位により挟まれた導入遺伝子(β−ガラクトシダーゼ)又は(2)導入遺伝子の5’に順方向にクローニングした右及び左ITRの2種の構築が実施されている(Fisherら,Virology 217(1996)11;Kumar−Singhら,Hum.Mol.Genet.5(1996)913)。最小アデノウイルスは直鎖状(1)又は環状(2)DNAのトランスフェクションにより293細胞で生産されており、ミニゲノムの複製及びパッケージングに必要なウイルスタンパク質はヘルパーウイルス(AdΔE1)によりトランス導入される。最小アデノウイルスは干渉欠損(ID)粒子として挙動し、連続継代中に漸進的に増幅される。この方法の使用による主な問題は、ヘルパーウイルスによるストックの汚染の原因となる2種の生成粒子の分離と、こうして得られる最小アデノウイルスの力価が非常に低い(108pfu/ml未満)ことである。
本発明によると、アデノウイルスミニゲノムを送達するためのバキュロウイルスと、トランス相補機能全体(相補ゲノム)を導入するためのバキュロウイルスを使用することにより、最小アデノウイルスをを製造することが初めて可能になった。
組換えアデノウイルスゲノムはヘルパーバキュロウイルスについて記載したように、コンピテント細胞で部位特異的組換えを可能にする2つの配列の間でバキュロウイルスに導入すると有利である。
本発明は特に、loxP/Cre系によりアデノウイルスミニゲノムを送達するためのバキュロウイルスと、同様にCre/loxP系によりトランス相補機能全体(相補ゲノム)を導入するためのバキュロウイルスを使用する最小アデノウイルスの製造システムに関する(図2〜4参照)。
別の実施態様によると、相補機能を送達するために使用する部位特異的組換えシステムは組換えアデノウイルスのゲノムを送達するために使用するシステムと異なる。特に、欠損アデノウイルスゲノムを送達するためにLoxP/Cre系を使用し、相補機能を送達するためにAttP/AttB系を使用することができる。
従って、本発明の方法は、全コーディングウイルス配列を欠失し、ITRとパッケージングシグナルのみを含むアデノウイルスベクター(最小アデノウイルス)を構築することができる。このベクターは理論的には37kbまでの外来配列を含むことができるが、実際のベクターのクローニング能は8.5kb以下である。従って、それらの全調節エレメント(プロモーター、エンハンサー、イントロン等)を使用してジストロフィン遺伝子(14kb)等の大きい寸法の遺伝子をクローニングすることができ、標的組織で最適発現が得られる。更に、免疫原ウイルス配列が全く存在しないため、休止組織で導入遺伝子の発現期間を延ばすことができる。
欠損AAV又はレトロウイルスのゲノムも上記方法によりウイルス、ゲノム又はプラスミドとして導入することができる。
コンピテント細胞
本発明の方法は種々の細胞で実施することができる。本発明の意味で「コンピテント細胞」とは、バキュロウイルスと製造しようとするウイルスの感染が可能であり、後者の生産ウイルス周期を可能にする細胞を意味する。細胞のこれらのウイルスの感染能は、大腸菌のLacZ遺伝子等のマーカー遺伝子を発現する組換えウイルスを使用することにより決定することができる。このような細胞としては哺乳動物細胞が好ましく、ヒト起源の細胞がより好ましい。使用するコンピテント細胞は休止細胞でも活性分裂細胞でもよく、樹立細胞系でも一次培養物でもよい。工業用途に適合可能な哺乳動物細胞、即ち病原性が認められず、培養可能であり、場合により適当な条件下で保存可能なものが有利である。使用する細胞は肝、筋、繊維芽、胚、神経、上皮(肺)又は眼(網膜)細胞が有利である。非限定的な例として、293細胞もしくは補助相補機能を含む任意誘導細胞(293E4、293E2a等)、A549細胞、HuH7細胞、Hep3B細胞、HepG2細胞、ヒト網膜芽細胞(HER、911)、HeLA細胞、3T3細胞又はKB細胞を挙げることができる。
本発明の方法を実施するためには、組換えウイルスのゲノムとバキュロウイルスを同時又は時間的に間をおいてコンピテント細胞集団に導入することができる。細胞を組換えゲノムとヘルパーバキュロウイルスに同時に接触させると有利である。複製分子をin vivo生成するシステムの場合には、リコンビナーゼを前以て、同時又は後で導入又は発現させる。
ウイルスが生産されると、一般に細胞が溶解する。従って、生産されたウイルスは細胞溶解後に公知精製法により回収することができる。その後、目的用途に応じて種々の方法でパックすることができる。また、場合によりコンピテント細胞に浸透しなかった微量のバキュロウイルス(ヘルパーバキュロウイルス又は組換えウイルスゲノムを導入するバキュロウイルス)によるウイルスストックの汚染の危険を避けるためには、次の方法を適用することができる。
−出願FR96/08164に記載の方法に従い、クロマトグラフィーによりアデノウイルスを精製することができる。この方法は場合により残留するバキュロウイルスからアデノウイルスを完全に分離することができる。
−有機溶剤(例えばエーテル、クロロホルム)を精製アデノウイルスストックに作用させてもよい。実際に、バキュロウイルスはエンベロープ(糖タンパクエンベロープ)をもつウイルスであるため、(そのエンベロープから脂質を抽出する)全有機溶剤に非常に感受性であるが、アデノウイルスはエンベロープをもたないので、同一溶剤の作用が全くない。
−CsCl勾配精製により場合により残留するバキュロウイルスと組換えウイルスを密度により分離することもできる。
これらの3種の方法は独立して使用してもよいし、併用してもよい。更に、当業者に公知の他の任意の方法も使用することができる。
ウイルスの使用
こうして製造したウイルスはin vitro、ex vivo又はin vivo遺伝子クローニング、導入及び発現に使用することができる。このような目的遺伝子は例えば酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン(例えばインターロイキン、インターフェロン、TNF等)(FR9203120)、成長因子、神経伝達物質又はその前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子(例えばBDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等)、アポリポタンパク質(例えばApoAI、ApoAIV、ApoE等)(WO94/25073)、ジストロフィン又はミニジストロフィン(WO93/06223)をコードする遺伝子、腫瘍抑制遺伝子(例えばp53、Rb、Rap1A、DCC、k−ref等)(WO94/24297)、因子VII、VIII、IX等の凝血関与因子をコードする遺伝子、自殺遺伝子(例えばチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ等)、更には天然又は人工免疫グロブリン(Fab、ScFv等、WO94/29446)の全部又は一部等を挙げることができる。目的遺伝子は標的細胞で発現されると遺伝子の発現又は細胞mRNAの転写を制御することが可能なアンチセンス遺伝子又は配列でもよい。このような配列はヨーロッパ特許第140308号に記載の方法に従い、例えば標的細胞で細胞mRNAの相補的RNAに転写すると、そのタンパク質翻訳を阻止することができる。目的遺伝子はワクチン製造の目的では、免疫応答を生じることが可能な抗原性ペプチドをコードする遺伝子でもよい。このような遺伝子としては特に、エプスタイン−バールウイルス、HIVウイルス、B型肝炎ウイルス(EP185573)、疑狂犬病ウイルスの特異抗原ペプチド、又は腫瘍特異抗原ペプチド(EP259212)が挙げられる。遺伝子は目的産物をコードする任意DNA(gDNA、cDNA等)であり得、場合により適当な発現シグナル(プロモーター、ターミネーター等)を含む。
これらのウイルスはこれらの組換えタンパク質の製造にin vitro使用することができる。これらのタンパクの作用メカニズムを研究するため又は遺伝子発現もしくはプロモーター活性の調節を研究するためにin vitro使用することもできる。動物モデル又はトランスジェニック動物の作出のためにin vivoで使用することもできる。遺伝子又は細胞治療アプローチで動物又はヒトに遺伝子をin vivo導入及び発現させるためにも使用することができる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は単に例示であり、発明を限定するものではない。
図面の説明
図1:baculo−E1,E4を使用した第3世代欠損組換えアデノウイルス(E1及びE4機能を欠損)の製造スキーム。
図2〜4:欠損アデノウイルスゲノムを導入するための第1のバキュロウイルスと相補機能を導入するための第2のバキュロウイルスを使用した最小アデノウイルスの製造スキーム。
図5:baculo−Rep/Capを使用したRep及びCap機能を欠損する組換えAAVの製造スキーム。
実施例
1.使用した細胞
本発明の範囲で使用する細胞はアデノウイルス、AAV又はレトロウイルスとバキュロウイルスにより感染可能であり、治療目的の使用に適合可能な任意細胞系又は細胞集団に由来するものを利用できる。哺乳動物、特にヒト細胞が好ましい。特に以下の細胞を挙げることができる。
−293系細胞
293系はアデノウイルス血清型5(Ad5)のゲノムの左側末端(約11〜12%)を含むヒト胎児腎細胞系であり、左側ITR、パッケージング領域、E1a,E1bを含むE1領域、pIXタンパク質をコードする領域及びpIVa2タンパク質をコードする領域の一部を含む(Grahamら,J.Gen.Virol.36(1977)59)。この系はE1領域を欠損即ちE1領域の全部又は一部を欠失する組換えアデノウイルスをトランス相補することができ、高力価をもつウイルスストックを生産することができる。
−A549系細胞
アデノウイルスのE1領域を相補する細胞をA549細胞から構築した(Imlerら,Gene Ther.(1996)75)。これらの細胞は、誘導プロモーターの制御下におかれたE1領域から左側ITRを除去したフラグメントを含む。
−HER系細胞
ヒト胎児網膜細胞(HER)はアデノウイルスにより感染可能である(Byrdら,Oncogene 2(1988)477)。これらの細胞から作製したアデノウイルスパッケージング細胞は例えば国際出願WO94/28152又はFallauxらの論文(Hum.Gene Ther.(1996)215)に記載されている。具体的には、HER細胞のゲノムに組み込まれたヌクレオチド79〜ヌクレオチド5789のアデノウイルスAd5のゲノムのE1領域を含む911系を挙げることができる。この細胞系はE1領域を欠損するウイルスを生産することができる。
−IGRP2細胞
IGRP2細胞は誘導プロモーターの制御下のE4領域の機能ユニットを組み込むことにより293細胞から得られる細胞である。これらの細胞はE1及びE4領域を欠損するウイルスを生産することができる(Yehら,J.Virol(1996)70)。
−VK細胞
VK(VK2−20及びVK10−9)細胞は誘導プロモーターの制御下のE4領域全体とpIXタンパク質をコードする領域を組み込むことにより293細胞から得られる細胞である。これらの細胞はE1及びE4領域を欠損するウイルスを生産することができる(Krougliakら,Hum.Gene Ther.6(1995)1575)。
−293E4細胞
293E4細胞はE4領域全体を組み込むことにより293細胞から得られる細胞である。これらの細胞はE1及びE4領域を欠損するウイルスを生産することができる(WO95/02697;Cancer Gene Ther.(1995)322)。
−Sf9及びSf21細胞は鱗翅目胚細胞である。これらの細胞は寄託菌(No.CRL−1711 ATCC)とその培養条件で入手できる。市販品もある(Gibco)。KingとPossee:The baculovirus expression system,London:Chapman & Hall,1992も参照されたい。
−ヒト肝細胞
HepG2及びHep3B及びHuH7細胞は肝細胞癌に由来するヒト細胞系である。これらの細胞は寄託菌から入手でき、その性質は例えば米国特許第4,393,133号及び4,393,133号に記載されている。
−ヒトKB細胞系:ヒト上皮癌に由来し、ATCC(CCL17)及びその培養条件から入手可能である。
−ヒトHela細胞系:ヒト上皮癌に由来し、ATCC(CCL2)及びその培養条件から入手可能である。
−W162細胞系:これらの細胞はアデノウイルスAd2のE4領域をそのゲノムに組み込んだvero細胞である。これらの細胞はWeinbergら(PNAS80(1983)5383)により記載されている。
2.ヒト細胞の組換えバキュロウイルス感染
本実施例はバキュロウイルスのヒト起源細胞への感染能に関する。
RSVのLTRの制御下にLacZ遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスの溶液の種々の希釈液をヒト細胞(特に293又はその誘導体)に感染させる。感染から48時間後に青色細胞の出現が認められ、これらの細胞にバキュロウイルスを感染できることが判明する。
3.アデノウイルスのE1領域を発現するバキュロウイルスおよび対応する欠損アデノウイルスの構築
3−1 2種のE1発現カセットのクローニング
プラスミドAE2はオリゴヌクレオチド5’−TCCTTGCATTTGGGTAACAG−3’及び5’−GCGGCCGCTCAATCTGTATCTTC−3’を用いてpBRE31で実施したPCRの産物をPCRII(Invitrogen)にクローニングすることにより得られ、このPCR産物はAd5のヌクレオチド3198〜3511即ちE1B領域の3’末端を含む。プラスミドpBRE1はほぼヌクレオチド1300〜2300を欠失するpBR322にクローニングしたAd5のヌクレオチド1〜5788を含む。
プラスミドAE3はpCDNA3(Invitrogen)をNotI−KpnIで消化し、PCR産物を含むAE2のNotI−KpnIフラグメントをクローニングすることにより得られる。AE3はAd5のヌクレオチド3198〜3511とそれに後続するBGHのポリアデニル化部位を含む。
プラスミドAE4はpBRE1にAE3のBglII−PvuIIフラグメントをクローニングすることにより得られる。AE4は以下のE1発現カセットを含むプラスミドである。
−Ad5のヌクレオチド1〜3511、即ち左側ITR、パッケージング配列、E1Aプロモーター、E1A遺伝子、E1Bプロモーター、E1B遺伝子、
−pCDNA3に由来するウシ成長ホルモン(BGH)のポリA。
pBRE1をBstNIで消化した後、T4 DNAポリメラーゼで消化して5’付着末端を平らにした後、XbaIで消化した。こうして作製したAd5のヌクレオチド391〜1339を含むフラグメントをSmaI−XvaI(非メチル化部位)で消化したpic20Hに導入し、プラスミドAE5を作製した。
プラスミドAE6はEcoRI−SmaIで消化したAE4にAE5のEcoRI−SmaIフラグメントをクローニングすることにより得られる。AE6は以下のE1発現カセットを含むプラスミドである。
−Ad5のヌクレオチド391〜3511、即ちE1Aの「短縮」プロモーター、E1A遺伝子、E1Bプロモーター、E1B遺伝子、
−pCDNA3に由来するウシ成長ホルモン(BGH)のポリA。
3−2 前記2種のE1カセットのバキュロウイルスクローニング
プラスミドAE4及びAE6の(付着5’末端SphIをT4 DNAポリメラーゼ消化により予め平滑にしておいた)EcoRI−SphIフラグメントをプラスミドpAcSG2(Pharmingen)のEcoRI及びEcoRV部位間にクローニングする。こうして夫々プラスミドAE14及びAE15を作製する。いずれの場合も、多面体遺伝子の遺伝子座にE1領域を導入する。
プラスミドAE14及び15をAcNPV株(Pharmingen)に由来するバキュロウイルスBaculoGoldのDNAと共に昆虫細胞Sf9に同時トランスフェクトし、多面体の遺伝子の遺伝子座に組み込まれた2種のE1発現カセットをもつ対応する2種の組換えバキュロウイルスBacAE14及びBacAE15を作製する。
3−3 新規E1欠失をもつ組換えアデノウイルスのクローニング
プラスミドpCO1(WO96/10088)をBstXIで消化した後、T4 DNAポリメラーゼで消化して付着3’末端を除去した後、RsaIで消化した。こうして作製されたAd5のヌクレオチド3513〜4607を含むフラグメントを、EcoRVで直鎖化してウシアルカリホスファターゼで消化しておいたpBS−SK+(Stratagene)に導入し、プラスミドAE0を作製した。
プラスミドpMA37は以下のフラグメントの連結により得られる。
−sacBを含むpXL2756のEcoRV−NsiIはそのEcoRI及びKpnI部位を除去した逆選択遺伝子SacBと、カナマイシン耐性遺伝子と、クローニング多重部位と、ColE1複製起点をもつ。
−(アデノ配列を含む)pCO1のNdeI−NsiI。
−pXL2756(カナマイシン耐性ベクター)のSalI(T4 DNAポリメラーゼにより平らにした付着5’末端)−AseI。
従って、pMA37は、
−カナマイシン耐性遺伝子と、
−これを発現する細菌にスクロース感受性を付与するSacB遺伝子と、
−Ad5の1〜382配列(HinfI)とそれに続くAd5の3446〜4415配列(NsiI)を含み、導入遺伝子は存在しない。
SalI−NsiIで消化したpMA37にAE0のXhoI−NsiIフラグメントを導入することによりプラスミドAE11を構築した。従って、このプラスミドは、
−カナマイシン耐性遺伝子と、
−これを発現する細菌にスクロース感受性を付与するSacB遺伝子と、
−Ad5の1〜382配列(HinfI)とそれに続くAd5の3513〜4415配列(NsiI)を含み、導入遺伝子は存在しない。
次に、プラスミドAE11から(目的導入遺伝子の挿入により)大腸菌で組換えにより組換えアデノウイルスの構築を可能にする自殺シャトルベクターを構築する。AE11はプラスミドAE6と相同の配列を含まない。プラスミドAE11及びAE4は共通してE1Aの上流にAd5の1〜382配列(Hinf)を含むが、これらの2種のプラスミド間でE1カセットの下流に相同は存在しない。従って、AE11に存在するE1欠失(即ち382〜3513)をもつアデノとバキュロウイルスBacAE14又はBacAE15の間の相同組換えによりRCAが発生する可能性はない。
3−4 第1世代組換えアデノウイルスの構築
まず、慣用技術に従ってBacAE14又は15のストックを調製する。次に、PacIで消化したプラスミドpXL2822(プラスミドpXL2822は完全Ad5からE1(382〜3446又は382〜3513)とE3(28592〜30470)を欠失し、カセットCMV−βGalをもつ)5gをコンピテント細胞(例えばHuH7)にトランスフェクトし、同時又は非同時に、MOI 10〜1000でBacAE14又は15を感染させる。細胞が溶解したら、トランスフェクション上清を回収し、その後、予め又は同時にBacAE14又は15(MOI 10〜1000)を感染させた「新規」コンピテント細胞に加えてアデノウイルスAd2822を増幅し、Ad2822のストックが得られるまで同様に操作する。Ad2822の増幅のモニターはこのウイルスにおけるlacZの存在によりできる。各増幅毎に上清をW162で疑似力価測定する。増幅時にウイルスのゲノムを分析し、その完全性を確認する。最後に、このストラテジーは、こうして製造したアデノウイルスストックにRCAを生じる可能性がないという利点がある。この汚染の不在も確認する。
4.アデノウイルスのE1及びE4領域を発現するバキュロウイルスの構築
4−1 バキュロウイルスE1,E4(Bac.E1−E4)の構築
以下のプロトコールを使用する。シャトルベクターpBacPAK8(Clontech,米国)の多面体の遺伝子(Ph)の遺伝子座にE1及びE4領域を逆向きにクローニングし、pBacE1−E4を得る。次に、慣用技術によりpBacE1−E4とバキュロウイルスBacPAK6のDNAをSf9細胞にコトランスフェクトすることにより組換えバキュロウイルスを単離する(KittsとPossee,Biotechniques 14(5)(1993)810)。次に、感染Sf9細胞からPCRにより組換えバキュロウイルスのゲノム中のE1及びE4の存在を確認する。精製組換えバキュロウイルスを感染させたHuh7細胞へのE1及びE4の転写を細胞質RNAからRT−PCRにより分析する。
バキュロウイルスE1−E4を構築するためには、E1をもつ種々のフラグメントを導入することができる。本実施例で使用するフラグメントはバキュロウイルス−E1の構築に関して実施例3に記載したものであり、適正なプロモーター(短縮E1aプロモーター及びE1bプロモーター)に制御下のE1領域を含む。使用するE4フラグメントは以下の通りである。
−完全なE4をもつMaeII−MscI 32720〜35835フラグメント、
−ORF6をもつBglII−PvuII 34115〜33126フラグメント、
−ORF6−ORF6/7をもつBglII−BglII 34115〜32490フラグメント、
−ORF3をもつPvuII−AluI 34801〜334329フラグメント。
これらのフラグメントはE4プロモーターの制御下においてもよいし、他のプロモーター、特にHSV−TK、CMV又はLTR−RSVプロモーターの制御下においてもよい。
上記位置はデータベースから入手可能なアデノウイルスAd5の公表配列に基づく。種々の血清型のアデノウイルスには多少の相違が存在する場合もあるが、これらの位置は一般に他の血清型、特にAd2、Ad7、Ad12及びAdCAV−2にも適用できる。
4−2 Bac.E1−E4によるAdΔE1ΔE4−LacZのトランス相補
アデノウイルスAdΔE1ΔE4−LacZの生産は、実施例4−1で調製したバキュロウイルスE1,E4とE1及びE4を欠損するアデノウイルスゲノムをコンピテント細胞に導入することにより得られる(図1参照)。精製Bac.E1−E4のトランス相補によるコンピテント細胞におけるAdΔE1ΔE4−LacZの最適生産条件を分析する。W162系におけるβ−ガラクトシダーゼのトランスダクション単位(t.d.u.)数としてAdΔE1ΔEの力価を測定し、得られたトランスン相補効率をパッケージング系IGRP2の効率と比較する。
5.アデノウイルスのゲノムの全体を相補するバキュロウイルスの構築
13kbまでの配列に相当し得る数種のタンパク質を単一ウイルスから同時発現することは報告されている(BelyaevとRoy,NAR 21(1993)1219)が、バキュロウイルスの最大クローニング能は十分に実証されていない。本実施例は、パッケージングシグナルを欠失し(Ad.Psi−)、2個のLoxP部位で挟まれたアデノウイルス(loxP−ITR−ITR〜E4−loxP)のゲノムをバキュロウイルスにクローニングできることを立証する。Creリコンビナーゼを誘導的又は非誘導的(Cre又はCre−ER系、実施例7参照)に発現するコンピテント細胞にこの組換えバキュロウイルスを感染させ、Creリコンビナーゼを活性化させると、アデノウイルスゲノムの切除と環化が可能になる。以後、アデノウイルスゲノムは初期遺伝子の導入、複製、後期遺伝子の活性化が可能になるが、パッケージングはできないので最小アデノウイルスの製造用ヘルパーとして利用する(図2〜4参照)。このシステムでは、2種のバキュロウイルスのコインフェクションと、loxP部位間の2回の組換えイベントの実施により最小アデノウイルスを製造する。このアプローチは、ヘルパーウイルスからアデノウイルス粒子を生成しないという利点がある。
ゲノムAd.Psi−の構築は大腸菌で実施する。このために、アデノウイルスAd5の完全ゲノムを原核クローニングベクターにクローニングし、ITRを結合する。酵素開裂と連結又は部位特異的突然変異誘発によりPsi配列を除去する。次に、アデノウイルスゲノムの両側に同じ向きにLoxP配列を導入する。得られた構築物[loxP−ITR−ITR,ΔPsi〜E4−loxP]を次に、実施例3に記載したストラテジーに従ってバキュロウイルスとの組換えを可能にするシャトルベクターにクローニングする。その後、得られた組換えバキュロウイルスBacAd.Psi−を慣用方法により単離する。
6.切除可能な形態で欠損組換えアデノウイルスのゲノムを含むバキュロウイルスの構築
本実施例は欠損組換えアデノウイルスのゲノムをコンピテント細胞に導入することが可能なバキュロウイルスの構築に関する。より詳細には、組換えアデノウイルスはコーディング領域全体を欠損し、ITR及びPsi領域のみを保存している(最小アデノウイルス又はAdΔ)。
6−1 大腸菌におけるミニゲノム(AdΔ)の構築
プラスミドP[loxP−(ITR−ITR−Psi−P.CMV−LacZ−pA)−loxP]を構築する。このために、アデノウイルスのITR配列のコピーを酵素切断により単離及び/又はPCRにより増幅した後、アデノウイルスのシャトルベクターpGY63に含まれるITR−Psi配列の上流にクローニングする。このベクターはpCO1(WO96/10088)に由来し、ITR−Psi配列とpIXをコードする遺伝子の間にクローニングしたSV40ウイルスのポリアデニル化シグナル(pA)を末端にもつサイトメガロウイルスの極初期プロモーター(P.CMV)の制御下のLacZ遺伝子をもつ。次に、(最小アデノウイルスのゲノムに対応する)このベクターの(ITR−ITR−Psi−P.CMV−LacZ−pA)領域を酵素切断により単離した後、プラスミドpBS246(Gibco)のクローニング多重部位のLoxP部位間にクローニングし、プラスミドp[loxP−(ITR−ITR−Psi−P.CMV−LacZ−pA)−loxP]を作製する。次に、Creリコンビナーゼ(AdCre)を発現するAd.ΔE1ΔE4を感染させたIGRP2系にこのプラスミドをトランスフェクトすることにより、環状DNAからアデノウイルスのミニゲノムを生産してパッケージングする能力を試験する。IGRP2系でトランスフェクション上清を数世代連続継代することにより、最小アデノウイルスを増幅する。その後、塩化セシウム勾配等密度遠心分離により精製し、W162系で偽滴定により定量する。当然のことながら、慣用分子生物学技術により、LacZ遺伝子を他の任意の目的核酸に容易に置き換えることができる。
6−2 切除可能なミニゲノムのバキュロウイルスクローニング
2つのloxP部位に挟まれた上記ミニゲノムAdΔをもつ構築物をシャトルベクターpAcUW1(Pharmingen,米国)でバキュロウイルスのP10遺伝子座にクローニングする。次に、バキュロウイルスBac.AdΔを生産し、上記Sf9細胞で慣用同時トランスフェクション技術により単離し、X−Gal染色後にプラーク表現型(白色)により選択する。従って、このバキュロウイルスは順方向に2つのloxP領域により挟まれた高度欠損アデノウイルスゲノムをもつ。
6−3 バキュロウイルスBacAdPsi−のトランス相補によるAdΔの生産。
アデノウイルスゲノム全体のトランス相補機能をもつバキュロウイルスBacAd.Psi−(実施例5に記載)と、(上記)偽アデノウイルスのゲノムをもつバキュロウイルスBac.AdΔをコンピテント細胞に同時にコンイフェクトする。培地にタンパク質を加えるか、又はCreを発現するプラスミドもしくはウイルス(バキュロウイルス)を細胞にトランスフェクトするか、又は(実施例7に記載するような)系のゲノムに安定に組み込んだカセットの発現によりCreリコンビナーゼを導入する。BacAd.Psi−と上清をコインフェクトした細胞の培養上清の連続継代により最小アデノウイルスを増幅した後、上記技術により精製及び滴定する。この方法によるとAdΔを単独ウイルスとして得られるので、慣用技術によりこれを単離及び精製すればよい。更に、得られる力価は工業用途に適合可能である。
7.Creタンパク質を発現する系の構築
誘導的又は非誘導的にCreを発現する系を構築し、本発明のバキュロウイルス(例えばBac.AdΔ及びBacAd.Psi−)におけるloxP部位間の組換え効率を増加すると共に、Creの発現を制御する。この構築物において、Creは誘導的又は非誘導的で好ましくは強力なユビキチンプロモーターの制御下に、エストラジオールレセプター(ER)結合ドメインとのC末端融合タンパク質として又は単独で発現される。より詳細には、使用するプロモーターはpGRE5プロモーター、メタロチオニンプロモーター、SV40プロモーター又はHSV−TK遺伝子のプロモーターである。
これらのCre系を構築するために、Cre発現カセット(Cre又はCre−ER)を含むプラスミドと、選択マーカー(Neo)のプラスミドの2種のプラスミドをコンピテント細胞にコトランスフェクトする。G418耐性クローンを選択し、これらのクローンにおけるCreの活性をプラスミドp(P.CMV−loxP−ATG−stop−pA−LoxP−LacZ)のコトランスフェクションにより試験する。このプラスミドは、3個のオープンリーディングフレームにおける一連のストップコドンと、2個のloxP部位に挟まれたSV40ウイルスの転写開始及びポリアデニル化シグナルをプロモーター(P.CMV)とLacZの始点の間に導入することにより不活化したLacZ遺伝子を含む。次に、2個のloxP部位間の組換えにより誘導したβ−ガラクトシダーゼ活性によりインデューサー(エストラジオール)の存在下又は不在下でのクローンにおけるCreの発現を試験する。こうして上記プロモーター及びコンピテント細胞から融合タンパク質Cre−ER又はCreタンパク質単独を安定に発現する数個のクローンを選択する。これらのクローンは本発明によるウイルスの製造に使用可能である。
Figure 0004686670

Claims (42)

  1. 欠損組換えウイルスのゲノムと、欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスを、in vitroにおいて肝細胞集団であるコンピテント細胞集団に導入することを特徴とする欠損組換えウイルスの製造方法であって、該欠損組換えウイルスがアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択される欠損組換えウイルスである、欠損組換えウイルスの製造方法
  2. バキュロウイルスが欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
  3. バキュロウイルスが欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の一部を含み、残りの部分はコンピテント細胞により相補されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
  4. 欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能が数種のバキュロウイルスにより導入されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
  5. 相補機能をもつバキュロウイルスとは異なる組換えバキュロウイルスと共に欠損組換えゲノムを細胞に導入することを特徴とする請求項1に記載の方法。
  6. 欠損組換えウイルスが欠損組換えアデノウイルスであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
  7. 欠損組換えゲノムを含むアデノウイルスの感染により前記ゲノムを細胞に導入することを特徴とする請求項6に記載の方法。
  8. 欠損組換えゲノムをトランスフェクションにより細胞に導入することを特徴とする請求項6に記載の方法。
  9. 組換えアデノウイルスのゲノムがE1、E2、E3、E4、L1〜L5、pIX及びIVa2から選択される1種以上の機能を欠損しており、バキュロウイルスが欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部を含むことを特徴とする請求項6に記載の方法。
  10. 組換えアデノウイルスのゲノムがE1、E2、E3、E4、L1〜L5、pIX及びIVa2から選択される1種以上の機能を欠損しており、バキュロウイルスが欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の一部を含み、残りの部分は1種以上の他のバキュロウイルス及び/又はコンピテント細胞により導入されることを特徴とする請求項6に記載の方法。
  11. 欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスがアデノウイルスのE1領域の全部又は一部を含み、E1領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相補を可能にすることを特徴とする請求項6に記載の方法。
  12. 欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスがアデノウイルスのE2領域の全部又は一部を含み、E2領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相補を可能にすることを特徴とする請求項6に記載の方法。
  13. 欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスがアデノウイルスのE4領域の全部又は一部を含み、E4領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相補を可能にすることを特徴とする請求項6に記載の方法。
  14. 欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスがアデノウイルスのE1及びE4領域の全部又は一部を含み、E1及びE4領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相補を可能にすることを特徴とする請求項6に記載の方法。
  15. 組換えアデノウイルスのゲノムがアデノウイルスのコーディング領域全体を欠失しており、欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスアデノウイルスゲノムのコーディング領域全体を含むことを特徴とする請求項6に記載の方法。
  16. バキュロウイルスがパッケージング領域を除き、アデノウイルスゲノムの全体を含むことを特徴とする請求項15に記載の方法。
  17. バキュロウイルスがパッケージング領域とITRを除き、アデノウイルスゲノムの全体を含むことを特徴とする請求項15に記載の方法。
  18. バキュロウイルスと欠損組換えウイルスのゲノムに存在する相補機能が組換えを生じる可能性のある相同ゾーンを含まないことを特徴とする請求項1に記載の方法。
  19. E1領域を欠く組換えアデノウイルスゲノムをコンピテント細胞に導入し、これらの細胞に同時又は非同時にE1領域を含むバキュロウイルスを感染させることを特徴とする請求項18に記載の方法であって、バキュロウイルスに含まれるアデノウイルスE1領域と欠損組換えアデノウイルスのゲノムは組換えを起こすことができる相同ゾーンを含まないものである請求項18に記載の方法。
  20. E1及びE3領域を欠く組換えアデノウイルスゲノムをコンピテント細胞に導入し、これらの細胞に同時又は非同時にE1領域を含むバキュロウイルスを感染させることを特徴とする請求項18に記載の方法であって、バキュロウイルスに含まれるアデノウイルスE1領域と欠損組換えアデノウイルスのゲノムは組換えを起こすことができる相同ゾーンを含まないものである請求18に記載の方法。
  21. バキュロウイルスがアデノウイルスAd5の391〜3511フラグメントを含み、E1領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムがアデノウイルスAd5の391〜3511フラグメントより大きい欠失をもつことを特徴とする請求項19に記載の方法。
  22. バキュロウイルスがアデノウイルスAd5の391〜3511フラグメントを含み、E1領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムがヌクレオチド383〜3512(両端を含む)をカバーする欠失をもつことを特徴とする請求項21に記載の方法。
  23. バキュロウイルスに対して異種であるプロモーターの制御下におかれた、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択される欠損ウイルスの相補機能をコードする核酸をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルス。
  24. 相補機能がアデノウイルスのE1、E2、E4、L1〜L5、pIX及びIVa2領域単独又はその組み合わせによりコードされる機能の全部又は一部から選択されることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
  25. 相補機能がAAVのRep及びCap領域単独又はその組み合わせによりコードされる機能の全部又は一部から選択されることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
  26. 相補機能がレトロウイルスのgag、pol及びenv領域単独又はその組み合わせによりコードされる機能の全部又は一部から選択されることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
  27. 相補機能をコードする核酸が血清型Ad2又はAd5のアデノウイルスのゲノムのフラグメントに対応するDNAから構成されることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
  28. プロモーターが相補機能の発現に天然に関与するプロモーター領域により構成されることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
  29. プロモーターが調節又は非調節下の強力な細胞又はウイルスプロモーターであることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
  30. 相補機能がアデノウイルスゲノムのE1領域又は少なくともE1a領域を含む前記領域の一部のみを含むことを特徴とする請求項24に記載のバキュロウイルス。
  31. 相補機能がアデノウイルスゲノムのE4領域又は少なくともORF3もしくはORF6を含む前記領域の一部のみを含むことを特徴とする請求項24に記載のバキュロウイルス。
  32. アデノウイルスゲノムのコーディング領域全体を含むことを特徴とする請求項24に記載のバキュロウイルス。
  33. パッケージング領域を除き、完全アデノウイルスゲノムを含むことを特徴とする請求項32に記載のバキュロウイルス。
  34. AcNPV株であることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
  35. 核酸が多面体の遺伝子座又はp10遺伝子座に導入されていることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
  36. 核酸がコンピテント細胞で切除可能なカセットの形態で導入されていることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
  37. 順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする2つの配列に挟まれた少なくとも1個のDNA領域をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスであって、前記DNA領域がコンピテント細胞で機能的な少なくとも1個の複製起点と、欠損組換えウイルスの相補機能をコードする核酸を含む前記バキュロウイルスであって、該欠損組換えウイルスがアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択される欠損組換えウイルスであって、かつ当該部位特異的組換えを可能にする配列がP1バクテリオファージのLoxPであり、かつ組換えがCreタンパク質の存在下に得られることを特徴とするバキュロウイルス。
  38. 順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする2つの配列に挟まれた少なくとも1個のDNA領域をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスであって、前記DNA領域がコンピテント細胞で機能的な少なくとも1個の複製起点と、欠損アデノウイルスのゲノムを含む前記バキュロウイルスであって、当該部位特異的組換えを可能にする配列がP1バクテリオファージのLoxPであり、かつ組換えがCreタンパク質の存在下に得られることを特徴とするバキュロウイルス。
  39. 欠損組換えアデノウイルスのゲノムが主にITR領域と、パッケージング配列と、目的核酸を含むことを特徴とする請求項38に記載のバキュロウイルス。
  40. 請求項37に記載のバキュロウイルスと請求項38に記載のバキュロウイルスをin vitroにおいてコンピテント細胞集団に感染させ、部位特異的組換えを可能にするリコンビナーゼの存在下に前記細胞をおき、その後、生産されたアデノウイルスを回収することを特徴とする欠損組換えアデノウイルスの製造方法。
  41. コンピテント細胞集団が肝細胞集団であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
  42. コンピテント細胞集団が、HuH7、Hep3B又はHepG2から選択されることを特徴とする請求項41に記載の方法。
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