JP4686670B2 - 組換えウイルスの製造方法 - Google Patents
組換えウイルスの製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4686670B2 JP4686670B2 JP52328298A JP52328298A JP4686670B2 JP 4686670 B2 JP4686670 B2 JP 4686670B2 JP 52328298 A JP52328298 A JP 52328298A JP 52328298 A JP52328298 A JP 52328298A JP 4686670 B2 JP4686670 B2 JP 4686670B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- baculovirus
- genome
- adenovirus
- region
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 100
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims abstract description 197
- 230000006870 function Effects 0.000 claims abstract description 100
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 199
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 195
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 91
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 83
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 40
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 39
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 29
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 25
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 25
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims description 24
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 22
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 13
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 10
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 8
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 claims description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 8
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 claims description 8
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 claims description 7
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 claims description 7
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 claims description 7
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 claims description 7
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 claims description 7
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 claims description 7
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 claims description 7
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 claims description 7
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 claims description 7
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 claims description 7
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 claims description 7
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 claims description 7
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 claims description 7
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 claims description 7
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 claims description 7
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 claims description 7
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 claims description 7
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 claims description 7
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 claims description 7
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 claims description 7
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 claims description 7
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 claims description 7
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 claims description 7
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 claims description 7
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 7
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 7
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 6
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 5
- 101150032643 IVa2 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 49
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 30
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 17
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 101150075174 E1B gene Proteins 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 7
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 5
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 5
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 5
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 229920003987 resole Polymers 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 3
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 3
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 3
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 3
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 2
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 2
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 108010085330 Estradiol Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 2
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 2
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 2
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 2
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 2
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 2
- -1 etc.) Proteins 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 108010057856 Adenovirus E2 Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108700040077 Baculovirus p10 Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150047856 Cav2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 1
- 102100031725 Cortactin-binding protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 208000010772 Dog disease Diseases 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 101150059079 EBNA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000210651 Enterobacteria phage 1 Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004862 Gastrin releasing peptide Human genes 0.000 description 1
- 108090001053 Gastrin releasing peptide Proteins 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 1
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 1
- 101710197985 Probable protein Rev Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010055047 Splenic necrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 101710110895 Uncharacterized 7.3 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- JLQUFIHWVLZVTJ-UHFFFAOYSA-N carbosulfan Chemical compound CCCCN(CCCC)SN(C)C(=O)OC1=CC=CC2=C1OC(C)(C)C2 JLQUFIHWVLZVTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N gastrin-releasingpeptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000004991 spatiotemporal regulation Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000010464 virion assembly Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pens And Brushes (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
ウイルス起源ベクターは(組換えタンパク質の製造、スクリーニング試験の実施、遺伝子調節研究用等に)in vitro、ex vivo又は(動物モデルの作出用又は治療アプローチで)in vivo遺伝子クローニング、導入及び発現に広く使用されている。これらのウイルスとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニアウイルスを特に挙げることができる。
アデノウイルス科は哺乳動物と鳥類に広く分布しており、正二十面体対称キャプシドをもつエンベロープなし2本鎖DNAウイルスの百種類以上の血清型を含む(Horwitz,In:Fields BN,Knipe DM,Howley PM編,Virology.第3版,Philadelpia:Raven Publishers,1996:2149−2171)。アデノウイルスは安全性に加え、非常に広い細胞親和性をもつ。細胞周期が細胞分裂に依存するレトロウイルスとは異なり、活性分裂細胞だけでなく休止細胞にも感染することができ、そのゲノムはエピソーム形態で維持される。更に、高力価(1011pfu/ml)で生産され得る。これらの主要利点により、異種遺伝子のクローニング及び発現用ベクターとして選択されている。C亜属(特に2及び5型)のアデノウイルスとCAV−2型イヌアデノウイルスは分子生物学が最もよくわかっており、実用されているベクターに利用されている。
アデノウイルスは複製起点を含む各末端の103bpの逆方向反復配列(ITR)と、左側ITRの近傍に配置されたパッケージングシグナルを含む36kbの直鎖状ゲノムをもつ(Shenk,Adenoviridae:The Viruses and Their Replication.In:Fields BN,Knipe DM,Howley PM編,Virology.Philadelpia:Raven Publishers,1996:2111−2148)。ウイルス周期中に次の3群の遺伝子群が発現される。
−細胞遺伝子の調節に関与し、特に細胞のS期導入(E1A)とアポトーシスの阻害(E1B)を可能にする極初期遺伝子(E1、E2、E3及びE4)。これらの遺伝子はメッセンジャーRNAの転写、スプライシング又は輸送のレベルで初期又は後期ウイルス遺伝子の調節にも関与している(E1A、E2A、E4)。また、複製と免疫応答エスケープにも役割を果たす。
−後初期遺伝子(pIX及びIVa2)は後期遺伝子の転写の調節(IVa2)とビリオンの組立て(pIX)に関係がある。
−後期遺伝子(L1〜L5)は強力なプロモーター(MLP)から転写される。28kbの一次転写産物は交互スプライシングと5個のポリアデニル化部位の使用により、ウイルス粒子の組立て及び成熟に関与する種々の構造(コア、ペントン、ヘキソン)及び非構造タンパク質に対応する転写産物を生成することができる。
アデノウイルスベクターはin vitro遺伝子クローニング及び発現(Gluzmanら,Cold Spring Harbor,New York 11724,p.187)、トランスジェニック動物の作出(WO95/22616)、遺伝子のex vivo細胞導入(WO95/14785;WO95/06120)又は遺伝子のin vivo細胞導入(特にWO93/19191,WO94/24297,WO94/08026参照)に使用されている。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、比較的小寸法のDNAをもつウイルスであり、これに感染する細胞のゲノムに比較的部位特異的に安定に組込まれる。アデノ随伴ウイルスは細胞増殖、形態又は分化に影響することなく広範な細胞に感染することができる。また、ヒトで疾病に関与しないと思われる。AAVのゲノムは既にクローニングされ、配列及び特性を決定されている。前記ゲノムは約4700塩基を含み、ウイルスの複製起点として機能する約145塩基の逆方向反復領域(ITR)各末端に含む。ゲノムの残余はパッケージング機能をもつ2つの主領域に分けられ、ゲノムの左側部分はウイルス複製とウイルス遺伝子の発現に関与するrep遺伝子を含み、ゲノムの右側部分はウイルスのキャプシドタンパク質をコードするcap遺伝子を含む。
AAVに由来するベクターをin vitro及びin vivo遺伝子導入に利用することは文献に記載されている(特にWO91/18088;WO93/09239;米国特許第4,797,368号、5,139,941号、ヨーロッパ特許第488528号参照)。
レトロウイルスは分裂細胞に選択的に感染する組込みウイルスである。従って、例えば癌や再発狭窄症に適用するのに有利なベクターである。レトロウイルスのゲノムは主に2つのLTRと、パッケージング配列と、3つのコーディング領域(gag、pol及びenv)を含む。組換えベクターの構築とそのin vitro又はin vivo使用については文献に広く記載されており、特にBreakfieldら,New Biologist 3(1991)203;ヨーロッパ特許第453242号及び178220号、Bernsteinら,Genet.Eng.7(1985)235;McCormick,BioTechnology 3(1985)689等を参照されたい。
組換えベクターとして使用するために、種々の目的遺伝子を組込んだ種々のウイルス由来構築物が作製されている。これらの構築物はいずれもウイルスが感染細胞で自己複製できないようにウイルスゲノムを改変している。従って、従来技術に記載されている構築物は、複製に必須のゲノムの所定領域を欠損するウイルスである。特に、アデノウイルスについては、第1世代構築物はウイルス複製に必須のE1領域に欠失があり、このレベルに異種DNA配列を挿入している(Levreroら,Gene 101(1991)195;Gosh−Choudhuryら,Gene 50(1986)161)。また、ベクターの性質を改良するために、アデノウイルスのゲノム内に他の欠失又は変異を形成することも提案されている。例えば、突然変異株ts125に感熱性点突然変異を導入し、E2領域によりコードされる72kDaのDNA結合タンパク質(DBP)を不活化している(Van der Vlietら,1975)。この他、ウイルス複製及び/又は増殖に必須の別の領域であるE4領域の欠失を含むベクターもある。E1及びE4領域を欠失するアデノウイルスベクターは転写バックグラウンドノイズとウイルス遺伝子発現が非常に低い。このようなベクターは例えば国際出願WO94/28152、WO95/02697、WO96/22378に記載されている。また、IVa2遺伝子のレベルに変異をもつベクターも記載されている(WO96/10088)。更に、ウイルス生産にシスで必要な領域(ITR及びパッケージング配列)しか含まず、全コーディングウイルス配列を欠失する「最小アデノウイルス」又は「偽アデノウイルス」(又はAdΔ)と呼ばれるベクターも記載されている(WO94/12649、WO94/28152、WO95/02697)が、以下に説明するようにそれらの製造はまだ非常に困難である。
AAVについては、記載されているベクターは一般にコーディング領域Rep及びCapを完全に除去し、目的核酸で置換している。
レトロウイルスに由来する組換えベクターでは、一般にgag、pol及びenv遺伝子を全部又は一部除去し、目的異種核酸配列で置換している。また、組換えレトロウイルスは転写活性を抑制するようにLTRのレベルに変異を加えたり、gag遺伝子の一部を含む拡張パッケージング配列にすることもできる(Benderら,J.Virol.61(1987)1639)。
これらの種々の組換えウイルスは複製欠損性であるため、ゲノムの欠失機能をトランス相補できるように製造する必要がある。これらのウイルスの製造、特にトランス相補機能の導入を非常に困難にしているのはトランス相補に他ならない。
この点では2種のアプローチが開発されている。第1はパッケージング系と呼ばれるトランス相補系の構築である。第2はヘルパーアデノウイルス又はヘルパープラスミドの使用に基づく。
種々の欠損ウイルスパッケージング系が構築されている。これらの系はウイルスベクターに欠損する機能を生成することができる。一般に、これらの系はウイルスゲノムの欠失領域(例えばアデノウイルスではE1、E2及び/又はE4、レトロウイルスではgag、pol及び/又はenv、AAVではrep及び/又はcap)をそのゲノムに組み込んでいる。
欠損アデノウイルスの製造用として知られている細胞系の1例は例えば、アデノウイルスのゲノムの一部を組み込んだ293系である。より詳細には、293系はアデノウイルス血清型5(Ad5)のゲノムの左側末端(約11〜12%)を含むヒト胎児腎細胞系であり、左側ITR、パッケージング領域、E1aとE1bを含むE1領域、pIXタンパク質をコードする領域及びpIVa2タンパク質をコードする領域の一部を含む。この系はE1領域を欠損即ちE1領域の全部又は一部を欠失する組換えアデノウイルスをトランス相補することができ、高力価をもつウイルスストックを生産することができる。この系は、感熱性E2突然変異を更に含むウイルスストックを許容温度(32℃)で生産することもできる。E1領域を相補することが可能な他の細胞系としては、特にヒト肺癌細胞A549(WO94/28152)やヒト網膜芽細胞(Hum.Gen.Ther.(1996)215)に由来するものも記載されている。また、アデノウイルスの複数の機能をトランス相補することが可能な細胞系も記載されている。特に、E1及びE4領域を相補する系(Yehら,J.Virol.70(1996)559;Cancer Gen.Ther.2(1995)322;Krougliakら,Hum.Gen.Ther.6(1995)1575)と、E1及びE2領域を相補する系(WO94/28152、WO95/02697、WO95/27071)を挙げることができる。
欠損レトロウイルスの製造用細胞系も種々のものが記載されており、一般にgag、pol及びenv遺伝子を発現することができる。このような系は例えばPA317系(米国特許第4,861,719号)、PsiCRIP系(WO90/02806)、GP+envAm−12系(WO89/07150)、BOSC系(WO94/19478)等である。目的核酸を含む組換えレトロウイルスを構築するためには、特にLTRとパッケージング配列と目的核酸を含むプラスミドを構築した後、このプラスミドを使用して、プラスミドに欠失するレトロウイルス機能をトランス導入することが可能な上記のようなパッケージング系にトランスフェクトする。生成した組換えレトロウイルスをその後、慣用技術により精製する。
しかし、細胞系の使用にはいくつかの欠点がある。例えばこのような細胞系を工業規模で構築及び評価するのは困難であり、費用がかかり、制約がある。実際に、これらの系は安定で且つ工業的利用に適合できなければならない。更に、記載されている系は汚染性複製ウイルス(RCA)の生産を避け難い。また、これらの系は現状では例えば上記最小アデノウイルスのような欠損度の非常に高いウイルスゲノムを工業的利用に十分にトランス相補することができない。実際に、アデノウイルスは空間時間的調節が非常に複雑な種々の転写単位から編成されるゲノムをもつ。細胞系から各転写単位を別々に構成的又は条件付きで発現させることにより全コーディングウイルス配列を欠失するアデノウイルスをトランス相補することはまだ十分に実施できていない。例えば細胞系から構成的に発現されているのは、E1、E4、pIX領域及びE2によりコードされる3種のタンパク質(pol、DBP及びp−TP)に対応するゲノムのごく一部に過ぎない。ゲノムの残余は28kbの一次転写産物から構造及び非構造タンパク質の全メッセンジャーを生産し、ゲノムの複製後に活性化される主要後期転写単位(MLTU)に対応する。しかし、最小アデノウイルスを作製するためには、これらの領域のトランス相補は不可欠である。これらの系から非常に高力価の組換えレトロウイルスを得ることはできない。
第2のアプローチは、相補機能を導入する構築物(プラスミド又はアデノウイルス)を欠損ウイルスゲノムと共にコトランスフェクトするものである。特に、欠損組換えAAVは一般に、ヒト補助ウイルス(例えばアデノウイルス)に感染させた細胞系に、AAVの2つの逆方向反復領域(ITR)で挟まれた目的核酸を含むプラスミドと、AAVの相補機能(rep及びcap遺伝子)をもつプラスミドを同時トランスフェクトすることにより作製される。変異体は国際出願WO95/14771、WO95/13365、WO95/13392又はWO95/06743に記載されている。ヘルパーアデノウイルスを使用する欠点は主に、アデノウイルスベクターとヘルパーアデノウイルスの組換えの危険が大きく、ウイルスストックの生産及び精製時にヘルパーの組換え体を分離しにくいという点にある。例えばRep/capプラスミド等のヘルパープラスミドを使用する欠点は、得られるトランスフェクションレベルが高力価のウイルスを生産するには不十分であるという点にある。
本願はこれらの欠点を解決することが可能な新規ウイルス製造システムに関する。本発明のシステムは相補機能を導入するためにバキュロウイルスを使用するものである。
本発明による製造システムは、樹立相補系を使用する必要がなく、RCAの問題がなく、高度欠損ゲノムをトランス相補できるという点が特に有利である。更に、本発明のシステムは所望ウイルスとバキュロウイルスにより感染可能な全細胞に適用可能であり、従って幅広い利用性を提供する。
従って、本発明の第1の目的は、欠損組換えウイルスのゲノムと、欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスをコンピテント細胞集団に導入することを特徴とする欠損組換えウイルスの製造方法にある。
従って、本発明の方法は相補機能を導入するためにバキュロウイルスを使用する。種々のアプローチが可能である。まず欠損組換えゲノムのトランス相補機能を発現しないコンピテント細胞を使用することができる。この場合には、欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な全機能を含むバキュロウイルス又は欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の1種以上を各々もつ数個のバキュロウイルスを使用することができる。欠損組換えゲノムの1種以上の機能を既にトランス相補することが可能なコンピテント細胞集団(パッケージング系)も使用できる。その場合には、使用する1種以上のバキュロウイルスは欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能のうちでコンピテント細胞によりまだトランス相補されていない機能のみを導入する。
上述のように、本発明のシステムは工業化(細胞系が不要、RCAを生産しない等)と応用性(全欠失型をもつ組換えウイルス、特に高度欠損組換えアデノウイルスの製造)に多数の利点がある。また、バキュロウイルスはヒト細胞で複製しないので、得られるウイルス調製物はバキュロウイルスに汚染されない。更に、バキュロウイルスはアデノウイルスとは系統分類的に非常に離れているため、両者間の組換え又はトランス相補の危険がない。従って、このシステムはRCAのない欠損ウイルスの濃縮ストックを生産できるという利点がある。このシステムは欠損組換えアデノウイルスの製造に特に有利である。
バキュロウイルスは脊椎動物に固有のエンベロープ付き環状2本鎖DNAウイルスである。その典型例であるAcNPVは133bkのゲノムをもつ。このウイルスは2種の強力プロモーター[多面体(Ph)及びP10]からの真核遺伝子の昆虫細胞発現ベクターとしてよく使用されている(KingとPossee,The baculovirus expression system.London:Champamn & Hall,1992)。AcNPVは所定の哺乳動物細胞に感染することができるが、ゲノムは転写も翻訳もされない。最近、Hofmannら(PNAS 92(1995)10099)は、LacZ遺伝子を発現する精製組換えバキュロウイルスにより肝細胞をin vitroで形質導入できることを示している。1000という高い感染多重度でも細胞毒性は報告されておらず、この論文に記載されているトランスフェクション効率はMOI100で約50%である。
本願出願人は、種々の細胞型に組換えバキュロウイルスを感染できることを示した。特に、本願出願人は、不死化胎児細胞等のヒト起源の細胞に組換えバキュロウイルスを感染できることを示した。本願出願人は、非常に高い導入効率(>80%)を得られることも示した。本願出願人は更に、アデノウイルスの相補機能をバキュロウイルスに導入し、コンピテント細胞集団でこれらの機能を発現できることも示した。従って本願出願人は、バキュロウイルスがウイルス相補機能の哺乳動物、特にヒト細胞導入及び発現に特に有利に使用可能な不活性ベクターであることを示すことができた。本発明のシステムの他の利点は、特に(i)完全アデノウイルスゲノムを相補可能なクローニング能が高いことと、(ii)バキュロウイルス技術の前進である。
以下の文中では、ウイルスの相補機能をもつバキュロウイルスをヘルパーバキュロウイルスとも言う。ヘルパーバキュロウイルスはウイルスの相補のための種々の機能を含むことができる。
例えば、ヘルパーバキュロウイルスはアデノウイルスのE1領域を含むことができる。第1世代アデノウイルス即ちE3状態に関係なく(即ち欠損AdΔE1,ΔE3、またはそうでない)、E1領域を欠損するアデノウイルス(AdΔE1)の製造にはBaculo−E1を使用することができる。第1世代欠損組換えアデノウイルス(E1領域と場合によりE3を欠損)の製造は本発明の方法の特に有利な第1の適用である。上述のように、E1機能をトランス相補することが可能な種々の細胞系が文献に記載されている(293細胞、A549細胞、911細胞等)。しかし、細胞系のゲノムに組み込まれたトランス相補機能をもつ領域と、製造しようとする組換えウイルスのDNAの間には相同ゾーンが存在する。このため、製造中に種々の組換えイベントが生じ、複製ウイルス粒子、特にE1+型のアデノウイルスを生成する恐れがある。例えば単純組換えイベント後に染色体が切れたり、二重組換えが生じることがある。これらの2種の変異の結果、細胞ゲノムに含まれるE1領域がアデノウイルスゲノム中の元の遺伝子座に再組み込みされる。更に、293系により製造される組換えベクターは力価が高い(>1012)ため、これらの組換えイベントが生じる確率は高い。従って、第1世代欠損組換えアデノウイルスベクターの多くのバッチは複製ウイルス粒子で汚染されていることが認められ、医薬用途に重大な欠点となっている。実際に、このような粒子が治療用組成物中に存在すると、ウイルス増殖と無制御の伝播をin vivo誘導し、炎症反応、組換え等の危険を伴う。従って、汚染したバッチはヒト治療に使用することができない。
本発明はこれらの欠点を解決することができる。実際に、本発明の方法の1実施態様によると、E1領域と場合によりE3を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムをコンピテント細胞に導入し、バキュロウイルスと欠損組換えアデノウイルスのゲノムに存在するアデノウイルスのE1領域が組換えを生じる恐れのある相同(オーバーラップ)ゾーンをもたないように、これらの細胞にE1領域をもつバキュロウイルスを同時に又は非同時に感染させる。従って、この実施態様によると、樹立細胞系を用いずにRCAのない第1世代組換えアデノウイルスストックを迅速に生産することができる。更に、後述するように、こうして生産したRCAのない組換えアデノウイルスストックは、コンピテント細胞にバキュロウイルスと共に同時インフェクトすることにより新規製造用出発材料として使用することができる。
ヘルパーバキュロウイルスは更にアデノウイルスのE2領域の全部又は一部、特にE2a及び/又はE2b領域を含んでいてもよい。E2領域(Ad−ΔE2)と場合によりE3領域(Ad−ΔE2,ΔE3)を欠損するアデノウイルスをコンピテント細胞で製造するにはbaculo−E2を使用することができる。更に、アデノウイルスのE1領域を相補することが可能なコンピテント細胞でbaculo−E2を使用すると、E1及びE2領域(Ad−ΔE1,ΔE2)と場合によりE3領域(Ad−ΔE1,ΔE2,ΔE3)を欠損する組換えアデノウイルスを製造することができる。同様に、アデノウイルスのE1及びE4領域を相補することが可能なコンピテント細胞(例えばIGRP2細胞)でbaculo−E2を使用すると、E1、E2及びE4領域(Ad−ΔE1,ΔE2,ΔE4)と場合によりE3(Ad−ΔE1,ΔE2,ΔE3,ΔE4)を欠損する組換えアデノウイルスを製造することができる。
ヘルパーバキュロウイルスは更にアデノウイルスのE4領域を(全部又は一部)含んでいてもよい。E4領域(Ad−ΔE4)と場合によりE3領域(Ad−ΔE4,ΔE3)を欠損するアデノウイルスをコンピテント細胞で製造するにはbaculo−E4を使用することができる。更に、アデノウイルスのE1領域を相補することが可能なコンピテント細胞でbaculo−E4を使用すると、E1及びE4領域(Ad−ΔE1,ΔE4)と場合によりE3領域(Ad−ΔE1,ΔE4,ΔE3)を欠損する組換えアデノウイルスを製造することができる。
ヘルパーバキュロウイルスは更にアデノウイルスのE1及びE4領域を(全部又は一部)含んでいてもよい。図1に示すように、E1及びE4領域(Ad−ΔE1,ΔE4)と場合によりE3領域(Ad−ΔE1,ΔE4,ΔE3)を欠損するアデノウイルスをコンピテント細胞で製造するにはbaculo−E1,E4を使用することができる。
更に、E1及びE4領域を欠損するウイルスを作製するためには、夫々E1機能とE4機能の全部又は一部を発現する2種のヘルパーバキュロウイルスを使用することもできる。
同様に、ヘルパーバキュロウイルスはE1、E2及びE4領域(全部又は一部)と、場合により後期遺伝子をもつ領域(L1〜L5)を含んでいてもよい。
ヘルパーバキュロウイルスは更にAAVのRep及び/又はCap領域を含んでいてもよい。例えば、baculo−Rep/Capは全コーディングウイルス配列を欠失するAAVゲノムを相補することができる(図5)。
バキュロウイルスは更にレトロウイルスのgag、pol及び/又はenv領域を含んでいてもよい。例えば、baculo−gag/pol/envは全コーディングウイルス配列を欠失するレトロウイルスゲノムをコンピテント細胞系で相補することができる。gag/pol領域を含むバキュロウイルスとenv領域を含む第2のバキュロウイルスを使用することもできる。
一般に、欠損組換えウイルスのゲノムとバキュロウイルスに存在する相補領域はオーバーラップをもたないことが好ましい。こうすると、実際に組換えとRCAの生成の危険が避けられる。これは第1世代アデノウイルス(Ad−ΔE1)の生産に特に重要である。この場合には、バキュロウイルスに導入されるE1領域は、組換えゲノムと共通配列をもたないように規定される。このためには、例えば実施例に記載するように、バキュロウイルスに挿入される相補領域よりも大きい領域を組換えゲノムから除去することができる。これはアデノウイルスAd−ΔE1,ΔE4の作製にも有利である。
このように、本発明の方法の特定実施態様では、欠損組換えウイルスのゲノムをコンピテント細胞に導入し、バキュロウイルスと欠損組換えウイルスのゲノムに存在する相補機能が組換えを生じる恐れのある相同ゾーンをもたないように、欠損ゲノムの相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスをこれらの細胞に同時又は非同時に感染させる。有利な態様では、ウイルスゲノムはE1領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムであり、バキュロウイルスはE1領域をトランス相補することが可能なアデノウイルスの領域をもつ。別の態様によると、ウイルスゲノムはE1及びE4領域を欠損する組換えアデノウイルスゲノムであり、バキュロウイルスは前記領域をトランス相補することが可能なアデノウイルスの2つの領域をもつか、又は夫々E1領域とE4領域をトランス相補することが可能なアデノウイルスの領域をもち、欠損アデノウイルスゲノムと相同ゾーンをもたない2種のバキュロウイルスを使用する。
特定実施態様によると、1個以上のヘルパーバキュロウイルスがアデノウイルスの全コーディング領域をもつ。より特定的な実施態様によると、アデノウイルスの全コーディング領域をもつ単一ヘルパーバキュロウイルスを使用する。従って、このようなヘルパーバキュロウイルスは最小組換えアデノウイルスをトランス相補するために使用可能である。このようなバキュロウイルスは実施例に示すように、パッケージング領域と場合によりITR以外は特にアデノウイルスゲノム全体を含むことができる。
相補機能の作製
ヘルパーバキュロウイルスに導入する相補機能は種々の血清型ウイルスから得られる。
アデノウイルスについては、構造と性質が少しずつ異なるが、類似の遺伝子地図をもつ種々の血清型が実際に存在する。より詳細には、本発明によりバキュロウイルスを構築するために使用される相補機能はヒト又は動物起源のアデノウイルスに由来する。
ヒト起源のアデノウイルスについては、C亜属に分類されるものを好適例として挙げることができる。種々のヒトアデノウイルス血清型のうち、本発明の範囲では特に2又は5型(Ad2又はAd5)のアデノウイルスを使用すると好ましい。A及びB亜属の7又は12型アデノウイルスに由来する領域を使用することもできる。動物起源の種々のアデノウイルスのうちでは、イヌ起源のアデノウイルス、特に全アデノウイルスCAV2株[例えばマンハッタン株又はA26/61(ATCC VR−800)]を使用すると好ましい。動物起源の他のアデノウイルスは、参考資料として本明細書の一部とする国際出願WO94/26914に特に記載されている。
本発明の1好適実施態様では、相補機能はC亜属のヒトアデノウイルスゲノムに由来する。アデノウイルスAd2又はAd5のゲノムに由来するものが特に好ましい。
種々の相補機能をもつ領域は当業者に公知の方法に従って酵素切断によりアデノウイルスゲノムから得られる。これらの領域は場合により修飾し、短縮したり、所定の調節エレメント(プロモーター、エンハンサー等)を異種エレメントで置換してもよい。一般に、これらの領域は次のように作製される。アデノウイルスのDNAは塩化セシウム勾配遠心分離により精製するか、又は原核(WO96/25506)もしくは真核(WO95/03400)プラスミドからin vitroで得られる。次にDNAを適当な制限酵素で開裂し、得られたフラグメントから所望相補機能をもつものを同定及び選択する。使用する制限酵素の選択は所望の相補機能に依存する。次に、アデノウイルスゲノムの公表されている制限地図と配列に従う。例えば、E1領域はE1Aプロモーターの下流にE1A及びE1Bの全オープンリーディングフレームをもつフラグメントとして単離することができる。E4領域はオープンリーディングフレーム全体又はその一部のみ、好ましくはORF3又はORF6又はORF−ORF6/7をもつフラグメントとして単離することができる。
同様の方法を実施して組換えAAV及びレトロウイルスの相補領域を作製する。例えば、AAVのrep及び/又はcap領域は種々のAAV血清型から単離したウイルスDNAから酵素切断により得られる。AAV−2が好ましい。レトロウイルスの場合には、gag、pol及び/又はenv領域は同様に種々のレトロウイルス、例えば特にMoMuLV(「モロニーマウス白血病ウイルス」、別称MoMLV)、MSV(「モロニーマウス肉腫ウイルス」)、HaSV(「ハーベー肉腫ウイルス」)、SNV(「脾壊死ウイルス」)、RSV(「ラウス肉腫ウイルス」)又はフレンドウイルス等のレトロウイルスから慣用分子生物学技術により得られる。
ヘルパーバキュロウイルスの構築
次に、相補領域をもつフラグメントをその操作(微細消化、PCR、調節配列付加等)が可能なプラスミドベクター、例えば原核又は真核生物にサブクローニングする。その後、相補機能をコードする得られた最終フラグメントを慣用分子生物学技術によりヘルパーバキュロウイルスに導入する。詳細には、バキュロウイルスのゲノムのある領域に相同な2つの配列の間にフラグメントをクローニングした後、得られたフラグメント又はプラスミドをバキュロウイルスのゲノムと共に昆虫細胞(一般にはspodoptera frugiperda細胞Sf9及びSf21であるが、trichopulsia ni細胞Tn−368及びHigh−Five(登録商標)BTI−TN−5B1−4(Gibco)、又はバキュロウイルスに許容可能でその製造に使用可能な他の任意の昆虫細胞でもよい)に同時トランスフェクトする。プラスミド又はフラグメントとバキュロウイルスのゲノムの相同組換えにより所望の組換えバキュロウイルスが生成され、慣用方法により回収及び精製することができる(特にKingとPossee:the baculovirus expression system.London:Chapman & Hall,1992参照)。組換えバキュロウイルスを構築するためには、シャトルベクターを含む種々のキットが市販されており、製造業者の指示に従って使用することができる。特に、Clontech社製品シャトルベクターpBAC、ベクターpAc(Vemeら,Bio/Technology 6(1988)47,Pharmingen,米国)、ベクターpBlue−Bac(Invitrogen)又はベクターpBSV(Boehringer)を使用することができる。こうして相補機能はバキュロウイルスの種々の部位に挿入することができ、特に多面体の遺伝子又は遺伝子p10の遺伝子座に挿入することができる。また、AcNPV又はBombyx mori(Maedaら,Nature 315(1988)592)等の種々のバキュロウイルス株を使用することができる。他方、使用するバキュロウイルスを変異させ、その親和性を改善/変化させてもよい。実際に、(i)ウイルスタンパク質と特異的リガンド(免疫グロブリンL鎖、ガストリン放出ペプチド)の融合により短縮するか又は(ii)異種ウイルス糖タンパク質[水疱性口内炎ウイルス(VSV)のG]との偽型の形成により拡大するように表面タンパク質を修飾することにより、ウイルスベクターの親和性を調節することができる[Liuら,J.Virol 70(4)(1996)2497;Michaelら,Gene Ther.2(1995)660]。最近では、HIVウイルスのgp120に融合したバキュロウイルスの表面糖タンパク質(gp64)はCD4レセプターに固定できることが立証されている(Boublikら,Bio/Technology 13(1995)1079)。gp64のこの修飾は昆虫細胞でバキュロウイルスの生存率に影響を与えない。VSVのGを用いて同様に構築しても、バキュロウイルスの哺乳動物細胞親和性を改善し、従ってHuh7細胞や他の細胞系のトランスダクション効率を向上できると思われる。
ヘルパーバキュロウイルスでは、コンピテント細胞中で機能的な異種(即ちバキュロウイルスとは異なる起源の)プロモーターの制御下に相補機能をおくと有利である。実際に、バキュロウイルスのプロモーターから昆虫細胞以外の細胞で相補機能の十分な発現レベルは得られないと思われる。プロモーターはまずウイルスの相補機能の固有プロモーター(同種プロモーター)であり得る(アデノウイルスにはEA1、E4、E2、MLPプロモーター、AAVにはP5又はP19プロモーター、RSVにはLTRのプロモーター等)。使用するコンピテント細胞中で機能的であれば別の起源の任意プロモーターを使用できる。この点では、例えばこの細胞で発現される遺伝子のプロモーター又は公知ユビキチンプロモーター(例えばPGK遺伝子のプロモーター、CMVの極初期プロモーター、ヘルペスウイルスのTK遺伝子のプロモーター又はRSVのLTRのプロモーター)が挙げられる。調節プロモーターでもよく、例えばMMTVウイルスのプロモーター、例えばGRE5型のホルモン応答プロモーター又はテトラサイクリン(WO)により調節されるプロモーターが挙げられる。同種、強力ユビキチン又は誘導プロモーターが有利である。
従って、本発明の別の目的は、異種プロモーターの制御下におかれたウイルスの相補機能をコードする核酸をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスに関する。より詳細には、相補機能は前記ウイルスの生産に必要なタンパク質であり、そのコーディング領域は欠損ウイルスゲノム中で不活化(突然変異、欠失等)されている。アデノウイルスでは、相補機能は特にアデノウイルスのE1、E2、E4、L1〜L5、pIX及びIVa2領域単独又はその組み合わせによりコードされる機能の全部又は一部から選択される。AAVでは、Rep及び/又はCap領域によりコードされる機能であり、レトロウイルスではgag、pol及び/又はenvである。核酸は選択された相補機能をコードする領域を含むウイルスゲノムの領域に対応するものが有利である。特に、血清型Ad2もしくはAd5のアデノウイルス、MoMLV又はAAV−2のゲノムのフラグメントが挙げられる。核酸は選択される相補機能の発現に天然に関与するプロモーター領域も含むことが特に好ましい。
特定例として、本発明はアデノウイルスのE1領域の全部又は一部を含むバキュロウイルスに関する。より詳細には、E1a、E1b又はE1aとE1b領域を含むバキュロウイルスである。アデノウイルスのE1領域はAd5のヌクレオチド104(E1aプロモーター)〜4070(ポリA E1b)のレベルに局在する。特に、E1aプロモーターのTATAボックスはヌクレオチド470のレベルに局在し、E1aのATGコドンはヌクレオチド560のレベル、E1bストップコドンはヌクレオチド3511のレベルに局在する。厳密な例として391〜3511フラグメントを含むバキュロウイルスを挙げることができる。このヘルパーバキュロウイルスはこの391〜3511フラグメントよりも大きい欠失をもつE1領域欠損組換えアデノウイルスの製造に特に適している。特に、RCAがなく、383〜3512ヌクレオチド(両端を含む)の範囲のE1領域に欠失をもつ第1世代アデノウイルスの製造に適している。
本発明によるバキュロウイルスの別の特定例は例えばアデノウイルスのE1及びE4領域の全部又は一部を含む。アデノウイルスのE4領域はORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF3/4、ORF6及びORF6/7と呼ばれる7個のオープンリーディングフレームから構成される。これらの種々のORFによりコードされるタンパク質のうちでは、ORF3とORF6により生産されるタンパク質がウイルスの「複製」を可能にし、従って、完全に欠損する場合であってもE4領域を欠損するアデノウイルスのトランス相補を可能にすると思われる。従って、本発明のヘルパーバキュロウイルスはE4領域の全部又は少なくともORF3もしくはORF6フレームを含む一部のみを含むと有利である。E4領域の種々の部分は当業者に公知の方法により酵素切断により得られ、修飾してもよい。特に、オープンリーディングフレームORF6はヌクレオチド34115〜33126に対応するBglII−PvuIIフラグメントとしてE4領域から単離することができ、オープンリーディングフレームORF6−ORF6/7はAd5のゲノムのヌクレオチド34115〜32490に対応するBglII−BglIIフラグメントとしてE4領域から単離することができる。バキュロウイルスは(例えばフラグメント32800〜35826又は32811〜35614又は32811〜35640として)オープンリーディングフレームORF1〜ORF7全体を含んでいてもよい。当然のことながら、アデノウイルスゲノムの公表配列に基づいて他のフラグメントを決定することもできる。E4領域の短い単位をもつバキュロウイルスを使用すると、E4領域のより大きい欠失をもち、従って相同ゾーンのない欠損アデノウイルスゲノムのトランス相補が可能になり、組換えの可能性が全くなくなるので有利である。
第1の実施態様によると、相補機能をコードする核酸を発現カセットの形態でヘルパーバキュロウイルスに導入する。この実施態様は最も簡単に実施できる。極初期遺伝子を欠損する組換えアデノウイルスの製造と、欠損組換えレトロウイルス及びAAVの製造に特に適している。
別の実施態様によると、相補機能をコードする核酸を切除可能なカセットの形態でヘルパーバキュロウイルスに導入し、コンピテント細胞で複製分子を生成する。細胞でカセットを複製すると、相補遺伝子のコピー数を増し、システムの生産レベルを改善できるという利点がある。この実施態様は、欠損度が高く、特に構造遺伝子を欠損する組換えアデノウイルスの製造に特に適している。特に、この実施態様は「最小」アデノウイルスの製造に特に適している。実際に、構造タンパク質の量は欠損度の高いアデノウイルス(最小アデノウイルス型)を高力価で生産するのを制限している要因である。この実施態様によると、トランス相補タンパク質、特に(L1〜L5領域によりコードされる)アデノウイルスの構造タンパクの細胞内レベルを最小アデノウイルスのトランス相補に適合可能なレベルまで大幅に増加することが初めて可能になった。
このように、本願出願人は、(エピソーム型)環状複製分子を生成するように、好ましくは誘導及び調節下に細胞で切除可能な異種領域を含む組換えバキュロウイルスを構築できることを示した。
切除は部位特異的組換えメカニズムにより実施すると有利であり、細胞内の複製は細胞分裂状態から独立した複製起源によりなし遂げられる。
より好ましくは、本発明の方法により使用される部位特異的組換えは、一般にリコンビナーゼと呼ばれる特定タンパク質の存在下に組換え可能な2種の特定配列により得られる。これらの特定配列は適当な向きに配置され、バキュロウイルス内で相補機能をコードする配列の両側に配置される。従って、本発明は部位特異的組換えを可能にする2種の配列により挟まれ、順方向に配置された少なくとも1個のDNA領域をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスにも関し、前記DNA領域はコンピテント細胞で機能的な少なくとも1個の複製起点とウイルスの相補機能をコードする核酸を含む。
本発明の範囲で使用される組換えを可能にする配列は一般に5〜100塩基対、より好ましくは50塩基対未満を含む。これらの配列は種々の構造クラス、特にP1バクテリオファージのリコンビナーゼ又はトランスポゾンのリゾルベースのファミリーに分類できる。
バクテリオファージ1のインテグラーゼのファミリーに属するリコンビナーゼとしては、特にλファージのインテグラーゼ(Landyら,Science 197(1977)1147)、P22及びF80(Leongら,J.Biol.Chem.260(1985)4468)、Haemophilus influenzaeのHP1(Hauserら,J.Biol.Chem.267(1992)6859)、P1ファージのCreインテグラーゼ、プラスミドpSAM2のインテグラーゼ(EP350341)又は酵母Saccharomyces cerevisiaeのプラスミド2μmのFLPリコンビナーゼを挙げることができる。
Tn3トランスポゾンのファミリーに属するリコンビナーゼとしては、特にTn3トランスポゾン又はgd、Tn21及びTn522トランスポゾンのリゾルベース(Starkら,1992)、muバクテリオファージのGinインベルターゼ又はRP4のparフラグメントのリゾルベースのようなプラスミドのリゾルベース(Abertら,Mol.Microbiol.12(1994)131)を挙げることができる。
好ましい実施態様によると、本発明の組換えバキュロウイルスにおいて部位特異的組換えを可能にする配列はバクテリオファージから誘導される。バクテリオファージの付着配列(attP及びattB配列)又は誘導配列がより好ましい。これらの配列は特にインテグラーゼと呼ばれるリコンビナーゼの存在下で相互に特異的に組換えが可能である。厳密な例としては、特にファージλ、P22、F80、P1、Haemophilus influenzaeのHP1又はプラスミドpSAM2もしくは2μmの付着配列を挙げることができる。
更に好ましくは、部位特異的組換えを可能にする配列は、P1ファージの組換え系である。P1ファージはlox P部位と呼ばれる34塩基対のヌクレオチド配列を特異的に認識するCreと呼ばれるリコンビナーゼをもつ(Sternbergら,J.Mol.Biol.150(1981)467)。この配列は8bpの保存配列に分離された2個の13bpのパリンドローム配列から構成されている。LoxP配列又は誘導配列とCreリコンビナーゼを使用することにより部位特異的組換えを得ると有利である。
誘導配列なる用語は、適当なリコンビナーゼの存在下に特異的に組換えを行う能力を維持しながら、上記組換え配列の修飾により得られる配列を意味する。例えば、これらの配列の短縮フラグメントでもよいし、逆に他の配列(制限部位等)の付加により拡張したフラグメントでもよい。また、突然変異、特に点突然変異により得られる変異体でもよい。
従って、本発明の好ましい態様によると、部位特異的組換えを可能にする配列はP1バクテリオファージのLoxP配列であり、組換えはCreタンパク質の存在下に得られる。この点では、組換えはコンピテント細胞とCreリコンビナーゼの直接接触又はコンピテント細胞におけるCreリコンビナーゼをコードする遺伝子の発現により得られる。対応する遺伝子の発現の誘導により細胞でCreリコンビナーゼを生産すると有利である。例えばリコンビナーゼをコードする遺伝子を誘導プロモーターの制御下におくか、又は調節可能な形態で構築すると有利である。この点では、CreとCreの活性を調節することが可能なステロイドホルモン(エストラジオール、プロゲステロン等)の固定ドメインの融合を使用し、組換えイベントを誘導すると有利である(Metzgerら,PNAS 92(1995)6991)。より一般には、リコンビナーゼの発現は調節下又は非調節下の任意強力プロモーターにより制御することができる。発現カセットは実施例に記載するようにコンピテント細胞にトランスフェクトしてもよいし、コンピテント細胞のゲノムに組み込んでもよい。
従って、このシステムはウイルス、特にアデノウイルスの高レベルの相補機能をコンピテント細胞で生成する複製分子を作製することができる。この種の構築物は高度欠損ゲノム、特に後期遺伝子を欠損するアデノウイルスゲノムの相補に特に適している。従って、本発明の特定構築物は、順方向に配置された2個のLoxP配列に挟まれた少なくとも1個のDNA領域をそのゲノムに挿入したバキュロウイルスであり、前記DNA領域はコンピテント細胞で機能的な少なくとも1個の複製起点と、アデノウイルスの相補機能をコードする核酸を含む。相補機能はE1、E2及びE4領域に存在する極初期遺伝子の全部又は一部を含むと有利である。より好ましくは、相補機能は極初期遺伝子と後初期遺伝子の全部又は一部を含む。好ましくは、相補機能は全コーディングウイルス配列を欠失する組換えアデノウイルスの相補を可能にする。特に、相補機能はITRとパッケージング領域を除くアデノウイルスゲノム全体から構成される。特定態様によると、相補機能はパッケージング領域を欠失する以外は完全なアデノウイルスゲノム(Ad.Psi−)から構成される。このゲノムは特に、切除後にコンピテント細胞でゲノムの複製に利用されるITRを含む。
従って、エピソーム分子の複製をなし遂げるためには、エピソーム分子は使用するコンピテント細胞で機能する複製起点を含む。この複製起点は分子の大量増幅を可能にするアデノウイルスの固有ITR配列から構成されることが好ましい。好ましくはコンピテント細胞で20倍を越えるウイルスDNA増幅を可能にする別の複製起点でもよい。例えばEBVウイルスの起点OriP/EBNA1又はパピローマウイルスのE2領域を挙げることができる。当然のことながら、アデノウイルスのITR配列は好ましい実施態様を構成する。
本発明の方法を実施するためには、一般に細胞生存率をさほど損なわずに大きな細胞集団に感染することが可能な感染多重度(MOI)でヘルパーバキュロウイルスを使用する。一般に、感染多重度は特に10〜1000である。MOIは細胞1個当たりのウイルス粒子数に対応する。MOIは、使用するコンピテント細胞に応じて主に感染効率と毒性の2つの基準に基づいて当業者により容易に調整可能である。ヘルパーバキュロウイルスに使用するMOIは20〜500が有利である。
ウイルスゲノムの導入
上述のように、本発明の方法はヘルパーバキュロウイルスと組換えウイルスゲノムをコンピテント細胞に導入するものである。この点では、欠損組換えアデノウイルスのゲノムを種々の方法でコンピテント細胞に導入することができる。
まず、有利にはRCAを除去した精製欠損組換えアデノウイルスを利用できる。この場合には、コンピテント細胞に欠損組換えアデノウイルスとヘルパーバキュロウイルスを感染させる。組換えアデノウイルスの感染により、対応するゲノムをコンピテント細胞に導入することができ、その後、増幅及びパッケージングし、RCAを含まない高力価ストックを生成する。この実施態様は第1世代のウイルス(Ad−ΔE1;Ad−ΔE1,E3)を製造するのに特に有利である。実際に、これらのウイルスはRCAの汚染なしに高力価で製造するのは難しい。本発明の方法によると、第1世代の欠損組換えアデノウイルスから出発し、E1領域を含むバキュロウイルスと共にコンピテント細胞に同時感染することにより、高品質の濃縮ストックを得ることが可能になった。この実施態様はそのゲノムの2又は3個の主要領域(特にE1、E2、E4)を欠損するウイルスの製造にも有利である。一般に、この実施態様はアデノウイルス感染効率が非常に高く(DNAトランスフェクション効率を上回る)、従って濃縮ストックを生成できるので有利である。この実施態様では、細胞生存率をさほど損なわずに大きい細胞集団に感染可能な感染多重度(MOI)で組換えアデノウイルスと組換えバキュロウイルスを使用することができる。バキュロウイルスに使用するMOIは上記の通りである(10〜1000)。アデノウイルスについては、1〜1000が有利であり、好ましくは1〜500、より好ましくは1〜100である。アデノウイルスに使用するMOIは選択する細胞型によっても異なる。MOI範囲は例えば別個のマーカー遺伝子を含むバキュロウイルスとアデノウイルスを使用して感染効率と競合を測定することにより、当業者により容易に決定することができる。より好ましくは、アデノウイルスのMOIは50未満、例えば1〜20である。
特に有利な実施態様によると、欠損組換えアデノウイルスのゲノムをDNAとして導入する。この場合には、場合によりトランスフェクションを助長する物質(脂質、リン酸カルシウム等)の存在下でトランスフェクションによりゲノムを導入する。このように導入する組換えゲノムは種々の技術によりin vitro作製することができ、特に大腸菌(WO96/25506)又は酵母(WO95/03400)で作製できる。この実施態様はRCAのない第1世代の欠損組換えウイルスを製造するのに特に有用であり、その後、前記実施態様により高力価ストックを製造するために使用することができる。
別の組換えバキュロウイルスを使用することにより欠損組換えアデノウイルスのゲノムを導入することもできる。この実施態様によると、例えば上述のように欠損組換えアデノウイルスのゲノムを作製した後、コンピテント細胞で切除可能なカセットの形態でバキュロウイルスに導入する。この実施態様によると、欠損組換えアデノウイルスのゲノムをもつバキュロウイルスと(相補機能をもつ)1個以上のヘルパーバキュロウイルスの存在下にコンピテント細胞をおく。この実施態様は高度欠損組換えアデノウイルスの製造に特に有利である。このシステムによると、実際に高度欠損組換えゲノムと対応する相補機能をコンピテント細胞集団に同時に多量に導入することができる。
従って、この点では、本発明の方法は欠損組換えアデノウイルスのゲノムをもつバキュロウイルスと、相補機能をもつ1個以上のヘルパーバキュロウイルスをコンピテント細胞に同時感染するものである。この実施態様で使用するMOIも、使用するバキュロウイルスの各々について10〜1000である。
従来技術では最小アデノウイルスの製造に、(1)ITR間にクローニングし、固有制限部位により挟まれた導入遺伝子(β−ガラクトシダーゼ)又は(2)導入遺伝子の5’に順方向にクローニングした右及び左ITRの2種の構築が実施されている(Fisherら,Virology 217(1996)11;Kumar−Singhら,Hum.Mol.Genet.5(1996)913)。最小アデノウイルスは直鎖状(1)又は環状(2)DNAのトランスフェクションにより293細胞で生産されており、ミニゲノムの複製及びパッケージングに必要なウイルスタンパク質はヘルパーウイルス(AdΔE1)によりトランス導入される。最小アデノウイルスは干渉欠損(ID)粒子として挙動し、連続継代中に漸進的に増幅される。この方法の使用による主な問題は、ヘルパーウイルスによるストックの汚染の原因となる2種の生成粒子の分離と、こうして得られる最小アデノウイルスの力価が非常に低い(108pfu/ml未満)ことである。
本発明によると、アデノウイルスミニゲノムを送達するためのバキュロウイルスと、トランス相補機能全体(相補ゲノム)を導入するためのバキュロウイルスを使用することにより、最小アデノウイルスをを製造することが初めて可能になった。
組換えアデノウイルスゲノムはヘルパーバキュロウイルスについて記載したように、コンピテント細胞で部位特異的組換えを可能にする2つの配列の間でバキュロウイルスに導入すると有利である。
本発明は特に、loxP/Cre系によりアデノウイルスミニゲノムを送達するためのバキュロウイルスと、同様にCre/loxP系によりトランス相補機能全体(相補ゲノム)を導入するためのバキュロウイルスを使用する最小アデノウイルスの製造システムに関する(図2〜4参照)。
別の実施態様によると、相補機能を送達するために使用する部位特異的組換えシステムは組換えアデノウイルスのゲノムを送達するために使用するシステムと異なる。特に、欠損アデノウイルスゲノムを送達するためにLoxP/Cre系を使用し、相補機能を送達するためにAttP/AttB系を使用することができる。
従って、本発明の方法は、全コーディングウイルス配列を欠失し、ITRとパッケージングシグナルのみを含むアデノウイルスベクター(最小アデノウイルス)を構築することができる。このベクターは理論的には37kbまでの外来配列を含むことができるが、実際のベクターのクローニング能は8.5kb以下である。従って、それらの全調節エレメント(プロモーター、エンハンサー、イントロン等)を使用してジストロフィン遺伝子(14kb)等の大きい寸法の遺伝子をクローニングすることができ、標的組織で最適発現が得られる。更に、免疫原ウイルス配列が全く存在しないため、休止組織で導入遺伝子の発現期間を延ばすことができる。
欠損AAV又はレトロウイルスのゲノムも上記方法によりウイルス、ゲノム又はプラスミドとして導入することができる。
コンピテント細胞
本発明の方法は種々の細胞で実施することができる。本発明の意味で「コンピテント細胞」とは、バキュロウイルスと製造しようとするウイルスの感染が可能であり、後者の生産ウイルス周期を可能にする細胞を意味する。細胞のこれらのウイルスの感染能は、大腸菌のLacZ遺伝子等のマーカー遺伝子を発現する組換えウイルスを使用することにより決定することができる。このような細胞としては哺乳動物細胞が好ましく、ヒト起源の細胞がより好ましい。使用するコンピテント細胞は休止細胞でも活性分裂細胞でもよく、樹立細胞系でも一次培養物でもよい。工業用途に適合可能な哺乳動物細胞、即ち病原性が認められず、培養可能であり、場合により適当な条件下で保存可能なものが有利である。使用する細胞は肝、筋、繊維芽、胚、神経、上皮(肺)又は眼(網膜)細胞が有利である。非限定的な例として、293細胞もしくは補助相補機能を含む任意誘導細胞(293E4、293E2a等)、A549細胞、HuH7細胞、Hep3B細胞、HepG2細胞、ヒト網膜芽細胞(HER、911)、HeLA細胞、3T3細胞又はKB細胞を挙げることができる。
本発明の方法を実施するためには、組換えウイルスのゲノムとバキュロウイルスを同時又は時間的に間をおいてコンピテント細胞集団に導入することができる。細胞を組換えゲノムとヘルパーバキュロウイルスに同時に接触させると有利である。複製分子をin vivo生成するシステムの場合には、リコンビナーゼを前以て、同時又は後で導入又は発現させる。
ウイルスが生産されると、一般に細胞が溶解する。従って、生産されたウイルスは細胞溶解後に公知精製法により回収することができる。その後、目的用途に応じて種々の方法でパックすることができる。また、場合によりコンピテント細胞に浸透しなかった微量のバキュロウイルス(ヘルパーバキュロウイルス又は組換えウイルスゲノムを導入するバキュロウイルス)によるウイルスストックの汚染の危険を避けるためには、次の方法を適用することができる。
−出願FR96/08164に記載の方法に従い、クロマトグラフィーによりアデノウイルスを精製することができる。この方法は場合により残留するバキュロウイルスからアデノウイルスを完全に分離することができる。
−有機溶剤(例えばエーテル、クロロホルム)を精製アデノウイルスストックに作用させてもよい。実際に、バキュロウイルスはエンベロープ(糖タンパクエンベロープ)をもつウイルスであるため、(そのエンベロープから脂質を抽出する)全有機溶剤に非常に感受性であるが、アデノウイルスはエンベロープをもたないので、同一溶剤の作用が全くない。
−CsCl勾配精製により場合により残留するバキュロウイルスと組換えウイルスを密度により分離することもできる。
これらの3種の方法は独立して使用してもよいし、併用してもよい。更に、当業者に公知の他の任意の方法も使用することができる。
ウイルスの使用
こうして製造したウイルスはin vitro、ex vivo又はin vivo遺伝子クローニング、導入及び発現に使用することができる。このような目的遺伝子は例えば酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン(例えばインターロイキン、インターフェロン、TNF等)(FR9203120)、成長因子、神経伝達物質又はその前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子(例えばBDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等)、アポリポタンパク質(例えばApoAI、ApoAIV、ApoE等)(WO94/25073)、ジストロフィン又はミニジストロフィン(WO93/06223)をコードする遺伝子、腫瘍抑制遺伝子(例えばp53、Rb、Rap1A、DCC、k−ref等)(WO94/24297)、因子VII、VIII、IX等の凝血関与因子をコードする遺伝子、自殺遺伝子(例えばチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ等)、更には天然又は人工免疫グロブリン(Fab、ScFv等、WO94/29446)の全部又は一部等を挙げることができる。目的遺伝子は標的細胞で発現されると遺伝子の発現又は細胞mRNAの転写を制御することが可能なアンチセンス遺伝子又は配列でもよい。このような配列はヨーロッパ特許第140308号に記載の方法に従い、例えば標的細胞で細胞mRNAの相補的RNAに転写すると、そのタンパク質翻訳を阻止することができる。目的遺伝子はワクチン製造の目的では、免疫応答を生じることが可能な抗原性ペプチドをコードする遺伝子でもよい。このような遺伝子としては特に、エプスタイン−バールウイルス、HIVウイルス、B型肝炎ウイルス(EP185573)、疑狂犬病ウイルスの特異抗原ペプチド、又は腫瘍特異抗原ペプチド(EP259212)が挙げられる。遺伝子は目的産物をコードする任意DNA(gDNA、cDNA等)であり得、場合により適当な発現シグナル(プロモーター、ターミネーター等)を含む。
これらのウイルスはこれらの組換えタンパク質の製造にin vitro使用することができる。これらのタンパクの作用メカニズムを研究するため又は遺伝子発現もしくはプロモーター活性の調節を研究するためにin vitro使用することもできる。動物モデル又はトランスジェニック動物の作出のためにin vivoで使用することもできる。遺伝子又は細胞治療アプローチで動物又はヒトに遺伝子をin vivo導入及び発現させるためにも使用することができる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は単に例示であり、発明を限定するものではない。
図面の説明
図1:baculo−E1,E4を使用した第3世代欠損組換えアデノウイルス(E1及びE4機能を欠損)の製造スキーム。
図2〜4:欠損アデノウイルスゲノムを導入するための第1のバキュロウイルスと相補機能を導入するための第2のバキュロウイルスを使用した最小アデノウイルスの製造スキーム。
図5:baculo−Rep/Capを使用したRep及びCap機能を欠損する組換えAAVの製造スキーム。
実施例
1.使用した細胞
本発明の範囲で使用する細胞はアデノウイルス、AAV又はレトロウイルスとバキュロウイルスにより感染可能であり、治療目的の使用に適合可能な任意細胞系又は細胞集団に由来するものを利用できる。哺乳動物、特にヒト細胞が好ましい。特に以下の細胞を挙げることができる。
−293系細胞
293系はアデノウイルス血清型5(Ad5)のゲノムの左側末端(約11〜12%)を含むヒト胎児腎細胞系であり、左側ITR、パッケージング領域、E1a,E1bを含むE1領域、pIXタンパク質をコードする領域及びpIVa2タンパク質をコードする領域の一部を含む(Grahamら,J.Gen.Virol.36(1977)59)。この系はE1領域を欠損即ちE1領域の全部又は一部を欠失する組換えアデノウイルスをトランス相補することができ、高力価をもつウイルスストックを生産することができる。
−A549系細胞
アデノウイルスのE1領域を相補する細胞をA549細胞から構築した(Imlerら,Gene Ther.(1996)75)。これらの細胞は、誘導プロモーターの制御下におかれたE1領域から左側ITRを除去したフラグメントを含む。
−HER系細胞
ヒト胎児網膜細胞(HER)はアデノウイルスにより感染可能である(Byrdら,Oncogene 2(1988)477)。これらの細胞から作製したアデノウイルスパッケージング細胞は例えば国際出願WO94/28152又はFallauxらの論文(Hum.Gene Ther.(1996)215)に記載されている。具体的には、HER細胞のゲノムに組み込まれたヌクレオチド79〜ヌクレオチド5789のアデノウイルスAd5のゲノムのE1領域を含む911系を挙げることができる。この細胞系はE1領域を欠損するウイルスを生産することができる。
−IGRP2細胞
IGRP2細胞は誘導プロモーターの制御下のE4領域の機能ユニットを組み込むことにより293細胞から得られる細胞である。これらの細胞はE1及びE4領域を欠損するウイルスを生産することができる(Yehら,J.Virol(1996)70)。
−VK細胞
VK(VK2−20及びVK10−9)細胞は誘導プロモーターの制御下のE4領域全体とpIXタンパク質をコードする領域を組み込むことにより293細胞から得られる細胞である。これらの細胞はE1及びE4領域を欠損するウイルスを生産することができる(Krougliakら,Hum.Gene Ther.6(1995)1575)。
−293E4細胞
293E4細胞はE4領域全体を組み込むことにより293細胞から得られる細胞である。これらの細胞はE1及びE4領域を欠損するウイルスを生産することができる(WO95/02697;Cancer Gene Ther.(1995)322)。
−Sf9及びSf21細胞は鱗翅目胚細胞である。これらの細胞は寄託菌(No.CRL−1711 ATCC)とその培養条件で入手できる。市販品もある(Gibco)。KingとPossee:The baculovirus expression system,London:Chapman & Hall,1992も参照されたい。
−ヒト肝細胞
HepG2及びHep3B及びHuH7細胞は肝細胞癌に由来するヒト細胞系である。これらの細胞は寄託菌から入手でき、その性質は例えば米国特許第4,393,133号及び4,393,133号に記載されている。
−ヒトKB細胞系:ヒト上皮癌に由来し、ATCC(CCL17)及びその培養条件から入手可能である。
−ヒトHela細胞系:ヒト上皮癌に由来し、ATCC(CCL2)及びその培養条件から入手可能である。
−W162細胞系:これらの細胞はアデノウイルスAd2のE4領域をそのゲノムに組み込んだvero細胞である。これらの細胞はWeinbergら(PNAS80(1983)5383)により記載されている。
2.ヒト細胞の組換えバキュロウイルス感染
本実施例はバキュロウイルスのヒト起源細胞への感染能に関する。
RSVのLTRの制御下にLacZ遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスの溶液の種々の希釈液をヒト細胞(特に293又はその誘導体)に感染させる。感染から48時間後に青色細胞の出現が認められ、これらの細胞にバキュロウイルスを感染できることが判明する。
3.アデノウイルスのE1領域を発現するバキュロウイルスおよび対応する欠損アデノウイルスの構築
3−1 2種のE1発現カセットのクローニング
プラスミドAE2はオリゴヌクレオチド5’−TCCTTGCATTTGGGTAACAG−3’及び5’−GCGGCCGCTCAATCTGTATCTTC−3’を用いてpBRE31で実施したPCRの産物をPCRII(Invitrogen)にクローニングすることにより得られ、このPCR産物はAd5のヌクレオチド3198〜3511即ちE1B領域の3’末端を含む。プラスミドpBRE1はほぼヌクレオチド1300〜2300を欠失するpBR322にクローニングしたAd5のヌクレオチド1〜5788を含む。
プラスミドAE3はpCDNA3(Invitrogen)をNotI−KpnIで消化し、PCR産物を含むAE2のNotI−KpnIフラグメントをクローニングすることにより得られる。AE3はAd5のヌクレオチド3198〜3511とそれに後続するBGHのポリアデニル化部位を含む。
プラスミドAE4はpBRE1にAE3のBglII−PvuIIフラグメントをクローニングすることにより得られる。AE4は以下のE1発現カセットを含むプラスミドである。
−Ad5のヌクレオチド1〜3511、即ち左側ITR、パッケージング配列、E1Aプロモーター、E1A遺伝子、E1Bプロモーター、E1B遺伝子、
−pCDNA3に由来するウシ成長ホルモン(BGH)のポリA。
pBRE1をBstNIで消化した後、T4 DNAポリメラーゼで消化して5’付着末端を平らにした後、XbaIで消化した。こうして作製したAd5のヌクレオチド391〜1339を含むフラグメントをSmaI−XvaI(非メチル化部位)で消化したpic20Hに導入し、プラスミドAE5を作製した。
プラスミドAE6はEcoRI−SmaIで消化したAE4にAE5のEcoRI−SmaIフラグメントをクローニングすることにより得られる。AE6は以下のE1発現カセットを含むプラスミドである。
−Ad5のヌクレオチド391〜3511、即ちE1Aの「短縮」プロモーター、E1A遺伝子、E1Bプロモーター、E1B遺伝子、
−pCDNA3に由来するウシ成長ホルモン(BGH)のポリA。
3−2 前記2種のE1カセットのバキュロウイルスクローニング
プラスミドAE4及びAE6の(付着5’末端SphIをT4 DNAポリメラーゼ消化により予め平滑にしておいた)EcoRI−SphIフラグメントをプラスミドpAcSG2(Pharmingen)のEcoRI及びEcoRV部位間にクローニングする。こうして夫々プラスミドAE14及びAE15を作製する。いずれの場合も、多面体遺伝子の遺伝子座にE1領域を導入する。
プラスミドAE14及び15をAcNPV株(Pharmingen)に由来するバキュロウイルスBaculoGoldのDNAと共に昆虫細胞Sf9に同時トランスフェクトし、多面体の遺伝子の遺伝子座に組み込まれた2種のE1発現カセットをもつ対応する2種の組換えバキュロウイルスBacAE14及びBacAE15を作製する。
3−3 新規E1欠失をもつ組換えアデノウイルスのクローニング
プラスミドpCO1(WO96/10088)をBstXIで消化した後、T4 DNAポリメラーゼで消化して付着3’末端を除去した後、RsaIで消化した。こうして作製されたAd5のヌクレオチド3513〜4607を含むフラグメントを、EcoRVで直鎖化してウシアルカリホスファターゼで消化しておいたpBS−SK+(Stratagene)に導入し、プラスミドAE0を作製した。
プラスミドpMA37は以下のフラグメントの連結により得られる。
−sacBを含むpXL2756のEcoRV−NsiIはそのEcoRI及びKpnI部位を除去した逆選択遺伝子SacBと、カナマイシン耐性遺伝子と、クローニング多重部位と、ColE1複製起点をもつ。
−(アデノ配列を含む)pCO1のNdeI−NsiI。
−pXL2756(カナマイシン耐性ベクター)のSalI(T4 DNAポリメラーゼにより平らにした付着5’末端)−AseI。
従って、pMA37は、
−カナマイシン耐性遺伝子と、
−これを発現する細菌にスクロース感受性を付与するSacB遺伝子と、
−Ad5の1〜382配列(HinfI)とそれに続くAd5の3446〜4415配列(NsiI)を含み、導入遺伝子は存在しない。
SalI−NsiIで消化したpMA37にAE0のXhoI−NsiIフラグメントを導入することによりプラスミドAE11を構築した。従って、このプラスミドは、
−カナマイシン耐性遺伝子と、
−これを発現する細菌にスクロース感受性を付与するSacB遺伝子と、
−Ad5の1〜382配列(HinfI)とそれに続くAd5の3513〜4415配列(NsiI)を含み、導入遺伝子は存在しない。
次に、プラスミドAE11から(目的導入遺伝子の挿入により)大腸菌で組換えにより組換えアデノウイルスの構築を可能にする自殺シャトルベクターを構築する。AE11はプラスミドAE6と相同の配列を含まない。プラスミドAE11及びAE4は共通してE1Aの上流にAd5の1〜382配列(Hinf)を含むが、これらの2種のプラスミド間でE1カセットの下流に相同は存在しない。従って、AE11に存在するE1欠失(即ち382〜3513)をもつアデノとバキュロウイルスBacAE14又はBacAE15の間の相同組換えによりRCAが発生する可能性はない。
3−4 第1世代組換えアデノウイルスの構築
まず、慣用技術に従ってBacAE14又は15のストックを調製する。次に、PacIで消化したプラスミドpXL2822(プラスミドpXL2822は完全Ad5からE1(382〜3446又は382〜3513)とE3(28592〜30470)を欠失し、カセットCMV−βGalをもつ)5gをコンピテント細胞(例えばHuH7)にトランスフェクトし、同時又は非同時に、MOI 10〜1000でBacAE14又は15を感染させる。細胞が溶解したら、トランスフェクション上清を回収し、その後、予め又は同時にBacAE14又は15(MOI 10〜1000)を感染させた「新規」コンピテント細胞に加えてアデノウイルスAd2822を増幅し、Ad2822のストックが得られるまで同様に操作する。Ad2822の増幅のモニターはこのウイルスにおけるlacZの存在によりできる。各増幅毎に上清をW162で疑似力価測定する。増幅時にウイルスのゲノムを分析し、その完全性を確認する。最後に、このストラテジーは、こうして製造したアデノウイルスストックにRCAを生じる可能性がないという利点がある。この汚染の不在も確認する。
4.アデノウイルスのE1及びE4領域を発現するバキュロウイルスの構築
4−1 バキュロウイルスE1,E4(Bac.E1−E4)の構築
以下のプロトコールを使用する。シャトルベクターpBacPAK8(Clontech,米国)の多面体の遺伝子(Ph)の遺伝子座にE1及びE4領域を逆向きにクローニングし、pBacE1−E4を得る。次に、慣用技術によりpBacE1−E4とバキュロウイルスBacPAK6のDNAをSf9細胞にコトランスフェクトすることにより組換えバキュロウイルスを単離する(KittsとPossee,Biotechniques 14(5)(1993)810)。次に、感染Sf9細胞からPCRにより組換えバキュロウイルスのゲノム中のE1及びE4の存在を確認する。精製組換えバキュロウイルスを感染させたHuh7細胞へのE1及びE4の転写を細胞質RNAからRT−PCRにより分析する。
バキュロウイルスE1−E4を構築するためには、E1をもつ種々のフラグメントを導入することができる。本実施例で使用するフラグメントはバキュロウイルス−E1の構築に関して実施例3に記載したものであり、適正なプロモーター(短縮E1aプロモーター及びE1bプロモーター)に制御下のE1領域を含む。使用するE4フラグメントは以下の通りである。
−完全なE4をもつMaeII−MscI 32720〜35835フラグメント、
−ORF6をもつBglII−PvuII 34115〜33126フラグメント、
−ORF6−ORF6/7をもつBglII−BglII 34115〜32490フラグメント、
−ORF3をもつPvuII−AluI 34801〜334329フラグメント。
これらのフラグメントはE4プロモーターの制御下においてもよいし、他のプロモーター、特にHSV−TK、CMV又はLTR−RSVプロモーターの制御下においてもよい。
上記位置はデータベースから入手可能なアデノウイルスAd5の公表配列に基づく。種々の血清型のアデノウイルスには多少の相違が存在する場合もあるが、これらの位置は一般に他の血清型、特にAd2、Ad7、Ad12及びAdCAV−2にも適用できる。
4−2 Bac.E1−E4によるAdΔE1ΔE4−LacZのトランス相補
アデノウイルスAdΔE1ΔE4−LacZの生産は、実施例4−1で調製したバキュロウイルスE1,E4とE1及びE4を欠損するアデノウイルスゲノムをコンピテント細胞に導入することにより得られる(図1参照)。精製Bac.E1−E4のトランス相補によるコンピテント細胞におけるAdΔE1ΔE4−LacZの最適生産条件を分析する。W162系におけるβ−ガラクトシダーゼのトランスダクション単位(t.d.u.)数としてAdΔE1ΔEの力価を測定し、得られたトランスン相補効率をパッケージング系IGRP2の効率と比較する。
5.アデノウイルスのゲノムの全体を相補するバキュロウイルスの構築
13kbまでの配列に相当し得る数種のタンパク質を単一ウイルスから同時発現することは報告されている(BelyaevとRoy,NAR 21(1993)1219)が、バキュロウイルスの最大クローニング能は十分に実証されていない。本実施例は、パッケージングシグナルを欠失し(Ad.Psi−)、2個のLoxP部位で挟まれたアデノウイルス(loxP−ITR−ITR〜E4−loxP)のゲノムをバキュロウイルスにクローニングできることを立証する。Creリコンビナーゼを誘導的又は非誘導的(Cre又はCre−ER系、実施例7参照)に発現するコンピテント細胞にこの組換えバキュロウイルスを感染させ、Creリコンビナーゼを活性化させると、アデノウイルスゲノムの切除と環化が可能になる。以後、アデノウイルスゲノムは初期遺伝子の導入、複製、後期遺伝子の活性化が可能になるが、パッケージングはできないので最小アデノウイルスの製造用ヘルパーとして利用する(図2〜4参照)。このシステムでは、2種のバキュロウイルスのコインフェクションと、loxP部位間の2回の組換えイベントの実施により最小アデノウイルスを製造する。このアプローチは、ヘルパーウイルスからアデノウイルス粒子を生成しないという利点がある。
ゲノムAd.Psi−の構築は大腸菌で実施する。このために、アデノウイルスAd5の完全ゲノムを原核クローニングベクターにクローニングし、ITRを結合する。酵素開裂と連結又は部位特異的突然変異誘発によりPsi配列を除去する。次に、アデノウイルスゲノムの両側に同じ向きにLoxP配列を導入する。得られた構築物[loxP−ITR−ITR,ΔPsi〜E4−loxP]を次に、実施例3に記載したストラテジーに従ってバキュロウイルスとの組換えを可能にするシャトルベクターにクローニングする。その後、得られた組換えバキュロウイルスBacAd.Psi−を慣用方法により単離する。
6.切除可能な形態で欠損組換えアデノウイルスのゲノムを含むバキュロウイルスの構築
本実施例は欠損組換えアデノウイルスのゲノムをコンピテント細胞に導入することが可能なバキュロウイルスの構築に関する。より詳細には、組換えアデノウイルスはコーディング領域全体を欠損し、ITR及びPsi領域のみを保存している(最小アデノウイルス又はAdΔ)。
6−1 大腸菌におけるミニゲノム(AdΔ)の構築
プラスミドP[loxP−(ITR−ITR−Psi−P.CMV−LacZ−pA)−loxP]を構築する。このために、アデノウイルスのITR配列のコピーを酵素切断により単離及び/又はPCRにより増幅した後、アデノウイルスのシャトルベクターpGY63に含まれるITR−Psi配列の上流にクローニングする。このベクターはpCO1(WO96/10088)に由来し、ITR−Psi配列とpIXをコードする遺伝子の間にクローニングしたSV40ウイルスのポリアデニル化シグナル(pA)を末端にもつサイトメガロウイルスの極初期プロモーター(P.CMV)の制御下のLacZ遺伝子をもつ。次に、(最小アデノウイルスのゲノムに対応する)このベクターの(ITR−ITR−Psi−P.CMV−LacZ−pA)領域を酵素切断により単離した後、プラスミドpBS246(Gibco)のクローニング多重部位のLoxP部位間にクローニングし、プラスミドp[loxP−(ITR−ITR−Psi−P.CMV−LacZ−pA)−loxP]を作製する。次に、Creリコンビナーゼ(AdCre)を発現するAd.ΔE1ΔE4を感染させたIGRP2系にこのプラスミドをトランスフェクトすることにより、環状DNAからアデノウイルスのミニゲノムを生産してパッケージングする能力を試験する。IGRP2系でトランスフェクション上清を数世代連続継代することにより、最小アデノウイルスを増幅する。その後、塩化セシウム勾配等密度遠心分離により精製し、W162系で偽滴定により定量する。当然のことながら、慣用分子生物学技術により、LacZ遺伝子を他の任意の目的核酸に容易に置き換えることができる。
6−2 切除可能なミニゲノムのバキュロウイルスクローニング
2つのloxP部位に挟まれた上記ミニゲノムAdΔをもつ構築物をシャトルベクターpAcUW1(Pharmingen,米国)でバキュロウイルスのP10遺伝子座にクローニングする。次に、バキュロウイルスBac.AdΔを生産し、上記Sf9細胞で慣用同時トランスフェクション技術により単離し、X−Gal染色後にプラーク表現型(白色)により選択する。従って、このバキュロウイルスは順方向に2つのloxP領域により挟まれた高度欠損アデノウイルスゲノムをもつ。
6−3 バキュロウイルスBacAdPsi−のトランス相補によるAdΔの生産。
アデノウイルスゲノム全体のトランス相補機能をもつバキュロウイルスBacAd.Psi−(実施例5に記載)と、(上記)偽アデノウイルスのゲノムをもつバキュロウイルスBac.AdΔをコンピテント細胞に同時にコンイフェクトする。培地にタンパク質を加えるか、又はCreを発現するプラスミドもしくはウイルス(バキュロウイルス)を細胞にトランスフェクトするか、又は(実施例7に記載するような)系のゲノムに安定に組み込んだカセットの発現によりCreリコンビナーゼを導入する。BacAd.Psi−と上清をコインフェクトした細胞の培養上清の連続継代により最小アデノウイルスを増幅した後、上記技術により精製及び滴定する。この方法によるとAdΔを単独ウイルスとして得られるので、慣用技術によりこれを単離及び精製すればよい。更に、得られる力価は工業用途に適合可能である。
7.Creタンパク質を発現する系の構築
誘導的又は非誘導的にCreを発現する系を構築し、本発明のバキュロウイルス(例えばBac.AdΔ及びBacAd.Psi−)におけるloxP部位間の組換え効率を増加すると共に、Creの発現を制御する。この構築物において、Creは誘導的又は非誘導的で好ましくは強力なユビキチンプロモーターの制御下に、エストラジオールレセプター(ER)結合ドメインとのC末端融合タンパク質として又は単独で発現される。より詳細には、使用するプロモーターはpGRE5プロモーター、メタロチオニンプロモーター、SV40プロモーター又はHSV−TK遺伝子のプロモーターである。
これらのCre系を構築するために、Cre発現カセット(Cre又はCre−ER)を含むプラスミドと、選択マーカー(Neo)のプラスミドの2種のプラスミドをコンピテント細胞にコトランスフェクトする。G418耐性クローンを選択し、これらのクローンにおけるCreの活性をプラスミドp(P.CMV−loxP−ATG−stop−pA−LoxP−LacZ)のコトランスフェクションにより試験する。このプラスミドは、3個のオープンリーディングフレームにおける一連のストップコドンと、2個のloxP部位に挟まれたSV40ウイルスの転写開始及びポリアデニル化シグナルをプロモーター(P.CMV)とLacZの始点の間に導入することにより不活化したLacZ遺伝子を含む。次に、2個のloxP部位間の組換えにより誘導したβ−ガラクトシダーゼ活性によりインデューサー(エストラジオール)の存在下又は不在下でのクローンにおけるCreの発現を試験する。こうして上記プロモーター及びコンピテント細胞から融合タンパク質Cre−ER又はCreタンパク質単独を安定に発現する数個のクローンを選択する。これらのクローンは本発明によるウイルスの製造に使用可能である。
Claims (42)
- 欠損組換えウイルスのゲノムと、欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスを、in vitroにおいて肝細胞集団であるコンピテント細胞集団に導入することを特徴とする欠損組換えウイルスの製造方法であって、該欠損組換えウイルスがアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択される欠損組換えウイルスである、欠損組換えウイルスの製造方法。
- バキュロウイルスが欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- バキュロウイルスが欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の一部を含み、残りの部分はコンピテント細胞により相補されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能が数種のバキュロウイルスにより導入されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 相補機能をもつバキュロウイルスとは異なる組換えバキュロウイルスと共に欠損組換えゲノムを細胞に導入することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 欠損組換えウイルスが欠損組換えアデノウイルスであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 欠損組換えゲノムを含むアデノウイルスの感染により前記ゲノムを細胞に導入することを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 欠損組換えゲノムをトランスフェクションにより細胞に導入することを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 組換えアデノウイルスのゲノムがE1、E2、E3、E4、L1〜L5、pIX及びIVa2から選択される1種以上の機能を欠損しており、バキュロウイルスが欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部を含むことを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 組換えアデノウイルスのゲノムがE1、E2、E3、E4、L1〜L5、pIX及びIVa2から選択される1種以上の機能を欠損しており、バキュロウイルスが欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の一部を含み、残りの部分は1種以上の他のバキュロウイルス及び/又はコンピテント細胞により導入されることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスがアデノウイルスのE1領域の全部又は一部を含み、E1領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相補を可能にすることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスがアデノウイルスのE2領域の全部又は一部を含み、E2領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相補を可能にすることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスがアデノウイルスのE4領域の全部又は一部を含み、E4領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相補を可能にすることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスがアデノウイルスのE1及びE4領域の全部又は一部を含み、E1及びE4領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相補を可能にすることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 組換えアデノウイルスのゲノムがアデノウイルスのコーディング領域全体を欠失しており、欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスがアデノウイルスゲノムのコーディング領域全体を含むことを特徴とする請求項6に記載の方法。
- バキュロウイルスがパッケージング領域を除き、アデノウイルスゲノムの全体を含むことを特徴とする請求項15に記載の方法。
- バキュロウイルスがパッケージング領域とITRを除き、アデノウイルスゲノムの全体を含むことを特徴とする請求項15に記載の方法。
- バキュロウイルスと欠損組換えウイルスのゲノムに存在する相補機能が組換えを生じる可能性のある相同ゾーンを含まないことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- E1領域を欠く組換えアデノウイルスゲノムをコンピテント細胞に導入し、これらの細胞に同時又は非同時にE1領域を含むバキュロウイルスを感染させることを特徴とする請求項18に記載の方法であって、バキュロウイルスに含まれるアデノウイルスE1領域と欠損組換えアデノウイルスのゲノムは組換えを起こすことができる相同ゾーンを含まないものである請求項18に記載の方法。
- E1及びE3領域を欠く組換えアデノウイルスゲノムをコンピテント細胞に導入し、これらの細胞に同時又は非同時にE1領域を含むバキュロウイルスを感染させることを特徴とする請求項18に記載の方法であって、バキュロウイルスに含まれるアデノウイルスE1領域と欠損組換えアデノウイルスのゲノムは組換えを起こすことができる相同ゾーンを含まないものである請求18に記載の方法。
- バキュロウイルスがアデノウイルスAd5の391〜3511フラグメントを含み、E1領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムがアデノウイルスAd5の391〜3511フラグメントより大きい欠失をもつことを特徴とする請求項19に記載の方法。
- バキュロウイルスがアデノウイルスAd5の391〜3511フラグメントを含み、E1領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムがヌクレオチド383〜3512(両端を含む)をカバーする欠失をもつことを特徴とする請求項21に記載の方法。
- バキュロウイルスに対して異種であるプロモーターの制御下におかれた、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択される欠損ウイルスの相補機能をコードする核酸をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルス。
- 相補機能がアデノウイルスのE1、E2、E4、L1〜L5、pIX及びIVa2領域単独又はその組み合わせによりコードされる機能の全部又は一部から選択されることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
- 相補機能がAAVのRep及びCap領域単独又はその組み合わせによりコードされる機能の全部又は一部から選択されることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
- 相補機能がレトロウイルスのgag、pol及びenv領域単独又はその組み合わせによりコードされる機能の全部又は一部から選択されることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
- 相補機能をコードする核酸が血清型Ad2又はAd5のアデノウイルスのゲノムのフラグメントに対応するDNAから構成されることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
- プロモーターが相補機能の発現に天然に関与するプロモーター領域により構成されることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
- プロモーターが調節又は非調節下の強力な細胞又はウイルスプロモーターであることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
- 相補機能がアデノウイルスゲノムのE1領域又は少なくともE1a領域を含む前記領域の一部のみを含むことを特徴とする請求項24に記載のバキュロウイルス。
- 相補機能がアデノウイルスゲノムのE4領域又は少なくともORF3もしくはORF6を含む前記領域の一部のみを含むことを特徴とする請求項24に記載のバキュロウイルス。
- アデノウイルスゲノムのコーディング領域全体を含むことを特徴とする請求項24に記載のバキュロウイルス。
- パッケージング領域を除き、完全アデノウイルスゲノムを含むことを特徴とする請求項32に記載のバキュロウイルス。
- AcNPV株であることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
- 核酸が多面体の遺伝子座又はp10遺伝子座に導入されていることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
- 核酸がコンピテント細胞で切除可能なカセットの形態で導入されていることを特徴とする請求項23に記載のバキュロウイルス。
- 順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする2つの配列に挟まれた少なくとも1個のDNA領域をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスであって、前記DNA領域がコンピテント細胞で機能的な少なくとも1個の複製起点と、欠損組換えウイルスの相補機能をコードする核酸を含む前記バキュロウイルスであって、該欠損組換えウイルスがアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択される欠損組換えウイルスであって、かつ当該部位特異的組換えを可能にする配列がP1バクテリオファージのLoxPであり、かつ組換えがCreタンパク質の存在下に得られることを特徴とするバキュロウイルス。
- 順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする2つの配列に挟まれた少なくとも1個のDNA領域をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスであって、前記DNA領域がコンピテント細胞で機能的な少なくとも1個の複製起点と、欠損アデノウイルスのゲノムを含む前記バキュロウイルスであって、当該部位特異的組換えを可能にする配列がP1バクテリオファージのLoxPであり、かつ組換えがCreタンパク質の存在下に得られることを特徴とするバキュロウイルス。
- 欠損組換えアデノウイルスのゲノムが主にITR領域と、パッケージング配列と、目的核酸を含むことを特徴とする請求項38に記載のバキュロウイルス。
- 請求項37に記載のバキュロウイルスと請求項38に記載のバキュロウイルスをin vitroにおいてコンピテント細胞集団に感染させ、部位特異的組換えを可能にするリコンビナーゼの存在下に前記細胞をおき、その後、生産されたアデノウイルスを回収することを特徴とする欠損組換えアデノウイルスの製造方法。
- コンピテント細胞集団が肝細胞集団であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- コンピテント細胞集団が、HuH7、Hep3B又はHepG2から選択されることを特徴とする請求項41に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR96/14278 | 1996-11-22 | ||
FR9614278A FR2756297B1 (fr) | 1996-11-22 | 1996-11-22 | Procede de production de virus recombinants |
PCT/FR1997/002073 WO1998022607A1 (fr) | 1996-11-22 | 1997-11-18 | Procede de production de virus recombinants |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001503993A JP2001503993A (ja) | 2001-03-27 |
JP2001503993A5 JP2001503993A5 (ja) | 2005-03-10 |
JP4686670B2 true JP4686670B2 (ja) | 2011-05-25 |
Family
ID=9497899
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP52328298A Expired - Lifetime JP4686670B2 (ja) | 1996-11-22 | 1997-11-18 | 組換えウイルスの製造方法 |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6387670B1 (ja) |
EP (1) | EP0946741B1 (ja) |
JP (1) | JP4686670B2 (ja) |
KR (1) | KR100719645B1 (ja) |
AT (1) | ATE317908T1 (ja) |
AU (1) | AU731106B2 (ja) |
BR (1) | BR9713388B1 (ja) |
CA (1) | CA2271438C (ja) |
CZ (1) | CZ293947B6 (ja) |
DE (1) | DE69735274T2 (ja) |
ES (1) | ES2260803T3 (ja) |
FR (1) | FR2756297B1 (ja) |
HU (1) | HU224713B1 (ja) |
IL (1) | IL129686A (ja) |
NO (2) | NO323937B1 (ja) |
SK (1) | SK286900B6 (ja) |
WO (1) | WO1998022607A1 (ja) |
ZA (1) | ZA9710516B (ja) |
Families Citing this family (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6793926B1 (en) * | 1999-05-27 | 2004-09-21 | Genovo, Inc. | Methods for production of a recombinant adeno-associated virus |
CA2375119A1 (en) * | 1999-05-27 | 2000-12-07 | Genovo, Incorporated | Compositions and methods for production of recombinant virus using a carrier vector derived from a nonmammalian virus |
AU5448400A (en) * | 1999-05-28 | 2000-12-18 | Mount Sinai School Of Medicine, The | A novel baculovirus/adenovirus hybrid vector for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors |
GB9919409D0 (en) | 1999-08-18 | 1999-10-20 | Univ Oxford Brookes | Baculovirus expression system |
CA2494772C (en) | 2002-08-29 | 2015-12-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Circular nucleic acid vectors, and methods for making and using the same |
GB0702694D0 (en) * | 2007-02-12 | 2007-03-21 | Ark Therapeutics Ltd | Vectors |
GB0702695D0 (en) * | 2007-02-12 | 2007-03-21 | Ark Therapeutics Ltd | Production of vectors |
EP2019143A1 (en) | 2007-07-23 | 2009-01-28 | Genethon | CNS gene delivery using peripheral administration of AAV vectors |
EP2058401A1 (en) | 2007-10-05 | 2009-05-13 | Genethon | Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors |
EP2249950B1 (en) * | 2008-03-05 | 2014-10-15 | Council of Scientific & Industrial Research | A polymeric hybrid membrane |
EP2287323A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-23 | Association Institut de Myologie | Widespread gene delivery to the retina using systemic administration of AAV vectors |
EP2292781A1 (en) | 2009-08-17 | 2011-03-09 | Genethon | Baculovirus-based production of biopharmaceuticals free of contaminating baculoviral virions |
WO2011123088A1 (en) * | 2010-04-01 | 2011-10-06 | Weidong Xiao | Compositions and methods for the production of recombinant virus vectors |
US9644187B2 (en) | 2010-04-14 | 2017-05-09 | Emd Millipore Corporation | Methods of producing high titer, high purity virus stocks and methods of use thereof |
US9677088B2 (en) | 2012-05-09 | 2017-06-13 | Oregon Health & Science University | Adeno associated virus plasmids and vectors |
TWI702955B (zh) | 2012-05-15 | 2020-09-01 | 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 | 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd) |
US20150182637A1 (en) | 2012-06-21 | 2015-07-02 | Association Institut De Myologie | Widespread gene delivery of gene therapy vectors |
WO2015031686A1 (en) | 2013-08-30 | 2015-03-05 | Amgen Inc. | High titer recombinant aav vector production in adherent and suspension cells |
SG10201810150UA (en) | 2014-03-17 | 2018-12-28 | Adverum Biotechnologies Inc | Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells |
CN107405507B (zh) | 2015-03-02 | 2022-05-03 | 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 | 用于将多核苷酸玻璃体内递送到视网膜视锥的组合物和方法 |
GB2545763A (en) | 2015-12-23 | 2017-06-28 | Adverum Biotechnologies Inc | Mutant viral capsid libraries and related systems and methods |
EP3716990A4 (en) | 2017-11-27 | 2021-12-08 | Coda Biotherapeutics, Inc. | COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR NEUROLOGICAL DISEASES |
US10610606B2 (en) | 2018-02-01 | 2020-04-07 | Homology Medicines, Inc. | Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof |
EP3755795A4 (en) | 2018-02-19 | 2022-07-20 | Homology Medicines, Inc. | ADENO-ASSOCIATED VIRUS COMPOSITIONS FOR RECOVERING F8 GENE FUNCTION AND METHODS OF USE THEREOF |
CN113924115A (zh) | 2019-01-31 | 2022-01-11 | 俄勒冈健康与科学大学 | 用于aav衣壳的使用转录依赖性定向进化的方法 |
CA3151920A1 (en) | 2019-08-21 | 2021-02-25 | Coda Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for neurological diseases |
TW202140791A (zh) | 2020-01-13 | 2021-11-01 | 美商霍蒙拉奇醫藥公司 | 治療苯酮尿症之方法 |
TW202208632A (zh) | 2020-05-27 | 2022-03-01 | 美商同源醫藥公司 | 用於恢復pah基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法 |
GB202013940D0 (en) | 2020-09-04 | 2020-10-21 | Synpromics Ltd | Regulatory nucleic acid sequences |
CA3195177A1 (en) | 2020-10-07 | 2022-04-14 | Asklepios Biopharmaceutical, Inc. | Therapeutic adeno-associated virus delivery of fukutin related protein (fkrp) for treating dystroglycanopathy disorders including limb girdle 2i (lgmd2i) |
WO2023212298A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Broadwing Bio Llc | Bispecific antibodies and methods of treating ocular disease |
WO2023212294A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Broadwing Bio Llc | Angiopoietin-related protein 7-specific antibodies and uses thereof |
WO2023212293A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Broadwing Bio Llc | Complement factor h related 4-specific antibodies and uses thereof |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL92298A (en) * | 1988-11-14 | 2001-04-30 | Us Secretary U S Dept Of Comme | Method for producing isolated empty b19 parvovirus capsids, introducing genes into cells utilizing the same, diagnostic assays for detecting parvovirus infection and an anti-parvovirus vaccine containing said capsids |
US5559099A (en) * | 1994-09-08 | 1996-09-24 | Genvec, Inc. | Penton base protein and methods of using same |
WO1996009074A1 (en) * | 1994-09-23 | 1996-03-28 | The General Hospital Corporation | Use of a non-mammalian dna virus to express an exogenous gene in a mammalian cell |
-
1996
- 1996-11-22 FR FR9614278A patent/FR2756297B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-11-18 CZ CZ19991822A patent/CZ293947B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 KR KR1019997004531A patent/KR100719645B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 AU AU52261/98A patent/AU731106B2/en not_active Expired
- 1997-11-18 IL IL12968697A patent/IL129686A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 HU HU0001762A patent/HU224713B1/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 1997-11-18 WO PCT/FR1997/002073 patent/WO1998022607A1/fr active IP Right Grant
- 1997-11-18 CA CA2271438A patent/CA2271438C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 US US09/308,398 patent/US6387670B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 EP EP97947083A patent/EP0946741B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 SK SK666-99A patent/SK286900B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 ES ES97947083T patent/ES2260803T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 BR BRPI9713388-4A patent/BR9713388B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 DE DE69735274T patent/DE69735274T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 JP JP52328298A patent/JP4686670B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 AT AT97947083T patent/ATE317908T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-11-21 ZA ZA9710516A patent/ZA9710516B/xx unknown
-
1999
- 1999-05-21 NO NO19992464A patent/NO323937B1/no not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-05-09 US US10/141,491 patent/US20030022356A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-04-15 NO NO2013009C patent/NO2013009I1/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU5226198A (en) | 1998-06-10 |
CZ293947B6 (cs) | 2004-08-18 |
FR2756297A1 (fr) | 1998-05-29 |
JP2001503993A (ja) | 2001-03-27 |
EP0946741B1 (fr) | 2006-02-15 |
SK66699A3 (en) | 2000-02-14 |
NO2013009I1 (no) | 2013-04-29 |
SK286900B6 (sk) | 2009-07-06 |
KR100719645B1 (ko) | 2007-05-17 |
HUP0001762A3 (en) | 2002-01-28 |
HUP0001762A2 (hu) | 2000-09-28 |
ATE317908T1 (de) | 2006-03-15 |
CA2271438A1 (fr) | 1998-05-28 |
BR9713388B1 (pt) | 2009-01-13 |
US6387670B1 (en) | 2002-05-14 |
EP0946741A1 (fr) | 1999-10-06 |
CA2271438C (fr) | 2010-10-26 |
IL129686A0 (en) | 2000-02-29 |
NO992464D0 (no) | 1999-05-21 |
BR9713388A (pt) | 2000-03-21 |
KR20000057202A (ko) | 2000-09-15 |
FR2756297B1 (fr) | 1999-01-08 |
HU224713B1 (en) | 2006-01-30 |
DE69735274T2 (de) | 2006-10-12 |
IL129686A (en) | 2005-12-18 |
DE69735274D1 (de) | 2006-04-20 |
ES2260803T3 (es) | 2006-11-01 |
AU731106B2 (en) | 2001-03-22 |
WO1998022607A1 (fr) | 1998-05-28 |
US20030022356A1 (en) | 2003-01-30 |
ZA9710516B (en) | 1998-06-10 |
CZ182299A3 (cs) | 1999-08-11 |
NO992464L (no) | 1999-06-23 |
NO323937B1 (no) | 2007-07-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4686670B2 (ja) | 組換えウイルスの製造方法 | |
JP3672494B2 (ja) | 機能的ゲノム適用にライブラリーを使用される遺伝子機能に関する高度処理能力スクリーニング法 | |
US6365394B1 (en) | Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus | |
US6878549B1 (en) | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy | |
US6156497A (en) | Recombinase-mediated generation of adenoviral vectors | |
KR102609021B1 (ko) | 아데노바이러스 벡터 | |
JP4190028B2 (ja) | 欠陥組換えアデノウイルスベクター及び遺伝子治療での使用 | |
AU759573B2 (en) | Adeno-associated virus and adenovirus chimeric recombinant viruses useful for the integration of foreign genetic information into the chromosomal DNA of target cells | |
US20200157567A1 (en) | Viral Vector | |
US20060210965A1 (en) | Efficient generation of adenovirus-based libraries by positive selection of adenoviral recombinants through ectopic expression of the adenovirus protease | |
JP2004517610A (ja) | 自己再編成性dnaベクター | |
MXPA99004449A (en) | Method for producing recombinant virus | |
AU7560500A (en) | Modified adenoviral vectors for use in gene therapy | |
JP2002535961A (ja) | ヘルパー依存性アデノウイルスベクター生産用細胞の製法およびその使用法 | |
US7585498B2 (en) | Regulation of adenovirus DNA packaging by IPTG | |
EP1083228A1 (en) | Modified adenoviral vectors for use in gene therapy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040622 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040622 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20050304 |
|
A72 | Notification of change in name of applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A721 Effective date: 20050304 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060725 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20061016 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20061204 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070125 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070410 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070803 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20071004 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20071129 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100329 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100401 |
|
RD13 | Notification of appointment of power of sub attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7433 Effective date: 20100726 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101014 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20101227 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101228 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110113 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140225 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |