NO323937B1 - Rekombinante hjelpe baculovirus samt fremgangsmate for fremstilling av rekombinante virus. - Google Patents
Rekombinante hjelpe baculovirus samt fremgangsmate for fremstilling av rekombinante virus. Download PDFInfo
- Publication number
- NO323937B1 NO323937B1 NO19992464A NO992464A NO323937B1 NO 323937 B1 NO323937 B1 NO 323937B1 NO 19992464 A NO19992464 A NO 19992464A NO 992464 A NO992464 A NO 992464A NO 323937 B1 NO323937 B1 NO 323937B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- baculovirus
- genome
- recombinant
- defective
- adenovirus
- Prior art date
Links
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 title claims description 183
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 86
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 179
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 172
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 112
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 90
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 56
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 39
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 39
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 37
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 22
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 14
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 12
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 11
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 claims description 9
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 claims description 7
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 4
- 101150032643 IVa2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 claims description 2
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 claims 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 91
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 28
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 24
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 101710200251 Recombinase cre Proteins 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 7
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 4
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 4
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 4
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 2
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 2
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 2
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 2
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 2
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 2
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 2
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 2
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 2
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 2
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 2
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 101150047856 Cav2 gene Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 2
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 2
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 2
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 2
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 2
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 2
- 101000607560 Homo sapiens Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 3 Proteins 0.000 description 2
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 2
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 2
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 2
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 2
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 2
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 description 2
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 2
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 2
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 2
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 2
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 2
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 2
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 2
- 102100039936 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 3 Human genes 0.000 description 2
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 description 2
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 2
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- -1 ApoATV Proteins 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 208000037088 Chromosome Breakage Diseases 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 241000210651 Enterobacteria phage 1 Species 0.000 description 1
- 241000701148 Equine adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000702189 Escherichia virus Mu Species 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004862 Gastrin releasing peptide Human genes 0.000 description 1
- 108090001053 Gastrin releasing peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000004038 Glia Maturation Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102100032889 Sortilin Human genes 0.000 description 1
- 241000713896 Spleen necrosis virus Species 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000459 effect on growth Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N gastrin-releasingpeptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001738 isopycnic centrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000004991 spatiotemporal regulation Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pens And Brushes (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante virus. De fremstille virusene kan anvendes som klonings- og/eller ekspresjonsvektorer for gener in vitro, ex vivo eller in vivo. Videre vedrører foreliggende oppfinnelse rekombinante hjelpe baculovirus.
Vektorer av viral opprinnelse finner utstrakt anvendelse for kloning, overføring og ekspresjon av gener in vitro (for fremstilling av rekombinante proteiner, gjennomføring av søkingstester, studie av regulering av gener, og så videre), ex vivo eller in vivo (for å sette opp dyremodeller, eller ved terapeutiske anvendelser). Blant disse virus kan man særlig nevne adenovirusene, de adeno-assosierte virus (AAV), retrovirus, herpesvirus eller også vaksinevirus.
Adenoviridae-familien har stor utbredelse hos pattedyr og fugler og omfatter mer enn 100 forskjellige serotyper av virus som ikke er omhyllet av bikatenær DNA, med en ikosaedrisk kapsidsymmetri (Horwitz i B.N Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley, utg. "Virology". 3. utgave, utg. Philadelphia: Raven Publishers, 1996: 2149-2171). I tillegg til sin ufarlighet har adenovirusen en meget stor cellulær tropi. I motsetning til retrovirus der syklus er avhengig av celledeling, kan den infisere celler under aktiv deling og hvilende celler og genomet opprettholdes i episomal form. Videre kan de fremstilles i store mengder (10<11> pfu/ml). Disse vesentlige fordeler har gjort dem til en valgt vektor for kloning og ekspresjon av heterologe gener. Adenovirus av gruppe C, særlig typene 2 og 5, samt canine-adenovirus av type CAV-2, hvis molekylære biologi er best kjent, er opprinnelsen for de mest benyttede vektorer.
Adenovirusen har et lineært genom på 36 kb og som ender i hver ende med inverse, repeterte sekvenser (ITR) på 103 bp omfattende en replikasjonsopprinnelse samt et enkapsideringssignal som befinner seg nær den venstre ITR (Shenk, "Adenoviridae: The Vimses and Their Replication". i B.N Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley, utg. "Virology", Philadelphia: Raven Publishers, 1996: 2111-2148). Tre familier av gener uttrykker seg under den virale syklus: - De umiddelbare tidlige gener (El, E2, E3 og E4) som er involvert i reguleringen av cellulære gener som særlig tillater inngang i cellen i S-fase (EIA) og inhibering av apoptose (E1B). De intervenerer også i reguleringen av virale, tidlige eller sene gener under transkripsjon, spleising eller transport av mRNA'er (EIA, E2A, E4). De spiller også en rolle ved replikasjon og ved unnslipping av den immunitære respons. - De forsinkede, tidlige gener (pXI og IVa2) er bundet til reguleringen av transkripsjonen av de sene gener (IVa2) eller til virion-sammensetningen (pDC). - De sene gener (LI til L5) transkriberes fra den sterke promotor (MLP). Et primærtranskript på 28 kb tillater å generere tilsvarende transkripter til forskjellige strukturelle (kjerne, penton, hekson) og ikke-strukturelle proteiner som deltar i sammensetningen og i modningen av virale partikler, ved alternativ spleising og anvendelse av de 5 polyadenyleirngsseter.
Adenovirale vektorer har vært benyttet for kloning og ekspresjon av gener in vitro (Gluzman et al., Cold Spring Harbor, New York, 11724, s. 187), for å skape transgene dyr (WO 95/22616) for overføring av gener i celler ex vivo (WO 95/14785, WO 95/06120) eller også for overføring av gener i celler in vivo (se særlig WO 93/19191, WO 94/24297, WO 94/08026).
Når det angår de adeno-assosierte virus, AAV, dreier det seg om virus med relativt redusert DNA-størrelse som integrerer seg i genomet av cellene de infiserer på stabil og relativt setespesifikk måte. De er i stand til å infisere et stort spektrum av celler uten å indusere noen effekt på vekst, morfologi eller celledifferensiering. Videre synes de ikke å være involvert i patologier hos mennesker. Genomet av AAV'er er klonet, sekvensert og karakterisert. De omfatter rundt 4700 baser og inneholder i hver ende et repetert, inverst område, ITR, på ca. 145 baser som tjener som replikasjonsopprinnelse for viruset. Resten av genomet er delt i to vesentlige områder som bærer enkapsiderings-funksjonene: den venstre del av genomet som inneholder genet rep involvert i den virale replikasjon og ekspresjon av virale gener; den høyre del av genomet som inneholder genet cap som koder for kapsidproteinene av viruset.
Anvendelsen av vektorer avledet fra AAV'er for overføring av gener in vitro og in vivo er beskrevet i litteraturen, (se særlig WO 91/18088; WO 93/09239; US 4 797 368, US 5 139 941, EP 488 528).
Hva angår retrovirusene, dreier det seg om integrative virus som selektivt infiserer celler under deling. De utgjør således vektorer av interesse for, for eksempel cancer- eller restenose anvendelser. Genomet av retrovirusene omfatter i det vesentlige to LTR'er, en enkapsideirngssekvens og tre kodende områder (gag, pol og env). Konstruksjonen av rekombinante vektorer og deres anvendelse in vitro eller in vivo er beskrevet i stor grad i litteraturen og det skal særlig henvises til Breakfield et al., "New Biologist", 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al., "Genet. Eng.", 7 (1985) 235; McCormick, "BioTechnology", 3 (1985) 689, og så videre.
For deres anvendelse som rekombinante vektorer, er det fremstilt forskjellige konstruksjoner avledet fra virus og som omfatter forskjellige gener av interesse. I hver av disse konstruksjoner er det virale genom modifisert for å gjøre viruset i stand til autonom replikasjon i den infiserte celle. Således er konstruksjonene som er beskrevet i den kjente teknikk, virus som er defekte for visse områder i genomet som er essensielle for replikasjonen. Særlig oppviser, når det dreier seg om adenovirus, konstruksjonene av første generasjon, en delesjon i området El, essensiell for den virale replikasjon, i hvilket det er skutt inn heterologe DNA-sekvenser (Levrero et al., "Gene", 101 (1991), 195; Gosh-Choudhury et al., "Gene", 50 (1986), 161). For imidlertid å forbedre vektor-egenskapene har det vært foreslått å skape andre delesjoner eller modifikasjoner i adenovirusens genom. Således er en termosensibel punktmutasjon innført i mutanten ts 125 som tillater å inaktivere proteinet på 72 kDa av bindingen til DNA (DBP), kodet av området E2 (Van der Vliet et al., 1975). Andre vektorer omfatter en delesjon i et annet område som er vesentlig for viral replikasjon og/eller propagering, området E4. De adenovirale vektorer der områdene El og E4 er deletert har en meget redusert transkripsjonsbakgrunnsstøy og meget redusert ekspresjon av virale gener. Slike vektorer er beskrevet for eksempel i WO 94/28152, WO 95/02697, WO 96/22378. Slike vektorer som bærer en modifikasjon i genet IVa2 er også beskrevet (WO 96/10088). Videre er vektorer kalt "minimum-adenovirus" eller "pseudo-adenovirus" (eller også ADA) som ikke bærer annet enn de områder som er nødvendig i cis for produksjon av virusen (ITR-sekvenser og enkapsideringssekvenser) og berøvet enhver kodende viral sekvens, også beskrevet WO 94/12649, WO 94/28152, WO 95/02697, selv om deres produksjon forblir meget vanskelig som forklart nedenfor.
Dreier det seg om AAV, er de beskrevne vektorer generelt berøvet helheten av de kodende områder Rep og Cap som er erstattet av nukleinsyrer av interesse.
I rekombinante virus avledet fra retrovirus er genene gag, pol og env generelt deletert helt eller delvis og erstattet med en heterolog nukleinsyresekvens av interesse. Videre kan de rekombinante retrovirus omfatter modifikasjoner i LTR'ene for å supprimere den transkripsjonene aktivitet samt sekvenser for utstrakt enkapsidering omfattende en del av genet gag (Bender et al., "J. Virol.", 61 (1987) 1639).
Tatt i betraktning deres defekte karakter for replikasjonen, gir produksjon av disse forskjellige rekombinante virus mulighet for å transkomplementere funksjonene som er deletert fra genomet. Transkomplementeringen er nettopp opprinnelsen til de vesentlige vanskeligheter for produksjonen av disse virus og særlig tilveiebringelsen av transkomplementeringsfunksj onene.
I denne forbindelse er to veier utviklet. Den første er basert på konstruksjonen av transkomplementante linjer, kalt enkapsideringslinjer. Den andre hviler på anvendelsen av en hjelper-adenovirus eller hjelper-plasmider.
Forskjellige linjer for enkapsidering av defekte virus er konstruert. Disse linjer er i stand til å produsere de defekte funksjoner i den virale vektor. Generelt omfatter linjene, integrert i sitt genom, det eller de områder som er deletert fra det virale genom (for eksempel El, E2 og/eller E4 for adenovirusen; gag, pol og/eller env for retrovirusene; rep og/eller cap for AAV).
En av de linjer som er kjent for produksjon av defekte adenovirus er for eksempel linje 293 i hvilken en del av genomet av adenovirusen er integrert. Mer spesielt er linje 293 en human embryo nyrecellelinje inneholdende den venstre del (ca. 11-12%) av genomet av adenovirus serotype 5 (Ad5), omfattende den venstre ITR, enkapsideringsområdet, området El inkludert Ela og Elb, området som koder for proteinet pDC samt en del av området som koder for proteinet pTVa2. Denne linje er i stand til å transkomplementere defekte, rekombinante adenovirus for området El, det vil si berøvet hele eller en del av området El, og å produsere virale forråd i høy mengde. Denne linje er likeledes i stand til, ved tillatelig temperatur (32°C), i stand til å produsere forråd av virus som videre omfatter den termosensible E2 mutasjon. Andre cellelinjer i stand til å komplementere området El er beskrevet, hovedsakelig basert på celler fra human lungekarsinom A549 (WO 94/28152) eller på humane retinoblaster ("Hum. Gen. Ther." (1996) 215). Videre er linjer i stand til transkomplementere flere funksjoner av adenovirusen, også beskrevet. Særlig kan det henvises til linjene som komplementerer områdene El og E4 (Yeh et al., "J. Virol.", 70 (1996) 559; "Cancer Gen. Ther.", 2 (1995) 322; Krougliak et al., "Hum. Gen. Ther.", 6 (1995) 1575) samt linjer som komplementerer områdene El og E2 (WO 94/28152, WO 95/02697, WO 95/27071).
Forskjellige linjer er likeledes beskrevet for produksjon av defekte retrovirus, generelt i stand til å uttrykke genene gag, pol og env. Slike linjer er for eksempel linjen PA317 (US 4 861 719), linjen PsiCRIP (WO 90/02806), linjen GP+envAm-12 (WO 89/07150), linjen BOSC (WO 94/19478), og så videre. For å konstruere rekombinante retrovirus omfattende en nukleinsyre av interesse, blir et plasmid som særlig bærer LTR'ene, enkapsideringssekvensen og nukleinsyren, konsentrert og deretter benyttet for å transfektere en enkapsideringslinje som beskrevet nedenfor, i stand til å tilveiebringe de defekte, retrovirale funksjoner i plasmidet. De fremstilte, rekombinante retrovirus blir så renset ved klassiske teknikker.
Anvendelsen av linjene kan imidlertid oppvise visse problemer. Således er det vanskelig, kostbart og begrensende på industrielt nivå å konstruere og å validere slike linjer. Således må linjene være stabile og kompatible med industrielle anvendelser. Videre tillater linjene vanskelig å skille ut produksjon av kontaminerende, replikative virus (RCA). Således tillater disse linjer i dag ikke på tilfredsstillende måte for industriell anvendelse å transkomplementere meget sterkt defekte, virale genomer som for eksempel mimimum-adenovirusene som beskrevet ovenfor. Således har adenovirusen et genom som er organisert i,forskjellige transkripsjonsenheter der den spatio-temporelle regulering er meget komplekst. Transkomplementeringen av en adenovirus som er deletert for alle kodende virale sekvenser og som uttrykker hver transkripsjonsenhet separat på konstitutiv eller kondisjonell måte fra en cellelinje har ikke kunnet realiseres på tilfredsstillende måte til i dag. Således er kun en liten del av genomet tilsvarende områdene El, E4, pIX og de tre proteiner som kodes av E2 (pol, DBP og p-TP) uttrykt på konstitutiv måte fra cellelinjer. Resten av genomet tilsvarer en større, sen transkripsjonsenhet (MLTU) som produserer alle meddelere for de strukturelle og ikke-strukturelle proteiner fra et primærtranskript på 28 kb og aktiveres etter replikering av genomet. Således er, for å generere minimum-adenovirus, transkomplementeringen av disse områder essensielt. Disse linjer tillater ikke å oppnå høyere mengder av rekombinante retrovirus.
Den andre vei består i å kotransfektere, med det defekte, virale genom, en konstruksjon (plasmid eller adenovirus) som tilveiebringer komplementeringsfunksjonene. Særlig fremstilles defekte, rekombinante AAV'er ved kotransfektering i en cellelinje infisert med en human hjelpevirus (for eksempel en adenovirus) med et plasmid inneholdende en nukleinsyre av interesse, kantet av to repeterte, inverse områder (ITR) av AAV, og et plasmid som bærer komplementeringsfunksj onene (genene rep og cap) av AAV. Slike varianter er beskrevet i dokumentene WO 95/14771; WO 95/13365; WO 95/13392 eller WO 95/06743. Mangelen ved å benytte en hjelper-adenovirus ligger hovedsakelig i risiko for rekombinasjon mellom den adenovirale vektor og hjelper-adenovirusen, og i vanskeligheten av å separere den rekombinante av hjelperen under produksjon og rensing av virusforrådene. Mangelen ved å benytte en plasmid-hjelper, for eksempel et Rep/cap-plasmid, ligger i de oppnådde transfeksjonsmengder som ikke tillater å fremstille høye virusmengder.
Det er i WO9607734 beskrevet et rekombinant baculovirus bestående av en nukleotidsekvens fra et adenovirus a serotypen Ad5.
Videre er det i WO9609074 beskrevet anvendelsen av et ikke-mammalsk DNA virus for ekspresjon av eksogene gener i mammalske celler.
Foreliggende oppfinnelse beskriver nå et nytt system for fremstilling av virus som tillater å bøte på disse mangler. Systemet ifølge oppfinnelsen er basert på anvendelsen av en baculovirus for å tilveiebringe komplementeringsfunksjonene.
Systemet for fremstilling ifølge oppfinnelsen tillater på spesielt fordelaktig måte å trekke nytte av anvendelsen av etablerte, komplementeirngslinjer, å unngå problemene av RCA og å transkomplementere de sterkt defekte genomer. Videre kan systemet ifølge oppfinnelsen anvendes på enhver celle som er infiserbar med den ønskede virus og med en baculovirus og som således gir en høy brukselastisitet.
Et første mål ved oppfinnelsen ligger således i en fremgangsmåte for fremstilling av defekte, rekombinante adenovirus i henhold til hvilken man i en kompetent cellepopulasjon innfører genomet av den defekte, rekombinante virus og en baculovirus som bærer alle eller en del av funksjonene som er nødvendige for transkomplementeringen av det rekombinante, defekte genom.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er således basert på anvendelsen av en baculovirus for å tilveiebringe de komplementante funksjoner. Forskjellige muligheter foreligger. Man kan benytte kompetente celler som ikke uttrykker noen transkomplementerings-funksjon av det defektive, rekombinante genom. I dette tilfellet er det mulig enten å benytte en baculovirus som bærer alle funksjonene som er nødvendige for transkomplementering av det defekte, rekombinante genom, eller flere baculovirus som hver bærer en eller flere av funksjonene som er nødvendige for transkomplementeringen av det defekte, rekombinante genom. Det er likeledes mulig å benytte en kompetent cellepopulasjon i stand til allerede å transkomplementere en eller flere funksjoner av det defekte, rekombinante genom (enkapsideringslinje). I dette tilfellet tilveiebringer det eller de benyttede baculovirus kun de funksjoner som er nødvendige for transkomplementering av det defekte, rekombinante genom som ikke allerede er transkomplementert av de kompetente celler.
Som antydet ovenfor er fordelene ved systemet ifølge oppfinnelsen tallrike i forbindelse med industrialisering (ikke behov for linjer, RC A, og så videre) og uttrykt ved anvendelsestermer (produksjon av rekombinante virus som bærer enhver type delesjon og særlig sterkt defektive, rekombinante adenovirus). Videre er, i den grad baculovirusen ikke replikeres i humane celler, det oppnådde, virale preparat ikke kontaminert med baculovirus. Videre er baculovirusen fylogenetisk meget fjern fra adenovirus og det er ingen risiko for rekombinasjon eller transkomplementering mellom de to. Dette system tillater således, på fordelaktig måte, å fremstille konsentrerte forråd av defekte virus, berøvet RCA. Dette systemet er spesielt fordelaktig for fremstilling av defekte, rekombinante adenovirus.
Baculovirusene er virus som er omhyllet av cellulær bikatenær DNA som er spesifikk for virvelløse dyr. Deres prototype, AcNPV, har et genom på 133 kb. Det benyttes meget som ekspresjonsvektor for eukaryotiske gener i innsektsceller, fra to sterke promotorer [polyedrin (Ph) og P10] (King og Possee, "The baculovirus expression system.", London; Champman & Hall, 1992). AcNPV er i stand til å infisere visse pattedyrceller, men genomet er aldri transkribert eller translatert. I den senere tid har Hofmann et al. ("PNAS", 92 (1995) 10099) vist at in vitro kan hepatocytt celler transduseres med en renset, rekombinant baculovirus som uttrykker genet LacZ. Ingen cellulær toksisitet er rapport, selv ved en infeksjonsmultiplisitet på 1000, og effektiviteten ved transfeksjonen som beskrevet i artikkelen er rundt 50% for en MOI på 100.
Foreliggende søkere har nå kunnet vise at det er mulig å infisere forskjellige cellulære typer med en rekombinant baculovirus. Særlig har man kunnet påvise at det, med en rekombinant baculovirus, er mulig å infisere celler av human opprinnelse som i morta-liserte embryonære celler. Foreliggende søkere har likeledes vist at det er mulig å oppnå en meget høy transduksjonseffektivitet (> 80%). Foreliggende søkere har likeledes vist at det er mulig, i en baculovirus, å innføre de funksjoner for komplementering av en adenovirus og å eksprimere dens funksjoner i en kompetent cellepopulasjon. Foreliggende søkere har således kunnet vise at baculovirusen består i en inert vektor som kan benyttes fortrinnsvis for overføring og ekspresjon av komplementeringsfunksjoner for viruset i pattedyr celler, særlig humane slike. Andre fordeler ved systemet ifølge oppfinnelsen er særlig (i) den store kloningskapasitet som tillater å komplementere et helt adenoviralt genom, og (ii) den avanserte utvikling av baculovirus-teknologien. Baculovirusen som bærer komplementeringsfunksj onene for viruset er likeledes desig-nert i det som kalles baclovirus-hjelper. Den kan bære forskjellige komplementeringsfunksj oner av viruset.
Således kan baculovirus-hjelperen omfatte området El av adenovirusen. En Baculo-El kan benyttes for fremstilling av adenovirus av første generasjon, det vil si adenovirus som er defekt for området El (AdAEl) uansett sin E3 status (det vil si defekt AdAEl,AE3, eller ikke). Produksjonen av defekte, rekombinante adenovirus av første generasjon (defekte for området El og eventuelt E3) utgjør en første spesielt fordelaktig anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Som antydet ovenfor er forskjellige linjer beskrevet i litteraturen, i stand til å transkomplementere funksjonen El (celler 293, celler A549, celler 911, og så videre). Imidlertid eksisterer det homologisoner mellom området som bærer transkomplementeirngsfunksjonene integrert i genomet av linjen og DNA'et av den rekombinante virus man ønsker å fremstille. Av denne grunn kan det under produksjonen skje forskjellige rekombineringsevenementer som skaper replikative, virale partikler, særlig adenovirus av typen E1+. Det kan dreie seg om et enkelt rekombineringsevnement, fulgt av en kromosom-knusing eller en dobbelt rekombinasjon. De to typer modifikasjoner fører til å reintegrere i sin initial locus i det adeno virale genom, området El inneholdt i det cellulære genom. Videre tatt i betraktning de meget store mengder rekombinant vektor som produseres av linje 293 (over IO<12>), er sannsynligheten for slike rekombineringsevenementer høy. Man har således kunnet konstatere tallrike lotter av defekte, rekombinante adenovirale vektorer av første generasjon, kontaminert med replikative, virale partikler, noe som kan utgjøre en vesentlig mangel for farmasøytisk anvendelse. Videre induserer nærværet av slike partikler i et terapeutisk preparat in vivo en viral propagering og en ukontrollert disseminering med risiko for inflammatorisk reaksjon, rekombinasjon, og så videre. Kontaminerte prøver kan således ikke benyttes i humanterapien.
Foreliggende oppfinnelse tillater å bøte på disse mangler. Ifølge en foretrukket ut-førelsesform av oppfinnelsen blir således genomet av den rekombinante virus som er defekt for området El og eventuelt E3 innført i kompetente celler, hvoretter cellene infiseres eventuelt samtidig med en baculovirus som bærer området El, der området El av adenovirusen som er til stede i baculovirusen og genomet av den defekte, rekombinante adenovirus ikke bærer noen homologisone (dekker) som kan være tilbøyelig til å gi noen rekombinasjon. I henhold til denne utførelsesform er det således mulig hurtig og uten etablert linje å produsere forråd av rekombinante adenovirus av første generasjon, berøvet RCA. Som antydet nedenfor kan videre forrådene av rekombinante adenovirus som dannet på denne måte, berøvet for RCA, benyttes som utgangsmateriale for en ny produksjon ved koinfeksjon i kompetente celler med en baculovirus.
Baculovirus-hjelperen kan likeledes bære området E2 av adenovirusen, helt eller delvis, særlig området E2a og/eller E2b. En baculo-E2 kan benyttes for, i de kompetente celler, å fremstille adenovirus som er defekte for området E2 (Ad-AE2) og eventuelt for området E3 (Ad-AE2,AE3). I kompetente celler som er i stand til å komplementere området El av adenovirusen, kan videre baculo-E2 tillate produksjon av rekombinante adenovirus som er defekte for områdene El og E2 (Ad-AE1,AE2) og eventuelt E3 (Ad-AE1,AE2,AE3). På samme måte kan baculo-E2 i kompetente celler i stand til å komplementere områdene El og E4 av adenovirusen (for eksempel i cellene IGRP2), tillate produksjon av rekombinante adenovirus som er defekte for områdene El, E2 og E4 (Ad-AE1 ,AE2,AE4) og eventuelt E3 (Ad-AEl ,AE2,AE3,AE4).
Baculovirus-hjelperen kan videre bære området E4 (helt eller delvis) av adenovirusen. En baculo-E4 kan benyttes for, i de kompetente celler, å produsere en adenovirus som er defekt for området E4 (Ad-AE4) og eventuelt for området E3 (Ad-AE4,AE3). I de kompetente celler i stand til å komplementere området El av adenovirusen, kan videre baculo-E4 tillate produksjon av rekombinante adenovirus som er defekte for områdene El og E4 (Ad-AEl,AE4) og eventuelt E3 (Ad-AE1,AE4,AE3).
Baculovirusen kan også bære områdene El og E4 (helt eller delvis) av adenovirusen. En baculo-El,E4 kan benyttes for, i kompetente celler, å fremstille en adenovirus som er defekt for områdene El og E4 (Ad-AEl,AE4) og eventuelt E3 (Ad-AE1,AE4,AE3) som vist i figur 1.
For videre å generere virus som er defekte for områdene El og E4 er det likeledes mulig å benytte to baculovirus-hjelpere, den ene som uttrykker funksjonen El og den andre funksjonen E4, helt eller delvis.
På samme måte kan baculovirus-hjelperen omfatte områdene El, E2 og E4 (helt eller delvis) og eventuelt området som bærer de sene gener (L1-L5).
Baculovirus-hjelperen kan likeledes omfatte området Rep og/eller Cap av AAV. En baculo-Rep/Cap tillater således, i en linje med kompetente celler, å komplementere et AAV-genom som er berøvet for hele den kodende sekvens (figur 5).
Baculovirusen kan likeledes omfatte områdene gag, pol og/eller env av en retrovirus. En baculo-gag/pol/env tillater således, i en linje av kompetente celler, å komplementere et retroviralt genom er berøvet for hele den virale, kodende sekvens. Det er likeledes mulig å benytte en baculovirus som bærer områdene gag/pol og en andre baculovirus som bærer området env.
Rent generelt er det å foretrekke at genomet av den defekte, rekombinante virus og komplementeringsområdene som er til stede i baculovirusen ikke har overlapping. Dette tillater å unngå risiko for rekombinering og derved dannelse av RCA. Dette er spesielt viktig for generering av adenovirus av første generasjon (Ad-AEl). I dette tilfellet er området El som innføres i baculovirusen definert slik at det ikke har noen sekvens felles med det rekombinante genom. For å oppnå dette er det for eksempel mulig fra det rekombinante genom å deletere et større område enn det komplementante området som skytes inn i baculovirusen, slik det er vist i eksemplene. Dette er likeledes fordelaktig for generering av adenovirusen Ad-AEl,AE4.
I en spesiell utførelsesform av oppfinnelsens fremgangsmåte, blir således genomet av den defekte, rekombinante virus innført i kompetente celler, disse celler infiseres eventuelt samtidig med en baculovirus som omfatter alle eller en del av de funksjoner som er nødvendige for komplementering av det defekte genom, idet komplementeringsfunksj onene som er til stede i baculovirusen og genomet av den defekte, rekombinante virus ikke omfatter noen homologisone som kan være tilbøyelig til å gi en rekombinasjon. Fortrinnsvis er det virale genom et genom av en rekombinant adenovirus som er defekt for området El og baculovirusen bærer et område av adenovirusen som er i stand til å transkomplementere området ELI henhold til en annen variant er det virale genom et genom av en rekombinant adenovirus som er defekt for områdene El og E4 og baculovirusen bærer to områder av adenovirus som er i stand til å transkomplementere de nevnte områder eller det benyttes to baculovirus, den ene som bærer et område av adenovirusen i stand til å transkomplementere området El og den andre et område av adenovirusen i stand til å transkomplementere området E4, uten homologisoner med det defektive, adenovirale genom.
I henhold til en spesiell utførelsesform, bæres helheten av områder som koder adenovirusen av en eller flere baculovirus-hjelpere. I henhold til en mer spesiell utførelses-form benyttes en eneste baculovirus-hjelper omfattende helheten av områder som koder for adenovirusen. En slik baculovirus-hjelper kan således anvendes for å transkomplementere den minimum-rekombinante adenovirus. En slik baculovirus kan særlig omfatte helheten av et adenoviralt genom bortsett fra enkapsideringsområdet og eventuelt ITR'ene som vist i eksemplene.
Fremstilling av komplementeringsfunksjoner
Komplementeringsfunksjonene som innføres i baculovirus-hjelperen kan stamme fra virus av forskjellige serotyper.
Når det dreier seg om adenovirus, eksisterer det forskjellige serotyper hvis struktur og egenskaper varierer noe, men som oppviser en sammenlignbar, genetisk organisasjon. Mer spesielt stammer funksjonene for komplementering som benyttes for konstruksjonen av baculovirusene ifølge oppfinnelsen, fra en adenovirus av human eller animalsk opprinnelse.
Når det gjelder adenovirus av human opprinnelse kan man fortrinnsvis angi to klasser i gruppe C. Aller helst foretrekker man, blant de forskjellige serotyper av humane adenovirus å benytte adenovirus av type 2 eller 5 (Ad2 eller Ad5). Det er likeledes mulig å benytte områder som stammer fra adenovirus av type 7 eller 12 fra gruppene A og B. Blant de forskjellige adenovirus av animalsk opprinnelse foretrekker man å benytte adenovirus av canine-opprinnelse, og særlig alle stammer fra adenovirusen CAV2 (for eksempel stamme manhattan eller A26/61 (ATCC VR-800)). Andre adenovirus av animalsk opprinnelse er særlig angitt i WO 94/26914.
I en mulig utførelsesform av oppfinnelsen stammer komplementeringsfunksj onen fra et human-adenovirus-genom fra gruppe C. Aller helst stammer det fra genomet av en adenovirus Ad2 eller Ad5.
Områdene som bærer de forskjellige komplementeringsfunksjoner kan oppnås fra et adenoviralt genom ved enzymatisk kutting i henhold til metoder kjent av fagmannen. Disse områder kan eventuelt modifiseres for å redusere størrelsen eller for å erstatte visse reguleringselementer (promotor, enhancer, og så videre) med heterologe elemen-ter. Rent generelt fremstilles områdene som følger. DNA av en adenovirus renses ved sentrifugering på en cesiumkloirdgradient eller oppnås in vitro fra et prokaryotisk (WO 96/25506 eller eukaryotisk (WO 95/03400) plasmid. Dette DNA spaltes så ved hjelp av egnede restriksjonsenzymer og de oppnådde fragmenter som bærer de ønskede komplementeringsfunksjoner identifiseres og selekteres. Valget av restriksjonsenzymer som
benyttes avhenger av de ønskede komplementeringsfunksjoner. Det hele veiledes av restriksjonskart og publiserte sekvenser for adenovirale genomer. Så kan området El
isoleres i form av fragmenter som bærer alle leserammene av EIA og E1B nedstrøms promotoren Ela. Området E4 kan isoleres i form av fragmenter som bærer alle lesefasene eller kun en del av disse og fortrinnsvis fasene ORF3 eller ORF6 eller ORF6-ORF6/6.
Tilsvarende metodologier benyttes for å fremstille komplementeirngsområdene av AAV og rekombinante retrovirus. Således kan områdene rep og/eller cap av AAV oppnås ved enzymatisk kutting fra viralt DNA isolert fra forskjellige serotyper av AAV. De er fortrinnsvis AAV-2. Når det gjelder disse retrovirus, kan områdene gag, pol og/eller env likeledes oppnås i henhold til klassiske teknikker innen molekylær biologien, fra forskjellige typer av retrovirus som særlig MoMuLV ("Murine Moloney Leukemia Virus"; også kalt MoMLV), MSV ("Murine Moloney Sarcoma Virus"), HaSV ("Harvey Sarcoma Virus"), SNV ("Spleen Necrosis Virus"), RSV ("Rous Sarcoma Virus") eller også Friends-virus.
Konstruksjon av baculovirus-hjelper
Fragmentene som bærer komplementeringsområdene blir deretter subklonet i en plasmid vektor som tillater deres manipulering (finere digestering, PCR, addisjon av reguleringssekvenser, og så videre), for eksempel i en prokaryotisk eller eukaryotisk organisme. Det oppnådde sluttfragment som koder for den eller de ønskede komplementeringsfunksjoner blir så innført i baculovirus-hjelperen under anvendelse av klassiske teknikker innen molekylærbiologien. Mer spesielt blir fragmenter klonet mellom to sekvenser som er homolog med et område av genomet av en baculovirus og deretter blir det resulterende fragment eller plasmid kotransfektert med genomet av en baculovirus i innsektsceller (klassisk Sf9 og Sf21, celler av Spodoptera frugiperda, men også Tn-368 og High-Five™ BTI-TN-5B1-4 (Gibco), celler av trikopulsia ni, eller enhver annen innsektscelle som er tillate for baculovirusen og anvendelig for produksjon). Den homologe rekombinasjon mellom plasmidet eller fragmentet og genomet av baculovirusen generer den ønskede, rekombinante baculovirus som så kan gjenvinnes og renses i henhold til klassiske metoder (se særlig King og Possee, "The baculovirus expression system", London, Chapman & Hall, 1992). For konstruksjon av rekombinante baculovirus, er forskjellige kits som bærer skyttelvektorene, kommersielt tilgjengelige og kan benyttes i henhold til fabrikantens anbefalinger. Særlig kan man benytte skyttelvektorene pBAC, kommersialisert av firma Clontech, vektorene pAc (Verne et al., "Bio/Technology", 6 (1988) 47, Pharmingen, USA), vektorene pBlue-Bac (Invitrogen) eller også vektorene pBSV (Boehringer). Komplementeringsfunksjonene kan også skytes inn på forskjellige seter av baculovirusen og særlig i locus av genet av polyhedrin eller genet pl0. Videre kan man benytte forskjellige stammer av baculovirusen som særlig AcNV eller Bombyx mori (Maeda et al., "Nature", 315 (1988) 592). På den annen side kan den benyttede baculovirus være modifisert for å forbedre/for-andre dens tropisme. Det er således mulig å modulere tropismen for de virale vektorer ved å modifisere deres overflateproteiner for (i) å begrense det ved fusjon av de virale proteiner med en spesifikk ligand (lett immunoglobulinkjede, Gastrin-Releasing-Peptide) eller (ii) å forstørre det ved dannelse av pseudotyper med et heterologt, viral glycoprotein [G-virus av Stomatite Vésicleuse (VSV)], [Lui et al., "J. Virol." 70(4)
(1996) 2497; Michael et al., "Gene Ther.", 2 (1995) 660]. I den senere tid er det vist at overflate-glycoproteinet av baculovirus (gp64) fusjonert til gpl20 av virusen VIH er i stand til å feste seg til reseptoren CD4 (Boublik et al., "Bio/Technology", 13 (1995) 1079). Denne modifikasjon av gp64 påvirker ikke levedyktigheten for baculovirusen i insektsceller. En analog konstruksjon med G av VSV kan tillate å forbedre tropismen for baculovirusen for pattedyrceller og således å øke effektiviteten ved transduksjonen av Huh7-celler samt andre cellelinjer.
I baculovirus-hjelperen er komplementeringsfunksjonene fortrinnsvis plassert under kontroll av en heterolog promotor (det vil si at en opprinnelse forskjellig fra baculovirusen), funksjonell i de kompetente celler. Det viser seg at baculovirus-promotorene ikke tillater å oppnå tilstrekkelige ekspresjonsnivåer for komplementeringsfunksjonene i celler andre enn innsektsceller og er således ikke de mest egnede for denne anvendelse av oppfinnelsen. Promotoren kan være den egentlige promotor (homolog promotor) for komplementeringsfunksjonene av viruset (promotor EIA, E4, E2, MLP for adeno-viruset, promotorene P5 eller Pl9 av AAV, promotorene av LTR av RSV, og så videre). Det kan likeledes dreie seg om enhver promotor av annen opprinnelse og som er funksjonell i den benyttede, kompetente celle. I denne forbindelse kan man for eksempel nevne promotore av gener uttrykt i cellen eller kjente, ubikitære promotorer som for eksempel promotoren av genet PGK, promotoren av det tidlige immediat av CMV, promotoren av genet TK av herpesviruset eller også promotoren av LTR av RSV. Det kan likeledes dreie seg om regulerte promotorer som for eksempel promotoren av virusen MMTV, en promotor som responderer på hormoner, for eksempel av typen GRE5, eller en promotor som reguleres av tetracyklin (WO). Fortrinnsvis er det en sterk eller induserbar, ubikitær, homolog promotor.
Således er en ytterligere gjenstand for oppfinnelsen en rekombinant baculovirus som, innskutt i sitt genom, omfatter en nukleinsyre som koder for en komplementeringsfunksjon for fremstilling av defekte rekombinante AAVer som omfatter Rep og Cap områdene til AAV under kontroll av en heterolog promotor. Mer spesielt er komplementeringsfunksj onen et protein som er nødvendig for produksjonen av viruset og hvis kodende område er inaktivt (mutert, deletert, og så videre) i det defekte, virale genom. For adenovirusene er komplementeringsfunksjonen mer spesielt valgt blant hele eller deler av funksjoner som kodes av områdene El, E2, E4, L1-L5, pIX og IVa2 av adenovirusen, alene eller i kombinasjon. For AAV dreier det seg om funksjoner som kodes av områdene Rep og/eller Cap; og for retrovirusene gag, pol og/eller env. Fortrinnsvis tilsvarer nukleinsyren et område av det virale genom som omfatter områder som koder for den valgte komplementeirngsfunksj on. Særlig dreier det seg om et fragment av et genom av adenovirus av serotype Ad2 eller Ad5, MoMLV eller AAV-2. Fortrinnsvis omfatter nukleinsyren likeledes promotorområdet som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av de valgte komplementeringsfunksjoner.
En egnet baculovirus er en baculovirus som bærer hele eller en del av området El av en adenovirus. Mer spesielt dreier det seg om en baculovirus som bærer området Ela, Elb eller Ela og Elb. Området El av adenovirusen er lokalisert i nukleotidene 104 (promotor Ela) til 4070 (polyA Elb) av Ad5. Særlig er boksen TATA av promotoren Ela lokalisert i nukleotid 470, kodonet ATG av Ela i nukleotidet 560 og stoppkodonet Elb i nukleotid 3511. Man kan som spesielt eksempel nevne en baculovirus som bærer et fragment 391-3511. Denne baculovirus-hjelperen er spesielt egnet for fremstilling av defekte, rekombinante adenovirus for området El som bærer en meget større delesjon enn dette fragment 391-3511. Særlig er den egnet til fremstilling av adenovirus av første generasjon, uten RC A, som bærer en delesjon i området El som dekker nukleotidene fra og med 383 til og med 3512.
Et annet spesielt eksempel på en egnet baculovirus er en baculovirus som omfatter for eksempel hele eller en del av områdene El og E4 av adenovirusen. Området E4 av adenovirusen består av 7 åpne lesefaser kalt OFR1, OFR2, OFR3, OFR3/4, OFR6 og OFR7. Blant proteinene som kodes av disse forskjellige OFR'ene, synes de som fremstilles av OFR3 og OFR6 å tillate "replikasjon" av viruset og således transkomplementering av en defekt adenovirus for området E4, selv i dets integralitet. På grunn av dette bærer baculovirus-hjelperen fortrinnsvis hele området E4 eller kun en del av dette som i det minste omfatter fasene OFR3 eller OFR6. De forskjellige deler av området E4 kan oppnås ved enzymatisk kutting eller modifisering i henhold til metoder velkjent av fagmannen. Særlig kan lesefasen OFR6 isoleres fra området E4 i form av et fragment BglH-PvuII, tilsvarende nukleotidene 34115-33126, og lesefasene OFR6-OFR6/7 kan isoleres fra området E4 i form av et fragment Bglll-Bglll som tilsvarer nkleotidene 34115-32490 av genet av genomet av Ad5. Baculovirusen kan likeledes omfatte helheten av lesefasene OFR1-OFR7 (for eksempel i form av et fragment 32800-35826 eller 32811-35614 eller 32811-35640). Det er klart at andre fragmenter kan bestemmes på basis av publiserte sekvenser av adenovirale genomer. Anvendelsen av en baculovirus som bærer en enhet redusert med området E4 er fordelaktig for dette tillater transkomplementering av et defekt, adenoviralt genom som bærer en delesjon som er større enn området E4, således uten homologisonen, hvorved man unngår enhver mulighet for rekombinasjon.
I henhold til en første utførelsesform blir nukleinsyren som koder for den eller de komplementerende funksjoner innført i hjelper-baculovirusen i form av en ekspresjonskassett. Denne utførelsesform er den enkleste å gjennomføre. Den er særlig egnet for fremstilling av defekte, rekombinante adenovirus for umiddelbar tidlige gener og for fremstilling av defekte, rekombinante retrovirus og AAV'er.
I henhold til en andre utførelsesform blir nukleinsyren som koder for den eller de komplementerende funksjoner innført i baculovirus-hjelperen i form av en utskjærbar kassett for å danne et replikativt molekyl i den kompetente celle. Replikasjonen av kassetten i cellen tillater fordelaktig å øke antallet kopier av de komplementerende gener og tillater derved å øke produksjonsnivået for systemet. Denne utførelsesform er særlig egnet for fremstilling av meget defekte, rekombinante adenovirus, særlig defekte når det gjelder strukturgenet. Spesielt er denne utførelsesform særlig egnet til fremstilling av "minimum"-adenovirus. Således er mengden strukturelt protein en begrensende faktor for fremstilling av betydelige mengder sterkt defekte adenovirus (type minimums-adenovirus). Denne utførelsesform tillater for første gang betydelig å øke de intracellulære nivåer av transkomplementante proteiner, særlig strukturelle proteiner av adenovirusen (kodet av områdene LI til L5) til nivåer som er kompatible med transkomplementeringen av minimum-adenovirusen.
Således har foreliggende søkere kunnet vise at det er mulig å konstruere rekombinante baculovirus omfattende et heterologt område som er i stand til å kunne skjæres ut i en celle, fortrinnsvis på induserbar og regulert måte, for å generere et sirkulært og replikativt molekyl (av episomal type).
Utskjæringen gjennomføres fortrinnsvis ved en setespesifikk rekombinasjonsmekaniske og replikasjonen i cellen sikres av en replikasjonsopprinnelse, uavhengig av den cellulære delingstilstand.
Mer spesielt oppnås den setespesifikke rekombinasjon som benyttes ifølge oppfinnelsen ved hjelp av to spesifikke sekvenser som er i stand til å rekombinere seg imellom i nærvær av et spesifikt protein, generelt kalt rekombinase. Disse spesifikke sekvenser, anordnet i egnet orientering, omgir i baculovirusen sekvensene som koder for komplementeringsfunksjonene. Således er oppfinnelsen også rettet mot en rekombinant baculovirus som, innskutt i sitt genom, omfatter minst et DNA-område omgitt av to sekvenser som tillater en setespesifikk rekombinasjon og posisjonert i direkte orientering, idet nevnte DNA-område omfatter minst en replikasjonsopprinnelse som er funksjonell i de kompetente celler og en nukleinsyre som koder for en komplemeringsfunksjon av en virus.
Sekvensene som tillater rekombinering som benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen omfatter generelt 5 til 100 basepar og fortrinnsvis minst 50 basepar. De kan stamme fra forskjellige strukturelle klasser og særlig familiene rekombinase av bakteriofagen Pl eller resolvasen av en transposon.
Blant rekombinasene som stammer fra familien av integrase av bakteriofagen 1, kan man særlig nevne integrasen av fagene X (Landy et al., "Science" 197 (1977) 1147), P22 og F80 (Leong et al., "J. Biol. Chem.", 260 (1985) 4468), HP1 av Haemophilus influenzae (Hauser et al., "J. Biol. Chem.", 267 (1992) 6859), integrasen Cre av fagen Pl, integrasen av plasmidet pSAM2 (EP 350 341) eller også FLP-rekombinasen av plasmidet 2 um av gjæren Sacchamomyces cerevivisiae.
Blant rekombinasene som stammer fra familien av transposonet Tn3, kan man særlig nevne resolvasen av transposonet Tn3 eller transposonene gd, Tn21 og Tn522 (Start et al., 1992); invertasen Gin av bakteriofagen mu eller også resolvasen av plasmidene som fragment par av RP4 (Abert et al., "Mol. Microbiol.", 12 (1994) 131).
I henhold til en foretrukket utførelsesform stammer, i de rekombinante baculovirus ifølge oppfinnelsen, sekvensene som tillater setespesifikk rekombinasjon, fra en bakteriofag. Mer foretrukket dreier det seg om festesekvenser (sekvensene attP og attB) av en bakteriofag eller avledede sekvenser. Disse sekvenser er i stand til å rekombinere spesifikt seg imellom i nærvær av en rekombinase kalt integrase. Som spesielt eksempel kan man særlig nevne festesekvensene av fagene X, P22, F80, Pl, HP1 og Haemophilus influenzae eller også plasmidet pSAM2, eller 2 um.
Ennå mer foretrukket er sekvensene som tillater setespesifikk rekombinasjon represen-tert ved rekombineringssystemet av fagen Pl. Fagen Pl har en rekombinase med navnet Cre som spesifikt gjenkjenner en nukleotidsekvens på 34 basepar, kalt sete lox P (Sternberg et al., "J. Mol. Biol.", 150 (1981) 467). Denne sekvens består av to palin-dromiske sekvenser på 13 pb, atskilt av en bevart sekvens på 8 bp. Den setespesifikke rekombinasjon oppnås fortrinnsvis under anvendelse av sekvensene LoxP eller avledede sekvenser og rekombinasen Cre.
Uttrykket avledet sekvens inkluderer sekvenser som er oppnådd ved en eller flere modifikasjoner av rekombineringssekvensene ovenfor, idet man bevarer evnen til spesifikk rekombinasjon i nærvær av en egnet rekombinase. Således kan det dreie seg om reduserte fragmenter av disse sekvenser eller tvert imot oppnådd ved addisjon av andre sekvenser (restriksjonsseter, og så videre). Det kan likeledes dreie seg om varianter oppnådd ved en eller flere mutasjoner, særlig en eller flere punktmutasjoner.
I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er således sekvensene som tillater en setespesifikk rekombinasjon sekvensene LoxP av bakteriofagen Pl, og rekombinasjonen oppnås i nærvær av proteinet Cre. I denne forbindelse kan rekombinasjonen oppnås ved direkte kontakt mellom de kompetente celler og rekombinasen Cre, eller ved ekspresjon av genet som kodet for rekombinasen Cre i de kompetente celler. Fortrinnsvis produseres rekombinase Cre i cellen ved induksjon av ekspresjonen av det tilsvarende gen. Således er genet som koder for rekombinasen fortrinnsvis plassert under kontroll av en induserbar promotor eller konstruert i regulerbar form. I denne forbindelse benytter man fortrinnsvis en fusjon mellom Cre og fikseringsdomenet for steroide hormoner (østradiol, progesteron, og så videre) som tillater å regulere aktiviteten av Cre og således å indusere rekombinasjonsevenementet (Metzger et al., "PNAS", 92 (1995) 6991). Mer generelt kan ekspresjonen av rekombinasen kontrolleres ved hjelp av en hvilken som helst sterk, eventuelt regulert promotor. Ekspresjonskassetten kan transfek-teres i de kompetente celler eller integreres i genomet av de kompetente celler som vist i eksemplene.
Dette system tillater således å generere replikative molekyler som, i de kompetente celler, produserer høye nivåer av komplementeringsfunksj onen av virusen, særlig adenovirusen. Denne konstruksjonstype er særlig egnet for komplementering av sterkt defektive genomer og særlig defektive, adenovirale genomer for sene gener. Således er en spesiell konstruksjon ifølge oppfinnelsen vist ved en baculovirus som, innskutt i sitt genom, inneholder minst et DNA-område omgitt av to LoxP-sekvenser posisjonert i direkte orientering, idet DNA-området omfatter minst en replikasjonsopprinnelse som er funksjonelle i de kompetente celler og en nukleinsyre som koder for en komplemente-rmgsfunksjon av en adenovirus. Fortrinnsvis omfatter komplementeringsfunksjonene hele eller en del av de umiddelbare tidlige gener som er til stede i områdene El, E2 og E4. Ennå mer foretrukket omfatter komplementeringsfunksjonene hele eller deler av umiddelbare tidlige gener og de forsinkede tidlige gener. Fortrinnsvis tillater komplementeringsfunksjonene komplementeringen av en rekombinant adenovirus som er berøvet for enhver kodende viral sekvens. Særlig består komplementeringsfunksjonene av helheten av det adenovirale genom bortsett fra i ITR'ene og innpakningsområdet. I henhold til en spesiell variant består komplementeringsfunksjonene av et komplett adenoviralt genom som imidlertid er berøvet for innpakningsområdet (Ad.Psi-). Dette genom omfatter særlig de ITR'er som tjener til replikasjon av genomet i de kompetente celler, efter utskjæring.
For å sikre replikasjon av det episomale molekyl inneholder disse således en replikasjonsopprinnelse som er funksjonell i de benyttede, kompetente celler. Denne replikasjonsopprinnelse består fortrinnsvis av de egentlige ITR-sekvenser av adenovirusen og som tillater en betydelig forsterkning av molekylet. Det kan likeledes dreie seg om en annen replikasjonsopprinnelse som fortrinnsvis tillater en forsterkning i en faktor over 20 av den virale DNA i den kompetente celle. Man kan som illustrasjon nevne opprinnelsen OriP/EBNAl av virusen EBV eller området E2 av papillomvirusen. Det er klart at ITR-sekvensene av adenovirusen utgjør en foretrukket utførelsesform.
For å gjennomføre oppfinnelsen blir det som baculovirus-hjelper(e) generelt benyttet en infeksjonsmultiplisitet (MOI) som tillater å infisere en stor cellepopulasjon uten på signifikant måte å innvirke på den cellulære levedyktighet. Generelt ligger den mer spesielt mellom 10 og 1000. MOI-verdiene tilsvarer antallet virale partikler pr. celle. MOI kan lett justeres av fagmannen som funksjon av de benyttede kompetente celler på basis av i det vesentlige to kriterier: infeksjonsineffektiviteten og den eventuelle toksisitet. Fortrinnsvis er den MOI-verdi som benyttes for baculovirus-hjelperen mellom 20 og 500.
Innføring av viralt genom
Som antydet ovenfor omfatter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen innføring, i de kompetente celler, av baculovirus-hjelperen og det rekombinante virale genom. I denne forbindelse kan genomet av den defekte, rekombinante adenovirus innføres på forskjellige måter i den kompetente celle.
Det kan særlig dreie seg om en renset, defekt, rekombinant adenovirus, fortrinnsvis berøvet sin RCA. I dette tilfellet blir de kompetente celler infisert med defekt, rekombinant adenovirus og med baculovirus-hjelperen. Infeksjonen med den rekombinante adenovirus tillater å innføre det tilsvarende genom i den kompetente celle, som så forsterkes og enkapsideres for å produsere forråd med høy titer, berøvet sin RCA. Denne utførelsesform er spesielt interessant for å generere virus av første generasjon (Ad-AEl; Ad-AEl,AE3). I realiteten er disse virus vanskelig å produsere i høye mengder uten kontaminering med RCA'er. I henhold til oppfinnelsens fremgangsmåte er det nå mulig, ved å gå ut fra en defekt, rekombinant adenovirus av første generasjon, ved koinfeksjon i en kompetent celle med en baculovirus som omfatter området El, å oppnå konsentrerte forråd med øket kvalitet. Denne utførelsesform er likeledes fordelaktig for fremstilling av virus som er defekte i to eller tre vesentlige områder i genomet (særlig El, E2 og E4). Rent generelt er denne utførelsesform fortrinnsvis fordi infeksjonseffektiviteten med adenovirusen er meget høy (høyere enn transfeksjonseffekti vi teten med DNA) og derfor tillater å generere konsentrerte forråd. I denne utførelsesform blir den rekombinante adenovirus og rekombinante baculovirus benyttet med infeksjonsmulitiplisiteter (MOI) som tillater å infisere en stor cellepopulasjon uten signifikant å forstyrre den cellulære levedyktighet. MOI-verdien som benyttes for baculovirusen er den som er nevnt ovenfor, altså mellom 10 og 1000. Hva angår adenovirusen, ligger denne fortrinnsvis mellom 1 og 1000, helst mellom 1 og 500 og aller helst mellom 1 og 100. MOI-verdien som benyttes for adenovirusen er likeledes tilpasset som funksjon av den valgte celletype. Området for MOI kan lett bestemmes av fagmannen ved for eksempel å benytte en adenovirus og baculovirus som bærer et distinkt markørgen for derved å måle infeksjonseffektivitet og en eventuell konkurranse. Mer spesielt ligger MOI-verdien for adenovirusen under 50, for eksempel mellom 1 og 20.
I henhold til en annen spesielt foretrukket utførelsesform, blir genomet av den defekte, rekombinante adenovirus innført i form av DNA. I dette tilfellet blir genomet innført ved transfeksjon, eventuelt i nærvær av et middel som letter transfeksjonen (lipider, kalsiumfosfat, og så videre). Det rekombinante genom som innføres på denne måte kan fremstilles in vitro i henhold til forskjellige teknikker og særlig i E. coli (WO 96/25506) eller i en gjær (WO 95/03400). Denne utførelsesform er særlig egnet for å generere en første prøve av defekt, rekombinant virus, berøvet RCA, som så i sin tur kan benyttes for å fremstille forråd i høy mengde i henhold til den ovenfor beskrevne utførelsesform. Genomet av den defekte, rekombinante adenovirus kan innføres under anvendelse av en annen rekombinant baculovirus. I henhold til denne utførelsesform blir genomet av den defekte, rekombinante adenovirus fremstilt in vitro, for eksempel som antydet ovenfor, og så innført i en baculovirus, i form av en kassett som kan skjæres ut av den kompetente celle. I henhold til denne utførelsesform blir de kompetente celler brakt i nærvær av en baculovirus som bærer genomet av den defekte, rekombinante adenovirus, og en eller flere baculovirus-hjelpere (som bærer komplementeringsfunksjonene). Denne utførelsesform er særlig fordelaktig for fremstilling av sterkt defekte, rekombinante adenovirus. Takket være dette system, er det nå mulig i populasjonen av kompetente celler, å innføre høye kvantiteter på en gang av det sterkt defekte, rekombinante genom og de tilsvarende komplementeringsfunksjoner.
I denne forbindelse omfatter en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen således koinfeksjon av de kompetente celler med en baculovirus som bærer genomet av den defekte, rekombinante adenovirus, og en eller flere baculovirus-hjelpere som bærer komplementeringsfunksjonene. MOI-verdiene som benyttes ved denne utførelsesform ligger likeledes mellom 10 og 1000 for hver av de benyttede baculovirus.
Denne konstruksjonstype er gjennomført i den kjente teknikk for fremstilling av minimum-adenovirus: (1) transgene (B-galactosidase) klonet mellom ITR'ene, kantet av et eneste restriksjons-sete eller (2) høyre og venstre ITR klonet i direkte orientering ved 5' av transgenet (Fisher et al.,
"Virology" 217 (1996) 11; Kumar-Sing et al.; "Hum. Mol. Genet. 5 (1996) 913).
Minimum-adenovirusene produseres i 293-celler ved transfeksjon av linearisert (1) eller sirkulær (2) DNA, idet de virale proteiner som er nødvendige for replikasjon og enkapsidering av mini-genomet tilveiebringes i trans av en virus-hjelper (AdAEl). Minimum-adenovirusen oppfører seg som de interferente, defektive partikler (DI) og forsterkes progressivt under suksessive passasjer. Hovedproblemet som oppstår ved bruk av denne metodologi er separeringen av de to typer partikler som fremstilles, ansvarlige for kontamineringen av forråd med virushjelper, og de små mengder således oppnådd minimum-adenovirus (mindre enn IO<8> upf/ml).
Foreliggende oppfinnelse tillater for første gang å generere minimum-adenovirus under anvendelse av en baculovirus for å avlevere det adenovirale mini-genom og en baculovirus for å tilveiebringe totaliteten av franskomplementeringsfunksjoner (komplementant genom).
Det rekombinante, adenovirale genom innføres fortrinnsvis i baculovirusen mellom to sekvenser som tillater en setespesifikk rekombinasjon i de kompetente celler som beskrevet for baculovirus-hjelperen.
Foreliggende oppfinnelse beskriver særlig et system for produksjon av minimum-adenovirus under anvendelse av en baculovirus for å avlevere det adenovirale mini-genom ved hjelp av systemet loxP/Cre og en baculovirus for å tilveiebringe totaliteten av trans-komplementeringsfunksjonene (komplementant genom), likeledes ved hjelp av et system Cre/loxP (se figurene 2 til 4).
I henhold til en annen utførelsesform er det setespesifikke rekombinasjonssystem som benyttes for å avlevere komplementeringsfunksjonene forskjellig fra det som benyttes for å avlevere genomet av den rekombinante adenovirus. Særlig kan systemet LoxP/Cre benyttes for å avlevere det defekte, adenovirale genom og systemet AttP/AttB for å avlevere komplementeringsfunksjonen(e).
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater således å konstruere en adenoviral vektor som er deletert for enhver viral kodende sekvens og som ikke omfatter mer enn ITR'ene og enkapsideringssignalet (minimum-adenovirus). Denne vektor kan teoretisk omfatte opptil 37 kb eksogensekvens, mens kloningskapasiteten for dagens vektorer ikke går ut over 8,5 kb. Man kan således nå klone gener med stor størrelse som dystrofingen (14 kb) med alle deres reguleringselementer (promotor, enhancer, introner, og så videre) for å oppnå en optimal ekspresjon i målvevet. Videre vil fraværet av enhver immunogen, viral sekvens øke ekspresjonsvarigheten av transgenet i de hvilende vev.
Genomet av den defektive AAV eller retrovirus kan likeledes innføres i form av en virus, et genom eller en plasmid i henhold til teknikker som beskrevet ovenfor.
Kompetente celler
Foreliggende oppfinnelse kan anvendes i forskjellige typer celler. Ifølge oppfinnelsen mener man med uttrykket "kompetent celle" en celle som tillater infeksjon med baculovirus og virus som skal produseres og som tillater en produktiv viral syklus for den sistnevnte. Kapasiteten for å infisere cellene med disse virus kan bestemmes under anvendelse av rekombinante virus som uttrykker et markørgen som genet LacZ av E.coli. Det dreier seg fortrinnsvis om pattedyr celler og aller helst om celler av human opprinnelse. De kompetente celler som benyttes kan være hvilende celler eller celler under aktiv deling, etablerte linjer eller primærkulturer. Det dreier seg fortrinnsvis om pattefyr celler som er kompatible med en industriell anvendelse, det vil si uten kjent patogen karakter, dyrkbare og eventuelt i stand til å kunne lagres under egnede betingelser. Fortrinnsvis er de benyttede celler hepatiske, muskel-, fibroblastiske, embryonære, nerve-, epitel(pulmonære)- eller okulære(retinen) celler. Man kan som ikke-begrensende eksempel nevne 293-celler eller enhver avledet celle som bærer en supplementær komplementeringsfunksjon (293E4, 293E2a, og så videre), cellene A549, cellene HuH7, cellene Hep3B, cellene HepG2, de humane retinoblastiske celler (HER, 911), HeLa-celler, 3T3-celler eller også KB-celler.
i
For å gjennomføre fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan genomet av den rekombinante virus og baculovirusen innføres i populasjonen av kompetente celler samtidig eller tidsforskutt. Fortrinnsvis bringes cellene samtidig i kontakt med det rekombinante genom og hjelper-baculovirusen. I det tilfellet der systemet genererer replikative molekyler in vivo, blir rekombinasen innført eller uttrykt på forhånd, samtidig eller etterpå.
Produksjonen av virusene fører generelt til cellelysering. De produserte virus kan således samles etter cellulær lysering i henhold til i og for seg kjente rensemetoder. De kan deretter kondisjoneres på forskjellige måter i henhold til den tilsiktede bruk. For videre å unngå enhver risiko av det virale forråd med eventuelle spor av baculovirus som ikke har penetrert de kompetente celler (baculovirus-hjelper eller baculovirus som tilveiebringer det rekombinante, virale genom), er det mulig å anvende de følgende teknikker: - Det er mulig å rense adenovirusene ved kromatografi i henhold til den metode som er beskrevet i FR 96/08164. Denne teknikk tillater å separere adenovirusene fra enhver eventuell gjenværende baculovirus. - Det er likeledes mulig å benytte organiske oppløsningsmidler (som eter, kloroform) på de rensede adenovirusforråd. Således er baculovirusen en omhyllet virus (glycoprotein-omhylling) og således meget følsom overfor ethvert organisk oppløsnings-middel (som ekstraherer lipider fra omhyllingen); eller tvert om er adenovirusen ikke omhyllet og der har oppløsningsmidlene ingen effekt. - Det er videre mulig, ved rensing på CsCl-gradient, å separere etter densitet, den eventuelle restbaculovirus fra rekombinant virus.
Disse tre metoder kan benyttes uavhengig eller i forbindelse med hverandre. Imidlertid kan en hvilken som helst annen metode som er kjent av fagmannen, benyttes.
Anvendelse av virusene
De således produserte virus kan benyttes for kloning, overføring og ekspresjon av gener av interesse in vitro, ex vivo eller in vivo. Slike gener av interesse er for eksempel gener som koder for enzymer, blodderivater, hormoner, lymfokiner: interleukiner, inter-feroner, TNF, og så videre (FR 9203120), vekstfaktorer, neurotransmittorer eller deres forløper eller synteseenzymer, trofiske faktorer: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, og så videre; apolipoproteiner: ApoAI, ApoATV, ApoE, og så videre (WO 94/25073), dystrofin eller et mini-dystrofin (WO 93/06223), tumorsuppressorgener p53, Rb, Rapi A, DCC, k-rev, og så videre (WO 94/24297), gener som koder for faktorer involvert i koagulering: faktorene VE, VIE, IX, og så videre, selvmordsgener: tymidinkinase, cytosindesaminase, og så videre; eller også hele eller en del av et naturlig eller kunstig immunoglobulin (Fab, ScFv, og så videre, WO 94/29446), og så videre. Genet av interesse kan likeledes være et antiretningsgen eller en -sekvens hvis ekspresjon i målcellen tillater å kontrollere ekspresjonen av gener eller transkripsjonen av cellulær mRNA. Slike sekvenser kan for eksempel transkriberes til RNA som er komplementær, cellulær mRNA og derved blokkere deres traduksjon til protein, i henhold til den teknikk som er beskrevet i EP 140 308. Genet av interesse kan likeledes være et gen som koder for et antigenisk peptid, i stand til å generere en immun respons, med henblikk på realisering av vaksiner. Det kan likeledes særlig dreie seg om antigeniske peptider som er spesifikke for Eppstein-Barr-virusen, HTV-virusen, hepatitt-B-virusen (EP 185 573), pesudo-hundegalskap-virusen eller også spesifikke for tumorer (EP 259 212. Genet kan være et hvilket som helst DNA (gDNA, cDNA, og så videre) som koder for et produkt av interesse, inkludert potensielt egnede ekspresjonssignaler (promotor, terminator, og så videre).
Disse virus kan benyttes in vitro for produksjon av de rekombinante proteiner. De kan likeledes benyttes, fremdeles in vitro, for å studere virkningsmekanismen for disse proteiner eller for å studere reguleringen av ekspresjonen av gener eller aktiviteten til promotoren. De kan likeledes benyttes in vivo for å skape dyremodeller eller transgeniske dyr. De kan likeledes benyttes for overføring og ekspresjon av gener in vivo, hos dyr eller mennesker, i gen- eller cellulærterapimetoder.
Foreliggende oppfinnelse skal beskrives i større detalj ved hjelp av de følgende illustrer-ende eksempler.
Figurforklaring
Figur 1: Produksjonsskjema for en defekte rekombinant adenovirus av tredje generasjon
(defekt for funksjonene El og E4) under anvendelse av en baculo-El,E4;
figurene 2-4: Produksjonsskjema for en minimum-adenovirus under anvendelse av en første baculovirus for å innføre det defekte, adenovirale genom og en andre baculovirus for å innføre komplementeringsfunksjonene; og
figur 5: Produksjonsskjema for en defekt, rekombinant AAV for Rep- og Cap-funksjonene under anvendelse av en baculo-Rep/Cap.
Eksempler
1. Anvendte celler
Cellene som benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen kan stamme fra en hvilken som helst linje eller cellulær populasjon som kan infiseres med en adenovirus eller en AAV eller en retrovirus eller med en baculovirus, kompatibel med en anvendelse for terapeutiske formål. Det kan fortrinnsvis dreie seg om en pattedyr celle og særlig human celle. Man kan i denne forbindelse særlig nevne:
- Celler fra linje 293:
Linje 293 er en human embryonyrecellelinje inneholdende den venstre ekstremitet (ca. 11-12%) av genomet av adenovirusen serotype 5 (Ad5), omfattende den venstre ITR, enkapsideringsområdet, området El inkludert Ela, Elb, området som koder for proteinet pIX og en del av området som koder for proteinet pIVa2 (Graham et al., "J. Gen. Virol.", 36 (1977) 59). Denne linje er i stand til transkomplementering av defekte, rekombinante adenovirus for området El, det vil si berøvet for hele eller en del av området El, og å produsere virale forråd med høye titere.
- Celler fra linje A549:
Celler som komplementerer området El av adenovirusen konstrueres fra cellene A549 (Imler et al., "Gene Ther. (1996) 75). Disse celler inneholder et begrenset fragment av området El, berøvet for den venstre ITR, plassert under kontroll av en induserbar promotor.
- Celler fra linjer HER:
De humane embryo-retinaceller (HER) kan infiseres med en adenovirus (Byrd et al.,
"Oncogene", 2 (1988) 477). Enkapsideringscellene av adenovirusen som fremstilles fra disse celler er beskrevet for eksempel i WO 94/28152 eller i en artikkel av Fallaux et al.
("Hum. Gene Ther." (1996) 215). Man kan særlig nevne linje 911 som omfatter området El av genomet av adenovirus Ad5, fra nukleotid 79 til nukleotid 5789, integrert i genomet av HER-cellene. Denne cellelinje tillater produksjon av virus som er defektive for området El.
- IGRP2- celler:
IGRP2-cellene er celler som oppnås fra 293-celler ved integrering av en funksjonell enhet fra området E4 under kontroll av en induserbar promotor. Disse celler tillater produksjon av virus som er defekte for områdene El og E4 (Yeh et al., "J. Virol. (1996) 70).
- VK- celler:
VK-celler (VK2-20 og VK10-9) er celler som oppnås fra 293-celler ved integrering av integraliteten av området E4 under kontroll av en induserbar promotor, og områder som koder for proteinet pDC. Disse celler tillater produksjon av virus som er defekt for områdene El og E4 (Krougliak et al., "Hum. Gene Ther.", 6 (1995) 1575).
- 293E4- celler:
293E4-celler er celler som oppnås fra 293-celler ved integrering av integraliteten av området E4. Disse celler tillater produksjon av virus som er defekte for områdene El og E4 (WO 95/02697; "Cancer Gene Ther.", (1995) 322). - Cellene Sf9 og Sf21 er lepidoptære embryonære celler. Disse celler er tilgjengelige i samlinger (nr. CRL-1711 ATCC) på samme måte som deres dyrkingsbetingelser. De er likeledes kommersielt tilgjengelige (Gibco). Se til dette King og Possee: 'The baculovirus expression system", London, Chapman og Hall, 1992.
- De humane heptocytære celler:
Cellene HepG2 og Hep3B og HuH7 er humane linjer som stammer fra hepatokarsi-nomer. De er tilgjengelige i deponeringssamlinger og deres egenskaper er beskrevet for eksempel i US 4 393 133 og US 4 393 133.
- Humancellelinje KB:
stammer fra et human epidermisk karsinom, denne linje er tilgjengelig fra ATCC under referansenummet CCL17 på samme måte som betingelsene som tillater dyrkingen.
- Humancellelinje HeLa:
stammer fra et karsinom av humanepitel, denne linje er tilgjengelig fra ATCC under nummeret CCL2 på samme måte som betingelsene som tillater dens dyrking; og
- Cellelinjen Wl62:
Disse celler er Vero-celler som, integrert i deres genom, omfatter området E4 og adenovirusen Ad2. Disse celler er beskrevet av Weinberg et al. ("PNAS", 80 (1983) 5383). 2. Infeksjon av bumane celler med en rekombinant baculovirus Dette eksempel beskriver evnen hos baculovirus til å infisere celler av human opprinnelse.
Humane celler (særlig 293 eller derivater derav) infiseres med forskjellige fortynninger av en oppløsning av rekombinant baculovirus som uttrykker genet LacZ under kontroll av LTR av RSV. 48 timer etter infeksjon blir opptredenen av blå celler påvist, noe som viser infiserbarheten av cellene med en baculovirus. 3. Konstruksjon av baculovirus som uttrykker området El av adenovirusen og en tilsvarende defekt adenovirus
3. 1. Kloning av to kassetter for ekspresjon av El.
Plasmidet AE2 stammer fra kloning, i PCRII (Invitrogen), av produktet fra PCR gjennomført på pBREl med oligonukleotidene 5'-TCCTTGCATTTGGGTAACAG-3' og 5' -GCGGCCGCTC AATCTGTATCTTC-3; dette PCR-produkt inneholder nukleotidene 3198 til 3511 av Ad5, det vil si 3'-enden av området E1B. Plasmidet pBREl inneholder nukleotidene 1 til 5788 av Ad5 klonet i pBR322, deletert omtrent for nukleotidene 1300 til 2300.
Plasmidet AE3 stammer fra kloning av fragmentet Notl-Kpnl av AE2, inneholdende produktet av PCR, i pCDNA3 (Invitrogen), digerert med Notl-Kpnl. Det inneholder nukleotidene 2198 til 3511 av Ad5, fulgt av polyadenyleringssetet av BGH. Plasmidet AE4 stammer fra kloning av fragmentet Bglll-PvuII av AE3 i pBREl. AE4 er et plasmid som inneholder den følgende ekspresjonskassett av El: - nukleotidene 1 til 3511 av Ad5, det vil si den venstre ITR, enkapsiderings-sekvensene, ElA-promotoren, genet EIA, promotoren E1B, genet E1B
- polyA av bovin veksthormonet (BGH) fra pCDNA3.
pBREl kuttes med BstNI og kuttes så med T4 DNA-polymerase for å fylle opp 5'-enden og kuttes så med Xbal. Det således genererte fragment inneholdende nukleotidene 391 til 1339 av Ad5 innføres i pic20H kuttet med Smal-Xbal (ikke metylert sete) for å generere plasmidet AE5.
Plasmidet AE6 stammer fra kloning av fragmentet EcoRI-Smal av AE5 i AE4 kuttet med EcoRI-Smal. AE6 er et plasmid som inneholder den følgende ekspresjonskassett av El: - nukleotidene 391 til 3511 av Ad5, det vil si promotoren "redusert" for EIA, genet EIA, promotoren E1B, genet E1B.
- polyA av bovinveksthormonet (BGH) fra pCDNA3.
3. 2. Kloning av de to El- kassetter i en baculovirus.
Fragmentene EcoRI-SphI (SphI utgående 5'-ende er på forhånd gjort butt ved fordøyning med T4 DNA-polymerase) av plasmidene AE4 og AE6 klones i plasmidet pAcSG2 (Pharmingen) mellom setene EcoRI og EcoRV. Dette gir respektivt plasmidene AE14 og AE15.1 de to tilfeller blir området El innført i locusen av genet av polyhedrin (gen+promotor av polyhedring er deletert).
Plasmidene AE14 og AE15 kotransfekteres med DNA av baculovirusen BaculoGold fra stammen AcNPV (Pharmingen) i innsektsceller Sf9 for å generere to rekombinante baculovirus tilsvarende BacAE14 og BacAE15 som bærer de to El-ekspresjonskassetter integrerte i locus av genet av polyhedrin.
3. 3. Kloning av rekombinant adenovirus som bærer en ny delesjon El.
Plasmidet pCOl (WO 96/10088) kuttes med BstXl og så fordøyd med T4 DNA-polymerase for å eliminere den uttredende 3'-ende og kuttes så med Rsal. Det således genererte fragment inneholdende nukleotidene 3513 til 4607 av Ad5 innføres i pBS-SK+ (Stratagene) linearisert med EcoRV og fordøyd med alkalisk fosfatase fra kalv, for å generere plasmidet AEO.
Plasmidet pMA37 oppnås ved ligering av fragmentene:
- EcoRV-Nsil av pXL2756 inneholdende sacB. pXL2756, har genet for kontraselek-sjon SacB, fritt for setene EcoRI og Kpnl, genet for kanamycinresistens, et kloningsmultisete og en replikasjonsopprinnelse ColEl.
- Ndel-Nsil av pCOl (inneholdende adenosekvensene)
- Sali (den uttredende 5'-ende fylt med T4 DNA-polymerase)-AseI av pXL2756 (resistent kanamycinvektor).
pMA37 inneholder således:
- genet for resistens mot kanamycin
- genet SacB som gir en sensitibilitet mot sucrose hos bakterier som uttrykker den
- sekvensene 1 til 382 (Hinfl) av Ad5, fulgt av sekvensene 3446 til 4415 (Nsil) av Ad5; det er intet transgen.
Plasmidet AE11 er konstruert ved innføring av fragmentet Xhol-Nsil av AEO i pMA37, fordøyd med Sall-Nsil. Det inneholder således:
- genet for resistens mot kanamycin
- genet SacB som gir en sensitibilitet mot sucrose hos bakterier som uttrykker den
- sekvensene 1 til 382 (Hinfl) av Ad5, fulgt av sekvensene 3513 til 4415 (Nsil) av Ad5; det er intet transgen.
Fra plasmidet AE11 konstrueres det så selvmordsskyttelvektorer (ved innskyting av transgene av interesse) som tillater konstruksjonen av rekombinante virus ved rekombinasjon i E. coli. AE11 inneholder ikke noen sekvens som er homolog med plasmidet AE6. Plasmidene AE11 og AE4 har til felles sekvensene 1 til 382 (Hinfl) av Ad5 oppstrøms EIA, men det er ingen homologi nedstrøms kassetten El mellom de to plasmider. Således kan det ikke være noen generering av RCA ved homolog rekombinasjon mellom en adenobærer av delesjonen El som foreligger i AE11 (det vil si 382 til 3513) og baculovirusene BacAE14 eller BacAE15.
3. 4. Konstruksjon av en rekombinant adenovirus av første generasjon.
I et første trinn blir et forråd av BacAE14 eller -15 preparert i henhold til klassiske teknikker. Deretter blir kompetente celler (for eksempel HuH7) transfektert med 5 ug plasmid pXL2822, fordøyd med PacI (plasmidet pXL2822 inneholder hele Ad5 deletert for El (382-3446 eller 382-3513) og E3 (28592-30470) og bærer en kassett CMV-BGal) og infiseres, eventuelt samtidig, ved en MOT mellom 10 og 1000, med BacEA14 eller
-15. Når cellene lyseres, samles transfeksjonssupematanten og bringes deretter på "friske" kompetente celler som på forhånd eller samtidig er infisert med BacAE14 eller -15 (MOI 10 til 1000) for å forsterke adenovirusen Ad2822, og deretter å oppnå et forråd av Ad2822. Forløpet av forsterkningen av Ad2822 lettes ved nærværet av LacZ i virusen. Ved hver forsterkning blir supernatanten således pseudo-titrert på W162. Genomet av virusen analyseres under forsterkning for å verifisere integriteten. Denne strategi gi fordelen av ikke å kunne generere RCA i de således fremstilte adenovirusforråd. Dette fravær av forurensing verifiseres også. 4. Konstruksjon av en baculovirus som uttrykker områdene £1 og E4 av adenovirusen
4. 1. Konstruksjon av baculovirusen El, E4 ( Bac. El- E4).
Den benyttede protokoll er den følgende: Områdene El og E4 klones i invert orientering til locusen av genet av polyhedrin (Ph), i skyttelvektoren pBacPAK8 (Clontech, USA) for derved å gi pBacEl-E4. Den rekombinante baculovirus isoleres deretter i henhold til klassiske teknikker ved kotransfeksjon av pBacEl-E4 og DNA av baculovirusen BacPAK6 i Sf9-celler (Kitts og Possee, "Biotechniques 14(5) (1993) 810). Nærværet av El og E4 i genomet av de rekombinerte baculovirus verifiseres deretter ved PCR fra infekterte Sf9-celler. Transkripsjonen av El og E4 i Huh7-celler som er infektert med renset, rekombinert baculovirus analyseres ved RT-PCR fra cytoplasmisk RNA.
For konstruksjonen av baculovirusen E1-E4 kan det innføres forskjellige fragmenter som bærer El. Fragmentene som benyttes i dette eksempel er de som er beskrevet i eksempel 3 for konstruksjon av baculovirus El inneholdende områdene El under kontroll av den egne promotor (den reduserte promotor Ela og promotoren Elb). De benyttede E4-fragmenter er således de følgende:
- fragment Maell-Mscl 32720-35835 som bærer integraliteten av E4
- fragment BglE-PvuII 34115-33216 som bærer fasen ORF6
- fragment Bglll-Bglll 34115-32490 som bærer fasene ORF6-ORF6/7
- fragment PvuII-AluI 34801-334329 som bærer fasen ORF3.
Disse fragmenter plasseres alternativt under kontroll av promotoren E4 eller forskjellige promotorer, særlig promotoren HSV-TK, CMV eller LTR-RSV.
De posisjoner som er gitt ovenfor refererer til sekvensen av vill-adenovirusen Ad5 som publisert og tilgjengelig i databaser. Selv om visse mindre variasjoner kan foreligge mellom forskjellige adenovirus-serotyper, er disse posisjoner generelt transponerbare til andre serotyper og særlig til Ad2, Ad7, Adl2 og Ad CAV-2.
4. 2. Transkomplementering av AdAElAE4- LacZ med Bac. El- E4.
Produksjonen av adenovirusen AdAElAE4-LacZ oppnås ved innføring i kompetente celler av baculovirusen E1.E4 som fremstilt i eksempel 4.1. og det adenovirale genom som er defektivt for El og E4 (se figur 1). De optimale betingelser for produksjon av AdAEl AE4-LacZ i de kompetente celler, ved transkomplementering med renset Bac.El-E4, analyseres. Titeren for AdAEl AE4 bestemmes ved antallet transduksjonsenheter av fi-galactosidase (td.u.) i linjen W162 og den oppnådde transkomplemen-teringseffektivitet sammenlignes med den til enkapsideringslinjen IGRP2.
5. Konstruksjon av en baculovirus som komplementerer helheten av genomet av
adenovirusen
Selv om samtidig ekspresjon av flere proteiner som kan representere helt opptil 13 kb sekvens, fra en enkelt virus, er rapportert (Belyaev og Roy, "NAR" 21 (1993) 1219), er den maksimale kloningskapasitet av baculovirusen ikke godt dokumentert. Dette eksempel viser imidlertid at det er mulig å klone genomet av adenovirusen som er deletert sitt enkapsideirngssignal (Ad.Psi-) og kantet av to seter loxP [loxP-ITR-ITR til E4 -loxP] i baculovirusen. Infeksjon av kompetente celler som eksprimerer rekombinasen Cre på eventuelt indukterbar måte (linjen Cre eller Cre-ER, se eksempel 7), med den rekombinerte baculovirus og aktivering av rekombinasen Cre, tillater utskjæring og sirkularisering av det adenovirale genom. Dette er nu i stand til å transdusere de tidlige gener, å replikere dem og å aktivere de sene gener, men ikke i stand til enkapsidering, og skiller seg så fra hjelperen for produksjon av en minimum-adenovirus (se figurene 2 til 4). I dette system er produksjonen av minimum-adenovirus basert på koinfeksjon med to baculovirus og realisering av to rekombinasjonsevenementer mellom setene loxP. Denne vei oppviser fordelene av ikke å generere adenovirale partikler fra virus-hjelperen.
Konstruksjonen av genomet Ad.Psi- gjennomføres i E. coli. For dette blir det komplette genom av adenovirusen Ad5 klonet i en prokaryotisk kloningsvektor, ITR-sammen-føyninger. Psi-sekvensen deleteres ved enzymatisk spalting og ligering eller ved rettet mutagenese. En LoxP-sekvens blir deretter innført på hver side av det adenovirale genom i parallell orientering. Den resulterende konstruksjon [loxP-ITR-ITR.APsi til E4
-loxP] og blir deretter klonet i en skyttelvektor som tillater rekombinasjon med en baculovirus i henhold til den strategi som er beskrevet i eksempel 3. Den oppnådde, rekombinante baculovirus kalt BacAd.Psi-, isoleres deretter i henhold til klassiske metoder. 6. Konstruksjon av en baculovirus som omfatter genomet av en defektiv,
rekombinant adenovirus i utkuttbar form
Dette eksempel beskriver konstruksjonen av en baculovirus som tillater i de kompetente celler å tilveiebringe genomet av en defekt, rekombinant adenovirus. Mer spesielt er den rekombinante adenovirus defekt for helheten av de kodende områder og holder ikke tilbake annet enn ITR- og Psi-områdene (minimum-adenovirus eller AdA).
6. 1. Konstruksjon av et mini- genom ( AdA) i E. coli.
Det konstrueres et plasmid p[loxP-(ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA)-loxP]. For dette formål blir en kopi av ITR-sekvensen av adenovirusen isolert ved enzymatisk kutting og/eller PCR-forsterkning og så klonet oppstrøms sekvensen ITR-Psi inneholdt i skyttelvektoren av adenovirusen pGY63. Denne vektor som stammer fra pCOl (WO 96/10088) og som har genet LacZ under kontroll av den umiddelbare tidlige promotor av cytomegalovirusen (P.CMV) avsluttet av polyadenyleringssignalet av virusen SV40 (pA), klonet mellom sekvensen ITR-Psi og genet som koder for pDC. Området av denne vektor (tilsvarende et minimum-adenovirusgenom) isoleres deretter ved enzymatisk kutting og klones så mellom LoxP-setene i multisete for kloning i plasmidet pBS246 (Gibco) for å generere plasmidet p[loxP-(ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA)-loxP]. Kapasiteten for å produsere mini-genomene av adenovirus fra en sirkulær DNA og å enkapsi-dere disse prøves deretter ved transfeksjon av plasmidet i linje IGRP2, infisert med et Ad.AElAE4 som uttrykker rekombinasen Cre (AdCre). Minimum-adenovirusene forsterkes ved noen suksessive føringer av supernatanten av transfeksjonen i linje IGRP2. De renses deretter ved isopycnisk sentrifugering i cesiumkloridgradient og kvantifisere ved pseudo-titrering i linjen W162. Det skal være klart at genet LacZ lett kan erstattes med en hvilken som helst annen nukleinsyre av interesse ved klassiske teknikker innen molekylærbiologi en.
6. 2. Kloning av et utskjærbart mini- genom i en baculovirus.
Konstruksjonen som bærer mini-genomet AdA kantet av de to loxP-seter som beskrevet ovenfor klones i locus P10 av baculovirusen i skyttelvektoren pAcUWl (Pharmingen, USA). Baculovirusen Bac.AdA fremstilles så og isoleres ved klassiske kotransfeksjons-teknikker i Sf9-celler som nevnt ovenfor og selekteres i henhold til sin populasjons-fenotype (hvit), etter farging med X-Gal. Denne baculovirus bærer således et sterkt defekt, adenoviralt genom, omgitt av loxP-områder i direkte orientering. 6. 3. Fremstilling av AdA ved transkomplementering med baculovirusen BacAdPsf. Kompetente celler ko-infiseres samtidig med baculovirusen BacAdPsi" (som beskrevet i eksempel 5) som bærer transkomplementeirngsfunksj onene av helheten av det adenovirale genom, og med baculovirusen Bac.AdA som bærer genomet av pseudo-adenovirusen (beskrevet ovenfor). Rekombinasen Cre tilveiebringes enten ved tilsetning av protein i kulturmedium eller ved transfeksjon av cellene med et plasmid eller en virus (baculovirus) som uttrykker Cre, eller ved ekspresjon av en kassett som stabilt er integrert i genomet av linjen (som beskrevet i eksempel 7). Mimmum-adenovirusen forsterkes ved suksessive passasjer av supematanten fra kulturer av cellene ko-infisert med BacAd.Psi" og med supernatant og renses og titreres så i henhold til teknikker som beskrevet ovenfor. Denne teknikk tillater at man som eneste virus oppnår AdA, noe som tillater isolering og rensing ved klassiske metoder. Videre er de mengder som oppnås forenelige med en industriell anvendelse.
7. Konstruksjon av en linje som uttrykker proteinet Cre
En linje som uttrykker Cre på eventuelt indukterbar måte, konstrueres for å øke rekombinasjonseffektiviteten mellom loxP-setene i baculovirusen ifølge oppfinnelsen (for eksempel Bac.AdA og BacAd.Psi") og å kontrollere ekspresjonen av Cre. I denne konstruksjon uttrykkes Cre alene eller i form av et C-terminalt fusjonsprotein med fikseringsdomenet av reseptoren for østradiol (ER) (Metzger et al., 1996, supra), under kontroll av en ubikitær promotor, fortrinnsvis sterk og eventuelt indukterbar. Mer spesielt er de benyttede promotorene, promotoren pGRE5, promotoren av metallotionin, promotoren SV40 eller promotoren av genet HSV-TK.
For å konstruere linjene Cre, blir de kompetente celler kotransfektert med to plasmider, det ene inneholdende ekspresjonskassetten Cre (Cre eller Cre-ER) og den andre en seleksjonsmarkør (Neo). Kloner som er resistente overfor G418 selekteres og Cre-aktiviteten i disse kloner testet ved transfeksjon av plasmidet p(P.CMV-loxP-ATG-stopp-pA-LoxP-LacZ). Dette plasmid inneholder genet LacZ, inaktivert ved introduk-sjon mellom en promotor (P.CMV) og begynnelsen av LacZ av en stoppkodonsuksesjon i de tre lesefaser og signalet for transkripsjons- og polyadenyleringsslutt av virusen SV40, kantet av to loxP-seter. Ekspresjonen av Cre i klonene, eventuelt i nærvær av induktor (østradiol) blir deretter tilkjennegitt ved den 6-galactosidase-aktivitet som induseres ved rekombinasjon mellom de to loxP-seter. Flere kloner uttrykker stabilt fusjonsproteinet Cre-ER eller proteinet Cre alene fra promoter og de kompetente celler som presiseres nedenfor er selektert. Disse kloner kan anvendes for fremstilling av virusen ifølge oppfinnelsen.
Claims (29)
1.
Fremgangsmåte for fremstilling av defekte rekombinante virus, karakterisert ved at man i en populasjon av kompetente celler, innfører genomet av den defekte, rekombinante virus og en baculovirus som bærer alle eller en del av de funksjoner som er nødvendige for transkomplementering av det defekte, rekombinante genom, hvor resten av nevnte funksjoner blir tilveiebrakt av den kompetente cellen.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at baculovirusen omfatter alle funksjoner som er nødvendige for transkomplementering av det defekte, rekombinante genom.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at baculovirusen omfatter en del av de funksjoner som er nødvendige for transkomplementering av det defekte, rekombinante genom, idet den andre del tilveiebringes av den kompetente celle.
4.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at funksjonene som er nødvendige for transkomplementering av det defekte, rekombinante genom tilveiebringes av flere baculovirus.
5.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den defekte, rekombinante virus er en defekt, rekombinant adenovirus.
6.
Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at genomet av den rekombinante adenovirus er defekt for en eller flere funksjoner valgt blant El, E2, E3, E4, L1-L5, pIX og IVa2 og at baculovirusen omfatter alle de funksjoner som er nødvendige for transkomplementering av det defekte, rekombinante genom.
7.
Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at genomet av den rekombinante adenovirus er defekt for en eller flere funksjoner valgt blant El, E2, E3, E4, L1-L5, pIX og IVa2, idet baculovirusen omfatter en del av funksjonene som er nødvendige for transkomplementering av det defekte, rekombinante genom og den andre del av funksjonene tilveiebringes av en eller flere andre baculovirus og/eller av den kompetente celle.
8.
Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at baculovirus-hjelperen omfatter hele eller en del av området El av adenovirusen som tillater komplementering av et rekombinant adenovirus genom med et mangelfullt El område.
9.
Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at baculovirus-hjelperen omfatter hele eller en del av området E2 av adenovirusen som tillater komplementering av et rekombinant adenovirus genom med et mangelfullt E2 område.
10.
Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at baculovirus-hjelperen omfatter hele eller en del av området E4 av adenovirusen som tillater komplementering av et rekombinant adenovirus genom med et mangelfullt E4 område.
11.
Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at baculovirus-hjelperen omfatter hele eller en del av området El og E4 av adenovirusen som tillater komplementering av et rekombinant adenovirus genom med et mangelfullt El og E4 område.
12.
Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at genomet av den rekombinante adenovirus er berøvet ethvert kodende viralt område og at baculovirus-hjelperen omfatter alle funksjonene som tillater komplementeringen.
13.
Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at baculovirusen omfatter helheten av et adenoviralt genom bortsett fra enkapsideringsområdet og eventuelt ITR'ene.
14.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at komplementeringsfunksjonene som er til stede i baculovirusen og genomet av den defekte, rekombinante virus ikke omfatter noen homologisone som kan gi en rekombinasjon.
15.
Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at et genom av rekombinant adenovirus som er defekt i området El og eventuelt E3 innføres i kompetente celler, cellene infiseres samtidig eller på annen måte med en baculovirus som bærer området El, idet området El av adenovirusen som er til stede i baculovirusen og genomet av den defekte, rekombinante adenovirus, ikke omfatter noen homologisone som kan gi noen rekombinasjon.
16.
Rekombinant hjelpe baculovirus som definert i krav 1, karakterisert ved at den innskutt i sitt genom omfatter en nukleinsyre som koder for en komplementeringsfunksj on for fremstilling av defekte rekombinante AAVer som omfatter Rep og Cap områdene til AAV under kontroll av en heterolog promotor.
17.
Rekombinant baculovirus som definert i krav 1, karakterisert v e d at den innskutt i sitt genom omfatter en nukleinsyre som koder for en komplementeirngsfunksj on valgt fra alle eller noen av funksjonene kodet av gag, pol og env områdene av et retrovirus, alene eller i kombinasjoner, under kontroll av en heterolog promotor.
18.
Baculovirus ifølge hvilket som helst av kravene 16 og 17, karakterisert ved at promotoren består av promotorområdet som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av komplementeringsfunksjonene.
19.
Baculovirus ifølge hvilket som helst av kravene 16 og 18, karakterisert ved at promotoren er en sterk, eventuelt regulert, viral eller cellulær promotor.
20,
Baculovirus ifølge hvilket som helst av kravene 16-19, karakterisert ved at nukleinsyren innføres i locus av polyhedrin eller locusp 10.
21.
Baculovirus ifølge hvilket som helst av kravene 16-20, karakterisert ved at nukleinsyren innføres i form av en kassett som kan skjæres ut i den kompetente celle.
22.
Rekombinant baculovirus ifølge hvilket som helst av kravene 16 og 17, karakterisert ved at den innskutt i sitt genom inneholder minst et DNA-område omgitt av to sekvenser som tillater en setespesifikk rekombinasjon, og anbragt i direkte orientering, idet DNA-området omfatter minst en replikasjonsopprinnelse som er funksjonell i de kompetente celler og en nukleinsyre som koder for en komplementeringsfunksj on av en virus, hvor nevnte sekvenser som tillater en setespesifikk rekombinasjon er LoxP sekvenser av av bakteriofagen Pl og at rekombinasjonen oppnås i nærvær av proteinet Cre.
23.
Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det defekte, rekombinante genom innføres i cellen ved infeksjon med en adenovirus som bærer genomet.
24.
Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det defekte, rekombinante genom innføres i cellen ved transfeksjon.
25.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det defekte, rekombinante genom innføres i cellen med en rekombinant baculovirus, forskjellig fra baculovirusen som bærer komplementeringsfunksjonene.
26.
Rekombinant baculovirus ifølge hvilket som helst av kravene 16-21, karakterisert ved at den innskutt i sitt genom inneholder minst et DNA-område omgitt av to sekvenser som tillater en setespesifikk rekombinasjon og at den er anbrakt i direkte orientering, idet nevnte DNA-område omfatter minst en replikasjonsopprinnelse som er funksjonell i de kompetente celler, og et defekt, adenoviralt genom som omfatter i det vesentlige ITR-områdene, enkapsideringssekvensen og en nukleinsyre av interesse.
27.
Fremgangsmåte for fremstilling av defekte, rekombinante adenovirus, karakterisert ved at man infiserer en populasjon av kompetente celler med en baculovirus ifølge krav 22 og med en baculovirus ifølge krav 26, idet man bringer cellene i nærvær av rekombinase som tillater setespesifikk rekombinasjon, hvoretter de produserte adenovirus gjenvinnes.
28.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at populasjonen av kompetente celler er en populasjon av hepatiske, muskel-, fibroblastiske, embryonale, epitel- (særlig pulmonære), okulære- (særlig retinal) eller nerveceller.
29.
Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at populasjonen av kompetente celler velges blant 293-celler eller enhver avledet celle som bærer en supplemenetr komplementeringsfunksj on, A549, HuH7, Hep3B, HepG2, HER, 911, HeLa eller KB.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9614278A FR2756297B1 (fr) | 1996-11-22 | 1996-11-22 | Procede de production de virus recombinants |
| PCT/FR1997/002073 WO1998022607A1 (fr) | 1996-11-22 | 1997-11-18 | Procede de production de virus recombinants |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO992464D0 NO992464D0 (no) | 1999-05-21 |
| NO992464L NO992464L (no) | 1999-06-23 |
| NO323937B1 true NO323937B1 (no) | 2007-07-23 |
Family
ID=9497899
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19992464A NO323937B1 (no) | 1996-11-22 | 1999-05-21 | Rekombinante hjelpe baculovirus samt fremgangsmate for fremstilling av rekombinante virus. |
| NO2013009C NO2013009I1 (no) | 1996-11-22 | 2013-04-15 | Alipogen tiparvovec |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO2013009C NO2013009I1 (no) | 1996-11-22 | 2013-04-15 | Alipogen tiparvovec |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6387670B1 (no) |
| EP (1) | EP0946741B1 (no) |
| JP (1) | JP4686670B2 (no) |
| KR (1) | KR100719645B1 (no) |
| AT (1) | ATE317908T1 (no) |
| AU (1) | AU731106B2 (no) |
| BR (1) | BR9713388B1 (no) |
| CA (1) | CA2271438C (no) |
| CZ (1) | CZ293947B6 (no) |
| DE (1) | DE69735274T2 (no) |
| ES (1) | ES2260803T3 (no) |
| FR (1) | FR2756297B1 (no) |
| HU (1) | HU224713B1 (no) |
| IL (1) | IL129686A (no) |
| NO (2) | NO323937B1 (no) |
| SK (1) | SK286900B6 (no) |
| WO (1) | WO1998022607A1 (no) |
| ZA (1) | ZA9710516B (no) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003501042A (ja) * | 1999-05-27 | 2003-01-14 | ジェノボ， インコーポレイテッド | 非哺乳動物ウイルス由来のキャリアベクターを使用する、組換えウイルスの産生のための組成物および方法 |
| US6793926B1 (en) | 1999-05-27 | 2004-09-21 | Genovo, Inc. | Methods for production of a recombinant adeno-associated virus |
| AU5448400A (en) * | 1999-05-28 | 2000-12-18 | Mount Sinai School Of Medicine, The | A novel baculovirus/adenovirus hybrid vector for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors |
| GB9919409D0 (en) | 1999-08-18 | 1999-10-20 | Univ Oxford Brookes | Baculovirus expression system |
| EP1572943B1 (en) | 2002-08-29 | 2015-04-22 | The Board of Trustees of The Leland S. Stanford Junior University | Circular nucleic acid vectors, and methods for making and using the same |
| GB0702694D0 (en) * | 2007-02-12 | 2007-03-21 | Ark Therapeutics Ltd | Vectors |
| GB0702695D0 (en) * | 2007-02-12 | 2007-03-21 | Ark Therapeutics Ltd | Production of vectors |
| EP2019143A1 (en) | 2007-07-23 | 2009-01-28 | Genethon | CNS gene delivery using peripheral administration of AAV vectors |
| EP2058401A1 (en) | 2007-10-05 | 2009-05-13 | Genethon | Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors |
| WO2009110001A1 (en) * | 2008-03-05 | 2009-09-11 | Council Of Scientific & Industrial Research | A polymeric hybrid membrane |
| EP2287323A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-23 | Association Institut de Myologie | Widespread gene delivery to the retina using systemic administration of AAV vectors |
| EP2292781A1 (en) | 2009-08-17 | 2011-03-09 | Genethon | Baculovirus-based production of biopharmaceuticals free of contaminating baculoviral virions |
| CN102884196B (zh) * | 2010-04-01 | 2015-05-06 | 肖卫东 | 重组病毒载体的结构及其制备 |
| BR112012026095A2 (pt) | 2010-04-14 | 2015-09-15 | Emd Millipore Corp | métodos de produção de estoques de vírus de alta pureza e altos títulos e métodos de uso dos mesmos. |
| EP2847337A4 (en) | 2012-05-09 | 2016-04-27 | Univ Oregon Health & Science | PLASMIDS AND VIRAL VECTORS ASSOCIATED WITH ADENOVIRUS |
| TWI775096B (zh) | 2012-05-15 | 2022-08-21 | 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 | 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd) |
| WO2013190059A1 (en) | 2012-06-21 | 2013-12-27 | Association Institut De Myologie | Widespread gene delivery of gene therapy vectors |
| US11078464B2 (en) * | 2013-08-30 | 2021-08-03 | Amgen Inc. | High titer recombinant AAV vector production in adherent and suspension cells |
| IL259321B2 (en) | 2014-03-17 | 2023-10-01 | Univ Washington | Preparations and methods for increasing gene expression in frogs |
| CN114480502A (zh) | 2015-03-02 | 2022-05-13 | 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 | 用于将多核苷酸玻璃体内递送到视网膜视锥的组合物和方法 |
| GB2545763A (en) | 2015-12-23 | 2017-06-28 | Adverum Biotechnologies Inc | Mutant viral capsid libraries and related systems and methods |
| US10538571B2 (en) | 2017-11-27 | 2020-01-21 | Coda Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for neurological diseases |
| US10610606B2 (en) | 2018-02-01 | 2020-04-07 | Homology Medicines, Inc. | Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof |
| CN112041437A (zh) | 2018-02-19 | 2020-12-04 | 同源药物公司 | 用于恢复f8基因功能的腺相关病毒组合物和其使用方法 |
| US20230193315A1 (en) | 2019-01-31 | 2023-06-22 | Oregon Health & Science University | Methods for using transcription-dependent directed evolution of aav capsids |
| US20220348635A1 (en) | 2019-08-21 | 2022-11-03 | Coda Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for neurological diseases |
| TW202140791A (zh) | 2020-01-13 | 2021-11-01 | 美商霍蒙拉奇醫藥公司 | 治療苯酮尿症之方法 |
| TW202208632A (zh) | 2020-05-27 | 2022-03-01 | 美商同源醫藥公司 | 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法 |
| GB202013940D0 (en) | 2020-09-04 | 2020-10-21 | Synpromics Ltd | Regulatory nucleic acid sequences |
| US20230374542A1 (en) | 2020-10-07 | 2023-11-23 | Asklepios Biopharmaceutical, Inc. | Therapeutic adeno-associated virus delivery of fukutin related protein (fkrp) for treating dystroglycanopathy. disorders including limb girdle 21 (lgmd21) |
| WO2023212298A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Broadwing Bio Llc | Bispecific antibodies and methods of treating ocular disease |
| WO2023212294A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Broadwing Bio Llc | Angiopoietin-related protein 7-specific antibodies and uses thereof |
| WO2023212293A1 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Broadwing Bio Llc | Complement factor h related 4-specific antibodies and uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL92298A (en) * | 1988-11-14 | 2001-04-30 | Us Secretary U S Dept Of Comme | Method for producing isolated empty b19 parvovirus capsids, introducing genes into cells utilizing the same, diagnostic assays for detecting parvovirus infection and an anti-parvovirus vaccine containing said capsids |
| US5559099A (en) * | 1994-09-08 | 1996-09-24 | Genvec, Inc. | Penton base protein and methods of using same |
| CA2200835A1 (en) * | 1994-09-23 | 1996-03-28 | Frederick M. Boyce | Use of a non-mammalian dna virus to express an exogenous gene in a mammalian cell |
-
1996
- 1996-11-22 FR FR9614278A patent/FR2756297B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-11-18 HU HU0001762A patent/HU224713B1/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 1997-11-18 SK SK666-99A patent/SK286900B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 BR BRPI9713388-4A patent/BR9713388B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 ES ES97947083T patent/ES2260803T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 CZ CZ19991822A patent/CZ293947B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 CA CA2271438A patent/CA2271438C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 AU AU52261/98A patent/AU731106B2/en not_active Expired
- 1997-11-18 DE DE69735274T patent/DE69735274T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 WO PCT/FR1997/002073 patent/WO1998022607A1/fr active IP Right Grant
- 1997-11-18 KR KR1019997004531A patent/KR100719645B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 IL IL12968697A patent/IL129686A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 AT AT97947083T patent/ATE317908T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-11-18 EP EP97947083A patent/EP0946741B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 US US09/308,398 patent/US6387670B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-18 JP JP52328298A patent/JP4686670B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-11-21 ZA ZA9710516A patent/ZA9710516B/xx unknown
-
1999
- 1999-05-21 NO NO19992464A patent/NO323937B1/no not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-05-09 US US10/141,491 patent/US20030022356A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-04-15 NO NO2013009C patent/NO2013009I1/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU5226198A (en) | 1998-06-10 |
| BR9713388B1 (pt) | 2009-01-13 |
| HUP0001762A2 (hu) | 2000-09-28 |
| JP2001503993A (ja) | 2001-03-27 |
| CZ182299A3 (cs) | 1999-08-11 |
| US20030022356A1 (en) | 2003-01-30 |
| JP4686670B2 (ja) | 2011-05-25 |
| BR9713388A (pt) | 2000-03-21 |
| ATE317908T1 (de) | 2006-03-15 |
| EP0946741B1 (fr) | 2006-02-15 |
| ZA9710516B (en) | 1998-06-10 |
| DE69735274D1 (de) | 2006-04-20 |
| CZ293947B6 (cs) | 2004-08-18 |
| HU224713B1 (en) | 2006-01-30 |
| ES2260803T3 (es) | 2006-11-01 |
| SK66699A3 (en) | 2000-02-14 |
| KR100719645B1 (ko) | 2007-05-17 |
| NO992464D0 (no) | 1999-05-21 |
| US6387670B1 (en) | 2002-05-14 |
| DE69735274T2 (de) | 2006-10-12 |
| WO1998022607A1 (fr) | 1998-05-28 |
| SK286900B6 (sk) | 2009-07-06 |
| FR2756297A1 (fr) | 1998-05-29 |
| CA2271438C (fr) | 2010-10-26 |
| HUP0001762A3 (en) | 2002-01-28 |
| IL129686A0 (en) | 2000-02-29 |
| CA2271438A1 (fr) | 1998-05-28 |
| EP0946741A1 (fr) | 1999-10-06 |
| AU731106B2 (en) | 2001-03-22 |
| NO992464L (no) | 1999-06-23 |
| IL129686A (en) | 2005-12-18 |
| NO2013009I1 (no) | 2013-04-29 |
| FR2756297B1 (fr) | 1999-01-08 |
| KR20000057202A (ko) | 2000-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO323937B1 (no) | Rekombinante hjelpe baculovirus samt fremgangsmate for fremstilling av rekombinante virus. | |
| EP1226264B1 (en) | Cell lines and constructs useful in production of e1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus | |
| US8236293B2 (en) | Means and methods for nucleic acid delivery vehicle design and nucleic acid transfer | |
| NO321309B1 (no) | Defektive, rekombinante adenovirus, cellelinje, samt et farmasoytisk preparat. | |
| AU2437200A (en) | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use | |
| US6489142B1 (en) | Methods and compositions for producing viral particles | |
| JP2004517610A (ja) | 自己再編成性ｄｎａベクター | |
| MXPA99004449A (en) | Method for producing recombinant virus | |
| US6890528B1 (en) | Cells for the production of helper dependent adenoviral vectors | |
| WO2001098513A2 (en) | Methods and means for the complementation of viral protein expression in stable cell lines | |
| EP1083229A1 (en) | Modified adenoviral vectors for use in gene therapy | |
| AU7560500A (en) | Modified adenoviral vectors for use in gene therapy | |
| AU4437100A (en) | Means and methods for nucleic acid transfer | |
| EP1083228A1 (en) | Modified adenoviral vectors for use in gene therapy | |
| Sitaraman | Sequence specific inhibition of adenoviral replication by the AAV Rep78 ORF |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| CREP | Change of representative |
Representative=s name: EHRNER & DELMAR PATENTBYRA AB, BOX |
|
| CREP | Change of representative |
Representative=s name: ZACCO NORWAY AS, POSTBOKS 2003 VIKA |
|
| CHAD | Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften) |
Owner name: SANOFI, FR |
|
| SPCF | Filing of supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAME: GLYBERA; REG. NO/DATE: EU/1/12/791/001 20121206 Spc suppl protection certif: 2013009 Filing date: 20130415 |
|
| MK1K | Patent expired |