ES2260803T3 - Procedimiento para la produccion de virus recombinantes. - Google Patents
Procedimiento para la produccion de virus recombinantes.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION DE VIRUS RECOMBINANTES. ESTE PROCEDIMIENTO SE BASA EN CONCRETO EN LA UTILIZACION DE BACULOVIRUS PARA APORTAR LAS FUNCIONES DE COMPLEMENTACION. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A CONSTRUCCIONES UTILIZADAS PARA LA PUESTA EN PRACTICA DE ESTE PROCEDIMIENTO, A LAS CELULAS PROTECTORAS Y A LOS VIRUS ASI OBTENIDOS.
Description
Procedimiento para la producción de virus
recombinantes.
La presente invención se refiere a un método
para la producción de virus recombinantes. También se refiere a las
construcciones utilizadas para llevar a cabo este método, a las
células productoras y a los virus así producidos. Estos virus pueden
utilizarse como vector de clonación y/o expresión de genes in
vitro, ex vivo o in vivo.
Los vectores de origen viral se utilizan
ampliamente para la clonación, la transferencia y la expresión de
genes in vitro (para la producción de proteínas
recombinantes, la realización de ensayos de cribado, el estudio de
la regulación de genes, etc.), ex vivo o in vivo (para
la creación de modelos animales, o en métodos terapéuticos). Entre
estos virus, se pueden citar principalmente los adenovirus, virus
adeno-asociados (AAV), retrovirus, virus del herpes
o de la vacuna.
La familia Adenoviridae está ampliamente
distribuida en los mamíferos y las aves y agrupa a más de cien
serotipos diferentes de virus sin envoltura con ADN bicatenario, que
poseen una cápsida de simetría icosaédrica (Horwitz. En: Fields BN,
Knipe DM, Howley PM, ed. Virology. Tercera edición ed. Philadelphia:
Raven Publishers, 1996: 2149-2171). Además de su
inocuidad los adenovirus poseen un gran tropismo celular. Al
contrario que los retrovirus, cuyo ciclo depende de la división
celular, pueden infectar a las células en división activa como las
células quiescentes y su genoma se mantiene en forma episomal.
Además pueden producirse con titulaciones elevadas (10^{11}
ufp/ml). Estas bazas importantes les hacen un vector destacado para
la clonación y expresión de genes heterólogos. Los adenovirus del
grupo C, principalmente del tipo 2 y 5, así como los adenovirus
caninos del tipo CAV-2, cuya biología molecular es
la que mejor se conoce, son en principio los vectores que se
utilizan actualmente.
Los adenovirus poseen un genoma lineal de 36 kb,
que termina en cada uno de sus extremos con secuencias repetidas
invertidas (ITR) de 103 pb que comprenden un origen de replicación
así como una señal de encapsidación situada cerca de la ITR
izquierda, (Shenk, Adenoviridae: The Viruses and Their Replication.
En: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, ed. Virology. Philadelphia:
Raven Publishers, 1996: 2111-2148). En el transcurso
del ciclo viral se expresan tres familias de genes:
- -
- Los genes tempranos inmediatos (E1, E2, E3 y E4) que están implicados en la regulación de genes celulares que permiten principalmente la entrada de la célula en la fase S (E1A) y la inhibición de la apoptosis (E1B). También intervienen en la regulación de genes virales tempranos o tardíos a nivel de la transcripción, del corte y empalme o del transporte de los ARN mensajeros (E1A, E2A, E4). También tienen un papel en la replicación y en evitar la respuesta inmunitaria.
- -
- Los genes tempranos retardados (pIX y IVa2) están vinculados a la regulación de la transcripción de los genes tardíos (IVa2) o a la formación del virión (pIX).
- -
- Los genes tardíos (L1 a L5) se transcriben a partir del promotor fuerte (MLP). Un transcrito primario de 28 kb permite generar los transcritos correspondientes a las diferentes proteínas estructurales (estructura central, pentón, hexón) y no estructurales que participan en la formación y maduración de las partículas virales, mediante corte y empalme alternativo y la utilización de 5 sitios de poliadenilación.
Los vectores adenovirales se han utilizado para
la clonación y expresión de genes in vitro (Gluzman et
al., Cold Spring Harbor, Nueva York 11724, p. 187), para la
creación de animales transgénicos (WO95/22616), para la
transferencia de genes a células ex vivo (WO95/14785;
WO95/06120) o también para la transferencia de genes a células in
vivo (véanse principalmente WO93/19191, WO94/24297,
WO94/08026).
En lo que se refiere a los virus
adeno-asociados (AAV), se trata de virus con un ADN
de un tamaño relativamente reducido, que se integran en el genoma de
las células que infectan, de manera estable y relativamente
específica de sitio. Son capaces de infectar un amplio espectro de
células, sin inducir un efecto sobre el crecimiento, morfología o
diferenciación celular. Por otro lado, no parece que estén
implicados en las patologías del ser humano. El genoma de los AAV se
ha clonado, secuenciado y caracterizado. Comprende aproximadamente
4.700 bases, y contiene en cada extremo una región repetida
invertida (ITR) de aproximadamente 145 bases, que sirve de origen
de replicación para el virus. El resto del genoma está dividido en 2
regiones esenciales en las que se encuentran las funciones de
encapsidación: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen
rep implicado en la replicación viral y la expresión de los
genes virales; la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica las proteínas de la cápsida del virus.
genes virales; la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica las proteínas de la cápsida del virus.
En la bibliografía se ha descrito la utilización
de los vectores obtenidos a partir de los AAV para la transferencia
de genes in vitro e in vivo (véanse principalmente WO
91/18088; WO 93/09239; EEUU 4.797.368, EEUU 5.139.941, EP 488
528).
En lo que se refiere a los retrovirus, se trata
de virus integrativos, que infectan selectivamente a las células en
división. Por lo tanto, son vectores de interés para aplicaciones,
por ejemplo, en cáncer o restenosis. El genoma de los retrovirus
comprende esencialmente dos LTR, una secuencia de encapsidación y
tres regiones codificadoras (gag, pol y env). La construcción de
vectores recombinantes y su utilización in vitro o in
vivo se ha descrito ampliamente en la bibliografía: véanse
principalmente Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203;
EP 453242, EP 178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985)
235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc.
Para su utilización como vectores recombinantes,
se han preparado diferentes construcciones obtenidas a partir de los
virus, que incorporan diferentes genes de interés. En cada una de
estas construcciones, el genoma viral se ha modificado de manera que
se obtiene un virus incapaz de replicación autónoma en la célula
infectada. De esta manera, las construcciones descritas en la
técnica anterior son virus defectivos en determinadas regiones de su
genoma esenciales para la replicación. En particular, cuando se
trata de adenovirus, las construcciones de primera generación
presentan una deleción en/de la región E1, esencial para la
replicación viral, a nivel de la cual se insertan las secuencias de
ADN heterólogo (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195;
Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161).
Por otro lado, para mejorar las propiedades del vector, se ha
propuesto crear otras deleciones o modificaciones en el genoma del
adenovirus. De esta manera, se ha introducido una mutación puntual
termosensible en el mutante ts125, que permite inactivar la proteína
de 72kDa de unión al ADN (DBP) codificada por la región E2 (Van der
Vliet et al., 1975). Otros vectores comprenden una deleción
de otra región esencial para la replicación y/o la propagación
viral, la región E4. Los vectores adenovirales en los que se han
delecionado las regiones E1 y E4 poseen un nivel basal de
transcripción y una expresión viral muy reducidos. Dichos vectores
se han descrito, por ejemplo, en las solicitudes WO94/28152,
WO95/02697, WO96/22378. Por otro lado, también se han descrito los
vectores que presentan una modificación a nivel del gen IVa2
(WO96/10088). Además, también se han descrito los vectores
denominados "adenovirus mínimo" o
"pseudo-adenovirus" (o también Ad\Delta) que
no contienen las regiones necesarias en cis para la producción de
los virus (secuencias ITR y de encapsidación) y están desprovistos
de cualquier secuencia viral codificadora (WO94/12649, WO94/28152,
WO95/02697), aunque su producción sigue siendo muy difícil, como se
explica a continuación.
Cuando se trata de AAV, los vectores descritos
están generalmente desprovistos de las regiones codificadoras Rep y
Cap, que están sustituidas por los ácidos nucleicos de interés.
En los vectores recombinantes obtenidos a partir
de los retrovirus, generalmente los genes gag, pol y env se
delecionan, total o parcialmente, y se reemplazan por una secuencia
de ácido nucleico heterólogo de interés. Por otro lado, los
retrovirus recombinantes pueden contener modificaciones a nivel de
las LTR para suprimir la actividad transcripcional, así como de las
secuencias amplias de encapsidación, que contienen una parte del gen
gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639).
Habida cuenta de su carácter defectivo en la
replicación, la producción de estos diferentes virus recombinantes
implica la posibilidad de transcomplementar las funciones
delecionadas del genoma. La transcomplementación es precisamente el
origen de las principales dificultades para la producción de estos
virus y, principalmente el aporte de las funciones de
transcomplementación.
A este respecto se han desarrollado dos
estrategias. La primera se basa en la construcción de líneas
transcomplementantes, denominadas líneas de encapsidación. La
segunda se basa en la utilización de adenovirus colaboradores o de
plásmidos colaboradores.
Se han construido diferentes líneas de
encapsidación de virus defectivos. Estas líneas son capaces de
producir las funciones deficientes en el vector viral. Generalmente,
estas líneas contienen, integrada en su genoma, la o las regiones
delecionadas del genoma viral (E1, E2 y/o E4 por ejemplo para los
adenovirus; gag, pol y/o env para los retrovirus, rep y/o cap para
los AAV).
Una de las líneas conocidas para la producción
de adenovirus defectivos es, por ejemplo, la línea 293 en la que se
ha integrado una parte del genoma del adenovirus. Más
específicamente, la línea 293 es una línea de células embrionarias
humanas de riñón que contiene el extremo izquierdo (aproximadamente
11-12%) del genoma del adenovirus serotipo 5 (Ad5),
que comprende ITR izquierda, la región de encapsidación, la región
E1, incluyendo E1a y E1b, la región que codifica la proteína pIX y
una parte de la región que codifica la proteína pIVa2. Esta línea es
capaz de trans-complementar los adenovirus
recombinantes defectivos en la región E1, es decir, desprovistos de
toda o parte de la región E1, y de producir lotes virales con
titulaciones elevadas. Esta línea también es capaz de producir, a
temperatura permisiva (32ºC), lotes de virus que además contienen la
mutación E2 termosensible. Se han descrito otras líneas celulares
capaces de complementar la región E1, basadas principalmente en
células de carcinoma de pulmón humano A549 (WO94/28152) o en
retinoblastos humanos (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Por otro lado,
también se han descrito líneas capaces de
trans-complementar varias funciones de los
adenovirus. En particular, se pueden citar las líneas que
complementan las regiones E1 y E4 (Yeh et al., J. Virol. 70
(1996) 559; Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 322; Krougliak et al.,
Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) y las líneas que complementan las
regiones E1 y E2 (WO94/281 52, WO95/02697, WO95/27071).
También se han descrito diferentes líneas para
la producción de retrovirus defectivos, generalmente capaces de
expresar los genes gag, pol y env. Dichas líneas son, por ejemplo,
la línea PA317 (EEUU 4.861.719), línea PsiCRIP (WO90/02806), línea
GP+envAm-12 (WO89/07150), línea BOSC (WO94/19478),
etc. Para construir retrovirus recombinantes que contienen un ácido
nucleico de interés, se construye un plásmido que contiene las LTR,
la secuencia de encapsidación y el ácido nucleico mencionado, que
después se utiliza para transfectar una línea de encapsidación tal
como la descrita anteriormente, capaz de aportar en trans las
funciones retrovirales deficientes en el plásmido. Los retrovirus
recombinantes producidos se purifican mediante las técnicas
clásicas.
La utilización de líneas puede presentar sin
embargo determinados inconvenientes. Así, es difícil, costoso y
apremiante construir y validar dichas líneas a nivel industrial. En
efecto, estas líneas deben ser estables y compatibles con las
utilizaciones industriales. Además, las líneas descritas permiten
difícilmente separar la producción de virus replicativos
contaminantes (RCA). Por otro lado, estas líneas no permiten
actualmente, de manera satisfactoria para una utilización
industrial, transcomplementar los genomas virales muy defectivos,
como por ejemplo los adenovirus mínimo tales como los descritos
anteriormente. En efecto, los adenovirus poseen un genoma
organizado en diferentes unidades de transcripción cuya regulación
espacio-temporal es muy compleja. Hasta el presente
no ha podido realizarse de manera satisfactoria la
transcomplementación de un adenovirus delecionado de todas las
secuencias virales codificadoras expresando cada unidad de
transcripción por separado, de manera constitutiva o inducible, a
partir de una línea celular. De esta manera, sólo se ha expresado de
manera constitutiva a partir de líneas celulares una pequeña
proporción del genoma correspondiente a las regiones E1, E4, pIX, y
a tres proteínas codificadas por E2 (pol, DBP y
p-TP). El resto del genoma corresponde a la unidad
principal de transcripción tardía (MLTU) que produce todos los
mensajeros de las proteínas estructurales y no estructurales a
partir de un transcrito primario de 28 kb y que se activa después de
la replicación del genoma. Para generar los adenovirus mínimo, es
indispensable la transcomplementación de estas regiones. Estas
líneas tampoco permiten obtener titulaciones muy elevadas de
retrovirus recombinantes.
La segunda estrategia consiste en
co-transfectar con el genoma viral defectivo una
construcción (plásmido o adenovirus) que aporta las funciones de
complementación. En particular los AAV recombinantes defectivos se
preparan generalmente mediante co-transfección, en
una línea celular infectada con un virus auxiliar humano (por
ejemplo un adenovirus), de un plásmido que contiene una secuencia
nucleica de interés flanqueada por dos regiones repetidas invertidas
(ITR) de AAV, y de un plásmido que contiene las funciones de
complementación (genes rep y cap) de AAV. Se han descrito las
variantes en las solicitudes WO95/14771: WO95/13365: WO95/13392 o
WO95/06743. El inconveniente de utilizar un adenovirus colaborador
reside principalmente en los riesgos de recombinación incrementados
entre el vector adenoviral y el adenovirus colaborador, y en la
dificultad de separar el recombinante del colaborador durante la
producción y la purificación de los lotes virales. El inconveniente
de utilizar un plásmido colaborador, por ejemplo, un plásmido
Rep/cap reside en los niveles de transfección obtenidos, que no
permiten producir titulaciones elevadas de virus.
También se ha descrito en la solicitud
WO96/09074 un vector baculovirus que contiene las secuencias ITR
(Repetición Terminal Integrativa) de AAV de manera que se permite su
integración. El baculovirus tal como el descrito en esta solicitud
comprende opcionalmente el gen rep de AAV con el fin de facilitar la
escisión y la inserción del ADN en el genoma de las células
diana.
La presente solicitud describe un sistema nuevo
de producción de virus que permite paliar estos inconvenientes. El
sistema de la invención se basa en la utilización de un baculovirus
para aportar las funciones de complementación.
El sistema de producción según la invención
permite de manera especialmente ventajosa evitar la utilización de
líneas de complementación establecidas, evitar los problemas de RCA,
y transcomplementar los genomas altamente defectivos. Además, el
sistema de la invención es aplicable a cualquier célula infectable
por el virus deseado y por un baculovirus, y ofrece de esta manera
una gran flexibilidad en su utilización.
Un primer objeto de la invención reside, por lo
tanto, en un proceso de producción de virus recombinantes defectivos
según el cual se introduce, en una población de células competentes,
el genoma del virus recombinante defectivo y un baculovirus que
contiene todas o una parte de las funciones necesarias para la
transcomplementación del genoma recombinante defectivo.
El proceso de la invención se basa, por lo
tanto, en la utilización de un baculovirus para aportar las
funciones de complementación. Son posibles diferentes estrategias.
Se puede, en primer lugar, utilizar células competentes que no
expresan ninguna función de transcomplementación del genoma
recombinante defectivo. En este caso, es posible utilizar bien un
baculovirus que contiene todas las funciones necesarias para la
transcomplementación del genoma recombinante defectivo o varios
baculovirus que contienen cada una o varias de las funciones
necesarias para la transcomplementación del genoma recombinante
defectivo. También es posible utilizar una población de células
competentes capaces de transcomplementar por sí mismas una o varias
funciones del genoma recombinante defectivo (línea de
encapsidación). En este caso, el o los baculovirus utilizados
aportarán únicamente las funciones necesarias para la
transcomplementación del genoma recombinante defectivo que no se
transcomplementan con las células competentes.
Como se ha indicado anteriormente, las ventajas
del sistema de la invención son numerosas en términos de
industrialización (sin necesidad de líneas, ni de RCA, etc), y en
términos de aplicaciones (producción de virus recombinantes que
contienen cualquier tipo de deleción, y principalmente de adenovirus
recombinantes altamente defectivos). Además, en la medida en que los
baculovirus no se replican en las células humanas, la preparación
viral obtenida no está contaminada con baculovirus. Además, como los
baculovirus están muy alejados filogenéticamente de los adenovirus
no existen riesgos de recombinación o transcomplementación entre
ellos. Por lo tanto, este sistema permite, de manera ventajosa,
producir lotes concentrados de virus defectivos, desprovistos de
RCA. Este sistema es especialmente ventajoso para la producción de
adenovirus recombinantes defectivos.
Los baculovirus son virus con envoltura con ADN
bicatenario circular específicos de invertebrados. Su prototipo,
AcNPV, tiene un genoma de 133 kb. Se utiliza mucho como vector de
expresión de genes eucariotas en células de insectos, a partir de
dos promotores fuertes [polihedrina (Ph) y P10], (King y Possee, The
baculovirus expression system. Londres: Chapman&Hall, 1992.).
AcNPV es capaz de infectar determinadas células de mamíferos aunque
el genoma no se transcribe ni se traduce. Recientemente, Hofmann
et al. (PNAS 92 (1995) 10099) han mostrado que in
vitro las células hepatocitarias pueden traducirse mediante un
baculovirus recombinante purificado que expresa el gen LacZ. No se
ha publicado ninguna toxicidad celular, incluso con una
multiplicidad de infección de 1.000, y la eficacia de la
transfección descrita en este artículo es de 50% aproximadamente
para una MOI de 100.
La solicitante ha mostrado que es posible
infectar diferentes tipos celulares con un baculovirus recombinado.
En especial, la solicitante ha mostrado que es posible, con un
baculovirus recombinado, infectar células de origen humano tales
como las células embrionarias inmortalizadas. La solicitante también
ha mostrado que es posible obtener una eficacia de transducción muy
elevada (> 80%). La solicitante también ha mostrado que es
posible introducir, en un baculovirus, las funciones de
complementación de un adenovirus, y expresar estas funciones en una
población de células competentes. La solicitante ha permitido
mostrar que el baculovirus constituye un vector inerte que puede
utilizarse ventajosamente para la transferencia y la expresión de
funciones de complementación de virus en las células de mamíferos,
principalmente humanas. Otras ventajas del sistema de la invención
son principalmente (i) la gran capacidad de clonación que permite
complementar un genoma adenoviral entero y (ii) el desarrollo
avanzado de la tecnología de los baculovirus.
Los baculovirus que contienen las funciones de
complementación de los virus también se denominan de aquí en
adelante baculovirus colaboradores. Pueden contener diferentes
funciones de complementación de los virus.
De esta manera, el baculovirus colaborador puede
contener la región E1 del adenovirus. Puede utilizarse un
Báculo-E1 para la producción de adenovirus de
primera generación, es decir, de adenovirus defectivos en la región
E1 (Ad\DeltaE1), cualquiera que sea su estado E3 (es decir,
defectivo Ad\DeltaE1, \DeltaE3, o no). La producción de
adenovirus recombinantes defectivos de primera generación
(defectivos en la región E1, y opcionalmente E3) constituye una
primera aplicación especialmente ventajosa del proceso de la
invención. Como se ha indicado anteriormente, en la bibliografía se
han descrito diferentes líneas capaces de transcomplementar la
función E1 (células 293, células A549, células 911, etc). Sin
embargo, existen zonas de homología entre la región que contiene las
funciones de transcomplementación integrada en el genoma de la línea
y el ADN del virus recombinante que se desea producir. Debido a
ello, durante la producción, pueden producirse diferentes eventos de
recombinación, que generan partículas virales replicativas,
principalmente los adenovirus de tipo E1+. Puede tratarse de un
evento simple de recombinación seguido de una rotura cromosómica, o
de una recombinación doble. Estos dos tipos de modificaciones
resultan en la reintegración en su locus inicial en el genoma
adenoviral de la región E1 contenida en el genoma celular. Por otro
lado, habida cuenta de las titulaciones elevadas del vector
recombinante producidas por la línea 293 (superiores a 10^{12}),
la probabilidad de que estos eventos de recombinación tengan lugar
es elevada. De hecho, se ha constatado que numerosos lotes de
vectores adenovirales recombinantes defectivos de primera generación
estaban contaminados con partículas virales replicativas, lo que
puede constituir un inconveniente importante para las utilizaciones
farmacéuticas. En efecto, la presencia de dichas partículas en las
composiciones terapéuticas inducirá in vivo una propagación
viral y una diseminación no controlada, con riesgos de reacción
inflamatoria, recombinación, etc. Por lo tanto, los lotes
contaminados no pueden utilizarse en la terapia humana.
La presente invención permite remediar estos
inconvenientes. En efecto, según un modo de realizar el proceso de
la invención, el genoma del adenovirus recombinante defectivo en la
región E1 y opcionalmente E3 se introduce en las células
competentes, estas células se infectan, de manera simultánea o no
con un baculovirus que contiene la región E1, no conteniendo la
región E1 del adenovirus presente en el baculovirus ni el genoma del
adenovirus recombinante defectivo ninguna zona de homología
(recubrimiento) susceptible de dar lugar a una recombinación. Según
este modo de realización, es posible producir rápidamente, sin línea
establecida, lotes de adenovirus recombinantes de primera generación
desprovistos de RCA. Por otro lado, como se ha indicado
anteriormente, los lotes de adenovirus recombinantes generados de
esta manera, desprovistos de RCA, pueden utilizarse como material de
partida para una producción nueva, por co-infección
en células competentes con un baculovirus.
El baculovirus colaborador también puede
contener la región E2 del adenovirus, completa o parcial,
principalmente la región E2a y/o E2b. Un báculo-E2
puede utilizarse para producir, en células competentes, adenovirus
defectivos en la región E2 (Ad-\DeltaE2), y
opcionalmente en la región E3 (Ad-\DeltaE2,
\DeltaE3). Además, en las células competentes capaces de
complementar la región E1 del adenovirus, el
báculo-E2 puede permitir la producción de adenovirus
recombinantes defectivos en las regiones E1 y E2
(Ad-\DeltaE1, \DeltaE2) y opcionalmente E3
(Ad-\DeltaE1, \DeltaE2, \DeltaE3). Así mismo,
en las células competentes capaces de complementar las regiones E1 y
E4 del adenovirus (por ejemplo en las células IGRP2), el
báculo-E2 puede permitir la producción de adenovirus
recombinantes defectivos en las regiones E1, E2 y E4
(Ad-\DeltaE1, \DeltaE2, \DeltaE4) y
opcionalmente E3 (Ad-\DeltaE1, \DeltaE2,
\DeltaE3, \DeltaE4).
El baculovirus colaborador puede contener además
la región E4 (completa o parcial) del adenovirus. Un
báculo-E4 puede utilizarse para producir, en células
competentes, adenovirus defectivos en la región E4
(Ad-\DeltaE4), y opcionalmente en la región E3
(Ad-\DeltaE4, \DeltaE3). Además, en las células
competentes capaces de complementar la región E1 del adenovirus, el
báculo-E4 puede permitir la producción de adenovirus
recombinantes defectivos en las regiones E1 y E4
(Ad-\DeltaE1, \DeltaE4) y opcionalmente E3
(Ad-\DeltaE1, \DeltaE4, \DeltaE3).
El baculovirus colaborador puede contener además
las regiones E1 y E4 (completas o parciales) del adenovirus. Un
báculo-E1,E4 puede utilizarse para producir, en
células competentes, adenovirus defectivos en las regiones E1 y E4
(Ad-\DeltaE1, \DeltaE4) y opcionalmente E3
(Ad-\DeltaE1, \DeltaE4, \DeltaE3), como se
ilustra en la Figura 1.
Además, para generar virus defectivos en las
regiones E1 y E4, también es posible utilizar dos baculovirus
colaboradores, uno que expresa la función E1, y el otro la función
E4, completa o parcial.
De la misma forma, el baculovirus colaborador
puede contener las regiones E1, E2 y E4 (completas o parciales), y
opcionalmente las regiones que contienen los genes tardíos
(L1-L5).
El baculovirus colaborador también puede
contener las regiones Rep y/o Cap del AAV. Un
báculo-Rep/Cap permite de esta manera complementar,
en una línea de células competentes, un genoma de AAV desprovisto de
cualquier secuencia viral codificadora (Figura 5).
El baculovirus también puede contener las
regiones gag, pol y/o env de un retrovirus. Un
báculo-gag/pol/env permite de esta manera
complementar, en una línea de células competentes, un genoma
retroviral desprovisto de cualquier secuencia viral codificadora.
También es posible utilizar un baculovirus que contiene las regiones
gag/pol y un segundo baculovirus que contiene la región env.
De manera general, es preferible que el genoma
del virus recombinante defectivo y las regiones de complementación
presentes en el baculovirus no presenten recubrimiento. Esto permite
evitar los riesgos de recombinación y, por lo tanto, la generación
de RCA. Esto es especialmente importante para la generación de
adenovirus de primera generación (Ad-\DeltaE1). En
este caso, la región E1 introducida en el baculovirus está definida
de manera que no contiene secuencias comunes con el genoma
recombinante. Para llevar a cabo esto, es posible, por ejemplo,
delecionar del genoma recombinante una región más grande que la
región de complementación insertada en el baculovirus, como se
ilustra en los ejemplos. Esto es también ventajoso para la
generación de adenovirus Ad-\DeltaE1,
\DeltaE4.
De esta manera, en un modo de realización
particular del proceso de la invención, el genoma del virus
recombinante defectivo se introduce en las células competentes,
estas células se infectan, de manera simultánea o no, con un
baculovirus que contiene todas o una parte de las funciones
necesarias para la complementación del genoma defectivo, no
conteniendo las funciones de complementación presentes en el
baculovirus ni el genoma del virus recombinante defectivo zonas de
homología susceptibles de dar lugar a una recombinación.
Ventajosamente, el genoma viral es un genoma de adenovirus
recombinante defectivo en la región E1 y el baculovirus contiene una
región del adenovirus capaz de trans-complementar la
región E1. Según otra variación, el genoma viral es un genoma de
adenovirus recombinante defectivo en las regiones E1 y E4 y el
baculovirus contiene dos regiones del adenovirus capaces de
trans-complementar dichas regiones o se utilizan dos
baculovirus, uno que contiene una región del adenovirus capaz de
trans-complementar la región E1 y el otro una región
del adenovirus capaz de trans-complementar la región
E4 sin zonas de homología con el genoma adenoviral defectivo.
Según un modo de realización particular, todas
las regiones codificadoras del adenovirus están presentes en uno o
varios baculovirus colaboradores. Según un modo de realización
particular, se utiliza un único baculovirus colaborador que contiene
todas las regiones codificadoras del adenovirus. Dicho baculovirus
colaborador puede utilizarse, por lo tanto, para transcomplementar
los adenovirus recombinantes mínimo. Dicho baculovirus puede
contener todo el genoma adenoviral, con la excepción de la región de
encapsidación y opcionalmente las ITR, como se ilustra en los
ejemplos.
Las funciones de complementación introducidas en
el baculovirus colaborador pueden provenir de virus con serotipos
diferentes.
Cuando se trata de adenovirus, existen
diferentes serotipos cuya estructura y propiedades varían un poco,
aunque presentan una organización genética comparable. Más
especialmente, las funciones de complementación utilizadas para la
construcción de los baculovirus según la invención provienen de un
adenovirus de origen humano o animal.
En lo que se refiere a los adenovirus de origen
humano, se pueden citar preferentemente las clases del grupo C. Más
preferentemente, entre los diferentes serotipos de adenovirus
humanos, se prefiere utilizar en el marco de la presente invención
los adenovirus de tipo 2 ó 5 (Ad 2 o Ad 5). También es posible
utilizar regiones que provienen de adenovirus de tipo 7 ó 12, que
pertenecen a los grupos A y B. Entre los diferentes adenovirus de
origen animal, se prefiere utilizar en el marco de la presente
invención los adenovirus de origen canino, y principalmente todas
las cepas de adenovirus CAV2 [cepa manhattan o A26/61 (ATCC
VR-800), por ejemplo]. En la solicitud WO94/26914,
incorporada en la presente invención por referencia, se citan otros
adenovirus de origen animal.
En un modo preferido de realizar la invención,
la función de complementación proviene de un genoma de adenovirus
humano del grupo C. De manera más preferente, ésta proviene del
genoma de un adenovirus Ad2 o Ad5.
Las regiones que contienen las diferentes
funciones de complementación pueden obtenerse, a partir de un genoma
adenoviral, mediante roturas enzimáticas según los métodos conocidos
por el experto en la técnica. Estas regiones pueden estar
opcionalmente modificadas para reducir su tamaño, o reemplazar
determinados elementos de regulación (promotor, amplificador, etc)
por elementos heterólogos. De manera general, estas regiones se
preparan como sigue. El ADN de un adenovirus se purifica mediante
centrifugación en gradiente de cloruro de cesio o se obtiene in
vitro a partir de un plásmido procariota (WO96/25506) o
eucariota (WO95/03400). El ADN se degrada mediante enzimas de
restricción apropiadas y se identifican y seleccionan los fragmentos
obtenidos que contienen las funciones de complementación buscadas.
La elección de las enzimas de restricción utilizadas depende de las
funciones de complementación buscadas. Se realiza teniendo en cuenta
los mapas de restricción y las secuencias publicadas de los genomas
adenovirales. De esta manera, la región E1 puede aislarse bajo la
forma de fragmentos que contienen todos los marcos de lectura de
E1A y E1B en posición 3' respecto al promotor E1A. La región E4
puede aislarse bajo la forma de fragmentos que contienen todas las
fases de lectura, o solamente una parte de ellas, y preferentemente
las fases ORF3 u ORF6 u ORF6-ORF6/7.
Se utilizan metodologías similares para preparar
las regiones de complementación de AAV y de retrovirus
recombinantes. De esta manera, las regiones rep y/o cap de AAV
pueden obtenerse mediante rotura enzimática a partir del ADN viral
aislado de diferentes serotipos de AAV. Se trata preferentemente de
AAV-2. Para los retrovirus, las regiones gag, pol
y/o env también pueden obtenerse según las técnicas clásicas de
biología molecular a partir de diferentes tipos de retrovirus tales
como principalmente MoMuLV ("Virus de la Leucemia Murina de
Moloney"; también denominado MoMLV), MSV ("Virus de Sarcoma
Murino de Moloney"), HaSV ("Virus de Sarcoma de Harvey");
SNV ("Virus de Necrosis del Bazo"); RSV ("Virus de Sarcoma de
Rous") o virus de Friend.
Los fragmentos que contienen las regiones de
complementación se subclonan en un vector plasmídico que permite su
manipulación (digestiones más finas, PCR, adiciones de secuencias de
regulación, etc), por ejemplo en un organismo procariota o
eucariota. El fragmento final obtenido, que codifica la o las
funciones de complementación, se introduce en el baculovirus
colaborador utilizando las técnicas clásicas de biología molecular.
Más precisamente, el fragmento se clona entre dos secuencias
homólogas a una región del genoma de un baculovirus, después el
fragmento o plásmido resultante se co-transfecta con
el genoma de un baculovirus en células de insecto (clásicamente Sf9
y Sf21, células de spodoptera frugiperda, aunque también
Tn-368 y High-Five™
BTI-TN-5B1-4
(Gibco), células de trichopulsia ni, o cualquier otra célula de
insecto permisiva a los baculovirus y que se pueda utilizar para su
producción). La recombinación homóloga entre el plásmido o fragmento
y el genoma del baculovirus genera el baculovirus recombinante
deseado, que puede recuperarse y purificarse según los métodos
clásicos (véase principalmente King y Possee: the baculovirus
expression system. Londres: Chapman & Hall, 1992). Para la
construcción de los baculovirus recombinantes, están comercializados
diferentes kits que contienen vectores lanzadera y pueden utilizarse
siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. Principalmente, se
pueden utilizar los vectores lanzadera pBAC comercializados por la
compañía Clontech, los vectores pAc (Verne et al.,
Bio/Technology 6 (1988) 47, Pharmingen, EEUU), los vectores
pBlue-Bac (Invitrogen) o los vectores pBSV
(Boehringer). Las funciones de complementación pueden insertarse en
diferentes sitios del baculovirus, y principalmente en el locus del
gen de la polihedrina o del gen p10. Por otro lado, pueden
utilizarse diferentes cepas de baculovirus, tales como AcNPV o
Bombyx mori (Maeda et al., Nature 315 (1988) 592). Por otra
parte, el baculovirus utilizado puede modificarse para
mejorar/cambiar su tropismo. Es posible modular el tropismo de los
vectores virales modificando sus proteínas de superficie con el fin
(i) de restringirlo mediante la fusión de las proteínas virales con
un ligando específico (cadena ligera de inmunoglobulina, Péptido
Liberador de Gastrina) o (ii) de incrementarlo mediante la formación
de pseudotipos con una glicoproteína viral heteróloga [G del virus
de la Estomatitis Vesicular (VSV)], [Liu et al., J. Virol
70(4) (1996) 2497; Michael et al., Gène Ther. 2 (1995)
660]. Recientemente, se ha mostrado que la glicoproteína de la
superficie del baculovirus (gp64) fusionada con gp120 del virus VIH
es capaz de fijarse al receptor CD4 (Boublik et al.
Bio/Technology 13 (1995) 1079). Esta modificación de gp64 no afecta
la viabilidad del baculovirus en las células de insectos. Una
construcción análoga con G de VSV deberá permitir mejorar el
tropismo del baculovirus para las células de mamífero y, por lo
tanto, incrementar la eficacia de la transducción de las células
Huh7 así como de otras líneas celulares.
En el baculovirus colaborador, las funciones de
complementación están ventajosamente situadas bajo el control de un
promotor heterólogo (es decir, con un origen diferente del
baculovirus) funcional en las células competentes. En efecto parece
que los promotores de baculovirus no permiten obtener niveles de
expresión suficientes de las funciones de complementación en las
células que no son de insecto y, por lo tanto, no son apropiados
para las aplicaciones de la invención. El promotor puede ser, en
primer lugar, el propio promotor (promotor homólogo) de las
funciones de complementación del virus (promotor E1A, E4, E2, MLP
para adenovirus, promotores P5 o P19 de AAV, promotor de LTR de RSV,
etc). También puede tratarse de cualquier promotor de origen
diferente funcional en la célula competente utilizada. Con este fin,
se pueden citar, por ejemplo, los promotores de genes expresados en
esta célula, o los promotores ubicuos conocidos como por ejemplo el
promotor del gen PGK, promotor temprano inmediato de CMV, promotor
del gen TK del virus del herpes o promotor de LTR de RSV. También
puede tratarse de promotores regulados, como por ejemplo, el
promotor del virus MMTV, un promotor que responda a hormonas, por
ejemplo del tipo GRE5, o un promotor regulado por tetraciclina (WO).
Ventajosamente, se trata de un promotor homólogo, ubicuo fuerte o
inducible.
De esta manera, otro objeto de la presente
invención se refiere a un baculovirus recombinante que comprende,
insertado en su genoma, un ácido nucleico que codifica una función
de complementación de un virus situado bajo el control de un
promotor heterólogo. Más específicamente, la función de
complementación es una proteína necesaria para la producción de
dicho virus, y cuya región codificadora es inactiva (mutada,
delecionada, etc) en el genoma viral defectivo. Para los adenovirus,
la función de complementación se elige más especialmente entre todas
o parte de las funciones codificadas por las regiones E1, E2, E4,
L1-L5, pIX y IVa2 del adenovirus, solas o en
combinación. Para AAV, se trata de las funciones codificadas por las
regiones Rep y/o Cap; y para los retrovirus, gag, pol y/o env.
Ventajosamente, el ácido nucleico corresponde a una región de un
genoma viral que contiene la región que codifica la función de
complementación elegida. En particular, se trata de un fragmento de
un genoma de adenovirus del serotipo Ad2 o Ad5, MoMLV o
AAV-2. De manera especialmente preferida, el ácido
nucleico también comprende la región promotora responsable
naturalmente de la expresión de las funciones de complementación
elegidas.
A modo de ejemplo particular, la presente
invención se refiere a un baculovirus que contiene toda o parte de
la región E1 de un adenovirus. Más específicamente, se trata de un
baculovirus que contiene la región E1a, E1b o E1a y E1b. La región
E1 del adenovirus está localizada a nivel de los nucleótidos 104
(promotor E1a) a 4.070 (poliA E1b) de Ad5. En particular, la caja
TATA del promotor E1a está localizada a nivel del nucleótido 470, el
codón ATG de E1a a nivel del nucleótido 560, y el codón de parada
E1b a nivel del nucleótido 3.511. A modo de ejemplo específico se
puede citar un baculovirus que contiene un fragmento
391-3.511. Este baculovirus colaborador está
especialmente adaptado para la producción de adenovirus
recombinantes defectivos en la región E1, que contienen una deleción
mayor que este fragmento 391-3.511. Principalmente,
está adaptado para la producción de adenovirus de primera
generación, sin RCA, que contienen una deleción en la región E1 que
abarca los nucleótidos 383-3.512 inclus.
Otro ejemplo particular de baculovirus según la
invención contiene, por ejemplo, todas o parte de las regiones E1 y
E4 del adenovirus. La región E4 del adenovirus está constituida por
7 fases abiertas de lectura, denominadas ORF1, ORF2, ORF3, ORF4,
ORF3/4, ORF6 y ORF6/7. Entre las proteínas codificadas por estas
diferentes ORF, las producidas por ORF3 y ORF6 parecen permitir la
"replicación" del virus y, por lo tanto, la
transcomplementación de un adenovirus defectivo en la región E4
incluso en su totalidad. Debido a esto, el baculovirus colaborador
de la invención contiene ventajosamente toda la región E4 o sólo una
parte de ésta que contiene al menos la fase ORF3 u ORF6. Las
diferentes partes de la región E4 pueden obtenerse mediante roturas
enzimáticas o ser modificadas según los métodos conocidos por el
experto en la técnica. En particular, la fase de lectura ORF6 puede
aislarse de la región E4 bajo la forma de un fragmento
BglII-PvuII, que corresponde a los nucleótidos
34.115-33.126, y las fases de lectura
ORF6-ORF6/7 pueden aislarse de la región E4 bajo la
forma de un fragmento BglII-BglII que corresponde a
los nucleótidos 34.115-32.490 del genoma de Ad5. El
baculovirus también puede contener todas las fases de lectura
ORF1-ORF7 (por ejemplo, bajo la forma de un
fragmento 32.800-35.826 ó
32.811-35.614 ó 32.811-35.640). Se
entiende que pueden determinarse otros fragmentos tomando como base
las secuencias publicadas de los genomas adenovirales. La
utilización de un baculovirus que contiene una unidad reducida de la
región E4 es ventajosa porque permite la transcomplementación de un
genoma adenoviral defectivo que contiene una deleción mayor que la
región E4, por lo tanto sin zona de homología y evita de esta manera
cualquier posibilidad de recombi-
nación.
nación.
Según un primer modo de realización, el ácido
nucleico que codifica la o las funciones de complementación se
introduce en el baculovirus colaborador bajo la forma de un casete
de expresión. Este modo de realización es el más sencillo de llevar
a cabo. Está especialmente adaptado para la producción de adenovirus
recombinantes defectivos en los genes tempranos inmediatos y para la
producción de retrovirus y AAV recombinantes defectivos.
Según otro modo de realización, el ácido
nucleico que codifica la o las funciones de complementación se
introduce en el baculovirus colaborador bajo la forma de un casete
escindible, que genera una molécula replicativa en la célula
competente. La replicación del casete en la célula permite
ventajosamente incrementar el número de copias de los genes que
complementan y, de esta manera, mejorar los niveles de producción
del sistema. Este modo de realización está especialmente adaptado
para la producción de adenovirus recombinantes altamente defectivos,
principalmente defectivos en los genes estructurales. En particular,
este modo de realización está especialmente adaptado para la
producción de adenovirus "mínimo". En efecto, la cantidad de
proteína estructural es un factor limitante para la producción de
titulaciones importantes de adenovirus altamente defectivos (tipo
adenovirus mínimo). Este modo de realización permite por primera vez
incrementar considerablemente los niveles intracelulares de
proteínas de transcomplementación, principalmente de proteínas
estructurales de adenovirus (codificadas por las regiones L1 a L5),
hasta niveles compatibles con la transcomplementación de adenovirus
mínimo.
De esta forma, la solicitante ha mostrado que es
posible construir baculovirus recombinantes que comprenden una
región heteróloga susceptible de ser escindida en una célula,
preferentemente de manera inducible y regulada, para generar una
molécula circular y replicativa (de tipo episomal).
La escisión se realiza ventajosamente mediante
un mecanismo de recombinación específico de sitio, y la replicación
en la célula está asegurada por un origen de replicación,
independiente del estado de división celular.
Más preferentemente, la recombinación específica
de sitio utilizada según el proceso de la invención se obtiene
mediante dos secuencias específicas que son capaces de recombinar
entre sí en presencia de una proteína específica, generalmente
denominada recombinasa. Estas secuencias específicas, dispuestas en
la orientación apropiada, flanquean en el baculovirus a las
secuencias que codifican las funciones de complementación. De esta
manera, la invención también tiene por objeto un baculovirus
recombinante que comprende, insertada en su genoma, al menos una
región de ADN flanqueada por dos secuencias que permiten una
recombinación específica de sitio y situadas en orientación directa,
conteniendo dicha región de ADN al menos un origen de replicación
funcional en las células competentes y un ácido nucleico que
codifica una función de complementación de un virus.
Las secuencias que permiten la recombinación
utilizadas en el marco de la invención comprenden generalmente de 5
a 100 pares de bases, y, más preferentemente, menos de 50 pares de
bases. Pueden pertenecer a diferentes clases estructurales y
principalmente a la familia de la recombinasa del bacteriófago P1 o
de la resolvasa de un transposón.
Entre las recombinasas que pertenecen a la
familia de la integrasa del bacteriófago 1, se pueden citar
principalmente la integrasa de los fagos lambda (Landy et
al., Science 197 (1977) 1147), P22 y F80 (Leong et al.,
J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HP1 de Haemophilus
influenzae (Hauser et al., J. Biol. Chem. 267 (1992)
6859), integrasa Cre del fago P1, integrasa del plásmido pSAM2 (EP
350 341) o FLP recombinasa del plásmido 2 \mum de la levadura
Saccharomyces cerevisiae.
Entre las recombinasas que pertenecen a la
familia del transposón Tn3, se pueden citar principalmente la
resolvasa del transposón Tn3 o de los transposones gd, Tn21 y Tn522
(Stark et al., 1992); invertasa Gin del bacteriófago mu o
resolvasa de plásmidos, tales como la del fragmento RP4 (Abert et
al., Mol. Microbiol. 12 (1994) 131).
Según un modo de realización preferido, en los
baculovirus recombinantes de la presente invención, las secuencias
que permiten la recombinación específica de sitio se obtienen a
partir de un bacteriófago. Más preferentemente, se trata de
secuencias de integración (secuencias attP y attB) de un
bacteriófago o de secuencias derivadas. Estas secuencias son capaces
de recombinarse específicamente entre sí en presencia de una
recombinasa denominada integrasa. A modo de ejemplos específicos, se
pueden citar principalmente las secuencias de integración de los
fagos lambda, P22, F80, P1, HP1 de Haemophilus influenzae o
del plásmido pSAM2, ó 2 \mum.
Aún más preferentemente, las secuencias que
permiten la recombinación específica de sitio están representadas
por el sistema de recombinación del fago P1. El fago P1 posee una
recombinasa denominada Cre que reconoce específicamente una
secuencia nucleotídica de 34 pares de bases denominada sitio lox P
(Stemberg et al., J. Mol. Biol. 150 (1981) 467). Esta
secuencia está compuesta por dos secuencias palindrómicas de 13 pb
separadas por una secuencia conservada de 8 pb. La recombinación
específica de sitio se obtiene ventajosamente utilizando las
secuencias LoxP o las secuencias derivadas, y la recombinasa
Cre.
El término secuencia derivada incluye las
secuencias obtenidas mediante modificación o modificaciones de las
secuencias de recombinación anteriores, que conservan la capacidad
de recombinar específicamente en presencia de la recombinasa
apropiada. De esta manera, se puede tratar de fragmentos reducidos
de estas secuencias o por el contrario grandes mediante la adición
de otras secuencias (sitios de restricción, etc). También puede
tratarse de variantes obtenidas mediante mutación o mutaciones,
principalmente mediante mutación o mutaciones puntuales.
Según un modo privilegiado de la invención, las
secuencias que permiten una recombinación específica de sitio son,
por lo tanto, secuencias LoxP del bacteriófago P1, y la
recombinación se obtiene en presencia de la proteína Cre. A este
respecto, la recombinación puede obtenerse poniendo en contacto
directo las células competentes con la recombinasa Cre, o mediante
la expresión del gen que codifica la recombinasa Cre en las células
competentes. Ventajosamente, la recombinasa Cre se produce en la
célula mediante la inducción de la expresión del gen
correspondiente. De esta manera, el gen que codifica la recombinasa
está situado ventajosamente bajo el control de un promotor
inducible, o construido en forma regulable. A este respecto, se
utiliza ventajosamente una fusión entre Cre y el dominio de fijación
de hormonas esteroideas (estradiol, progesterona, etc) que permite
regular la actividad de Cre y, por lo tanto, inducir el evento de
recombinación (Metzger et al., PNAS 92 (1995) 6991). Más
generalmente, la expresión de la recombinasa puede estar controlada
por cualquier promotor fuerte, regulado o no. El casete de expresión
puede transfectarse en las células competentes, o integrarse en el
genoma de las células competentes, como se ilustra en los
ejemplos.
ejemplos.
Este sistema permite por lo tanto generar
moléculas replicativas que producen, en las células competentes,
niveles elevados de la función de complementación del virus,
principalmente de adenovirus. Este tipo de construcción está
especialmente adaptado para la complementación de genomas altamente
defectivos y, en especial, de genomas adenovirales defectivos en los
genes tardíos. De esta manera, una construcción particular según la
invención está representada por un baculovirus que comprende,
insertada en su genoma, al menos una región de ADN flanqueada por
dos secuencias LoxP situadas en orientación directa, conteniendo
dicha región de ADN al menos un origen de replicación funcional en
las células competentes y un ácido nucleico que codifica una función
de complementación de un adenovirus. Ventajosamente, las funciones
de complementación comprenden todos o parte de los genes tempranos
inmediatos presentes en las regiones E1, E2 y E4. Aún más
preferentemente, las funciones de complementación comprenden todos o
parte de los genes tempranos inmediatos y los genes tempranos
retardados. Preferentemente, las funciones de complementación
permiten la complementación de un adenovirus recombinante
desprovisto de cualquier secuencia viral codificadora. En
particular, las funciones de complementación están constituidas por
todo el genoma adenoviral, con la excepción de las ITR y de la
región de empaquetamiento. Según una variante particular, las
funciones de complementación están constituidas por un genoma
adenoviral completo desprovisto, sin embargo, de la región de
empaquetamiento (Ad.Psi-). Este genoma comprende en particular las
ITR que sirven para la replicación del genoma en las células
competentes, después de la escisión.
Para asegurar la replicación de la molécula
episomal, ésta contiene un origen de replicación funcional en las
células competentes utilizadas. Este origen de replicación está
constituido preferentemente por secuencias ITR propias del
adenovirus, que permiten una amplificación importante de la
molécula. También puede tratarse de otro origen de replicación que
permite, preferentemente, una amplificación con un factor superior a
20 del ADN viral en la célula competente. A modo ilustrativo se
puede citar el origen OriP/EBNA1 del virus EBV o la región E2 del
virus del papiloma. Se entiende que las secuencias ITR del
adenovirus constituyen un modo de realización preferido.
Para levar a cabo el proceso de la invención, el
o los baculovirus colaboradores se utilizan generalmente con una
Multiplicidad de Infección (MOI) que permite infectar una gran
población de células, sin perjudicar de manera significativa la
viabilidad celular. Generalmente, ésta está comprendida más
especialmente entre 10 y 1.000. La MOI corresponde al número de
partículas virales por célula. La MOI puede ajustarse fácilmente por
el experto en la técnica en función de las células competentes
utilizadas, tomando como base dos criterios: la eficacia de la
infección y la toxicidad posible. Ventajosamente, la MOI utilizada
para el baculovirus colaborador está comprendida entre 20 y 500.
Como se ha indicado anteriormente, el proceso de
la invención comprende la introducción, en células competentes, del
baculovirus colaborador y del genoma viral recombinante. A este
respecto, el genoma del adenovirus recombinante defectivo puede
introducirse de diferentes maneras en la célula competente.
En primer lugar, puede tratarse de un adenovirus
recombinante defectivo purificado, ventajosamente desprovisto de
RCA. En este caso, las células competentes se infectan con el
adenovirus recombinante defectivo y con el baculovirus colaborador.
La infección con el adenovirus recombinante permite introducir en la
célula competente el genoma correspondiente, que se amplifica y
encapsida para producir lotes con titulación elevada, desprovistos
de RCA. Este modo de realización es especialmente interesante para
generar virus de primera generación (Ad-\DeltaE1;
Ad-\DeltaE1, \DeltaE3). En efecto, estos virus
son difíciles de producir con titulaciones elevadas, sin
contaminación de RCA. Según el proceso de la invención, ahora es
posible, partiendo de un adenovirus recombinante defectivo de
primera generación, mediante co-infección en una
célula competente con un baculovirus que contiene la región E1,
obtener lotes concentrados con una calidad elevada. Este modo de
realización también es ventajoso para la producción de virus
defectivos en dos o tres regiones esenciales de su genoma (E1, E2,
E4 principalmente). De una manera general, este modo de realización
es ventajoso porque la eficacia de la infección con el adenovirus es
muy elevada (superior a la eficacia de transfección con el ADN), y
permite, por lo tanto, generar lotes concentrados. En este modo de
realización, el adenovirus recombinante y los baculovirus
recombinantes se utilizan con multiplicidades de infección (MOI) que
permiten infectar una gran población de células, sin perjudicar de
manera significativa la viabilidad celular. La MOl utilizada para el
baculovirus es la mencionada anteriormente (entre 10 y 1.000). En lo
que respecta al adenovirus, está comprendida ventajosamente entre 1
y 1.000, preferentemente entre 1 y 500, aún más preferentemente
entre 1 y 100. La MOI utilizada para el adenovirus también se adapta
en función del tipo celular elegido. El intervalo de MOI puede
determinarse fácilmente por el experto en la técnica utilizando, por
ejemplo, un adenovirus y un baculovirus que contienen un gen
marcador distinto, con el fin de determinar la eficacia de la
infección y una competición posible. Más preferentemente, la MOI del
adenovirus es inferior a 50, por ejemplo, está comprendida entre 1
y 20.
Según otro modo de realización especialmente
ventajoso, el genoma del adenovirus recombinante defectivo se
introduce en forma de ADN. En este caso, el genoma se introduce
mediante transfección, opcionalmente en presencia de un agente que
facilita la transfección (lípidos, fosfato de calcio, etc). El
genoma recombinante producido de esta manera puede prepararse in
vitro según diferentes técnicas, y en particular en E.
coli (WO96/25506) o en una levadura (WO95/03400). Este modo de
realización es especialmente útil para generar un primer lote de
virus recombinantes defectivos, desprovistos de RCA, que puede
utilizarse a su vez para producir lotes con una titulación elevada
según el modo de realización precedente.
El genoma del adenovirus recombinante defectivo
también puede introducirse utilizando otro baculovirus recombinante.
Según este modo de realización, el genoma del adenovirus
recombinante defectivo se prepara in vitro, por ejemplo, como
se ha indicado anteriormente, después se introduce en un
baculovirus, en la forma de un casete escindible en la célula
competente. Según este modo de realización, las células competentes
se ponen en presencia de un baculovirus que contiene el genoma del
adenovirus recombinante defectivo, y de uno o varios baculovirus
colaboradores (que contienen las funciones de complementación). Este
modo de realización es especialmente ventajoso para la producción de
adenovirus recombinantes altamente defectivos. Gracias a este
sistema, es posible introducir a la vez en la población de células
competentes cantidades elevadas de genoma recombinante altamente
defectivo y las funciones de complementación correspondientes.
A este respecto, un proceso de la invención
comprende por lo tanto la co-infección de las
células competentes con un baculovirus que contiene el genoma del
adenovirus recombinante defectivo, y uno o varios baculovirus
colaboradores que contienen las funciones de complementación. Las
MOI utilizadas en este modo de realización también están
comprendidas entre 10 y 1.000 para cada uno de los baculovirus
utilizados.
En la técnica anterior se han realizado dos
tipos de construcciones para la producción de adenovirus mínimo: (1)
el transgén (\beta.galactosidasa) clonado entre las ITR,
flanqueadas por un sitio de restricción único o (2) las ITR derecha
e izquierda clonadas en orientación directa en 5' del transgén
(Fisher et al., Virology 217 (1996) 11;
Kumar-Singh et al; Hum. Mol. Genet. 5 (1996)
913). Los adenovirus mínimo se han producido en las células 293
mediante transfección de ADN linearizado (1) o circular (2),
aportando en trans las proteínas virales necesarias para la
replicación y la encapsidación del mini-genoma un
virus colaborador (Ad\DeltaE1). Los adenovirus mínimo se comportan
como partículas defectivas interferentes (DI) y son progresivamente
amplificados en el transcurso de las propagaciones sucesivas. El
principal problema que presenta la utilización de esta metodología
es la separación de los dos tipos de partículas producidos
responsables de la contaminación de los lotes por el virus
colaborador, y las titulaciones escasas del adenovirus mínimo que se
obtienen de esta manera (inferiores a 10^{8} ufp/ml).
La presente solicitud permite por primera vez
generar adenovirus mínimo utilizando un baculovirus para suministrar
el mini-genoma adenoviral y un baculovirus para
aportar todas las funciones de transcomplementación (genoma
complementante).
El genoma adenoviral recombinante se introduce
ventajosamente en el baculovirus, entre dos secuencias que permiten
una recombinación específica de sitio en las células competentes,
como se ha descrito para el baculovirus colaborador.
La presente solicitud describe en particular un
sistema de producción de adenovirus mínimo que utiliza un
baculovirus para suministrar el mini-genoma
adenoviral mediante un sistema loxP/Cre y un baculovirus para
aportar todas las funciones de transcomplementación (genoma
complementante), también mediante un sistema Cre/loxP (véanse las
Figuras 2-4).
Según otro modo de realización, el sistema de
recombinación específico de sitio utilizado para suministrar las
funciones de complementación es diferente del utilizado para
suministrar el genoma del adenovirus recombinante. En particular, el
sistema LoxP/Cre puede utilizarse para suministrar el genoma
adenoviral defectivo y el sistema AttP/AttB para suministrar la o
las funciones de complementación.
El proceso de la invención permite construir un
vector adenoviral delecionado de cualquier secuencia viral
codificadora y que no contiene las ITR y la señal de encapsidación
(adenovirus mínimo). Este vector puede teóricamente contener hasta
37 kb de secuencia exógena cuando la capacidad de clonación de los
vectores actuales no sobrepasa 8,5 kb. Por lo tanto, permite clonar
genes de gran tamaño como el gen de la distrofina (14 kb), con
todos sus elementos de regulación (promotor, amplificador, intrones,
...) con el fin de obtener una expresión óptima, en el tejido diana.
Además, la ausencia de cualquier secuencia viral inmunogénica deberá
incrementar la duración de la expresión del transgén en los tejidos
quiescentes.
El genoma de AAV o de retrovirus defectivos
también puede introducirse en forma de un virus, genoma, o plásmido,
según las técnicas descritas anteriormente.
El proceso de la invención puede llevarse a cabo
en diferentes tipos de células. Se entiende en el marco de la
invención por "célula competente" una célula permisiva a la
infección con el baculovirus y el virus que se va a producir, y que
permite un ciclo viral productivo para éste último. La capacidad de
infectar células con estos virus puede determinarse utilizando virus
recombinantes que expresan un gen marcador tal como el gen LacZ de
E. coli. Preferentemente, se trata de una célula de mamífero,
aún más preferentemente de una célula de origen humano. Las células
competentes utilizadas pueden ser células quiescentes o células en
división activa, líneas establecidas o cultivos primarios.
Ventajosamente se trata de células de mamífero compatibles con una
utilización industrial, es decir, sin carácter patógeno conocido,
cultivables y llegado el caso susceptibles de ser almacenadas en las
condiciones apropiadas. Ventajosamente, las células utilizadas son
células hepáticas, musculares, fibroblásticas, embrionarias,
nerviosas, epiteliales (pulmonares) u oculares (retinales). A modo
de ejemplo no limitativo se pueden citar las células 293 o cualquier
célula derivada que contiene una función de complementación
adicional (293E4, 293E2a, etc), células A549, células HuH7, células
Hep3B, células HepG2, células retinoblásticas humanas (HER, 911),
células HeLa, células 3T3 o células
KB.
KB.
Para llevar a cabo el proceso de la invención,
el genoma del virus recombinante y el baculovirus pueden
introducirse en la población de células competentes de manera
simultánea o espaciada en el tiempo. Ventajosamente, las células se
ponen en contacto a la vez con el genoma recombinante y el
baculovirus colaborador. En el caso de un sistema que genera
moléculas replicativas in vivo, la recombinasa se introduce o
expresa previamente, simultáneamente o posteriormente.
La producción de los virus conduce generalmente
a la lisis de las células. Los virus producidos pueden recogerse,
por lo tanto, después de la lisis celular, según los métodos
conocidos de purificación. Pueden acondicionarse de diferentes
maneras según la utilización pretendida. Por otro lado, para evitar
cualquier riesgo de contaminación del lote viral por trazas de
baculovirus que no hayan entrado en las células competentes
(baculovirus colaborador o baculovirus que aporta el genoma viral
recombinante), es posible aplicar las técnicas siguientes:
- -
- Es posible purificar los adenovirus mediante cromatografía según el método descrito en la solicitud FR96/ 08164. Esta técnica permite separar el adenovirus de cualquier baculovirus residual posible.
- -
- También es posible hacer actuar disolventes orgánicos (por ejemplo, éter, cloroformo) sobre los lotes de adenovirus purificados. En efecto, el baculovirus es un virus con envoltura (envoltura glicoproteica), y por lo tanto muy sensible a cualquier disolvente orgánico (que extrae los lípidos de su envoltura); por el contrario, los adenovirus no tienen envoltura, y los mismos disolventes no tienen ningún efecto sobre ellos.
- -
- También es posible, mediante purificación en gradiente de CsCl, separar por densidad el baculovirus residual posible y el virus recombinante.
Estos tres métodos pueden utilizarse
independientemente o conjuntamente. Por otro lado, también puede
utilizarse cualquier otro método conocido por el experto en la
técnica.
Los virus producidos de esta manera pueden
utilizarse para la clonación, transferencia y expresión de genes de
interés in vitro, ex vivo o in vivo. Dichos genes de
interés son, por ejemplo, los genes que codifican enzimas, derivados
sanguíneos, hormonas, linfoquinas: interleuquinas, interferones,
TNF, etc (FR 9203120), factores de crecimiento, neurotransmisores o
sus precursores o enzimas de síntesis, factores tróficos: BDNF,
CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; apolipoproteínas:
ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (WO94/25073), distrofina o una
minidistrofina (WO93/06223), genes supresores de tumores: p53, Rb,
Rap1A, DCC, k-rev, etc (WO94/24297), genes que
codifican factores implicados en la coagulación: Factores VII, VIII,
IX, etc, genes suicidas: Timidina quinasa, citosina desaminasa, etc;
o también toda o parte de una inmunoglobulina natural o artificial
(Fab, ScFv, etc, WO94/29446), etc. El gen de interés también puede
ser un gen o una secuencia antisentido, cuya expresión en la célula
diana permite controlar la expresión de genes o la transcripción de
ARNm celulares. Dichas secuencias pueden, por ejemplo, transcribirse
en la célula diana en ARN complementarios de ARNm celulares y
bloquear de esta manera su traducción en proteínas, según la técnica
descrita en la patente EP 140 308. El gen de interés también puede
ser un gen que codifica un péptido antigénico, capaz de generar una
respuesta inmunitaria, con el fin de realizar vacunas. Puede
tratarse de péptidos antigénicos específicos del virus de epstein
barr, virus HIV, virus de la hepatitis B (EP 185 573), virus de la
pseudo-rabia, o específicos de tumores (EP 259 212).
El gen puede ser cualquier ADN (ADNg, ADNc, etc) que codifica un
producto de interés, incluyendo potencialmente las señales de
expresión apropiadas (promotor, terminador, etc).
Estos virus pueden utilizarse in vitro
para la producción de estas proteínas recombinantes. También pueden
utilizarse, siempre in vitro, para estudiar el mecanismo de
acción de estas proteínas o para estudiar la regulación de la
expresión de genes o la actividad de promotores. También pueden
utilizarse in vivo, para la creación de modelos animales o de
animales transgénicos. También pueden utilizarse para la
transferencia y expresión de genes in vivo, en animales o
seres humanos, en las estrategias de terapia génica o celular.
La presente solicitud se describirá más
detalladamente mediante los ejemplos que siguen, que deben
considerarse ilustrativos y no limitativos.
Figura 1: Esquema de producción de un adenovirus
recombinante defectivo de tercera generación (defectivo en las
funciones E1 y E4) utilizando un báculo-E1,E4.
Figuras 2-4: Esquema de
producción de un adenovirus mínimo utilizando un primer baculovirus
para introducir el genoma adenoviral defectivo y un segundo
baculovirus para introducir las funciones de complementación.
Figura 5: Esquema de producción de un AAV
recombinante defectivo en las funciones Rep y Cap utilizando un
báculo-Rep/Cap.
Las células utilizadas en el marco de la
invención pueden provenir de cualquier línea o población celular
infectable con un adenovirus o un AAV o un retrovirus y con un
baculovirus, compatible con una utilización con fines terapéuticos.
Más preferentemente, se trata de una célula de mamífero,
principalmente humana. Más especialmente, se pueden citar:
- -
- Las células de la línea 293:
- La línea 293 es una línea de células embrionarias de riñón humanas que contiene el extremo izquierdo (aproximadamente 11-12%) del genoma del adenovirus serotipo 5 (Ad5), que comprende la ITR izquierda, la región de encapsidación, la región E1, incluyendo E1a y E1b, la región que codifica la proteína pIX y una parte de la región que codifica la proteína pIVa2 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Esta línea es capaz de trans-complementar los adenovirus recombinantes defectivos en la región E1, es decir, desprovistos de toda o parte de la región E1, y de producir lotes virales con titulaciones elevadas.
- -
- Las células de la línea A549
- Las células que complementan la región E1 del adenovirus se construyeron a partir de las células A549 (Imler et al., Gene Ther. (1996) 75). Estas células contienen un fragmento reducido de la región E1, desprovisto de la ITR izquierda, situado bajo el control de un promotor inducible.
- -
- Las células de la línea HER
- Las células embrionarias de la retina humana (HER) pueden infectarse con un adenovirus (Byrd et al., Oncogene 2 (1988) 477). Las células de encapsidación de adenovirus preparadas a partir de estas células han sido descritas, por ejemplo, en la solicitud WO94/28152 o en el artículo de Fallaux et al. (Htun.Gene Ther. (1996) 215). Más especialmente, se puede citar la línea 911 que comprende la región E1 del genoma del adenovirus Ad5 del nucleótido 79 al nucleótido 5.789 integrada en el genoma de las células HER. Estas línea de células permite la producción de virus defectivos en la región E1.
- -
- Las células IGRP2
- Las células IGRP2 son células obtenidas a partir de células 293, mediante la integración de una unidad funcional de la región E4 bajo el control de un promotor inducible. Estas células permiten la producción de virus defectivos en las regiones E1 y E4 (Yeh et al., J. Virol (1996) 70).
- -
- Las células VK
- Las células VK (VK2-20 y VK10-9) son células obtenidas a partir de células 293, mediante la integración de la totalidad de la región E4 bajo el control de un promotor inducible, y de la región que codifica la proteína pIX. Estas células permiten la producción de virus defectivos en las regiones E1 y E4 (Krougliak et al., Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1575).
- -
- Las células 293E4
- Las células 293E4 son células obtenidas a partir de células 293, mediante la integración de la totalidad de la región E4. Estas células permiten la producción de virus defectivos en las regiones E1 y E4 (WO95/02697; Cancer Gene Ther. (1995) 322).
- -
- Las células Sf9 y Sf21 son células embrionarias de lepidópteros. Estas células pueden obtenerse de las colecciones (nº CRL-1711 ATCC) así como sus condiciones de cultivo. También están disponibles comercialmente (Gibco). Véase también King y Posée: The baculovirus expression system, Londres: Chapman y Hall, 1992.
- -
- Las células hepatocitarias humanas
- Las células HepG2 y Hep3B y HuH7 son líneas humanas que provienen de hepatocarcinomas. Se pueden obtener de las colecciones de depósito y sus propiedades han sido descritas, por ejemplo, en las patentes EEUU 4.393.133 y EEUU 4.393.133.
- -
- Línea de células humanas KB: Proveniente de un carcinoma epidérmico humano, esta línea se puede obtener en la ATCC (ref. CCL17) así como las condiciones que permiten su cultivo.
- -
- Línea de células humanas Hela: Proveniente de un carcinoma de epitelio humano, esta línea se puede obtener en la ATCC (ref. CCL2) así como las condiciones que permiten su cultivo.
- -
- Línea de células W162: Estas células son células Vero que comprenden, integrada en su genoma, la región E4 del adenovirus Ad2. Estas células han sido descritas por Weinberg et al. (PNAS 80 (1983) 5383).
Este ejemplo describe la capacidad de los
baculovirus de infectar células de origen humano.
Las células humanas (principalmente 293 o sus
derivados) se infectan con diferentes diluciones de una disolución
de baculovirus recombinante que expresa el gen LacZ bajo el control
de LTR de RSV. 48 horas después de la infección, se pone en
evidencia la aparición de células azules, lo que demuestra la
infectabilidad de estas células por un baculovirus.
El plásmido AE2 proviene de la clonación, en
PCRII (Invitrogen), del producto de la PCR realizada sobre pBRE1 con
los oligonucleótidos
5'-TCCTTGCATTTGGGTAACAG-3' y
5'-GCGGCCGCTCAATCTGTATCTTC-3': este
producto de PCR contiene los nucleótidos 3.198 a 3.511 de Ad5, es
decir, el extremo 3' de la región E1B. El plásmido pBRE1 contiene
los nucleótidos 1 a 5.788 de Ad5 clonado en pBR322, delecionado
aproximadamente de los nucleótidos 1.300 a 2.300.
El plásmido AE3 se obtiene de la clonación del
fragmento NotI-KpnI de AE2, que contiene el producto
de PCR en pCDNA3 (Invitrogen) digerido con
NotI-KpnI. Contiene los nucleótidos 3.198 a 3.511 de
Ad5 seguido del sitio de poliadenilación de BGH.
El plásmido AE4 se obtiene de la clonación del
fragmento BglII-PvuII de AE3 en pBRE1. AE4 es un
plásmido que contiene el casete de expresión de E1 siguiente:
- -
- nucleótidos: hasta 3.511 de Ad5, es decir, ITR izquierda, secuencias de encapsidación, promotor E1A, gen E1A, promotor E1B, gen E1B
- -
- poliA de la hormona de crecimiento bovina (BGH) que proviene de pCDNA3.
Se digirió pBRE1 con BstNI, después se digirió
con ADN polimerasa de T4 para rellenar el extremo 5' protuberante, y
se digirió con XbaI. El fragmento generado de esta manera que
contiene los nucleótidos 391 a 1.339 de Ad5 se introdujo en pic20H y
se digirió con SmaI-XbaI (sitio no metilado), para
generar el plásmido AE5.
El plásmido AE6 se obtiene de la clonación del
fragmento EcoRI-SmaI de AE5 en AE4 digerido con
EcoRI-SmaI. AE6 es un plásmido que contiene el
casete de expresión de E1 siguiente:
- -
- nucleótidos 391 a 3.511 de Ad5, es decir, promotor "reducido" de E1A, gen E1A, promotor E1B, gen E1B.
- -
- poliA de la hormona de crecimiento bovina (BGH) que proviene de pCDNA3.
Los fragmentos EcoRI-SphI
(habiéndose convertido previamente el extremo 5' protuberante SphI
en romo mediante digestión con la ADN polimerasa de T4) de los
plásmidos AE4 y AE6 se clonan en el plásmido pAcSG2 (Pharmingen)
entre los sitios EcoRI y EcoRV. Esto genera respectivamente los
plásmidos AE14 y AE15. En los dos casos, la región E1 se introduce
en el locus del gen de la polihedrina (estando delecionados el
gen+promotor de la polihedrina).
Los plásmidos AE14 y 15 se cotransfectan con el
ADN del baculovirus BaculoGold obtenido a partir de la cepa AcNPV
(Pharmingen) en las células de insecto Sf9, con el fin de generar
los dos baculovirus recombinantes correspondientes BacAE14 y
BacAE15, que contienen los dos casetes de expresión de E1 integrados
en el locus del gen de la polihedrina.
El plásmido pCO1 (WO96/10088) se digirió con
BstXI, después se digirió con la ADN polimerasa de T4 para eliminar
el extremo 3' protuberante y se digirió con RsaI. El fragmento
generado de esta manera que contiene los nucleótidos 3.513 a 4.607
de Ad5 se introdujo en pBS-SK+ (Stratagene)
linearizado con EcoRV y se digirió con fosfatasa alcalina de
ternera, para generar el plásmido AE0.
El plásmido pMA37 se obtiene por ligación de los
fragmentos:
- -
- EcoRV-NsiI de pXL2756, que contiene sacB. pXL2756, posee el gen de contra-selección SacB sin sus sitios EcoRI y KpnI, el gen de resistencia a la kanamicina, un multisitio de clonación y un origen de replicación ColE1.
- -
- NdeI-NsiI de pCO1 (que contiene las secuencias adeno)
- -
- SalI (extremo 5' protuberante rellenado con la ADN polimerasa de T4)-Asel de pXL2756 (vector resistente a la kanamicina).
Por lo tanto, pMA37 contiene:
- -
- el gen de resistencia a la kanamicina
- -
- el gen SacB que confiere sensibilidad a la sacarosa a las bacterias que lo expresan
- -
- las secuencias 1 a 382 (HinfI) de Ad5 seguidas de las secuencias 3.446 a 4.415 (NsiI) de Ad5; sin transgén.
El plásmido AE1 se construyó mediante la
introducción del fragmento XhoI-NsiI de AE0 en pMA37
digerido con SalI-NsiI. Por lo tanto, contiene:
- -
- el gen de resistencia a la kanamicina
- -
- el gen SacB que confiere sensibilidad a la sacarosa a las bacterias que lo expresan
- -
- las secuencias 1 a 382 (HinfI) de Ad5 seguidas de las secuencias 3.513 a 4.415 (NsiI) de Ad5; sin transgén.
A partir del plásmido AE11 se construyen los
vectores lanzadera suicidas (mediante la inserción del transgén de
interés) lo que permite la construcción de adenovirus recombinantes
por recombinación en E. Coli. AE11 no contiene ninguna
secuencia homóloga con el plásmido AE6. Los plásmidos AE11 y AE4
tienen en común las secuencias 1 a 382 (HinfI) de Ad5 en posición 5'
con respecto a E1A, pero no existe homología en posición 3' respecto
al casete E1 entre estos dos plásmidos. De esta manera, no puede
producirse la generación de RCA por recombinación homóloga entre un
adeno que contiene la deleción E1 existente en AE11 (es decir,
382-3.513) y los baculovirus BacAE14 o BacAE15.
En primer lugar, se prepara un lote de BacAE14 ó
15 según las técnicas clásicas. Después, las células competentes
(por ejemplo HuH7) se transfectan con 5 \mug del plásmido pXL2822
digerido con PacI (el plásmido pXL2822 contiene Ad5 delecionado para
E1 (382-3.446 ó 382-3.513) y E3
(28.592-30.470) y contiene un casete
CMV-\betaGal), y se infectan, simultáneamente o
no, con una MOI comprendida entre 10 y 1.000, con BacAE14 ó 15.
Cuando las células se lisan, se recoge el sobrenadante de la
transfección, se aplica sobre células competentes "frescas"
previamente o simultáneamente infectadas con Bac\DeltaE14 ó 15
(MOI 10 a 1.000), con el fin de amplificar el adenovirus Ad2822,
sin interrupción hasta la obtención de un lote de Ad2822. El
seguimiento de la amplificación de Ad2822 está facilitado por la
presencia de lacZ en este virus. De esta manera, en cada
amplificación, el sobrenadante se pseudo-titula en
W162. El genoma del virus se analiza durante las amplificaciones con
el fin de verificar su integridad. Por último, esta estrategia
presenta la ventaja de que no puede generarse RCA en los lotes de
adenovirus producidos de esta manera. También se verifica esta
ausencia de contaminación.
El protocolo utilizado es el siguiente: Las
regiones E1 y E4 se clonan en orientación inversa en el locus del
gen de la polihedrina (Ph), en el vector lanzadera pBacPAK8
(Clontech, EEUU) para rendir pBacE1-E4. El
baculovirus recombinado se aísla según las técnicas clásicas
mediante co-transfección de
pBacE1-E4 y del ADN del baculovirus BacPAK6 en las
células Sf9 (Kitts y Possee, Biotechniques 14(5) (1993) 810).
La presencia de E1 y E4 en el genoma de los baculovirus recombinados
se verifica por PCR a partir de las células Sf9 infectadas. La
transcripción de E1 y E4 en las células Huh7 infectadas con el
baculovirus recombinado purificado se analiza por
RT-PCR a partir de los ARN citoplásmicos.
Para la construcción del baculovirus
E1-E4, pueden introducirse diferentes fragmentos que
contienen E1. Los fragmentos utilizados en este ejemplo son los
descritos en el ejemplo 3 para la construcción del
Baculovirus-E1, que contienen las regiones E1 bajo
el control de su propio promotor (promotor E1a reducido y promotor
E1b). Los fragmentos E4 utilizados son los siguientes:
- fragmento MaeII-MscI
32.720-35.835 que contiene la totalidad de E4
- fragmento BglII-PvuII
34.115-33.126 que contiene la fase ORF6
- fragmento BglII-BglII
34.115-32.490 que contiene las fases
ORF6-ORF6/7
- fragmento PvuII-AluI
34.801-334.329 que contiene la fase ORF3
Estos fragmentos se sitúan alternativamente bajo
el control del promotor E4 o de promotores diferentes,
principalmente del promotor HSV-TK, CMV o
LTR-RSV.
Las posiciones indicadas anteriormente hacen
referencia a la secuencia del adenovirus Ad5 salvaje tal como está
publicado y accesible tomando como base lo indicado. Aunque pueden
existir determinadas variaciones menores entre los diferentes
serotipos de adenovirus, estas posiciones son generalmente
aplicables a otros serotipos y principalmente a Ad2, Ad7, Ad12 y Ad
CAV-2.
La producción del adenovirus
Ad\DeltaE1\DeltaE4-LacZ se obtiene mediante la
introducción en las células competentes del baculovirus E1,E4
preparado en el ejemplo 4-1 y del genoma adenoviral
defectivo en E1 y E4 (véase la figura 1). Se analizan las
condiciones óptimas de producción de
Ad\DeltaE1\DeltaE4-LacZ en las células
competentes, por transcomplementación con Bac.E1-E4
purificado. La titulación de Ad\DeltaE1\DeltaE4 se determina en
número de unidades de transducción de la \betagalactosidasa
(t.d.u.) en la línea W162 y se compara la eficacia de la
transcomplementación obtenida con la de la línea de encapsidación
IGRP2.
Aunque se ha publicado que la expresión
simultánea de varias proteínas puede representar hasta 13 kb de
secuencia, a partir de un único virus (Belyaev y Roy, NAR 21 (1993)
1219), la capacidad máxima de clonación del baculovirus no está muy
documentada. Este ejemplo muestra que es posible clonar el genoma
del adenovirus delecionado de su señal de encapsidación (Ad.Psi-) y
flanqueado por dos sitios loxP
[loxP-ITR-ITR E4 -loxp] en el
baculovirus. La infección de las células competentes que expresan la
recombinasa Cre, de manera inducible o no (línea Cre o
Cre-ER, véase el ejemplo 7), con este baculovirus
recombinado y la activación de la recombinasa Cre, permiten la
escisión y la circularización del genoma adenoviral. Éste es capaz
de transducir los genes tempranos, de replicarse y de activar los
genes tardíos pero incapaz de encapsidarse, y de esta manera sirve
de colaborador para la producción de un adenovirus mínimo (véanse
las figuras 2-4). En este sistema la producción de
los adenovirus mínimo se basa en la co-infección con
dos baculovirus y la realización de 2 eventos de recombinación entre
los sitios loxP. Esta estrategia presenta la ventaja de que no se
generan partículas adenovirales a partir del virus colaborador.
La construcción del genoma Ad.Psi- se realiza en
E. coli. Para llevar esto a cabo, se clona el genoma completo
del adenovirus Ad5 en un vector de clonación procariota, ITR juntas.
La secuencia Psi se deleciona mediante degradación enzimática y
ligación, o mediante mutagénesis dirigida. Se introduce una
secuencia LoxP por ambas partes del genoma adenoviral, en
orientación paralela. La construcción resultante
[loxP-ITR-ITR, \DeltaPsi a E4
-loxP] se clona en un vector lanzadera que permite la recombinación
con un baculovirus, según la estrategia descrita en el ejemplo 3. El
baculovirus recombinante obtenido, denominado BacAd.Psi-, se aísla
según los métodos clásicos.
Este ejemplo describe la construcción de un
baculovirus que permite aportar a las células competentes el genoma
del adenovirus recombinante defectivo. Más especialmente, el
adenovirus recombinante es defectivo en todas las regiones
codificadoras, y no retiene más que las regiones ITR y Psi
(adenovirus mínimo, o Ad\Delta).
Se construye un plásmido
p[IoxP-(ITR-ITR-Psi-P.CMV-Lac2-pA)-IoxP].
Para llevar a cabo esto, se aísla una copia de la secuencia ITR del
adenovirus mediante rotura enzimática y/o se amplifica por PCR, y se
clona en posición 5' con respecto a la secuencia
ITR-Psi contenida en el vector lanzadera del
adenovirus pGY63. Este vector que se obtiene a partir de pCO1
(WO96/10088) y posee el gen LacZ bajo el control del promotor
temprano inmediato del citomegalovirus (P.CMV) terminado por la
señal de poliadenilación del virus SV40 (pA), se clona entre la
secuencia ITR-Psi y el gen que codifica pIX. La
región
(ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA)
de este vector (correspondiente a un genoma de adenovirus mínimo) se
aísla mediante rotura enzimática y se clona entre los sitios LoxP en
el multisitio de clonación del plásmido pBS246 (Gibco), para generar
el plásmido
p[loxP-(ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA)-loxP].
La capacidad de producir mini-genomas de adenovirus
a partir de un ADN circular y de encapsidarlos se ensaya mediante
transfección de este plásmido en la línea IGRP2 infectada con un Ad.
\DeltaE1\DeltaE4 que expresa la recombinasa Cre (AdCre). Los
adenovirus mínimo se amplifican mediante propagaciones sucesivas del
sobrenadante de la transfección en la línea IGRP2. Después, se
purifican mediante centrifugación isopícnica en gradiente de cloruro
de cesio y cuantifican mediante pseudo-titulación en
la línea W162. Se entiende que el gen LacZ puede sustituirse
fácilmente por cualquier otro ácido nucleico de interés, mediante
las técnicas de biología molecular clásicas.
La construcción que contiene el
mini-genoma Ad\Delta flanqueado por los dos sitios
loxP descrita anteriormente se clona en el locus P10 del baculovirus
en el vector lanzadera pAcUW1 (Pharmingen, EEUU). El baculovirus
Bac.Ad\Delta se produce y aísla mediante las técnicas clásicas de
co-transfección en las células Sf9 citadas
anteriormente, y se selecciona por su fenotipo de cubierta (blanca),
después de coloración con X-Gal. Este baculovirus
contiene, por lo tanto, un genoma adenoviral altamente defectivo,
enmarcado por dos regiones loxP en orientación directa.
Las células competentes se
co-infectan simultáneamente con el baculovirus
BacAdPsi (descrito en el ejemplo 5), que contiene las funciones de
transcomplementación de todo el genoma adenoviral, y con el
baculovirus Bac.Ad\Delta que contiene el genoma del
PseudoAdenovirus (descrito anteriormente). La recombinasa Cre se
aporta por adición de la proteína al medio de cultivo, por
transfección de las células con un plásmido o un virus (baculovirus)
que expresa Cre o por expresión de un casete integrado de manera
estable en el genoma de la línea (tal como el descrito en el ejemplo
7). El adenovirus mínimo se amplifica mediante propagaciones
sucesivas de los sobrenadantes del cultivo de las células
co-infectadas con BacAd.Psi- y con el sobrenadante
y se purifica y titula según las técnicas citadas previamente. Esta
técnica permite obtener, como único virus, Ad\Delta, lo que
permite su aislamiento y purificación mediante los métodos clásicos.
Además, las titulaciones obtenidas son compatibles con una
utilización industrial.
Se construye una línea que expresa Cre, de
manera inducible o no, con el fin de incrementar la eficacia de
recombinación entre los sitios loxP en el baculovirus de la
invención (por ejemplo, Bac.Ad\Delta y BacAd.Psi-) y de controlar
la expresión de Cre. En esta construcción, Cre se expresa sola o en
forma de una proteína de fusión en el extremo
C-terminal con el dominio de fijación del receptor
del estradiol (ER), (Metzger et al., 1996, citado
anteriormente), bajo el control de un promotor ubicuo,
preferentemente fuerte, inducible o no. Más especialmente, los
promotores utilizados son el promotor pGRE5, promotor de la
metalotionina, promotor SV40 o promotor del gen
HSV-TK.
Para construir estas líneas Cre, las células
competentes se co-transfectan con dos plásmidos, uno
que contiene el casete de expresión Cre (Cre o
Cre-ER) y el otro el de un marcador de selección
(Neo). Se seleccionan los clones resistentes G418, y se ensaya la
actividad Cre de estos clones por transfección del plásmido
p(P.CMV-loxP-ATG-stop-pA-LoxP-LacZ).
Este plásmido contiene el gen LacZ inactivado por la introducción
entre el promotor (P.CMV) y el inicio de LacZ de una sucesión de
codones de parada en las tres fases de lectura y de la señal de la
terminación de la transcripción y de poliadenilación del virus
SV40, flanqueados por dos sitios loxP. La expresión de Cre en los
clones, en presencia o no del inductor (estradiol), se revela
mediante la actividad \beta-galactosidasa inducida
por la recombinación entre los dos sitios loxP. De esta manera, se
seleccionan varios clones que expresan de manera estable la proteína
de fusión Cre-ER o la proteína Cre sola a partir de
los promotores y de las células competentes precisadas
anteriormente. Estos clones pueden utilizarse para la producción de
virus según la invención.
| Célula Competente | Promotor HSV-TK | Promotor SV40 | Promotor MMTV | Promotor GRES | ||||
| Recombinasa | Cre | Cre-ER | Cre | Cre-ER | Cre | Cre-ER | Cre | Cre-ER |
| 293 | #1 | #7 | #13 | #19 | #25 | #31 | #37 | #43 |
| IGRP2 | #2 | #8 | #14 | #20 | #26 | #32 | #38 | #44 |
| Huf7 | #3 | #9 | #15 | #21 | #27 | #33 | #39 | #45 |
| HepG2 | #4 | #10 | #16 | #22 | #28 | #34 | #40 | #46 |
| HER | #5 | #11 | #17 | #23 | #29 | #35 | #41 | #47 |
| Vero | #6 | #12 | #18 | #24 | #30 | #36 | #42 | #48 |
Claims (29)
1. Proceso de producción de virus recombinantes
defectivos según el cual se introduce, en una población de células
competentes, el genoma del virus recombinante defectivo y un
baculovirus que contiene todas o una parte de las funciones
necesarias para la transcomplementación del genoma recombinante
defectivo, aportando la célula competente la parte restante de
dichas funciones.
2. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el baculovirus contiene todas las
funciones necesarias para la transcomplementación del genoma
recombinante defectivo.
3. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el baculovirus contiene una parte de las
funciones necesarias para la transcomplementación del genoma
recombinante defectivo, aportando la célula competente la otra
parte.
4. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque las funciones necesarias para la
transcomplementación del genoma recombinante defectivo son aportadas
por varios baculovirus.
5. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el virus recombinante defectivo es un
adenovirus recombinante defectivo.
6. Proceso según la reivindicación 5,
caracterizado porque el genoma del adenovirus recombinante
defectivo es defectivo en una o varias funciones elegidas entre E1,
E2, E3, E4, L1-L5, pIX y IVa2 y el baculovirus
contiene todas las funciones necesarias para la transcomplementación
del genoma recombinante defectivo.
7. Proceso según la reivindicación 5,
caracterizado porque el genoma del adenovirus recombinante es
defectivo en una o varias funciones elegidas entre E1, E2, E3, E4,
L1-L5. pIX y IVa2, el baculovirus contiene una parte
de las funciones necesarias para la transcomplementación del genoma
recombinante defectivo, aportando la otra parte de las funciones uno
o varios baculovirus y/o la célula competente.
8. Proceso según la reivindicación 5,
caracterizado porque el baculovirus colaborador contiene toda
o una parte de la región E1 del adenovirus, lo que permite la
complementación de un genoma de adenovirus recombinante defectivo en
la región E1.
9. Proceso según la reivindicación 5,
caracterizado porque el baculovirus colaborador contiene toda
o una parte de la región E2 del adenovirus, lo que permite la
complementación de un genoma de adenovirus recombinante defectivo en
la región E2.
10. Proceso según la reivindicación 5,
caracterizado porque el baculovirus colaborador contiene toda
o una parte de la región E4 del adenovirus, lo que permite la
complementación de un genoma de adenovirus recombinante defectivo en
la región E4.
11. Proceso según la reivindicación 5,
caracterizado porque el baculovirus colaborador contiene
todas o una parte de las regiones E1 y E4 del adenovirus, lo que
permite la complementación de un genoma de adenovirus recombinante
defectivo en las regiones E1 y E4.
12. Proceso según la reivindicación 5,
caracterizado porque el genoma del adenovirus recombinante
está desprovisto de cualquier región viral codificadora y el
baculovirus colaborador contiene todas las funciones que permiten su
complementación.
13. Proceso según la reivindicación 12,
caracterizado porque el baculovirus contiene todo un genoma
adenoviral con la excepción de la región de encapsidación y
opcionalmente de las ITR.
14. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque las funciones de complementación
presentes en el baculovirus y el genoma del virus recombinante
defectivo no contienen zonas de homología susceptibles de dar lugar
a una recombinación.
15. Proceso según la reivindicación 14,
caracterizado porque un genoma de adenovirus recombinante
defectivo en la región E1 y opcionalmente E3 se introduce en células
competentes, estas células se infectan, de manera simultánea o no
con un baculovirus que contiene la región E1, no conteniendo la
región E1 del adenovirus presente en el baculovirus ni el genoma del
adenovirus recombinante defectivo zonas de homología susceptibles de
dar lugar a una recombinación.
16. Baculovirus auxiliar recombinante tal
como se ha definido en la reivindicación 1, que comprende insertado
en su genoma un ácido nucleico que codifica una función de
complementación para la producción de AAV recombinantes defectivos
que comprende las regiones Rep y Cap de AAV bajo el control de un
promotor heterólogo.
17. Baculovirus recombinante tal como se
ha definido en la reivindicación 1, que comprende insertado en su
genoma un ácido nucleico que codifica una función de complementación
elegida entre todas o parte de las funciones codificadas por las
regiones gag, pol y env de un retrovirus, solas o en combinaciones,
bajo el control de un promotor heterólogo.
18. Baculovirus según una cualquiera de
las reivindicaciones 16 y 17, caracterizado porque el
promotor está constituido por la región promotora responsable
naturalmente de la expresión de las funciones de
complementación.
19. Baculovirus según una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque el
promotor es un promotor celular o viral fuerte, regulado o no.
20. Baculovirus según una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 19, caracterizado porque el ácido
nucleico se introduce a nivel del locus de la polihedrina o del
locus p10.
21. Baculovirus según una cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque el ácido
nucleico se introduce en forma de un casete escindible en la célula
competente.
22. Baculovirus recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 16 y 17, que comprende insertada
en su genoma al menos una región de ADN enmarcada por dos secuencias
que permiten una recombinación específica de sitio y situadas en
orientación directa, teniendo dicha región de ADN al menos un origen
de replicación funcional en las células competentes y un ácido
nucleico que codifica una función de complementación de un virus
siendo dichas secuencias que permiten una recombinación específica
de sitio las secuencias LoxP del bacteriófago P1, y la
recombinación se obtiene en presencia de la proteína Cre.
23. Proceso según la reivindicación 5,
caracterizado porque el genoma recombinante defectivo se
introduce en la célula por infección con un adenovirus que contiene
dicho genoma.
24. Proceso según la reivindicación 5,
caracterizado porque el genoma recombinante defectivo se
introduce en la célula por transfección.
25. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el genoma recombinante defectivo se
introduce en la célula con un baculovirus recombinante, distinto del
baculovirus que contiene las funciones de complementación.
26. Baculovirus recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21 que comprende, insertada
en su genoma, al menos una región de ADN enmarcada por dos
secuencias que permiten una recombinación específica de sitio y
situadas en orientación directa, teniendo dicha región de ADN al
menos un origen de replicación funcional en las células competentes
y un genoma de adenovirus recombinante defectivo que comprende
esencialmente las regiones ITR, la secuencia de encapsidación y un
ácido nucleico de interés.
27. Proceso de producción de adenovirus
recombinantes defectivos, caracterizado porque se infecta una
población de células competentes con un baculovirus según la
reivindicación 22 y con un baculovirus según la reivindicación 26,
se ponen las células en presencia de la recombinasa que permite la
recombinación específica de sitio y se recuperan los adenovirus
producidos.
28. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la población de células competentes es
una población de células hepáticas, musculares, fibroblásticas,
embrionarias, epiteliales (principalmente pulmonares), oculares
(principalmente retinales) o nerviosas.
29. Proceso según la reivindicación 28,
caracterizado porque la población de células competentes se
elige entre las células 293 o cualquier célula derivada que contiene
una función de complementación adicional, A549, HuH7, Hep3B, HepG2,
HER, 911, HeLa o KB.
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