JP2023545731A - 肢帯型２ｉ（ｌｇｍｄ２ｉ）を含むジストログリカノパチー障害を処置するためのフクチン関連タンパク質（ｆｋｒｐ）の治療的アデノ随伴ウイルス送達 - Google Patents

肢帯型２ｉ（ｌｇｍｄ２ｉ）を含むジストログリカノパチー障害を処置するためのフクチン関連タンパク質（ｆｋｒｐ）の治療的アデノ随伴ウイルス送達 Download PDF

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Abstract

フクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）をコードする、種々の最適化された核酸が本明細書に開示される。タンパク質を（例えば、骨格筋および心筋において）発現させるための、最適化された核酸（例えば、筋肉特異的プロモーターと動作可能に連結した）を含む組換えベクター、例えば組換えアデノ随伴ウイルスベクター、および前記ベクターを含有する治療用組成物も開示される。ジストログリカノパチー障害（例えば、肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ）を有する対象を処置するための、前記ベクターの対象への治療的投与方法も開示される。【選択図】図６

Description

関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年１０月７日出願の米国仮出願第６３／０８８，７５７号、２０２１年６月２３日出願の米国仮出願第６３／２１４，１２３号、および２０２１年８月５日出願の米国仮出願第６３／２２９，７２６号の利益を主張するものである。
発明の分野
本発明は、遺伝子治療およびジストログリカノパチー障害の処置の分野に関する。
発明の背景
肢帯型筋ジストロフィー、またはＬＧＭＤは、肩関節または股関節に接続している筋肉の衰弱および萎縮に関連する、遺伝学的に定義された２０種を超える稀なミオパチーの広範なクラスを代表するものであり、一般に肢帯型と称される。これらの遺伝性ミオパチーは、優性疾患として遺伝するものであるか劣性疾患として遺伝するものであるかに基づいて、それぞれＬＧＭＤ１群とＬＧＭＤ２群に細分される。各ＬＧＭＤは、種々異なる遺伝子の変異によって引き起こされる。
ＬＧＭＤ２Ｉに関連する症状は、多くの場合に小児期後期に発生し、罹患小児は走ることおよび歩くことが困難になり始める。症状および動きやすさの問題は経時的に徐々に悪化し、患者は、一般に、発症から２３年から２６年の間に車いすに頼ることになる。肩および腕が衰弱することにより、物を持つこと、持ち運ぶこと、および持ち上げることが困難になり得、その結果、補助器具が必要になり得る。この疾患は、呼吸困難（ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）、心筋症および不整脈、ならびにＬＧＭＤ２Ｉ表現型に至る主な病変である筋鞘に対する収縮誘導性剪断損傷も引き起こし得る。ジストログリカンは、ジストロフィン－糖タンパク質複合体またはＤＧＣの中心的なタンパク質であり、そのグリコシル化が、筋細胞の構造要素を、それらを囲む細胞外マトリックスまたはＥＣＭと称される構造と柔軟に接続するために極めて重要である。ＦＫＲＰは、リビトール－５－Ｐをグリカン配列に取り付け、α－ＤＧを次第に装飾する。高速液体クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣ、質量分析、および核磁気共鳴またはＮＭＲの組合せを使用した最も信頼できる研究により、フクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）が、２つのリビトール－５－リン酸のうち２つ目をグリカン鎖に、グリカン鎖のリガンド結合性部分のすぐ前に挿入するトランスフェラーゼであることが実証された。このグリカン鎖のいずれの部分も存在しないと、α－ＤＧがそのＥＣＭ標的に結合できなくなり、それにより、ＬＧＭＤ２Ｉを含めた多くのＬＧＭＤの特質である、筋鞘または細胞膜に対する繰り返しストレスが導かれる。公的に利用可能なゲノムデータベースの解析に基づくと、１００万人に４．３人がＬＧＭＤ２Ｉに罹患していると推定される。ＬＧＭＤ２Ｉは北欧において最も大きく蔓延しており、これは、地理的または文化的に隔離されているまたは隔離されていた群であり、かつ祖先の１人または複数人が変更された遺伝子の保因者であった群においてＦＫＲＰをコードする遺伝子の遺伝的変更が高頻度で観察される、創始者変異効果に起因する。
ＦＫＲＰをコードする遺伝子の変異により、軽症肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ（ＬＧＭＤ２Ｉ）、重症ウォーカー－ワールブルグ症候群、および筋眼脳病を含めた広範な疾患表現型がもたらされる。現在のところ、α－ＤＧのグリコシル化の減少が関与するジストログリカノパチーに対する効果的な治療は知られていない（Xu et al. Mol. Therapy 21: 10doi:10.1038/mt.2013.156(Jul 2, 2013)）。ＬＧＭＤ２Ｉに対する承認された治療は存在せず、処置は、支持的ケアおよび動きやすくするための補助器具を含めた、症状の管理を目的としたものである。
発明の概要
本発明の態様は、組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクターであって、そのゲノム内に、５’から３’の方向に、ａ）５’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）；ｂ）筋肉特異的プロモーター；ｃ）イントロン配列；ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有し、筋肉特異的プロモーターと動作可能に連結した、ヒトフクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）をコードする核酸；ｅ）ＦＫＲＰをコードする核酸と動作可能に連結したポリＡシグナル配列；ｆ）３’ＡＡＶ ＩＴＲを含む、組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクターに関する。
本明細書に記載のｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、ＩＴＲ２ｍである。
本明細書に記載のｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、３’ＩＴＲは、ＩＴＲ２である。
本明細書に記載のｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、Ｓｙｎ１００（配列番号３）である。
本明細書に記載のｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、イントロン配列は、ＶＨ４－Ｉｇ－イントロン３（配列番号４）またはその誘導体である。
本明細書に記載のｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、ポリＡシグナル配列は、配列番号５である。
本明細書に記載のｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーター、イントロン配列、ＦＫＲＰをコードする核酸、およびポリＡシグナル配列は、配列番号１内に含まれる。
本明細書に記載のｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、血清型は、ＡＡＶ９である。
本発明の態様は、上記および本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターの種々の実施形態を含む医薬組成物にも関する。
本発明の態様は、ジストログリカノパチー障害を有する対象を処置するための方法であって、対象に、本明細書に記載の組換えＡＡＶベクター、および／または本明細書に記載の医薬組成物の種々の実施形態を治療有効量で全身投与して、それにより、対象の筋組織における機能的ＦＫＲＰの発現を増加させるステップを含む、方法にも関する。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、ジストログリカノパチー障害は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｉである。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、対象に単回用量を投与する。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、投与は、静脈内注入によるものである。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、投与される用量は、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇから約６×１０１３ｖｇ／ｋｇまで（例えば、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇ）である。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、対象において、投与後に、以下：ａ）対象の骨格筋および／もしくは心筋におけるα－ＤＧの機能的グリコシル化が実質的に増加すること；ｂ）対象の血清クレアチンキナーゼレベルが実質的に低下すること；ｃ）対象の骨格筋におけるコラーゲン沈着が実質的に減少すること；ｄ）対象の筋組織（例えば、ヒラメ筋（ｓｏｌｅｕｓ）、横隔膜および／またはＥＤＬ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ筋力（ｍｕｓｃｌｅ ｆｏｒｃｅ）分析が有意に向上すること；ｅ）対象の１回換気量が実質的に増加すること；ならびに／またはｆ）対象がトレッドミル試験において有意に長い距離を走ることができること、のうちの１つまたは複数が生じる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、対象は、成体、青年期個体、または乳幼児期個体である。本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、対象は、雄または雌である。
本発明の態様は、ヒトフクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）をコードする合成核酸であって、ａ）核酸のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて減少している；ｂ）そのＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１０％よりも大きく減少している；および／またはｃ）配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する、核酸にも関する。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、コード配列のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも５０％減少している。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、コード配列のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％減少している。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、コード配列のＣｐＧ部位含量は、０％である。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、ＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１５％よりも大きく減少している。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、核酸は、配列番号２に対して少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、核酸は、配列番号２に示される配列を有する。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、合成核酸は、プロモーターと作動可能に連結している。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、プロモーターは、筋肉特異的プロモーターである。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、プロモーターは、合成プロモーターである。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、プロモーターは、Ｓｙｎ１００である。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、プロモーターは、表１～４に列挙されているプロモーターから選択される。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、プロモーターは、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢ）である。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、合成核酸は、エンハンサー配列をさらに含む。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、エンハンサー配列は、ＣＭＶエンハンサー、筋肉クレアチンキナーゼエンハンサー、および／またはミオシン軽鎖エンハンサーを含む。
本発明の態様は、５’および３’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）；５’ＩＴＲと３’ＩＴＲとの間に配置される、筋肉特異的プロモーターと動作可能に連結したヒトフクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）をコードするコード配列であって、コード配列のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて減少している；ＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１０％よりも大きく減少している；および／または
配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する、コード配列を含む核酸にも関する。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、核酸は、筋肉特異的プロモーターとコード配列との間に配置されるイントロン配列をさらに含む。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、イントロン配列は、ＶＨ４－Ｉｇ－イントロン３（配列番号４）またはその誘導体である。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、核酸は、コード配列の下流に配置される少なくとも１つのポリＡシグナル配列をさらに含む。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、ポリＡシグナル配列は、配列番号５である。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、ＩＴＲ２ｍである。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、３’ＩＴＲは、ＩＴＲ２である。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、コード配列のＧＣ含量は、配列番号６のＧＣ含量と比べて１５％よりも大きく減少している。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、コード配列は、配列番号２に対して少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、コード配列のＣｐＧ部位含量は、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも５０％減少している。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、コード配列のＣｐＧ部位含量は、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％減少している。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、コード配列のＣｐＧ部位含量は、０％である。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、コード配列は、配列番号２である。
本発明の態様は、上記および本明細書に記載の合成核酸を含むベクターにも関する。
本明細書に記載の核酸、ベクターおよび方法の一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
本明細書に記載の核酸、ベクターおよび方法の一部の実施形態では、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、表６に列挙されている任意の血清型（例えば、ＡＡＶ９）である。
本発明の態様は、ゲノム内に、ａ）５’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）および３’ＡＡＶ ＩＴＲ；ｂ）５’ＩＴＲと３’ＩＴＲとの間に配置される、ヒトフクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）をコードする核酸であって、ｉ）ＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて減少している；ｉｉ）ＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１０％よりも大きく減少している；および／またはｉｉｉ）配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有し、筋肉特異的プロモーターと動作可能に連結している、核酸を含む、組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクターにも関する。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、ＡＡＶゲノムは、５’から３’の方向に、５’ＩＴＲ、筋肉特異的プロモーター、イントロン配列、ＦＫＲＰをコードする核酸；および３’ＩＴＲを含む。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、ＭＣＫプロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、ｅｎｈ３５８ＭＣＫプロモーター、ＣＫ６プロモーターおよびＳｙｎ１００プロモーター、表１～４または８～１２に列挙されている任意のプロモーター、ならびにその誘導体からなる群から選択される。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、ＦＫＲＰをコードする核酸は、そのＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて減少している。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、ＦＫＲＰをコードする核酸は、そのＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも５０％減少している。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、ＦＫＲＰをコードする核酸は、そのＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％減少している。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、ＦＫＲＰをコードする核酸は、そのＣｐＧ部位含量が、０％である。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、ＦＫＲＰをコードする核酸のＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１０％よりも大きく減少している。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、ＦＫＲＰをコードする核酸は、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、ＦＫＲＰをコードする核酸は、配列番号２に示される配列を有する。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ＦＫＲＰポリペプチドをコードする核酸に対して３’側、かつ３’ＩＴＲ配列に対して５’側に配置される少なくとも１つのポリＡシグナル配列をさらに含む。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、ポリＡシグナル配列は、配列番号５である。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、ＩＴＲは、挿入、欠失または置換を含む。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、ＩＴＲ内の１つまたは複数のＣｐＧ部位（one or more CpG site sites）が除去されている。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、ＩＴＲ２ｍである。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、３’ＩＴＲは、ＩＴＲ２である。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、イントロン配列は、ＶＨ４－Ｉｇ－イントロン３（配列番号４）またはその誘導体である。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、キメラＡＡＶベクター、一倍体ＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクターまたは倍数体ＡＡＶベクターである。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、表６に列挙されている任意のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ９である。
本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶベクターおよび方法の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、表７から選択されるカプシドタンパク質または表６に列挙されているものからなる群の任意のＡＡＶ血清型、およびこれらの組合せを含む。
本発明の態様は、上記および本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターを、薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物にも関する。
本発明の態様は、上記および本明細書に記載の核酸ならびに／または上記および本明細書に記載のベクターを含む形質転換された細胞にも関する。
本発明の態様は、上記および本明細書に記載の核酸、ならびに／または上記および本明細書に記載のベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、ならびに／または上記および本明細書に記載の形質転換された細胞を含むトランスジェニック動物にも関する。
本発明の態様は、α－ジストログリカン（α－ＤＧ）のグリコシル化を増加させることを必要とする対象におけるα－ジストログリカン（α－ＤＧ）のグリコシル化を増加させる方法であって、前記対象に、上記および本明細書に記載の核酸、上記および本明細書に記載のベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、上記および本明細書に記載の医薬組成物、ならびに／または上記および本明細書に記載の形質転換された細胞を治療有効量で投与するステップを含み、前記対象において合成核酸が発現され、それにより、ヒトＦＫＲＰが産生され、α－ＤＧのグリコシル化が増加する、方法にも関する。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、対象は、ジストログリカノパチー障害を有するまたはそれが発生するリスクがある。
本発明の態様は、対象におけるジストログリカノパチー障害を処置する（treating or a dystroglycanopathy disorder）方法であって、対象に、上記および本明細書に記載の核酸、上記および本明細書に記載のベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、上記および本明細書に記載の医薬組成物、ならびに／または上記および本明細書に記載の形質転換された細胞を治療有効量で投与するステップを含み、前記対象において合成核酸が発現され、それにより、対象におけるジストログリカノパチー障害を処置する、方法にも関する。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、ジストログリカノパチー障害は、ＦＫＲＰ異常に関連するものである。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、ジストログリカノパチー障害は、ＦＫＲＰをコードする核酸の変異および／またはα－ジストログリカン（α－ＤＧ）のグリコシル化不全を含む。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、ジストログリカノパチー障害は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｉである、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ１Ｃ）、ウォーカー－ワールブルグ症候群、筋眼脳病、またはこれらの任意の組合せである。
本発明の態様は、ジストログリカノパチー障害を有する対象を処置するための方法であって、対象に、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター、ｒＡＡＶゲノム、核酸配列、および／または医薬組成物のいずれかを治療有効量で投与して、それにより、対象の筋組織における機能的ＦＫＲＰの発現を増加させるステップを含む、方法にも関する。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、対象に単回用量を投与する。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、投与は、全身性のものである。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、投与は、静脈内注入によるものである。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、投与後に、対象の骨格筋および／または心筋におけるα－ＤＧの機能的グリコシル化が実質的に増加する。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、投与後に、対象の血清クレアチンキナーゼレベルが実質的に低下する。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、投与後に、対象の骨格筋におけるコラーゲン沈着が実質的に減少する。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、対象の筋組織（例えば、ヒラメ筋、横隔膜および／またはＥＤＬ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ筋力分析が有意に向上する。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、対象の１回換気量が実質的に増加する。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、対象がトレッドミル試験において有意に長い距離を走ることができる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、対象は、成体である。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、対象は、若齢期個体（juvenile）である。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、対象は、乳幼児期個体（infant）である。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、対象は、投与前に有意な疾患病態を示している。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、対象は、投与前に有意な疾患病態を示していない。
図１は、実施した用量設定および毒性試験の要約である。
図２は、空ビヒクルを受けたマウスと比較した、レシピエントマウスの横隔膜および四頭筋における代表的な発現レベルを示す。
図３は、陽性対照としての機能を果たす、正常なＢＬ６マウス（左上の写真）、１×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－ＦＫＲＰを受けたＰ４４８Ｌマウス（右上）および３×１０１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－ＦＫＲＰを受けたＰ４４８Ｌマウス（左下）、ならびに、陰性対照としての機能を果たす、空ビヒクルを受けたＰ４４８Ｌマウス（右下）における代表的なα－ジストログリカン発現を示す。
図４は、ＤＡＰＩを用いた、Ｐ４４８Ｌマウスの四頭筋の横断面積における機能的α－ＤＧ発現の代表的な免疫蛍光画像を示す。左上の枠は、野生型ＢＬ６マウスにおけるα－ジストログリカンである。右上の枠は、１×１０１４ｖｇ／ｋｇを投与されたＰ４４８Ｌマウスにおけるα－ジストログリカンである。左下の枠は、３×１０１３ｖｇ／ｋｇを投与されたＰ４４８Ｌマウスにおけるα－ジストログリカンである。右下の枠は、空ビヒクルを投与されたＰ４４８Ｌマウスである。
図５は、四頭筋の断面におけるコラーゲン沈着についてのピクロシリウスレッド染色の代表的な画像を示す（上）。雄の画像が示されている。無処置の場合、Ｐ４４８マウス（中央上）では、広範なコラーゲン沈着および不規則な筋線維形状を示す。これらの特色は、種々の用量のＡＡＶ９－ＦＫＲＰで次第に正常に戻る。（下）は、Ｐ４４８Ｌマウスにおける定量的コラーゲン沈着のグラフ表示である。コラーゲン沈着が四頭筋内の総面積に対するパーセンテージとして示されている。雄および雌のデータをまとめたものである。コラーゲン沈着は全ての用量で減少する。＃＃＃対応のないｔ検定、ｐ＜０．００１、ｎ≧１３；＊ダネットの多重比較検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５、ｎ≧１２；＊＊ダネットの多重比較検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１、ｎ≧１２。パーセントコラーゲンを（赤色染色の総面積／総生検面積）×１００として算出した。
図６は、種々の量のＡＡＶ９－ＦＫＲＰを受けたマウスにおける血清クレアチンキナーゼレベルの調査から得られたデータの２つのグラフ表示を示す。左側は雄マウスにおいて得られた結果であり、右側は雌マウスにおいて得られた結果である。ＢＬ６ビヒクルレシピエントマウスが陽性対照としての機能を果たし、Ｐ４４８Ｌマウスが陰性対照としての機能を果たす。Ｐ４４８Ｌマウスは、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇまたは３×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－ＦＫＲＰを受けた。
図７は、単離された長指伸筋からの比力応答の２つのグラフ表示を示す。左側 － 雄の応答、右側 － 雌の応答。ＢＬ６ビヒクルレシピエントマウスが陽性対照としての機能を果たし、Ｐ４４８Ｌマウスが陰性対照としての機能を果たす。Ｐ４４８Ｌマウスは、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇまたは３×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－ＦＫＲＰを受けた。ほとんどの場合、１×１０１３の用量で骨格筋の修復が実現される。この用量を超えると閾値効果が観察される。＃ＢＬ６はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０５）、＃＃ＢＬ６はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０１）、＃＃＃ＢＬ６はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．００１）、＊処置群はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０５）、＊＊処置群はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０１）、＊＊＊処置群はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．００１）。
図８は、単離された横隔膜筋からの比力応答の２つのグラフ表示を示す。左側 － 雄の応答、右側 － 雌の応答。ＢＬ６ビヒクルレシピエントマウスが陽性対照としての機能を果たし、Ｐ４４８Ｌマウスが陰性対照としての機能を果たす。Ｐ４４８Ｌマウスは、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇまたは３×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－ＦＫＲＰを受けた。ほとんどの場合、１×１０１３の用量で骨格筋の修復が実現される。この用量を超えると閾値効果が観察される。＃ＢＬ６はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０５）、＃＃ＢＬ６はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０１）、＃＃＃ＢＬ６はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．００１）、＊処置群はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０５）、＊＊処置群はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０１）、＊＊＊処置群はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．００１）。
図９は、単離されたヒラメ筋（ｓｏｌｅｕｓ ｍｕｓｃｌｅ）からの比力の２つのグラフ表示を示す。左側 － 雄の応答、右側 － 雌の応答。ＢＬ６ビヒクルレシピエントマウスが陽性対照としての機能を果たし、Ｐ４４８Ｌマウスが陰性対照としての機能を果たす。Ｐ４４８Ｌマウスは、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇまたは３×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－ＦＫＲＰを受けた。ほとんどの場合、１×１０１３の用量で骨格筋の修復が実現される。この用量を超えると閾値効果が観察される。＃ＢＬ６はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０５）、＃＃ＢＬ６はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０１）、＃＃＃ＢＬ６はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．００１）、＊処置群はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０５）、＊＊処置群はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０１）、＊＊＊処置群はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．００１）。
図１０は、Ｐ４４８マウスにおける消耗トレッドミル距離を示す。３×１０１ ４の最大用量以外の全ての用量で総距離が回復する。＃ＢＬ６はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０５）、＃＃ＢＬ６はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０１）、＃＃＃ＢＬ６はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．００１）、＊処置群はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０５）、＊＊処置群はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０１）、＊＊＊処置群はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．００１）。
図１１は、Ｐ４４８マウスにおける回転輪走行距離を示す。３×１０１４の最大用量以外の全ての用量で総距離が回復する。＃ＢＬ６はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０５）、＃＃ＢＬ６はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０１）、＃＃＃ＢＬ６はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．００１）、＊処置群はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０５）、＊＊処置群はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．０１）、＊＊＊処置群はＰ４４８Ｌビヒクルとの差異を有する（ｐ＜０．００１）。
図１２は、雄（左側）および雌（右側）レシピエントマウスにおけるプレチスモグラフィー試験を示す。ＢＬ６ビヒクルレシピエントマウスが陽性対照としての機能を果たし、Ｐ４４８Ｌマウスが陰性対照としての機能を果たす。Ｐ４４８Ｌマウスは、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇまたは３×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－ＦＫＲＰを受けた。
図１３は、ｄｓＡＡＶ－Ｓｙｎ１００－ＦＫＲＰの模式的なプラスミドマップである。ＩＴＲ（ＩＴＲ２ｍ、ＩＴＲ２）、プロモーター（Ｓｙｎ１００）、イントロン（ＶＨ４－Ｉｇ－イントロン３）、ＦＫＲＰの最適化されたコード配列（Ｏｐｔｉ－ｈｕ－ＦＫＲＰ－ＣｐＧ（－））、ポリＡシグナル配列（ｓＰｏｌｙＡ）、および種々のスペーサーを含むプラスミドの種々の構成成分のヌクレオチド配列も示されている。 同上。
図１４は、図１３のプラスミドのヒトＦＫＲＰタンパク質をコードする合成核酸のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。この核酸のＣｐＧ部位は０％である。
図１５は、図１３のプラスミドのプロモーター（Ｓｙｎ１００）のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
図１６は、図１３のプラスミドのイントロン（ＶＨ４－Ｉｇ－イントロン３）のヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。
図１７は、図１３のプラスミドのポリＡシグナル配列のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
図１８は、ヒトＦＫＲＰをコードする天然ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。
図１９は、図１３のプラスミドの他のヌクレオチド配列、ＩＴＲ２Ｍ配列（配列番号７）、ＩＴＲ２配列（配列番号８）、スペーサー配列（配列番号９～１３）を示す。
図２０は、心筋管に分化するＨ９Ｃ２細胞株における本発明の一部の実施形態による合成筋肉特異的プロモーターの平均活性を示す。エラーバーは標準偏差である。ＣＢＡおよびＣＫ８は対照プロモーターである。
図２１は、短い合成筋肉特異的プロモーターからの結果を示す。心筋管に分化するＨ９Ｃ２細胞株における１１種の選択された合成筋肉特異的プロモーター、ＳＰ０４９７、ＳＰ０５００、ＳＰ０５０１、ＳＰ０５０６、ＳＰ０５０８、ＳＰ０５１０、ＳＰ０５１４、ＳＰ０５１９、ＳＰ０５２０、ＳＰ０５２１およびＳＰ４１６９の、ＣＢＡ対照プロモーターに対して正規化された平均活性を示す。エラーバーは３連での標準偏差である。ＣＢＡおよびＣＫ８は対照プロモーターである。
図２２は、示されているＭＯＩで４８時間および７２時間のヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡ－ＶＳＭＣまたはＨＡＳＭＣ）生存の棒グラフを示す。
図２３Ａおよび２３Ｂは、形質導入の４８時間後のＨＡＳＭＣ細胞溶解物におけるＦＫＲＰを示す。（図２３Ａ）ＦＫＲＰおよびＧＡＰＤＨのタンパク質発現。（図２３Ｂ）タンパク質に対して正規化されたＦＫＲＰ活性、およびベクターゲノム（ｖｇ）当たりのＦＫＲＰ。
図２４Ａおよび２４Ｂは、形質導入の７２時間後のＨＡＳＭＣ細胞溶解物におけるＦＫＲＰを示す。（図２４Ａ）ＦＫＲＰおよびＧＡＰＤＨのタンパク質発現（図２４Ｂ）タンパク質に対して正規化されたＦＫＲＰ活性、およびベクターゲノム（ｖｇ）当たりのＦＫＲＰ。
図２５は、示されているＭＯＩでの７２時間のＨＡＳＭＣ細胞生存を示す。
図２６Ａおよび２６Ｂは、形質導入の７２時間後のＨＡＳＭＣ細胞溶解物におけるＦＫＲＰを示す。（図２６Ａ）ＦＫＲＰおよびＧＡＰＤＨのタンパク質発現。（図２６Ｂ）タンパク質に対して正規化されたＦＫＲＰ活性、およびベクターゲノム（ｖｇ）当たりのＦＫＲＰ。
上記の図は、以下の説明において詳細にさらに定義される、本発明の例示的な実施形態のうちの少なくとも１つにおける態様を例示するものである。異なる図において同じ数字によって参照される本発明の特色、要素、および態様は、１つまたは複数の実施形態による同じ、等価の、または同様の特色、要素、または態様を表す。
発明の詳細な説明
肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）は、疾患遺伝子および遺伝によってカテゴリー化される多くの亜型を伴う多様な障害群である。構造タンパク質または酵素のいずれかの欠陥をもたらす多数の遺伝子変異が、ＬＧＭＤを引き起こすものとして同定されている。肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ（ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ２Ｉ）（ＬＧＭＤ２Ｉ）は、当技術分野では肢帯型筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ）；常染色体劣性９；ＬＧＭＤＲ９筋ジストロフィー；２Ｉ型肢帯型；肢帯型筋ジストロフィー－ジストログリカノパチー；およびＦＲＫＰ関連肢帯型としても公知であり、一遺伝子性の極めて稀な奇病である。
ＬＧＭＤ２Ｉは、α－ジストログリカン（α－ＤＧ）のグリコシル化に必要なフクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）の遺伝子の変異によって引き起こされる常染色体劣性筋ジストロフィーとして分類される。ＦＫＲＰがないと、α－ＤＧのグリコシル化が損なわれることにより細胞外マトリックスにおけるラミニンとの結合が減少し、したがって、筋細胞筋鞘に対する剪断損傷、慢性炎症、および筋線維の分解が経時的に増加する。ＬＧＭＤ２Ｉは、若齢期個体／成体において緩徐に進行する疾患であり、著しい能力障害および早期死亡が伴う。これらの患者は、早期死亡に至る恐れがある心臓線維症、呼吸器合併症、および嚥下困難を起こしやすい。創始Ｌ２７６Ｉ変異（ホモ接合性）が欧州人症例のおよそ７０％に相当する。Ｌ２７６Ｉヘテロ接合体（２５％）は、より重症の表現型を有する（第２の対立遺伝子における様々な変異）。
本発明の態様は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｉなどの疾患を処置するための遺伝子治療における使用のための、フクチン関連タンパク質をコードする核酸の開発に関する。
本明細書で使用される場合、「ＦＫＲＰ」は、フクチン関連タンパク質を指す。本明細書に記載の核酸、ベクター、組成物および方法は、細胞（例えば、筋細胞）におけるＦＫＲＰのレベルの上昇を対象とするものである。そのような方法は、例えば、グリコシル化α－ジストログリカンの欠乏（本明細書ではジストログリカノパチー障害と称される）を有する対象に対して有益であり得る。
「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、典型的には、ヌクレオチドから本質的に構成される任意の長さのオリゴマーまたはポリマー（好ましくは直鎖状ポリマー）を指す。ヌクレオチド単位は、一般に、複素環式塩基、糖基、および、少なくとも１つ、例えば、１つ、２つ、または３つの、修飾または置換されたリン酸基を含めたリン酸基を含む。複素環式塩基は、とりわけ、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）などのプリンおよびピリミジン塩基を含み得、これらは、天然に存在する核酸、他の天然に存在する塩基（例えば、キサンチン、イノシン、ヒポキサンチン）および化学的または生化学的に修飾された（例えば、メチル化された）、非天然のまたは誘導体化された塩基に広範にわたる。糖基は、とりわけ、天然に存在する核酸に共通するペントース（ペントフラノース）基、例えば、好ましくはリボースおよび／もしくは２－デオキシリボースなど、またはアラビノース、２－デオキシアラビノース、トレオースもしくはヘキソース糖基、ならびに修飾または置換された糖基を含み得る。本発明で意図される核酸は、天然に存在するヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたはそれらの混合物を含み得る。修飾されたヌクレオチドは、修飾された複素環式塩基、修飾された糖部分、修飾されたリン酸基またはこれらの組合せを含み得る。安定性、酵素による分解に対する抵抗性、またはいくつかの他の有用な特性を改善するために、リン酸基または糖の修飾を導入することができる。「核酸」という用語は、特にｈｎＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、増幅産物、オリゴヌクレオチド、および合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ ＲＮＡハイブリッドを含めた、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ ＲＮＡハイブリッド分子をさらに包含することが好ましい。核酸は、天然に存在するもの、例えば、自然界に存在するまたは自然界から単離されたものであってもよく、天然に存在しないもの、例えば、組換え型、すなわち、組換えＤＮＡ技術によって産生されたもの、および／または部分的もしくは完全に化学的もしくは生化学的に合成されたものであってもよい。「核酸」は、二本鎖、部分的に二本鎖、または一本鎖であってもよい。一本鎖である場合、核酸は、センス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。さらに、核酸は、環状であっても直鎖状であってもよい。
「同一性」および「同一の」などの用語は、２つのポリマー分子間、例えば２つの核酸分子間、例えば２つのＤＮＡ分子間の配列類似性を指す。配列アラインメントおよび配列同一性の決定は、例えば、最初にAltschul et al. 1990 (J Mol Biol 215: 403-10）に記載されたＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、例えば、Tatusova and Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250)に記載された「Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」アルゴリズムを使用して実施することができる。
比較のために配列をアラインメントするための方法は当技術分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、例えば：Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482；Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443；Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444；Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44；Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3；Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90；Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65；Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31；Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。配列アラインメント方法および相同性算出に関する詳細な考察は、例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に見いだすことができる。
いくつかの配列解析プログラムと関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschul et al. (1990)）が、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給源から、およびインターネット上で入手可能である。このプログラムを使用した配列同一性の決定の仕方に関する説明は、インターネット上でＢＬＡＳＴ（商標）の「ｈｅｌｐ」セクションの下で入手可能である。核酸配列の比較のために、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」機能を、デフォルトパラメータを使用して用いることができる。この方法によって評価した場合、参照配列に対してさらに大きな類似性を有する核酸配列は、同一性パーセンテージの上昇を示す。典型的には、配列同一性パーセンテージは、配列の長さ全体にわたって算出される。
例えば、包括的な最適なアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムにより、以下のスコアリングパラメータを用いて適切に見いだされる：マッチスコア（Ｍａｔｃｈ ｓｃｏｒｅ）：＋２、ミスマッチスコア（Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｓｃｏｒｅ）：－３；ギャップペナルティ（Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）：ギャップオープン（ｇａｐ ｏｐｅｎ）５、ギャップエクステンション（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）２。得られた最適なグローバルアラインメントの同一性パーセンテージは、アラインメントされた塩基の数のアラインメントの全長に対する比に１００を掛けることよって適切に算出され、ここで、アラインメントの長さには、マッチおよびミスマッチの両方が含まれる。
「ハイブリダイズすること（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」という用語は、少なくとも部分的に相補的な２つのヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプロセスにおけるアニーリングを意味する。ハイブリダイゼーションを生じさせるために、相補的な核酸分子を、一般に、二本鎖を２つの一本鎖に融解するため、および／または一本鎖核酸からヘアピンもしくは他の二次構造を除去するために、熱的にまたは化学的に変性させる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、塩濃度およびハイブリダイゼーション緩衝液の組成などの条件に影響される。従来のハイブリダイゼーション条件が、例えばSambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New Yorkに記載されているが、既知のまたは予測される相同性および／または核酸配列の長さに応じて多数の異なるハイブリダイゼーション条件を設計することができることが、当業者には理解されよう。ハイブリダイゼーションの高ストリンジェンシー条件には、高温および／または低ナトリウム／塩濃度（塩としては、例としてＮａＣｌおよびクエン酸Ｎａとしてのナトリウムが挙げられる）、および／またはハイブリダイゼーション緩衝液にホルムアミドを組み入れること、および／またはハイブリダイゼーション緩衝液中のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム洗浄剤）などの化合物の濃度を減じること、および／またはデキストラン硫酸塩もしくはポリエチレングリコール（分子クラウディングを促進する）などの化合物をハイブリダイゼーション緩衝液から排除することが含まれる。非限定的な例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの代表的な塩および温度条件は、１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、６５℃である。ＳＳＣという略語は、核酸ハイブリダイゼーション溶液に使用される緩衝液を指す。２０×（２０倍濃縮物）ストックＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．０）１リットルは、塩化ナトリウム１７５．３ｇおよびクエン酸ナトリウム８８．２ｇを含有する。ハイブリダイゼーションを実現するための代表的な期間は、１２時間である。
「コンセンサス配列」の意味は当技術分野で周知である。本出願では、文脈によりそうでないことが示されない限り、コンセンサス配列に対して以下の表示法が使用されている。以下の例示的なＤＮＡ配列について考察すると：
Ａ［ＣＴ］Ｎ｛Ａ｝ＹＲ－Ａは、Ａがその位置に常に見いだされることを意味する；［ＣＴ］は、その位置におけるＣまたはＴのいずれかを表す；Ｎは、その位置における任意の塩基を表す；｛Ａ｝は、Ａ以外の任意の塩基がその位置に見いだされることを表す。Ｙは任意のピリミジンを表し、Ｒは任意のプリンを示す。
「合成」とは、本出願では、天然には存在しない核酸分子を意味する。本発明の合成核酸発現構築物は、典型的には組換え技術により、人工的に作製される。そのような合成核酸は、天然に存在する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、および他のそのような調節配列）を含有し得るが、これらは、天然に存在しない状況で存在している。例えば、合成遺伝子（または遺伝子の一部分）は、典型的には、天然には連続していない１つもしくは複数の核酸配列（キメラ配列）を含有する、ならびに／または、置換、挿入、および欠失およびこれらの組合せを包含し得る。「合成プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、天然には存在しないプロモーターに関する。
「相補的な」または「相補性」は、本明細書で使用される場合、２つの核酸配列のワトソン－クリック塩基対合を指す。例えば、配列５’－ＡＧＴ－３’は相補配列３’－ＴＣＡ－５’と結合する。２つの核酸配列間の相補性は、「部分的」であり得、その場合、塩基の一部のみがそれらの補体と結合する、または、２つの核酸配列間の相補性は完全であり得、その場合、配列内の全ての塩基がその相補的な塩基と結合する。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に著しい影響を及ぼす。
「スペーサー配列」または「スペーサー」は、本明細書で使用される場合、２つの機能的核酸配列を分離する核酸配列である。「スペーサー配列」または「スペーサー」は、機能的核酸配列（例えば、シス調節エレメント）が所望の通り機能することを妨げる（例えば、サイレンサー配列を含む、所望の転写因子の結合を妨げる、などの場合に生じ得る）ことがないのであれば、本質的に任意の配列を有し得る。典型的には、「スペーサー配列」または「スペーサー」は、隣接する機能的核酸配列の互いとの間隔をとるためだけに存在する場合、非機能性である。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、任意の天然に存在するアミノ酸、その修飾された形態、および合成アミノ酸を包含する。
「ベクター」は、外来遺伝子材料をそれが複製および／または発現され得る別の細胞に運搬するためのビヒクルとして使用される化合物を指す。外来核酸を含有するクローニングベクターは組換えベクターと称される。核酸ベクターの例は、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体である。組換えベクターは、典型的には、複製開始点、マルチクローニング部位、および選択マーカーを含有する。核酸配列は、典型的には、挿入断片（組換え核酸または導入遺伝子）、およびベクターの「骨格」としての機能を果たすより大きな配列からなる。遺伝情報を別の細胞に移行するベクターの目的は、典型的には、標的細胞において挿入断片を単離する、増加させる、または発現させることである。発現ベクター（発現構築物）は、標的細胞において外因性遺伝子を発現させるためのものであり、一般に、外因性遺伝子／ＯＲＦの発現を駆動するプロモーター配列を有する。標的細胞へのベクターの挿入は、細菌細胞および真核細胞については形質転換またはトランスフェクションと称されるが、ウイルスベクターの挿入は多くの場合、形質導入と称される。「ベクター」という用語は、一般に、例えば、これだけに限定されないが、形質転換された細胞またはナノ粒子などの、外来遺伝子材料を別の細胞に運搬する機能を果たす事項を記載するためにも使用することができる。
「送達ベクター」は、典型的には、細胞において核酸を発現させるために、核酸カーゴを細胞に送達するために使用される。一実施形態では、本発明の送達ベクターとしては、限定することなく、ウイルスベクターが挙げられる。種々のウイルスベクターが当技術分野で公知である（例えば、ヘルペスウイルス、エプスタイン－バーウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスなどのパルボウイルスに由来するもの）。非ウイルス送達ベクターも当技術分野で公知であり、それらの使用も本発明に包含される。一実施形態では、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。そのようなウイルスベクターは、ＡＡＶカプシドを含み、ＡＡＶもしくはｒＡＡＶゲノムまたはウイルス核酸を含む任意の他の核酸をパッケージングすることができる。あるいは、一部の状況では、「ベクター」、「ウイルスベクター」、「送達ベクター」という用語（および同様の用語）は、ビリオンの非存在下のベクターゲノム（例えば、ｖＤＮＡ）および／またはカプシドにつながれたもしくはカプシド内にパッケージングされた分子を送達するための輸送体として作用するウイルスカプシドを指すように使用される場合がある。
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」（例えば、ＡＡＶベクター）「ウイルス送達ベクター」という用語（および同様の用語）は、特定の実施形態では、一般に、核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン内にパッケージングされたウイルス核酸（すなわち、ベクターゲノム）を含むウイルス粒子を指す。
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開ＷＯ０１／９２５５１（その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている二重鎖パルボウイルス粒子であり得る。したがって、一部の実施形態では、二本鎖（二重鎖）ゲノムをパッケージングすることができる。
「組換えＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、少なくとも１つの末端逆位配列（例えば、１つ、２つまたは３つの末端逆位配列）および１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、一般に、ウイルスを生成するために、１４５塩基の末端逆位配列（ＩＴＲ）をシスに保持する；しかし、部分的にまたは完全に合成の配列を含む改変ＡＡＶ ＴＲおよび非ＡＡＶ ＴＲによってもこの目的を果たすことができる。他のウイルス配列は全て不要であり、トランスに供給することができる（Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97）。ｒＡＡＶベクターは、必要に応じて、ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）を２つ含み、それらは一般に、異種ヌクレオチド配列に対して５’末端側および３’末端側に存在するが、異種ヌクレオチド配列と連続している必要はない。ＩＴＲは、互いに同じであっても異なってもよい。ベクターゲノムはまた、３’末端または５’末端に単一のＩＴＲを含有してもよい。
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター（ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）」、「ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」という用語は、核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン内にパッケージングされたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含むウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を指す。
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源のエレメントを少なくとも１つ含み、ウイルスベクター粒子にパッケージングされる能力を有する核酸ベクター構築物を指し得る。ウイルスベクターは、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸を、非必須ウイルス遺伝子の代わりに含有し得る。ベクターおよび／または粒子を、本明細書に記載の合成核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで細胞に移入するために利用することができる。多数の形態のウイルスベクターが当技術分野で公知であり、本明細書に提示される。
「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、１つまたは複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターには、一般に、ウイルスを生成するために、末端逆位配列（複数可）（ＴＲ（複数可））のみがシスで必要である。他のウイルス配列は全て不要であり、トランスで供給することができる（Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbial. Immunol. 158:97）。典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージングすることができる導入遺伝子のサイズを最大にするために、１つまたは複数のＴＲ配列のみを保持する。構造および非構造タンパク質コード配列は、トランスで（例えば、プラスミドなどのベクターによって、または配列をパッケージング細胞に安定に組み込むことによって）提供することができる。本発明の複数の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ配列）、必要に応じて、典型的にはベクターゲノムの５’末端および３’末端に存在し、異種核酸を挟むがそれと連続している必要はない２つのＩＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含む。ＴＲは互いに同じであっても異なってもよい。
「末端反復」または「ＴＲ」という用語は、ヘアピン構造を形成し、末端逆位配列（すなわち、複製、ウイルスパッケージング、組込みおよび／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を媒介するＩＴＲ）として機能する任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＴＲは、ＡＡＶ ＴＲであっても非ＡＡＶ ＴＲであってもよい。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ－１９）または任意の他の適切なウイルス配列（例えば、ＳＶ４０複製開始点としての機能を果たすＳＶ４０ヘアピン）のものなどの非ＡＡＶ ＴＲ配列をＴＲとして使用することができ、これらを、トランケーション、置換、欠失、挿入および／または付加によってさらに改変することができる。さらに、ＴＲは、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第５，４７８，７４５号に記載されている「２重Ｄ配列」など、部分的にまたは完全に合成のものであってもよい。
「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ ＴＲ」は、「ＡＡＶ末端逆位配列」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」を含め、これだけに限定されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２または現在公知であるまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含めた任意のＡＡＶに由来するものであってもよい（例えば、表３を参照されたい）。ＡＡＶ末端反復は、末端反復により所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組込み、および／またはプロウイルスレスキューなどが媒介される限りは、天然末端反復配列を有する必要はない（例えば、天然ＡＡＶ ＴＲまたはＡＡＶ ＩＴＲ配列を挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス変異によって変更することができる）。
ＡＡＶタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、一緒に相互作用して、正二十面体対称性のＡＡＶカプシドを形成するカプシドタンパク質である。ＶＰ１．５は、米国特許出願公開第２０１４／００３７５８５号に記載されているＡＡＶカプシドタンパク質である。カプシドタンパク質は、当技術分野で周知の通り、天然に存在するものであっても改変されたものであってもよい。
さらに、ウイルスカプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含めた他の改変を含有し得る。
「キメラ」カプシドタンパク質は、本明細書で使用される場合、野生型と比べた、カプシドタンパク質のアミノ酸配列における１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）のアミノ酸残基の置換、ならびに、野生型と比べた、アミノ酸配列における１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）のアミノ酸残基の挿入および／または欠失によって改変されたＡＡＶカプシドタンパク質を意味する。一部の実施形態では、１つのＡＡＶ血清型に由来する完全なまたは部分的なドメイン、機能的領域、エピトープなどによって、対応する、ＡＡＶ血清型が異なる野生型ドメイン、機能的領域、エピトープなどを、任意の組合せで置き換えて、本発明のキメラカプシドタンパク質を作製することができる。キメラカプシドタンパク質の作製は、当技術分野で周知のプロトコールに従って実施することができ、本発明のカプシドに含めることができるキメラカプシドタンパク質が多数、文献および本明細書に記載されている。
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開ＷＯ００／２８００４号およびChao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619に記載されている「標的化」ウイルスベクター（例えば、方向性のある向性を有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＴＲとウイルスカプシドが異なるパルボウイルスに由来する）であってもよい。
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開ＷＯ０１／９２５５１号（その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている二重鎖パルボウイルス粒子であってもよい。したがって、一部の実施形態では、二本鎖（二重鎖）ゲノムを本発明のウイルスカプシドにパッケージングすることができる。
本明細書で使用される場合、「一倍体ＡＡＶ」という用語は、本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１８／２２７２５に記載されているＡＡＶを意味するものとする。
「ハイブリッド」ＡＡＶベクターまたはパルボウイルスという用語は、ウイルスＴＲまたはＩＴＲとウイルスカプシドが異なるパルボウイルスに由来するｒＡＡＶベクターを指す。ハイブリッドベクターは、国際特許公開ＷＯ００／２８００４号およびChao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619に記載されている。例えば、ハイブリッドＡＡＶベクターは、典型的には、アデノウイルスの複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス５’および３’シスＩＴＲ配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。
「倍数体ＡＡＶ」という用語は、２つまたはそれよりも多くのＡＡＶ血清型に由来するカプシドで構成され、例えば、より高度の形質導入のために個々の血清型を活用するが、ある特定の実施形態では、親由来の向性が排除されない、ＡＡＶベクターを指す。
「シス調節エレメント」または「ＣＲＥ」という用語は、当業者に周知の用語であり、近接する遺伝子の転写を（すなわちシスに）調節またはモジュレートすることができるエンハンサー、プロモーター、インスレーター、またはサイレンサーなどの核酸配列を意味する。ＣＲＥは、ＣＲＥにより調節される遺伝子の付近に見いだされる。ＣＲＥは、典型的には、ＴＦに結合することによって遺伝子転写を調節する、すなわち、ＴＦＢＳを含む。単一のＴＦが多くのＣＲＥと結合し、したがって、多くの遺伝子の発現を制御することができる（多面作用）。ＣＲＥは、通常、常にではないが、ＣＲＥにより調節される遺伝子の転写開始点（ＴＳＳ）の上流に配置される。「エンハンサー」は、それらが作動可能に関連する遺伝子の転写を増強する（すなわち、アップレギュレートする）ＣＲＥであり、そのエンハンサーによって調節される遺伝子の上流、下流、さらにはイントロン内に見いだすことができる。１つの遺伝子の転写を調節するために複数のエンハンサーが協調して作用し得る。この文脈において、「サイレンサー」は、遺伝子の転写を妨げるまたはダウンレギュレートするように作用する、リプレッサーと称されるＴＦに結合するＣＲＥに関する。「サイレンサー」という用語は、ｍＲＮＡ分子の翻訳を抑制するタンパク質に結合する、メッセンジャーＲＮＡの３’非翻訳領域内の領域も指し得るが、この使用は、ＣＲＥの記載におけるその使用とは別個である。一般に、本発明のＣＲＥは、筋肉特異的エンハンサー（多くの場合、筋肉特異的ＣＲＥ、または筋肉特異的ＣＲＥエンハンサー、などと称される）である。この文脈において、ＣＲＥは、転写開始点（ＴＳＳ）から１５００ヌクレオチドまたはそれ未満、より好ましくはＴＳＳから１０００ヌクレオチドまたはそれ未満、より好ましくはＴＳＳから５００ヌクレオチドまたはそれ未満、および適切にはＴＳＳから２５０、２００、１５０、または１００ヌクレオチドまたはそれ未満に配置されることが好ましい。本発明のＣＲＥは、比較的短い長さ、好ましくは１００ヌクレオチドまたはそれ未満の長さであることが好ましく、例えば、９０、８０、７０、６０ヌクレオチドまたはそれ未満の長さであり得る。
「シス調節モジュール」または「ＣＲＭ」という用語は、２つまたはそれよりも多くのＣＲＥで構成される機能的モジュールを意味する；本発明では、ＣＲＥは、典型的には肝臓特異的エンハンサーである。したがって、本出願では、ＣＲＭは、典型的には、複数の筋肉特異的エンハンサーＣＲＥを含む。典型的には、ＣＲＭ内の複数のＣＲＥは一緒になって作用して（例えば、相加的または相乗的に）、ＣＲＭが作動可能に関連している遺伝子の転写を増強する。ＣＲＭ内のＣＲＥをシャッフルする（すなわち、並べ替える）ため、逆さにする（すなわち、逆向きにする）ため、およびそれらの間隔を変更するための保存可能な範囲が存在する。したがって、本発明のＣＲＭの機能的バリアントは、参照されたＣＲＭの、それらの中のＣＲＥがシャッフルおよび／または逆さにされた、および／またはＣＲＥ間の間隔が変更されたバリアントを含む。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という句は、一般に、転写される核酸配列の上流に配置される、転写を生じさせるために必要である、すなわち、転写を開始するＤＮＡの領域を指す。プロモーターは、それらの制御下にあるコード配列の転写を適正に活性化または抑止することを可能にするものである。プロモーターは、典型的には、複数のＴＦが認識し、結合する特定の配列を含有する。ＴＦがプロモーター配列に結合し、その結果、遺伝子のコード領域からＲＮＡを合成する酵素であるＲＮＡポリメラーゼが動員される。非常に多くのプロモーターが当技術分野で公知である。
「合成プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、天然には存在しないプロモーターに関する。この文脈において、合成プロモーターは、典型的には、最小（またはコア）プロモーターまたは近位プロモーター、例えば、筋肉特異的プロモーターと作動可能に連結した本発明の合成ＣＲＥおよび／またはＣＲＭを含む。本発明のＣＲＥおよび／またはＣＲＭは、プロモーターと作動可能に連結した遺伝子の筋肉特異的転写を増強する機能を果たす。合成プロモーターの一部は天然に存在するものであり得るが（例えば、最小プロモーターまたはプロモーター内の１つもしくは複数のＣＲＥ）、完全な実体としての合成プロモーターは天然に存在しないものである。
本明細書で使用される場合、「最小プロモーター」（「コアプロモーター」としても公知）は、それ自体では不活性またはほとんど不活性であるが、他の転写調節エレメントと組み合わさると転写を媒介し得る短いＤＮＡセグメントを指す。最小プロモーター配列は、原核生物および真核生物遺伝子を含む種々の異なる供給源に由来するものであってもよい。最小プロモーターの例は上に記載されており、それらとして、ドーパミンベータ－ヒドロキシラーゼ遺伝子最小プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子最小プロモーター（ＣＭＶ－ＭＰ）、およびヘルペスチミジンキナーゼ最小プロモーター（ＭｉｎＴＫ）が挙げられる。最小プロモーターは、典型的には、転写開始点（ＴＳＳ）およびすぐ上流のエレメント、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合部位、および一般的な転写因子結合性部位（多くの場合、ＴＡＴＡボックス）を含む。
本明細書で使用される場合、「近位プロモーター」は、最小プロモーターと、それに加えて、主要な調節エレメントを含有する傾向がある、遺伝子の上流の近位配列に関する。近位プロモーターは、多くの場合、ＴＳＳの上流のおよそ２５０塩基対に及び、特定のＴＦＢＳを含む。本発明の場合では、近位プロモーターは、本発明の１つまたは複数のＣＲＥまたはＣＲＭと組み合わせることができる天然に存在する近位プロモーター（例えば、肝臓特異的またはＣＮＳ特異的）であることが適切である。しかし、近位プロモーターは合成であってもよい。
シス調節エレメント、シス調節モジュール、プロモーターまたは他の核酸配列の「機能的バリアント」は、本発明の文脈では、参照配列、例えば、筋肉特異的シス調節エンハンサーエレメント、筋肉特異的シス調節モジュールまたは筋肉特異的プロモーターと同様に機能する能力を保持する参照配列のバリアントである。そのような機能的バリアントの代替用語として、「生物学的等価物」または「等価物」が挙げられる。
所与のシス調節エレメントの筋肉特異的エンハンサーとして機能する能力は、その配列の、参照配列が結合するものと同じ筋肉特異的ＴＦに結合する能力によって主に決定されることが理解されよう。したがって、ほとんどの場合、シス調節エレメントの機能的バリアントは、参照シス調節エレメントと同じＴＦに対するＴＦＢＳを含有することになる。機能的バリアントのＴＦＢＳは、参照シス調節エレメントと同じ相対位置（すなわち、順序）にあることが好ましいが必須ではない。機能的バリアントのＴＦＢＳが参照配列と同じ向きであることも好ましいが必須ではない（一部の場合では参照配列においてＴＦＢＳが逆向きに、例えば、配列に向かい合った逆相補物として存在し得ることに留意されたい）。機能的バリアントのＴＦＢＳが参照配列と同じ鎖上にあることも好ましいが必須ではない。したがって、好ましい実施形態では、機能的バリアントは、参照配列と同じＴＦに対するＴＦＢＳを、同じ順序で、同じ向きで、かつ同じ鎖上に含む。ＴＦＢＳ間に存在する配列（一部の場合ではスペーサー配列などと称される）はシス調節エレメントの機能に対する重要性が低いことも理解されよう。そのような配列については、典型的には、大幅に変動させることができ、それらの長さを変更することができる。しかし、好ましい実施形態では、機能的バリアントにおける間隔（すなわち、隣接するＴＦＢＳ間の距離）は、参照配列におけるものと実質的に同じである（例えば、２０％よりも大きくは変動しない、好ましくは１０％よりも大きくは変動しない、より好ましくは同じである）。一部の場合では、シス調節エンハンサーエレメントの機能的バリアントは、逆向きに存在し得る、例えば、上記のシス調節エンハンサーエレメント、またはそのバリアントの逆相補物であり得ることが明らかになろう。
機能的バリアントと参照配列との間の配列同一性のレベルもまた、保持される機能性の指標になり得る。シス調節エレメントのＴＦＢＳの配列同一性のレベルが高いことは、一般に、スペーサー配列（何らかの配列の保存がほとんどまたは全く必要ない）の配列同一性よりも重要である。しかし、機能的ＴＦＢＳの配列がコンセンサス配列と正確にマッチする必要はないことを考慮すると、ＴＦＢＳ内であっても同程度の配列変動が許容され得ることが理解されよう。
１つまたは複数のＴＦの、所与の機能的バリアント内のＴＦＢＳに結合する能力は、これだけに限定されないが、電気移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、結合アッセイ、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）、およびＣｈＩＰシーケンシング（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）を含めた当技術分野で公知の任意の関連性のある手段によって決定することができる。好ましい実施形態では、１つまたは複数のＴＦの、所与の機能的バリアントに結合する能力をＥＭＳＡによって決定する。ＥＭＳＡを実施する方法は当技術分野で周知である。適切な手法は上で引用されたＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．に記載されている。この手順が記載されている多くの関連する論文、例えばHellman and Fried, Nat Protoc. 2007; 2(8): 1849-1861が入手可能である。
「筋肉特異的プロモーター」は、筋組織において他の組織よりも実質的に高い発現を促進するプロモーターである。筋肉特異的プロモーターの例としては、限定することなく、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、ｅｎｈ３５８ＭＣＫプロモーター、およびＣＫ６プロモーター（Wang et al. Gene Ther 15, 1489-1499 (2008)）、およびＳｙｎ１００プロモーター（(Qiao et al., Molecular Therapy Vol. 22 no. 11, p.1890-1899 (2014)）が挙げられる。追加の筋肉特異的プロモーターは本明細書に提示される。
「筋肉特異的」または「筋肉特異的発現」は、シス調節エレメント、シス調節モジュールまたはプロモーターの、筋組織（または筋肉由来細胞）における遺伝子の発現を他の組織（例えば、脾臓、肝臓、肺、血液、および脳）と比較して優先的にまたは優勢に増強または駆動する能力を指す。遺伝子の発現は、ｍＲＮＡまたはタンパク質の形態であり得る。好ましい実施形態では、筋肉特異的発現は、他の（すなわち、非筋肉）組織または細胞における発現が無視できる、すなわち、発現が高度に筋肉特異的であるようなものである。一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターにより、骨格筋および／または心筋における発現が促進される。一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターにより、筋組織における発現が１つまたは複数の他の組織における発現よりも３０％またはそれよりも大きく、４０％またはそれよりも大きく、５０％またはそれよりも大きく、６０％またはそれよりも大きく、７０％またはそれよりも大きく、８０％またはそれよりも大きく、９０％またはそれよりも大きく、９５％またはそれよりも大きく、９６％またはそれよりも大きく、９７％またはそれよりも大きく、９８％またはそれよりも大きく、９９％またはそれよりも大きく促進される。一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターにより、１つまたは複数の非筋組織における著しいまたは検出可能な発現はもたらされない。
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で使用される場合、当技術分野と一致し、医薬組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントに対して有害ではないことを意味する。
「有効量」という用語は、「治療有効量」、「有効用量」、または「治療有効用量」と同義である。「治療有効」量は、本明細書で使用される場合、対象にいくらかの改善または利益をもたらすために十分な量である。代替的に述べると、「治療有効」量は、対象における少なくとも１つの臨床症状のいくらかの軽減、緩和、減少または安定化をもたらす量である。治療効果は、対象にいくらかの利益がもたらされる限りは、完全または治癒的なものである必要はないことが当業者には理解されよう。ある実施形態では、ジストログリカノパチー障害を処置するための本明細書に開示される治療用化合物の効果は、これだけに限定することなく、個体における改善を、障害に関連する１つもしくは複数の臨床症状、および／または生理的指標に基づいて観察することによって決定することができる。ある実施形態では、障害に関連する症状の改善は、並行治療の必要性が減少することによって示され得る。
「予防有効」量は、本明細書で使用される場合、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状を予防するおよび／もしくはその発症を遅延させるのに、ならびに／または、本発明の方法の非存在下で生じるものと比べて、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状の重症度を低下させるおよび／もしくはその発症を遅延させるのに十分な量である。予防のレベルは、対象にいくらかの利益がもたらされる限りは、完全なものである必要はないことが当業者には理解されよう。
ＦＫＲＰをコードする核酸
本発明の１つの態様は、ヒトフクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）をコードする合成核酸に関する。ＦＫＲＰは、ＤＧグリコシル化経路に存在することが同定されたタンパク質の１つである。ＦＫＲＰは、α－ＤＧ内のＯ結合マンノースのグリコシル化に関与する（Qiao et al., Molecular Therapy 22, pp 1890-1899 (2014)）。ヒトＦＫＲＰは、よく特徴付けられている。ＦＫＲＰをコードする遺伝子の変異により、軽症肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ（ＬＧＭＤ２Ｉ）、重症ウォーカー－ワールブルグ症候群、先天性筋ジストロフィー１Ｃ型（ＣＭＤ１Ｃ）、および筋眼脳病を含めた広範な疾患表現型が生じる。ＦＫＲＰ遺伝子の変異により、脳および眼の異常を伴う重症先天性筋ジストロフィー－ジストログリカノパチー（Ａ５型；ＭＤＤＧＡ５）および知的発達の障害を伴うまたは伴わない先天性筋ジストロフィー－ジストログリカノパチー（Ｂ５型；ＭＤＤＧＢ５）も生じ得る。そのような疾患を有する対象に機能的ＦＫＲＰ遺伝子を導入し、それにより、対象の筋組織における発現および機能的ＦＫＲＰレベルを増加させることには、対象に対する治療的利益があることになる。対象に導入される、ＦＫＲＰタンパク質をコードする核酸を最適化することにより、発現を最大にして、それにより、対象に対する治療的利益を増加させる。最適化には、これだけに限定することなく、ＦＫＲＰコード核酸のＣｐＧ部位の減少およびＧＣ含量の全体的な減少が含まれる。
一実施形態では、対象は、ＦＫＲＰ欠乏をもたらすＦＫＲＰ変異における変異を有する。ＦＫＲＰ欠乏をもたらす例示的なＦＫＲＰ変異は、例えば、Liang, W-C；et al. Orphanet Journal of Rare Diseases (2020) 15:160.；Liu, W.；et al. bioRxiv preprint, doi: 10.1101/502708;posted Feb. 7, 2019.；Nallamilli, B.；et al. Annals of Clinical and Translational Neurology 2018; 5(12): 1574-1587.；Murphy, L.B.；et al. Annals of Clinical and Translational Neurology 2020; 7(5): 757-766に記載されており、また、本明細書の表１３に提示される。
Figure 2023545731000002
Figure 2023545731000003
さらに、既知のＦＫＲＰ変異は、例えば、ワールドワイドウェブｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９Ｈ９Ｓ５にさらに記載されている。
ＣｐＧ部位またはＣＧ部位は、塩基の直鎖状配列内で５’→３’方向に沿って、シトシンヌクレオチドの後にグアニンヌクレオチドが続くＤＮＡの領域である。ＣｐＧ部位の欠失または数の減少により、対象における導入されたコード配列の免疫原性を減少させることができる。これは、ＣｐＧ部位において生じるＤＮＡ配列へのＴＬＲ－９結合の減少または完全な阻害に起因する。ＣｐＧモチーフのメチル化により、転写サイレンシングがもたらされることも周知である。配列のＣｐＧモチーフの除去により、ＴＬＲ－９認識の低減および／またはメチル化の低減、したがって、導入遺伝子サイレンシングの低減がもたらされることが予想される。一部の実施形態では、ＦＫＲＰコード配列から１つまたは複数のＣｐＧ部位を取り除く。一部の実施形態では、ＦＫＲＰコード配列から１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％または全てのＣｐＧ部位を取り除く。一部の実施形態では、ＦＫＲＰコード配列から全てのＣｐＧ（または１００％のＣｐＧ）部位を取り除く。ＣｐＧ部位の除去または枯渇は、異なるヌクレオチドによる置換を行い、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を保存することによって実現される。
ＦＫＲＰコード配列の最適化の別の形態は、核酸の全体的なＧＣ含量の減少である。これは、グアニンおよびシトシンを配列から排除し、コードされるＦＫＲＰタンパク質のアミノ酸配列が保存されるように必要に応じて置き換えることによって実現される。ＧＣ含量の減少は、減少前のＦＫＲＰコード配列（例えば、天然配列である配列番号６）と比較することによって定量することができる。一部の実施形態では、ＦＫＲＰコード配列の全体的なＧＣ含量を、天然配列（配列番号６）と比較して１０％よりも大きく減少させる。一部の実施形態では、ＦＫＲＰをコードする合成ポリヌクレオチドは、ＦＫＲＰをコードするヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなり、ここで、ＧＣ含量は、配列番号６のＧＣ含量と比較して約１１％～約１５％（例えば、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、またはこの中の任意の範囲もしくは値）減少している。一部の実施形態では、ＧＣ含量を約１５％またはそれよりも大きく（例えば、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％またはそれよりも大きく）減少させる。一部の実施形態では、ＧＣ含量を配列番号６のＧＣ含量と比較して約２０％～約３０％（例えば、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％）減少させる。一部の実施形態では、ＧＣ含量を配列番号６のＧＣ含量と比較して約３０～４０％（例えば、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％または４０％）減少させる。一部の実施形態では、ＧＣ含量を配列番号６のＧＣ含量と比較して約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％減少させる。本発明者らは、驚くべきことに、ＧＣ含量の増加により発現が増加すると理解される（Kudla et al. PLos Biology DOI: 10.1371/journal.pbio.0040180 (2006)）、核酸発現およびタンパク質産生の分野で一般に理解されていることに反して、コードするポリヌクレオチドのＧＣ含量を配列番号６のＧＣ含量の１０％よりも大きく減少させることにより、前記ポリヌクレオチドの発現がＦＫＲＰをコードする天然ポリヌクレオチドと比較して増加し、それにより、ＦＫＲＰの産生がＦＫＲＰをコードする天然ポリヌクレオチドと比較して増加することを発見した。
本明細書で使用される場合、「ｃｏＦＫＲＰ」は、０％ＣｐＧ枯渇ＦＫＲＰを含むコドン最適化されたＦＫＲＰを意味する。
一部の実施形態では、合成核酸は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、合成核酸は、配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％または９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、合成核酸は、配列番号２に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、合成核酸は、配列番号２に対して示されている配列同一性を有し、本明細書に示されている減少したＣｐＧ部位（例えば、０％）および／または本明細書に記載の減少したＧＣ含量（例えば、配列番号６と比べて１０％よりも大きく、または１５％もしくはそれよりも大きく減少した）をさらに有する。
一部の実施形態では、合成核酸は、配列番号４０７に示されるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、合成核酸は、配列番号４０７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％または９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、合成核酸は、配列番号４０７に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、合成核酸は、配列番号４０７に対して示されている配列同一性を有し、本明細書に示されている減少したＣｐＧ部位（例えば、０％）および／または本明細書に記載の減少したＧＣ含量（例えば、配列番号６と比べて１０％よりも大きく、または１５％もしくはそれよりも大きく減少した）をさらに有する。
一部の実施形態では、ＦＫＲＰをコードする合成核酸は、プロモーター（例えば、筋肉特異的プロモーター）をさらに含む。ＦＫＲＰがプロモーターと動作可能に連結していることが好ましい。一実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、Ｓｙｎ１００である。合成核酸に組み入れるための種々の筋肉特異的プロモーター（例えば、合成）が本明細書に記載されている（例えば、表１～４のもの）。一部の実施形態では、配列番号２を含むｒＡＡＶは、筋肉特異的プロモーター、例えばＳｙｎ１００；あるいは、表１～４から選択される合成筋肉特異的プロモーターもしくはその断片、および／もしくはエンハンサー、および／もしくはシス調節エレメント（ＣＲＥ；例えば、表１～４を参照されたい）、またはこれらの任意の組合せ；あるいは、表８～１２から選択される短縮型筋肉特異的プロモーター、もしくはその断片、および／もしくは、シス調節エレメント（ＣＲＥ；例えば、表８～１２を参照されたい）、またはこれらの任意の組合せをさらに含む。一部の実施形態では、配列番号４０７を含むｒＡＡＶは、筋肉特異的プロモーター、例えばＳｙｎ１００；あるいは、表１～４から選択される合成筋肉特異的プロモーターもしくはその断片、および／もしくは、エンハンサー、および／もしくはシス調節エレメント（ＣＲＥ；例えば、表１～４を参照されたい）、またはこれらの任意の組合せ；あるいは、表８～１２から選択される短縮型筋肉特異的プロモーター、もしくはその断片、および／もしくは、シス調節エレメント（ＣＲＥ；例えば、表８～１２を参照されたい）、またはこれらの任意の組合せをさらに含む。
一部の実施形態では、合成核酸は、本明細書に記載の通り、１つまたは複数の追加の調節構成成分および／またはベクター（例えば、ウイルスベクター）の構成成分をさらに含む。一部の実施形態では、追加の調節構成成分は、エンハンサー配列（例えば、ＣＭＶエンハンサー、筋肉クレアチンキナーゼエンハンサー、ミオシン軽鎖エンハンサーなど、およびこれらの組合せ）である。一部の実施形態では、合成核酸は、末端逆位配列などの本明細書に開示される１つまたは複数のＡＡＶゲノムエレメントをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、５’ＡＡＶ ＩＴＲおよび３’ＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。
ＦＫＲＰコード核酸を含むベクター
本発明の別の態様は、本明細書に開示されるＦＫＲＰをコードする合成核酸を含むベクターに関する。そのようなベクターおよびベクターを含む組成物を、合成核酸の作製、ベクターの作製、および細胞（例えば、それを必要とする対象の筋細胞）における機能的ＦＫＲＰのレベルを上昇させるための治療的使用に使用する。種々の実施形態では、核酸を含むベクターは、適宜、核酸と動作可能に連結した調節配列をさらに含む。そのような調節配列の例は本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、ベクター（例えば、ＡＡＶなどのウイルスベクター）は、肝臓における発現を減少させる核酸エレメントをさらに含み得る。代表的な実施形態では、ベクターは、ｍｉｒ１２２結合エレメントをさらに含む。ｍｉｒ１２２配列および肝臓における発現を減少させるためのその使用は、当技術分野において周知である（例えば、Qiao et al, Gene Therapy 18, 403-410 (April 2011) doi:10.1038/gt.2010.157を参照されたい）。
一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの非ウイルスベクターである。非ウイルスベクターの例は本明細書に提示されている。一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
組換えウイルスベクターおよび産生
本発明の一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスである。本発明のウイルスベクターの非限定的な例としては、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、およびキメラウイルスベクターが挙げられる。
当技術分野で公知の任意のウイルスベクターを本発明に使用することができる。そのようなウイルスベクターの例としては、これだけに限定されないが、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ群；Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ群；Ｃａｒｍｏｖｉｒｕｓウイルス群；Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ群；Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ群；Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ黄色斑紋ウイルス群；Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓウイルス群；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ；ＰＭ２ファージ群；Ｃｏｒｃｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ；潜伏ウイルス群；種子伝染性潜伏ウイルス群；Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓウイルス群ファミリー（［ＰＨｇｒ］６ファージ群）；Ｃｙｓｉｏｖｉｒｉｄａｅ；カーネーション輪紋群；Ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓウイルス群；ソラマメウイルト群；Ｆａｂａｖｉｒｕｓウイルス群；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ群；Ｇｅｒｍｉｎｉｖｉｒｕｓ群；Ｇｉａｒｄｉａｖｉｒｕｓ群；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓウイルス群；Ｉｌｌａｒｖｉｒｕｓウイルス群；Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ；Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ群；Ｍａｒａｆｉｖｉｒｕｓウイルス群；トウモロコシ退緑萎縮ウイルス群；Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｎｅｃｒｏｖｉｒｕｓ群；Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓウイルス群；Ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅ；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；パースニップ黄斑ウイルス群；Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ；エンドウひだ葉モザイクウイルス群；Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｒｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ群；Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｈｉｚｉｄｉｏｖｉｒｕｓ群；Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｓｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓ群；ＳＳＶ １型ファージ；Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ；Ｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ群；Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ群；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｕｓ群；Ｔｏｒｏｖｉｒｕｓ群；Ｔｏｔｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｙｍｏｖｉｒｕｓ群；および植物ウイルスサテライトに由来するベクターが挙げられる。
産生されるウイルスベクターは、任意の天然に存在するおよび／もしくは組換えウイルスベクターヌクレオチド配列（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルスなど）またはバリアントのゲノムの一部または全体を含み得る。ウイルスベクターバリアントは、核酸レベルおよびアミノ酸レベルで有意に相同なゲノム配列を有し得、一般に物理的および機能的等価物であるウイルスベクターを生じ、同様の機構によって複製され、かつ、同様の機構によってアセンブルされる。
本明細書に記載のＦＫＲＰ導入遺伝子カセットを含むウイルスベクターは、当技術分野で公知の任意の手段によって産生させることができる。これだけに限定することなく、ウイルス粒子を産生させる方法の１つの例は、（ａ）本明細書に記載の安定な細胞株のいずれか、例えば、ウイルス発現系において誘導性プロモーターの制御下で異種毒性タンパク質の安定発現を有する細胞株を提供するステップ；（ｂ）細胞を、少なくとも１つの毒性タンパク質が発現される条件下で培養するステップであって、少なくとも１つの毒性タンパク質が、少なくとも１つの誘導性プロモーターと動作可能に連結している、ステップ；（ｃ）細胞を、ウイルス粒子が産生される条件下で培養するステップ；および（ｄ）必要に応じて、ウイルス粒子を単離するステップを含む方法である。
組換えウイルスベクターを産生させるためおよび核酸送達のためにウイルスベクターを使用するためのプロトコールは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989)および他の標準の実験マニュアル（例えば、Vectors for Gene Therapy. In: Current Protocols in Human Genetics. John Wiley and Sons, Inc.: 1997）に見いだすことができる。さらに、ＡＡＶベクターの産生は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４４１，２０６号にさらに記載されている。
ウイルス発現系において産生されたウイルスベクターを、任意の標準の技法を使用して放出させる（すなわち、ベクターを産生した細胞から解き放つ）ことができる。例えば、ウイルスベクターを、機械的方法、例えば、マイクロ流体化、遠心分離、もしくは超音波処理、または化学的方法、例えば、溶解緩衝液および洗浄剤によって放出させることができる。次いで、放出されたウイルスベクターを回収（すなわち、収集）し、当技術分野における標準の方法を使用して精製して、純粋な集団を得ることができる。例えば、ウイルスベクターを、それらが放出された緩衝液から、深層濾過または接線流濾過（ＴＦＦ）を使用した清澄化ステップを含む精製方法によって回収することができる。本明細書において実施例に記載の通り、ウイルスベクターを細胞から超音波処理によって放出させ、清澄化された溶解物をカラムクロマトグラフィーを使用して精製することによって回収することができる。
本明細書に記載のウイルス発現系においてウイルスベクターを産生させるために、バリアントウイルスベクター配列を使用することができる。例えば、所与のベクター（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルスなど）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、またはそれよりも大きなヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列同一性を有する１つまたは複数（or more）の配列（例えば、約７５～９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列）。
ウイルス発現系は、本明細書に記載の方法を使用した所与のウイルスベクターの産生の間にそのウイルスベクターを補完するために要求される任意の必要なエレメントを含むようにさらに改変されることが理解されるべきである。例えば、ある特定の実施形態では、核酸カセットを末端反復配列で挟む。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターを産生させるためにＡＡＶ発現系に、組換えＡＡＶプラスミド、Ｒｅｐを発現するプラスミド、Ｃａｐを発現するプラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドのうちの少なくとも１つをさらに含めることになる。所与のウイルスベクターに対する補完的なエレメントは当技術分野で周知であり、当業者は、適宜、本明細書に記載のウイルス発現系を改変することができよう。
ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ発現系）を製造するためのウイルス発現系は、複製（Ｒｅｐ）遺伝子および／またはカプシド（Ｃａｐ）遺伝子を、トランスに、例えば、誘導性プロモーターの制御下でさらに含むことができる。ＲｅｐおよびＣａｐの発現は、これらの遺伝子の発現が一緒に「オン」になるように１つの誘導性プロモーターの制御下に置くこともでき、別個の誘導因子によって「オン」になる２つの別々の誘導性プロモーターの制御下に置くこともできる。ＡＡＶゲノムの左側にはｐ５およびｐ１９と称される２つのプロモーターがあり、これらから長さが異なる２つのオーバーラップしたメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が産生され得る。これらのｍＲＮＡのそれぞれが、イントロンを含有し、それがスプライシングされるか否かであり得、その結果、４つの潜在的なＲｅｐ遺伝子；Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０がもたらされる。Ｒｅｐ遺伝子（特にＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８）は、自己プライミング作用でＩＴＲによって形成されるヘアピンに結合し、ヘアピン内の指定の末端解離部位を切断する。これらはＡＡＶゲノムのＡＡＶＳ１特異的組込みに必要である。４つのＲｅｐタンパク質は全て、ＡＴＰに結合することおよびヘリカーゼ活性を有することが示された。ポジティブセンスＡＡＶゲノムの右側は、３つのカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のオーバーラップする配列をコードし、これはｐ４０と称される１つのプロモーターから始まる。ｃａｐ遺伝子により、アセンブリ活性化タンパク質（Ａｓｓｅｍｂｌｙ－Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＡＰ）と称される追加の非構造タンパク質が産生される。このタンパク質は、ＯＲＦ２から産生され、カプシドアセンブリプロセスに必須である。ＡＡＶベクターを製造するために必要なエレメントは当技術分野で公知であり、例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第ＵＳ５４７８７４５Ａ号；同第ＵＳ５６２２８５６Ａ号；同第ＵＳ５６５８７７６Ａ号；同第ＵＳ６４４０７４２Ｂ１号；同第ＵＳ６６３２６７０Ｂ１号；同第ＵＳ６１５６３０３Ａ号；同第ＵＳ８００７７８０Ｂ２号；同第ＵＳ６５２１２２５Ｂ１号；同第ＵＳ７６２９３２２Ｂ２号；同第ＵＳ６９４３０１９Ｂ２号；同第ＵＳ５８７２００５Ａ号；および米国特許出願第ＵＳ２０１７／０１３０２４５号；同第ＵＳ２００５０２６６５６７Ａ１号；同第ＵＳ２００５０２８７１２２Ａ１号においてさらに概説されている可能性がある。
本明細書に記載の方法を使用してレンチウイルスを製造するためのウイルス発現系は、核酸カセットを挟む長い末端反復（ＬＴＲ）をさらに含むことになる。ＬＴＲは、レトロトランスポゾンまたはレトロウイルスＲＮＡの逆転写によって形成されるプロウイルスＤＮＡのいずれかの末端における、数百回または数千回繰り返される同一のＤＮＡ配列である。ＬＴＲは、レトロウイルスＤＮＡのＬＴＲ特異的インテグラーゼによる宿主染色体への組込みを媒介する。レンチウイルスベクターを製造するためのＬＴＲおよび方法は、例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第ＵＳ７０８３９８１Ｂ２号；同第ＵＳ６２０７４５５Ｂ１号；同第ＵＳ６５５５１０７Ｂ２号；同第ＵＳ８３４９６０６Ｂ２号；同第ＵＳ７２６２０４９Ｂ２号；および米国特許出願第ＵＳ２００７００２５９７０Ａ１号；同第ＵＳ２０１７００６７０７９Ａ１号；同第ＵＳ２０１１００２８６９４Ａ１号にさらに記載されている。
本明細書に記載の方法を使用してアデノウイルスを製造するためのウイルス発現系は、核酸カセットを挟む、およそ９０～１４０塩基対（正確な長さは血清型に依存する）の同一の末端逆位配列（ＩＴＲ）をさらに含むことになる。ウイルス複製開始点はＩＴＲ内の正確にゲノムの最後にある。アデノウイルスゲノムは、およそ３６０００塩基対の直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子である。多くの場合、遺伝子治療に使用されるアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域に欠失を有し、そこに新規の遺伝情報を導入することができる；Ｅ１欠失により、組換えウイルスが複製欠損性になる。アデノウイルスベクターを製造するためのＩＴＲおよび方法は、例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第ＵＳ７５１０８７５Ｂ２号；同第ＵＳ７８２０４４０Ｂ２号；同第ＵＳ７７４９４９３Ｂ２号；同第ＵＳ７８２０４４０Ｂ２号；同第ＵＳ１００４１０４９Ｂ２号；国際特許出願第ＷＯ２００００７００７１Ａ１号；および米国特許出願第ＷＯ２００００７００７１Ａ１号；同第ＵＳ２００３００２２３５６Ａ１号；同第ＵＳ２００８００５０７７０Ａ１号にさらに記載されている。
一実施形態では、ウイルス発現系は、ウイルス、哺乳動物細胞または昆虫細胞などの宿主細胞であり得る。例示的な昆虫細胞としては、これだけに限定されないが、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉ－５、およびＳ２昆虫細胞株が挙げられる。例えば、ＡＡＶベクターを製造するためのウイルス発現系は、例えば、ウイルス発現系が昆虫細胞である場合、バキュロウイルス発現系をさらに含み得る。バキュロウイルス発現系は、バキュロウイルス感染昆虫細胞からの効率的な大規模ウイルス産生および組換えタンパク質の発現のために設計される。バキュロウイルス発現系は、例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第ＵＳ６９１９０８５Ｂ２号；同第ＵＳ６２２５０６０Ｂ１号；同第ＵＳ５１９４３７６Ａ号にさらに記載されている。
別の実施形態では、ウイルス発現系は、無細胞系である。ウイルスベクター産生のための無細胞系は、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Cerqueira A., et al. Journal of Virology, 2016；Sheng J., et al. The Royal Society of Chemistry, 2017；およびSvitkin Y.V., and Sonenberg N. Journal of Virology, 2003にさらに記載されている。一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸配列は、少なくとも１つのＤＤ－ＩＴＲを含む非ウイルスＤＮＡ構築物によって送達される。ＷＯ２０１９／２４６５５４に記載されている非ウイルスＤＮＡ構築物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ｒＡＡＶベクターおよび産生
本発明の態様は、本明細書に記載のＦＫＲＰをコードする合成核酸を含む組換えＡＡＶベクターに関する。一実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター（ｒＡＡＶビリオンとも称される）は、カプシドタンパク質、およびカプシドタンパク質内のｒＡＡＶゲノムを含む。本明細書に記載のベクターおよび方法に使用されるｒＡＡＶビリオンのｒＡＡＶカプシドは、表６に列挙されているもののいずれか、またはそれらの任意の組合せである。一実施形態では、本発明のｒＡＡＶは、表６に記載のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質由来のカプシドタンパク質配列を少なくとも１つ含む。
表6: AAV血清型および例示的な公開された対応するカプシド配列
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表７に、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターおよびそれを産生させるための方法においてＡＡＶカプシドとして、または現在既知のもしくは後に同定される野生型カプシドタンパク質および／または他のキメラもしくはバリアントカプシドタンパク質との任意の組合せで使用することができる、例示的なキメラまたはバリアントカプシドタンパク質を記載する；表７に記載の参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、９，０１２，２２４およびＵＳ７，８９２，８０９に開示されるキメラベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、表７に列挙されているキメラまたはバリアントカプシドからのカプシドを少なくとも１つ含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２２７２５に開示される倍数体ｒＡＡＶベクターである、または、例えば、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年７月３１日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４４６３２および米国特許第１０，５５０，４０５号に開示される合理的倍数体（または一倍体）ｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，０１２，２２４号およびＷＯ２０１７／１０６２３６に開示されるｒＡＡＶ３ベクターである。
表7:例示的なキメラおよびrAAVバリアントカプシド
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一実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、本発明のＡＡＶカプシドに現在既知のまたは後に同定される野生型カプシドタンパク質および／または他のキメラもしくはバリアントカプシドタンパク質との任意の組合せで組み入れることができるキメラまたはバリアントカプシドタンパク質が記載されているＵＳＰＴＯ発行特許および公開出願のファイルラッパーに列挙されている以下の生物学的配列ファイルのいずれかに関連するカプシドタンパク質を含む（実証目的のため、１１４８６２５４は、米国特許出願第１１／４８６，２５４号に対応し、他の生物学的配列ファイルも同様に読まれるべきである）：１１４８６２５４．ｒａｗ、１１９３２０１７．ｒａｗ、１２１７２１２１．ｒａｗ、１２３０２２０６．ｒａｗ、１２３０８９５９．ｒａｗ、１２６７９１４４．ｒａｗ、１３０３６３４３．ｒａｗ、１３１２１５３２．ｒａｗ、１３１７２９１５．ｒａｗ、１３５８３９２０．ｒａｗ、１３６６８１２０．ｒａｗ、１３６７３３５１．ｒａｗ、１３６７９６８４．ｒａｗ、１４００６９５４．ｒａｗ、１４１４９９５３．ｒａｗ、１４１９２１０１．ｒａｗ、１４１９４５３８．ｒａｗ、１４２２５８２１．ｒａｗ、１４４６８１０８．ｒａｗ、１４５１６５４４．ｒａｗ、１４６０３４６９．ｒａｗ、１４６８０８３６．ｒａｗ、１４６９５６４４．ｒａｗ、１４８７８７０３．ｒａｗ、１４９５６９３４．ｒａｗ、１５１９１３５７．ｒａｗ、１５２８４１６４．ｒａｗ、１５３６８５７０．ｒａｗ、１５３７１１８８．ｒａｗ、１５４９３７４４．ｒａｗ、１５５０３１２０．ｒａｗ、１５６６０９０６．ｒａｗ、および１５６７５６７７．ｒａｗ。
ある実施形態では、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質およびウイルスカプシドは、例えば、参照により組み込まれる国際特許公開第ＷＯ００／２８００４号に記載されている通り、別のウイルス、必要に応じて、別のパルボウイルスまたはＡＡＶ由来のカプシドサブユニットの全部または一部を含み得るという点で、キメラであり得る。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７８４，７９９号に記載されている一本鎖または単量体二重鎖である。
さらなる実施形態として、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質およびウイルスカプシドは、参照により組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１８／２２７２５に記載されている通り、単一のＡＡＶカプシド内に異なる組合せのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ ＡＡＶ血清型を含み得るという点で、倍数体（一倍体とも称される）であり得る。
一実施形態では、カプシドは任意のカプシドであってもよいが、筋肉向性カプシド、例えば、優先的に骨格筋特異的および／または心筋特異的になるように設計された合理的一倍体カプシドであることが好ましい。
一実施形態では、細菌配列を欠くｒＡＡＶを製造するために使用される核酸は、配列番号４０６に示されるヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、細菌配列を欠くｒＡＡＶを製造するために使用される核酸は、配列番号４０６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％または９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、本発明のｒＡＡＶを、例えば、図１３に示されている通り、プラスミドＤＮＡ鋳型から製造する。一部の実施形態では、本発明のｒＡＡＶを、例えば、配列番号４０６に示されている通り、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡから製造する。
本発明において有用なｒＡＡＶベクターゲノムは、細胞へのそれらの導入を容易にするために、（１）発現させる異種配列（一実施形態では、ＦＫＲＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）ならびに（２）異種遺伝子の組込みおよび発現を容易にするウイルス配列エレメントを含む、組換え核酸構築物である。ウイルス配列エレメントは、ＤＮＡの複製およびＡＡＶカプシドへのパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のためにシスで必要とされる、ＡＡＶベクターゲノムの配列を含み得る。
最適化されたｒＡＡＶベクターゲノム
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、最適化されたｒＡＡＶベクターゲノムを、プロモーター、ＩＴＲ、ポリＡ尾部、異種遺伝子の発現を増加または減少させることが可能なエレメント、ならびに一実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＦＫＲＰの発現のためにコドン最適化された核酸配列、および必要に応じて、免疫原性を減少させるための１つまたは複数のエレメントをコードする核酸配列を含め、本明細書に開示されるエレメントのいずれかから、および任意の組合せで創製する。そのような最適化されたｒＡＡＶベクターゲノムを、ｒＡＡＶベクターゲノムを形質導入し、発現させる組織および細胞、例えば骨格筋および心筋に対する向性を有する任意のＡＡＶカプシドと共に使用することができる。
組換えＡＡＶベクター産生
本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターは、当技術分野で公知の任意の方法によって産生させることができる。これだけに限定することなく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を産生させるためのそのような方法の１つの例は、（ａ）本明細書に記載の安定な細胞のいずれか、例えば、ＡＡＶ発現系において、誘導性プロモーターの制御下で、ＡＡＶベクター産生のために必要な少なくとも１つの異種毒性タンパク質、例えばｒｅｐまたはｃａｐなどの安定発現を有する細胞株を提供するステップ、（ｂ）細胞を、少なくとも１つの毒性タンパク質が発現される条件下で培養するステップ、（ｃ）細胞を、ＡＡＶ粒子が産生される条件下で培養するステップ、および（ｄ）必要に応じて、ＡＡＶ粒子を単離するステップ、を含む。
一実施形態では、細胞を、ＡＡＶ粒子が産生される条件下で培養するステップを、毒性タンパク質が十分に発現された後にのみ行う。例えば、細胞を誘導因子と接触させてからまたは適切な誘導条件を細胞に適用してから少なくとも１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、１５時間後、１６時間後、１７時間後、１８時間後、１９時間後、２０時間後、２１時間後、２２時間後、２３時間後、２４時間後、２５時間後、２６時間後、２７時間後、２８時間後、２９時間後、３０時間後、３１時間後、３２時間後、３３時間後、３４時間後、３５時間後、３６時間後、３７時間後、３８時間後、３９時間後、４０時間後、４１時間後、４２時間後、４３時間後、４４時間後、４５時間後、４６時間後、４７時間後、４８時間後またはそれよりも後。本明細書で使用される場合、「十分な発現」は、適当な機能のために必要なタンパク質の発現レベル、例えば、細胞において複製を誘導するために必要なｒｅｐタンパク質のレベルを指す。
細胞が、１つよりも多くの別個の誘導性プロモーターを含む場合、その１つよりも多くの誘導性プロモーターを、タンパク質の発現を実質的に同じ時間（same time）に、または異なる時間に駆動するように、誘導することができる。あるいは、細胞が１つよりも多くの別個の誘導性プロモーターを含む場合、その１つよりも多くの誘導性プロモーターを、誘導されるタンパク質の発現を同じ期間にわたって、または異なる期間にわたって駆動するように、誘導することができる。一実施形態では、細胞を、少なくとも２種の誘導因子と共に、実質的に同じ時間に、同じ持続時間にわたって培養する。一実施形態では、第１の誘導因子との培養を行っている最中に第２の誘導因子との培養を開始し、したがって、培養期間が重複する。これは、本明細書では、時には、「同時培養」または「並行培養」と称される。他の実施形態では、第１の誘導因子との培養を第２の誘導因子との培養を開始する前に終了する。培養を実質的に同じ時間にまたは同時に行う場合、第１の誘導因子および第２の誘導因子を、同じ培養培地中に提供することができる。あるいは、培養を実質的に同じ時間にまたは同時に行う場合、第１の誘導因子および第２の誘導因子を異なる培養培地に提供することができる。
一実施形態では、細胞を懸濁液中で培養する。別の実施形態では、細胞を、動物成分を含まない条件で培養する。動物成分を含まない培地は、所与の細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞に適合する任意の動物成分を含まない培地（例えば、無血清培地）であってもよい。例としては、これだけに限定することなく、ＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ－２９３（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｅｘ－Ｃｅｌｌ ２９３（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬＣ－ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＰｒｏ２９３－Ｓ（Ｌｏｎｚａ）が挙げられる。
ＡＡＶ粒子の複製およびパッケージングに十分な条件は、例えば、ＡＡＶ鋳型の複製およびＡＡＶカプシドへのカプシド形成に十分なＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ配列およびＡＡＶ ｃａｐ配列）ならびにアデノウイルスおよび／またはヘルペスウイルス由来のヘルパー配列が存在することであり得る。特定の実施形態では、ＡＡＶ鋳型は、異種核酸配列に対して５’側および３’側に配置される２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むが、異種核酸配列と直接隣接している必要はない。
一部の実施形態では、ＡＡＶ鋳型は、国際特許公開ＷＯ０１／９２５５１号および米国特許第８，７８４，７９９号に記載されている通り、Ｒｅｐによって分解されずに二重鎖ＡＡＶベクターを生じるＩＴＲを含む。
ＡＡＶ鋳型ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされるＡＡＶ鋳型を含むウイルスベクターが細胞において産生される条件下で提供される。方法は、培養物からウイルスベクターを収集するステップをさらに含み得る。一実施形態では、例えば、細胞を培養培地から取り出した後に細胞を溶解させることによって、例えば、細胞をペレット化することによって、ウイルスベクターを収集することができる。別の実施形態では、例えば、細胞から分泌されるベクターを単離するために、細胞が培養されている培地からウイルスベクターを収集することができる。ｒＡＡＶを収集するために、培地の一部または全部を、培養物から、例えば、トランスフェクションの約４８時間後から開始して１回または１回よりも多く、例えば、培養ステップの間に規則的な間隔で取り出すことができる（例えば、１２時間ごと、１８時間ごと、２４時間ごと、もしくは３６時間ごと、または細胞生存率およびベクター産生に適合するより長い延長時間）。培地を取り出した後、追加の栄養分を補充したまたは補充していない新鮮な培地を培養物に添加することができる。一実施形態では、細胞を灌流系で培養することができ、したがって、培地が絶えず細胞上を流れ、また、分泌されたｒＡＡＶが単離のために収集される。培地からのｒＡＡＶの収集を、トランスフェクトされた細胞が生存可能なままである限り、例えば、トランスフェクション後４８時間、７２時間、９６時間、もしくは１２０時間もしくはより長い時間にわたって、または毒性タンパク質を発現させるために誘導性プロモーターを使用する場合には、例えば、誘導後４８時間、７２時間、９６時間、もしくは１２０時間もしくはそれよりも長い時間にわたって、継続することができる。ある特定の実施形態では、分泌されたｒＡＡＶの収集を、産生細胞に結合しないまたは緩くしか結合しない血清型のＡＡＶ（ＡＡＶ８およびＡＡＶ９など）を用いて行う。他の実施形態では、分泌されたｒＡＡＶの収集を、それらが産生された細胞に結合しないように改変された、ヘパリンに結合する血清型のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）を用いて行う。適切な改変、およびｒＡＡＶ収集技法の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９／０２７５１０７号に開示されている。
安定な細胞株がｒｅｐまたはｃａｐを安定にまたは一過性に発現しない場合には、これらの配列をＡＡＶ発現系に提供すべきである。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、当技術分野で公知の任意の方法によって提供することができる。現行のプロトコールでは、典型的には、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を単一のプラスミド上で発現させる。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列を一緒に提供する必要はないが、そうした方が都合がよい場合がある。ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列を任意のウイルスまたは非ウイルスベクターによって提供することができる。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列をハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供することができる（例えば、欠失アデノウイルスベクターのＥｌａまたはＥ３領域に挿入する）。ＥＢＶベクターを用いてＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現させることもできる。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターはエピソーム性であり、連続的な細胞分裂全体を通してなお高いコピー数を維持する（すなわち、細胞に「ＥＢＶに基づく核エピソーム」と称される染色体外エレメントとして安定に組み込まれる（arc stably integrated）、Margolski, Curr. Top. Microbial. Immun. 158:67 (1992)を参照されたい）。
典型的には、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージング維持を防止するために、ＴＲで挟まれない。
ＡＡＶ鋳型を細胞に当技術分野で公知の任意の方法を使用して提供することができる。例えば、鋳型を非ウイルス（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給することができる。特定の実施形態では、ＡＡＶ鋳型をヘルペスウイルスまたはアデノウイルスベクターによって供給する（例えば、欠失アデノウイルスのＥｌａまたはＥ３領域に挿入する）。別の例示として、Palombo et al., J. Virol. 72:5025 (1998)には、ＡＡＶ ＴＲによって挟まれたレポーター遺伝子を有するバキュロウイルスベクターが記載されている。ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上記の通り、ＥＢＶベクターを用いて鋳型を送達することもできる。
別の代表的な実施形態では、ｒＡＡＶウイルスを複製することによってＡＡＶ鋳型を提供する。さらに他の実施形態では、ＡＡＶ鋳型を含むＡＡＶプロウイルスを、細胞の染色体に安定に組み込む。
ウイルス力価を増強するために、産生性ＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を細胞に提供することができる。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野で公知である。典型的には、これらの配列を、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供する。あるいは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列を、別の非ウイルスまたはウイルスベクターによって、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ferrari et al., Nature Med. 3:1295 (1997)、ならびに米国特許第６，０４０，１８３号および同第６，０９３，５７０号に記載されている通り、効率的なＡＡＶ産生を促進するヘルパー遺伝子を全て有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして提供することができる。
さらに、ヘルパーウイルス機能を、染色体に埋め込まれたまたは安定な染色体外エレメントとして維持されるヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供することができる。一般に、例えば、ＴＲに挟まれていないヘルパーウイルス配列をＡＡＶビリオンにパッケージングすることはできない。
ＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ配列ならびにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を単一のヘルパー構築物上で提供することが有利であり得ることが、当業者には理解されよう。一実施形態では、単一のヘルパー構築物によってコードされる少なくとも１つの遺伝子産物の発現を、誘導性プロモーターによって制御する。このヘルパー構築物は、非ウイルス構築物であってもウイルス構築物であってもよい。１つの非限定的な例示として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであってもよい。
特定の一実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列ならびにアデノウイルスヘルパー配列を、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供する。このベクターは、ＡＡＶ鋳型をさらに含み得る。ＡＡＶ ｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ配列ならびに／またはＡＡＶ鋳型をアデノウイルスの欠失領域（例えば、Ｅ１ａまたはＥ３領域）に挿入することができる。一実施形態では、ＡＡＶ鋳型によってコードされる少なくとも１つの遺伝子産物の発現を、誘導性プロモーターによって制御する。
さらなる実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列ならびにアデノウイルスヘルパー配列を、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給する。この実施形態によると、ＡＡＶ鋳型をプラスミド鋳型として提供することができる。
別の例示的な実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列ならびにアデノウイルスヘルパー配列を、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供し、ＡＡＶ鋳型を細胞にプロウイルスとして組み込む。あるいは、ＡＡＶ鋳型を、細胞内に染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶに基づく核エピソームとして）維持されるＥＢＶベクターによって提供する。
本明細書に記載の誘導性および抑制性プロモーターの使用は、ウイルスベクター産生に必要な任意の毒性タンパク質、例えば、ｒｅｐおよびｃａｐの一時的調節を達成するために使用することができる。一実施形態では、誘導性および／または抑制性プロモーターにより、毒性タンパク質の発現の綿密な微調整がもたらされ、したがって、産生中の所望のタイミングで所望の発現レベルが実現されるように、発現の開始および停止を調整することができる。
さらなる例示的な実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列ならびにアデノウイルスヘルパー配列を、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供する。ＡＡＶ鋳型を、別々の複製ウイルスベクターとして提供することができる。例えば、ＡＡＶ鋳型を、ＡＡＶ粒子または第２の組換えアデノウイルス粒子によって提供することができる。
前記の方法によると、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、典型的には、アデノウイルスの複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス５’および３’シス配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列、ならびに、存在する場合にはＡＡＶ鋳型をアデノウイルス骨格に埋め込み、５’および３’シス配列で挟み、したがって、これらの配列をアデノウイルスカプシドにパッケージングすることができる。上記の通り、アデノウイルスヘルパー配列ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、一般に、ＴＲで挟まれず、したがって、これらの配列は、ＡＡＶビリオンにパッケージングされない。Zhang et al., Gene Ther. 18:704 ((2001))には、アデノウイルスならびにＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の両方を含むキメラヘルパーが記載されている。
ヘルペスウイルスをＡＡＶパッケージング法においてヘルパーウイルスとして使用することもできる。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（複数可）をコードするハイブリッドヘルペスウイルスにより、スケーラブルなＡＡＶベクター産生スキームを有利に容易にすることができる。ＡＡＶ－２ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ－１）ベクターが記載されている（Conway et al., Gene Ther. 6:986 (1999)およびＷＯ００／１７３７７）。
ヘルパーウイルスの夾雑を伴わないＡＡＶベクターストックを、当技術分野で公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、ＡＡＶとヘルパーウイルスをサイズに基づいて容易に区別することができる。ＡＡＶをヘパリン基質に対する親和性に基づいてヘルパーウイルスから分離することもできる（Zolotukhin et al. Gene Ther. 6:973 (1999)）。欠失を有する複製欠損ヘルパーウイルスを使用することができ、したがって、いかなる夾雑ヘルパーウイルスも複製コンピテントではない。さらなる代替として、ＡＡＶのパッケージングを媒介するために必要なのはアデノウイルス初期遺伝子発現のみであるので、後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスヘルパーを用いることができる。後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルス変異体は、当技術分野で公知である（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス変異体）。
種々の実施形態では、本発明のＡＡＶウイルスベクターを産生させる方法は、完全にスケーラブルであり、したがって、任意の所望の体積の培養培地、例えば、１０ｍｌ（例えば、シェーカーフラスコ中）から１０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、またはそれよりも大きな体積まで（例えば、ウェーブバイオリアクター系および撹拌槽などのバイオリアクター中）で実施することができる。一実施形態では、閉端直鎖状二重鎖核酸を使用してｒＡＡＶを産生させる。他の実施形態では、他の形態の核酸、例えばプラスミドＤＮＡを使用してｒＡＡＶを産生させる。
方法は、ＡＡＶの全ての血清型およびキメラ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、および任意のそのキメラの産生に適する。
ある特定の実施形態では、方法により、精製前に細胞当たり少なくとも約１×１０４個のベクターゲノム含有粒子、例えば、精製前に細胞当たり少なくとも約２×１０４、３×１０４個、４×１０４個、５×１０４個、６×１０４個、７×１０４個、８×１０４個、９×１０４個、もしくは１×１０５個またはそれよりも多くのベクターゲノム含有粒子がもたらされる。他の実施形態では、方法により、細胞培養物１リットル当たり少なくとも約１×１０１２個の精製されたベクターゲノム含有粒子、例えば、細胞培養物１リットル当たり少なくとも約５×１０１２個、１×１０１３個、５×１０１３個、もしくは１×１０１４個またはそれよりも多くの精製されたベクターゲノム含有粒子がもたらされる。
ｒＡＡＶゲノムエレメント
本明細書に開示される通り、本発明の態様は、ＦＫＲＰをコードする合成核酸を含むｒＡＡＶベクターに関する。ｒＡＡＶベクターは、カプシドを含み、そのカプシド内に、「ｒＡＡＶベクターゲノム」と称されるヌクレオチド配列を含む。ｒＡＡＶベクターゲノム（「ｒＡＡＶゲノム」とも称される）は、これだけに限定されないが、２つの末端逆位配列（ＩＴＲ、例えば、５’－ＩＴＲおよび３’－ＩＴＲ）を含めた複数のエレメントを含む。典型的には、ＩＴＲの間に、以下のうちの１つまたは複数を含む追加のエレメントを配置する：ＦＫＲＰをコードする合成核酸（異種遺伝子として）と動作可能に連結したプロモーター（例えば、筋肉特異的プロモーター）、および合成核酸と動作可能に連結したポリＡシグナル配列。典型的には、ポリＡシグナル配列を、コード配列の下流に機能的に配置する。一部の実施形態では、ポリＡシグナルは、配列番号５に示される核酸配列を有する。使用することができる他のポリＡシグナル配列としては、限定することなく、ｂＧＨ、ｈＧＨ、ＳＶ４０初期、ＳＶ４０後期、合成ポリＡ、ｒＢＧポリＡ、ＴＫポリＡ、ウシ成長ホルモン、ウサギβ－グロビン、およびＳＶ４０ポリＡシグナルが挙げられる。ポリＡシグナル配列のさらなる例は本明細書に提示されている。
一部の実施形態では、異種核酸配列は、イントロン配列およびポリＡシグナル配列などの１つまたは複数の追加のエレメント（例えば、調節エレメント、スペーサーエレメント）をさらに含み得る。一部の実施形態では、イントロン配列は、プロモーターとＦＫＲＰをコードする核酸との間に位置し、発現（例えば、対象における）が容易になるように動作可能に置かれている。一部の実施形態では、イントロン配列は、ＶＨ４－Ｉｇ－イントロン３（配列番号４）である。他の可能性のあるイントロン配列の例としては、限定することなく、キメラプロメガイントロン、ｃｍｖイントロン、キメラニワトリベータアクチン－ヒトグロビンイントロン、ｍｖｍイントロン、ヒトｕｂＢイントロン、ヒトＵｂＣイントロン、ヒトベータグロビンＩＶＳ２が挙げられる。追加のイントロン配列は本明細書に提示されている。
ここでｒＡＡＶゲノムのエレメントのそれぞれを考察する。
イントロン配列
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ遺伝子型は、プロモーター配列の３’側に配置されるイントロン配列を含む。イントロン配列は、以下のうちの１つまたは複数を増加させる機能を果たす：ｍＲＮＡ安定性、ｍＲＮＡの核外輸送および／または発現および／または発現されるＦＫＲＰタンパク質産物の調節。機能性を実質的に保存しながらイントロンのヌクレオチド配列を改変するまたは適合させることができることが、当業者には理解されよう。そのようなイントロン配列の誘導体も、本明細書に記載の本発明の種々の実施形態に包含される。
一部の実施形態では、イントロン配列は、ＭＶＭイントロン配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列である。
一部の実施形態では、イントロン配列は、ＨＢＢ２イントロン配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列である。
一部の実施形態では、イントロン配列は、ヒトベータグロビンｂ２（またはＨＢＢ２）イントロン、ＦＩＸイントロン、ニワトリベータ－グロビンイントロン、およびＳＶ４０イントロンからなる群から選択される。一部の実施形態では、イントロンは、必要に応じて、改変イントロン、例えば、改変ＨＢＢ２イントロン（例えば、ＷＯ２０１８０４６７７４Ａ１の配列番号１７を参照されたい）：改変ＦＩＸイントロン（例えば、ＷＯ２０１８０４６７７４Ａ１の配列番号１９を参照されたい）、または改変ニワトリベータ－グロビンイントロン（例えば、ＷＯ２０１８０４６７７４Ａ１の配列番号２１を参照されたい）、またはその内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／１６２３０２に開示されている改変ＨＢＢ２もしくはＦＩＸイントロンである。
ポリＡシグナル配列
一部の実施形態では、ＦＫＲＰをコードする合成核酸を含有するｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのポリＡシグナル配列を含む。典型的には、そのような配列は、コード配列に対して３’側および下流に配置される。一部の実施形態では、スペーサー配列は、コード配列とポリＡシグナル配列との間に配置される。一部の実施形態では、ポリＡシグナルは、本明細書で定義されている安定性配列またはＣＳ配列に対して３’側にある。これだけに限定されないが、ｈＧＨポリＡ、ｓｙｎｐＡポリＡなど（例えば、配列番号５）を含めた任意のポリＡシグナル配列を使用することができる。一部の実施形態では、ポリＡは、合成ポリＡシグナル配列である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、２つのポリＡシグナル配列、例えば、配列番号５および別のポリＡ配列を含み、２つのポリＡシグナル配列間にスペーサー核酸配列が配置される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、ＦＫＲＰをコードする核酸に対して３’側、またはあるいは、ＣＳ配列に対して３’側に、以下のエレメントを含む；第１のポリＡシグナル配列、スペーサー核酸配列（１００～４００ｂｐ、または約２５０ｂｐ）、第２のポリＡシグナル配列、スペーサー核酸配列、および３’ＩＴＲ。一部の実施形態では、第１のポリＡ配列および第２のポリＡ配列は配列番号５であり、一部の実施形態では、第１のポリＡ配列および第２のポリＡ配列は合成ポリＡ配列である。一部の実施形態では、第１のポリＡ配列は配列番号５であり、第２のポリＡ配列は、合成配列である、または逆もまた同じである － すなわち、代替の実施形態では、第１のポリＡ配列は合成ポリＡ配列であり、第２のポリＡ配列は配列番号５である。例示的なポリＡシグナル配列は、例えば、配列番号５、または配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド配列同一性を有するポリＡシグナル配列である。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムから転写されるＦＫＲＰ ＲＮＡ転写物が安定化されるように、ポリＡ尾部を操作する。代替の実施形態では、ＲＮＡ転写物に不安定化させるエレメントが含まれるようにポリＡシグナル配列を操作することができる。
ある実施形態では、ポリＡ尾部の長さを変更することにより、ポリＡシグナル配列によって不安定化エレメントを操作することができる。ある実施形態では、ポリＡ尾部を延長または短縮することができる。さらなる実施形態では、ＦＫＲＰの発現レベルを変更するまたは産生される最終ポリペプチドを変更するために、ＦＫＲＰコード配列とポリＡ配列との間に存在する３’非翻訳領域を延長または短縮することができる。
別の実施形態では、不安定化エレメントは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり、ｍｉＲＮＡが結合する、異種遺伝子をコードするＲＮＡ転写物をサイレンシングする（翻訳を抑止するおよび分解を促進する）能力を有する。ＦＫＲＰ導入遺伝子の発現のモジュレーションは、ポリＡ尾部内の、ｍｉＲＮＡが結合するシード領域を改変する、付加するまたは欠失させることによって行うことができる。ある実施形態では、ポリＡ尾部内のシード領域の付加または欠失により、ＦＫＲＰの発現を増加または低減させることができる。さらなる実施形態では、シード領域の付加または欠失に起因するそのような発現の増加または低減は、ｒＡＡＶベクターゲノムを含有するＡＡＶによって形質導入される細胞型に依存する。例えば、筋細胞および心臓細胞において発現されるが、肝細胞では見いだされないｍｉＲＮＡに特異的なシード領域を使用して、肝細胞においてＦＫＲＰを産生させるが、筋細胞または心臓細胞ではＦＫＲＰを産生させないようにすることができる。
別の実施形態では、シード領域を、ＦＫＲＰ導入遺伝子とポリＡ尾部との間に配置される３’非翻訳領域内に操作して入れることもできる。さらなる実施形態では、不安定化因子はｓｉＲＮＡであり得る。ｓｉＲＮＡのコード領域をｒＡＡＶベクターゲノムに含めることができ、一般に、ポリＡ尾部に対して下流、３’側に配置する。ある実施形態では、ｓｉＲＮＡのコード領域をｒＡＡＶカセットに、例えば、ポリＡ配列に対して下流、３’側に含めることによってＦＫＲＰ導入遺伝子の発現を行うことができる。さらなる実施形態では、ＦＫＲＰ導入遺伝子の発現が望まれない組織ではｓｉＲＮＡがサイレンシングされ、ＦＫＲＰ導入遺伝子の発現が望まれる組織ではｓｉＲＮＡ発現が生じないように、ｓｉＲＮＡの発現を誘導するためのプロモーターを組織特異的なものにすることができる。
スペーサーエレメント
一部の実施形態では、１つまたは複数のスペーサーエレメントまたは配列を、ＡＡＶゲノム配列内に配置する。一部の実施形態では、スペーサーエレメントは、少なくとも１アミノ酸のスペーサーをコードする核酸を１つまたは複数含む。一部の実施形態では、スペーサーエレメント（複数可）は、いかなるアミノ酸もコードする機能を果たさない。
本明細書に開示される方法および組成物の全ての態様では、ｒＡＡＶゲノムは、本明細書に記載の種々の構成成分の間に配置される１つまたは複数のスタッファーまたはスペーサーＤＮＡ核酸配列も含み得る（図１３および１９参照）。一部の実施形態では、スペーサー配列を５’ＩＴＲとプロモーターとの間に配置する（例えば、配列番号９）。一部の実施形態では、スペーサー配列をプロモーターとイントロンとの間に配置する（例えば、配列番号１０）。一部の実施形態では、スペーサー配列をイントロンとＦＫＲＰコード配列との間に配置する（例えば、配列番号１１）。一部の実施形態では、スペーサー配列をＦＫＲＰコード配列とポリＡシグナル配列との間に配置する（例えば、配列番号１２）。一部の実施形態では、スペーサー配列をポリＡシグナル配列と３’ＩＴＲとの間に配置する（例えば、配列番号１３）。例示的なスタッファーＤＮＡ配列は、配列番号１３またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列である。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、スタッファー核酸断片は、２０～５０ｂｐ、５０～１００ｂｐ、１００～２００ｂｐ、２００～３００ｂｐ、３００～５００ｂｐ、または２０～５００ｂｐの間の任意の整数である。例示的なスタッファー（またはスペーサー）核酸配列は、配列番号９～１３またはそれらと少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一の核酸配列を含む。
スタッファー配列を、ポリＡシグナル配列に対して３’側に配置することができ、かつ、例えば、３’ＩＴＲ配列に対して５’側に配置する。一部の実施形態では、スタッファーＤＮＡ配列は、合成ポリアデニル化シグナルを逆向きに含む。一部の実施形態では、スタッファー核酸配列（「スペーサー」核酸断片とも称される、図１３および１９参照）をポリＡ配列と３’ＩＴＲとの間に配置することができる（すなわち、スタッファー核酸配列をポリＡ配列に対して３’側かつ３’ＩＴＲに対して５’側に配置する）（例えば、図８～１０を参照されたい）。そのようなスタッファー核酸配列は、約３０ｂｐ、５０ｐｂ、７５ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐであり得るまたは３００ｂｐより長いものであり得る。
ＡＡＶ ＩＴＲ
本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムは、望ましい特徴を有し、ＩＴＲが組み入れられるベクターの活性、およびそれに対する細胞応答がモジュレートされるように設計することができる、ＡＡＶ ＩＴＲを含む。別の実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４４７，４３３号に記載されているものを含めた、望ましい特徴を有し、１つまたは２つの合成ＩＴＲを含むベクターの活性およびそれに対する細胞応答がマニピュレートされるように設計することができる、合成ＡＡＶ ＩＴＲである。一部の実施形態では、ＩＴＲの１つは、以下にさらに考察される自己相補的ＡＡＶベクターの形成を可能にする変異を有する。一部の実施形態では、本発明のｒＡＡＶは、全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願第ＷＯ２００１０９２５５１号；米国特許第ＵＳ７４６５５８３号、同第ＵＳ７７９０１５４号、同第ＵＳ８３６１４５７号、同第ＵＳ８７８４７９９号に開示されている自己相補的ゲノムを含む。
本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムに使用するためのＡＡＶ ＩＴＲは、特定の適用に適した任意の血清型のものであってもよい。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムはＡＡＶ ＩＴＲに挟まれている。一部の実施形態では、ＩＴＲは、全長ＩＴＲ配列、ＣｐＧ部位／モチーフ／アイランドを含む配列が除去されたＩＴＲ、ＣｐＧ配列を含む配列が付加されたＩＴＲ、トランケートされたＩＴＲ配列、ＩＴＲ内に１つもしくは複数の欠失を有するＩＴＲ配列、ＩＴＲ内に１つもしくは複数の付加を有するＩＴＲ配列、または、一緒に連結してハイブリッドＩＴＲを形成する上記ＩＴＲの任意の部分を含む組合せを含む。
長期にわたる発現を容易にするために、ある実施形態では、ＦＫＲＰをコードする合成核酸をＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）（例えば、第１のまたは５’ＡＡＶ ＩＴＲと第２の３’ＡＡＶ ＩＴＲ）の間に挿入する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＷＴ ｒＡＡＶベクターゲノムの両末端に見いだされ、ＤＮＡ複製の開始点およびプライマーとしての機能を果たす。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＤＮＡ複製のため、および原核生物プラスミドからのレスキューまたは削除のためにシスで必要である。ある実施形態では、ｒＡＡＶゲノムの核酸内に含有されるＡＡＶ ＩＴＲ配列は、任意のＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、３ｂ、４、５、６、７、８、９、および１０、表６に示されている任意の血清型）に由来するものであってもよく、２つまたはそれよりも多くのＡＡＶ血清型の一部を組み合わせてＩＴＲを構築することを含め、１つよりも多くの血清型に由来するものであってもよい。ある実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムを含めたｒＡＡＶベクターに使用するために、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、ＷＴまたは操作されたＩＴＲの、パッケージングおよび複製に必要な最小部分を少なくとも含むべきである。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含み、ここで、前記ＩＴＲは、（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ結合エレメント；（ｂ）ＡＡＶ末端解離配列；および（ｃ）ＡＡＶ ＲＢＥ（Ｒｅｐ結合エレメント）を含む、それから本質的になる、またはそれからなる；前記ＩＴＲは、いかなる他のＡＡＶ ＩＴＲ配列も含まない。別の実施形態では、エレメント（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、ＡＡＶ２ ＩＴＲに由来するものであり、ＩＴＲはいかなる他のＡＡＶ２ ＩＴＲ配列も含まない。さらなる実施形態では、エレメント（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、これだけに限定されないが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９を含めた任意のＡＡＶ ＩＴＲに由来するものである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つの合成ＩＴＲを含み、それらは同じであっても異なってもよい。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムを含むｒＡＡＶベクター内のポリヌクレオチドは、２つのＩＴＲを含み、それらは同じであっても異なってもよい。ＩＴＲ内の３つのエレメントは、ＩＴＲ機能に十分であることが決定されたものである。この最小機能的ＩＴＲを、ＡＡＶベクター産生および形質導入の全ての態様に使用することができる。さらなる欠失により、さらに小さい最小機能的ＩＴＲを規定することができる。ＩＴＲの長さが短いほど、より大きなトランスジェニックカセットのパッケージングおよび形質導入が有利に可能になる。
一部の実施形態では、合成ＩＴＲ内に存在するエレメントのそれぞれは、天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲ（ＷＴ配列）内に存在する正確な配列であってもよく、ＡＡＶ ＩＴＲのエレメントの機能が天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲ内に存在するこれらの同じエレメントの機能と実質的に異ならないように十分なレベルで機能し続ける限りは、わずかに異なってもよい（例えば、１、２、３、４、５またはそれよりも多くのヌクレオチドの付加、欠失、および／または置換によって異なる）。
別の実施形態では、ＩＴＲは、天然に存在するＩＴＲ、例えば、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ２と比べて改変された転写活性を示す。ＩＴＲ２配列はプロモーター活性を本質的に有することが公知である。ＩＴＲ２配列はまた、ポリ（Ａ）配列と同様の終止活性も本質的に有する。本発明の最小機能的ＩＴＲは、実施例に示されている通り、転写活性を示すが、そのレベルはＩＴＲ２と比べて減弱したものである。したがって、一部の実施形態では、ＩＴＲは、転写に関して機能的である。他の実施形態では、ＩＴＲは、転写に関して欠陥がある。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、転写インスレーターとして作用し得、例えば、ベクターが宿主染色体に組み込まれた場合に、ベクター内に存在するトランスジェニックカセットの転写を妨げる。
本発明の１つの態様は、少なくとも１つの合成ＡＡＶ ＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターゲノムに関し、ここで、ＩＴＲ内の１つまたは複数の転写因子結合部位のヌクレオチド配列が、ＩＴＲ２などの天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲの配列と比べて欠失および／または置換されている。一部の実施形態では、これは、１つまたは複数の転写因子結合部位が欠失したおよび／または置換された最小機能的ＩＴＲである。一部の実施形態では、少なくとも１つの転写因子結合部位、例えば、少なくとも５もしくはそれよりも多く、または１０もしくはそれよりも多くの転写因子結合部位、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の転写因子結合部位が欠失しているおよび／または置換されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターゲノムを含むｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つの合成ＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、ここで、典型的にはＩＴＲの転写開始点またはその近くに存在する１つまたは複数のＣｐＧ部位／モチーフ（すぐ後ろにグアニン塩基が続くシトシン塩基（ＣｐＧ）、そのような配置にあるシトシンはメチル化される傾向がある）が欠失しているおよび／または置換されている。ある実施形態では、ＣｐＧ部位の欠失または数の減少により、ｒＡＡＶベクターの免疫原性を減少させることができる。これは、ＣｐＧ部位において生じるｒＡＡＶベクターＤＮＡ配列へのＴＬＲ－９結合の減少または完全な阻害に起因する。ＣｐＧモチーフのメチル化により、転写サイレンシングがもたらされることも周知である。ＩＴＲ内のＣｐＧモチーフの除去により、ＴＬＲ－９認識の低減および／またはメチル化の低減、したがって導入遺伝子サイレンシングの低減がもたらされることが予想される。一部の実施形態では、合成ＡＡＶ ＩＴＲは、１つまたは複数のＣｐＧ部位が欠失したおよび／または置換された最小機能的ＩＴＲである。ある実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲ２は１６のＣｐＧ部位を含有すること公知であり、そのうちの１つもしくは複数、または１６全てを欠失させることができる。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、例えば、少なくとも４つもしくはそれよりも多く、または８つもしくはそれよりも多くのＣｐＧモチーフ、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のＣｐＧモチーフを欠失させるおよび／または置換する。「欠失および／または置換」という句は、本明細書で使用される場合、ＣｐＧモチーフ内のヌクレオチドの一方または両方を欠失させること、異なるヌクレオチドで置換すること、または欠失および置換の任意の組合せを意味する。
一部の実施形態では、合成ＩＴＲは、以下に列挙するヌクレオチド配列のうちの１つを含む、それから本質的になる、またはそれからなる。他の実施形態では、合成ＩＴＲは、以下に列挙するヌクレオチド配列のうちの１つと少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
ＭＨ－２５７
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCAATTTGATAAAAATCGTCAAATTATAAACAGGCTTTGCCTGTTTAGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT (SEQ ID NO: 36)
ＭＨ－２５８
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGGATAAAAATCCAGGCTTTGCCTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT (SEQ ID NO: 37)
ＭＨデルタ２５８
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGGATAAAAATCCAGGCTTTGCCTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT (SEQ ID NO: 38)
ＭＨテロメア－１ ＩＴＲ
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGGGATTGGGATTGCGCGCTCGCTCGCGGGATTGGGATTGGGATTGGGATTGGGATTGGGATTGATAAAAATCAATCCCAATCCCAATCCCAATCCCAATCCCAATCCCGCGAGCGAGCGCGCAATCCCAATCCCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT (SEQ ID NO: 39)
ＭＨテロメア２ ＩＴＲ
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCGGGATTGGGATTGGGATTGGGATTGGGATTGGGATTGATAAAAATCAATCCCAATCCCAATCCCAATCCCAATCCCAATCCCGCGAGCGAGCGCGCAGGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTAAGCTTATTATA (SEQ ID NO: 40)
ＭＨ ＰｏｌＩＩ ２５８ ＩＴＲ
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGGCGCCTATAAAGATAAAAATCCAGGCTTTGCCTGCCTCAGTTAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT (SEQ ID NO: 41)
ＭＨ ２５８デルタＤ保存的
CTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGGATAAAAATCCAGGCTTTGCCTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAG (SEQ ID NO: 42)
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターゲノムは、宿主細胞に形質導入することができるＡＡＶウイルス粒子を産生させることが可能な合成ＩＴＲを含む。そのようなＩＴＲを、例えば、異種核酸のウイルスによる送達に使用することができる。そのようなＩＴＲの例としては、上に列挙したＭＨ－２５７、ＭＨ－２５８、およびＭＨデルタ２５８が挙げられる。
他の実施形態では、合成ＩＴＲを含有する本明細書に記載のｒＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶウイルス粒子を産生させることができないものである。そのようなＩＴＲは、例えば、異種核酸の非ウイルス移入に使用することができる。そのようなＩＴＲの例としては、上に列挙したＭＨテロメア－１、ＭＨテロメア－２、およびＭＨ Ｐｏｌ ＩＩ ２５８が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明の合成ＩＴＲを含む本明細書に記載のｒＡＡＶベクターゲノムは、第１のＩＴＲと同じであっても異なってもよい第２のＩＴＲをさらに含む。一部の実施形態では、ＩＴＲの一方（例えば、５’ＩＴＲ）は、Ｒｅｐタンパク質によって分解することができないものである、すなわち、二本鎖ウイルスＤＮＡの形成を促進するものである。そのようなＩＴＲは、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，７８４，７９９号に記載されている。そのようなＩＴＲが存在することにより、単鎖ウイルスＤＮＡの産生がもたらされる。
一部の実施形態では、第２のＩＴＲはＩＴＲ２ｍ（配列番号７）である。一部の実施形態では、５’ＩＴＲはＩＴＲ２ｍ（配列番号７）であり、３’ＩＴＲはＩＴＲ２（配列番号８）である。一部の実施形態では、５’ＩＴＲはＩＴＲ２（配列番号８）であり、３’ＩＴＲはＩＴＲ２ｍ（配列番号７）である。
ある実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、本発明の合成ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、パルボウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターであり得る。別の実施形態では、組換えパルボウイルス粒子（例えば、組換えＡＡＶ粒子）は、合成ＩＴＲを含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、細菌配列を欠く、かつ／または、代替オープンリーディングフレームを欠く、かつ／または、コード配列由来のＣｐＧを欠く、かつ／または、二本鎖ＲＮＡブロッカーを有する核酸を含む。一部の実施形態では、本発明の組換えＡＡＶを、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ鋳型から生成する。一部の実施形態では、本発明の組換えＡＡＶを、プラスミドＤＮＡ鋳型から生成する。
本発明の別の実施形態は、ＡＡＶカプシドのトランスジェニックＤＮＡパッケージング容量を増加させる方法であって、ＦＫＲＰをコードする合成核酸を含有し、少なくとも１つの合成ＡＡＶ ＩＴＲをさらに含有するｒＡＡＶベクターゲノムを生成するステップを含み、前記ＩＴＲが、（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ結合エレメント；（ｂ）ＡＡＶ末端解離配列；および（ｃ）ＡＡＶ ＲＢＥエレメントを含み、前記ＩＴＲが、いかなる他のＡＡＶ ＩＴＲ配列も含まない、方法に関する。そのようなｒＡＡＶベクターは本発明に包含される。
本発明のさらなる実施形態は、ｒＡＡＶベクターゲノムによる感染に対する細胞応答を変更する方法であって、ＦＫＲＰをコードする合成核酸を含有し、少なくとも１つの合成ＩＴＲをさらに含有するｒＡＡＶベクターゲノムを生成するステップを含み、前記ＩＴＲ内の１つまたは複数の転写因子結合部位のヌクレオチド配列が欠失しているおよび／または置換されており、さらに、ｒＡＡＶベクターゲノムが、感染に対して変更された細胞応答を生じる少なくとも１つの合成ＩＴＲを含む、方法に関する。そのようなｒＡＡＶベクターは本発明に包含される。
本発明の追加の実施形態は、ｒＡＡＶベクターゲノムによる感染に対する細胞応答を変更する方法であって、ＦＫＲＰをコードする合成核酸を含有し、少なくとも１つの合成ＩＴＲをさらに含有するｒＡＡＶベクターゲノムを生成するステップを含み、前記ＩＴＲ内の１つまたは複数のＣｐＧモチーフが欠失しているおよび／または置換されており、少なくとも１つの合成ＩＴＲを含むベクターが、感染に対して変更された細胞応答を生じる、方法に関する。
筋肉特異的プロモーター
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法において使用されるプロモーターは、骨格筋および心筋の両方において活性な合成筋肉特異的プロモーターである。骨格筋および心筋の両方において活性な筋肉特異的プロモーターの例としては、以下の表１に示されるもの、例えば、ＳＰ００１０、ＳＰ００２０、ＳＰ００３３、ＳＰ００３８、ＳＰ００４０、ＳＰ００４２、ＳＰ００５１、ＳＰ００５７、ＳＰ００５８、ＳＰ００６１、ＳＰ００６２、ＳＰ００６４、ＳＰ００６５、ＳＰ００６６、ＳＰ００６８、ＳＰ００７０、ＳＰ００７１、ＳＰ００７６、ＳＰ０１３２、ＳＰ０１３３、ＳＰ０１３４、ＳＰ０１３６、ＳＰ０１４６、ＳＰ０１４７、ＳＰ０１４８、ＳＰ０１５０、ＳＰ０１５３、ＳＰ０１５５、ＳＰ０１５６、ＳＰ０１５７、ＳＰ０１５８、ＳＰ０１５９、ＳＰ０１６０、ＳＰ０１６１、ＳＰ０１６２、ＳＰ０１６３、ＳＰ０１６４、ＳＰ０１６５、ＳＰ０１６６、ＳＰ０１６９、ＳＰ０１７０、ＳＰ０１７１、ＳＰ０１７３、ＳＰ０２２８、ＳＰ０２２９、ＳＰ０２３０、ＳＰ０２３１、ＳＰ０２３２、ＳＰ０２５７、ＳＰ０２６２、ＳＰ０２６４、ＳＰ０２６５、ＳＰ０２６６、ＳＰ０２６７、ＳＰ０２６８、ＳＰ０２７０、ＳＰ０２７１、ＳＰ０２７９、ＳＰ０２８６、ＳＰ０３０５、ＳＰ０３０６、ＳＰ０３０７、ＳＰ０３０９、ＳＰ０３１０、ＳＰ０３１１、ＳＰ０３１２、ＳＰ０３１３、ＳＰ０３１４、ＳＰ０３１５、ＳＰ０３１６、ＳＰ０３２０、ＳＰ０３２２、ＳＰ０３２３、ＳＰ０３２４、ＳＰ０３２５、ＳＰ０３２６、ＳＰ０３２７、ＳＰ０３２８、ＳＰ０３２９、ＳＰ０３３０、ＳＰ０３３１、ＳＰ０３３２、ＳＰ０３３３、ＳＰ０３３４、ＳＰ０３３５、ＳＰ０３３６、ＳＰ０３３７、ＳＰ０３３８、ＳＰ０３３９、ＳＰ０３４０、ＳＰ０３４１、ＳＰ０３４３、ＳＰ０３４５、ＳＰ０３４６、ＳＰ０３４７、ＳＰ０３４８、ＳＰ０３４９、ＳＰ０３５０、ＳＰ０３５１、ＳＰ０３５２、ＳＰ０３５３、ＳＰ０３５４、ＳＰ０３５５、ＳＰ０３５６、ＳＰ０３５８、ＳＰ０３５９、ＳＰ０３６１、ＳＰ０３６２、ＳＰ０３６３、ＳＰ０３６４、ＳＰ０３６５、ＳＰ０３６６、ＳＰ０３６７、ＳＰ０３６８、ＳＰ０３６９、ＳＰ０３７０、ＳＰ０３７１、ＳＰ０３７２、ＳＰ０３７３、ＳＰ０３７４、ＳＰ０３７５、ＳＰ０３７６、ＳＰ０３７７、ＳＰ０３７８、ＳＰ０３７９、ＳＰ０３８０、ＳＰ０３８１、ＳＰ０３８２、ＳＫＭ＿１４、ＳＫＭ＿１８、ＳＫＭ＿２０、ＳＰ０３５７、ＳＰ０４３７～ＳＰ０４４５、ＳＰ０４４７およびＳＰ０４５３～ＳＰ０４７１、ＳＰ０４７３～４７４が挙げられる。骨格筋および心筋の両方において活性な好ましい合成筋肉特異的プロモーターの例は、ＳＰ００５７、ＳＰ０１３４、ＳＰ０１７３、ＳＰ０２７９、ＳＰ０２８６、ＳＰ０３１０、ＳＰ０３１６、ＳＰ０３２０およびＳＰ０３２６である。
ＳＰ００５７およびそのバリアント
一部の実施形態では、プロモーターは、シス調節エレメントＣＲＥ００２９およびＣＲＥ００７１またはその機能的バリアントの組合せを含む合成筋肉特異的プロモーターである。典型的には、ＣＲＥは、プロモーターエレメントと作動可能に連結している。一部の好ましい実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、前記ＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００２９、ＣＲＥ００７１の順序で含み、その次にプロモーターエレメントを含む（順序は、当技術分野における慣習の通り、上流から下流の方向に示される）。一部の好ましい実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、前記ＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００７１、ＣＲＥ００２９、その次にプロモーターエレメントの順序で含む。
プロモーターエレメントは、任意の適切な近位プロモーターまたは最小プロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは最小プロモーターである。プロモーターが近位プロモーターである場合、一般に、近位プロモーターは筋肉特異的であることが好ましい。
一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントは、ＣＲＥ００７０またはその機能的バリアントである。ＣＲＥ００７０は、筋肉特異的近位プロモーターである。
したがって、一実施形態では、プロモーターは、以下の調節エレメント：ＣＲＥ００２９、ＣＲＥ００７１およびＣＲＥ００７０またはその機能的バリアントを含む。
ＣＲＥ００２９は、本明細書に提示される表に示されている配列番号２０６による配列を有する。その機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有し得る。
ＣＲＥ００２９の機能的バリアントは、ＣＲＥ００２９とは異なる配列を有するが、筋肉特異的ＣＲＥとしての活性を実質的に保持する調節エレメントである。必要な転写因子（ＴＦ）に結合し、発現を増強するＣＲＥの能力を保持させながら、ＣＲＥの配列を変動させることが可能であることが、当業者には理解されよう。機能的バリアントは、ＣＲＥを実質的に非機能性なものにしないという条件で、参照ＣＲＥと比較して置換、欠失および／または挿入を含んでもよい。
一部の実施形態では、ＣＲＥ００２９の機能的バリアントは、プロモーター内のＣＲＥ００２９の代わりに置換した場合に、その活性を実質的に保持するＣＲＥとみなすことができる。例えば、ＣＲＥ００２９の代わりに置換されたＣＲＥ００２９の機能的バリアントを含む筋肉特異的プロモーターは、その活性の８０％、より好ましくはその活性の９０％、より好ましくはその活性の９５％、さらにより好ましくはその活性の１００％を保持することが好ましい。例えば、例としてプロモーターＳＰ００５７を考えると、ＳＰ００５７内のＣＲＥ００２９をＣＲＥ００２９の機能的バリアントで置き換えることができ、プロモーターはその活性を実質的に保持する。活性の保持は、適切なレポーターの発現を、参照プロモーターの制御下にある場合と、置換されたＣＲＥを含む他の点では同一のプロモーターを同等の条件下で用いた場合とで比較することによって評価することができる。
ＣＲＥ００２９またはその機能的バリアントは、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれの鎖上にも提供することができ、いずれの向きでも提供することができることに留意されたい。したがって、配列番号２０６またはその機能的バリアントの相補配列および逆相補配列が本発明の範囲内に入る。配列番号２０６またはその機能的バリアントによる配列を含む一本鎖核酸も本発明の範囲内に入る。
ＣＲＥ００７１は、本明細書に提示される表に示されている配列番号２１６による配列を有する。その機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有し得る。
ＣＲＥ００７１の機能的バリアントは、ＣＲＥ００７１とは異なる配列を有するが、筋肉特異的ＣＲＥとしての活性を実質的に保持する調節エレメントである。必要な転写因子（ＴＦ）に結合し、発現を増強するＣＲＥの能力を保持させながら、ＣＲＥの配列を変動させることが可能であることが、当業者には理解されよう。機能的バリアントは、ＣＲＥを実質的に非機能性なものにしないという条件で、参照ＣＲＥと比較して置換、欠失および／または挿入を含んでもよい。
一部の実施形態では、ＣＲＥ００７１の機能的バリアントは、プロモーター内のＣＲＥ００７１の代わりに置換した場合に、その活性を実質的に保持するＣＲＥとみなすことができる。例えば、ＣＲＥ００７１の代わりに置換されたＣＲＥ００２９の機能的バリアントを含む筋肉特異的プロモーターは、その活性の８０％、より好ましくはその活性の９０％、より好ましくはその活性の９５％、さらにより好ましくはその活性の１００％を保持することが好ましい。例えば、例としてプロモーターＳＰ００５７を考えると、ＳＰ００５７内のＣＲＥ００７１をＣＲＥ００７１の機能的バリアントで置き換えることができ、プロモーターはその活性を実質的に保持する。活性の保持は、適切なレポーターの発現を、参照プロモーターの制御下にある場合と、置換されたＣＲＥを含む他の点では同一のプロモーターを同等の条件下で用いた場合とで比較することによって評価することができる。
ＣＲＥ００７１またはその機能的バリアントは、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれの鎖上にも提供することができ、いずれの向きでも提供することができることに留意されたい。したがって、配列番号２１６またはその機能的バリアントの相補配列および逆相補配列が本発明の範囲内に入る。配列番号２１６またはその機能的バリアントによる配列を含む一本鎖核酸も本発明の範囲内に入る。
ＣＲＥ００７０の配列（配列番号４２）およびそのバリアントは、本明細書の他の箇所に記載されている。
一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、配列番号８７による配列またはその機能的バリアントを含む。一部の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号８７と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有し得る。本明細書に提示される表に示されている配列番号８７による配列を有するプロモーターは、ＳＰ００５７と称される。ＳＰ００５７プロモーターは、一部の実施形態において特に好ましい。このプロモーターは、筋肉に対する特異性が非常に高いことが見いだされており、そのことが一部の状況において有利である。
ＳＰ０１３４およびそのバリアント
一部の実施形態では、プロモーターは、シス調節エレメントＣＲＥ００２０およびＣＲＥ００７１またはその機能的バリアントの組合せを含む合成筋肉特異的プロモーターである。典型的には、ＣＲＥは、プロモーターエレメントと作動可能に連結している。一部の好ましい実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、前記ＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００２０、ＣＲＥ００７１の順序で含み、その次にプロモーターエレメントを含む（順序は、当技術分野における慣習の通り、上流から下流の方向に示される）。一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、前記ＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００７１、ＣＲＥ００２０の順序で含み、その次にプロモーターエレメントを含む。
プロモーターエレメントは、任意の適切な近位プロモーターまたは最小プロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは最小プロモーターである。プロモーターが近位プロモーターである場合、一般に、近位プロモーターは筋肉特異的であることが好ましい。
一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントは、ＣＲＥ００７０またはその機能的バリアントである。ＣＲＥ００７０は、筋肉特異的近位プロモーターである。
したがって、一実施形態では、プロモーターは、以下の調節エレメント：ＣＲＥ００２０、ＣＲＥ００７１およびＣＲＥ００７０またはその機能的バリアントを含む。
ＣＲＥ００２０は、本明細書に提示される表に示されている配列番号２０３による配列を有する。その機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有し得る。
ＣＲＥ００２０の機能的バリアントは、ＣＲＥ００２０とは異なる配列を有するが、筋肉特異的ＣＲＥとしての活性を実質的に保持する調節エレメントである。必要な転写因子（ＴＦ）に結合し、発現を増強するＣＲＥの能力を保持させながら、ＣＲＥの配列を変動させることが可能であることが、当業者には理解されよう。機能的バリアントは、ＣＲＥを実質的に非機能性なものにしないという条件で、参照ＣＲＥと比較して置換、欠失および／または挿入を含んでもよい。
一部の実施形態では、ＣＲＥ００２０の機能的バリアントは、プロモーター内のＣＲＥ００２０の代わりに置換した場合に、その活性を実質的に保持するＣＲＥとみなすことができる。例えば、ＣＲＥ００２０の代わりに置換されたＣＲＥ００２０の機能的バリアントを含む骨格筋特異的プロモーターは、その活性の８０％、より好ましくはその活性の９０％、より好ましくはその活性の９５％、さらにより好ましくはその活性の１００％を保持することが好ましい。例えば、例としてプロモーターＳＰ０２２７を考えると、ＳＰ０２２７内のＣＲＥ００２０をＣＲＥ００２０の機能的バリアントで置き換えることができ、プロモーターはその活性を実質的に保持する。活性の保持は、適切なレポーターの発現を、参照プロモーターの制御下にある場合と、置換されたＣＲＥを含む他の点では同一のプロモーターを同等の条件下で用いた場合とで比較することによって評価することができる。
ＣＲＥ００２０またはその機能的バリアントは、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれの鎖上にも提供することができ、いずれの向きでも提供することができることに留意されたい。したがって、配列番号２０３またはその機能的バリアントの相補配列および逆相補配列が本発明の範囲内に入る。配列番号２０３またはその機能的バリアントによる配列を含む一本鎖核酸も本発明の範囲内に入る。
一部の実施形態では、ＣＲＥ００２０またはその機能的バリアントは、３００ヌクレオチドもしくはそれ未満、２５０ヌクレオチドもしくはそれ未満、２００ヌクレオチドもしくはそれ未満、１５０ヌクレオチドもしくはそれ未満、１２５ヌクレオチドもしくはそれ未満、または１００ヌクレオチドもしくはそれ未満の長さを有する。
ＣＲＥ００７１の配列およびそのバリアントは上に記載されている。
ＣＲＥ００７０の配列およびそのバリアントは、本明細書の他の箇所に記載されている。
一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、本明細書に提示される表に示されている配列による配列またはその機能的バリアントを含む。一部の実施形態では、機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有し得る。本明細書に提示される表に示されている配列番号１００による配列を有するプロモーターは、ＳＰ０１３４と称される。ＳＰ０１３４プロモーターは一部の実施形態において特に好ましい。このプロモーターは、筋肉に対する特異性が非常に高いことが見いだされており、そのことが一部の状況において有利である。
ＳＰ０１７３およびそのバリアント
一部の実施形態では、プロモーターは、筋肉特異的近位プロモーターＣＲＥ００１０とシス調節エレメントＣＲＥ００３５またはその機能的バリアントの組合せを含む合成筋肉特異的プロモーターである。典型的には、筋肉特異的近位プロモーターＣＲＥ００１０およびシス調節エレメントＣＲＥ００３５は、さらなるプロモーターエレメントと作動可能に連結している。一部の好ましい実施形態では、合成筋肉特異的プロモーターは、前記近位プロモーターおよびＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００１０、ＣＲＥ００３５の順序で含み、その次にさらなるプロモーターエレメントを含む（順序は、当技術分野における慣習の通り、上流から下流の方向に示される）。一部の実施形態では、合成筋肉特異的プロモーターは、前記近位プロモーターおよびＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００３５、ＣＲＥ００１０の順序で含み、その次にさらなるプロモーターエレメントを含む。
プロモーターエレメントは、任意の適切な近位プロモーターまたは最小プロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは最小プロモーターである。プロモーターが近位プロモーターである場合、一般に、近位プロモーターは筋肉特異的であることが好ましい。
一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントは、ＳＫＭ＿１８またはその機能的バリアントである。ＳＫＭ＿１８は、筋肉特異的近位プロモーターである。
したがって、一実施形態では、プロモーターは、以下の調節エレメント：ＣＲＥ００１０、ＣＲＥ００３５およびＳＫＭ＿１８、またはその機能的バリアントを含む。
ＣＲＥ００１０は、配列番号２６４による配列を有する。その機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有し得る。
上記の通り、ＣＲＥ００１０の機能的バリアントは、筋肉特異的プロモーターエレメントとして作用するＣＲＥ００１０の能力を実質的に保持する。例えば、筋肉特異的プロモーターＳＰ０３２０中にＣＲＥ００１０の機能的バリアントによる置換を行った場合、改変されたプロモーターは、ＳＰ０３２０の活性の少なくともその活性の８０％、より好ましくは少なくともその活性の９０％、より好ましくは少なくともその活性の９５％、さらにより好ましくは１００％を保持する。ＣＲＥ００１０の機能的バリアントは、本明細書に提示される表に示されている配列番号２６４に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性である配列を含むことが適切である。
一部の好ましい実施形態では、ＣＲＥ００１０またはその機能的バリアントを含む、またはそれからなるプロモーターエレメントは、４００ヌクレオチドもしくはそれ未満、３００ヌクレオチドもしくはそれ未満、２５０ヌクレオチドもしくはそれ未満、２００ヌクレオチドもしくはそれ未満、１５０ヌクレオチドもしくはそれ未満、１２５ヌクレオチドもしくはそれ未満、１１０ヌクレオチドもしくはそれ未満、または９５ヌクレオチドもしくはそれ未満の長さを有する。
ＣＲＥ００３５は、本明細書に提示される表に示されている配列番号２０８による配列を有する。その機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有し得る。
ＣＲＥ００３５の機能的バリアントは、ＣＲＥ００３５とは異なる配列を有するが、筋肉特異的ＣＲＥとしての活性を実質的に保持する調節エレメントである。必要な転写因子（ＴＦ）に結合し、発現を増強するＣＲＥの能力を保持させながら、ＣＲＥの配列を変動させることが可能であることが、当業者には理解されよう。機能的バリアントは、ＣＲＥを実質的に非機能性なものにしないという条件で、参照ＣＲＥと比較して置換、欠失および／または挿入を含んでもよい。
一部の実施形態では、ＣＲＥ００３５の機能的バリアントは、プロモーター内のＣＲＥ００３５の代わりに置換した場合に、その活性を実質的に保持するＣＲＥとみなすことができる。例えば、ＣＲＥ００３５の代わりに置換したＣＲＥ００３５の機能的バリアントを含む筋肉特異的プロモーターは、その活性の８０％、より好ましくはその活性の９０％、より好ましくはその活性の９５％、さらにより好ましくはその活性の１００％を保持することが好ましい。例えば、例としてプロモーターＳＰ０１７３を考えると、ＳＰ０１７３内のＣＲＥ００３５をＣＲＥ００３５の機能的バリアントで置き換えることができ、プロモーターはその活性を実質的に保持する。活性の保持は、適切なレポーターの発現を、参照プロモーターの制御下にある場合と、置換されたＣＲＥを含む他の点では同一のプロモーターを同等の条件下で用いた場合とで比較することによって評価することができる。
ＣＲＥ００３５またはその機能的バリアントは、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれの鎖上にも提供することができ、いずれの向きでも提供することができることに留意されたい。したがって、配列番号２０８またはその機能的バリアントの相補配列および逆相補配列が本発明の範囲内に入る。配列番号２０８またはその機能的バリアントによる配列を含む一本鎖核酸も本発明の範囲内に入る。
ＳＫＭ＿１８の配列およびそのバリアントは、本明細書の他の箇所に記載されている。
一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、本明細書に提示される表に示されている配列番号１２２による配列またはその機能的バリアントを含む。一部の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１２２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有し得る。配列番号１２２による配列を有するプロモーターは、ＳＰ０１７３と称される。ＳＰ０１７３プロモーターは一部の実施形態において特に好ましい。このプロモーターは、筋肉に対する特異性が非常に高いことが見いだされており、そのことが一部の状況において有利である。
ＳＰ０２７９およびそのバリアント
一部の実施形態では、プロモーターは、シス調節エレメントＣＲＥ００２０およびＣＲＥ００７１またはその機能的バリアントの組合せを含む合成筋肉特異的プロモーターである。典型的には、ＣＲＥは、プロモーターエレメントと作動可能に連結している。一部の好ましい実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、前記ＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００２０、ＣＲＥ００７１の順序で含み、その次にプロモーターエレメントを含む（順序は、当技術分野における慣習の通り、上流から下流の方向に示される）。一部の好ましい実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、前記ＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００７１、ＣＲＥ００２０の順序で含み、その次にプロモーターエレメントを含む。一部の好ましい実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、前記ＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００２０、ＣＲＥ００７１の順序で含み、プロモーターエレメント、ならびにＣＭＶ－ＩＥ ５’ＵＴＲおよびイントロンを含む（順序は、当技術分野における慣習の通り、上流から下流の方向に示される）。
プロモーターエレメントは、任意の適切な近位プロモーターまたは最小プロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは最小プロモーターである。プロモーターが近位プロモーターである場合、一般に、近位プロモーターは筋肉特異的であることが好ましい。
一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントは、ＣＲＥ００７０またはその機能的バリアントである。ＣＲＥ００７０は、筋肉特異的近位プロモーターである。
したがって、一実施形態では、プロモーターは、以下の調節エレメントを含む：ＣＲＥ００２０、ＣＲＥ００７１、ＣＲＥ００７０ならびにＣＭＶ－ＩＥ ５’ＵＴＲおよびイントロンまたはその機能的バリアント。
ＣＲＥ００２０の配列およびそのバリアントは上に記載されている。
ＣＲＥ００７１の配列およびそのバリアントは上に記載されている。
ＣＲＥ００７０の配列およびそのバリアントは、本明細書の他の箇所に記載されている。
ＣＭＶ－ＩＥ ５’ＵＴＲおよびイントロンの配列ならびにそのバリアントは、本明細書の他の箇所に記載されている。
一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、本明細書に提示される表に示されている配列番号１３７による配列またはその機能的バリアントを含む。一部の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１３７と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有し得る。配列番号１３７による配列を有するプロモーターは、ＳＰ０２７９と称される。ＳＰ０２７９プロモーターは一部の実施形態において特に好ましい。このプロモーターは、筋肉に対する特異性が非常に高いことが見いだされており、そのことが一部の状況において有利である。
ＳＰ０２８６およびそのバリアント
一部の実施形態では、プロモーターは、プロモーターエレメントと作動可能に連結したＣＲＥ００７１を含む合成筋肉特異的プロモーターである。一部の好ましい実施形態では、合成筋肉特異的プロモーターは、ＣＲＥ００７１を、プロモーターエレメントのすぐ上流に含む。一部の好ましい実施形態では、合成筋肉特異的プロモーターは、ＣＲＥ００７１を、プロモーターエレメントならびにＣＭＶ－ＩＥ ５’ＵＴＲおよびイントロンのすぐ上流に含む。
プロモーターエレメントは、任意の適切な近位または最小プロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは最小プロモーターである。プロモーターが近位プロモーターである場合、一般に、近位プロモーターは筋肉特異的であることが好ましい。
一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントは、ＣＲＥ００７０またはその機能的バリアントである。ＣＲＥ００７０は、筋肉特異的近位プロモーターである。
一部の実施形態では、合成筋肉特異的プロモーターは、以下のエレメント（またはその機能的バリアント）を含む：ＣＲＥ００７１、ＣＲＥ００７０、その次にＣＭＶ－ＩＥ ５’ＵＴＲおよびイントロン。
ＣＲＥ００７１の配列およびそのバリアントは上に記載されている。
ＣＲＥ００７０の配列およびそのバリアントは、本明細書の他の箇所に記載されている。
ＣＭＶ－ＩＥ ５’ＵＴＲおよびイントロンの配列ならびにそのバリアントは、本明細書の他の箇所に記載されている。
一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、配列番号１３８による配列またはその機能的バリアントを含む。一部の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１３８と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有し得る。配列番号１３８による配列を有するプロモーターは、ＳＰ０２８６と称される。ＳＰ０２８６プロモーターは一部の実施形態において特に好ましい。このプロモーターは、筋肉に対する特異性が非常に高いことが見いだされており、そのことが一部の状況において有利である。
ＳＰ０３１０およびそのバリアント
一部の実施形態では、プロモーターは、プロモーターエレメントと作動可能に連結したＣＲＥ００３５を含む合成筋肉特異的プロモーターである。一部の好ましい実施形態では、合成筋肉特異的プロモーターは、ＣＲＥ００３５を、プロモーターエレメントのすぐ上流に含む。
プロモーターエレメントは、任意の適切な近位または最小プロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは最小プロモーターである。プロモーターが近位プロモーターである場合、一般に、近位プロモーターは筋肉特異的であることが好ましい。
一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントは、ＳＫＭ＿１８またはその機能的バリアントである。ＳＫＭ＿１８は、筋肉特異的近位プロモーターである。
一部の実施形態では、心筋特異的プロモーターは、以下のエレメント（またはその機能的バリアント）を含む：ＣＲＥ００３５、その後にＳＫＭ＿１８。
ＣＲＥ００３５の配列およびそのバリアントは上に記載されている。
ＳＫＭ＿１８の配列およびそのバリアントは、本明細書の他の箇所に記載されている。
一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、本明細書に提示される表に示されている配列番号１４３による配列またはその機能的バリアントを含む。一部の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１４３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有し得る。配列番号１４３による配列を有するプロモーターは、ＳＰ０３１０と称される。ＳＰ０３１０プロモーターは一部の実施形態において特に好ましい。このプロモーターは、筋肉に対する特異性が非常に高いことが見いだされており、そのことが一部の状況において有利である。
ＳＰ０３１６およびそのバリアント
一部の実施形態では、プロモーターは、プロモーターエレメントと作動可能に連結したＣＲＥ００５０を含む合成筋肉特異的プロモーターである。一部の好ましい実施形態では、合成筋肉特異的プロモーターは、ＣＲＥ００５０を、プロモーターエレメントのすぐ上流に含む。
プロモーターエレメントは、任意の適切な近位または最小プロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは最小プロモーターである。プロモーターが近位プロモーターである場合、一般に、近位プロモーターは筋肉特異的であることが好ましい。
一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントは、ＳＫＭ＿１８またはその機能的バリアントである。ＳＫＭ＿１８は、筋肉特異的近位プロモーターである。
一部の実施形態では、心筋特異的プロモーターは、以下のエレメント（またはその機能的バリアント）を含む：ＣＲＥ００５０、その後にＳＫＭ＿１８。
ＣＲＥ００５０は、配列番号２１１による配列を有する。その機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有し得る。
ＣＲＥ００５０の機能的バリアントは、ＣＲＥ００５０とは異なる配列を有するが、筋肉特異的ＣＲＥとしての活性を実質的に保持する調節エレメントである。必要な転写因子（ＴＦ）に結合し、発現を増強するＣＲＥの能力を保持させながら、ＣＲＥの配列を変動させることが可能であることが、当業者には理解されよう。機能的バリアントは、ＣＲＥを実質的に非機能性なものにしないという条件で、参照ＣＲＥと比較して置換、欠失および／または挿入を含んでもよい。
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５０の機能的バリアントは、プロモーター内のＣＲＥ００５０の代わりに置換した場合に、その活性を実質的に保持するＣＲＥとみなすことができる。例えば、ＣＲＥ００５０の代わりに置換されたＣＲＥ００３５の機能的バリアントを含む筋肉特異的プロモーターは、その活性の８０％、より好ましくはその活性の９０％、より好ましくはその活性の９５％、さらにより好ましくはその活性の１００％を保持することが好ましい。例えば、例としてプロモーターＳＰ０３１６を考えると、ＳＰ０３１６内のＣＲＥ００５０をＣＲＥ００５０の機能的バリアントで置き換えることができ、プロモーターはその活性を実質的に保持する。活性の保持は、適切なレポーターの発現を、参照プロモーターの制御下にある場合と、置換されたＣＲＥを含む他の点では同一のプロモーターを同等の条件下で用いた場合とで比較することによって評価することができる。
ＣＲＥ００５０またはその機能的バリアントは、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれの鎖上にも提供することができ、いずれの向きでも提供することができることに留意されたい。したがって、配列番号２１１またはその機能的バリアントの相補配列および逆相補配列が本発明の範囲内に入る。配列番号２１１またはその機能的バリアントによる配列を含む一本鎖核酸も本発明の範囲内に入る。
ＳＫＭ＿１８の配列およびそのバリアントは、本明細書の他の箇所に記載されている。
一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、本明細書に提示される表に示されている配列番号１４９による配列またはその機能的バリアントを含む。一部の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１４９と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有し得る。配列番号１４９による配列を有するプロモーターは、ＳＰ０３１６と称される。ＳＰ０３１６プロモーターは一部の実施形態において特に好ましい。このプロモーターは、筋肉に対する特異性が非常に高いことが見いだされており、そのことが一部の状況において有利である。
ＳＰ０３２０およびそのバリアント
一部の実施形態では、プロモーターは、筋肉特異的近位プロモーターＣＲＥ００１０とシス調節エレメントＣＲＥ００３５またはその機能的バリアントの組合せを含む合成筋肉特異的プロモーターである。典型的には、筋肉特異的近位プロモーターＣＲＥ００１０およびシス調節エレメントＣＲＥ００３５は、さらなるプロモーターエレメントと作動可能に連結している。一部の好ましい実施形態では、合成筋肉特異的プロモーターは、前記近位プロモーターおよびＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００１０、ＣＲＥ００３５の順序で含み、その次にさらなるプロモーターエレメントを含む（順序は、当技術分野における慣習の通り、上流から下流の方向に示される）。一部の実施形態では、合成筋肉特異的プロモーターは、前記近位プロモーターおよびＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００３５、ＣＲＥ００１０の順序で含み、その次にさらなるプロモーターエレメントを含む。一部の好ましい実施形態では、合成筋肉特異的プロモーターは、前記近位プロモーターおよびＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００１０、ＣＲＥ００３５の順序で含み、さらなるプロモーターエレメント、続いてＣＭＶ－ＩＥ ５’ＵＴＲおよびイントロンを含む。
さらなるプロモーターエレメントは、任意の適切な近位プロモーターまたは最小プロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは最小プロモーターである。プロモーターが近位プロモーターである場合、一般に、近位プロモーターは筋肉特異的であることが好ましい。
一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントは、ＳＫＭ＿１８またはその機能的バリアントである。ＳＫＭ＿１８は、筋肉特異的近位プロモーターである。
したがって、一実施形態では、プロモーターは、以下の調節エレメントを含む：ＣＲＥ００１０、ＣＲＥ００３５、ＳＫＭ＿１８ならびにＣＭＶ－ＩＥ ５’ＵＴＲおよびイントロンまたはその機能的バリアント。
ＣＲＥ００１０の配列およびそのバリアントは上に記載されている。
ＣＲＥ００３５の配列およびそのバリアントは上に記載されている。
ＳＫＭ＿１８の配列およびそのバリアントは、本明細書の他の箇所に記載されている。
ＣＭＶ－ＩＥ ５’ＵＴＲおよびイントロンの配列ならびにそのバリアントは、本明細書の他の箇所に記載されている。
一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、本明細書に提示される表に示されている配列番号１５０による配列またはその機能的バリアントを含む。一部の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１５０と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有し得る。配列番号１５０による配列を有するプロモーターは、ＳＰ０３２０と称される。ＳＰ０３２０プロモーターは一部の実施形態において特に好ましい。このプロモーターは、筋肉に対する特異性が非常に高いことが見いだされており、そのことが一部の状況において有利である。
ＳＰ０３２６およびそのバリアント
一部の実施形態では、プロモーターは、プロモーターエレメントと作動可能に連結したＣＲＥ００７１を含む合成筋肉特異的プロモーターである。一部の好ましい実施形態では、合成筋肉特異的プロモーターは、ＣＲＥ００７１を、プロモーターエレメントのすぐ上流に含む。
プロモーターエレメントは、任意の適切な近位または最小プロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは最小プロモーターである。プロモーターが近位プロモーターである場合、一般に、近位プロモーターは筋肉特異的であることが好ましい。
一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントは、ＳＫＭ＿１８またはその機能的バリアントである。ＳＫＭ＿１８は、筋肉特異的近位プロモーターである。
一部の実施形態では、心筋特異的プロモーターは、以下のエレメント（またはその機能的バリアント）を含む：ＣＲＥ００７１、その後にＳＫＭ＿１８。
ＣＲＥ００７１の配列およびそのバリアントは上に記載されている。
ＳＫＭ＿１８の配列およびそのバリアントは、本明細書の他の箇所に記載されている。
一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、本明細書に提示される表に示されている配列番号１５５による配列またはその機能的バリアントを含む。一部の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１５５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有し得る。配列番号１５５による配列を有するプロモーターは、ＳＰ０３２６と称される。ＳＰ０３２６プロモーターは一部の実施形態において特に好ましい。このプロモーターは、筋肉に対する特異性が非常に高いことが見いだされており、そのことが一部の状況において有利である。
表1 - 心筋および骨格筋において活性な筋肉特異的プロモーター
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 表8 - 心筋および骨格筋において活性な短縮型筋肉特異的プロモーター
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 表2- 表1のプロモーターにおいて見いだされるCREおよび他のエレメント
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 表9 - 示されているシス調節エレメントおよび最小または近位プロモーターを有する本発明の実施形態による表8の心筋および骨格筋において活性な短縮型筋肉特異的プロモーターの概略図
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 表3. 表1および2のプロモーターに含まれるシス調節エレメント
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 表10 - 表8および9のプロモーターからのCRE.
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 表4 - 表1、2および3のプロモーターに含まれる最小/近位プロモーター
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 表11 - 表8の短縮型合成プロモーターからのプロモーターエレメント
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 表5 - 他のエレメント(例えばイントロン/UTR)
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 表12 - 表8のプロモーターからのCRM
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 筋肉特異的プロモーターの機能的バリアント
一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターの機能的バリアントは、プロモーター内の参照プロモーターエレメントの代わりに置換した場合に、その活性を実質的に保持するプロモーターエレメントとみなすことができる。例えば、本明細書に開示される所与のプロモーターの機能的バリアントを含む筋肉特異的プロモーターの機能的バリアントは、その活性の少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％または少なくとも８０％、より好ましくは少なくともその活性の９０％、より好ましくは変化していないプロモーターの活性の少なくとも９５％、さらにより好ましくはその活性の１００％を保持することが好ましい（改変されていないプロモーターエレメントを含む変化していないプロモーター配列と比較して）。筋肉特異的プロモーター活性を評価するのに適切なアッセイは当技術分野で公知である。
一部の実施形態では、本明細書に開示される筋肉特異的プロモーターの機能的バリアントまたは機能性断片は、元の改変されていない配列に対して少なくとも約７５％の配列同一性、または少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性を有し、かつ、プロモーター活性の少なくとも３５％、またはプロモーター活性の少なくとも約４５％、またはプロモーター活性の少なくとも約５０％、またはプロモーター活性の少なくとも約６０％、またはプロモーター活性の少なくとも約７５％、またはプロモーター活性の少なくとも約８０％、またはプロモーター活性の少なくとも約８５％、またはプロモーター活性の少なくとも約９０％、または対応する改変されていないプロモーター配列のプロモーター活性の少なくとも約９５％も有する。
ＦＫＲＰ核酸およびベクターを含有する組成物
本発明の別の態様は、本発明の合成核酸および／または本発明の合成核酸を含むベクターを含む細胞（例えば、単離された細胞、形質転換された細胞、組換え細胞など）に関する。したがって、本発明の種々の実施形態は、本発明の合成核酸を含むベクター（例えば、発現カセット）を含有する組換え宿主細胞を対象とする。そのような細胞は、単離されたものであり得るおよび／または動物、例えば、トランスジェニック動物内に存在するものであり得る。細胞の形質転換は下にさらに記載される。
本発明の別の態様は、本発明の合成核酸、ベクター、および／または形質転換された細胞を含むトランスジェニック動物に関する。トランスジェニック動物としては、これだけに限定されないが、農場動物（例えば、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギなど）、齧歯類（マウス、ラットおよびモルモットなど）、および家庭の愛玩動物（例えば、ネコおよびイヌ）を挙げることができる。一部の実施形態では、トランスジェニック動物は、ヒトではない。
トランスジェニック動物は、単一細胞胚に、ＦＫＲＰをコードする本発明の合成核酸を、合成核酸が成熟動物の生殖系列細胞のＤＮＡに安定に組み込まれ、正常なメンデル様式で遺伝するように導入することによって作製することができる。本発明のトランスジェニック動物は、体液および／または組織中にＦＫＲＰを産生する表現型を有することになる。一部の実施形態では、ＦＫＲＰをこれらの流体および／または組織から取り出し、例えば、治療的使用のために処理することができる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Clark et al. "Expression of human anti-hemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep" Bio/Technology 7:487-492 (1989)；Van Cott et al. "Haemophilic factors produced by transgenic livestock: abundance can enable alternative therapies worldwide" Haemophilia 10 (4):70-77 (2004)を参照されたい）。
ＤＮＡ分子を細胞および胚に、これだけに限定されないが、全能性または多能性幹細胞の微量注射、リン酸カルシウム媒介性沈殿、リポソーム融合、またはレトロウイルス感染を含めた種々の手段によって導入することができる。次いで、形質転換された細胞を胚に導入し、その中に組み入れて、トランスジェニック動物を形成する。トランスジェニック動物を作製する方法は、例えば、Transgenic Animal Generation and Use by L. M. Houdebine, Harwood Academic Press, 1997に記載されている。トランスジェニック動物はまた、例えば、Campbell et al., Nature 380: 64-66 (1996) およびWilmut et al., Nature 385:810-813 (1997)に記載されている通り、胚または成体細胞株を使用した核移植またはクローニング方法を使用して生成することもできる。さらに、ＤＮＡの細胞質内注射を利用する技法を、米国特許第５，５２３，２２２号に記載されている通り使用することができる。
ＦＫＲＰを産生するトランスジェニック動物は、本発明の合成核酸を含むキメラ構築物を導入することによって得ることができる。トランスジェニック動物を得るための方法は周知である。例えば、全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Press 1986)；Krimpenfort et al., Bio/Technology 9:88 (1991)；Palmiter et al., Cell 41:343 (1985)、Kraemer et al., Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1985)；Hammer et al., Nature 315:680 (1985)；Wagner et al., 米国特許第５，１７５，３８５号；Krimpenfort et al., 米国特許第５，１７５，３８４号、Janne et al., Ann. Med. 24:273 (1992)、Brem et al., Chim. Oggi. 11:21 (1993)、Clark et al., 米国特許第５，４７６，９９５号を参照されたい。
ＦＫＲＰをコードする合成核酸、または前記合成ポリヌクレオチドを含むベクターおよび／もしくは細胞を、医薬組成物に含めることができる。そのような医薬組成物の容器も本発明に包含される。一部の実施形態は、例えば、本発明の方法を実施するための、前記合成核酸、または本発明の前記合成核酸を含むベクターおよび／もしくは細胞、ならびに／またはは試薬および／もしくはキットを使用するための指示を含むキットを対象とする。
本発明のさらなる態様は、ＦＫＲＰをコードする合成核酸、または１つもしくは複数のＦＫＲＰをコードする合成核酸を含むベクター、発現カセット、および／もしくは細胞の、使用に関する。したがって、一態様は、細胞においてまたは対象においてＦＫＲＰポリペプチドを産生させる方法であって、細胞または対象に本発明の合成核酸、ベクター、および／または形質転換された細胞を送達し、それにより、前記細胞または前記対象においてＦＫＲＰポリペプチドを産生させるステップを含む、方法に関する。合成核酸、ベクター、および／または形質転換された細胞を、ＦＫＲＰをコードする合成核酸の発現が生じて、ＦＫＲＰポリペプチドが産生される条件下で送達する。そのような条件は当技術分野で周知である。
一部の実施形態では、医薬組成物は、組換えＡＡＶベクターを約ｐＨ７．０～約ｐＨ８．０の緩衝液（例えば、賦形剤）中に含む。一部の実施形態では、緩衝液のｐＨは約７．０から約７．５までである。好ましい実施形態では、緩衝液のｐＨは７．５未満である。いくつかの実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。ある特定の実施形態では、緩衝液または賦形剤は、ナトリウム、カリウム、リン酸、塩化物イオン、カルシウム、マグネシウム、硫酸、クエン酸およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるイオンを含む。医薬組成物は、ポリオール、糖などをさらに含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、グリセロールまたはプロピレングリコール、または、ポリエチレングリコール、または、ソルビトール、または、マンニトールを含む。いくつかの実施形態では、ソルビトール濃度は、約１％（ｗ／ｖ）から約１０％（ｗ／ｖ）までにわたる。一部の実施形態では、ソルビトール濃度は、約２％（ｗ／ｖ）から約８％（ｗ／ｖ）までにわたる。好ましい実施形態では、ソルビトール濃度は、約３％（ｗ／ｖ）から約６％（ｗ／ｖ）までにわたる。ある特定の実施形態では、ソルビトール濃度は、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、６％（ｗ／ｖ）、７％（ｗ／ｖ）、８％（ｗ／ｖ）、９％（ｗ／ｖ）、または、１０％（ｗ／ｖ）である。医薬組成物は、非イオン界面活性剤をさらに含む。一部の実施形態では、非イオン界面活性剤は、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体、アルキルグルコシド、アルキルフェノールエトキシレート、ポリソルベート、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、非イオン界面活性剤は、ポロキサマー１８８またはＥｃｏｓｕｒｆ ＳＡ－１５である。ある特定の実施形態では、ポロキサマー１８８またはＥｃｏｓｕｒｆ ＳＡ－１５の濃度は、０．０００５％（ｗ／ｖ）、０．０００８％（ｗ／ｖ）、０．０００９％（ｗ／ｖ）、０．００１％（ｗ／ｖ）、０．００２％（ｗ／ｖ）、０．００２５％（ｗ／ｖ）、０．００３％（ｗ／ｖ）、０．００３５％（ｗ／ｖ）、０．００４％（ｗ／ｖ）、０．００４５％（ｗ／ｖ）、０．００５％（ｗ／ｖ）、０．００６％（ｗ／ｖ）、０．００７％（ｗ／ｖ）、０．００８％（ｗ／ｖ）、０．００９％（ｗ／ｖ）、または、０．０１％（ｗ／ｖ）である。
医薬組成物は、本発明に開示される通り、少なくとも１×１０１０ｖｇ／ｍｌの組換えＡＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、約１×１０１１ｖｇ／ｍｌ～約１×１０１４ｖｇ／ｍｌの組換えＡＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、約１×１０１２ｖｇ／ｍｌ～約８×１０１３ｖｇ／ｍｌの組換えＡＡＶベクターを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１×１０１３ｖｇ／ｍｌ～約６×１０１３ｖｇ／ｍｌの、本発明に開示されるＦＫＲＰポリペプチドをコードする核酸を含む組換えＡＡＶ９ｓｃベクターを含み、ここで、核酸は、ＭＣＫプロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、ｅｎｈ３５８ＭＣＫプロモーター、ＣＫ６プロモーターおよびＳｙｎ１００プロモーター、表１～４または８～１２に列挙されている任意のプロモーター、ならびにその誘導体からなる群から選択されるプロモーターと動作可能に連結している。
一部の実施形態では、肢帯型疾患もしくは障害を有する対象または本発明のｒＡＡＶの投与を必要とする対象に、本発明のｒＡＡＶを投与し、ここで、ｒＡＡＶは、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇから約６×１０１３ｖｇ／ｋｇまでにわたる用量で投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶを、５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、９×１０１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、２×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、４×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または、６×１０１３ｖｇ／ｋｇで投与する。一部の実施形態では、投与されるｒＡＡＶの総用量は、２×１０１４ｖｇ、３×１０１４ｖｇ、５×１０１４ｖｇ、６×１０１４ｖｇ、７×１０１４ｖｇ、８×１０１４ｖｇ、９×１０１４ｖｇ、１×１０１５ｖｇ、２×１０１５ｖｇ、または３×１０１５ｖｇである。
一部の実施形態では、本発明のｒＡＡＶを、経時的に漸増用量で投与する。例えば、ｒＡＡＶを第１の用量として１×１０１３ｖｇ／ｋｇで送達し、次いで、第２の用量として３×１０１３ｖｇ／ｋｇで送達することができる。一実施形態では、対象に、１×１０１３ｖｇ／ｋｇで少なくとも２用量投与し、３×１０１３ｖｇ／ｋｇで少なくとも１用量（例えば、少なくとも２用量、３用量、４用量またはそれよりも多く）投与する。一実施形態では、用量を、例えば、少なくとも４５日間空けた間隔で投与する。
例示的な製剤医薬組成物：
本発明の種々の態様では、医薬組成物は、ｒＡＡＶ－ＦＫＲＰを含む組換えＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９ｓｃ．Ｓｙｎ１００．ｃｏＨｕＦＫＲＰ）を、３０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０００５％（ｗ／ｖ）ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ ７２０中、充填体積５ｍｌまで含む。一部の実施形態では、充填体積は、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、または１０ｍｌである。
本発明の一態様では、医薬組成物は、ｒＡＡＶ－ＦＫＲＰを含む組換えＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９ｓｃ．Ｓｙｎ１００．ｃｏＨｕＦＫＲＰ）を、２０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、３％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．００１％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ（登録商標） Ｓ２０中、充填体積５ｍｌまで含む。一部の実施形態では、充填体積は、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、または１０ｍｌである。
本発明のいくつかの態様では、医薬組成物は、ｒＡＡＶ－ＦＫＲＰを含む組換えＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９ｓｃ．Ｓｙｎ１００．ｃｏＨｕＦＫＲＰ）を、２０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、３％（ｗ／ｖ）ソルビトール、０．００１％（ｗ／ｖ）Ｅｃｏｓｕｒｆ ＳＡ－１５中、充填体積５ｍｌまで含む。一部の実施形態では、充填体積は、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、または１０ｍｌである。
本発明の種々の態様では、医薬組成物は、ｒＡＡＶ－ＦＫＲＰを含む組換えＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９ｓｃ．Ｓｙｎ１００．ｃｏＨｕＦＫＲＰ）を、１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４、３５０ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、０．００１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８中、充填体積５ｍｌまで含む。一部の実施形態では、充填体積は、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、または１０ｍｌである。
本明細書に提示される本発明のいくつかの態様では、医薬組成物は、ｒＡＡＶ－ＦＫＲＰを含む組換えＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９ｓｃ．Ｓｙｎ１００．ｃｏＨｕＦＫＲＰ）を、１５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４、３７５ｍＭのＮａＣｌ、３．５ｍＭのＫＣｌ、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール、０．０００５％（ｗ／ｖ）Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ－１０中、充填体積５ｍｌまで含む。一部の実施形態では、充填体積は、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、または１０ｍｌである。
本発明の一態様では、医薬組成物は、ｒＡＡＶ－ＦＫＲＰを含む組換えＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９ｓｃ．Ｓｙｎ１００．ｃｏＨｕＦＫＲＰ）を、１５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４、３７５ｍＭのＮａＣｌ、３．５ｍＭのＫＣｌ、３％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．０００５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０中、充填体積５ｍｌまで含む。一部の実施形態では、充填体積は、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、または１０ｍｌである。
処置および治療薬
本発明の態様は、細胞（例えば、筋細胞）におけるまたは機能的ＦＫＲＰの量を増加させることを必要とする対象の細胞および組織（例えば、骨格筋および／または心筋などの筋細胞）における機能的ＦＫＲＰの量を増加させるための、ＦＫＲＰをコードする合成核酸、ならびに合成核酸を含むベクターおよび組成物の使用に関する。本発明の一態様では、ＦＫＲＰをコードする合成核酸、合成核酸を含むベクターおよび組成物を細胞（例えば、骨格筋および／または心筋などの筋細胞）にＦＫＲＰの発現に適した条件下で送達して、それにより、細胞における機能的ＦＫＲＰの量を増加させることができる。一部の実施形態では、細胞における機能的ＦＫＲＰの増加により、細胞におけるα－ジストログリカンのグリコシル化も増加する。一実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにある。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにある。
ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞におけるＦＫＲＰレベルのモジュレーション
本明細書に記載の核酸、ベクター、およびビリオンを使用して、細胞における機能的ＦＫＲＰのレベルをモジュレートすることができる。方法は、細胞に、本明細書に記載の通り２つのＡＡＶ ＩＴＲの間に挿入された本明細書に記載のＦＫＲＰをコードする合成核酸を含む組成物を投与するステップを含む。細胞は、本発明の核酸を投与することができる任意の動物由来のものであってもよい。ＦＫＲＰ異常を有する対象由来の哺乳動物細胞（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヤギなど）は、本発明における使用のための典型的な標的細胞である。一部の実施形態では、細胞は、骨格筋または心筋（ｈｅａｒｔ ｍｕｓｃｌｅ）細胞である。
別の態様では、ＦＫＲＰをコードする核酸を細胞に投与する方法であって、細胞に、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムを、核酸が細胞に導入され、発現されて、ＦＫＲＰが産生される条件下で接触させるステップを含む、方法が本明細書に開示される。一部の実施形態では、細胞は、培養された細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにある細胞である。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト）である。一部の実施形態では、細胞は、筋細胞（例えば、骨格筋または心筋）である。
本発明の別の態様は、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター（例えば、コードされるＦＫＲＰタンパク質を発現する）を用いて形質導入した細胞のｅｘ ｖｉｖｏ送達に関する。そのようなｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子送達を使用して、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターを用いて形質導入した、対象から元々得た細胞を、対象に移植して戻すことができる。さらなる実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）治療を使用して、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターを用いて形質導入した細胞を対象に移植して戻すことができる。適切なｅｘ ｖｉｖｏプロトコールは、いくつかのステップを含み得る。例えば、標的組織（例えば、筋肉）のセグメントを対象から回収し、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターを使用して、ＦＫＲＰコード核酸を組織の細胞に形質導入することができる。次いで、これらの遺伝子改変された細胞を対象に移植して戻すことができる。細胞を対象に再導入するために、標的組織（筋組織）への静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、またはｉｎ ｓｉｔｕ注射を含めたいくつかの手法を使用することができる。本発明で使用することができる別の技法として、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターを用いて形質導入したまたは本明細書に記載のｒＡＡＶベクターを感染させた改変されたｅｘ ｖｉｖｏ細胞のマイクロカプセル化がある。自己および同種異系細胞移植を本発明に従って使用することができる。
本明細書に記載のそのような方法を使用して、処置することを必要とする対象（例えば、ＦＫＲＰ異常を有する対象）を処置することができる。一実施形態では、方法は、上で考察されている方法によって作製された、ＦＫＲＰを発現する対象の細胞を、薬学的に許容される担体中、治療有効量で投与することを含む。一部の実施形態では、対象はヒトである。
対象におけるＦＫＲＰレベルおよび活性の増加
本明細書に記載の核酸、ベクター、およびビリオンを使用して、対象における機能的ＦＫＲＰのレベルをモジュレートすることができる。方法は、対象に、２つのＡＡＶ ＩＴＲの間に挿入されたＦＫＲＰをコードする合成核酸を含む本明細書に記載のｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶベクターを含む組成物を投与することを含み、ここで、ｈＦＫＲＰは筋肉特異的プロモーターと動作可能に連結している。一実施形態では、対象は、そのようなモジュレーションを必要としている。
「それを必要とする対象」という用語は、本明細書で使用される場合、対象の現下のまたは予測される状態を指す。そのような対象は、診断されたジストログリカノパチー障害（例えば、ＬＧＭＤ２Ｉなどの、ＦＫＲＰ異常に起因するもの）を有する対象であり得る、または、そのような障害が発生するリスクがある対象であり得る。対象は、任意の動物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヤギなど）であってもよい。本発明の方法および組成物は、１つまたは複数の筋肉（例えば、骨格筋および／または心筋）におけるα－ジストログリカンのグリコシル化を増加させることが有益であろう、ＦＫＲＰが欠乏しているヒト対象に特に適用可能である。一実施形態では、対象は、ＦＫＲＰ異常（例えば、ＦＫＲＰの欠乏）を有する。ＦＫＲＰ異常は、対象の筋組織における機能的ＦＫＲＰのレベルの、正常な対象の同じ組織における機能的ＦＫＲＰのレベルと比較した低下をもたらす状態である。機能的ＦＫＲＰのレベルの低下により、グリコシル化α－ジストログリカンの欠乏がもたらされ得る。そのような状態は、対象のＦＫＲＰ遺伝子の直接的な変異に起因する場合もあり、内在性ＦＫＲＰの発現および／または産生の間接的な破壊に起因する場合もある。ＦＫＲＰ遺伝子の変異は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｉなどの種々の疾患／障害に寄与することが見いだされている。機能的ＦＫＲＰのレベルの上昇が有益であることが分かっている障害としては、限定することなく、肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ、先天性筋ジストロフィー、ウォーカー－ワールブルグ症候群、および筋眼脳病が挙げられる。それを必要とする対象は、そのような状態または障害の１つまたは組合せを有する対象であり得る、またはそれが発生するリスクがある対象であり得る。筋組織における機能的ＦＫＲＰのレベルを上昇させることによって改善する可能性があるジストログリカノパチー障害をもたらす別の状態を有するまたはそれが発生するリスクがある対象も、「それを必要とする」対象を構成する。対象が、状態が発生するリスクがあることは、当技術分野で公知の種々の手段、例えば、遺伝子解析、家族歴、および／または疾患もしくは障害に対する素因に関連付けられる前提条件によって決定することができる。
一部の実施形態では、対象は成体である。一部の実施形態では、対象は若齢期個体である。一部の実施形態では、対象は乳幼児期個体である。一部の実施形態では、対象は、障害の１つまたは複数の症状を顕在化する。一部の実施形態では、対象は、障害の１つまたは複数の症状を顕在化できない。一部の実施形態では、対象は、投与前に有意な疾患病態を示している。一部の実施形態では、対象は、投与前に有意な疾患病態を示していない。
さらに、本明細書に記載の核酸、ベクター、およびビリオンを、ヒトを含めた動物に、任意の適切な製剤で任意の適切な方法によって投与することができる。例えば、本明細書に開示される方法および組成物のいずれの実施形態でも、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムを、対象の骨格筋および心筋（ｈｅａｒｔ ｍｕｓｃｌｅ）に送達するために、対象に直接導入することができる。投与は、標的組織（筋肉）におけるＦＫＲＰ導入遺伝子の発現をもたらす任意の手段によるものであってもよい。一部の実施形態では、投与は、全身性のものである（例えば、静脈内注入）。種々の全身性投与経路が当業者に公知であり、また、本明細書に提示されている。適した全身性経路はベクターおよび対象に依存する。一部の実施形態では、投与は局所的（例えば、筋肉標的に直接）である。
本明細書に開示される方法および組成物のいずれの実施形態でも、方法は、対象における障害（例えば、機能的ＦＫＲＰタンパク質の欠乏に起因するジストログリカノパチー障害および／またはＬＧＭＤ２Ｉまたは別の障害）を処置することを対象とし、ここで、障害に罹患している患者に、本明細書に開示される治療有効量ｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムを投与する。投与後、外因性ＦＫＲＰ核酸が対象の標的細胞（筋肉）において発現され、それにより、筋組織における機能的ＦＫＲＰタンパク質レベルが上昇する。そのような上昇は、直接的に（例えば、生検により）または間接的に（例えば、機能的に）検出可能である。一実施形態では、機能的ＦＫＲＰタンパク質レベルの上昇により、障害の一因となる機能的ＦＫＲＰ欠乏が代償される。一部の実施形態では、本明細書に開示される治療用化合物の、障害（例えば、ＬＧＭＤ２Ｉ）の処置に関する効果を、これだけに限定することなく、障害に関連する１つもしくは複数の臨床症状および／または生理的指標に基づいて個体における改善を観察することによって決定することができる。一部の実施形態では、障害（例えば、ＬＧＭＤ２Ｉ）に関連する症状の改善は、並行治療の必要性が減少することによって示され得る。
一部の実施形態では、対象の骨格筋およびまたは心筋におけるα－ジストログリカンの機能的グリコシル化が実質的に増加する。そのような増加は、直接的手段によって（例えば、生検により）または間接的手段によって（例えば、機能的に）検出することができる。一部の実施形態では、処置を受ける対象は、血清クレアチンキナーゼの、処置を受ける前の血清クレアチンキナーゼと比較して有意なまたは実質的な（持続的な、統計的に有意な量の）減少を示す。一部の実施形態では、処置を受ける対象は、レシピエント骨格筋におけるコラーゲン沈着の、処置を受ける前のコラーゲン沈着と比較して有意なまたは実質的な減少を示す。一部の実施形態では、処置の結果、対象のレシピエント筋組織（例えば、ヒラメ筋、横隔膜、および／またはＥＤＬ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ筋力の有意な増加がもたらされる。一部の実施形態では、処置の結果、対象が身体作業をより良好にまたはより長い期間にわたって行うこと、例えば、有意に長い距離を走ること（例えば、トレッドミル試験において）ができるようになる。
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターまたはＡＡＶゲノムである、本明細書に記載のｒＡＡＶ ＦＫＲＰ構築物（例えば、ＡＡＶ９を含めた、表６に記載されている任意の血清型のＡＡＶベクター）の投与により、レシピエント対象（例えば、本明細書に記載のジストログリカノパチーを有する）における血清クレアチンキナーゼレベル、コラーゲン沈着レベルのうちの１つまたは複数を、投与前と比較して、または同じ処置を受けていない対象と比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％低下させることが可能である。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示される本明細書に記載のｒＡＡＶ ＦＫＲＰ構築物（例えば、ＡＡＶ９を含めた、表６に記載されている任意の血清型のＡＡＶベクター）の投与により、レシピエント対象（例えば、本明細書に記載のジストログリカノパチーを有する）における血清クレアチンキナーゼレベル、コラーゲン沈着レベル、疼痛および／または嗜眠のうちの１つまたは複数を、投与前と比較して、または同じ処置を受けていない対象と比較して、例えば、約１０％～約１００％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、または約６０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％、または約５０％～約７０％低下させることが可能である。
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターまたはＡＡＶゲノムである、本明細書に記載のｒＡＡＶ ＦＫＲＰ構築物（例えば、ＡＡＶ９を含めた、表６に記載されている任意の血清型のＡＡＶベクター）の投与により、ジストログリカノパチー障害に関連する有害作用を、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を減少させることが可能であり、ジストログリカノパチー障害に関連する有害作用の重症度が、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少する。別の実施形態では、ジストログリカノパチー障害に関連する有害作用が、投与前と比較して、または同じ処置を受けていない対象と比較して、約１０％～約１００％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、または約６０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％、または約５０％～約７０％減少する。そのような有害作用としては、限定することなく、わずかな筋肉の強度（ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）、わずかな筋肉の可動性、筋痙攣、心臓に関する問題、視覚に関する問題、呼吸困難（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ）、嚥下困難、顔の筋肉の衰え、立ち上がることが困難であること、階段を上ることが困難であること、走ることが困難であること、跳び跳ねることが困難であることが挙げられる。
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターまたはＡＡＶゲノムである、本明細書に記載のｒＡＡＶ ＦＫＲＰ構築物（例えば、ＡＡＶ９を含めた、表６に記載されている任意の血清型のＡＡＶベクター）の投与により、対象の骨格筋および／または心筋における機能的ＦＫＲＰの発現および／またはα－ジストログリカンの機能的グリコシル化を、投与前と比較して、または同じ処置を受けていない対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％増加させることが可能である。
別の実施形態では、対象の骨格筋および／または心筋における機能的ＦＫＲＰの発現および／またはα－ジストログリカンの機能的グリコシル化のレベルが、投与前と比較して、または同じ処置を受けていない対象と比較して、約１０％～約１００％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、または約６０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％、または約５０％～約７０％増加する。
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターまたはＡＡＶゲノムである、本明細書に記載のｒＡＡＶ ＦＫＲＰ構築物（例えば、ＡＡＶ９を含めた、表６に記載されている任意の血清型のＡＡＶベクター）の投与により、レシピエント対象の、所与の身体作業（例えば、歩くことまたは走ること）を行う能力を、投与前と比較して、または同じ処置を受けていない対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、または約１０％～約１００％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、または約６０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％、もしくは約５０％～約７０％増加させることが可能である。
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターまたはＡＡＶゲノムである、本明細書に記載のｒＡＡＶ ＦＫＲＰ構築物（例えば、ＡＡＶ９を含めた、表６に記載されている任意の血清型のＡＡＶベクター）の投与により、レシピエント対象の、所与の身体作業（例えば、歩くことまたは走ること）を行う能力を、投与前と比較して、または同じ処置を受けていない対象と比較して、約１００％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％など、増加させることが可能である。言い換えると、所与の身体作業を行う能力が、投与前と比較して、または同じ処置を受けていない対象と比較して、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、またはそれよりも大きく増加する。
「１回換気量」は、特別な努力が適用されない場合の正常な吸気と呼気との間に入れ替わる正常な空気の量を表す、肺気量である。健康な若年ヒト成体では、１回換気量は、吸気当たりおよそ５００ｍＬまたは体重１ｋｇ当たり７ｍＬである。ジストログリカノパチー障害（例えば、ＬＧＭＤ２Ｉ）を有する対象では１回換気量が損なわれる。本発明の一部の実施形態では、ＬＧＭＤ２Ｉなどのジストログリカノパチー障害を有する対象にｒＡＡＶ ＦＫＲＰ構築物を治療有効量で投与することにより、対象の１回換気量が有意に改善される。
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターまたはＡＡＶゲノムである、本明細書に記載のｒＡＡＶ ＦＫＲＰ構築物（例えば、ＡＡＶ９を含めた、表６に記載されている任意の血清型のＡＡＶベクター）の投与により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ筋力（例えば、ヒラメ筋、横隔膜および／またはＥＤＬ筋）、および／または１回換気量（例えば、本明細書に記載の通り分析して）を、投与前と比較して、または同じ処置を受けていない当該対象の筋肉と比較して、または同じ処置を受けていない対象の当該筋肉と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、または約１０％～約１００％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、もしくは約６０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％、または約５０％～約７０％増加させることが可能である。
免疫抑制
本明細書に開示される方法および組成物のいずれの実施形態でも、本明細書に開示されるＦＫＲＰ導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムの投与を受ける対象は、免疫抑制剤の投与を受ける。ＡＡＶの投与を受ける患者の免疫応答の免疫抑制をもたらすための様々な方法が公知である。当技術分野で公知の方法は、患者にプロテアソーム阻害剤などの免疫抑制剤を投与することを含む。当技術分野で公知のそのようなプロテアソーム阻害剤の１つは、例えば、どちらも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１６９，４９２号および米国特許出願第１５／７９６，１３７号に開示されている通り、ボルテゾミブである。別の実施形態では、免疫抑制剤は、例えば、抗体産生細胞を排除または抑制することによって免疫応答を抑制することが可能な、ポリクローナル、モノクローナル、ｓｃｆｖまたは他の抗体由来分子を含めた、抗体であり得る。さらなる実施形態では、免疫抑制性エレメントは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。そのような実施形態では、ｓｈＲＮＡのコード領域をｒＡＡＶカセットに含め、一般に、ポリＡ尾部に対して下流、３’側に配置する。サイトカイン、成長因子（トランスフォーミング成長因子β１およびβ２、ＴＮＦならびに公的に知られているその他のものを含める）などの免疫賦活剤の発現が減少または排除されるように、ｓｈＲＮＡをターゲティングすることができる。
対象における免疫系を抑制するための免疫抑制剤および方法は、例えば、米国特許第１０，０２８，９９３号；同第９，５９２，２４７号；同第８，８０９，２８２号；同第９，１８６，４２０号；および同第１０，０９８，９０５号に記載されている。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、免疫グロブリン分解酵素、例えば、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、ＩｄｅＳ／Ｚ、Ｅｎｄｏ Ｓ、またはそれらの機能的バリアントである。そのような免疫グロブリン分解酵素およびそれらの使用に関する参考文献の非限定的な例は、それぞれの全体が参照により組み込まれる、ＵＳ７，６６６，５８２、ＵＳ８，１３３，４８３、ＵＳ２０１８００３７９６２、ＵＳ２０１８００２３０７０、ＵＳ２０１７０２０９５５０、ＵＳ８，８８９，１２８、ＷＯ２０１００５７６２６、ＵＳ９，７０７，２７９、ＵＳ８，３２３，９０８、ＵＳ２０１９０３４５５３３、ＵＳ２０１９０２６２４３４、およびＷＯ２０２００１６３１８に記載されている。
ステロイド
一実施形態では、対象に、本明細書に記載のＡＡＶまたは任意の治療薬と共にステロイドをさらに投与する。一実施形態では、ステロイドはプレドニゾンである。一実施形態では、ステロイドはコルチコステロイドである。例示的なコルチコステロイドとしては、（１）ヒドロコルチゾン／コルチゾン；（２）プレドニゾロン／プレドニゾン／メチルプレドニゾロン；（３）ベタメタゾン／デキサメタゾン；および（４）トリアムシノロンが挙げられる。一実施形態では、ステロイドは、アルクロメタゾン、アルクロメタゾンジプロピオン酸エステル、アムシノニド、増強ベタメタゾン、増強ベタメタゾンジプロピオン酸エステル（ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ ｄｉｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ベクロメタゾン、ベクロメタゾンジプロピオン酸エステル、ベタメタゾン、安息香酸ベタメタゾン、ベタメタゾンジプロピオン酸エステル、ベタメタゾンリン酸エステルナトリウム、ベタメタゾン吉草酸エステル、ブデソニド、クロベタゾール、クロベタゾールプロピオン酸エステル、クロコルトロン、ピバル酸クロコルトロン、コルチゾン、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、デキサメタゾン酢酸エステル、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、ジフロラゾン、ジフロラゾンアセトニド、ジフロラゾン二酢酸エステル、フルオシノロン（flucinolone）、フルドロキシコルチド、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルランドレノリド、フルチカゾン、フルチカゾンプロピオン酸エステル、ハルシノニド、ハロベタゾール、ハロベタゾールプロピオン酸エステル、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン酢酸エステル、酪酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンリン酸エステルナトリウム、吉草酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン酢酸エステル、メチルプレドニゾロンコハク酸エステルナトリウム、モメタゾン、フランカルボン酸モメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾロン酢酸エステル、プレドニゾロンリン酸エステルナトリウム、プレドニゾロンテブト酸エステル、プレドニゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロン二酢酸エステル、トリアムシノロンヘキサセトニド、ウロベタゾール、これらのステロイドのうちの２つもしくはそれよりも多くの組合せ、またはこれらのステロイドの市販品から選択される。
一実施形態では、ステロイドを経口投与する。本発明のステロイドを、定義される全身または局所投与に包含される任意の経路によって投与することができる。例えば、本発明のステロイドを皮膚に局所適用すること、眼に局所適用すること、経口摂取すること、肺に直接吸入すること、静脈内もしくは筋肉内に注射すること、または炎症を起こしている関節に直接注射することができる。経口経路によって投与することができるステロイドとしては、これだけに限定されないが、以下のステロイド：ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、これらのステロイドのうちの２つまたはそれよりも多くの組合せ、およびこれらのステロイドの市販品が挙げられる。非経口的注射などの非経口経路によって投与することができるステロイドとしては、これだけに限定されないが、以下のステロイド：ベタメタゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、これらのステロイドのうちの２つまたはそれよりも多くの組合せ、およびこれらのステロイドの市販品が挙げられる。吸入によって投与することができるステロイドとしては、これだけに限定されないが、以下のステロイド：ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、これらのステロイドのうちの２つまたはそれよりも多くの組合せ、およびこれらのステロイドの市販品が挙げられる。局部経路によって投与することができるステロイドとしては、これだけに限定されないが、以下のステロイド：アルクロメタゾン、アムシノニド、増強ベタメタゾン、ベタメタゾン、クロベタゾール、クロコルトロン、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、フルオシノロン、フルオシノニド、フルランドレノリド、フルチカゾン、ハルシノニド、ハロベタゾール、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、プレドニカルベート、トリアムシノロン、これらのステロイドのうちの２つまたはそれよりも多くの組合せ、およびこれらのステロイドの市販品が挙げられる。特定のステロイドを１つよりも多くの経路によって適用することができる、例えば、局部製剤に利用されるステロイドを静脈内または経口投与に適応させることができることが、当業者には理解されよう。
一実施形態では、ステロイドを本明細書に記載のＡＡＶまたは治療薬と実質的に同じ時間に投与する。一実施形態では、ステロイドを本明細書に記載のＡＡＶまたは治療薬の投与の、少なくとも８時間後に、１６時間後に、２４時間後に、３２時間後に、４０時間後またはそれよりも後（40 hours for more）に投与する。一実施形態では、ステロイドを本明細書に記載のＡＡＶまたは治療薬の投与の、少なくとも８時間前に、１６時間前に、２４時間前に、３２時間前に、４０時間前またはそれよりも前（40 hours for more）に投与する。一実施形態では、ステロイド、例えば、プレドニゾンを１日当たり体重１ｋｇ当たり１ｍｇ、総用量６０ｍｇまでの用量で４週間にわたって投与し、その後、少なくとも１２週間にわたって、各週、最も近い１ｍｇ単位にして約０．０８ｍｇ／ｋｇずつ、例えば、６０ｍｇを摂取している場合には５ｍｇずつ減少させて投与する。
ステロイドには、これだけに限定されないが、（１）抗炎症使用、例えば、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、およびトリアムシノロン；（２）制吐使用、例えば、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、およびプレドニゾン；（３）診断への使用、例えば、クッシング症候群を検出するために使用される場合のデキサメタゾン；ならびに（４）免疫抑制使用、例えば、ベタメタゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン（methylprednicolone）、プレドニゾロン、プレドニゾン、およびトリアムシノロンを含めた種々の医学的使用があることが、当業者には理解されよう。さらに、コルチコステロイド薬物を、眼用製品（種々の眼の状態を処置するためのもの）、吸入器（喘息または気管支疾患を処置するためのもの）、点鼻剤および噴霧剤（種々の鼻の状態を処置するためのもの）、ならびに軟膏剤およびクリーム剤などの外用製品（種々の皮膚の状態を処置するためのもの）に含有される成分として使用することができることが、当業者には理解されよう。
ステロイド間で効力が変動し得ることが当業者には理解されよう。例えば、全身投与に関連する場合、ベタメタゾンおよびデキサメタゾンは、高い全体的な効力および高い抗炎症効力を示し、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、プレドニゾロン、およびプレドニゾンは、中程度の全体的な効力および中程度の抗炎症効力を示し、ヒドロコルチゾンおよびコルチゾンは、低い全体的な効力および抗炎症効力を示す。
リビトール
一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶまたは治療薬をリビトールと並行して投与する。リビトールは、リボースの還元によって形成される結晶性のペントースアルコールである。リビトールは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける、Ｄ－リボースおよびリビトールの産生のためのＤ－グルコースのペントースリン酸経路への流入を増強する。リビトールは、ジストロフィーマウスモデルにおいてα－ジストログリカンのグリコシル化をもたらすことが以前に示されている；この作用は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Cataldi, MP, et al. Molecular Therapy: Methods and Clinical Dev., Volume 17, June 2020にさらに記載されている。
リビトールは、例えばＳｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）によって市販されており、以下の化学構造を有する
Figure 2023545731000106
一実施形態では、リビトールを本明細書に記載のＡＡＶまたは治療薬と実質的に同じ時間に投与する。一実施形態では、リビトールを本明細書に記載のＡＡＶまたは治療薬の投与の少なくとも８時間後、１６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、１２４時間後またはそれよりも後に投与する。一実施形態では、リビトールを本明細書に記載のＡＡＶまたは治療薬の投与の少なくとも８時間前、１６時間前、２４時間前、４８時間前、７２時間前、１２４時間前またはそれよりも前に投与する。
一実施形態では、リビトールを少なくとも１回投与する。一実施形態では、リビトールを少なくとも２回、例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回またはそれよりも多く投与する。一実施形態では、リビトールを少なくとも毎日１回、少なくとも毎週１回、少なくとも毎月１回、少なくとも毎年１回投与する。例示的なリビトールレジメンは、本明細書に記載のＦＫＲＰ治療薬を含むｒＡＡＶと共投与する場合、リビトール約６グラム～約１２グラムを毎日１回または２回経口投与することを含む。一部の実施形態では、共投与レジメンにおいて、本発明に記載のＦＫＲＰ治療薬を含むｒＡＡＶと一緒に、その前に、またはその後に投与する場合、約１グラム、約２グラム、約３グラム、約４グラム、約５グラム、約６グラム、約７グラム、約８グラム、約９グラム、約１０グラム、約１１グラム、または、約１２グラムのリビトールを経口投与する。一部の実施形態では、共投与レジメンにおいて、本発明に記載のＦＫＲＰ治療薬を含むｒＡＡＶと一緒に、その前に、またはその後に投与する場合、約１２グラムよりも多くのリビトールを経口投与する。一実施形態では、リビトールを毎日２回、共投与する。一実施形態では、リビトールを毎日３回、共投与する。一実施形態では、リビトールを毎日３回よりも多く、共投与する。一部の実施形態では、リビトールを経口的に、または鼻腔内に、または静脈内経路によって、または皮下経路によって、または筋肉内経路によって、または髄腔内経路によって、または舌下および頬側経路によって、または直腸経路によって、または鼻経路によって、または吸入経路によって、または噴霧経路によって、または皮膚経路によって、または、経皮経路によって、共投与する。好ましい実施形態では、リビトールを、本発明に記載のＦＫＲＰ治療薬を含むｒＡＡＶと一緒に、その前に、またはその後に投与する場合、経口的に共投与する。
投与量
対象に投与される本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムの投与量は、投与形式、処置および／または予防される疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクターまたはカプシド、ならびに送達される核酸などに依存し、常套的な様式で決定することができる。治療効果を実現するための例示的な用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５形質導入単位、必要に応じて、約１０８～約１０１３形質導入単位の力価である。本発明の一部の実施形態では、投与量は、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇから約６×１０１３ｖｇ／ｋｇまでである。一部の実施形態では、投与量は、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇから約３×１０１３ｖｇ／ｋｇまでである。一部の実施形態では、投与量は、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇから約６×１０１３ｖｇ／ｋｇまでである。一部の実施形態では、投与量は、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、２×１０１３ｖｇ／ｋｇ、２．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、４×１０１３ｖｇ／ｋｇ、４．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または６×１０１３ｖｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、投与量は、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇから約６×１０１４ｖｇ／ｋｇまでである。一実施形態では、投与量は、３×１０１４ｖｇ／ｋｇである。
投与経路およびレジメン
投与経路としては、限定することなく、所望の投与経路および標的とされる組織に応じて、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルによる）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、子宮内（または卵）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格筋、横隔膜および／または心筋への投与を含む］、皮内、胸膜内、脳内、および関節内）、局部（例えば、皮膚および気道表面を含めた粘膜表面の両方への投与、ならびに経皮投与）、リンパ内など、ならびに直接的な組織もしくは器官への注射（例えば、骨格筋、心筋、横隔膜筋への注射）または他の非経口経路が挙げられる。
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本発明による骨格筋への限局的投与は、これだけに限定されないが、四肢（例えば、上腕、前腕、上腿、および／または下腿）、背中、頸部、頭部（例えば、舌）、胸郭、腹部、骨盤／会陰部、および／または指の骨格筋への投与を含む。適切な骨格筋としては、これだけに限定されないが、小指外転筋（手）、小指外転筋（足）、母指外転筋、第五中足骨外転筋、短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転筋、長内転筋、大内転筋、母指内転筋、肘筋、前斜角筋、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、烏口腕筋、雛眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、顎二腹筋、背側骨間筋（手）、背側骨間筋（足）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、指伸筋、短指伸筋、長指伸筋、短母趾伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋、短母指伸筋、長母指伸筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（手）、短小指屈筋（足）、短指屈筋、長指屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋、長母指屈筋、前頭筋、腓腹筋、オトガイ舌骨筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、薄筋、頸腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸肋筋、腸骨筋、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘突間筋、横突間筋（intertransversi）、外側翼突筋、外側直筋、広背筋、口角挙筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長回旋筋（ｌｏｎｇ ｒｏｔａｔｏｒ）、頭最長筋、頸最長筋、胸最長筋、頭長筋、頸長筋、虫様筋（手）、虫様筋（足）、咬筋、内側翼突筋、内側直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第三腓骨筋、梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頸筋、膝窩筋、後斜角筋、方形回内筋、円回内筋、大腰筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半膜様筋、頭半棘筋、頸半棘筋、胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短回旋筋（ｓｈｏｒｔ ｒｏｔａｔｏｒ）、ヒラメ筋、頭棘筋、頸棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頸板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸部の筋、甲状舌骨筋、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋、および小頬骨筋、ならびに当技術分野で公知の任意の他の適切な骨格筋が挙げられる。
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、心筋への限局的投与には、左心房、右心房、左心室、右心室および／または中隔への投与が含まれる。ウイルスベクターおよび／またはカプシドを心筋に静脈内投与、大動脈内投与などの動脈内投与、直接的な心臓内注射（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室内）、および／または冠状動脈灌流によって送達することができる。
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与、ならびに直接的な筋肉注射を含めた任意の適切な方法によるものであってもよい。
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムを対象の骨格筋、横隔膜、肋骨筋、および／または心筋細胞に投与する。例えば、従来のシリンジおよび針を使用して、ｒＡＡＶビリオン懸濁液を対象に局所または全身注射することができる。ｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムの注射による非経口投与は、例えば、ボーラス注射または連続注入によって実施することができる。注射用製剤は、単位剤形として、例えば、保存剤を添加したアンプルまたは複数回用量容器中に提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤などの形態をとってもよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの、医薬製剤のための作用剤を含有してもよい。あるいは、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムは、使用前に適切なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水を用いて構成するために、粉末の形態（例えば、凍結乾燥されたもの）であってもよい。
一部の実施形態では、単回投与を用いる。一部の実施形態では、１回よりも多くの投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回など、またはそれよりも多くの投与）を用いて、種々の間隔、例えば、毎時、毎日、毎週、毎月、毎年などの期間にわたって所望のレベルの遺伝子発現を実現することができる。投与は、単回投与量または累積的なもの（連続的な投与）であり得、当業者が容易に決定することができる。例えば、疾患または障害の処置は、本明細書に開示される医薬組成物のウイルスベクターを有効用量で一回投与することを含み得る。あるいは、疾患または障害の処置は、ウイルスベクターを有効用量で複数回投与することを含み得、複数回投与は、種々の期間にわたって、例えば、毎日１回、毎日２回、毎日３回、数日ごとに１回、または毎週１回、行われる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムの対象への投与は、毎日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、またはそれよりも長く行われる。
投与のタイミングは、個体の年齢および／または個体の症状の重症度などの因子に応じて個体間で変動し得る。例えば、本明細書に開示されるウイルスベクターの有効用量を６カ月毎に１回、無期限で、または個体に治療が必要なくなるまで、個体に投与することができる。個体の状態を処置の過程全体を通してモニタリングすることができること、および投与される本明細書に開示されるウイルスベクターの有効量を適宜調整することができることが、当業者には理解されよう。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムの対象への投与により、循環半減期が２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間またはそれよりも長いＦＫＲＰタンパク質の産生がもたらされる。
投与の有効性は、当技術分野で公知の様々なアッセイ、例えば、肢帯型筋ジストロフィーのための北極星評価（Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｌｉｍｂ Ｇｉｒｄｌｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ）（ＮＳＡＤ）（例えば、Jacobs MB, et al. Ann Neurol. 2021 May;89(5):967-978. doi: 10.1002/ana.26044. Epub 2021 Feb 26.に記載されている）；疾患の改善、重症度、および治療有効性に関する臨床全般印象（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＣＧＩ）；１０メートル歩行テスト（１０ＭＷＴ）（例えば、McDonald CM, et al. Muscle Nerve. 2013 Sep; 48(3):357-68. doi: 10.1002/mus. 23905. Epub 2013 Jul 17.に記載されている）；１００メートル歩行テスト（１００ＭＷＴ）（例えば、Mendel, et al. JAMA Neurol. 2020;77(9):1122-1131. doi: 10.1001/jamaneurol.2020.1484に記載されている）；４段の階段上り（４ＳＣ）；タイムドアップアンドゴー（Ｔｉｍｅｄ－Ｕｐ ａｎｄ －Ｇｏ）（ＴＵＧ）；上肢パフォーマンス（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｕｐｐｅｒ Ｌｉｍｂ）（ＰＵＬ）（例えば、Gandolla M, et al. PLoS One. 2020 Sep 28;15(9):e0239064. doi: 10.1371/journal. pone. 0239064に記載されている）；および／または患者報告アウトカム尺度（例えば、個別化生活の質、疲労、眠気、うつ病スコア）によって評価することができる。
一実施形態では、本明細書に記載のＦＫＲＰ治療薬を含むｒＡＡＶを受けている対象は、ベースラインから少なくともまたは約１．７３点であるＮＳＡＤスコアを示す。一実施形態では、本明細書に記載の治療薬を受けている対象は、ベースラインから少なくともまたは約０．１点、０．２点、０．３点、０．４点、０．５点、０．６点、０．７点、０．８点、０．９点、１点、１．１点、１．２点、１．３点、１．４点、１．５点、１．６点、１．７点、１．８点、１．９点、２点、２．１点、２．２点、２．３点、２．４点、２．５点、２．６点、２．７点、２．８点、２．９点、３点、３．１点、３．２点、３．３点、３．４点、３．５点、３．６点、３．７点、３．８点、３．９点、４点、４．１点、４．２点、４．３点、４．４点、４．５点、４．６点、４．７点、４．８点、４．９点、５点またはそれよりも大きな点であるＮＳＡＤスコアを示す。本明細書で使用される場合、「ベースライン」は、治療薬の投与を受ける前の対象のＮＳＡＤスコアを指す。ＮＳＡＤスコアの評価の仕方は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Jacobs MB, et al. Assessing Dysferlinopathy Patients Over Three Years With a New Motor Scale. Ann Neurol. 2021 May;89(5):967-978に記載されている通り、当業者には理解されよう。
一実施形態では、本明細書に記載のＦＫＲＰ治療薬を含むｒＡＡＶを受けている対象は、ベースラインから少なくともまたは約３１％（例えば、２．３秒）である１０ＭＷＴスコアを示す。一実施形態では、本明細書に記載の治療薬を受けている対象は、ベースラインから少なくともまたは約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるまたはそれよりも大きい１０ＭＷＴスコアを示す。本明細書で使用される場合、「ベースライン」は、治療薬の投与を受ける前の対象の１０ＭＷＴスコアを指す。１０ＭＷＴスコアの評価の仕方は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、McDonald CM, et al. The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study. Muscle Nerve. 2013 Sep;48(3):357-68.に記載されている通り、当業者には理解されよう。
一実施形態では、本明細書に記載のＦＫＲＰ治療薬を含むｒＡＡＶを受けている対象は、ベースラインから少なくともまたは約６秒である１００ＭＷＴスコアを示す。一実施形態では、本明細書に記載の治療薬を受けている対象は、ベースラインから少なくともまたは約０．５秒、１秒、２秒、３秒、４秒、５秒、６秒、７秒、８秒、９秒、１０秒、１１秒、１２秒、１３秒、１４秒、１５秒、１６秒、１７秒、１８秒、１９秒、２０秒、２１秒、２２秒、２３秒、２４秒、２５秒、２６秒、２７秒、２８秒、２９秒、３０秒、３１秒、３２秒、３３秒、３４秒、３５秒、３６秒、３７秒、３８秒、３９秒、４０秒、４１秒、４２秒、４３秒、４４秒、４５秒、４６秒、４７秒、４８秒、４９秒、５０秒、５１秒、５２秒、５３秒、５４秒、５５秒、５６秒、５７秒、５８秒、５９秒、６０秒またはそれよりも長い１００ＭＷＴスコアを示す。本明細書で使用される場合、「ベースライン」は、治療薬の投与を受ける前の対象の１００ＭＷＴスコアを指す。１００ＭＷＴスコアの評価の仕方は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Mendell JR, et al. Assessment of Systemic Delivery of rAAVrh74. MHCK7. micro-dystrophin in Children With Duchenne Muscular Dystrophy: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA Neurol. 2020; 77 (9): 1122-1131.に記載されている通り、当業者には理解されよう。
一実施形態では、本明細書に記載のＦＫＲＰ治療薬を含むｒＡＡＶを受けている対象は、ベースラインから少なくともまたは約３０％である４ＳＣスコアを示す。一実施形態では、本明細書に記載の治療薬を受けている対象は、ベースラインから少なくともまたは約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるまたはそれよりも大きい４ＳＣスコアを示す。本明細書で使用される場合、「ベースライン」は、治療薬の投与を受ける前の対象の４ＳＣスコアを指す。４ＳＣスコアの評価の仕方は当業者には理解されよう。
一実施形態では、本明細書に記載のＦＫＲＰ治療薬を含むｒＡＡＶを受けている対象は、ベースラインから少なくともまたは約３０％であるＴＵＧスコアを示す。一実施形態では、本明細書に記載の治療薬を受けている対象は、ベースラインから少なくともまたは約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるまたはそれよりも大きいＴＵＧスコアを示す。本明細書で使用される場合、「ベースライン」は、治療薬の投与を受ける前の対象のＴＵＧスコアを指す。ＴＵＧスコアの評価の仕方は当業者には理解されよう。
一実施形態では、本明細書に記載のＦＫＲＰ治療薬を含むｒＡＡＶを受けている対象は、ベースラインから少なくともまたは約４点であるＰＵＬスコアを示す。一実施形態では、本明細書に記載の治療薬を受けている対象は、ベースラインから少なくともまたは約０．１点、０．２点、０．３点、０．４点、０．５点、０．６点、０．７点、０．８点、０．９点、１点、１．１点、１．２点、１．３点、１．４点、１．５点、１．６点、１．７点、１．８点、１．９点、２点、２．１点、２．２点、２．３点、２．４点、２．５点、２．６点、２．７点、２．８点、２．９点、３点、３．１点、３．２点、３．３点、３．４点、３．５点、３．６点、３．７点、３．８点、３．９点、４点、４．１点、４．２点、４．３点、４．４点、４．５点、４．６点、４．７点、４．８点、４．９点、５点、５．１点、５．２点、５．３点、５．４点、５．５点、５．６点、５．７点、５．８点、５．９点、６点、６．１点、６．２点、６．３点、６．４点、６．５点、６．６点、６．７点、６．８点、６．９点、７点、７．１点、７．２点、７．３点、７．４点、７．５点、７．６点、７．７点、７．８点、７．９点、８．０点またはそれよりも大きい点であるＰＵＬスコアを示す。本明細書で使用される場合、「ベースライン」は、治療薬の投与を受ける前の対象のＰＵＬスコアを指す。ＰＵＬスコアの評価の仕方は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Gandolla M, et al. Test-retest reliability of the Performance of Upper Limb (PUL) module for muscular dystrophy patients. PLoS One. 2020 Sep 28; 15 (9): e02390に記載されている通り、当業者には理解されよう。
ウイルス排出アッセイ：
製品ｓｃＡＡＶ９－Ｓｙｎ１００－ｃｏＦＫＲＰ、または、例えば、表１～４のいずれかもしくは表８～１２から選択される合成筋肉プロモーターでＳｙｎ１００プロモーターが置き換えられた、任意のその誘導体に対するウイルス排出アッセイを開発する。排出アッセイは、典型的には、無処置の個体への伝播の尤度に関する情報を収集するために実施される。２０２０年７月６日にＰｆｉｚｅｒによって発表されたデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するＡＡＶ遺伝子治療に関する公開プレゼンテーションでは、ウイルス排出現象が、処置を受けている人の家族（例えば、処置を受けていない同胞）のセロコンバージョンの可能性として実証された。セロコンバージョンは、治療用製品に対する、例えば、処置に使用されるＡＡＶ血清型に対する抗体を有さない状態から抗体を有する状態への変化を示す。ウイルスは、遺伝子治療の一部として投与された後、短時間、体液を通じて、例えば唾液を通じて体外に出て、処置を受けていない人がその排出期間中にその体液に接触した場合、その無処置の人においてウイルスに対する抗体が発生する可能性があり得、それにより、その人が今後必要に応じた遺伝子治療を受けることが妨げられる可能性がある。
排出生成物の存在は、多くの場合、対象の臨床試料、例えば、便、尿、鼻スワブ、唾液に由来する試料において試験される。分析アッセイでは、臨床試料中への排出を、治療用製品をコードする核酸を検出することによって、または感染性ウイルス粒子の存在によって、測定する。ウイルス排出アッセイ結果は、治療用製品が排出されるかどうか、排出生成物が感染性であるかどうか、臨床試料中の感染性の量が第三者における感染開始に必要なものと同等であるかどうか、排出生成物を含有する臨床試料が伝播の天然経路であるかどうかの決定に役立つ。目的、アッセイの設計、分析を含めたウイルス排出アッセイの詳細は、その全体が参照によって組み込まれる、Design and Analysis of shedding studies for virus or, bacteria based gene therapy and oncolytic products, US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research, August 2015において考察されている。
効力アッセイの開発
治療用製品ｓｃＡＡＶ９－ｓｙｎ１００－ｃｏＦＫＲＰまたはその誘導体に対して、治療用製品の調製物の同等性試験および異なるロットもしくはバッチを支持するため、ならびに／または、試験物の応答を指定の参照と比較するため、ならびに／または、ＦＫＲＰの複雑な生物活性（例えば、α－ＤＧのグリコシル化、ラミニン結合）を反映するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイが本発明者らにより開発される。このアッセイは、いくつかの細胞、例えば、ヒト大動脈平滑筋細胞株（ＨＡ－ＶＳＭＣ、または、ＨＡＳＭＣ細胞）、ＬＧＭＤ２Ｉ患者由来ＦＫＲＰ欠乏脊椎傍骨格筋細胞、心筋または骨格筋細胞株に分化するｉＰＳＣ幹細胞株、ＦＫＲＰノックダウンまたはノックアウト細胞株に関して開発されることを意図したものである。
本明細書に記載のアッセイにより、例えば、筋生検組織内のベクターウイルスゲノムコピー、筋生検組織におけるｍＲＮＡ発現および導入遺伝子タンパク質発現（ウエスタンブロットおよび／または免疫組織化学的検査によって測定されるタンパク質発現）を定量すること、筋生検組織における導入遺伝子発現の下流の影響（例えば、生検組織におけるα－ＤＧのグリコシル化、ラミニン結合）を特徴付けることができる。
本明細書に記載のアッセイでは、例えば開放筋生検材料における標的活性の程度、例えば、ベースラインを上回る十分な標的活性があるかどうかをさらに測定することができる。目的のバイオマーカー（例えば、ｄｅ ｎｏｖｏ筋肉バイオマーカー）および（ｓｃＡＡＶ９－ｓｙｎ１００－ｃｏＦＫＲＰ）処理した筋生検材料における標的活性を決定するための筋肉アッセイの重要なアウトプットには、以下が含まれる：筋肉への形質導入の証拠（例えば、筋組織内の多数のＡＡＶ９－Ｓｙｎ１００－ＦＫＲＰベクターゲノムコピー）、筋肉におけるｈＦＫＲＰ（ヒトＦＫＲＰ）導入遺伝子のｍＲＮＡ発現の証拠、ベースラインを上回るｍＲＮＡレベル、筋肉におけるベースラインを上回る健康なＦＫＲＰ酵素レベルの上昇の証拠（例えば、免疫蛍光、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどによるもの）、ベースラインを上回るＦＫＲＰ酵素レベルの上昇に直接関連する下流の活性の増加（例えば、α－ＤＧサブユニットの末端グリコシル化の増加；ラミニン結合の増加）の証拠。ベースラインは、処理前のレベルを指す。一部の場合では、ベースラインは、目的の治療用製品、例えばｓｃＡＡＶ９－ｓｕｎ１００－ｃｏＦＫＲＰを受けていないモック処理後に得られたレベル（the level obtained aster mock treatment）を指す。
製剤
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムを、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターを溶解させるのに十分な量の溶媒、エマルションまたは他の希釈剤中に製剤化することができる。この実施形態の他の態様では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムを、ここでは、例えば、約９０％（ｖ／ｖ）未満、約８０％（ｖ／ｖ）未満、約７０％（ｖ／ｖ）未満、約６５％（ｖ／ｖ）未満、約６０％（ｖ／ｖ）未満、約５５％（ｖ／ｖ）未満、約５０％（ｖ／ｖ）未満、約４５％（ｖ／ｖ）未満、約４０％（ｖ／ｖ）未満、約３５％（ｖ／ｖ）未満、約３０％（ｖ／ｖ）未満、約２５％（ｖ／ｖ）未満、約２０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、または約１％（ｖ／ｖ）未満の量の溶媒、エマルションまたは希釈剤中に製剤化することができる。他の態様では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／または本明細書に開示され得るｒＡＡＶゲノムは、例えば、約１％（ｖ／ｖ）～９０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～７０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～６０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）～１５％（ｖ／ｖ）、または約８％（ｖ／ｖ）～１２％（ｖ／ｖ）の範囲の量の溶媒、エマルションまたは他の希釈剤を含み得る。
本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムの送達を容易にするために、ｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムを担体または賦形剤と混合することができる。使用することができる担体および賦形剤としては、食塩水（特に、滅菌パイロジェンフリー食塩水）、食塩水緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、および炭酸水素緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールが挙げられる。ヒト対象へのビリオンの送達には、ＵＳＰグレード担体および賦形剤が特に有用である。
前記の製剤に加えて、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムを、デポ剤調製物として製剤化することもできる。そのような長時間作用型製剤は、埋め込み（例えば、皮下もしくは筋肉内）によって、またはＩＭ注射によって投与することができる。したがって、例えば、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムを適切なポリマーもしくは疎水性材料を用いて（例えば、許容される油中エマルションとして）またはイオン交換樹脂を用いて、またはやや難溶性の誘導体として製剤化することができる。
注射剤を従来の形態で、液体の液剤または懸濁剤として、注射前に液体中液剤もしくは懸濁剤に適した固体形態として、または乳剤として調製することができる。あるいは、本発明のウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを、全身様式ではなく局所的に、例えば、デポ剤または持続放出製剤として投与することができる。さらに、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを、外科的に埋め込み可能なマトリックスに接着させて送達することができる（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ－２００４－００１３６４５－Ａ１号に記載されている通り）。本明細書に開示されるウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを、対象の肺に任意の適切な手段によって、必要に応じて、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドで構成される呼吸に適した粒子のエアロゾル懸濁液を投与し、それを対象が吸入することによって、投与することができる。呼吸に適した粒子は、液体または固体であり得る。ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを含む液体粒子のエアロゾルは、例えば、当業者には公知の通り、圧力駆動型エアロゾルネブライザーまたは超音波ネブライザーを用いてなど、任意の適切な手段によって作製することができる。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含む固体粒子のエアロゾルも同様に、任意の固体粒子医薬エアロゾル発生器を用いて、製薬技術分野で公知の技法によって作製することができる。
本明細書に開示される技術の組成物および方法の全ての態様を、以下の番号を付した項のうちの任意の１つまたは複数において定義することができる：
１． 組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクターであって、そのゲノム内に、５’から３’の方向に、
ａ）５’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）；
ｂ）筋肉特異的プロモーター；
ｃ）イントロン配列；
ｄ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有し、筋肉特異的プロモーターと動作可能に連結した、ヒトフクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）をコードする核酸；
ｅ）ＦＫＲＰをコードする核酸と動作可能に連結したポリＡシグナル配列；
ｆ）３’ＡＡＶ ＩＴＲ
を含む、組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクター。
２． ５’ＩＴＲが、ＩＴＲ２ｍである、項１の組換えＡＡＶベクター。
３． ３’ＩＴＲが、ＩＴＲ２である、項１から２のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
４． 筋肉特異的プロモーターが、Ｓｙｎ１００（配列番号３）である、項１から３のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
５． イントロン配列が、ＶＨ４－Ｉｇ－イントロン３（配列番号４）またはその誘導体である、項１から４のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
６． ポリＡシグナル配列が、配列番号５である、項１から５のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
７． 筋肉特異的プロモーター、イントロン配列、ＦＫＲＰをコードする核酸、およびポリＡシグナル配列が、配列番号１内に含まれる、項１から６のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
８． 血清型がＡＡＶ９である、項１から７のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
９． 項１から８のいずれか１つの組換えＡＡＶベクターを含む医薬組成物。
１０． ジストログリカノパチー障害を有する対象を処置するための方法であって、対象に、項１から８のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター、および／または項９の医薬組成物を治療有効量で全身投与して、それにより、対象の筋組織における機能的ＦＫＲＰの発現を増加させるステップを含む、方法。
１１． ジストログリカノパチー障害が、肢帯型筋ジストロフィー２Ｉである、項１０の方法。
１２． 対象に単回用量を投与する、項１０から１１のいずれか１つの方法。
１３． 投与が静脈内注入によるものである、項１０から１２のいずれか１つの方法。
１４． 投与される用量が、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇから約６×１０１３ｖｇ／ｋｇまで（例えば、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇ）である、項１０から１３のいずれか１つの方法。
１５． 対象において、投与後に、以下：
ａ）対象の骨格筋および／もしくは心筋におけるα－ＤＧの機能的グリコシル化が実質的に増加すること；
ｂ）対象の血清クレアチンキナーゼレベルが実質的に低下すること；
ｃ）対象の骨格筋におけるコラーゲン沈着が実質的に減少すること；
ｄ）対象の筋組織（例えば、ヒラメ筋、横隔膜および／またはＥＤＬ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ筋力分析が有意に向上すること；ならびに／または
ｅ）対象がトレッドミル試験において有意に長い距離を走ることができること
のうちの１つまたは複数が生じる、項１０から１４のいずれか１つの方法。
１６． 対象が成体である、項１０から１５のいずれか１つの方法。
１７． ヒトフクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）をコードする合成核酸であって、
ａ）核酸のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて減少している；
ｂ）そのＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１０％よりも大きく減少している；および／または
ｃ）核酸が、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する、
合成核酸。
１８． コード配列のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも５０％減少している、項１７の核酸。
１９． コード配列のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％減少している、項１７から１８のいずれか１つの核酸。
２０． コード配列のＣｐＧ部位含量が、０％である、項１７から１９のいずれか１つの核酸。
２１． ＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１５％よりも大きく減少している、項１７のいずれか１つの合成核酸。
２２． 配列番号２に対して少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する、項１７のいずれか１つの合成核酸。
２３． 配列番号２に示される配列を有する、項１７の合成核酸。
２４． プロモーターと作動可能に連結している、項１７から２３のいずれか１つの合成核酸。
２５． プロモーターが、筋肉特異的プロモーターである、項２４の合成核酸。
２６． プロモーターが、合成プロモーターである、項２４から２５のいずれか１つの合成核酸。
２７． プロモーターが、Ｓｙｎ１００である、項２４から２６のいずれか１つの合成核酸。
２８． プロモーターが、表１～４に列挙されているプロモーターから選択される、項２３から２６のいずれか１つの合成核酸。
２９． プロモーターが、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢ）である、項２４から２５のいずれか１つの合成核酸。
３０． エンハンサー配列をさらに含む、項１７から２９のいずれか１つの合成核酸。
３１． エンハンサー配列が、ＣＭＶエンハンサー、筋肉クレアチンキナーゼエンハンサー、および／またはミオシン軽鎖エンハンサーを含む、項３０の合成核酸。
３２．
ａ）５’および３’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）；
ｂ）５’ＩＴＲと３’ＩＴＲとの間に配置される、筋肉特異的プロモーターと動作可能に連結したヒトフクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）をコードするコード配列であって、
ｉ）ＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて減少している；
ｉｉ）ＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１０％よりも大きく減少している；および／または
ｉｉｉ）配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する、
コード配列
を含む核酸。
３３． 筋肉特異的プロモーターとコード配列との間に配置されるイントロン配列をさらに含む、項３２の核酸。
３４． イントロン配列が、ＶＨ４－Ｉｇ－イントロン３（配列番号４）またはその誘導体である、項３３の核酸。
３５． コード配列の下流に配置される少なくとも１つのポリＡシグナル配列をさらに含む、項３２から３４のいずれか１つの核酸。
３６． ポリＡシグナル配列が、配列番号５である、項３５の核酸。
３７． ５’ＩＴＲが、ＩＴＲ２ｍである、項３２から３６のいずれか１つの核酸。
３８． ３’ＩＴＲが、ＩＴＲ２である、項３２から３７のいずれか１つの核酸。
３９． コード配列のＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１５％よりも大きく減少している、項３２から３８のいずれか１つの核酸。
４０． コード配列が、配列番号２に対して少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する、項３２から４０のいずれか１つの核酸。
４１． コード配列のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも５０％減少している、項３２から４０のいずれか１つの核酸。
４２． コード配列のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％減少している、項３２から４１のいずれか１つの核酸。
４３． コード配列のＣｐＧ部位含量が、０％である、項３２から４２のいずれか１つの核酸。
４４． コード配列が、配列番号２である、項３２から４３のいずれか１つの核酸配列。
４５． 項１７から４４のいずれか１つの合成核酸を含むベクター。
４６． ベクターが、ウイルスベクターである、項４５のベクター。
４７． ベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項４６のベクター。
４８． ＡＡＶベクターが、表６に列挙されている任意の血清型である、項４７のベクター。
４９． ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ９ベクターである、項４７または項４８のベクター。
５０． ゲノム内に、
ａ）５’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）および３’ＡＡＶ ＩＴＲ；
ｂ）５’ＩＴＲと３’ＩＴＲとの間に配置される、ヒトフクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）をコードする核酸であって、
ｉ）ＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて減少している；
ｉｉ）ＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１０％よりも大きく減少している；および／または
ｉｉｉ）配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有し、
筋肉特異的プロモーターと動作可能に連結している、
核酸
を含む、組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクター。
５１． ＡＡＶゲノムが、５’から３’の方向に、
ａ．５’ＩＴＲ、
ｂ．筋肉特異的プロモーター、
ｃ．イントロン配列、
ｄ．ＦＫＲＰをコードする核酸；および、
ｅ．３’ＩＴＲ
を含む、項５０の組換えＡＡＶベクター。
５２． 筋肉特異的プロモーターが、ＭＣＫプロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、ｅｎｈ３５８ＭＣＫプロモーター、ＣＫ６プロモーターおよびＳｙｎ１００プロモーター、表１～４または８～１２に列挙されている任意のプロモーター、ならびにその誘導体からなる群から選択される、項５０から５１のいずれかの組換えＡＡＶベクター。
５３． ＦＫＲＰをコードする核酸のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて減少している、項５０から５２のいずれかの組換えＡＡＶベクター。
５４． ＦＫＲＰをコードする核酸のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも５０％減少している、項５０から５３のいずれかの組換えＡＡＶベクター。
５５． ＦＫＲＰをコードする核酸のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％減少している、項５０から５３のいずれかの組換えＡＡＶベクター。
５６． ＦＫＲＰをコードする核酸のＣｐＧ部位含量が、０％である、項５０から５５のいずれかの組換えＡＡＶベクター。
５７． ＦＫＲＰをコードする核酸のＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１０％よりも大きく減少している、項５０から５６のいずれかの組換えＡＡＶベクター。
５８． ＦＫＲＰをコードする核酸が、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する、項５０から５７のいずれかの組換えＡＡＶベクター。
５９． ＦＫＲＰをコードする核酸が、配列番号２に示される配列を有する、項５０から５８のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
６０． ＦＫＲＰポリペプチドをコードする核酸に対して３’側、かつ３’ＩＴＲ配列に対して５’側に配置される少なくとも１つのポリＡシグナル配列をさらに含む、項５０から５９のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
６１． ポリＡシグナル配列が、配列番号５である、項６０の組換えＡＡＶベクター。
６２． ＩＴＲが、挿入、欠失または置換を含む、項５０から６１のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
６３． ＩＴＲ内の１つまたは複数のＣｐＧ部位が除去されている、項５０から６２のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
６４． ５’ＩＴＲが、ＩＴＲ２ｍである、項５０から６３のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
６５． ３’ＩＴＲが、ＩＴＲ２である、項５０から６４のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
６６． イントロン配列が、ＶＨ４－Ｉｇ－イントロン３（配列番号４）またはその誘導体である、項５０から６５のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
６７． 組換えＡＡＶベクターが、キメラＡＡＶベクター、一倍体ＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクターまたは倍数体ＡＡＶベクターである、項５０から６６のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
６８． 組換えＡＡＶベクターが、表６に列挙されている任意のＡＡＶ血清型のものである、項５０から６６のいずれかの組換えＡＡＶベクター。
６９． 血清型がＡＡＶ９である、項６８の組換えＡＡＶベクター。
７０． 組換えＡＡＶベクターが、表７から選択されるカプシドタンパク質または表６に列挙されているものからなる群の任意のＡＡＶ血清型、およびこれらの組合せを含む、項５０から６９のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター。
７１． 項５０から７０のいずれか１つの組換えＡＡＶベクターを、薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物。
７２． 項１７から４４のいずれか１つの核酸および／または項４５から７０のいずれか１つのベクターを含む形質転換された細胞。
７３． 項１７から４４のいずれか１つの核酸、項４５から７０のいずれか１つのベクター、および／または項７２の形質転換された細胞を含むトランスジェニック動物。
７４． α－ジストログリカン（α－ＤＧ）のグリコシル化を増加させることを必要とする対象におけるα－ジストログリカン（α－ＤＧ）のグリコシル化を増加させる方法であって、前記対象に、項１７から４４のいずれか１つの核酸、項４５から７０のいずれか１つのベクター、項７１の医薬組成物、および／または項７２の形質転換された細胞を治療有効量で投与するステップを含み、前記対象において合成核酸が発現され、それにより、ヒトＦＫＲＰが産生され、α－ＤＧのグリコシル化が増加する、方法。
７５． 対象が、ジストログリカノパチー障害を有するまたはそれが発生するリスクがある、項７４の方法。
７６． 対象におけるジストログリカノパチー障害を処置する方法であって、対象に、項１７から４４のいずれか１つの核酸、項４５から７０のいずれか１つのベクター、項７１の医薬組成物、および／または項７２の形質転換された細胞を治療有効量で投与するステップを含み、前記対象において合成核酸が発現され、それにより、対象におけるジストログリカノパチー障害を処置する、方法。
７７． ジストログリカノパチー障害が、ＦＫＲＰ異常に関連するものである、項７５または７６のいずれか１つの方法。
７８． ジストログリカノパチー障害が、ＦＫＲＰをコードする核酸の変異および／またはα－ジストログリカン（α－ＤＧ）のグリコシル化不全を含む、項７５から７７のいずれか１つの方法。
７９． ジストログリカノパチー障害が、肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ１Ｃ）、ウォーカー－ワールブルグ症候群、筋眼脳病、またはこれらの任意の組合せである、項７５から７８のいずれか１つの方法。
８０． ジストログリカノパチー障害を有する対象を処置するための方法であって、対象に、前の項のいずれか１つの組換えＡＡＶベクター、ｒＡＡＶゲノム、核酸配列、および／または医薬組成物のいずれかを治療有効量で投与して、それにより、対象の筋組織における機能的ＦＫＲＰの発現を増加させるステップを含む、方法。
８１． 対象に単回用量を投与する、項７４から８０のいずれか１つの方法。
８２． 投与が、全身性のものである、項７４から８１のいずれか１つの方法。
８３． 投与が、静脈内注入によるものである、項８２のいずれか１つの方法。
８４． 投与後に、対象の骨格筋および／または心筋におけるα－ＤＧの機能的グリコシル化が実質的に増加する、項７４から８３のいずれか１つの方法。
８５． 投与後に、対象の血清クレアチンキナーゼレベルが実質的に低下する、項７４から８４のいずれか１つの方法。
８６． 投与後に、対象の骨格筋におけるコラーゲン沈着が実質的に減少する、項７４から８５のいずれか１つの方法。
８７． 対象が、成体である、項７４から８６のいずれか１つの方法。
８８． 対象が、若齢期個体である、項７４から８６のいずれか１つの方法。
８９． 対象が、乳幼児期個体である、項７４から８６のいずれか１つの方法。
９０． 対象が、投与前に有意な疾患病態を示している、項７４から８９のいずれか１つの方法。
９１． 対象が、投与前に有意な疾患病態を示していない、項７４から８９のいずれか１つの方法。
本明細書において特に定義されていなければ、本出願に関連して使用される科学技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により必要とされない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。
本発明は、本明細書に記載の特定の方法体系、プロトコール、および試薬などに限定されず、したがって、変動し得る。本明細書において使用される用語法は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。
操作実施例または特に示されている場合以外は、本明細書で使用される成分の分量または反応条件を表す数字は全て、全ての場合に「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。「約」という用語は、本発明を記載するためにパーセンテージと関連して使用される場合、±１％を意味する。
ある点では、本発明は、本明細書に記載の組成物、方法、および本発明に必須であるそのそれぞれの構成成分（複数可）に関するが、さらに、必須のまたは必須ではない不特定の要素を組み入れる余地がある（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）。一部の実施形態では、組成物、方法またはそのそれぞれの構成成分の記載に含まれる他の要素は、本発明の基本的なおよび新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないものに限定される（「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ））。これは、記載の方法内のステップならびにその中の組成物および構成成分に等しく当てはまる。他の実施形態では、本明細書に記載の発明、組成物、方法、およびそのそれぞれの構成成分は、構成成分、組成物または方法に必須の要素とはみなされないいかなる要素も除外するものであることが意図される（「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」）。
特定された特許、特許出願、および刊行物は全て、例えば、本発明に関連して使用され得る、そのような刊行物に記載されている方法体系を説明し開示する目的で、明白に参照により本明細書に組み込まれる。これらの刊行物は、単に、本出願の出願日より前のそれらの開示に関して提示される。この点については何も、本発明者らが先行発明に基づいて、または任意の他の理由でそのような開示に先立つ権限がないことの容認と解釈されるべきではない。これらの文書の内容に関する日付または表示に関する記載は全て、出願人らが入手可能な情報に基づき、これらの文書の日付または内容の正確さに関してはいかなる承認もなさない。
以下の非限定的な実施例は、現在意図されている代表的な実施形態の徹底的な理解を容易にするために、例示する目的でのみ提供される。これらの実施例は、ＡＡＶビリオンおよびｒＡＡＶベクターを利用することができる全ての可能性のある状況の単なるサブセットであるものとする。したがって、これらの実施例は、ＡＡＶビリオンおよびｒＡＡＶベクターならびに／または方法およびその使用に関するものを含め、本明細書に記載の実施形態のいずれも限定するものと解釈されるべきではない。究極的には、ＡＡＶビリオンおよびベクターは、遺伝子送達が望まれる事実上あらゆる状況に利用され得る。
以下の非限定的な実施例は、現在意図されている代表的な実施形態のより徹底した理解を容易にするために、例示する目的でのみ提供される。これらの実施例は、ＡＡＶビリオンおよびｒＡＡＶベクターを利用することができる全ての可能性のある状況の単なるサブセットであるものとする。したがって、これらの実施例は、ＡＡＶビリオンおよびｒＡＡＶベクターならびに／または方法およびその使用に関するものを含め、本明細書に記載の実施形態のいずれも限定するものと解釈されるべきではない。究極的には、ＡＡＶビリオンおよびベクターを、遺伝子送達が望まれる事実上あらゆる状況で利用することができる。
（実施例１）
ＬＧＭＤを処置するために使用されるベクター構築物
ＬＧＭＤ２Ｉを処置するための、ＦＫＲＰを含有するＡＡＶ遺伝子治療製品候補を開発した。ＬＧＭＤ２Ｉは、ジストログリカノパチーに分類され、α－ジストログリカンまたはα－ＤＧ構造および活性の細胞内修飾であるグリコシル化に関係づけられるゴルジ結合型トランスフェラーゼであるフクチン関連タンパク質をコードするＦＫＲＰ遺伝子の変異によって引き起こされる、稀な筋ジストロフィーである。現在のところ、ＬＧＭＤ２Ｉを処置するための、ＦＤＡにより承認された治療は存在しない。本明細書に記載の実験は、ヒト患者に投与される本明細書に記載のＡＡＶ遺伝子治療製品により、患者に、有意に改善された転帰を生じさせる有意な治療結果がもたらされることを示すものである。
本明細書に記載の実験で送達される治療用ＦＫＲＰをコードするＡＡＶ９ベクターが図１３に示されている。
ＦＫＲＰ導入遺伝子カセット全体の核酸配列も提示されている（図１３、配列番号１）。カセットは、合成筋肉特異的プロモーターであるＳｙｎ１００プロモーター（配列番号３）（Qiao et al., Molecular Therapy Vol. 22 no. 11, p.1890-1899 (2014)）を含む。カセットは、ＶＨ４－Ｉｇイントロン３（配列番号４）をさらに含有し、ポリＡ配列（配列番号５）も含有し、プロモーターとイントロンとの間のスペーサー配列（ａｃｔａｇｔａ）、イントロンとコード配列との間のスペーサー配列（ｃｃｇｃｇｇｇｃｃａｃｃ）、およびコード配列とポリＡ配列との間のスペーサー配列（ｇｔｃｇａｃ）を有する。カセットは、２つのＩＴＲ、ＩＴＲ２ｍおよびＩＴＲ２によって挟まれている（図１３）。
ＦＫＲＰタンパク質をコードする核酸配列も示されている（配列番号２）。この配列はコドン最適化されており、０％のＣｐＧをさらに有する。さらに、ＦＫＲＰコード配列の総ＧＣ含量は、ヒトＦＫＲＰをコードする天然ヌクレオチド配列からのＧＣ含量において１５％減少している％である（図１８、配列番号６）。
（実施例２）
ＬＧＭＤ２Ｉマウスモデルへの投与
ＡＡＶ９ ＦＫＲＰベクターの送達により、ベクターに組み入れられたＳｙｎ－１００プロモーターの作用を通じて、主に筋組織におけるＦＫＲＰタンパク質の発現がもたらされる。ＡＡＶ９－ＦＫＲＰの送達が、ＬＧＭＤ２Ｉ患者における筋肉の病態を好転させることができるものであるかどうか、したがって、効果的な治療としての役割を果たすかどうかを決定するために、マウスモデル系において以下の実験を実施した。図１は実施した用量設定および毒性試験の概略である。
２種のマウスモデルをこれらの試験に使用した。マウス対立遺伝子にロイシン２７６のイソロイシンへのヒト変異（Ｌ２７６Ｉ）を担持するマウスモデルであるホモ接合性ノックインマウスモデル（Ｌ２７６ＩＫＩ）では、骨格筋および心筋の両方におけるＬＧＭＤ２Ｉの古典的な遅発性表現型が模倣される（Qiao et al. Mol Ther. 2014 Nov; 22 (11): 1890-1899）。このモデルを毒性学および体内分布試験のために最初に使用した。ＦＫＲＰ遺伝子にホモ接合性ミスセンス変異（ｃ．１３４３Ｃ＞Ｔ、ｐ．Ｐｒｏ４４８Ｌｅｕ）を含有するＬＧＭＤ２Ｉのマウスモデル（ＦＫＲＰＰ４４８Ｌ変異体）（Chan et al. (2010) Hum. Mol. Genet. 19, 3995-1006；Blaeser et al. (2013) Hum. Genet. 132, 923-934））を、構築物の有効性および用量設定機能性を実証するために使用した。
様々な用量（３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ９－ＦＫＲＰベクターを受けたマウスモデルマウスの種々の筋組織におけるＦＫＲＰタンパク質発現を、空ビヒクルを受けたマウスと比較して観察した。図２は、空ビヒクルを受けたマウスと比較した、レシピエントマウスの横隔膜および四頭筋における代表的な発現レベルの写真を示す。骨格筋において、治療用ＦＫＲＰタンパク質発現はα－ジストログリカンの機能的グリコシル化発現の増加と相関した。図３は、陽性対照としての機能を果たす、正常なＢＬ６マウス（左上の写真）、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ（右上）および３×１０１３ｖｇ／ｋｇ（左下）のＡＡＶ９－ＦＫＲＰを受けたＰ４４８Ｌマウス、ならびに、陰性対照としての機能を果たす、空ビヒクルを受けたＰ４４８Ｌマウス（右下）における代表的なα－ジストログリカン発現の写真を示す。四頭筋切片からの免疫蛍光染色により、ＡＡＶ９－ＦＫＲＰに対するはっきりした応答が示され、シャム注射を受けたＰ４４８Ｌマウスでは無処置のＢＬ６マウスと比較してα－ＤＧの発現の低減が示された（図４）。無処置のＰ４４８マウスと比較して、ＡＡＶ９－ＦＫＲＰで処置されたマウスでは、全用量レベルでα－ＤＧの発現の増加が示され、これにより、効果的なＦＫＲＰ発現およびその後のα－ＤＧのグリコシル化が示唆される。
コラーゲン含量の増加は、ジストロフィー病態に起因する進行中の線維症を反映するものである。種々の量のＡＡＶ９－ＦＫＲＰまたはビヒクルを与えたＰ４４８Ｌマウスにおいて四頭筋のピクロシリウスレッド染色および定量的分析の両方を実施した。四頭筋の断面の代表的な結果が図５の写真に示されている（左側）。無処置の場合、Ｐ４４８Ｌマウス（中央上の写真）では、広範なコラーゲン沈着および不規則な筋線維形状が実証される。これらの特色は、種々の用量のＡＡＶ９－ＦＫＲＰで次第に正常に戻る。この結果は図５に示されているグラフ表示において定量される（右側）。ジストロフィー病態の減少および線維症の減少が観察された。シャム注射を受けたＰ４４８Ｌマウスでは、正常なＢＬ６マウスと比較してコラーゲン含量の増加が示された。ＡＡＶ９－ＦＫＲＰで処置されたマウスでは、全用量レベルで、コラーゲンの発現が減少（パーセントコラーゲンが低下）し、これにより、収縮誘発損傷および線維性物質の沈着がより少ないことが示唆される。
クレアチンキナーゼは、骨格筋が損傷を受けると放出される。クレアチンキナーゼ（creative kinase）のレベルから進行中のＬＧＭＤ疾患病態が読み取れる。Ｐ４４８Ｌマウスにおける血清クレアチンキナーゼを分析した。図６に結果が示されている。空ビヒクルを受けたＢＬ６マウスは、正常なクレアチンキナーゼレベルを示すものである。空ビヒクルを受けたＰ４４８Ｌマウスは、疾患状態のクレアチンキナーゼレベルを示すものである。驚いたことに、任意の用量のＡＡＶ９－ＦＫＲＰを受けた全てのＰ４４８Ｌマウスで、血清クレアチンキナーゼが正常化の点まで低下した。
レシピエントマウスにおいて、筋肉の強度、持久力および身体活動の機能的尺度を設けて、それらの尺度のベースラインまでの回復が得られるかどうかを調査した。図７～９に示されている通り、ビヒクルのみを投与されたＰ４４８Ｌマウスでは、ＢＬ６ビヒクルマウスと比較して有意に低い横隔膜およびヒラメ筋筋力が示された。ＡＡＶ９－ＦＫＲＰを用いた処置では、全用量レベルで、横隔膜およびヒラメ筋に関してＢＬ６ビヒクルマウスにおけるものよりも有意に高い筋力がもたらされた。同様の傾向がＥＤＬ筋においても観察された。
図１１に示されている通り、雄マウスおよび雌マウスの両方を用いた終点自発的回転輪試験では、絶対的にも、データを体重に対して正規化した場合にも、Ｐ４４８Ｌビヒクルマウスが走った距離は、ＢＬ６ビヒクルマウスと比較して有意に短かった。さらに、ＡＡＶ９－ＦＫＲＰで処置されたマウスが走った距離は、Ｐ４４８Ｌビヒクルマウスと比較して長かった。トレッドミル消耗状態のマウスからも同様の結果が得られたが（図１０）、データを体重に対して正規化した場合に、ＡＡＶ９－ＦＫＲＰで処置された雌マウスに関しては統計的有意性が観察されなかった。マウスの性間での応答の差異の理由は不明のままであるが、これらの結果から、Ｐ４４８ＬマウスにおけるＡＡＶ９－ＦＫＲＰに対する応答が、意味のあるものであり、持久力および身体活動を改善するものであることが示される。
図１２に示されている通り、実施したプレチスモグラフィー試験により、正規化された１回換気量の増加によって示される、呼吸の改善が明らかになり、改善は用量依存的なものであった。これは、雌において雄よりも容易に観察された（observe）。
考察
これらの前臨床的用量設定および毒性試験の結果から、ＡＡＶ９－ＦＫＲＰが、ヒト患者に類似用量で全身送達した後、骨格筋収縮機能の修復、骨格筋におけるアルファ－ジストログリカンの機能的グリコシル化の全身に及ぶ発現、非収縮性組織（線維症および脂肪）の出現の減少を伴う収縮性組織（筋肉）の進行性喪失の減少、ならびに身体能力および持久力などの機能的尺度の改善を含めた治療的利益を有することが示される。
（実施例３）
臨床試験
パイロット／ピボタル臨床試験は、フクチン関連タンパク質をコードする遺伝子の稀な常染色体劣性変異（遺伝子型で確認されたＬＧＭＤ２Ｉ／Ｒ９）を有するヒト患者における、ＡＡＶ９－ＦＫＲＰの多施設、二重盲検、ランダム化、プラセボ対照第１／２相臨床試験である。この試験は、２パートで実施される：試験パート１は、安全性、標的活性、および予備的な有効性を評価して、遺伝子治療の第２相推奨用量（ＲＰ２Ｄ）の特定を補助するためのパイロット研究であり、試験パート２は、Ｒ２ＰＤでの遺伝子治療の安全性および有効性を確認するためのピボタル試験である。
本臨床試験では、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、および３×１０１３ｖｇ／ｋｇの単一ＩＶ注入用量を評価するために、Ｌ２７６１／Ｒ９（ｃ．８２６Ｃ＞Ａ）変異についてホモ接合性のヒト対象を組み入れ（パイロット研究、パート１）、続いて、Ｌ２７６１／Ｒ９（ｃ．８２６Ｃ＞Ａ）変異についてホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかであるヒト対象を登録する（ピボタル試験、パート２）。パイロット試験には、患者４名のコホート１（低用量、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ）、および患者６名のコホート２（高用量、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ）の２つの用量漸増コホートを含める。
ピボタル試験には、５１名の対象を登録すると推定され、Ｒ２ＰＤでの投与を受ける。パイロット試験およびピボタル試験のどちらにおいても、プラセボにランダム化される対象には、その対象が試験のそれぞれのパートの最後に適格のままである場合、遺伝子治療が提案される。
治療を受ける場合、対象は、免疫抑制薬物適用を受ける。ステロイド予防法を、１日目のベクター投与の２４時間＋／－８時間前に開始する；経口プレドニゾンを１日当たり体重１ｋｇ当たり１ｍｇ、総用量６０ｍｇまでの用量で４週間にわたって与え、その後、１２週間にわたって、各週、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、または６０ｍｇを摂取している場合には５ｍｇを（１ｍｇ単位まで）、漸減させて与える。ステロイド服薬遵守に関する日誌を対象につけてもらい、来院時、往診時、および電話診療の間に試験チームがモニタリングする。
予め規定される共主要評価項目（ｃｏ－ｐｒｉｍａｒｙ ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ）には、安全性および有効性を含める。有効性は、これだけに限定されないが、肢帯型筋ジストロフィーのための北極星評価（ＮＳＡＤ）；疾患の改善、重症度、および治療有効性に関する臨床全般印象（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＣＧＩ）；１０メートル歩行テスト（１０ＭＷＴ）；１００メートル歩行テスト（１００ＭＷＴ）；４段の階段上り（４ＳＣ）；タイムドアップアンドゴー（ＴＵＧ）；上肢パフォーマンス（ＰＵＬ）；および／または患者報告アウトカム尺度（例えば、個別化生活の質、疲労、眠気、うつ病スコア）を含む主要および副次機能評価項目によって評価する。
さらに、心疾患および肺疾患の進行を調査するために、心機能および呼吸器機能に関する生理学的評価を評価する。下肢のＭＲＩ評価を実施して、慢性筋損傷の急性増悪および疾患進行（例えば、筋肉浮腫、脂肪置換、および消耗）を評価する。レシピエント対象の筋肉、横隔膜および心臓組織を標的とし、ＦＫＲＰ発現、α－ジストログリカン含量、グリコシル化α－ジストログリカン含量、コラーゲン含量を筋生検分析によって分析する。血清クレアチンキナーゼならびに他のプロテオミクスおよびメタボロミクスバイオマーカーも分析する。
これらの評価項目全てについて、ベースラインからの変化を、異なる時点において、例えば、ベースライン、１６週間、２４週間、４０週間、および５２週間の時点で測定する。これらの評価項目は探索的なものであり、したがって、ベースラインからの統計的有意差に留意する。さらに、血清ＣＫレベルの統計的に有意な低下（例えば、正常に向かう）は、筋損傷の減少の代理であり得る、すなわち、本明細書に記載の治療用製品の有効性を示すものであり得る。Ｌ ＶＥＦ拡張期および収縮期体積ならびに心拍出量のベースラインからの変化を、前記時点の１つまたは複数で測定する。さらに、ベースラインから最大１２カ月までのＢ細胞およびＴ細胞免疫学的応答（総／循環および中和抗アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）抗体価）；ならびに／または、ＡＡＶおよびＦＫＲＰに対するＴ細胞反応性）；ならびに／またはＡＡＶ９ベクター排出を分析する。
さらに、以下のうちの１つまたは複数の分析を含む、探索的評価項目を測定する；Ｂ細胞およびＴ細胞の免疫表現型検査を観察し、努力肺活量（ＦＶＣ）によって測定される肺機能の、２４週間、４０週間、および５２週間の時点でのベースラインからの変化を観察し、最初の１秒間の努力呼気量（ＦＥＶ１）の、２４週間、４０週間、および５２週間の時点でのベースラインからの変化を観察し、最大吸気圧（ＭＩＰ）の、２４週間、４０週間、および５２週間の時点でのベースラインからの変化を観察し、最大呼気圧（ＭＥＰ）の、２４週間、４０週間、および５２週間の時点でのベースラインからの変化を観察し、駆出率（ＥＦ）によって測定される心臓の構造および機能の、８週間、２４週間、および５２週間の時点でのベースラインからの変化を観察し、左室収縮末期容積係数（ＬＶＥＳＶＩ）のベースラインから５２週間までの変化を観察し、心エコー図による心筋ピーク円周方向ストレインの、８週間、２４週間および５２週間の時点でのベースラインからの変化を観察し、ＭＲＩ Ｔ２ｗ（ＳＴＩＲ）によって測定される下肢筋肉の質および分量、中心的にスコア化される脂肪抑制浮腫シグナルの、５２週間の時点でのベースラインからの変化を観察し、ＭＲＩ ３点Ｄｉｘｏｎ脂肪画分シーケンスによって測定される、積極的処置群における対照群と比較した下肢筋肉のベースラインおよび５２週間からの変化を観察する。
処置を受けた患者に関して、プラセボと比較して、主要／副次評価項目のうちの１つまたは複数、例えばクレアチンキナーゼレベルが経時的に改善されることが予想される。例えば、処置を受けた患者に関して、クレアチンキナーゼレベルが経時的に低下し、驚いたことにほぼ正常レベルにまでなることが予想される。
本発明に記載されている遺伝子治療を用いると、本明細書で考察されている評価項目に関して臨床的に意味のある変化が観察されることが予想される。例えば、ＮＳＡＤに関しては、ベースラインから約１．７３点という観察可能であり臨床的に意味のある差異が観察される１。１０ＭＷＴに関しては、ベースラインから約３１％（例えば、２．３秒）という観察可能であり臨床的に意味のある変化が観察される２。１００ＭＷＴに関しては、ベースラインから約６秒という観察可能であり臨床的に意味のある変化が観察される３。４ＳＣに関しては、ベースラインから約３０％（例えば、２．１秒）という観察可能であり臨床的に意味のある差異が観察される。ＴＵＧに関しては、ＤＭ－１患者において認められるものと同様に、ベースラインから約３０％という観察可能であり臨床的に意味のある変化が観察される。ＰＵＬに関しては、ＬＧＭＤ患者において認められる、ベースラインから約４点という観察可能であり臨床的に意味のある変化が観察される４。
実施例３の参考文献
Figure 2023545731000107
 （実施例４）
ＨＥＫ２９３細胞を使用した、筋肉特異的プロモーターと動作可能に連結したＦＫＲＰポリペプチドをコードする核酸を含むウイルスベクターの産生
接着ＨＥＫ２９３適格マスターセルバンクからの浮遊ＨＥＫ２９３細胞の誘導。親ＨＥＫ２９３マスターセルバンク（ＭＣＢ）からの浮遊細胞株の誘導を、クラス１０，０００クリーンルーム設備で実施する。浮遊細胞株の誘導を、まず、ウシ血清を含有する培地から細胞を引き離し、次いで、その細胞をＨＥＫ２９３細胞と適合する無血清浮遊培地に順応させる２相プロセスで行う。浮遊細胞株を以下の通り作り出す。まず、適格マスターセルバンク（ＭＣＢ）のバイアルを解凍し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ培地での培養下におき、数日間培養して、細胞を凍結／解凍サイクルから回復させる。４週間の期間にわたって、組織培養培地中のＦＢＳの量を１０％から２．５％まで徐々に減少させながら、ＭＣＢ細胞を培養し、継代する。次いで、細胞をＤＭＥＭ ２．５％ＦＢＳから無血清浮遊培地に移し、シェーカーフラスコ中で成長させる。次いで、細胞を無血清培地中でさらに３週間、それらの成長速度および生存率をモニタリングしながら培養する。次いで、適合させた細胞を拡大し、凍結させる。続いて、このセルバンクからいくつかのバイアルを解凍し、シェーカーフラスコおよびウェーブバイオリアクター系を使用してｒＡＡＶベクターを生成するためのスケーラブルな製造プロセスを創出する生み出すためのプロセス開発試験の間に使用する。浮遊ＨＥＫ２９３細胞を、シェーカーフラスコおよびウェーブバイオリアクターバッグ中、成長および高トランスフェクション効率の両方を支持する無血清浮遊培地で成長させる。細胞の維持およびｒＡＡＶベクターの生成のために、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎシェーカーインキュベーター（ＡＴＲ）を特定のｒｐｍ振とうスピード（細胞培養物の体積に基づく）、８０％湿度、および５％ＣＯ２で使用する。
浮遊ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション。トランスフェクション当日に、細胞を、ＶｉＣｅｌｌ ＸＲ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して計数し、トランスフェクションのために希釈する。トランスフェクションカクテルを混合するために、以下の試薬を以下の順序でコニカルチューブに添加する：プラスミドＤＮＡ、ＯＰＴＩＭＥＭ（登録商標）Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）もしくはＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ）、または他の無血清の適合するトランスフェクション培地、次いでプラスミドＤＮＡに対して特定の比のトランスフェクション試薬。プラスミドＤＮＡは、筋肉特異的プロモーターと動作可能に連結したＦＫＲＰタンパク質をコードする異種核酸配列を含む配列を、他の必要な調節配列と共に有する（配列番号１）。さらに、ＡＡＶ ｒｅｐおよびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子ならびにアデノウイルスヘルパー遺伝子（例えば、１つまたは複数のさらなるプラスミド上にコードされる）も添加する。カクテルを反転させて混合した後、室温でインキュベートする。次いで、トランスフェクションカクテルを、ピペットを用いてフラスコに入れ、シェーカー／インキュベーターに戻す。全ての最適化試験を３０ｍＬの培養体積で行い、その後、より大きな培養体積で検証を行う。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収する。
ウェーブバイオリアクター系を使用したｒＡＡＶの産生。トランスフェクションの２日前にウェーブバッグへの播種を行う。ウェーブバッグへの播種の２日後に、細胞培養計数を行い、次いで、トランスフェクションの前に細胞培養物を拡大させる／希釈する。次いで、ウェーブバイオリアクター細胞培養物をトランスフェクトする。トランスフェクションの４８時間後、ウェーブバイオリアクター細胞培養物を、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の発現を誘導する条件下で培養する。ｒｅｐ発現のための条件は、ＮＫＨ４７７を１μＭから１００μＭまで、例えば８μＭの濃度でウェーブバイオリアクター細胞培養物に投与することを必要とするものである。ｃａｐ発現のためのこのような条件は、細胞を低酸素条件、すなわち５％酸素で培養することを必要とするものである。誘導の少なくとも４８時間後に細胞培養物をウェーブバイオリアクターバッグから回収する。
フローサイトメトリーを使用したトランスフェクション効率の分析。誘導のおよそ２４時間後、各フラスコまたはウェーブバイオリアクターバッグならびに誘導を行っていない対照から細胞培養物１ｍＬを取り出す。試料を、Ｄａｋｏ Ｃｙａｎフローサイトメーターを使用して分析して、プラスミドＤＮＡを確認する。
シェーカーフラスコおよびウェーブバイオリアクターバッグからの浮遊細胞の回収。誘導の４８時間後、細胞培養物を、シェーカーフラスコから注ぐことによってか、またはウェーブバイオリアクターバッグからポンプでくみ上げることによって収集して５００ｍＬのポリプロピレンコニカルチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れる。次いで、細胞培養物を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ３Ｃ ｐｌｕｓ遠心分離機およびＨ６０００Ａローターを使用して６５５×ｇで１０分間遠心分離する。上清を廃棄し、細胞を１×ＰＢＳに再懸濁させ、５０ｍＬのコニカルチューブに移し、６５５×ｇで１０分間遠心分離する。この時点で、ペレットをＮＬＴ－６０℃で保存するかまたは精製を続けることができる。
ｑＰＣＲを使用した細胞溶解物からのｒＡＡＶの力価測定。細胞培養物１０ｍＬを取り出し、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ３Ｃ ｐｌｕｓ遠心分離機およびＨ６０００Ａローターを使用して６５５×ｇで１０分間遠心分離する。細胞ペレットから上清をデカントする。次いで、細胞ペレットをＤＮａｓｅ緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）５ｍＬに再懸濁させ、その後、細胞を効率的に溶解させるために超音波処理する。次いで、３００μｌを取り出し、１．５ｍＬの微量遠心管に入れる。次いで、１４０単位のＤＮａｓｅ Ｉを各試料に添加し、３７℃で１時間インキュベートする。ＤＮａｓｅによる消化の効果を決定するために、プラスミドＤＮＡ４～５μｇを、トランスフェクトされていない細胞溶解物に、ＤＮａｓｅの添加を伴ってまたは伴わずにスパイクする。次いで、ＥＤＴＡ／サルコシル溶液（６．３％サルコシル、６２．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）５０μｌを各管に添加し、７０℃で２０分間インキュベートする。次いで、プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）５０μｌを添加し、５５℃で少なくとも２時間インキュベートする。次いで、試料を１５分間煮沸してプロテイナーゼＫを不活化させる。ｑＰＣＲによる分析のために一定分量を各試料から取り出す。細胞当たりどのくらいのｒＡＡＶベクターが生成するかを有効に決定するために、２つのｑＰＣＲ反応を行う。
粗溶解物からのｒＡＡＶの精製。各細胞ペレットを、最終体積１０ｍＬに調整する。ペレットを短時間ボルテックスし、３０％出力、１秒間オン、１秒間オフのバーストで４分間、超音波処理を行う。超音波処理後、５５０ＵのＤＮａｓｅを添加し、３７℃で４５分間インキュベートする。次いで、ペレットを、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣＳＢ遠心分離機およびＨＳ－４ローターを使用して９４００×ｇで遠心分離して、細胞片をペレット化し、清澄化された溶解物をＴｙｐｅ ７０Ｔｉ遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ ３６１６２５）に移す。ｒＡＡＶを単離するための浮遊ＨＥＫ２９３細胞の回収および溶解に関しては、当業者は、マイクロ流体化などの機械的方法または洗浄剤などの化学的方法を使用し、その後、深層濾過または接線流濾過（ＴＦＦ）を使用した清澄化ステップを行うことができる。
ＡＡＶベクター精製。清澄化されたＡＡＶ溶解物を、当業者には知られており、以下の原稿（Allay et al.、Davidoff et al.、Kaludov et al.、Zolotukhin et al.、Zolotukin et alなど）に記載されているカラムクロマトグラフィー法によって精製する。
ドットブロットを使用したｒＡＡＶの力価測定。ＤＮａｓｅ緩衝液（１４０単位のＤＮａｓｅ、５ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）１００μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加する。ウイルス１～３μｌまたは段階希釈物を各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、試料に、サルコシル／ＥＤＴＡ溶液（６．３％サルコシル、６２．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）１５μｌを補充し、７０℃で２０分間置く。次に、プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）１５μｌを添加し、５０℃で少なくとも２時間インキュベートする。ＮａＯＨ緩衝液（８０ｍＭのＮａＯＨ、４ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）１２５μｌを各ウェルに添加する。一連の、導入遺伝子に特異的な標準物質を希釈系列によって作り出す。次いで、ＮａＯＨ緩衝液を添加し、インキュベートする。ナイロンメンブレンを０．４ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５中、室温でインキュベートし、次いで、ドットブロット装置にセットする。ＮａＯＨ緩衝液中で１０～１５分間インキュベートした後、試料および標準物質を、ドットブロット装置中、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ ＰｌｕｓＲハイブリダイゼーション転写メンブレン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上にローディングする。次いで、試料を、真空を使用してメンブレンに適用する。ナイロンメンブレンを０．４ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５に浸漬し、ＵＶ ｓｔｒａｔａ ｌｉｎｋｅｒ １８００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を６００マイクロジュール×１００で使用して架橋結合させる。次いで、ＣＨＵＲＣＨ緩衝液（１％ＢＳＡ、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ７．５）中でメンブレンのプレハイブリダイゼーションを行う。プレハイブリダイゼーション後、メンブレンに３２Ｐ－ＣＴＰ標識された導入遺伝子プローブ（Ｒｏｃｈｅ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ）を一晩、ハイブリダイズさせる。翌日、メンブレンを低ストリンジェンシーＳＳＣ緩衝液（１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）および高ストリンジェンシー（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で洗浄する。次いでそのメンブレンをホスホイメージャー（phosphorimager）スクリーンに曝露し、ＳＴＯＲＭ８４０スキャナー（ＧＥ）を使用してデンシトメトリーのために分析する。
銀染色法を使用したｒＡＡＶベクター純度の分析。精製されたベクター由来の試料をＮｕＰａｇｅ １０％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にローディングし、１×ＮｕＰａｇｅランニング緩衝液を使用して流す。典型的には、ウェル当たり１×１０１０個の粒子をローディングする。ゲルをＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ Ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ＃ＬＣ６１００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて処理する。
アルカリ性ゲル電気泳動およびサザンブロットを使用した自己相補的ゲノムの分析。簡単に述べると、精製された自己相補的ｒＡＡＶをＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液（１４０単位のＤＮａｓｅ、５ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）２００μｌに添加し、３７℃で６０分間インキュベートし、その後、ＥＤＴＡサルコシル／ＥＤＴＡ溶液（６．３％サルコシル、６２．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）３０μｌを添加し、７０℃で２０分間置くことにより、ＤＮａｓｅの不活化を行う。次いで、プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）２０μｌを試料に添加し、５０℃で最低２時間インキュベートする。フェノール／クロロホルムを１：１の比で添加し、その後、ウイルスベクターＤＮＡのエタノール沈殿を行う。次いで、ペレット化したＤＮＡを、変性させるためにアルカリ性緩衝液（５０ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させ、１％アルカリ性アガロースゲルにローディングし、２５Ｖで一晩流す。次いで、ゲルをアルカリ性転写緩衝液（０．４ＭのＮａＯＨ、１ＭのＮａＣｌ）中で平衡化し、ベクターＤＮＡをＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ ＰｌｕｓＲハイブリダイゼーション転写メンブレン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に一晩転写することによってサザンブロットを実施する。次いで、メンブレンを、０．５ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５を１ＭのＮａＣｌと共に使用して中和し、３２Ｐ－ＣＴＰ標識された導入遺伝子プローブを一晩ハイブリダイズさせる。メンブレンを以前に記載されている通り洗浄した後、メンブレンをホスホイメージャースクリーンに曝露させ、ＳＴＯＲＭ８４０スキャナーを使用して分析する。
形質導入アッセイ。ＨｅＬａＲＣ－３２細胞（Chadeuf et al., J Gene Med. 2:260 (2000)）を２４ウェルプレートにウェル当たり細胞２×１０５個でプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートする。細胞を９０～１００％コンフルエントになるよう観察する。２％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを伴うＤＭＥＭ ５０ｍＬを予め温め、アデノウイルス（ｄ１３０９）をＭＯＩ １０で添加する。ｄ１３０９含有培地を９００μｌ画分の一定分量に分け、それを使用してｒＡＡＶを一連の１０倍希釈物に希釈する。次いで、ｒＡＡＶを４００μｌでプレーティングし、３７℃で４８時間インキュベートする。
濃度アッセイ。出発ベクターストックを試料採取し、ビバスピンカラムにローディングし、１０分間隔で、４７０×ｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｈ１０００Ｂ）で遠心分離する。所望の体積／濃度が実現されたら、メンブレンの両側を濃縮水（retentate）ですすぎ、次いでそれを回収する。予備濃縮および濃縮したｒＡＡＶの試料を取得して、物理的力価および形質導入単位を決定する。
陰性染色されたｒＡＡＶ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）検査。電子顕微鏡法により、ウイルス粒子を直接可視化することが可能になる。精製された透析されたｒＡＡＶベクターを、４００メッシュのグロー放電処理したカーボングリッドに、グリッドをウイルス２０μｌの液滴上で反転させることによって載せる。次いで、グリッドを２回洗浄し、ｄｄＨ２Ｏの２０μｌの液滴上で反転させ、その後、グリッドを２％酢酸ウラニルの２０μｌの液滴上で反転させて３０秒間置く。グリッドの縁にＷｈａｔｍａｎ紙をそっと当てることによってグリッドを拭いて乾燥させる。Ｚｅｉｓｓ ＥＭ ９１０電子顕微鏡を使用して各ベクターを可視化する。
（実施例５）
Ｐｒｏ１０細胞を使用した、筋肉特異的プロモーターと動作可能に連結したＦＫＲＰポリペプチドをコードする核酸を含むウイルスベクターの産生
ＦＫＲＰ発現カセットを含む核酸構築物（配列番号１）（例えば、図１３のプラスミド）を使用して、ＡＡＶ産生のための安定な細胞株、Ｐｒｏ１０細胞においてウイルスベクターを製造する。例えば米国特許第９，４４１，２０６号に記載されている、これらのＡＡＶ産生のための安定なＰｒｏ１０細胞は、スケーラブルなＡＡＶベクターの産生のために理想的なものである。細胞株をＦＫＲＰ核酸構築物（例えば、図１３に示されているプラスミド）とトランスフェクションによって接触させて、核酸を受けとらせる。核酸構築物の存在を、プラスミドに特異的なプライマーを使用したＰＣＲに基づくアッセイによって確認する。
トランスフェクション。安定なＰｒｏ１０細胞に、ＦＫＲＰ核酸構築物をトランスフェクトし、また、Ｒｅｐおよび血清型特異的Ｃａｐをコードするパッケージングプラスミドもトランスフェクトする：あるいは、ＡＡＶ－Ｒｅｐ／Ｃａｐを自己アニーリングさせた環状核酸として提供し、かつ／またはＡｄ－ヘルパープラスミド（ＸＸ６８０：アデノウイルスヘルパー配列をコードする）を１つもしくは複数のプラスミド上に、もしくは自己アニーリングさせた環状核酸として提供する。
トランスフェクション当日に、細胞を、ＶｉＣｅｌｌ ＸＲ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して計数し、トランスフェクションのために希釈する。トランスフェクションカクテルを混合するために、以下の試薬を以下の順序でコニカルチューブに添加する：プラスミドＤＮＡ、ＯＰＴＩＭＥＭ（登録商標）Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）もしくはＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ）、または他の無血清の適合するトランスフェクション培地、次いでプラスミドＤＮＡに対して特定の比のトランスフェクション試薬。カクテルを反転させて混合した後、室温でインキュベートする。トランスフェクションカクテルをピペットで取ってフラスコに入れ、シェーカー／インキュベーターに戻す。全ての最適化試験を３０ｍＬの培養体積で行い、その後、より大きな培養体積で検証を行う。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収する。
ウェーブバイオリアクター系を使用したｒＡＡＶの産生。トランスフェクションの２日前にウェーブバッグへの播種を行う。ウェーブバッグへの播種の２日後に、細胞培養計数を行い、次いで、トランスフェクションの前に細胞培養物を拡大させる／希釈する。次いで、ウェーブバイオリアクター細胞培養物をトランスフェクトする。少なくともトランスフェクションの４８時間後にウェーブバイオリアクターバッグから細胞培養物を回収する。
力価：ＤＮａｓｅによる消化後に、検量線（ＡＡＶ ＩＴＲ特異的）および第ＩＸ因子核酸構築物に特異的なプライマーに対するｑＰＣＲを使用してＡＡＶ力価を算出する。
シェーカーフラスコおよび６０ウェーブバイオリアクターバッグからの浮遊細胞の回収。トランスフェクションの４８時間後、細胞培養物を、シェーカーフラスコから注ぐことによってか、またはウェーブバイオリアクターバッグからポンプでくみ上げることによって収集して５００ｍＬのポリプロピレンコニカルチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れる。次いで、細胞培養物を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ３Ｃ ｐｌｕｓ遠心分離機およびＨ６０００Ａローターを使用して６５５×ｇで１０分間遠心分離する。上清を廃棄し、細胞を１×ＰＢＳに再懸濁させ、５０ｍＬのコニカルチューブに移し、６５５×ｇで１０ｍＭ遠心分離する。この時点で、ペレットをＮＬＴ－６０℃で保管するか、または精製を続けることができる。
ｑＰＣＲを使用した細胞溶解物からのｒＡＡＶの力価測定。細胞培養物１０ｍＬを取り出し、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ３Ｃ ｐｌｕｓ遠心分離機およびＨ６０００Ａローターを使用して６５５×ｇで１０分間遠心分離する。細胞ペレットから上清をデカントする。次いで、細胞ペレットをＤＮａｓｅ緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）５ｍＬに再懸濁させ、その後、細胞を効率的に溶解させるために超音波処理する。次いで、３００μＬを取り出し、１．５ｍＬの微量遠心管に入れる。次いで、１４０単位のＤＮａｓｅ Ｉを各試料に添加し、３７℃で１時間インキュベートする。ＤＮａｓｅによる消化の効果を決定するために、第ＩＸ因子核酸構築物４～５ｍｇを、トランスフェクトされていない細胞溶解物に、ＤＮａｓｅの添加を伴ってまたは伴わずにスパイクする。ＥＤＴＡ／サルコシル溶液（６．３％サルコシル、６２．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）５０μＬを各管に添加し、７０℃で２０分間インキュベートする。次いで、プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを添加し、５５℃で少なくとも２時間インキュベートする。試料を１５分間煮沸してプロテイナーゼＫを不活化する。ｑＰＣＲによる分析のために一定分量を各試料から取り出す。細胞当たりどのくらいのｒＡＡＶベクターが生成するかを有効に決定するために、２つのｑＰＣＲ反応を行う。一方のｑＰＣＲ反応は、プラスミドＸＸ６８０、ｐＸＲ２および第ＩＸ因子核酸構築物の骨格上の相同な配列に結合するように設計されたプライマーセット２ｓを使用して組み立てる。第２のｑＰＣＲ反応は、第ＩＸ因子ミニ遺伝子内の領域に結合し、それを増幅するプライマーセットを使用して組み立てる。Ｓｙｂｒ ｇｒｅｅｎ試薬および３０ ＲｏｃｈｅのＬｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ ４８０を使用してｑＰＣＲを行う。試料を９５℃で１０分間にわたって変性させ、その後、４５サイクルを行い（９０℃で１０秒、６２℃で１０秒および７２℃で１０秒）、融解曲線を得る（１サイクル、９９℃で３０秒、６５℃で１分連続）。
粗溶解物からのｒＡＡＶの精製。各細胞ペレットを、最終体積１０ｍＬに調整する。ペレットを短時間ボルテックスし、３０％出力、１秒間オン、１秒間オフのバーストで４分間、超音波処理を行う。超音波処理後、５５０ＵのＤＮａｓｅを添加し、３７℃で４５分間インキュベートする。次いで、ペレットを、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣＳＢ遠心分離機およびＨＳ－４ローターを使用して９４００×ｇで遠心分離して、細胞片をペレット化し、清澄化された溶解物をＴｙｐｅ７０Ｔｉ遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ ３６１６２５）に移す。ｒＡＡＶを単離するための浮遊ＨＥＫ２９３細胞の回収および溶解に関しては、当業者は、マイクロ流体化などの機械的方法または洗浄剤などの化学的方法を使用し、その後、深層濾過または接線流濾過（ＴＦＦ）を使用した清澄化ステップを行うことができる。
ＡＡＶベクター精製。清澄化されたＡＡＶ溶解物を、当業者には知られており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる以下の原稿（Allay et al.、Davidoff et al.、Kaludov et al.、Zolotukhin et al.、Zolotukin et alなど）に記載されているカラムクロマトグラフィー法によって精製する。
（実施例６）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
本発明のある特定の実施形態による合成筋肉特異的プロモーターまたは骨格筋特異的プロモーターの強度を、これらのプロモーターをレポーター遺伝子ルシフェラーゼと作動可能に連結することによって試験する。試験される筋肉特異的プロモーターまたは骨格筋特異的プロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子を含む発現カセットを適切なプラスミドに挿入し、次いでそのプラスミドを、細胞に、これらの細胞におけるプロモーターからの発現を試験するためにトランスフェクトする。
材料および方法
ＤＮＡの調製物を、Ｈ９Ｃ２（ラットＢＤＩＸ心筋芽細胞株、ＡＴＣＣから入手可能）にトランスフェクトして、転写活性を評価する。Ｈ９Ｃ２細胞株は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける骨格筋および心筋活性の良好な予測因子であることが以前の実験で示されているので、これを使用した。
Ｈ９Ｃ２細胞培養およびトランスフェクション
Ｈ９Ｃ２は、ラットＢＤＩＸ心筋芽細胞株である。Ｈ９Ｃ２は、心筋特性、例えば、アセチルコリンに応答したコンフルエンシーで形成される筋管を有する。
細胞維持
Ｈ９Ｃ２細胞を、Ｔ－７５フラスコ中、１％ＦＢＳ（熱失活させたもの－Ｇｉｂｃｏ １０２７０－１０６、ロット番号４２Ｇ２０７６Ｋ）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（３５０５０－０３８、Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１５１４０－１２２、Ｇｉｂｃｏ）を伴うＤＭＥＭ（高グルコース、Ｄ６５４６、Ｓｉｇｍａ）で培養する。細胞がコンフルエントになり、融合して筋管を形成し始めるリスクを回避するために、細胞をサブコンフルエントの段階（７０～８０％）で継代する。
細胞維持中に継代するために、培養培地を除去し、細胞を、ＣａＣｌ２もＭｇＣｌ２も伴わないＤＰＢＳ（１４１９０－０９４、Ｇｉｂｃｏ）５ｍｌで２回洗浄する。細胞を、トリプシンＥＤＴＡ（２５２００－０５６、Ｇｉｂｃｏ）１ｍｌと共におよそ５分間インキュベートすることによってフラスコから剥離させる。次いで、培養培地４ｍｌをフラスコに添加し、混合物を穏やかに上下にピペッティングして、フラスコ表面からの細胞の剥離を補助する。細胞を１００ｇで３分間にわたってペレット化する。上清を捨て、細胞を培養培地３ｍｌに再懸濁させる。細胞をＣｏｕｎｔｅｓｓ自動細胞カウンターで計数し、１：３～１：１０で播種する、すなわち、１ｃｍ２当たり細胞１～３×１０，０００個で播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
細胞トランスフェクションおよび分化
Ｈ９Ｃ２細胞を、およそ７０～８０％コンフルエンシーのＴ－７５フラスコ２つから、上記の通り、ＤＰＢＳで洗浄し、トリプシンＥＤＴＡ１ｍｌを使用してフラスコから剥離させ、フラスコの表面を培養培地４ｍｌで洗い流し、１００ｇで３分間にわたってペレット化することによって収集する。細胞を培養培地４５ｍｌに再懸濁させ、４８ウェル平底プレート（３００μｌ／ウェル）（３５３２３０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）にウェル当たり細胞４０，０００個の密度で播種する。４８ウェルプレート中の細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
２４時間後、細胞上の培養培地を１％ＦＢＳ（熱失活させたもの－Ｇｉｂｃｏ １０２７０－１０６、ロット番号４２Ｇ２０７６Ｋ）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（３５０５０－０３８、Ｇｉｂｃｏ））を伴う抗生物質を含まない培養培地（すなわち、ＤＭＥＭ（高グルコース、Ｄ６５４６、Ｓｉｇｍａ）３００μｌと交換する。ウェル当たり３００ｎｇのＤＮＡを、ウェル当たり３０μｌの総複合体体積中ｖｉａｆｅｃｔ（Ｅ４９８１、Ｐｒｏｍｅｇａ）でトランスフェクトする。プレートをトランスフェクション後に穏やかに混合し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
２４時間後、培養培地を、トランスフェクトされた細胞から取り除き、ＤＭＥＭ（高グルコース、Ｄ６５４６、Ｓｉｇｍａ）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（３５０５０－０３８、Ｇｉｂｃｏ）、１％ＦＢＳ（熱失活させたもの－Ｇｉｂｃｏ １０２７０－１０６、ロット番号４２Ｇ２０７６Ｋ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（１５１４０－１２２、Ｇｉｂｃｏ）および０．１％レチノイド酸（Retinoid Acid）（Ｓｉｇｍａ－Ｒ２６２５）からなる分化培地３００μｌで置き換える。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７日間インキュベートして、分化を誘導する。分化後、細胞の形態を観察して、筋管への分化を確認する。
次いで、細胞を、ＤＰＢＳ５００μｌで洗浄し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を使用して１×希釈したルシフェラーゼ細胞培養溶解５Ｘ試薬（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ ５Ｘ Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｅ１５３１、Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌを用いて溶解させる。細胞溶解試薬を１０回上下にピペッティングし、次いで、プレートを中速で３０分間ボルテックスして細胞溶解を促進させる。プレートを、ルシフェラーゼアッセイの完了前に、密封し、－８０℃で保管する。Ｈ９Ｃ２細胞におけるトランスフェクション後のルシフェラーゼアッセイから収集されたデータは、１回の生物学的反復での３回の技術的反復に基づく。
ルシフェラーゼ活性の測定
－ ルシフェラーゼ活性を、ＬＡＲＩＩ（Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １０００ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１９８０）を使用して測定する
－ トランスフェクションの２４時間後、培地を細胞から取り除く
－ 細胞をＤＰＢＳ ３００μｌで１回洗浄する
－ 細胞を、受動的溶解緩衝液１００μｌを使用し、振とうしながら１５分間インキュベートして溶解させる。
－ 細胞片を、プレートをベンチトップ遠心分離機において最大スピードで１分間遠心分離することによってペレット化する
－ 試料１０μｌを白色９６ウェルプレートに移し、ＬＡＲＩＩ基質５０μｌをＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダーに注入することによって発光を測定する。
これらの細胞培養から生じた結果が図２０に示されている。この図は、合成プロモーターＳＰ０５００、ＳＰ０５１０、ＳＰ０５１４およびＳＰ０５１９が筋細胞株Ｈ９Ｃ２において良好な活性を示すことを示す。本明細書に記載の他の同様のプロモーターも、同じまたはより良好な性能を有すると予測される。
実施例６の参考文献
Llanga, T. et al. (2017) ‘Structure-Based Designed Nano-Dysferlin Significantly Improves Dysferlinopathy in BLA/J Mice’, Molecular Therapy. Elsevier Ltd., 25(9), pp. 2150-2162. doi: 10.1016/j.ymthe.2017.05.013.
（実施例７）
短い骨格筋特異的プロモーターのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
材料および方法
ＤＮＡの調製物を、Ｈ９Ｃ２（ラットＢＤＩＸ心筋芽細胞株、ＡＴＣＣから入手可能）にトランスフェクトして、転写活性を評価した。Ｈ９Ｃ２細胞株は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける骨格筋および心筋活性の良好な予測因子であることが以前の実験で示されているので、これを使用した。
Ｈ９Ｃ２細胞培養およびトランスフェクション
Ｈ９Ｃ２は、ラットＢＤＩＸ心筋芽細胞株である。Ｈ９Ｃ２は、心筋特性、例えば、アセチルコリンに応答したコンフルエンシーで形成される筋管を有する。
細胞維持
Ｈ９Ｃ２細胞を、Ｔ－７５フラスコ中、１％ＦＢＳ（熱失活させたもの－Ｇｉｂｃｏ １０２７０－１０６、ロット番号４２Ｇ２０７６Ｋ）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（３５０５０－０３８、Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１５１４０－１２２、Ｇｉｂｃｏ）を伴うＤＭＥＭ（高グルコース、Ｄ６５４６、Ｓｉｇｍａ）で培養した。細胞を、細胞がコンフルエントになり、融合して筋管を形成し始めるリスクを回避するために、サブコンフルエントの段階（７０～８０％）で継代した。
細胞維持中に継代するために、培養培地を除去し、細胞を、ＣａＣｌ２もＭｇＣｌ２も伴わないＤＰＢＳ（１４１９０－０９４、Ｇｉｂｃｏ）５ｍｌで２回洗浄した。細胞を、Ｔｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡ（２５２００－０５６、Ｇｉｂｃｏ）１ｍｌと共におよそ５分間インキュベートすることによってフラスコから剥離させた。次いで、培養培地４ｍｌをフラスコに添加し、混合物を穏やかに上下にピペッティングしてフラスコ表面からの細胞の剥離を補助した。細胞を１００ｇで３分間にわたってペレット化した。上清を捨て、細胞を培養培地３ｍｌに再懸濁させた。細胞をＣｏｕｎｔｅｓｓ自動細胞カウンターで計数し、１：３～１：１０で播種した、すなわち、１ｃｍ２当たり細胞１～３×１０，０００個で播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
細胞トランスフェクションおよび分化
Ｈ９Ｃ２細胞を、およそ７０～８０％コンフルエンシーのＴ－７５フラスコ２つから、上記の通り、ＤＰＢＳで洗浄し、Ｔｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡ１ｍｌを使用してフラスコから剥離させ、フラスコの表面を培養培地４ｍｌで洗い流し、１００ｇで３分間にわたってペレット化することによって収集した。細胞を、培養培地４５ｍｌに再懸濁させ、４８ウェル平底プレート（３００μｌ／ウェル）（３５３２３０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）にウェル当たり細胞４０，０００個の密度で播種した。４８ウェルプレート中の細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
２４時間後、細胞上の培養培地を、１％ＦＢＳ（熱失活させたもの－Ｇｉｂｃｏ １０２７０－１０６、ロット番号４２Ｇ２０７６Ｋ）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（３５０５０－０３８、Ｇｉｂｃｏ））を伴う抗生物質を含まない培養培地（すなわち、ＤＭＥＭ（高グルコース、Ｄ６５４６、Ｓｉｇｍａ）３００μｌと交換した。ウェル当たり３００ｎｇのＤＮＡを、ウェル当たり３０μｌの総複合体体積中ｖｉａｆｅｃｔ（Ｅ４９８１、Ｐｒｏｍｅｇａ）でトランスフェクトした。プレートをトランスフェクション後に穏やかに混合し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
２４時間後、培養培地を、トランスフェクトされた細胞から取り除き、ＤＭＥＭ（高グルコース、Ｄ６５４６、Ｓｉｇｍａ）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（３５０５０－０３８、Ｇｉｂｃｏ）、１％ＦＢＳ（熱失活させたもの－Ｇｉｂｃｏ １０２７０－１０６、ロット番号４２Ｇ２０７６Ｋ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（１５１４０－１２２、Ｇｉｂｃｏ）および０．１％レチノイド酸（Ｓｉｇｍａ－Ｒ２６２５）からなる分化培地３００μｌで置き換えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７日間インキュベートして分化を誘導した。分化後、細胞の形態を観察して、筋管への分化を確認した。
次いで、細胞を、ＤＰＢＳ５００μｌで洗浄し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を使用して１×希釈したルシフェラーゼ細胞培養溶解 ５Ｘ試薬（Ｅ１５３１、Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌを用いて溶解させた。細胞溶解試薬を１０回上下にピペッティングし、次いで、プレートを中速で３０分間ボルテックスして細胞溶解を促進した。プレートを、ルシフェラーゼアッセイの完了前に、密封し、－８０℃で保管した。Ｈ９Ｃ２細胞におけるトランスフェクション後のルシフェラーゼアッセイから収集されたデータは、３回の生物学的反復に基づき、そのそれぞれが３回の技術的反復の平均である。
ルシフェラーゼ活性の測定
－ ルシフェラーゼ活性を、ＬＡＲＩＩ（Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １０００ ａｓｓａｙ系、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１９８０）を使用して測定した
－ トランスフェクションの２４時間後、培地を細胞から取り除いた
－ 細胞をＤＰＢＳ ３００μｌで１回洗浄した。
－ 細胞を、受動的溶解緩衝液１００μｌを使用し、振とうしながら１５分間インキュベートして溶解させた。
－ 細胞片を、プレートをベンチトップ遠心分離機において最大スピードで１分間遠心分離することによってペレット化した
－ 試料１０μｌを白色９６ウェルプレートに移し、ＬＡＲＩＩ基質５０μｌをＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダーに注入することによって発光を測定した
結果
これらの細胞培養から生じた結果が図２１に示されている。図２１は、合成プロモーターＳＰ０４９７、ＳＰ０５００、ＳＰ０５０１、ＳＰ０５０６、ＳＰ０５０８、ＳＰ０５１０、ＳＰ０５１４、ＳＰ０５１９、ＳＰ０５２０、ＳＰ０５２１およびＳＰ４１６９が、筋細胞株Ｈ９Ｃ２において良好な活性を有することを示す。プロモーターＳＰ０４９８、ＳＰ０４９９、ＳＰ０５０２、ＳＰ０５０３、ＳＰ０５０４、ＳＰ０５０５、ＳＰ０５０７、ＳＰ０５０９、ＳＰ０５１１、ＳＰ０５１２、ＳＰ０５１３、ＳＰ０５１５、ＳＰ０５１６、ＳＰ０５１７、ＳＰ０５１８、ＳＰ０５２２、ＳＰ０５２３およびＳＰ０５２４もＨ９Ｃ２細胞株において実験的にしたが、示された活性は低かった（データは示していない）。実験を３連で実施した。
（実施例８）
ＨＡ－ＶＳＭＣを使用してＦＫＲＰ活性を決定するための調製
ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡ－ＶＳＭＣまたはＨＡＳＭＣ細胞）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。
試薬の調製
ＦＢＳ ２５ｍＬおよび血管平滑筋細胞補充キットを解凍した。解凍したＦＢＳおよび平滑筋細胞補充キット（構成成分については表２を参照されたい）を、滅菌０．２２μｍＰＥＳフィルターシステムの目盛り付きフィルターに添加した。目盛り付きフィルターをＦ－１２Ｋ培地で５００ｍＬまで満たし、次いで、濾過滅菌した。
表14. 血管平滑筋細胞成長キット構成成分
Figure 2023545731000108
ＨＡＳＭＣ細胞を分割し、計数するための手順
細胞調製には以下のステップが含まれた：
１． 成長培地を室温にし（約３０分間）、成長培地をＨＡ－ＶＳＭＣフラスコから吸引し、フラスコをＰＢＳで２回洗浄し、次いで、トリプシンを添加して（７５ｃｍ２のフラスコに対してトリプシン１．５ｍｌ）、細胞を成長表面から剥離させた。
２． およそ室温で≦５分で細胞を剥離させたら、成長培地９．５ｍｌを添加してトリプシンを中和し、フラスコの表面をすすぎ、次いで、細胞懸濁液を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞をペレット化し、次いで、細胞ペレットを成長培地１ｍｌに再懸濁させ、Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ試験を用い、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒｓを使用して細胞生存率を確認した。
３． ９６ウェルプレートのウェル当たり１０，０００個の細胞をプレーティングし、最終体積を１５０μｌ／ウェルとした。
４． アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中で２２±２時間インキュベートした。
ベクターの調製および形質導入の手順
ＡＡＶ９－ｓｙｎ－ｃｏＦＫＲＰストックの必要量を決定した。≦－８０℃で保管していた参照標準ストックを取り出し、室温で解凍した。解凍したストック室温に平衡化した。
低血清培地（５％）を調製し、血管平滑筋細胞補充キットを滅菌０．２２μｍＰＥＳフィルターシステムの目盛り付きフィルターに添加した。目盛り付きフィルターをＦ－１２Ｋ培地で５００ｍＬまで満たした。
ベクター溶液を、表１５の通り（結果が図２２、２３および２４に示されている）；ならびに表１６の通り（結果が図２５および２６に示されている）、調整された力価４．６７×１０１２を使用して調製した。
表の注釈：これらは全て、最高用量コホートと同じ体積まで希釈緩衝液を添加することを必要とする。
表15. 96ウェルプレートの各ウェルのrAAV(scAAV9-syn100-coFKRP)希釈物
Figure 2023545731000109
表16. 96ウェルプレートの各ウェルのrAAV(scAAV9-syn100-coFKRP)希釈物
Figure 2023545731000110
研究グレード（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒａｄｅ）のベクター力価は過大に見積もられており（約１０倍）、元の力価４．６７×１０１３では用量反応が検出されないことに留意する。
ＦＫＲＰ活性を決定するためのＨＡＳＭＣ細胞溶解物
回収された細胞溶解物の調製
形質導入の４８時間後および７２時間後、１５０μＬ／ウェルの低血清培地を除去し、１５０μＬ／ウェルのＰＢＳで置き換えた。培地の除去およびＰＢＳの添加をさらに３回繰り返した。最終的な洗浄の後、細胞層を乱さないように慎重に、液体を全て除去した。プロテアーゼ阻害剤を伴うＲＩＰＡ緩衝液５０μＬを各ウェルに添加し、室温で５分間インキュベートした。プレートを密封し、≦－８０℃で凍結させた。試料の試験を行う準備ができたら、試料を解凍した。細胞溶解物をｄｄＰＣＲプレートに慎重に移し、２～８℃、４．７ｋ ＲＰＭで２０分間遠心分離した。溶解物を氷上で維持した。
細胞溶解物に対するＦＫＲＰアッセイ
ＥＺ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐａｃｋ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）に含まれる試薬を、以下を完了させることによって調製した：
１． 脱イオン（ＤＩ）水４０μＬをジチオスレイトール（ＤＴＴ）に添加して、４００ｍＭ濃度の溶液を作製した。
２． １０×試料緩衝液２０μＬおよび４００ｍＭのＤＴＴ溶液２０μＬを蛍光５×マスターミックスに添加して１×溶液を作製した。
３． ＤＩ水２０μＬをビオチン化ラダーに添加した。試薬をボルテックスして混合し、使用するまで氷上で維持した。
４． 蛍光マスターミックス１．５μＬと溶解物６μＬとを組み合わせることによって溶解物を調製した。次いで、これらを清潔な一群の管中で組み合わせ、試料をボルテックスして混合した。
５． 試料を、９５℃に設定したヒートブロック内に入れて５分間置くことによって変性させた。
６． 試料を再度ボルテックスした。次いで、短時間遠心分離して管の底部の試料を収集し、使用する準備が整うまで氷上で保持した。
７． 抗ＦＫＲＰ（ＰＡ５－６５３４９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１：２５０）および抗ＧＡＰＤＨ（ＮＢ１００－５６８７５、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏ；１：５０００）一次抗体を、抗体希釈剤２で希釈することによって調製した。
８． ルミノール－Ｓ １００μＬと過酸化物１００μＬとを混合することによって基質を調製した。
９． 提供されたプレートマップに従って、ビオチンラダー５μＬ、調製された試料５μＬ、抗体希釈剤２ ２０μＬ、一次抗体および二次抗体それぞれ１５μＬ、ルミノール－過酸化物基質１５μＬをピペットで３８４ウェルプレートに入れた。
１０． まずスタッキングマトリックス１５μＬ、次いでＤＩ水３０μＬ、最後に分離マトリックス１５μＬをピペットで入れた。
１１． プレートを、室温、２５００ｒｐｍ（約１０００×ｇ）で５分間遠心分離した。
１２． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ（登録商標）Ｃｏｍｐａｓｓ Ｗｅｓｔｅｒｎソフトウェアで所望のアッセイテンプレートを開いた。
１３． 次いで、残りの指示に従って実行を開始して、アッセイの実行に向け機械を準備させた。
１４． 実行が完了したらそれを保存した。
実行解析 － 実行が完了した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ（登録商標）Ｃｏｍｐａｓｓ ｆｏｒ Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｐｒｏｇｒａｍ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｔａｎｄａｒｄｓによってデータを解析した。
結果
細胞生存率アッセイ
同じ条件およびＭＯＩで形質導入した細胞の追加のセットを細胞生存率アッセイのために調製した。細胞を、トリプシンを用いて培養プレートから穏やかに取り出した。生存率について試験する細胞懸濁液の一定分量を１０００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットをＰＢＳ ２００μＬに再懸濁した。細胞懸濁液１０μＬをトリパンブルー１０μＬと混合し、室温で２分間インキュベートした。次いで、インキュベーション終了から３分以内に、懸濁液１０μｌを使い捨てスライドに入れ、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞を計数した。
図２２は、細胞生存／細胞生存率に対して、ＭＯＩにかかわらず、４８時間インキュベートした時点および７２時間インキュベートした時点で形質導入の影響がなかったことを実証する。
細胞溶解物におけるＦＫＲＰ活性
図２３Ａ、２３Ｂ、２４Ａ、２４Ｂ、２６Ａ、および２６Ｂに示されている通り、細胞溶解物におけるＦＫＲＰ活性は、４８時間および７２時間、ならびにＭＯＩの増加に伴って増加した。
細胞溶解物に関しては、ＦＫＲＰ活性は、タンパク質に対して正規化した場合、ＭＯＩと共に増加し（図２３Ａ、２３Ｂ、２４Ａ、２４Ｂおよび２６Ａ）、ＭＯＩが増加するとベクターゲノム当たり減少した（図２３Ａ、２３Ｂ、２４Ａ、２４Ｂおよび２６Ｂ）。
図２４Ａおよび２４Ｂによると、形質導入の７２時間後のデータでは、形質導入の４８時間後よりも（then）良好な用量反応が示され（図２３Ａおよび２３Ｂ）、したがって、より高いＭＯＩでの（ｓｃＡＡＶ９－ｓｙｎ－ｃｏＦＫＲＰ）に対する細胞応答をさらに確認するために、次により多くのＭＯＩレベルが実行された。表１６に従った１．３×１０５から７．６×１０６の間でのベクターの調製および希釈。
図２５から、細胞生存／細胞生存率に対して、ＭＯＩにかかわらず、７２時間インキュベートした時点で形質導入の影響がないことが実証された。
考察
ＦＫＲＰを含む治療用ｒＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ９－ｓｙｎ－ｃｏＦＫＲＰ）についてｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイを開発する。アッセイは、アッセイ当たり４．４×１０５～７．５×１０６のベクターゲノムの範囲にわたって再現性があり、線形であり、複数の独立に合成されたベクターロットの相対的な効力を評価するために有用である。したがって、このアッセイは、リリース試験およびベクターロットの経時的な安定性の評価に適する。
結果は、以下の結論を支持するものである：（１）溶解物におけるＦＫＲＰの最大産生は７２時間の時点で生じる；（２）正規化されたＦＫＲＰの活性が４．４×１０５～７．５×１０６のＭＯＩの範囲にわたって示される；および（３）細胞生存に対して、ベクターによる形質導入の影響はない。
これらの結果から、臨床的投与のための薬物製品ｓｃＡＡＶ９－ｓｙｎ－ｃｏＦＫＲＰの活性を決定するためのこのアッセイの検証および使用が、現行のｉｎ ｖｉｖｏアッセイに置き換わるものとして示される。本発明者らによって開発されたｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイはまた、ベクターの変化、または、プロモーターの変化、または、導入遺伝子の変化（例えば、導入遺伝子のコドン最適化）または発現カセットを含むｒＡＡＶの任意の構成成分の変化がある場合に、ブリッジングアッセイとしても機能し得、また、変更された治療用製品の親治療用製品または参照と比較した効力の検証に役立つ。このアッセイはまた、ｒＡＡＶがプラスミド鋳型からまたは閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅｌＤＮＡ）鋳型から製造される場合にも、ブリッジングアッセイとして適切に機能し、したがって、各フォーマットから得られる治療用製品の効力を検証することができる。
（実施例９）
ＬＧＭＤ２Ｉ患者由来細胞株を使用してＦＫＲＰ活性を決定するための調製
ＬＧＭＤ２Ｉ患者由来細胞株は、α－ジストログリカンが欠乏しており、低下したレベルのＦＫＲＰを発現する。
試薬の調製
ＦＢＳ ２５ｍＬおよび筋細胞補充キットを解凍する。解凍したＦＢＳおよび平滑筋細胞補充キット（構成成分については表２を参照されたい）を滅菌０．２２μｍＰＥＳフィルターシステムの目盛り付きフィルターに添加する。目盛り付きフィルターをＦ－１２Ｋ培地で５００ｍＬまで満たす。滅菌濾過し、ビンに試薬名、試薬ロット番号、有効期限、イニシャル、日付および保管条件をラベルする。成長培地の有効期限は１カ月である。
表17. 筋肉細胞成長キット構成成分
Figure 2023545731000111
ＬＧＭＤ２Ｉ患者由来細胞の分割および計数の手順
細胞調製には以下のステップが含まれる：
１． 成長培地を室温にする（約３０分間）。
２． ＬＧＭＤ２Ｉ患者由来細胞のフラスコのいずれから回収を行うか決定する。
３． ＬＧＭＤ２Ｉ患者由来細胞のフラスコから成長培地を吸引する。
４． ７５ｃｍ２のフラスコそれぞれの中の細胞をＰＢＳ １０ｍＬで２回すすぐ。
５． ７５ｃｍ２のフラスコそれぞれにトリプシン１．５ｍＬを添加する。フラスコを振とうしてトリプシンを均一に分布させる。
６． 細胞を室温で≦５分間インキュベートする。フラスコの側面を軽くたたいて細胞をはずす。
７． 成長培地９．５ｍＬを添加してトリプシンを中和し、添加の間、フラスコの成長表面をすすぐ。
８． 細胞懸濁液を滅菌１５ｍＬ遠心管に移す。細胞のフラスコを複数回収する場合、細胞懸濁液を５０ｍＬ遠心管にプールする。
９． 細胞懸濁液を室温、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞をペレット化する。
１０． ｐ１０００ピペットを使用して上清を吸引し、細胞ペレットを成長培地１ｍＬに再懸濁させる。５～２０回上下にピペッティングして細胞の凝集塊を壊してばらばらにする。
１１． 細胞懸濁液１０μｌをピペットで１．５ｍＬエッペンドルフに入れ、Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ １０μｌを添加し、室温で２分間インキュベートする。
１２． 次いで、インキュベーション終了から３分以内に、懸濁液１０μｌをピペットで取って使い捨てスライドに入れ、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒｓを使用して細胞生存率数を計数する。
１３． ９６ウェルプレートにウェル当たり１００００個の細胞をプレーティングし、最終体積を１５０μｌ／ウェルにする。
１４． アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中で２２±２時間インキュベートする。
ベクターの調製および形質導入の手順
ＡＡＶ９－ｓｙｎ－ｃｏＦＫＲＰストックの必要量を決定する。≦－８０℃で保管していた参照標準ストックを取り出し、室温で解凍する。解凍したストックを室温に平衡化する。
低血清培地（５％）を調製し、筋細胞補充キットを解凍し、平滑筋細胞補充キットを滅菌０．２２μｍＰＥＳフィルターシステムの目盛り付きフィルターに添加する。目盛り付きフィルターをＦ－１２Ｋ培地で５００ｍＬまで満たす。
表１８および表１９の通り、調整された力価４．６７×１０１２を使用してベクター溶液を調製する。
表の注釈：これらは全て、希釈緩衝液を最高用量コホートと同じ体積まで添加することを必要とする。
表18. 96ウェルプレートの各ウェルのrAAV希釈物
Figure 2023545731000112
表19. 96ウェルプレートの各ウェルのrAAV希釈物
Figure 2023545731000113
研究グレードのベクター力価は過大に見積もられており（約１０倍）、元の力価４．６７×１０１３では用量反応が検出されないことに留意する。
ＦＫＲＰ活性を決定するためのＬＧＭＤ２Ｉ患者由来細胞溶解物
回収された細胞溶解物の調製
形質導入の４８時間後および７２時間後、５０μＬ／ウェルの低血清培地を除去し、１５０μＬ／ウェルのＰＢＳで置き換える。培地の除去およびＰＢＳの添加をさらに３回繰り返す。最終的な洗浄の後、細胞層を乱さないように慎重に、液体を全て除去する。プロテアーゼ阻害剤を伴うＲＩＰＡ緩衝液５０μＬを各ウェルに添加する。室温で５分間インキュベートする。プレートを密封し、≦－８０℃で凍結させる。プレートを密封し、≦－８０℃で凍結させる。試料の試験を行う準備ができたら、試料を解凍する。溶解物をｄｄＰＣＲプレートに慎重に移し、２～８℃、４．７ｋ ＲＰＭで２０分間遠心分離する。溶解物を氷上で維持する。
細胞溶解物に対するＦＫＲＰアッセイ
ＥＺ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐａｃｋ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）に含まれる試薬を、以下を完了させることにより調製する：
１５． 脱イオン（ＤＩ）水４０μＬをジチオスレイトール（ＤＴＴ）に添加して４００ｍＭ濃度の溶液を作製する。
１６． １０×試料緩衝液２０μＬおよび４００ｍＭのＤＴＴ溶液２０μＬを蛍光５×マスターミックスに添加して１×溶液を作製する。
１７． ＤＩ水２０μＬをビオチン化ラダーに添加する。試薬をボルテックスして混合し、使用するまで氷上で維持する。
１８． 蛍光マスターミックス１．５μＬと溶解物６μＬとを組み合わせることによって溶解物を調製する。清潔な一群の管中で組み合わせ、試料をボルテックスして混合する。
１９． 試料を、９５℃に設定したヒートブロック内に入れて５分間置くことによって変性させる。
２０． 試料を再度ボルテックスする。次いで、短時間遠心分離して管の底部の試料を収集し、使用する準備ができるまで氷上で保持する。
２１． 抗ＦＫＲＰ（ＰＡ５－６５３４９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１：２５０）および抗ＧＡＰＤＨ（ＮＢ１００－５６８７５、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏ；１：５０００）一次抗体を、抗体希釈剤２で希釈することによって調製する。
２２． 基質を、ルミノール－Ｓ １００μＬと過酸化物１００μＬとを混合することによって調製する。
２３． 提供されたプレートマップに従って、ビオチンラダー５μＬ、調製された試料５μＬ、抗体希釈剤２ ２０μＬ、一次抗体および二次抗体それぞれ１５μＬ、ルミノール－過酸化物基質１５μＬを３８４ウェルプレートにピペットで入れる。
２４． まずスタッキングマトリックス１５μＬ、次いでＤＩ水３０μＬ、最後に分離マトリックス１５μＬをピペットで入れる。
２５． プレートを、室温、２５００ｒｐｍ（約１０００×ｇ）で５分間遠心分離する。
２６． 所望のアッセイテンプレートをＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ（登録商標）Ｃｏｍｐａｓｓ Ｗｅｓｔｅｒｎソフトウェアで開く。
２７． 開始を押し、残りの指示に従って、アッセイの実行に向け機械を準備する。
２８． 実行が完了したらそれを保存する。
実行解析－実行が完了した後、データをＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ（登録商標）Ｃｏｍｐａｓｓ ｆｏｒ Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｐｒｏｇｒａｍ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって解析することができる。
結果
細胞生存率アッセイ
同じ条件およびＭＯＩで形質導入した細胞の追加のセットを細胞生存率アッセイのために調製する。細胞を、トリプシンを用いて培養プレートから穏やかに取り出す。生存率について試験する細胞懸濁液の一定分量を１０００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットをＰＢＳ ２００μＬに再懸濁した。細胞懸濁液１０μＬをトリパンブルー１０μＬと混合し、室温で２分間インキュベートした。次いで、インキュベーション終了から３分以内に、懸濁液１０μｌを使い捨てスライドに入れ、細胞を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して計数した。
細胞生存／細胞生存率に対して、ＭＯＩにかかわらず、４８時間インキュベートした時点および７２時間インキュベートした時点で形質導入の影響はない。
細胞溶解物におけるＦＫＲＰ活性
細胞溶解物におけるＦＫＲＰ活性は、４８時間および７２時間、ならびにＭＯＩの増加に伴って増加する。細胞溶解物に関しては、ＦＫＲＰ活性は、タンパク質に対して正規化した場合、ＭＯＩと共に増加し、ＭＯＩが増加するとベクターゲノム当たり減少する。
形質導入の７２時間後のデータでは、形質導入の４８時間後よりも（then）良好な用量反応が示され、したがって、次に、より高いＭＯＩでのＡＡＶ９－ｓｙｎ－ｃｏＦＫＲＰに対する細胞応答をさらに確認するために、そのＭＯＩレベルで実施する。表１９に従って１．３×１０５から７．６×１０６の間でのベクターの調製および希釈。
細胞生存／細胞生存率に対して、ＭＯＩにかかわらず、７２時間インキュベートした時点で形質導入の影響はなかった。
考察
ＬＧＭＤ２Ｉ患者由来細胞における治療用ＡＡＶ９－ｓｙｎ－ｃｏＦＫＲＰについてのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイを開発する。アッセイは、アッセイ当たり４．４×１０５～７．５×１０６のベクターゲノムの範囲にわたって再現性があり、線形であり、複数の独立に合成されたベクターロットの相対的な効力を評価するために有用である。したがって、このアッセイは、リリース試験およびベクターロットの経時的な安定性の評価に適する。
結果は、以下の結論を支持するものである：（１）溶解物におけるＦＫＲＰの最大産生は７２時間の時点で生じる；（２）正規化されたＦＫＲＰの活性が４．４×１０５～７．５×１０６のＭＯＩの範囲にわたって示される；および（３）細胞生存に対してベクターによる形質導入の影響はない。
これらの結果から、臨床的投与のための薬物製品ｓｃＡＡＶ９－ｓｙｎ－ｃｏＦＫＲＰの活性を決定するためのこのアッセイの検証および使用が、現行のｉｎ ｖｉｖｏアッセイに置き換わるものとして示される。
本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイは、心筋または骨格筋細胞株に分化するｉＰＳＣ幹細胞株、または、ＦＫＲＰノックダウン細胞株もしくはＦＫＲＰノックアウト細胞株に対して効果的であることが予想される。アッセイは、実施例８および実施例９に記載の細胞株の任意の１つまたは複数において使用され、現行のｉｎ ｖｉｖｏアッセイに置き換わるものとして、治療用製品ｓｃＡＡＶ９－ｓｙｎ１００－ｃｏＦＫＲＰの活性を決定するため、および臨床的投与のためのプラットフォームとしての役割を果たす。このアッセイは、ベクターの変化、またはプロモーターの変化、または導入遺伝子の変化（例えば、導入遺伝子のコドン最適化）、または発現カセットを含むｒＡＡＶの任意の構成成分の変化がある場合に、ブリッジングアッセイとして機能し得、また、変更された治療用製品の親治療用製品または参照と比較した効力を検証する。
（実施例９）
ＬＧＭＤ２ｉ構築物のための閉端直鎖状ＤＮＡ配列
Figure 2023545731000114
Figure 2023545731000115
Figure 2023545731000116
Figure 2023545731000117
配列番号４０６は、骨格配列を含む、ＬＧＭＤ２ｉ構築物のための閉端直鎖状ＤＮＡ配列である。配列番号４０６に記載の核酸配列を使用して、細菌配列を欠くｒＡＡＶを製造する。
配列番号４０６の塩基対１９２２～３４１２（配列番号４０７）は、ＣｐＧ枯渇ＦＫＲＰコード配列の配列である。配列番号４０７、または配列番号２に記載のＦＫＲＰコード配列からのＦＫＲＰ発現を、合成のおよび合成の短いプロモーター、例えば、表１～４または表８～１２から選択されるプロモーターおよび／またはシス調節エレメント、またはそれらの任意の組合せを含めた異なる筋肉プロモーターから駆動することができる。配列番号４０７、または配列番号２に記載のＦＫＲＰコード配列からのＦＫＲＰ発現を異なる筋肉プロモーター、例えばＳｙｎ１００によって駆動することができる。
Figure 2023545731000118
Figure 2023545731000119
配列番号４０６の塩基対１２９５～３６３３（配列番号４０８）は、左側のＩＴＲ（ＬＩＴＲｍ－自己相補的）から右側のＩＴＲ配列までを含むｒＡＡＶの配列である。一部の実施形態では、配列番号４０８を含むｒＡＡＶは、配列番号４０８のＳｙｎ１００プロモーターが表１～４または表８～１２から選択される合成筋肉プロモーターおよび／もしくはシス調節エレメント、またはそれらの任意の断片もしくはそれらの任意の組合せのいずれかで置き換えられた、配列番号３に記載のＳｙｎ１００プロモーターを含む。
Figure 2023545731000120
Figure 2023545731000121

Claims (91)

  1. 組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクターであって、そのゲノム内に、５’から３’の方向に、
    ａ）５’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）；
    ｂ）筋肉特異的プロモーター；
    ｃ）イントロン配列；
    ｄ）配列番号２または配列番号４０７に示されるヌクレオチド配列を有し、前記筋肉特異的プロモーターと動作可能に連結した、ヒトフクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）をコードする核酸；
    ｅ）ＦＫＲＰをコードする前記核酸と動作可能に連結したポリＡシグナル配列；
    ｆ）３’ＡＡＶ ＩＴＲ
    を含む、組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクター。
  2. 前記５’ＩＴＲが、ＩＴＲ２ｍである、請求項１に記載の組換えＡＡＶベクター。
  3. 前記３’ＩＴＲが、ＩＴＲ２である、請求項１から２のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
  4. 前記筋肉特異的プロモーターが、Ｓｙｎ１００（配列番号３）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
  5. 前記イントロン配列が、ＶＨ４－Ｉｇ－イントロン３（配列番号４）またはその誘導体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
  6. 前記ポリＡシグナル配列が、配列番号５である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
  7. 前記筋肉特異的プロモーター、イントロン配列、ＦＫＲＰをコードする核酸、およびポリＡシグナル配列が、配列番号１内に含まれる、請求項１から６のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
  8. 血清型がＡＡＶ９である、請求項１から７のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
  9. 請求項１から８のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む医薬組成物。
  10. ジストログリカノパチー障害を有する対象を処置するための方法であって、前記対象に、請求項１から８のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター、および／または請求項９に記載の医薬組成物を治療有効量で全身投与して、それにより、前記対象の筋組織における機能的ＦＫＲＰの発現を増加させるステップを含む、方法。
  11. 前記ジストログリカノパチー障害が、肢帯型筋ジストロフィー２Ｉである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記対象に単回用量を投与する、請求項１０から１１に記載の方法。
  13. 投与が静脈内注入によるものである、請求項１０から１２に記載の方法。
  14. 投与される前記用量が、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇから約６×１０１３ｖｇ／ｋｇまで（例えば、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇ）である、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記対象において、投与後に、以下：
    ａ）前記対象の骨格筋および／もしくは心筋におけるα－ＤＧの機能的グリコシル化が実質的に増加すること；
    ｂ）前記対象の血清クレアチンキナーゼレベルが実質的に低下すること；
    ｃ）前記対象の骨格筋におけるコラーゲン沈着が実質的に減少すること；
    ｄ）前記対象の筋組織（例えば、ヒラメ筋、横隔膜および／またはＥＤＬ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ筋力分析が有意に向上すること；
    ｅ）前記対象の１回換気量が実質的に増加すること；ならびに／または
    ｆ）前記対象がトレッドミル試験において有意に長い距離を走ることができること
    のうちの１つまたは複数が生じる、請求項１０から１４に記載の方法。
  16. 前記対象が成体である、請求項１０から１５に記載の方法。
  17. ヒトフクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）をコードする合成核酸であって、
    ａ）前記核酸のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて減少している；
    ｂ）そのＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１０％よりも大きく減少している；および／または
    ｃ）前記核酸が、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する、
    合成核酸。
  18. 前記コード配列のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも５０％減少している、請求項１７に記載の核酸。
  19. 前記コード配列のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％減少している、請求項１７から１８に記載の核酸。
  20. 前記コード配列のＣｐＧ部位含量が、０％である、請求項１７から１９に記載の核酸。
  21. 前記ＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１５％よりも大きく減少している、請求項１７に記載の合成核酸。
  22. 配列番号２に対して少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する、請求項１７に記載の合成核酸。
  23. 配列番号２または配列番号４０７に示される配列を有する、請求項１７に記載の合成核酸。
  24. プロモーターと作動可能に連結している、請求項１７から２３に記載の合成核酸。
  25. 前記プロモーターが、筋肉特異的プロモーターである、請求項２４に記載の合成核酸。
  26. 前記プロモーターが、合成プロモーターである、請求項２４から２５のいずれか一項に記載の合成核酸。
  27. 前記プロモーターが、Ｓｙｎ１００である、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の合成核酸。
  28. 前記プロモーターが、表１～４に列挙されているプロモーターから、または、表８～１２から選択される、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の合成核酸。
  29. 前記プロモーターが、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）プロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢ）である、請求項２４から２５のいずれか一項に記載の合成核酸。
  30. エンハンサー配列をさらに含む、請求項１７から２９のいずれか一項に記載の合成核酸。
  31. 前記エンハンサー配列が、ＣＭＶエンハンサー、筋肉クレアチンキナーゼエンハンサー、および／またはミオシン軽鎖エンハンサーを含む、請求項３０に記載の合成核酸。
  32. ａ）５’および３’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）；
    ｂ）前記５’ＩＴＲと３’ＩＴＲとの間に配置される、筋肉特異的プロモーターと動作可能に連結したヒトフクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）をコードするコード配列であって、
    ｉ）ＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて減少している；
    ｉｉ）ＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１０％よりも大きく減少している；および／または
    ｉｉｉ）配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する、
    コード配列
    を含む核酸。
  33. 前記筋肉特異的プロモーターと前記コード配列との間に配置されるイントロン配列をさらに含む、請求項３２に記載の核酸。
  34. 前記イントロン配列が、ＶＨ４－Ｉｇ－イントロン３（配列番号４）またはその誘導体である、請求項３３に記載の核酸。
  35. 前記コード配列の下流に配置される少なくとも１つのポリＡシグナル配列をさらに含む、請求項３２から３４に記載の核酸。
  36. 前記ポリＡシグナル配列が、配列番号５である、請求項３５に記載の核酸。
  37. 前記５’ＩＴＲが、ＩＴＲ２ｍである、請求項３２から３６に記載の核酸。
  38. 前記３’ＩＴＲが、ＩＴＲ２である、請求項３２から３７に記載の核酸。
  39. 前記コード配列の前記ＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１５％よりも大きく減少している、請求項３２から３８に記載の核酸。
  40. 前記コード配列が、配列番号２に対して少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する、請求項３２から４０に記載の核酸。
  41. 前記コード配列のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも５０％減少している、請求項３２から４０に記載の核酸。
  42. 前記コード配列のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％減少している、請求項３２から４１に記載の核酸。
  43. 前記コード配列のＣｐＧ部位含量が、０％である、請求項３２から４２に記載の核酸。
  44. 前記コード配列が、配列番号２である、請求項３２から４３に記載の核酸配列。
  45. 請求項１７から４４のいずれか一項に記載の合成核酸を含むベクター。
  46. ウイルスベクターである、請求項４５に記載のベクター。
  47. 組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４６に記載のベクター。
  48. 前記ＡＡＶベクターが、表６に列挙されている任意の血清型由来である、請求項４７に記載のベクター。
  49. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ９ベクターである、請求項４７または請求項４８に記載のベクター。
  50. 組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクターであって、そのゲノム内に、
    ａ）５’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）および３’ＡＡＶ ＩＴＲ；
    ｂ）前記５’ＩＴＲと３’ＩＴＲとの間に配置される、ヒトフクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）をコードする核酸であって、
    ｉ）ＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて減少している；
    ｉｉ）ＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１０％よりも大きく減少している；および／または
    ｉｉｉ）配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有し、
    筋肉特異的プロモーターと動作可能に連結している、
    核酸
    を含む、組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクター。
  51. 前記ＡＡＶゲノムが、５’から３’の方向に、
    ａ）前記５’ＩＴＲ、
    ｂ）前記筋肉特異的プロモーター、
    ｃ）イントロン配列、
    ｄ）ＦＫＲＰをコードする前記核酸；および、
    ｅ）前記３’ＩＴＲ
    を含む、請求項５０に記載の組換えＡＡＶベクター。
  52. 前記筋肉特異的プロモーターが、ＭＣＫプロモーター、ｄＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、ｅｎｈ３５８ＭＣＫプロモーター、ＣＫ６プロモーターおよびＳｙｎ１００プロモーター、表１～４または８～１２に列挙されている任意のプロモーター、ならびにその誘導体からなる群から選択される、請求項５０から５１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  53. ＦＫＲＰをコードする前記核酸のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて減少している、請求項５０から５２のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  54. ＦＫＲＰをコードする前記核酸のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも５０％減少している、請求項５０から５３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  55. ＦＫＲＰをコードする前記核酸のＣｐＧ部位含量が、配列番号６のＣｐＧ部位含量と比べて少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％減少している、請求項５０から５３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  56. ＦＫＲＰをコードする前記核酸のＣｐＧ部位含量が、０％である、請求項５０から５５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  57. ＦＫＲＰをコードする前記核酸のＧＣ含量が、配列番号６のＧＣ含量と比べて１０％よりも大きく減少している、請求項５０から５６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  58. ＦＫＲＰをコードする前記核酸が、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項５０から５７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  59. ＦＫＲＰをコードする前記核酸が、配列番号２に示される配列を有する、請求項５０から５８に記載の組換えＡＡＶベクター。
  60. 前記ＦＫＲＰポリペプチドをコードする前記核酸に対して３’側、かつ前記３’ＩＴＲ配列に対して５’側に配置される少なくとも１つのポリＡシグナル配列をさらに含む、請求項５０から５９のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  61. 前記ポリＡシグナル配列が、配列番号５である、請求項６０に記載の組換えＡＡＶベクター。
  62. 前記ＩＴＲが、挿入、欠失または置換を含む、請求項５０から６１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  63. 前記ＩＴＲ内の１つまたは複数のＣｐＧ部位が除去されている、請求項５０から６２に記載の組換えＡＡＶベクター。
  64. 前記５’ＩＴＲが、ＩＴＲ２ｍである、請求項５０から６３のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
  65. 前記３’ＩＴＲが、ＩＴＲ２である、請求項５０から６４のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
  66. 前記イントロン配列が、ＶＨ４－Ｉｇ－イントロン３（配列番号４）またはその誘導体である、請求項５０から６５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター。
  67. キメラＡＡＶベクター、一倍体ＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクターまたは倍数体ＡＡＶベクターである、請求項５０から６６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  68. 表６に列挙されている任意のＡＡＶ血清型のものである、請求項５０から６６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  69. 前記血清型がＡＡＶ９である、請求項６８に記載の組換えＡＡＶベクター。
  70. 表７から選択されるカプシドタンパク質または表６に列挙されているものからなる群の任意のＡＡＶ血清型、およびこれらの組合せを含む、請求項５０から６９のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
  71. 請求項５０から７０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターを、薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物。
  72. 請求項１７から４４のいずれか一項に記載の核酸および／または請求項４５から７０のいずれか一項に記載のベクターを含む形質転換された細胞。
  73. 請求項１７から４４のいずれか一項に記載の核酸、請求項４５から７０のいずれか一項に記載のベクター、および／または請求項７２に記載の形質転換された細胞を含むトランスジェニック動物。
  74. α－ジストログリカン（α－ＤＧ）のグリコシル化を増加させることを必要とする対象におけるα－ジストログリカン（α－ＤＧ）のグリコシル化を増加させる方法であって、前記対象に、請求項１７から４４のいずれか一項に記載の核酸、請求項４５から７０のいずれか一項に記載のベクター、請求項７１に記載の医薬組成物、および／または請求項７２に記載の形質転換された細胞を治療有効量で投与するステップを含み、前記対象において前記合成核酸が発現され、それにより、ヒトＦＫＲＰが産生され、α－ＤＧのグリコシル化が増加する、方法。
  75. 前記対象が、ジストログリカノパチー障害を有するまたはそれが発生するリスクがある、請求項７４に記載の方法。
  76. 対象におけるジストログリカノパチー障害を処置する方法であって、前記対象に、請求項１７から４４のいずれか一項に記載の核酸、請求項４５から７０のいずれか一項に記載のベクター、請求項７１に記載の医薬組成物、および／または請求項７２に記載の形質転換された細胞を治療有効量で投与するステップを含み、前記対象において前記合成核酸が発現し、それにより、前記対象における前記ジストログリカノパチー障害を処置する、方法。
  77. 前記ジストログリカノパチー障害が、ＦＫＲＰ異常に関連するものである、請求項７５または７６に記載の方法。
  78. 前記ジストログリカノパチー障害が、ＦＫＲＰをコードする前記核酸の変異および／またはα－ジストログリカン（α－ＤＧ）のグリコシル化不全を含む、請求項７５から７７に記載の方法。
  79. 前記ジストログリカノパチー障害が、肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ１Ｃ）、ウォーカー－ワールブルグ症候群、筋眼脳病、またはこれらの任意の組合せである、請求項７５から７８に記載の方法。
  80. ジストログリカノパチー障害を有する対象を処置するための方法であって、前記対象に、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター、前記ｒＡＡＶゲノム、核酸配列、および／または医薬組成物のいずれかを治療有効量で投与して、それにより、前記対象の筋組織における機能的ＦＫＲＰの発現を増加させるステップを含む、方法。
  81. 前記対象に単回用量を投与する、請求項７４から８０に記載の方法。
  82. 投与が、全身性のものである、請求項７４から８１に記載の方法。
  83. 投与が、静脈内注入によるものである、請求項８２に記載の方法。
  84. 投与後に、前記対象の骨格筋および／または心筋におけるα－ＤＧの機能的グリコシル化が実質的に増加する、請求項７４から８３に記載の方法。
  85. 投与後に、前記対象の血清クレアチンキナーゼレベルが実質的に低下する、請求項７４から８４に記載の方法。
  86. 投与後に、前記対象の骨格筋におけるコラーゲン沈着が実質的に減少する、請求項７４から８５に記載の方法。
  87. 前記対象が、成体である、請求項７４から８６に記載の方法。
  88. 前記対象が、若齢期個体である、請求項７４から８６に記載の方法。
  89. 前記対象が、乳幼児期個体である、請求項７４から８６に記載の方法。
  90. 前記対象が、投与前に有意な疾患病態を示している、請求項７４から８９に記載の方法。
  91. 前記対象が、投与前に有意な疾患病態を示していない、請求項７４から８９に記載の方法。
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