KR20240023643A - 조절 핵산 서열 - Google Patents

조절 핵산 서열 Download PDF

Info

Publication number
KR20240023643A
KR20240023643A KR1020247002456A KR20247002456A KR20240023643A KR 20240023643 A KR20240023643 A KR 20240023643A KR 1020247002456 A KR1020247002456 A KR 1020247002456A KR 20247002456 A KR20247002456 A KR 20247002456A KR 20240023643 A KR20240023643 A KR 20240023643A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
muscle
promoter
specific
synthetic
gene
Prior art date
Application number
KR1020247002456A
Other languages
English (en)
Inventor
호르헤 오마르 야네즈-쿠나
후안 마누엘 이글레시아스
싱클레어 쿠퍼
마이클 엘. 로버츠
안토니아 에브리피오티
Original Assignee
신프로믹스 엘티디
아스클레피오스 바이오파마슈티컬, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB2108997.4A external-priority patent/GB202108997D0/en
Application filed by 신프로믹스 엘티디, 아스클레피오스 바이오파마슈티컬, 인크. filed Critical 신프로믹스 엘티디
Publication of KR20240023643A publication Critical patent/KR20240023643A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 유전자의 근육 특이적 발현을 증진시킬 수 있는 조절 핵산 서열, 특히, 근육 특이적 프로모터, 이의 요소 및 기타 이러한 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 근육 특이적 조절 핵산 서열을 포함하는 발현 작제물, 벡터 및 세포, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 조절 핵산 서열은 유전자 치료 응용 분야에 특히 유용할 뿐만 아니라, 생물 처리 및 생명 공학과 같은 다른 분야에서도 유용성을 발견한다.

Description

조절 핵산 서열
본 발명은 유전자의 근육 특이적 발현을 증진시킬 수 있는 조절 핵산 서열, 특히, 근육 특이적 합성 프로모터, 이의 요소 및 기타 이러한 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 근육 특이적 조절 핵산 서열을 포함하는 발현 작제물, 벡터 및 세포, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 조절 핵산 서열은 유전자 치료 응용 분야에 특히 유용할 뿐만 아니라, 생물 처리 및 생명 공학과 같은 다른 분야에서도 유용성을 발견한다.
하기 논의는 본 개시 내용을 이해하는 데 독자에게 도움을 주기 위해 제공되며, 선행 기술의 내용이나 관련성에 대한 어떠한 인정도 구성하지 않는다.
유전자 치료를 비롯한 많은 분야에서, 목적하는 세포, 조직 또는 장기 내에서 유전자의 발현을 유도하여 단백질 또는 핵산 발현 산물을 생산할 수 있는 조절 핵산 서열을 제공하는 것이 바람직하다.
근육에서의 치료학적 유전자의 발현은 유전자 치료에 매력적이다. 근육에서의 유전자 치료는 디스트로핀 및 사르코글리칸과 같은 다양한 근육 단백질의 발현을 교정하거나 증대시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 이는 근 이영양증, 예를 들어, 뒤시엔느 근 이영양증(Duchenne muscular dystrophy: DMD)과 같은 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 근육은 또한 울혈성 심부전과 같은 다른 병태의 치료를 위한 치료학적 단백질을 발현하는 플랫폼으로 사용될 수 있다.
다양한 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus: AAV) 벡터뿐만 아니라 플라스미드와 같은 비-바이러스 벡터가 근육 세포에 유전자를 전달하기 위해 사용되었다. 아데노바이러스 벡터는 비교적 큰 클로닝 능력을 가지며, 일부 세포를 효율적으로 형질 도입시킬 수 있다. 그러나, 이들은 이들이 유도하는 경향이 있는 강력한 면역 반응의 관점에서 상당한 어려움에 직면해 있다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터는 장점과 단점 모두와 관련되는 게놈에 안정적으로 통합된다. 렌티바이러스 벡터는 분열 세포와 비분열 세포 모두를 형질 도입시킬 수 있지만, 대부분의 통상적인 레트로바이러스 벡터는 분열 세포만을 형질 도입시킬 수 있어 비분열 근육 세포에서의 사용이 제한된다. 플라스미드 DNA는 시험관 내에서 유전자를 근육 세포로 전달하는 데 사용될 수 있지만, 임상적 맥락에서의 잠재적인 유용성은 덜 명확하다. AAV 벡터는 근육에서의 유전자 치료 응용 분야에 특히 매력적이다. AAV 벡터는 근육 세포에 대한 자연 친화성(natural tropism)을 나타내며, 치료학적 페이로드의 장기간 발현을 유도할 수 있고, 최소한의 면역 반응을 유도할 수 있다.
근육 세포를 우선적으로 형질 도입시키는 일부 유전자 치료 벡터의 능력에도 불구하고, 오프-표적(off-target) 형질 도입이 일어난다. AAV 혈청형 1, 2 및 키메라 2.5를 사용하는 여러 1상 및 2상 임상 시험이 뒤시엔느 근 이영양증(DMD) 및 알파-1 항트립신 결핍의 치료에 대해 보고되었다(문헌 [D. E. Bowles, S. WJ McPhee, C. Li, S. J. Gray, J. J. Samulski, A. S. Camp, J. Li, B. Wang, P. E. Monahan, J. E. Rabinowitz, J. C. Grieger, La. Govindasamy, M. Agbandje-McKenna, X. Xiao and R. J. Samulski, Phase 1 gene therapy for Duchenne Muscular Dystrophy using a translational optimised AAV vector. Molecular Therapy, 20, 443-455 (2012)]; [M. L. Brantly, J. D. Chulay, L. Wang, C. Mueller, M. Humphries, L. T. Spencer, F. Rouhani, T. J. Conlon, R. Calcedo, M. R. Berts, C. Spencer, B. J. Byrne, J. M. Wilson, T. R. Flotte, Sustained transgene expression despite T lymphocyte responses in a clinical trial of rAAVl-AAT gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 16363-16368 (2009)]; [T. R. Flotte, M. L. Brantly, L. T. Spencer, B. J. Byrne, C. T. Spencer, D. J. Baker, M. Humphries, 15 Phase I trial of intramuscular injection of a recombinant adeno-associated virus alpha 1-antitrypsin (rAAV2-CB-hAAT) gene vector to AAT-deficient adults. Human gene therapy 15, 93-128 (2004)]; [T. R. Flotte, B. C. Trapnell, M. Humphries, B. Carey, R. Calcedo, F. Rouhani, M. Campbell-Thompson, A. T. Yachnis, R. A. Sandhaus, N. G. McElvaney, C. Mueller, L. M. Messina, J. M. Wilson, M. Brantly, D. R. Knop, G. J. Ye, J. D. Chulay, Phase 2 clinical trial of a recombinant adeno-associated viral vector expressing alphal-antitrypsin: interim results. Human gene therapy 22, 1239-1247 (2011)]; [C. Mueller, J. D. Chulay, B. C. Trapnell, M. Humphries, B. Carey, R. A. Sandhaus, N. G. McElvaney, L. Messina, Q. Tang, F. N. Rouhani, M. Campbell-Thompson, A. D. Fu, A. Yachnis, D. R. Knop, G. J. Ye, M. Brantly, R. Calcedo, S. Somanathan, L. P. Richman, R. H. Vonderheide, M. A. Hulme, T. M. Brusko, J. M. Wilson, T. R. Flotte, Human Treg responses allow sustained recombinant adeno-associated virus-mediated transgene expression. The Journal of clinical investigation 123, 5310-5318 (2013)]).
근육 특이적 방식으로 유전자 발현을 조절하는 시스템을 제공하는 것이 바람직하다. 이상적으로, 이러한 시스템은 근육에 매우 특이적이며(따라서 비표적 조직에서 오프-표적 발현을 피하거나 최소화함), 또한 강력하며, 즉, 근육에서 높은 발현 수준을 유도한다. 또한, 우세한 골격근 특이적 방식 또는 우세한 심근 특이적 방식으로 유전자 발현을 조절하는 시스템을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 시스템은 골격근 또는 심근 질환 또는 장애의 치료를 위해 목적하는 유전자의 특정 발현을 위한 발현 작제물 및 벡터에 포함될 수 있다. 시스-작용 조절 요소의 사용이 특이성과 활성 모두를 제공하기 위해 제안되었다. 전형적으로, 이는 시스-조절 인핸서 서열, 즉, 시스에서 작용하여 프로모터의 활성을 증가시키는 핵산 서열에 관한 것이다.
다양한 근육 특이적 프로모터는 당해 분야에 공지되어 있으며, 전형적으로 근육에서 우세하게 발현되는 유전자, 예를 들어, 데스민, 골격 액틴, 심장 α-액틴, 근육 크레아틴 키나아제(CKM), 미오신 중쇄 및 경쇄, 및 트로포닌 T/I를 인코딩하는 것들로부터 수득된다. C5-12 프로모터는 공지된 합성 프로모터를 나타낸다. 짧은 길이의 조절 서열은 조절 서열에 의해 차지되는 유전자 치료 벡터의 비율을 최소화하는 데 특히 바람직하며; 이는 AAV 벡터와 같은 제한된 용량(페이로드)을 갖는 유전자 치료 벡터에 특히 중요하다. 또한, 강력한 프로모터를 제공하는 것이 바람직하지만, 많은 경우에서, 예를 들어, 다양한 세기를 갖는 다양한 프로모터로부터 목적하는 세기를 갖는 적합한 프로모터를 선택할 수 있는 것이 통상의 기술자에게 바람직할 수 있다.
근육 특이적 유전자 발현을 유도할 수 있는 조절 핵산에 대한 당해 분야의 필요성이 여전히 존재한다. 특히, 목적하는 유전자(예를 들어, 유전자 치료 맥락에서 치료학적 이식 유전자)의 근육 특이적 발현을 위한 발현 작제물 및 벡터에 통합될 수 있는 짧은 크기의 근육 특이적 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 시스-조절 모듈, 시스-조절 요소 및 최소 또는 근위 프로모터 요소)이 필요하다. 또한, 목적하는 유전자의 골격근 특이적 발현 또는 심근 특이적 발현을 위한 발현 작제물 및 벡터에 포함될 수 있는 골격근 또는 심근에서 주로 활성인 짧은 크기의 근육 특이적 조절 서열이 필요하다.
본 발명의 첫 번째 양태에서, 하기가 제공된다:
a) 서열 번호 1~29 및 66 중 어느 하나에 따른 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터; 또는
b) 서열 번호 30~47 중 어느 하나에 따른 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 시스-조절 모듈(cis-regulatory module: CRM)을 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터.
일부 실시 형태에서, 상기 합성 근육 특이적 프로모터는 서열 번호 1~29 및 66 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 합성 근육 특이적 CRM은 서열 번호 30~47 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 시스-조절 모듈(CRM)은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 작동 가능하게 연결된 시스-조절 요소(cis-regulatory element: CRE)를 포함한다:
- CRE0119(서열 번호 48) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0127(서열 번호 49) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0137(서열 번호 50) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0138(서열 번호 51) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0139(서열 번호 52) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0143(서열 번호 53) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0145(서열 번호 54) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0077(서열 번호 55) 또는 이의 기능적 변이체;
- DES_MT_인핸서_48bp(서열 번호 56) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0075(서열 번호 57) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0083(서열 번호 58) 또는 이의 기능적 변이체;
- Ch2EnhMYL1_3_v1(서열 번호 59) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0050(서열 번호 60) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0031(서열 번호 67) 또는 이의 기능적 변이체; 및
- CRE0069(서열 번호 61) 또는 이의 기능적 변이체.
일부 실시 형태에서, b)에 따른 합성 근육 특이적 프로모터는 프로모터 요소(전형적으로는 최소 또는 근위 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 상기에 제시된 CRM을 포함한다. 상기 근위 프로모터는 바람직하게는 근육 특이적 근위 프로모터이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 합성 프로모터는,
- BG_mp(서열 번호 62) 또는 이의 기능적 변이체;
- SCP1(서열 번호 63) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0070(서열 번호 64) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0037(서열 번호 68) 또는 이의 기능적 변이체; 및
- CRE0053(서열 번호 65) 또는 이의 기능적 변이체
로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 프로모터 요소에 작동 가능하게 연결된,
- CRE0119(서열 번호 48) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0127(서열 번호 49) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0137(서열 번호 50) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0138(서열 번호 51) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0139(서열 번호 52) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0143(서열 번호 53) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0145(서열 번호 54) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0077(서열 번호 55) 또는 이의 기능적 변이체;
- DES_MT_인핸서_48bp(서열 번호 56) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0075(서열 번호 57) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0083(서열 번호 58) 또는 이의 기능적 변이체;
- Ch2EnhMYL1_3_v1(서열 번호 59) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0050(서열 번호 60) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0031(서열 번호 67) 또는 이의 기능적 변이체; 및
- CRE0069(서열 번호 61) 또는 이의 기능적 변이체
로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 시스-조절 요소(CRE)를 포함한다.
따라서, 본 발명은 다양한 합성 근육 특이적 프로모터 및 이의 기능적 변이체를 제공한다. 서열 번호 1~29 및 66 중 어느 하나의 변이체인 본 발명에 따른 합성 프로모터는 참조 프로모터의 활성의 적어도 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%를 보유하는 것이 일반적으로 바람직하다. 적합하게는, 상기 활성은 본 출원에 기재된 바와 같은 예 중 하나를 사용하여 평가되지만, 다른 방법도 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 서열 번호 48~61 및 47 중 어느 하나에 따른 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 근육 특이적 시스-조절 요소(CRE)가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 상기 근육 특이적 CRE는 서열 번호 48~61 또는 67 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 안의 임의의 포인트가 동일한 서열을 포함한다.
서열 번호 48~61 또는 67 중 어느 하나의 변이체인 본 발명에 따른 근육 특이적 CRE는 참조 CRE의 활성의 적어도 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%를 보유하는 것이 일반적으로 바람직하다. 적합하게는, 상기 활성은 본 출원에 기재된 바와 같은 예 중 하나를 사용하여 평가되지만, 다른 방법도 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 임의의 양태의 CRE를 포함하는 합성 프로모터가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 서열 번호 30~47 중 어느 하나에 따른 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 CRM이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 상기 근육 특이적 CRM은 서열 번호 30~47 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 안의 임의의 포인트가 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 CRM은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 작동 가능하게 연결된 시스-조절 요소(CRE)를 포함한다:
- CRE0119(서열 번호 48) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0127(서열 번호 49) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0137(서열 번호 50) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0138(서열 번호 51) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0139(서열 번호 52) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0143(서열 번호 53) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0145(서열 번호 54) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0077(서열 번호 55) 또는 이의 기능적 변이체;
- DES_MT_인핸서_48bp(서열 번호 56) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0075(서열 번호 57) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0083(서열 번호 58) 또는 이의 기능적 변이체;
- Ch2EnhMYL1_3_v1(서열 번호 59) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0050(서열 번호 60) 또는 이의 기능적 변이체;
- CRE0031(서열 번호 67) 또는 이의 기능적 변이체; 및
- CRE0069(서열 번호 61) 또는 이의 기능적 변이체.
본 발명의 추가의 양태에서, 서열 번호 62~65 및 68 중 어느 하나에 따른 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 최소 또는 근위 프로모터가 제공된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 최소 또는 근위 프로모터를 포함하는 합성 프로모터, 적합하게는 상기 최소 또는 근위 프로모터를 포함하는 합성 근육 특이적 프로모터가 제공된다. 적합하게는, 기능적 변이체는 서열 번호 62~65 또는 68과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다. 상기에서 명시된 바와 같이, '프로모터 요소'는 최소 또는 근위 프로모터를 지칭하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 CRE, CRM, 최소/근위 프로모터 및 합성 프로모터는 다양한 근육 조직에서, 특히 독점적으로는 아니지만 골격근 및/또는 심근에서 활성일 수 있다. 적어도 하나의 근육 조직 유형 또는 적어도 하나의 근육 세포 유형에서 활성인 CRE, CRM, 프로모터 요소 또는 합성 프로모터는 '근육 특이적'이라고 지칭될 수 있다. 용이성을 위해, 근육 특이적 CRE, CRM, 프로모터 요소 또는 합성 프로모터는 CRE, CRM, 프로모터 요소 또는 합성 프로모터가 골격근 또는 심근에서 우세하게 활성인지 여부에 따라 서브타입으로 더 세분화될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 시스-조절 요소, CRM, 프로모터 요소 및 합성 프로모터는 골격근 특이적이다. 골격근에서 우세하게 활성이고 심근에서 덜 활성이거나 활성이 아닌 시스 조절 요소, CRM, 프로모터 요소 및 합성 프로모터는 '골격근 특이적'이라고 호칭된다. 골격근의 비제한적인 예는 사두근(quadriceps), 횡격막(diaphragm), 전경골근(tibialis anterior) 및 가자미근(soleus)이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 시스-조절 요소, CRM, 프로모터 요소 및 합성 프로모터는 심근 특이적이다. 심근에서 우세하게 활성이고 골격근에서 덜 활성이거나 활성이 아닌 본 발명의 시스 조절 요소, CRM, 프로모터 요소 및 합성 프로모터는 '심근 특이적'이라고 호칭된다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 시스-조절 요소, CRM, 프로모터 요소 및 합성 프로모터는 골격근 및 심근 모두 특이적이다.
일부 실시 형태에서, 골격근 특이적 CRE, CRM, 프로모터 요소 및 합성 프로모터가 바람직할 수 있다. 이들 CRE, CRM, 프로모터 요소 및 합성 프로모터는 심장(심근)에서 거의 또는 전혀 활성이 없고 골격근에서 프로모터 활성이 필요할 때 바람직할 수 있다. 골격근에서 우세하게 활성인 것으로 디자인된 합성 근육 특이적 프로모터(골격근 특이적 합성 프로모터)의 예는 SP0497, SP0498, SP0499, SP0500, SP0501, SP0502, SP0503, SP0504, SP0505, SP0506, SP0507, SP0508, SP0509, SP0510, SP0511, SP0512, SP0513, SP0514, SP0515, SP0516, SP0517, SP0518, SP0519, SP0520, SP0521, SP0522, SP4169, SP0523 및 SP0524를 포함한다. 바람직한 합성 골격근 특이적 프로모터의 예는 SP0498, SP0500, SP0505, SP0508, SP0509, SP0513, SP0519, SP0522 및 SP0524이다. 골격근 특이적 프로모터는 속근 및/또는 지근에서 활성일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 속근에서 활성인 골격근 특이적 CRE, CRM, 프로모터 요소 및 합성 프로모터가 바람직할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 지근에서 활성인 골격근 특이적 CRE, CRM, 프로모터 요소 및 합성 프로모터가 바람직할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 지근 및 속근 모두에서 활성인 골격근 특이적 CRE, CRM, 프로모터 요소 및 합성 프로모터가 바람직할 수 있다. 지근에서 활성인 것으로 디자인된 골격근 특이적 프로모터의 예는 SP0500, SP0501 및 SP0514이다.
골격근 특이적 프로모터는 주로 골격근에서 활성이지만 심근에서는 낮은 활성을 가질 수 있다. 골격근에서 우세하게 활성인 것으로 디자인되었지만 심근에서는 낮은 활성을 가질 것으로 예상되는 합성 근육 특이적 프로모터의 예는 SP0497, SP0498, SP0499 및 SP0512를 포함한다.
골격근 특이적 프로모터는 주로 골격근에서 활성이지만 심근에서 활성을 가질 수 있다. 골격근에서 우세하게 활성인 것으로 디자인되었지만 심근에서 활성을 가질 것으로 예상되는 합성 근육 특이적 프로모터의 예는 SP0502, SP0515, SP0521, SP4169, SP0522, SP0523 및 SP0524를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 서열 번호 1(SP0497), 서열 번호 4(SP0500), 서열 번호 5(SP0501), 서열 번호 10(SP0506), 서열 번호 12(SP0508), 서열 번호 14(SP0510), 서열 번호 18(SP0514), 서열 번호 23(SP0519), 서열 번호 24(SP0520), 서열 번호 25(SP0521) 및 서열 번호 26(SP4169) 중 어느 하나에 따른 서열을 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터가 특히 바람직하다. 일부 실시 형태에서, 서열 번호 4(SP0500), 서열 번호 14(SP0510), 서열 번호 18(SP0514) 및 서열 번호 23(SP0519) 중 어느 하나에 따른 서열을 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터가 특히 바람직하다. 일부 실시 형태에서, 특정 근육 특이적 프로모터는 다른 것보다 특정 근육, 예를 들어, 심근, 골격근에서 보다 많이 발현되며, 서열 번호 18(SP0514) 및 서열 번호 23(SP0519)이 특히 바람직하다.
일부 실시 형태에서, 서열 번호 4(SP0500) 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터가 특히 바람직하다. SP0500은 심근과 같은 특정 근육에서 주로 활성이며 골격근에서도 활성이 관찰되고; SP0500은 골격근과 비교하여 심근에서 보다 많이 발현된다(예를 들어, 도 5, 6 및 12 참조). 이와 같이, SP0500은 강력한 심근 특이적 프로모터이며, 270개 미만의 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 실시 형태에서, 서열 번호 27(SP0522) 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터가 특히 바람직하다. SP0522는 심근에서 주로 활성이며 골격근에서도 활성이 관찰되고; SP0522는 골격근과 비교하여 심근에서 보다 많이 발현된다(예를 들어, 도 5, 6 및 17 참조). 이와 같이, SP0522는 강력한 심근 특이적 프로모터이며, 240개 미만의 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 실시 형태에서, 서열 번호 29(SP0524) 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터가 특히 바람직하다. SP0524는 심근과 골격근에서 활성이며; SP0524는 심근과 골격근에서 비슷한 발현 수준을 나타낸다(예를 들어, 도 5, 6 및 18 참조). 이와 같이, SP0524는 250개 미만의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 근육 특이적 프로모터이다.
일부 실시 형태에서, 서열 번호 22(SP0518) 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터가 바람직하다. SP0518은 골격근에서 활성을 가지며 심근에서도 활성이 관찰된다.
일부 실시 형태에서, 서열 번호 11(SP0507) 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터가 바람직하다. SP0507은 골격근과 심근에서 활성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 서열 번호 18(SP0514) 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터가 바람직하다. SP0514는 심근에서 활성을 가지며 골격근에서도 활성이 관찰되고; SP0514는 골격근과 비교하여 심근에서 보다 많이 발현된다(예를 들어, 도 5, 6 및 14 참조).
일부 실시 형태에서, 서열 번호 23(SP0519) 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터가 바람직하다. SP0519는 골격근에서 활성을 가지며 심근에서도 활성이 관찰되고; SP0519는 심근과 비교하여 일부 골격근 유형에서 증가된 발현을 갖는다(예를 들어, 도 5, 6 및 16 참조).
일부 실시 형태에서, 서열 번호 4(SP0500) 또는 서열 번호 27(SP0522) 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터가 특히 바람직하다. SP0500 및 SP0522는 주로 심근에서 활성이며 골격근에서 활성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 서열 번호 4(SP0500), 서열 번호 27(SP0522) 및 서열 번호 29(SP0524) 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터가 특히 바람직하다.
일부 실시 형태에서, 서열 번호 4(SP0500), 서열 번호 27(SP0522), 서열 번호 22(SP0518) 및 서열 번호 29(SP0524) 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터가 특히 바람직하다.
일부 실시 형태에서, 서열 번호 4(SP0500), 서열 번호 27(SP0522), 서열 번호 22(SP0518), 서열 번호 29(SP0524), 서열 번호 11(SP0507), 서열 번호 18(SP0514) 및 서열 번호 23(SP0519) 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터가 특히 바람직하다.
일부 실시 형태에서, 서열 번호 66(SP0321) 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 합성 근육 특이적 프로모터가 특히 바람직할 수 있다. SP0321은 근육에서 활성일 것으로 예상된다. SP0321은 또한 폐에서 활성일 것으로 예상된다. 이와 같이, SP0321은 근육 특이적 및 폐 특이적 프로모터일 것으로 예상된다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 합성 프로모터는 횡격막에서 CK8, CK7 또는 CMV보다 더 높은 활성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 합성 프로모터는 TA에서 CK8, CK7 또는 CMV보다 더 높은 활성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 합성 프로모터는 심장에서 CK8, CK7 또는 CMV보다 더 높은 활성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 합성 프로모터는 사두근에서 CK8, CK7 또는 CMV보다 더 높은 활성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 합성 프로모터는 가자미근에서 CK8, CK7 또는 CMV보다 더 높은 활성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 합성 프로모터는 간에서 CK8, CK7 또는 CMV보다 더 낮은 활성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 더 높은 활성은 대조군, 예를 들어, CK8, CK7 또는 CMV와 비교하여 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99% 또는 그 이상, 또는 적어도 1×, 2×, 3×, 4×, 5×, 10×, 20×, 30×, 40×, 50×, 100×, 500×, 1000× 또는 그 이상이다. 합성 프로모터의 활성을 테스트하기 위한 예시적인 방법론은 실시예 2 및 3에서 발견될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 프로모터는 또한 다른 조직 또는 세포에서도 활성이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 프로모터는 또한 다음 조직 또는 세포 그룹 중 하나 이상에서 활성이다: CNS, 간, 신장, 비장, 폐 및 십이지장.
일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 프로모터는 하기 표 5에 제시된 바와 같이 프로모터 요소 또는 이의 기능적 변이체에 작동 가능하게 연결된 CRE의 조합 중 하나 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
본 출원에 개시된 CRE의 조합 중 임의의 것 또는 이의 기능적 변이체에서, 언급된 CRE는 임의의 순서로 존재할 수 있다. 일부 바람직한 실시 형태에서, CRE는 언급된 순서로(즉, 작동 가능하게 연결된 프로모터 요소 또는 유전자에 대한 이의 위치를 참조로 업스트림에서 다운스트림 순서로) 존재한다. 본 출원에 개시된 CRE의 조합 중 임의의 것 또는 이의 기능적 변이체에서, 언급된 CRE의 일부 또는 전부는 적절하게 CRM에서 서로 인접하여 위치할 수 있다(즉, 임의의 개재 CRE 또는 기타 조절 요소 없음). 상기 CRE는 연속(contiguous)하거나 비연속할 수 있다(즉, 이들은 서로 바로 인접하여 위치할 수 있거나 스페이서 또는 다른 서열에 의해 분리될 수 있음). 일부 실시 형태에서, 상기 CRE의 일부 또는 전부는 연속한 것이 바람직하다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 상기 CRE 또는 이의 기능적 변이체는 언급된 순서로 제공되며 서로 인접해 있다. 예를 들어, 상기 합성 근육 특이적 CRM은 CRE0075의 바로 업스트림에 CRE0077 등을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 프로모터 요소는 CRE의 다운스트림에 있으며 전형적으로 근위 CRE에 인접해 있다. 상기 프로모터 요소는 인접한 CRE와 연속할 수 있거나 스페이서에 의해 분리될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, 발현 산물, 적합하게는 유전자, 예를 들어, 이식 유전자를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태의 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터를 포함하는 발현 카세트가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 산물은 치료학적 발현 산물이다.
상기 치료학적 발현 산물은, 근육에서의 발현이 사용될 수 있는 임의의 병태의 치료, 예를 들어, 근육 병태의 치료, 또는 근육으로부터의 치료학적 발현 산물의 분비가 바람직할 수 있는 병태의 치료에 유용한 치료학적 발현 산물일 수 있다. 상기 치료학적 발현 산물은 심혈관 병태 또는 심장 질환 및 장애, 예를 들어, 심부전 또는 CHF의 치료에 유용한 치료학적 발현 산물일 수 있다. 상기 치료학적 발현 산물은 골격근 병태, 질환 또는 장애, 예를 들어, 임의의 유형의 근 이영양증의 치료에 유용한 치료학적 발현 산물일 수 있다.
상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 상염색체의 X-연관 또는 Y-연관된 우성 또는 열성 질환에서 손상되거나 기능하지 않는 하나 이상의 유전자의 기능을 대체하는 하나 이상의 유전자일 수 있다. 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 상염색체의 X-연관 또는 Y-연관된 우성 또는 열성 질환에서 손상되거나 기능하지 않는 단백질의 대체 야생형 대응물을 인코딩하는 하나 이상의 유전자일 수 있다. 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 상염색체 열성 질환에서 손상되거나 기능적으로 기능하지 않는 단백질의 대체 야생형 대응물을 인코딩하는 유전자일 수 있다.
상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 사람 게놈에서 발견되는 유전자 또는 합성 유전자일 수 있다. 적합하게는, 상기 치료학적 발현 산물은 사람 게놈에서 발견되는 유전자일 수 있다. 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 디스펄린 유전자(DYSF 유전자)일 수 있으며, 상기 치료학적 발현 산물은 디스펄린 단백질일 수 있다. 상기 디스펄린 단백질의 기능을 손상시키는 DYSF 유전자의 돌연변이는 디스펄린 병증을 초래한다. DYSF 유전자의 돌연변이에 기인하는 디스펄린 병증의 예는 미요시 근병증(Miyoshi myopathy), 제2B형 지대형 근 이영양증(Limb Girdle muscular dystrophy type 2B) 및 원위 근병증(Distal Myopathy)을 포함한다. 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태의 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 디스펄린 병증, 예를 들어, 미요시 근병증, 제2B형 지대형 근 이영양증 및 원위 근병증의 치료에 유용할 수 있으며, 여기서, 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 DYSF 유전자이다.
상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 디스트로핀 유전자(DMD 유전자)일 수 있으며, 상기 치료학적 발현 산물은 디스트로핀 단백질일 수 있다. 디스트로핀 단백질의 기능을 손상시키는 DMD 유전자의 돌연변이는 근력 저하를 특징으로 하는 X-연관된 열성 근 이영양증 장애인 베커 근 이영양증 또는 뒤시엔느 근 이영양증을 초래한다. 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태의 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 베커 근 이영양증 또는 뒤시엔느 근 이영양증의 치료에 유용할 수 있으며, 여기서, 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 DMD 유전자이다.
상기 DMD 유전자는 사람에서 공지된 가장 큰 유전자(약 240만 염기 쌍)이다. 그러므로, 전장 DMD 유전자는 AAV 벡터와 같은 제한된 용량(페이로드)의 일부 바이러스 벡터에 패키징되기에는 너무 크다. 이러한 문제를 해결하기 위해, DMD 유전자의 보다 짧은 버전(미니 디스트로핀이라고 호칭됨)이 사용되고 있다. 그럼에도 불구하고, 심지어 상기 미니 디스트로핀도 상당히 커서(예를 들어, 3.5~4 kB), 여전히 AAV 패키징을 어렵게 만든다. 그러므로, 짧은 길이(예를 들어, 400개 미만의 뉴클레오타이드 길이, 350개 미만의 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 300개 미만의 뉴클레오타이드 길이, 보다 더 바람직하게는 290개 미만의 뉴클레오타이드 길이, 가장 바람직하게는 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 150, 100, 75, 70, 68개 미만의 뉴클레오타이드 길이)의 합성 근육 특이적 프로모터가 발현 카세트에서 특히 바람직할 수 있으며, 여기서, 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 DMD 유전자 또는 DMD 유전자의 미니 버전(미니 디스트로핀)이다.
일부 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 DMD 유전자의 짧은 버전(미니 디스트로핀)에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태의 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 DMD 유전자의 짧은 버전(미니 디스트로핀)에 작동 가능하게 연결된 서열 번호 29(SP0524) 또는 이의 기능적 변이체에 따른 합성 근육 특이적 프로모터를 포함한다.
상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 내인성 DUX4 유전자의 발현을 표적화하고 감소시키는 miRNA 또는 snRNA일 수 있다. DUX4 유전자의 기능 획득 돌연변이는 결국 진행성 근육 손상을 특징으로 하는 상염색체 우성 근 이영양증 장애인 안면 견갑 상완 근 이영양증(facioscapulohumeral muscular dystrophy: FSHD)을 유발하는 유해한 유전자 발현 변화를 초래하는 DUX4 전사 인자의 억제 상실로 이어진다. 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태의 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 FSHD의 치료에 유용할 수 있으며, 여기서, 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 내인성 DUX4 유전자의 발현을 표적화하고 감소시키는 miRNA 또는 snRNA이다.
상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 내인성 미토닌-단백 키나아제 유전자(DMPK 유전자)의 발현을 표적화하고 감소시키는 miRNA 또는 snRNA일 수 있다. DMPK 유전자의 돌연변이는 근육 기능 손상을 특징으로 하는 상염색체 우성 근 이영양증 장애인 제1형 근 긴장성 이영양증(DM1)을 초래한다. 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태의 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 DM1의 치료에 유용할 수 있으며, 여기서, 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 내인성 DMPK 유전자의 발현을 표적화하고 감소시키는 miRNA 또는 snRNA이다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 내인성 DMPK 유전자 및 야생형 대체 DMPK 유전자의 발현을 표적화하고 감소시키는 miRNA 또는 snRNA에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태의 하나 이상의 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 내인성 DMPK 유전자 및 야생형 대체 MBNL1 유전자의 발현을 표적화하고 감소시키는 miRNA 또는 snRNA에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태의 하나 이상의 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 내인성 DMPK 유전자, 야생형 대체 DMPK 유전자 및 야생형 대체 MBNL1 유전자의 발현을 표적화하고 감소시키는 miRNA 또는 snRNA에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태의 하나 이상의 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터를 포함할 수 있다.
상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 내인성 세포 핵산 결합 단백질 유전자(CNBP 유전자)의 발현을 표적화하고 감소시키는 miRNA 또는 snRNA일 수 있다. CNBP 유전자의 기능 획득 돌연변이는 근육 기능 손상을 특징으로 하는 상염색체 우성 근 이영양증 장애인 제2형 근 긴장성 이영양증(DM2)을 초래한다. 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태의 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 DM2의 치료에 유용할 수 있으며, 여기서, 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 내인성 CNBP 유전자의 발현을 표적화하고 감소시키는 miRNA 또는 snRNA이다.
상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 내인성 폴리아데닐레이트 결합 단백질 2 유전자(PABPN1 유전자)의 발현을 표적화하고 감소시키는 miRNA 또는 snRNA일 수 있다. CNBP 유전자의 기능 획득 돌연변이는 상염색체 우성 또는 상염색체 열성 근 이영양증 장애인 눈 인두 근 이영양증(Oculopharyngeal muscular dystrophy)을 초래한다. 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태의 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 눈 인두 근 이영양증의 치료에 유용할 수 있으며, 여기서, 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 내인성 PABPN1 유전자의 발현을 표적화하고 감소시키는 miRNA 또는 snRNA이다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 내인성 PABPN1 유전자 및 합성 대체 PABN1 유전자의 발현을 표적화하고 감소시키는 miRNA 또는 snRNA에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태의 하나 이상의 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 적합하게는, 상기 합성 대체물은 내인성 PABPN1 유전자의 발현을 감소시키는 miRNA 또는 snRNA의 표적이 되지 않도록 변형되거나 코돈 최적화되었다.
상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 C1C-1 이온 채널 유전자(CLCN1 유전자)일 수 있으며, 상기 치료학적 발현 산물은 C1C-1 이온 채널일 수 있다. CLCN1 유전자의 돌연변이는 골격근에 영향을 미치는 상염색체 우성 또는 상염색체 열성 채널 병증(channelopathy)인 선천성 근 긴장증(Myotonia congenita)을 초래한다. 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태의 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 선천성 근 긴장증의 치료에 유용할 수 있으며, 여기서, 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 CLCN1 유전자이다.
상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 전압 개폐 나트륨 채널 Nav1.4 유전자(SCN4A 유전자)일 수 있으며, 상기 치료학적 발현 산물은 전압 개폐 나트륨 채널 Nav1.4일 수 있다. SCN4A 유전자의 돌연변이는 선천성 이상 근 긴장증(Paramyotonia congenita), 칼륨 악화 근 긴장증(Potassium-aggravated myotonia), 고칼륨혈증 주기성 마비(Hyperkalemia periodic paralysis) 및 저칼륨혈증 주기성 마비(Hypokalemic periodic paralysis)를 유발한다. 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태의 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 선천성 이상 근 긴장증, 칼륨 악화 근 긴장증, 고칼륨혈증 주기성 마비 및 저칼륨혈증 주기성 마비의 치료에 유용할 수 있으며, 여기서, 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 SCN4A 유전자이다.
상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 SEPN1 또는 RYR1 유전자일 수 있다. SEPN1 또는 RYR1 유전자의 돌연변이는 다발심/미세심 근병증(Multi/minicore myopathy)을 초래한다. 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태의 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터를 포함하는 발현 카세트는 다발심/미세심 근병증의 치료에 유용할 수 있으며, 여기서, 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 SEPN1 또는 RYR1 유전자이다.
적합하게는, 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 합성 유전자일 수 있다. 상기 합성 유전자는 단축된, 예를 들어, AAV 벡터에 패키징되는 것을 가능하게 하도록 단축된 사람 게놈에서 발견되는 유전자일 수 있다. 상기 합성 유전자는 보다 빠른 번역을 위해 최적화된, 예를 들어, 코돈 최적화된 사람 게놈에서 발견되는 유전자 또는 그렇지 않으면 인공 작제물일 수 있다. 코돈 최적화는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 잘 이해되며, 유전자 발현을 개선시키고 번역 효율을 증가시키기 위해 숙주 유기체의 코돈 편향을 수용하도록 동의 코돈을 조정하는 것을 지칭한다. 상기 합성 유전자는, 이의 발현 단백질이 특정한 세포내 국소화를 갖도록 변형된 사람 게놈에서 발견되는 유전자, 예를 들어, 이러한 신호를 갖는 단백질이 핵 수송에 의해 세포 핵으로 유입되도록 핵 국소화 신호를 포함하도록 변형된 유전자일 수 있다. 상기 합성 유전자는, 이의 발현 단백질이 보다 효율적으로 분비되도록 변형된 사람 게놈에서 발견되는 유전자, 예를 들어, 이러한 신호를 갖는 단백질이 소포체 막을 가로지르는 전위 및 환경으로의 분비를 표적화하도록 분비 신호를 포함하도록 변형된 유전자일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 합성 유전자는 이의 발현 산물이, 예를 들어, B 세포 에피토프의 제거에 의해, 덜 면역원성으로 되도록 변형된 사람 게놈에서 발견되는 유전자일 수 있다. 상기 합성 유전자는 이의 기능이 증가되거나 감소되도록 변형된 사람 게놈에서 발견되는 유전자일 수 있다. 상기 합성 유전자는 이의 기능이 특정 miRNA 또는 snRNA에 의해 침묵되지 않도록 변형된 사람 게놈에서 발견되는 유전자일 수 있다. 사람 게놈에서 발견되는 임의의 유전자는 상기에 기재된 변형 중 하나 이상에 의해 변형되어 합성 유전자를 생성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형된 유전자는 본 출원의 양태 중 임의의 양태에서 나열된 유전자 중 어느 하나이다.
상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 합성 디스펄린 유전자(DYSF 유전자)일 수 있으며, 상기 치료학적 발현 산물은 합성 디스펄린 단백질일 수 있다. 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 단축된 합성 디스펄린 유전자(DYSF 유전자)일 수 있다. 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 AAV 벡터에 패키징되는 것을 가능하게 하도록 단축된 합성 디스펄린 유전자(DYSF 유전자)일 수 있다. 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 6 kb 미만, 5.5 kb 미만, 5 kb 미만, 4.5 kb 미만, 4 kb 미만, 3.5 kb 미만 또는 3 kb 미만으로 단축된 합성 디스펄린 유전자(DYSF 유전자)일 수 있다. 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 단일 AAV 벡터 패키징을 잘 받아 들이도록 단축된 합성 디스펄린 유사 분자일 수 있다. 상기 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 서열은 문헌 [Llanga et al., 2017]의 표 1 및 도 1A에 상세히 설명된 바와 같은 나노-디스펄린일 수 있다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 문헌 [Llanga et al., 2017]의 표 1 및 도 1A에 상세히 설명된 바와 같은 나노-디스펄린에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 임의의 양태에 따른 근육 특이적 프로모터를 포함한다.
상기 치료학적 발현 산물은 포스파타아제 활성, 예를 들어, 제1형 포스파타아제 활성의 조정 인자일 수 있다. 상기 조정 인자는 포스파타아제 활성, 예를 들어, 제1형 포스파타아제 활성을 억제하는 단백질일 수 있다. 상기 조정 인자는 전사 인자와 같은 포스파타아제 활성을 억제하는 단백질을 인코딩하는 내인성 핵산의 발현을 증가시키는 핵산일 수 있다. 상기 조정 인자는 포스파타아제 활성을 억제하는 단백질을 인코딩하는 내인성 핵산에 또는 그 근처에 통합되는 조절 서열일 수 있다. 상기 조정 인자는 siRNA와 같은 유전자 발현의 핵산 조정 인자를 제공할 수 있는 핵산일 수 있다.
상기 치료학적 발현 산물은 단백질 포스페이트 1(protein phosphate 1: PP1)의 억제 인자, 예를 들어, I-1 폴리펩타이드일 수 있다. 제1형 포스파타아제는 PP1cα, PP1cβ, PP1cδ 및 PP1cγ를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 포스파타아제 억제 인자-1(또는 "I-1") 단백질은 제1형 포스파타아제의 내인성 억제 인자이다. I-1 수준 또는 활성의 증가는 기능 저하된 사람 심근 세포의 β-아드레날린 반응성을 회복시킬 수 있다. 적합하게는, 상기 I-1 단백질은 트레오닌 35가 아스파르트산 대신 글루탐산으로 대체된 I-1 단백질과 같이 항시적으로 활성일 수 있다. 상기 치료학적 발현 산물은 포스파타아제 억제 인자 2(PP2), 오카다산 또는 칼리쿨린, 및 단백질 포스파타아제 1의 내인성 핵 억제 인자인 니플(nippl)로부터 선택된 억제 인자 중 임의의 하나 이상일 수 있다.
상기 치료학적 발현 산물은 포스파타아제 제1형 억제 인자, 예를 들어, I-1 또는 근형질 세망 Ca2+ ATPase(SERCA), 예를 들어, SERCA1(예를 들어, 1a 또는 1b), SERCA2(예를 들어, 2a 또는 2b) 또는 SERCA3과 같은 심장 활동을 조정하는 임의의 단백질일 수 있다.
상기 치료학적 발현 산물은 포스파타아제 억제 인자-1 단백질의 돌연변이 형태를 인코딩하는 핵산 서열일 수 있으며, 여기서, 상기 돌연변이 형태는 야생형의 PKC-α 인산화 부위인 위치에 적어도 하나의 아미노산을 포함하고, 여기서, 상기 적어도 하나의 아미노산은 항시적으로 비인산화되어 있거나 돌연변이 형태의 비인산화 상태를 모방한다. 상기 치료학적 발현 산물은 아데닐릴 사이클라아제 6(AC6, 아데닐일 사이클라아제 VI으로도 또한 지칭됨), S100A1, β-아드레날린성 수용체 키나아제-ct(βARKct), 사르코/소포체(SR) Ca-ATPase(SERCA2a), IL-18, VEGF, VEGF 활성 인자, 유로코르틴 및 B 세포 림프종 2(Bcl2) 관련 안타노겐 3(BAG3)일 수 있다.
상기 치료학적 발현 산물은 IL-18 억제 인자와 같은 사이토카인의 억제 인자일 수 있다. 상기 치료학적 발현 산물은 심장 기능을 증진시키기 위한 베타-아드레날린성 신호 전달 단백질(베타-ASP)(베타-아드레날린성 수용체(베타-Ars), G-단백질 수용체 키나아제 억제 인자(GRK 억제 인자) 및 아데닐릴 사이클라아제(Acs) 포함)를 인코딩할 수 있다.
상기 치료학적 발현 산물은 혈관 형성 단백질일 수 있다. 상기 혈관 형성 단백질은 혈관의 발달과 분화를 촉진한다. 상기 혈관 형성 단백질의 예는 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor: FGF) 계열, 예를 들어, aFGF(FGF-1), bFGF(FGF-2), FGF-4("hst/KS3"으로도 또한 공지됨), FGF-5 및 FGF-6, 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF) 계열, 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor: PDGF) 계열, 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor: IGF) 계열 등의 구성원을 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 프로모터, 골격근 특이적 프로모터 또는 발현 카세트를 포함하는 벡터가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 상기 벡터는 발현 벡터이다. 일부 실시 형태에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시 형태에서, 상기 벡터는 유전자 치료 벡터, 적합하게는 AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다. AAV 벡터가 특히 중요하다. AAV 벡터는 AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, BNP116, rh10, AAV2.5, AAV2i8, AAVDJ8 및 AAV2G9, 또는 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 AAV 혈청형 9(AAV9)는 심근 및 골격근에서 효율적인 형질 도입을 달성하는 것으로 알려져 있으므로, AAV9 및 이의 유도체는 적합한 AAV 벡터의 하나의 비제한적인 예를 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 상기 rAAV 벡터는 AAV3b265D 비리온, AAV3b265D549A 비리온, AAV3b549A 비리온, AAV3bQ263Y 비리온 또는 AAV3bSASTG 비리온(즉, Q263A/T265 돌연변이를 포함하는 AAV3b 캡시드를 포함하는 비리온)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 AAV3b 혈청형이다. 일부 실시 형태에서, 상기 비리온은 합리적 반수체일 수 있거나, 키메라 또는 임의의 돌연변이체, 예를 들어, 캡시드는 목적하는 위치, 예를 들어, 심근 또는 골격근에서 업데이트 증가를 위해 맞추어질 수 있다. 다른 캡시드는 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, AAV10 등을 포함하는 공지된 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형으로부터의 캡시드를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 상기 AAV 벡터는 AAV2i8이다. 일부 실시 형태에서, 상기 AAV 벡터는 AAV9이다.
본 발명에 따른 벡터는 근 이영양증의 치료를 위한 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 AAV 벡터일 수 있으며, 여기서, 상기 핵산은 골격근 특이적 프로모터 또는 근육 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다.
본 발명에 따른 벡터는 심부전의 치료를 위한 치료학적 발현 산물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 AAV 벡터일 수 있으며, 여기서, 상기 핵산은 심근 특이적 프로모터일 수 있는 근육 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다.
추가의 양태에서, 본 발명에 따른 벡터, 적합하게는 바이러스 벡터를 포함하는 비리온(바이러스 입자)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 상기 비리온은 AAV 비리온이다. 적합한 비리온은 상기에 기재되어 있다.
추가의 양태에서, 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 프로모터, 합성 골격근 특이적 프로모터, 발현 카세트, 벡터 또는 비리온을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
추가의 양태에서, 요법, 즉, 의학적 병태 또는 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 적합하게는, 이를 필요로 하는 대상체의 요법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 프로모터, 합성 골격근 특이적 프로모터, 발현 카세트, 벡터, 비리온 또는 약제학적 조성물이 제공된다. 적합하게는, 상기 병태 또는 질환은 비정상적 유전자 발현, 임의로, 근육 세포(근 세포) 또는 조직에서의 비정상적 유전자 발현과 관련되어 있다. 적합하게는, 상기 병태 또는 질환은 골격근 또는 골격 조직의 비정상적 유전자 발현과 관련되어 있다. 적합하게는, 상기 병태 또는 질환은 심근 세포 또는 심장 조직에서의 비정상적 유전자 발현과 관련되어 있다. 적합하게는, 골격근 및/또는 심근에서 치료학적 발현 산물의 발현에 사용하기 위한 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 프로모터, 합성 골격근 특이적 프로모터, 발현 카세트, 벡터, 비리온 또는 약제학적 조성물이 제공된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 질환은 골격근 질환 또는 장애일 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 질환은 근 이영양증, 예를 들어, 베커 근 이영양증, 선천성 근 이영양증, 뒤시엔느 근 이영양증, 원위 근 이영양증, 에머리-드라이푸스 근 이영양증, 안면 견갑 상완 근 이영양증, 지대형 근 이영양증, 제1형 근 긴장성 근 이영양증, 제2형 근 긴장성 근 이영양증 또는 눈 인두 근 이영양증일 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 질환은 선천성 근 긴장증, 선천성 이상 근 긴장증, 칼륨 악화 근 긴장증, 고칼륨혈증 주기성 마비 또는 저칼륨혈증 주기성 마비와 같은 근 긴장증일 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 질환은 네말린 근병증(nemaline myopathy), 다발심/미세심 근병증 및 중심핵성 근병증(Centronuclear myopathy)으로부터 선택된 선천성 근병증일 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 질환은 미토콘드리아 근병증, 주기성 마비, 염증성 근병증, 대사성 근병증, 브로디 근병증 및 유전성 봉입체 근병증으로부터 선택될 수 있다. 적합하게는, 상기 용도는 유전자 치료를 위한 것이고, 바람직하게는 비정상적 유전자 발현과 관련된 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 적합하게는, 상기 유전자 치료는 근육 세포 또는 조직에서, 적합하게는 골격근 세포 또는 골격 조직 및/또는 심근 세포 또는 심장 조직에서의 치료학적 발현 산물의 발현을 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 질환은 심혈관 질환 또는 심장 질환 및 장애일 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 질환은 울혈성 심부전과 같은 심부전일 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 질환은 허혈, 부정맥, 심근 경색(myocardial infarction: MI), 비정상적 심장 수축, 비허혈성 심근병증, 말초 동맥 폐색 질환 및 비정상적 Ca2+ 대사, 및 이의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 질환은 울혈성 심부전, 심근병증, 심근 경색, 조직 허혈, 심장 허혈, 혈관 질환, 후천성 심장 질환, 선천성 심장 질환, 죽상 동맥 경화증, 전도 시스템 기능 장애, 관상 동맥 기능 장애 및 폐 심장 고혈압의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 질환은 울혈성 심부전, 관상 동맥 질환, 심근 경색, 심근 허혈, 죽상 동맥 경화증, 심근병증, 특발성 심근병증, 심장 부정맥, 다논병, 근 이영양증, 근육량 이상, 근육 변성, 감염성 심근염, 약물 또는 독소 유발된 근육 이상, 과민성 심근염, 자가 면역 심내막염 및 선천성 심장 질환으로부터 선택될 수 있다. 적합하게는, 상기 용도는 유전자 치료를 위한 것이고, 바람직하게는 비정상적 유전자 발현과 관련된 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 적합하게는, 상기 유전자 치료는 근육 세포 또는 조직에서, 적합하게는 심근 세포 또는 심장 조직에서 및/또는 적합하게는 골격근 세포 또는 골격 조직에서의 치료학적 발현 산물의 발현을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 출원에 개시된 방법 및 조성물은 심근병증 대상체를 치료하는데 사용될 수 있으며, 여기서, 상기 심근병증 대상체는 심부전을 앓고 있다. 이러한 실시 형태에서, 상기 심부전 대상체는 뉴욕 심장 학회(York Heart Association: NYHA) 분류 시스템에서 클래스 III 이상과 동등한 분류를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 심부전 대상체는 좌심실 재형성, 말초 동맥 폐색 질환(peripheral arterial occlusive disease: PAOD), 특발성 확장성 심근병증(idiopathic dilated cardiomyopathy: IDCM)을 포함하는 확장성 심근병증(DCM), 관상 동맥 질환, 허혈, 부정맥, 심근 경색(MI), 비정상적 심장 수축, 급성(비보상성) 심부전(acute heart failure: AHF), 비정상적 Ca2+ 대사, 심근 허혈, 죽상 동맥 경화증, 심근병증, 특발성 심근병증, 유전적 장애 유발된 심근병증, 심장 부정맥, 다논병, 근 이영양증, 근육량 이상, 근육 변성, 감염성 심근염, 약물 또는 독소 유발된 근육 이상, 과민성 심근염, 자가 면역 심내막염 및 선천성 심장 질환 및 폐 심장 고혈압 중 임의의 것으로부터 선택된 심혈관 질환 또는 심장 질환을 앓고 있다.
일부 실시 형태에서, 본 출원에 개시된 방법 및 조성물은 심근병증 대상체를 치료하는데 사용될 수 있으며, 여기서, 상기 심근병증 대상체는 후천성 심근병증, 감염 또는 독소 등의 결과로 인한 후천성 심근병증, 또는 선천성 심근병증 또는 심장 증상을 동반하는 유전적 장애를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 비허혈성 심부전 및/또는 비허혈성 심근병증을 앓고 있다. 일부 실시 형태에서, 선천성 심근병증 또는 심장 증상을 동반하는 유전적 장애를 앓고 있는 대상체는 부정맥성 우심실 심근병증, 심방 점액종, 가족성 일차공 심방 중격 결손, 정맥동 심방 중격 결손, 바르트 증후군, 근 이영양증, 버거병, 심장 뇌 근병증, 염색체 1p36 결실 증후군, 제4형 선천성 전신성 지방 이영양증, 선천성 심장 차단, 확장성 심근병증, 뒤시엔느 근 이영양증(DMD), 파브리병, 가족성 심방 세동, 가족성 확장성 심근병증, 가족성 비대성 심근병증, 가족성 진행성 심장 전도 결함, 가족성 흉부 대동맥류 및 대동맥 박리, 섬유근 이형성증, 프리드라이히 운동 실조증, 고셔병, 글리코겐 축적 질환(제2형, 제3형 또는 제4형), 히스 번들 빈맥(His bundle tachycardia), 후를러 증후군, 좌심 형성 부전 증후군, 영아 조직구양 심근병증, 두개내 동정맥 기형, 이소부티릴-CoA 데하이드로게나아제 결핍, 칼리크레인 고혈압, 가와사키병, 컨스-세이어 증후군, 좌심실 비압축, 지대형 근 이영양증(제1B형, 제2E형, 제2F형, 제2M형, 제2C형, 제2D형), 제한형 전신 경화증, 긴 QT 증후군 1, 림프 부종 및 뇌 동정맥 기형, 림프구성 혈관염, 소두증-심근병증, 미토콘드리아 뇌 근병증 락트산증 및 뇌졸중 유사 에피소드, 미토콘드리아 삼중 기능성 단백질 결핍, 제1형 근 긴장성 이영양증, 신생아 뇌졸중, 제1형, 제2형, 제3형, 제4형, 제5형 및 제6형 누난 증후군, 분만전후 심근병증, 피터스 플러스 증후군, PGM1-CDG, PHACE 증후군, 포스포람반 Arg 14 결실, 자세 기립성 빈맥 증후군, 원발성 카르니틴 결핍증, 진행성 가족성 심장 차단(제1A형, 제1B형 및 제2형), 제2형 가성 저알도스테론증, 폐동맥 고혈압, 심실 중격 결손을 동반하지 않은 폐동맥판 폐쇄, 심실 중격 결손을 동반한 폐동맥판 폐쇄, 폐동맥판 협착증, 폐정맥 협착증, 폐동맥 협착증, 신장성 고혈압증, 판막 상부 폐동맥 협착증을 동반한 망막 대동맥류, 우심실 형성 부전증, 사르코이드증, 센거 증후군, 내장 역위증, 부정맥 돌연사 증후군, 판막 상부 대동맥 협착증, 스와이어 증후군, TANGO2 관련 대사성 뇌 병증 및 부정맥, TARP 증후군, 팔로 4징후, 티모시 증후군, 삼첨판 폐쇄증, 비키(Vici) 증후군, VLCAD 결핍증 및 윌리엄스 증후군으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환 또는 장애를 앓고 있다.
일부 실시 형태에서, 본 출원에 개시된 방법 및 조성물은 심근병증 대상체를 치료하는데 사용될 수 있으며, 여기서, 상기 심근병증 대상체는 허혈성 심근병증을 앓고 있다.
적절하게는, 요법을 필요로 하는 대상체는 골격근 병태에 특징적인 증상, 예를 들어, 상기에 논의된 바와 같은 근 이영양증을 나타낼 것이다. 의학 용도는 일반적으로 치료학적 양의 치료학적 산물을 발현함으로써 이를 필요로 하는 대상체에 의해 나타나는 증상을 개선시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 골격근 특이적 프로모터 또는 근육 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 디스펄린 또는 합성 디스펄린을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 상기 요법은 적합하게는 상기 대상체의 골격근 조직에서 치료학적 양의 디스펄린 또는 합성 디스펄린을 발현시키는 것을 포함한다. 적합하게는, 골격근 조직에서의 치료학적 양의 디스펄린 또는 합성 디스펄린의 발현은 대상체에서 디스펄린 병증의 증상을 감소시킨다. 적합하게는, 골격근 조직에서의 치료학적 양의 디스펄린 또는 합성 디스펄린의 발현은 골격근의 쇠약 및 소모를 약화시킬 수 있다.
적절하게는, 요법을 필요로 하는 대상체는 심혈관 병태에 특징적인 증상, 예를 들어, 상기에 논의된 바와 같은 심장 질환 또는 심부전을 나타낼 것이다. 의학 용도는 일반적으로 치료학적 양의 치료학적 산물을 발현함으로써 이를 필요로 하는 대상체에 의해 나타나는 증상을 개선시키는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 카세트는 근육 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 PP1의 억제 인자를 인코딩하는 유전자를 포함한다. 상기 요법은 적합하게는 상기 대상체의 심장 조직에서 치료학적 양의 PP1 억제 인자를 발현시키는 것을 포함한다. 적합하게는, 심장 조직에서의 치료학적 양의 PP1 억제 인자의 발현은 대상체의 심부전 또는 심장 장애의 증상을 감소시킨다. 적절하게는, 심장 조직에서의 치료학적 양의 PP1 억제 인자의 발현은 심장 재형성을 약화시키거나, 운동 능력을 개선시키거나, 심장 수축성을 개선시킬 수 있다. 적절하게는, 심장 조직에서의 치료학적 양의 PP1 억제 인자의 발현은 근세포 단축, 이완을 위한 시간 상수의 저하, 칼슘 신호 붕괴의 가속화를 초래하여 수축기말 압력 치수 관계 및 이의 조합을 개선시킬 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명의 합성 근육 특이적 프로모터, 합성 골격근 특이적 프로모터, 발현 카세트, 벡터 또는 비리온을 포함하는 세포가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 진핵 세포, 임의로는 포유 동물 세포, 임의로는 사람 세포이다. 적합하게는, 상기 세포는 근육 세포일 수 있으며, 임의로, 상기 세포는 사람 근육 세포, 적합하게는 사람 골격근 세포 또는 사람 심근 세포이다. 본 발명의 합성 근육 특이적 프로모터, 합성 골격근 특이적 프로모터, 발현 카세트, 벡터 또는 비리온은 에피솜일 수 있거나 세포의 게놈에 있을 수 있다.
추가의 양태에서, 의학적 병태 또는 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 본 출원에 기재된 바와 같은 합성 근육 특이적 CRE, CRM, 합성 근육 특이적 프로모터, 합성 골격근 특이적 프로모터, 발현 카세트, 벡터, 비리온 또는 약제학적 조성물이 제공된다.
추가의 양태에서, 발현 산물을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 발명의 합성 근육 특이적 또는 골격근 특이적 발현 카세트를 근육 세포에 제공하는 단계 및 상기 합성 근육 특이적 발현 카세트에 존재하는 유전자를 발현시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 시험관 내에서 또는 생체 외에서 이루어질 수 있거나 생체 내에서 이루어질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 생물 처리 방법이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 근육 세포는 골격근 세포이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 근육 세포는 심근 세포이다.
추가의 양태에서, 근육 세포에서 치료학적 이식 유전자를 발현시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 출원에 기재된 바와 같은 합성 근육 특이적 또는 골격근 특이적 발현 카세트, 벡터 또는 비리온을 상기 근육 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 근육 세포는 골격근 세포이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 근육 세포는 심근 세포이다.
추가의 양태에서, 이를 필요로 하는 대상체, 바람직하게는 사람의 치료 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 본 발명에 따른 프로모터에 작동 가능하게 연결된 치료학적 산물을 인코딩하는 서열을 포함하는, 본 출원에 기재된 바와 같은 발현 카세트, 벡터, 비리온 또는 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계; 및
- 상기 대상체의 근육에서 치료학적 양의 치료학적 산물을 발현시키는 단계.
치료학적 산물은 생리학적 과정 또는 질환을 예방, 완화, 치유 또는 긍정적으로 변형시키는 데 사용되는 산물이다.
하나의 실시 형태에서, 상기 근육은 골격근 세포 또는 조직이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 근육은 심근 세포 또는 조직이다. 적합하게는, 대상체의 치료 방법은 골격근 및/또는 심근에서의 치료학적 양의 치료학적 산물의 발현을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 치료학적 산물을 인코딩하는 유전자를 포함하는 본 출원에 기재된 바와 같은 발현 카세트, 벡터, 비리온 또는 약제학적 조성물을 상기 대상체의 근육에 도입하는 단계; 및
- 상기 대상체의 근육에서 치료학적 양의 치료학적 산물을 발현시키는 단계.
하나의 실시 형태에서, 상기 근육은 골격근 세포 또는 조직이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 근육은 심근 세포 또는 조직이다. 적합하게는, 상기 방법은 상기 대상체의 골격근 및/또는 심근에서의 치료학적 양의 치료학적 산물의 발현을 포함한다.
적합하게는, 상기 방법은 본 출원에 기재된 바와 같은 벡터, 비리온 또는 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 상기 벡터는 바이러스 유전자 치료 벡터, 바람직하게는 AAV 벡터이다.
일부 실시 형태에서, 상기 치료 방법은 본 발명에 따른 프로모터에 작동 가능하게 연결된 치료학적 산물을 인코딩하는 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 상기 바이러스 벡터는 전행성 심외막 관상 동맥 주입(anterograde epicardial coronary artery infusion: AECAI)에 의해 상기 대상체에게 투여된다. 일부 특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 바이러스 유전자 치료 벡터는 경피 대퇴부 접근을 통해 전행성 심외막 관상 동맥 주입(AECAI)에 의해 상기 대상체에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 상기 대상체는 심부전 또는 울혈성 심부전을 앓고 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 대상체의 치료 방법은 심부전 또는 울혈성 심부전의 치료를 위한 것이다.
본 발명의 추가 특징 및 실시 형태가 이제 다음 섹션에서 기재될 것이다. 임의의 섹션의 임의의 특징 또는 실시 형태는 임의의 다른 특징 또는 실시 형태 또는 본 발명의 임의의 양태와 임의의 실행 가능한 조합으로 조합될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 합성 근육 특이적 프로모터는 2개 이상의 프로모터 요소를 포함한다. 2개 이상의 프로모터 요소를 포함하는 합성 프로모터는 본 출원에서 '직렬(tandem) 프로모터'로서 지칭된다. 본 출원에서 CRE로 명명된 CRE0138은 TNNI2 유전자의 전사 개시 부위를 포함하며, 프로모터 요소와 유사하게 수행될 것으로 예상될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, SP0508은 프로모터 요소 CRE0138 및 CRE0053을 포함하므로 직렬 프로모터로 간주될 수 있다. 유사하게, SP0519는 프로모터 요소 CRE0138 및 BG mp를 포함하므로 직렬 프로모터로 간주될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 직렬 프로모터는 또 다른 프로모터 요소의 바로 업스트림에 프로모터 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 직렬 프로모터는 프로모터 요소 중 하나 또는 각각의 업스트림에 하나 이상의 CRE를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 직렬 프로모터는 프로모터 요소 사이에 하나 이상의 CRE를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에 개시된 합성 근육 특이적 프로모터 중 어느 하나는 추가의 프로모터 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 출원에 개시된 임의의 다른 합성 프로모터가 본 출원에 개시된 임의의 프로모터 요소에 작동 가능하게 추가로 연결될 수 있음을 인식할 것이다.
도 1은 심장 근관으로 분화된 H9C2 세포주에서 본 발명의 일부 실시 형태에 따른 합성 근육 특이적 프로모터의 평균 활성을 도시한 것이다. 오차 막대는 표준 편차이다. CBA와 CK8은 대조군 프로모터이다. y 축은 루시퍼라아제 활성(상대 광 단위)이다.
도 2는 심장 근관으로 분화된 H9C2 세포주에서 본 발명의 일부 실시 형태에 따른 합성 근육 특이적 프로모터의 평균 활성을 도시한 것이다. 오차 막대는 표준 편차이다. CBA와 CK8은 대조군 프로모터이다. 평균 활성은 대조군 프로모터 CBA에 대해 정규화되었다. y 축은 루시퍼라아제 활성(상대 광 단위)이다.
도 3은 횡격막에서 합성 근육 특이적 프로모터 SP0500, SP0507, SP0514, SP0518, SP0519, SP0522 및 SP0524와 대조군 프로모터 CK8, CMV, CK7의 생체내 활성을 도시한 것이다. 식염수 대조군(배경)도 또한 실험에 포함되었다. 식염수 대조군(배경)을 각각의 프로모터의 루시퍼라아제 발현으로부터 공제한 다음, 이 값을 횡격막의 각각의 프로모터의 벡터 카피 수로 나누었다.
도 4는 전경골근(tibialis anterior: TA)에서 합성 근육 특이적 프로모터 SP0500, SP0507, SP0514, SP0518, SP0519, SP0522 및 SP0524와 대조군 프로모터 CK8, CMV, CK7의 생체내 활성을 도시한 것이다. 식염수 대조군(배경)도 또한 실험에 포함되었다. 식염수 대조군(배경)을 각각의 프로모터의 루시퍼라아제 발현으로부터 공제한 다음, 이 값을 횡격막의 각각의 프로모터의 벡터 카피 수로 나누었다.
도 5는 심장에서 합성 근육 특이적 프로모터 SP0500, SP0507, SP0514, SP0518, SP0519, SP0522 및 SP0524와 대조군 프로모터 CK8, CMV, CK7의 생체내 활성을 도시한 것이다. 식염수 대조군(배경)도 또한 실험에 포함되었다. 식염수 대조군(배경)을 각각의 프로모터의 루시퍼라아제 발현으로부터 공제한 다음, 이 값을 횡격막의 각각의 프로모터의 벡터 카피 수로 나누었다.
도 6은 사두근에서 합성 근육 특이적 프로모터 SP0500, SP0507, SP0514, SP0518, SP0519, SP0522 및 SP0524와 대조군 프로모터 CK8, CMV, CK7의 생체내 활성을 도시한 것이다. 식염수 대조군(배경)도 또한 실험에 포함되었다. 식염수 대조군(배경)을 각각의 프로모터의 루시퍼라아제 발현으로부터 공제한 다음, 이 값을 횡격막의 각각의 프로모터의 벡터 카피 수로 나누었다.
도 7은 가자미근에서 합성 근육 특이적 프로모터 SP0500, SP0507, SP0514, SP0518, SP0519, SP0522 및 SP0524, 대조군 프로모터 CK8, CMV, CK7 및 식염수 대조군의 생체내 활성을 도시한 것이다. 어떠한 벡터 카피 수도 가자미근에서 이용 가능하지 않으므로, 이러한 그래프는 각각의 프로모터의 루시퍼라아제 발현을 나타낸다.
도 8은 간에서 합성 근육 특이적 프로모터 SP0500, SP0507, SP0514, SP0518, SP0519, SP0522 및 SP0524와 대조군 프로모터 CK8, CMV, CK7의 생체내 활성을 도시한 것이다. 식염수 대조군(배경)을 각각의 프로모터의 루시퍼라아제 발현으로부터 공제한 다음, 이 값을 횡격막의 각각의 프로모터의 벡터 카피 수로 나누었다.
도 9는 횡격막, 전경골근(TA), 사두근, 심장 및 간에서의 대조군 프로모터 CK8의 생체내 활성을 도시한 것이다.
도 10은 횡격막, 전경골근(TA), 사두근, 심장 및 간에서의 대조군 프로모터 CMV의 생체내 활성을 도시한 것이다.
도 11은 횡격막, 전경골근(TA), 사두근, 심장 및 간에서의 대조군 프로모터 CK7의 생체내 활성을 도시한 것이다.
도 12는 횡격막, 전경골근(TA), 사두근, 심장 및 간에서의 합성 근육 특이적 프로모터 SP0500의 생체내 활성을 도시한 것이다.
도 13은 횡격막, 전경골근(TA), 사두근, 심장 및 간에서의 합성 근육 특이적 프로모터 SP0507의 생체내 활성을 도시한 것이다.
도 14는 횡격막, 전경골근(TA), 사두근, 심장 및 간에서의 합성 근육 특이적 프로모터 SP0514의 생체내 활성을 도시한 것이다.
도 15는 횡격막, 전경골근(TA), 사두근, 심장 및 간에서의 합성 근육 특이적 프로모터 SP0518의 생체내 활성을 도시한 것이다.
도 16은 횡격막, 전경골근(TA), 사두근, 심장 및 간에서의 합성 근육 특이적 프로모터 SP0519의 생체내 활성을 도시한 것이다.
도 17은 횡격막, 전경골근(TA), 사두근, 심장 및 간에서의 합성 근육 특이적 프로모터 SP0522의 생체내 활성을 도시한 것이다.
도 18은 횡격막, 전경골근(TA), 사두근, 심장 및 간에서의 합성 근육 특이적 프로모터 SP0524의 생체내 활성을 도시한 것이다.
CRE 및 이의 기능적 변이체
근육 특이적 프로모터의 작제에 사용될 수 있는 다양한 CRE가 본 출원에 개시된다. 이들 CRE는 일반적으로 게놈 프로모터 및 인핸서 서열로부터 유래하지만, 이들의 본래의 게놈 환경과 상당히 상이한 맥락에서 본 출원에 사용된다. 일반적으로, 상기 CRE는 이들이 일반적으로 결합되는 유전자의 발현을 제어하는 훨씬 더 큰 게놈 조절 도메인의 작은 부분을 구성한다. 놀랍게도, 이들 중 다수의 매우 작은 CRE는 정상 환경으로부터 단리될 수 있으며, 다양한 합성 프로모터를 작제하는 데 사용될 때 근육 특이적 조절 활성을 유지할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이는 게놈의 복잡한 "3 차원" 자연 환경으로부터의 조절 서열의 제거가 종종 상당한 활성 손실을 초래하므로 주어진 CRE가 일단 이의 자연 환경으로부터 제거되면 관찰된 활성 수준을 유지할 것이라고 기대할 이유가 없기 때문에 놀라운 일이다. 이들 CRE의 많은 조합이 테스트되었으며 최소 및 근위 프로모터와 조합될 때 근육 특이적 프로모터 활성을 증진시키는 데 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 CRE 서열은 상당한 활성 손실을 초래하지 않고 변경될 수 있다는 점에 유의해야 한다. CRE의 활성에 상당히 해로운 변형이 회피되는 한, CRE의 기능적 변이체는 CRE의 서열을 변형함으로써 제조될 수 있다. 본 개시 내용에서 제공된 정보의 관점에서, 기능적 변이체를 제공하기 위한 CRE의 변형은 간단하다. 또한, 본 개시 내용은 임의의 주어진 CRE 변이체의 기능성을 간단히 평가하기 위한 방법론을 제공한다. 기능적 변이체의 예는 하기에서 논의된다.
CRE0145는 CRE0050의 기능적 변이체이며, 그 반대도 마찬가지인데, 이는 CRE0145가 CRE0050의 보다 짧은 버전이기 때문이다.
본 발명에 따른 특정 CRE의 상대적으로 작은 크기는 유리한데, 이는 CRE, 보다 구체적으로는 이를 함유하는 프로모터가 벡터 페이로드의 최소량을 차지하면서 벡터에 제공될 수 있기 때문이다. 이는 AAV 기반 벡터와 같은 제한된 용량의 벡터에 CRE를 사용할 때 특히 중요하다.
본 발명의 CRE는 특정 근육 특이적 TFBS를 포함한다. 이들 근육 특이적 TFBS가 CRE의 기능적 변이체에서 기능적으로 유지되는 것이 일반적으로 바람직하다. 통상의 기술자는 TFBS 서열이 다양하면서도 기능성을 유지할 수 있음을 잘 알고 있다. 이러한 관점에서, TFBS에 대한 서열은 전형적으로는 어느 정도의 변이가 전형적으로 존재하는 공통 서열로 예시된다. TFBS에서 발생하는 변이에 대한 추가 정보는, 주어진 뉴클레오타이드가 공통 서열의 주어진 위치에서 전형적으로 발견되는 빈도를 나타내는 위치 가중치 행렬(positional weight matrix: PWM)을 사용하여 예시될 수 있다. TF 공통 서열 및 관련 위치 가중치 행렬의 세부 사항은, 예를 들어, Jaspar 또는 Transfac 데이터베이스(http://jaspar.genereg.net/ 및 http://gene-regulation.com/pub/databases.html)에서 별견된 수 있다. 이러한 정보는 통상의 기술자가 CRE 기능을 유지하고 일부 경우에는 심지어 증가시키는 방식으로 CRE의 임의의 주어진 TFBS에서 서열을 변형하는 것을 가능하게 한다. 이러한 관점에서, 통상의 기술자는 임의의 주어진 TF에 대한 TFBS가 목적하는 TF에 결합하는 능력을 유지하면서 어떻게 변형될 수 있는지에 대한 충분한 지침을 갖고 있으며; Jaspar 시스템은, 예를 들어, 주어진 PWM과의 유사성을 기반으로 추정 TFBS의 점수를 매길 것이다. 또한, JASPAR 데이터베이스의 모든 PWM에 대해 CRE를 스캔하여 모든 TFBS를 식별/분석할 수 있다. 통상의 기술자는 물론 문헌에서 추가 지침을 발견할 수 있고, 또한, 일상적인 실험을 사용하여 임의의 변이체 CRE에서 추정 TFBS에 대한 TF 결합을 확인할 수 있다. CRE, 심지어는 CRE의 TFBS 내의 유의한 서열 변형이 기능을 유지하면서 이루어질 수 있음은 명백할 것이다.
합성 근육 특이적 CRM 및 이의 기능적 변이체
합성 근육 특이적 프로모터의 작제에 사용될 수 있는 다양한 합성 근육 특이적 CRM이 본 출원에 개시된다. 본 발명의 CRM은 광범위한 적합한 최소 프로모터 또는 근육 특이적 근위 프로모터와 조합하여 사용될 수 있다.
CRM의 기능적 변이체는 참조 CRM 요소와는 상이하지만 근육 특이적 CRM으로서의 활성을 실질적으로 유지하는 서열을 포함한다. 적합한 근육 특이적 전사 인자(transcription factor: TF)를 모집하여 발현을 증진시키는 능력을 유지하면서 CRM의 서열을 변화시키는 것이 가능함은 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다. CRM의 기능적 변이체는 CRM을 실질적으로 비기능적으로 되게 하지 않는다면 참조 CRM과 비교하여 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, CRM의 기능적 변이체는 프로모터에서 참조 CRM 대신에 치환될 때 이의 활성을 실질적으로 유지하는 CRM으로 볼 수 있다. 예를 들어, 주어진 CRM의 기능적 변이체를 포함하는 근육 특이적 프로모터는 (비변형된 CRM을 포함하는 참조 프로모터와 비교하여) 바람직하게는 이의 활성의 적어도 80%, 보다 바람직하게는 이의 활성의 적어도 90%, 보다 바람직하게는 이의 활성의 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 이의 활성의 100%를 유지한다.
적합하게는, CRM의 기능적 변이체는 참조 CRM과 상당한 수준의 서열 동일성을 유지한다. 적합하게는, 기능적 변이체는 참조 CRM과 적어도 70% 동일한, 보다 바람직하게는 참조 CRM과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
활성 유지는 참조 프로모터 제어 하의 적합한 리포터의 발현을 동등한 조건 하의 치환된 CRM을 포함하는 다른 동일한 프로모터와 비교함으로써 평가될 수 있다. 근육 특이적 프로모터 활성을 평가하기 위한 적합한 어세이(assay)는 본 출원에, 예를 들어, 실시예에 개시되어 있다.
일부 실시 형태에서, 주어진 CRM의 기능적 변이체는 참조 CRM에 존재하는 하나 이상의 CRE의 기능적 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 주어진 CRM의 기능적 변이체는 참조 CRM에 존재하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CRE의 기능적 변이체를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 주어진 CRM의 기능적 변이체는 참조 CRM과 동일한 조합 CRE를 포함할 수 있지만, CRE는 참조 CRM과 상이한 순서로 존재할 수 있다. CRE는 참조 CRM과 동일한 순서로 존재하는 것이 일반적으로 바람직하다(따라서, CRM의 기능적 변이체는 적합하게는 참조 CRM에 제시된 바와 동일한 CRE 순열을 포함함).
일부 실시 형태에서, 주어진 CRM의 기능적 변이체는 참조 CRM에 존재하는 것들에 대해 하나 이상의 추가의 CRE를 포함할 수 있다. 추가의 CRE는 참조 CRM에 존재하는 CRE의 업스트림에, 참조 CRM에 존재하는 CRE의 다운스트림에, 및/또는 참조 CRM에 존재하는 CRE 사이에 제공될 수 있다. 추가의 CRE는 본 출원에 개시된 CRE일 수 있거나, 다른 CRE일 수 있다. 일반적으로, 주어진 CRM의 기능적 변이체는 동일한 CRE(또는 이의 기능적 변이체)를 포함하고 추가의 CRE를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
주어진 CRM의 기능적 변이체는 참조 CRM과 비교하여 하나 이상의 추가의 조절 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들은 CRM을 실질적으로 비기능적으로 되게 하지 않는다면 유도성 또는 억제성 요소, 경계 제어 요소, 절연자, 유전자좌 제어 영역, 반응 요소, 결합 부위, 말단 반복부의 분절, 반응 부위, 안정화 요소, 탈안정화 요소 및 플라이싱 요소 등을 포함할 수 있다.
주어진 CRM의 기능적 변이체는 인접한 CRE 사이에 추가의 스페이서를 포함할 수 있거나, 하나 이상의 스페이서가 참조 CRM에 존재하는 경우, 상기 하나 이상의 스페이서는 참조 CRM보다 더 길거나 더 짧을 수 있다.
본 출원에 개시된 바와 같은 CRM 또는 이의 기능적 변이체가 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 프로모터를 제공하기 위해 임의의 적합한 프로모터 요소와 조합될 수 있음은 명백할 것이다.
다수의 경우, 특히 벡터(예를 들어, AAV와 같은 바이러스 벡터)가 제한된 용량을 갖는 상황에서 사용하기 위한 보다 짧은 프로모터 서열이 바람직하다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 합성 근육 특이적 CRM은 250개 이하의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 220, 200, 180, 150, 100, 75, 60, 50개 이하의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 특히 바람직한 실시 형태에서, 합성 근육 특이적 CRM은 200개 이하의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.
프로모터 요소 및 이의 기능적 변이체:
본 발명의 CRE 및 CRM은 일괄적으로 프로모터 요소로 호칭되는 광범위한 적합한 최소 프로모터 또는 근육 특이적 근위 프로모터와 조합하여 사용될 수 있다.
프로모터 요소의 기능적 변이체는 참조 프로모터 요소와는 상이하지만 근육 특이적 프로모터 요소로서의 활성을 실질적으로 유지하는 서열을 포함한다. 발현을 촉진시키는 능력을 유지하면서 프로모터 요소의 서열을 변화시키는 것이 가능함은 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다. 프로모터 요소의 기능적 변이체는 프로모터 요소를 실질적으로 비기능적으로 되게 하지 않는다면 참조 프로모터 요소와 비교하여 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 프로모터 요소의 기능적 변이체는 합성 프로모터에서 참조 프로모터 요소 대신에 치환될 때 이의 활성을 실질적으로 유지하는 프로모터 요소로 볼 수 있다. 예를 들어, 주어진 프로모터 요소의 기능적 변이체를 포함하는 근육 특이적 합성 프로모터는 (비변형된 프로모터 요소를 포함하는 참조 프로모터와 비교하여) 바람직하게는 이의 활성의 적어도 80%, 보다 바람직하게는 이의 활성의 적어도 90%, 보다 바람직하게는 이의 활성의 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 이의 활성의 100%를 유지한다.
적합하게는, 프로모터 요소의 기능적 변이체는 참조 프로모터 요소와 상당한 수준의 서열 동일성을 유지한다. 적합하게는, 기능적 변이체는 참조 프로모터 요소와 적어도 70% 동일한, 보다 바람직하게는 참조 프로모터 요소와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
활성 유지는 참조 프로모터 제어 하의 적합한 리포터의 발현을 동등한 조건 하의 치환된 프로모터 요소를 포함하는 다른 동일한 프로모터와 비교함으로써 평가될 수 있다. 근육 특이적 프로모터 활성을 평가하기 위한 적합한 어세이는 본 출원에, 예를 들어, 실시예에 개시되어 있다.
합성 근육 특이적 프로모터 및 이의 기능적 변이체
다양한 합성 근육 특이적 프로모터가 본 출원에 개시된다. 참조 합성 근육 특이적 프로모터의 기능적 변이체는 참조 합성 근육 특이적 프로모터와는 상이하지만 근육 특이적 프로모터 활성을 실질적으로 유지하는 서열을 포함하는 프로모터이다. 적합한 근육 특이적 전사 인자(TF)를 모집하고 RNA 폴리머라아제 II를 모집하여 작동 가능하게 연결된 서열(예를 들어, 오픈 리딩 프레임(open reading frame))의 근육 특이적 발현을 제공하는 능력을 유지하면서 합성 근육 특이적 프로모터의 서열을 변화시키는 것이 가능함은 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다. 합성 근육 특이적 프로모터의 기능적 변이체는 참조 프로모터와 비교하여 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있으며, 단, 이러한 치환, 결실 및/또는 삽입은 합성 근육 특이적 프로모터를 참조 프로모터와 비교하여 실질적으로 비기능적으로 되게 하지 않는다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 합성 근육 특이적 프로모터의 기능적 변이체는 참조 프로모터의 근육 특이적 프로모터 활성을 실질적으로 유지하는 변이체로 볼 수 있다. 예를 들어, 합성 근육 특이적 프로모터의 기능적 변이체는 바람직하게는 참조 프로모터 활성의 적어도 70%, 보다 바람직하게는 이의 활성의 적어도 80%, 보다 바람직하게는 이의 활성의 적어도 90%, 보다 바람직하게는 이의 활성의 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 이의 활성의 100%를 유지한다.
합성 근육 특이적 프로모터의 기능적 변이체는 종종 참조 합성 근육 특이적 프로모터와 상당한 수준의 서열 유사성을 유지한다. 일부 실시 형태에서, 기능적 변이체는 참조 합성 근육 특이적 프로모터와 적어도 70% 동일한, 보다 바람직하게는 참조 합성 근육 특이적 프로모터와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
기능적 변이체의 활성은 참조 합성 근육 특이적 프로모터의 제어 하의 적합한 리포터의 발현과 동등한 조건 하의 추정 기능적 변이체의 제어 하의 적합한 리포터의 발현을 비교함으로써 평가될 수 있다. 근육 특이적 프로모터 활성을 평가하기 위한 적합한 어세이는 본 출원에, 예를 들어, 실시예에 개시되어 있다.
주어진 합성 근육 특이적 프로모터의 기능적 변이체는 참조 합성 근육 특이적 프로모터에 존재하는 하나 이상의 CRE의 기능적 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 주어진 CRM의 기능적 변이체는 참조 CRM에 존재하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CRE를 포함할 수 있다. CRE의 기능적 변이체는 상기에 논의되어 있다.
주어진 합성 근육 특이적 프로모터의 기능적 변이체는 참조 합성 근육 특이적 프로모터와 비교할 때 프로모터 요소의 기능적 변이체 또는 상이한 프로모터 요소를 포함할 수 있다.
주어진 합성 근육 특이적 프로모터의 기능적 변이체는 참조 합성 근육 특이적 프로모터와 동일한 CRE를 포함할 수 있지만, CRE는 참조 합성 근육 특이적 프로모터와 상이한 순서로 존재할 수 있다.
주어진 합성 근육 특이적 프로모터의 기능적 변이체는 참조 합성 근육 특이적 프로모터에 존재하는 것들에 대해 하나 이상의 추가의 CRE를 포함할 수 있다. 추가의 CRE는 참조 합성 근육 특이적 프로모터에 존재하는 CRE의 업스트림에, 참조 합성 근육 특이적 프로모터에 존재하는 CRE의 다운스트림에, 및/또는 참조 합성 근육 특이적 프로모터에 존재하는 CRE 사이에 제공될 수 있다. 추가의 CRE는 본 출원에 개시된 CRE일 수 있거나, 다른 CRE일 수 있다.
주어진 합성 근육 특이적 프로모터의 기능적 변이체는 참조 합성 근육 특이적 프로모터와 비교하여 하나 이상의 추가의 조절 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들은 프로모터를 실질적으로 비기능적으로 되게 하지 않는다면 유도성 요소, 인트론 요소, 경계 제어 요소, 절연자, 유전자좌 제어 영역, 반응 요소, 결합 부위, 말단 반복부의 분절, 반응 부위, 안정화 요소, 탈안정화 요소 및 플라이싱 요소 등을 포함할 수 있다.
주어진 합성 근육 특이적 프로모터의 기능적 변이체는 인접한 CRE와 프로모터 요소 사이에 추가의 스페이서를 포함할 수 있거나, 하나 이상의 스페이서가 참조 합성 근육 특이적 프로모터에 존재하는 경우, 상기 하나 이상의 스페이서는 참조 합성 근육 특이적 프로모터보다 더 길거나 더 짧을 수 있다. 기능적 변이체의 예는 하기에 제공된다.
SP0522는 SP0502의 기능적 변이체이며, 그 반대도 마찬가지인데, 이는 SP0522가 SP0502의 보다 짧은 버전이기 때문이다. SP0523은 SP0515의 기능적 변이체이며, 그 반대도 마찬가지인데, 이는 SP0523이 SP0515의 보다 짧은 버전이기 때문이다. SP0524는 SP0521의 기능적 변이체이며, 그 반대도 마찬가지인 데, 이는 SP0524가 SP0521의 보다 짧은 버전이기 때문이다.
본 발명의 합성 근육 특이적 프로모터가 본 발명의 합성 근육 특이적 프로모터 및 추가의 조절 서열을 포함할 수 있음은 명백할 것이다. 예를 들어, 이들은 프로모터를 실질적으로 비기능적으로 되게 하지 않는다면 하나 이상의 추가의 CRM, 유도성 또는 억제성 요소, 경계 제어 요소, 절연자, 유전자좌 제어 영역, 반응 요소, 결합 부위, 말단 반복부의 분절, 반응 부위, 안정화 요소, 탈안정화 요소 및 플라이싱 요소 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 합성 근육 특이적 프로모터는 근육 세포에서 CBA 또는 RSV 프로모터에 의해 나타나는 활성의 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350% 또는 400%인 근육 특이적 프로모터 활성을 나타낸다. 다수의 경우에서, 보다 높은 수준의 프로모터 활성이 바람직하지만 이는 항상 그런 것은 아니며; 따라서, 일부 경우에는 보다 적당한 수준의 발현이 바람직할 수 있다. 일부 경우에서, 발현 수준이 요구 사항에 맞추어질 수 있도록 상이한 활성 수준의 다양한 프로모터를 사용하는 것이 바람직하며; 본 개시 내용은 이러한 범위의 활성을 제공할 것으로 예상되는 프로모터를 제공한다. CBA 또는 RSV와 비교한 본 발명의 주어진 합성 근육 특이적 프로모터의 활성은 합성 근육 특이적 프로모터의 제어 하의 리포터 유전자의 근육 특이적 발현과 CBA 또는 RSV 프로모터(2개의 프로모터가 다른 동등한 발현 작제물에서 동등한 조건 하에 제공될 때)의 제어 하의 동일한 리포터의 발현을 비교함으로써 평가될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 합성 근육 특이적 프로모터는 대상체의 근육에서 또는 근육 세포에서 유전자(예를 들어, 치료학적 유전자 또는 관심 유전자)의 발현을 공지된 근육 특이적 프로모터, 적합하게는 SPc5-12 프로모터(문헌 [Gene Ther. 2008 Nov;15(22):1489-99])에 비해 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 80%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 500%, 적어도 1000% 또는 그 이상 증가시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 합성 근육 특이적 프로모터는 CMV-IE와 비교할 때 50% 이하, 바람직하게는 CMV-IE보다 25% 이하, 보다 바람직하게는 CMV-IE보다 10% 이하, 일부 경우에서는 CMV-IE보다 5% 이하 또는 CMV-IE보다 1% 이하인 활성을 비근육 세포(예를 들어, Huh7 및 HEK293 세포)에서 나타낸다.
다수의 경우, 특히 벡터(예를 들어, AAV와 같은 바이러스 벡터)가 제한된 용량을 갖는 상황에서 사용하기 위한 보다 짧은 프로모터 서열이 바람직하다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 합성 근육 특이적 프로모터는 300개 이하의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 150, 100, 75, 70, 68개 이하의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 합성 근육 특이적 프로모터는 300개 이하의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 290개 이하의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 280개 이하의 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 270개 이하의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 합성 근육 특이적 프로모터는 260개 이하의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 250개 이하의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 240개 이하의 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 230개 이하의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
특히 바람직한 합성 근육 특이적 프로모터는 짧고 높은 수준의 활성을 나타내는 것들이다.
합성 근육 특이적 발현 카세트
본 발명은 또한 발현 산물, 적합하게는 유전자(예를 들어, 이식 유전자)를 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 합성 근육 특이적 프로모터를 포함하는 합성 근육 특이적 발현 카세트를 제공한다.
상기 유전자는 전형적으로 폴리펩타이드(단백질) 또는 RNA와 같은 목적하는 유전자 발현 산물을 인코딩한다. 상기 유전자는 전장 cDNA 또는 게놈 DNA 서열, 또는 적어도 일부 목적하는 생물학적 활성을 갖는 이의 임의의 단편, 서브유닛 또는 돌연변이체일 수 있다.
상기 유전자가 단백질을 인코딩할 때, 이는 본질적으로 임의의 유형의 단백질일 수 있다. 비제한적인 예로서, 상기 단백질은 효소, 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 단클론 항체), 바이러스 단백질(예를 들어, REP-CAP, REV, VSV-G 또는 RD114), 치료학적 단백질 또는 독성 단백질(예를 들어, 카스파아제 3, 8 또는 9)일 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시 형태에서, 상기 유전자는 임의로 근육에서, 임의로, 골격근 및/또는 심근에서 비정상적 유전자 발현과 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용하기에 적합한 치료학적 발현 산물, 바람직하게는 치료학적 폴리펩타이드를 인코딩한다.
일부 실시 형태에서, 상기 치료학적 발현 산물은 근육 질환의 치료에 유용한 것들을 포함한다. "근 질환" 또는 "근육 질환"이라는 용어는 원칙적으로 통상의 기술자에 의해 이해된다. 상기 용어는 근육, 특히, 근육 세포에 대한 활성 화합물의 투여에 의해 치료 및/또는 예방할 수 있는 질환에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 상기 근 질환은 골격근 질환이다. 일부 실시 형태에서, 상기 근 질환은 심근 질환이다.
일부 실시 형태에서, 상기 치료학적 발현 산물은 뒤시엔느 근 이영양증의 치료에 유용한 것들이다. 일부 실시 형태에서, 상기 치료학적 발현 산물은 DMD 유전자 또는 이의 기능적 변이체이다.
일부 실시 형태에서, 상기 치료학적 발현 산물은 심부전 또는 울혈성 심부전의 치료에 유용한 것들이다.
일부 실시 형태에서, 상기 근 질환은 혈관 질환, 근 이영양증, 심근병증, 근 긴장증, 근 위축증, 간대성 근 경련 근 긴장 이상증(발병 유전자: SGCE), 미토콘드리아 근병증, 횡문근 융해증, 섬유 근육통 및/또는 근막 통증 증후군이다.
하나의 실시 형태에서, 상기 질환은 심혈관 질환 또는 심장 질환 또는 장애일 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 질환은 울혈성 심부전과 같은 심부전일 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 질환은 허혈, 부정맥, 심근 경색(MI), 비정상적 심장 수축, 비허혈성 심근병증, 말초 동맥 폐색 질환 및 비정상적 Ca2+ 대사, 및 이의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 질환은 울혈성 심부전, 심근병증, 심근 경색, 조직 허혈, 심장 허혈, 혈관 질환, 후천성 심장 질환, 선천성 심장 질환, 죽상 동맥 경화증, 전도 시스템 기능 장애, 관상 동맥 기능 장애 및 폐 심장 고혈압의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 질환은 울혈성 심부전, 관상 동맥 질환, 심근 경색, 심근 허혈, 죽상 동맥 경화증, 심근병증, 특발성 심근병증, 심장 부정맥, 다논병, 근 이영양증, 근육량 이상, 근육 변성, 감염성 심근염, 약물 또는 독소 유발된 근육 이상, 과민성 심근염, 자가 면역 심내막염 및 선천성 심장 질환으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 심근병증은 비대성 심근병증, 부정맥성 우심실 이형성증, 확장성 심근병증, 제한성 심근병증, 좌심실 비압축, 타코츠보 심근병증, 심근염, 호산구성 심근염 및 허혈성 심근병증이다. 바람직하게는, 상기 비대성 심근병증은 CMH1(유전자: MYH7), CMH2(유전자: TNNT2), CMH3(유전자: TPM1), CMH4(유전자: MYBPC3), CMH5, CMH6(유전자: PRKAG2), CMH7(유전자: TNNI3), CMH8(유전자: MYL3), CMH9(유전자: TTN), CMH10(유전자: MYL2), CMH11(유전자: ACTC1) 또는 CMH12(유전자: CSRP3)이다. 바람직하게는, 상기 부정맥성 우심실 이형성증은 ARVD1(유전자: TGFB3), ARVD2(유전자: RYR2), ARVD3, ARVD4, ARVD5(유전자: TMEM43), ARVD6, ARVD7(유전자: DES), ARVD8(유전자: DSP), ARVD9(유전자: PKP2), ARVD10(유전자: DSG2), ARVD11(유전자: DSC2) 및/또는 ARVD12(유전자: JUP)이다.
일부 실시 형태에서, 상기 근 질환은 혈관 질환이다. 혈관 질환은 관상 동맥 질환, 말초 동맥 질환, 뇌혈관 질환, 신동맥 협착증 또는 대동맥류일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 근 질환은 심근병증일 수 있다. 상기 심근병증은 고혈압성 심장 질환, 심부전(예를 들어, 울혈성 심부전), 폐성 심장 질환, 심부정맥, 염증성 심장 질환(예를 들어, 심내막염, 염증성 심장 비대, 심근염), 심장 판막 질환, 선천성 심장 질환 및 류마티스성 심장 질환일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 근 이영양증은 뒤시엔느 근 이영양증(발병 유전자: DMD), 베커 근 이영양증(발병 유전자: DMD), 지대형 근 이영양증(서브타입 및 발병 유전자: LGMD1A(유전자: TTID), LGMD1B(유전자: LMNA), LGMD1C(유전자: CAV3), LGMD1D(유전자: DNAJB6), LGMD1E(유전자: DES), LGMD1F(유전자: TNP03), LGMD1G(유전자: HNRPDL), LGMD1H, LGMD2A(유전자: CAPN3), LGMD2B(유전자: DYSF), LGMD2C(유전자: SGCG), LGMD2D(유전자: SGCA), LGMD2E(유전자: SGCB), LGMD2F(유전자: SGCD), LGMD2G(유전자: TCAP), LGMD2H(유전자: TRIM32), LGMD2I(유전자: FKRP), LGMD2J(유전자: TTN), LGMD2K(유전자: POMT1), LGMD2L(유전자: AN05), LGMD2M(유전자: FKTN), LGMD2N(유전자: POMT2), LGMD20(유전자: POMGNT1), LGMD2Q(유전자: PLEC1), 선천성 근 이영양증, 뒤시엔느 근 이영양증, 에머리-드라이푸스 근 이영양증, 원위 근 이영양증(서브타입 및 발병 유전자: 미요시 근병증(유전자: DYSF), 전경골 발병을 동반한 원위 근병증(유전자: DYSF), 웰랜더(Welander) 원위 근병증(유전자: TIA1), 고워-라잉(Gowers-Laing) 원위 근병증(유전자: MYH7), 노나카 원위 근병증, 제1형 유전성 봉입체 근염, 성대 및 인두 쇠약을 동반한 원위 근병증, ZASP 관련 근병증, 안면 견갑 상완 근 이영양증(서브타입 및 발병 유전자: 제1형(유전자: DUX4), 제2형(유전자: SMCHD1)), 눈 인두 근 이영양증(발병 유전자: PABPN1) 및/또는 근 긴장성 이영양증(서브타입 및 발병 유전자: DM1(유전자: DMPK) 및 DM2(유전자: ZNF9))이다.
일부 실시 형태에서, 상기 근 긴장증은 선천성 근 긴장증(발병 유전자: CLCN1; 서브타입: 톰센 유형, 베커 유형), 칼륨 악화 근 긴장증 및/또는 선천성 이상 근 긴장증(발병 유전자: SCN4A)이다.
일부 실시 형태에서, 상기 근 질환은 뒤시엔느 근 이영양증(유전자: DMD), 근세관성 근병증(유전자: MTM1), 척수성 근 위축증(유전자: SMA), 제II형 글리코겐 축적 질환(폼페병, 유전자: GAA), 또는 심근병증이다.
일부 실시 형태에서, 상기 질환은 고칼륨혈증 주기성 마비 또는 저칼륨혈증 주기성 마비일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 질환은 네말린 근병증, 다발심/미세심 근병증 및 중심핵성 근병증으로부터 선택된 선천성 근병증일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 질환은 염증성 근병증, 대사성 근병증, 브로디 근병증 또는 유전성 봉입체 근병증으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 유전자는 비질환 매개 변이체, 예를 들어, DMD, GALGT2, SMA, GAA, MTM1, TTID, LMNA, CAV3, DNAJB6, DES, TNP03, HNRPDL, CAPN3, DYSF, SGCG, SGCA, SGCB, SGCD, TCAP, TRIM32, FKRP, TTN, POMT1, AN05, FKTN, POMT2, PFEC1, TIA1, MYH7, DUX4, SMCHD, PABPN1, DMPK, MBNL1, ZNF9, CFCN1, SCN4A, MYH7, TNNT2, TPM1, MYBPC3, PRKAG2, TNNI3, MYF3, TTN, MYF2, ACTC1, CSRP3, TGFB3, RYR2, TMEM43, DES, DSP, PKP2, DSG2, DSC2, JUP, CNBP, CLCN1, SEPN1, RYR1 및 HYPP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 사람 유전자의 야생형 변이체를 인코딩한다.
일부 실시 형태에서, 상기 유전자는　DMD GALGT2, SMA, GAA, MTM1, TTID, LMNA, CAV3, DNAJB6, DES, TNP03, HNRPDL, CAPN3, DYSF, SGCG, SGCA, SGCB, SGCD, TCAP, TRIM32, FKRP, TTN, POMT1, AN05, FKTN, POMT2, PFEC1, TIA1, MYH7, DUX4, SMCHD, PABPN1, DMPK, MBNL1, ZNF9, CFCN1, SCN4A, MYH7, TNNT2, TPM1, MYBPC3, PRKAG2, TNNI3, MYF3, TTN, MYF2, ACTC1, CSRP3, TGFB3, RYR2, TMEM43, DES, DSP, PKP2, DSG2, DSC2, JUP, CNBP, CLCN1, SEPN1, RYR1 및 HYPP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 사람 유전자의 합성 야생형 변이체를 인코딩한다.
추가의 예시적인 근육 조직 관련 질환은 산성 말타아제 결핍증(acid maltase deficiency: AMD), 알파-1 항트립신 결핍증, 근 위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 안데르센-타윌 증후군, 베커 근 이영양증(Becker muscular dystrophy: BMD), 선천성 베커 근 긴장증, 베들렘 근병증, 심혈관 질환, 카르니틴 결핍증, 카르니틴 팔미틸 트랜스퍼라아제 결핍증(CPT 결핍증), 중심핵 질환(central core disease: CCD), 중심핵성 근병증, 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease: CMT), 선천성 근무력증 증후군(congenital myasthenic syndrome: CMS), 선천성 근 긴장성 이영양증, 울혈성 심부전, 코리병(탈분지 효소 결핍증), 탈분지 효소 결핍증, 데제린-소타스병(Dejerine-Sottas disease: DSD), 피부근염(dermatomyositis: DM), 내분비성 근병증, 오일렌부르그(Eulenberg)병(선천성 이상 근 긴장증), 포브스병(탈분지 효소 결핍증), 프리드라이히 운동 실조증(Friedreich's ataxia: FA), 제10형 글리코겐증, 제11형 글리코겐증, 제2형 글리코겐증, 제3형 글리코겐증, 제5형 글리코겐증, 제7형 글리코겐증, 제9형 글리코겐증, 고워-라잉 원위 근병증, 하우프만-탄호이저(Hauptmann-Thanheuser) MD(에머리-드라이푸스 근 이영양증), 유전성 봉입체 근염, 유전성 운동 및 감각 신경 병증(샤르코-마리-투스병), 갑상선 기능 항진 근병증, 갑상선 기능 저하 근병증, 봉입체 근염(inclusion-body myositis: IBM), 유전성 근병증, 인테그린 결핍 선천성 근 이영양증, 락테이트 데하이드로게나아제 결핍증, 램버트-이튼 근무력증 증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome: LEMS), 맥아들(McArdle)병(포스포릴라아제 결핍증), 근육 대사 질환, 미토콘드리아 근병증, 미요시 원위 근병증, 운동 신경원성 질환, 근육-눈-뇌 질환, 중증 근육무력증(myasthenia gravis: MG), 미오아데닐레이트 데아미나아제 결핍증, 근원섬유 근병증, 미오포스포릴라아제 결핍증, 선천성 근 긴장증(myotonia congenita: MC), 근 긴장성 근 이영양증(myotonic muscular dystrophy: MMD), 근세관성 근병증(myotubular myopathy: MTM 또는 MM), 네말린 근병증, 노나카 원위 근병증, 눈 인두 근 이영양증(oculopharyngeal muscular dystrophy: OPMD), 선천성 이상 근 긴장증, 피어슨 증후군, 주기성 마비, 비골근 위축증(샤르코- 마리-투스병), 포스포프럭토키나아제 결핍증, 포스포글리세레이트 키나아제 결핍증, 포스포글리세레이트 뮤타아제 결핍증, 포스포릴라아제 결핍증, 포스포릴라아제 결핍증, 다발성 근염(polymyositis: PM), 폼페병(산성 말타아제 결핍증), 진행성 외안근 마비(progressive external ophthalmoplegia: PEO), 막대체 질환(네말린 근병증), 척수성 근 위축증(spinal muscular atrophy: SMA), 척수-연수성 근 위축증(spinal-bulbar muscular atrophy: SBMA), 스타이너트(Steinert)병(근 긴장성 근 이영양증), 타루이(Tarui)병(포스포프럭토키나아제 결핍증), 톰센병(선천성 근 긴장증), 울리히 선천성 근 이영양증, 워커-워버그 증후군(선천성 근 이영양증), 웰랜더 원위 근병증 및 ZASP 관련 근병증을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시 형태에서, 상기 근 질환은 심근 질환이다. 일부 실시 형태에서, 상기 근 질환은 울혈성 심부전이다.
일부 실시 형태에서, 유용한 발현 산물은 디스트로핀(마이크로-디스트로핀 포함), 베타 1,4-n-아세틸갈락토사민 갈락토실트랜스퍼라아제(GALGT2), 카바모일 신세타아제 I, 알파-1 항트립신, 오르니틴 트랜스카바밀라아제, 아르기노석시네이트 신세타아제, 아르기노석시네이트 리아제, 아르기나아제, 푸마릴아세토아세테이트 하이드롤라아제, 페닐알라닌 하이드록실라아제, 글루코오스-6-포스파타아제, 포르포빌리노겐 데아미나아제, 시스타티온 베타-신타아제, 분지쇄 케토산 데카복실라아제, 알부민, 이소발레릴-coA 데하이드로게나아제, 프로피오닐 CoA 카복실라아제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타아제, 글루타릴 CoA 데하이드로게나아제, 인슐린, 베타-글루코시다아제, 피루베이트 카복실레이트, 간 포스포릴라아제, 포스포릴라아제 키나아제, 글리신 데카복실라아제, H-단백질, T-단백질 및 낭포성 섬유증 막 관통 조절 인자(cystic fibrosis transmembrane regulator: CFTR)를 포함한다.
또 다른 유용한 발현 산물은 효소 대체 요법에 유용한 효소를 포함하며, 이는 효소의 활성 결핍으로 인해 발생하는 다양한 병태에 유용하다. 예를 들어, 만노오스-6-포스페이트를 함유하는 효소는 리소좀 축적 질환에 대한 치료에 활용될 수 있다(예를 들어, 적합한 유전자는 β-글루쿠로니다아제(GUSB)를 인코딩하는 유전자를 포함함).
일부 실시 형태에서, 예시적인 폴리펩타이드 발현 산물은 신경 보호 폴리펩타이드 및 항혈관 형성 폴리펩타이드를 포함한다. 적합한 폴리펩타이드는 아교 세포 유래 신경 영양 인자(glial derived neurotrophic factor: GDNF), 섬유아세포 성장 인자 2(fibroblast growth factor 2: FGF-2), 뉴투린(nurturin), 섬모 신경 영양 인자(ciliary neurotrophic factor: CNTF), 신경 성장 인자(nerve growth factor: NGF; 예를 들어, 신경 성장 인자-베타), 뇌 유래 신경 영양 인자(brain derived neurotrophic factor: BDNF), 뉴로트로핀-3(neurotrophin-3: NT-3), 뉴로트로핀-4(NT-4), 뉴로트로핀-6(NT-6), 표피 성장 인자(epidermal growth factor: EGF), 색소 상피 유래 인자(pigment epithelium derived factor: PEDF), Wnt 폴리펩타이드, 가용성 Fit-1, 안지오스타틴, 엔도스타틴, VEGF, 항-VEGF 항체, 가용성 VEGFR, 인자 VIII(FVIII), 인자 IX(FIX) 및 헤지호그(hedgehog) 계열의 구성원(소닉(sonic) 헤지호그, 인디안(Indian) 헤지호그, 데저트(desert) 헤지호그 등)를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시 형태에서, 유용한 치료학적 발현 산물은 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬(growth hormone: GH), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone: PTH), 성장 호르몬 방출 인자(growth hormone releasing factor: GRF), 여포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone: FSH), 황체 형성 호르몬(luteinizing hormone: LH), 사람 융모성 고나도트로핀(human chorionic gonadotropin: hCG), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 안지오포이에틴, 안지오스타틴, 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor: GCSF), 에리트로포이에틴(erythropoietin: EPO), 결합 조직 성장 인자(connective tissue growth factor: CTGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor: bFGF), 산성 섬유아세포 성장 인자(acidic fibroblast growth factor: aFGF), 표피 성장 인자(EGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 성장 인자 I 및 II(insulin growth factor I 및 II: IGF-I 및 IGF-II), TGFa를 비롯한 형질 전환 성장 인자 알파 슈퍼패밀리, 액티빈, 인히빈 중 어느 하나, 또는 골 형성 단백질(bone morphogenic protein: BMP) BMP 1~15 중 어느 하나, 성장 인자의 헤레귤린/뉴레귤린/ARIA/neu 분화 인자(neu differentiation factor: NDF), 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 및 NT-4/5, 섬모 신경 영양 인자(CNTF), 아교 세포주 유래 신경 영양 인자(glial cell line derived neurotrophic factor: GDNF), 뉴투린(neurturin), 아그린의 계열 중 어느 하나, 세마포린/콜랩신, 네트린-1 및 네트린-2, 간 세포 성장 인자(hepatocyte growth factor: HGF), 에프린, 노긴, 소닉 헤지호그 및 타이로신 하이드록실라아제의 계열 중 어느 하나를 제한 없이 포함하는 호르몬 및 성장 및 분화 인자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 유용한 발현 산물은 사이토카인 및 림포카인, 예를 들어, 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨(IL) IL-1 내지 IL-25(IL-2, IL-4, IL-12 및 IL-18 포함), 단핵구 화학 유인 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립구-대식 세포 콜로니 자극 인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 알파 및 베타, 인터페론(알파, 베타 및 감마), 줄기 세포 인자, flk-2/flt3 리간드를 제한 없이 포함하는 면역계를 조절하는 단백질을 포함한다. 면역계에 의해 생산된 유전자 산물도 또한 본 발명에 유용하다. 이들은 면역글로불린 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 사람화 항체, 단일 쇄 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일 쇄 T 세포 수용체, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자뿐만 아니라 조작된 면역글로불린과 MHC 분자도 포함한다. 유용한 유전자 산물은 또한 막 보조 인자 단백질(membrane cofactor protein: MCP), 붕괴 가속 인자(decay accelerating factor: DAF), CR1, CF2 및 CD59와 같은 보체 조절 단백질을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 유용한 발현 산물은 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 림포카인, 조절 단백질 및 면역계 단백질에 대한 수용체 중 어느 하나를 포함한다. 유용한 이종 핵산 서열은 또한 저밀도 지질 단백질(low-density lipoprotein: LDL) 수용체, 고밀도 지질 단백질(high density lipoprotein: HDL) 수용체, 초저밀도 지질 단백질(very low density lipoprotein: VLDL) 수용체 및 스캐빈저 수용체를 비롯한 콜레스테롤 조절 및/또는 지질 조정을 위한 수용체를 포함한다. 본 발명은 또한 글루코코르티코이드 수용체 및 에스트로겐 수용체, 비타민 D 수용체 및 기타 핵 수용체를 비롯한 스테로이드 호르몬 수용체 슈퍼패밀리의 구성원과 같은 유전자 산물의 용도를 포함한다. 또한, 유용한 유전자 산물은 전사 인자, 예를 들어, jun, fos, max, mad, 혈청 반응 인자(serum response factor: SRF), AP-1, AP-2, myb, MyoD 및 미오게닌, ETS 박스 함유 단백질, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, CCAAT 박스 결합 단백질, 인터페론 조절 인자(IRF-1), 윌름스 종양 단백질, ETS 결합 단백질, STAT, GATA 박스 결합 단백질, 예를 들어, GATA-3, 및 나선형 익상 단백질(winged helix protein)의 포크헤드 계열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 유용한 발현 산물은 혈우병 B(인자 IX 포함) 및 혈우병 A(인자 VIII 및 이의 변이체, 예를 들어, 이종 이량체 및 B 결실 도메인의 경쇄 및 중쇄 포함; 미국 특허 US 6,200,560 및 미국 특허 US 6,221,349)를 비롯한 혈우병의 치료에 사용되는 것들을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 유용한 발현 산물은 포스파타아제 활성, 예를 들어, 제1형 포스파타아제 활성의 조정 인자일 수 있다. 상기 조정 인자는 포스파타아제 활성, 예를 들어, 제1형 포스파타아제 활성을 억제하는 단백질일 수 있다. 상기 조정 인자는 전사 인자와 같은 포스파타아제 활성을 억제하는 단백질을 인코딩하는 내인성 핵산의 발현을 증가시키는 핵산일 수 있다. 상기 조정 인자는 포스파타아제 활성을 억제하는 단백질을 인코딩하는 내인성 핵산에 또는 그 근처에 통합되는 조절 서열일 수 있다. 상기 조정 인자는 siRNA와 같은 유전자 발현의 핵산 조정 인자를 제공할 수 있는 핵산일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 유용한 발현 산물은 단백질 포스페이트 1(PP1)의 억제 인자, 예를 들어, I-1 폴리펩타이드일 수 있다. 포스파타아제 억제 인자-1(또는 "I-1") 단백질은 제1형 포스파타아제의 내인성 억제 인자이다. I-1 수준 또는 활성의 증가는 기능 저하된 사람 심근 세포의 β-아드레날린 반응성을 회복시킬 수 있다. 적합하게는, 상기 I-1 단백질은 트레오닌 35가 아스파르트산 대신 글루탐산으로 대체된 I-1 단백질과 같이 항시적으로 활성일 수 있다. 상기 치료학적 발현 산물은 포스파타아제 억제 인자 2(PP2), 오카다산 또는 칼리쿨린, 및 단백질 포스파타아제 1의 내인성 핵 억제 인자인 니플로부터 선택된 억제 인자 중 임의의 하나 이상일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 유용한 발현 산물은 포스파타아제 제1형 억제 인자, 예를 들어, I-1 또는 근형질 세망 Ca2+ ATPase(SERCA), 예를 들어, SERCA1(예를 들어, 1a 또는 1b), SERCA2(예를 들어, 2a 또는 2b) 또는 SERCA3과 같은 심장 활동을 조정하는 임의의 단백질일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 유용한 발현 산물은 포스파타아제 억제 인자-1 단백질의 돌연변이 형태를 인코딩하는 핵산 서열일 수 있으며, 여기서, 상기 돌연변이 형태는 야생형의 PKC-α 인산화 부위인 위치에 적어도 하나의 아미노산을 포함하고, 여기서, 상기 적어도 하나의 아미노산은 항시적으로 비인산화되어 있거나 돌연변이 형태의 비인산화 상태를 모방한다. 상기 치료학적 발현 산물은 아데닐릴 사이클라아제 6(AC6, 아데닐일 사이클라아제 VI으로도 또한 지칭됨), S100A1, β-아드레날린성 수용체 키나아제-ct(βARKct), 사르코/소포체(SR) Ca-ATPase(SERCA2a), IL-18, VEGF, VEGF 활성 인자, 유로코르틴 및 B 세포 림프종 2(Bcl2) 관련 안타노겐 3(BAG3)일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 유용한 발현 산물은 IL-18 억제 인자와 같은 사이토카인의 억제 인자일 수 있다. 상기 치료학적 발현 산물은 심장 기능을 증진시키기 위한 베타-아드레날린성 신호 전달 단백질(베타-ASP)(베타-아드레날린성 수용체(베타-Ars), G-단백질 수용체 키나아제 억제 인자(GRK 억제 인자) 및 아데닐릴 사이클라아제(Acs) 포함)일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 유용한 발현 산물은 혈관 형성 단백질일 수 있다. 상기 혈관 형성 단백질은 혈관의 발달과 분화를 촉진한다. 상기 혈관 형성 단백질의 예는 섬유아세포 성장 인자(FGF) 계열, 예를 들어, aFGF(FGF-1), bFGF(FGF-2), FGF-4("hst/KS3"으로도 또한 공지됨), FGF-5 및 FGF-6, 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF) 계열, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 계열, 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 계열 등의 구성원을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 유용한 발현 산물은 삽입, 결실 또는 아미노산 치환을 포함하는 비자연 발생 아미노산 서열을 갖는 키메라 또는 하이브리드 폴리펩타이드와 같은 비자연 발생 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 발현 산물은 야생형 디스펠린의 보다 짧은 버전인 문헌 [Llanga et al., 2017]의 표 1 및 도 1A에 상세히 설명된 바와 같은 합성 디스펠린 단백질, 예를 들어, 나노-디스펠린일 수 있다.
추가의 적합한 발현 산물은 마이크로 RNA(miRNA), 간섭 RNA, 안티센스 RNA, 리보자임 및 압타머를 포함한다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 상기 발현 산물은 단백질 포스페이트 1(PP1)의 억제 인자이다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 상기 합성 근육 특이적 발현 카세트는 유전자 편집에 유용한 유전자, 예를 들어, 메가뉴클레아제, 아연 집게 뉴클레아제(zinc finger nuclease: ZFN), 전사 활성 인자 유사 이펙터 기반 뉴클레아제(transcription activator-like effector-based nuclease: TALEN) 또는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부 시스템(CRISPR-Cas)과 같은 부위 특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 유전자를 포함한다. 적합하게는, 상기 부위 특이적 뉴클레아제는 이후에 비상동 말단 연결(non-homologous end-joining: NHEJ) 또는 상동성 의존적 복구(homology dependent repair: HDR)를 통해 복구되는 절단(전형적으로는 부위 특이적 이중 가닥 파손)을 생성함으로써 목적하는 표적 게놈 유전자좌를 편집하여 목적하는 편집을 달성하도록 적합화된다. 상기 편집은 기능 장애가 있는 유전자의 부분적 또는 완전한 복구, 또는 기능성 유전자의 녹다운 또는 녹아웃일 수 있다. 대안으로, 상기 편집은 당해 분야에 공지된 적합한 시스템을 사용하여 염기 편집 또는 프라임 편집을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 상기 합성 근육 특이적 발현 카세트는 유전자 조정에 유용한 유전자, 예를 들어, 유전자 억제 인자 또는 유전자 활성 인자와 융합된 DNA 결합 단백질, 예를 들어, 유전자 억제 인자 또는 유전자 활성 인자에 융합된 아연 집게 단백질 또는 유전자 억제 인자 또는 유전자 활성 인자에 융합된 엔도뉴클레아제 결핍 cas9를 포함한다.
적합하게는, 상기 합성 근육 특이적 발현 카세트는 리보솜 결합 부위, 개시 코돈, 정지 코돈 및 전사 종결 서열 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 제공하거나 인딩하는 서열을 포함한다. 적합하게는, 상기 발현 카세트는 전사후 조절 요소를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 적합하게는, 상기 발현 카세트는 폴리A 요소를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
벡터 및 바이러스 입자
본 발명은 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 프로모터 또는 발현 카세트를 포함하는 벡터를 추가로 제공한다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 상기 벡터는 플라스미드이다. 이러한 플라스미드는 하나 이상의 선택 마커, 하나 이상의 복제 원점, 다중 클로닝 부위 등과 같은 다양한 다른 기능적 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터이다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 상기 벡터는 진핵 세포에서의 발현을 위한 발현 벡터이다. 진핵 발현 벡터의 예는 Stratagene으로부터 입수 가능한 pW-LNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG; Amersham Pharmacia Biotech로부터 입수 가능한 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL; 및 Clontech으로부터 입수 가능한 pCMVDsRed2-express, pIRES2-DsRed2, pDsRed2-Mito, pCMV-EGFP를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 다수의 다른 벡터가 잘 공지되어 있고 상업적으로 이용 가능하다. 포유 동물 세포 아데노바이러스 벡터의 경우, pSV 및 pCMV 시리즈 벡터는 특히 잘 공지된 비제한적인 예이다. 효모 삽입 플라스미드(yeast integrative plasmid: Yip) 및 효모 복제 플라스미드(yeast replicative plasmid: Yrp)를 제한 없이 포함하는 다수의 잘 공지된 효모 발현 벡터가 있다. 식물의 경우, 아그로박테리움의 Ti 플라스미드는 예시적인 발현 벡터이고, 식물 바이러스, 예를 들어, 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus: TMV), 감자 바이러스 X 및 동부 모자이크 바이러스는 또한 적합한 발현 벡터를 제공한다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 상기 벡터는 유전자 치료 벡터이다. 다양한 유전자 치료 벡터가 당해 분야에 공지되어 있으며, AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터가 언급될 수 있다. 상기 벡터가 유전자 치료 벡터인 경우, 상기 벡터는 바람직하게는 치료학적 산물, 적합하게는 치료학적 단백질을 인코딩하는 본 발명의 합성 근육 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열을 포함한다. 상기 치료학적 단백질은 분비성 단백질일 수 있다. 분비성 단백질의 비제한적인 예는 상기에 논의되어 있으며, 예시적인 분비성 치료학적 단백질은 응고 인자, 예를 들어, 인자 VIII 또는 인자 IX, 인슐린, 에리트로포이에틴, 지질 단백질 리파아제, 항체 또는 나노바디, 성장 인자, 사이토카인, 케모카인, 혈장 인자, 독성 단백질 등을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 상기 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터와 같은 바이러스 벡터이다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 상기 벡터는 AAV 벡터이다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 상기 AAV는 근육 형질 도입에 적합한 혈청형을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 AAV는 AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 BNP116, rh10, AAV2.5, AAV2i8, AAVDJ8 및 AAV2G9, 또는 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. AAV 벡터는 바람직하게는 AAV 형질 도입(즉, 단일 가닥에서 이중 가닥 AAV로의 전환)에서 제한적인 단계 중 하나를 극복하기 위해 자가 상보적 이중 가닥 AAV 벡터(scAAV)로서 사용되지만, 단일 가닥 AAV 벡터(ssAAV)의 사용도 본 출원에 포함된다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 상기 AAV 벡터는 키메라이며, 이는 AAV2의 ITR 및 AAV5의 캡시드 단백질과 같은 적어도 2개의 AAV 혈청형의 성분을 포함함을 의미한다. AAV9는 골격근 및 심근을 특히 효과적으로 형질 도입하는 것으로 공지되어 있으므로, AAV9 및 이의 유도체는 골격근 및 심근을 표적화하는 데 특히 중요하다. AAV1, AAV6, AAV7 및 AAV8은 또한 골격근을 표적화하는 것으로 공지되어 있으므로, 이들 AAV 혈청형 및 이의 유도체도 또한 골격근을 표적화하는 데 특히 중요하다. AAV1 및 AAV8은 또한 심근을 표적화하는 것으로 공지되어 있으므로, 이들 AAV 혈청형 및 이의 유도체도 또한 심근을 표적화하는 데 특히 중요하다. 일부 실시 형태에서, 상기 rAAV 벡터는 AAV3b265D 비리온, AAV3b265D549A 비리온, AAV3b549A 비리온, AAV3bQ263Y 비리온 또는 AAV3bSASTG 비리온(즉, Q263A/T265 돌연변이를 포함하는 AAV3b 캡시드를 포함하는 비리온)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 AAV3b 혈청형이다. 일부 실시 형태에서, 상기 비리온은 합리적 반수체일 수 있거나, 키메라 또는 임의의 돌연변이체, 예를 들어, 캡시드는 목적하는 위치, 예를 들어, 심근에서 업데이트 증가를 위해 맞춤화될 수 있다. 다른 캡시드는 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, AAV10 등을 포함하는 공지된 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형으로부터의 캡시드를 포함할 수 있다.
본 발명은 상기에 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 재조합 비리온(바이러스 입자)을 추가로 제공한다.
약제학적 조성물
본 발명의 벡터 또는 비리온은 약제학적으로 허용되는 부형제, 즉, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 물질 및/또는 첨가제, 예를 들어, 완충제, 담체, 부형제, 안정화제 등과 함께 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 키트의 형태로 제공될 수 있다. AAV 벡터에 적절한 약제학적 조성물 및 전달 시스템 및 이의 방법 및 용도는 당해 분야에 공지되어 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 양태는 본 출원에 기재된 바와 같은 벡터 또는 비리온을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
치료 및 기타 방법과 용도
본 발명은 또한 질환, 바람직하게는 임의로 근육에서의 비정상적 유전자 발현과 관련된 질환(예를 들어, 유전적 근육 질환)의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 다양한 양태에 따른 합성 근육 특이적 프로모터, 발현 카세트, 벡터, 비리온 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 하나의 실시 형태에서, 본 발명은 골격근 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 다양한 양태에 따른 합성 근육 특이적 프로모터, 발현 카세트, 벡터, 비리온 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 하나의 실시 형태에서, 본 발명은 또한 심근 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 다양한 양태에 따른 합성 근육 특이적 프로모터, 발현 카세트, 벡터, 비리온 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
관련 병태, 질환 및 치료학적 발현 산물은 상기에 논의되었다.
본 발명은 또한 본 출원에 언급된 임의의 병태 또는 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 다양한 양태에 따른 합성 근육 특이적 프로모터, 발현 카세트, 벡터 또는 비리온을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 다양한 양태에 따른 합성 근육 특이적 프로모터, 발현 카세트, 벡터 또는 비리온을 포함하는 세포를 추가로 제공한다. 적합하게는, 상기 세포는 진핵 세포이다. 상기 진핵 세포는 적합하게는 진균 세포(예를 들어, 효모 세포), 동물(후생 동물) 세포(예를 들어, 포유 동물 세포) 또는 식물 세포일 수 있다. 대안으로, 상기 세포는 원핵 세포일 수 있다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 생체외, 예를 들어, 세포 배양 중에 있다. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 상기 세포는 조직 또는 다세포 유기체의 일부일 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 생체 외에 또는 생체 내에 있을 수 있는 근육 세포(근 세포)이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 생체 외에 또는 생체 내에 있을 수 있는 심근 세포이다. 대안적인 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 생체 외에 또는 생체 내에 있을 수 있는 골격근 세포이다. 상기 근육 세포는 일차 근육 세포, 또는 근육 유래 세포주, 예를 들어, 불멸화 세포주의 세포일 수 있다. 상기 세포는 근육 조직 환경 내에(예를 들어, 동물의 근육 내에) 존재할 수 있거나, 근육 조직으로부터 단리될 수 있는 데, 이는 세포 배양 중에 있을 수 있다. 적합하게는, 상기 세포는 사람 세포이다.
상기 골격근 세포는 속근 또는 지근으로부터 유래할 수 있다.
상기 심근 세포는 심실 심근 세포, 심방 심근 세포, 심장 섬유아세포 또는 심장 내피 세포(endothelial cell: EC)뿐만 아니라 혈관 주위 세포 및 심박 조율 세포로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 합성 근육 특이적 프로모터, 발현 카세트 또는 벡터는 세포의 게놈에 삽입될 수 있거나 에피솜일 수 있다(예를 들어, 에피솜 벡터에 존재함).
추가의 양태에서, 본 발명은 발현 산물을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (바람직하게는 상기에 제시된 바와 같은 벡터 내의) 본 발명에 따른 합성 근육 특이적 발현 카세트를 세포, 바람직하게는, 근육 세포에 제공하는 단계 및 상기 합성 근육 특이적 발현 카세트에 존재하는 유전자를 발현시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 적합하게는 유전자 발현을 위한 적합한 조건 하에 상기 근육 세포를 유지하는 단계를 포함한다. 배양에서, 이는 적합한 배양 조건 하에 세포 또는 세포를 포함하는 조직을 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 상기 발현은 물론 생체 내에서, 예를 들어, 대상체의 근육 내의 하나 이상의 세포에서 이루어질 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 근육 세포(들)는 심근 세포(들)이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 근육 세포(들)는 골격근 세포(들)이다.
적합하게는, 상기 방법은 합성 근육 특이적 발현 카세트를 근육 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 근육 세포를 형질 감염시키는 광범위한 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 근육 세포를 형질 감염시키는 바람직한 방법은 합성 근육 특이적 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터로 세포를 형질 감염시키는 것이다.
본 발명의 다양한 양태에 따른 합성 근육 특이적 프로모터, 발현 카세트, 벡터 또는 비리온이 유전자 치료에 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 유전자 치료에서의 이러한 핵산 작제물의 사용은 본 발명의 일부를 형성한다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 본 발명은 대상체에서 유전자 치료, 바람직하게는 치료학적 유전자의 근육 특이적 발현을 통한, 적합하게는, 치료학적 유전자의 골격근 특이적 발현 및/또는 치료학적 유전자의 심근 특이적 발현을 통한 유전자 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 발현 카세트, 벡터 또는 비리온을 제공한다. 상기 요법은 근육 세포로부터 치료학적 산물의 분비를 통한 질환, 적합하게는 상기에 논의된 질환과 같은 근육 내의 비정상적 유전자 발현과 관련된 질환의 치료를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 근육 세포에서 치료학적 이식 유전자를 발현시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 벡터를 근육 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 상기 근육 세포는 생체 내에 또는 생체 외에 있을 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 근육 세포(들)는 심근 세포(들)이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 근육 세포(들)는 골격근 세포(들)이다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체, 바람직하게는 사람의 유전자 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 치료학적 산물을 인코딩하는 유전자를 포함하는 본 발명의 합성 근육 특이적 발현 카세트, 벡터, 비리온 또는 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는(적합하게는 상기 대상체의 근육에 도입하는) 단계.
하나의 실시 형태에서, 상기 근육은 심근이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 근육은 골격근이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 근육은 심근 및/또는 골격근이다.
상기 방법은 적합하게는 상기 대상체의 근육에서 상기 유전자로부터 치료학적 양의 치료학적 산물을 발현시키는 단계를 포함한다. 치료될 수 있는 다양한 병태와 질환은 상기에 논의되어 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 근육은 심근이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 근육은 골격근이다.
적합한 치료학적 산물을 인코딩하는 유전자는 상기에 논의되어 있다.
상기 방법은 적합하게는 본 발명에 따른 벡터 또는 비리온을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 적합하게는, 상기 벡터는 바이러스 유전자 치료 벡터, 예를 들어, AAV 벡터이다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 치료학적 산물을 인코딩하는 유전자를 포함하는 합성 근육 특이적 바이러스 유전자 치료 벡터(즉, 본 출원에 기재된 근육 특이적 프로모터를 포함하는 바이러스 유전자 치료 벡터)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 바이러스 유전자 치료 벡터를 전신 투여하는 단계를 포함한다. 전신 투여는 장관내(예를 들어, 경구, 설하, 직장) 또는 비경구(예를 들어, 주사)일 수 있다. 바람직한 주사 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 동맥내, 관절내, 경막내 및 진피내 주사를 포함한다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 상기 바이러스 유전자 치료 벡터는 전행성 심외막 관상 동맥 주입(AECAI)에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 바이러스 유전자 치료 벡터는 경피 대퇴부 접근을 통해 전행성 심외막 관상 동맥 주입(AECAI)에 의해 상기 대상체에게 투여된다.
일부 실시 형태에서, 상기 대상체는 심부전을 앓고 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 대상체의 유전자 치료 방법은 심부전의 치료를 위한 것이다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 전행성 심외막 관상 동맥 주입(AECAI)을 통해 심부전의 치료를 위한 합성 근육 특이적 바이러스 유전자 치료 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 벡터는 치료학적 산물을 인코딩하는 유전자를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 바이러스 유전자 치료 벡터는 하나 이상의 추가의 치료제 또는 세망 내피계에 의한 벡터의 청소를 방지하도록 디자인된 하나 이상의 포화제와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
상기 벡터가 AAV 벡터인 경우, 벡터의 투약량은 1×1010 gc/kg 내지 1×1015 gc/kg 또는 그 이상, 적합하게는 1×1012 gc/kg 내지 1×1014 gc/kg, 적합하게는 5×1012 gc/kg 내지 5×1013 gc/kg일 수 있다.
일반적으로, 이를 필요로 하는 대상체는 포유 동물, 바람직하게는 영장류, 보다 바람직하게는 사람일 것이다. 전형적으로, 이를 필요로 하는 대상체는 질환에 특징적인 증상을 나타낼 것이다. 상기 방법은 일반적으로 치료학적 양의 치료학적 산물을 발현함으로써 이를 필요로 하는 대상체에 의해 나타나는 증상을 개선시키는 단계를 포함한다.
시험관내 및 생체내 표적 세포에서의 치료학적 유전자 발현을 위한 유전자 치료 프로토콜은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 여기서는 상세히 논의되지 않을 것이다. 간단히 말하면, 이들은 (네이키드 또는 리포솜 내의) 플라스미드 DNA 벡터 또는 바이러스 벡터의 근육내 주사, 간질 주사, 기도내 점적 주입, 내피, 간내 실질에 대한 적용, 정맥내 또는 동맥내(예를 들어, 간 동맥내, 간 정맥내) 투여를 포함한다. 표적 세포에 대한 DNA의 이용 가능성을 증진시키기 위한 다양한 디바이스가 개발되었다. 간단한 접근법은 관련 벡터를 포함하는 카테터 또는 이식 가능한 물질과 표적 세포를 물리적으로 접촉시키는 것이지만, 보다 복잡한 접근법은 제트 주사 디바이스 등을 사용할 수 있다. 포유 동물 근육 세포로의 유전자 전달은 생체외 및 생체내 절차 모두를 사용하여 수행되었다. 생체외 접근법은 전형적으로 근육 세포의 수확, 적합한 발현 벡터에 의한 시험관내 형질 도입, 이어서 형질 도입된 근세포의 근육으로의 재도입을 필요로 한다. 생체내 유전자 전달은 DNA 또는 바이러스 벡터를 근육에 주사함으로써 달성되었다. 전행성 심외막 관상 동맥 주입은 심장에 매우 근접하게 DNA 또는 바이러스 벡터를 주사하는 데 사용될 수 있다.
일부 바람직한 실시 형태에 따르면, 상기에 제시된 방법은 상기에 논의된 바와 같은 근육 관련 질환, 예를 들어, 근 이영양증 또는 울혈성 심부전을 갖는 대상체의 치료에 사용될 수 있다.
정의 및 일반 사항
본 발명의 다양한 실시 형태의 제조 및 사용은 하기에 상세히 논의되지만, 본 발명이 매우 다양한 구체적인 맥락에서 구체화될 수 있는 다수의 적용 가능한 독창적인 개념을 제공하고 있음을 인식해야 할 것이다. 본 출원에 논의된 구체적인 실시 형태는 본 발명을 제조하고 사용하는 구체적인 방식을 예시하는 것일 뿐이지 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 출원에서의 본 발명의 배경 기술에 대한 논의는 본 발명의 맥락을 설명하기 위해 포함된다. 이는 임의의 언급된 자료가 임의의 청구항의 우선 일자로 임의의 국가에서 반포되거나 공지되거나 일반 상식의 일부임을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
본 개시 내용 전체에 걸쳐, 다양한 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서는 식별 인용으로 참조된다. 본 명세서에서 인용된 모든 문서는 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다. 특히, 본 출원에 구체적으로 언급된 이러한 문서의 교시 내용 또는 섹션은 참조로 포함된다.
본 발명의 실시는, 달리 명시되지 않는다면, 당해 분야의 기술 내에 속하는, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자 이식 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상의 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA]; [Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press]; [Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., 1984]; 미국 특허 US 4,683,195; [Nucleic Acid Hybridization, Harries and Higgins eds., 1984]; [Transcription and Translation, Hames and Higgins eds. 1984]; [Culture of Animal Cells, Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987]; [Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986]; [Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)]; 시리즈, [Methods in Enzymology (Abelson and Simon, eds. -in-chief, Academic Press, Inc., New York, 특히 Vols. 154 및 155 (Wu et al. eds.) 및 Vol. 185, "Gene Expression Technology" (Goeddel, ed.)]; [Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, Miller and Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory]; [Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987]; [Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV, Weir and Blackwell, eds., 1986]; 및 [Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986]을 참조한다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어가 하기에 정의되거나 설명된다. 본 출원에 사용되는 용어는 본 발명과 관련된 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. "한", "하나" 및 "상기"와 같은 용어는 단지 하나의 엔터티(entity)만을 지칭하는 것이 아니라, 구체적인 예가 예시를 위해 사용될 수 있는 일반적인 클래스를 포함한다. 본 출원의 용어는 본 발명의 구체적인 실시 형태를 기재하기 위해 사용되지만, 이의 사용은 청구범위에 개략적으로 서술된 것을 제외하고는 본 발명을 한정하지 않는다.
"근육"이라는 용어는 통상의 기술자에 의해 잘 이해된다. 바람직하게는, 상기 근육은 골격근(횡격막 포함) 또는 심근이다. 본 발명의 프로모터는 골격근 및/또는 심근에서 활성일 수 있다. 바람직하게는, 상기 근육은 척추 동물, 보다 바람직하게는 포유 동물, 보다 더 바람직하게는 사람 대상체의 근육이다. 바람직하게는, 상기 근육은 가로무늬근이다.
"근육 세포" 또는 "근 세포"라는 용어는 본 맥락에서 근육(근육 조직)에서 발견되거나 근육 조직으로부터 유래되는 세포에 관한 것이다. 근육 세포는 일차 세포 또는 세포주(예를 들어, C2C12 또는 H2K 세포(골격근 세포주) 또는 H9C2 세포(심장 세포주))일 수 있다. 상기 근육 세포는 생체 내에서(예를 들어, 근육 조직에서) 또는 시험관 내에서(예를 들어, 세포 배양물에서) 있을 수 있다. 근육 조직에서 발견되는 근세포는 전형적으로 근육 형성으로 공지된 과정에서 근모세포로부터 발달하여 근육을 형성하는 긴 관상 세포이다. 본 출원에 사용되는 근육 세포 또는 근세포라는 용어는 골격근 및 심근(심근 세포)으로부터의 근세포를 포함한다. 본 발명의 프로모터는 골격근 세포 및/또는 심근 세포에서 활성일 수 있다.
"시스-조절 요소" 또는 "CRE"라는 용어는 통상의 기술자에게 잘 공지된 용어이며, 이웃하는 유전자(즉, 인 시스(in cis))의 전사를 조절 또는 조정할 수 있는 인핸서, 프로모터, 절연자 또는 사일런서와 같은 핵산 서열을 의미한다. CRE는 자신이 조절하는 유전자의 부근에서 발견된다. CRE는 전형적으로 TF에 결합하여 유전자 전사를 조절하며, 즉, TFBS를 포함한다. 단일 TF는 다수의 CRE에 결합하여 다수의 유전자의 발현(다면 발현(pleiotropy))을 제어할 수 있다. CRE는 일반적으로 자신이 조절하는 유전자의 전사 개시 부위(transcription start site: TSS)의 업스트림에 위치하지만, 항상 그런 것은 아니다. 본 맥락에서의 "인핸서"는 자신이 작동 가능하게 결합되어 있는 유전자의 전사를 증진시키는(즉, 상향 조절하는) CRE이며, 자신이 조절하는 유전자의 업스트림, 다운스트림 및 심지어 인트론 내에서도 발견될 수 있다. 다중 인핸서는 하나의 유전자의 전사를 조절하도록 협조 방식으로 작용할 수 있다. 본 맥락에서의 "사일런서"는 유전자의 전사를 방지하거나 하향 조절하는 역할을 하는 억제자(repressor)라고 호칭되는 TF에 결합하는 CRE에 관한 것이다. "사일런서"라는 용어는 또한 mRNA 분자의 번역을 억제하는 단백질에 결합하는 메신저 RNA의 3' 비번역된 영역 중의 영역을 지칭할 수 있지만, 이러한 사용은 CRE를 기술하는 데 있어서 이의 사용과는 구별된다. 일반적으로, 본 발명의 CRE는 근육 특이적 또는 골격근 특이적 인핸서 요소(근육 특이적 또는 골격근 특이적 CRE, 또는 근육 특이적 또는 골격근 특이적 CRE 인핸서 등으로도 종종 지칭됨)이다. 본 맥락에서, 상기 CRE는 전사 개시 부위(TSS)로부터 2500개 이하의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 TSS로부터 2000개 이하의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 TSS로부터 1500개 이하의 뉴클레오타이드, 적합하게는 TSS로부터 1000, 750, 500, 250, 200, 150 또는 100개 이하의 뉴클레오타이드에 위치하는 것이 바람직하다. 본 발명의 CRE는 바람직하게는 비교적 짧은 길이, 바람직하게는 250개 이하의 뉴클레오타이드 길이이며, 예를 들어, 200, 175, 150, 90, 80, 70, 60 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 본 발명의 CRE는 전형적으로 최소 프로모터 또는 근위 프로모터일 수 있는 작동 가능하게 연결된 프로모터 요소와 조합하여 제공되며; 본 발명의 CRE는 프로모터 요소의 근육 특이적 또는 골격근 특이적 활성을 증진시킨다. 본 출원에 개시된 CRE의 조합 중 임의의 것 또는 이의 기능적 변이체에서, 언급된 CRE와 프로모터 요소의 일부 또는 전부는 적절하게 프로모터에서 서로 인접하여 위치할 수 있다(즉, 임의의 개재 CRE 또는 기타 조절 요소 없음). 상기 CRE는 연속하거나 비연속할 수 있다(즉, 이들은 서로 바로 인접하여 위치할 수 있거나 스페이서 또는 다른 서열에 의해 분리될 수 있음). 상기 CRE는 임의의 순서일 수 있다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 상기 CRE 또는 이의 기능적 변이체는 언급된 순서로 제공되며 서로 인접해 있다. 예를 들어, 상기 합성 근육 특이적 조절 핵산은 CRE0075의 바로 업스트림에 CRE0077 등을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 CRE의 일부 또는 전부는 연속한 것이 바람직하다.
"시스-조절 모듈" 또는 "CRM"이라는 용어는 일반적으로 2개 이상의 CRE를 포함하는 기능적 조절 핵산 모듈을 의미하며; 본 발명에서, CRE는 전형적으로 근육 특이적 또는 골격근 특이적 인핸서이므로, CRM은 합성 근육 특이적 또는 골격근 특이적 조절 핵산이다. 따라서, 본 출원에서, CRM은 전형적으로 복수의 근육 특이적 또는 골격근 특이적 CRE를 포함한다. 전형적으로, CRM 내의 다중 CRE는 CRM을 포함하는 합성 프로모터가 작동 가능하게 결합되어 있는 유전자의 전사를 증진시키기 위해 함께 (예를 들어, 상가적으로 또는 상승적으로) 작용한다. CRM 내에서 CRE의 셔플링(즉, 재정렬), 역전(즉, 역배향), 및 간격 변경의 상당한 범위가 존재한다. 따라서, 본 발명의 CRM의 기능적 변이체는 특히 참조된 CRM의 변이체를 포함하며, 여기서, 이들 내의 CRE는 셔플링되고/되거나 역전되고/되었거나, CRE 사이의 간격은 변경되었다.
본 출원에 사용되는 "프로모터"라는 문구는 일반적으로 전사가 일어나기 위해 필요한, 즉, 전사를 개시하는, 전사되는 핵산 서열의 업스트림에 위치하는 DNA의 영역을 지칭한다. 프로모터는 자신의 제어 하에 코딩 서열 전사의 적절한 활성화 또는 억제를 허용한다. 프로모터는 전형적으로 복수의 TF에 의해 인식되고 결합되는 특정 서열을 포함한다. TF는 프로모터 서열에 결합하여 유전자의 코딩 영역으로부터 RNA를 합성하는 효소인 RNA 폴리머라아제의 모집을 초래한다. 다수의 다양한 프로모터가 당해 분야에 공지되어 있다.
일부 경우에서, "프로모터" 또는 "복합 프로모터"라는 용어는 프로모터와 추가의 조절 요소, 예를 들어, 전사 개시 부위(TSS)의 바로 다운스트림에 위치한 조절 서열, 예를 들어, 5' UTR 및/또는 5' UTR 및 인트론의 조합을 지칭하기 위해 본 출원에서 사용된다. TSS의 다운스트림의 이러한 서열은 전사 및/또는 번역 단계에서 발현의 조절에 기여할 수 있다.
본 출원에 사용되는 "합성 프로모터"라는 용어는 자연에서 발생하지 않는 프로모터에 관한 것이다. 본 맥락에서, 이는 전형적으로 최소(또는 코어) 프로모터 또는 근육 특이적 또는 골격근 특이적 근위 프로모터(프로모터 요소)에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 CRE 및/또는 CRM을 포함한다. 본 발명의 CRE 및/또는 CRM은 합성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자의 근육 특이적 또는 골격근 특이적 전사를 증진시키는 역할을 한다. 합성 프로모터의 일부(예를 들어, 최소 프로모터 또는 프로모터 내의 하나 이상의 CRE)는 자연적으로 발생될 수 있지만, 엔터티로서의 합성 프로모터는 자연적으로 발생하지 않는다.
본 출원에 사용되는 "최소 프로모터"("코어 프로모터"로도 또한 공지됨)는 그 자체로는 불활성이거나 대부분 불활성이지만 다른 전사 조절 요소와 조합될 때 전사를 매개할 수 있는 전형적인 짧은 DNA 분절을 지칭한다. 최소 프로모터 서열은 원핵 생물 및 진핵 생물 유전자를 비롯한 다양한 상이한 공급원으부터 유래될 수 있다. 최소 프로모터의 예는 상기에 논의되어 있으며, 데스민 최소 프로모터(desmin minimum promoter), 도파민 베타-하이드롤라아제 유전자 최소 프로모터(dopamine beta-hydroxylase gene minimum promoter), 사이토메갈로바이러스 급초기 유전자 최소 프로모터(cytomegalovirus (CMV) immediate early gene minimum promoter (CMV-MP)) 및 헤르페스 티미딘 키나아제 최소 프로모터(herpes thymidine kinase minimal promoter (MinTK))를 포함한다. 최소 프로모터는 전형적으로 전사 개시 부위(TSS) 및 바로 업스트림의 요소, RNA 폴리머라아제 II에 대한 결합 부위 및 일반 전사 인자 결합 부위(종종 TATA 박스)를 포함한다. 최소 프로모터는 또한 TSS의 다운스트림에 일부 요소를 포함할 수 있지만, 이들은 전형적으로 추가의 조절 요소가 없으면 기능이 거의 없다.
본 출원에 사용되는 "근위 프로모터"는 최소 프로모터 및 적어도 일부 추가의 조절 서열, 전형적으로는 일차 조절 요소를 함유하는 경향이 있는 유전자의 업스트림의 근위 서열에 관한 것이다. 이는 종종 TSS의 업스트림에 약 250개의 염기 쌍을 확장시키며, 특정 TFBS를 포함한다. 근위 프로모터는 또한 TSS의 다운스트림에 하나 이상의 조절 요소, 예를 들어, UTR 또는 인트론을 포함할 수 있다. 본 경우에서, 상기 근위 프로모터는 적합하게는 본 발명의 하나 이상의 CRE 또는 CRM과 조합될 수 있는 자연 발생 근육 특이적 또는 골격근 특이적 근위 프로모터일 수 있다. 그러나, 상기 근위 프로모터는 합성일 수 있다.
본 출원에 사용되는 "프로모터 요소"는 상기에 정의된 바와 같은 최소 프로모터 또는 근위 프로모터를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 프로모터 요소는 본 발명의 합성 근육 특이적 또는 골격근 특이적 프로모터를 제공하기 위해 전형적으로 하나 이상의 CRE와 조합된다.
본 발명의 맥락에서의 CRE, CRM, 프로모터 요소, 합성 프로모터 또는 다른 조절 핵산의 "기능적 변이체"는 참조 서열과 동일한 방식으로, 예를 들어, 근육 특이적 또는 골격근 특이적 CRE, 근육 특이적 또는 골격근 특이적 CRM 또는 근육 특이적 또는 골격근 특이적 프로모터로서 기능하는 능력을 보유하는 참조 서열의 변이체이다. 이러한 기능적 변이체에 대한 대체 용어는 "생물학적 등가물" 또는 "등가물"을 포함한다.
근육 특이적 또는 골격근 특이적 인핸서로서 기능하는 주어진 CRE, CRM, 프로모터 또는 다른 조절 서열의 능력이 참조 서열에 결합하는 동일한 근육 특이적, 심근 특이적 또는 골격근 특이적 TF에 결합하는 서열의 능력에 의해 유의하게 결정됨은 인식될 것이다. 따라서, 대부분의 경우에서, CRE 또는 CRM의 기능적 변이체는 참조 CRE, CRM 또는 프로모터와 동일한 TF의 대부분 또는 전부에 대한 TFBS를 포함한다. 기능적 변이체의 TFBS는 참조 CRE, CRM 또는 프로모터와 동일한 상대 위치(즉, 순서 및 일반 위치)에 있는 것이 바람직하지만 필수적이지는 않다. 기능적 변이체의 TFBS는 참조 서열과 동일한 배향으로 있는 것이 또한 바람직하지만 필수적이지는 않다(일부 경우에는 TFBS가 참조 서열의 서열과 비교하여 역배향으로, 예를 들어, 역상보체로서 존재할 수 있음에 유의할 것이다). 기능적 변이체의 TFBS는 참조 서열과 동일한 가닥 상에 있는 것이 또한 바람직하지만 필수적이지는 않다. 따라서, 바람직한 실시 형태에서, 기능적 변이체는 참조 서열과 동일한 TF에 대한 TFBS를 동일한 순서로, 동일한 위치에서, 동일한 배향으로 및 동일한 가닥 상에 포함한다. TFBS 사이에 있는 서열(일부 경우에는 스페이서 서열 등으로 지칭됨)은 CRE 또는 CRM의 기능에 덜 중요하다는 것도 또한 인식될 것이다. 이러한 서열은 전형적으로 상당히 다양할 수 있으며, 이의 길이는 변경될 수 있다. 그러나, 바람직한 실시 형태에서, 간격(즉, 인접한 TFBS 사이의 거리)은 참조 서열에 있는 바와 같이 기능적 변이체에서 실질적으로 동일하다(예를 들어, 이는 20% 초과까지, 바람직하게는 10% 초과까지 달라지지 않으며, 보다 바람직하게는 대략 동일함). 일부 경우에는 CRE의 기능적 변이체가 역배향으로 존재할 수 있음은 명백할 것이며, 예를 들어, 이는 상기에 기재된 바와 같은 CRE의 역상보체 또는 이의 변이체일 수 있다.
기능적 변이체와 참조 서열 사이의 서열 동일성의 수준은 또한 보유된 기능성에 대한 지표일 수 있다. CRE, CRM 또는 프로모터의 TFBS에서의 높은 수준의 서열 동일성은 스페이서 서열의 서열 동일성(임의의 서열 보존에 대한 요구 사항이 거의 없거나 전혀 없는 경우)보다 일반적으로 더 중요하다. 그러나, 기능적 TFBS의 서열이 공통 서열(consensus sequence)과 정확히 일치할 필요가 없다는 점을 고려해 볼 때, 상당한 정도의 서열 변이가 TFBS 내에서도 수용될 수 있음은 이해될 것이다.
주어진 기능적 변이체에서의 TFBS에 결합하는 하나 이상의 TF의 능력은 전기 이동성 이동 어세이(electromobility shift assay: EMSA), 결합 어세이, 염색질 면역 침강(chromatin immunoprecipitation: ChIP) 및 ChIP 서열 분석(ChIP-seq)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 당해 분야에 공지된 임의의 관련 수단에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 주어진 기능적 변이체에 결합하는 하나 이상의 TF의 능력은 EMSA에 의해 결정된다. EMSA를 수행하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 적합한 접근법은 상기에 인용된 문헌 [Sambrook et al.]에 기재되어 있다. 이러한 절차를 기술하는 다수의 관련 논문은, 예를 들어, 문헌 [Hellman and Fried, Nat Protoc. 2007; 2(8): 1849-1861]에서 이용 가능하다.
"근육 특이적" 또는 "근육 특이적 발현"은 다른 조직(예를 들어, 간, 신장, 비장, 심장, 폐 및 뇌)과 비교하여 우선적이거나 우세한 방식으로 근육 세포(또는 근육 유래 세포)에서 유전자의 발현을 증진시키거나 유도하는 시스-조절 요소, 시스-조절 모듈 또는 프로모터의 능력을 지칭한다. 유전자의 발현은 mRNA 또는 단백질의 형태일 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 근육 특이적 발현은 다른(즉, 비근육) 조직 또는 세포에서 무시해도 될 정도의 발현이며, 즉, 발현은 매우 근육 특이적이다. 예를 들어, 다른 세포와는 대조적으로 근육 세포에서의 발현은 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. "심근 특이적" 또는 "심근 특이적 발현"은 다른 조직(예를 들어, 비장, 간, 폐 및 뇌) 및 골격근 조직과 비교하여 우선적이거나 우세한 방식으로 심근에서 유전자의 발현을 증진시키거나 유도하는 시스-조절 요소, 시스-조절 모듈, 프로모터 요소 또는 프로모터의 능력을 지칭한다. "골격근 특이적" 또는 "골격근 특이적 발현"은 다른 조직(예를 들어, 비장, 간, 폐 및 뇌) 및 심근 조직과 비교하여 우선적이거나 우세한 방식으로 골격근에서 유전자의 발현을 증진시키거나 유도하는 시스-조절 요소, 시스-조절 모듈, 프로모터 요소 또는 프로모터의 능력을 지칭한다. 보다 낮은 정도의 특이성이 바람직한 경우가 있고,이는 본 발명의 일부이다.
근육 특이적, 심근 특이적 또는 골격근 특이적 CRE, CRM 또는 프로모터로서 기능하는 CRE, CRM 또는 프로모터의 능력은 통상의 기술자에 의해 용이하게 평가될 수 있다. 따라서, 통상의 기술자는 상기에 언급된 특정 CRE, CRM 또는 프로모터의 임의의 변이체가 기능적으로 남아 있는지(즉, 상기에 정의된 바와 같은 기능적 변이체인지) 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 평가되는 임의의 주어진 CRM을 최소 프로모터(예를 들어, CMV-MP의 업스트림에 위치함)에 작동 가능하게 연결시킬 수 있으며, 유전자(전형적으로는 리포터 유전자)의 근육 특이적, 심근 특이적 또는 골격근 특이적 발현을 유도하는 시스-조절 요소의 능력을 측정한다. 대안으로, CRE 또는 CRM의 변이체를 참조 CRE 또는 CRM 대신에 합성 근육 특이적, 심근 특이적 또는 골격근 특이적 프로모터에 대체시킬 수 있으며, 상기 변형된 프로모터에 의해 유도된 근육 특이적, 심근 특이적 또는 골격근 특이적 발현에 대한 효과를 결정하고 비변형된 형태와 비교할 수 있다. 유사하게, 근육 특이적, 심근 특이적 또는 골격근 특이적 발현을 유도하는 프로모터의 능력은 통상의 기술자에 의해 용이하게 평가될 수 있다(예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같음). 참조 프로모터의 변이체에 의해 유도되는 유전자의 발현 수준은 참조 프로모터에 의해 유도되는 발현 수준과 비교될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변이체 프로모터에 의해 유도되는 근육 특이적 또는 골격근 특이적 발현 수준은 참조 프로모터에 의해 유도된 발현 수준의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%인 경우, 상기 변이체는 기능을 보유한다고 말할 수 있다. 근육 특이적, 심근 특이적 또는 골격근 특이적 발현 증진을 평가하기 위한 적합한 핵산 작제물 및 리포터 어세이는 용이하게 작제될 수 있으며, 하기에 제시된 실시예는 적합한 방법론을 제공한다.
유전자(예를 들어, 치료학적 유전자 또는 리포터 유전자)의 발현이 근육 유래 세포 또는 골격근에서 우선적으로 또는 우세하게 일어나는 근육 특이성, 심근 특이성 또는 골격근 특이성을 식별할 수 있다. 예를 들어, 발현의 수준이 다른 유형의 세포(즉, 비근육 유래 세포, 비심근 특이적 또는 비골격근 유래 세포)보다 근육 유래, 심근 특이적 또는 골격근 유래 세포에서 유의하게 더 높은 경우, 우선적이거나 우세한 발현을 정의할 수 있다. 예를 들어, 근육 유래, 심근 특이적 또는 골격근 유래 세포에서의 발현은 적합하게는 비근육 세포, 비심근 특이적 또는 비골격근 세포에서의 발현보다 적어도 5배 더 높고, 바람직하게는 비근육 세포 또는 비골격근 세포에서의 발현보다 적어도 10배 더 높으며, 일부 경우에서 50배 이상 더 높을 수 있다. 편의상, 근육 특이적 발현은 적합하게는 간 유래 세포주(예를 들어, Huh7 또는 HepG2), 신장 유래 세포주(예를 들어, HEK-293), 자궁 경부 조직 유래 세포주(예를 들어, HeLa) 및/또는 폐 유래 세포주(예를 들어, A549)에서의 발현 수준과 비교하여 근육 세포주(예를 들어, C2C12 또는 H2K 세포(골격근) 또는 H9C2 세포(심장)와 같은 근육 유래 세포주)에서의 발현 수준의 비교를 통해 입증될 수 있다. 심근 특이적 발현은 적합하게는 간 유래 세포주(예를 들어, Huh7 또는 HepG2), 신장 유래 세포주(예를 들어, HEK-293), 자궁 경부 조직 유래 세포주(예를 들어, HeLa), 폐 유래 세포주(예를 들어, A549) 및/또는 골격근 유래 세포(예를 들어, C2C12 또는 H2K)에서의 발현 수준과 비교하여 심근 세포주(예를 들어, H9C2와 같은 심근 유래 세포주) 또는 일차 심근 세포에서의 발현 수준의 비교를 통해 입증될 수 있다. 골격근 특이적 발현은 적합하게는 간 유래 세포주(예를 들어, Huh7 또는 HepG2), 신장 유래 세포주(예를 들어, HEK-293), 자궁 경부 조직 유래 세포주(예를 들어, HeLa), 폐 유래 세포주(예를 들어, A549) 및/또는 심근 세포주(예를 들어, H9C2)에서의 발현 수준과 비교하여 골격근 유래 세포(예를 들어, C2C12 또는 H2K) 또는 일차 골격근 세포에서의 발현 수준의 비교를 통해 입증될 수 있다.
본 발명의 합성 근육 특이적, 심근 특이적 또는 골격근 특이적 프로모터는 바람직하게는 CMV-IE와 같은 비조직 특이적 프로모터와 비교할 때 비근육 유래 세포, 적합하게는 Huh7, HEK-293, HeLa 및/또는 A549 세포에서 감소된 발현을 나타낸다. 본 발명의 합성 근육 특이적, 심근 특이적 또는 골격근 특이적 프로모터는 바람직하게는 비근육 유래 세포(적합하게는 Huh7, HEK-293, HeLa 및/또는 A549 세포)에서 CMV-IE 프로모터보다 50% 이하, 적합하게는 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하의 활성을 갖는다. 일반적으로, 비근육 유래 세포에서 발현을 최소화하는 것이 바람직하지만, 일부 경우에는 이것이 필요하지 않을 수 있다. 본 발명의 합성 프로모터가, 예를 들어, 1 또는 2개의 비근육 세포에서 보다 높은 발현을 갖는다고 할지라도, 일반적으로 비근육 세포에 비해 다양한 근육 세포에서 전체적으로 보다 높은 발현을 갖는 한, 이는 여전히 근육 특이적 프로모터일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 근육 특이적 프로모터는 비근육 세포와 비교하여 근육 세포에서 유전자를 적어도 25% 또는 적어도 35% 또는 적어도 45% 또는 적어도 55% 또는 적어도 65% 또는 적어도 75% 또는 적어도 80% 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95%, 또는 25%~95%의 임의의 정수로 발현한다.
본 발명의 합성 근육 특이적 프로모터는 바람직하게는, 예를 들어, 이식 유전자, 바람직하게는 치료학적 이식 유전자의 근육 특이적 발현을 유도하는 대상체의 근육에서 발현을 촉진하는 데 적합하다. 본 발명의 합성 골격근 특이적 프로모터는 바람직하게는, 예를 들어, 이식 유전자, 바람직하게는 치료학적 이식 유전자의 골격근 특이적 발현을 유도하는 대상체의 골격근에서 발현을 촉진하는 데 적합하다. 본 발명의 바람직한 합성 근육 특이적 프로모터는 근육 특이적 이식 유전자 발현을 촉진하는 데 적합하며, CBA 프로모터의 활성의 적어도 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350% 또는 400%인 근육 세포에서의 활성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 합성 근육 특이적 프로모터는 CBA 프로모터 활성의 적어도 100%, 바람직하게는 CBA 또는 SPc5-12 프로모터 활성의 150%, 200%, 300% 또는 500%의 수준으로 근육 특이적 이식 유전자 발현을 촉진하는 데 적합하다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 합성 골격근 특이적 프로모터는 Tnnt2 또는 Myl2 프로모터 활성의 적어도 100%, 바람직하게는 SPc5-12 프로모터 활성의 150%, 200%, 300% 또는 500%의 수준으로 골격근 특이적 이식 유전자 발현을 촉진하는 데 적합하다. 이러한 근육 특이적 발현은 근육 유래 세포, 예를 들어, C2C12 또는 H2K 세포(골격근) 또는 H9C2 세포(심장) 또는 일차 근육 세포(적절하게는 일차 사람 근세포)에서 적절하게 결정된다.
본 발명의 합성 근육 특이적, 심근 특이적 또는 골격근 특이적 프로모터는 또한 근육 유래 세포(예를 들어, C2C12 또는 H2K 세포(골격근) 또는 H9C2 세포(심장))에서 CMV-IE와 비교하여 유전자의 근육 특이적 또는 골격근 특이적 발현을 적어도 50%, 100%, 150% 또는 200%의 수준으로 촉진할 수 있다.
본 출원에 사용되는 "핵산"이라는 용어는 전형적으로는 뉴클레오타이드로 필수적으로 구성된 임의 길이의 올리고머 또는 중합체(바람직하게는 선형 중합체)를 지칭한다. 뉴클레오타이드 단위는 일반적으로 헤테로사이클릭 염기, 당 기, 및 변형 또는 치환된 포스페이트 기를 비롯한 적어도 하나, 예를 들어, 1, 2 또는 3개의 포스페이트 기를 포함한다. 헤테로사이클릭 염기는 특히, 자연 발생 핵산, 기타 자연 발생 염기(예를 들어, 크산틴, 이노신, 하이포크산틴)뿐만 아니라 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된(예를 들어, 메틸화된) 비천연 또는 유도체화된 염기에 널리 퍼져 있는 퓨린 및 피리미딘 염기, 예를 들어, 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)을 포함할 수 있다. 당 기는 특히 오탄당(펜토푸라노오스) 기, 예를 들어, 바람직하게는 자연 발생 핵산에서 흔한 리보오스 및/또는 2-데옥시리보오스, 또는 아라비노오스, 2-데옥시아라비노오스, 3탄당 또는 6탄당 당 기뿐만 아니라 변형 또는 치환된 당 기를 포함할 수 있다. 본 출원에서 의도되는 핵산은 자연 발생 뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 변형된 헤테로사이클릭 염기, 변형된 당 모이어티(moiety), 변형된 포스페이트 기 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 포스페이트 기 또는 당의 변형이 안정성, 효소 분해에 대한 저항성 또는 일부 기타 유용한 특성을 개선시키기 위해 도입될 수 있다. "핵산"이라는 용어는 추가로 바람직하게는 DNA, RNA 및 DNA RNA 하이브리드 분자를 포함하며, 구체적으로는 hnRNA, pre-mRNA, mRNA, cDNA, 게놈 DNA, 증폭 산물, 올리고뉴클레오타이드, 및 합성(예를 들어, 화학적으로 합성된) DNA, RNA 또는 DNA RNA 하이브리드를 포함한다. 핵산은 자연 발생적일 수 있고, 예를 들어, 자연에 존재하거나 이로부터 단리될 수 있으며; 또는 비자연적 발생적, 예를 들어, 재조합적일 수 있고, 즉, 재조합 DNA 기술에 의해 생산되고/되거나 부분적으로 또는 전체적으로, 화학적으로 또는 생화학적으로 합성될 수 있다. "핵산"은 이중 가닥, 부분 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥인 경우, 핵산은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 또한, 핵산은 원형 또는 선형일 수 있다.
"단리된"이란, 핵산을 언급할 때, 자연에서 이와 일반적으로 연관된 서열, 또는 자연에 존재하지만 이와 연관된 이종 서열을 갖는 서열, 또는 염색체로부터 분리된 분자가 전체적으로 또는 부분적으로 없는 핵산 분자를 의미한다.
"동일성" 및 "동일한" 등의 용어는 2개의 중합체 분자 사이, 예를 들어, 2개의 핵산 분자 사이, 예를 들어, 2개의 DNA 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 서열 정렬 및 서열 동일성 결정은, 예를 들어, 문헌 [Altschul et al. 1990, J Mol Biol 215: 403-10]에 의해 최초로 기술된 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool), 예를 들어, 문헌 [Tatusova and Madden 1999, FEMS Microbiol Lett 174: 247-250]에 의해 기술된 "Blast 2 서열" 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 다양한 프로그램과 정렬 알고리즘은, 예를 들어, 문헌 [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]; [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]; [Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444]; [Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44]; [Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3]; [Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90]; [Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65]; [Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31]; [Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50]에 기술되어 있다. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 대한 자세한 고려 사항은, 예를 들어, 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]에서 발견될 수 있다.
여러 서열 분석 프로그램과 연계하여 사용하기 위한 미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI) BLASTTM(문헌 [Altschul et al.(1990)])는 미국 국립 생물 정보 센터(Bethesda, MD)를 비롯한 여러 출처와 인터넷 상에서 이용 가능하다. 이러한 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법에 대한 설명은 BLASTTM에 대한 "도움말" 섹션 하에 인터넷 상에서 이용 가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, 디폴트 파라미터를 사용하여 BLASTTM(Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능을 이용할 수 있다. 참조 서열과 훨씬 더 큰 유사성을 갖는 핵산 서열은 이러한 방법에 의해 평가될 때 증가하는 퍼센트 동일성을 나타낼 것이다. 전형적으로, 퍼센트 서열 동일성은 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산된다.
예를 들어, 전역 최적 정렬은 다음 점수 파라미터를 사용하여 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘에 의해 적절하게 발견된다: 일치 점수: +2, 불일치 점수: -3; 갭 페널티: 갭 개방 5, 갭 확장 2. 생성된 최적의 전역 정렬의 퍼센트 동일성은 전체 정렬 길이에 대한 정렬된 염기 수의 비율에 100을 곱하여 적절하게 계산되며, 여기서, 상기 정렬 길이는 일치 및 불일치 모두를 포함한다.
"혼성화하는"이라는 용어는 혼성화 과정에서 적어도 부분적으로 상보적인 2개의 뉴클레오타이드 서열에 대한 어닐링을 의미한다. 혼성화가 일어나도록 하기 위해, 상보적 핵산 분자는 일반적으로 이중 가닥을 2개의 단일 가닥으로 용융시키거나 단일 가닥 핵산으로부터 헤어핀 또는 기타 2차 구조를 제거하기 위해 열적으로 또는 화학적으로 변성된다. 혼성화의 엄격성은 온도, 염 농도 및 혼성화 완충액 조성과 같은 조건에 의해 영향을 받는다. 통상적인 혼성화 조건은, 예를 들어, 문헌 [Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York]에 기술되어 있지만, 통상의 기술자는 수많은 상이한 혼성화 조건이 공지된 또는 예상되는 핵산 서열의 상동성 및/또는 길이의 함수로 디자인될 수 있음을 인식할 것이다. 혼성화를 위한 높은 엄격성 조건은 고온 및/또는 낮은 나트륨/염 농도(염은, 예를 들어, NaCl 및 Na-시트레이트에서와 같은 나트륨을 포함함) 및/또는 혼성화 완충액 중 포름아미드의 포함 및/또는
혼성화 완충액 중 SDS(나트륨 도데실 설페이트 계면 활성제)와 같은 화합물의 농도의 저하 및/또는 혼성화 완충액으로부터 덱스트란 설페이트 또는 폴리에틸렌 글리콜(분자 군집 촉진)과 같은 화합물의 제외를 포함한다. 비제한적인 예로서, 엄격한 혼성화를 위한 대표적인 염 및 온도 조건은 65℃에서 1 × SSC, 0.5% SDS이다. 약어 SSC는 핵산 혼성화 용액에 사용되는 완충액을 지칭한다. 1 리터의 20×(20배 농축물) 스톡 SSC 완충 용액(pH 7.0)은 175.3 g의 나트륨 클로라이드 및 88.2 g의 나트륨 시트레이트를 함유한다. 혼성화를 달성하기 위한 대표적인 기간은 12 시간이다.
"전사 인자 결합 부위"(transcription factor binding site: TFBS)라는 용어는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 대안적인 TFBS 서열이 의도된 TF에 의해 결합된다면 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 출원에 개시된 다양한 TFBS에 대한 공통 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며, 통상의 기술자는 대안적인 TFBS를 결정하기 위해 이러한 정보를 용이하게 사용할 수 있다. 또한, 주어진 추정 서열에 결합하는 TF의 능력은 통상의 기술자에 의해 실험적으로 용이하게 결정될 수 있다(예를 들어, EMSA 및 당해 분야에 잘 공지되어 있고 본 출원에 논의된 다른 접근법에 의함).
"공통 서열"의 의미는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 본 출원에서, 문맥상 달리 명시되지 않는다면, 다음 표기법이 공통 서열에 대해 사용된다. 하기 예시적인 DNA 서열을 고려한다:
A[CT]N{A}YR
A는 A가 해당 위치에서 항상 발견됨을 의미하고; [CT]는 해당 위치의 C 또는 T를 나타내고; N은 해당 위치의 임의의 염기를 나타내고; {A}는 A를 제외한 임의의 염기가 해당 위치에서 발견됨을 의미한다. Y는 임의의 피리미딘을 나타내고, R은 임의의 퓨린을 나타낸다.
본 출원의 "합성"은 자연에서 발생되지 않는 핵산 분자를 의미한다. 본 발명의 합성 핵산은 전형적으로 재조합 기술 또는 새로운 합성에 의해 인공적으로 생산된다. 이러한 합성 핵산은 자연 발생 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론 및 기타 이러한 조절 서열)을 포함할 수 있지만, 이들은 비자연 발생 환경에서 존재한다. 예를 들어, 합성 유전자(또는 유전자의 일부)는 전형적으로는 사실상 인접하지 않는 하나 이상의 핵산 서열(키메라 서열)을 함유하고/하거나 치환, 삽입, 결실 및 이의 조합을 포함할 수 있다.
본 출원에 사용되는 "상보적" 또는 "상보성"은 2개의 핵산 서열의 왓슨-크릭 염기 쌍 형성을 지칭한다. 예를 들어, 서열 5'-AGT-3'는 상보적 서열 3'-TCA-5'에 결합한다. 2개의 핵산 서열 사이의 상보성은 염기 중 일부만이 이의 상보체에 결합하는 "부분적"일 수 있거나, 서열 내의 모든 염기가 이의 상보적 염기에 결합할 때와 같이 완전할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율과 강도에 유의한 영향을 미친다.
본 출원의 "형질 감염"은 의도적으로 핵산을 세포에 도입하는 임의의 과정을 광범위하게 지칭하고, 바이러스 및 비바이러스 벡터의 도입을 포괄하고, 형질 전환, 형질 도입 및 유사한 용어 및 과정을 포함하거나 이와 동등하다. 예는 바이러스 벡터에 의한 형질 감염, 플라스미드 벡터에 의한 형질 전환, 전기 천공(문헌 [Fromm et al. (1986) Nature 319　:791-3]), 리포펙션(문헌 [Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84　:7413-7]), 미세 주사(문헌 [Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85]), 아그로박테리움-매개성 전달(문헌 [Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7]), 직접 DNA 흡수, Whisker 매개성 형질 전환 및 미세 입자 투사법(문헌 [Klein et al. (1987) Nature 327:70])을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에 사용되는 "이식 유전자"라는 문구는 외인성 핵산 서열을 지칭한다. 하나의 예에서, 이식 유전자는 산업적으로 또는 약제학적으로 유용한 화합물을 인코딩하는 유전자, 또는 바람직한 형질을 인코딩하는 유전자이다. 또 다른 예에서, 이식 유전자는 안티센스 핵산 서열과 같은 유용한 핵산을 인코딩하며, 여기서, 상기 안티센스 핵산 서열의 발현은 표적 핵산 서열의 발현을 억제한다. 상기 이식 유전자는 바람직하게는 치료학적 산물, 예를 들어, 단백질을 인코딩한다.
"벡터"라는 용어는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 본 출원에 사용된 바와 같이 본 발명에 따른 핵산 서열이 삽입될 수 있는 핵산 분자, 예를 들어, 이중 가닥 DNA를 지칭한다. 벡터는 적합하게는 삽입된 핵산 분자를 적합한 숙주 세포 내로 수송하는 데 사용된다. 벡터는 전형적으로는 삽입 핵산 분자를 전사하는 것, 바람직하게는 전사물을 폴리펩타이드로 번역하는 것을 가능하게 하는 모든 필요 요소를 함유한다. 벡터는 전형적으로는 벡터가 숙주 세포 내에 있으면 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 또는 동시에 복제할 수 있도록 모든 필요 요소를 함유하며; 벡터 및 이의 삽입된 핵산 분자의 여러 카피가 생성될 수 있다. 본 발명의 벡터는 에피솜 벡터(즉, 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않음)일 수 있거나, 숙주 세포 게놈에 통합되는 벡터일 수 있다. 이러한 정의는 비바이러스 및 바이러스 벡터 모두를 포함한다. 비바이러스 벡터는 플라스미드 벡터(예를 들어, pMA-RQ, pUC 벡터, 블루스크립트 벡터(pBS) 및 pBR322 또는 세균 서열이 없는 이의 유도체(미니서클)), 트랜스포손 기반 벡터(예를 들어, PiggyBac(PB) 벡터 또는 Sleeping Beauty(SB) 벡터) 등을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 인공 염색체(세균(BAC), 효모(YAC) 또는 사람(HAC))와 같은 보다 큰 벡터는 보다 큰 삽입물을 수용하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 바이러스로부터 유래되며, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노 관련 바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 간염 바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 반드시 그런 것은 아니지만 전형적으로, 바이러스 벡터는 복제에 필수적인 바이러스 유전자가 바이러스 벡터로부터 제거되었기 때문에 주어진 세포에서 증식하는 능력을 상실하여 복제 결핍되어 있다. 그러나, 일부 바이러스 벡터는 또한 주어진 세포, 예를 들어, 암 세포에서 특이적으로 복제되도록 적합화될 수 있으며, 전형적으로는 (암) 세포 특이적 (종양)용해를 촉발시키는 데 사용된다. 바이로솜은 바이러스 요소와 비바이러스 요소 모두를 포함하는 벡터의 비제한적인 예이며, 특히, 불활성화된 HIV 또는 인플루엔자 바이러스와 리포솜을 결합시킨다(문헌 [Yamada et al., 2003]). 또 다른 예는 양이온성 지질과 혼합된 바이러스 벡터를 포함한다.
본 출원에 사용되는 "작동 가능하게 연결된", "작동 가능하게 결합된"이라는 용어 또는 동등한 표현은, 다양한 핵산 요소가 기능적으로 연결되고 의도된 방식으로 서로 상호 작용할 수 있도록 서로에 대한 다양한 핵산 요소의 배열을 지칭한다. 이러한 요소는 합성 프로모터, CRE(예를 들어, 인핸서 또는 기타 조절 요소), CRM, 프로모터 요소, 폴리아데닐화 서열, 하나 이상의 인트론 및/또는 엑손, 및 발현되는 관심 유전자의 코딩 서열을 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 핵산 서열 요소는 적절하게 배향되거나 작동 가능하게 연결될 때 함께 작용하여 서로의 활성을 조정하며, 궁극적으로는 발현 산물의 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다. 조정한다는 것은 특정 요소의 활성 수준을 증가, 감소 또는 유지하는 것을 의미한다. 다른 요소에 대한 각각의 요소의 위치는 각각의 요소의 5' 말단 및 3' 말단, 또는 또 다른 요소 또는 위치(예를 들어, TSS 또는 프로모터 요소)의 업스트림 또는 다운스트림의 위치로 표현될 수 있으며, 임의의 특정 요소 사이의 거리는 요소 사이에 개재 뉴클레오타이드 또는 염기 쌍의 수에 의해 언급될 수 있다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 작동 가능하게 연결된은 기능적 활성을 내포하며, 반드시 자연 위치 연결과 관련되는 것은 아니다. 실제로, 핵산 발현 카세트에 사용될 때, CRE는 전형적으로는 프로모터 요소의 바로 업스트림에 위치할 것이지만(이는 일반적인 경우이지만, 이는 핵산 발현 카세트 내의 위치의 제한 또는 배제로서 해석되어서는 절대로 안됨), 이는 생체내의 경우일 필요는 없으며, 예를 들어, 전사에 영향을 미치는 유전자의 다운스트림에 자연적으로 발생하는 조절 요소 서열은 프로모터의 업스트림에 위치할 때와 동일한 방식으로 기능할 수 있다. 따라서, 구체적인 실시 형태에 따르면, 상기 조절 요소의 조절 또는 증진 효과는 위치 독립적일 수 있다.
본 출원에 사용되는 "스페이서 서열" 또는 "스페이서"는 2개의 기능적 핵산 서열(예를 들어, TFBS, CRE, CRM, 프로모터 요소 등)을 분리하는 핵산 서열이다. 이는, 기능적 핵산 서열(예를 들어, 시스-조절 요소)이 목적하는 바와 같이 기능하는 것을 방지하지 않는다면(예를 들어, 이는 사일런서 서열을 포함하거나 목적하는 전사 인자의 결합을 방지하는 등의 경우에 일어날 수 있음), 본질적으로 임의의 서열을 가질 수 있다. 전형적으로, 이는 기능적 핵산 서열이 서로 인접한 공간에만 존재하므로 비기능적이다. 일부 실시 형태에서, 스페이서는 75, 50, 40, 30, 30 또는 10개 이하의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 또는 스페이서들은 하나 이상의 제한 효소에 대한 인식 부위일 수 있다.
본 출원에 사용되는 "약제학적으로 허용되는"이라는 용어는 당해 분야와 일치하며, 약제학적 조성물의 다른 성분과 상용 가능하고 이의 수용자에게 유해하지 않음을 의미한다.
"치료학적 유효량" 및 유사한 문구는, 예를 들어, 근육에서 치료학적 유전자를 발현시키기 위해, 목적하는 특정 약리학적 효과를 제공하는 대상체의 용량 또는 혈장 농도를 의미한다. 치료학적 유효량은, 이러한 투약량이 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 치료학적 유효량으로 간주되더라도, 본 출원에 기재된 병태를 치료하는 데 항상 효과적이지 않을 수 있다. 상기 치료학적 유효량은 투여 경로 및 투여 형태(dossage from), 대상체의 연령 및 체중, 및/또는 치료되는 질환 또는 병태를 기준으로 달라질 수 있다.
본 출원에 사용되는 "AAV 벡터"라는 용어는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 일반적으로 다양한 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터 핵산 서열을 지칭한다. 본 출원에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로는 벡터의 일부로서 AAV 기원이 아닌 이종 핵산 서열을 포함한다. 이러한 이종 핵산 서열은 전형적으로는 본 출원에 개시된 바와 같은 프로모터뿐만 아니라 세포의 유전적 형질 전환을 위한 다른 관심 서열을 포함한다. 일반적으로, 상기 이종 핵산 서열은 적어도 하나, 일반적으로는 2개의 AAV 역위 말단 반복부(inverted terminal: ITR) 서열에 의해 플랭킹된다. "AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 폴리펩타이드(변이체 AAV 캡시드 폴리펩타이드와 비변이체 모체 캡시드 폴리펩타이드 모두 포함) 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드 AAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 상기 입자가 이종 핵산(즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 다른 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 포유 동물 세포에 전달되는 이식 유전자)을 포함하는 경우, 이는 "AAV 벡터 입자" 또는 간단히 "AAV 벡터"로 지칭될 수 있다. 따라서, AAV 비리온 또는 AAV 입자의 생산은 AAV 벡터의 생산을 반드시 포함하는데, 이는 이러한 벡터가 AAV 비리온 또는 AAV 입자 내에 포함되기 때문이다.
"소간섭" 또는 "짧은 간섭 RNA" 또는 siRNA는 관심 유전자("표적 유전자")에 표적화된 뉴클레오타이드의 RNA 듀플렉스이다. "RNA 듀플렉스"는 RNA 분자의 두 영역 사이의 상보적 쌍 형성에 의해 형성된 구조를 지칭한다. siRNA는 유전자에 "표적화"되며, siRNA의 듀플렉스 부분의 뉴클레오타이드 서열은 표적화된 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대해 상보적이다. 일부 실시 형태에서, siRNA의 듀플렉스의 길이는 30개 미만의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시 형태에서, 상기 듀플렉스는 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 듀플렉스의 길이는 19~25개의 뉴클레오타이드 길이이다. siRNA의 RNA 듀플렉스 부분은 헤어핀 구조의 일부일 수 있다. 듀플렉스 부분에 추가하여, 헤어핀 구조는 듀플렉스를 형성하는 2개의 서열 사이에 위치한 루프 부분을 포함할 수 있다. 루프는 길이가 다양할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 루프는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 뉴클레오타이드 길이이다. 헤어핀 구조는 또한 3' 또는 5' 오버행 부분을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 오버행은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오타이드 길이의 3' 또는 5' 오버행이다.
본 출원에 사용되는 "마이크로RNA"라는 용어는 내인성 마이크로RNA 및 인공 마이크로RNA(예를 들어, 합성 miRNA)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 임의의 유형의 간섭 RNA를 지칭한다. 내인성 마이크로RNA는 mRNA의 생산적 이용을 조정할 수 있는 게놈에 자연적으로 인코딩된 작은 RNA이다. 인공 마이크로RNA는 mRNA의 활성을 조정할 수 있는, 내인성 마이크로RNA 이외의 다른 임의의 유형의 RNA 서열일 수 있다. 마이크로RNA 서열은 이들 서열 중 임의의 하나 이상으로 구성된 RNA 분자일 수 있다. 마이크로RNA(또는 "miRNA") 서열은 문헌 [Lim, et al, 2003, Genes & Development, 17, 991-1008], [Lim et al, 2003, Science, 299, 1540], [Lee and Ambrose, 2001, Science, 294, 862], [Lau et al, 2001, Science 294, 858-861], [Lagos-Quintana et al, 2002, Current Biology, 12, 735-739], [Lagos-Quintana et al., 2001, Science, 294, 853-857] 및 [Lagos-Quintana et al., 2003, RNA, 9, 175-179]과 같은 간행물에 기재되어 있다. 마이크로RNA의 예는 보다 큰 RNA의 임의의 RNA 단편을 포함하거나, miRNA, siRNA, stRNA, sncRNA, tncRNA, snoRNA, smRNA, shRNA, snRNA 또는 기타 작은 비코딩 RNA이다. 예를 들어, 미국 특허 출원 US 20050272923, 20050266552, 20050142581 및 20050075492를 참조한다. "마이크로RNA 전구체"(또는 "pre-miRNA")는 마이크로RNA 서열이 내부에 포함된 스템-루프 구조를 갖는 핵산을 지칭한다. "성숙 마이크로RNA"(또는 "성숙 miRNA")는 마이크로RNA 전구체("pre-miRNA")로부터 절단되거나 합성된(예를 들어, 무세포 합성에 의해 실험실에서 합성됨) 마이크로RNA를 포함하고, 약 19개의 뉴클레오타이드 내지 약 27개의 뉴클레오타이드를 가지며, 예를 들어, 성숙 마이크로RNA는 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, 25 nt, 26 nt 또는 27 nt의 길이를 가질 수 있다. 성숙 마이크로RNA는 표적 mRNA에 결합하여 표적 mRNA의 번역을 억제할 수 있다.
"치료" 또는 "치료하는"이라는 용어는 질환 또는 병태의 하나 이상의 징후, 증상 또는 영향을 감소, 개선 또는 제거하는 것을 지칭한다. 본 출원에 사용되는 "치료"는 포유 동물, 특히, 사람에서 질환의 임의의 치료를 포함하며, (a) 질환에 걸리기 쉽거나 질환에 걸릴 위험이 있지만 이에 걸린 것으로 아직 진단되지 않은 대상체에서 질환의 발생을 예방하는 것; (b) 질환를 억제하는 것, 즉, 이의 발생을 저지하는 것; 및 (c) 질환을 경감시키는 것, 즉, 질환의 퇴행을 유발하는 것을 포함한다.
대상체에 대한 제제의 "투여"는 의도된 기능을 수행하도록 대상체에게 제제를 도입하거나 전달하는 임의의 경로를 포함한다. 투여는 경구, 비강내, 안구내, 안과적, 비경구(정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하) 또는 국소를 비롯한 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다. 투여는 전행성 심외막 관상 동맥 주입을 통해 이루어질 수 있다. 투여는 자가 투여와 타인에 의한 투여를 포함한다. 근육내 투여가 본 발명에서 특히 중요하다.
"개체", "대상체" 및 "환자"라는 용어는 상호 교환적으로 사용되며, 치료를 필요로 하는 질환 또는 병태를 가진 임의의 개별 대상체를 지칭한다. 본 개시 내용의 목적상, 상기 대상체는 영장류, 바람직하게는 사람, 또는 또 다른 포유 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 말, 돼지, 염소 또는 소 등일 수 있다.
실시예
본 발명의 특정 실시 형태에 따른 합성 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터의 강도는 이들을 리포터 유전자 루시퍼라아제에 작동 가능하게 연결하여 테스트되었다. 테스트되는 근육 특이적 프로모터 또는 골격근 특이적 프로모터와 루시퍼라아제 유전자로 구성된 발현 카세트를 적합한 플라스미드에 삽입한 다음, 세포에 형질 감염시켜 이들 세포에서 프로모터의 발현을 테스트하였다.
실시예 1 - 시험관내 테스트
재료 및 방법
전사 활성을 평가하기 위해, DNA 제제를 H9C2(래트 BDIX 심장 근모세포주, ATCC에서 입수 가능)에 형질 감염시켰다. H9C2 세포주는 이전 실험에서 생체내 골격근 및 심근 활동의 좋은 예측 변수인 것으로 나타났기 때문에 사용되었다. DNA 제제는 루시퍼라아제에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(예를 들어, SP0500)를 포함하였다.
H9C2 세포 배양 및 형질 감염
H9C2는 래트 BDIX 심장 근모세포 세포주이다. 이들은 심근 특성을 가지며, 예를 들어, 합류도(confluency)에서 형성된 근관은 아세틸콜린에 반응한다.
세포 유지
T-75 플라스크에 1% FBS(열 불활성화 -Gibco 10270-106, 로트 번호 42G2076K), 1% 글루타맥스(35050-038, Gibco) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액(15140-122, Gibco)을 함유하는 DMEM(고글루코스, D6546, Sigma)에서 H9C2 세포를 배양하였다. 세포를 하위 합류 단계(70~80%)에서 계대하여, 세포가 합류되고 융합되어 근관을 형성하는 위험을 방지하였다.
세포 유지 동안 계대를 위해, 배양 배지를 제거하고, 세포를 CaCl2 및 MgCl2(14190-094, Gibco)을 함유하지 않는 5 ml의 DPBS로 2회 세척하였다. 약 5분 동안 1 ml의 트립신 EDTA(25200-056, Gibco)와 함께 인큐베이션함으로써 세포를 플라스크로부터 분리하였다. 그 다음, 4 ml의 배양 배지를 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 플라스크 표면으로부터 세포를 분리하는 데 도움을 주었다. 세포를 100g에서 3분 동안 펠렛화하였다. 상청액을 폐기하고, 세포를 3 ml의 배양 배지에 재현탁시켰다. Countess 자동 세포 계수기에서 세포를 계수하고, 1:3 내지 1:10으로 씨딩하고, 즉, 1~3×10,000개 세포/cm2로 씨딩하고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
세포 형질 감염 및 분화
상기에 기재된 바와 같이, DPBS로 세척하고, 1 ml의 트립신 EDTA를 사용하여 플라스크로부터 분리하고, 4 ml의 배양 배지로 플라스크 표면을 세척 제거하고, 100g에서 3분 동안 펠렛화함으로써, 약 70~80%의 합류도의 2개의 T-75 플라스크로부터 H9C2 세포를 수집하였다. 세포를 45 ml의 배양 배지에 재현탁시키고, 48-웰 평저 플레이트(300 μl/웰)(353230, Corning)에 40,000개 세포/웰의 밀도로 씨딩하였다. 48-웰 플레이트 내의 세포를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
24 시간 후, 세포 상의 배양 배지를 300 μl의 항생제 무함유 배양 배지(즉, 1% FBS(열 불활성화 -Gibco 10270-106, 로트 번호 42G2076K) 및 1% 글루타맥스(35050-038, Gibco)를 함유하는 DMEM(고글루코스, D6546, Sigma)) 로 교체하였다. 웰 당 300 ng의 DNA를 Viafect(E4981, Promega)에 의해 웰 당 30 μl의 총 복합체 부피로 형질 감염시켰다. 형질 감염 후 플레이트를 부드럽게 혼합하고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
24 시간 후, 형질 감염된 세포로부터 배양 배지를 제거하고, DMEM(고글루코스, D6546, Sigma), 1% 글루타맥스(35050-038, Gibco), 1% FBS(열 불활성화 -Gibco 10270-106, 로트 번호 42G2076K), 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(15140-122, Gibco) 및 0.1% 레티노이드산(Sigma-R2625)으로 이루어진 300 μl의 분화 배지로 교체하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 7일 동안 인큐베이션하여 분화를 유도하였다. 분화 후, 세포 형태를 관찰하여 근관으로의 분화를 확인하였다.
그 다음, 세포를 500 μl의 DPBS로 세척하고, Milli-Q 물을 사용하여 1×로 희석된 100 μl의 루시퍼라아제 세포 배양 용해 5× 시약(E1531, Promega)으로 용해하였다. 세포 용해 시약을 위아래로 10회 피펫팅한 다음, 플레이트를 중간 세기로 30분 동안 와동시켜 세포 용해를 촉진하였다. 플레이트를 밀봉하고, 루시퍼라아제 어세이를 완료하기 전에 -80℃에서 보관하였다. H9C2 세포의 형질 감염 후 루시퍼라아제 어세이로부터 수집된 데이터는 하나의 생물학적 복제에 대한 3개의 기술적 복제를 기반으로 한다.
루시퍼라아제 활성의 측정
- LARII(듀얼 루시퍼라아제 리포터 1000 어세이 시스템, Promega, E1980)를 사용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다.
- 형질 감염 24 시간 후, 세포로부터 배지를 제거하였다.
- 세포를 300 μl의 DPBS로 1회 세척하였다.
- 100 μl의 수동 용해 완충액을 사용하여 세포를 용해시키고, 15분 동안 흔들면서 인큐베이션하였다.
- 벤치탑 원심 분리기에서 최대 속도로 1분 동안 플레이트의 원심 분리에 의해 세포 잔해물을 펠렛화하였다.
- 10 μl의 샘플을 백색 96-웰 플레이트에 옮기고, BMG Labtech FLUOstar Omega 플레이트 리더에서 50 μl의 LARII 기질의 주입에 의해 발광을 측정하였다.
이들 세포 배양물로부터 생성된 결과는 도 1에 도시되어 있다. 이러한 도면은 합성 프로모터 SP0500, SP0510, SP0514 및 SP0519가 근육 세포주 H9C2에서 우수한 활성을 나타냄을 도시한다. 본 출원에 기재된 다른 유사한 프로모터는 동일하거나 보다 우수한 성능을 가질 것으로 예상된다.
실시예 2 - 시험관내 데이터
실시예 1에서 상기에 상세히 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. 그러나, H9C2 세포의 형질 감염 후 루시퍼라아제 어세이로부터 본 실시예에서 수집된 데이터는 3개의 생물학적 복제를 기반으로 하며, 이들 각각은 3개의 기술적 복제의 평균이다.
이들 세포 배양물로부터 생성된 결과는 도 2에 도시되어 있으며, 결과는 CBA에 대해 정규화되어 있다. 이러한 도면은 합성 프로모터 SP0497, SP0500, SP0501, SP0506, SP0508, SP0510, SP0514, SP0519, SP0520, SP0521 및 SP4169가 근육 세포주 H9C2에서 우수한 활성을 나타냄을 도시한다. 프로모터 SP0498, SP0499, SP0502, SP0503, SP0504, SP0505, SP0507, SP0509, SP0511, SP0512, SP0513, SP0515, SP0516, SP0517, SP0518, SP0522, SP0523 및 SP0524도 또한 H9C2 세포주에서 실험적으로 테스트되었지만 보다 낮은 활성을 나타냈다(데이터는 도시되지 않음).
실시예 3 - 생체내 데이터
선택된 합성 근육 특이적 프로모터를 생체 내에서 테스트하였다(예를 들어, 도 3~18 참조).
재료 및 방법
루시퍼라아제에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(예를 들어, SP0500, SP0507, SP0514, SP0518, SP0519, SP0522 및 SP0524)를 포함하는 AAV를 0.9% 식염수로 희석하고, 8 주령 수컷 Balb/c 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스 당 1e11 vg/200 μl로 전달하였다(그룹 당 6 마리의 마우스). 주사 6주 후에 마우스를 희생시켰다. 횡격막, 심장, 사두근, 가자미근, 전경골근(TA) 및 간을 각각의 마우스로부터 수집하였다. 벡터 카피 수(vector copy number: VCN) 분석을 위해, 절제 직후 샘플을 액체 질소에서 급속 냉동하고, -80℃에서 보관하였다.
제조업체의 지침에 따라 BCA Pierce 단백질 어세이 키트((ThermoFisher 23225)를 사용하여 단백질을 추출하고 정량화하였다.
루시퍼라아제 정량화를 ONE-Glo 루시퍼라아제 어세이 시스템(Promega E6120)에 의해 수행하였다.
DNA를 추출하고, 완전히 해동되고 평형 온도가 될 때까지 모든 샘플과 시약을 실온에서 인큐베이션하였다. 모든 샘플과 시약을 사용하기 전에 잘 혼합하였다. ONE-GloTM 시약을 각각의 샘플에 동일한 부피로 첨가하고, 샘플을 완전히 혼합하였다. 3분 후, 완전한 세포 용해를 보장하기 위해, 샘플을 루미노미터에서 측정하였다.
벡터 카피 수를 이중 Taqman qPCR에 의해 수행하였다. DNeasy® 혈액 및 조직 키트(250)(QIAGEN, 카탈로그 번호 #69506)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 루시퍼라아제 및 GAPDH 특이적 프라이머와 프로브 세트 모두를 사용하여 각각의 샘플에 대해 Taqman qPCR을 수행하였다.
표준 곡선을 분석 목적으로 Luc 및 GAPDH에 대해 사용하였다. 다중 qPCR 프로토콜에서, 다음과 같은 최종 농도의 시약과 DNA를 사용하였다: Luc2 fw 프라이머(350 nM), Luc2 RV 프라이머(350 nM), mGapdH FW 프라이머(350 nM), mGapdH RV 프라이머(350 nM), Luc2 프로브 (250 nM), mGapdH 프로브(250 nM) 및 DNA(10 ng/uL). PCR 주기 프로토콜은 다음과 같았다: 95C - 20초, PCR: 40회 주기, 95C - 1초, 60C - 20초. 식염수 샘플(임계값)에 대해 게놈 당 평균 VCN(수량)을 공제하여 게놈 당 ΔΔCt VCN(수량)을 계산하였다.
결과
도 12에 도시된 바와 같이, 합성 근육 특이적 프로모터 SP0500은 심근(심장)에서 높은 활성을 나타냈다. 또한, SP0500은 골격근(예를 들어, TA, 사두근 및 횡격막)에서 활성을 나타냈다.
도 13에 도시된 바와 같이, 합성 근육 특이적 프로모터 SP0507은 골격근(예를 들어, TA) 및 심근(심장)에서 활성을 나타낸다.
도 14에 도시된 바와 같이, 합성 근육 특이적 프로모터 SP0514는 심근(심장)에서 활성을 나타낸다. 또한, SP0514는 골격근(예를 들어, 횡격막 및 TA)에서 일부 활성을 나타낸다.
도 15에 도시된 바와 같이, 합성 근육 특이적 프로모터 SP0518은 골격근(예를 들어, TA)에서 활성을 나타낸다. 또한, SP0518은 심근에서 일부 활성을 나타낸다.
도 16에 도시된 바와 같이, 합성 근육 특이적 프로모터 SP0519는 골격근(예를 들어, TA)에서 활성을 나타낸다. 또한, SP0519는 심근에서 일부 활성을 나타낸다.
도 17에 도시된 바와 같이, 합성 근육 특이적 프로모터 SP0522는 심근(심장)에서 높은 활성을 나타냈다. 또한, SP0522는 골격근(예를 들어, TA 및 횡격막)에서 활성을 나타냈다.
도 18에 도시된 바와 같이, 합성 근육 특이적 프로모터 SP0524는 심근(심장) 및 골격근(예를 들어, TA, 횡격막 및 사두근)에서 높은 활성을 나타냈다.
도 3에 도시된 바와 같이, 합성 근육 특이적 프로모터 SP0524는 횡격막에서 대조군 프로모터 CMV 및 CK8과 비교하여 비교적 또는 보다 높은 활성을 나타냈다. 합성 근육 특이적 프로모터 SP500, SP0518 및 SP0522는 횡경막에서 CK7과 비교하여 비교적 또는 보다 높은 활성을 나타냈다.
도 4에 도시된 바와 같이, 합성 근육 특이적 프로모터 SP0524는 TA에서 대조군 프로모터 CMV, CK7 및 CK8과 유사한 활성을 나타냈다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 합성 근육 특이적 프로모터 SP500, SP0522 및 SP0524는 심장에서 대조군 프로모터 CK8, CMV 및 CK7과 비교하여 비교적 또는 보다 높은 활성을 나타냈다.
도 6에 도시된 바와 같이, 테스트된 모든 합성 프로모터는 사두근에서 대조군 프로모터 CK8, CMV 및 CK7과 비교하여 보다 낮은 활성을 나타냈다.
도 7에 도시된 바와 같이, 합성 근육 특이적 프로모터 SP0524는 가자미근에서 대조군 프로모터 CK8 및 CMV와 비교하여 비교적 또는 보다 높은 활성을 나타냈다. 합성 근육 특이적 프로모터 SP0500 및 SP0522는 대조군 프로모터 CK7과 비교하여 비교적 또는 보다 높은 활성을 나타냈다.
도 8에 도시된 바와 같이, 테스트된 합성 근육 특이적 프로모터 SP500, SP0507, SP0514, SP0518, SP0519, SP0522 및 SP0524는 대조군 프로모터 CK8 및 CMV와 비교하여 간에서 보다 낮거나 유사한 활성을 나타냈다.
참고 문헌
Llanga, T. et al. (2017) ‘Structure-Based Designed Nano-Dysferlin Significantly Improves Dysferlinopathy in BLA/J Mice’, Molecular Therapy. Elsevier Ltd., 25(9), pp. 2150-2162. doi: 10.1016/j.ymthe.2017.05.013.
서열 정보
[표 1]
근육 특이적 합성 프로모터
[표 2]
표 1의 합성 프로모터로부터의 CRM
[표 3]
표 1의 합성 프로모터로부터의 CRE
[표 4]
표 1의 합성 프로모터로부터의 프로모터 요소
[표 5]
표시된 시스-조절 요소 및 프로모터 요소를 갖는 본 발명의 실시 형태에 따른 근육 특이적 합성 프로모터의 도식적 표현
SEQUENCE LISTING <110> Synpromics Limited Asklepios BioPharmaceutical Inc <120> Regulatory Nucleic Acid Sequences <130> P306790WO <150> GB 2108997.4 <151> 2021-06-23 <150> GB 2111317.0 <151> 2021-08-05 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 270 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0497 <400> 1 tctgagggag acagggaggc atgatcactg ccaaatgccc accaaggaca aggcacatcc 60 cagggagaca gacgcagacc tggtgccctc tggacactgg cattcctgga gttctcctct 120 ataaataccc gctctggtat ttggggttgg cagctgttgc ggccggggcc gcattcctgg 180 gggccgggcg gtgctcccgc ccgcctcgat aaaaggctcc ggggccggcg gcggcccacg 240 agctacccgg aggagcggga ggcggccacc 270 <210> 2 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0498 <400> 2 tctgagggag acagggaggc atgatcactg ccaaatgccc accaaggaca aggcacatcc 60 cagggagaca gacgcagacc tggtgccctc tggacactgg cattcctgga gagggtcagt 120 gtcctgcccc aacccatgag atgacagact ataatagcca caggattaac atagcaggca 180 ttgcaccgcc tgctgccacg gccggccgta taaatagagg cgaggagcag ctgggctctc 240 ttggcagtca ccgccacc 258 <210> 3 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0499 <400> 3 tctgagggag acagggaggc atgatcactg ccaaatgccc accaaggaca aggcacatcc 60 cagggagaca gacgcagacc tggtgccctc tggacactgg cattcctgga gttctcctct 120 ataaataccc gctctggtat ttggggttgg cagctgttgc accgcctgct gccacggccg 180 gccgtataaa tagaggcgag gagcagctgg gctctcttgg cagtcaccgc cacc 234 <210> 4 <211> 267 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0500 <400> 4 ccagcccacc tgtcccaatg ctgacttagt gcaaggcgag ccagcaagga gggaggacag 60 gtggcagtgg ggggtgagga gcatctaaaa atagccccag cccacctgtc ccaatgctga 120 cttagtgcaa ggcgagccag caaggaggga ggacaggtgg cagtgggggg tgaggagcat 180 ctaaaaatag cccaccgcct gctgccacgg ccggccgtat aaatagaggc gaggagcagc 240 tgggctctct tggcagtcac cgccacc 267 <210> 5 <211> 219 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0501 <400> 5 ccagcccacc tgtcccaatg ctgacttagt gcaaggcgag ccagcaagga gggaggacag 60 gtggcagtgg ggggtgagga gcatctaaaa atagccttct cctctataaa tacccgctct 120 ggtatttggg gttggcagct gttgcaccgc ctgctgccac ggccggccgt ataaatagag 180 gcgaggagca gctgggctct cttggcagtc accgccacc 219 <210> 6 <211> 251 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0502 <400> 6 ctagactagc atgctgccca tgtaaggagg caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt 60 tataattaac ccagacatgt ggctgccccc ccccccccaa cacctgctgc ctctaaaaat 120 aaccctgctt ctcctctata aatacccgct ctggtatttg gggttggcag ctgttgcacc 180 gcctgctgcc acggccggcc gtataaatag aggcgaggag cagctgggct ctcttggcag 240 tcaccgccac c 251 <210> 7 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0503 <400> 7 tcgtcccctg gctggcccat gtaatctgag cccagcattg tacatatcct gggaacagct 60 gacaatgcag tggtcagaca gctggtgggg ccagctagag ctggcagggt tggctgggag 120 gggagtgtag gctgattctc ctctataaat acccgctctg gtatttgggg ttggcagctg 180 ttgcaccgcc tgctgccacg gccggccgta taaatagagg cgaggagcag ctgggctctc 240 ttggcagtca ccgccacc 258 <210> 8 <211> 265 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0504 <400> 8 ttggcccagg tcacactggg gtgaggctag tgttcctgag ccttgacaag gagacagctt 60 gaaatagacg agtgtcacat ttctgagcag ctgtgtggcg acagcaggag gggtagggaa 120 tagacagtat aaaagagaaa gcttctcctc tataaatacc cgctctggta tttggggttg 180 gcagctgttg caccgcctgc tgccacggcc ggccgtataa atagaggcga ggagcagctg 240 ggctctcttg gcagtcaccg ccacc 265 <210> 9 <211> 269 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0505 <400> 9 ccctgccatc ttgggtttca gggcagagga gtcttgctaa ttttgatgcc tatttttgga 60 cacttcagct gccactggct ccttataaac gcatgacacc ccatgcaaac acactacccc 120 tccctccact gctgacaggt gtgtggttct cctctataaa tacccgctct ggtatttggg 180 gttggcagct gttgcaccgc ctgctgccac ggccggccgt ataaatagag gcgaggagca 240 gctgggctct cttggcagtc accgccacc 269 <210> 10 <211> 274 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0506 <400> 10 aattattttt aataacactt actggtaaga gaaaggggag aaaccttaga caggcactta 60 gatgtgacta aggcaggttt atctctgatt ccaaagcact ggagtggaag tcacaccgtg 120 actcagagca ttgtgatggg ccagctgtcc attctcctct ataaataccc gctctggtat 180 ttggggttgg cagctgttgc accgcctgct gccacggccg gccgtataaa tagaggcgag 240 gagcagctgg gctctcttgg cagtcaccgc cacc 274 <210> 11 <211> 274 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0507 <400> 11 cagtgttcct atatttatcc caccatacag agcttccttt gcctcagaag gaccagcagt 60 ttcgctagct taacaaaacc agccactcag ggtattggtt tacagtcaag caactctggg 120 agagggcagc tgctctcaga catcatacag cttctcctct ataaataccc gctctggtat 180 ttggggttgg cagctgttgc accgcctgct gccacggccg gccgtataaa tagaggcgag 240 gagcagctgg gctctcttgg cagtcaccgc cacc 274 <210> 12 <211> 240 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0508 <400> 12 cttctcaagc caaaggagca agagttaaaa ataacaggct caccctggca gccacctgtg 60 ctggccagcc ccaccccatc cctccctcgg ggacagctgc agctcctcag gccccgcccg 120 ggacattttg ggaacacttt ctcctcttac ttctcatctt cagggcaccg cctgctgcca 180 cggccggccg tataaataga ggcgaggagc agctgggctc tcttggcagt caccgccacc 240 <210> 13 <211> 275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0509 <400> 13 agggtcagtg tcctgcccca acccatgaga tgacagacta taatagccac aggattaaca 60 tagcaggcat tgatttttaa agactgagga attaggcacc tgtcattttt gccagctggt 120 gtagatgtta aaaattactg tcactcttcc gcctgctact ttattttgca cctgctgtta 180 cttgagttac aggcatttca caccgcctgc tgccacggcc ggccgtataa atagaggcga 240 ggagcagctg ggctctcttg gcagtcaccg ccacc 275 <210> 14 <211> 251 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0510 <400> 14 atttttaaag actgaggaat taggcacctg tcatttttgc cagctggtgt agatgttaaa 60 aattactgtc actcttccgc ctgctacttt attttgcacc tgctgttact tgagttacag 120 gcatttcatt ctcctctata aatacccgct ctggtatttg gggttggcag ctgttgcacc 180 gcctgctgcc acggccggcc gtataaatag aggcgaggag cagctgggct ctcttggcag 240 tcaccgccac c 251 <210> 15 <211> 274 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0511 <400> 15 agactggggc aggtgcaggc tggattgggt ttccagaggc tatatatata aaggctgccg 60 ggagccccag ggccgctccc tgagggcaca acactgtggg ggcccagcca ggcccacatt 120 cctttccaga ggccagctct ccatttatag cccctgggca gagcagcttc tcctctataa 180 atacccgctc tggtatttgg ggttggcagc tgttggggct gggcataaaa gtcagggcag 240 agccatctat tgcttacatt tgcttctggc cacc 274 <210> 16 <211> 218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0512 <400> 16 tctgagggag acagggaggc atgatcactg ccaaatgccc accaaggaca aggcacatcc 60 cagggagaca gacgcagacc tggtgccctc tggacactgg cattcctgga gttctcctct 120 ataaataccc gctctggtat ttggggttgg cagctgttgg ggctgggcat aaaagtcagg 180 gcagagccat ctattgctta catttgcttc tggccacc 218 <210> 17 <211> 275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0513 <400> 17 ccagcccacc tgtcccaatg ctgacttagt gcaaggcgag ccagcaagga gggaggacag 60 gtggcagtgg ggggtgagga gcatctaaaa atagccaggg tcagtgtcct gccccaaccc 120 atgagatgac agactataat agccacagga ttaacatagc aggcattgtt ctcctctata 180 aatacccgct ctggtatttg gggttggcag ctgttggggc tgggcataaa agtcagggca 240 gagccatcta ttgcttacat ttgcttctgg ccacc 275 <210> 18 <211> 251 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0514 <400> 18 ccagcccacc tgtcccaatg ctgacttagt gcaaggcgag ccagcaagga gggaggacag 60 gtggcagtgg ggggtgagga gcatctaaaa atagccttct cctctataaa tacccgctct 120 ggtatttggg gttggcagct gttgttctcc tctataaata cccgctctgg tatttggggt 180 tggcagctgt tggggctggg cataaaagtc agggcagagc catctattgc ttacatttgc 240 ttctggccac c 251 <210> 19 <211> 235 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0515 <400> 19 ctagactagc atgctgccca tgtaaggagg caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt 60 tataattaac ccagacatgt ggctgccccc ccccccccaa cacctgctgc ctctaaaaat 120 aaccctgctt ctcctctata aatacccgct ctggtatttg gggttggcag ctgttggggc 180 tgggcataaa agtcagggca gagccatcta ttgcttacat ttgcttctgg ccacc 235 <210> 20 <211> 242 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0516 <400> 20 tcgtcccctg gctggcccat gtaatctgag cccagcattg tacatatcct gggaacagct 60 gacaatgcag tggtcagaca gctggtgggg ccagctagag ctggcagggt tggctgggag 120 gggagtgtag gctgattctc ctctataaat acccgctctg gtatttgggg ttggcagctg 180 ttggggctgg gcataaaagt cagggcagag ccatctattg cttacatttg cttctggcca 240 cc 242 <210> 21 <211> 249 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0517 <400> 21 ttggcccagg tcacactggg gtgaggctag tgttcctgag ccttgacaag gagacagctt 60 gaaatagacg agtgtcacat ttctgagcag ctgtgtggcg acagcaggag gggtagggaa 120 tagacagtat aaaagagaaa gcttctcctc tataaatacc cgctctggta tttggggttg 180 gcagctgttg gggctgggca taaaagtcag ggcagagcca tctattgctt acatttgctt 240 ctggccacc 249 <210> 22 <211> 253 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0518 <400> 22 ccctgccatc ttgggtttca gggcagagga gtcttgctaa ttttgatgcc tatttttgga 60 cacttcagct gccactggct ccttataaac gcatgacacc ccatgcaaac acactacccc 120 tccctccact gctgacaggt gtgtggttct cctctataaa tacccgctct ggtatttggg 180 gttggcagct gttggggctg ggcataaaag tcagggcaga gccatctatt gcttacattt 240 gcttctggcc acc 253 <210> 23 <211> 272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0519 <400> 23 cttctcaagc caaaggagca agagttaaaa ataacaggct caccctggca gccacctgtg 60 ctggccagcc ccaccccatc cctccctcgg ggacagctgc agctcctcag gccccgcccg 120 ggacattttg ggaacacttt ctcctcttac ttctcatctt cagggttctc ctctataaat 180 acccgctctg gtatttgggg ttggcagctg ttggggctgg gcataaaagt cagggcagag 240 ccatctattg cttacatttg cttctggcca cc 272 <210> 24 <211> 259 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0520 <400> 24 agggtcagtg tcctgcccca acccatgaga tgacagacta taatagccac aggattaaca 60 tagcaggcat tgatttttaa agactgagga attaggcacc tgtcattttt gccagctggt 120 gtagatgtta aaaattactg tcactcttcc gcctgctact ttattttgca cctgctgtta 180 cttgagttac aggcatttca gggctgggca taaaagtcag ggcagagcca tctattgctt 240 acatttgctt ctggccacc 259 <210> 25 <211> 263 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0521 <400> 25 ctagactagc atgctgccca tgtaaggagg caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt 60 tataattaac ccagacatgt ggctgccccc ccccccccaa cacctgctgc ctctaaaaat 120 aaccctgctt ctcctctata aatacccgct ctggtatttg gggttggcag ctgttggtac 180 ttatataagg gggtgggggc gcgttcgtcc tcagtcgcga tcgaacactc gagccgagca 240 gacgtgccta cggaccggcc acc 263 <210> 26 <211> 287 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP4169 <400> 26 ctagactagc atgctgccca tgtaaggagg caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt 60 tataattaac ccagacatgt ggctgccccc ccccccccaa cacctgctgc ctctaaaaat 120 aaccctgctt ctcctctata aatacccgct ctggtatttg gggttggcag ctgttgcggc 180 cggggccgca ttcctggggg ccgggcggtg ctcccgcccg cctcgataaa aggctccggg 240 gccggcggcg gcccacgagc tacccggagg agcgggaggc ggccacc 287 <210> 27 <211> 237 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0522 <400> 27 gctgcccatg taaggaggca aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta taattaaccc 60 agacatgtgg ctgccccccc cccccaacac ctgctgcctc taaaaataac cctgttctcc 120 tctataaata cccgctctgg tatttggggt tggcagctgt tgcaccgcct gctgccacgg 180 ccggccgtat aaatagaggc gaggagcagc tgggctctct tggcagtcac cgccacc 237 <210> 28 <211> 221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0523 <400> 28 gctgcccatg taaggaggca aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta taattaaccc 60 agacatgtgg ctgccccccc cccccaacac ctgctgcctc taaaaataac cctgttctcc 120 tctataaata cccgctctgg tatttggggt tggcagctgt tggggctggg cataaaagtc 180 agggcagagc catctattgc ttacatttgc ttctggccac c 221 <210> 29 <211> 249 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0524 <400> 29 gctgcccatg taaggaggca aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta taattaaccc 60 agacatgtgg ctgccccccc cccccaacac ctgctgcctc taaaaataac cctgttctcc 120 tctataaata cccgctctgg tatttggggt tggcagctgt tggtacttat ataagggggt 180 gggggcgcgt tcgtcctcag tcgcgatcga acactcgagc cgagcagacg tgcctacgga 240 ccggccacc 249 <210> 30 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM from SP0497, SP0499 and SP0512 <400> 30 tctgagggag acagggaggc atgatcactg ccaaatgccc accaaggaca aggcacatcc 60 cagggagaca gacgcagacc tggtgccctc tggacactgg cattcctgga gttctcctct 120 ataaataccc gctctggtat ttggggttgg cagctgttg 159 <210> 31 <211> 183 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM_SP0498 <400> 31 tctgagggag acagggaggc atgatcactg ccaaatgccc accaaggaca aggcacatcc 60 cagggagaca gacgcagacc tggtgccctc tggacactgg cattcctgga gagggtcagt 120 gtcctgcccc aacccatgag atgacagact ataatagcca caggattaac atagcaggca 180 ttg 183 <210> 32 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM_SP0500 <400> 32 ccagcccacc tgtcccaatg ctgacttagt gcaaggcgag ccagcaagga gggaggacag 60 gtggcagtgg ggggtgagga gcatctaaaa atagccccag cccacctgtc ccaatgctga 120 cttagtgcaa ggcgagccag caaggaggga ggacaggtgg cagtgggggg tgaggagcat 180 ctaaaaatag cc 192 <210> 33 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM_SP0501 <400> 33 ccagcccacc tgtcccaatg ctgacttagt gcaaggcgag ccagcaagga gggaggacag 60 gtggcagtgg ggggtgagga gcatctaaaa atagccttct cctctataaa tacccgctct 120 ggtatttggg gttggcagct gttg 144 <210> 34 <211> 176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM from SP0502, SP0515, SP0521 and SP4169 <400> 34 ctagactagc atgctgccca tgtaaggagg caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt 60 tataattaac ccagacatgt ggctgccccc ccccccccaa cacctgctgc ctctaaaaat 120 aaccctgctt ctcctctata aatacccgct ctggtatttg gggttggcag ctgttg 176 <210> 35 <211> 183 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM from SP0503 and SP0516 <400> 35 tcgtcccctg gctggcccat gtaatctgag cccagcattg tacatatcct gggaacagct 60 gacaatgcag tggtcagaca gctggtgggg ccagctagag ctggcagggt tggctgggag 120 gggagtgtag gctgattctc ctctataaat acccgctctg gtatttgggg ttggcagctg 180 ttg 183 <210> 36 <211> 190 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM from SP0504 and SP0517 <400> 36 ttggcccagg tcacactggg gtgaggctag tgttcctgag ccttgacaag gagacagctt 60 gaaatagacg agtgtcacat ttctgagcag ctgtgtggcg acagcaggag gggtagggaa 120 tagacagtat aaaagagaaa gcttctcctc tataaatacc cgctctggta tttggggttg 180 gcagctgttg 190 <210> 37 <211> 194 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM from SP0505 and SP0518 <400> 37 ccctgccatc ttgggtttca gggcagagga gtcttgctaa ttttgatgcc tatttttgga 60 cacttcagct gccactggct ccttataaac gcatgacacc ccatgcaaac acactacccc 120 tccctccact gctgacaggt gtgtggttct cctctataaa tacccgctct ggtatttggg 180 gttggcagct gttg 194 <210> 38 <211> 199 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM_SP0506 <400> 38 aattattttt aataacactt actggtaaga gaaaggggag aaaccttaga caggcactta 60 gatgtgacta aggcaggttt atctctgatt ccaaagcact ggagtggaag tcacaccgtg 120 actcagagca ttgtgatggg ccagctgtcc attctcctct ataaataccc gctctggtat 180 ttggggttgg cagctgttg 199 <210> 39 <211> 199 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM_SP0507 <400> 39 cagtgttcct atatttatcc caccatacag agcttccttt gcctcagaag gaccagcagt 60 ttcgctagct taacaaaacc agccactcag ggtattggtt tacagtcaag caactctggg 120 agagggcagc tgctctcaga catcatacag cttctcctct ataaataccc gctctggtat 180 ttggggttgg cagctgttg 199 <210> 40 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM_SP0508 <400> 40 cttctcaagc caaaggagca agagttaaaa ataacaggct caccctggca gccacctgtg 60 ctggccagcc ccaccccatc cctccctcgg ggacagctgc agctcctcag gccccgcccg 120 ggacattttg ggaacacttt ctcctcttac ttctcatctt caggg 165 <210> 41 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM from SP0509 and SP0520 <400> 41 agggtcagtg tcctgcccca acccatgaga tgacagacta taatagccac aggattaaca 60 tagcaggcat tgatttttaa agactgagga attaggcacc tgtcattttt gccagctggt 120 gtagatgtta aaaattactg tcactcttcc gcctgctact ttattttgca cctgctgtta 180 cttgagttac aggcatttca 200 <210> 42 <211> 176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM_SP0510 <400> 42 atttttaaag actgaggaat taggcacctg tcatttttgc cagctggtgt agatgttaaa 60 aattactgtc actcttccgc ctgctacttt attttgcacc tgctgttact tgagttacag 120 gcatttcatt ctcctctata aatacccgct ctggtatttg gggttggcag ctgttg 176 <210> 43 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM_SP0511 <400> 43 agactggggc aggtgcaggc tggattgggt ttccagaggc tatatatata aaggctgccg 60 ggagccccag ggccgctccc tgagggcaca acactgtggg ggcccagcca ggcccacatt 120 cctttccaga ggccagctct ccatttatag cccctgggca gagcagcttc tcctctataa 180 atacccgctc tggtatttgg ggttggcagc tgttg 215 <210> 44 <211> 216 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM_SP0513 <400> 44 ccagcccacc tgtcccaatg ctgacttagt gcaaggcgag ccagcaagga gggaggacag 60 gtggcagtgg ggggtgagga gcatctaaaa atagccaggg tcagtgtcct gccccaaccc 120 atgagatgac agactataat agccacagga ttaacatagc aggcattgtt ctcctctata 180 aatacccgct ctggtatttg gggttggcag ctgttg 216 <210> 45 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM_SP0514 <400> 45 ccagcccacc tgtcccaatg ctgacttagt gcaaggcgag ccagcaagga gggaggacag 60 gtggcagtgg ggggtgagga gcatctaaaa atagccttct cctctataaa tacccgctct 120 ggtatttggg gttggcagct gttgttctcc tctataaata cccgctctgg tatttggggt 180 tggcagctgt tg 192 <210> 46 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM_SP0519 <400> 46 cttctcaagc caaaggagca agagttaaaa ataacaggct caccctggca gccacctgtg 60 ctggccagcc ccaccccatc cctccctcgg ggacagctgc agctcctcag gccccgcccg 120 ggacattttg ggaacacttt ctcctcttac ttctcatctt cagggttctc ctctataaat 180 acccgctctg gtatttgggg ttggcagctg ttg 213 <210> 47 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM from SP0522, SP0523 and SP0524 <400> 47 gctgcccatg taaggaggca aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta taattaaccc 60 agacatgtgg ctgccccccc cccccaacac ctgctgcctc taaaaataac cctgttctcc 120 tctataaata cccgctctgg tatttggggt tggcagctgt tg 162 <210> 48 <211> 151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0119 <400> 48 aattattttt aataacactt actggtaaga gaaaggggag aaaccttaga caggcactta 60 gatgtgacta aggcaggttt atctctgatt ccaaagcact ggagtggaag tcacaccgtg 120 actcagagca ttgtgatggg ccagctgtcc a 151 <210> 49 <211> 142 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0127 <400> 49 ttggcccagg tcacactggg gtgaggctag tgttcctgag ccttgacaag gagacagctt 60 gaaatagacg agtgtcacat ttctgagcag ctgtgtggcg acagcaggag gggtagggaa 120 tagacagtat aaaagagaaa gc 142 <210> 50 <211> 146 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0137 <400> 50 ccctgccatc ttgggtttca gggcagagga gtcttgctaa ttttgatgcc tatttttgga 60 cacttcagct gccactggct ccttataaac gcatgacacc ccatgcaaac acactacccc 120 tccctccact gctgacaggt gtgtgg 146 <210> 51 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0138 <400> 51 cttctcaagc caaaggagca agagttaaaa ataacaggct caccctggca gccacctgtg 60 ctggccagcc ccaccccatc cctccctcgg ggacagctgc agctcctcag gccccgcccg 120 ggacattttg ggaacacttt ctcctcttac ttctcatctt caggg 165 <210> 52 <211> 151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0139 <400> 52 cagtgttcct atatttatcc caccatacag agcttccttt gcctcagaag gaccagcagt 60 ttcgctagct taacaaaacc agccactcag ggtattggtt tacagtcaag caactctggg 120 agagggcagc tgctctcaga catcatacag c 151 <210> 53 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0143 <400> 53 tcgtcccctg gctggcccat gtaatctgag cccagcattg tacatatcct gggaacagct 60 gacaatgcag tggtcagaca gctggtgggg ccagctagag ctggcagggt tggctgggag 120 gggagtgtag gctga 135 <210> 54 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0145 <400> 54 gctgcccatg taaggaggca aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta taattaaccc 60 agacatgtgg ctgccccccc cccccaacac ctgctgcctc taaaaataac cctg 114 <210> 55 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0077 <400> 55 tctgagggag acagggaggc atgatcactg ccaaatgccc accaaggaca aggcacatcc 60 cagggagaca gacgcagacc tggtgccctc tggacactgg cattcctgga g 111 <210> 56 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DES_MT_enhancer_48bp <400> 56 ttctcctcta taaatacccg ctctggtatt tggggttggc agctgttg 48 <210> 57 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0075 <400> 57 agggtcagtg tcctgcccca acccatgaga tgacagacta taatagccac aggattaaca 60 tagcaggcat tg 72 <210> 58 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0083 <400> 58 ccagcccacc tgtcccaatg ctgacttagt gcaaggcgag ccagcaagga gggaggacag 60 gtggcagtgg ggggtgagga gcatctaaaa atagcc 96 <210> 59 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ch2EnhMYL1_3_v1 <400> 59 atttttaaag actgaggaat taggcacctg tcatttttgc cagctggtgt agatgttaaa 60 aattactgtc actcttccgc ctgctacttt attttgcacc tgctgttact tgagttacag 120 gcatttca 128 <210> 60 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0050 <400> 60 ctagactagc atgctgccca tgtaaggagg caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt 60 tataattaac ccagacatgt ggctgccccc ccccccccaa cacctgctgc ctctaaaaat 120 aaccctgc 128 <210> 61 <211> 167 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0069 <400> 61 agactggggc aggtgcaggc tggattgggt ttccagaggc tatatatata aaggctgccg 60 ggagccccag ggccgctccc tgagggcaca acactgtggg ggcccagcca ggcccacatt 120 cctttccaga ggccagctct ccatttatag cccctgggca gagcagc 167 <210> 62 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BG_mp <400> 62 gggctgggca taaaagtcag ggcagagcca tctattgctt acatttgctt ctg 53 <210> 63 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCP1 <400> 63 gtacttatat aagggggtgg gggcgcgttc gtcctcagtc gcgatcgaac actcgagccg 60 agcagacgtg cctacggacc g 81 <210> 64 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0070 <400> 64 cggccggggc cgcattcctg ggggccgggc ggtgctcccg cccgcctcga taaaaggctc 60 cggggccggc ggcggcccac gagctacccg gaggagcggg aggcg 105 <210> 65 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0053 <400> 65 caccgcctgc tgccacggcc ggccgtataa atagaggcga ggagcagctg ggctctcttg 60 gcagtcacc 69 <210> 66 <211> 392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP0321 <400> 66 taagtccggg cagggtcctg tccataaaag gcttttcccg ggccggctcc ccgccggcag 60 cgtgccccgc cccggcccgc tccatctcca aagcatgcag agaatgtctc ggcagccccg 120 gtagactgct ccaacttggt gtctttcccc aaatatggag cctgtgtgga gtcactgggg 180 gagccggggg tggggagcgg agccggcttc ctctagaggt ccctatatgg ttgtgttaga 240 gtgaacggcc agcttcagcc cgtctttgct ccttgtttgg gaagcgagtg ggaggggatc 300 agagcaaggg gctatataac ccttcagcgt tcagcctccc gggacaccac ccacccagag 360 tggagaagcc cagccagtcg ctgtcagcca cc 392 <210> 67 <211> 216 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0031 <400> 67 taagtccggg cagggtcctg tccataaaag gcttttcccg ggccggctcc ccgccggcag 60 cgtgccccgc cccggcccgc tccatctcca aagcatgcag agaatgtctc ggcagccccg 120 gtagactgct ccaacttggt gtctttcccc aaatatggag cctgtgtgga gtcactgggg 180 gagccggggg tggggagcgg agccggcttc ctctag 216 <210> 68 <211> 176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE0037 <400> 68 aggtccctat atggttgtgt tagagtgaac ggccagcttc agcccgtctt tgctccttgt 60 ttgggaagcg agtgggaggg gatcagagca aggggctata taacccttca gcgttcagcc 120 tcccgggaca ccacccaccc agagtggaga agcccagcca gtcgctgtca gccacc 176 <210> 69 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Luc2 forward primer <400> 69 acgctgggct acttgatc 18 <210> 70 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Luc2 reverse primer <400> 70 caagaatagc tcctcctcg 19 <210> 71 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGapdH forward primer <400> 71 acggcaaatt caacggcac 19 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGapdH reverse primer <400> 72 tagtggggtc tcgctcctgg 20 <210> 73 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Luc2 probe <400> 73 tttcgggtcg tgctcatg 18 <210> 74 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGapdH probe <400> 74 ttgtcatcaa cgggaagccc atca 24

Claims (23)

  1. 하기를 포함하는 합성 근육 특이적 프로모터:
    a) 서열 번호 1~29 및 66 중 어느 하나에 따른 서열 또는 이의 기능적 변이체; 또는
    b) 서열 번호 30~47 중 어느 하나에 따른 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 시스-조절 모듈(cis-regulatory module: CRM).
  2. 제1항에 있어서,
    서열 번호 1~29 및 66 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는, 합성 근육 특이적 프로모터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 CRM은 서열 번호 30~47 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 것인, 합성 근육 특이적 프로모터.
  4. 제3항에 있어서,
    프로모터 요소에 작동 가능하게 연결된 상기에 제시된 바와 같은 CRM을 포함하는, 합성 근육 특이적 프로모터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기능적 변이체는 참조 프로모터의 활성의 적어도 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%를 보유하는 것인, 합성 근육 특이적 프로모터.
  6. 서열 번호 48~61 및 47 중 어느 하나에 따른 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 근육 특이적 시스-조절 요소(cis-regulatory element: CRE).
  7. 제6항에 있어서,
    서열 번호 48~61 및 67 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는, 근육 특이적 CRE.
  8. 제6항 또는 제7항에 따른 CRE를 포함하는 합성 근육 특이적 프로모터.
  9. 서열 번호 62~65 및 68 중 어느 하나에 따른 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 단리된 최소 또는 근위 프로모터.
  10. 제9항에 있어서,
    서열 번호 62~65 및 68 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는, 단리된 최소 또는 근위 프로모터.
  11. 제9항 또는 제10항에 따른 최소 또는 근위 프로모터를 포함하는 합성 근육 특이적 프로모터.
  12. 발현 산물을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 제1항 내지 제5항, 제8항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 합성 근육 특이적 프로모터를 포함하는 발현 카세트.
  13. 제1항 내지 제5항, 제8항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 합성 근육 특이적 프로모터 또는 제12항에 따른 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  14. 제13항에 있어서,
    AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  15. 제14항에 따른 벡터를 포함하는 비리온.
  16. 제1항 내지 제5항, 제8항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 합성 근육 특이적 프로모터, 제12항에 따른 발현 카세트, 제13항 또는 제14항에 따른 벡터 또는 제15항에 따른 비리온을 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항, 제8항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 합성 근육 특이적 프로모터, 제12항에 따른 발현 카세트, 제13항 또는 제14항에 따른 벡터, 제15항에 따른 비리온 또는 제16항에 따른 약제학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제5항, 제8항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 합성 근육 특이적 프로모터, 제12항에 따른 발현 카세트, 제13항 또는 제14항에 따른 벡터 또는 제15항에 따른 비리온을 포함하는 세포.
  19. 의학적 병태 또는 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항, 제8항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 합성 근육 특이적 프로모터, 제12항에 따른 발현 카세트, 제13항 또는 제14항에 따른 벡터, 제15항에 따른 비리온 또는 제16항에 따른 약제학적 조성물.
  20. 발현 산물을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 제12항에 따른 합성 근육 특이적 발현 카세트를 근육 세포에 제공하는 단계 및 상기 합성 근육 특이적 발현 카세트에 존재하는 유전자를 발현시키는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 근육 세포에서 치료학적 이식 유전자를 발현시키는 방법으로서, 상기 방법은 제12항에 따른 합성 근육 특이적 발현 카세트, 제13항 또는 제14항에 따른 벡터 또는 제15항에 따른 비리온을 상기 근육 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 이를 필요로 하는 대상체, 바람직하게는 사람의 치료 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 대상체의 치료 방법:
    제1항 내지 제5항, 제8항 및 제11항 중 어느 한 항에 따른 프로모터에 작동 가능하게 연결된 치료학적 산물을 인코딩하는 서열을 포함하는, 제12항에 따른 발현 카세트, 제13항 또는 제14항에 따른 벡터, 제15항에 따른 비리온 또는 제16항에 따른 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계; 및
    상기 대상체의 근육에서 치료학적 양의 치료학적 산물을 발현시키는 단계.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 치료학적 양의 치료학적 산물은 골격근 및/또는 심근에서 발현되는 것인, 대상체의 치료 방법.
KR1020247002456A 2021-06-23 2022-06-23 조절 핵산 서열 KR20240023643A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB2108997.4 2021-06-23
GBGB2108997.4A GB202108997D0 (en) 2021-06-23 2021-06-23 Regulatory nucleic acid sequences
GB202111317 2021-08-05
GB2111317.0 2021-08-05
PCT/GB2022/051611 WO2022269269A1 (en) 2021-06-23 2022-06-23 Regulatory nucleic acid sequences

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240023643A true KR20240023643A (ko) 2024-02-22

Family

ID=82655313

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020247002456A KR20240023643A (ko) 2021-06-23 2022-06-23 조절 핵산 서열

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP4359548A1 (ko)
KR (1) KR20240023643A (ko)
AU (1) AU2022297795A1 (ko)
CA (1) CA3221707A1 (ko)
IL (1) IL309630A (ko)
WO (1) WO2022269269A1 (ko)

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US6221349B1 (en) 1998-10-20 2001-04-24 Avigen, Inc. Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells
US6200560B1 (en) 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
WO2005047505A2 (en) 2003-08-07 2005-05-26 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods and products for expression of micro rnas
US20050142581A1 (en) 2003-09-04 2005-06-30 Griffey Richard H. Microrna as ligands and target molecules
WO2005056761A2 (en) 2003-12-05 2005-06-23 Massachusetts Institute Of Technology REAGENTS AND METHODS FOR IDENTIFICATION OF RNAi PATHWAY GENES AND CHEMICAL MODULATORS OF RNAi
KR100614827B1 (ko) 2004-05-06 2006-08-25 재단법인서울대학교산학협력재단 양방향 은닉 마코프 모델을 이용한 완숙한마이크로알엔에이 위치예측방법 및 이를 구현하기 위한컴퓨터 프로그램을 기록한 저장매체
JP6626829B2 (ja) * 2014-01-21 2019-12-25 フレイエ ユニヴェルシテイト ブリュッセルＶｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ 筋特異的核酸調節エレメント並びにその方法及び使用
EP4065596A2 (en) * 2019-11-28 2022-10-05 RegenxBio Inc. Microdystrophin gene therapy constructs and uses thereof
US20230233710A1 (en) * 2019-12-24 2023-07-27 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Regulatory nucleic acid sequences
IL300367A (en) * 2020-08-05 2023-04-01 Asklepios Biopharmaceutical Inc Methods for the treatment of heart disorders and heart failure and administration of AAV vectors
CA3195177A1 (en) * 2020-10-07 2022-04-14 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus delivery of fukutin related protein (fkrp) for treating dystroglycanopathy disorders including limb girdle 2i (lgmd2i)

Also Published As

Publication number Publication date
IL309630A (en) 2024-02-01
CA3221707A1 (en) 2022-12-29
AU2022297795A1 (en) 2024-01-04
EP4359548A1 (en) 2024-05-01
WO2022269269A1 (en) 2022-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6825167B2 (ja) アデノ随伴ウイルス変異キャプシドおよびその使用方法
US20230233710A1 (en) Regulatory nucleic acid sequences
CA2909733C (en) Effective delivery of large genes by dual aav vectors
US9422576B2 (en) Cell capable of producing adeno-associated virus vector
CA3091806A1 (en) Novel adeno-associated virus (aav) vectors, aav vectors having reduced capsid deamidation and uses therefor
KR20210124969A (ko) 근이영양증의 치료를 위한 조합 요법
US20220096606A1 (en) Compositions and Methods for Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy
JP2022507402A (ja) 肝特異的ウイルスプロモーター及びその使用方法
CA3129321A1 (en) Modulation of rep protein activity in closed-ended dna (cedna) production
JP2023510799A (ja) 併用療法のためのウイルスベクター
TW202221127A (zh) 新穎aav衣殼及含有其之組成物
KR20240023643A (ko) 조절 핵산 서열
CN117957326A (zh) 调控核酸序列
EP4389899A1 (en) Regulatory nucleic acid sequences
WO2024133793A1 (en) Regulatory nucleic acid sequences
US20240200093A1 (en) Artificial regulatory cassettes for muscle-specific gene expression
JP2021007395A (ja) 脂肪組織に形質導入するのに有用なアデノ随伴ウイルスベクター
WO2024126762A2 (en) Recombinant adeno-associated virus gene therapy vectors with reduced liver tropism and enhanced transduction of cardiac cells for the therapy of heart diseases and diseases associated with heart dysfunction
CN115702246A (zh) 调节性核酸序列