JP2023510799A - 併用療法のためのウイルスベクター - Google Patents

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Abstract

本明細書に記載の本発明は、２つ以上のＧＤＩを共発現する遺伝子治療ベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。本発明のベクターは、いくつかの遺伝性疾患、例えば、トリヌクレオチドリピート伸長障害を治療するために広く使用され得る。
【選択図】なし

Description

関連出願の参照
本出願は、２０２０年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／９５９，２５６号、及び２０２０年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／９６２，３０６号の優先権を主張する。それらの全内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
本出願はまた、参照することにより、２０１８年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／７７８，６４６号、及び２０１２年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／７７８，６４６号の優先権を主張する２０１９年１２月１１日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８号を組み込む。
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、進行性衰弱及び筋肉量の損失を引き起こす疾患群である。筋ジストロフィーでは、異常遺伝子（突然変異遺伝子）は、健康な筋肉を形成するために必要な機能性の野生型タンパク質を産生しない。
筋ジストロフィーは、罹患患者の生活の質を深刻に悪化させる。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、新生男児の５，０００人に１人が罹患する最も深刻な筋肉疾患の１つである。これは、ジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）のメンバーをコードする遺伝子の突然変異に起因する最もよく特徴付けられた筋ジストロフィーである。これらのＭＤは、ＤＡＰＣによる筋細胞膜鞘－細胞骨格連結の喪失に関連する膜の脆弱性に起因する。
具体的には、ＤＭＤはＤＭＤ遺伝子の突然変異によって引き起こされ、ＤＭＤのｍＲＮＡの減少及びジストロフィンまたは機能的ジストロフィン、すなわち、ジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）に関連する４２７ｋＤａの筋細胞膜鞘タンパク質の欠如につながる（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５１（６）：９１９－９２８，１９８７）。ＤＡＰＣは、筋細胞膜鞘において、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び細胞骨格間に、ジストロフィン、すなわち、アクチン結合タンパク質、及びアルファ－ジストログリカン、すなわち、ラミニン結合タンパク質を介した構造的関連を形成する複数のタンパク質で構成されている。これらの構造的関連は、収縮時に筋細胞膜を安定させ、収縮による損傷を防ぐように作用する。
ＤＭＤ遺伝子突然変異の結果としてのジストロフィンの損失により、ジストロフィン糖タンパク質複合体が破壊され、筋膜の脆弱性が増加する。筋形質へのカルシウムの流入、プロテアーゼ及び炎症性サイトカインの活性化、ならびにミトコンドリア機能不全等の一連の事象は、進行性の筋変性をもたらす。さらに、神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）の転位は、組織虚血、酸化ストレスの増加、及び修復の障害に寄与する。疾患の進行は、筋壊死、線維化、及び脂肪組織置換の増加、ならびにその後の筋生検で見られる線維サイズの変化の程度がより大きいことによって特徴付けられる。
蓄積されたエビデンスは、細胞内Ｃａ２＋（Ｃａ２＋ ｉ）の異常な上昇が、ＤＭＤにおける疾患の進行を開始し、永続させる重要な早期の病原性事象であることを示唆している。筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）ポンプの正常機能は、サイトゾルからの＞７０％のＣａ２＋除去及び適切な筋収縮の主要因である。ＳＥＲＣＡ活性の低下は、それ故、ＤＭＤにおけるＣａ２＋ ｉ過負荷及び筋機能不全の主な原因と考えられている。
現在のところ、ＤＭＤの治療法はない。標準治療としては、コルチコステロイド（プレドニゾンまたはデフラザコート等）を投与し、筋力及び機能を安定させること、独立歩行を延長させること、ならびに脊柱側彎及び心筋症を遅延させること、ビスホスフォネート、ならびにデノスマブ及び組み換え副甲状腺ホルモンが挙げられる。
遺伝子治療の出現により、ＤＭＤ治療の研究及び臨床試験は、ジストロフィン機能を少なくとも部分的に回復させることを目的とした遺伝子置換または他の遺伝子治療に焦点を合わせている。これらには、ジストロフィン遺伝子の機能性コピー、例えば、ジストロフィンミニ遺伝子の供給、またはエクソンスキッピング及びナンセンス変異抑制による欠陥ジストロフィン遺伝子産物の修復が含まれる。
しかしながら、ジストロフィンの突然変異によって引き起こされる影響の範囲は広いため、ジストロフィンの一次突然変異に関連する他の二次的症状を治療する必要がある。
例えば、ジストロフィンの損失は、ジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）の損失につながり、これは次に、ｎＮＯＳによる一酸化窒素（ＮＯ）の産生、及びＨＤＡＣ２の異常なＮ－ニトロシル化につながる。かかる異常にＮ－ニトロシル化されたＨＤＡＣ２は、クロマチンから解離し、特定のマイクロＲＮＡのカスケードの阻害を解放し、これが次に、線維化及び酸化ストレスの増加等の多数の下流の事象につながる。
特に、線維化に関しては、ジストロフィンが損失すると、膜の脆弱性により、筋細胞膜鞘の分裂及びカルシウムの流入が生じ、カルシウム活性化プロテアーゼ及び分節状線維壊死を誘発する（Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０（２）：１６８－１７５，１９９７）。この制御不能な筋変性と筋再生のサイクルは、最終的に筋幹細胞集団を枯渇させ（Ｓａｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４３（７）：１０５９－１０７１，２０１０、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ７１：３７－５７，２００９）、進行性筋衰弱、筋内膜炎症、及び線維性瘢痕を引き起こす。
ジストロフィンまたはマイクロジストロフィンによる膜安定化がないため、ＤＭＤでは、制御不能な組織の傷害と修復のサイクルが現れ、最終的に結合組織の増殖を介して、失われた筋線維が線維性瘢痕組織で置き換わる。
ＤＭＤと診断された最低年齢（例えば、４～５歳）で行われた筋生検は、顕著な結合組織の増殖を明らかにしている。筋線維症は、様々な点で有害である。それは、結合組織バリアを介した筋内膜栄養素の正常な通過を減らし、血流を減らし、筋肉から血管由来の栄養成分を奪い、機能的には、四肢拘縮による歩行の早期喪失の一因となる。時間の経過とともに、筋肉の著しい線維化による治療の課題が増加する。これは、連続した時点での結合組織の増殖を比較する筋生検で観察され得る。この過程は悪化を続け、歩行の喪失につながり、特に、車椅子に依存している患者では、加速して制御不能になる。
従って、線維性浸潤は、ＤＭＤでは深刻であり、任意の治療の可能性を妨げる重大な障害である。この関連で、単独の遺伝子置換療法は、ＤＭＤの幼児にすでに存在する重度の線維化によって通常は妨げられる。
線維症は、コラーゲン及びエラスチン等のＥＣＭ基質タンパク質の過剰な沈着を特徴とする。ＥＣＭタンパク質は主に、サイトカイン、例えば、ストレス及び炎症に反応して活性化した線維芽細胞によって放出されるＴＧＦから産生される。ＤＭＤの主な病理学的特徴は、筋線維の変性及び壊死であるが、病理学的帰結としての線維症は、同等の影響を与える。線維性組織の過剰産生は、筋再生を制限し、ＤＭＤ患者の進行性筋衰弱の一因となる。
ある研究では、最初のＤＭＤ筋生検での線維化の存在が、１０年間の追跡調査での運動転帰不良と高度に相関した（Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ６８（７）：７６２－７６７，２００９）。これらの結果は、線維化がＤＭＤの筋機能不全の主要原因であることを示しており、線維性組織を減少させる治療法を開発する必要性を強調している。
ｍｄｘマウスで試験されたほとんどの抗線維化治療は、ＴＧＦ経路の阻害を通じて線維化サイトカインのシグナル伝達をブロックするように作用する。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２２ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡであり、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内の塩基と対合することにより転写後レベルで遺伝子抑制を仲介し、翻訳を阻害するか、またはｍＲＮＡの分解を促進する。該ｍｉＲＮＡの５’末端にある７ｂｐのシード配列は、該ｍｉＲＮＡを標的とし、さらなる認識は、該標的配列の残部及びその二次構造によって提供される。ｍｉＲＮＡは筋疾患の病理において重要な役割を果たし、問題の筋ジストロフィーの型に独自に依存する発現プロファイルを示す（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４（４３）：１７０１６－１７０２１，２００７）。相次ぐエビデンスは、心臓、肝臓、腎臓、及び肺等の多くの臓器でｍｉＲＮＡが線維化過程に関与していることを示唆している（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４（４３）：１７０１６－１７０２１，２００７）。
最近、ｍｉＲ－２９の下方制御が心筋線維化に寄与することが示された（Ｃａｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ １２（４）：３４１－３５１，２０１０）。ｍｉＲ－２９の発現低下は、ヒトＤＭＤ患者の筋肉と遺伝的に関連していた（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４（４３）：１７０１６－１７０２１，２００７）。
ｍｉＲ－２９ファミリーは、２つのバイシストロン性ｍｉＲＮＡクラスターから発現する３つのファミリーメンバーからなる。ｍｉＲ－２９ａは、ｍｉＲ－２９ｂ（ｍｉＲ－２９ｂ－１）と共発現し、ｍｉＲ－２９ｃは、ｍｉＲ－２９ｂの第二のコピー（ｍｉＲ－２９ｂ－２）と共発現する。ｍｉＲ－２９ファミリーは、保存されたシード配列を共有しており、ｍｉＲ－２９ａとｍｉＲ－２９ｂは、各々、ｍｉＲ－２９ｃと１塩基異なるのみである。さらに、ｍｄｘマウス筋へのｍｉＲ－２９プラスミド（ｍｉＲ－２９ａ及びｍｉＲ－２９ｂ－１のクラスター）のエレクトロポレーションは、ＥＣＭ成分、コラーゲン及びエラスチンの発現レベルを低下させ、処理後２５日以内で筋肉部位におけるコラーゲン沈着を大幅に減少させた（Ｃａｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ １２（４）：３４１－３５１，２０１０）。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、約４．７ｋｂの長さであり、１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む。
ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的な独自の機能を有する。培養細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は無症状及び無症候である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳類細胞に感染するため、インビボで多くの異なる組織を標的にすることが可能になる。さらに、ＡＡＶは、分裂が遅い細胞及び非分裂細胞への形質導入を引き起こし、基本的にそれらの細胞の生涯にわたって、転写活性のある核エピソーム（染色体外因子）として存続することができる。ＡＡＶのプロウイルスゲノムは、プラスミドにクローン化されたＤＮＡとして感染性であり、これにより、組み換えゲノムの構築が可能になる。さらに、ＡＡＶの複製、ゲノムのカプシド形成及び組み込みを指示するシグナルはＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれているため、該ゲノムの内部約４．３ｋｂの一部またはすべて（複製及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）は、外来ＤＮＡ、例えば、プロモーター、目的のＤＮＡ及びポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセットと交換され得る。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、ｔｒａｎｓで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、これが非常に安定した豊富なウイルスであるということである。アデノウイルスの不活化に使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐えるため、ＡＡＶの低温保存はそれほど重要ではない。ＡＡＶは、凍結乾燥される場合もある。最後に、ＡＡＶに感染した細胞は、重複感染に対して耐性はない。
複数の研究により、筋肉では、長期（＞１．５年）の組み換えＡＡＶ媒介タンパク質発現が実証された。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８：６５９－６６９（１９９７）、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）、及びＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２：６１９－６２３（２０００）及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ４：２１７－２２２（２００１）も参照のこと。さらに、筋肉は高度に血管新生されているため、組み換えＡＡＶ形質導入により、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：５８０４－５８０９（１９９７）及びＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載の通り、筋肉注射後の体循環において導入遺伝子産物が出現した。さらに、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正確な抗体グリコシル化、フォールディング、及び分泌に必要な細胞因子を有することを示し、筋肉は、分泌タンパク質治療の安定発現が可能であることを示している。
ＡＡＶベクターを使用した遺伝子治療は、この部門への多大な投資を奨励しているが、商業化には重要な課題が残る。組み換えウイルスベクターの生産は複雑であると考えられており、生産のスケールアップは技術的に大きな課題であり、商業化には大きな障壁であると見なされる。
具体的には、ＡＡＶベースのウイルスベクターについて報告されている臨床用量は、治療領域に応じて、患者あたり１０１１～１０１４のゲノム粒子（ベクターゲノム、ｖｇ）に及ぶ。従って、より広い遺伝子治療開発の観点から、現在のスケールアップアプローチは、後の相（例えば、第ＩＩ／ＩＩＩ相）の追跡を進めるために必要な投与回数を供給するには不十分であり、ひいては、遺伝子治療薬の開発を遅らせている。これは、臨床試験の大部分が非常に小規模で、患者数＜１００人（場合によっては＜１０人）で行われ、ごくわずかな量の製品を生成する接着細胞トランスフェクション過程を使用しているという事実によって裏付けられている。後の相の進展に必要なウイルスの予測量を現在の生産性（例えば、単一の１０層セルファクトリーから５×１０１１ｖｇ）と比較すると、このアプローチが、「標準」遺伝子治療の適応症はもちろん、高用量及び小患者コホートの超希少疾患であっても後の相に対する材料要件及び市場のニーズには不十分であるという現実の懸念がある。
Ｃｌｅｍｅｎｔ及びＧｒｉｅｇｅｒが最近の総説（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１６）３，１６００２、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１６．２）で述べているように、「臨床環境でのｒＡＡＶの使用は、極めて大量の高純度ｒＡＡＶ粒子の生成が可能な生産及び精製システムに対する差し迫ったニーズを強調している。典型的なＦＤＡ承認治験薬には、毒物学、安全性、用量、及び生体内分布の評価のための広範な前臨床研究が含まれており、ベクターの要件は、多くの場合、１Ｅ１５～１Ｅ１６のベクターゲノムの範囲に達する。かかる量を製造することは、技術的には実現可能であるが、現在の生産システムを用いた場合、依然として信じられないほどの努力を意味する。」
この問題は、体系的に（局所的にの対語として）送達されることが望ましいＡＡＶベクターの場合に特に緊急である。最近の論文において、Ａｄａｍｓｏｎ－Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１６）３，１６０３１、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１６．３１）は、以下のように述べている。「ベクターの生産及び精製における現在の制約は、特に、全身投与が検討される場合、臨床候補ベクターの広範な実施を妨げる。…これは、しばしば高ＡＡＶ用量での全身投与に依存する全身への遺伝子導入が必要になる可能性がある場合、筋ジストロフィー等の先天性遺伝性疾患の治療に特に当てはまる。」実際、筋ジストロフィーの臨床試験におけるｒＡＡＶの以前の研究では、全身投与を支援するために必要な量を生成するための大規模な生産能力が多くの場合不足しているために、筋肉注射を介してベクターを送達している。併用療法における２つのＡＡＶベクターの体系的送達は、その併用療法に必要な高品質のＡＡＶベクターを十分な量生産するという点で、さらに大きな課題をもたらす。
従って、ＤＭＤ及び他の筋ジストロフィーに罹患した患者の機能改善には、遺伝子の回復及び線維化等のいくつかの二次カスケードに関連する症状の軽減の両方が必要である。代替的にまたはさらに、筋ジストロフィーは、異なる疾患の原因となる経路を同時に標的とする治療から利益を得る可能性がある。より効果的なＤＭＤ及び他の筋ジストロフィーの治療のための遺伝子回復法と組み合わせられ得るかかる二次カスケード症状（例えば、線維化）を軽減する方法が必要である。かかる併用療法は、特に、遺伝子治療ベクターの体系的送達において、両方の治療成分を標的組織に送達するのに十分な量の遺伝子治療ベクターを生産するという重要な臨床的及び商業的課題もまた克服しなければならない。
本明細書に記載される本発明は、遺伝子治療のためのウイルスベクターで、第一のポリペプチドまたは第一のＲＮＡ（「第一の転写および／または発現ユニットまたはカセット」）と、第一の転写および／または発現カセットに関していわゆる「分岐カセット」から発現される第二のポリペプチドまたは第二のＲＮＡ（「第二の転写および／または発現ユニットまたはカセット」）とを同時にコードするポリヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを提供し、ここで、分岐カセットは、第一および第二のポリペプチドおよび／またはＲＮＡのそれぞれの発現のための別個の独立した制御を与え、異なる転写および／または発現ユニットまたはカセット間の転写干渉は最小限であるか、または全くない。したがって、本発明のウイルスベクターは、「分岐ベクター」と呼ばれることがある。特定の態様では２つの転写および／または発現ユニットまたはカセットがそれぞれ、それ自体の独立した制御要素またはプロモーターの制御下にある。特定の態様では、２つの独立した制御要素またはプロモーターが反対方向に作用する。例えば、各々はその最も近い末端反復配列（例えば、ＡＡＶベクター中のＩＴＲ配列）に向かって（から離れて、とは反対に）転写する。
本明細書で使用される場合、「第一の」および「第二の」転写カセットまたは単位は、２つの転写カセットのうちのいずれか１つを、第一の転写カセットまたは第二の転写カセットと呼ぶことができるという意味で、相対的な用語である。したがって、ある特定の例の下に記載される「第一の転写カセット」は、異なる例の下に記載される別の「第一の転写カセット」と必ずしも同一または同等ではない。
本発明は、１つ以上のコード配列が特定の位置に、例えば、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のための制御要素またはプロモーターと最も近いＩＴＲとの間に位置する、いわゆる「分岐カセット」（下記参照）に、挿入され得るという驚くべき発見に部分的に基づいている。機能性タンパク質（例えば、ジストロフィンミクロ遺伝子またはミニ遺伝子産物）および１つまたは複数のコード配列の両方は機能性タンパク質（例えば、ジストロフィンミニ遺伝子産物）のみまたは１つまたは複数のコード配列のみを包含する同様のベクター構築物と比較して、発現の有意な減少なしに、感染した標的細胞（例えば、筋細胞）の内部で発現され得る。特定の態様では、分岐カセットからの１つまたは複数のコード配列の発現が同じコード配列をウイルスベクターの他の部分、例えばＧＯＩの異種イントロンまたは３’－ＵＴＲに挿入することと比較して大幅に増加する。
本明細書で使用される場合、「転写および／または発現ユニットまたはカセット」は、少なくとも制御要素、コード配列、および転写終結配列を含む。各転写および／または発現ユニットまたはカセット中のコード配列は、タンパク質、ポリペプチド、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはそれらの前駆体など）、アンチセンス配列、遺伝子編集酵素のためのガイド配列、またはｍｉＲＮＡ阻害剤などのいずれかを独立してコードすることができる。コード配列は、プロモーター、および場合により１つ以上のエンハンサー、またはＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ ＩＩまたはＰｏｌ ＩＩＩを含む）による転写を開始または影響するためのものであり、コード配列によってコードされるものが何であっても転写され得る他の制御要素を含む制御要素に作動可能に連結され、その制御下にある。コード配列はまた、転写が所望に応じて終結され得るように、下流の転写終結配列（例えば、Ｔ６転写終結配列）に作動可能に連結される。
本明細書で使用される場合、２つ以上の転写単位および／またはカセットが反対／分岐／多方向に動作する構築物は、「分岐構築物」と呼ばれる。
具体的には、本発明のウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベースのウイルスベクターまたはレンチウイルスベースのウイルスベクター）は２つの転写および／または発現ユニットもしくはカセットのそのような配置、またはウイルスプラスミドベクターバックボーン中の分岐構築物を有し、「分岐ベクター」と称される。
例えば、本発明のベクターは第一の転写カセットから発現される第一の治療剤（例えば、タンパク質）と、分岐カセットから発現される第二の治療剤（例えば、ＲＮＡ）とを同時にコードし得る。
第一および第二（分岐）発現単位および／またはカセットへの言及は、２つのＧＯＩのいずれも、発現ユニットおよび／またはカセットのいずれかから発現させることができるよう相対的であることを理解されたい。例えば、一態様では、ミクロジストロフィンコード配列が第一または第二（分岐）発現カセットから発現させることができる。別の態様では、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどのいずれも、第一または第二（分岐）発現カセットから発現させることもできる。さらに、発現ユニット／カセットの両方を使用して、本明細書に記載のタンパク質または非タンパク質産物（ｍｉＲＮＡまたはその前駆体など）を発現させることができる。
すなわち、第一または第二のＲＮＡのいずれか、または両方は、タンパク質またはポリペプチドを産生しない非コードＲＮＡであり得る。そのような非コードＲＮＡはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、ｓｈＲＮＡ（短ヘアピンＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｘｉｓｔ及びＨＯＴＡＩＲのような長鎖ｎｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、又はそれらの前駆体であり得、好ましくは治療的価値を有するもの、例えば、癌、自閉症、アルツハイマー病、軟骨毛髪形成不全症、難聴、及びＰｒａｄｅｒ－Ｗｉｌｌｉ症候群、特にＤＭＤ／ＢＭＤを含む種々のタイプの筋ジストロフィー（ＭＤ）に関連するものであり得る。
そのような非コードＲＮＡはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質の単一または複数のガイドＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ（以前はＣｐｆ１）タンパク質のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であり得る。
さらに、２つの転写ユニット／カセットは、生物学的に無関係であるか、または生物学的機能に関して何らかの関連がある産物（タンパク質、ペプチド、ＲＮＡなど）を発現するために使用され得る。例えば、コードされた／発現された産物の一方は疾患または状態における欠陥遺伝子産物の機能を置き換えることができ、他方のコードされた／発現された産物は別々の生物学的経路に作用することができ、したがって、２つの産物が送達され、望ましくは相加的または相乗的な生物学的および治療的効果をもたらす。筋ジストロフィーを治療する文脈において、例えば、コード化／発現された産物の１つは失われたジストロフィン機能を補うジストロフィン（μＤｙｓなど）の機能バージョンであり得、一方、他のコード化／発現された産物は線維症などのジストロフィン機能の喪失に関連する副作用に拮抗し得る。
したがって、一側面では本発明がａ）作動可能に連結された第一の制御要素の制御下で第一の目的の遺伝子（第一のＧＯＩ）を発現するための第一の転写カセットと、ｂ）作動可能に連結された第二の制御要素の制御下で、第二の目的の遺伝子（第二のＧＯＩ）を発現するための第二の転写カセットとを含む組換えウイルスベクターを提供し、前記第一の転写カセットおよび前記第二の転写カセットは配列が重複せず、前記第一の制御要素および前記第二の制御要素は互いから離れる、反対方向に、それぞれ、第一のＧＯＩおよび第二のＧＯＩを転写する。
すなわち、第一の転写カセットおよび第二の転写カセットは独立して、逆方向／分岐方向に、好ましくはそれぞれ最も近い末端反復配列（例えば、ＡＡＶのＩＴＲ）に転写を向ける、それら自体の転写制御要素／プロモーターの制御下にある。
特定の態様では、第一の目的の遺伝子が疾患または状態に欠陥がある野生型または正常遺伝子（例えば、コドン最適化野生型または正常遺伝子）をコードし、第二の目的の遺伝子は疾患または状態に欠陥がある前記遺伝子の産物を標的とするアンタゴニストをコードする。
ある特定の態様では、第一の目的の遺伝子がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３ａ～１３ｄ）をコードし、前記第二の目的の遺伝子は標的配列にそれぞれ特異的な１つまたは複数のガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９のｓｇＲＮＡ、またはＣａｓ１２ａのｃｒＲＮＡ）をコードする。
特定の態様では、第一の目的の遺伝子および第二の目的の遺伝子が疾患または状態の治療に有益な異なる経路で機能する産物をコードする。
ある特定の態様では、組換えウイルスベクターにおいて、ａ）第一のＧＯＩは下流のタンパク質コード配列、タンパク質コード配列の下流の３’－ＵＴＲコード領域、およびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ）の発現を増強する異種イントロン配列を含み； ｂ）第二のＧＯＩは独立して以下をコードする１つ以上のコード配列を含む：タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、遺伝子編集酵素のガイド配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および／またはｍｉＲＮＡ阻害剤；ならびに、ｃ）場合により、第一のＧＯＩの異種イントロン配列および／または３’）および／またはｍｉＲＮＡ阻害剤を含む。
特定の態様では、本発明がａ）筋ジストロフィーを治療するのに有効なものなどの、目的の機能的遺伝子またはタンパク質（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチドであって、３’－ＵＴＲコード領域を含み、ポルヌクレオチドによってコードされる機能的タンパク質の発現を増強する異種イントロン配列に対して直ちに３’であるポリヌクレオチド； ｂ）ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、その発現を駆動する第一の制御要素（例えば、筋特異的制御要素）；およびｃ）第一の制御要素と最も近いウイルス末端配列（例えば、ＡＡＶ中のＩＴＲ）との間に挿入され、第二の制御要素に作動可能に連結された１つまたは複数のコード配列；および（２）任意選択でイントロン配列または３’－ＵＴＲコード領域にさらに挿入された１つまたは複数のコード配列を含む組換えウイルスベクターを提供し；ここで、前記１つまたは複数のコード配列は独立して、タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、ａ． 遺伝子編集酵素のガイド配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａのａｃｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および／またはｍｉＲＮＡ阻害剤。
特定の態様では、組換えウイルスベクターが組換えＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクターまたは組換えレンチウイルスベクターである。
特定の態様では本発明がａ）筋ジストロフィーを治療するのに有効な機能性タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、３’－ＵＴＲコード領域を含み、ポルヌクレオチドによってコードされる機能性タンパク質の発現を増強する異種イントロン配列に対して直ちに３’であるポリヌクレオチド； ｂ）ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、その発現を駆動する筋特異的制御要素；およびｃ）筋特異的制御要素と最も近いＡＡＶ ＩＴＲとの間に挿入され、第二の制御要素に作動可能に連結された１つまたは複数のコード配列；および（２）場合によりイントロン配列または３’－ＵＴＲコード領域にさらに挿入された１つまたは複数のコード配列を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを提供し、ここで、前記１つまたは複数のコード配列は独立して、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および／またはｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする。
特定の態様では、本明細書に記載される本発明がａ）機能性マイクロジストロフィンタンパク質（例えば、ミクロＤ５）をコードするジストロフィンミクロ遺伝子またはミニ遺伝子であって、３’－ＵＴＲコード領域を含み、ジストロフィンミクロ遺伝子またはミニ遺伝子の発現を増強する異種イントロン配列に対して直ちに３’であるジストロフィンミクロ遺伝子またはミニ遺伝子； ｂ）ジストロフィンミクロ遺伝子またはミニ遺伝子に作動可能に連結され、発現を駆動する筋特異的制御要素；およびｃ）筋特異的制御要素と最も近いＡＡＶ ＩＴＲとの間に挿入され、第二の制御要素に作動可能に連結された１つまたは複数（例えば、１つ、２ アンチセンス配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および／またはｍｉＲＮＡ阻害剤。
特定の態様では、第二の制御要素が１つまたは複数のコード配列を転写するプロモーターまたはプロモーターの一部である。例えば、第二の制御要素は、第一の制御要素と最も近いウイルス末端配列との間に挿入された１つ以上のコード配列を、場合により第一の制御要素によって開始される転写と反対の方向に転写するｐｏｌ ＩＩプロモーターである。他の態様では、第二の制御要素がｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。他の態様では、第一の制御要素および第二の制御要素は両方とも同じプロモーターである。他の態様では、第一および第二の制御要素が異なるプロモーターである。
特定の態様では機能的ジストロフィンタンパク質がミクロＤ５であり、および／または筋肉特異的制御要素／プロモーターはＣＫプロモーターである。
特定の態様では、１つまたは複数のコード配列が機能性タンパク質をコードまたは発現しない転写カセットに挿入される。ある特定の態様では、１つまたは複数のコード配列が３’－ＵＴＲコード領域にさらに挿入されるか、または機能性タンパク質をコードまたは発現する転写カセットのポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ）の後に挿入される。
特定の態様では、機能的ＧＯＩの発現が１つまたは複数のコード配列の存在下では実質的に影響を受けない（例えば、前記１つまたは複数のコード配列を含まない他の点では同一の対照構築物と比較して）。
ある特定の態様では、第一のＧＯＩがｗｔまたは正常なＳＥＲＰＩＮＡ１コード配列（例えば、コドン最適化ＳＥＲＰＩＮＡ１コード配列）であり、第二のＧＯＩはＳＥＲＰＩＮＡ１の変異対立遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）をコードする。
特定の態様では、ＳＥＲＰＩＮＡ１の変異対立遺伝子がピッツバーグ対立遺伝子、Ｂ（Ａｌｈａｍｂｒａ）対立遺伝子、Ｍ（Ｍａｌｔｏｎ）対立遺伝子、Ｍ（Ｈｅｅｒｌｅｎ）対立遺伝子、Ｍ（Ｍｉｎｅｒａｌ Ｓｐｒｉｎｇｓ）対立遺伝子、Ｍ（ｐｒｏｃｉｄａ）対立遺伝子、Ｉ（Ｎｉｃｈｉｎａｎ）対立遺伝子、Ｐ（Ｌｏｗｅｌｌ）対立遺伝子、ヌル（Ｇｒａｎｉｔｅ ｆａｌｌｓ）対立遺伝子、ヌル（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ）対立遺伝子、ヌル（Ｍａｔｔａｗａ）対立遺伝子、ヌル（ｐｒｏｃｉｄａ）対立遺伝子、ヌル（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ １）対立遺伝子、ヌル（Ｂｏｌｔｏｎ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ対立遺伝子、Ｖ（アウクスブルク）対立遺伝子、Ｗ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）対立遺伝子、ヌル（Ｄｅｖｏｎ）対立遺伝子、ヌル（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ）対立遺伝子、Ｚ（Ｗｒｅｘｈａｍ）対立遺伝子、ヌル（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ ２）対立遺伝子、ヌル（Ｒｉｅｄｅｎｂｕｒｇ）対立遺伝子、カルシェカー－ポラー対立遺伝子、Ｐ（Ｄｕａｒｔｅ）対立遺伝子、ヌル（Ｗｅｓｔ）対立遺伝子、 Ｓ（Ｉｉｙａｍａ）対立遺伝子、またはＺ（Ｂｒｉｓｔｏｌ）対立遺伝子。
ある特定の態様では第一のＧＯＩが５’－ＵＴＲおよび／または変異ＳＥＲＰＩＮＡ１とは異なる３’－ＵＴＲを有するＳＥＲＰＩＮＡ１のコドン最適化ｗｔコード配列または正常コード配列であり、ＲＮＡｉ剤は５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、および／またはＳＥＲＰＩＮＡ１のコドン最適化ｗｔ対立遺伝子ではなく変異体に特異的に関連するコード配列標的配列を標的とする。
特定の態様では、第一の制御要素および／または第二の制御要素がＡｐｏＥエンハンサーおよびα１－アンチトリプシンプロモーターなどの肝臓特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。
特定の態様では、第一のＧＯＩが反復伸長障害（ＲＥＤ）に欠陥のある遺伝子のｗｔまたは正常なコード配列（例えば、ＲＥＤに欠陥のある遺伝子のコドン最適化ｗｔまたは正常なコード配列）であり、第二のＧＯＩはＲＥＤに欠陥のある遺伝子の変異対立遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）をコードする。
ある特定の態様ではＲＥＤが（５２超の）ＣＡＧトリヌクレオチド反復を有する変異ＡＴＸＮ３遺伝子から生じる脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）であり、ＲＮＡｉ剤はＡＴＸＮ３のｗｔ対立遺伝子ではなく変異体に特異的に関連するＳＮＰを標的とする。
ある特定の態様ではＲＥＤが（５２超の）ＣＡＧトリヌクレオチド反復を有する変異体ＡＴＸＮ３遺伝子から生じる脊髄小脳性運動失調３（ＳＣＡ３）であり、ここで、第一のＧＯＩは変異体ＡＴＸＮ３の５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを有するＡＴＸＮ３のコドン最適化ｗｔまたは正常コード配列であり、ＲＮＡｉ剤はＡＴＸＮ３のコドン最適化ｗｔ対立遺伝子ではなく、変異体に特異的に関連する５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、および／またはコード配列標的配列を標的とする。
特定の態様では、第一の制御要素および／または第二の制御要素がニューロン特異的プロモーターおよび／またはエンハンサー（シナプシンプロモーターなど）、または天然ＡＴＸＮ３プロモーター、またはユビキタスプロモーターを含む。
ある特定の態様ではＲＥＤがそれぞれＳＣＡ１、２、３、６、７、８、１０、１２、または１７であり、ＲＮＡｉ剤はアタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰのｗｔ対立遺伝子ではなく変異体に特異的に関連するＳＮＰを標的とする。
ある特定の態様ではＲＥＤがそれぞれ、アタキシン－１、アタキシン－２、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰのコドン最適化されたｗｔコード配列であり、それぞれ、５’－ＵＴＲおよび／または変異体アタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰのものとは異なる３’－ＵＴＲを有し、ＲＮＡｉ剤は５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、および／または変異体と特異的に関連するコード配列標的配列を標的とするが、これに限定されない。アタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰのコドン最適化ｗｔ対立遺伝子。
ある特定の態様ではＲＥＤが（５０超の）ＣＴＧトリヌクレオチド反復を有する変異ＤＭＰＫ遺伝子から生じる筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）であり、ＲＮＡｉ剤はＤＭＰＫのｗｔ対立遺伝子ではなく変異体に特異的に関連するＳＮＰを標的とする。
ある特定の態様ではＲＥＤが（５０超の）ＣＴＧトリヌクレオチド反復を有する変異ＤＭＰＫ遺伝子から生じる筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）であり、ここで、第一のＧＯＩは変異ＤＭＰＫの５’－ＵＴＲおよび／または変異ＤＭＰＫのそれとは異なる３’－ＵＴＲを有するＤＭＰＫのコドン最適化ｗｔまたは正常コード配列であり、ＲＮＡｉ剤はＤＭＰＫのコドン最適化ｗｔ対立遺伝子ではなく、変異体に特異的に関連する５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、および／またはコード配列標的配列を標的とする。
特定の態様では、第一の制御要素および／または第二の制御要素が筋特異的プロモーターおよび／またはエンハンサー（ＣＫ８プロモーターなど）、または天然ＤＭＰＫプロモーター、またはユビキタスプロモーターを含む。
ある特定の態様では、第一のＧＯＩがｗｔまたはコドン最適化ＭＢＮＬ１遺伝子をコードし、第二のＧＯＩは５０個を超えるＣＴＧトリヌクレオチド反復を有することから生じる筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を欠損するＤＭＰＫ遺伝子の変異対立遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）をコードする。
ある特定の態様ではＲＥＤが（５５超の）ＣＧＧトリヌクレオチド反復を有する変異体ＦＭＲ１遺伝子から生じる脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）であり、ＲＮＡｉ剤はＦＭＲ１のｗｔ対立遺伝子ではなく変異体に特異的に関連するＳＮＰを標的とする。
ある特定の態様ではＲＥＤが（５５超の）ＣＧＧトリヌクレオチド反復を有する変異体ＦＭＲ１遺伝子から生じる脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）であり、ここで、最初のＧＯＩは変異体ＦＭＲ１の５’－ＵＴＲおよび／または変異体ＦＭＲ１のそれとは異なる３’－ＵＴＲを有するＦＭＲ１のコドン最適化ｗｔまたは正常コード配列であり、ＲＮＡｉ剤はＦＭＲ１のコドン最適化ｗｔ対立遺伝子ではなく、変異体に特異的に関連する５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、および／またはコード配列標的配列を標的とする。
特定の態様では、第一の制御要素および／または第二の制御要素がニューロン特異的プロモーターおよび／またはエンハンサー（シナプシンプロモーターなど）、または天然ＦＭＲ１プロモーターを含む。
特定の態様では、第一のＧＯＩが筋肉特異的プロモーター（ＣＫ８プロモーターなど）の制御下で機能的ジストロフィンタンパク質（マイクロＤ５など）をコードする。
いくつかの関連態様において、組換えＡＶ（ｒＡＶ）ベクトルにおいて、ポリ核酸はａ）機能的な５スペクトリンに似たリピートジストリンジストリプロフィンたんぱく質を包含するジストリンミニ遺伝子である（例えば、マイクロＤ５；本文中に記載されている１０，４７９，８２１米ドルに記述されているように、本文中で引用文献）また、ｂ）筋特殊制御要素はジストロフィンミニ遺伝子の表現とうまく結びついており、かつ、推進力となるＣＫプロモーターである。
ある特定の態様では、第二のＧＯＩがジストロフィンのエクソン４５～５５、またはジストロフィンのエクソン４４、４５、５１、および／または５３のいずれか１つなどの、欠陥ジストロフィンのエクソンのスキッピングを誘導するエクソンスキッピングアンチセンス配列を含む。
特定の態様において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－２９ｃ、ｍｉＲ－３０ｃおよび／またはｍｉＲ－２０６である。例えば、マイクロＲＮＡは任意に、標的配列のために設計されたｍｉＲ－２９ｃのガイド鎖のプロセシングを増強する修飾された隣接骨格配列を有するｍｉＲ－２９ｃであってもよい。特定の態様では、修飾隣接骨格配列がｍｉＲ－３０、－１０１、－１５５、または－４５１由来であるか、またはそれに基づく。
特定の態様では、宿主細胞におけるマイクロＲＮＡの発現が宿主細胞におけるマイクロＲＮＡの内因性発現と比較して、少なくとも約１．５～１００倍（例えば、約２～８０倍、約１．５～１０倍、約１５～７０倍、約５０～７０倍、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または約８０倍）上方制御される。
ある特定の態様では、ＲＮＡｉ配列がサルコリピン（ｓｈＳＬＮ）に対するｓｈＲＮＡである。
特定の態様では、１つまたは複数のコード配列がサルコリピン（ｓｈＳＬＮ）に対する１つまたは複数の同一または異なるｓｈＲＮＡをコードする。
特定の態様において、ｓｈＲＮＡは、カルコリピンｍＲＮＡおよび／またはサルコリピン蛋白質発現を少なくとも約５０％低下させる。
特定の態様では、ＧＯＩはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり、ガイド配列はｓｇＲＮＡであるか；またはＧＯＩはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａであり、ガイド配列はｃｒＲＮＡである。
特定の態様では、前記ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、前記アンチセンス配列、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍｉＲＮＡ、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ ｃｒＲＮＡおよび／または前記マイクロＲＮＡは、炎症性遺伝子、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化因子（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＮＦ－κＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ）、ＮＦ－κＢ、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ２）、ＴＧＦ－β、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、エラスチン、細胞外マトリックスの構造成分であるグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ミオスタチンなどの１つ以上の標的遺伝子の機能に拮抗する ホスホジエステラーゼ－５（ＰＥＤ－５）またはＡＣＥ、ＶＥＧＦデコイ受容体１型（ＶＥＧＦＲ－１またはＦｌｔ－１）、および造血プロスタグランジンＤシンターゼ（ＨＰＧＤＳ）などの、１以上の標的遺伝子の機能と拮抗する。
ある特定の態様では、異種イントロン配列は、配列番号１である。
ある特定の態様では、ベクターが血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ １１、ＡＡＶ １２、またはＡＡＶ １３の組換えＡＡＶベクターである。
ある特定の態様ではベクター、例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターにおいて： ａ）ポリヌクレオチドは機能性フクチン（ＦＫＴＮ）タンパク質をコードし；および／またはｂ）１つまたは複数のコード配列が福山先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）患者における欠陥ＦＫＴＮ遺伝子における正しいエクソン１０スプライシングを回復させるエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。
特定の態様ではベクター、例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターにおいて： ａ）ポリヌクレオチドは機能性ＬＡＭＡ２タンパク質をコードする；および／またはｂ）１つまたは複数のコード配列がメロシン欠損先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）患者における欠損ＬＡＭＡ２遺伝子のＣ末端Ｇドメイン（エクソン４５～６４）、特にＧ４およびＧ５の発現を回復させるエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。
特定の態様ではベクター、例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターにおいて： ａ）ポリヌクレオチドは機能性ＤＭＰＫタンパク質、またはＣＬＣＮ１遺伝子をコードする；および／またはｂ）ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は欠損ＤＭＰＫ遺伝子における変異転写物の拡大反復を標的とするか、またはＤＭ１患者におけるＣＬＣＮ１遺伝子におけるエクソン７Ａのスキッピングをもたらすエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。
ある特定の態様ではベクター、例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター、において：ａ）ポリヌクレオチドは、機能性ＤＹＳＦタンパク質をコードする；および／またはｂ）１以上のコード配列は、ジスフェルリノパシー（ＬＧＭＤ２ｂまたはＭＭ）患者における欠陥ＤＹＳＦ遺伝子におけるエクソン３２のスキッピングをもたらすエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。
特定の態様において、ベクター、例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターにおいて：ａ）ポリ核酸ベクタは、機能的ＳＧＣＧたんぱく質をエンコードする；および／またはｂ）１つ以上のコード配列は、ＬＧＭＤ２Ｃ患者において欠陥のあるＬＧＭＤ２Ｃ遺伝子（例えばΔ－５２１Ｔ ＳＧＣＧミューテーションを有するもの）におけるエクソン４－７のスキップにつながるエクソンススキッピングアンチセンス配列をコードする。
特定の態様では、１つまたは複数のコード配列がイントロン配列にさらに挿入される。
特定の態様では、機能的タンパク質の発現が前記１つ以上のコード配列の挿入によって負の影響を受けない。
ある特定の態様では、ベクターが血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ １１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３のベクターである。特定の態様では、ベクターが既知の血清型の誘導体である。特定の態様では、誘導体が所望の組織特異性または指向性、所望の免疫原性プロファイル（例えば、対象患者の免疫系による攻撃を受けない）、または様々な適応症のための薬学的組成物もしくは遺伝子治療のための他の所望の特性を示し得る。
特定の態様では、第一の制御要素（または分岐カセット中のプロモーター）が１つまたは複数のコードＧＯＩ配列を組織特異的な様式で転写するプロモーターまたはプロモーターの一部である。特定の態様では、組織特異的制御要素が筋肉特異的制御要素である。
特定の態様では、筋特異的制御要素が、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格速筋収縮トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋収縮性心臓トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋収縮性トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント、またはグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）である。
特定の態様では、筋肉特異的制御要素がＷＯ２０１７／１８１０１５（参照により本明細書に組み込まれる）の配列番号１０または配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。
本発明の別の側面は、任意のベクター、例えば本発明の組換えウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物を提供する。
特定の態様では、組成物が治療上適合する担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む医薬組成物である。
特定の態様では治療上許容される担体、希釈剤、または賦形剤はｐＨ６．０の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および１ｍＭ塩化マグネシウムを含む滅菌水溶液である。
特定の態様において、組成物は、少なくとも１．６×１０１３個のベクターゲノムを有する約１０ｍＬの水溶液の剤形である。
特定の態様では、組成物が１ミリリットル当たり少なくとも２×１０１２個のベクターゲノムの効力を有する。
本発明の別の側面は対象組成物を産生する方法であって、ベクター、例えば、細胞中の組換えＡＡＶベクターを産生すること、およびベクターを得るために細胞を溶解することを含む方法を提供する。
ある特定の態様では、ベクターがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３ベクターである。
本発明の別の側面はそれを必要とする対象において筋ジストロフィーまたはジストロフィー症を治療する方法を提供し、この方法は対象に、治療有効量の組換えベクター、例えば、本発明の組換えＡＡＶベクター、または本発明の組成物のいずれか１つを投与することを含む。
特定の態様では、筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーである。
特定の態様では、筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）、ジスフェリノパシー、筋強直性ジストロフィー、およびメロシン欠損先天性筋ジストロフィー１Ａ型、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、または肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤＲ５またはＬＧＭＤ２Ｃ）である。
本発明の別の側面はアルファ－１抗トリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）の治療を必要とする対象においてアルファ－１抗トリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）を治療する方法であって、治療有効量の本発明の組換えウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）、またはそのような組換えウイルスベクターを含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
本発明の別の側面はそれを必要とする対象において脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）を治療する方法であって、治療有効量の本発明の組換えウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）、またはそのような組換えウイルスベクターを含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
本発明の別の側面はそれを必要とする対象において筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を治療する方法であって、治療有効量の本発明の組換えウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）、またはそのような組換えウイルスベクターを含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
本発明の別の側面はそれを必要とする対象において脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）を治療する方法であって、治療有効量の本発明の組換えウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）、またはそのような組換えウイルスベクターを含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
特定の態様では組換えベクター、例えば、組換えＡＡＶベクターまたは組成物は筋肉内注射、静脈内注射、非経口投与または全身投与によって投与される。
本発明の別の側面は対象におけるＤＭＤまたは関連／関連疾患などの疾患を予防または治療するためのキットを提供し、キットは１つまたは複数のベクター、例えば、本明細書に記載の組換えＡＡＶ、または本明細書に記載の組成物；使用説明書（書面、印刷、電子／光学記憶媒体、またはオンライン）；および／またはパッケージングを含む。特定の態様において、キットはまた、併用療法のための、疾患（例えば、ＤＭＤ）を処置するための公知の治療組成物を含む。
実施例または特許請求の範囲のみに記載されたものを含む、本明細書に記載された任意の１つの態様はそのような組み合わせが明示的に放棄されるかまたは不適切でない限り、本発明の任意の１つまたは複数の他の態様と組み合わせることができることを理解されたい。
各々が、別々の転写調節因子の制御下で、互いに異なる配向／方向で離れて、別々の転写カセットから発現される第一の目的の遺伝子（ＧＯＩ）及び第二のＧＯＩを包含する本主題の組み換えウイルス（例えば、レンチウイルスまたはＡＡＶ）ベクターの代表的かつ非限定的な態様を示す概略図を示す（正確な縮尺ではない）。ここで、該転写カセットは、配列が重複していない。かかる構築物は、任意の２つ以上のＧＯＩを発現させるために使用することができ、それらの産物は、好ましくは相乗的に協働し、所望の生物学的結果を達成し得る。例えば、該ＧＯＩの１つは、以下に記載のマイクロジストロフィン、ミニジストロフィンまたはジストロフィンミニ遺伝子（例えば、以下に記載の５－スペクトリン様リピートマイクロＤ５ジストロフィンタンパク質、または機能性ＤＭＤ遺伝子（マイクロジストロフィンまたは図面では「μＤｙｓ」として標識される）の型）をコードする場合があり、別のＧＯＩは、タンパク質、ポリペプチド、または非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えば、ｓｈＲＮＡのいずれか１つであり得る１つ以上のさらなるコード配列をコードする場合がある。ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ等のコード配列は、該ベクターの「転写産物」が示されている範囲、例えば、該ＧＯＩの１つに対するプロモーター（図面では、例示的な筋特異的プロモーターＣＫ８として標識される）とその最も近いＩＴＲ配列との間の領域、ＧＯＩの前のイントロン、３’－ＵＴＲ領域、またはポリＡシグナル配列の後に挿入することができる。該さらなるｎｃＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）コード配列は、同じでも異なってもよい。本発明のこれらのいわゆる「分岐／独立」転写産物は、それらのそれぞれの独自の独立したプロモーターから転写され、以下でさらに詳細に記載される。 ヒトｉＰＳ由来心筋細胞における相対的ｍｉＲ－２９ｃ発現レベルの変化（μＤｙｓのみを発現する対照ベクターに対する比）を、ｍｉＲ－２９ｃをコードする様々な組み換えウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターに関して、該ウイルスベクターの単独のコード配列として（「ソロ」構築物）、２０１９年１２月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８に記載の融合構築物の一部として（「融合」構築物）、または本開示の分岐構築物の一部として（「分岐」構築物）のいずれかで示す。 分化したＣ２Ｃ１２筋管または初代マウス心筋細胞におけるｍｉＲ－２９ｃの相対的発現レベルを、ｍｉＲ－２９ｃをコードする様々な組み換えＡＡＶベクターに関して、該ウイルスベクターの単独のコード配列として（「ソロ」構築物）、または本開示の分岐構築物の一部として（「分岐」構築物）のいずれかで示す。 本開示の複数のｓｈＳＬＮ－μＤｙｓ分岐構築物による、対照のレニラ構築物の活性に対して正規化したホタル活性によって測定したマウスＳＬＮルシフェラーゼ構築物レベルの約９０％のノックダウンを示す。比較として、ソロ構築物を使用した結果も示した。最後の２つのサンプルは、ｍＳＬＮノックダウンに対する市販の陰性及び陽性ｓｈＲＮＡ対照である。 分化したＣ２Ｃ１２筋管またはマウス心筋細胞におけるｓｉＳＬＮ（転写ｓｈＳＬＮ由来のプロセスｓｉＲＮＡ産物）の相対的発現レベルを、ｓｈＳＬＮをコードする様々な組み換えＡＡＶベクターに関して、該ウイルスベクターの単独のコード配列として（「ソロ」）、または本開示の分岐構築物の一部として（「分岐」）のいずれかで示す。 ヒトｉＰＳ由来の心筋細胞における、ｓｈｈＳＬＮをコードするいくつかの主題の分岐構築物による最大約９０～９５％のヒトＳＬＮのｍＲＮＡのノックダウンを示す。 初代マウス心筋細胞における、ｓｈｍＳＬＮをコードするいくつかの主題のソロ及び分岐構築物による最大約９０％のマウスＳＬＮのｍＲＮＡのノックダウンを示す。 ヒトｉＰＳ由来の心筋細胞における、いくつかのＨｕｍ－ｓｈＳＬＮ－μＤｙｓ分岐構築物の正規化されたμＤｙｓのｍＲＮＡレベルを示す。 変性アガロースゲルの画像であり、ｍｉＲ－２９ｃまたはｓｈＳＬＮコード配列を有するソロ、融合、及び分岐構築物におけるほぼ無傷のＡＡＶゲノムを示唆している。 ３つのＡＡＶ９カプシドタンパク質ＶＰ１～ＶＰ３すべての比が、ＡＡＶ９ベースのソロ、融合、及び分岐ベクター間で変化しないことを示す。 ＡＡＶ９ベクターで本発明のｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ分岐構築物を用いた左腓腹筋における最大６倍のｍｉＲ－２９ｃの上方制御（上のパネル）、横隔膜における最大５．８倍のｍｉＲ－２９ｃの上方制御（左下のパネル）、及び左心室における最大７．５倍のｍｉＲ－２９ｃの上方制御（右下のパネル）を示す。 ソロまたは分岐ベクターが感染したマウスにおけるｍｉＲ－２９ｃの血漿レベルの上昇を示す。 左腓腹筋において、ｍｉＲ－２９ｃ上方制御分岐ＡＡＶ９ベクターによるＲＮＡ（左のパネル）及びタンパク質（右のパネル）レベルでのμＤｙｓ発現の低下がないことを示す。 ｓｈＳＬＮ－μＤｙｓ分岐構築物のμＤｙｓのみのＡＡＶ９に対するＡＡＶ９媒介性の発現を介した横隔膜における最大７５％のｍＳＬＮのｍＲＮＡの下方制御（上のパネル）、左心房における最大９５％のｍＳＬＮのｍＲＮＡの下方制御（左下のパネル）、及び左腓腹筋における最大８０％のｍＳＬＮのｍＲＮＡの下方制御（右下のパネル）を示す。 ＡＡＶ９のｓｈｍＳＬＮ－μＤｙｓ分岐構築物を介した横隔膜における同様のレベルのμＤｙｓのＲＮＡ／タンパク質発現を示す。同様の結果が心房でも得られた（データは示さず）。 ＡＡＶ９のｓｈｍＳＬＮ－μＤｙｓ分岐構築物を介した舌における同様のレベルのμＤｙｓのタンパク質発現及びｍＳＬＮのｍＲＮＡのノックダウンを示す。 ＡＡＶ９のｍｉＲ－２９ｃソロ及びｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ分岐構築物が血清ＣＫレベルを低下させることを示す。Ｍｉｒ－２９ｃ及びμＤｙｓの共発現は、さらなる血清ＣＫレベルの低下をもたらし得る。 ＡＡＶ９のｓｈｍＳＬＮソロ及び分岐構築物における血清ＣＫレベルを示す。 ＡＡＶ９のｍｉＲ－２９ｃソロ及びｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ分岐構築物が血清ＴＩＭＰ１レベルを低下させることを示す。 いくつかのＡＡＶ９のｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ分岐ベクターまたはＡＡＶ９のｓｈｍＳＬＮ－μＤｙｓ分岐ベクター由来の腓腹筋におけるｍｉＲ－２９ｃまたはｓｈＳＬＮベクターのほぼ同様の生体内分布を示す。 肝臓における、ｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ及びｓｈｍＳＬＮ－μＤｙｓ分岐構築物のμＤｙｓソロ構築物に対して概して低いＡＡＶ９ベクターの力価を示す。 ｍｉＲ－２９ｃ発現分岐ベクターが感染した動物において、血漿ＡＬＴレベルが同程度であることを示しており、肝臓障害が、ある特定の感染動物で観察された肝臓の力価の低下の推定原因ではないことを示唆する。 横隔膜における、本発明の分岐構築物のμＤｙｓ構築物単独に対する追加的な効果を、それらが２つの線維化マーカー遺伝子に与える影響に基づいて示す。
線維化及び細胞内Ｃａ２＋の異常な上昇等の様々な二次カスケード症状を治療するための並行したアプローチがなければ、エクソンスキッピング、終止コドンリードスルー、または遺伝子置換療法の利点が完全に達成される可能性は低い。小分子またはタンパク質補充戦略であっても、筋線維症を含めたかかる二次カスケード事象の症状を軽減するアプローチなしでは失敗する可能性がある。例えば、ＡＡＶマイクロジストロフィンで処理された既存の線維化を有する老齢ｍｄｘマウスにおける以前の研究では、完全な機能回復を達成することができないことが示された（Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２：４９２９－４９３７，２０１３）。また、ＤＭＤ心筋症の進行には心室壁の瘢痕化及び線維化が伴うことも知られている。
本発明は、１つには、患者を治療するための遺伝子治療法に関し、これは、ジストロフィン及びその機能の欠陥を、代替の機能性ジストロフィンミニ遺伝子を提供することによって補償するだけでなく、同じ遺伝子治療ベクターにおいて１つ以上のさらなるコード配列を使用して１つ以上の二次カスケード遺伝子を直接標的とし、ひいては、１つのコンパクトなベクターにて体系的送達用の併用療法を達成する。
実際には、本発明、特に本発明の組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、ＤＭＤの治療に限定されない。本発明は、遺伝子が欠損している他の筋ジストロフィーの治療に適用可能である。例えば、本発明の組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、筋ジストロフィーを治療するための機能性タンパク質及び／または１つ以上のコード配列（非コードＲＮＡ、例えば、ＲＮＡｉ配列、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）を提供することができる。該機能性タンパク質は、筋ジストロフィーの欠陥遺伝子産物の野生型代替物を提供するか、または、非野生型であるにもかかわらず筋ジストロフィーの治療に有効な代替物（例えば、５－スペクトリン様マイクロＤ５ジストロフィンミニ遺伝子産物）を提供する。
さらに、本発明、特に、本発明の組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、筋ジストロフィーの治療にも限定されない。それは、各々が、他方の転写カセットの有無にかかわらず独立した転写制御を受けることができると思われる少なくとも２つの目的の遺伝子（ＧＯＩ１及びＧＯＩ２）を発現させるために使用され得るとともに、該ＧＯＩの発現レベルは、２０１９年１２月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８において先に記載された融合構築物よりも高いと思われ、予想外にはるかに高い場合もあると思われる。
従って、１つの側面では、本発明は、以下を含む組み換えウイルスベクター、例えば、組み換えレンチウイルスまたはＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する：ａ）作動可能に連結された第一の制御要素の制御下で、第一の目的の遺伝子（第一のＧＯＩ）を発現させるための第一の転写カセット、ｂ）作動可能に連結された第二の制御要素の制御下で、第二の目的の遺伝子（第二のＧＯＩ）を発現させるための第二の転写カセット、ここで、該第一の転写カセット及び該第二の転写カセットは、配列が重複しない（転写調節因子、例えば、プロモーター及び／またはエンハンサーを除く）とともに、該第一の制御要素及び該第二の制御要素は、それぞれ、第一のＧＯＩ及び第二のＧＯＩを、互いに反対方向に離れて転写する。
本明細書で使用される、各ＧＯＩは、少なくとも１つの遺伝子産物をコードする。該遺伝子産物は、タンパク質またはペプチド、及び最終的にタンパク質にもペプチドにも翻訳されない可能性がある機能性ＲＮＡ、例えば、ＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、調節ＲＮＡ、またはアンチセンス配列等であり得る。最初に転写されたＲＮＡ遺伝子産物は、細胞内でさらにプロセシングされ、機能性の形態が生じ得る。
さらに、各ＧＯＩは、複数の遺伝子産物をコードし得る。例えば、該転写カセットのいずれかにおいて、タンパク質コード配列は、イントロン及び／またはＵＴＲ領域（例えば、３’ＵＴＲ領域）を含み得る。ある特定の非コードＲＮＡ遺伝子産物に対するコード配列は、該転写カセットの１つの中、例えば、該イントロンまたは該３’ＵＴＲ領域の内部に挿入または埋め込まれ得る。該転写カセットからの最初のＲＮＡ産物の転写後、タンパク質産物をコードする成熟ｍＲＮＡ、及び１つ以上の非コードＲＮＡ遺伝子産物が、細胞内ＲＮＡプロセシング後に生じる。
ある特定の態様では、さらなるＧＯＩ（複数可）（例えば、第三のＧＯＩ）が同じウイルスベクターに、例えば、該第一及び第二の転写カセット間に存在する場合もあれば、（完全にまたは部分的に）該第一及び第二の転写カセットと重複する場合もある。かかるさらなるＧＯＩは、該第一及び第二の転写カセットの転写調節因子に作動可能に連結される場合もあれば、それらの独自の転写調節因子の制御下にある場合もある。
本明細書で使用される、「互いに反対方向に離れて」とは、該第一及び第二の転写カセットにおける鋳型鎖（ＲＮＡポリメラーゼが転写の鋳型として使用する）が、二本鎖ベクターＤＮＡの異なる鎖に存在する（すなわち、該第一の転写カセットに対する鋳型鎖が１つの鎖にあり、該第二の転写カセットに対する鋳型鎖が他方の／相補鎖にある）ことを意味する。さらに、該第一の転写カセットのプロモーターからの転写は、該ＲＮＡポリメラーゼを該第二の転写カセットのプロモーターからさらに離して（それに向かわせるのではなく）移動させ、逆もまた同様である。
ある特定の態様では、該２つの非重複転写カセットは、互いに０、１、５、１０、２０、５０、１００、１５０、または２００ヌクレオチド離れている。
ある特定の態様では、該２つの非重複転写カセットは、互いに約２０～３０ヌクレオチド離れている。
ある特定の態様では、インスレーター配列（例えば、ＣＴＣＦ結合部位）が異なる転写カセットのプロモーター間に挿入され、隣接するプロモーターの相互作用が最小限に抑えられ、及び／または各転写単位の標的特異的発現が高められる。脊椎動物では、インスレーター配列のエンハンサー遮断活性は、ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）の結合部位と関連している。ＣＴＣＦは、普遍的に発現する核タンパク質／進化的に保存された転写因子であり、１１個のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを有する。それは、長い多様なヌクレオチド配列を認識し、遺伝子調節の様々な側面に関与する。
本発明のウイルスベクターの１つの利点は、本主題のベクターのデザイン及び構築、ならびにその標的細胞または組織への送達が、特定の生物学的なニーズに適合するようにカスタマイズ及び／または最適化するためのより多くの機会を与えることである。これは、一部には、複数のコードされたＧＯＩの発現が、独立して別々に複数のレベルで制御され得るという事実に起因する。
例えば、該ベクターの各ＧＯＩは、その独自の転写調節因子、例えば、別々のプロモーター及びエンハンサーを担持し得る。ある特定の態様では、異なる転写カセットに対するプロモーター及び／またはエンハンサーは、同一であり得る。ある特定の他の態様では、異なる転写カセットに対するプロモーター及び／またはエンハンサーは、異なり得る。後者の場合、該ベクターが存在する組織または細胞に応じて、１つのプロモーター／エンハンサーのみが活性化される場合もあれば、異なるプロモーター／エンハンサーが異なる程度に活性化される場合もある。具体的には、ある特定の態様では、１つのプロモーター／エンハンサーは、組織特異的なものであってよく、別のプロモーター／エンハンサーは、普遍的なものであってよい。ある特定の態様では、１つのプロモーター／エンハンサーは、誘導性のものであってよく、別のプロモーター／エンハンサーは、構成的なものであっても、異なる誘導性のものであってもよい。
組織特異的プロモーター及び誘導プロモーターの例は、当技術分野で既知であり、本明細書における以下に記載のものを含む。
ある特定の態様では、ＡＡＶウイルスベクターでは、天然のまたは操作されたウイルスのカプシドタンパク質に基づくＡＡＶの指向性は、選択された／所望の組織または器官での任意のＧＯＩの発現を優先的に標的とするように選択される。
ある特定の態様では、本発明のウイルスベクターは、選択された器官、組織、または細胞型に局所的に（全身的にの対語として）送達され、限られた量のウイルスベクターの所望の標的部位への送達を最大にすることができ、及び／または望ましくない副作用を回避することができる。
本主題のベクターの別の明白な利点は、任意の所与の生体系において、任意の生物学的フィードバックループの存在を考慮に入れることができるということである。例えば、ある特定の状況では、１つの標的遺伝子の活性の調節は、所与の系における既存の生物学的フィードバックループのバランスを補正する可能性があり、望ましくない副作用につながる場合もあれば、さらなる介入のための別の機会を提示する場合もある。そのレベルが以前に達成可能であったものよりはるかに高い可能性がある独立した発現制御の下での第二のＧＯＩの存在は、望ましくない副作用に対抗するための、または相乗効果のある治療選択ではないにしても添加剤を送達するための好機を提供する。
本明細書で論じる多くの利点に一部起因して、本発明の分岐ベクターは、幅広い用途に使用され得る。
以下で詳細に記載するように、ある特定の遺伝性疾患では、内在性遺伝子が欠損または機能不全となり、その遺伝子の正常機能が失われ、置換または補完が必要になる。その一方で、該欠損／機能不全遺伝子は、変異タンパク質をコードし、これは、それ自体が欠陥があるかまたは機能不全であるか、さもなければ、病的状態の原因に寄与する。かかる状況では、単に失われた野生型遺伝子の正常機能を供給するだけでは十分ではない可能性がある。それどころか、該変異タンパク質の悪影響を除去することまたは少なくとも低減することも必要であり得る。
従って、ある特定の態様では、該第一の目的の遺伝子は、疾患または状態では欠陥がある野生型（ｗｔ）または正常遺伝子（例えば、コドン最適化野生型または正常遺伝子）をコードする場合があり、該第二の目的の遺伝子は、該疾患または状態では欠陥のある該遺伝子の（変異）産物を標的とするアンタゴニストをコードする場合がある。
例えば、ある特定の態様では、該第一のＧＯＩは、ｗｔまたは正常ＳＥＲＰＩＮＡ１コード配列（例えば、コドン最適化ＳＥＲＰＩＮＡ１コード配列）であり、該第二のＧＯＩは、ＳＥＲＰＩＮＡ１の変異アレルを標的とするＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）をコードする。
ある特定の態様では、該ＳＥＲＰＩＮＡ１の変異アレルは、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇアレル、Ｂ（Ａｌｈａｍｂｒａ）アレル、Ｍ（Ｍａｌｔｏｎ）アレル、Ｓアレル、Ｍ（Ｈｅｅｒｌｅｎ）アレル、Ｍ（Ｍｉｎｅｒａｌ Ｓｐｒｉｎｇｓ）アレル、Ｍ（ｐｒｏｃｉｄａ）アレル、Ｍ（Ｎｉｃｈｉｎａｎ）アレル、Ｉアレル、Ｐ（Ｌｏｗｅｌｌ）アレル、ヌル（Ｇｒａｎｉｔｅ ｆａｌｌｓ）アレル、ヌル（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ）アレル、ヌル（Ｍａｔｔａｗａ）アレル、ヌル（ｐｒｏｃｉｄａ）アレル、ヌル（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ １）アレル、ヌル（Ｂｏｌｔｏｎ）アレル、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈアレル、Ｖ（Ｍｕｎｉｃｈ）アレル、Ｚ（Ａｕｇｓｂｕｒｇ）アレル、Ｗ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）アレル、ヌル（Ｄｅｖｏｎ）アレル、ヌル（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ）アレル、Ｚ（Ｗｒｅｘｈａｍ）アレル、ヌル（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ ２）アレル、ヌル（Ｒｉｅｄｅｎｂｕｒｇ）アレル、Ｋａｌｓｈｅｋｅｒ－Ｐｏｌｌｅｒアレル、Ｐ（Ｄｕａｒｔｅ）アレル、ヌル（Ｗｅｓｔ）アレル、Ｓ（Ｉｉｙａｍａ）アレル、またはＺ（Ｂｒｉｓｔｏｌ）アレルである。
ある特定の態様では、該第一のＧＯＩは、変異ＳＥＲＰＩＮＡ１のものとは異なる５’－ＵＴＲ及び／または３’－ＵＴＲを有するＳＥＲＰＩＮＡ１に対するコドン最適化ｗｔまたは正常コード配列であり、該ＲＮＡｉ剤は、該変異体に特異的に関連するが、ＳＥＲＰＩＮＡ１のコドン最適化ｗｔアレルには関連しない５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、及び／またはコード配列標的配列を標的とする。
ある特定の態様では、該第一の制御要素及び／または該第二の制御要素は、肝臓特異的プロモーター及び／またはエンハンサー、例えば、ＡｐｏＥエンハンサー及びα１－アンチトリプシンプロモーターを含む。
ある特定の態様では、該第一のＧＯＩは、リピート伸長障害（ＲＥＤ）において欠陥のある遺伝子に対するｗｔまたは正常コード配列（例えば、ＲＥＤにおいて欠陥のある遺伝子に対するコドン最適化ｗｔまたは正常コード配列）であり、該第二のＧＯＩは、ＲＥＤにおいて欠陥のある遺伝子の変異アレルを標的とするＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）をコードする。
ある特定の態様では、該ＲＥＤは、（５２超の）ＣＡＧトリヌクレオチドリピートを有する変異ＡＴＸＮ３遺伝子に起因する脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）であり、該ＲＮＡｉ剤は、該変異体に特異的に関連するが、ＡＴＸＮ３のｗｔアレルには関連しないＳＮＰを標的とする。
ある特定の態様では、該ＲＥＤは、（５２超の）ＣＡＧトリヌクレオチドリピートを有する変異ＡＴＸＮ３遺伝子に起因する脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）であり、該第一のＧＯＩは、該変異ＡＴＸＮ３のものとは異なる５’－ＵＴＲ及び／または３’－ＵＴＲを有するＡＴＸＮ３に対するコドン最適化ｗｔまたは正常コード配列であり、該ＲＮＡｉ剤は、該変異体に特異的に関連するが、ＡＴＸＮ３のコドン最適化ｗｔアレルには関連しない５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、及び／またはコード配列標的配列を標的とする。
ある特定の態様では、該第一の制御要素及び／または該第二の制御要素は、ニューロン特異的プロモーター及び／またはエンハンサー（例えば、シナプシンプロモーター）、または天然のＡＴＸＮ３プロモーターを含む。
ある特定の態様では、該ＲＥＤは、それぞれ、ＳＣＡ１、２、３、６、７、８、１０、１２、または１７であり、該ＲＮＡｉ剤は、該変異体に特異的に関連するが、それぞれ、アタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰのｗｔアレルには関連しないＳＮＰを標的とする。
ある特定の態様では、該ＲＥＤは、それぞれ、ＳＣＡ１、２、３、６、７、８、１０、１２、または１７であり、該第一のＧＯＩは、それぞれ、変異アタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰのものとは異なる５’－ＵＴＲ及び／または３’－ＵＴＲを有する、それぞれ、アタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰに対するコドン最適化ｗｔまたは正常コード配列であり、該ＲＮＡｉ剤は、該変異体に特異的に関連するが、それぞれ、アタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰのコドン最適化ｗｔアレルには関連しない５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、及び／またはコード配列標的配列を標的とする。
ある特定の態様では、該ＲＥＤは、（５０超の）ＣＴＧトリヌクレオチドリピートを有する変異ＤＭＰＫ遺伝子に起因する筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）であり、該ＲＮＡｉ剤は、該変異体に特異的に関連するが、ＤＭＰＫのｗｔアレルには関連しないＳＮＰを標的とする。
ある特定の態様では、該ＲＥＤは、（５０超の）ＣＴＧトリヌクレオチドリピートを有する変異ＤＭＰＫ遺伝子に起因する筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）であり、該第一のＧＯＩは、該変異ＤＭＰＫのものとは異なる５’－ＵＴＲ及び／または３’－ＵＴＲを有するＤＭＰＫに対するコドン最適化ｗｔまたは正常コード配列であり、該ＲＮＡｉ剤は、該変異体に特異的に関連するが、ＤＭＰＫのコドン最適化ｗｔアレルには関連しない５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、及び／またはコード配列標的配列を標的とする。
ある特定の態様では、該第一の制御要素及び／または該第二の制御要素は、筋特異的プロモーター及び／またはエンハンサー（例えば、ＣＫ８プロモーター）、または天然のＤＭＰＫプロモーター、または普遍的なプロモーターを含む。
ある特定の態様では、該第一のＧＯＩは、ｗｔまたはコドン最適化ＭＢＮＬ１遺伝子をコードし、該第二のＧＯＩは、５０超のＣＴＧトリヌクレオチドリピートを有することに起因する筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）において欠陥のあるＤＭＰＫ遺伝子の変異アレルを標的とするＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）をコードする。
ある特定の態様では、該ＲＥＤは、（５５超の）ＣＧＧトリヌクレオチドリピートを有する変異ＦＭＲ１遺伝子に起因する脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）であり、該ＲＮＡｉ剤は、該変異体に特異的に関連するが、ＦＭＲ１のｗｔアレルには関連しないＳＮＰを標的とする。
ある特定の態様では、該ＲＥＤは、（５５超の）ＣＧＧトリヌクレオチドリピートを有する変異ＦＭＲ１遺伝子に起因する脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）であり、該第一のＧＯＩは、該変異ＦＭＲ１のものとは異なる５’－ＵＴＲ及び／または３’－ＵＴＲを有するＦＭＲ１に対するコドン最適化ｗｔまたは正常コード配列であり、該ＲＮＡｉ剤は、該変異体に特異的に関連するが、ＦＭＲ１のコドン最適化ｗｔアレルには関連しない５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、及び／またはコード配列標的配列を標的とする。
ある特定の態様では、該第一の制御要素及び／または該第二の制御要素は、ニューロン特異的プロモーター及び／またはエンハンサー（例えば、シナプシンプロモーター）、または天然のＦＭＲ１プロモーターを含む。
ある特定の態様では、該第一のＧＯＩは、筋特異的プロモーター（例えば、ＣＫ８プロモーター）の制御下で、機能性ジストロフィンタンパク質（例えば、マイクロＤ５）をコードする。
同様に以下で詳細に記載するように、ある特定の遺伝性疾患では、効果的な治療は、特に、第一の目的の遺伝子及び第二の目的の遺伝子が、異なる経路で機能する産物をコードし、さらに両方が、当該疾患または状態の治療に利益をもたらす場合に、わずか１つのベクターを使用して２つの遺伝子を同時に標的化することによって充実し得る。
さらに別の態様では、本発明のベクターは、遺伝子編集のため、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づく任意の使用のために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを標的細胞に送達するために使用され得る。具体的には、該ＧＯＩの１つは、Ｃａｓ酵素、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３ａ～１３ｄをコードし得る。その一方で、他方のＧＯＩは、コードされたＣａｓ酵素と一致する１つ以上のガイドＲＮＡ、例えば、Ｃａｓ９に対するｓｇＲＮＡ、またはＣａｓ１２ａに対するｃｒＲＮＡをコードし得る。
本主題のベクターを使用して行われ得る上記の選択された態様の各々は、以下にさらに記載され、例示されている。
例えば、本発明の特定の分岐ベクターは以下を含み得る：ａ）下流のタンパク質コード配列の発現を高める異種イントロン配列、該タンパク質コード配列の下流の３’－ＵＴＲコード領域、及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ）を含む第一のＧＯＩ、ｂ）独立して、タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、遺伝子編集酵素のガイド配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び／またはｍｉＲＮＡ阻害物質をコードする１つ以上のコード配列を含む第二のＧＯＩ、ならびにｃ）任意に、該第一のＧＯＩの異種イントロン配列及び／または３’－ＵＴＲコード領域に挿入された１つ以上のさらなるコード配列、ここで、該１つ以上のさらなるコード配列は、独立して、タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、遺伝子編集酵素のガイド配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び／またはｍｉＲＮＡ阻害物質をコードするもの。
ある特定の態様では、該第一のＧＯＩ及び／または該第二のＧＯＩの発現は、互いの存在下で実質的に影響を受けない。
関連する態様では、本発明の別の特定の分岐ベクターは、酵素ベースの遺伝子編集システムの２つ以上の成分、例えば、標的ゲノム部位／標的ゲノム配列でＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を創出することができる標的配列特異的（改変）ヌクレアーゼ、及び該（野生型または所望の）標的ゲノム配列と一致するドナーまたは鋳型配列等を同時に送達する／発現させるためのウイルスベクターとして使用することができる。かかるシステムにより、該標的細胞内で内因性相同組み換え（ＨＲ）プロセスを利用して、欠陥のある／望ましくない標的ゲノム配列を削除し、それを所望の標的ゲノム位置で野生型または他の所望の配列と置き換えることが可能になる。
ある特定の態様では、該組み換えウイルスベクターは、組み換えＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクターである。
例えば、該標的配列特異的（改変）ヌクレアーゼとしては、メガヌクレアーゼ（ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのもの等）及び固有の標的ゲノム配列を認識するそのバリアント、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集酵素が挙げられ得る。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの場合、本主題のベクターは、ドナー配列以外の、またはドナー配列に加えて、１つ以上の標的配列（複数可）を標的とするために望ましい配列（複数可）を有する１つ以上の遺伝子編集ガイド配列（複数可）、及び該ウイルスベクターによってＧＯＩとしてコードされ得る適合性の編集酵素を同時に送達することができる。かかるウイルス送達システムを使用して、細胞、組織、または生物に生じる望ましくない配列を所望の配列で置換することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素システムの一例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ（かつてはＣｐｆ１）、及び標的細胞に対して必要な１つ以上のガイド配列（例えば、Ｃａｓ９の場合は一本鎖ガイドＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡ、またはＣａｓ１２ａの場合はｃｒＲＮＡ）である。Ｃａｓ９には、野生型Ｃａｓ９及びその機能性バリアントが含まれる。いくつかのＣａｓ９バリアントは、マイクロジストロフィン遺伝子とほぼ同じサイズであり、本発明のウイルスベクターによってコードされる機能性ＧＯＩであり得る。Ｃａｓ１２ａは、Ｃａｓ９よりもさらに小さく、同様にＧＯＩとしてコードされ得る。ある特定の態様では、該ウイルス構築物によってコードされるＣａｓ遺伝子は、ＵＴＲ及び／またはイントロン要素を有する場合もあれば、有さない場合もある。
ある特定の態様では、該ＧＯＩは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり、該ガイド配列は、ｓｇＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ）であるか、または該ＧＯＩは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａであり、該ガイド配列は、ｃｒＲＮＡである。
ある特定の態様では、該組み換えウイルスベクターは、組み換えＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクターである。
ある特定の態様では、該組み換えウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
従って、関連する側面では、本発明は、エキソビボまたはインビボ遺伝子治療で用いる組み換えレンチウイルスベクターを提供する。エキソビボ遺伝子治療では、培養宿主細胞は、主題のウイルスベクターを使用してインビトロでトランスフェクトされ、目的の遺伝子を発現し、その後、体内に移植される。インビボ遺伝子治療は、遺伝物質を標的組織に挿入する直接的な方法であり、形質導入は患者自身の細胞内で行われる。
ある特定の態様では、本発明のレンチウイルスベクターは、以下を含み得る：ａ）治療を必要とする患者／対象／個体における筋ジストロフィーの治療に有効な機能性遺伝子またはタンパク質（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチド、ここで、該ポリヌクレオチドは、３’－ＵＴＲコード領域を含み、該ポリヌクレオチドによってコードされる機能性タンパク質の発現を高める異種イントロン配列の直接３’にあり、ここで、該機能性タンパク質の対応する野生型は、筋ジストロフィーでは欠損しているか、または、該機能性タンパク質は、野生型ではないにもかかわらず、筋ジストロフィーの治療に有効であるもの、ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、その発現を駆動する第一の制御要素（例えば、筋特異的制御要素）、ならびにｃ）（１）該第一の制御要素とそれに最も近いウイルスの末端配列（例えば、ＡＡＶのＩＴＲ）の間に挿入され、第二の制御要素に作動可能に連結された、及び（２）任意に、さらに該イントロン配列もしくは該３’－ＵＴＲコード領域または該発現カセットの他の場所に挿入された１つ以上のコード配列、ここで、該１つ以上のコード配列は、独立して、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び／またはｍｉＲＮＡ阻害物質をコードするもの。
本明細書で使用される場合、文脈次第で、「融合」という用語は、異なる意味を有する場合があり、融合タンパク質、２つ以上のコード配列（例えば、ＧＯＩのコード配列及び該ＧＯＩの３－ＵＴＲ領域またはイントロン配列に挿入された／埋め込まれた１つ以上のＲＮＡｉ剤のコード配列等）が存在し得る融合ＲＮＡ転写産物、ならびに該ウイルスベクターが該ＧＯＩ及び該１つ以上のＲＮＡｉ剤のコード配列を含む融合構築物等を含む。
重ねて、本明細書で使用される場合、文脈次第で、「分岐」という用語（例えば、「分岐構築物」または「分岐（ウイルス）ベクター」等で使用される）は、当該ウイルス構築物／ベクターに少なくとも２つの転写カセットまたは単位が存在し、一方が（第一の制御要素または第一のプロモーターの制御下で）、第一の転写カセット／単位における１つの（第一の）ＧＯＩ（タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡ等）の転写に関与し、他方の（第二の）ＧＯＩが（第二の制御要素または第二のプロモーターの制御下で）、該第一のＧＯＩ以外の他のコードされた配列、例えば、ｎｃＲＮＡまたは別のタンパク質コード配列の転写に関与し、該２つの転写カセットが、主に互いに別々に独立して作動するという事実を指す。第二の転写カセット／単位は、該第一のＧＯＩの第一の転写単位に対するプロモーターと、その最も近いウイルスベクターの末端配列（例えば、ＡＡＶベクターの最も近いＩＴＲ）との間に位置し得る。ある特定の態様では、該第二の転写単位は、該第一の転写単位の転写方向に対して反対方向に、互いに離れて転写する。
ある特定の態様では、該第二の制御要素は、該１つ以上のコード配列を転写するプロモーターまたはプロモーターの一部である。例えば、該第二の制御要素は、ｐｏｌ ＩＩプロモーターであり、該第一の制御要素とその最も近いウイルスの末端配列との間に挿入された１つ以上のコード配列を、該第一の制御要素によって開始された転写とは反対方向に転写する。他の態様では、該第二の制御要素は、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。他の態様では、該第一及び第二の制御要素は、両方とも同じプロモーターである。他の態様では、該第一及び第二の制御要素は、異なるプロモーターである。
ある特定の態様では、一方のＧＯＩの発現は、他方のＧＯＩの存在のために上方制御または下方制御される（例えば、他方のＧＯＩがない以外は同一の対照構築物と比較して）。
ある特定の態様では、一方のＧＯＩの発現は、他方のＧＯＩ存在下で実質的に影響を受けない。
例えば、ある特定の態様では、インスレーター配列（例えば、ＣＴＣＦ結合部位）が異なる転写カセットのプロモーター間に挿入され、隣接するプロモーターの相互作用が最小限に抑えられ、及び／または各転写単位の標的特異的発現が高められる。
筋ジストロフィーの治療
ある特定の態様では、本発明の分岐ベクターは、一方のＧＯＩが筋ジストロフィーにおいて欠陥のある遺伝子をコードするという場合に、筋ジストロフィーを治療するために使用され得る。
本明細書で使用される、「筋ジストロフィー（ＭＤ）」は、健康な筋肉を形成するのに必要な野生型のタンパク質の産生を妨げる異常な遺伝子または遺伝子突然変異による進行性衰弱及び筋肉量の損失を特徴とする疾患群を含む。ＭＤは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、特に、特定された遺伝子突然変異を有するもの、例えば、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）及びメロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）を含めた後述のもの、ジスフェリン異常症（ＬＧＭＤ２Ｂ及び三好ミオパチー）、筋緊張性ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、例えば、ＬＧＭＤ２Ｃ、ならびに顔面肩甲上腕型（ＦＳＨＤ）を含む。
本明細書で使用される、「患者」、「対象」、及び「個体」は、同義で使用され、本主題の方法で治療される、診断される、及び／または生体試料が取得される哺乳類（例えば、ヒト）対象を含む。通常、該対象は、ＤＭＤ及び本明細書に記載の他の関連疾患、ならびにいくつかの実施形態では、ＤＭＤならびに関連する心筋症及びジストロフィー性心筋症に罹患しているか、または罹患する可能性が高い。特定の実施形態では、対象は、ヒト小児または青年（例えば、１８歳、１５歳、１２歳、１０歳、８歳、５歳、３歳、１歳、月齢６か月、月齢３か月、月齢１か月未満等）である。特定の実施形態では、該小児または青年は男子である。別の特定の実施形態では、対象は、成人（例えば、≧１８歳）、例えば、成年男子である。
完全長ジストロフィン遺伝子は、２．６ｍｂであり、７９エクソンをコードする。１１．５－ｋｂのコード配列が、４２７－ｋＤのタンパク質になる。ジストロフィンは、Ｎ末端ドメイン、桿状ドメイン、システインリッチドメイン、及びＣ末端ドメインを含めた４つの主要なドメインに分割することができる。桿状ドメインは、さらに、２４のスペクトリン様リピート及び４つのヒンジに分割することができる。
機能性「ジストロフィンミニ遺伝子」または「ジストロフィンマイクロ遺伝子」は、２４個未満のスペクトリン様リピート及び遺伝子治療送達ベクター（アデノウイルス及びレンチウイルス）と適合性の１つ以上のヒンジ領域を有し、ＵＳ７００１７６１、ＵＳ６８６９７７７、ＵＳ８５０１９２０、ＵＳ７８９２８２４、ＵＳ１０４７９８２１、及びＵＳ１０１６６２７２（すべて参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。
１つの実施形態では、該筋ジストロフィーは、ＤＭＤまたはＢＭＤであり、該組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターにおいて：ａ）該ポリヌクレオチドは、機能性５－スペクトリン様リピートジストロフィンタンパク質（参照することにより本明細書に組み込まれるＵＳ１０，４７９，８２１に記載のマイクロＤ５ジストロフィンタンパク質等）をコードするジストロフィンミニ遺伝子であり、及び／または、ｂ）該筋特異的制御要素は、ジストロフィンミニ遺伝子に作動可能に連結され、その発現を駆動するＣＫプロモーターである。
本明細書で使用される、「マイクロＤ５」、「ＳＧＴ－００１によってコードされるマイクロジストロフィンミニ遺伝子」、または略して「ＳＧＴ－００１」は、Ｎ末端からＣ末端へ、ヒト完全長ジストロフィンタンパク質のＮ末端アクチン結合ドメイン、ヒンジ領域１（Ｈ１）、スペクトリン様リピートＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３、及びＲ２４、ヒンジ領域４（Ｈ４）、及びＣ末端ジストログリカン結合ドメインを含む特定の改変５リピートマイクロジストロフィンタンパク質を指す。この５リピートマイクロジストロフィン及び関連するジストロフィンミニ遺伝子のタンパク質配列は、ＵＳ１０，４７９，８２１及びＷＯ２０１６／１１５５４３（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ある特定の実施形態では、該ジストロフィンミニ遺伝子は、例えば、特定のスペクトリン様リピート、及び／またはスペクトリン様リピートの数に関してマイクロＤ５とは異なる（例えば、ヒトジストロフィンのスペクトリン様リピートを最低４、５、または６個含み、好ましくは、１、２、または３個の最Ｎ末端及び／または最Ｃ末端リピートを含む）機能性ジストロフィンタンパク質をコードする。該ヒトジストロフィンの１つ以上のスペクトリン様リピートは、ユートロフィンまたはスペクトリン由来のスペクトリン様リピートでも置換され得る。ある特定の実施形態では、該ジストロフィンミニ遺伝子は、ＡＡＶウイルスベクターの５ｋｂのパッケージング制限より小さく、好ましくは、４．９ｋｂ、４．８ｋｂ、４．６ｋｂ、４．５ｋｂ、４．４ｋｂ、４．３ｋｂ、４．２ｋｂ、４．１ｋｂ、または４ｋｂ以下である。
ある特定の実施形態では、該ジストロフィンミニ遺伝子は、例えば、マイクロＤ５に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性であるマイクロジストロフィンタンパク質をコードし、該タンパク質は、マイクロジストロフィン活性を保持する。
ある特定の実施形態では、該マイクロジストロフィンは、マイクロＤマイクロジストロフィンをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。該ポリヌクレオチドは、任意に、哺乳類、例えば、ヒトでの発現用にコドン最適化される。
ある特定の実施形態では、該ヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で、マイクロＤ５マイクロジストロフィン、またはその相補体をコードする核酸配列にハイブリダイズし、機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードする。
「ストリンジェントな」という用語は、当技術分野でストリンジェントであると通常理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に温度、イオン強度、及びホルムアミド等の変性剤の濃度によって決まる。ハイブリダイゼーション及び洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、６５～６８℃の０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、及び４２℃の５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。
よりストリンジェントな条件（より高温度、より低イオン強度、より高ホルムアミド、または他の変性剤等）もまた使用され得るが、ハイブリダイゼーションの速度が影響を受ける。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関係している場合、さらなる例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、３７℃（１４塩基オリゴの場合）、４８℃（１７塩基オリゴの場合）、５５℃（２０塩基オリゴの場合）、及び６０℃（２３塩基オリゴの場合）で６×ＳＳＣ０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄が挙げられる。
非特異的及び／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少させる目的で、他の薬剤をハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液に含めてもよい。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳ０４、（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、及び硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤を使用することもできる。これら添加剤の濃度及び種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更することができる。ハイブリダイゼーションの実験は、通常、ｐＨ６．８～７．４で行われるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨにほとんど依存しない。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい。これらの可変要素に対応し、異なる配列近縁性のＤＮＡにハイブリッドを形成させるため、当業者によってハイブリダイゼーション条件が調整され得る。
さらなるジストロフィンミニ遺伝子配列は、例えば、ＵＳ２０１７／０３６８１９８（参照することにより本明細書に組み込まれる）、及びＷＯ２０１７／１８１０１５（参照することにより本明細書に組み込まれる）の配列番号７に見出すことができる。
ある特定の実施形態では、マイクロＤ５等の任意のジストロフィンミニ遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、本開示のタンパク質配列に基づく任意のものであり得る。好ましくは、該ヌクレオチド配列は、ヒトでの発現用にコドン最適化される。
該マイクロジストロフィンタンパク質は、筋収縮時の筋膜を安定させる。例えば、マイクロジストロフィンは、筋収縮時に衝撃吸収材として機能する。
ある特定の実施形態では、該１つ以上のコード配列のうちの少なくとも１つは、ＤＭＤにおける二次カスケード遺伝子の１つを標的とする。
例えば、ある特定の実施形態では、該１つ以上のコード配列のうちの少なくとも１つは、マイクロＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－２９、特にｍｉＲ２９ｃ、ｍｉＲ－３０ｃ、及び／またはｍｉＲ－２０６をコードする。例えば、ｍｉＲ－２９ｃは、結合組織の３つの主要な成分（例えば、コラーゲン１、コラーゲン３及びフィブロネクチン）を直接減少させ、線維化を低減する。任意に、ある特定の実施形態では、該マイクロＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－２９、特にｍｉＲ２９ｃ、ｍｉＲ－３０ｃ、及び／またはｍｉＲ－２０６は、標的配列用にデザインされたガイド鎖のプロセシングを促進する修飾隣接骨格配列を有する。ある特定の実施形態では、該修飾隣接骨格配列は、ｍｉＲ－３０、－１０１、－１５５、または－４５１に由来する場合もそれに基づく場合もある。
本明細書で使用される、「線維化」は、骨格筋、心筋、肝臓、肺、腎臓、及び膵臓等の損傷時の組織における、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の過剰または無秩序な沈着ならびに異常な修復過程を指す。沈着するＥＣＭ成分には、フィブロネクチン及びコラーゲン、例えば、コラーゲン１、コラーゲン２またはコラーゲン３が含まれる。
本明細書で使用される、「ｍｉＲ－２９」は、ｍｉＲ－２９ａ、－２９ｂ、または－２９ｃのうちの１つを指す。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－２９は、ｍｉＲ－２９ｃを指す。
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、発現したｍｉＲ２９（ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－２９ｂ、またはｍｉＲ－２９ｃ等）は、コラーゲン及びフィブロネクチン遺伝子の３’ＵＴＲに結合し、これら標的遺伝子の発現を下方制御すると考えられる。
別の実施形態では、該１つ以上のコード配列のうちの少なくとも１つは、ＲＮＡｉ配列、例えば、サルコリピンに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）をコードする。該１つ以上のコード配列は、同一または異なるサルコリピンに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）をコードし得る。ある特定の実施形態では、該ｓｈＲＮＡは、サルコリピンのｍＲＮＡ及び／またはサルコリピンタンパク質の発現を少なくとも約５０％減少させる。
本明細書で使用される、「サルコリピン（ＳＬＮ）」、「サルコリピンタンパク質」、「ＳＬＮタンパク質」、「サルコリピンポリペプチド」及び「ＳＬＮポリペプチド」は、同義で使用され、ＳＬＮ遺伝子の発現産物、例えば、アミノ酸配列（ＭＧＩＮＴＲＥＬＦＬＮＦＴＩＶＬＩＴＶＩＬＭＷＬＬＶＲＳＹＧＹ）（配列番号５）、受託番号ＮＰ＿００３０５４．１を有する天然のヒトＳＬＮタンパク質を含む。該用語は、好ましくは、該ヒトＳＬＮを指す。該用語は、バリアントＳＬＮタンパク質を指すために使用される場合もあり、該バリアントは、配列番号５とは、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、または８アミノ酸異なり、任意に、該相違は、残基２～５、１０、１４、１７、２０、及び３０、好ましくは、２～５及び３０にある。該用語は、残基６～２９で配列番号５と同一であるか、または残基６～２９で最大１、２、もしくは３個の保存的置換、例えばＬ→Ｉ及び／またはＩ→Ｖによって異なるバリアントＳＬＮタンパク質を指すために使用される場合もある。任意に、該バリアントＳＬＮは、Ｇ３０Ｑ置換を有する。該バリアントは、天然のＳＬＮタンパク質の機能活性を示し、これには、ＳＬＮのリン酸化、脱リン酸化、ニトロシル化及び／またはユビキチン化、またはＳＥＲＣＡへの結合、及び／または、例えば、ＡＴＰ加水分解に由来するＣａ２＋輸送の脱共役によって、ＳＥＲＣＡによる筋小胞体へのカルシウムの取り込み速度を低下させること、または、エネルギー代謝及び体重増加の調節におけるその役割が含まれ得る。
本明細書で使用される、「ＳＬＮ遺伝子」、「ＳＬＮポリヌクレオチド」、及び「ＳＬＮ核酸」は同義で使用され、天然のヒトＳＬＮコード核酸配列、例えば、該天然のヒトＳＬＮ遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ受託：ＮＭ＿００３０６３．２）、ＳＬＮのｃＤＮＡが転写され得る配列を有する核酸、及び／または前述のものの対立遺伝子バリアント及びホモログ、例えば、本明細書に記載のバリアントＳＬＮのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む。該用語には、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、及びＲＮＡが含まれる。
別の実施形態では、本主題のベクターの１つ以上のさらなるコード配列は、ジストロフィン遺伝子の欠損に起因する二次カスケード事象のうちの１つに関連する任意の他の遺伝子、例えば、炎症遺伝子、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化因子（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＮＦ－κＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ）、及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ））、ＮＦ－κＢ、ＮＦ－κＢによって誘導される下流の炎症性サイトカイン、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ２）、ＴＧＦ－β、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、コラーゲン、エラスチン、細胞外マトリックスの構成成分、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ミオスタチン、ホスホジエステラーゼ－５（ＰＥＤ－５）またはＡＣＥ、ＶＥＧＦデコイ受容体１型（ＶＥＧＦＲ－１またはＦｌｔ－１）、及び造血プロスタグランジンＤシンターゼ（ＨＰＧＤＳ）を標的とし得る。該１つ以上のさらなるコード配列は、上記標的遺伝子の機能に拮抗するＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、及び／またはマイクロＲＮＡであり得る。
本主題の組み換えベクターのデザインは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５）のかかる二次カスケード遺伝子または経路、例えば、ＳＬＮ、マイクロＲＮＡ等を同時に標的とすることができる。
例えば、ある特定の実施形態では、本主題のベクターのさらなるコード配列のうちの１つは、ＳＬＮの発現を下方制御し、ひいては、ＳＥＲＣＡによるカルシウムの再取り込みを増加させることによってジストロフィー筋での二次欠陥である細胞内Ｃａ２＋の異常な上昇を少なくとも部分的に軽減するようにデザインされたＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）またはアンチセンス配列であり得る。
ある特定の代替的な実施形態では、二次カスケード遺伝子の１つを標的とする代わりに、またはそれに加えて、該１つ以上のコード配列のうちの少なくとも１つは、欠陥のある内因性ジストロフィンのエクソン、例えば、ジストロフィンのエクソン４５～５５のいずれか１つ、またはジストロフィンのエクソン４４、４５、５１、及び／または５３のスキッピングを誘導し、ひいては、ジストロフィンミニ遺伝子（例えば、マイクロＤ５）の治療効果をさらに高めるエクソンスキッピングアンチセンス配列でもよい。
本明細書で使用される、「エクソンスキッピング」または「スプライススイッチング」アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）は、ＲＮａｓｅ－Ｈ耐性であるアンチセンス配列の一種であり、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節し、該ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシング欠陥を修正するように作用する。アンチセンスを介したエクソンスキッピング療法では、ＡＯＮは通常、特定のスプライシングシグナルをブロックし、ある特定のエクソンの特異的スキッピングを誘導するように使用される。これが、変異転写産物のリーディングフレームの修正をもたらし、それが、内部欠損であるが部分的に機能性のタンパク質に翻訳され得る。
特定の側面では、本発明は、ジストロフィンミニ遺伝子コード配列（マイクロＤ５／ＳＧＴ－００１等）、及びジストロフィン機能の損失に起因する二次カスケードに関与する１つ以上のさらなる標的遺伝子を標的とするための１つ以上のさらなる配列の両方をコードする組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。かかる構築物は、ジストロフィンミニ遺伝子、ならびに該第一の制御要素または該ジストロフィンミニ遺伝子のプロモーターとそれに最も近いウイルスの末端配列（例えば、ＡＡＶのＩＴＲ）の間に挿入され、第二の制御要素に作動可能に連結された、及び（２）任意に、さらに該ジストロフィンミニ遺伝子の５’の異種イントロン、または該ジストロフィンミニ遺伝子の３’－ＵＴＲ領域に挿入された１つ以上のさらなるコード配列の両方を含む。
具体的には、１つの側面では、本発明は、以下を含む組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する：ａ）機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードするジストロフィンミニ遺伝子、ここで、該ジストロフィンミニ遺伝子は、３’－ＵＴＲコード領域を含み、該ジストロフィンミニ遺伝子の発現を高める異種イントロン配列の直接３’にあるもの、ｂ）該ジストロフィンミニ遺伝子に作動可能に連結され、その発現を駆動する筋特異的制御要素、ならびにｃ）該筋特的制御要素とその最も近いＡＡＶのＩＴＲ配列の間に挿入され、第二の制御要素に作動可能に連結された、及び（２）任意に、さらに該イントロン配列または該３’－ＵＴＲコード領域に挿入された１つ以上（例えば、１、２、３、４、または５つ）のコード配列（複数可）、ここで、該１つ以上のコード配列（複数可）は、独立して、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び／またはｍｉＲＮＡ阻害物質をコードするもの。
例えば、該ｒＡＡＶベクターは、ｍｉＲ－２９（例えば、ｍｉＲ－２９ｃ）を発現するポリヌクレオチド配列、例えば、ｍｉＲ－２９ｃ標的ガイド鎖（ＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＡＧＡ、参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号３）、ｍｉＲ－２９ｃガイド鎖（ＴＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＴＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴＴＡ、参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号４）ならびに天然のｍｉＲ－３０骨格及びステムループ（ＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧ、参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号５）を含むヌクレオチド配列を含み得る。
ｍｉＲ－３０骨格にｍｉＲ－２９ｃのｃＤＮＡを含む例示的なポリヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１７／１８１０１５（参照することにより本明細書に組み込まれる）の配列番号２及び図１に示される。
ある特定の実施形態では、該マイクロＲＮＡ－２９コード配列は、ｍｉＲ－２９ｃをコードする。
ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－２９ｃは、標的配列用にデザインされたｍｉＲ－２９ｃのガイド鎖のプロセシングを促進する修飾隣接骨格配列を任意に有する。例えば、該修飾隣接骨格配列は、ｍｉＲ－３０（ｍｉＲ－３０Ｅ）、－１０１、－１５５、または－４５１のものに由来する場合もそれに基づく場合もある。
ある特定の実施形態では、該マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－３０ｃ、及び／またはｍｉＲ－２０６である。
ある特定の実施形態では、宿主細胞での該マイクロＲＮＡの発現は、該宿主細胞での該マイクロＲＮＡの内因性の発現と比較して、少なくとも約１．５～１５倍（例えば、約２～１０倍、約１．４～２．８倍、約２～５倍、約５～１０倍、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または約１５倍）上方制御される。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、サルコリピン（ＳＬＮ）の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、サルコリピンの機能に拮抗するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）をコードする。例示的なｓｈＳＬＮ配列としては、２０１９年１２月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８の図９及び１０に開示されるもの（例えば、図９の下線付きの配列、及び図１０の強調表示された配列）が挙げられる。さらなる例示的なｓｈＳＬＮ配列としては、ＷＯ２０１８／１３６８８０（参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示される配列番号７～１１が挙げられる。
本発明はまた、１つには、遺伝子治療ベクター、例えば、該１つ以上のコード配列（複数可）、例えば、該ジストロフィンミニ遺伝子を発現するレンチウイルスまたはＡＡＶ、ならびにそれを使用して疾患を治療するための方法、例えば、それを筋肉に送達し、ジストロフィン機能を回復しつつ二次カスケード症状を軽減及び／または予防する方法に関する。
１つの実施形態では、該筋ジストロフィーは、既知の遺伝的欠陥、例えば、フクチン遺伝子またはＦＫＲＰ（フクチン関連タンパク質）遺伝子と関連する先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）である。従って、ある特定の実施形態では、該先天性筋ジストロフィーは、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）である。
先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）は、出生時またはその間近に明らかになる筋ジストロフィーの一群である。ある特定の実施形態では、本発明の方法及びｒＡＡＶは、ＣＭＤ、特に、タイチン（心筋症を伴うＣＭＤ）、ＳＥＰＮ１（デスミン封入を伴うＣＭＤ、もしくは（初期の）脊髄性固縮を伴うＣＭＤ）、インテグリン－アルファ７（インテグリンアルファ７変異を伴うＣＭＤ）、インテグリン－アルファ９（関節過弛緩を伴うＣＭＤ）、プレクチン（家族性接合部型表皮水疱症を伴うＣＭＤ）、フクチン（福山型ＣＭＤもしくはＭＤＤＧＡ４）、フクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）（筋肥大を伴うＣＭＤもしくはＭＤＣ１Ｃ）、ＬＡＲＧＥ（ＭＤＣ１Ｄ）、ＤＯＫ７（筋無力症候群を伴うＣＭＤ）、ラミンＡ／Ｃ（脊髄性固縮及びラミンＡ／Ｃ異常を伴うＣＭＤ）、ＳＢＰ２（脊髄性固縮及びセレンタンパク質欠損を伴うＣＭＤ）、コリンキナーゼベータ（ミトコンドリアの構造的異常を伴うＣＭＤ）、ラミニンアルファ２（メロシン欠損ＣＭＤもしくはＭＤＣ１Ａ）、ＰＯＭＧｎＴ１（Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ筋・眼・脳病）、ＣＯＬＧＡ１、ＣＯＬ６Ａ２、もしくはＣＯＬ６Ａ３（Ｕｌｌｒｉｃｈ ＣＭＤ）、Ｂ３ＧＮＴ１（ウォーカー・ワールブルグ症候群：ＭＤＤＧＡ型）、ＰＯＭＴ１（ウォーカー・ワールブルグ症候群：ＭＤＤＧＡ１型）、ＰＯＭＴ２（ウォーカー・ワールブルグ症候群：ＭＤＤＧＡ２型）、ＩＳＰＤ（ＭＤＤＧＡ３、ＭＤＤＧＡ４、ＭＤＤＧＢ５、ＭＤＤＧＡ６、及びＭＤＤＧＡ７）、ＧＴＤＣ２（ＭＤＤＧＡ８）、ＴＭＥＭ５（ＭＤＤＧＡ１０）、Ｂ３ＧＡＬＮＴ２（ＭＤＤＧＡ１１）、またはＳＧＫ１９６（ＭＤＤＧＡ１２）等の遺伝子に既知の遺伝的欠陥を有するＣＭＤの治療に使用することができる。
従って、本発明のレンチウイルスまたはｒＡＡＶベクターは、治療を必要とする対象のＣＭＤを治療するため、ＣＭＤにおいて欠陥のある野生型遺伝子（上記で挙げたもの等）のいずれか、またはその機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを含み得る。１つ以上のさらなるコード配列は、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、または変異ＣＭＤ遺伝子を排除または修飾するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または該野生型遺伝子機能の喪失によって上方制御される二次カスケード遺伝子をコードし得る。
例えば、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）は、変異ＦＫＴＮ遺伝子が原因であり、該１つ以上のさらなるコード配列は、エクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードし、正しいエクソン１０スプライシングを、該患者における欠陥のあるＦＫＴＮ遺伝子において修復する。
別の例では、該先天性筋ジストロフィーは、６５エクソンのＬＡＭＡ２遺伝子の突然変異によって引き起こされるメロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）である。
従って、本発明のレンチウイルスまたはｒＡＡＶベクターは、機能性ＬＡＭＡ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み得る。該１つ以上のさらなるコード配列は、α－ジストログリカンとの相互作用の仲介にとって最も重要なＬＡＭＡ２のＣ末端のＧドメイン（エクソン４５～６４）、特にＧ４及びＧ５の発現を回復するエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードし得る。例えば、該変異ＬＡＭＡ２遺伝子のエクソン４は、ＭＤＣ１Ａを治療するためにスキップされ得る。
１つの実施形態では、該筋ジストロフィーは、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）、例えば、ＤＭ１またはＤＭ２である。
従って、本発明のレンチウイルスまたはｒＡＡＶベクターは、ＤＭ１における欠陥のある機能性筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）タンパク質、またはＤＭ２における機能性ＣＣＨＣ型ジンクフィンガー核酸結合タンパク質遺伝子（ＣＮＢＰ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み得る。該１つ以上のさらなるコード配列は、ＤＭＰＫ遺伝子またはＣＮＢＰ遺伝子の変異転写産物の伸長リピートを標的とし、ＲＮａｓｅによって分解するために使用することができるＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードし得る。該１つ以上のさらなるコード配列は、ＤＭ１患者のＣＬＣＮ１遺伝子のエクソン７Ａのスキッピングをもたらすエクソンスキッピングアンチセンス配列もコードする場合がある。
１つの実施形態では、該筋ジストロフィーは、ジスフェリン（ＤＹＳＦ）遺伝子の突然変異によって引き起こされるジスフェリン異常症であり、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）及び三好ミオパチー（ＭＭ）を含む。
従って、本発明のレンチウイルスまたはｒＡＡＶベクターは、ＬＧＭＤ２ＢまたはＭＭで欠陥のある機能性ＤＹＳＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み得る。該１つ以上のさらなるコード配列は、ジスフェリン異常症患者で欠陥のあるＤＹＳＦ遺伝子のエクソン３２のスキッピングをもたらすエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする場合もある。
１つの実施形態では、該筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）であり、４つのサルコグリカン遺伝子、すなわち、α（ＬＧＭＤ２Ｄ）、β（ＬＧＭＤ２Ｅ）、γ（ＬＧＭＤ２Ｃ）及びδ（ＬＧＭＤ２Ｆ）遺伝子のうちのいずれか、特に、ＳＧＣＧ遺伝子によってコードされるγサルコグリカン（ＬＧＭＤ２Ｃ）の突然変異によって引き起こされる。
従って、本発明のレンチウイルスまたはｒＡＡＶベクターは、ＬＧＭＤで欠陥のある機能性サルコグリカンタンパク質、例えば、ＬＧＭＤ２Ｃで欠陥のあるＳＧＣＧ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み得る。該１つ以上のさらなるコード配列は、欠陥ＬＧＭＤ２Ｃ遺伝子、例えば、Δ－５２１ＴのＳＧＣＧ変異を有するもののエクソン４～７のスキッピングをもたらすエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする場合もある。
１つの実施形態では、該筋ジストロフィーは、ＤＵＸ４遺伝子の突然変異によって引き起こされる顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。
従って、該１つ以上のさらなるコード配列は、ＤＵＸ４または下流の標的、例えば、ＰＩＴＸ１の発現を低下させるＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする場合もある。
ある特定の実施形態では、該１つ以上のさらなるコード配列は、ＤＵＸ４の３’－ＵＴＲを標的とし、その発現を低下させるエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。これは、ＤＵＸ４コード配列が、完全に該遺伝子の第一のエクソンに位置するため、及び該ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの要素を標的とするエクソンスキッピングが、許容状態のポリアデニル化を妨害するか、またはイントロン１もしくは２のスプライシングを妨害し、ひいては機能性ＤＵＸ４のｍＲＮＡを破壊することができるためである。
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）は、進行性の筋変性によって臨床的に特徴付けられる遺伝性の常染色体優性疾患である。これは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及び筋緊張性ジストロフィーに次いで３番目に多い筋ジストロフィーである。ＦＳＨＤは、４番染色体上のマクロサテライトリピートのサブセットの病原性短縮によって遺伝的に特徴付けられ、ダブルホメオボックスプロテイン４（ＤＵＸ４）遺伝子の異常な発現をもたらす。
ＦＳＨＤには、２つの型、すなわち、ＦＳＨＤ１及びＦＳＨＤ２がある。ＦＳＨＤ１は、全ＦＳＨＤ患者の９５％以上に発症する最も一般的な形態である。遺伝分析により、ＦＳＨＤ１は、４番染色体上のマクロサテライトＤ４Ｚ４リピート配列の遺伝的短縮に関連付けられている。一方、ＦＳＨＤ２は、正常数のＤ４Ｚ４リピートを有するが、代わりに、染色体１８ｐにＳＭＣＨＤ１遺伝子におけるヘテロ接合突然変異、クロマチン修飾因子を含む。ＦＳＨＤ１及びＦＳＨＤ２の患者は、同様の臨床像を共有する。
現在の薬物療法は、ＦＳＨＤを治すものではないが、ＦＳＨＤ症状の管理に焦点を当てており、ミオスタチン阻害物質ラスパテルセプトや抗炎症生物製剤（ＡＴＹＲ１９４０）を含む。抗炎症生物製剤の原則は、ＦＳＨＤ患者の筋病理に一般に見られる炎症を抑制し、表現型の進行を遅らせることである。従って、本主題の１つ以上のコード配列は、ミオスタチンまたは炎症経路の遺伝子に対するＲＮＡｉ試薬またはアンチセンスＲＮＡをコードし得る。それと同時に、該ＲＮＡｉ試薬、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、もしくはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、筋障害性ＤＵＸ４遺伝子及びその下流のｐａｉｒｅｄ－ｌｉｋｅホメオドメイン転写因子１（ＰＩＴＸ１）等の分子の発現をノックダウンするために使用することができる。実際に、インビトロ研究では、アンチセンスオリゴをＦＳＨＤ患者の一次骨格筋細胞に投与し、かつＡＡＶベクターを使用してＤＵＸ４マウスモデルに送達されたＤＵＸ４に対するｍｉＲＮＡを使用することにより、ＤＵＸ４のｍＲＮＡ発現の抑制に成功したことが示されている。さらに、ＰＩＴＸ１発現の抑制の成功は、インビボではすでに全身的に実証されている。
ある特定の実施形態では、該１つ以上のさらなるコード配列は、同じ配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンス）をコードすることができ、ひいては、該さらなるコード配列のコピー数は、投与を考慮して調節または微調整され得る。
ある特定の実施形態では、該１つ以上のさらなるコード配列は、異なる配列をコードして、異なる標的を標的とする場合もあれば、同じ標的を標的とする場合もある。例えば、ある特定の実施形態では、１つのさらなるコード配列は、標的に対するアンチセンスであり、別のさらなるコード配列は、同じ標的に対するｓｈＲＮＡである。代替的に、２つのさらなるコード配列は、両方ともｓｈＲＮＡであるが、それらは、同じ標的の異なる領域を標的とする。
ある特定の実施形態では、該機能性タンパク質、例えば、ジストロフィンミニ遺伝子産物の発現は、該１つ以上のコード配列（複数可）の挿入による悪影響を受けない。
１９９０年代初頭までに、イントロンを含まない多くの導入遺伝子は、インビトロでは組織培養細胞中で完全に発現するものの、インビボ（例えば、該導入遺伝子を有するトランスジェニックマウス）では同じ導入遺伝子の発現ができず、ある特定の異種イントロン配列を、該導入遺伝子のプロモーター及び該（イントロンを含まない）コード配列間に挿入することで、インビボでの導入遺伝子の発現が大きく向上することが分かった。
特に、Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：４７８－４８２， １９９１、参照することにより本明細書に組み込まれる）は、メタロチオネインプロモーター及び成長ホルモン導入遺伝子間に挿入されたいくつかの異種イントロンが、導入遺伝子の発現を改善することを示し、導入遺伝子の発現を改善するための一般的な戦略として、ある特定の異種イントロンの付加を提供した。これらとしては、天然のｒＧＨの第一のイントロン、ラットインスリンＩＩ（ｒＩｎｓ－ＩＩ）遺伝子のイントロンＡ、ｈβＧ遺伝子のイントロンＢ、及びＳＶ４０の小ｔイントロンから選択される異種イントロンが挙げられる。
同様の発見は、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１（６）：３０７０－３０７４，１９９１、参照することにより本明細書に組み込まれる）によっても確認された。彼らは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の細菌遺伝子に連結されたヒトヒストンＨ４プロモーターを有するトランスジェニックマウスにおいて、２３０－ｂＰの異種ハイブリッドイントロンが転写単位に存在することで、ＣＡＴ活性が大きく（該介在配列を正確に削除した類似導入遺伝子と比較して、５～３００倍）向上することを報告した。このハイブリッドイントロンは、アデノウイルスのスプライスドナー及び免疫グロブリンＧのスプライスアクセプターからなり、該動物の広範囲の組織で発現を刺激した。該ハイブリッドイントロンは、組織培養中で組織プラスミノーゲン活性化因子及び第ＶＩＩＩ因子の発現を刺激したため、Ｃｈｏｉは、このマウスで見られた向上は、ＣＡＴに特異的である可能性は低く、代わりにトランスジェニックマウスでの任意のｃＤＮＡの発現に一般に適用可能であると結論付けた。
従って、ある特定の実施形態では、本主題のレンチウイルスまたはｒＡＡＶベクターにおける異種イントロンは、天然のｒＧＨの第一のイントロン、ラットインスリンＩＩ（ｒＩｎｓ－ＩＩ）遺伝子のイントロンＡ、ｈβＧ遺伝子のイントロンＢ、ＳＶ４０の小ｔイントロン、及びＣｈｏｉのハイブリッドイントロンからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、該異種イントロン配列は、以下の配列番号１である：
ＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ。
ある特定の実施形態では、該分岐カセットに（例えば、該ＧＯＩプロモーターとそれに最も近いＡＡＶのＩＴＲの間に）挿入されていることに加えて、該１つ以上のさらなるコード配列は、該異種イントロン配列（配列番号１）にすべて挿入されるか、または該３’－ＵＴＲ領域にすべて挿入されるか、または両方の領域に挿入される。例えば、該マイクロＲＮＡ－２９ｃコード配列は、以下の配列番号２にあるようなイントロンコード配列に挿入することができる：
ＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＣＴＧＴＴＴＴＴＧＴＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＴＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴＴＡＴＧＡＴＧＴＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ。
配列番号２におけるｍｉＲ－２９ｃ配列は、
ＡＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＧＡＧＴＣＴＧＴＴＴＴＴＧＴＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＴＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴＴＡＴＧＡＴＧＴＡＧＧＧＧＧＡ（配列番号３）である。
ある特定の実施形態では、該レンチウイルスまたはｒＡＡＶは、該ポリヌクレオチド（該ジストロフィンミニ遺伝子等）及び該さらなるコード配列（複数可）に隣接する２つのレンチウイルスまたはＡＡＶのＬＴＲ／ＩＴＲ配列をさらに含む。
ある特定の実施形態では、本発明のレンチウイルスまたはｒＡＡＶベクターによってコードされるＧＯＩは、筋特異的制御要素に作動可能に連結され得る。例えば、該筋特異的制御要素は、ヒト骨格アクチン遺伝子素、心筋型アクチン遺伝子素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ｔＭＣＫ（切断型ＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５－１２（合成プロモーター）、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子素、遅筋心筋トロポニンＣ遺伝子素、遅筋トロポニンＩ遺伝子素、低酸素誘導性核内因子、ステロイド誘導性因子、またはグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）であり得る。
ある特定の実施形態では、筋特異的制御要素は、該異種イントロン配列に対して５’であり、これは、該ジストロフィンミニ遺伝子に対して５’であり、これは、翻訳終止コドン（ＴＡＧ等）、ポリＡアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ等）、及びｍＲＮＡ切断部位（ＣＡ等）を含む３’－ＵＴＲ領域を含む。
ある特定の実施形態では、該筋特異的制御要素は、ＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号１０または配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。
ＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号１０：
Figure 2023510799000001
ＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号１１：
Figure 2023510799000002
ある特定の実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターは、ＭＣＫエンハンサーのヌクレオチド配列（参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号１０参照）及び／またはＭＣＫプロモーターの配列（参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１８１０１５の配列番号１１参照）を含む筋特異的制御要素に作動可能に連結され得る。
ある特定の実施形態では、該ｒＡＡＶは、さらに、該ジストロフィンミニ遺伝子及び該さらなるコード配列に作動可能に連結され、それらの転写を駆動することが可能なプロモーターを含む。
例示的なプロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。
ある特定の態様では、該ｒＡＡＶは、さらに、ポリＡ配列を転写ｍＲＮＡに挿入するためのポリＡアデニル化配列を含む。
ある特定の態様では、本発明のｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはＡＡＶ１３のものである。
本発明の別の側面は、ウイルスベクター、例えば、本発明のｒＡＡＶベクターの生成方法を提供し、該方法は、任意のウイルスベクター、例えば、本発明のｒＡＡＶベクターでトランスフェクトされた細胞を培養すること、及び該ウイルス、例えば、ｒＡＡＶ粒子を、該トランスフェクトされた細胞の上清から回収することを含む。
本発明の別の側面は、該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明の組み換えＡＡＶベクターを含むウイルス粒子を提供する。
本発明の別の側面は、筋ジストロフィーにおいて、欠陥があるか、または該筋ジストロフィーの治療に有効な機能性タンパク質（マイクロジストロフィンタンパク質等）、及び１つ以上のさらなるコード配列（複数可）を生成する方法を提供し、該方法は、宿主細胞内で本発明の機能性タンパク質（例えば、マイクロジストロフィン）及び該コード配列産物（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス、マイクロＲＮＡまたはその阻害物質）を共発現する主題の組み換えＡＡＶベクターで宿主細胞を感染させることを含む。
本発明の別の側面は、治療を必要とする対象において筋ジストロフィー（ＤＭＤもしくはＢＭＤ等）またはジストロフィン異常症を治療する方法を提供し、該方法は、治療有効量のウイルスベクター、例えば、本発明の組み換えＡＡＶベクター、または本発明の組成物を該対象に投与することを含む。
本発明は、該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明のＡＡＶベクターを、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤもしくはＢＭＤまたは任意の他のＭＤ、特に、欠陥ジストロフィン関連筋ジストロフィーと診断された患者に、好ましくは、該対象で線維化等の１つ以上の二次カスケード症状が認められる前に、または該対象の筋力が減少する前に、または該対象の筋肉量が減少する前に投与することを企図する。
本発明はまた、該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明のｒＡＡＶを、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤもしくはＢＭＤまたは任意の他のＭＤ、特に、ジストロフィン関連筋ジストロフィーに罹患し、線維化等の１つ以上の二次カスケード症状をすでに発症している対象に投与し、これら対象においてさらなる疾患の進行を防止または減速することを企図する。
本発明の別の側面は、筋ジストロフィーにおいて欠損しているか、または該筋ジストロフィーの治療に有効な機能性タンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、マイクロジストロフィンタンパク質）及び該１つ以上のさらなるコード配列を含む組み換えウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターを提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、機能性マイクロジストロフィンタンパク質、例えば、マイクロＤ５をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを提供する。
該ウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターは、筋特異的プロモーター、例えば、ＭＣＫプロモーター、該ジストロフィン遺伝子の発現を高めるのに有効な異種イントロン配列、該マイクロジストロフィン遺伝子のコード配列、ポリＡアデニル化シグナル配列、これらの配列に隣接するＩＴＲ／ＬＴＲリピートを含み得る。該ウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターは、任意にさらに、細菌宿主での増幅のためのアンピシリン耐性及びプラスミド骨格配列またはｐＢＲ３２２複製起点を含んでもよい。
１つの側面では、本発明の組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはＡＡＶ１３である。
本発明の方法のいずれかでは、該ｒＡＡＶベクターは、筋肉注射または静脈内注射によって投与することができる。
本発明の方法のいずれかでは、該ウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターまたは組成物は、全身投与される。例えば、該ウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターまたは組成物は、注射、注入または移植によって非経口投与される。
本発明の別の側面は、該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明のｒＡＡＶベクターを含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
ある特定の態様では、該組成物は、さらに治療上適合性のある担体または賦形剤を含み得る医薬組成物である。
別の態様では、本発明は、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤまたはベッカー型筋ジストロフィーに罹患した対象を治療するための本主題の機能性タンパク質（例えば、マイクロジストロフィン）及び該１つ以上のさらなるコード配列を共発現するウイルスベクターのいずれか、例えば、ｒＡＡＶベクターを含む組成物を提供する。
本発明の組成物（例えば、医薬組成物）は、筋肉注射または静脈内注射用に製剤化することができる。本発明の組成物は、全身投与用、例えば、注射、注入または移植による非経口投与用に製剤化することもできる。さらに、該組成物のいずれかは、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィー、例えばＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーに罹患した対象に投与するために製剤化される。
さらなる態様では、本発明は、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーに罹患した対象を回復させるための薬剤の調製のための主題の機能性タンパク質（例えば、マイクロジストロフィン）及び該１つ以上のさらなるコード配列を共発現する該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明のｒＡＡＶベクターの使用を提供する。
本発明は、ＤＭＤと診断された患者に対して、１つ以上の二次カスケード症状、例えば、線維化が該対象で認められる前に投与するための薬剤の調製用の該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明のＡＡＶベクターの使用を企図する。
本発明はまた、筋ジストロフィーに罹患し、線維化等の二次カスケード症状をすでに発症している対象に対して該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明のｒＡＡＶを投与し、これら対象において疾患の進行を防止または減速するための薬剤の調製用の該ウイルスベクターのいずれか、例えば、本発明のＡＡＶベクターの使用を企図する。
本発明はまた、筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤ／ＢＭＤの治療用の薬剤の調製のための主題の機能性タンパク質、例えば、マイクロジストロフィン、及び該１つ以上のさらなるコード配列を共発現するウイルスベクター、例えば、本発明のｒＡＡＶベクターの使用を提供する。
本発明の使用のいずれかでは、該薬剤は、筋肉注射用に製剤化することができる。さらに、該薬剤のいずれかは、筋ジストロフィー、例えばＤＭＤまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーに罹患した対象に投与するために製剤化され得る。
本発明はまた、筋ジストロフィー患者において、主題の機能性タンパク質（例えば、マイクロジストロフィン）及び該１つ以上のさらなるコード配列を共発現する遺伝子治療ベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターを提供する。
本明細書に記載の本発明の任意の１つの態様は、実施例にのみまたは上記もしくは下記のセクションの１つにのみ、あるいは本発明の１つの態様に記載の態様を含め、本発明の任意の１つ以上のさらなる側面と組み合わせることができることを理解されたい。
ＡＡＶ
本明細書で使用される、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの標準的な省略形である。アデノ随伴ウイルスは、同時感染するヘルパーウイルスによってある特定の機能が提供される細胞でのみ増殖する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。特徴付けられているＡＡＶには少なくとも１３の血清型が存在する。ＡＡＶの概説及び総説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（参照することにより本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。しかしながら、様々な血清型は、遺伝子レベルでも構造的及び機能的に非常に密接に関連していることがよく知られているため、これらの同じ原則がさらなるＡＡＶの血清型に適用されることが十分に予想される。例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．のｐｐ．１６５－１７４、及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい。例えば、すべてのＡＡＶの血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに示し、すべてが、ＡＡＶ２で発現するような３つの関連するカプシドタンパク質を有する。近縁性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範なクロスハイブリダイゼーションを明らかにするヘテロ二本鎖分析、及び「末端逆位配列」（ＩＴＲ）に対応する末端での類似の自己アニーリングセグメントの存在によってさらに示唆される。同様の感染性パターンもまた、各血清型の複製機能が同様の調整制御下にあることを示唆する。
本明細書で使用される、「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶの末端リピート配列（ＩＴＲ）が隣接する１つ以上の目的のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含むベクターを指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコードし、発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に存在する場合、感染性ウイルス粒子に複製及びパッケージ化され得る。
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド形成されたポリヌクレオチドＡＡＶベクターからなるウイルス粒子を指す。該粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、これは、通常、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と称される。従って、かかるベクターは、ＡＡＶベクター粒子内に含まれるため、ＡＡＶベクター粒子の生成は、ＡＡＶベクターの生成を必然的に含む。
本発明の組み換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子及び核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶのＩＴＲを含む。
ＡＡＶには複数の血清型があり、該ＡＡＶの血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ４５：５５５－５６４（１９８３）に示され、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７５：３３８５－３３９２（１９９４）によって修正された。ともに参照することにより本明細書に組み込まれる。他の例として、ＡＡＶ－１の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７（参照することにより本明細書に組み込まれる）に示され、ＡＡＶ－３の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９（参照することにより本明細書に組み込まれる）に示され、ＡＡＶ－４の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９（参照することにより本明細書に組み込まれる）に示され、ＡＡＶ－５のゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６（参照することにより本明細書に組み込まれる）に示され、ＡＡＶ－６の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２（参照することにより本明細書に組み込まれる）に示され、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６（参照することにより本明細書に組み込まれる）及びＡＸ７５３２４９（参照することにより本明細書に組み込まれる）にそれぞれ示され（ＡＡＶ－８に関しては米国特許第７，２８２，１９９号及び第７，７９０，４４９号も参照のこと）、ＡＡＶ－９のゲノムは、参照することにより本明細書に組み込まれるＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７８：６３８１－６３８８（２００４）に示され、ＡＡＶ－１０のゲノムは、参照することにより本明細書に組み込まれるＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３（１）：６７－７６（２００６）に示され、ＡＡＶ－１１のゲノムは、参照することにより本明細書に組み込まれるＶｉｒｏｌｏｇｙ ３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に示される。ＡＡＶｒｈ７４血清型は、参照することにより本明細書に組み込まれるＲｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．５：４５（２００７）に記載されている。
ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶのＤＮＡは、組み換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からのものであってもよく、これには以下に限定されないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、及びＡＡＶ－２ｉ８が含まれる。
偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、参照することにより全体として本明細書に組み込まれるＷＯ０１／８３６９２に開示されている。
他の型のｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシドの突然変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野で既知である。
ある特定の実施形態では、骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶｒｈ．７４が使用され得る。
ある特定の実施形態では、本主題のＡＡＶベクターのＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ９である。
ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組み込みを指示するシス作用性配列は、ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的なマップ位置からｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と呼ばれる）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。
これら２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、単一のＡＡＶイントロン（例えば、ＡＡＶ２ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）の選択的スプライシングを伴って、該ｒｅｐ遺伝子由来の４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的に該ウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。
ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、該３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。
単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、該ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。
本発明のＤＮＡプラスミドは、本発明のｒＡＡＶゲノムを含む。該ＤＮＡプラスミドは、該ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子に組み立てるため、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅｌ欠失アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を感染させることができる細胞に移入される。パッケージ化されるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を生成する技術は、当技術分野では標準的である。ｒＡＡＶの生成は、単一の細胞（本明細書ではパッケージング細胞を意味する）内に以下の成分が存在することが必要である：ｒＡＡＶゲノム、該ｒＡＡＶゲノムとは別の（すなわち、ｒＡＡＶ内ではない）ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能。該ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組み換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からのものであってもよく、ｒＡＡＶゲノムのＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型、すなわち、以下に限定されないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２及びＡＡＶ－１３等からのものでもよい。
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子生成に必要なすべての成分を安定的に発現する細胞株を創出することである。例えば、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子が欠如したｒＡＡＶゲノムを含むプラスミド（または複数のプラスミド）、ｒＡＡＶゲノムとは別のＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびに選択可能なマーカー、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、細菌のプラスミドに、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７９：２０７７－２０８１，１９８２）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２３：６５－７３，１９８３）等の手順によって、または直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：４６６１－４６６６，１９８４）によって導入されている。該パッケージング細胞株を次にアデノウイルス等のヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、これらの細胞が選択可能であること及びｒＡＡＶの大規模生産に適していることである。
適切な方法の他の例では、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、ｒＡＡＶゲノム及び／またはｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入する。
ｒＡＡＶ生成の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５３３－１５３９，１９９２、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９，１９９２）に概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２，１９８４、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６４６６，１９８４、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１，１９８５、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３，１９８８、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９，１９８８、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２－３８２８，１９８９、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５、及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０，１９９５、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５，１９９３、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２，１９９６、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、ｒＡＡＶの生成に関連する該文書のセクションに特に重点を置いて、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、本発明のＡＡＶベクターは、Ａｄａｍｓｏｎ－Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１６）３，１６０３１；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１６．３１、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載の方法、すなわち、高力価及び高品質のアデノ随伴９型ベクターを、ＨＳＶプラットフォームを使用して生産するための拡張性のある方法に従って生産される。これは、完全単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベースの生産及び精製方法であり、１０層のＣｅｌｌＳＴＡＣＫのＨＥＫ２９３生成細胞あたり１×１０１４を超えるｒＡＡＶ９ベクターゲノム、または最終的な完全に精製された生成物中、細胞あたり１×１０５を超えるベクターゲノムを生成することが可能である。これは、トランスフェクションベースの方法に比べて５～１０倍の増加を表す。さらに、この方法によって生産されたｒＡＡＶベクターは、トランスフェクションベースの生産と比較して、高い形質導入単位対ベクターゲノム比及び低い空対充実比によって示される総カプシドタンパク質量の減少によって示される感染性の増加を含め、改善された生物学的特性を示した。この方法は、大規模医薬品安全性試験実施基準（ＧＬＰ）ならびに製造管理及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）のｒＡＡＶ９ベクターの生産に容易に適用することもでき、前臨床及び臨床試験を可能にし、後の相及び商業生産に向けたプラットフォームを構築する。この研究ではＡＡＶ９が使用されたが、この方法は、他の血清型にも拡張可能である可能性が高く、前臨床研究、初期相の臨床試験、ならびに遺伝子疾患及び障害に対する遺伝子治療ベースの薬物の大規模な世界的開発の間のギャップを埋めるはずである。
本発明は、従って、感染性ｒＡＡＶを生成するパッケージング細胞を提供する。１つの実施形態では、パッケージング細胞は、安定に形質転換されたがん細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞及びＰｅｒＣ．６細胞（同族２９３系統）であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥｌで形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎仔肺細胞）である。
本発明の組み換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド形成ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。例示的な実施形態では、両方のｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐのＤＮＡを欠き、換言すれば、該ゲノムのＩＴＲ間に、ＡＡＶのｒｅｐのＤＮＡもｃａｐのＤＮＡも存在しない。本発明の核酸分子を含むように構築され得るｒＡＡＶの例は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号（ＷＯ２０１３／０１６３５２）に記載されている。
該ｒＡＡＶは、当技術分野で標準的な方法、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製する方法は、当技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（６）：１０３１－１０３９，１９９９、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６９：４２７－４４３，２００２、米国特許第６，５６６，１１８号及びＷＯ９８／０９６５７に開示されている方法を含む。
該ＡＡＶウイルスベクターの指向性は、部分的に、ＧＯＩが発現される意図された標的器官または組織に基づいて選択され得る。以下の表は、選択されたＡＡＶの血清型の指向性の概要を示し、所与の器官の形質導入に最適な血清型（複数可）を示している。
Figure 2023510799000003
例えば、ＡＡＶｐｏｌは、ブタから単離され、マウスへの直接の筋肉内注射後、効果的に筋肉を形質導入することが分かった。それは、末梢注入から、心臓及び横隔膜を含めたすべての主要な筋組織を確実に形質導入するその能力のため、概して筋肉の遺伝子治療に有用である。
ある特定の実施形態では、ＡＡＶの指向性は、異なるＡＡＶ血清型からのカプシド及びゲノムを混合することによるシュードタイピングを介してさらに洗練される。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５からのカプシドにパッケージ化された血清型２のゲノムを含むウイルスを示す。該偽型ウイルスは、改善された導入効率を有し得るとともに、指向性を変更し得る。
例えば、ＡＡＶ２／５は、ＡＡＶ２／２によって効果的に形質導入されないニューロンを標的とし、脳内でより広範に分布し、導入効率の改善を示している。これらのハイブリッドウイルスの多くは、よく特徴づけられており、インビボでの適用に関して標準的なウイルスよりも好ましい場合がある。
ある特定の実施形態では、指向性は、さらに、複数の異なる血清型に由来する組み換え的に生成されたハイブリッドカプシドを使用して洗練される。１つの一般的な例は、ＡＡＶ－ＤＪであり、これは、８つの血清型に由来するハイブリッドカプシドを含む。ＡＡＶ－ＤＪは、いかなる野生型の血清型よりもインビトロで高い導入効率を示し、インビボで広範な細胞型にわたって極めて高い感染性を示す。変異型ＡＡＶ－ＤＪ８は、ＡＡＶ－ＤＪの特性を示すが、脳への取り込みが向上している。
ＡＡＶの別の操作されたＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂファミリーは、ＣＮＳのあらゆる場所に遺伝子を効果的に送達し、ＣＮＳ送達を必要とする遺伝子治療に使用され得る。
Ｄａｖｉｄｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ １１６（５２）：２７０５３－２７０６２，２０１９）は、最近になって、インビボで単回のスクリーニングのみを使用して、大規模に操作されたカプシド構造の効果的な選択を可能にするいわゆるＢＲＡＶＥ（バーコード化合理的ＡＡＶベクターエボリューション）アプローチを記載した。該ＢＲＡＶＥアプローチ及び隠れマルコフモデルベースのクラスタリングを使用して、著者らは、げっ歯類及びヒトの両ドパミン作動性ニューロンに関して示される特定のニューロンのサブタイプにおける逆行性軸索輸送等の洗練された特性を有する２５の合成カプシドバリアントを提示した。
その一方で、Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．８（１）：１９４－２０６，２０１９）は、特性が改善された新規なベクターを増殖させるための特に協力な技術、すなわち、ＤＮＡファミリーシャフリングを記載した。これは、ホモロジー駆動ＤＮＡ組み換えによってキメラカプシドを生成する。
ある特定の実施形態では、本主題のウイルスベクターのカプシドは、選択された細胞型特異的遺伝子送達用に表面操作される。例えば、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（１２）：７７７－７９０，２０１５）は、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに基づく遺伝子ベクターを操作して、それらが、それらの天然の受容体の代わりに細胞への侵入のための最適な細胞表面マーカーを使用するようにすることができることを開示している。該表面マーカーへの結合は、該ベクター粒子表面に提示される標的リガンドによって媒介され、これは、ペプチド、一本鎖抗体、またはデザインされたアンキリンリピートタンパク質であり得る。例としては、遺伝子を特異的内皮細胞もしくはリンパ球、腫瘍細胞、または神経系の特定の細胞に送達するベクターが挙げられる。
さらなるコード配列
筋ジストロフィーの治療では、マイクロＤ５等のジストロフィンタンパク質のコード配列に加えて、本発明の組み換えベクターは、ジストロフィンの損失に関連する、またはこれに起因する二次合併症／二次カスケードの１つにおける標的遺伝子（複数可）のための１つ以上のさらなるコード配列も含む。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、特定のジストロフィン遺伝子突然変異を修正することができるエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。
例えば、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、対象における欠損ジストロフィン遺伝子のプレメッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）スプライシング時に特定のエクソンのスキッピングを誘導し、リーディングフレームの回復及び内部切断型タンパク質の部分的産生をもたらし、ベッカー型筋ジストロフィーで見られるジストロフィンタンパク質の発現と類似している。
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、フレーム破壊エクソン（突然変異エクソン）及び／または隣接するエクソンをスキップまたはスプライスし、正しい転写リーディングフレームを回復し、短くなったが機能性のジストロフィンタンパク質を産生する。
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、単一のエクソンスキッピングを誘導する。ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、複数のエクソンスキッピング、例えば、エクソン４５～５５のうちの１つ以上、またはそのすべてのスキッピング（すなわち、天然のエクソン４４が直接エクソン５６に結合される）を誘導する。例えば、１１個のアンチセンス配列を一緒に使用して、エクソン４５～５５を含む１１個のエクソンすべてをスキップすることができる。１０個のＡＯＮのカクテルを、ｍｄｘ５２マウスモデル（エクソン５２を削除）に使用して、エクソン４５～５１及び５３～５５のスキップを誘導し、機能性ジストロフィンの発現を回復させた。
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、ジストロフィンのｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン５１のスキッピングを誘導する。エクソン５１のスキッピングの成功で、理論的には、すべてのＤＭＤ患者の約１４％を治療することができる。
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１のエクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）部位を標的とし、ひいては、エクソン５１のスキップを引き起こし、切断されたが部分的に機能性のジストロフィンタンパク質を産生する。
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、エクソン４４、４５、及び５３のうちの１つ以上のスキッピングを誘導する。
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、カシメルセン（エクソン４５）、ＮＳ－０６５／ＮＣＮＰ－０１もしくはゴロジルセン（エクソン５３）、またはエテプリルセンもしくはＥｘｏｎｄｙｓ５１（エクソン５１）のものと同じ標的配列を標的とする。
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）患者における突然変異ＦＣＭＤ／ＦＫＴＮ遺伝子の潜在スプライシングドナー及び／またはアクセプター部位を標的とし、正しいエクソン１０のスプライシングを回復する。
福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）は、まれな常染色体劣性疾患であり、日本で２番目に一般的な形態の小児筋ジストロフィーである。ＦＣＭＤ（ＦＣＭＤ、ＦＫＴＮとしても知られる）の原因となる遺伝子は、推定グリコシルトランスフェラーゼであるタンパク質フクチンをコードし、ジストロフィン結合糖タンパク質複合体（ＤＡＧＣ）のメンバーであるα－ジストログリカンをグリコシル化する。ＦＣＭＤの病因は、フクチン遺伝子の３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）へのＳＩＮＥ－ＶＮＴＲ－Ａｌｕ（ＳＶＡ）レトロトランスポゾンの祖先挿入により、エクソン１０の新たな潜在スプライスドナー、及び該ＳＶＡ挿入部位での新たな潜在スプライスアクセプターが活性化され、ひいては該潜在ドナー及びアクセプター部位間で異常なｍＲＮＡのスプライシングが誘導されることによって生じる。その結果、ＦＣＭＤのエクソン１０が早期切断される。ＦＣＭＤ患者の細胞及びインビボでのモデルマウスでは、該潜在スプライス調節領域を標的とする３つのビボＰＭＯのカクテルが、病原性ＳＶＡエクソントラッピングを防止し、正常なＦＫＴＮタンパク質レベル及びα－ジストログリカンのＯ－グリコシル化を回復させることが示された。
ある特定の実施形態では、該アンチセンス配列は、３－または４－ヌクレオチドリピートの病的な伸長、例えば、ＤＭ１患者におけるＤＭＰＫ遺伝子の３’－ＵＴＲ領域でのＣＴＣトリプレットリピート、またはＤＭ２患者におけるＣＮＢＰ遺伝子の第一のイントロン内のＣＣＴＧリピートを標的とする。
筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）は、成年期の筋ジストロフィーの最も一般的な形態である。筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）及び筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）に分類され得るのは、常染色体優性疾患である。ＤＭ１は、筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’－ＵＴＲ領域のＣＴＣトリプレットの病的伸長によって引き起こされるが、ＤＭ２は、ＣＣＨＣ型ジンクフィンガー核酸結合タンパク質遺伝子（ＣＮＢＰ）の第一のイントロンにおけるＣＣＴＧトラクトの病的伸長によって引き起こされる。リピートが伸長した転写ＲＮＡ凝集体から生じるＲＮＡの機能獲得毒性は、異常なスプライシング（スプライセオパシー（ｓｐｌｉｃｅｏｐａｔｈｙ））につながる。有毒なＲＮＡの凝集体は、マッスルブラインドライク（Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ－ｌｉｋｅ）（ＭＢＮＬ）タンパク質及びＣＵＧ結合タンパク質１（ＣＵＧＢＰ１）等の選択的スプライシング調節因子の機能を、前者の核内ＲＮＡ焦点内で封鎖及び枯渇させることにより、ならびに後者の発現及びリン酸化を高めることによりＤＭ１において破壊する。ＭＢＮＬ及びＣＵＧＢＰ１タンパク質の機能の変化は、標的遺伝子、すなわち、それぞれ、インスリン抵抗性、筋緊張、筋衰弱、及びジストロフィー筋過程（すべて筋緊張性ジストロフィーの典型的な症状）に関連する、インスリン受容体（ＩＮＳＲ）、筋クロライドチャネル（ＣＬＣＮ１）、ブリッジングインテグレーター１（ＢＩＮ１）、及びジストロフィン（ＤＭＤ）のｐｒｅ－ｍＲＮＡの異常なスプライシングにつながる。
従って、ＤＭＰＫ遺伝子のＣＵＧリピートの伸長は、ＭＢＮＬ１タンパク質を隔離し、いくつかの下流の遺伝子で異常なスプライシングを引き起こし、それにより、ＤＭ１表現型が生じる。一方、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＲＮａｓｅによる分解のための変異転写産物のかかる伸長リピートを標的とし、それにより、下流の遺伝子のスプライシングを回復させることができる。２’－Ｏ－メトキシエチルギャップマーＡＯＮは、変異ＲＮＡ転写産物のＲＮａｓｅ Ｈによる伸長ＣＵＧの分解を標的とし、変異ｍＲＮＡ転写産物の減少及びタンパク質発現の回復をもたらすために使用されている。
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、ＤＭ１患者のＣＬＣＮ１遺伝子のエクソン７Ａのスキッピングをもたらす。
ＤＭ１患者ではクロライドチャネル１（ＣＬＣＮ１）が筋緊張を引き起こすため、この遺伝子の異常なスプライシングを修正することによってもＤＭ１を治療することができる。超音波照射したバブルリポソームとともにＰＭＯ（ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー）を使用してＤＭ１マウス（ＨＳＡＬＲ）の筋肉へのＰＭＯの送達を高めることで、ＣＬＣＮ１のエクソン７Ａのスキッピングがインビボで達成され、骨格筋で筋緊張及びＣｌｃｎ１タンパク質発現が改善された。
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、ＤＹＳＦ突然変異を有するジスフェリン異常症（例えば、ＬＧＭＤ２ＢまたはＭＭ）患者でのエクソンスキッピングのため、ＤＹＳＦ遺伝子のエクソン１７、３２、３５、３６、及び／または４２、好ましくは、エクソン３２及び／または３６を標的とする。
ジスフェリン異常症は、ジスフェリン（ＤＹＳＦ）遺伝子の突然変異によって引き起こされる筋ジストロフィーを包含する総称である。ジスフェリン遺伝子は、筋膜損傷の修復に必要な筋細胞膜鞘タンパク質をコードする。これは、カルシウム依存性Ｃ２脂質結合ドメイン及び不可欠な膜貫通ドメインからなる。２つの一般的なジスフェリン異常症、すなわち、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）及び三好ミオパチー（ＭＭ）があり、どちらも臨床的に異なる表現型及び常染色体劣性遺伝を有する。ＬＧＭＤ２Ｂは、近位筋衰弱を特徴とし、ＭＭは、遠位筋衰弱を特徴とする。ＬＧＭＤ２ＢとＭＭの初期臨床表現型は異なる。しかしながら、病気が進行するにつれて、両方の状態の臨床症状は重複し、より類似したものになり、患者は四肢近位及び遠位の両方で筋衰弱を経験する。ジスフェリン欠損筋線維は、膜修復に欠陥がある。
ジスフェリン異常症は、１つには、わずか１０％の野生型レベルの発現の切断型変異ＤＹＳＦタンパク質を有する患者において観察される軽度の表現型のため、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたエクソンスキッピングによって治療することができる。具体的には、複合ヘテロ接合女性患者のＬＧＭＤ２Ｂの症例では、該患者は、イントロン３１に、１つのヌル対立遺伝子及びの他の対立遺伝子にＤＹＳＦ分岐点突然変異を有していた。エクソン３２の天然のインフレームスキッピングにより、野生型レベルの約１０％で発現する切断型ジスフェリンタンパク質が生じ、これは、ヌル突然変異を部分的に補完するのに十分であった。該患者は軽度の症状を示し、７０歳で歩行可能であった。近年、患者の細胞でのエクソン３２のスキッピングにより、疑似ジスフェリン発現レベルがもたらされ、これにより、低浸透圧及び筋細胞膜鞘に局在するレーザー損傷にさらされた処理細胞の膜修復がインビトロでレスキューされたことが示された。
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、ＬＡＭＡ２の突然変異を有するメロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）患者におけるエクソンスキッピングのため、ＬＡＭＡ２遺伝子のエクソン４を標的とする。ある特定の実施形態では、エクソンスキッピングにより、α－ジストログリカンとの相互作用の仲介にとって最も重要なＣ末端のＧドメイン（エクソン４５～６４）、特にＧ４及びＧ５の発現を回復する。
メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）は、ラミニン－α２鎖の発現を完全にまたは部分的に欠損させる６５エクソンのＬＡＭＡ２遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ラミニン－α２鎖は、ベータ１（β１）、及びガンマ１（γ１）鎖とともに、ラミニン－２１１またはメロシンとして知られるヘテロ三量体ラミニンアイソフォームの一部であり、神経筋接合部を含めた骨格筋の基底膜及びシュワン細胞（末梢神経）で特に発現される。ラミニン－α２は、ジストロフィン－ジストログリカン複合体（ＤＧＣ）と相互作用し、骨格筋及び末梢神経における細胞のシグナル伝達、接着、及び組織の完全性を仲介する。いつでも当てはまるというわけではないが、ラミニン－α２の部分的発現は、軽度のＭＤＣ１Ａを引き起こし、ラミニン－α２の完全な欠如は、重度のＭＤＣ１Ａを引き起こす。Ｃ末端のＧドメイン（エクソン４５～６４）、特にＧ４及びＧ５は、α－ジストログリカンとの相互作用の仲介にとって最も重要である。Ｇ４及びＧ５を排除する突然変異は、部分切断型ラミニン－α２発現の存在下でも深刻な表現型と関連がある。
ＰＭＯを介したエクソン４のスキッピングがオープンリーディングフレームを修正し、切断型ラミニン－α２鎖の回復及び患者の寿命のわずかな延長をもたらすという点で、エクソンスキッピングは、ＭＤＣ１Ａの治療のために探求されてきた。
ある特定の実施形態では、該エクソンスキッピングアンチセンス配列は、Δ－５２１ＴのＳＧＣＧ突然変異の肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型患者の治療のため、ＬＧＭＤ２Ｃ／ＳＧＣＧ遺伝子における最も一般的なΔ－５２１Ｔ突然変異のエクソン４～７のスキッピング、及びリーディングフレームの回復を誘導し、内部切断型ＳＧＣＧタンパク質を産生する。ある特定の実施形態では、エクソンスキッピングは、野生型ＳＧＣＧタンパク質の細胞内、膜貫通、及び最遠カルボキシ末端を保持する内部切断型ＳＧＣＧタンパク質の発現を回復する。
ジストロフィン結合タンパク質（ＤＡＰ）は、筋細胞膜内の複合体であり、その膜貫通成分は、細胞骨格を成熟筋線維の細胞外マトリックスに連結し、筋細胞膜の完全性の維持に不可欠である。ＤＧＣ内のサルコグリカンサブ複合体は、４つの１回貫通膜貫通サブユニット：α－、β－、γ－、及びδ－サルコグリカンからなる。α～δ－サルコグリカン遺伝子、すなわち、α（ＬＧＭＤ２Ｄ）、β（ＬＧＭＤ２Ｅ）、γ（ＬＧＭＤ２Ｃ）及びδ（ＬＧＭＤ２Ｆ）は、横紋筋において主に（β）または排他的に（α、γ及びδ）発現される。該４つのサルコグリカン遺伝子のいずれかの突然変異は、おそらく該サルコグリカン複合体の不安定化により、他のサルコグリカンタンパク質の二次欠乏症を引き起こし、サルコグリカン異常症、すなわち、常染色体劣性肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）を引き起こす可能性がある。α～δ遺伝子における疾患を引き起こす突然変異は、筋細胞膜のジストロフィン結合タンパク質（ＤＡＰ）複合体内で崩壊を引き起こす。
ヒトでは、γサルコグリカン（ＬＧＭＤ２Ｃ）は、ＳＧＣＧ遺伝子によってコードされるタンパク質である。重症小児常染色体劣性筋ジストロフィー（ＳＣＡＲＭＤ）は、γ－サルコグリカン遺伝子で、マイクロサテライトマーカーと分離する進行性の筋消耗性疾患である。γ－サルコグリカン遺伝子の突然変異は、γ－サルコグリカン異常症が、通常の発生率よりも高い北アフリカのマグレブ諸国で最初に報告された。ＬＧＭＤ２Ｃ患者で最も一般的な突然変異の１つであるΔ－５２１Ｔは、γ－サルコグリカン遺伝子のエクソン６のヌクレオチド塩基５２１～５２５における５つのチミン鎖からのチミンの欠失である。この突然変異は、リーディングフレームをずらし、γ－サルコグリカンタンパク質の不在ならびにβ－及びδ－サルコグリカンの二次的な低下をもたらし、ひいては重度の表現型を引き起こす。該突然変異は、マグレブの集団及び他の諸国の両方で生じる。
エクソンスキッピングは、得られる内部切断型ＳＧＣＧタンパク質が、γ－サルコグリカンを欠くショウジョウバエモデルにおいて、異種細胞発現試験において、及びトランスジェニックマウスにおいて、γ－サルコグリカンの欠損を修正するために機能的及び病理学的な利点をもたらすという点で、Δ－５２１Ｔの突然変異を有するＬＧＭＤ２Ｃの治療のために探索されてきた。ヒト筋疾患の細胞モデルも作成され、変異ヒトγ－サルコグリカンをコードするＲＮＡで複数のエクソンスキッピングが誘導され得ることが示された。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、サルコリピン（ＳＬＮ）の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、サルコリピンの機能に拮抗するｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＬＮ）をコードする。
例示的なｓｈＳＬＮ配列としては、２０１９年１２月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８の図９及び１０に開示されるもの（例えば、図９の下線付きの配列、及び図１０の強調表示された配列）が挙げられる。さらなる例示的なｓｈＳＬＮ配列としては、ＷＯ２０１８／１３６８８０（参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示される配列番号７～１１が挙げられる。
さらなるｓｈＳＬＮ配列は、以下に示すヒトＳＬＮのｍＲＮＡ配列を使用して、当技術分野で認識されている任意の方法に基づいてデザインされ得る。
Figure 2023510799000004
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、１つ以上の標的遺伝子、例えば、炎症遺伝子の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。
ＩκＢキナーゼ／核内因子－カッパＢ（ＮＦ－κＢ）のシグナル伝達は、ＤＭＤの動物モデル及び患者の両方において、免疫細胞及び再生筋線維で持続的に上昇する。さらに、ＤＭＤの筋肉では、ＴＮＦ－αならびにＩＬ－１及びＩＬ－６等のＮＦ－κＢの活性化因子が上方制御される。従って、ＮＦ－κＢのシグナル伝達カスケードの成分、例えば、ＮＦ－κＢ自体、その上流の活性化因子及び下流の炎症性サイトカインを阻害することは、欠損ジストロフィン遺伝子の置換／修復と併せて対象患者を治療するのに有益である。
従って、ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、１つ以上の炎症遺伝子、例えば、ＮＦ－κＢ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１（ＩＬ－１β）、ＩＬ－６、ＮＦ－κＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ）、及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、ヒストンデアセチラーゼ、例えば、ＨＤＡＣ２の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。ＤＭＤでは、筋細胞膜鞘でのジストロフィンの不在により、一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）が非局在化及び下方制御され、これにより、ＨＤＡＣ２のＳ－ニトロシル化及びそのクロマチン結合が変化する。ＮＯ経路が欠損しているジストロフィン欠損ｍｄｘマウスでは、ＨＤＡＣ２の活性が特異的に増加した。対照的に、ｍｄｘ動物におけるｎＮＯＳ発現のレスキューは、ジストロフィーの表現型を改善した。さらに、デアセチラーゼ阻害物質は、ジストロフィー筋線維に強い形態機能的な効果をもたらした。実際、ヒストンデアセチラーゼ阻害物質であるギビノスタットは、ＤＭＤの潜在的な疾患修飾治療として評価段階にある。データは、マウスとヒトの両ジストロフィー細胞において、ジストロフィンの不在は、ｍｉＲＮＡの特定のサブセットに結合するＨＤＡＣ２と相関し（下記参照）、ジストロフィンのレスキュー時に、ＨＤＡＣ２がこれらのプロモーターから放出されることを示している。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＴＧＦ－β、または結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）の機能に拮抗するアンチセンス配列、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）、またはマイクロＲＮＡをコードする。筋ジストロフィーにおけるＴＧＦ－βレベルの上昇は、衛星細胞の活性化を阻害することにより線維化を刺激し、筋肉再生を損なう。ＴＧＦ－βの発現を減少させるアンギオテンシンＩＩタイプ１受容体遮断薬であるロサルタンを含め、筋ジストロフィーのマウスモデルで抗線維化剤が試験されている。ＨＴ－１００（ハロフジノン）は、筋ジストロフィーにおいてＴＧＦ－β／Ｓｍａｄ３経路を介して線維化を防ぐことも示されている。一方、線維化の病因における中心的なメディエーターである結合組織増殖因子の作用を阻害する完全ヒトモノクローナル抗体であるＦＧ－３０１９は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の患者での非盲検第二相試験で評価されている。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、例えば、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－２９ｃ、ｍｉＲ－３０ｃ、ｍｉＲ－１３３、及び／またはｍｉＲ－２０６をコードする。デュシェンヌ型状態の野生型状態に対する異なったＨＤＡＣ２のニトロシル化状態が、マイクロＲＮＡ遺伝子の特定のサブセットの発現を脱調節する。同定されたマイクロＲＮＡによって制御されるいくつかの回路、例えば、ｍｉＲ－１をＧ６ＰＤ酵素及び細胞のレドックス状態に結合するもの、またはｍｉＲ－２９を細胞外タンパク質及び線維化過程に結合するものは、いくつかのＤＭＤの病因を説明する。ｍｄｘで下方制御された筋特異的（ｍｙｏｍｉＲ）ｍｉＲ－１及びｍｉＲ－１３３、ならびに普遍的なｍｉＲ－２９ｃ及びｍｉＲ－３０ｃは、エクソンスキッピング処理された動物において野生型レベルまで回復した。該ｍｄｘモデルによると、エクソンスキッピングを介してジストロフィン合成が回復した場合、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－２９ｃ、ｍｉＲ－３０ｃ、及びｍｉＲ－２０６のレベルは増加したが、ｍｉＲ－２３ａの発現は変化しなかった。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＤＭＤまたはその関連疾患において上方制御されるマイクロＲＮＡの機能を阻害するマイクロＲＮＡ阻害物質をコードする。例えば、炎症性ｍｉＲ－２２３の発現レベルは、ｍｄｘマウスの筋肉では上方制御され、エクソンスキッピング処理マウスでは下方制御される。その減少は、エクソンスキッピングによるジストロフィンレスキューに起因して、観察された筋肉の炎症状態の改善と一致する。
該ｍｄｘ動物は、広範な線維化変性を受け、ｍｉＲ－２９は、コラーゲン、エラスチン、及び細胞外マトリックスの構造成分等の線維化変性に関与する重要な因子のｍＲＮＡを標的とすることが示されている。ｍｄｘマウスでは、ｍｉＲ－２９の発現が不良であり、コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）及びエラスチン（ＥＬＮ）のｍＲＮＡが上方制御された。従って、ｍｉＲ－２９ｃの発現は、ＤＭＤ患者における線維化変性を、１つには、コラーゲン及びエラスチンの発現、ならびにコラーゲン及びエラスチンの発現に関連する病的な細胞外マトリックスの修飾を下方制御することを介して軽減する。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、Ｇ６ＰＤ（グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ）の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。ジストロフィー筋における１つの重要な問題は、疾患の進行に関与することが示唆されている酸化ストレスに対する感受性及び反応である。Ｇ６ＰＤは、ペントースリン酸経路の細胞質内酵素であり、ＮＡＤＰＨのレベルを維持することによって細胞に還元エネルギーを供給する。これにより、還元型グルタチオンと酸化型グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）の比が高くなる。ＧＳＨは、細胞を酸化的障害から保護する主要な抗酸化分子である。Ｇ６ＰＤのｍＲＮＡは、ｍｄｘの筋内で脱調節されている。それは、その３’－ＵＴＲ領域に、ｍｉＲ－１ファミリーの３つの推定結合部位を含み、ｍｉＲ－１及びｍｉＲ－２０６は、Ｇ６ＰＤ発現を抑制することができる。実際、Ｇ６ＰＤとｍｉＲ－１の発現の間には逆相関があり、Ｃ２筋芽細胞のインビトロでの分化は、ｍｉＲ－１のレベルの増加が、Ｇ６ＰＤタンパク質、ｍＲＮＡレベル、及びＧＳＨ／ＧＳＳＧ比の減少と相関していることを示した。ｍｉＲ－１が下方制御されているｍｄｘマウスでは、Ｇ６ＰＤはＷＴ筋より高レベルで検出されたが、ｍｉＲ－１が回復するエクソンスキッピング処理されたｍｄｘでは、Ｇ６ＰＤの量が減少した。特に、ｍｄｘマウスでは、Ｇ６ＰＤレベルの増加は、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比の減少を伴った。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、ミオスタチンの機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。ミオスタチンは、筋肉量の負の調節因子である。内因性ミオスタチンの阻害または遮断は、ＤＭＤを含めた多くの種類の筋ジストロフィーに共通する重度の筋肉消耗を補償する。ミオスタチン遮断抗体であるＭＹＯ－０２９は、ＢＭＤ及びその他のジストロフィーを有する成人被験者を対象とした臨床試験中である。フォリスタチンならびにＰＦ－０６２５２６１６（ＮＣＴ０２３１０７６４）及びＢＭＳ－９８６０８９等のミオスタチン阻害物質を使用した他の臨床試験も実施されている。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、ホスホジエステラーゼ－５（ＰＥＤ－５）もしくはＡＣＥ、またはＶＥＧＦデコイ受容体１型（ＶＥＧＦＲ－１もしくはＦｌｔ－１）の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。ジストロフィンの損失は、神経型一酸化窒素合成酵素の転位及び筋肉由来の一酸化窒素の減少を微小血管系にもたらし、機能性筋虚血及びさらなる筋障害につながる。従って、ホスホジエステラーゼ－５もしくはＡＣＥ、またはＶＥＧＦデコイ受容体１型（ＶＥＧＦＲ－１もしくはＦｌｔ－１）のいくつかの阻害物質が、筋肉への血流を増加させる戦略の一部として試験されており、ホスホジエステラーゼ－５またはＡＣＥのいずれかの医薬品阻害を含む。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、造血プロスタグランジンＤシンターゼ（ＨＰＧＤＳ）の機能に拮抗するアンチセンス配列、またはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）は、様々な炎症細胞によって産生され、造血ＰＧＤシンターゼ（ＨＰＧＤＳ）は、ＤＭＤ患者の壊死筋で発現することが分かっている。ＨＰＧＤＳ阻害物質の投与により、ＤＭＤのｍｄｘマウスモデルにおいて、ＰＧＤ２の尿代謝産物であるテトラノル－ＰＧＤＭの尿排泄が減少し、筋壊死が抑制された。新規ＨＰＧＤＳ阻害物質であるＴＡＳ－２０５は、ＤＭＤ治療に関して臨床試験で評価されている。
ＲＮＡｉ及びアンチセンスのデザイン
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）では、内因性の標的ｍＲＮＡに相補的であり、これに結合する低ＲＮＡ分子が創出される。かかる結合は、該標的ｍＲＮＡの分解を含めた該標的ｍＲＮＡの機能的不活化につながる。
該ＲＮＡｉ経路は、植物や動物を含めた多くの真核生物に見出され、細胞質で酵素ダイサーによって開始され、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を、約２１ヌクレオチドの低分子二本鎖断片ｓｉＲＮＡに切断する。各ｓｉＲＮＡは次に、２つの一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、すなわち、パッセンジャー鎖とガイド鎖に巻き戻される。パッセンジャー鎖は分解され、ガイド鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。最もよく研究されている結果は、転写後遺伝子サイレンシングであり、これは、ガイド鎖がｍＲＮＡ分子内の相補配列と対合し、ＲＩＳＣの触媒成分であるアルゴノート２（Ａｇｏ２）による切断を誘導する場合に生じる。一部の生物では、最初はｓｉＲＮＡのモル濃度が制限されるにもかかわらず、このプロセスが全身に広がる。
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ以外に、ＲＮＡ干渉の中心となる別のタイプの低ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。
マイクロＲＮＡは、特に発達段階の遺伝子発現の調節を支援する、ゲノム的にコードされた非コードＲＮＡである。成熟型ｍｉＲＮＡは、構造的にはｓｉＲＮＡと同様であるが、成熟に達する前に、最初に大幅な転写後修飾を受ける必要がある。ｍｉＲＮＡは、非常に長いＲＮＡコード遺伝子から、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡとして知られる一次転写産物として発現され、これが次に、細胞核内で、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素Ｄｒｏｓｈａ及びｄｓＲＮＡ結合タンパク質ＤＧＣＲ８からなるマイクロプロセッサ複合体によって、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡと呼ばれる７０ヌクレオチドのステムループ構造までプロセシングされる。このｐｒｅ－ｍｉＲＮＡがサイトゾルに輸送されると、そのｄｓＲＮＡ部分がダイサーによって固定及び切断され、成熟型ｍｉＲＮＡ分子が生成され、この２本の鎖が、パッセンジャー鎖とガイド鎖に分離され得る。このｍｉＲＮＡのガイド鎖は、ｓｉＲＮＡのガイド鎖と同様、同じＲＩＳＣ複合体に組み込まれ得る。
従って、２つのｄｓＲＮＡ経路、ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡは、どちらも、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの成熟型機能性ガイド鎖を生成するために、骨格配列を有する前駆体分子（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、及びｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）のプロセシングを必要とし、どちらの経路も最終的にはＲＩＳＣ複合体に合流する。
ＲＩＳＣへの組み込み後、ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと塩基対を形成してそれを切断し、それが翻訳鋳型として使用されることを防ぐ。しかしながら、ｓｉＲＮＡとは異なり、ｍｉＲＮＡを搭載するＲＩＳＣ複合体は、潜在的な相補性に関して細胞質ｍＲＮＡをスキャンする。破壊的な切断（Ａｇｏ２による）の代わりに、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲ領域を標的とし、通常はそこで不完全な相補性で結合し、ひいては翻訳のためのリボソームの接近をブロックする。
ｍｉＲＮＡ、特に動物のｍｉＲＮＡは通常、標的との塩基対合が不完全であり、同様の配列を有する多くの異なるｍＲＮＡの翻訳を阻害するという点で、ｓｉＲＮＡとｍｉＲＮＡは異なる。対照的に、ｓｉＲＮＡは通常、完全に塩基対を形成し、単一の特定の標的でのみｍＲＮＡの切断を誘導する。
歴史的には、ＲＮＡｉの応用には、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡが使用されてきた。ｓｉＲＮＡは通常、２０～２５ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを、それらが細胞内で分解されるまで一時的に阻害する。ｓｈＲＮＡは通常、約８０塩基対の長さであり、ヘアピン構造を創出する内部ハイブリダイゼーションの領域を含む。前述のように、ｓｈＲＮＡ分子は細胞内でプロセシングされてｓｉＲＮＡを形成し、これが次に遺伝子発現をノックダウンする。ｓｈＲＮＡの１つの利点は、より長期のまたは安定した発現、ひいては標的ｍＲＮＡのより長いノックダウンのためにそれらをプラスミドベクターに組み込むこと及びゲノムＤＮＡに統合することができることである。
ｓｈＲＮＡのデザインは市販されている。例えば、Ｃｅｌｌｅｃｔａは、ヒト全ゲノムｓｈＲＮＡライブラリまたはマウスＤＥＣＩＰＨＥＲ ｓｈＲＮＡライブラリ（約１０，０００のマウス遺伝子を標的とする）を使用して、任意の標的遺伝子（例えば、１９，２７６のタンパク質コードヒト遺伝子すべて）に対するＲＮＡｉスクリーニングサービスを提供している。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃは、ＡｍｂｉｏｎのＳｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡ（クラシック２１量体）を提供しており、これには、製造元によれば、ｓｉＲＮＡデザイン、オフターゲット効果予測アルゴリズム、及び化学における最新の改善が組み込まれている。
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃはまた、内因性成熟型ｍｉＲＮＡを模倣するようにデザインされた、化学修飾された低分子二本鎖ＲＮＡ分子であるＡｍｂｉｏｎ（登録商標）Ｐｒｅ－ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体分子も提供している。かかるＰｒｅ－ｍｉＲ ｍｉＲＮＡ前駆体を使用すると、ｍｉＲＮＡ活性の上方制御によるｍｉＲＮＡの機能解析が可能になり、ｍｉＲＮＡの標的部位の同定及び検証、標的遺伝子の発現を調節するｍｉＲＮＡのスクリーニング、及び標的遺伝子（ＳＬＮ等）または細胞過程の機能に影響を与えるｍｉＲＮＡのスクリーニングに使用することができる。
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃはさらに、内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子に特異的に結合して阻害するようにデザインされた、化学修飾された一本鎖核酸であるＡｍｂｉｏｎ（登録商標）Ａｎｔｉ－ｍｉＲ（商標）ｍｉＲＮＡ阻害物質を提供している。
アンチセンス配列のデザインもまた、多くの商業的及び公的供給源、例えば、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＧｅｎＬｉｎｋから市販されている。デザイン上の考慮事項としては、オリゴ長、標的ｍＲＮＡの二次／三次構造、標的ｍＲＮＡ上のタンパク質結合部位、標的ｍＲＮＡまたはアンチセンスオリゴのいずれかにおけるＣＧモチーフの存在、アンチセンスオリゴにおける四重体の形成、及びアンチセンスの活性を向上するまたは低下させるモチーフの存在を挙げてもよい。
エクソンスキッピングアンチセンスオリゴのデザインは、当技術分野で既知である。例えば、標的部位の選択、オリゴの長さ、オリゴの化学、及びＲＮＡ鎖に対する融解温度等の要因を考慮に入れ、効果的なエクソンスキッピングオリゴヌクレオチドのデザインについて詳しく論じたＳｈｉｍｏ ｅｔ ａｌ．によるＣａｍｉｌｌａ Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｉ（ｅｄ．），Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１６８７，ＤＯＩ １０．１００７／９７８－１－４９３９－７３７４－３＿１０，Ｃｈａｐｔｅｒ １０（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ ＬＬＣにより発行），２０１８）を参照されたい。複数のエクソンをスキップするためのアンチセンスオリゴのカクテルの使用についても論じられている。取り扱われている特定の遺伝子及び筋ジストロフィーには、ＤＭＤ（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、ＬＡＭＡ２（メロシン欠損型ＣＭＤ、ＤＹＳＦ（ジスフェリン異常症、ＦＫＴＮ（福山型ＣＭＤ）、ＤＭＰＫ（筋緊張性ジストロフィー、及びＳＧＣＧ（ＬＧＭＤ２Ｃ）が含まれる。その全内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
例えば、罹患疾患遺伝子におけるタンパク質／遺伝子配列及びその突然変異は、ＮＣＢＩ及びライデン筋ジストロフィーページ（Ｌｅｉｄｅｎ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｐａｇｅｓ）からオンラインで公開されている。効率的なエクソンスキッピングの潜在的な標的部位は、ｗｗｗ．ｕｍｄ．ｂｅ／ＨＳＦのヒューマンスプライシングファインダーのウェブサイトを使用して取得することができる。標的ｍＲＮＡの二次構造は、例えば、Ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕウェブサイトのｍｆｏｄウェブサーバーを使用して評価することができる。オリゴの長さは通常８～３０量体である。オリゴのＧＣ含量の計算は、ノースウェスタン大学のサーバーにあるＯｌｉｇｏＣａｌｃのＷｅｂサイトで可能である。任意の標的外配列の検索は、ＧＧＧｅｎｏｍｅのウェブサイトを使用して行うことができる。オリゴの融解温度は、ｓｇ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍのＬＮＡオリゴ予測ツールまたはＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ３．１ソフトウェアで推定することができる。
ＲＮＡｉ（ｍｉＲ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）のガイド鎖生成の改善
ある特定の実施形態では、該コード配列は、ＲＮＡｉ試薬、例えば、ｍｉＲ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡをコードする。
ある特定の実施形態では、ｍｉＲ及び／またはｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡのデザインに関して、成熟型ｍｉＲまたは成熟型ｓｉＲＮＡが生成される野生型骨格配列を修飾して、ガイド鎖生成を改善すること及びパッセンジャー鎖の生成を最小化／排除することができる。成熟型ｍｉＲ／ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡの両方の鎖（切断後）は、理論上、ＲＩＳＣ複合体に組み込まれ、ＲＮＡｉのガイド鎖になり得るため、例えば、オフターゲット効果（例えば、パッセンジャー鎖がＲＩＳＣに搭載された場合の意図しない標的配列の切断に起因する）を低減または最小化するために、ＲＩＳＫ複合体において、デザインされたガイド鎖の利用を選択的に高め、大部分相補的なパッセンジャー鎖の利用を最小限に抑えることが有利である。
この目標（リーディング鎖の生成を高め、パッセンジャー鎖の生成を最小化／排除する）を達成するために使用することができる１つのアプローチは、所望のガイド鎖を含むデザインされた成熟型ｍｉＲ／ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ配列が、ガイド鎖の生成に有利に働きかつパッセンジャー鎖の生成に不利な他のｍｉＲ配列の骨格配列の内部に埋め込まれているハイブリッド構築物を使用することによる。
この原理は、いくつかの修飾ｍｉＲ－２９ｃ構築物及びｓｈＳＬＮ構築物のデザインに示されているが、同じ原理は、任意の他の配列を標的とする他のＲＮＡｉ試薬に容易に採用することができる。
以下に示すすべてのデザインについて、採用するデザイン戦略としては、天然の骨格配列の２Ｄ及び３Ｄ構造を維持するために、隣接する骨格配列、ループ配列、及びパッセンジャー鎖のヌクレオチド配列の改変が挙げられる。これに関連して、ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡデザインの場合、天然の骨格配列の２Ｄ／３Ｄ構造は、主に、ステムループと隣接する骨格ポリヌクレオチド配列間の距離、中心ステムの構造、バルジの位置及び／またはサイズ、ステム内の任意の内部ループ及びミスマッチの存在及び局在等を指す。選択されたｍｉＲ－３０Ｅ、ｍｉＲ－１０１、及びｍｉＲ－４５１の骨格配列に基づくｍｉＲ－２９ｃハイブリッド構築物のある特定の例示的な２Ｄ構造マップを、以下に実例として提供する。
Ａ．ｍｉＲ－３０骨格配列を有するハイブリッドｍｉＲ－２９ｃ（２９ｃ－Ｍ３０Ｅ）
Ｆｅｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．５（６）：１７０４－１７１３， ２０１３、参照することにより本明細書に組み込まれる）は、いわゆる「ｓｈＲＮＡｍｉｒ」、すなわち、内因性マイクロＲＮＡ文脈に埋め込まれた合成ｓｈＲＮＡの最適プロセシングに極めて必要な基本的なステムの保存要素の３’を特定することによる、実験的ｍｉＲ－３０骨格を最適化するための体系的なアプローチを記載している。得られた「ｍｉＲ－Ｅ」と呼ばれる最適化骨格は、成熟型ｓｈＲＮＡのレベル及びノックダウン効果を大きく増加させた。このアプローチは、既存のｍｉＲ及びｓｈＲＮＡ試薬をｍｉＲ－Ｅに容易に変換し、より効果的なｍｉＲ及びｓｈＲＮＡを生成することができる。
この技術を適用して、２９ｃ－Ｍ３０Ｅハイブリッド配列が、所望の成熟型ｍｉＲ－２９ｃ配列、及びＦｅｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．に記載の改変／最適化ｍｉＲ－３０骨格配列に基づいて生成された。この２９ｃ－Ｍ３０Ｅ配列（その予測２Ｄ構造については、２０１９年１２月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８の図２９参照）は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：μＤｙｓ－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ－ｉ２、ＥＦ１Ａ－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ、Ｕ６－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ。以下の２９ｃ－Ｍ３０Ｅの５’→３’配列は、連続配列であり、該連続配列の異なるセグメントを示すために異なるラインに人為的に分離されている。
Figure 2023510799000005
具体的には、上記の連続配列において、中央のラインは、パッセンジャー鎖配列、二重下線付きループ配列、及び成熟型ｍｉＲ－２９ｃガイド配列を表す。該パッセンジャー配列及びガイド配列は、互いに逆相補的であり、スナップバックして、介在ループ配列とともにステムループ構造を形成することができることに留意されたい。しかしながら、完全な逆相補配列は必要ではないことに留意されたい。内部にバルジ等がある可能性があるため、該２本の鎖は、場合によっては必ずしも互いに１００％相補的ではない（本サブセクションの最後の配列におけるガイド鎖及びパッセンジャー鎖を参照のこと）。上のライン及び下のラインは、ガイド配列の生成を高め、パッセンジャー鎖の生成を最小化するように最適化されたＭ３０Ｅの隣接骨格配列を表す。
同様のデザインで、ヒトＳＬＮを標的とするｓｉＲＮＡが、ｍｉＲ－３０Ｅ－ｈＳＬＮ－ｃ１において同じＭ３０Ｅ骨格配列に埋め込まれている（本パラグラフの直上及び直下の配列の上行及び下行、ならびに二重下線付きのループ配列を比較されたい）。ただし、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖は異なる。このいわゆるｃ１－Ｍ３０Ｅ配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ｃ１－Ｍ３０Ｅ－ｉ２、ｃ１－Ｍ３０Ｅ－３ＵＴＲ、及びｃ１－Ｍ３０Ｅ－ｐａ。
Figure 2023510799000006
ヒトＳＬＮもまた標的とする同様にデザインされた第二のｓｉＲＮＡが、ｍｉＲ－３０Ｅ－ｈＳＬＮ－ｃ２において同じＭ３０Ｅ骨格配列に埋め込まれている（本パラグラフの直上及び直下の配列の上行及び下行、ならびに二重下線付きのループ配列を比較されたい）。ただし、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖は異なる。このいわゆるｃ２－Ｍ３０Ｅ配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ｃ２－Ｍ３０Ｅ－ｉ２、ｃ２－Ｍ３０Ｅ－３ＵＴＲ、及びｃ２－Ｍ３０Ｅ－ｐａ。
Figure 2023510799000007
天然のｍｉＲ－３０骨格配列（「Ｍ３０Ｎ」）を使用した修飾ｍｉＲ－２９ｃの配列も、比較として以下に提供する。この場合のガイド鎖は、ループ配列の５’にあることに留意されたい。このＭ３０Ｎ骨格配列も同様にガイド鎖の生成を高めたが、調べた実験系のＭ３０Ｅ骨格配列よりも程度は低かった（データは示さず）。
Figure 2023510799000008
Ｂ．ｍｉＲ－１０１骨格配列を有するハイブリッドｍｉＲ－２９ｃ（２９ｃ－１０１）
ｍｉＲ－１０１骨格配列を使用した異なるｍｉＲ－２９ｃハイブリッド（２９ｃ－１０１、その予測２Ｄ構造については２０１９年１２月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８の図３０参照）を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と最後の２行は、ｍｉＲ－１０１骨格配列を表し、２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ配列、及びガイド鎖を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃである。この２９ｃ－１０１配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：μＤｙｓ－２９ｃ－１０１－ｉ２、μＤｙｓ－２９ｃ－３ＵＴＲ－１０１。
Figure 2023510799000009
Ｃ．ｍｉＲ－１５５骨格配列を有するハイブリッドｍｉＲ－２９ｃ（２９ｃ－１５５）
ｍｉＲ－１５５骨格配列を使用した異なるｍｉＲ－２９ｃハイブリッド（２９ｃ－１５５）を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と下行は、ｍｉＲ－１５５の隣接骨格配列を表し、２番目の行は、ガイド鎖、ループ配列、及びパッセンジャー鎖を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃである。この２９ｃ－１５５配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ＥＦ１Ａ－２９ｃ－１５５。
Figure 2023510799000010
同様にｍｉＲ－１５５骨格配列を使用した別のｍｉＲ－２９ｃハイブリッド（２９ｃ－１９ｎｔ）を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と下行は、ｍｉＲ－１５５の隣接骨格配列（直上の配列におけるものと同一）を表し、２番目の行は、ガイド鎖、ループ配列、及びパッセンジャー鎖を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃである。ここでのループ配列は、上記の配列の１７ｎｔループの代わりに、１９ｎｔであることに留意されたい。この２９ｃ－１９ｎｔ配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ＥＦ１Ａ－２９ｃ－１９ｎｔ、２９ｃ－１９ｎｔ－μＤｙｓ－ｐＡ、２９ｃ－１９ｎｔ－μＤｙｓ－３ＵＴＲ。
Figure 2023510799000011
Ｄ．ｍｉＲ－１５５骨格配列を有するハイブリッドｓｈＳＬＮ（ｓｈｍＳＬＮ－ｖ２及びｃ１／ｃ２－ｍ１５５）
ｓｈＳＬＮを含むｍｉＲ－１５５骨格配列を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と下行は、ｍｉＲ－１５５の隣接骨格配列を表し、２番目の行は、ガイド鎖、ループ配列（１９ｎｔ）、及びパッセンジャー鎖を有するマウスＳＬＮを標的とする成熟型ｓｈＲＮＡ（ｓｈｍＳＬＮ）である。このｓｈｍＳＬＮ－ｖ２配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ＥＦ１Ａ－ｍＳＬＮ、融合－ｖ１、μＤｙｓ－ｓｈｍＳＬＮ－ｖ１。
Figure 2023510799000012
ｓｈＳＬＮを含むｍｉＲ－１５５骨格配列を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と下行は、ｍｉＲ－１５５の隣接骨格配列を表し、２番目の行は、ガイド鎖、ループ配列（１９ｎｔ）、及びパッセンジャー鎖を有するマウスＳＬＮを標的とする別の成熟型ｓｈＲＮＡ（ｓｈｍＳＬＮ）である。上記の類似／関連するｓｈｍＳＬＮ配列と比較して、余分なジヌクレオチド塩基対ＴＴ：ＡＡ（または厳密には、ｓｉＲＮＡの３’末端のＵＵ）の存在は、生成されたガイド鎖ｓｉＲＮＡの効力の増加と関連している。このｓｈｍＳＬＮ－ｖ２配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ＥＦ１Ａ－ｍＳＬＮ－ｖ２、融合－ｖ２、μＤｙｓ－ｓｈｍＳＬＮ－ｖ２。
Figure 2023510799000013
別のｓｈＳＬＮを含むｍｉＲ－１５５骨格配列を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と下行は、ｍｉＲ－１５５の隣接骨格配列を表し、２番目の行は、ガイド鎖、ループ配列（１９ｎｔ）、及びパッセンジャー鎖を有するヒトＳＬＮを標的とする成熟型ｓｈＲＮＡである。このｃ１－ｍ１５５配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ｃ１－ｍ１５５－ｐａ、ｃ１－ｍ１５５－ｉ２、ｃ１－ｍ１５５－３ＵＴＲ。
Figure 2023510799000014
別のｓｈＳＬＮを含むｍｉＲ－１５５骨格配列を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上行と下行は、ｍｉＲ－１５５の隣接骨格配列を表し、２番目の行は、異なるガイド鎖、ループ配列（１９ｎｔ）、及びパッセンジャー鎖を有するヒトＳＬＮを標的とする成熟型ｓｈＲＮＡである。このｃ２－ｍ１５５配列は、以下の実施例で使用される下記の本主題のウイルスベクターに組み込まれている：ｃ２－ｍ１５５－ｐａ、ｃ２－ｍ１５５－ｉ２、ｃ２－ｍ１５５－３ＵＴＲ。
Figure 2023510799000015
Ｅ．ｍｉＲ－４５１骨格配列を有するハイブリッドｍｉＲ－２９ｃ（２９ｃ－４５１）
ｍｉＲ－４５１骨格配列を使用したｍｉＲ－２９ｃハイブリッド（２９ｃ－４５１、その予測２Ｄ構造については２０１９年１２月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８の図３１参照）を、本明細書における同じ命名規則を使用して以下に示す。ここで、上２行と下２行は、ｍｉＲ－４５１の隣接骨格配列を表し、３番目の行は、ガイド鎖、ループ配列、及びパッセンジャー鎖を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃである。
Figure 2023510799000016
Ｆ．Ｕ６駆動ｍｉＲ－２９ｃ及びｓｈＳＬＮ
以下の実験のセクションでは、ｍｉＲ－２９ｃのみまたはｓｈＳＬＮのみを発現するある特定の「ソロ」ウイルスベクター構築物の使用についても説明する。かかるソロ発現カセットは、強力なＰｏｌ ＩＩＩ Ｕ６プロモーターによって駆動される。この強力なＵ６プロモーターは、隣接するヌクレオチド配列なしで、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡまたはｓｈＳＬＮを直接生成するため、かかる配列は、修飾ｍｉＲ－２９ｃまたは修飾ｓｈＳＬＮ配列には属さない。しかしながら、比較の目的で、かかる配列も同じ命名法を使用してここに記載する。
該Ｕ６プロモーターによって駆動されるｍｉＲ－２９ｃを以下に示す（Ｕ６－２９ｃ－ｖ１）。ここで、２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ配列、及びガイド鎖を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃである。これは、ｐＧＦＰ－Ｕ６－ｓｈＡＡＶ－ＧＦＰベクターで「ソロ」対照ベクターを生成するために使用されている。以下の連続配列の最初の行のヌクレオチドは、Ｕ６プロモーターの転写開始部位後の最初の５ヌクレオチドであり、Ｔ６の転写終結配列は、以下の連続配列の最後の行のクローニングに使用された配列の前にある。
Figure 2023510799000017
該Ｕ６プロモーターによって駆動されるｓｈＳＬＮを以下に示す（Ｕ６－ｓｈｍＳＬＮ－ｖ１）。ここで、２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ配列、及びガイド鎖を有する成熟型ｓｈＳＬＮである。これは、実施例のＵ６－ｓｈｍＳＬＮ－ｖ１ベクターで使用されている。
Figure 2023510799000018
該Ｕ６プロモーターによって駆動されるｓｈＳＬＮを以下に示す（Ｕ６－ｍＳＬＮ－ｖ４）。ここで、２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ配列、及びガイド鎖を有する成熟型ｓｈＳＬＮである。これは、実施例のＵ６－ｍＳＬＮ－ｖ４ベクターで使用されている。
Figure 2023510799000019
Ｇ．分岐構築物
本主題のウイルスベクター内の分岐発現カセットから発現される、いくつかのｍｉＲ２９ｃコード配列、及びＳＬＮ標的化ｓｈＲＮＡコード配列を本明細書において以下に記載する。
概して、以下のすべての配列は、該Ｕ６プロモーターの転写開始部位の下流に直接挿入され、そのＴＴＴＴＴＴストレッチは、Ｔ６転写終結部位である。以下のすべてのデザインについて、デザイン戦略には、天然の骨格の２Ｄ及び３Ｄ構造を維持するために、隣接する配列、ループ及びパッセンジャー鎖のヌクレオチド配列の改変を含めた。ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡデザインの場合、主に、ステムループと隣接するヌクレオチド配列間の距離、中心ステムの構造、バルジの位置及びサイズ、内部ループ、及びステム内のミスマッチによって定義される２Ｄ／３Ｄ構造が、すべて考慮すべき重要な点である。
＞Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ＿２９ｃ＿ｖ１
Figure 2023510799000020
 該分岐発現カセットでＵ６プロモーターによって駆動されるｍｉＲ－２９ｃ。ここでは、５’から３’へ、パッセンジャー鎖配列、ループ配列（二重下線付き）、及びガイド鎖配列を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃが、Ｔ６転写終結部位の直５’に示されている。
＞Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ＿２９ｃ＿ｖ２
Figure 2023510799000021
 該分岐発現カセットでＵ６プロモーターによって駆動されるｍｉＲ－２９ｃ。ここでは、５’から３’へ、パッセンジャー鎖配列、ループ配列（二重下線付き）、及びガイド鎖配列を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃが、Ｔ６転写終結部位の直５’に示されている。
＞Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ＿２９ｃ＿ｖ３
Figure 2023510799000022
 該分岐発現カセットでＵ６プロモーターによって駆動されるｍｉＲ－２９ｃ。ここでは、５’から３’へ、パッセンジャー鎖配列、ループ配列（二重下線付き）、及びガイド鎖配列を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃが、Ｔ６転写終結部位の直５’に示されている。
＞Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ＿２９ｃ＿ｖ４
Figure 2023510799000023
 該分岐発現カセットでＵ６プロモーターによって駆動されるｍｉＲ－２９ｃ。ここでは、５’から３’へ、パッセンジャー鎖配列、ループ配列（二重下線付き）、及びガイド鎖配列を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃが、Ｔ６転写終結部位の直５’に示されている。
＞Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ＿２９ｃ＿ｖ５（ｍｉｒ－１５５骨格ベースのデザイン）
Figure 2023510799000024
 該分岐発現カセットでＵ６プロモーターによって駆動されるｍｉＲ－２９ｃ。ここでは、ｍｉＲ－２９ｃは、ｍｉＲ－１５５骨格配列を使用し、上行と下行の配列は、ｍｉＲ－１５５の隣接骨格配列を表し、２番目の行の配列は、５’から３’へ、ガイド鎖配列、ループ配列（二重下線付き）、及びパッセンジャー鎖配列を有する成熟型ｍｉＲ－２９ｃを含む。
＞Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ＿ｍＳＬＮ＿ｓｈｖ１
Figure 2023510799000025
 該分岐発現カセットでＵ６プロモーターによって駆動されるｍＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡ。ここでは、５’から３’へ、パッセンジャー鎖配列、ループ配列（二重下線付き）、及びガイド鎖配列を有する成熟型ｓｈｍＳＬＮが、Ｔ６転写終結部位の直５’に示されている。
＞Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ＿ｍＳＬＮ＿ｓｈｖ２
Figure 2023510799000026
 該分岐発現カセットでＵ６プロモーターによって駆動されるｍＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡ。ここでは、５’から３’へ、パッセンジャー鎖配列、ループ配列（二重下線付き）、及びガイド鎖配列を有する成熟型ｓｈｍＳＬＮが、Ｔ６転写終結部位の直５’に示されている。
＞Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ＿ｍＳＬＮ＿ｓｈｖ３
Figure 2023510799000027
 該分岐発現カセットでＵ６プロモーターによって駆動されるｍＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡ。ここでは、５’から３’へ、パッセンジャー鎖配列、ループ配列（二重下線付き）、及びガイド鎖配列を有する成熟型ｓｈｍＳＬＮが、Ｔ６転写終結部位の直５’に示されている。
＞Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ＿ｍＳＬＮ＿ｓｈｖ４
Figure 2023510799000028
 該分岐発現カセットでＵ６プロモーターによって駆動されるｍＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡ。ここでは、５’から３’へ、パッセンジャー鎖配列、ループ配列（二重下線付き）、及びガイド鎖配列を有する成熟型ｓｈｍＳＬＮが、Ｔ６転写終結部位の直５’に示されている。
以下の配列は、ヒトＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈｈＳＬＮ）のみをコードするソロ構築物（すなわち、分岐カセットではない）、または分岐発現カセットでＧＯＩ（例えば、μＤｙｓコード配列）及びヒトＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡの両方をコードする組み合わせ（「コンボ」）構築物のいずれかで使用されている。図６を参照されたい。
＞Ｕ６－ｈＳＬＮ－ｃ１－ｖ１
Figure 2023510799000029
 該Ｕ６プロモーターによって駆動されるｈＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡ。ここでは、５’から３’へ、パッセンジャー鎖配列、ループ配列（二重下線付き）、及びガイド鎖配列を有する成熟型ｓｈｈＳＬＮが、Ｔ６転写終結部位の直５’に示されている。
＞Ｕ６－ｈＳＬＮ－ｃ１－ｖ２
Figure 2023510799000030
 該Ｕ６プロモーターによって駆動されるｈＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡ。ここでは、５’から３’へ、パッセンジャー鎖配列、ループ配列（二重下線付き）、及びガイド鎖配列を有する成熟型ｓｈｈＳＬＮが、Ｔ６転写終結部位の直５’に示されている。
＞Ｕ６－ｈＳＬＮ－ｃ２－ｖ１
Figure 2023510799000031
 該Ｕ６プロモーターによって駆動されるｈＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡ。ここでは、５’から３’へ、パッセンジャー鎖配列、ループ配列（二重下線付き）、及びガイド鎖配列を有する成熟型ｓｈｈＳＬＮが、Ｔ６転写終結部位の直５’に示されている。
＞Ｕ６－ｈＳＬＮ－ｃ２－ｖ２
Figure 2023510799000032
 該Ｕ６プロモーターによって駆動されるｈＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡ。ここでは、５’から３’へ、パッセンジャー鎖配列、ループ配列（二重下線付き）、及びガイド鎖配列を有する成熟型ｓｈｈＳＬＮが、Ｔ６転写終結部位の直５’に示されている。
＞Ｕ６－ｈＳＬＮ－ｃ３－ｖ１
Figure 2023510799000033
 該Ｕ６プロモーターによって駆動されるｈＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡ。ここでは、５’から３’へ、パッセンジャー鎖配列、ループ配列（二重下線付き）、及びガイド鎖配列を有する成熟型ｓｈｈＳＬＮが、Ｔ６転写終結部位の直５’に示されている。
＞Ｕ６－ｈＳＬＮ－ｃ３－ｖ２
Figure 2023510799000034
 該Ｕ６プロモーターによって駆動されるｈＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡ。ここでは、５’から３’へ、パッセンジャー鎖配列、ループ配列（二重下線付き）、及びガイド鎖配列を有する成熟型ｓｈｈＳＬＮが、Ｔ６転写終結部位の直５’に示されている。
本発明のウイルスベクターは、上記の様々な筋ジストロフィーが挙げられるがこれらに限定されないいくつかの遺伝性疾患を治療するための遺伝子治療に使用され得る。本発明の分岐ベクターを使用して治療され得るさらなる遺伝性疾患のいくつか
を以下のさらなるセクションに記載する。
アルファ－１アンチトリプシン欠損症（Ａ１ＡＤまたはＡＡＴＤ）の治療
アルファ－１アンチトリプシン欠損症（Ａ１ＡＤまたはＡＡＴＤ）は、Ａ１ＡＴタンパク質（セルピンスーパーファミリープロテアーゼインヒビター）の不十分な産生をもたらすＳＥＲＰＩＮＡ１（セルピンプロテアーゼインヒビター、クレードＡ、メンバー１）の変異に起因する遺伝性疾患である。アルファ－１アンチトリプシン欠損症は、世界中で生じるが、その有病率は、人口によって異なる。この障害は、ヨーロッパ系の１，５００～３，５００人に約１人の割合で発生する。これは、アジア系の人ではまれである。プロテアーゼインヒビターであるその名前にもかかわらず、Ａ１ＡＴは、トリプシンだけを阻害するわけではない。それは、主にエラスターゼと結合し／複合体を形成するが、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、及び細菌プロテアーゼとも結合し／複合体を形成する。それは、肝臓で産生され、通常は体循環に入る。血中でのその参照範囲は、０．９～２．３ｇ／Ｌであるが、急性炎症時にはその濃度は何倍にも上昇し得る。
Ａ１ＡＴは、炎症細胞の酵素、特に好中球エラスターゼから組織を保護する。血液が不十分な量のＡ１ＡＴまたは機能的に欠陥のあるＡ１ＡＴを含む場合（例えば、アルファ－１アンチトリプシン欠損症）、好中球エラスターゼは、過度に自由にエラスチンを分解し、肺の弾性が低下し、呼吸器合併症、例えば、成人における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）をもたらす。
さらに、欠陥のあるＡ１ＡＴは、その発生部位である肝臓から出ることができず、その代わりに肝臓に蓄積し、成人または小児のいずれかで肝硬変を引き起こす可能性がある。例えば、いわゆるＺ変異／アレルは、肝細胞でＡ１ＡＴタンパク質を重合させ、血中へのその分泌を妨げるとともに、凝集した変異タンパク質が毒性機能の獲得を示す（その一方で、動物のデータでは、野生型タンパク質の上方制御がない場合でも、変異タンパク質のレベルの単なる低下が有益な効果を有することが示されている）。
従って、疾患Ａ１ＡＤは、肺疾患及び／または肝臓疾患として現れる可能性があり、その発症機序は、好中球エラスターゼが遮断されないこと及び肝臓での異常なＡ１ＡＴの蓄積を含み得る。それは、１つの欠陥のあるアレルが２つの欠陥のあるアレルより軽度の疾患を引き起こす傾向があるという点で常染色体共優性である。肺疾患の症状としては、息切れ、喘鳴、または肺感染症のリスクの増加が挙げられる。Ａ１ＡＤの合併症としてはまた、ＣＯＰＤ、肝硬変、新生児黄疸、または脂肪織炎が挙げられ得る。
Ａ１ＡＴは、成熟型の３９４アミノ酸からなる単鎖糖タンパク質であり、多くのグリコフォームを示す。成熟型Ａ１ＡＴタンパク質は、ヒト染色体１４ｑ３２に局在するＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の約１．２ｋｂ（１２５４ｎｔ）のポリヌクレオチドによってコードされ得る。ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の７５を超える変異が特定されており、その多くは臨床的に重大な影響を及ぼす（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｐｈａ１－Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６０ （２６）：２７４９－２７５７，２００９参照（参照することにより本明細書に組み込まれる））。
例えば、重度の欠損症であるＰｉＺ（すなわち、Ｚアレル）の最も一般的な原因は、３４２位でのグルタミン酸からリジンへの変異（Ｅ３４２Ｋ、またはＧｌｕ３４２Ｌｙｓ、以下の表を参照）につながる単一の塩基対置換である。ホモ接合型ＺＺ表現型は、肺気腫及び肝臓疾患のリスクが高いことに関連している。その一方で、ＰｉＳ（すなわち、Ｓアレル）は、２６４位でのグルタミン酸からバリンへの変異によって引き起こされる（Ｅ２６４Ｖ、またはＧｌｕ２６４Ｖａｌ、以下の表を参照）。ＳＳホモ接合体は肺気腫のリスクはないが、ＳとＺ、またはＳとヌルのヘテロ接合体は、肺気腫のリスクがわずかに高くなる。他のよりまれな形態、例えば、肝臓と肺の両疾患のリスクの増加に関連するＰｉＭ（Ｍａｌｔｏｎ）アレルも記載されており、その一部は、当技術分野で使用されている様々な命名法とともに以下の表に記載されている。他のアレルとしては、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇアレル（Ｍｅｔ３５８Ａｒｇ）が挙げられ、これは、Ａ１ＡＴ活性部位で発生し、その機能を変更して、エラスターゼではなくトロンビン及び第ＸＩ因子の強力な阻害剤になり、出血障害を引き起こす。
現在、肺疾患の治療には、気管支拡張薬、吸入ステロイド、及び感染症が発生した場合の抗生物質が含まれる。Ａ１ＡＴタンパク質の静脈内注入、または重度の疾患では、肺移植も推奨される場合がある。重度の肝臓疾患がある場合は、肝移植が選択肢となる場合がある。インフルエンザ、肺炎球菌、肝炎の予防接種も推奨されている。
従って、本発明のＡＡＶベクターは、本発明の分岐ベクターまたは融合ベクターを使用して、（１）野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１のコード配列を含む第一の治療薬、及び（２）欠陥のあるＡ１ＡＴタンパク質の発現が減少または排除されるような変異型ＳＥＲＰＩＮＡ１に対するアンタゴニストを含む第二の治療薬を送達することができるという点で、Ａ１ＡＤを治療するために使用することができる。
例えば、該ｗｔ ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子は、１２５７ｎｔのポリヌクレオチド配列（下記参照）であり得、肝臓特異的エンハンサー及び／またはプロモーターのいずれか１つを使用して肝臓で発現され得る。
ＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＧＣＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＴＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡＣＣＣＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＧＴＴＣＧＣＣＴＴＣＡＧＣＣＴＡＴＡＣＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＴＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＡＡＴＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＴＣＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴＴＴＧＣＡＡＴＧＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡＣＡＣＴＣＡＣＧＡＴＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＡＡＴＴＴＣＡＡＣＣＴＣＡＣＧＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＧＣＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＴＣＣＴＣＣＧＴＡＣＣＣＴＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＴＧＧＣＣＴＧＴＴＣＣＴＣＡＧＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＴＡＡＡＡＡＧＴＴＧＴＡＣＣＡＣＴＣＡＧＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴＧＴＣＡＡＣＴＴＣＧＧＧＧＡＣＡＣＣＧＡＡＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＡＧＡＴＣＡＡＣＧＡＴＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＣＡＡＧＧＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＧＣＴＴＧＡＣＡＧＡＧＡＣＡＣＡＧＴＴＴＴＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＡＡＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＡＡＡＧＧＣＡＡＡＴＧＧＧＡＧＡＧＡＣＣＣＴＴＴＧＡＡＧＴＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＴＴＡＧＧＣＡＴＧＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＴＧＴＡＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＣＡＣＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＧＴＣＴＧＣＣＡＧＣＴＴＡＣＡＴＴＴＡＣＣＣＡＡＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＡＣＴＧＧＡＡＣＣＴＡＴＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＣＴＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＣＴＡＡＧＧＴＣＴＴＣＡＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＣＧＧＧＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＡＧＧＣＡＣＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＴＧＴＴＴＴＴＡＧＡＧＧＣＣＡＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＡＴＣＣＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＡＡＡＣＣＣＴＴＴＧＴＣＴＴＣＴＴＡＡＴＧＡＴＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＡＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＴＣＣＣＡＣＣＣＡＡＡＡＡＴＡＡ
肝臓プロモーター（例えば、肝臓特異的ＡｐｏＥエンハンサー及びα１－アンチトリプシンプロモーターは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／８８４５３８９で見出すことができる。これは、Ｍ型ＳＥＲＰＩＮＡ１、及びＡＡＴＤを引き起こすＳＥＲＰＩＮＡ１バリアント型に対する任意のＲＮＡｉ剤の発現を駆動する。
ヒトでの発現用にコドン最適化されたＳＥＲＰＩＮＡ１（下記参照）も使用され得る。
ＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＧＴＧＴＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＴＴＧＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＴＣＴＴＧＣＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＧＡＴＡＣＣＡＧＴＣＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＣＣＴＡＣＴＴＴＣＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＣＧＣＣＣＡＡＣＣＴＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＡＴＣＧＧＣＡＧＣＴＣＧＣＧＣＡＣＣＡＧＴＣＣＡＡＴＴＣＡＡＣＣＡＡＣＡＴＡＴＴＴＴＴＣＴＣＡＣＣＧＧＴＴＡＧＣＡＴＣＧＣＡＡＣＴＧＣＧＴＴＣＧＣＡＡＴＧＴＴＧＴＣＣＣＴＣＧＧＴＡＣＡＡＡＡＧＣＣＧＡＣＡＣＧＣＡＴＧＡＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＡＡＣＴＴＴＡＡＴＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＴＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＴＴＣＡＣＧＡＧＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＣＡＣＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＣＣＧＧＡＴＴＣＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＡＣＡＡＣＴＧＧＧＡＡＣＧＧＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＴＣＴＧＡＧＧＧＡＣＴＴＡＡＡＣＴＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＴＴＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＧＣＴＣＴＡＣＣＡＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＧＧＴＴＡＡＴＴＴＣＧＧＧＧＡＴＡＣＧＧＡＡＧＡＧＧＣＧＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＴＡＡＡＣＧＡＴＴＡＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＣＡＣＡＧＧＧＴＡＡＡＡＴＣＧＴＴＧＡＴＴＴＧＧＴＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＧＣＴＣＴＧＧＴＡＡＡＴＴＡＣＡＴＡＴＴＣＴＴＴＡＡＧＧＧＣＡＡＡＴＧＧＧＡＧＣＧＡＣＣＧＴＴＣＧＡＡＧＴＣＡＡＡＧＡＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＴＴＣＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＡＧＴＧＡＣＣＡＣＣＧＴＡＡＡＧＧＴＣＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＡＣＧＣＣＴＣＧＧＧＡＴＧＴＴＴＡＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＴＡＡＡＡＡＡＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＧＡＡＡＴＧＣＡＡＣＣＧＣＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＡＣＡＴＧＡＴＡＴＡＡＴＣＡＣＣＡＡＡＴＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＧＴＣＣＧＣＴＡＧＴＴＴＧＣＡＴＴＴＧＣＣＴＡＡＡＴＴＧＴＣＣＡＴＡＡＣＡＧＧＣＡＣＡＴＡＣＧＡＴＣＴＴＡＡＧＴＣＣＧＴＣＣＴＴＧＧＡＣＡＡＣＴＣＧＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＧＴＣＴＴＣＡＧＴＡＡＣＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＴＧＡＧＴＧＧＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＣＴＴＴＧＡＡＡＴＴＧＴＣＣＡＡＡＧＣＧＧＴＡＣＡＴＡＡＡＧＣＡＧＴＧＣＴＴＡＣＴＡＴＡＧＡＣＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＧＡＴＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＧＣＧＡＴＡＣＣＡＡＴＧＴＣＣＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＧＴＡＴＴＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＧＡＡＣＡＧＡＡＴＡＣＡＡＡＡＡＧＴＣＣＣＣＴＣＴＴＴＡＴＧＧＧＴＡＡＧＧＴＣＧＴＴＡＡＴＣＣＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＴＡＡ
ある特定の実施形態では、該アンタゴニストは、欠陥のあるＡ１ＡＴ（野生型Ａ１ＡＴではなく）のｍＲＮＡを標的とするＲＮＡｉ試薬（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等）をコードする。
ある特定の実施形態では、該ｓｉＲＮＡの標的位置は、本主題のウイルスベクターから発現されるＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子が、天然のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子配列とは異なり、それ故該変異型ＳＥＲＰＩＮＡ１に対するｓｉＲＮＡによって標的とされないコドン最適化コード配列及び最適化ＵＴＲを有し得るため、ＳＥＲＰＩＮＡ１の３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、及び／またはコード領域を含むことができる。説明のため、変異型ＳＥＲＰＩＮＡ１を標的とするいくつかの代表的なｓｈＲＮＡ配列を以下に示す。
＞ＳＥＲＰＩＮＡ１－ｓｉＲＮＡ－１（２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ、及びガイド鎖配列を表す）：
Figure 2023510799000035
＞ＳＥＲＰＩＮＡ１－ｓｉＲＮＡ－２（２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ、及びガイド鎖配列を表す）
Figure 2023510799000036
ある特定の実施形態では、該欠陥のあるＡ１ＡＴは、Ｂ（Ａｌｈａｍｂｒａ）アレル、Ｍ（Ｍａｌｔｏｎ）アレル、Ｓアレル、Ｍ（Ｈｅｅｒｌｅｎ）アレル、Ｍ（Ｍｉｎｅｒａｌ Ｓｐｒｉｎｇｓ）アレル、Ｍ（ｐｒｏｃｉｄａ）アレル、Ｍ（Ｎｉｃｈｉｎａｎ）アレル、Ｉアレル、Ｐ（Ｌｏｗｅｌｌ）アレル、ヌル（Ｇｒａｎｉｔｅ ｆａｌｌｓ）アレル、ヌル（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ）アレル、ヌル（Ｍａｔｔａｗａ）アレル、ヌル（ｐｒｏｃｉｄａ）アレル、ヌル（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ １）アレル、ヌル（Ｂｏｌｔｏｎ）アレル、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈアレル、Ｖ（Ｍｕｎｉｃｈ）アレル、Ｚ（Ａｕｇｓｂｕｒｇ）アレル、Ｗ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）アレル、ヌル（Ｄｅｖｏｎ）アレル、ヌル（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ）アレル、Ｚ（Ｗｒｅｘｈａｍ）アレル、ヌル（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ ２）アレル、ヌル（Ｒｉｅｄｅｎｂｕｒｇ）アレル、Ｋａｌｓｈｅｋｅｒ－Ｐｏｌｌｅｒアレル、Ｐ（Ｄｕａｒｔｅ）アレル、ヌル（Ｗｅｓｔ）アレル、Ｓ（Ｉｉｙａｍａ）アレル、及びＺ（Ｂｒｉｓｔｏｌ）アレルを含む。
ある特定の実施形態では、該欠陥のあるＡ１ＡＴは、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇアレル、及び／または以下の表に記載する変異の１つ以上を含む。
２つの変異アレルが存在する場合、該第二の治療薬は、各々が変異アレルの少なくとも１つの特定の領域を標的とする（同じベクターによってコードされる野生型アレルは除外する）複数のアンタゴニストをコードしてもよい。例えば、１つのアンタゴニストは、Ｚアレル変異を標的とするｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡであってよく、別のアンタゴニストは、Ｓアレル変異を標的とするｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ等であってよい。
ある特定の実施形態では、本主題のベクターは、野生型アレルのコードにかかわらず、複数の欠陥のあるＡ１ＡＴアレルに対する複数のアンタゴニストをコードし得る。
本明細書で使用される、「野生型アレル」は、正常な（欠陥のない）レベルのＡ１ＡＴ阻害活性を有するバリアントを指し、Ｍ１Ａ（残基２１３のＡｌａ）、Ｍ１Ｖ（残基２１３のＶａｌ）、Ｍ２、Ｍ３アレル等を含む（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：４１１－７，１９８９、参照することにより組み込まれる）。
Figure 2023510799000037
ある特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、肝細胞及び組織に優先的に感染する。例えば、ＡＡＶ８キャプシド（ＡＡＶ２／８と命名）を用いた組み換えＡＡＶ２ベクターゲノムの疑似血清型決定は、肝細胞に対する指向性を増強する。
リピート伸長障害
本発明のベクターは、遺伝子全体で起こり得る拡張されたヌクレオチドリピートによって引き起こされるある特定のいわゆるリピート伸長障害（ＲＥＤ）を治療するために使用することもできる。
かかるＲＥＤの例としては、５’ＵＴＲ領域におけるトリプレットヌクレオチドリピート（例えば、脆弱Ｘ症候群（ＣＧＧリピート）、ＦＸＴＡＳ（ＣＧＧリピート）、脆弱ＸＥ精神遅滞（ＧＣＣリピート）、及び脊髄小脳失調症１２型（ＣＡＧリピート））、エクソンにおけるトリプレットヌクレオチドリピート（例えば、脊髄小脳失調症１、２、３、６、７、及び１７型（ＣＡＧリピート）、ハンチントン病（ＣＡＧリピート）、ハンチントン病様２（ＣＡＧリピート）、球脊髄性筋萎縮症（ＣＡＧリピート）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＣＡＧリピート）、多発性骨格異形成（ＧＡＣリピート）、合多指症症候群（ＧＣＧリピート）、手足生殖器症候群（ＧＣＧリピート）、鎖骨頭蓋骨異形成症（ＧＣＧリピート）、全前脳欠損症（ＧＣＧリピート）、眼球咽頭型筋ジストロフィー
（ＧＣＧリピート）、先天性中枢性低換気症候群（ＧＣＧリピート）、ＢＰＥＩ症候群（ＧＣＧリピート）、及びＸ連鎖精神遅滞（ＧＣＧリピート））、イントロンにおけるヌクレオチドリピート（例えば、フリードライヒ運動失調症（ＧＡＡリピート）、筋緊張性ジストロフィー２型（ＣＣＴＧリピート）、脊髄小脳失調症１０型（ＡＴＴＣＴリピート）、脊髄小脳失調症３１型（ＴＧＧＡＡリピート）、脊髄小脳失調症３６型（ＧＧＣＣＴＧリピート）、及び筋萎縮性側索硬化症（ＧＧＧＧＣＣリピート））、ならびに３’ＵＴＲ領域におけるトリプレットヌクレオチドリピート（例えば、筋緊張性ジストロフィー１型（ＣＴＧリピート）及び脊髄小脳失調症８型（ＣＴＧリピート））が挙げられる。
例えば、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）は、脳の運動制御に関連する部分（小脳）の変性変化を特徴とする遺伝性運動失調症のグループであり、脊髄の場合もある。特定のＳＣＡ型の原因となる突然変異（変化した）遺伝子に従って分類された識別の順序に従って、多数のＳＣＡ型が存在する（ＯＭＩＭウェブサイトのＳＣＡ１－４５参照）順序。その徴候と症状は型によって異なり得るが、類似しており、協調性のない歩行（足取り）、手と目の協調不全、及び異常な発語（構音障害）が含まれ得る。Ｍａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ病としても知られるＳＣＡ３は、最も一般的なＳＣＡ型である。ＳＣＡ型９～３６はまれであり、あまりよく特徴付けられていない。
ヒト染色体上の遺伝子座、コードされたタンパク質のサイズを含む遺伝子産物、及び基礎となる変異の型を含めた、選択されたＳＣＡを以下の表にまとめる。
Figure 2023510799000038
ＳＣＡは、常染色体優性遺伝形式で遺伝する。脊髄小脳という用語を使用する他の疾患は、常染色体劣性遺伝（「ＳＣＡＲ」）を有し得る。現在の治療は支持的であり、ＳＣＡの患者に存在する徴候と症状（原因ではなく）に基づいている。
これらのＲＥＤの共通の特徴の１つは、それらすべてが、何度も繰り返されるＤＮＡのセグメントであるヌクレオチドリピート、主にトリヌクレオチドリピートを含むことである。これらの反復が存在しても問題を引き起こさないことは異常ではない場合もあるが、通常よりも多くのリピートは、影響を受ける遺伝子の機能を妨害し、遺伝子疾患を引き起こす可能性がある。かかるトリヌクレオチドリピートは不安定であり、親から子に移ると長さが変化する可能性がある。リピート数の増加は、多くの場合、発症年齢の早期化とより深刻な疾患につながる。
常染色体優性疾患では、各細胞の原因遺伝子の変異コピーが１つあれば、該疾患の徴候や症状を引き起こすのに十分である。従って、かかるＲＥＤの治療を成功させるには、欠陥遺伝子を置換するだけでなく、欠陥遺伝子または遺伝子産物を減少または排除する必要があり得る。
具体例として、最も一般的なＳＣＡは、ＳＣＡ３、またはＭａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ病（ＭＪＤ）であり、主に運動失調、痙性、及び眼球運動異常を特徴とする常染色体優性進行性神経障害である。ＭＪＤは、世界中で１００，０００人あたり１～５人が罹患していると推定されている。ＭＪＤは、染色体１４ｑ３２上のアタキシン－３遺伝子（ＡＴＸＮ３）のＧｉｎリピートをコードするヘテロ接合（ＣＡＧ）ｎトリヌクレオチドリピートの伸長によって引き起こされる。正常な人は最大４４個のＱリピートを有し、ＭＪＤ患者は、５２～８６個のＱリピートを有する。Ａｌｖｅｓｅｔａｌ．（ＰＬＯＳＯＮＥ３（１０）：ｅ３３４１，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００３３４１）は、Ｍａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ病（ＭＪＤ）患者の７０％超に一塩基多型（ＳＮＰ）が存在することを示した。このＳＮＰは、インビトロ及びインビボのＭＪＤのラットモデルの両方で、レンチウイルスベクター媒介ＲＮＡｉ（ｓｈＲＮＡ）を使用して、変異型アタキシン－３アレルを選択的に不活性化するために使用され得る。このアプローチの選択性は、インビトロでは変異型アレル特異的ｓｈＲＮＡの共発現による野生型アタキシン－３発現の保存によって、またインビボでは野生型アレル特異的ｓｈＲＮＡの変異型アタキシン－３遺伝子発現に対する限定効果によって実証された。アタキシン－３のアレル特異的サイレンシングは、ＭＪＤに関連する神経病理学的異常の重症度を大幅に低下させた。従って、本発明のベクターを使用して、欠陥のあるＳＣＡ３アレルのアンタゴニストと、変異型アレル特異的アンタゴニストが標的とすることができないＳＣＡ３の野生型アレルを同時に送達できる場合、同様のアプローチを使用することができる。
野生型アレルと変異型アレルの間にＳＮＰが存在する場合、同じアプローチが任意の他のＲＥＤに対して使用され得る。
従って、本発明のＡＡＶベクターは、本発明の分岐ベクターまたは融合ベクターを使用して、（１）治療されるＲＥＤに内在する野生型遺伝子のコード配列を含む第一の治療薬、及び（２）欠陥のあるＲＥＤ遺伝子及び／またはタンパク質の発現が減少または排除されるような変異型ＲＥＤ遺伝子に対するアンタゴニストを含む第二の治療薬を送達することができるという点で、ＲＥＤのいずれかを治療するために使用することができる。
ある特定の実施形態では、該ＲＥＤは、それぞれ、ＳＣＡ１、２、３、６、７、８、１０、１２、または１７であり、該第一の治療薬は、それぞれ、野生型アタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰのコード配列を含み、（２）該第二の治療薬は、それぞれ、アタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰの変異型アレルに特異的なアンタゴニストを含む。
例えば、該ｗｔアタキシン－３遺伝子ＡＴＸＮ３は、１０８６ｎｔのポリヌクレオチド配列（下記参照）によってコードされ得、シナプシンプロモーター等のニューロン特異的プロモーターのいずれか１つを使用してニューロンで発現され得る。
ＡＴＧＧＡＧＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧＣＴＣＡＣＴＴＴＧＴＧＣＴＣＡＡＣＡＴＴＧＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＡＴＴＧＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＡＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＡＴＴＡＴＣＣＴＣＡＡＴＴＧＣＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＡＣＴＡＧＴＧＡＡＧＡＴＴＡＴＣＧＣＡＣＧＴＴＴＴＴＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＡＴＧＧＡＴＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＴＣＡＧＧＴＴＡＴＡＡＧＣＡＡＴＧＣＣＴＴＧＡＡＡＧＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＧＡＡＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＴＣＣＡＧＡＧＴＡＴＣＡＧＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＧＡＴＣＣＴＡＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＴＡＴＧＣＡＡＴＴＡＴＡＡＧＧＡＡＣＡＣＴＧＧＴＴＴＡＣＡＧＴＴＡＧＡＡＡＡＴＴＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＴＧＧＴＴＴＡＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＴＣＴＣＴＴＧＡＣＧＧＧＴＣＣＡＧＡＡＴＴＡＡＴＡＴＣＡＧＡＴＡＣＡＴＡＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＣＡＡＴＴＡＣＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＴＴＴＧＴＣＧＴＴＡＡＧＧＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＧＣＧＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＴＴＡＧＧＧＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＧＣＡＴＣＧＡＣＣＡＡＡＡＣＴＴＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＴＡＧＣＡＣＡＡＣＴＡＡＡＡＧＡＧＣＡＡＡＧＡＧＴＣＣＡＴＡＡＡＡＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＧＡＧＴＧＴＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡＴＧＡＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＡＴＧＴＴＡＧＡＣＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＴＴＴＧＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＴＡＡＧＴＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧＡＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＴＡＴＴＣＡＧＣＴＡＡＧＴＡＴＧＣＡＡＧＧＴＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＣＡＴＡＴＣＴＣＡＡＧＡＴＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＧＴＡＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＴＴＣＡＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＧＡＡＧＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＣＡＣＴＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＣＴＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＧＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＴＡＧＡＡＡＣＴＧＴＣＡＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＧＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡ
ヒトでの発現に対するコドン最適化ＡＴＸＮ３（下記参照）も使用され得る。
ＡＴＧＧＡＡＡＧＴＡＴＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧＧＡＡＧＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＡＡＣＡＴＴＧＴＣＴＴＡＡＣＡＡＣＴＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＧＧＡＧＴＡＴＴＴＣＡＧＴＣＣＴＧＴＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＡＴＧＣＧＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＴＡＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＧＣＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＡＧＣＧＧＧＡＡＣＡＴＧＧＡＣＧＡＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＡＴＣＣＡＧＧＴＣＡＴＡＡＧＴＡＡＣＧＣＧＣＴＣＡＡＧＧＴＣＴＧＧＧＧＴＴＴＧＧＡＡＣＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＣＣＣＴＧＡＧＴＡＴＣＡＧＡＧＡＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＡＣＣＣＴＡＴＡＡＡＣＧＡＧＡＧＡＴＣＣＴＴＴＡＴＡＴＧＴＡＡＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＴＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＴＡＣＧＧＡＡＡＴＴＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＧＧＧＴＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＴＡＴＣＣＧＡＣＡＣＧＴＡＴＴＴＧＧＣＧＣＴＴＴＴＴＣＴＣＧＣＣＣＡＧＴＴＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＡＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＴＴＧＴＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＣＡＧＣＡＡＡＴＧＣＡＴＡＧＡＣＣＧＡＡＧＴＴＧＡＴＴＧＧＣＧＡＧＧＡＡＣＴＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴＴＧＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＴＣＧＡＡＧＣＡＡＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＡＧＡＣＧＡＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＡＧＣＣＣＴＣＧＣＴＴＴＧＡＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＧＡＴＡＧＡＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＡＣＧＡＧＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＴＧＣＡＧＧＧＡＡＧＴＴＣＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＴＣＴＣＡＡＧＡＣＡＴＧＡＣＧＣＡＡＡＣＧＡＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＴＣＴＣＡＣＴＡＧＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＡＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＧＧＧＴＧＡＴＣＴＣＡＧＣＧＧＧＣＡＡＡＧＴＡＧＣＣＡＣＣＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＣＣＣＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＧＡＴＧＣＡＡＴＧＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＧＴＴＡＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＣＧＡＡＡＣＡＧＴＣＣＧＣＡＡＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＧＴＡＡＡＡＡＧＴＡＡ
ある特定の実施形態では、該アンタゴニストは、欠陥のあるアタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰの（それらの野生型の対応部分ではない）ｍＲＮＡを標的とするＲＮＡｉ試薬（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等）をコードする。該アレルの特異性は、ＳＮＰに基づき得る。
ある特定の実施形態では、該ｓｉＲＮＡの標的位置は、本主題のウイルスベクターから発現されるＡＴＸＮ３遺伝子が、天然のＡＴＸＮ３遺伝子配列とは異なり、それ故該変異型ＡＴＸＮ３に対するｓｉＲＮＡによって標的とされないコドン最適化コード配列及び最適化ＵＴＲを有し得るため、ＡＴＸＮ３のＣＡＧリピート、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、及び／またはコード領域を含み得る。説明のため、変異型ＡＴＸＮ３を標的とするいくつかの代表的なｓｈＲＮＡ配列を以下に示す。
＞ＡＴＸＮ３－ｓｉＲＮＡ－１（２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ、及びガイド鎖配列を表す）：
Figure 2023510799000039
＞ＡＴＸＮ３－ｓｉＲＮＡ－２（２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ、及びガイド鎖配列を表す）：
Figure 2023510799000040
＞ＡＴＸＮ３－ｓｉＲＮＡ－３（ｍｉｒ－３０骨格）（２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ、及びガイド鎖配列を表す）：
Figure 2023510799000041
＞ＡＴＸＮ３－ｓｉＲＮＡ－４（ｍｉｒ－３０骨格）（２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ、及びガイド鎖配列を表す）：
Figure 2023510799000042
該ＡＴＸＮ３及び／またはコードされたＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、任意のニューロン選択的プロモーター、例えば、シナプシンプロモーター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ４２２９５８３／）、または天然のＡＴＸＮ３プロモーター、またはＵ６プロモーター（特に、ｓｈＲＮＡに対する）から発現され得る。
本発明のベクターによって治療可能な別のＲＥＤは、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）であり、これは、骨格筋及び平滑筋、ならびに眼、心臓、内分泌系、及び中枢神経系に影響を与える常染色体優性多系統遺伝性疾患である。軽度から重度までの一連の臨床所見は、軽度、古典的、先天性の３つのやや重複する表現型に分類されている。現在、ＤＭ１の治療法はない。治療は、存在する徴候と症状に基づいて行われる。
ＺＮＦ９遺伝子のイントロン１にＣＣＴＧヌクレオチド伸長を有し、まれでありかつより軽度の症状と関連する筋緊張性ジストロフィー２型またはＤＭ２とは対照的に
、ＤＭ１は、ＤＭＰＫ遺伝子の非コード３’－ＵＴＲ領域でのＣＴＧトリヌクレオチドリピートの伸長によって引き起こされる。ＣＴＧリピートの長さは５～３４が正常であると見なされ、３５～４９リピートが易変正常と見なされるが、５０を超えるリピートは、完全な浸透度異常と見なされる。分子遺伝学的検査では、罹患者のほぼ１００％で病的バリアントが検出される。ＤＭ１は、世界中で８，０００人に１人が罹患すると推定されている。
ＤＭＰＫ遺伝子によって作られるタンパク質、すなわち、筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼは、細胞内及び細胞間の情報伝達及び刺激伝達に役割を果たすと考えられている。それは、心臓、脳、及び骨格筋の細胞が正しく機能するために重要であると考えられている。ＣＴＧリピートの数が通常より多いと、より長く有毒なＲＮＡが創出される。これは、主にそれが重要なタンパク質を閉じ込めて無効にするため、細胞に問題を引き起こす。これにより、筋肉やその他の組織の細胞の正常な機能が妨げられ、ＭＤ１の徴候及び症状につながる。従って、ＤＭ１の治療のデザインにおける重要な戦略は、細胞タンパク質、特にｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ１またはＭＢＮＬ１と呼ばれるものをＲＮＡウェブから解放すること、及び／またはＭＢＮＬ１の発現を増加させることである。
従って、ある特定の実施形態では、該ＲＥＤはＤＭ１であり、この場合、第一の治療薬は、野生型ＤＭＰＫ（例えば、正常数の５～３４個のＣＴＧリピートを有する、好ましくは、１２個以下のＣＴＧリピート、すなわち、正常細胞または非ＤＭ１細胞に見出されるＣＴＧリピートの平均数を有する）のコード配列を含み（２）第二の治療薬は、ＤＭＰＫの変異型アレル（例えば、５０を超えるＣＴＧリピートを有するもの）に特異的なアンタゴニストを含む。
例えば、該ｗｔ ＤＭＰＫ遺伝子は、１８８７ｎｔ（数少ない利用可能なＤＭＰＫアイソフォームの１つについては下記参照）によってコードされ得、普遍的に発現される場合もあれば、ＣＫ８等の筋特異的プロモーターのいずれか１つを使用して筋肉で特異的に発現される場合もある。
ＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＡＣＧＧＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＣＣＴＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＧＴＣＣＴＡＧＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＣＴＴＴＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＣＧＧＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＣＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＧＡＣＧＡＣＴＴＣＧＡＧＡＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＣＧＧＡＣＧＣＧＧＧＧＣＧＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＴＡＧＣＧＧＴＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＴＡＴＧＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＧＡＡＣＡＡＧＴＧＧＧＡＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＴＴＧＧＴＧＡＡＴＧＧＧＧＡＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＴＧＡＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＴＣＡＴＧＧＡＧＴＡＴＴＡＣＧＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＴＴＴＧＧＧＧＡＧＣＧＧＡＴＴＣＣＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＧＣＧＣＧＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＧＣＧＧＡＧＡＴＴＧＴＣＡＴＧＧＣＣＡＴＡＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣＧＧＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＧＧＴＧＣＧＧＴＣＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧＧＣＡＧＣＴＡＣＧＧＧＣＣＣＧＡＧＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＴＧＴＡＴＴＣＧＣＣＴＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＴＡＣＧＣＧＧＡＴＴＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＧＡＣＣＴＡＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＧＴＣＣＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＧＡＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＧＧＴＴＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＧＡＣＡＣＡＴＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＧＣＣＴＣＧＡＣＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＴＣＣＧＧＧＡＣＡＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＴＡＣＡＣＣＧＧＡＴＴＴＣＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＣＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＴＣＧＡＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＴＣＧＧＡＣＡＴＴＣＧＧＧＡＡＧＧＴＧＣＧＣＣＧＣＴＡＧＧＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＴＴＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＴＣＣＴＡＣＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＴＧＡＧＧＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＧＡＧＣＣＡＣＡＣＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＧＡＴＧＡＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＧＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＣＡＣＣＣＧＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＧＧＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＧＣＡＣＧＧＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣＧＣＣＡＧＴＣＡＡＣＴＡＣＧＣＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＴＣＧＧＡＡＣＣＧＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧＧＣＡＣＡＣＧＴＣＣＧＧＣＡＧＴＴＧＣＡＧＧＡＧＣＧＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＧＧＧＧＧＴＣＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＣＣＧＧＣＣＧＴＧＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＣＧＣＴＧＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＴＧＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧＧＴＣＣＣＴＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＡＴＣＧＧＡＧＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＣＴＧＴＣＴＣＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＣＣＣＡＣＧＣＣＧＧＣＣＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＧＣＣＧＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＧＣＣＣＧＣＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＴＡＧ
ＤＭＰＫに由来するプロモーターは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／９５３５９０４のものを含み得る。
ヒトでの発現に対するコドン最適化ＡＴＸＮ３（下記参照）も使用され得る。
ＡＴＧＧＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＧＣＣＧＧＡＡＣＣＣＴＡＣＡＣＧＧＴＣＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＧＣＴＣＡＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＴＣＣＴＣＧＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＧＧＣＡＡＡＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＧＴＡＡＧＴＡＧＴＧＣＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＧＡＴＴＣＴＴＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＡＣＣＣＣＴＣＣＣＧＣＧＧＡＧＣＣＴＡＴＡＧＴＡＧＴＴＡＧＡＴＴＧＡＡＧＧＡＧＧＴＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＧＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＡＴＡＧＧＴＣＧＧＧＧＧＧＣＴＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＴＴＧＣＧＧＴＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＡＡＧＴＧＴＡＣＧＣＴＡＴＧＡＡＧＡＴＴＡＴＧＡＡＣＡＡＧＴＧＧＧＡＣＡＴＧＣＴＴＡＡＡＣＧＧＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＣＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴＡＣＴＣＧＴＡＡＡＣＧＧＡＧＡＴＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＴＴＣＧＣＡＴＴＴＣＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＴＧＴＡＣＣＴＧＧＴＡＡＴＧＧＡＧＴＡＣＴＡＴＧＴＣＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＴＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＴＴＣＧＧＣＧＡＧＣＧＣＡＴＴＣＣＧＧＣＡＧＡＡＡＴＧＧＣＡＡＧＡＴＴＣＴＡＣＣＴＴＧＣＡＧＡＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＧＡＣＡＧＴＧＴＡＣＡＣＣＧＡＣＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＡＴＡＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＡＡＣＡＴＴＣＴＴＣＴＴＧＡＴＣＧＣＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＧＧＣＴＧＧＣＣＧＡＴＴＴＴＧＧＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＡＧＴＴＧＡＧＧＧＣＧＧＡＴＧＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＡＡＧＴＴＴＧＧＴＧＧＣＴＧＴＡＧＧＡＡＣＡＣＣＡＧＡＴＴＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＡＡＴＡＴＴＧＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＣＣＧＧＴＴＣＡＴＡＣＧＧＴＣＣＣＧＡＧＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＧＧＣＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＡＣＧＡＡＡＴＧＴＴＴＴＡＴＧＧＧＣＡＡＡＣＴＣＣＣＴＴＣＴＡＣＧＣＡＧＡＴＡＧＴＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＡＴＧＧＧＡＡＧＡＴＡＧＴＴＣＡＴＴＡＴＡＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＣＣＡＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＣＧＣＧＡＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＣＧＧＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＧＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧＧＡＣＧＡＧＧＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＧＧＴＴＧＧＡＴＴＧＧＧＡＣＧＧＴＴＴＧＡＧＡＧＡＣＴＣＡＧＴＡＣＣＴＣＣＡＴＴＣＡＣＣＣＣＣＧＡＣＴＴＣＧＡＡＧＧＧＧＣＡＡＣＧＧＡＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＴＴＧＡＣＣＴＴＧＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＧＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴＴＣＧＣＧＡＡＧＧＴＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＧＴＴＧＧＧＴＡＣＴＣＡＴＡＴＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＣＡＴＴＧＡＧＧＧＡＴＴＣＣＧＡＧＧＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＡＡＧＣＣＧＡＧＣＡＧＴＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＧＴＣＴＧＴＴＡＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＡＧＴＣＡＣＧＴＴＧＣＧＧＧＡＧＴＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣＡＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＣＣＴＧＡＣＧＣＧＣＣＡＡＴＣＡＣＴＴＡＧＣＣＧＣＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＣＣＧＣＡＣＧＧＡＣＡＡＴＣＡＧＡＡＣＴＴＣＧＣＧＴＣＣＣＡＡＣＴＧＣＧＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＣＧＡＧＡＣＴＴＧＧＡＧＧＣＡＣＡＣＧＴＧＣＧＣＣＡＡＴＴＧＣＡＡＧＡＧＣＧＣＡＴＧＧＡＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＧＧＧＧＴＴＣＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＣＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧＣＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＣＧＣＣＡＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＴＧＴＴＧＴＴＣＣＴＴＧＣＣＡＧＧＡＴＣＴＣＴＣＧＧＴＣＴＴＧＣＣＴＡＴＣＧＡＡＧＧＣＧＣＴＴＣＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＧＣＴＣＣＣＣＧＣＴＣＴＴＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＣＣＡＣＣＧＣＣＴＴＧＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＣＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＴＣＣＣＣＡＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＣＣＧＴＡＧ
ある特定の実施形態では、該アンタゴニストは、変異型ＤＭＰＫアレルを標的とするＲＮＡｉ試薬（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等）またはアンチセンス配列をコードする。該アンタゴニストは、ＣＴＧリピートコード変異型アレルに対して特異的である場合もあれば、該変異型アレルコードｍＲＮＡの別の領域（例えば、該変異型アレルに存在するＳＮＰ）に対して特異的である場合もある。
ある特定の実施形態では、該ｗｔアレルのコドン最適化型は、該転写カセットの１つから発現され得、かかるコドン最適化ｗｔアレルからのＲＮＡ転写産物は、該ＲＮＡｉ試薬に対して感受性ではない。
ある特定の実施形態では、該ｓｉＲＮＡの標的位置は、本主題のウイルスベクターから発現されるＤＭＰＫ遺伝子が、天然のＤＭＰＫ遺伝子配列とは異なり、それ故該変異型ＤＭＰＫに対するｓｉＲＮＡによって標的とされないコドン最適化コード配列及び最適化ＵＴＲを有し得るため、ＤＭＰＫのＣＴＧリピート、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、及び／またはコード領域を含み得る。説明のため、変異型ＤＭＰＫを標的とするいくつかの代表的なｓｈＲＮＡ配列を以下に示す。
＞ＤＭ１－リピート－ｓｈＲＮＡ－１（２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ、及びガイド鎖配列を表す）：
Figure 2023510799000043
＞ＤＭ１－リピート－ｓｈＲＮＡ－１（２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ、及びガイド鎖配列を表す）：
Figure 2023510799000044
関連する側面では、ｗｔ ＤＭＰＫを発現させる代わりに、ｗｔ ＭＢＮＬ１遺伝子（例えば、１１４６ｎｔのコード配列）が第一の治療薬としてコードされ得る。
例えば、該ｗｔ ＭＢＮＬ１遺伝子は、１１４６ｎｔのポリヌクレオチド配列（数少ない利用可能なＭＢＮＬ１アイソフォームの１つについては下記参照）によってコードされ得、普遍的に発現される場合もあれば、ＣＫ８等の筋特異的プロモーターのいずれか１つを使用して筋肉で特異的に発現される場合もある。
ＡＴＧＧＣＴＧＴＴＡＧＴＧＴＣＡＣＡＣＣＡＡＴＴＣＧＧＧＡＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＴＡＡＣＡＣＴＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＡＧＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＡＣＴＴＧＣＴＣＡＣＧＧＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＡＡＴＧＴＡＡＡＴＴＴＧＣＡＣＡＴＣＣＴＴＣＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＣＧＡＧＴＡＡＴＣＧＣＣＴＧＣＴＴＴＧＡＴＴＣＡＴＴＧＡＡＡＧＧＣＣＧＴＴＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＡＡＴＡＴＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＡＡＡＴＧＧＡＣＧＣＡＡＴＡＡＣＴＴＧＡＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＧＣＣＡＴＧＴＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＡＡＴＧＣＡＡＣＴＡＧＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＡＴＴＡＣＡＡＣＣＣＧＴＧＣＣＡＡＴＧＴＴＴＴＣＡＧＴＴＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＴＴＡＡＴＣＣＣＴＡＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＧＴＴＴＣＴＣＣＡＡＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＧＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＣＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＴＧＴＴＧＧＴＴＡＣＡＧＧＧＡＡＴＣＣＧＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＴＡＡＴＧＣＧＡＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＴＴＧＡＧＧＴＡＴＧＴＣＧＡＧＡＧＴＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＡＡＴＴＧＣＡＡＣＣＧＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＧＡＴＴＧＴＣＧＧＴＴＴＧＣＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＣＡＡＴＧＡＣＡＡＣＡＣＡＧＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＴＡＴＧＧＡＴＴＡＣＡＴＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＧＣＴＣＴＣＧＧＧＡＡＡＡＧＴＧＣＡＡＡＴＡＣＴＴＴＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＴＴＧＣＡＡＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＡＴＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＧＧＣＴＧＴＣＡＡＡＴＣＡＣＴＧＡＡＧＣＧＡＣＣＣＣＴＣＧＡＧＧＣＡＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＴＡＣＴＴＣＣＣＣＣＡＴＴＡＣＣＡＡＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＴＣＴＴＧＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＧＧＴＧＣＣＡＣＣＧＣＡＧＴＣＴＴＴＡＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＴＣＣＡＡＴＡＣＣＡＡＣＡＧＧＣＴＣＴＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧＣＡＧＴＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＡＣＡＧＣＡＴＴＴＣＴＣＣＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＴＡＴＴＧＴＧＣＡＴＧＡＣＡＣＣＣＧＣＴＡＣＡＡＧＴＧＴＴＧＴＴＣＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＧＣＴＡＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＴＧＣＣＡＣＡＡＧＴＧＴＴＣＣＣＴＴＣＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＣＡＴＡＡＴＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＣＡＴＣＴＧＡＣＴＡＧＣＣＡＣＡＡＧＴＡＴＧＴＴＡＣＣＣＡＧＡＴＧＴＡＧ
ＭＢＮＬ１に由来するプロモーターは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ５３８９５４９／ｇｅｎｅｓのものを含み得る。
ヒトでの発現に対するコドン最適化ＭＢＮＬ１（下記参照）も使用され得る。
ＡＴＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＣＣＧＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＣＧＡＡＧＴＧＧＣＴＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＡＡＴＴＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＡＣＡＴＧＴＡＧＣＡＧＡＣＣＧＧＡＣＡＣＡＧＡＡＴＧＣＡＡＧＴＴＴＧＣＴＣＡＴＣＣＴＡＧＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＡＣＧＧＡＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＣＧＴＧＣＴＴＣＧＡＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＣＧＣＴＧＣＡＧＴＣＧＣＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＡＣＴＴＧＡＡＡＡＣＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＣＣＴＴＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＧＧＣＡＡＴＧＣＴＴＧＣＧＣＡＡＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＴＡＡＴＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＣＧＣＴＧＣＡＡＣＣＧＧＴＴＣＣＡＡＴＧＴＴＣＴＣＣＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＣＧＡＡＴＧＣＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＴＣＣＴＴＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＧＴＴＴＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＣＧＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＣＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＧＴＴＡＣＣＧＧＣＡＡＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＴＣＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＣＡＡＡＡＡＣＴＴＡＴＧＣＧＧＡＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＧＴＧＴＣＧＧＧＡＡＴＡＴＣＡＧＣＧＣＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＡＴＣＧＧＧＧＡＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＴＴＴＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＧＴＡＣＧＡＴＧＡＴＣＧＡＣＡＣＧＡＡＴＧＡＴＡＡＣＡＣＴＧＴＡＡＣＣＧＴＧＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＧＴＡＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＡＧＣＡＡＡＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＴＡＴＣＡＡＧＴＣＡＡＴＣＡＡＧＣＣＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＡＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＡＧＣＣＧＴＡＡＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＧＧＣＣＴＴＴＧＧＡＡＧＣＣＡＣＴＴＴＣＧＡＴＴＴＧＧＧＧＡＴＡＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＧＣＧＡＣＣＧＧＣＧＴＴＧＧＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＴＧＴＴＣＡＡＴＡＣＣＧＧＣＡＴＡＴＴＣＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＣＧＧＣＴＴＴＣＣＴＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴＧＣＡＴＧＡＣＴＣＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＣＧＡＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＡＣＡＣＣＧＧＣＧＡＣＴＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＣＧＡＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＴＣＣＣＣＴＴＴＧＣＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＧＡＴＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＣＡＣＴＴＧＡＣＴＴＣＡＣＡＣＡＡＧＴＡＴＧＴＣＡＣＣＣＡＡＡＴＧＴＡＧ
本発明のベクターによって治療可能なさらに別のＲＥＤは、ハンチントン病（ＨＤ）であり、これは、米国では１０，０００人に１人が罹患すると推定される運動障害、認知障害、及び行動障害を特徴とする致死的で現在治癒不可能な常染色体優性神経変性障害である。これは、通常３１４４アミノ酸のＨＴＴタンパク質をコードするハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子のＣＡＧリピート領域の有毒な伸長によって引き起こされる。結果として生じる変異型ハンチンチン遺伝子（ｍＨＴＴ）は、エクソン１内に３６を超えるＣＡＧリピートを有し、変異タンパク質に起因する毒性を、まだ明らかにされていないメカニズムを介して付与する。
該変異型ハンチンチンタンパク質は、線条体ニューロンに対するＢＤＮＦ神経栄養サポートの喪失、軸索輸送の障害、小胞リサイクルの変化、ミトコンドリア機能障害、オートファジーの増加、タンパク質凝集、及び転写調節不全を含めた複数の有害な分子的及び細胞的結果をもたらす。しかしながら、変異型ハンチンチンの単一異常効果は、神経機能障害及び早期死亡を説明しない。ＨＤ患者は通常、４０歳代で不随意運動、認知機能障害、及び行動の変化を発症する。
本発明のベクターは、少なくとも２つの異なるアプローチでＨＤを治療するために使用され得る。第一のアプローチでは、本発明のベクターを使用して、第一の治療薬を送達し、正常または野生型ＨＴＴ遺伝子を提供することができる一方、第二の治療薬を同時に送達して、変異型ＨＴＴ遺伝子産物を特異的に標的とすることができる。
例えば、ＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）またはＡＳＯを介した遺伝子サイレンシングを使用して、変異型ＨＴＴのｍＲＮＡを特異的に標的とすることができる。これは、例えば、変異型ＨＴＴアレル上のＳＮＰを標的とすることによって達成され得る。ｖａｎ Ｂｉｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９（７）：７１０－７１９，２００８）は、疾患を引き起こす突然変異から数千塩基下流に位置する一塩基多型（ＳＮＰ）を特異的に標的とすることにより、ヘテロ接合性ＨＤドナーの病原性アレルの内在性ｍＲＮＡを選択的に約８０％低下させる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用した。内因性変異型ＨＴＴタンパク質の選択的な抑制もまた、このｓｉＲＮＡを使用して示された。Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．２１７（２）：３１２－３１９，２００９）は、ＨＤ遺伝子の２６のＳＮＰ部位で３２７人の血縁関係のないヨーロッパの白色人種ＨＤ患者のＤＮＡの遺伝子型を特定し、患者の８６％以上が少なくとも１つのＳＮＰについてヘテロ接合体であることを発見した。さらに、これらの部位を標的とするアレル特異的ｓｉＲＮＡは、ハイスループットスクリーニング法を使用して容易に同定でき、この方法を使用して同定されたアレル特異的ｓｉＲＮＡは、ＨＤ患者の線維芽細胞における内因性変異型ｈｔｔタンパク質の選択的抑制を実際に示している。Ｐｆｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．１９（９）：７７４－８，２００９）は同様に、調べた患者集団の４８％が単一のＳＮＰ部位でヘテロ接合体でり、このＳＮＰの１つのアイソフォームがＨＤに関連することを発見した。さらに、わずか３つのＳＮＰ部位に対応する５つのアレル特異的ｓｉＲＮＡが、米国及びヨーロッパのＨＤ患者集団の４分の３を治療するために使用され得る。
第二のアプローチでは、変異型ＨＴＴ遺伝子産物を特異的に標的とする第二の治療薬を使用する代わりに、第二の治療薬は、該変異型ＨＴＴ遺伝子産物と野生型遺伝子産物の両方を同時に標的として、両方の発現を低下させる（が排除しない）ことができる。野生型ハンチンチンタンパク質は、細胞内でニューロン機能に重要な多数の生理活性を有するため、変異型及び野生型の両ハンチンチンを完全に抑制することは望ましくない場合がある。従って、野生型ＨＤＤタンパク質を第一の治療薬として同時に発現させると、ｗｔ ＨＴＴタンパク質の機能がさらに回復する可能性がある。変異型ハンチンチンタンパク質発現の低下は、たとえ部分的であっても、治療効果を得るには十分である可能性があることがデータで示されているため、この治療アプローチは、ＨＴＴ発現のＳＮＰベースの変異アレル特異的ノックダウンに適格でない患者に使用することができる。
これらのアプローチの代替として、該野生型ＨＴＴを第一の治療剤として発現させる代わりに、ＨＤを治療するのに有益な修飾因子を第一の治療剤として発現させてもよい。例えば、Ｇｏｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２８（４）：６５０－６６１，２０１９）は、ＦＡＮ１（ＦＡＮＣＤ２及びＦＡＮＣＩ関連ヌクレアーゼ１）の発現の増加が、発症時のＨＤ年齢の遅延、及びＨＤのゆっくりとした進行と有意に関連していることを示しており、ＦＡＮ１が、伸長したＨＴＴのＣＡＧリピートという状況下で保護的であることを示唆する。ヒト細胞でのＦＡＮ１の過剰発現により、外因的に発現した変異型ＨＴＴエクソン１におけるＣＡＧリピートの伸長が減少し、患者由来の幹細胞及び分化した中型有棘ニューロンでは、ＦＡＮ１のノックダウンがＣＡＧリピートの伸長を増加させる。その安定化効果は、ＦＡＮ１濃度及びＣＡＧリピート長に依存する。
ＨＤを治療するために有益な別の修飾因子は、ＭＳＨ３のアンタゴニストでもよい。これは、このミスマッチ修復遺伝子ＭＳＨ３のバリアントが、ＨＤ及びＤＭ１の進行に関連しているためである。Ｆｌｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｂｒａｉｎ １４２（７）：１８７６－１８８６，２０１９）を参照されたい。同じ戦略をＤＭ１を治療するために使用してもよい。
本発明のベクターによって治療可能なさらに別のＲＥＤは、最も一般的に遺伝する運動失調症であるフリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）である。これは、運動失調を引き起こす脊髄の神経組織の変性に関連する常染色体劣性遺伝性疾患である。米国では、５０，０００人に１人が罹患していると推定されている。特に影響を受けるのは、小脳との接続を介して腕と脚の筋肉の動きを指示するために不可欠な感覚ニューロンである。従って、患者は歩行が困難になり、腕及び脚の感覚が失われ、言語障害が時間とともに悪化する。多くの人は肥大型心筋症と呼ばれる心臓病の一種も患っており、ＦＲＤＡ患者の最も一般的な死因となっている。現在、この疾患に対する有効な治療法はない。
ＦＲＤＡは、フラタキシンと呼ばれる重要なタンパク質を産生する第９染色体上のＦＸＮ遺伝子の変異によって引き起こされる。フラタキシンの正確な役割は不明のままであるが、電子伝達系での鉄－硫黄タンパク質合成を支援してＡＴＰを生成し、適切な量の活性酸素種（ＲＯＳ）を提供して正常なプロセスを維持することでミトコンドリアでの鉄移動を調節すると考えられている。フラタキシンがないと、ミトコンドリアのエネルギーが低下し、過剰な鉄が余分なＲＯＳを創出し、さらなる細胞損傷につながる。フラタキシンのレベルが低いと、ミトコンドリアの電子伝達及び機能性アコニターゼのアセンブリに必要な鉄－硫黄クラスターの生合成が不十分になり、細胞全体の鉄代謝異常につながる。
症例の９６％で、変異型ＦＸＮ遺伝子は両アレルのイントロン１に９０～１，３００のＧＡＡトリヌクレオチドリピートの伸長を有する。この伸長は、エピジェネティックな変化及びリピート付近のヘテロクロマチンの形成を引き起こす。より短いＧＡＡリピート長は、発症年齢及び疾患の重症度と相関している。ヘテロクロマチンの形成により、遺伝子の転写が減少し、フラタキシンのレベルが低下し、ＦＤＲＡ患者は、健康な人で発現されるフラタキシンの正常レベルの５～３５％しか発現しない傾向がある。変異型ＦＸＮ遺伝子のヘテロ接合保因者でさえ、フラタキシンレベルが５０％低下する。しかし、この低下は症状を引き起こすには不十分である。症例の残りの４％は、一方のアレルでＧＡＡの伸長、及び他方のアレルで点突然変異（ミスセンス、ナンセンス、またはイントロンの点突然変異）に関連している。
従って、ある特定の実施形態では、該ＲＥＤはＦＲＤＡであり、該第一の治療薬は、野生型ＦＸＮ遺伝子のコード配列（例えば、６３０ヌクレオチドのコード配列）を含み、（２）該第二の治療薬は、ＧＡＡリピートを有するＦＸＮ遺伝子の変異型アレルに特異的なアンタゴニストを含む。
ある特定の実施形態では、該第二の治療薬は、ＲＮＡｉ試薬、例えば、該ＦＸＮ遺伝子の変異型アレルに特異的なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡコード配列を含む。アレル特異性は、伸長したＧＡＡのリピート、または該変異型アレルに関連するＳＮＰに基づき得る。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、神経細胞、例えば、腕及び脚の筋肉運動を導くために必須の感覚ニューロンを含めた、脊髄または末梢ニューロンにおけるニューロンにおける発現を標的とし得る。該ベクターは、該標的ニューロンに局所的に送達され得る。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、心臓、筋肉、膵臓、及び／またはＦＲＤＡで一般に影響を受ける他の系における発現を標的とし得る。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、普遍的に発現を標的とし得る。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＦＸＮプロモーター、神経特異的プロモーター（例えば、シナプシンプロモーター）、筋特異的プロモーター（例えば、ＣＫ８）、または普遍的プロモーターを使用して、該第一及び／または該第二の治療薬の発現を駆動する。
本発明のベクターによって治療可能なさらに別のＲＥＤは、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）であり、これは、遺伝性精神遅滞、知的障害、及び自閉症の最も一般的な原因であり、２１トリソミーに次いで遺伝的に関連する精神障害の２番目に一般的な原因である。控えめに見積もっても、脆弱Ｘ症候群は、ほぼ男性２，５００～４，０００人に１人及び女性７，０００～８，０００人に１人が罹患していると報告されている。
ＦＸＳは、Ｘ連鎖優性遺伝する。これは、通常、Ｘ染色体上の脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）遺伝子の５’－ＵＴＲ領域内のＣＧＧトリプレットリピートの伸長に起因する。正常なＦＭＲ１遺伝子は、５～４４のＣＧＧリピートを有し、最も一般的には、２９または３０のリピートを有する。このＣＧＧリピートが５５～２００超に伸長すると、脆弱Ｘ症候群が生じる。前突然変異は、中間数のリピートが生じたときに存在すると言われている。リピート伸長が２００を超える個人では、ＣＧＧリピート伸長及びＦＭＲ１プロモーターのメチル化が存在し、ＦＭＲ１遺伝子のサイレンシング及びその産物の欠如につながる。ある研究では、ＦＭＲ１のｍＲＮＡが５’非翻訳領域の一部として転写されたＣＧＧリピートトラクトを含み、これがＦＭＲ１遺伝子の相補的なＣＧＧリピート部分にハイブリダイズして、ＲＮＡ－ＤＮＡ二本鎖を形成するという点で、ＦＭＲ１のサイレンシングがＦＭＲ１のｍＲＮＡによって媒介されるということが発見された。ＦＭＲ１遺伝子の変異型を有することの最終結果は、不十分な量の脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）の生成であり、このタンパク質は、ニューロン間の接続の正常な発達に必要である。現在、この疾患の治療法はない。
従って、ある特定の実施形態では、該ＲＥＤは、ＦＸＳであり、この場合、該第一の治療薬は、野生型ＦＭＲ１遺伝子のコード配列（例えば、１８６３ヌクレオチドのコード配列）を含み、（２）該第二の治療薬は、ＣＣＧリピートを有するＦＸＳ遺伝子の変異型アレルに特異的なアンタゴニストを含む。
例えば、該ｗｔ ＦＭＲ１遺伝子は、１８９９ｎｔのポリヌクレオチド配列（下記参照）によってコードされ得、シナプシンプロモーター等のニューロン特異的プロモーターのいずれか１つを使用してニューロンで発現され得る。
ＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧＣＡＴＴＴＧＴＡＡＡＧＧＡＴＧＴＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＴＣＡＡＴＡＡＣＡＧＴＴＧＣＡＴＴＴＧＡＡＡＡＣＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＧＡＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧＴＣＡＧＡＴＴＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＴＡＧＧＴＴＡＴＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＧＡＧＧＴＧＴＡＴＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＧＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＴＡＧＣＴＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＡＡＡＧＧＧＴＧＡＧＴＴＴＴＡＴＧＴＧＡＴＡＧＡＡＴＡＴＧＣＡＧＣＡＴＧＴＧＡＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＡＡＴＧＡＡＡＴＴＧＴＣＡＣＡＡＴＴＧＡＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡＴＣＴＧＴＴＡＡＴＣＣＣＡＡＣＡＡＡＣＣＴＧＣＣＡＣＡＡＡＡＧＡＴＡＣＴＴＴＣＣＡＴＡＡＧＡＴＣＡＡＧＣＴＧＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＴＡＣＧＧＣＡＡＡＴＧＴＧＴＧＣＣＡＡＡＧＡＧＧＣＧＧＣＡＣＡＴＡＡＧＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＣＴＴＴＴＣＴＧＴＡＡＣＴＴＡＴＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＡＴＴＡＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡＣＣＴＣＡＡＡＧＣＧＡＧＣＡＣＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＴＧＡＣＡＴＧＣＡＣＴＴＴＣＧＧＡＧＴＣＴＧＣＧＣＡＣＴＡＡＧＴＴＧＴＣＴＣＴＧＡＴＡＡＴＧＡＧＡＡＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＧＴＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＴＴＣＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＡＴＧＡＡＣＡＧＴＴＴＡＴＣＧＴＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＴＴＧＧＴＡＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＴＡＡＴＡＴＴＣＡＧＣＡＡＧＣＴＡＧＡＡＡＡＧＴＡＣＣＴＧＧＧＧＴＣＡＣＴＧＣＴＡＴＴＧＡＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＣＡＣＡＴＴＴＣＡＴＡＴＴＴＡＴＧＧＡＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＴＣＴＣＧＡＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡＡＴＡＣＡＡＧＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＣＴＴＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＴＡＡＴＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＡＡＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧＧＡＧＡＴＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＡＴＴＧＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＣＣＡＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＡＴＧＣＣＡＣＣＡＡＡＴＴＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＡＡＴＡＡＴＴＣＡＡＧＧＧＴＴＧＧＡＣＣＴＡＡＴＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＴＴＡＧＡＴＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴＣＡＡＣＣＴＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＡＡＧＴＣＣＡＧＡＧＧＧＴＧＴＴＡＧＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＧＴＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＧＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＴＡＴＧＧＴＡＣＣＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＴＣＧＣＴＡＡＴＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＧＧＡＡＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＴＧＣＧＴＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＡＣＡＡＡＴＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＣＧＡＣＡＧＡＴＴＧＧＡＧＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＴＣＧＴＡＣＡＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＴＡＴＧＴＧＡＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＡＣＣＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴＡＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＣＡＧＡＣＧＣＧＧＴＣＣＴＧＧＡＴＡＴＡＣＴＴＣＡＧＧＡＡＣＴＡＡＴＴＣＴＧＡＡＧＣＡＴＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＧＡＣＧＡＡＣＴＣＡＧＴＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＴＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＣＡＡＡＧＧＡＡＡＣＧＡＣＧＡＴＣＡＣＴＣＣＣＧＡＡＣＡＧＡＴＡＡＴＣＧＴＣＣＡＣＧＴＡＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＴＡＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＡＧＡＴＣＡＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＣＡＡＴＡＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＴＧＴＣＣＡＣＡＣＴＡＡＡＡＣＡＴＴＡＣＡＧＡＡＴＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＡＧＴＣＧＧＣＴＧＣＧＣＡＣＧＧＧＴＡＡＡＧＡＴＣＧＴＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＣＧＴＧＧＡＴＧＧＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＣＴＣＧＴＧＡＡＴＧＧＡＧＴＡＣＣＣＴＡＡ
該シナプシンプロモーターは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ４２２９５８３／で見出され得る。代替的に、天然のＦＭＲ１プロモーターまたはＵ６プロモーターを使用して、その発現を駆動してもよい。
ヒトでの発現に対するコドン最適化ＦＭＲ１（下記参照）も使用され得る。
ＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＧＴＧＧＡＧＧＴＡＣＧＡＧＧＴＴＣＡＡＡＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＡＴＡＡＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＡＡＧＧＡＣＧＴＡＣＡＣＧＡＡＧＡＣＴＣＡＡＴＡＡＣＡＧＴＴＧＣＡＴＴＣＧＡＧＡＡＴＡＡＴＴＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＡＧＡＴＣＣＣＡＴＴＴＣＡＣＧＡＣＧＴＧＡＧＧＴＴＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＴＡＡＴＡＡＧＧＡＴＡＴＣＡＡＣＧＡＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＡＴＡＴＴＣＴＣＧＧＧＣＧＡＡＴＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＣＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＧＣＴＡＡＡＧＴＴＣＧＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧＧＴＧＡＧＴＴＴＴＡＴＧＴＣＡＴＡＧＡＡＴＡＴＧＣＡＧＣＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＣＣＴＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣＧＴＣＡＣＡＡＴＴＧＡＧＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＧＴＴＡＡＴＣＣＧＡＡＣＡＡＡＣＣＣＧＣＴＡＣＴＡＡＡＧＡＴＡＣＧＴＴＴＣＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＡＧＧＣＡＡＡＴＧＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＣＡＴＡＡＡＧＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＣＡＴＴＣＡＧＣＧＴＴＡＣＧＴＡＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＡＴＣＡＡＣＧＡＧＧＴＴＡＣＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＧＣＧＣＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣＡＴＴＴＣＣＧＧＡＧＣＴＴＧＣＧＣＡＣＧＡＡＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＡＧＧＡＡＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＴＣＡＡＡＧＣＡＧＣＴＣＧＡＡＡＧＴＡＧＣＣＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣＡＡＧＡＴＴＴＣＡＴＧＡＡＣＡＧＴＴＴＡＴＣＧＴＧＣＧＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＧＡＴＣＧＧＣＡＣＧＣＡＣＧＧＧＧＣＴＡＡＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＧＧＡＡＡＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＴＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＣＴＴＧＣＡＣＣＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＡＴＧＧＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＣＧＣＧＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＣＴＡＧＧＡＧＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＴＡＴＡＣＡＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＴＴＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＴＡＡＴＡＧＧＴＡＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡＣＴＣＡＴＡＣＡＡＧＡＧＡＴＡＧＴＣＧＡＴＡＡＡＡＧＴＧＧＣＧＴＡＧＴＣＡＧＡＧＴＡＡＧＧＡＴＣＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧＴＡＣＣＣＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＣＡＴＧＣＣＡＣＣＡＡＡＣＡＧＴＴＴＧＣＣＧＴＣＴＡＡＣＡＡＣＡＧＴＣＧＧＧＴＣＧＧＣＣＣＣＡＡＴＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＧＣＡＣＡＣＡＣＴＴＣＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＡＴＴＣＡＡＣＣＡＡＡＧＴＧＣＡＡＣＧＡＧＴＴＣＴＴＧＴＡＧＣＴＴＣＡＴＣＡＧＴＣＧＴＴＧＣＣＧＧＣＧＡＡＴＣＴＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＴＡＴＧＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＴＡＴＴＴＧＴＧＧＧＴＡＣＧＡＡＧＧＡＣＴＣＴＡＴＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＧＴＡＣＴＣＣＴＣＧＡＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＴＴＧＡＴＣＡＧＣＴＴＣＧＣＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＣＧＡＧＣＡＧＴＴＧＣＧＧＣＡＧＡＴＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＴＡＧＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＡＡＣＡＧＧＡＣＡＧＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＣＴＡＣＧＴＴＡＣＧＧＡＴＧＡＣＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＴＧＧＧＣＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＡＴＡＴＡＧＧＡＡＴＣＧＣＧＧＧＣＡＴＧＧＴＣＧＣＡＧＡＧＧＡＣＣＣＧＧＴＴＡＣＡＣＣＴＣＡＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＡＣＧＣＣＴＣＡＧＡＡＡＣＧＧＡＧＡＧＣＧＡＣＣＡＴＡＧＧＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＴＧＧＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＣＧＡＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＧＧＧＡＧＡＧＴＴＴＣＴＴＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＡＴＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＣＧＡＧＧＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＴＴＡＡＧＧＧＣＡＡＣＧＡＴＧＡＴＣＡＣＴＣＡＡＧＧＡＣＣＧＡＴＡＡＴＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＣＧＣＧＣＧＡＡＧＣＧＡＡＡＧＧＧＡＧＧＡＣＴＡＣＡＧＡＣＧＧＧＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡＴＡＡＧＡＧＴＣＧＡＴＴＧＣＡＡＣＡＡＴＧＡＧＣＧＧＴＣＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＣＴＴＣＡＡＡＡＴＡＣＣＴＣＡＴＣＣＧＡＧＧＧＴＴＣＣＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＣＡＧＧＣＡＡＡＧＡＣＡＧＧＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＴＣＡＧＴＣＧＡＣＧＧＡＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＴＧＧＴＴＡＡＣＧＧＴＧＴＧＣＣＣＴＡＡ
ある特定の実施形態では、該第二の治療薬は、ＲＮＡｉ試薬、例えば、該ＦＸＮ１遺伝子の変異型アレルに特異的なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡコード配列を含む。アレル特異性は、伸長したＣＣＧのリピート、または該変異型アレルに関連するＳＮＰに基づき得る。
ある特定の実施形態では、該ｓｉＲＮＡの標的位置は、本主題のウイルスベクターから発現されるＦＭＲ１遺伝子が、天然のＦＭＲ１遺伝子配列とは異なり、それ故該変異型ＦＭＲ１に対するｓｉＲＮＡによって標的とされないコドン最適化コード配列及び最適化ＵＴＲを有し得るため、ＦＭＲ１のＣＧＧリピート、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、及び／またはコード領域を含み得る。説明のため、変異型ＦＭＲ１を標的とするいくつかの代表的なｓｈＲＮＡ配列を以下に示す。
＞ＦＭＲ１－ｓｉＲＮＡ－１（２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ、及びガイド鎖配列を表す）：
Figure 2023510799000045
＞ＦＭＲ１－ｓｉＲＮＡ－２（２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ、及びガイド鎖配列を表す）：
Figure 2023510799000046
＞ＦＭＲ１－ｓｉＲＮＡ－３（ｍｉｒ－３０骨格）（２番目の行は、パッセンジャー鎖、ループ、及びガイド鎖配列を表す）：
Figure 2023510799000047
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、神経細胞における発現を標的とし得る。該ベクターは、該標的ニューロンに局所的に送達され得る。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、普遍的に発現を標的とし得る。
ある特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＦＭＲ１プロモーター、神経特異的プロモーター（例えば、シナプシンプロモーター）、または普遍的プロモーターを使用して、該第一及び／または該第二の治療薬の発現を駆動する。
組成物及び医薬組成物
別の実施形態では、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び医薬的に許容される担体を含む。該組成物は、他の成分、例えば、希釈剤及びアジュバントも含んでよい。許容される担体、希釈剤及びアジュバントは、レシピエントに無害であり、好ましくは、使用される用量及び濃度で不活性であり、これらとしては、緩衝剤、例えば、リン酸、クエン酸、もしくは他の有機酸、抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸、低分子量ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン、単糖、二糖、及び他の炭水化物、すなわち、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン等、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール、塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム、及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、ｐｌｕｒｏｎｉｃ、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
投薬及び投与
本発明の方法において投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、及び標的とされる細胞型（複数可）に応じて変化し、当技術分野で標準的な方法で決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌあたり、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３から、約１×１０１４まで、またはそれを超えるＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）に及び得る。用量は、ウイルスゲノムの単位（ｖｇ）で表される場合もある。
標的細胞にインビボまたはインビトロでｒＡＡＶを形質導入する方法は、本発明によって企図される。該インビボ法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量または有効複数回用量を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。該用量が障害／疾患の発症前に投与される場合、該投与は予防的である。該用量が障害／疾患の発症後に投与される場合、該投与は治療的である。本発明の実施形態では、有効用量は、治療される障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除または軽減）する用量であり、それにより、障害／疾患状態への進行が遅延または防止され、障害／疾患状態の進行が遅延または防止され、疾患の程度が弱まり、疾患の寛解（部分または完全）がもたらされ、及び／または生存期間が延長される。本発明の方法による予防または治療に対して企図される疾患の例は、ＰＭＤまたは他のミエリン産生、変性、再生、または機能の欠陥を特徴とする疾患である。
投与に関して、有効量及び治療有効量（本明細書では用量とも呼ばれる）は、最初は、インビトロアッセイ及び／または動物モデルでの試験の結果に基づいて推定され得る。例えば、細胞培養で決定されたＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するように、動物モデルにおける用量が処方され得る。かかる情報は、目的の対象での有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
該組成物の有効用量の投与は、当技術分野で標準的な経路によるものでよく、筋肉内、非経口、静脈内、経口、口腔、経鼻、経肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣内を含むがこれらに限定されない、本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、該ＡＡＶのＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路（複数可）及び血清型（複数可）は、当業者によって、治療される感染及び／または疾患状態ならびに該１つ以上のコード配列及び／またはマイクロジストロフィンを発現する標的細胞／組織（複数可）を考慮して選択及び／または適合され得る。
具体的には、本明細書に記載の製剤は、限定されないが、注射、注入、灌流、吸入、洗浄、及び／または摂取によって投与され得る。投与経路としては、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、膀胱内、心膜内、臍内、眼内、粘膜、経口、皮下、及び／または結膜下が挙げられ得るが、これらに限定されない。
本発明は、本発明の併用療法を含む本発明のｒＡＡＶ及び組成物の有効用量の局所投与または全身投与を提供する。例えば、全身投与は循環系への投与であり、全身が影響を受ける。全身投与には、経腸投与、例えば、消化管からの吸収、及び注射、注入または移植による非経口投与が含まれる。
特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、動物の標的組織、例えば、骨格筋に該ｒＡＡＶ組み換えベクターを輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本発明による投与には、筋肉、血流及び／または直接肝臓への注射が含まれるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水にｒＡＡＶを再懸濁するだけで、筋組織での発現に有用な媒体を提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与することができる担体または他の成分に対する制限は知られていない（ただし、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶでは普通に回避するべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが目的の特定の標的組織、例えば、筋肉を標的とするように修飾され得る。例えば、その開示が参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。
医薬組成物は、注射製剤または経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製され得る。筋肉注射及び経皮輸送の両方に対する多数の製剤が以前に開発されており、本発明の実施において使用することができる。該ｒＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするための任意の医薬的に許容される担体とともに使用することができる。
本明細書に開示する方法で投与されるｒＡＡＶの用量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、及び標的とされる細胞型（複数可）に応じて変化し、当技術分野で標準的な方法で決定され得る。
特定の対象に投与される実際の投与量は、医師、獣医、または研究者によって、体重、状態の重症度、疾患の型、以前のまたは併用される治療的介入、該対象の特発性疾患、及び／または投与経路を含めた物理的及び生理的因子等であるが、これらに限定されないパラメータを考慮して決定される場合もある。
投与される各ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌあたり、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１×１０１４から、または約１×１０１５まで、またはそれを超えるＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）に及び得る。用量は、ウイルスゲノムの単位（ｖｇ）で表される場合もある（すなわち、それぞれ、１×１０７ｖｇ、１×１０８ｖｇ、１×１０９ｖｇ、１×１０１０ｖｇ、１×１０１１ｖｇ、１×１０１２ｖｇ、１×１０１３ｖｇ、１×１０１４ｖｇ、１×１０１５ｖｇ）。用量は、体重１キログラム（ｋｇ）あたりのウイルスゲノムの単位（ｖｇ）で表される場合もある（すなわち、それぞれ、１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０１５ｖｇ／ｋｇ）。ＡＡＶの力価を測定する方法は、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１０３１－１０３９，１９９９に記載されている。
例示的な用量は、約１×１０１０～約１×１０１５ベクターゲノム（ｖｇ）／キログラム体重に及び得る。いくつかの実施形態では、用量は、１×１０１０ｖｇ／ｋｇ体重、１×１０１１ｖｇ／ｋｇ体重、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ体重、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ体重、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ体重、または１×１０１５ｖｇ／ｋｇ体重を含み得る。用量は、１×１０１０ｖｇ／ｋｇ／日、１×１０１１ｖｇ／ｋｇ／日、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ／日、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ／日、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ／日、または１×１０１５ｖｇ／ｋｇ／日を含み得る。用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日～５ｍｇ／ｋｇ／日または０．５ｍｇ／ｋｇ／日～１ｍｇ／ｋｇ／日または０．１ｍｇ／ｋｇ／日～５μｇ／ｋｇ／日または０．５ｍｇ／ｋｇ／日～１μｇ／ｋｇ／日に及び得る。他の非限定的な例では、用量は、１μｇ／ｋｇ／日、５μｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日、５０μｇ／ｋｇ／日、１００μｇ／ｋｇ／日、２００μｇ／ｋｇ／日、３５０μｇ／ｋｇ／日、５００μｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日、５ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日、５０ｍｇ／ｋｇ／日、１００ｍｇ／ｋｇ／日、２００ｍｇ／ｋｇ／日、３５０ｍｇ／ｋｇ／日、５００ｍｇ／ｋｇ／日、または１０００ｍｇ／ｋｇ／日を含み得る。治療有効量は、治療計画の過程（すなわち、数日、数週間、数ヶ月等）において、単回投与により達成される場合もあれば、複数回投与により達成される場合もある。
いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、少なくとも１．６×１０１３のベクターゲノムを有する水溶液１０ｍＬの剤形である。いくつかの実施形態では、該剤形は、１ミリリットルあたり少なくとも２×１０１２のベクターゲノムの効力を有する。いくつかの実施形態では、該剤形は、１０ｍＭのｐＨ６．０のＬ－ヒスチジン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び１ｍＭの塩化マグネシウムを含む滅菌水溶液を含む。いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、１０ｍＭのｐＨ６．０のＬ－ヒスチジン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び１ｍＭの塩化マグネシウムを含む１０ｍＬの滅菌水溶液の剤形に含まれ、少なくとも１．６×１０１３のベクターゲノムを有する。
いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、１×１０１０～１×１０１５のベクターゲノムを含む１０ｍＬの水溶液、１×１０１１～１×１０１４のベクターゲノムを含む１０ｍＬの水溶液、１×１０１２～２×１０１３のベクターゲノムを含む１０ｍＬの水溶液、または約１．６×１０１３以上のベクターゲノムを含む１０ｍＬの水溶液を含む剤形であり得る。いくつかの実施形態では、該水溶液は、約１０ｍＭのｐＨ６．０のＬ－ヒスチジンと、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び１ｍＭの塩化マグネシウムを含む滅菌水溶液である。いくつかの実施形態では、該剤形は、１ミリリットルあたりのベクターゲノム（ｖｇ／ｍＬ）約１×１０１１超、約１×１０１２ｖｇ／ｍＬ超、約２×１０１２ｖｇ／ｍＬ超、約３×１０１２ｖｇ／ｍＬ超、または約４×１０１２ｖｇ／ｍＬ超の効力を有する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＡＡＶベクターは、医薬組成物の一部として提供される。該医薬組成物は、例えば、少なくとも０．１％ｗ／ｖの該ＡＡＶベクターを含み得る。いくつかの他の実施形態では、該医薬組成物は、該医薬組成物の重量あたり２％～７５％の化合物、または該医薬組成物の重量あたり２５％～６０％の化合物を含み得る。
いくつかの実施形態では、該剤形はキットに含まれる。該キットはさらに、該剤形の使用説明書を含んでもよい。
筋肉注射の目的のため、滅菌水溶液だけでなく、ゴマ油もしくは落花生油等のアジュバント溶液または水性プロピレングリコール溶液も使用することができる。かかる水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、該希釈液は最初に生理食塩水またはグルコースで等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合した水中で調製され得る。ｒＡＡＶの分散体もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中及び油中で調製され得る。通常の保存条件及び使用条件下、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含む。これに関連して、使用される無菌水性媒体はすべて、当業者に周知の標準的な技術で容易に得られる。
いくつかの実施形態では、注射用に、製剤は水溶液として、例えば、限定されないが、ハンクス液、リンゲル液、及び／または生理食塩水を含む緩衝液として作製され得る。該溶液は、懸濁剤、安定剤及び／または分散剤等の配合剤を含んでもよい。代替的に、該製剤は、凍結乾燥状態及び／または粉末形態であってもよく、使用前に適切な媒体対照（例えば、パイロジェンフリーの滅菌水）で構成される。
本明細書に開示する任意の製剤は、有利には、研究、予防、及び／または治療処置用であるかどうかにかかわらず、投与の利益を上回る可能性のある重大な副反応、アレルギー反応、または他の有害反応を生じさせないものを含む、任意の他の医薬的に許容される担体（複数可）を含み得る。例示的な医薬的に許容される担体及び製剤は、それに関連する教示に関して、参照することにより本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０に開示されている。さらに、製剤は、米国ＦＤＡのＤｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ及び／または他の関連する米国及び外国の規制機関によって要求される、無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たすように調製され得る。
例示的な一般的に使用される医薬的に許容される担体は、増量剤もしくは充填剤、溶媒もしくは共溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、及びビタミンＥ）、防腐剤、等張剤、吸収遅延剤、塩、安定剤、緩衝剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、ゲル、結合剤、崩壊剤、及び／または滑沢剤を含み得るが、これらに限定されない。
例示的な緩衝剤は、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、フマル酸緩衝剤、グルコン酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、乳酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、及び／またはトリメチルアミン塩を含み得るが、これらに限定されない。
例示的な防腐剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタ－クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化ベンザルコニウム、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン（メチルまたはプロピルパラベン等）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び／または３－ペンタノールを含み得るが、これらに限定されない。
例示的な等張剤は、三価以上の糖アルコール（例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及び／またはマンニトール）を含むがこれらに限定されない多価糖アルコールを含み得る。
例示的な安定剤は、有機糖、多価糖アルコール、ポリエチレングリコール、硫黄含有還元剤、アミノ酸、低分子量ポリペプチド、タンパク質、免疫グロブリン、親水性ポリマー、及び／または多糖類を含み得るが、これらに限定されない。
製剤はまた、デポー製剤でもよい。いくつかの実施形態では、かかる長時間作用型製剤は、限定されないが、移植（例えば、皮下もしくは筋肉内）または筋肉注射によって投与され得る。従って、例えば、化合物は、適切なポリマー及び／または疎水性材料（例えば、許容される油中エマルションとして）もしくはイオン交換樹脂で、または難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）製剤化され得る。
さらに、様々な実施形態では、該ＡＡＶベクターは、持続放出システム、例えば、該ＡＡＶベクターを含む固体ポリマーの半透性マトリックスを使用して送達され得る。様々な持続放出材料が確立されており、当業者には周知である。持続放出カプセルは、その化学的性質に応じて、投与後数週間から１００日以上にわたって該ベクターを放出する。
注射用途に適した医薬担体、希釈剤または賦形剤としては、滅菌注射剤溶液または分散体の即時調製用の滅菌水溶液または分散体及び滅菌粉末が挙げられる。すべての場合で、当該形態は、無菌でなければならず、容易にシリンジを通過する程度に流動性でなければならない。これは、製造及び保管条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。該担体は、溶媒の場合も分散媒の場合もあり、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、及び植物油を含む。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散体の場合は必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の抑制は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射剤組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。
無菌注射剤溶液は、必要量のｒＡＡＶを、必要に応じて上記に列挙した様々な他の成分とともに適切な溶媒に組み込み、その後、濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散体は、滅菌された活性成分を、基本的な分散媒及び上記に列挙したものから必要な他の成分を含む滅菌媒体に組み込むことによって調製される。滅菌注射剤溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分に加えて任意のさらなる所望の成分の粉末が、予め滅菌濾過されたその溶液から得られる。
ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで行われる場合もある。１つの実施形態では、所望の標的筋細胞は、該対象から取り出され、ｒＡＡＶで形質導入され、該対象に再導入される。代替的に、同系または異種筋細胞を使用することができ、ここでは、これらの細胞は、不適切な免疫応答を該対象内で生じない。
対象への形質導入及び形質導入細胞の再導入に適した方法は、当技術分野で既知である。１つの実施形態では、細胞は、インビトロで、例えば、適切な培地中でｒＡＡＶを筋細胞と混合すること、及び目的のＤＮＡを有する細胞を、従来の技術、例えば、サザンブロット及び／またはＰＣＲを使用して、または選択可能なマーカーを使用してスクリーニングすることにより、形質導入することができる。形質導入細胞は、その後医薬組成物に製剤化することができ、該組成物は、様々な技術、例えば、筋肉内、静脈内、皮下及び腹腔内注射、または、例えば、カテーテルを用いた平滑筋及び心筋への注射により、該対象に導入され得る。
本発明のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、該１つ以上のさらなるコード配列及びマイクロジストロフィンの持続的な共発現をもたらす。本発明は、従って、該１つ以上のさらなるコード配列及びマイクロジストロフィンを共発現するｒＡＡＶを動物、好ましくはヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法には、組織（筋肉等の組織、肝臓及び脳等の器官、ならびに唾液腺等の腺を含むが、これらに限定されない）を本発明の１つ以上のｒＡＡＶで形質導入することが含まれる。形質導入は、組織特異的制御要素を含む遺伝子カセットを用いて行われ得る。例えば、本発明の１つの実施形態は、筋肉特異的制御要素によって指示される筋細胞及び筋組織を形質導入する方法を提供し、該制御要素としては、限定されないが、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリーに由来するもの、例えば、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリー由来のもの（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６１－７６６，１９９１参照）、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２（Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：４８５４－４８６２，１９９１）、ヒト骨格アクチン遺伝子（Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：４０８９－４０９９，１９８７）、心筋型アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列要素（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：３３９３－３３９９，１９８９）、及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素に由来する制御要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心筋トロポニンＣ遺伝子及び遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素：低酸素誘導性核内因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５６８０－５６８４，１９９１）、ステロイド誘導性因子及びグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）を含むプロモーター（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５６０３－５６０７，１９９３参照）、ならびに他の制御要素が挙げられる。
筋肉組織は、それが重要器官ではなく、かつ近づきやすいため、インビボでのＤＮＡ送達の魅力的な標的である。本発明は、形質導入された筋線維からのｍｉＲＮＡとマイクロジストロフィンの持続的な共発現を企図する。
本明細書で使用される、「筋細胞」または「筋組織」は、あらゆる種類の筋肉に由来する細胞または細胞群を意味する（例えば、骨格筋及び平滑筋、例えば、消化管、膀胱、血管または心臓組織に由来するもの）。かかる筋細胞は、分化していても未分化でもよく、例えば、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞及び心筋芽細胞であり得る。
「形質導入」という用語は、該１つ以上のさらなるコード配列及び該マイクロジストロフィンのコード領域を、インビボまたはインビトロのいずれかで、レシピエント細胞による該１つ以上のさらなるコード配列及びマイクロジストロフィンの共発現をもたらす本発明の複製欠損性のｒＡＡＶを介して、該レシピエント細胞に投与／送達することを指すために使用される。
従って、本発明は、該１つ以上のさらなるコード配列及びマイクロジストロフィンをコードするｒＡＡＶの有効用量（または複数回用量、本質的に同時に投与されるか、または間隔を置いて投与される）を、それを必要とする患者に投与する方法を提供する。
ＡＡＶの生成
ＡＡＶベクターの必要な複製（ｒｅｐ）及び構造（ｃａｐ）タンパク質をコードする遺伝子は、ＡＡＶベクターから削除されており、送達されるべき配列を残りの末端リピート配列間に挿入することが可能である。従って、ＡＡＶベクターの増殖には、ヘルパーウイルスだけでなく、感染細胞に送達される必要があるｒｅｐ及びｃａｐタンパク質をコードする遺伝子が必要である。代替的に、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質をコードする遺伝子は、生成に使用される細胞に存在することが必要である。
本発明の方法に適したＡＡＶベクターは、当技術分野で認められている方法のいずれかを使用して生成することができる。最近の総説で、Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ．８，ｐａｇｅｓ １６６－１８０，２０１８）は、ｒＡＡＶを生成するために最も一般的に使用される上流方法の総説を示した。該総説に記載の各方法は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
パッケージング細胞株（ＨＥＫ２９３）の一過性トランスフェクション
特に、ある特定の実施形態では、該ＡＡＶベクターは、パッケージング細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを使用して生成される。これは、ヒト胚性ＨＥＫ２９３細胞へのプラスミドトランスフェクションを含む、最も確立されたＡＡＶの生成方法である。通常、ＨＥＫ２９３細胞は、ベクタープラスミド（目的の遺伝子、例えば、該ジストロフィンミニ遺伝子及び該１つ以上のさらなるコード配列の両方をコードする本主題のポリヌクレオチドを含む）、及び１つまたは２つのヘルパープラスミドによって、リン酸カルシウムまたはカチオン性ポリマーであるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて同時にトランスフェクトされる。
該ヘルパープラスミド（複数可）は、４つのＲｅｐタンパク質、ＡＡＶの３つの構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３、ＡＡＰ、及びアデノウイルス補助機能Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡＲＮＡの発現を可能にする。ｒＡＡＶ複製に必要なさらなるアデノウイルスＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ補因子は、ＨＥＫ２９３生成細胞で発現される。Ｒｅｐ－ｃａｐ及びアデノウイルスヘルパー配列は、２つの別々のプラスミドにクローニングされるか、または１つのプラスミドに結合されるため、トランスフェクションのための３つのプラスミド系及び２つのプラスミド系の両方が可能である。３つのプラスミドのプロトコルは、ある血清型から別の血清型に容易に切り替えることができるｃａｐ遺伝子を備えた汎用性を提供する。
該プラスミドは通常、従来の技術により、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、細菌起源の抗生物質耐性遺伝子を使用して、またはミニサークル技術によって生成される。
接着性のＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクションは、ｒＡＡＶベクターの大規模製造に使用されている。最近では、ＨＥＫ２９３細胞はまた、長期にわたり経済的に実行可能な浮遊条件にも適応している。
ＨＥＫ２９３株は、無血清浮遊Ｆ１７、Ｅｘｐｉ２９３、または他の製造元の特殊培地で維持される浮遊ＨＥＫ２９３細胞を除き、通常、Ｌ－グルタミン、５％～１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで増殖させる。接着細胞の場合、動物由来成分による汚染を制限するため、ＡＡＶの生成時にＦＢＳの割合を減らすことができる。
一般に、ｒＡＡＶベクターは、血清型に応じて、プラスミドのトランスフェクションの４８～７２時間後に細胞ペレット及び／または上清から回収される。
組み換えバキュロウイルスによる昆虫細胞の感染
バキュロウイルスＳｆ９のプラットフォームは、哺乳類細胞におけるＧＭＰ準拠の拡張可能な代替ＡＡＶ生成方法として確立されている。これは、粗製収穫物で細胞あたり最大２×１０５ベクターゲノム（ｖｇ）を生成することができる。
現在のプロトコルは、２つの組み換えバキュロウイルス、すなわち、Ｒｅｐ７８／５２及びＣａｐの合成を可能にするバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）、及びＡＡＶのＩＴＲに隣接する目的の遺伝子を運ぶ組み換えバキュロウイルスによるＳｆ９昆虫細胞の感染を含む。いくつかの無血清培地は、浮遊でのＳｆ９細胞の増殖に適応化される。
該デュアルバキュロウイルスＳｆ９生成システムは、これらの安全性の問題に関して他の生成プラットフォームと比べて多くの利点を有する：（１）無血清培地の使用、（２）Ｓｆ細胞株での外来ウイルス転写産物の発見にもかかわらず、昆虫に感染するウイルスのほとんどは、哺乳類細胞では能動的に複製しない、及び（３）バキュロウイルス以外に、昆虫細胞でのｒＡＡＶ生成にヘルパーウイルスは必要ない。
ある特定の実施形態では、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質を発現する安定なＳｆ９昆虫細胞株が使用されるため、感染性ｒＡＡＶベクターを高収率で生成するためには１つのみの組み換えバキュロウイルスの感染が必要とされる。
ｒＨＳＶベクターによる哺乳類細胞の感染
ＨＳＶは、許容細胞でのＡＡＶの複製用のヘルパーウイルスである。従って、ＨＳＶは、ヘルパーとして、及びＡＡＶゲノムの複製及び生成細胞へのパッケージングを支援する必須のＡＡＶ機能を送達するためのシャトルとしての両方の役割を果たし得る。
ｒＨＳＶとの重感染に基づくＡＡＶ生成では、大量のｒＡＡＶを効率的に生成することができる。高い総収量（最大１．５×１０５ｖｇ／細胞）に加えて、該方法は、ウイルス力価の改善によって測定される明らかに品質が向上したｒＡＡＶストックを創出する点でさらに有利である。
本方法では、細胞、通常はハムスターＢＨＫ２１細胞株またはＨＥＫ２９３及び派生体に、１つはＡＡＶのＩＴＲで囲まれた目的の遺伝子を搭載し（ｒＨＳＶ－ＡＶＶ）、２つ目は所望の血清型のＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐのＯＲＦを有する（ｒＨＳＶｒｅｐｃａｐ）２つのｒＨＳＶを感染させる。２～３日後、該細胞及び／または培地を回収し、ｒＡＡＶを複数の精製ステップで精製して、細胞不純物、ＨＳＶ由来の混入物、及びパッケージ化されていないＡＡＶのＤＮＡを除去する。
従って、いくつかの実施形態では、ＨＳＶは、ＡＡＶ感染のヘルパーウイルスとしての役割を果たす。いくつかの実施形態では、ＡＡＶの増殖は、ＩＣＰ２７が欠失したＨＳＶの非複製突然変異体を使用して達成される。
哺乳類細胞で組み換えＡＡＶウイルス粒子を生成するある特定の方法は、当技術分野で知られており、過去１０年間で改善されてきた。例えば、米国出願公開第二００７０２０２５８７号は、２つ以上の複製欠損組み換えＨＳＶベクターによる該細胞の重感染に基づく、哺乳類細胞における組み換えＡＡＶの生成について記載している。米国出願公開第二０１１０２２９９７１号及びＴｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０（８）：８６１－８７０，２００９）は、浮遊培養に適応化させた哺乳類細胞の組み換えＨＳＶ１型の重感染を使用した、拡張可能な組み換えＡＡＶの生成方法について記載している。Ａｄａｍｓｏｎ－Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８（１）：１－１４，２０１７）は、該ＨＳＶ系を用いた無血清浮遊製造プラットフォームでのＡＡＶの生成方法の改良を記載している。
哺乳類の安定細胞株
ｒＡＡＶベクターはまた、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を安定して発現する安定した哺乳類の生成細胞を使用して、効率的かつ拡張可能に生成され得る。かかる細胞は、野生型のＡｄ５ヘルパーウイルス（これは遺伝的に安定しており、高力価で容易に生成され得る）に感染し、高レベルのｒｅｐ及びｃａｐの発現を誘導することができる。感染性ｒＡＡＶベクターは、これらのパッケージング細胞株に野生型Ａｄ５型を感染させ、プラスミドのトランスフェクションによって、または組み換えＡｄ／ＡＡＶハイブリッドウイルスによる感染後にｒＡＡＶゲノムを提供することで生成され得る。
別の方法として、Ａｄを、ヘルパーウイルスとしてのＨＳＶ－１で置き換えることもできる。
適切な安定した哺乳類の生成細胞としては、ＨｅＬａ由来の生成細胞株、Ａ５４９細胞、またはＨＥＫ２９３細胞が挙げられ得る。好ましいＨｅＬａ細胞株は、ＨｅＬａＳ３細胞、すなわち、浮遊培養に適応化させたＨｅＬａサブクローンである。
本明細書に記載の方法を使用して、動物成分を含まない培地中で、好ましくは２５０－Ｌ規模、または２，０００－Ｌの商業規模で、本主題のＡＡＶベクターを製造することができる。
実施例１ 分岐構築物からのコード配列のインビトロ発現
本発明の分岐ウイルスベクターは、目的の機能性遺伝子またはタンパク質（ＧＯＩ）だけでなく、ある特定のＲＮＡｉ、アンチセンス、ｓｇＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはそれらの阻害物質の１つ以上のコード配列も発現することができる。本発明の組み換えウイルスベクターの代表的な非限定的な構成を図１に示す。例えば、本発明の組み換えウイルスベクターは、分岐ＡＡＶベクター、例えば、ある型の機能性ジストロフィン遺伝子、例えば、前述のμＤｙｓ遺伝子のいずれか１つを発現するようにデザインされたＡＡＶ９ベクターであり得る。同じ分岐ベクターはまた、ＧＯＩプロモーターとそれに最も近いＩＴＲ配列の間に位置する独立／分岐転写単位から１つ以上のさらなるコード配列（複数可）を発現する（図１参照）。すなわち、かかる１つ以上のさらなるコード配列（複数可）の少なくとも１つは、ＧＯＩプロモーター（例えば、筋特異的ＣＫ８プロモーター）とは異なる独立／分岐プロモーターから転写される。この分岐転写単位における転写の方向は、ＧＯＩプロモーターのものとは反対であり得る。本主題の分岐ベクターのデザインは、ＧＯＩ転写単位と分岐転写単位を独立して別々に制御し、ひいてはこれら別々の転写単位の発現においてより多くの柔軟性及び制御を提供する。
さらなるコード配列がｍｉＲ－２９ｃ等のｍｉＲＮＡをコードする場合、成熟型ｍｉＲ－２９ｃ配列の周囲の配列が他のｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ－３０、－１０１、－１５５、または－４５１のものから得られるように、ｍｉＲ－２９ｃコード配列の骨格配列を修飾することができる。（上記参照）。天然のｍｉＲ－２９ｃの周辺配列をｍｉＲ－３０、－１０１、－１５５、または－４５１からのもので置き換えると、ｍｉＲ－２９ｃの標的配列を標的とするようにデザインされたｍｉＲ－２９ｃの１本の鎖（すなわち、ガイド鎖）の生成を高める（すなわち、ｍｉＲ－２９ｃの標的配列を標的とするのに有用ではないその相補的パッセンジャー鎖の生成を低下させる）ことができることが分かっている。
対照として、いくつかのいわゆるｍｉＲ－２９ｃ「ソロ」発現構築物を同じベクターバックグラウンドで生成した。これらのｍｉＲ－２９ｃソロ発現構築物は、μＤｙｓ遺伝子を発現しないが、代わりにＥＧＦＰまたはＧＦＰ等のレポーター遺伝子を発現し得る。
例えば、１つのかかるソロベクターは、すべてＥＦ１Ａプロモーターから、ＥＧＦＰコード配列の上流のイントロン配列に挿入されたｍｉＲ－２９ｃコード配列を発現する可能性がある。ｍｉＲ－２９ｃコード配列の骨格配列は、ｍｉＲ－３０、－１０１、－１５５、または－４５１のものによって修飾される場合もある。
別のかかるソロベクターは、ｓｈＲＮＡ、例えば、ＳＬＮを標的とする／その発現を下方制御するｓｈＳＬＮを発現する場合もある。このｓｈＲＮＡの発現は、短いＲＮＡ転写産物の強力な転写を生成するＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩによって使用され得るＵ６プロモーターによって駆動される場合もある。このｓｈＲＮＡコード配列は、ＧＦＰのコード配列の前のＵ６転写カセットのイントロンに挿入され得る。
比較として、２０１９年１２月１１日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８号に記載のいくつかのいわゆる「融合」ベクターもこの実験に含めた。
具体的には、いくつかの代表的な分岐、融合、またはソロベクターを使用して、ヒトｉＰＳ由来の心筋細胞をインビトロでトランスフェクトし、感染した心筋細胞におけるｍｉＲ－２９ｃの発現を測定し、その結果を図２に示した。
具体的には、５種のソロ構築物、５種の融合構築物、３種の分岐構築物、及び数種の対照のμＤｙｓ発現構築物を、標準的な手順に従って、ヒトｉＰＳ由来の心筋細胞にトランスフェクトした。成熟型ｍｉＲ－２９ｃのレベルは、ＴａｑｍａｎステムループＱＰＣＲで測定した。調べた５種のソロ構築物は、Ｕ６またはＥＦ１Ａ駆動型のｍｉＲ－２９ｃ発現カセットをｍｉＲ－３０骨格でデザインしたもの（ＥＦ１Ａ－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ及びＵ６－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ）ならびにｍｉＲ－１５５骨格でデザインしたもの（ＥＦ１Ａ－２９ｃ－１９ｎｔ及びＥＦ１Ａ－２９ｃ－１５５）を含む。調べた５種の融合構築物は、ｍｉＲ－２９ｃ発現カセットを、ｍｉＲ－１０１骨格でデザインし（μＤｙｓ－２９ｃ－１０１－ｉ２及びμＤｙｓ－２９ｃ－３ＵＴＲ－１０１）、ｍｉＲ－３０骨格でデザインし（μＤｙｓ－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ－ｉ２）、ならびにｍｉＲ－１５５骨格でデザインし（２９ｃ－１９ｎｔ－μＤｙｓ－３ＵＴＲ及び２９ｃ－１９ｎｔ－μＤｙｓ－ｐａ）、μＤｙｓ発現カセットに対してイントロン（ｉ２）、３’ＵＴＲ（３ＵＴＲ）及びｐＡ後（ｐａ）部位の位置に挿入されたものを含む。３種の分岐構築物（Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ－２９ｃ－ｖ１、－ｖ２、及び－ｖ５）はすべて、Ｐｏｌ ＩＩＩ（Ｕ６）プロモーターによって駆動される分岐発現カセットからｍｉＲ－２９ｃを発現した。
融合構築物は、感染させたヒトｉＰＳ由来の心筋細胞において、類似の構築物を用いたμＤｙｓのみを発現する対照（ひいては、内因性ｍｉＲ－２９ｃ発現のバックグラウンドレベルのみが存在するもの）と比較して、概してｍｉＲ－２９ｃを２～１１倍で過剰発現したことが明らかである。
図２のデータを生成するために使用した特定の融合構築物は、以下を含む：
２９ｃ－１９ｎｔ－μＤｙｓ－３ＵＴＲ：修飾ｍｉＲ２９ｃをｍｉＲ－１５５骨格に含み、μＤｙｓ発現カセットの３’－ＵＴＲ領域（ポリＡアデニル化シグナル配列の前）に挿入されたもの。
２９ｃ－１９ｎｔ－μＤｙｓ－ｐＡ：同じ修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－１５５骨格に含み、μＤｙｓ発現カセットのポリＡアデニル化シグナル配列の後に挿入されたもの。
μＤｙｓ－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ－ｉ２：修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－３０Ｅ骨格に含み、μＤｙｓ発現カセットのイントロン領域に挿入されたもの。
μＤｙｓ－２９ｃ－１０１－ｉ２：修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－１０１骨格に含み、μＤｙｓ発現カセットのイントロン領域に挿入されたもの。
μＤｙｓ－２９ｃ－３ＵＴＲ－１０１：修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－１０１骨格に含み、μＤｙｓ発現カセットの３’－ＵＴＲ領域に挿入されたもの。
一方、ｍｉＲ－２９ｃを発現するソロ構築物は、感染させたヒトｉＰＳ由来の心筋細胞において、μＤｙｓのみを発現する同じ対照ベクターと比較して、概してｍｉＲ－２９ｃを６～７３倍で過剰発現した。
図２のデータを生成するために使用した特定のソロ構築物は、以下を含む：
ＥＦ１Ａ－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ：修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－３０Ｅ骨格に含み、ＥＦ１Ａプロモーターによって駆動されるもの。
Ｕ６－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ：修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－３０Ｅ骨格に含み、Ｐｏｌ ＩＩＩ Ｕ６プロモーターによって駆動されるもの。
Ｕ６－２９ｃ－ｖ１：ｍｉＲ２９ｃコード配列がＰｏｌ ＩＩＩ Ｕ６プロモーターによって駆動されるもの。
ＥＦ１Ａ－２９ｃ－１９ｎｔ：修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－１５５骨格に含み、ＥＦ１Ａプロモーターによって駆動されるもの。
ＥＦ１Ａ－２９ｃ－１５５：別の修飾ｍｉＲ２９ｃコード配列をｍｉＲ－１５５骨格に含み、ＥＦ１Ａプロモーターによって駆動されるもの。
３種の分岐構築物はすべて、高～極高レベルのｍｉＲ－２９ｃ転写産物を発現し、ｖ２構築物は、最高の融合構築物μＤｙｓ－２９ｃ－Ｍ３０Ｅ－ｉ２のレベルに近く、ｖ１及びｖ５の両分岐構築物は、最高のソロ構築物に近かった（５０～７０倍）。図２を参照されたい。
これらの構築物からのｍｉＲ－２９ｃの（優先的な）生成を示す同様の傾向は、これらの構築物をＭｏｕｌｙのヒトの健康な初代筋芽細胞、マウスＣ２Ｃ１２不死化筋芽細胞株、及びマウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞を含めた他のインビトロ細胞系で評価した際にも得られ、すべてが、同じベクターからのμＤｙｓ発現に変化がなかった（データは示さず）。従って、μＤｙｓ発現カセットも含む本主題の分岐ベクターへのｍｉＲ－２９ｃ発現カセットの挿入は、μＤｙｓのｍＲＮＡ産生に大幅な減少（もしあれば）をもたらさない。
いくつかの選択された分岐組み換えウイルスベクターを含むＡＡＶ９ウイルス粒子（Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ－２９ｃ－ｖ１、－ｖ２、及び－ｖ５）を同様に使用して、分化したＣ２Ｃ１２の筋管及び初代マウス心筋細胞に感染させ、ｍｉＲ－２９ｃの発現をこれらの細胞でも確認した。μＤｙｓのみを発現する対照に対して正規化した後の相対的ｍｉＲ－２９ｃ発現として表される結果を含む図３を参照されたい。
この実験では、μＤｙｓの産生は、対照群と比較して大きく影響されないと思われた。さらに、ｍｉＲ－２９ｃのパッセンジャー鎖のレベルは、レベルの増加を示さなかった。
一方、本主題の分岐構築物からのｓｈｍＳＬＮの発現、及びかかる分岐構築物でトランスフェクトしたマウスＣ２Ｃｌ２細胞におけるマウスＳＬＮ－ホタル構築物のレベルの約９０％の下方制御の結果を、図４に示した。
図４で使用された様々な構築物を以下に示す。
μＤｙｓ：μＤｙｓ（ＧＯＩ）のみをコードする対照ＡＡＶ９ベクター。
ＥＦ１Ａ－ｍＳＬＮ：マウスＳＬＮ（ｍＳＬＮ）を標的とするｓｈＲＮＡのみを発現するソロ構築物。このｓｈＲＮＡコード配列の転写は、ＥＦ１Ａプロモーターによって駆動される。
ＥＦ１Ａ－ｍＳＬＮ（Ｖ２）：マウスＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡのみを発現する別のソロ構築物。このｓｈＲＮＡコード配列の転写は、ＥＦ１Ａプロモーターによって駆動される。
ｍＳＬＮ－ｓｈＲＮＡ対照：マウスＳＬＮを標的とする市販の陽性対照ｓｈＲＮＡ。
スクランブル：陽性対照ｓｈＲＮＡのスクランブル配列を有する市販の陰性対照ｓｈＲＮＡ。
４種の分岐構築物（Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ＿Ｖ１～＿Ｖ４）は、上に記載した。
約５０％のｍＳＬＮ発現のノックダウン（データは示さず）を達成した融合構築物に対比して、本主題の分岐構築物は、一貫して、デュアルルシフェラーゼベースのアッセイにおいて＞９０％のｍＳＬＮノックダウンを達成した。その結果は、ホタルルシフェラーゼからのＲＬＵ（相対的ルシフェラーゼ単位）のレニラルシフェラーゼからのＲＬＵに対する比として表現される。図４の結果は、調べたｍＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡを発現する４種すべての分岐構築物（Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ－Ｖ１、－Ｖ２、－Ｖ３及び４）が各々、μＤｙｓのみを発現し、ｍＳＬＮに対するｓｈＲＮＡを発現しない対照構築物（μＤｙｓ）と比較して、ｍＳＬＮの発現を＞９０％ノックダウンしたことを示す（正規化比１．０）。比較として、ＥＦ１Ａ－ｍＳＬＮ及びＥＦ１Ａ－ｍＳＬＮＶ２融合構築物は、同様のデュアルルシフェラーゼベースのアッセイで、それぞれ、約５０％～３０％ｍＳＬＮをノックダウンした。ｍＳＬＮ－ｓｈＲＮＡ陽性対照も同様に約８０～９０％ｍＳＬＮ発現をノックダウンしたが、スクランブル対照は、効果がなかった。図４を参照されたい。
図５は、分化したＣ２Ｃ１２筋管またはマウスの初代心筋細胞におけるｓｉＳＬＮ（転写ｓｈＳＬＮ由来のプロセスｓｉＲＮＡ産物）の相対的発現レベルを、ｓｈｍＳＬＮをコードする様々な組み換えＡＡＶ９ベクターに関して、このウイルスベクターの単独のコード配列として（「ソロ」）、または本開示の分岐構築物の一部として（「分岐」）のいずれかで示す。ｓｉＲＮＡ産生は、慣用ＴａｑｍａｎステムループＱＰＣＲシステムで定量化した。ソロ及び分岐構築物の相対的なｓｉＳＬＮ発現レベルを、μＤｙｓ対照群のレベルに対して正規化したが、対照群ではｓｉＳＬＮ様ＲＮＡの生成がほぼないか、または非常にわずかであるため、明らかな高い発現比は参考にはならない可能性がある。それでもなお、調べた両細胞型において、ソロ構築物は、対照群と比較して、強力なＵ６ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターから約１０００倍高いレベルのｓｉＳＬＮを発現したことは明らかである。一方、調べた分岐構築物は、ソロ構築物と比較して、同様に高いレベル（高くはないにしても）のｓｉＳＬＮに達した。
分岐ＡＡＶ構築物のすべてが、μＤｙｓのみを発現するソロ構築物のものにほぼ匹敵するＡＡＶ収量を有する。
ヒトＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡを発現する多数のさらなるソロ及び分岐構築物も同様に、ヒトｉＰＳ由来の心筋細胞で調べた。これらは、ヒトＳＬＮを標的とする６種のソロ構築物及び６種の分岐構築物を含む。これらの実験の結果を図６に要約した。
具体的には、いくつかの陰性対照（例えば、複数のμＤｙｓ及びＧＦＰプラスミド）ならびに陽性対照を図６の実験で使用した。陰性対照は、以下を含む：μＤｙｓのみを発現する２種の構築物（μＤｙｓ１及びμＤｙｓ２）（ＳＬＮのｍＲＮＡ発現レベルに影響を与えなかった）、筋特異的プロモーターＣＫ８の下でＧＦＰを発現する構築物（ＣＫ８－ＧＦＰ）（このＧＦＰもＳＬＮのｍＲＮＡ発現に影響を与えなかった）、ならびに「シグマスクランブル」、すなわち、ｈＳＬＮを標的とするｓｈＳＬＮのスクランブル配列を発現する構築物（これは、ＳＬＮのｍＲＮＡ発現に影響を与えなかったと予想される）。陽性対照は、「シグマｓｈｒｎａ」であり、これは、約８０％のｈＳＬＮのｍＲＮＡを下方制御するｈＳＬＮ標的化ｓｈＳＬＮをコードするＳｉｇｍａ製の市販のｓｈＲＮＡプラスミドである。
各々が、ｈＳＬＮを標的とするある型のｓｈＲＮＡを発現し、かつ各々が強力なＰｏｌ ＩＩＩ Ｕ６プロモーターの転写制御下にある６種のソロ構築物を調べたところ、概してｈＳＬＮのｍＲＮＡ発現の約８０～９０％を下方制御することが分かった。
６種のソロ構築物及び本発明の４種の分岐構築物にわたって、最大９０～９５％のｈＳＬＮのｍＲＮＡ発現のダウンダウン（ｄｏｗｎ－ｄｏｗｎ）も観察された。例えば、このｃｏｍｂｏ－ｃ１－ｖ１構築物は、μＤｙｓ及びｈＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡを共発現する分岐構築物である。ヒトｉＰＳ由来の心筋細胞にこの構築物を感染させると、ｈＳＬＮのｍＲＮＡの最大９０％がノックダウンされた。同じことが、他の３種のコンボ構築物、ｃｏｍｂｏ－ｃ１－ｖ２、ｃｏｍｂｏ－ｃ２－ｖ１、及びｃｏｍｂｏ－ｃ２－ｖ２でも認められた。
同じ結果はまた、初代マウス心筋細胞でも認められ、ｍＳＬＮを標的とするｓｈＲＮＡを発現するソロまたは本発明の分岐ＡＡＶ９構築物を使用して、ｍＳＬＮのｍＲＮＡ発現が最大９０％ノックダウンされた。図７を参照されたい。
これらの分岐構築物は、ｈＳＬＮのｍＲＮＡ発現に大きく影響を与えたが、同じベクターからのμＤｙｓの発現には悪影響を与えるとは思われなかった。図８に示すように、ヒトＳＬＮを標的とする６種のソロ及び６種の分岐構築物を、ヒトｉＰＳ由来の心筋細胞にトランスフェクトした。ほとんどの分岐構築物は、対照のμＤｙｓのみの構築物とほぼ同様の（＞５０％）μＤｙｓのｍＲＮＡ発現を示した。
選択されたソロ、融合、及び分岐構築物の変性アガロースゲル分析でも、これらのｍｉＲ－２９ｃまたはｓｈＳＬＮ構築物のＡＡＶ９ゲノムがほとんど無傷であることが確認された。図９を参照されたい。さらに、図９において、３種すべてのＡＡＶ９カプシドタンパク質ＶＰ１～ＶＰ３の比は、すべてのＡＡＶ９ベースのソロ、融合、及び分岐ベクター間で同じままである。図１０を参照されたい。
これらの結果は、本主題の分岐ベクターから生じたＡＡＶ９ウイルスベクターが、融合ベクターと同様に、ゲノムの完全性を有することを実証している。
実施例２ 分岐構築物からのコード配列のインビボ発現
この実験は、本主題の分岐構築物を融合構築物と同様に使用して、μＤｙｓと、別の経路（例えば、ＳＬＮの下方制御、及び／またはｍｉＲ－２９ｃの上方制御）に影響する１つ以上のさらなるコード配列（複数可）を同時に発現することができ、相乗的な治療効果ではないにしても、ソロ以上を達成することができることを実証する。
この一連の実験では、μＤｙｓ遺伝子及び第二のコード配列、すなわち、ｍｉＲ－２９ｃまたはマウスＳＬＮを標的とするｓｈｍＳＬＮをコードするＡＡＶ９のいくつかの融合及び分岐構築物を使用した。これらの融合及び分岐構築物を、用量約５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇで（１つの群、すなわち、Ｕ６－２９ｃ－ｖ１の１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇを除く）、６週齢の雄ｍｄｘマウスに尾静脈から注射した。次いで、μＤｙｓ、ｍｉＲ－２９ｃ、及びＳＬＮのｍＲＮＡの発現を、注射後２８日間にわたって観察した。詳細な実験設定を以下に要約する：
Figure 2023510799000048
ｍｉＲ－２９ｃの実験群では、調べた２種の融合構築物、すなわち、Ｍ３０Ｅ骨格に含まれ、μＤｙｓ発現カセットのイントロンに挿入されたもの、及びｍｉＲ－１０１骨格に含まれ、μＤｙｓ発現カセットの３’－ＵＴＲ領域に挿入されたものは、左腓腹筋（ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８の図２０Ａ参照）、横隔膜（ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８の図２０Ｂ参照）、及び左心室（ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８の図２０Ｃ参照）において、１．４～２．８倍のｍｉＲ－２９ｃの上方制御をもたらすことが見出された。ｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ融合ＡＡＶ９構築物は、５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。ＡＡＶ９中のソロＵ６プロモーター駆動型ｍｉＲ－２９ｃ構築物は、５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量では２～１１倍の上方制御をもたらし、１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの用量では６～１６倍をもたらした。
一方、融合ＡＡＶ９構築物によるｍｉＲ－２９ｃの上方制御は、腓腹筋（ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８の図２１参照）、横隔膜（データは示さず）及び左心室（データは示さず）において、μＤｙｓ産生の減少をもたらさなかった。融合ＡＡＶ９構築物は、ＲＮＡ及びタンパク質の両レベルで、対照のμＤｙｓのみのＡＡＶ９構築物のものと同様のμＤｙｓ発現を示した。ｍｉＲ－２９ｃのみを発現するソロ構築物は、μＤｙｓを産生しないため、μＤｙｓレベルの欠如を示した。
同様に、調べた３種の分岐構築物（Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ－２９ｃ－ｖ１、－ｖ２、及び－ｖ５）は、左腓腹筋において２～６倍のｍｉＲ－２９ｃの上方制御（図１１、上のパネル）、横隔膜において最大５．８倍のｍｉＲ－２９ｃの上方制御（図１１、左下のパネル）、及び左心室において最大７．５倍のｍｉＲ－２９ｃの上方制御（図１１、右下のパネル）をもたらすことが見出された。
興味深いことに、ｍｉＲ－２９ｃの発現レベルの上昇は、血漿でも検出することができたことから（図１２）、ｍｉＲ－２９ｃの血清／血漿レベルが、ｍｉＲ－２９ｃの発現レベルを追跡するためのバイオマーカーとして使用され得ることが示唆される。
分岐ＡＡＶ９構築物によるｍｉＲ－２９ｃの上方制御はまた、左腓腹筋（図１３、左のパネルがＲＮＡに関し、右のパネルがタンパク質に関する）、横隔膜（データは示さず）、及び左心室（データは示さず）におけるμＤｙｓ産生の低下をもたらさなかった。これらの分岐ＡＡＶ９構築物は、ＲＮＡ及びタンパク質の両レベルで、対照のμＤｙｓのみのＡＡＶ９構築物のものと同様のμＤｙｓ発現を示した。ｍｉＲ－２９ｃのみを発現するソロ構築物は、μＤｙｓを産生しないため、無視できるほどのμＤｙｓレベルを示した。
このｓｈｍＳＬＮ実験群では、調べたｓｈｍＳＬＮ融合ＡＡＶ９構築物は、横隔膜、左腓腹筋、及び心房（ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８の図２２参照）、ならびに舌（データは示さず）において最大５０％のｍＳＬＮのｍＲＮＡの下方制御をもたらすことが分かった。同様に、融合ＡＡＶ９構築物によるｍＳＬＮのｍＲＮＡの下方制御は、ＲＮＡ及びタンパク質の両レベルで、腓腹筋（ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８の図２３参照）、横隔膜（データは示さず）、及び左心室（データは示さず）において、μＤｙｓのみを発現する対照ＡＡＶ９のものと比較してμＤｙｓ産生を減少させなかった。ｓｈｍＳＬＮのみを発現するソロ構築物は、μＤｙｓを産生しなかったため、μＤｙｓレベルの欠如を示した。横隔膜の結果を示す。舌及び心房でも同様の結果となる。
同様に、調べた２種のｓｈｍＳＬＮ分岐ＡＡＶ９構築物（Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ－ｓｈｍＳＬＮ－ｖ１及び－ｖ２）は、横隔膜において最大７５％のｍＳＬＮのｍＲＮＡの下方制御（図１４、上のパネル）、左心房において最大９５％のｍＳＬＮのｍＲＮＡの下方制御（図１４、左下のパネル）、及び左腓腹筋において最大８０％のｍＳＬＮのｍＲＮＡの下方制御（図１４、右下のパネル）を、ならびに舌においても（図１６参照）もたらすことが見出された。ｓｉＲＮＡの産生は、これらの実験で別々に確認した。
１つの分岐ＡＡＶ９構築物によるｍＳＬＮのｍＲＮＡの下方制御も同様に、ＲＮＡ及びタンパク質の両レベルで、横隔膜（図１５、左のパネルがＲＮＡに関し、右のパネルがタンパク質に関する）、舌（図１６、左のパネル）、及び心房（データは示さず）において、Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ－ｓｈｍＳＬＮ－ｖ２構築物が左腓腹筋において６０～７０％μＤｙｓ発現を低下させたことを除いて、μＤｙｓのみを発現する対照ＡＡＶ９のものと比較してμＤｙｓ産生を低下させなかった。ｓｈｍＳＬＮのみを発現するソロ構築物はμＤｙｓを産生しなかったため、μＤｙｓレベルを示さない。
これらのデータは、本主題の分岐構築物が、μＤｙｓ遺伝子及び少なくとも１つのさらなるコード配列、例えば、ｍｉＲ－２９ｃまたはＳＬＮに対するｓｈＲＮＡの両方を同時に発現することができること、ひいては、１つのコード配列、例えば、μＤｙｓのみを発現するウイルスベクターと比較して、良好な治療結果を達成することを示す。
実施例３ 分岐構築物からインビボで発現されるコード配列は生物学的に活性である
この実験は、本発明の分岐構築物から発現されるコード配列が生物学的に活性であることを実証する。
ジストロフィンは、筋細胞膜に構造的安定性をもたらし、筋細胞膜鞘の透過性の増加は、筋線維からのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の放出につながる。従って、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルの上昇は、筋損傷の特徴である。ＤＭＤ患者では、ＣＫレベルは正常範囲を超えて大幅に増加する（例えば、出生以来正常レベルの１０～１００倍）。同様に、血清ＣＫレベルは、ｍｄｘマウスモデルでは、筋肉の健康状態の一般的な尺度と見なされる。
この実験のデータは、ＡＡＶ９のｍｉＲ－２９ｃソロ（１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの高用量で投与）及びｍｉＲ－２９ｃ－μＤｙｓ分岐（５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与）の両構築物が、ｍｄｘマウスモデルの血清ＣＫレベルをμＤｙｓ対照と比較して同程度まで低下させたことを示すことから、ＤＭＤ患者において、ｍｉＲ－２９ｃを発現することの治療的有用性を示唆している。
具体的には、実施例２のインビボ実験で、様々なマウス群の血清ＣＫレベルも測定した。図１７は、μＤｙｓ単独の発現が血清ＣＫレベルの有意な低下を引き起こしたことを示す。調べた３種すべての分岐構築物でのμＤｙｓ及びｍｉＲ－２９ｃの共発現により、血清ＣＫレベルも同様に有意に低下した。興味深いことに、ｍｉＲ－２９ｃを単独で発現させると、特に、より高ウイルス用量（のｍｉＲ－２９ｃを発現するソロ構築物）を使用した場合に、血清ＣＫレベルが有意に低下した。
図１８では、ソロ構築物または分岐構築物のいずれかからのｓｈｍＳＬＮの発現は、血清ＣＫレベルを低下させるとは思われなかった。
一方、組織性メタロプロテアーゼ阻害因子１（ＴＩＭＰ－１）は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者の疾患の進行及び／または治療効果を観察するための血清バイオマーカーとして提示されている。これは、健康な対照と比較して、ＤＭＤ患者ではＴＩＭＰ－１の血清レベルが有意に高いからである。同様に、ＴＩＭＰ１は、ｍｄｘマウスモデルにおける筋肉の健康状態の血清マーカーでもある。
従って、実施例２のインビボ実験で、様々なｍｄｘマウス群の血清ＴＩＭＰ１レベルも測定した。ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８の図２５の左側のパネルでは、μＤｙｓ単独の発現が血清ＴＩＭＰ１レベルの有意な低下を引き起こすことが示された。両方とも調べた融合構築物でのμＤｙｓ及びｍｉＲ－２９ｃの共発現により、血清ＴＩＭＰ１レベルも同様に有意に低下した。一方、ｍｉＲ－２９ｃを単独で発現させると、より高ウイルス用量（のｍｉＲ－２９ｃを発現するソロ構築物）を使用した場合でも、血清ＴＩＭＰ１レベルは低下しなかった。
同様に、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５７１８の図２５の右側のパネルは、μＤｙｓ単独の発現が血清ＴＩＭＰ１レベルの有意な低下を引き起こしたことを示す。調べた融合構築物でのμＤｙｓ及びｍＳＬＮに対するｓｈＲＮＡの共発現により、血清ＴＩＭＰ１レベルも同様に有意に低下した。一方、ｍＳＬＮに対するｓｈＲＮＡを単独で発現させても、血清ＴＩＭＰ１レベルは低下しなかった。
ここで、同様の結果が分岐構築物から得られた。図１９の左のパネルでは、μＤｙｓ単独の発現により、血清ＴＩＭＰ１レベルの有意な低下がもたらされた。調べた３種すべての分岐構築物によるμＤｙｓとｍｉＲ－２９ｃの共発現もまた、血清ＴＩＭＰ１レベルの同様に有意な低下をもたらした。一方、ｍｉＲ－２９ｃ単独の発現では、高ウイルス用量（のｍｉＲ－２９ｃ発現ソロ構築物）を用いた場合であっても、血清ＴＩＭＰ１レベルの低下につながらなかった。
同様に、図１９の右のパネルでは、μＤｙｓ単独の発現により、血清ＴＩＭＰ１レベルの有意な低下がもたらされた。調べた分岐構築物によるμＤｙｓとｍＳＬＮに対するｓｈＲＮＡの共発現もまた、血清ＴＩＭＰ１レベルの同様に有意な低下をもたらした。一方、ソロ構築物でのｍＳＬＮに対するｓｈＲＮＡ単独の発現では、血清ＴＩＭＰ１レベルの低下につながらなかった。
実施例４ 分岐構築物は腓腹筋において対照構築物に匹敵する生体内分布を示す
実施例２のインビボ実験で、分岐ウイルスベクターの生体内分布を、μＤｙｓのみを発現するソロウイルスベクターのものと比較した。使用されたほとんどのウイルスベクターの生体内分布は、分岐構築物がｍｉＲ－２９ｃを発現するかｓｈｍＳＬＮを発現するかにかかわらず、腓腹筋ではほぼ同じであることが分かった。図２０を参照されたい。ｓｈｍＳＬＮをコードする分岐ベクターの１つは、しかしながら、μＤｙｓソロ構築物のものと比較して低いと思われた。
実施例５ ２種の分岐構築物は肝臓における生体内分布の低下を示した
実施例２のインビボ実験で、分岐ウイルスベクターの肝臓レベルを、μＤｙｓのみを発現するソロウイルスベクターのものと比較した。使用されたほとんどのウイルスベクターのウイルス力価は、分岐構築物がｍｉＲ－２９ｃを発現するかｓｈＳＬＮを発現するかにかかわらず、肝臓ではやや低いことが分かった。図２１を参照されたい。唯一の例外は、ｍｉＲ－２９ｃを発現するＤＩＶ－２９ｃ－ｖ５ベクターであると思われ、これは、明らかに、μＤｙｓソロ構築物のものと同じ（高くはないにしても）ウイルス力価を有していた。
肝臓障害が肝臓におけるこの明白な低力価の原因であるかどうかを特定するため、分岐ベクターが感染した様々な群に関して血漿ＡＬＴレベルを評価した。図２２の結果は、肝臓でのウイルス力価が低い２種の分岐構築物、ＤＩＶ－２９ｃ－ｖ１及び－ｖ２は、両方ともＰＢＳ対照のものより低くはないにしても同等の血漿ＡＬＴレベルを有していたことから、肝臓障害が肝臓における低力価の原因である可能性が低いことを示した。
実施例６ 分岐構築物を使用する治療効果のμＤｙｓ単独療法と比較した向上
μＤｙｓとｍｉＲ－２９ｃの同時発現が、良好な治療効果及び／または線維化等の合併症の減少につながるかどうかを判断するため、２つの線維化マーカー遺伝子、Ｃｏｌ３ａ１及びＦｎ１の発現レベルを、実施例２の様々な分岐、ソロ、または対照構築物を投与したマウスで調べた。Ｃｏｌ３Ａ１の発現及びＦＮ１の発現は、線維化活性のマーカーとして使用されている。
横隔膜では、μＤｙｓまたはｍｉＲ－２９ｃのみを発現するソロＡＡＶベクターは、線維化マーカー遺伝子Ｃｏｌ３Ａ１の発現を約３５～５０％低下させた。高用量のソロｍｉＲ－２９ｃ構築物（１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）は、対照のレベルの約１／３までさらにＣｏｌ３Ａ１の発現を低下させた（図２３、左上のパネル）。分岐構築物の１つであるＤＩＶ－２９ｃ－ｖ１は、Ｃｏｌ３Ａ１レベルを９０％超、劇的に低下させた。これは、μＤｙｓ及びｍｉＲ－２９ｃ単独による低下のレベルを考えると、予想外であった。他方の分岐構築物であるＤＩＶ－２９ｃ－ｖ５は、ｍｉＲ－２９ｃソロ構築物であるＵ６－２９ｃ－ｖ１と同じ程度までＣｏｌ３Ａ１の発現を低下させた。
他方の繊維化遺伝子Ｆｎ１の発現もまた、程度は低いものの低下した。μＤｙｓ単独構築物は、横隔膜でのＦｎ１の発現を大幅に低下させるようには見えなかったが、ｍｉＲ－２９ｃソロ構築物は、通常用量の５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇでＦｎ１の発現を中程度に約２５％低下させ、高用量の１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇでは、５０％超低下させた。両分岐ベクターは、Ｆｎ１の発現を、通常力価と高力価のｍｉＲ－２９ｃの間のレベルで低下させた。
左腓腹筋では、しかしながら、Ｃｏｌ３Ａ１の発現レベルは、μＤｙｓによって５０％超低下したが、ｍｉＲ－２９ｃによって通常力価では約５０％、及び高力価では１００％明らかに増加した。両分岐ベクターは、左腓腹筋におけるＣｏｌ３Ａ１の発現をほぼ５０％直下まで低下させた。
同様の結果が左腓腹筋におけるＦｎ１の発現に関して認められた。μＤｙｓはＦｎ１の発現を低下させ、ｍｉＲ－２９ｃはそこでのＦｎ１の発現を増加させたと同時に、両分岐ベクターは、μＤｙｓ単独と同じ程度まで（高くはないにしても）、予想外にＦｎ１の発現を低下させた。
しかしながら、この週齢のｍｄｘマウス（すなわち、１０週）では、線維化は通常横隔膜でのみ現れることに留意されたい。腓腹筋は、線維化の観点からは大部分が「正常」である。
これらの結果は、横隔膜において及び恐らくは左腓腹筋においても、本発明の分岐構築物のμＤｙｓ構築物単独に対する追加的な効果を、それらがこれら２つの線維化マーカー遺伝子に与える影響に基づいて示す。
実施例７ 酵素ベースの遺伝子編集の送達：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ及びｓｇＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ
本主題のウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶウイルスベクターを使用して、標的細胞での標的遺伝子の同時ノックダウンのため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ（または他の改変もしくは修飾Ｃａｓ酵素もしくはその相同物）を、標的細胞に、１つ以上のｓｇＲＮＡ（Ｃａｓ９用）、または１つ以上のｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ１２ａ用）とともに送達することができる。標的細胞の指向性は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ及びｓｇＲＮＡ／ｃｒＲＮＡをコードする配列が存在するウイルス粒子の指向性によって部分的に制御することができる。
例えば、ＡＡＶを介した送達の場合、本主題のウイルスベクターにおけるＧＯＩは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａのコード配列であり得る。Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａにそれぞれ搭載することができる１つ以上のｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２ａの発現カセットの分岐発現カセット、イントロン、３’－ＵＴＲ、または他の場所から発現され得る。
標的細胞を本主題のウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターに感染させると、Ｃａｓタンパク質及びｓｇＲＮＡ／ｃｒＲＮＡが標的細胞内で共発現され、遺伝子編集を媒介する。
本明細書に記載される本発明は、遺伝子治療のためのウイルスベクターで、第一のポリペプチドまたは第一のＲＮＡ（「第一の転写および／または発現ユニットまたはカセット」）と、第一の転写および／または発現カセットに関していわゆる「分岐カセット」から発現される第二のポリペプチドまたは第二のＲＮＡ（「第二の転写および／または発現ユニットまたはカセット」）とを同時にコードするポリヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを提供し、ここで、分岐カセットは、第一および第二のポリペプチドおよび／またはＲＮＡのそれぞれの発現のための別個の独立した制御を与え、異なる転写および／または発現ユニットまたはカセット間の転写干渉は最小限であるか、または全くない。したがって、本発明のウイルスベクターは、「分岐ベクター」と呼ばれることがある。特定の態様では２つの転写および／または発現ユニットまたはカセットがそれぞれ、それ自体の独立した制御要素またはプロモーターの制御下にある。特定の態様では、２つの独立した制御要素またはプロモーターが反対方向に作用する。例えば、各々はその最も近い末端反復配列（例えば、ＡＡＶベクター中のＩＴＲ配列）に向かって（から離れて、とは反対に）転写する。
本明細書で使用される場合、「第一の」および「第二の」転写カセットまたは単位は、２つの転写カセットのうちのいずれか１つを、第一の転写カセットまたは第二の転写カセットと呼ぶことができるという意味で、相対的な用語である。したがって、ある特定の例の下に記載される「第一の転写カセット」は、異なる例の下に記載される別の「第一の転写カセット」と必ずしも同一または同等ではない。
本発明は、１つ以上のコード配列が特定の位置に、例えば、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のための制御要素またはプロモーターと最も近いＩＴＲとの間に位置する、いわゆる「分岐カセット」（下記参照）に、挿入され得るという驚くべき発見に部分的に基づいている。機能性タンパク質（例えば、ジストロフィンミクロ遺伝子またはミニ遺伝子産物）および１つまたは複数のコード配列の両方は機能性タンパク質（例えば、ジストロフィンミニ遺伝子産物）のみまたは１つまたは複数のコード配列のみを包含する同様のベクター構築物と比較して、発現の有意な減少なしに、感染した標的細胞（例えば、筋細胞）の内部で発現され得る。特定の態様では、分岐カセットからの１つまたは複数のコード配列の発現が同じコード配列をウイルスベクターの他の部分、例えばＧＯＩの異種イントロンまたは３’－ＵＴＲに挿入することと比較して大幅に増加する。
本明細書で使用される場合、「転写および／または発現ユニットまたはカセット」は、少なくとも制御要素、コード配列、および転写終結配列を含む。各転写および／または発現ユニットまたはカセット中のコード配列は、タンパク質、ポリペプチド、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはそれらの前駆体など）、アンチセンス配列、遺伝子編集酵素のためのガイド配列、またはｍｉＲＮＡ阻害剤などのいずれかを独立してコードすることができる。コード配列は、プロモーター、および場合により１つ以上のエンハンサー、またはＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ ＩＩまたはＰｏｌ ＩＩＩを含む）による転写を開始または影響するためのものであり、コード配列によってコードされるものが何であっても転写され得る他の制御要素を含む制御要素に作動可能に連結され、その制御下にある。コード配列はまた、転写が所望に応じて終結され得るように、下流の転写終結配列（例えば、Ｔ６転写終結配列）に作動可能に連結される。
本明細書で使用される場合、２つ以上の転写単位および／またはカセットが反対／分岐／多方向に動作する構築物は、「分岐構築物」と呼ばれる。
具体的には、本発明のウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベースのウイルスベクターまたはレンチウイルスベースのウイルスベクター）は２つの転写および／または発現ユニットもしくはカセットのそのような配置、またはウイルスプラスミドベクターバックボーン中の分岐構築物を有し、「分岐ベクター」と称される。
例えば、本発明のベクターは第一の転写カセットから発現される第一の治療剤（例えば、タンパク質）と、分岐カセットから発現される第二の治療剤（例えば、ＲＮＡ）とを同時にコードし得る。
第一および第二（分岐）発現単位および／またはカセットへの言及は、２つのＧＯＩのいずれも、発現ユニットおよび／またはカセットのいずれかから発現させることができるよう相対的であることを理解されたい。例えば、一態様では、ミクロジストロフィンコード配列が第一または第二（分岐）発現カセットから発現させることができる。別の態様では、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどのいずれも、第一または第二（分岐）発現カセットから発現させることもできる。さらに、発現ユニット／カセットの両方を使用して、本明細書に記載のタンパク質または非タンパク質産物（ｍｉＲＮＡまたはその前駆体など）を発現させることができる。
すなわち、第一または第二のＲＮＡのいずれか、または両方は、タンパク質またはポリペプチドを産生しない非コードＲＮＡであり得る。そのような非コードＲＮＡはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、ｓｈＲＮＡ（短ヘアピンＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｘｉｓｔ及びＨＯＴＡＩＲのような長鎖ｎｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、又はそれらの前駆体であり得、好ましくは治療的価値を有するもの、例えば、癌、自閉症、アルツハイマー病、軟骨毛髪形成不全症、難聴、及びＰｒａｄｅｒ－Ｗｉｌｌｉ症候群、特にＤＭＤ／ＢＭＤを含む種々のタイプの筋ジストロフィー（ＭＤ）に関連するものであり得る。
そのような非コードＲＮＡはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質の単一または複数のガイドＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ（以前はＣｐｆ１）タンパク質のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であり得る。
さらに、２つの転写ユニット／カセットは、生物学的に無関係であるか、または生物学的機能に関して何らかの関連がある産物（タンパク質、ペプチド、ＲＮＡなど）を発現するために使用され得る。例えば、コードされた／発現された産物の一方は疾患または状態における欠陥遺伝子産物の機能を置き換えることができ、他方のコードされた／発現された産物は別々の生物学的経路に作用することができ、したがって、２つの産物が送達され、望ましくは相加的または相乗的な生物学的および治療的効果をもたらす。筋ジストロフィーを治療する文脈において、例えば、コード化／発現された産物の１つは失われたジストロフィン機能を補うジストロフィン（μＤｙｓなど）の機能バージョンであり得、一方、他のコード化／発現された産物は線維症などのジストロフィン機能の喪失に関連する副作用に拮抗し得る。
したがって、一側面では本発明がａ）作動可能に連結された第一の制御要素の制御下で第一の目的の遺伝子（第一のＧＯＩ）を発現するための第一の転写カセットと、ｂ）作動可能に連結された第二の制御要素の制御下で、第二の目的の遺伝子（第二のＧＯＩ）を発現するための第二の転写カセットとを含む組換えウイルスベクターを提供し、前記第一の転写カセットおよび前記第二の転写カセットは配列が重複せず、前記第一の制御要素および前記第二の制御要素はそれぞれ、第一のＧＯＩおよび第二のＧＯＩを、互いに離れて、反対方向に転写する。
すなわち、第一の転写カセットおよび第二の転写カセットは独立して、逆方向／分岐方向に、好ましくはそれぞれ最も近い末端反復配列（例えば、ＡＡＶのＩＴＲ）に転写を向ける、それら自体の転写制御要素／プロモーターの制御下にある。
特定の態様では、第一の目的の遺伝子が疾患または状態に欠陥がある野生型または正常遺伝子（例えば、コドン最適化野生型または正常遺伝子）をコードし、第二の目的の遺伝子は疾患または状態に欠陥がある前記遺伝子の産物を標的とするアンタゴニストをコードする。
ある特定の態様では、第一の目的の遺伝子がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３ａ～１３ｄ）をコードし、前記第二の目的の遺伝子は標的配列にそれぞれ特異的な１つまたは複数のガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９のｓｇＲＮＡ、またはＣａｓ１２ａのｃｒＲＮＡ）をコードする。
特定の態様では、第一の目的の遺伝子および第二の目的の遺伝子が疾患または状態の治療に有益な異なる経路で機能する産物をコードする。
ある特定の態様では、組換えウイルスベクターにおいて、ａ）第一のＧＯＩは下流のタンパク質コード配列、タンパク質コード配列の下流の３’－ＵＴＲコード領域、およびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ）の発現を増強する異種イントロン配列を含み； ｂ）第二のＧＯＩは独立して以下をコードする１つ以上のコード配列を含む：タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、遺伝子編集酵素のガイド配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および／またはｍｉＲＮＡ阻害剤；ならびに、ｃ）場合により、第一のＧＯＩの異種イントロン配列および／または３’）および／またはｍｉＲＮＡ阻害剤を含む。
特定の態様では、本発明がａ）筋ジストロフィーを治療するのに有効なものなどの、目的の機能的遺伝子またはタンパク質（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチドであって、３’－ＵＴＲコード領域を含み、ポルヌクレオチドによってコードされる機能的タンパク質の発現を増強する異種イントロン配列に対して直ちに３’であるポリヌクレオチド； ｂ）ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、その発現を駆動する第一の制御要素（例えば、筋特異的制御要素）；およびｃ）第一の制御要素と最も近いウイルス末端配列（例えば、ＡＡＶ中のＩＴＲ）との間に挿入され、第二の制御要素に作動可能に連結された１つまたは複数のコード配列；および（２）任意選択でイントロン配列または３’－ＵＴＲコード領域にさらに挿入された１つまたは複数のコード配列を含む組換えウイルスベクターを提供し；ここで、前記１つまたは複数のコード配列は独立して、タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、ａ． 遺伝子編集酵素のガイド配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａのａｃｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および／またはｍｉＲＮＡ阻害剤。
特定の態様では、組換えウイルスベクターが組換えＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクターまたは組換えレンチウイルスベクターである。
特定の態様では本発明がａ）筋ジストロフィーを治療するのに有効な機能性タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、３’－ＵＴＲコード領域を含み、ポルヌクレオチドによってコードされる機能性タンパク質の発現を増強する異種イントロン配列に対して直ちに３’であるポリヌクレオチド； ｂ）ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、その発現を駆動する筋特異的制御要素；およびｃ）筋特異的制御要素と最も近いＡＡＶ ＩＴＲとの間に挿入され、第二の制御要素に作動可能に連結された１つまたは複数のコード配列；および（２）場合によりイントロン配列または３’－ＵＴＲコード領域にさらに挿入された１つまたは複数のコード配列を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを提供し、ここで、前記１つまたは複数のコード配列は独立して、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および／またはｍｉＲＮＡ阻害剤をコードする。
特定の態様では、本明細書に記載される本発明がａ）機能性マイクロジストロフィンタンパク質（例えば、ミクロＤ５）をコードするジストロフィンミクロ遺伝子またはミニ遺伝子であって、３’－ＵＴＲコード領域を含み、ジストロフィンミクロ遺伝子またはミニ遺伝子の発現を増強する異種イントロン配列に対して直ちに３’であるジストロフィンミクロ遺伝子またはミニ遺伝子； ｂ）ジストロフィンミクロ遺伝子またはミニ遺伝子に作動可能に連結され、発現を駆動する筋特異的制御要素；およびｃ）筋特異的制御要素と最も近いＡＡＶ ＩＴＲとの間に挿入され、第二の制御要素に作動可能に連結された１つまたは複数（例えば、１つ、２ アンチセンス配列、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および／またはｍｉＲＮＡ阻害剤。
特定の態様では、第二の制御要素が１つまたは複数のコード配列を転写するプロモーターまたはプロモーターの一部である。例えば、第二の制御要素は、第一の制御要素と最も近いウイルス末端配列との間に挿入された１つ以上のコード配列を、場合により第一の制御要素によって開始される転写と反対の方向に転写するｐｏｌ ＩＩプロモーターである。他の態様では、第二の制御要素がｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。他の態様では、第一の制御要素および第二の制御要素は両方とも同じプロモーターである。他の態様では、第一および第二の制御要素が異なるプロモーターである。
特定の態様では機能的ジストロフィンタンパク質がミクロＤ５であり、および／または筋肉特異的制御要素／プロモーターはＣＫプロモーターである。
特定の態様では、１つまたは複数のコード配列が機能性タンパク質をコードまたは発現しない転写カセットに挿入される。ある特定の態様では、１つまたは複数のコード配列が３’－ＵＴＲコード領域にさらに挿入されるか、または機能性タンパク質をコードまたは発現する転写カセットのポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ）の後に挿入される。
特定の態様では、機能的ＧＯＩの発現が１つまたは複数のコード配列の存在下では実質的に影響を受けない（例えば、前記１つまたは複数のコード配列を含まない他の点では同一の対照構築物と比較して）。
ある特定の態様では、第一のＧＯＩがｗｔまたは正常なＳＥＲＰＩＮＡ１コード配列（例えば、コドン最適化ＳＥＲＰＩＮＡ１コード配列）であり、第二のＧＯＩはＳＥＲＰＩＮＡ１の変異アレルを標的とするＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）をコードする。
特定の態様では、ＳＥＲＰＩＮＡ１の変異アレルがピッツバーグアレル、Ｂ（Ａｌｈａｍｂｒａ）アレル、Ｍ（Ｍａｌｔｏｎ）アレル、Ｍ（Ｈｅｅｒｌｅｎ）アレル、Ｍ（Ｍｉｎｅｒａｌ Ｓｐｒｉｎｇｓ）アレル、Ｍ（ｐｒｏｃｉｄａ）アレル、Ｉ（Ｎｉｃｈｉｎａｎ）アレル、Ｐ（Ｌｏｗｅｌｌ）アレル、ヌル（Ｇｒａｎｉｔｅ ｆａｌｌｓ）アレル、ヌル（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ）アレル、ヌル（Ｍａｔｔａｗａ）アレル、ヌル（ｐｒｏｃｉｄａ）アレル、ヌル（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ １）アレル、ヌル（Ｂｏｌｔｏｎ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈアレル、Ｖ（アウクスブルク）アレル、Ｗ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）アレル、ヌル（Ｄｅｖｏｎ）アレル、ヌル（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ）アレル、Ｚ（Ｗｒｅｘｈａｍ）アレル、ヌル（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ ２）アレル、ヌル（Ｒｉｅｄｅｎｂｕｒｇ）アレル、カルシェカー－ポラーアレル、Ｐ（Ｄｕａｒｔｅ）アレル、ヌル（Ｗｅｓｔ）アレル、Ｓ（Ｉｉｙａｍａ）アレル、またはＺ（Ｂｒｉｓｔｏｌ）アレル。
ある特定の態様では第一のＧＯＩが５’－ＵＴＲおよび／または変異ＳＥＲＰＩＮＡ１とは異なる３’－ＵＴＲを有するＳＥＲＰＩＮＡ１のコドン最適化ｗｔコード配列または正常コード配列であり、ＲＮＡｉ剤は５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、および／またはＳＥＲＰＩＮＡ１のコドン最適化ｗｔアレルではなく変異体に特異的に関連するコード配列標的配列を標的とする。
特定の態様では、第一の制御要素および／または第二の制御要素がＡｐｏＥエンハンサーおよびα１－アンチトリプシンプロモーターなどの肝臓特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。
特定の態様では、第一のＧＯＩが反復伸長障害（ＲＥＤ）に欠陥のある遺伝子のｗｔまたは正常なコード配列（例えば、ＲＥＤに欠陥のある遺伝子のコドン最適化ｗｔまたは正常なコード配列）であり、第二のＧＯＩはＲＥＤに欠陥のある遺伝子の変異アレルを標的とするＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）をコードする。
ある特定の態様ではＲＥＤが（５２超の）ＣＡＧトリヌクレオチド反復を有する変異ＡＴＸＮ３遺伝子から生じる脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）であり、ＲＮＡｉ剤はＡＴＸＮ３のｗｔアレルではなく変異体に特異的に関連するＳＮＰを標的とする。
ある特定の態様ではＲＥＤが（５２超の）ＣＡＧトリヌクレオチド反復を有する変異体ＡＴＸＮ３遺伝子から生じる脊髄小脳性運動失調３（ＳＣＡ３）であり、ここで、第一のＧＯＩは変異体ＡＴＸＮ３の５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを有するＡＴＸＮ３のコドン最適化ｗｔまたは正常コード配列であり、ＲＮＡｉ剤はＡＴＸＮ３のコドン最適化ｗｔアレルではなく、変異体に特異的に関連する５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、および／またはコード配列標的配列を標的とする。
特定の態様では、第一の制御要素および／または第二の制御要素がニューロン特異的プロモーターおよび／またはエンハンサー（シナプシンプロモーターなど）、または天然ＡＴＸＮ３プロモーター、またはユビキタスプロモーターを含む。
ある特定の態様ではＲＥＤがそれぞれＳＣＡ１、２、３、６、７、８、１０、１２、または１７であり、ＲＮＡｉ剤はアタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰのｗｔアレルではなく変異体に特異的に関連するＳＮＰを標的とする。
ある特定の態様ではＲＥＤがそれぞれ、アタキシン－１、アタキシン－２、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰのコドン最適化されたｗｔコード配列であり、それぞれ、５’－ＵＴＲおよび／または変異体アタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰのものとは異なる３’－ＵＴＲを有し、ＲＮＡｉ剤は５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、および／または変異体と特異的に関連するコード配列標的配列を標的とするが、これに限定されない。アタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰのコドン最適化ｗｔアレル。
ある特定の態様ではＲＥＤが（５０超の）ＣＴＧトリヌクレオチド反復を有する変異ＤＭＰＫ遺伝子から生じる筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）であり、ＲＮＡｉ剤はＤＭＰＫのｗｔアレルではなく変異体に特異的に関連するＳＮＰを標的とする。
ある特定の態様ではＲＥＤが（５０超の）ＣＴＧトリヌクレオチド反復を有する変異ＤＭＰＫ遺伝子から生じる筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）であり、ここで、第一のＧＯＩは変異ＤＭＰＫの５’－ＵＴＲおよび／または変異ＤＭＰＫのそれとは異なる３’－ＵＴＲを有するＤＭＰＫのコドン最適化ｗｔまたは正常コード配列であり、ＲＮＡｉ剤はＤＭＰＫのコドン最適化ｗｔアレルではなく、変異体に特異的に関連する５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、および／またはコード配列標的配列を標的とする。
特定の態様では、第一の制御要素および／または第二の制御要素が筋特異的プロモーターおよび／またはエンハンサー（ＣＫ８プロモーターなど）、または天然ＤＭＰＫプロモーター、またはユビキタスプロモーターを含む。
ある特定の態様では、第一のＧＯＩがｗｔまたはコドン最適化ＭＢＮＬ１遺伝子をコードし、第二のＧＯＩは５０個を超えるＣＴＧトリヌクレオチド反復を有することから生じる筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を欠損するＤＭＰＫ遺伝子の変異アレルを標的とするＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）をコードする。
ある特定の態様ではＲＥＤが（５５超の）ＣＧＧトリヌクレオチド反復を有する変異体ＦＭＲ１遺伝子から生じる脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）であり、ＲＮＡｉ剤はＦＭＲ１のｗｔアレルではなく変異体に特異的に関連するＳＮＰを標的とする。
ある特定の態様ではＲＥＤが（５５超の）ＣＧＧトリヌクレオチド反復を有する変異体ＦＭＲ１遺伝子から生じる脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）であり、ここで、最初のＧＯＩは変異体ＦＭＲ１の５’－ＵＴＲおよび／または変異体ＦＭＲ１のそれとは異なる３’－ＵＴＲを有するＦＭＲ１のコドン最適化ｗｔまたは正常コード配列であり、ＲＮＡｉ剤はＦＭＲ１のコドン最適化ｗｔアレルではなく、変異体に特異的に関連する５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、および／またはコード配列標的配列を標的とする。
特定の態様では、第一の制御要素および／または第二の制御要素がニューロン特異的プロモーターおよび／またはエンハンサー（シナプシンプロモーターなど）、または天然ＦＭＲ１プロモーターを含む。
特定の態様では、第一のＧＯＩが筋肉特異的プロモーター（ＣＫ８プロモーターなど）の制御下で機能的ジストロフィンタンパク質（マイクロＤ５など）をコードする。
いくつかの関連態様において、組換えＡＶ（ｒＡＶ）ベクトルにおいて、ポリ核酸はａ）機能的な５スペクトリンに似たリピートジストリンジストリプロフィンたんぱく質を包含するジストリンミニ遺伝子である（例えば、マイクロＤ５；本文中に記載されている１０，４７９，８２１米ドルに記述されているように、本文中で引用文献）また、ｂ）筋特殊制御要素はジストロフィンミニ遺伝子の表現とうまく結びついており、かつ、推進力となるＣＫプロモーターである。
ある特定の態様では、第二のＧＯＩがジストロフィンのエクソン４５～５５、またはジストロフィンのエクソン４４、４５、５１、および／または５３のいずれか１つなどの、欠陥ジストロフィンのエクソンのスキッピングを誘導するエクソンスキッピングアンチセンス配列を含む。
特定の態様において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－２９ｃ、ｍｉＲ－３０ｃおよび／またはｍｉＲ－２０６である。例えば、マイクロＲＮＡは任意に、標的配列のために設計されたｍｉＲ－２９ｃのガイド鎖のプロセシングを増強する修飾された隣接骨格配列を有するｍｉＲ－２９ｃであってもよい。特定の態様では、修飾隣接骨格配列がｍｉＲ－３０、－１０１、－１５５、または－４５１由来であるか、またはそれに基づく。
特定の態様では、宿主細胞におけるマイクロＲＮＡの発現が宿主細胞におけるマイクロＲＮＡの内因性発現と比較して、少なくとも約１．５～１００倍（例えば、約２～８０倍、約１．５～１０倍、約１５～７０倍、約５０～７０倍、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または約８０倍）上方制御される。
ある特定の態様では、ＲＮＡｉ配列がサルコリピン（ｓｈＳＬＮ）に対するｓｈＲＮＡである。
特定の態様では、１つまたは複数のコード配列がサルコリピン（ｓｈＳＬＮ）に対する１つまたは複数の同一または異なるｓｈＲＮＡをコードする。
特定の態様において、ｓｈＲＮＡは、カルコリピンｍＲＮＡおよび／またはサルコリピン蛋白質発現を少なくとも約５０％低下させる。
特定の態様では、ＧＯＩはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり、ガイド配列はｓｇＲＮＡであるか；またはＧＯＩはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａであり、ガイド配列はｃｒＲＮＡである。
特定の態様では、前記ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、前記アンチセンス配列、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍｉＲＮＡ、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ ｃｒＲＮＡおよび／または前記マイクロＲＮＡは、炎症性遺伝子、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化因子（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＮＦ－κＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ）、ＮＦ－κＢ、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ２）、ＴＧＦ－β、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、エラスチン、細胞外マトリックスの構造成分であるグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ミオスタチンなどの１つ以上の標的遺伝子の機能に拮抗する ホスホジエステラーゼ－５（ＰＥＤ－５）またはＡＣＥ、ＶＥＧＦデコイ受容体１型（ＶＥＧＦＲ－１またはＦｌｔ－１）、および造血プロスタグランジンＤシンターゼ（ＨＰＧＤＳ）などの、１以上の標的遺伝子の機能と拮抗する。
ある特定の態様では、異種イントロン配列は、配列番号１である。
ある特定の態様では、ベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３の組換えＡＡＶベクターである。
ある特定の態様ではベクター、例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターにおいて：ａ）ポリヌクレオチドは機能性フクチン（ＦＫＴＮ）タンパク質をコードし；および／またはｂ）福山先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）患者において、１つまたは複数のコード配列が、欠陥ＦＫＴＮ遺伝子における正しいエクソン１０スプライシングを回復させるエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。
特定の態様ではベクター、例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターにおいて：ａ）ポリヌクレオチドは機能性ＬＡＭＡ２タンパク質をコードする；および／またはｂ）メロシン欠損先天性筋ジストロフィー１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）患者において、１つまたは複数のコード配列が。欠損ＬＡＭＡ２遺伝子のＣ末端Ｇドメイン（エクソン４５～６４）、特にＧ４およびＧ５の発現を回復させるエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。
特定の態様ではベクター、例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターにおいて：ａ）ポリヌクレオチドは機能性ＤＭＰＫタンパク質、またはＣＬＣＮ１遺伝子をコードする；および／またはｂ）ＤＭ１患者において、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、欠損ＤＭＰＫ遺伝子における変異転写物の拡大反復を標的とするか、またはＣＬＣＮ１遺伝子におけるエクソン７Ａのスキッピングをもたらすエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。
ある特定の態様ではベクター、例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターにおいて：ａ）ポリヌクレオチドは、機能性ＤＹＳＦタンパク質をコードする；および／またはｂ）ジスフェルリノパシー（ＬＧＭＤ２ｂまたはＭＭ）患者において、１以上のコード配列は、欠陥ＤＹＳＦ遺伝子におけるエクソン３２のスキッピングをもたらすエクソンスキッピングアンチセンス配列をコードする。
特定の態様において、ベクター、例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターにおいて：ａ）ポリ核酸ベクターは、機能的ＳＧＣＧたんぱく質をエンコードする；および／またはｂ）ＬＧＭＤ２Ｃ患者において、１つ以上のコード配列は、欠陥のあるＬＧＭＤ２Ｃ遺伝子（例えばΔ－５２１Ｔ ＳＧＣＧミューテーションを有するもの）におけるエクソン４－７のスキップにつながるエクソンススキッピングアンチセンス配列をコードする。
特定の態様では、１つまたは複数のコード配列がイントロン配列にさらに挿入される。
特定の態様では、機能的タンパク質の発現は前記１つ以上のコード配列の挿入によって負の影響を受けない。
ある特定の態様では、ベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３のベクターである。特定の態様では、ベクターが既知の血清型の誘導体である。特定の態様では、誘導体が所望の組織特異性または指向性、所望の免疫原性プロファイル（例えば、対象患者の免疫系による攻撃を受けない）、または様々な適応症のための薬学的組成物もしくは遺伝子治療のための他の所望の特性を示し得る。
特定の態様では、第一の制御要素（または分岐カセット中のプロモーター）は、１つまたは複数のコードＧＯＩ配列を組織特異的な様式で転写するプロモーターまたはプロモーターの一部である。特定の態様では、組織特異的制御要素が筋肉特異的制御要素である。
特定の態様では、筋特異的制御要素は、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、切断型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格速筋収縮トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋収縮性心臓トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋収縮性トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント、またはグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）である。
特定の態様では、筋肉特異的制御要素は、ＷＯ２０１７／１８１０１５（参照により本明細書に組み込まれる）の配列番号１０または配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。
本発明の別の側面は、任意のベクター、例えば本発明の組換えウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物を提供する。
特定の態様では、組成物は、治療上適合する担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む医薬組成物である。
特定の態様では治療上許容される担体、希釈剤、または賦形剤は、ｐＨ６．０の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および１ｍＭ塩化マグネシウムを含む滅菌水溶液である。
特定の態様において、組成物は、少なくとも１．６×１０１３個のベクターゲノムを有する約１０ｍＬの水溶液の剤形である。
特定の態様では、組成物は、１ミリリットル当たり少なくとも２×１０１２個のベクターゲノムの効力を有する。
本発明の別の側面は対象組成物を産生する方法であって、ベクター、例えば、細胞中の組換えＡＡＶベクターを産生すること、およびベクターを得るために細胞を溶解することを含む方法を提供する。
ある特定の態様では、ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３ベクターである。
本発明の別の側面はそれを必要とする対象において筋ジストロフィーまたはジストロフィー症を治療する方法を提供し、この方法は対象に、治療有効量の組換えベクター、例えば、本発明の組換えＡＡＶベクター、または本発明の組成物のいずれか１つを投与することを含む。
特定の態様では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーである。
特定の態様では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）、ジスフェリノパシー、筋強直性ジストロフィー、およびメロシン欠損先天性筋ジストロフィー１Ａ型、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、または肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤＲ５またはＬＧＭＤ２Ｃ）である。
本発明の別の側面は、アルファ－１抗トリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）の治療を必要とする対象においてアルファ－１抗トリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）を治療する方法であって、治療有効量の本発明の組換えウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）、またはそのような組換えウイルスベクターを含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
本発明の別の側面は、脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）の治療を必要とする対象において脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）を治療する方法であって、治療有効量の本発明の組換えウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）、またはそのような組換えウイルスベクターを含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
本発明の別の側面は、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）の治療を必要とする対象において筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を治療する方法であって、治療有効量の本発明の組換えウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）、またはそのような組換えウイルスベクターを含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
本発明の別の側面は、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）の治療を必要とする対象において脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）を治療する方法であって、治療有効量の本発明の組換えウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）、またはそのような組換えウイルスベクターを含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
特定の態様では、組換えベクター、例えば、組換えＡＡＶベクターまたは組成物は筋肉内注射、静脈内注射、非経口投与または全身投与によって投与される。
本発明の別の側面は、対象におけるＤＭＤまたは関連／関連疾患などの疾患を予防または治療するためのキットを提供し、キットは１つまたは複数のベクター、例えば、本明細書に記載の組換えＡＡＶ、または本明細書に記載の組成物；使用説明書（書面、印刷、電子／光学記憶媒体、またはオンライン）；および／またはパッケージングを含む。特定の態様において、キットはまた、併用療法のための、疾患（例えば、ＤＭＤ）を処置するための公知の治療組成物を含む。
実施例または特許請求の範囲のみに記載されたものを含む、本明細書に記載された任意の１つの態様はそのような組み合わせが明示的に放棄されるかまたは不適切でない限り、本発明の任意の１つまたは複数の他の態様と組み合わせることができることを理解されたい。

Claims (46)

  1. 以下：
    ａ)作動可能に連結された第一の制御要素の制御下で第一の目的の遺伝子（第一のＧＯＩ）を発現するための第一の転写カセット；
    ｂ)作動可能に連結された第二の制御要素の制御下で第二の目的の遺伝子（第二のＧＯＩ）を発現するための第二の転写カセット；
    含む組換えウイルスベクターであって、
    ここにおいて、前記第一の転写カセットおよび前記第二の転写カセットは配列が重複せず、前記第一の制御要素および前記第二の制御要素はそれぞれ、第一のＧＯＩおよび第二のＧＯＩを、互いに離れて、反対方向に転写する、
    前記組換えウイルスベクター。
  2. 前記第一の目的の遺伝子が、疾患または状態に欠陥がある野生型または正常遺伝子（例えば、コドン最適化野生型または正常遺伝子）をコードし、前記第二の目的の遺伝子が、前記疾患または状態に欠陥がある前記遺伝子の産物を標的とするアンタゴニストをコードする、請求項１に記載の組換えウイルスベクター。
  3. 前記第一の目的の遺伝子が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３ａ～１３ｄ）をコードし、前記第二の目的の遺伝子が標的配列にそれぞれ特異的な１つまたは複数のガイドＲＮＡ(例えば、Ｃａｓ９のｓｇＲＮＡ、またはＣａｓ１２ａのｃｒＲＮＡ）をコードする、請求項１に記載の組換えウイルスベクター。
  4. 前記第一の目的の遺伝子および前記第二の目的の遺伝子が、疾患または状態の治療に有益な異なる経路で機能する産物をコードする、請求項１に記載の組換えウイルスベクター。
  5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクターであって、ここにおいて：
    ａ)前記第一のＧＯＩは、下流のタンパク質コード配列の発現を増強する異種イントロン配列、タンパク質コード配列の下流の３’－ＵＴＲコード領域、およびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ）を含み；
    ｂ)前記第二のＧＯＩは、タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、遺伝子編集酵素のためのガイド配列、マイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)、および／またはｍｉＲＮＡ阻害剤を独立してコードする１つ以上のコード配列を含み；そして
    ｃ)任意に、第一のＧＯＩの異種イントロン配列および／または３’－ＵＴＲコード領域に挿入された１つまたは複数のさらなるコード配列であって、タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス配列、遺伝子編集酵素のためのガイド配列、マイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)、および／またはｍｉＲＮＡ阻害剤を独立してコードする、１つまたは複数のさらなるコード配列、を含む、
    前記組換えウイルスベクター。
  6. 前記組換えウイルスベクターが、組換えＡＡＶ(アデノ随伴ウイルス）ベクターである、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
  7. 前記組換えウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
  8. 前記第一のＧＯＩおよび／または前記第二のＧＯＩの発現が、互いの存在下で実質的に影響を受けない、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
  9. 前記第一のＧＯＩが、ｗｔまたは正常なＳＥＲＰＩＮＡ１コード配列（例えば、コドン最適化ＳＥＲＰＩＮＡ１コード配列）であり、前記第二のＧＯＩが、ＳＥＲＰＩＮＡ１の変異対立遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）をコードする、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
  10. ＳＥＲＰＩＮＡ１の変異対立遺伝子が、ピッツバーグ対立遺伝子、Ｂ(Ａｌｈａｍｂｒａ)対立遺伝子、Ｍ(Ｍａｌｔｏｎ)対立遺伝子、S対立遺伝子、Ｍ(Ｈｅｅｒｌｅｎ)対立遺伝子、M(Mineral Springs)対立遺伝子、Ｍ（ｐｒｏｃｉｄａ）対立遺伝子、M（Ｎｉｃｈｉｎａｎ）対立遺伝子、I対立遺伝子、Ｐ(Ｌｏｗｅｌｌ)対立遺伝子、ヌル(Granite falls)対立遺伝子、ヌル（Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ）対立遺伝子、ヌル（Ｍａｔｔａｗａ）対立遺伝子、ヌル（ｐｒｏｃｉｄａ）対立遺伝子、ヌル(Hong Kong １）対立遺伝子、ヌル(Bolton)対立遺伝子、Pittsburgh対立遺伝子、Ｖ(Munich)対立遺伝子、Z（アウクスブルク）対立遺伝子、Ｗ(Ｂｅｔｈｅｓｄａ)対立遺伝子、ヌル（Ｄｅｖｏｎ）対立遺伝子、ヌル（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ）対立遺伝子、Ｚ(Ｗｒｅｘｈａｍ)対立遺伝子、ヌル(Hong Kong ２）対立遺伝子、ヌル（Ｒｉｅｄｅｎｂｕｒｇ）対立遺伝子、カルシェカー・ポーラー対立遺伝子、Ｐ(Ｄｕａｒｔｅ)対立遺伝子、ヌル （West）対立遺伝子、Ｓ(Ｉｉｙａｍａ)対立遺伝子、またはＺ(Ｂｒｉｓｔｏｌ)対立遺伝子である、請求項９に記載の組換えウイルスベクター。
  11. 前記第一のＧＯＩが、前記変異ＳＥＲＰＩＮＡ１とは異なる５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを有するＳＥＲＰＩＮＡ１のコドン最適化ｗｔまたは正常コード配列であり、前記ＲＮＡｉ剤が、５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、および／またはＳＥＲＰＩＮＡ１の変異対立遺伝子に特異的に関連するが、コドン最適化ｗｔ対立遺伝子には関連しないコード配列標的配列、を標的とする、請求項９または１０に記載の組換えウイルスベクター。
  12. 前記第一の制御要素および／または前記第二の制御要素が、肝臓特異的プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、ＡｐｏＥエンハンサーおよびα１－アンチトリプシンプロモーターを含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
  13. 前記第一のＧＯＩが、反復伸長障害（ＲＥＤ）に欠陥のある遺伝子のｗｔまたは正常なコード配列（例えば、ＲＥＤに欠陥のある遺伝子のコドン最適化ｗｔまたは正常なコード配列）であり、前記第二のＧＯＩが、前記ＲＥＤに欠陥のある遺伝子の変異対立遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）をコードする、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
  14. 前記ＲＥＤが、（５２超の)ＣＡＧトリヌクレオチド反復を有する変異ＡＴＸＮ３遺伝子から生じる脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）であり、ＲＮＡｉ剤が、ＡＴＸＮ３のｗｔ対立遺伝子ではなく変異対立遺伝子に特異的に関連するＳＮＰを標的とする、請求項１３に記載の組換えウイルスベクター。
  15. 前記ＲＥＤが、（５２超の)ＣＡＧトリヌクレオチド反復を有する変異ＡＴＸＮ３遺伝子から生じる脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）であり、
    ここにおいて、前記第一のＧＯＩが前記変異ＡＴＸＮ３のものとは異なる５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを有するＡＴＸＮ３のコドン最適化ｗｔコード配列であり、
    前記ＲＮＡｉ剤が、５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、および／または前記変異ＡＴＸＮ３の変異対立遺伝子と特異的に関連するが、コドン最適化ｗｔ対立遺伝子とは関連しないコード配列標的配列、を標的とする、
    請求項１３に記載の組換えウイルスベクター。
  16. 前記第一の制御要素および／または前記第二の制御要素が、ニューロン特異的プロモーターおよび／またはエンハンサー（シナプシンプロモーターなど）、または天然ＡＴＸＮ３プロモーターを含む、請求項１４または１５に記載の組換えウイルスベクター。
  17. 前記ＲＥＤが、それぞれＳＣＡ１、２、３、６、７、８、１０、１２、または１７であり、前記ＲＮＡｉ剤が、それぞれアタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰの変異体と特異的に関連するが、ｗｔ対立遺伝子とは関連しないＳＮＰ、を標的とする、請求項１３に記載の組換えウイルスベクター。
  18. 前記ＲＥＤが、それぞれＳＣＡ１、２、３、６、７、８、１０、１２、または１７であり、
    ここにおいて、前記第一のＧＯＩが、それぞれ、アタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰのコドン最適化ｗｔ配列または正常コード配列であり、前記アタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰの変異体とは異なる５’－ＵＴＲ及び／又は３’－ＵＴＲをそれぞれ有し、
    ここにおいて、前記ＲＮＡｉ剤が、５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、および／またはアタキシン－１、アタキシン－２、アタキシン－３、ＣＡＣＮＡ１、アタキシン－７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、またはＴＢＰの前記変異体と特異的に関連するが、コドン最適化ｗｔ対立遺伝子とは関連しないコード配列標的配列、を標的とする、
    請求項１３に記載の組換えウイルスベクター。
  19. 前記ＲＥＤが、（５０超の)ＣＴＧトリヌクレオチド反復を有する変異ＤＭＰＫ遺伝子から生じる筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）であり、前記ＲＮＡｉ剤が、ＤＭＰＫのｗｔ対立遺伝子ではなく変異体に特異的に関連するＳＮＰを標的とする、請求項１３に記載の組換えウイルスベクター。
  20. 前記ＲＥＤが、（５０超の)ＣＴＧトリヌクレオチド反復を有する変異ＤＭＰＫ遺伝子から生じる筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）であり、
    ここにおいて、前記第一のＧＯＩが、前記変異ＤＭＰＫの５’－ＵＴＲおよび／または前記変異ＤＭＰＫのそれとは異なる３’－ＵＴＲを有するＤＭＰＫのコドン最適化されたｗｔまたは正常なコード配列であり、
    前記ＲＮＡｉ剤が、前記変異ＤＭＰＫのコドン最適化されたｗｔ対立遺伝子ではなく、前記変異ＤＭＰＫに特異的に関連する５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、および／またはコード配列標的配列、を標的とする、
    請求項１３に記載の組換えウイルスベクター。
  21. 前記第一の制御要素および／または前記第二の制御要素が、筋特異的プロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、ＣＫ８プロモーター）、または天然ＤＭＰＫプロモーター、またはユビキタスプロモーターを含む、請求項１９または２０に記載の組換えウイルスベクター。
  22. 前記第一のＧＯＩが、ｗｔまたはコドン最適化ＭＢＮＬ１遺伝子をコードし、前記第二のＧＯＩが、５０個を超えるＣＴＧトリヌクレオチド反復を有することから生じる筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を欠損する前記ＤＭＰＫ遺伝子の変異対立遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）をコードする、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
  23. 前記ＲＥＤが、（５５超の)ＣＧＧトリヌクレオチド反復を有する変異体ＦＭＲ１遺伝子から生じる脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）であり、前記ＲＮＡｉ剤が、前記変異体に特異的に関連するが、ＦＭＲ１のｗｔ対立遺伝子には関連しないＳＮＰを標的とする、請求項１３に記載の組換えウイルスベクター。
  24. 前記ＲＥＤが、（５５超の)ＣＧＧトリヌクレオチド反復を有する変異体ＦＭＲ１遺伝子から生じる脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）であり、ここにおいて、前記第一のＧＯＩが、前記変異体ＦＭＲ１の５’－ＵＴＲおよび／または前記変異体ＦＭＲ１のそれとは異なる３’－ＵＴＲを有するＦＭＲ１のコドン最適化ｗｔまたは正常コード配列であり、
    前記ＲＮＡｉ剤が、ＦＭＲ１のコドン最適化ｗｔ対立遺伝子ではなく、前記変異体に特異的に関連する５’－ＵＴＲ標的配列、３’－ＵＴＲ標的配列、および／またはコード配列標的配列、を標的とする、
    請求項１３に記載の組換えウイルスベクター。
  25. 前記第一の制御要素および／または前記第二の制御要素が、ニューロン特異的プロモーターおよび／またはエンハンサー（シナプシンプロモーターなど）、または天然ＦＭＲ１プロモーターを含む、請求項２３または２４に記載の組換えウイルスベクター。
  26. 前記第一のＧＯＩが、筋肉特異的プロモーター（例えば、ＣＫ８プロモーター）の制御下の機能的ジストロフィンタンパク質（例えば、ｍｉｃｒｏＤ５）をコードする、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
  27. 前記第二のＧＯＩが、ジストロフィンのエクソン４５～５５、またはジストロフィンのエクソン４４、４５、５１、および／または５３のいずれか１つなどの、欠陥ジストロフィンのエクソンのスキッピングを誘導するエクソンスキッピングアンチセンス配列を含む、１つ以上のコード配列をコードする、請求項２６に記載の組換えウイルスベクター。
  28. 前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－２９ｃ、ｍｉＲ－３０ｃおよび／またはｍｉＲ－２０６である、請求項５－８のいずれか１つの組換えウイルスベクター。
  29. 前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ－２９ｃであり、任意に、標的配列のために設計されたｍｉＲ－２９ｃのガイド鎖のプロセシングを増強する、修飾された隣接骨格配列を有する、請求項２８に記載の組換えウイルスベクター。
  30. 前記修飾隣接骨格配列が、ｍｉＲ－３０、－１０１、－１５５、または－４５１由来であるか、またはそれに基づく、請求項２９に記載の組換えウイルスベクター。
  31. 前記ＲＮＡｉ配列が、サルコリピン（ｓｈＳＬＮ）に対するｓｈＲＮＡである、請求項５～８のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
  32. 前記ＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、前記アンチセンス配列、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡ、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ ｃｒＲＮＡおよび／または前記マイクロＲＮＡが、炎症性遺伝子、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化因子（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＮＦ－κＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ））、ＮＦ－κＢ、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ２）、ＴＧＦ－β、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、オラーゲン、エラスチン、細胞外マトリックス、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ミオスタチン、ホスホジエステラーゼ－５（ＰＥＤ－５）またはＡＣＥ、ＶＥＧＦデコイ受容体１型（ＶＥＧＦＲ－１またはＦｌｔ－１）、および 造血プロスタグランジンＤシンターゼ（ＨＰＧＤＳ）などの、１つ以上の標的遺伝子に拮抗する、請求項５～８のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
  33. 前記異種イントロン配列が配列番号１である、請求項５～８のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
  34. 前記ベクターが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ １１、ＡＡＶ １２、またはＡＡＶ １３の組換えＡＡＶベクターである、請求項１～３３のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター。
  35. 請求項１～３４のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクターを含む、組成物。
  36. 治療上適合性のある担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む、医薬組成物である、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記治療上許容される担体、希釈剤、または賦形剤が、ｐＨ６．０の１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および１ｍＭ塩化マグネシウムを含む滅菌水溶液である、請求項３６に記載の組成物。
  38. 少なくとも１．６×１０１３個のベクターゲノムを有する約１０ｍＬの水溶液の剤形である、請求項３６または３７に記載の組成物。
  39. 少なくとも２×１０１２個のベクターゲノム／ミリリットルの効力を有する、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 細胞中で組換えウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）を産生し、そして、およびベクターを得るために細胞を溶解する、ことを含む、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の組成物を産生する方法。
  41. 前記ベクターが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ １１、ＡＡＶ １２、またはＡＡＶ １３の組換えＡＡＶベクターである、請求項４０に記載の方法。
  42. アルファ－１抗トリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）の治療を必要とする対象においてアルファ－１抗トリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）を治療する方法であって、治療有効量の請求項９～１２のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）、または組換えウイルスベクターを含む組成物を対象に投与することを含む、方法。
  43. 脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）の治療を必要とする対象において脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）を治療する方法であって、治療有効量の請求項１４～１６のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）、または組換えウイルスベクターを含む組成物を対象に投与することを含む、方法。
  44. 筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）の治療を必要とする対象において筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を治療する方法であって、治療有効量の請求項１９～２２のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）、または組換えウイルスベクターを含む組成物を対象に投与することを含む、方法。
  45. 脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）の治療を必要とする対象において脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）を治療する方法であって、治療有効量の請求項２３～２５のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター（例えば、組換えＡＡＶベクター）、または組換えウイルスベクターを含む組成物を対象に投与することを含む、方法。
  46. 前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が、筋肉内注射、静脈内注射、非経口投与または全身投与によって投与される、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
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