CN117957326A - 调控核酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及调控核酸序列，特别是肌肉特异性启动子、其元件和其他此类核酸序列，它们能够增强基因的肌肉特异性表达。本发明还涉及包含这种肌肉特异性调控核酸序列的表达构建体、载体和细胞，以及它们的使用方法。调控核酸序列对基因治疗应用特别有用，但也可用于其他领域，如生物加工和生物技术。

Description

调控核酸序列

技术领域

本发明涉及调控核酸序列，特别是肌肉特异性合成启动子、其元件和其他此类核酸序列，它们能够增强基因的肌肉特异性表达。本发明还涉及包含这种肌肉特异性调控核酸序列的表达构建体、载体和细胞，以及它们的使用方法。调控核酸序列对基因疗法应用特别有用，但也可用于其他领域，如生物加工和生物技术。

背景技术

提供以下讨论是为了帮助读者理解本公开，并不构成对现有技术的内容或相关性的任何承认。

在包括基因疗法在内的许多领域中，需要提供能够驱动基因表达以在所需细胞、组织或器官中产生蛋白或核酸表达产物的调控核酸序列。

肌肉中治疗性基因的表达对基因疗法具有吸引力。肌肉中的基因疗法有可能纠正或增加各种肌肉蛋白的表达，如抗肌萎缩蛋白和肌聚糖蛋白。这可用于治疗诸如肌营养不良等病况，如杜氏肌营养不良(DMD)。肌肉也可以用作表达治疗性蛋白质的平台，用于治疗其他病况如充血性心力衰竭。

各种载体已被用于向肌肉细胞递送基因，例如腺病毒、逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒(AAV)，以及非病毒载体如质粒。腺病毒载体具有相对较大的克隆能力，可以有效地转导一些细胞。然而，鉴于它们往往会引发强烈的免疫反应，它们面临着重大挑战。逆转录病毒和慢病毒载体稳定地整合到基因组中，这既有好处也有坏处。慢病毒载体可以转导分裂细胞和非分裂细胞，但大多数常规逆转录病毒载体只能转导分裂细胞，这限制了它们在非分裂肌肉细胞中的应用。质粒DNA可用于在体外将基因转移到肌肉细胞中，但它们在临床背景中的潜在用途尚不清楚。AAV载体对于肌肉中的基因疗法应用特别有吸引力。AAV载体显示出对肌肉细胞的天然嗜性，可以驱动治疗性有效负载(payload)的长期表达，并引发最小的免疫反应。尽管一些基因治疗载体能够优先转导肌肉细胞，但确实会发生脱靶转导。已经报道了使用AAV血清型1、2和嵌合型2.5治疗杜氏肌营养不良(DMD)和α-1抗胰蛋白酶缺乏症的几项1期和2期临床试验(D.E.Bowles,S.WJ McPhee,C.Li,S.J.Gray,J.J.Samulski,A.S.Camp,J.Li,B.Wang,P.E.Monahan,J.E.Rabinowitz,J.C.Grieger,La.Govindasamy,M.Agbandje-McKenna,X.Xiao and R.J.Samulski,Phase 1gene therapy for DuchenneMuscular Dystrophy using a translational optimised AAV vector.MolecularTherapy,20,443-455(2012)；M.L.Brantly,J.D.Chulay,L.Wang,C.Mueller,M.Humphries,L.T.Spencer,F.Rouhani,T.J.Conlon,R.Calcedo,M.R.Berts,C.Spencer,B.J.Byrne,J.M.Wilson,T.R.Flotte,Sustained transgene expression despite T lymphocyteresponses in a clinical trial of rAAVl-AAT gene therapy.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 106,16363-16368(2009)；T.R.Flotte,M.L.Brantly,L.T.Spencer,B.J.Byrne,C.T.Spencer,D.J.Baker,M.Humphries,15Phase I trial of intramuscular injection of a recombinantadeno-associated virus alpha 1-antitrypsin(rAAV2-CB-hAAT)gene vector to AAT-deficient adults.Human gene therapy 15,93-128(2004)；T.R.Flotte,B.C.Trapnell,M.Humphries,B.Carey,R.Calcedo,F.Rouhani,M.Campbell-Thompson,A.T.Yachnis,R.A.Sandhaus,N.G.McElvaney,C.Mueller,L.M.Messina,J.M.Wilson,M.Brantly,D.R.Knop,G.J.Ye,J.D.Chulay,Phase 2clinical trial of a recombinant adeno-associated viral vector expressing alphal-antitrypsin:interim results.Humangene therapy 22,1239-1247(2011)；C.Mueller,J.D.Chulay,B.C.Trapnell,M.Humphries,B.Carey,R.A.Sandhaus,N.G.McElvaney,L.Messina,Q.Tang,F.N.Rouhani,M.Campbell-Thompson,A.D.Fu,A.Yachnis,D.R.Knop,G.J.Ye,M.Brantly,R.Calcedo,S.Somanathan,L.P.Richman,R.H.Vonderheide,M.A.Hulme,T.M.Brusko,J.M.Wilson,T.R.Flotte,Human Treg responses allow sustained recombinant adeno-associatedvirus-mediated transgene expression.The Journal of clinical investigation123,5310-5318(2013))。

希望提供以肌肉特异性方式调节基因表达的系统。理想情况下，这种系统对肌肉具有高度特异性(从而避免或最小化非靶组织中的脱靶表达)，并且功能强大，即它们在肌肉中驱动高表达水平。此外，可能需要提供以主要骨骼肌特异性方式或主要心肌特异性方式调节基因表达的系统。这种系统可以整合到用于所需基因的特异性表达的表达构建体和载体中，用于治疗骨骼肌或心肌疾病或病症。已经提出使用顺式作用调控元件来提供特异性和活性。通常，这涉及顺式调控增强子序列，即以顺式作用增加启动子活性的核酸序列。

本领域已知多种肌肉特异性启动子，通常从主要在肌肉中表达的基因中获得，例如编码结蛋白(desmin)、骨骼肌动蛋白、心脏α-肌动蛋白、肌肉肌酸激酶(CKM)、肌球蛋白重链和轻链以及肌钙蛋白T/I的基因。C5-12启动子代表一种已知的合成启动子。

短长度的调控序列对于最小化基因治疗载体被调控序列占据的比例是特别理想的；这对于容量(有效负载)有限的基因治疗载体如AAV载体尤其重要。此外，尽管希望提供功能强大的启动子，但在许多情况下，技术人员可能希望能够选择具有所需功能的合适启动子，例如从一系列不同功能的启动子中选择。

本领域仍然需要能够驱动肌肉特异性基因表达的调控核酸。具体来说，需要短尺寸的肌肉特异性调控序列(例如启动子、顺式调控模块、顺式调控元件和最小或近端启动子元件)，其可被整合至用于所需基因(例如基因疗法背景中的治疗性转基因)的肌肉特异性表达的表达构建体和载体中。此外，需要主要在骨骼肌或心肌中有活性的短长度的肌肉特异性调控序列，其可被整合至用于所需基因的骨骼肌特异性表达或心肌特异性表达的表达构建体和载体中。

发明内容

在本发明的第一方面，提供了：

a)合成的肌肉特异性启动子，其包含根据SEQ ID NO:1-29、66中任一项的序列或其功能性变体或由其组成；或者

b)合成的肌肉特异性启动子，其包含顺式调控模块(CRM)或由其组成，所述顺式调控模块包含根据SEQ ID NO:30-47中任一项的序列或其功能性变体。

在一些实施方案中，合成的肌肉特异性启动子包含与SEQ ID NO:1-29、66中任一项至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。

在一些实施方案中，合成的肌肉特异性CRM包含与SEQ ID NO:30-47中任一项至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，根据本发明的合成肌肉特异性顺式调控模块(CRM)包含两个或多个可操作地连接的选自由以下组成的组的顺式调控元件(CRE)：

-CRE0119(SEQ ID NO:48)或其功能性变体；

-CRE0127(SEQ ID NO:49)或其功能性变体；

-CRE0137(SEQ ID NO:50)或其功能性变体；

-CRE0138(SEQ ID NO:51)或其功能性变体；

-CRE0139(SEQ ID NO:52)或其功能性变体；

-CRE0143(SEQ ID NO:53)或其功能性变体；

-CRE0145(SEQ ID NO:54)或其功能性变体；

-CRE0077(SEQ ID NO:55)或其功能性变体；

-DES_MT_增强子_48bp(SEQ ID NO:56)或其功能性变体；

-CRE0075(SEQ ID NO:57)或其功能性变体；

-CRE0083(SEQ ID NO:58)或其功能性变体；

-Ch2EnhMYL1_3_v1(SEQ ID NO:59)或其功能性变体；

-CRE0050(SEQ ID NO:60)或其功能性变体；

-CRE0031(SEQ ID NO:67)或其功能性变体；和

-CRE0069(SEQ ID NO:61)或其功能性变体。

在一些实施方案中，根据b)的合成的肌肉特异性启动子包含与启动子元件(通常是最小或近端启动子)可操作地连接的上述CRM。近端启动子优选是肌肉特异性近端启动子。

在一些实施方案中，根据本发明的合成的肌肉特异性合成启动子包含至少一个选自由以下组成的组的顺式调控元件(CRE)：

-CRE0119(SEQ ID NO:48)或其功能性变体；

-CRE0127(SEQ ID NO:49)或其功能性变体；

-CRE0137(SEQ ID NO:50)或其功能性变体；

-CRE0138(SEQ ID NO:51)或其功能性变体；

-CRE0139(SEQ ID NO:52)或其功能性变体；

-CRE0143(SEQ ID NO:53)或其功能性变体；

-CRE0145(SEQ ID NO:54)或其功能性变体；

-CRE0077(SEQ ID NO:55)或其功能性变体；

-DES_MT_增强子_48bp(SEQ ID NO:56)或其功能性变体；

-CRE0075(SEQ ID NO:57)或其功能性变体；

-CRE0083(SEQ ID NO:58)或其功能性变体；

-Ch2EnhMYL1_3_v1(SEQ ID NO:59)或其功能性变体；

-CRE0050(SEQ ID NO:60)或其功能性变体；

-CRE0031(SEQ ID NO:67)或其功能性变体；和

-CRE0069(SEQ ID NO:61)或其功能性变体

可操作地连接到至少一个选自由以下组成的组的启动子元件上：

-BG_mp(SEQ ID NO:62)或其功能性变体；

-SCP1(SEQ ID NO:63)或其功能性变体；

-CRE0070(SEQ ID NO:64)或其功能性变体；

-CRE0037(SEQ ID NO:68)或其功能性变体；和

-CRE0053(SEQ ID NO:65)或其功能性变体。

因此，本发明提供了各种合成的肌肉特异性启动子及其功能性变体。通常优选地，根据本发明的合成启动子是SEQ ID NO:1-29、66中任一项的变体，保留了参考启动子的至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的活性。合适地，所述活性使用本文所述的实施例之一进行评估，但也可以使用其他方法。

在本发明的另一方面，提供了一种肌肉特异性顺式调控元件(CRE)，其包含根据SEQ ID NO:48-61、67中任一项的序列或其任何功能性变体或由其组成。在一些实施方案中，肌肉特异性CRE包含与SEQ ID NO:48-61或67中任一项至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或其中的任何点。

通常优选地，根据本发明的肌肉特异性CRE是SEQ ID NO:48-61或67中任一项的变体，保留了参考CRE的至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的活性。合适地，所述活性使用本文所述的实施例之一进行评估，但也可以使用其他方法。

在本发明的另一方面，提供了一种包含本发明任何方面的CRE的合成启动子。

在本发明的另一方面，提供了一种CRM，其包含根据SEQ ID NO:30-47中任一项的序列或其功能性变体或由其组成。在一些实施方案中，肌肉特异性CRM包含与SEQ ID NO:30-47中任一项至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或其中的任何点。

在一些实施方案中，CRM包含两个或多个可操作地连接的选自由以下组成的组的顺式调控元件(CRE)：

-CRE0119(SEQ ID NO:48)或其功能性变体；

-CRE0127(SEQ ID NO:49)或其功能性变体；

-CRE0137(SEQ ID NO:50)或其功能性变体；

-CRE0138(SEQ ID NO:51)或其功能性变体；

-CRE0139(SEQ ID NO:52)或其功能性变体；

-CRE0143(SEQ ID NO:53)或其功能性变体；

-CRE0145(SEQ ID NO:54)或其功能性变体；

-CRE0077(SEQ ID NO:55)或其功能性变体；

-DES_MT_增强子_48bp(SEQ ID NO:56)或其功能性变体；

-CRE0075(SEQ ID NO:57)或其功能性变体；

-CRE0083(SEQ ID NO:58)或其功能性变体；

-Ch2EnhMYL1_3_v1(SEQ ID NO:59)或其功能性变体；

-CRE0050(SEQ ID NO:60)或其功能性变体；

-CRE0031(SEQ ID NO:67)或其功能性变体；和

-CRE0069(SEQ ID NO:61)或其功能性变体。

在本发明的另一方面，提供了一种最小或近端启动子，其包含根据SEQ ID NO:62-65、68中任一项的序列或其功能性变体或由其组成。在本发明的另一方面，提供了一种包含所述最小或近端启动子的合成启动子，合适地包含所述最小或近端启动子的合成肌肉特异性启动子。合适地，功能性变体包含与SEQ ID NO:62-65或68至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。如上所述，“启动子元件”可用于指最小或近端启动子。

本发明的CRE、CRM、最小/近端启动子和合成启动子可以在各种肌肉组织中(特别地但不限于在骨骼肌和/或心肌中)具有活性。在至少一种肌肉组织类型或至少一种肌肉细胞类型中有活性的CRE、CRM、启动子元件或合成启动子可被称为“肌肉特异性的”。为方便起见，肌肉特异性CRE、CRM、启动子元件或合成启动子可根据CRE、CRM、启动子元件或合成启动子是否主要在骨骼肌或心肌中具有活性而进一步细分为亚型。

在一些实施方案中，本发明的顺式调控元件、CRM、启动子元件和合成启动子是骨骼肌特异性的。主要在骨骼肌中有活性而在心肌中活性较低或无活性的顺式调控元件、CRM、启动子元件和合成启动子被称为“骨骼肌特异性的”。骨骼肌的非限制性实例是四头肌、隔膜、胫骨前肌和比目鱼肌。

在一些实施方案中，本发明的顺式调控元件、CRM、启动子元件和合成启动子是心肌特异性的。主要在心肌中有活性而在骨骼肌中活性较低或无活性的本发明的顺式调控元件、CRM、启动子元件和合成启动子被称为“心肌特异性的”。

在一些实施方案中，本发明的顺式调控元件、CRM、启动子元件和合成启动子是骨骼肌和心肌特异性的。

在一些实施方案中，骨骼肌特异性CRE、CRM、启动子元件和合成启动子可能是优选的。当骨骼肌中需要启动子活性而心脏中(心肌中)很少或没有活性时，这些CRE、CRM、启动子元件和合成启动子可能是优选的。设计成主要在骨骼肌中有活性的合成肌肉特异性启动子(骨骼肌特异性合成启动子)的实例包括SP0497、SP0498、SP0499、SP0500、SP0501、SP0502、SP0503、SP0504、SP0505、SP0506、SP0507、SP0508、SP0509、SP0510、SP0511、SP0512、SP0513、SP0514、SP0515、SP0516、SP0517、SP0518、SP0519、SP0520、SP0521、SP0522、SP4169、SP0523和SP0524。优选的合成骨骼肌特异性启动子的实例是SP0498、SP0500、SP0505、SP0508、SP0509、SP0513、SP0519、SP0522和SP0524。骨骼肌特异性启动子可能在快肌和/或慢肌中有活性。在一些实施方案中，在快肌中有活性的骨骼肌特异性CRE、CRM、启动子元件和合成启动子可能是优选的。在一些实施方案中，在慢肌中有活性的骨骼肌特异性CRE、CRM、启动子元件和合成启动子可能是优选的。在一些实施方案中，在慢肌和快肌中均有活性的骨骼肌特异性CRE、CRM、启动子元件和合成启动子可能是优选的。设计成在慢肌中有活性的骨骼肌特异性启动子的实例是SP0500、SP0501和SP0514。

骨骼肌特异性启动子可能主要在骨骼肌中有活性，而在心肌中活性较低。设计成主要在骨骼肌中有活性但预计在心肌中活性较低的合成肌肉特异性启动子的实例包括SP0497、SP0498、SP0499和SP0512。

骨骼肌特异性启动子可能主要在骨骼肌中有活性，而在心肌中也有活性。设计成主要在骨骼肌中有活性但预计在心肌中也有活性的合成肌肉特异性启动子的实例包括SP0502、SP0515、SP0521、SP4169、SP0522、SP0523和SP0524。

在一些实施方案，包含根据以下中任一项的序列或由其组成的合成肌肉特异性启动子是特别优选的：SEQ ID NO:1(SP0497)、SEQ ID NO:4(SP0500)、SEQ ID NO:5(SP0501)、SEQ ID NO:10(SP0506)、SEQ ID NO:12(SP0508)、SEQ ID NO:14(SP0510)、SEQ ID NO:18(SP0514)、SEQ ID NO:23(SP0519)、SEQ ID NO:24(SP0520)、SEQ ID NO:25(SP0521)和SEQID NO:26(SP4169)。在一些实施方案，包含根据以下中任一项的序列或由其组成的合成肌肉特异性启动子是特别优选的：SEQ ID NO:4(SP0500)、SEQ ID NO:14(SP0510)、SEQ IDNO:18(SP0514)和SEQ ID NO:23(SP0519)。在一些实施方案中，某些肌肉特异性启动子在某些肌肉(例如心肌、骨骼肌)中比在其他肌肉中表达更高，特别优选SEQ ID NO:18(SP0514)和SEQ ID NO:23(SP0519)。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:4(SP0500)或其功能性变体或由其组成的合成肌肉特异性启动子是特别优选的。SP0500主要在某些肌肉如心肌中有活性，在骨骼肌中观察到活性；与骨骼肌相比，SP0500在心肌中的表达更高，参见例如图5、6和12。因此，SP0500是一个强心肌特异性启动子，长度小于270个核苷酸。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:27(SP0522)或其功能性变体或由其组成的合成肌肉特异性启动子是特别优选的。SP0522主要在心肌中有活性，在骨骼肌中观察到活性；与骨骼肌相比，SP0522在心肌中的表达更高，参见例如图5、6和17。因此，SP0522是一个强心肌特异性启动子，长度小于240个核苷酸。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:29(SP0524)或其功能性变体或由其组成的合成肌肉特异性启动子是特别优选的。SP0524在心肌和骨骼肌中有活性；SP0524在心肌和骨骼肌中表现出相当的表达水平，参见例如图5、6和18。因此，SP0524是一个肌肉特异性启动子，长度小于250个核苷酸。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:22(SP0518)或其功能性变体或由其组成的合成肌肉特异性启动子是优选的。SP0518在骨骼肌中具有活性，在心肌中观察到活性。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:11(SP0507)或其功能性变体或由其组成的合成肌肉特异性启动子是优选的。SP0507在骨骼肌和心肌中具有活性。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:18(SP0514)或其功能性变体或由其组成的合成肌肉特异性启动子是优选的。SP0514在心肌中有活性，在骨骼肌中观察到活性；与骨骼肌相比，SP0514在心肌中的表达更高，参见例如图5、6和14。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:23(SP0519)或其功能性变体或由其组成的合成肌肉特异性启动子是优选的。SP0519在骨骼肌中有活性，在心肌中观察到活性；与心肌相比，SP0519在一些骨骼肌类型中的表达增加，参见例如图5、6和16。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:4(SP0500)或SEQ ID NO:27(SP0522)或其功能性变体或由其组成的合成肌肉特异性启动子是特别优选的。SP0500和SP0522主要在心肌中有活性，在骨骼肌中也有活性。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:4(SP0500)、SEQ ID NO:27(SP0522)和SEQ IDNO:29(SP0524)或其功能性变体或由其组成的合成肌肉特异性启动子是特别优选的。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:4(SP0500)、SEQ ID NO:27(SP0522)、SEQ IDNO:22(SP0518)和SEQ ID NO:29(SP0524)或其功能性变体或由其组成的合成肌肉特异性启动子是特别优选的。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:4(SP0500)、SEQ ID NO:27(SP0522)、SEQ IDNO:22(SP0518)、SEQ ID NO:29(SP0524)、SEQ ID NO:11(SP0507)、SEQ ID NO:18(SP0514)和SEQ ID NO:23(SP0519)或其功能性变体或由其组成的合成肌肉特异性启动子是特别优选的。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:66(SP0321)或其功能性变体或由其组成的合成肌肉特异性启动子可能是特别优选的。预计SP0321在肌肉中有活性。预计SP0321在肺中也有活性。因此，预计SP0321成为肌肉特异性和肺特异性启动子。

在一些实施方案中，根据本发明的合成肌肉特异性合成启动子在膈膜中具有比CK8、CK7或CMV更高的活性。在一些实施方案中，根据本发明的合成肌肉特异性合成启动子在TA中具有比CK8、CK7或CMV更高的活性。在一些实施方案中，根据本发明的合成肌肉特异性合成启动子在心脏中具有比CK8、CK7或CMV更高的活性。在一些实施方案中，根据本发明的合成肌肉特异性合成启动子在四头肌中具有比CK8、CK7或CMV更高的活性。在一些实施方案中，根据本发明的合成肌肉特异性合成启动子在比目鱼肌中具有比CK8、CK7或CMV更高的活性。在一些实施方案中，根据本发明的合成肌肉特异性合成启动子在肝脏中具有比CK8、CK7或CMV更低的活性。在一些实施方案中，与对照如CK8、CK7或CMV相比，更高的活性为至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99％或更高，或至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更高。测试合成启动子活性的示例性方法可以参见实施例2和3。

在一些实施方案中，根据本发明的合成肌肉特异性启动子在其他组织或细胞中也具有活性。在一些实施方案中，根据本发明的合成肌肉特异性启动子在下列一种或多种组织或细胞中也具有活性：CNS、肝脏、肾脏、脾脏、肺和十二指肠。

在一些实施方案中，根据本发明的合成肌肉特异性启动子包含CRE或其功能性变体的组合之一，其与启动子元件或其功能性变体可操作地连接，如下表5所示。

在本文公开的CRE或其功能性变体的任何组合中，所述CRE可以以任何顺序存在。在一些优选的实施方案中，CRE以所述顺序存在(即，从上游到下游的顺序，参照它们相对于可操作地连接的启动子元件或基因的位置)。在本文公开的CRE或其功能性变体的任何组合中，一些或全部所述CRE可合适地在CRM中彼此相邻放置(即没有任何插入的CRE或其他调控元件)。CRE可以是连续的或非连续的(即它们可以彼此紧邻放置，或者它们可以被间隔区或其他序列分隔开)。在一些实施方案中，优选地，一些或全部CRE是连续的。在一些优选的实施方案中，CRE或其功能性变体以所述顺序提供并且彼此相邻。例如，合成的肌肉特异性CRM可以包含紧接在CRE0075上游的CRE0077等等。在一些实施方案中，启动子元件位于CRE的下游，通常与近端CRE相邻。启动子元件可以与相邻的CRE是连续的，或者可以被间隔区分隔开。

在本发明的另一方面，提供了一种表达盒，其包含本发明任何方面的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子，所述启动子与编码表达产物(合适地为基因，例如转基因)的序列可操作地连接。在一些实施方案中，表达产物是治疗性表达产物。

治疗性表达产物可以是用于治疗任何病况的治疗性表达产物，其中肌肉中的表达可能有用，例如用于治疗肌肉病况或治疗可能需要从肌肉中分泌治疗性表达产物的病况。治疗性表达产物可以是用于治疗心血管病况或心脏疾病和病症(如心力衰竭或CHF)的治疗性表达产物。治疗性表达产物可以是用于治疗骨骼肌病况、疾病或病症(如任何类型的肌营养不良)的治疗性表达产物。

编码治疗性表达产物的序列可以是一个或多个基因，其替代在常染色体、X-连锁或Y-连锁、显性或隐性疾病中受损或无功能的一个或多个基因的功能。编码治疗性表达产物的序列可以是编码在常染色体、X-连锁或Y-连锁、显性或隐性疾病中受损或无功能的蛋白质的替代野生型对应物的一个或多个基因。编码治疗性表达产物的序列可以是编码在常染色体隐性疾病中受损或无功能的蛋白质的替代野生型对应物的基因。

编码治疗性表达产物的序列可以是在人类基因组中发现的基因或合成基因。合适地，治疗性表达产物可以是在人类基因组中发现的基因。编码治疗性表达产物的序列可以是dysferlin基因(DYSF基因)，治疗性表达产物可以是dysferlin蛋白。DYSF基因中损害dysferlin蛋白功能的突变会导致dysferlin肌病(dysferlinopathy)。由DYSF基因中的突变引起的dysferlin肌病的实例包括Miyoshi肌病、2B型肢带型肌营养不良和远端肌病。表达盒包含本发明任何方面的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子，所述启动子与编码治疗性表达产物的序列可操作地连接，其中编码治疗性表达产物的序列是DYSF基因，可用于治疗dysferlin肌病，如Miyoshi肌病、2B型肢带型肌营养不良和远端肌病。

编码治疗性表达产物的序列可以是抗肌萎缩蛋白基因(DMD基因)，治疗性表达产物可以是抗肌萎缩蛋白。DMD基因中损害抗肌萎缩蛋白功能的突变导致贝克肌营养不良或杜氏肌营养不良，它们是以肌肉无力为特征的X连锁隐性肌营养不良病症。表达盒包含本发明任何方面的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子，所述启动子与编码治疗性表达产物的序列可操作地连接，其中编码治疗性表达产物的序列是DMD基因，可用于治疗贝克肌营养不良或杜氏肌营养不良。

DMD基因是人类中已知的最大基因(大约240万个碱基对)。因此，全长DMD基因太大，不能被包装到一些容量(有效负载)有限的病毒载体(如AAV载体)中。为了解决这个问题，人们使用了较短的DMD基因版本(称为微型抗肌萎缩蛋白)。尽管如此，即使是微型抗肌萎缩蛋白也相当大(例如3.5-4kb)，这仍然使AAV包装困难。因此，较短长度(例如长度小于400个核苷酸，长度小于350个核苷酸，优选长度小于300个核苷酸，更优选长度小于290个核苷酸，最优选长度小于280、270、260、250、240、230、220、210、200、150、100、75、70、68个核苷酸)的合成肌肉特异性启动子在表达盒中可能是特别优选的，其中编码治疗性表达产物的序列是DMD基因或DMD基因的微型版本(微型抗肌萎缩蛋白)。

在一些实施方案中，表达盒包含本发明任何方面的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子，其可操作地连接到较短版本的DMD基因(微型抗肌萎缩蛋白)。在一些实施方案中，表达盒包含根据SEQ ID NO:29(SP0524)或其功能性变体的合成肌肉特异性启动子，其可操作地连接到较短版本的DMD基因(微型抗肌萎缩蛋白)。

编码治疗性表达产物的序列可以是靶向并降低内源性DUX4基因表达的miRNA或snRNA。DUX4基因的功能获得突变导致DUX4转录因子的抑制作用丧失，进而导致有害的基因表达变化，引起面肩肱肌营养不良(FSHD)，这是一种以进行性肌肉损伤为特征的常染色体显性肌营养不良病症。表达盒包含本发明任何方面的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子，所述启动子与编码治疗性表达产物的序列可操作地连接，其中编码治疗性表达产物的序列是靶向并降低内源性DUX4基因表达的miRNA或snRNA，可用于治疗FSHD。

编码治疗性表达产物的序列可以是靶向并降低内源性强直性肌营养不良蛋白激酶(myotonin-protein kinase)基因(DMPK基因)表达的miRNA或snRNA。DMPK基因中的突变导致1型强直性肌营养不良(DM1)，这是一以肌肉功能受损为特征的常染色体显性肌营养不良病症。表达盒包含本发明任何方面的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子，所述启动子与编码治疗性表达产物的序列可操作地连接，其中编码治疗性表达产物的序列是靶向并降低内源性DMPK基因表达的miRNA或snRNA，可用于治疗DM1。在一些实施方案中，表达盒可包含一个或多个本发明任何方面的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子，其可操作地连接至靶向并降低内源性DMPK基因和野生型替代DMPK基因表达的miRNA或snRNA。在一些实施方案中，表达盒可包含一个或多个本发明任何方面的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子，其可操作地连接至靶向并降低内源性DMPK基因和野生型替代MBNL1基因表达的miRNA或snRNA。在一些实施方案中，表达盒可包含一个或多个本发明任何方面的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子，其可操作地连接至靶向并降低内源性DMPK基因、野生型替代DMPK基因和野生型替代MBNL1基因表达的miRNA或snRNA。

编码治疗性表达产物的序列可以是靶向并降低内源性细胞核酸结合蛋白基因(CNBP基因)表达的miRNA或snRNA。CNBP基因中的功能获得突变导致2型强直性肌营养不良(DM2)，这是一以肌肉功能受损为特征的常染色体显性肌营养不良病症。表达盒包含本发明任何方面的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子，所述启动子与编码治疗性表达产物的序列可操作地连接，其中编码治疗性表达产物的序列是靶向并降低内源性CNBP基因表达的miRNA或snRNA，可用于治疗DM2。

编码治疗性表达产物的序列可以是靶向并降低内源性聚腺苷酸结合蛋白2基因(PABPN1基因)表达的miRNA或snRNA。CNBP基因中的功能获得突变导致眼咽肌营养不良，这是一种常染色体显性或常染色体隐性肌营养不良病症。表达盒包含本发明任何方面的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子，所述启动子与编码治疗性表达产物的序列可操作地连接，其中编码治疗性表达产物的序列是靶向并降低内源性PABPN1基因表达的miRNA或snRNA，可用于治疗眼咽肌营养不良。在一些实施方案中，表达盒可包含一个或多个本发明任何方面的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子，其可操作地连接至靶向并降低内源性PABPN1基因和合成的替代PABN1基因表达的miRNA或snRNA。合适地，合成的替代已被修饰或密码子优化，从而不成为降低内源性PABPN1基因表达的miRNA或snRNA的靶标。

编码治疗性表达产物的序列可以是C1C-1离子通道基因(CLCN1基因)，治疗性表达产物可以是C1C-1离子通道。CLCN1基因中的突变导致先天性肌强直，这是一种影响骨骼肌的常染色体显性或常染色体隐性离子通道病。表达盒包含本发明任何方面的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子，所述启动子与编码治疗性表达产物的序列可操作地连接，其中编码治疗性表达产物的序列是CLCN1基因，可用于治疗先天性肌强直。

编码治疗性表达产物的序列可以是电压门控钠通道Na_v1.4基因(SCN4A基因)，治疗性表达产物可以是电压门控钠通道Na_v1.4。SCN4A基因中的突变导致先天性副肌强直、钾加重型肌强直、高钾性周期性麻痹和低钾性周期性麻痹。表达盒包含本发明任何方面的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子，所述启动子与编码治疗性表达产物的序列可操作地连接，其中编码治疗性表达产物的序列是SCN4A基因，可用于治疗先天性副肌强直、钾加重型肌强直、高钾性周期性麻痹和低钾性周期性麻痹。

编码治疗性表达产物的序列可以是SEPN1或RYR1基因。SEPN1或RYR1基因中的突变导致多轴空性/微轴空性(Multi/minicore)肌病。表达盒包含本发明任何方面的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子，所述启动子与编码治疗性表达产物的序列可操作地连接，其中编码治疗性表达产物的序列是SEPN1基因或RYR1基因，可用于治疗多轴空性/微轴空性肌病。

合适地，编码治疗性表达产物的序列可以是合成基因。合成基因可以是在人类基因组中发现的基因，该基因已经被缩短，例如被缩短以允许包装在AAV载体中。合成基因可以是在人类基因组中发现的基因，该基因已经被优化用于更快的翻译，例如优化的密码子或人工构建体。密码子优化为本领域技术人员所熟知，指调节同义密码子以适应宿主生物的密码子偏好性，从而改善基因表达并提高翻译效率。合成基因可以是在人类基因组中发现的基因，该基因已经被修饰，使得其表达蛋白具有特定的细胞内定位，例如已经被修饰以包括核定位信号的基因，使得具有该信号的蛋白通过核转运进入细胞核。合成基因可以是在人类基因组中发现的基因，该基因已经被修饰以使其更有效地分泌，例如已经被修饰以包括分泌信号的基因，使得具有该信号的蛋白被靶向转运穿过内质网膜并分泌到环境中。在一些实施方案中，合成基因可以是在人类基因组中发现的基因，该基因已经被修饰以使其表达产物的免疫原性较低，例如通过去除B细胞表位。合成基因可以是在人类基因组中发现的基因，该基因已经被修饰以使其功能增强或减弱。合成基因可以是在人类基因组中发现的基因，该基因已经被修饰以使其不被特定的miRNA或snRNA沉默。人类基因组中发现的任何基因都可以通过一种或多种上述修饰进行修饰，从而产生合成基因。在一些实施方案中，已被修饰的基因是本文任何方面中列出的任一种基因。

编码治疗性表达产物的序列可以是合成的dysferlin基因(DYSF基因)，治疗性表达产物可以是合成的dysferlin蛋白。编码治疗性表达产物的序列可以是合成的dysferlin基因(DYSF基因)，该基因已被缩短。编码治疗性表达产物的序列可以是合成的dysferlin基因(DYSF基因)，该基因已被缩短以允许包装在AAV载体中。编码治疗性表达产物的序列可以是合成的dysferlin基因(DYSF基因)，该基因已被缩短至小于6kb、小于5.5kb、小于5kb、小于4.5kb、小于4kb、小于3.5kb或小于3kb。编码治疗性表达产物的序列可以是合成的dysferlin样分子，其被缩短成可适应于单AAV载体包装。编码治疗性表达产物的序列可以是如(Llanga等人.,2017)的表1和图1A中详述的纳米-Dysferin。

在一些优选的实施方案中，表达盒包含根据本发明任何方面的肌肉特异性启动子，该启动子与纳米-Dysferin可操作地连接，该纳米-Dysferin如(Llanga等人,2017)的表1和图1A所详述。

治疗性表达产物可以是磷酸酶活性(例如1型磷酸酶活性)的调节剂。调节剂可以是抑制磷酸酶活性(例如1型磷酸酶活性)的蛋白质。调节剂可以是增加内源核酸表达的核酸，所述内源核酸编码抑制磷酸酶活性的蛋白质，如转录因子。调节剂可以是整合在编码抑制磷酸酶活性的蛋白质的内源核酸中或其附近的调控序列。调节剂可以是能提供基因表达的核酸调节剂的核酸，如siRNA。

治疗性表达产物可以是蛋白磷酸1(PP1)的抑制剂，例如I-1多肽。1型磷酸酶包括但不限于PP1cα、PP1cβ、PP1cδ和PP1cγ。磷酸酶抑制剂-1(或“I-1”)蛋白是1型磷酸酶的内源性抑制剂。增加I-1水平或活性可以恢复衰竭人类心肌细胞的β肾上腺素能反应性。合适地，I-1蛋白可以是组成型活性的，如I-1蛋白，其中苏氨酸35被谷氨酸代替，而不是被天冬氨酸代替。治疗性表达产物可以是选自下列的任何一种或多种抑制剂：磷酸酶抑制剂2(PP2)；冈田酸或caliculin；以及nippl，它是蛋白磷酸酶1的内源性核抑制剂。

治疗性表达产物可以是调节心脏活性的任何蛋白，如1型磷酸酶抑制剂，例如I-1或肌浆网Ca2+ATP酶(SERCA)，例如SERCA1(例如1a或1b)、SERCA2(例如2a或2b)或SERCA3。

治疗性表达产物可以是编码磷酸酶抑制剂-1蛋白突变形式的核酸序列，其中突变形式在野生型中PKC-α磷酸化位点处包含至少一个氨基酸，其中所述至少一个氨基酸在突变形式中是结构上未磷酸化的或模拟未磷酸化的状态。治疗性表达产物可以是腺苷酸环化酶6(AC6，也称为腺苷酸环化酶VI)、S100A1、β-肾上腺素能受体激酶-ct(βARKct)、肌/内质网(SR)Ca-ATP酶(SERCA2a)、IL-18、VEGF、VEGF激活剂、尿皮质素和B-细胞淋巴瘤2(Bcl2)相关anthanogene-3(BAG3)。

治疗性表达产物可以是细胞因子的抑制剂，如IL-18抑制剂。治疗性表达产物可编码β肾上腺素能信号传导蛋白(β-ASP)(包括β肾上腺素能受体(β-Ars)、G蛋白受体激酶抑制剂(GRK抑制剂)和腺苷酸环化酶(Acs))，以增强心脏功能。

治疗性表达产物可以是血管生成蛋白。血管生成蛋白促进血管的发育和分化。血管生成蛋白的实例包括成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员，如aFGF(FGF-1)、bFGF(FGF-2)、FGF-4(也称为“hst/KS3”)、FGF-5和FGF-6、血管内皮生长因子(VEGF)家族、血小板衍生生长因子(PDGF)家族、胰岛素样生长因子(IGF)家族等。

在另一方面，提供了一种载体，其包含根据本发明的合成肌肉特异性启动子、骨骼肌特异性启动子或表达盒。在一些实施方案中，载体是表达载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是基因治疗载体，合适地是AAV载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体。AAV载体尤其令人感兴趣。AAV载体可选自由AAV2、AAV6、AAV8、AAV9、BNP116、rh10、AAV2.5、AAV2i8、AAVDJ8和AAV2G9或其衍生物组成的组。已经注意到AAV血清型9(AAV9)在心肌和骨骼肌中实现了有效的转导，因此AAV9及其衍生物代表了合适的AAV载体的一个非限制性实例。在一些实施方案中，rAAV载体是AAV3b血清型，包括但不限于AAV3b265D病毒体、AAV3b265D549A病毒体、AAV3b549A病毒体、AAV3bQ263Y病毒体或AAV3bSASTG病毒体(即包含含有Q263A/T265突变的AAV3b衣壳的病毒体)。在一些实施方案中，病毒体可以是合理的单倍体，或嵌合体或任何突变体，如衣壳可以被定制用于在所需位置(例如心脏或骨骼肌)提高更新。其他衣壳可包括来自任何已知AAV血清型的衣壳，包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV10等。在一些优选的实施方案中，AAV载体是AAV2i8。在一些实施方案中，AAV载体是AAV9。

根据本发明的载体可以是AAV载体，其包含编码用于治疗肌营养不良的治疗性表达产物的核酸，其中该核酸与骨骼肌特异性启动子或肌肉特异性启动子可操作地连接。

根据本发明的载体可以是AAV载体，其包含编码用于治疗心力衰竭的治疗性表达产物的核酸，其中该核酸与肌肉特异性启动子可操作地连接，该肌肉特异性启动子可能是肌肉特异性启动子。

在另一方面，提供了一种病毒体(病毒颗粒)，其包含根据本发明的载体，合适地为病毒载体。在一些实施方案中，病毒体是AAV病毒体。合适的病毒体如上所述。

在另一方面，提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的合成肌肉特异性启动子、合成骨骼肌特异性启动子、表达盒、载体或病毒体。

在另一方面，提供了根据本发明的用于治疗(即预防或治疗医学病况或疾病)的合成肌肉特异性启动子、合成骨骼肌特异性启动子、表达盒、载体、病毒体或药物组合物。合适地，用于治疗有此需要的受试者。合适地，病况或疾病与异常基因表达有关，任选地与肌肉细胞(肌细胞)或组织中的异常基因表达有关。合适地，病况或疾病与骨骼肌或组织中的异常基因表达有关。合适地，病况或疾病与心肌细胞或心脏组织中的异常基因表达有关。合适地，提供了根据本发明的用于在骨骼肌和/或心肌中表达治疗性表达产物的合成肌肉特异性启动子、合成骨骼肌特异性启动子、表达盒、载体、病毒体或药物组合物。

在一个实施方案中，疾病可以是骨骼肌疾病或病症。在一个实施方案中，疾病可以是肌营养不良，如贝克肌营养不良、先天性肌营养不良、杜氏肌营养不良、远端肌营养不良、Emery-Dreifuss肌营养不良、面肩肱肌营养不良、肢带型肌营养不良、强直性肌营养不良1型、强直性肌营养不良2型或眼咽肌营养不良。在一个实施方案中，疾病可以是肌强直，如先天性肌强直、先天性副肌强直、钾加重型肌强直、高钾性周期性麻痹或低钾性周期性麻痹。在一个实施方案中，疾病可以是选自杆状体肌病、多轴空性/微轴空性肌病和中央核性肌病的先天性肌病。在一个实施方案中，疾病可选自线粒体肌病、周期性麻痹、炎症性肌病、代谢性肌病、布罗迪肌病(Brody myopathy)和遗传性包涵体肌病。合适地，该用途用于基因疗法，优选用于治疗涉及异常基因表达的疾病。合适地，基因疗法包括在肌肉细胞或组织中表达治疗性表达产物，合适地在骨骼肌细胞或骨骼组织和/或心肌细胞或心脏组织中表达。

在一个实施方案中，疾病可以是心血管病况或心脏疾病和病症。在一个实施方案中，疾病可以是心力衰竭，如充血性心力衰竭。在一个实施方案中，疾病可选自缺血、心律失常、心肌梗死(MI)、心脏收缩力异常、非缺血性心肌病、外周动脉闭塞性疾病和异常Ca²⁺代谢及其组合。在一些实施方案中，疾病选自由以下组成的组：充血性心力衰竭、心肌病、心肌梗死、组织缺血、心脏缺血、血管疾病、获得性心脏病、先天性心脏病、动脉粥样硬化、传导系统功能障碍、冠状动脉功能障碍、肺心病高血压。在一些实施方案中，疾病可选自充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、心肌梗死、心肌缺血、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、心律失常、丹农病(Danon disease)、肌营养不良、肌肉质量异常、肌肉退化、感染性心肌炎、药物或毒素引起的肌肉异常、过敏性心肌炎、自身免疫性心内膜炎和先天性心脏病。合适地，该用途用于基因疗法，优选用于治疗涉及异常基因表达的疾病。合适地，基因疗法包括在肌肉细胞或组织中表达治疗性表达产物，合适地在心肌细胞或心脏组织和/或合适地在骨骼肌细胞或骨骼组织中表达。

在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可用于治疗心肌病受试者，其中心肌病受试者患有心力衰竭。在这样的实施方案中，患有心力衰竭的受试者具有相当于纽约心脏协会(NYHA)分类系统中III级或以上的分类。在一些实施方案中，患有心力衰竭的受试者患有选自以下任何一种的心血管疾病或心脏疾病：左心室重构、外周动脉闭塞性疾病(PAOD)、扩张型心肌病(DCM)(包括特发性扩张型心肌病(IDCM))、冠状动脉疾病、缺血、心律失常、心肌梗死(MI)、心脏收缩力异常、急性(失代偿性)心力衰竭(AHF)、Ca2+代谢异常、心肌缺血、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、遗传性病症引起的心肌病、心律失常、丹农病、肌营养不良、肌肉质量异常、肌肉退化、感染性心肌炎、药物或毒素引起的肌肉异常、过敏性心肌炎、自身免疫性心内膜炎、先天性心脏病和肺心病高血压。

在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可用于治疗心肌病受试者，其中心肌病受试者患有非缺血性心力衰竭和/或非缺血性心肌病，包括但不限于，获得性心肌病、因感染或毒素等导致的获得性心肌病、或先天性心肌病或具有心脏表现的遗传病症。在一些实施方案中，患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传病症的受试者患有选自由以下组成的组的疾病或病症：致心律失常性右心室心肌病、心房粘液瘤、家族性、原发孔型房间隔缺损、静脉窦型房间隔缺损、巴特综合征(Barth syndrome)、肌营养不良、伯格病(Buergerdisease)、心脑肌病(Cardioencephalomyopathy)、染色体1p36缺失综合征、先天性全身型脂肪营养不良4型、先天性心脏阻滞、扩张型心肌病、杜氏肌营养不良(DMD)、法布里病(Fabry disease)、家族性心房颤动、家族性扩张型心肌病、家族性肥厚性心肌病、家族性进行性心脏传导缺陷、家族性胸主动脉瘤和主动脉夹层、纤维肌发育异常、弗里德赖希共济失调、戈谢病、糖原累积病(2、3或4型)、希氏束性心动过速、胡尔勒综合征(Hurlersyndrome)、左心发育不良综合征、婴儿组织细胞样心肌病、颅内动静脉畸形、异丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症、激肽释放酶高血压、川崎病、卡恩斯-赛尔综合征(Kearns-Sayresyndrome)、左心室致密化不全、肢带型肌营养不良(1B、2E、2F、2M、2C、2D型)、局限性系统性硬化症、长QT综合征1、淋巴水肿和脑动静脉异常、淋巴细胞性血管炎、小头畸形-心肌病；线粒体脑肌病伴乳酸酸中毒和卒中样发作、线粒体三功能蛋白缺陷、强直性肌营养不良1型、新生儿卒中、努南综合征1-、2-、3-、4-、5-和6、围生期心肌病、Peters plus综合征、PGM1-CDG、PHACE综合征、受磷蛋白Arg 14缺失、体位性心动过速综合征、原发性肉碱缺乏症、进行性家族性心脏阻滞(1A、1B和2型)、假性醛固酮减少症2型、肺动脉高压、室间隔完整型肺动脉闭锁、肺动脉闭锁合并室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、肺静脉狭窄、肺动脉口狭窄、去肾性高血压、视网膜大动脉瘤伴肺动脉瓣上狭窄、右心室发育不良、结节病、Sengers综合征、内脏逆位、突发性心律失常性猝死综合征、主动脉瓣上狭窄、Swyer综合征、TANGO2相关代谢性脑病和心律失常、TARP综合征、法洛四联症(Tetralogy of Fallot)、Timothy综合征、三尖瓣闭锁、Vici综合征、VLCAD缺陷和Williams综合征。

在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可用于治疗心肌病受试者，其中心肌病受试者患有缺血性心肌病。

合适地，需要治疗的受试者将表现出骨骼肌病况的特征性症状，例如上文讨论的肌营养不良。医疗用途通常包括通过表达治疗量的治疗性产物来改善有此需要的受试者表现出的症状。在一些实施方案中，表达盒包含编码dysferlin或合成的dysferlin的基因，该基因与骨骼肌特异性启动子或肌肉特异性启动子可操作地连接。该疗法合适地包含在所述受试者的骨骼肌组织中表达治疗量的dysferlin或合成的dysferlin。合适地，在骨骼肌组织中表达治疗量的dysferlin或合成的dysferlin可减轻受试者的dysferlin肌病症状。合适地，在骨骼肌组织中表达治疗量的dysferlin或合成的dysferlin可减轻骨骼肌的虚弱和消瘦。

合适地，需要治疗的受试者将表现出心血管病况的特征性症状，例如上文讨论的心脏疾病或心力衰竭。医疗用途通常包括通过表达治疗量的治疗性产物来改善有此需要的受试者表现出的症状。在一些实施方案中，表达盒包含编码PP1抑制剂的基因，该基因与肌肉特异性启动子可操作地连接。该疗法合适地包含在所述受试者的心脏组织中表达治疗量的PP1抑制剂。合适地，在心脏组织中表达治疗量的PP1抑制剂可减轻受试者心力衰竭或心脏病症的症状。合适地，在心脏组织中表达治疗量的PP1抑制剂可减轻心脏重塑、改善运动能力或改善心脏收缩力。合适地，在心脏组织中表达治疗量的PP1抑制剂可导致肌细胞缩短、舒张时间常数降低和加速钙信号衰减、改善收缩末期压力维度关系及其组合。

在另一方面，提供了一种细胞，其包含本发明的合成肌肉特异性启动子、合成骨骼肌特异性启动子、表达盒、载体或病毒体。在一些实施方案中，细胞是真核细胞，任选地是哺乳动物细胞，任选地是人类细胞。合适地，细胞可以是肌肉细胞，任选地，其中细胞是人类肌肉细胞。合适地，是人类骨骼肌细胞或人类心肌细胞。本发明的合成肌肉特异性启动子、合成骨骼肌特异性启动子、表达盒、载体或病毒体可以是游离基因的或位于细胞基因组中。

在另一方面，提供了如本文所述用于制造治疗医学病况或疾病的药物组合物的合成肌肉特异性CRE、CRM、合成肌肉特异性启动子、合成骨骼肌特异性启动子、表达盒、载体、病毒体或药物组合物。

在另一方面，提供了一种生产表达产物的方法，该方法包括在肌肉细胞中提供本发明的合成肌肉特异性或骨骼肌特异性表达盒，并表达表达盒中存在的基因。该方法可以是体外或离体的，或者可以是体内的。在一些实施方案中，该方法是生物加工方法。在一个实施方案中，肌肉细胞是骨骼肌细胞。在一个实施方案中，肌肉细胞是心肌细胞。

在另一方面，提供了一种在肌肉细胞中表达治疗性转基因的方法，该方法包括将本文所述的合成肌肉特异性或骨骼肌特异性表达盒、载体或病毒体引入肌肉细胞。在一个实施方案中，肌肉细胞是骨骼肌细胞。在一个实施方案中，肌肉细胞是心肌细胞。

在另一方面，提供了一种治疗有此需要的受试者(优选人类)的方法，该方法包括：

-向受试者施用本文所述的表达盒、载体、病毒体或药物组合物，其包含与根据本发明的启动子可操作地连接的编码治疗性产物的序列；和

-在所述受试者的肌肉中表达治疗量的治疗性产物。

治疗性产物是用于预防、缓解、治愈或积极改善生理过程或疾病的产物。

在一个实施方案中，肌肉是骨骼肌细胞或组织。在一个实施方案中，肌肉是心肌细胞或组织。合适地，治疗受试者的方法包括在骨骼肌和/或心肌中表达治疗量的治疗性产物。

在一些实施方案中，该方法包括：

-将本文所述的表达盒、载体、病毒体或药物组合物引入受试者的肌肉中，所述表达盒、载体、病毒体或药物组合物包含编码治疗性产物的基因；和

-在所述受试者的肌肉中表达治疗量的治疗性产物。

在一个实施方案中，肌肉是骨骼肌细胞或组织。在一个实施方案中，肌肉是心肌细胞或组织。合适地，该方法包括在所述受试者的骨骼肌和/或心肌中表达治疗量的治疗性产物。

合适地，该方法包括向受试者施用本文所述的载体、病毒体或药物组合物。在一些优选的实施方案中，载体是病毒基因治疗载体，优选AAV载体。

在一些实施方案中，治疗方法包括向受试者施用病毒载体，该病毒载体包含与根据本发明的启动子可操作地连接的编码治疗性产物的序列。在一些优选的实施方案中，通过顺行心外膜冠状动脉输注(AECAI)向受试者施用病毒载体。在一些特别优选的实施方案中，经由经皮股动脉途径通过顺行心外膜冠状动脉输注(AECAI)向受试者施用病毒基因治疗载体。在一些实施方案中，受试者患有心力衰竭或充血性心力衰竭。在一些实施方案中，受试者的治疗方法用于治疗心力衰竭或充血性心力衰竭。

现在将在以下章节描述本发明的进一步特征和实施方案。任何章节中的任何特征或实施方案可以以任何可行的组合与任何其他特征或实施方案或本发明的任何方面相结合。

在一些实施方案中，合成的肌肉特异性启动子包含两个或多个启动子元件。包含两个或多个启动子元件的合成启动子在本文中被称为“串联启动子”。CRE0138在本文中被命名为CRE，其包含TNNI2基因的转录起始位点，可以预计其功能类似于启动子元件。因此，例如，SP0508可以被认为是串联启动子，因为它包含启动子元件CRE0138和CRE0053。类似地，SP0519可以被认为是串联启动子，因为它包含启动子元件CRE0138和BG mp。

在一些实施方案中，串联启动子可以包含直接位于另一个启动子元件上游的启动子元件。在一些实施方案中，串联启动子可以在一个或每个启动子元件的上游包含一个或多个CRE。在一些实施方案中，串联启动子可以在启动子元件之间包含一个或多个CRE。在一些实施方案中，本文公开的任何一种合成肌肉特异性启动子可以与另一启动子元件可操作地连接。应当理解，本文公开的任何其他合成启动子可以进一步与本文公开的任何启动子元件可操作地连接。

附图说明

图1显示了根据本发明一些实施方案的合成肌肉特异性启动子在分化为心肌管的H9C2细胞系中的平均活性。误差条是标准偏差。CBA和CK8是对照启动子。y轴是荧光素酶活性(相对光单位)。

图2显示了根据本发明一些实施方案的合成肌肉特异性启动子在分化为心肌管的H9C2细胞系中的平均活性。误差条是标准偏差。CBA和CK8是对照启动子。平均活性已经相对于对照启动子CBA进行了标准化。y轴是荧光素酶活性(相对光单位)。

图3显示了膈膜中合成肌肉特异性启动子SP0500、SP0507、SP0514、SP0518、SP0519、SP0522和SP0524以及对照启动子CK8、CMV、CK7的体内活性。生理盐水对照(背景)也包括在实验中。从每个启动子的荧光素酶表达中减去生理盐水对照(背景)，然后将该值除以隔膜中每个启动子的载体拷贝数。

图4显示了胫骨前肌(TA)中合成肌肉特异性启动子SP0500、SP0507、SP0514、SP0518、SP0519、SP0522和SP0524以及对照启动子CK8、CMV、CK7的体内活性。生理盐水对照(背景)也包括在实验中。从每个启动子的荧光素酶表达中减去生理盐水对照(背景)，然后将该值除以隔膜中每个启动子的载体拷贝数。

图5显示了心脏中合成肌肉特异性启动子SP0500、SP0507、SP0514、SP0518、SP0519、SP0522和SP0524以及对照启动子CK8、CMV、CK7的体内活性。生理盐水对照(背景)也包括在实验中。从每个启动子的荧光素酶表达中减去生理盐水对照(背景)，然后将该值除以隔膜中每个启动子的载体拷贝数。

图6显示了四头肌中合成肌肉特异性启动子SP0500、SP0507、SP0514、SP0518、SP0519、SP0522和SP0524以及对照启动子CK8、CMV、CK7的体内活性。生理盐水对照(背景)也包括在实验中。从每个启动子的荧光素酶表达中减去生理盐水对照(背景)，然后将该值除以隔膜中每个启动子的载体拷贝数。

图7显示了比目鱼肌中合成肌肉特异性启动子SP0500、SP0507、SP0514、SP0518、SP0519、SP0522和SP0524、对照启动子CK8、CMV、CK7和生理盐水对照的体内活性。比目鱼肌中没有可用的载体拷贝数，因此该图显示了每个启动子的荧光素酶表达。

图8显示了肝脏中合成肌肉特异性启动子SP0500、SP0507、SP0514、SP0518、SP0519、SP0522和SP0524、对照启动子CK8、CMV、CK7的体内活性。从每个启动子的荧光素酶表达中减去生理盐水对照(背景)，然后将该值除以隔膜中每个启动子的载体拷贝数。

图9显示了对照启动子CK8在膈膜、胫骨前肌(TA)、四头肌、心脏和肝脏中的体内活性。

图10显示了对照启动子CMV在膈膜、胫骨前肌(TA)、四头肌、心脏和肝脏中的体内活性。

图11显示了对照启动子CK7在膈膜、胫骨前肌(TA)、四头肌、心脏和肝脏中的体内活性。

图12显示了合成肌肉特异性启动子SP0500在膈膜、胫骨前肌(TA)、四头肌、心脏和肝脏中的体内活性。

图13显示了合成肌肉特异性启动子SP0507在膈膜、胫骨前肌(TA)、四头肌、心脏和肝脏中的体内活性。

图14显示了合成肌肉特异性启动子SP0514在膈膜、胫骨前肌(TA)、四头肌、心脏和肝脏中的体内活性。

图15显示了合成肌肉特异性启动子SP0518在膈膜、胫骨前肌(TA)、四头肌、心脏和肝脏中的体内活性。

图16显示了合成肌肉特异性启动子SP0519在膈膜、胫骨前肌(TA)、四头肌、心脏和肝脏中的体内活性。

图17显示了合成肌肉特异性启动子SP0522在膈膜、胫骨前肌(TA)、四头肌、心脏和肝脏中的体内活性。

图18显示了合成肌肉特异性启动子SP0524在膈膜、胫骨前肌(TA)、四头肌、心脏和肝脏中的体内活性。

具体实施方式

CRE及其功能性变体

本文公开了可用于构建肌肉特异性启动子的各种CRE。这些CRE通常来源于基因组启动子和增强子序列，但它们在本文中的使用环境与其天然基因组环境完全不同。一般来说，CRE构成了大得多的基因组调控结构域的一小部分，这些调控结构域控制着与它们通常相关的基因的表达。令人惊讶地发现，这些CRE(其中许多非常小)可以从其正常环境中分离出来，并在用于构建各种合成启动子时保留肌肉特异性调控活性。这是令人意外的，因为从基因组中复杂和“三维”的自然环境中去除调控序列通常会导致活性的显著丧失，因此没有理由期望给定的CRE一旦从其自然环境中去除后仍保持观察到的活性水平。已经检测了这些CRE的许多组合，发现当与最小和近端启动子组合时，在增强肌肉特异性启动子活性方面非常有效。应该注意的是，本发明CRE的序列可以被改变而不会导致活性的基本丧失。CRE的功能性变体可以通过修饰CRE的序列来制备，前提是避免对CRE活性显著有害的修饰。鉴于本公开中提供的信息，对CRE进行修饰以提供功能性变体是简单易懂的。此外，本公开提供了用于简单评估任何给定CRE变体的功能的方法。功能性变体的实例如下所述。

CRE0145是CRE0050的功能性变体，反之亦然，因为CRE0145是CRE0050的较短版本。

根据本发明的某些CRE的相对较小的大小是有利的，因为它允许在载体中提供CRE，更具体地说是包含它们的启动子，同时占用载体的最小有效负载量。当在容量有限的载体(如基于AAV的载体)中使用CRE时，这一点尤其重要。

本发明的CRE包含某些肌肉特异性TFBS。通常希望在CRE的功能性变体中，这些肌肉特异性TFBS维持功能性。技术人员很清楚TFBS序列可以变化但仍维持功能性。鉴于此，TFBS的序列通常由共有序列来说明，其中通常存在一定程度的变异。关于TFBS中发生的变异的进一步信息可以使用位置权重矩阵(PWM)来说明，位置权重矩阵代表给定核苷酸在共有序列中给定位置处通常出现的频率。TF共有序列和相关位置权重矩阵的细节可以参见，例如，Jaspar或Transfac数据库(http://jaspar.genereg.net/和http://gene-regulation.com/pub/databases.html)。该信息允许技术人员以维持甚至在某些情况下增加CRE功能性的方式修饰CRE的任何给定TFBS中的序列。鉴于此，技术人员对如何修饰任何给定TF的TFBS同时保持与所需TF结合的能力具有充分的指导；例如，Jaspar系统将根据与给定PWM的相似性对推定的TFBS进行评分。此外，可以根据JASPAR数据库中的所有PWM扫描CRE，以识别/分析所有TFBS。技术人员当然可以在文献中找到额外的指导，此外，可以使用常规实验来证实TF与任何变体CRE中推定的TFBS的结合。显而易见的是，可以在CRE中，甚至在CRE中的TFBS中进行显著的序列修饰同时维持功能。

合成的肌肉特异性CRM及其功能性变体

本文公开了可用于构建合成肌肉特异性启动子的各种合成肌肉特异性CRM。本发明的CRM可与大范围的合适的最小启动子或肌肉特异性近端启动子联合使用。

CRM的功能性变体包括与参考CRM元件不同的序列，但其基本上保留了肌肉特异性CRM的活性。技术人员将理解，有可能改变CRM的序列，同时保留其募集合适的肌肉特异性转录因子(TF)的能力，从而增强表达。与参考CRM相比，CRM的功能性变体可包含取代、缺失和/或插入，前提是它们不会使CRM基本失去功能。

在一些实施方案中，CRM的功能性变体可被视为当替代启动子中的参考CRM时基本上保持其活性的CRM。例如，包含给定CRM的功能性变体的肌肉特异性启动子优选保留至少80％的活性，更优选至少90％的活性，更优选至少95％的活性，甚至更优选100％的活性(与包含未修饰CRM的参考启动子相比)。

合适地，CRM的功能性变体保留相对于参考CRM显著水平的序列同一性。合适地，功能性变体包含与参考CRM至少70％相同的序列，更优选与参考CRM至少80％、90％、95％或99％相同的序列。

活性保留可通过比较参考启动子控制下合适的报告基因的表达与同等条件下包含取代CRM的相同启动子的表达来评估。本文公开了用于评估肌肉特异性启动子活性的合适的测定法，例如在实施例中。

在一些实施方案中，给定CRM的功能性变体可以包含参考CRM中存在的一个或多个CRE的功能性变体。例如，给定CRM的功能性变体可以包含参考CRM中存在的1、2、3、4、5或6个CRE的功能性变体。

在一些实施方案中，给定CRM的功能性变体可以包含与参考CRM相同的组合CRE，但是CRE可以以与参考CRM不同的顺序出现。通常优选CRE以与参考CRM相同的顺序存在(因此，CRM的功能性变体合适地包含与参考CRM中列出的CRE相同的排列)。

在一些实施方案中，给定CRM的功能性变体可以包含参考CRM中存在的CRE之外的一个或多个额外的CRE。可以在参考CRM中存在的CRE的上游、参考CRM中存在的CRE的下游和/或参考CRM中存在的CRE之间提供额外的CRE。额外的CRE可以是本文公开的CRE，或者它们可以是其他CRE。通常，优选给定CRM的功能性变体包含相同的CRE(或其功能性变体)并且不包含额外的CRE。

给定CRM的功能性变体可以包含一个或多个与参考CRM相比额外的调控元件。例如，它们可以包含诱导型或阻抑型元件、边界控制元件、绝缘体、基因座控制区、响应元件、结合位点、末端重复片段、反应位点、稳定化元件、去稳定化元件和剪接元件等，前提是它们不会使CRM基本失去功能。

给定CRM的功能性变体可以在相邻的CRE之间包含额外的间隔区，或者如果参考CRM中存在一个或多个间隔区，则所述一个或多个间隔区可以比参考CRM中的更长或更短。

显然，本文公开的CRM或其功能性变体可以与任何合适的启动子元件组合，以提供根据本发明的合成肌肉特异性启动子。

在许多情况下，优选较短的启动子序列，特别是用于载体(例如病毒载体如AAV)能力有限的情况。因此，在一些实施方案中，合成的肌肉特异性CRM具有250个或更少核苷酸的长度，例如220、200、180、150、100、75、60、50个或更少核苷酸。在一些特别优选的实施方案中，合成的肌肉特异性CRM具有200个或更少核苷酸的长度。

启动子元件及其功能性变体：

本发明的CRE和CRM可与大范围的合适的最小启动子或肌肉特异性近端启动子联合使用，统称为启动子元件。

启动子元件的功能性变体包括与参考启动子元件不同的序列，但其基本上保留了肌肉特异性启动子元件的活性。技术人员将理解，有可能改变启动子元件的序列，同时保留其促进表达的能力。与参考启动子元件相比，启动子元件的功能性变体可包含取代、缺失和/或插入，前提是它们不会使启动子元件基本失去功能。

在一些实施方案中，启动子元件的功能性变体可被视为当替代合成启动子中的参考启动子元件时基本上保持其活性的启动子元件。例如，包含给定启动子元件的功能性变体的肌肉特异性合成启动子优选保留至少80％的活性，更优选至少90％的活性，更优选至少95％的活性，甚至更优选100％的活性(与包含未修饰启动子元件的参考启动子相比)。

合适地，启动子元件的功能性变体保留相对于参考启动子元件显著水平的序列同一性。合适地，功能性变体包含与参考启动子元件至少70％相同的序列，更优选与参考启动子元件至少80％、90％、95％或99％相同的序列。

活性保留可通过比较参考启动子控制下合适的报告基因的表达与同等条件下包含取代启动子元件的相同启动子的表达来评估。本文公开了用于评估肌肉特异性启动子活性的合适的测定法，例如在实施例中。

合成的肌肉特异性启动子及其功能性变体

本文公开了各种合成的肌肉特异性启动子。参考合成肌肉特异性启动子的功能性变体是包含与参考合成肌肉特异性启动子不同的序列但基本上保留肌肉特异性启动子活性的启动子。技术人员将理解，有可能改变合成肌肉特异性启动子的序列，同时保留其募集合适的肌肉特异性转录因子(TF)和募集RNA聚合酶II的能力，以提供可操作地连接的序列(例如开放阅读框)的肌肉特异性表达。与参考启动子相比，合成肌肉特异性启动子的功能性变体可以包含取代、缺失和/或插入，前提是这种取代、缺失和/或插入不会使合成肌肉特异性启动子与参考启动子相比基本失去功能。

因此，在一些实施方案中，合成肌肉特异性启动子的功能性变体可以被视为基本上保留了参考启动子的肌肉特异性启动子活性的变体。例如，合成肌肉特异性启动子的功能性变体优选保留参考启动子的至少70％活性，更优选至少80％活性，更优选至少90％活性，更优选至少95％活性，甚至更优选100％活性。

合成肌肉特异性启动子的功能性变体通常保留相对于参考合成肌肉特异性启动子显著水平的序列相似性。在一些实施方案中，功能性变体包含与参考合成肌肉特异性启动子至少70％相同的序列，更优选与参考合成肌肉特异性启动子至少80％、90％、95％或99％相同的序列。

功能性变体中的活性可以通过比较在同等条件下在参考合成肌肉特异性启动子控制下合适的报告基因的表达与在推定的功能性变体控制下合适的报告基因的表达来评估。本文公开了用于评估肌肉特异性启动子活性的合适的测定法，例如在实施例中。

给定合成肌肉特异性启动子的功能性变体可以包含参考合成肌肉特异性启动子中存在的一种或多种CRE的功能性变体。例如，给定CRM的功能性变体可以包含参考CRM中存在的1、2、3、4、5或6个CRE。CRE的功能性变体如上所述。

给定合成肌肉特异性启动子的功能性变体可以包含启动子元件的功能性变体，或与参考合成肌肉特异性启动子相比不同的启动子元件。

给定合成肌肉特异性启动子的功能性变体可以包含与参考合成肌肉特异性启动子相同的CRE，但CRE可以以与参考合成肌肉特异性启动子不同的顺序存在。

给定合成肌肉特异性启动子的功能性变体可以包含参考合成肌肉特异性启动子中存在的CRE之外的一个或多个额外的CRE。可以在参考CRM中存在的CRE的上游、参考合成肌肉特异性启动子中存在的CRE的下游和/或参考合成肌肉特异性启动子中存在的CRE之间提供额外的CRE。额外的CRE可以是本文公开的CRE，或者它们可以是其他CRE。

给定合成肌肉特异性启动子的功能性变体可以包含一个或多个与参考合成肌肉特异性启动子相比额外的调控元件。例如，它们可以包含诱导型元件、固有元件、边界控制元件、绝缘体、基因座控制区、响应元件、结合位点、末端重复片段、反应位点、稳定化元件、去稳定化元件和剪接元件等，前提是它们不会使启动子基本失去功能。

给定合成肌肉特异性启动子的功能性变体可以在相邻的CRE和启动子元件之间包含额外的间隔区，或者如果参考合成肌肉特异性启动子中存在一个或多个间隔区，则所述一个或多个间隔区可以比参考合成肌肉特异性启动子中的更长或更短。下面提供了功能性变体的实例。

SP0522是SP0502的功能性变体，反之亦然，因为SP0522是SP0502的较短版本。SP0523是SP0515的功能性变体，反之亦然，因为SP0523是SP0515的较短版本。SP0524是SP0521的功能性变体，反之亦然，因为SP0524是SP0521的较短版本。

显然，本发明的合成肌肉特异性启动子可以包含本发明的合成肌肉特异性启动子和额外的调控序列。例如，它们可以包含一个或多个额外的CRM、诱导型或阻抑型元件、边界控制元件、绝缘体、基因座控制区、响应元件、结合位点、末端重复片段、反应位点、稳定化元件、去稳定化元件和剪接元件等，前提是它们不会使启动子基本失去功能。

本发明优选的合成肌肉特异性启动子表现出的肌肉特异性启动子活性是CBA或RSV启动子在肌肉细胞中表现出的活性的至少15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％或400％。在许多情况下，优选较高水平的启动子活性，但并非总是如此；因此，在某些情况下，可能优选更适度的表达水平。在某些情况下，需要有一系列不同活性水平的启动子，以使表达水平符合要求；本公开提供了有望提供这样一系列活性的启动子。当CBA和RSV在其他方面等同的表达构建体中并在等同的条件下提供时，与CBA或RSV相比本发明给定的合成肌肉特异性启动子的活性可以通过比较在合成肌肉特异性启动子控制下的报告基因的肌肉特异性表达与在CBA或RSV启动子控制下的相同报告基因的表达来评估。

在一些实施方案中，相对于已知的肌肉特异性启动子，本发明的合成肌肉特异性启动子能够将受试者肌肉或肌肉细胞中的基因(例如治疗性基因或目的基因)的表达增加至少20％、至少40％、至少60％、至少80％、至少100％、至少200％、至少300％、至少500％、至少1000％或更多，所述已知肌肉特异性启动子合适地为SPc5-12启动子(Gene Ther.2008Nov；15(22):1489-99)。

本发明优选的合成肌肉特异性启动子在非肌肉细胞(例如Huh7和HEK293细胞)中表现出的活性比CMV-IE低50％或更低，优选比CMV-IE低25％或更低，更优选比CMV-IE低10％或更低，在某些情况下比CMV-IE低5％或更低，或比CMV-IE低1％或更低。

在许多情况下，优选较短的启动子序列，特别是用于载体(例如病毒载体如AAV)能力有限的情况。因此，在一些实施方案中，合成的肌肉特异性启动子具有300个或更少核苷酸的长度，例如290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、150、100、75、70、68个或更少核苷酸。在一些实施方案中，合成肌肉特异性启动子的长度为300个或更少核苷酸，优选290个或更少核苷酸，更优选280个或更少核苷酸，甚至更优选270个或更少核苷酸。在一些实施方案中，合成肌肉特异性启动子的长度为260个或更少核苷酸，优选250个或更少核苷酸，更优选240个或更少核苷酸，甚至更优选230个或更少核苷酸。

特别优选的合成肌肉特异性启动子是那些既短又显示高水平活性的启动子。

合成肌肉特异性表达盒

本发明还提供了合成肌肉特异性表达盒，其包含与编码表达产物(合适地为基因，例如转基因)的序列可操作地连接的本发明合成肌肉特异性启动子。

该基因通常编码所需的基因表达产物，如多肽(蛋白质)或RNA。该基因可以是全长cDNA或基因组DNA序列，或具有至少一些所需的生物活性的其任何片段、亚基或突变体。

当基因编码一种蛋白质时，它基本上可以是任何类型的蛋白质。作为非限制性实例，蛋白质可以是酶、抗体或抗体片段(例如单克隆抗体)、病毒蛋白(例如REP-CAP、REV、VSV-G或RD114)、治疗性蛋白质或毒性蛋白质(例如半胱天冬酶3、8或9)。

在本发明的一些优选实施方案中，基因编码治疗性表达产物，优选适用于治疗与异常基因表达相关的疾病或病况的治疗性多肽，任选地，在肌肉中，任选地，在骨骼肌和/或心肌中。

在一些实施方案中，治疗性表达产物包括用于治疗肌肉疾病的表达产物。技术人员理论上理解术语“肌肉疾病”。该术语涉及通过向肌肉，特别是肌肉细胞施用活性化合物来治疗和/或预防的疾病。在一些实施方案中，肌肉疾病是骨骼肌疾病。在一些实施方案中，肌肉疾病是心肌疾病。

在一些实施方案中，治疗性表达产物是用于治疗杜氏肌营养不良的表达产物。在一些实施方案中，治疗性表达产物是DMD基因或其功能性变体。

在一些实施方案中，治疗性表达产物是用于治疗心力衰竭或充血性心力衰竭的表达产物。

在一些实施方案中，肌肉疾病是血管疾病、肌营养不良、心肌病、肌强直、肌萎缩、肌阵挛性肌张力障碍(受影响的基因：SGCE)、线粒体肌病、横纹肌溶解症、纤维肌痛和/或肌筋膜疼痛综合征。

在一个实施方案中，疾病可以是心血管病况或心脏疾病或病症。在一个实施方案中，疾病可以是心力衰竭，如充血性心力衰竭。在一个实施方案中，疾病可选自缺血、心律失常、心肌梗死(MI)、心脏收缩力异常、非缺血性心肌病、外周动脉闭塞性疾病和异常Ca2+代谢及其组合。在一些实施方案中，疾病选自由以下组成的组：充血性心力衰竭、心肌病、心肌梗死、组织缺血、心脏缺血、血管疾病、获得性心脏病、先天性心脏病、动脉粥样硬化、传导系统功能障碍、冠状动脉功能障碍、肺心病高血压。在一些实施方案中，疾病可选自充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、心肌梗死、心肌缺血、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、心律失常、丹农病、肌营养不良、肌肉质量异常、肌肉退化、感染性心肌炎、药物或毒素引起的肌肉异常、过敏性心肌炎、自身免疫性心内膜炎和先天性心脏病。

在一些实施方案中，心肌病是肥厚型心肌病、致心律失常性右心室发育不良、扩张型心肌病、限制性心肌病、左心室致密化不全、应激性心肌病(Takotsubo心肌病)、心肌炎、嗜酸性心肌炎和缺血性心肌病。优选地，肥厚型心肌病是CMH1(基因：MYH7)、CMH2(基因：TNNT2)、CMH3(基因：TPM1)、CMH4(基因：MYBPC3)、CMH5、CMH6(基因：PRKAG2)、CMH7(基因：TNNI3)、CMH8(基因：MYL3)、CMH9(基因：TTN)、CMH10(基因：MYL2)、CMH11(基因：ACTC1)或CMH12(基因：CSRP3)。优选地，致心律失常性右心室发育不良是ARVD1(基因：TGFB3)、ARVD2(基因：RYR2)、ARVD3、ARVD4、ARVD5(基因：TMEM43)、ARVD6、ARVD7(基因：DES)、ARVD8(基因：DSP)、ARVD9(基因：PKP2)、ARVD10(基因：DSG2)、ARVD11(基因：DSC2)和/或ARVD12(基因：JUP)。

在一些实施方案中，肌肉疾病是血管疾病。血管疾病可以是冠状动脉疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病、肾动脉狭窄或主动脉瘤。在一些实施方案中，肌肉疾病可以是心肌病。心肌病可以是高血压性心脏病、心力衰竭(如充血性心力衰竭)、肺心病、心律失常、炎症性心脏病(如心内膜炎、炎症性心脏肥大、心肌炎)、瓣膜性心脏病、先天性心脏病和风湿性心脏病。

在一些实施方案中，肌营养不良是杜氏肌营养不良(受影响的基因：DMD)、贝克肌营养不良(受影响的基因：DMD)、肢带型肌营养不良(亚型和受影响的基因：LGMD1A(基因：TTID)、LGMD1B(基因：LMNA)、LGMD1C(基因：CAV3)、LGMD1D(基因：DNAJB6)、LGMD1E(基因：DES)、LGMD1F(基因：TNP03)、LGMD1G(基因：HNRPDL)、LGMD1H、LGMD2A(基因：CAPN3)、LGMD2B(基因：DYSF)、LGMD2C(基因：SGCG)、LGMD2D(基因：SGCA)、LGMD2E(基因：SGCB)、LGMD2F(基因：SGCD)、LGMD2G(基因：TCAP)、LGMD2H(基因：TRIM32)、LGMD2I(基因：FKRP)、LGMD2J(基因：TTN)、LGMD2K(基因：POMT1)、LGMD2L(基因：AN05)、LGMD2M(基因：FKTN)、LGMD2N(基因：POMT2)、LGMD20(基因：POMGNT1)、LGMD2Q(基因：PLEC1))、先天性肌营养不良、杜氏肌营养不良、Emery-Dreifuss肌营养不良、远端肌营养不良(亚型和受影响的基因：Miyoshi肌病(基因：DYSF))、胫骨前部发病的远端肌病(基因：DYSF)、Welander远端肌病(基因：TIA1)、Gowers-Laing远端肌病(基因：MYH7)、Nonaka远端肌病、1型遗传性包涵体肌炎、伴有声带和咽部无力的远端肌病、ZASP相关肌病、面肩肱肌营养不良(亚型和受影响的基因：1型(基因：DUX4)、2型(基因：SMCHD1))、眼咽肌营养不良(受影响的基因：PABPN1)和/或肌强直性营养不良(亚型和受影响的基因：DM1(基因：DMPK)和DM2(基因：ZNF9))。

在一些实施例中，肌强直是先天性肌强直(受影响的基因：CLCN1；亚型：Thomsen型、Becker型)、钾加重型肌强直和/或先天性肌强直(受影响的基因：SCN4A)。

在一些实施方案中，肌肉疾病是杜氏肌营养不良(基因：DMD)、肌管型肌病(基因：MTM1)、脊髓性肌萎缩(基因：SMA)、II型糖原累积病(庞贝病，基因：GAA)或心肌病。

在一些实施方案中，疾病可以是高钾性周期性麻痹或低钾性周期性麻痹。

在一些实施方案中，疾病可以是选自杆状体肌病、多轴空性/微轴空性肌病和中央核性肌病的先天性肌病。

在一些实施方案中，疾病可选自炎症性肌病、代谢性肌病、布罗迪肌病或遗传性包涵体肌病。

在一些实施方案中，该基因编码非疾病介导的变体，例如选自由以下组成的组的至少一种人类基因的野生型变体：DMD、GALGT2、SMA、GAA、MTM1、TTID、LMNA、CAV3、DNAJB6、DES、TNP03、HNRPDL、CAPN3、DYSF、SGCG、SGCA、SGCB、SGCD、TCAP、TRIM32、FKRP、TTN、POMT1、AN05、FKTN、POMT2、PFEC1、TIA1、MYH7、DUX4、SMCHD、PABPN1、DMPK、MBNL1、ZNF9、CFCN1、SCN4A、MYH7、TNNT2、TPM1、MYBPC3、PRKAG2、TNNI3、MYF3、TTN、MYF2、ACTC1、CSRP3、TGFB3、RYR2、TMEM43、DES、DSP、PKP2、DSG2、DSC2、JUP、CNBP、CLCN1、SEPN1、RYR1和HYPP。

在一些实施方案中，该基因编码选自由以下组成的组的至少一种人类基因的合成野生型变体：DMD、GALGT2、SMA、GAA、MTM1、TTID、LMNA、CAV3、DNAJB6、DES、TNP03、HNRPDL、CAPN3、DYSF、SGCG、SGCA、SGCB、SGCD、TCAP、TRIM32、FKRP、TTN、POMT1、AN05、FKTN、POMT2、PFEC1、TIA1、MYH7、DUX4、SMCHD、PABPN1、DMPK、MBNL1、ZNF9、CFCN1、SCN4A、MYH7、TNNT2、TPM1、MYBPC3、PRKAG2、TNNI3、MYF3、TTN、MYF2、ACTC1、CSRP3、TGFB3、RYR2、TMEM43、DES、DSP、PKP2、DSG2、DSC2、JUP、CNBP、CLCN1、SEPN1、RYR1和HYPP。

其他示例性肌肉组织相关疾病包括但不限于酸性麦芽糖酶缺乏症(AMD)、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、Andersen-Tawil综合征、贝克肌营养不良(BMD)、贝克先天性肌强直、Bethlem肌病、心血管疾病、肉碱缺乏症、肉碱棕榈酰转移酶缺乏症(CPT缺乏症)、中央轴空病(CCD)、中央核性肌病、腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth病，CMT)、先天性肌无力综合征(CMS)、先天性强直性肌营养不良、充血性心力衰竭、Cori病(脱支酶缺乏症)、脱支酶缺乏症、Dejerine-Sottas病(DSD)、皮肌炎(DM)、内分泌肌病、Eulenberg病(先天性副肌强直)、Forbes病(脱支酶缺乏症)、Friedreich共济失调症(FA)、10型糖原累积症、11型糖原累积症、2型糖原累积症、3型糖原累积症、5型糖原累积症、7型糖原累积症、9型糖原累积症、Gowers-Laing远端肌病、Hauptmann-Thanheuser MD(Emery-Dreifuss肌营养不良)、遗传性包涵体肌炎、遗传性运动和感觉神经病(Charcot-Marie-Tooth病)、甲亢性肌病、甲状腺功能减退性肌病、包涵体肌炎(IBM)、遗传性肌病、整合素缺陷型先天性肌营养不良、乳酸脱氢酶缺乏症、Lambert-Eaton肌无力综合征(LEMS)、McArdle病(磷酸化酶缺乏症)、肌肉代谢性疾病、线粒体肌病、Miyoshi远端肌病、运动神经元病、肌-眼-脑疾病、重症肌无力(MG)、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症、肌原纤维肌病、肌磷酸化酶缺乏症、先天性肌强直(MC)、强直性肌营养不良(MMD)、肌管型肌病(MTM或MM)、杆状体肌病、Nonaka远端肌病、眼咽肌营养不良(OPMD)、先天性副肌强直、Pearson综合征、周期性麻痹、腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth病)、磷酸果糖激酶缺乏症、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症、磷酸化酶缺乏症、磷酸化酶缺乏症、多发性肌炎(PM)、庞贝病(酸性麦芽糖酶缺乏症)、进行性眼外肌麻痹(PEO)、杆状体疾病(杆状体肌病)、脊髓性肌萎缩症(SMA)、脊髓延髓性肌萎缩症(SBMA)、Steinert病(强直性肌营养不良)、Tarui病(磷酸果糖激酶缺乏症)、Thomsen病(先天性肌强直)、Ullrich型先天性肌营养不良、Walker-Warburg综合征(先天性肌营养不良)、Welander远端肌病和ZASP相关肌病。

在一些实施方案中，肌肉疾病是心肌疾病。在一些实施方案中，肌肉疾病是充血性心力衰竭。

在一些实施方案中，有用的表达产物包括肌营养不良蛋白(包括微型肌营养不良蛋白)、β1,4-n-乙酰半乳糖胺半乳糖基转移酶(GALGT2)、氨甲酰合成酶I、α-1抗胰蛋白酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨酸琥珀酸合成酶、精氨酸琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、富马酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、胱硫醚β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰基辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β-葡萄糖苷酶、丙酮酸羧酸酯、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、T-蛋白和囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)。

其他有用的表达产物包括用于酶替代疗法的酶，其可用于各种由酶活性不足引起的病况。例如，含有甘露糖-6-磷酸的酶可用于溶酶体贮积症的疗法(例如，合适的基因包括编码β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)的基因)。

在一些实施方案中，示例性多肽表达产物包括神经保护多肽和抗血管生成多肽。合适的多肽包括但不限于神经胶质源性神经营养因子(GDNF)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、nurturin、睫状神经营养因子(CNTF)、神经生长因子(NGF；例如神经生长因子-β)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)、神经营养蛋白-6(NT-6)、表皮生长因子(EGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、Wnt多肽、可溶性Fit-1、血管抑制素、内皮抑制素、VEGF、抗VEGF抗体、可溶性VEGFR、VIII因子(FVIII)、IX因子(FIX)和刺猬蛋白家族成员(声波刺猬蛋白、印度刺猬蛋白和沙漠刺猬蛋白等)。

在一些实施方案中，有用的治疗性表达产物包括激素和生长和分化因子，包括但不限于胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、促卵泡激素(FSH)、黄体化激素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管抑制素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、转化生长因子α超家族中的任何一种(包括TGFa)、激活素、抑制素或骨形态发生蛋白(BMP)BMP 1-15中的任何一种、生长因子的heregluin/神经调节蛋白/ARIA/神经鞘分化因子(NDF)家族中的任何一种、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素NT-3和NT-4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、neurturin、聚集蛋白(agrin)、信号素/脑衰蛋白家族中的任何一种、纺锤蛋白-1和纺锤蛋白-2、肝细胞生长因子(HGF)、ephrin、头蛋白(noggin)、声波刺猬蛋白和酪氨酸羟化酶。

在一些实施方案中，有用的表达产物包括调节免疫系统的蛋白，包括但不限于，细胞因子和淋巴因子，如血小板生成素(TPO)、白细胞介素(IL)IL-1至IL-25(包括IL-2、IL-4、IL-12和IL-18)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素(α、β和γ)、干细胞因子、flk-2/flt3配体。免疫系统产生的基因产物也可用于本发明。这些包括但不限于免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、I类和II类MHC分子以及工程化免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因产物还包括补体调节蛋白，如补体调节蛋白、膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、CR1、CF2和CD59。

在一些实施方案中，有用的表达产物包括激素、生长因子、细胞因子、淋巴因子、调控蛋白和免疫系统蛋白的任一种受体。有用的异源核酸序列还包括胆固醇调控和/或脂质调节受体，包括低密度脂蛋白(LDL)受体、高密度脂蛋白(HDL)受体、极低密度脂蛋白(VLDL)受体和清道夫受体。本发明还包括使用基因产物，如类固醇激素受体超家族成员，包括糖皮质激素受体和雌激素受体、维生素D受体和其他核受体。此外，有用的基因产物包括转录因子如jun、fos、max、mad、血清反应因子(SRF)、AP-1、AP-2、myb、MyoD和肌细胞生成素、含有ETS-盒的蛋白质、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、结合CCAAT-盒的蛋白质、干扰素调节因子(IRF-1)、肾母细胞瘤蛋白、ETS结合蛋白、STAT、结合GATA-盒的蛋白质(例如GATA-3)以及有翼螺旋蛋白的叉头家族。

在一些实施方案中，有用的表达产物包括用于治疗血友病的表达产物，包括血友病B(包括因子IX)和血友病A(包括因子VIII及其变体，如异二聚体的轻链和重链以及B-缺失结构域；美国专利号6,200,560和美国专利号6,221,349)。

在一些实施方案中，有用的表达产物可以是磷酸酶活性(例如1型磷酸酶活性)的调节剂。调节剂可以是抑制磷酸酶活性(例如1型磷酸酶活性)的蛋白质。调节剂可以是增加内源核酸表达的核酸，所述内源核酸编码抑制磷酸酶活性的蛋白质如转录因子。调节剂可以是整合在编码抑制磷酸酶活性的蛋白质的内源核酸中或其附近的调控序列。调节剂可以是能提供基因表达的核酸调节剂的核酸，如siRNA。

在一些实施方案中，有用的表达产物可以是蛋白磷酸1(PP1)的抑制剂，例如I-1多肽。磷酸酶抑制剂-1(或“I-1”)蛋白是1型磷酸酶的内源性抑制剂。增加I-1水平或活性可以恢复衰竭人类心肌细胞的β肾上腺素能反应性。合适地，I-1蛋白可以是组成型活性的，如I-1蛋白，其中苏氨酸35被谷氨酸代替，而不是被天冬氨酸代替。治疗性表达产物可以是选自下列的任何一种或多种抑制剂：磷酸酶抑制剂2(PP2)；冈田酸或caliculin；以及nippl，它是蛋白磷酸酶1的内源性核抑制剂。

在一些实施方案中，有用的表达产物可以是调节心脏活性的任何蛋白，如1型磷酸酶抑制剂，例如I-1或肌浆网Ca2+ATP酶(SERCA)，例如SERCA1(例如1a或1b)、SERCA2(例如2a或2b)或SERCA3。

在一些实施方案中，有用的表达产物可以是编码磷酸酶抑制剂-1蛋白突变形式的核酸序列，其中突变形式在野生型中PKC-α磷酸化位点处包含至少一个氨基酸，其中所述至少一个氨基酸在突变形式中是结构上未磷酸化的或模拟未磷酸化的状态。治疗性表达产物可以是腺苷酸环化酶6(AC6，也称为腺苷酸环化酶VI)、S100A1、β-肾上腺素能受体激酶-ct(βARKct)、肌/内质网(SR)Ca-ATP酶(SERCA2a)、IL-18、VEGF、VEGF激活剂、尿皮质素和B-细胞淋巴瘤2(Bcl2)相关anthanogene-3(BAG3)。

在一些实施方案中，有用的表达产物可以是细胞因子的抑制剂，如IL-18抑制剂。治疗性表达产物可以是β肾上腺素能信号传导蛋白(β-ASP)(包括β肾上腺素能受体(β-Ars)、G蛋白受体激酶抑制剂(GRK抑制剂)和腺苷酸环化酶(Acs))，以增强心脏功能。

在一些实施方案中，有用的表达产物可以是血管生成蛋白。血管生成蛋白促进血管的发育和分化。血管生成蛋白的实例包括成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员，如aFGF(FGF-1)、bFGF(FGF-2)、FGF-4(也称为“hst/KS3”)、FGF-5和FGF-6、血管内皮生长因子(VEGF)家族、血小板衍生生长因子(PDGF)家族、胰岛素样生长因子(IGF)家族等。

在一些实施方案中，有用的表达产物包括非天然存在的多肽，如具有包含插入、缺失或氨基酸取代的非天然存在的氨基酸序列的嵌合或杂交多肽。在一些实施方案中，表达产物可以是合成的dysferlin蛋白，如(Llanga等人,2017)的表1和图1A中详述的纳米Dysferlin，其是野生型dysferlin的较短版本。

其他合适的表达产物包括微RNA(miRNA)、干扰RNA、反义RNA、核酶和适配体。

在一些优选的实施方案中，表达产物是蛋白磷酸1(PP1)的抑制剂。

在本发明的一些实施方案中，合成的肌肉特异性表达盒包含用于基因编辑的基因，例如编码位点特异性核酸酶的基因，如大范围核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应物的核酸酶(TALEN)或规律间隔成簇短回文重复序列系统(CRISPR-Cas)。合适地，位点特异性核酸酶适于通过产生切口(通常是位点特异性双链断裂)来编辑所需的靶基因组基因座，然后通过非同源末端连接(NHEJ)或同源性依赖修复(HDR)进行修复，产生所需的编辑。该编辑可以是功能障碍基因的部分或完全修复，或者功能基因的敲低或敲除。或者，可以使用本领域已知的合适系统通过碱基编辑或先导编辑(prime editing)进行编辑。

在本发明的一些实施方案中，合成的肌肉特异性表达盒包含用于基因调节的基因，例如与基因阻遏物或基因激活物融合的DNA结合蛋白。例如，与基因阻遏物或基因激活物融合的锌指蛋白或与基因阻遏物或基因激活物融合的内切核酸酶缺陷型cas9。

合适地，合成的肌肉特异性表达盒包含提供或编码核糖体结合位点、起始密码子、终止密码子和转录终止序列中的一个或多个(优选全部)的序列。合适地，表达盒包含编码转录后调控元件的核酸。合适地，表达盒包含编码多聚腺苷酸元件的核酸。

载体和病毒颗粒

本发明进一步提供了一种载体，其包含根据本发明的合成肌肉特异性启动子或表达盒。

在本发明的一些实施方案中，载体是质粒。这种质粒可以包括多种其他功能性核酸序列，如一个或多个选择性标记、一个或多个复制起点、多克隆位点等。在本发明的一些实施方案中，载体是病毒载体。

在本发明的一些实施方案中，载体是用于在真核细胞中表达的表达载体。真核表达载体的实例包括但不限于可从Stratagene获得的pW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl和pSG；可从Amersham Pharmacia Biotech获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；和可从Clontech获得的pCMVDsRed2-express、pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito、pCMV-EGFP。许多其他载体是众所周知的，并且是市售的。对于哺乳动物细胞腺病毒载体，pSV和pCMV系列载体是特别众所周知的非限制性实例。有许多众所周知的酵母表达载体，包括但不限于酵母整合质粒(Yip)和酵母复制质粒(Yrp)。对于植物来说，农杆菌的Ti质粒是示例性的表达载体，植物病毒也提供合适的表达载体，例如烟草花叶病毒(TMV)、马铃薯病毒X和豇豆花叶病毒。

在一些优选的实施方案中，载体是基因治疗载体。各种基因治疗载体是本领域已知的，可以提及的有AAV载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。当载体是基因治疗载体时，载体优选包含与本发明的合成肌肉特异性启动子可操作地连接的核酸序列，该核酸序列编码治疗性产物，合适地，编码治疗性蛋白质。治疗性蛋白质可以是可分泌的蛋白质。上文讨论了可分泌蛋白质的非限制性实例，示例性的可分泌的治疗性蛋白质包括凝血因子(如因子VIII或因子IX)、胰岛素、红细胞生成素、脂蛋白脂肪酶、抗体或纳米抗体、生长因子、细胞因子、趋化因子、血浆因子、毒性蛋白质等。

在本发明的一些实施方案中，载体是病毒载体，如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒(AAV)载体。在一些优选的实施方案中，载体是AAV载体。在一些优选的实施方案中，AAV具有适用于肌肉转导的血清型。在一些实施方案中，AAV选自由以下组成的组：AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9 BNP116、rh10、AAV2.5、AAV2i8、AAVDJ8和AAV2G9或其衍生物。AAV载体优选用作自身互补的双链AAV载体(scAAV)，以克服AAV转导中的限制性步骤之一(即单链至双链AAV转化)，尽管单链AAV载体(ssAAV)的使用也包括在本文中。在本发明的一些实施方案中，AAV载体是嵌合的，这意味着它包含来自至少两种AAV血清型的组分，例如AAV2的ITR和AAV5的衣壳蛋白。已知AAV9特别有效地转导骨骼肌和心肌，因此AAV9及其衍生物对于靶向骨骼肌和心肌特别有意义。还已知AAV1、AAV6、AAV7和AAV8靶向骨骼肌，因此这些AAV血清型及其衍生物对于靶向骨骼肌也特别有意义。还已知AAV1和AAV8靶向心肌，因此这些AAV血清型及其衍生物对于靶向心肌也特别有意义。在一些实施方案中，rAAV载体是AAV3b血清型，包括但不限于AAV3b265D病毒体、AAV3b265D549A病毒体、AAV3b549A病毒体、AAV3bQ263Y病毒体或AAV3bSASTG病毒体(即包含含有Q263A/T265突变的AAV3b衣壳的病毒体)。在一些实施方案中，病毒体可以是合理的单倍体，或嵌合体或任何突变体，如衣壳可以被定制用于在所需位置(例如心脏)提高更新。其他衣壳可包括来自任何已知AAV血清型的衣壳，包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV10等。

本发明进一步提供了包含上述载体的重组病毒体(病毒颗粒)。

药物组合物

本发明的载体或病毒体可以与药学上可接受的赋形剂(即一种或多种药学上可接受的载体物质和/或添加剂，例如缓冲剂、载体、赋形剂、稳定剂等)一起配制在药物组合物中。药物组合物可以试剂盒的形式提供。适用于AAV载体的药物组合物和递送系统及其方法和用途是本领域已知的。

因此，本发明的另一方面提供了包含本文所述载体或病毒体的药物组合物。

治疗和其他方法及用途

本发明还提供了根据本发明各个方面的合成肌肉特异性启动子、表达盒、载体、病毒体或药物组合物，用于治疗疾病，优选与异常基因表达相关的疾病，任选地在肌肉中(例如遗传性肌肉疾病)。在一个实施方案中，本发明提供了根据本发明各个方面的合成肌肉特异性启动子、表达盒、载体、病毒体或药物组合物，用于治疗骨骼肌疾病。在一个实施方案中，本发明还提供了根据本发明各个方面的合成肌肉特异性启动子、表达盒、载体、病毒体或药物组合物，用于治疗心肌疾病。

上文讨论了相关病况、疾病和治疗性表达产物。

本发明还提供了根据本发明各个方面的合成肌肉特异性启动子、表达盒、载体、病毒体，用于制造治疗本文提及的任何病况或疾病的药物组合物。

本发明进一步提供了一种细胞，其包含根据本发明各个方面的合成肌肉特异性启动子、表达盒、载体、病毒体。合适地，细胞是真核细胞。合适地，真核细胞可以是真菌细胞(例如酵母细胞)、动物(后生动物)细胞(例如哺乳动物细胞)或植物细胞。或者，细胞可以是原核细胞。

在本发明的一些实施方案中，细胞是离体的，例如在细胞培养物中。在本发明的其他实施方案中，细胞可以是组织或多细胞生物的一部分。

在一个优选的实施方案中，细胞是肌肉细胞(肌细胞)，其可以是离体的或体内的。在一个优选的实施方案中，细胞是心肌细胞，其可以是离体的或体内的。在另一个优选的实施方案中，细胞是骨骼肌细胞，可以是离体的或体内的。肌肉细胞可以是原代肌肉细胞或肌源性细胞系的细胞，例如永生化细胞系。细胞可以存在于肌肉组织环境中(例如，在动物的肌肉中)，或者可以从肌肉组织中分离，例如，可以在细胞培养物中。合适地，细胞是人类细胞。

骨骼肌细胞可以来自快肌或慢肌。

心肌细胞可选自心室心肌细胞、心房心肌细胞、心脏成纤维细胞或心脏中的内皮细胞(EC)，以及血管周围细胞和起搏细胞。

根据本发明的合成肌肉特异性启动子、表达盒或载体可以插入细胞基因组中，或者可以是游离基因的(例如存在于游离基因载体中)。

在另一方面，本发明提供了一种生产表达产物的方法，该方法包括在细胞(优选肌肉细胞)中提供根据本发明的合成肌肉特异性表达盒(优选在如上所述的载体中)，并表达存在于合成肌肉特异性表达盒中的基因。合适地，该方法包括将所述肌肉细胞维持在适合基因表达的条件下。在培养中，这可以包括在合适的培养条件下孵育细胞或包含该细胞的组织。该表达当然可以在体内进行，例如在受试者肌肉的一个或多个细胞中进行。在一个实施方案中，肌肉细胞是心肌细胞。在一个实施方案中，肌肉细胞是骨骼肌细胞。

合适地，该方法包括将合成的肌肉特异性表达盒引入肌肉细胞的步骤。转染肌肉细胞的多种方法是本领域众所周知的。转染肌肉细胞的优选方法是用包含合成肌肉特异性表达盒的病毒载体(例如AAV载体)转导细胞。

对技术人员来说显而易见的是，根据本发明各个方面的合成肌肉特异性启动子、表达盒、载体或病毒体可用于基因疗法。因此，这种核酸构建体在基因疗法中的应用构成了本发明的一部分。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了根据本发明的表达盒、载体或病毒体，用于受试者的基因疗法，优选通过治疗性基因的肌肉特异性表达进行的基因疗法。合适地，通过治疗性基因的骨骼肌特异性表达和/或治疗性基因的心肌特异性表达。该疗法可以包括通过从肌肉细胞中分泌治疗性产物来治疗疾病，合适地涉及肌肉中异常基因表达的疾病，如上文讨论的疾病。

本发明还提供了一种在肌肉细胞中表达治疗性转基因的方法，该方法包括将根据本发明的表达盒或载体引入肌肉细胞。肌肉细胞可以是体内的或离体的。在一个实施方案中，肌肉细胞是心肌细胞。在一个实施方案中，肌肉细胞是骨骼肌细胞。

本发明还提供了一种对有此需要的受试者(优选人类)进行基因治疗的方法，该方法包括：

-向受试者施用(合适地引入受试者的肌肉中)本发明的合成肌肉特异性表达盒、载体、病毒体或药物组合物，其包含编码治疗性产物的基因。

在一个实施方案中，肌肉是心肌。在一个实施方案中，肌肉是骨骼肌。在一个实施方案中，肌肉是心肌和/或骨骼肌。

合适地，该方法包括在所述受试者的肌肉中表达治疗量的来自该基因的治疗性产物。上文讨论了可以治疗的各种病况和疾病。在一个实施方案中，肌肉是心肌。在一个实施方案中，肌肉是骨骼肌。

上文讨论了编码合适的治疗性产物的基因。

合适地，该方法包括向受试者施用根据本发明的载体或病毒体。合适地，载体是病毒基因治疗载体，例如AAV载体。

在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用合成的肌肉特异性病毒基因治疗载体(即，包含本文所述肌肉特异性启动子的病毒基因治疗载体)，其包含编码治疗性产物的基因。

在一些实施方案中，该方法包括全身性施用病毒基因治疗载体。全身施用可以是肠内的(例如口服、舌下和直肠)或胃肠外的(例如注射)。优选的注射途径包括静脉内、肌肉内、皮下、动脉内、关节内、囊内和皮内注射。在一些优选的实施方案中，通过顺行心外膜冠状动脉输注(AECAI)向受试者施用病毒基因治疗载体。在一些特别优选的实施方案中，经由经皮股动脉途径通过顺行心外膜冠状动脉输注(AECAI)向受试者施用病毒基因治疗载体。

在一些实施方案中，受试者患有心力衰竭。在一些实施方案中，对受试者进行的基因治疗方法用于治疗心力衰竭。

在一些实施方案中，该方法包括通过顺行心外膜冠状动脉输注(AECAI)向受试者施用用于治疗心力衰竭的合成肌肉特异性病毒基因治疗载体，其中该载体包含编码治疗性产物的基因。

在一些实施方案中，病毒基因治疗载体可以与一种或多种额外的治疗剂或一种或多种设计用于防止网状内皮系统清除载体的饱和剂同时或依次施用。

当载体是AAV载体时，载体的剂量可以为1x10¹⁰gc/kg至1x10¹⁵gc/kg或更高，合适地为1x10¹²gc/kg至1x10¹⁴gc/kg，合适地为5x10¹²gc/kg至5x10¹³gc/kg。

通常，有此需要的受试者是哺乳动物，优选是灵长类动物，更优选是人类。一般，有此需要的受试者将表现出疾病的特征性症状。该方法通常包括通过表达治疗量的治疗性产物来改善有此需要的受试者表现出的症状。

用于体外和体内靶细胞中治疗性基因表达的基因疗法方案是本领域众所周知的，本文将不再详细讨论。简而言之，它们包括质粒DNA载体(裸露的或在脂质体中)或病毒载体的肌肉内注射、间质注射、气道内滴注、内皮应用、肝内薄壁组织施用以及静脉内或动脉内施用(例如肝内动脉、肝内静脉)。已经开发了各种装置来提高DNA对靶细胞的可进入性。虽然一种简单的方法是用含有相关载体的导管或可植入材料物理接触靶细胞，但更复杂的方法可以使用喷射注射装置等。已经使用离体和体内步骤将基因转移到哺乳动物肌肉细胞中。离体方法通常需要采集肌肉细胞，用合适的表达载体进行体外转导，然后将转导的肌细胞重新引入肌肉。体内基因转移是通过将DNA或病毒载体注射到肌肉中实现的。顺行心外膜冠状动脉输注可用于在心脏附近注射DNA或病毒载体。

根据一些优选的实施方案，上述方法可用于治疗患有上述肌肉相关疾病的受试者，例如肌营养不良或充血性心力衰竭。

定义和一般要点

虽然下文详细讨论了本发明的各种实施方案的制造和使用，但是应当理解，本发明提供了许多可应用的发明概念，这些概念可以在各种各样的具体环境中实施。本文讨论的具体实施方案仅仅是制造和使用本发明的具体方式的说明，并不限制本发明的范围。

本文包括对本发明背景的讨论以解释本发明的上下文。这并不意味着承认截至任何权利要求的优先权日，所提及的任何材料在任何国家都是公开的、已知的或公知常识的一部分。

在整个公开内容中，各种出版物、专利和公开的专利说明书通过识别性引证来引用。本说明书中引用的所有文献均整体通过引用的方式并入本文。特别地，本文特别提及的这些文献的教导或部分通过引用的方式并入本文。

除非另有说明，本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分的解释。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第三版(Sambrook等人,2001,Cold Spring Harbor,New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；美国专利号4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(Harries和Higgins编,1984)；Cultureof Animal Cells(Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Methodsin Enzymology系列(Abelson和Simon主编,Academic Press,Inc.,New York)，特别地，Vols.154-155(Wu等人编)和Vol.185，“Gene Expression Technology”(Goeddel编)；GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells(Miller和Calos编,1987,Cold Spring HarborLaboratory)；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayer和Walker编,Academic Press,London,1987)；Handbook of Experimental Immunology,Vols.I-IV(Weir和Blackwell编,1986)；和Manipulating the Mouse Embryo,(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。

为了便于理解本发明，下文定义或解释了许多术语。本文使用的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一个”、“一种”和“该”的术语不旨在仅指代单一实体，而是包括可以使用特定示例进行说明的一般类别。本文的术语用于描述本发明的特定实施方案，但是除了权利要求中概述的之外，它们的使用不限制本发明。

术语“肌肉”为技术人员所熟知。优选地，肌肉是骨骼肌(包括膈膜)或心肌。本发明的启动子可以在骨骼肌和/或心肌中具有活性。优选地，肌肉是脊椎动物的肌肉，更优选地是哺乳动物的肌肉，甚至更优选地是人类受试者的肌肉。优选地，肌肉是横纹肌。

术语“肌肉细胞”或“肌细胞”在本发明中涉及在肌肉(肌肉组织)中发现的细胞或来自肌肉组织的细胞。肌肉细胞可以是原代细胞或细胞系(如C2C12或H2K细胞(骨骼肌细胞系)或H9C2细胞(心肌细胞系))。肌肉细胞可以在体内(例如在肌肉组织中)或体外(例如在细胞培养中)。肌肉组织中发现的肌细胞通常是长管状细胞，在称为肌生成的过程中从成肌细胞发育形成肌肉。本文使用的术语肌肉细胞或肌细胞包括来自骨骼肌和心肌的肌细胞(心肌细胞)。本发明的启动子可以在骨骼肌细胞和/或心肌细胞中具有活性。

术语“顺式调控元件”或“CRE”是技术人员熟知的术语，指可以调控或调节相邻基因(即顺式)转录的核酸序列，如增强子、启动子、绝缘子或沉默子。CRE在它们调控的基因附近被发现。CRE通常通过与TF结合来调控基因转录，即它们包括TFBS。单个TF可能与许多CRE结合，因此控制许多基因的表达(多效性)。CRE通常(但不总是)位于其调控基因的转录起始位点(TSS)上游。本文上下文中的“增强子”是增强(即上调)与其可操作相关的基因的转录的CRE，并且可以在它们调控的基因的上游、下游甚至内含子中发现。多个增强子可以协同作用来调控一个基因的转录。本文上下文中的“沉默子”与结合TF(被称为阻遏物)的CRE有关，其作用是阻止或下调基因的转录。术语“沉默子”也可以指信使RNA的3’非翻译区中的区域，其结合抑制该mRNA分子翻译的蛋白质，但这种用法不同于其在描述CRE中的使用。通常，本发明的CRE是肌肉特异性或骨骼肌特异性增强子元件(通常称为肌肉特异性或骨骼肌特异性CRE，或肌肉特异性或骨骼肌特异性CRE增强子等)。在本文上下文中，优选CRE位于距转录起始位点(TSS)2500个核苷酸或更少的位置，更优选距TSS2000个核苷酸或更少的位置，更优选距TSS1500个核苷酸或更少的位置，合适地距TSS 1000、750、500、250、200、150或100个核苷酸或更少的位置。本发明的CRE优选长度相对较短，优选长度为250个核苷酸或更少，例如它们的长度可以为200、175、150、90、80、70、60或50个核苷酸或更少。本发明的CRE通常与可操作地连接的启动子元件组合提供，该元件可以是最小启动子或近端启动子；本发明的CRE增强了启动子元件的肌肉特异性或骨骼肌特异性活性。在本文公开的CRE或其功能性变体的任何组合中，一些或全部所述CRE和启动子元件可合适地在启动子中彼此相邻放置(即没有任何插入的CRE或其他调控元件)。CRE可以是连续的或非连续的(即它们可以彼此紧邻放置，或者它们可以被间隔区或其他序列分隔开)。CRE可以按任何顺序排列。在一些优选的实施方案中，CRE或其功能性变体以所述顺序提供并且彼此相邻。例如，合成的肌肉特异性调控核酸可以包含紧接在CRE0075上游的CRE0077等等。在一些实施方案中，优选地，一些或全部CRE是连续的。

术语“顺式调控模块”或“CRM”是指功能性调控核酸模块，其通常包含两个或多个CRE；在本发明中，CRE通常是肌肉特异性或骨骼肌特异性增强子，因此CRM是合成的肌肉特异性或骨骼肌特异性调控核酸。因此，在本申请中，CRM通常包括多个肌肉特异性或骨骼肌特异性CRE。通常，CRM中的多个CRE共同作用(例如，相加或协同)以增强基因的转录，该基因与包含CRM的合成启动子可操作地相关。CRM中的CRE有相当大范围的洗牌(即重新排序)、反转(即反向定位)和改变间距的空间。因此，本发明CRM的功能性变体尤其包括参考CRM的变体，其中它们中的CRE已被洗牌和/或反转和/或CRE之间的间距已被改变。

如本文所用，短语“启动子”指通常位于转录发生所需的待转录核酸序列上游的DNA区域，即启动转录的区域。启动子允许在其控制下正确激活或抑制编码序列的转录。启动子通常包含被多个TF识别和结合的特定序列。TF与启动子序列结合并导致RNA聚合酶的募集，RNA聚合酶是一种从基因编码区合成RNA的酶。本领域已知许多不同的启动子。

在一些情况下，术语“启动子”或“复合启动子”在本文中用于指启动子和额外调控元件的组合，例如紧邻转录起始位点(TSS)下游的调控序列，例如5’UTR和/或5’UTR和内含子。TSS下游的这种序列可以有助于转录和/或翻译阶段的表达调控。

如本文所用，术语“合成启动子”是指天然不存在的启动子。在本文上下文中，它通常包含与最小(或核心)启动子或肌肉特异性或骨骼肌特异性近端启动子(启动子元件)可操作地连接的本发明的CRE和/或CRM。本发明的CRE和/或CRM用于增强与合成启动子可操作地连接的基因的肌肉特异性或骨骼肌特异性转录。合成启动子的一部分可以是天然存在的(例如最小启动子或启动子中的一种或多种CRE)，但合成启动子作为一个实体不是天然存在的。

如本文所用，“最小启动子”(也称为“核心启动子”)是指通常较短的DNA片段，其本身无活性或大部分无活性，但当与其他转录调控元件结合时可介导转录。最小启动子序列可以来自各种不同的来源，包括原核和真核基因。最小启动子的实例如上所述，包括结蛋白最小启动子、多巴胺β-羟化酶基因最小启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期基因最小启动子(CMV-MP)和疱疹胸苷激酶最小启动子(MinTK)。最小启动子通常包含转录起始位点(TSS)和直接位于上游的元件、RNA聚合酶II的结合位点和一般转录因子结合位点(通常是TATA盒)。最小启动子也可能包括TSS下游的一些元件，但这些元件在缺少额外调控元件的情况下通常几乎没有功能性。

如本文所用，“近端启动子”涉及最小启动子加上至少一些额外的调控序列，通常是倾向于包含主要调控元件的基因上游的近端序列。它通常在TSS上游延伸约250个碱基对，并包括特定的TFBS。近端启动子也可能包括TSS下游的一个或多个调控元件，例如UTR或内含子。在这种情况下，近端启动子可能合适地是天然存在的肌肉特异性或骨骼肌特异性近端启动子，其可以与本发明的一种或多种CRE或CRM组合。然而，近端启动子可以是合成的。

如本文所用，“启动子元件”指如上文定义的最小启动子或近端启动子。在本发明的上下文中，启动子元件通常与一种或多种CRE组合，以提供本发明的合成肌肉特异性或骨骼肌特异性启动子。

在本发明的上下文中，CRE、CRM、启动子元件、合成启动子或其他调控核酸的“功能性变体”是参考序列的变体，其保留了以与参考序列相同的方式发挥功能的能力，例如作为肌肉特异性或骨骼肌特异性CRE、肌肉特异性或骨骼肌特异性CRM或肌肉特异性或骨骼肌特异性启动子。这些功能性变体的替代术语包括“生物等效物”或“等效物”。

应当理解，给定CRE、CRM、启动子或其他调控序列作为肌肉特异性或骨骼肌特异性增强子发挥功能的能力显著取决于该序列与和参考序列结合的相同肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性TF的结合能力。因此，在大多数情况下，CRE或CRM的功能性变体将包含与参考CRE、CRM或启动子相同的大部分或全部TF的TFBS。优选但非必要的是，功能性变体的TFBS与参考CRE、CRM或启动子处于相同的相对位置(即顺序和一般位置)。同样优选但非必要的是，功能性变体的TFBS与参考序列的方向相同(应注意，TFBS在某些情况下可以反向存在，例如作为与参考序列中的序列相对的反向互补物)。同样优选但非必要的是，功能性变体的TFBS与参考序列位于同一条链上。因此，在优选的实施方案中，功能性变体包含与参考序列处于相同顺序、相同位置、相同方向和位于相同链上的相同TF的TFBS。还将认识到位于TFBS之间的序列(在某些情况下称为间隔区序列等)对CRE或CRM的功能不太重要。这种序列通常可以有相当大的变化，并且它们的长度可以改变。然而，在优选实施方案中，功能性变体中的间距(即相邻TFBS之间的距离)与参考序列中的间距基本相同(例如，其变化不超过20％，优选不超过10％，更优选大致相同)。显而易见的是，在某些情况下，CRE的功能性变体可以反向存在，例如，它可以是上述CRE的反向互补物或其变体。

功能性变体和参考序列之间的序列同一性水平也可以作为保留功能性的指标。CRE、CRM或启动子的TFBS中的高水平序列同一性通常比间隔区序列中的序列同一性更重要(间隔区序列中几乎不需要或不需要任何序列保守性)。然而，应该理解，即使在TFBS内，也可以适应相当程度的序列变异，只要功能性TFBS的序列不需要完全匹配共有序列。

一种或多种TF与给定功能性变体中的TFBS结合的能力可以通过本领域已知的任何相关方法来确定，包括但不限于电泳迁移率变动分析(EMSA)、结合分析、染色质免疫沉淀(ChIP)和ChIP测序(ChIP-seq)。在一个优选的实施方案中，一种或多种TF结合给定功能性变体的能力通过EMSA来确定。进行EMSA的方法在本领域中是众所周知的。上文引用的Sambrook等描述了合适的方法。许多描述该步骤的相关文章是可用的，例如Hellman和Fried,Nat Protoc.2007；2(8):1849–1861。

“肌肉特异性”或“肌肉特异性表达”是指与其他组织(例如肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肺和脑)相比，顺式调控元件、顺式调控模块或启动子以优先或主导方式增强或驱动基因在肌肉细胞(或肌肉源细胞)中表达的能力。基因的表达可以是mRNA或蛋白质的形式。在优选的实施方案中，肌肉特异性表达使得在其他(即非肌肉)组织或细胞中的表达可以忽略不计，即表达是高度肌肉特异性的。例如，与其他细胞相比，在肌肉细胞中的表达为至少75％、80％、85％、90％或95％。“心肌特异性”或“心肌特异性表达”是指与其他组织(例如脾脏、肝脏、肺和脑)相比和与骨骼肌组织相比，顺式调控元件、顺式调控模块、启动子元件或启动子以优先或主导方式增强或驱动基因在心肌中表达的能力。“骨骼肌特异性”或“骨骼肌特异性表达”是指与其他组织(例如脾脏、肝脏、肺和脑)相比和与心肌组织相比，顺式调控元件、顺式调控模块、启动子元件或启动子以优先或主导方式增强或驱动基因在骨骼肌中表达的能力。可能存在需要较低程度特异性的情况，这也是本发明的一部分。

技术人员可以容易地评估CRE、CRM或启动子作为肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性CRE、CRM或启动子发挥功能的能力。因此，技术人员可以容易地确定上述特定CRE、CRM或启动子的任何变体是否保持功能性(即它是如上定义的功能性变体)。例如，待评估的任何给定CRM可以与最小启动子(例如位于CMV-MP的上游)可操作地连接，并且测量顺式调控元件驱动基因(通常为报告基因)的肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性表达的能力。或者，可以将CRE或CRM的变体取代到合成的肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性启动子中，以代替参考CRE或CRM，并且可以确定由所述修饰的启动子驱动的对肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性表达的影响，并与未修饰的形式进行比较。类似地，技术人员可以容易地评估启动子驱动肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性表达的能力(例如，如以下实施例中所述)。由参考启动子变体驱动的基因表达水平可以与由参考启动子驱动的表达水平进行比较。在一些实施方案中，当由变体启动子驱动的肌肉特异性或骨骼肌特异性表达水平为由参考启动子驱动的表达水平的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％时，可以说变体保留功能性。可以容易地构建用于评估肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性表达增强的合适的核酸构建体和报告子测定法，下文列出的实施例给出了合适的方法。

可以鉴定肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性，其中基因(例如治疗性或报告基因)的表达优先或主要发生在肌源细胞或骨骼肌中。例如，当肌源的、心肌特异性的或骨骼肌源的细胞中的表达水平显著高于其他类型的细胞(即非肌源的细胞、非心肌特异性的或非骨骼肌源的细胞)时，可以定义为优先或主要表达。例如，在肌源的、心肌特异性的或骨骼肌源的细胞中的表达合适地比在非肌肉细胞、非心肌特异性的或非骨骼肌细胞中的表达高至少5倍，优选比在非肌肉细胞或非骨骼肌细胞中的表达高至少10倍，并且在某些情况下可以高50倍或更多。为方便起见，合适地，肌肉特异性表达可通过将肌肉细胞系(例如肌源的细胞系，如C2C12或H2K细胞(骨骼肌)或H9C2细胞(心脏))中的表达水平与肝源的细胞系(例如Huh7或HepG2)、肾源的细胞系(例如HEK-293)、颈部组织源的细胞系(例如HeLa)和/或肺源的细胞系(例如A549)中的表达水平进行比较来证明。合适地，心肌特异性表达可通过将心肌细胞系(例如心肌源的细胞系，如H9C2)或原代心肌细胞中的表达水平与肝源的细胞系(例如Huh7或HepG2)、肾源的细胞系(例如HEK-293)、颈部组织源的细胞系(例如HeLa)、肺源的细胞系(例如A549)和/或骨骼肌源细胞(例如C2C12或H2K)中的表达水平进行比较来证明。合适地，骨骼肌特异性表达可通过将骨骼肌源细胞(例如C2C12或H2K)或原代骨骼肌细胞中的表达水平与肝源的细胞系(例如Huh7或HepG2)、肾源的细胞系(例如HEK-293)、颈部组织源的细胞系(例如HeLa)、肺源的细胞系(例如A549)和/或心肌细胞系(例如H9C2)中的表达水平进行比较来证明。

当与非组织特异性启动子(如CMV-IE)相比时，本发明的合成肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性启动子优选在非肌源的细胞中表现出降低的表达，合适地在Huh7、HEK-293、HeLa和/或A549细胞中。本发明的合成肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性启动子优选在非肌源的细胞(合适地在Huh7、HEK-293、HeLa和/或A549细胞中)中具有CMV-IE启动子的50％或更低的活性，合适地为25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低、5％或更低或1％或更低。通常，优选在非肌肉源细胞中的表达最小化，但在某些情况下这可能不是必需的。即使本发明的合成启动子在例如一种或两种非肌肉细胞中具有更高的表达，只要它通常在一系列肌肉细胞中相对于非肌肉细胞具有更高的总体表达，它仍然可以是肌肉特异性启动子。在一些实施方案中，与非肌肉细胞相比，肌肉特异性启动子在肌肉细胞中表达的基因高至少25％、或至少35％、或至少45％、或至少55％、或至少65％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或25％-95％之间的任何整数。

本发明的合成肌肉特异性启动子优选适于促进受试者肌肉中的表达，例如驱动转基因的肌肉特异性表达，优选治疗性转基因。本发明的合成骨骼肌特异性启动子优选适于促进受试者骨骼肌中的表达，例如驱动转基因的骨骼肌特异性表达，优选治疗性转基因。本发明优选的合成肌肉特异性启动子适于促进肌肉特异性转基因表达，并且在肌肉细胞中的活性为CBA启动子活性的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％或400％。在一些实施方案中，本发明的合成肌肉特异性启动子适于以CBA启动子活性的至少100％的水平，优选CBA或SPc5-12启动子活性的150％、200％、300％或500％的水平促进肌肉特异性转基因表达。在一些实施方案中，本发明的合成骨骼肌特异性启动子适于以Tnnt2或Myl2启动子活性的至少100％的水平，优选SPc5-12启动子活性的150％、200％、300％或500％的水平促进骨骼肌特异性转基因表达。合适地，这种肌肉特异性表达在肌源细胞中确定，例如C2C12或H2K细胞(骨骼肌)或H9C2细胞(心脏)或原代肌肉细胞(合适地，原代人类肌细胞)。

本发明的合成肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性启动子还能够以与肌源细胞(例如C2C12或H2K细胞(骨骼肌)或H9C2细胞(心脏))中的CMV-IE相比至少50％、100％、150％或200％的水平促进基因的肌肉特异性或骨骼肌特异性表达。

本文使用的术语“核酸”通常指基本上由核苷酸组成的任何长度的寡聚体或聚合物(优选线性聚合物)。核苷酸单位通常包括杂环碱基、糖基和至少一个(例如一个、两个或三个)磷酸基团，包括修饰或取代的磷酸基团。杂环碱基尤其可以包括嘌呤和嘧啶碱基，例如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，它们广泛存在于天然存在的核酸、其他天然存在的碱基(例如黄嘌呤、肌苷、次黄嘌呤)以及化学或生物化学修饰的(例如甲基化的)、非天然或衍生的碱基中。糖基尤其可以包括戊糖(戊呋喃糖)基团，如优选天然存在的核酸中常见的核糖和/或2-脱氧核糖，或阿拉伯糖、2-脱氧阿拉伯糖、苏糖或己糖糖基，以及修饰或取代的糖基。本文所指的核酸可包括天然存在的核苷酸、修饰的核苷酸或其混合物。修饰的核苷酸可以包括修饰的杂环碱基、修饰的糖部分、修饰的磷酸基团或其组合。可以引入磷酸基团或糖的修饰以改善稳定性、抗酶降解性或一些其他有用的性质。术语“核酸”进一步优选包含DNA、RNA和DNA RNA杂交分子，具体包括hnRNA、前mRNA、mRNA、cDNA、基因组DNA、扩增产物、寡核苷酸和合成的(例如化学合成的)DNA、RNA或DNA RNA杂交体。核酸可以是天然存在的，例如存在于自然界中或从自然界中分离出来的；或者可以是非天然存在的，例如重组的，即通过重组DNA技术产生的，和/或部分或全部化学或生物化学合成的。“核酸”可以是双链的、部分双链的或单链的。在单链的情况下，核酸可以是有义链或反义链。此外，核酸可以是环状或线性的。

当提及核酸时，“分离的”是指整体或部分缺乏自然界中通常与之相关的序列的核酸分子；或天然存在的序列，但具有与之相关的异源序列；或者从染色体上分离的分子。

术语“同一性”和“相同的”等是指两个聚合分子之间的序列相似性，例如两个核酸分子之间，如两个DNA分子之间的序列相似性。序列比对和序列同一性的确定可以使用例如最初由Altschul等人1990(J Mol Biol 215:403-10)描述的基本局部比对搜索工具(BLAST)进行，例如由Tatusova和Madden 1999(FEMS Microbiol Lett 174:247-250)描述的“Blast 2序列”算法。

比对序列进行比较的方法是本领域众所周知的。各种程序和比对算法在以下文献中描述，例如：Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins and Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang et al.(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson et al.(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana et al.(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50。对序列比对方法和同源性计算的详细考虑可以在例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10中找到。

国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLAST^TM；Altschul等人(1990))可从多个来源获得，包括国家生物技术信息中心(Bethesda，MD)和互联网，用于与多个序列分析程序结合使用。关于如何使用该程序确定序列同一性的说明可在互联网上BLAST^TM的“帮助”章节找到。为了比较核酸序列，可以使用默认参数使用Blast^TM(Blastn)程序的“Blast 2序列”功能。当用这种方法评估时，与参考序列具有更大相似性的核酸序列将显示出增加的同一性百分比。通常，序列同一性百分比是在整个序列长度上计算的。

例如，合适地，用以下评分参数通过Needleman-Wunsch算法建立全局最佳比对：匹配评分：+2，错配评分：-3；空位罚分：空位产生(gap open)5，空位延伸2。合适地，所得最佳全局比对的同一性百分比可通过比对碱基数与比对总长度的比值乘以100来计算，其中比对长度包括匹配和错配。

术语“杂交”是指在杂交过程中与两个至少部分互补的核苷酸序列退火。为了允许杂交发生，互补核酸分子通常被热变性或化学变性以将双链解链成两条单链和/或从单链核酸中去除发夹或其他二级结构。杂交的严格性受到诸如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成等条件的影响。常规杂交条件描述于例如Sambrook(2001)Molecular Cloning:aLaboratory manual，第三版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York，但是熟练的技术人员将会理解，可以根据核酸序列的已知的或预期的同源性和/或长度来设计许多不同的杂交条件。杂交的高度严格条件包括高温和/或低钠/盐浓度(盐包括例如NaCl和柠檬酸钠中的钠)和/或在杂交缓冲液中包含甲酰胺和/或降低杂交缓冲液中化合物如SDS(十二烷基硫酸钠去污剂)的浓度和/或从杂交缓冲液中排除化合物如硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促进分子聚集)。作为非限制性实例，用于严格杂交的代表性盐和温度条件是：1xSSC，0.5％SDS，65℃。缩写SSC是指核酸杂交溶液中使用的缓冲液。1升20X(浓缩20倍)储备SSC缓冲溶液(pH 7.0)含有175.3g氯化钠和88.2g柠檬酸钠。实现杂交的代表性时间段是12小时。

术语“转录因子结合位点”(TFBS)在本领域是众所周知的。对技术人员来说显而易见的是，可以使用替代的TFBS序列，条件是它们被预期的TF结合。本文公开的各种TFBS的共有序列是本领域已知的，技术人员可以容易地使用该信息来确定替代的TFBS。此外，技术人员可以通过实验容易地确定TF结合给定推定序列的能力(例如，通过EMSA和本领域熟知和本文讨论的其他方法)。

“共有序列”的含义是本领域众所周知的。在本申请中，以下符号用于共有序列，除非上下文另有说明。考虑以下示例性DNA序列：

A[CT]N{A}YR

A表示A总是出现在那个位置；[CT]代表该位置上为C或T；N代表该位置为任何碱基；而{A}表示在该位置发现除A以外的任何碱基。Y代表任何嘧啶，R表示任何嘌呤。

本申请中的“合成的”是指自然界中不存在的核酸分子。本发明的合成核酸是人工生产的，通常通过重组技术或从头合成。此类合成核酸可包含天然存在的序列(例如启动子、增强子、内含子和其他此类调控序列)，但这些序列存在于非天然存在的环境中。例如，合成基因(或基因的一部分)通常包含一个或多个本质上不连续的核酸序列(嵌合序列)，和/或可以包含取代、插入和缺失及其组合。

本文所用的“互补”或“互补性”是指两个核酸序列的沃森-克里克碱基配对。例如，序列5′-AGT-3′与互补序列3′-TCA-5′结合。两个核酸序列之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些碱基与其互补物结合，或者它可以是完全的，如序列中的每个碱基都与其互补碱基结合。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。

本申请中的“转染”泛指将核酸有意引入细胞的任何过程，包括病毒和非病毒载体的引入，并包括或等同于转化、转导以及类似术语和过程。实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔(Fromm等人(1986)Nature 319:791-3)；脂质体转染(Feigner等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7)；显微注射(Mueller等人(1978)Cell 15:579-85)；农杆菌介导的转移(Fraley et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)；DNA直接摄取；晶须介导的转化；和微粒轰击(Klein等人(1987)Nature 327:70)。

如本文所用，短语“转基因”指外源核酸序列。在一个实例中，转基因是编码工业或药学上有用的化合物的基因，或编码所需性状的基因。在另一个实例中，转基因编码有用的核酸，如反义核酸序列，其中反义核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。转基因优选编码治疗性产物，例如蛋白质。

术语“载体”在本领域中是众所周知的，如本文所用，是指核酸分子，例如双链DNA，其中可能插入了根据本发明的核酸序列。合适地，载体用于将插入的核酸分子转运到合适的宿主细胞中。载体通常包含使插入核酸分子转录的所有必需元件，并且优选将转录物翻译成多肽。载体通常包含所有必需的元件，使得一旦载体在宿主细胞中，载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA一致地复制；可以产生载体及其插入的核酸分子的几个拷贝。本发明的载体可以是游离基因的载体(即其不整合到宿主细胞基因组中)，或者可以是整合到宿主细胞基因组中的载体。这一定义包括非病毒载体和病毒载体。非病毒载体包括但不限于质粒载体(例如pMA-RQ、pUC载体、bluescript载体(pBS)和pBR322或其缺乏细菌序列的衍生物(微环))、基于转座子的载体(例如PiggyBAC(PB)载体或Sleeping Beauty(SB)载体)等。更大的载体如人工染色体(细菌(BAC)、酵母(YAC)或人类(HAC))可用于容纳更大的插入物。病毒载体来源于病毒，包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、腺病毒、疱疹病毒、肝炎病毒载体等。通常，但不是必须地，病毒载体是复制缺陷型的，因为它们已经失去了在给定细胞中繁殖的能力，因为复制所必需的病毒基因已经从病毒载体中消除。然而，一些病毒载体也可适于在给定细胞(例如癌细胞)中特异性复制，并通常用于触发(癌)细胞特异性(肿瘤)裂解。病毒体是包含病毒和非病毒元件的载体的非限制性实例，特别是它们将脂质体与灭活的HIV或流感病毒结合(Yamada等人,2003)。另一个实例包换与阳离子脂质混合的病毒载体。

本文使用的术语“可操作地连接”、“可操作地相连”或等同表达是指各种核酸元件相对于彼此的排列，使得这些元件功能性地连接并且能够以预期的方式彼此相互作用。这些元件可以包括但不限于合成启动子、CRE(例如增强子或其他调控元件)、CRM、启动子元件、多聚腺苷酸化序列、一个或多个内含子和/或外显子以及待表达的目的基因的编码序列。当正确定向或可操作地连接时，核酸序列元件一起发挥作用以调节彼此的活性，并最终可能影响表达产物的表达水平。调节是指增加、降低或维持特定元件的活性水平。每个元件相对于其他元件的位置可以用每个元件的5’末端和3’末端或它们在另一个元件或位置(如TSS或启动子元件)上游或下游的位置来表示，任何特定元件之间的距离可以参考元件之间插入的核苷酸或碱基对的数量。如技术人员所理解的，可操作地连接意味着功能活性，并且不一定与天然的位置连接相关。事实上，当用于核酸表达盒时，CRE通常紧邻启动子元件的上游(虽然通常是这种情况，但绝对不应该解释为限制或排除核酸表达盒内的位置)，但在体内不一定是这种情况，例如，天然存在于其转录受影响的基因下游的调控元件序列在位于启动子上游时能够以相同的方式起作用。因此，根据一个具体实施方案，调控元件的调节或增强作用可以是位置无关的。

本文使用的“间隔区序列”或“间隔区”是分开两个功能性核酸序列(例如TFBS、CRE、CRM、启动子元件等)的核酸序列。它基本上可以具有任何序列，只要它不阻止功能性核酸序列(例如顺式调控元件)按预期发挥功能(例如，如果它包括沉默子序列、阻止所需转录因子的结合等，这可能会发生)。通常，它是无功能的，因为它的存在只是为了将相邻的功能性核酸序列彼此隔开。在一些实施方案中，间隔区可以具有75、50、40、30、30或10个核苷酸或更少的长度。在一些实施方案中，一个或多个间隔区可以是一种或多种限制性酶的识别位点。

本文使用的术语“药学上可接受的”与本领域一致，是指与药物组合物的其他成分相容且对其接受者无害。

“治疗有效量”和类似短语是指在受试者中提供期望的特定药理学效果(例如在肌肉中表达治疗基因)的剂量或血浆浓度。治疗有效量并不总是能有效治疗本文所述的病况，即使本领域技术人员认为这种剂量是治疗有效量。治疗有效量可以根据施用途径和剂型、受试者的年龄和体重和/或所治疗的疾病或病况而变化。

本文使用的术语“AAV载体”是本领域众所周知的，通常指包括各种核酸序列的AAV载体核酸序列。本文所用的AAV载体通常包含非AAV来源的异源核酸序列作为载体的一部分。该异源核酸序列通常包含本文公开的启动子以及用于细胞遗传转化的其他目的序列。通常，异源核酸序列的侧翼至少有一个，通常两个AAV反向末端重复序列(ITR)。“AAV病毒体”或“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳多肽(包括变体AAV衣壳多肽和非变体亲本衣壳多肽)和有包膜的多核苷酸AAV载体组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源核酸(即不同于野生型AAV基因组的多核苷酸，如将被递送至哺乳动物细胞的转基因)，则它可被称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV病毒体或AAV颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，因为这种载体包含在AAV病毒体或AAV颗粒内。

“小干扰”或“短干扰RNA”或siRNA是靶向目的基因(“靶基因”)的核苷酸的RNA双链体。“RNA双链体”是指通过RNA分子的两个区域之间互补配对形成的结构。siRNA“靶向”基因，siRNA双链体部分的核苷酸序列与靶向基因的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，siRNA双链体的长度小于30个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度可以是29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为19-25个核苷酸。siRNA的RNA双链体部分可以是发夹结构的一部分。除了双链体部分，发夹结构还可以包含位于形成双链体的两个序列之间的环部分。环的长度可以变化。在一些实施方案中，环的长度为5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。发夹结构也可以包含3’或5’突出端部分。在一些实施方案中，突出端是长度为0、1、2、3、4或5个核苷酸的3’或5’突出端。

如本文所用，术语“microRNA”指任何类型的干扰RNA，包括但不限于内源性microRNA和人工microRNA(例如，合成的microRNA)。内源性microRNA是基因组中天然编码的小RNA，能够调节mRNA的生产性利用。除了内源性microRNA之外，人工microRNA可以是能够调节mRNA活性的任何类型的RNA序列。microRNA序列可以是由任何一个或多个这些序列组成的RNA分子。microRNA(或“miRNA”)序列已在以下出版物中描述，如Lim等人,2003,Genes&Development,17,991-1008，Lim等人,2003,Science,299,1540，Lee和Ambrose,2001,Science,294,862，Lau等人,2001,Science 294,858-861，Lagos-Quintana等人,2002,Current Biology,12,735-739，Lagos-Quintana等人,2001,Science,294,853-857和Lagos-Quintana等人,2003,RNA,9,175-179。microRNA的实例包括较大RNA的任何RNA片段或者是miRNA、siRNA、stRNA、sncRNA、tncRNA、snoRNA、smRNA、shRNA、snRNA或其他小的非编码RNA。参见，例如美国专利申请20050272923、20050266552、20050142581和20050075492。“microRNA前体”(或“pre-miRNA”)是指具有茎环结构的核酸，其中掺入了microRNA序列。“成熟microRNA”(或“成熟miRNA”)包括从microRNA前体(“pre-miRNA”)裂解的microRNA，或合成的microRNA(例如，在实验室中通过无细胞合成而合成的)，并且具有约19个核苷酸至约27个核苷酸的长度，例如，成熟microRNA可以具有19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt或27nt的长度。成熟的microRNA可以与靶mRNA结合并抑制靶mRNA的翻译。

术语“治疗”是指减少、改善或消除疾病或病况的一种或多种体征、症状或影响。因此，本文所用的“治疗”包括对哺乳动物(尤其是人类)疾病的任何治疗，包括：(a)预防易患该疾病或有患该疾病风险但尚未被诊断为患有该疾病的受试者发生该疾病；(b)抑制疾病，即阻止该疾病的发展；和(c)缓解该疾病，即引起该疾病消退。

向受试者“施用”药剂包括向受试者引入或递送药剂以实现其预期功能的任何途径。施用可以通过任何合适的途径进行，包括口服、鼻内、眼内、眼部、胃肠外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)或局部。可以通过顺行心外膜冠状动脉输注施用。施用包括自我施用和由他人施用。肌肉内施用在本发明中特别受关注。

术语“个体”、“受试者”和“患者”可互换使用，是指患有需要治疗的疾病或病况的任何个体受试者。出于本公开的目的，受试者可以是灵长类动物，优选人，或另一种哺乳动物，如狗、猫、马、猪、山羊或牛等。

实施例

通过将根据本发明某些实施方案的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子可操作地连接至报告基因荧光素酶来测试它们的强度。将包含待测试的肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子和荧光素酶基因的表达盒插入到合适的质粒中，然后转染到细胞中，以检测这些细胞中来自启动子的表达。

实施例1-体外检测

材料与方法

将DNA制品转染到H9C2(大鼠BDIX心脏成肌细胞系，可从ATCC获得)中以评估转录活性。使用H9C2细胞系是因为先前的实验表明它是体内骨骼肌和心肌活性的良好预测因子。DNA制品包含与荧光素酶可操作地连接的合成启动子(例如SP0500)。

H9C2细胞培养和转染

H9C2是大鼠BDIX心脏成肌细胞系。它们具有心肌特性，例如融合时形成的肌管对乙酰胆碱有反应。

细胞维持

H9C2细胞在T-75烧瓶中在含有1％FBS(热灭活-Gibco 10270-106，批号42G2076K)、1％Glutamax(35050-038，Gibco)、1％青霉素-链霉素溶液(15140-122，Gibco)的DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma)中培养。细胞在亚融合阶段(70-80％)传代以避免细胞融合并融合形成肌管的风险。

为了在细胞维持期间传代，去除培养基，用不含CaCl₂和MgCl₂的5ml DPBS(14190-094，Gibco)洗涤细胞两次。通过用1ml胰蛋白酶EDTA(25200-056，Gibco)孵育约5分钟，从烧瓶中分离细胞。然后，向烧瓶中加入4ml培养基，轻轻上下吸取混合物以帮助细胞从烧瓶表面脱离。细胞以100g沉淀3分钟。处理上清液并将细胞重悬于3ml培养基中。在Countess自动化细胞计数器上计数细胞，以1:3至1:10接种，即每平方厘米接种1-3x10,000个细胞，并在37℃5％CO₂下孵育。

细胞转染和分化

如上所述，通过用DPBS洗涤、用1ml胰蛋白酶EDTA从烧瓶中分离、用4ml培养基从烧瓶表面洗去并在100g下沉淀3分钟，从两个大约70-80％融合的T-75烧瓶中收集H9C2细胞。将细胞重悬于45ml培养基中，并以40,000细胞/孔的密度接种于48孔平底板(300μl/孔)(353230，Corning)中。48孔板中的细胞在37℃5％CO₂下孵育。

24小时后，将细胞上的培养基更换为300μl无抗生素培养基(即含有1％FBS(热灭活-Gibco 10270-106，批号42G2076K)、1％Glutamax(35050-038，Gibco)的DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma)。用viafect(E4981，Promega)以每孔30μl的总复合体积转染每孔300ng的DNA。转染后轻轻混合平板，并在37℃5％CO₂下孵育。

24小时后，从转染的细胞中取出培养基，并用300μl分化培养基代替，所述分化培养基由DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma)、1％Glutamax(35050-038，Gibco)、1％FBS(热灭活-Gibco 10270-106，批号42G2076K)、1％青霉素/链霉素溶液(15140-122，Gibco)和0.1％视黄酸(Sigma-R2625)组成。将平板在37℃5％CO₂下孵育7天以诱导分化。分化后，观察细胞形态以确认分化为肌管。

然后用500μl DPBS洗涤细胞，并用100μl荧光素酶细胞培养裂解5X试剂(E1531，Promega)裂解细胞，所述试剂用Milli-Q水稀释至1X。上下吸取细胞裂解试剂10次，然后在中等功率下涡旋平板30分钟以促进细胞裂解。在完成荧光素酶测定之前，将平板密封并储存在-80℃下。H9C2细胞转染后从荧光素酶测定中收集的数据是基于一次生物重复的三次技术重复的。

荧光素酶活性的测量

-使用LARII(双荧光素酶报告子1000测定系统，Promega，E1980)测量荧光素酶活性。

-转染后24小时，从细胞中去除培养基。

-细胞在300μl DPBS中洗涤一次。

-使用100μl被动裂解缓冲液裂解细胞，并摇动孵育15分钟。

-通过在台式离心机中以最大速度使平板离心1min来沉淀细胞碎片。

-将10μl样品转移到白色96孔板中，通过在BMG Labtech FLUOstar Omega酶标仪上注射50μl LARII底物来测量发光。

这些细胞培养产生的结果如图1所示。该图显示合成启动子SP0500、SP0510、SP0514和SP0519在肌肉细胞系H9C2中显示出良好的活性。本文描述的其他类似启动子预计具有相同或更好的性能。

实施例2-体外数据

实验按照以上实施例1中的详细描述进行。然而，本实施例中从H9C2细胞转染后的荧光素酶测定中收集的数据是基于三次生物重复的，每次生物重复是三次技术重复的平均值。

这些细胞培养产生的结果如图2所示，结果相对于CBA进行标准化。该图显示合成启动子SP0497、SP0500、SP0501、SP0506、SP0508、SP0510、SP0514、SP0519、SP0520、SP0521和SP4169在肌肉细胞系H9C2中显示出良好的活性。启动子SP0498、SP0499、SP0502、SP0503、SP0504、SP0505、SP0507、SP0509、SP0511、SP0512、SP0513、SP0515、SP0516、SP0517、SP0518、SP0522、SP0523和SP0524也在H9C2细胞系中进行了实验性检测，但显示出较低的活性(数据未显示)。

实施例3-体内数据

选择的合成肌肉特异性启动子在体内进行了检测，参见例如图3-18。

材料与方法

将包含可操作地连接至荧光素酶的合成启动子(例如：SP0500、SP0507、SP0514、SP0518、SP0519、SP0522和SP0524)的AAV稀释在0.9％盐水中，并通过尾静脉注射以每只小鼠1e¹¹vg/200μl(每组6只小鼠)的剂量递送给8周龄雄性Balb/c小鼠。注射后6周处死小鼠。从每只小鼠收集膈膜、心脏、四头肌、比目鱼肌、胫骨前肌(TA)和肝脏。对于载体拷贝数(VCN)分析，解剖后立即在液氮中快速冷冻样品，并储存在-80℃下。

按照制造商的说明，提取蛋白质并使用BCA Pierce蛋白测定试剂盒(ThermoFisher 23225)对蛋白质进行定量。

荧光素酶定量通过ONE-Glo荧光素酶测定系统(Promega E6120)进行。

提取DNA，在室温下孵育所有样品和试剂，直到完全解冻并达到平衡温度。所有样品和试剂在使用前充分混合。向每个样品中加入等体积的ONE-GloTM试剂，并彻底混合样品。3分钟后，为了确保细胞完全裂解，在光度计中测量样品。

载体拷贝数通过双重Taqman qPCR进行测量。使用血液和组织试剂盒(250)(QIAGEN，目录号#69506)提取DNA。使用荧光素酶和GAPDH特异性引物和探针组对每个样品进行Taqman qPCR：/>

标准曲线用于Luc和GAPDH的分析目的。在多重qPCR方案中，使用以下最终浓度的试剂和DNA：Luc2 fw引物(350nM)、Luc2 RV引物(350nM)、mGapdH FW引物(350nM)、mGapdHRV引物(350nM)、Luc2探针(250nM)、mGapdH探针(250nM)和DNA(10ng/uL)。PCR循环方案如下：95C-20秒，PCR：40次循环，95C-1秒，60C-20秒。通过减去生理盐水样品(阈值)的每基因组的平均VCN(数量)来计算每基因组的ΔΔCt VCN(数量)。

结果

如图12所示，合成的肌肉特异性启动子SP0500在心肌(心脏)中表现出高活性。此外，SP0500在骨骼肌(例如TA、四头肌和膈膜)中显示出活性。

如图13所示，合成的肌肉特异性启动子SP0507在骨骼肌(例如TA)和心肌(心脏)中显示出活性。

如图14所示，合成的肌肉特异性启动子SP0514在心肌(心脏)中显示出活性。此外，SP0514在骨骼肌(例如膈膜和TA)中显示出一些活性。

如图15所示，合成的肌肉特异性启动子SP0518在骨骼肌(例如TA)中显示出活性。此外，SP0518在心肌中显示出一些活性。

如图16所示，合成的肌肉特异性启动子SP0519在骨骼肌(例如TA)中显示出活性。此外，SP0519在心肌中显示出一些活性。

如图17所示，合成的肌肉特异性启动子SP0522在心肌(心脏)中显示出高活性。此外，SP0522在骨骼肌(例如TA和膈膜)中显示出活性。

如图18所示，合成的肌肉特异性启动子SP0524在心肌(心脏)中和在骨骼肌(例如TA、膈膜和四头肌)中显示出高活性。

如图3所示，与对照启动子CMV和CK8相比，合成的肌肉特异性启动子SP0524在膈膜中显示出相当或更高的活性。合成的肌肉特异性启动子SP500、SP0518和SP0522在膈膜中显示出与CK7相当或更高的活性。

如图4所示，合成的肌肉特异性启动子SP0524在TA中显示出与对照启动子CMV、CK7和CK8相似的活性。

如图5所示，与对照启动子CK8、CMV和CK7相比，合成的肌肉特异性启动子SP500、SP0522和SP0524在心脏中显示出相当或更高的活性。

如图6所示，与对照启动子CK8、CMV和CK7相比，所有检测的合成启动子在四头肌中显示出较低的活性。

如图7所示，与对照启动子CK8和CMV相比，合成的肌肉特异性启动子SP0524在比目鱼肌中显示出相当或更高的活性。与对照启动子CK7相比，合成的肌肉特异性启动子SP0500和SP0522显示出相当或更高的活性。

如图8所示，与对照启动子CK8和CMV相比，检测的合成肌肉特异性启动子SP500、SP0507、SP0514、SP0518、SP0519、SP0522和SP0524在肝脏中显示出较低或相似的活性。

参考文献

Llanga,T.et al.(2017)‘Structure-Based Designed Nano-DysferlinSignificantly Improves Dysferlinopathy in BLA/J Mice’,MolecularTherapy.Elsevier Ltd.,25(9),pp.2150–2162.doi:10.1016/j.ymthe.2017.05.013。

序列信息

表1-肌肉特异性合成启动子

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表2-来自表1的合成启动子的CRM

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表3-来自表1的合成启动子的CRE

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表4-来自表1的合成启动子的启动子元件

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表5–根据本发明实施方案的肌肉特异性合成启动子的示意性代表，显示了顺式调控元件和启动子元件

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Claims (23)

1.一种合成的肌肉特异性启动子，其包含：

a)根据SEQ ID NO:1-29、66中任一项的序列或其功能性变体；或

b)顺式调控模块(CRM)，其包含根据SEQ ID NO:30-47中任一项的序列或其功能性变体。

2.根据权利要求1a)所述的合成的肌肉特异性启动子，其包含与SEQ ID NO:1-29、66中任一项至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。

3.根据权利要求1b)所述的合成的肌肉特异性启动子，其中所述CRM包含与SEQ ID NO:30-47中任一项至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。

4.根据权利要求3所述的合成的肌肉特异性启动子，其包含与启动子元件可操作地连接的如上所述的CRM。

5.根据前述权利要求中任一项所述的合成的肌肉特异性启动子，其中所述功能性变体保留了参考启动子的至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的活性。

6.一种肌肉特异性顺式调控元件(CRE)，其包含根据SEQ ID NO:48-61、67中任一项的序列或其任何功能性变体。

7.根据权利要求6所述的肌肉特异性CRE，其包含与SEQ ID NO:48-61、67中任一项至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。

8.一种合成的肌肉特异性启动子，其包含根据权利要求6或7所述的CRE。

9.一种分离的最小或近端启动子，其包含根据SEQ ID NO:62-65、68中任一项的序列或其功能性变体。

10.根据权利要求9的分离的最小或近端启动子，其包含与SEQ ID NO:62-65、68至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。

11.一种合成的肌肉特异性启动子，其包含根据权利要求9或10所述的最小或近端启动子。

12.一种表达盒，其包含与编码表达产物的序列可操作地连接的根据权利要求1至5、8和11中任一项所述的合成的肌肉特异性启动子。

13.一种载体，其包含根据权利要求1至5、8和11中任一项所述的合成的肌肉特异性启动子或根据权利要求12所述的表达盒。

14.根据权利要求13所述的载体，其是AAV载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体。

15.一种病毒体，其包含根据权利要求14所述的载体。

16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至5、8和11中任一项所述的合成的肌肉特异性启动子、根据权利要求12所述的表达盒、根据权利要求13或14所述的载体或根据权利要求15所述的病毒体。

17.根据权利要求1至5、8和11中任一项所述的合成的肌肉特异性启动子、根据权利要求12所述的表达盒、根据权利要求13或14所述的载体、根据权利要求15所述的病毒体或根据权利要求16所述的药物组合物，其用于治疗。

18.一种细胞，其包含根据权利要求1至5、8和11中任一项所述的合成的肌肉特异性启动子、根据权利要求12所述的表达盒、根据权利要求13或14所述的载体、根据权利要求15所述的病毒体。

19.根据权利要求1至5、8和11中任一项所述的合成的肌肉特异性启动子、根据权利要求12所述的表达盒、根据权利要求13或14所述的载体、根据权利要求15所述的病毒体或根据权利要求16所述的药物组合物，其用于制造用于治疗医学病况或疾病的药物组合物。

20.一种用于产生表达产物的方法，所述方法包括在肌肉细胞中提供根据权利要求12所述的合成肌肉特异性表达盒，并表达存在于合成肌肉特异性表达盒中的基因。

21.一种在肌肉细胞中表达治疗性转基因的方法，所述方法包括将根据权利要求12所述的合成肌肉特异性表达盒、根据权利要求13或14所述的载体、根据权利要求15所述的病毒体引入肌肉细胞。

22.一种治疗有此需要的受试者的方法，优选人类，所述方法包括：

向受试者施用根据权利要求12所述的表达盒、根据权利要求13或14所述的载体、根据权利要求15所述的病毒体或根据权利要求16所述的药物组合物，其包含编码治疗性产物的序列，所述序列与根据权利要求1至5、8和11中任一项所述的启动子可操作地连接；和

在所述受试者的肌肉中表达治疗量的治疗性产物。

23.根据权利要求22所述的治疗受试者的方法，其中在骨骼肌和/或心肌中表达治疗量的治疗性产物。