JP2023541444A - 筋ジストロフィー患者における多様なｄｍｄ変異の補正のためのａａｖ媒介性の相同性非依存的標的化組み込み遺伝子編集 - Google Patents

筋ジストロフィー患者における多様なｄｍｄ変異の補正のためのａａｖ媒介性の相同性非依存的標的化組み込み遺伝子編集 Download PDF

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Abstract

ＤＭＤ遺伝子の様々な領域に関与する、領域を取り囲む又は領域に影響を及ぼす任意の変異を含むがそれらに限定されない、ＤＮＡ修復に適した変異を伴う筋ジストロフィーの治療、改善、進行の遅延、及び／又は予防のための、新規の遺伝子療法のための製品、方法及び使用が、本明細書で開示される。詳細には、本開示は、以前は達成可能でなかった、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及び相同性非依存的標的化組み込み（ＨＩＴＩ）を使用して高効率ノックインを達成する又は複数のエクソンを含むＤＭＤ遺伝子の大部分を置き換えて又は非相同末端末結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路を使用して大きな置き換えをすることにより、複数のエクソンを含むＤＭＤ遺伝子の大きなセグメントの置き換えによって、多様なＤＭＤ変異を修復するための製品及び方法を提供する。特に、本開示はＤＭＤエクソン１～１９、２～１９又は４１～５５の置き換えのための製品、方法及び使用を提供する。

Description

配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、その全体が参照により本明細書に取り込まれる、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５５６５０ＰＣ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：１０５，３８６バイト：作成日：２０２１年９月１４日）を含む。
本開示は、筋ジストロフィーの治療のための遺伝子療法の分野に関する。より詳細には、本開示は、複数のエクソンにわたるＤＭＤ遺伝子の様々な領域に関与する、領域を取り囲む、又は領域に影響を及ぼす任意の変異を含むがそれらに限定されない、ＤＮＡ修復に適した変異を伴う筋ジストロフィーを治療する、改善する、進行を遅延する、及び／又は予防するための、新規の遺伝子療法のための製品、方法、及び使用を提供する。詳細には、本開示は、以前は達成できなかった、ＤＭＤ遺伝子の大きなセグメントを置き換えることによって、多様なＤＭＤ変異を修復するための製品及び方法を提供する。本開示は、イントロン１～１９及びイントロン４０～５５によって包含される領域内のＤＭＤ遺伝子座内の変異に対処するための製品及び方法を提供する。いくつかの態様において、変異は、ＤＭＤエクソン１～１９、２～１９、又は４１～５５に関与するか、それを取り囲むか、又は影響を及ぼす。いくつかの態様において、変異は、ＤＭＤプロモーター、５’非翻訳領域、並びにエクソン１～イントロン１９によって包含される。いくつかの態様において、本開示は、ＤＭＤエクソン１～１９、２～１９、又は４１～５５の置き換えのための製品及び方法を提供する。しかしながら、本開示は、ＤＭＤ遺伝子の他の領域の置き換えにも同様に適用可能である方法を提供する。
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、主に随意筋に影響を与える遺伝性変性疾患群である。このグループは、動作を制御する骨格筋の進行性の衰弱および変性を特徴とする。ＭＤのいくつかの形態は乳児期または小児期に発症するが、他の形態は中年以降まで現れない場合がある。障害は、筋力低下の分布および程度（ＭＤのいくつかの形態は心筋にも影響を及ぼす）、発病年齢、進行速度、ならびに遺伝形式の点で異なる。
ＭＤは、個人、家族、およびコミュニティに深刻な影響を与える、特定可能な治療のない疾患群である。コストは計り知れない。個人は、自尊心の喪失に関連する感情的な緊張および低減した生活の質に苦しむ。手足の機能の喪失に起因する極度の身体的困難は、日常生活の動作において苦難をもたらす。家族関係は、経済的損失および対人関係への課題によって苦しむ。影響を受けた兄弟は身動きがとれないと感じ、配偶者間の争いは、特に、筋ジストロフィーの責任が親パートナーの一方の足元に置かれ得る場合、しばしば離婚につながる。治療法を見つけるための探求の負荷は、多くの場合、人生のあらゆる側面を損ない、試す、生涯にわたる非常に集中した努力となる。家族を超えて、コミュニティは、特殊教育、特殊輸送、ならびに再発性気道感染症および心合併症を治療するための再入院のコストにおける筋ジストロフィー人口のハンディキャップに対応する追加施設の必要性による経済的負荷を負う。経済的責任は、州および連邦政府機関によって共有され、納税者コミュニティに責任が拡大される。
ＭＤの１つの形態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。これは、５０００人に１人の新生男児に影響を与える最も一般的な重度小児形態の筋ジストロフィーである。ＤＭＤは、ＤＭＤ遺伝子における突然変異によって引き起こされ、骨格筋および心筋、ならびに胃腸管および網膜におけるジストロフィンタンパク質（４２７ＫＤａ）の不在をもたらす。ジストロフィンは、筋鞘を伸張性収縮から保護するだけでなく、筋鞘のすぐ近くに多数のシグナル伝達タンパク質を固定する。ＭＤの別の形態は、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）である。ＢＭＤは、ＤＭＤと同様に、体の筋肉を徐々に弱く、小さくする遺伝性疾患である。ＢＭＤは、臀部、骨盤、大腿部、および肩、ならびに心臓の筋肉に影響を及ぼすが、ＤＭＤほど深刻な問題を引き起こさないことが知られている。
ＤＭＤの多くの臨床例は、ＤＭＤ遺伝子の欠失突然変異に関連している。欠失突然変異とは対照的に、ＤＭＤエクソン重複は、ジストロフィノパチー患者の偏りのない試料における疾患を引き起こす突然変異の約５％を占めるが［Ｄｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ，１３４（３）：２９５－２９８（２００５）］、突然変異のいくつかのカタログでは、１１％であった、Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．［Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ，３０（１２）：１６５７－１６６６（２００９）］によるＵｎｉｔｅｄ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｏｐａｔｈｙ Ｐｒｏｊｅｃｔによって発表されたものを含み、重複の数が多い。ＢＭＤはまた、タンパク質を過度に短くする、ジストロフィン遺伝子の変化によって引き起こされる。欠陥のあるジストロフィンは、通常の使用で筋細胞を損傷の危険にさらす。２０１２年３月２９日に公開された、米国特許出願公開第２０１２／００７７８６０号、２０１３年３月２１日に公開された、同第２０１３／００７２５４１号、および２０１３年２月２１日に公開された、同第２０１３／００４５５３８号も参照されたい。
エクソン４５の欠失は、ＤＭＤ患者に見られる最も一般的な欠失のうちの１つであるが、エクソン４４および４５の欠失は、一般にＢＭＤに関連している［Ａｎｔｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ ７１：３２－４０（２０１４）］。したがって、エクソン４４がこれらのＤＭＤ患者の転写産物であるプレメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）でバイパスされ得る場合、これはリーディングフレームを復元し、部分的に機能するＢＭＤ様ジストロフィンの産生を可能にするであろう［Ａａｒｔｓｍａ－Ｒｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ ２７（５）：２５１－２５９（２０１７）］。実際、エクソン４５に隣接する欠失を有する多くの患者は、非常に低いレベルであるが、エクソン４４を自発的なスキップが見える。これは、他の欠失を有するＤＭＤ患者と比較される場合、わずかに増加したレベルのジストロフィンをもたらし、他の欠失を有するＤＭＤ患者と比較して、これらの患者において観察される重症度の低い疾患進行の根底にある可能性が最も高い［Ａｎｔｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｐａｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ８３４００（２０１４）、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓ １：９１－９４（２０１４）］。
ＤＭＤ遺伝子の特定に続く多くの研究ラインにもかかわらず、治療選択肢は限定される。したがって、ＤＭＤを含む、ＭＤのための治療について当該技術分野には必要性が残っている。最も先進的な療法には、変異特異的遺伝子アプローチを使用して、欠損したタンパク質であるジストロフィンの復元を目的としたものが含まれる。
本開示は、ＤＭＤエクソンに関与する、それを取り囲む、又はそれに影響を与える任意の変異を含むが、これに限定されない、ＤＮＡ修復に適した変異を含む筋ジストロフィーを治療、改善、その進行を遅延、及び／又は予防するための新規の遺伝子療法のための製品、方法、及び使用を提供する。詳細には、本開示は、以前は達成できなかった、ＤＭＤ遺伝子の大きなセグメントを置き換えることによって、多様なＤＭＤ変異を修復するための製品及び方法を提供する。本開示は、イントロン１～１９及びイントロン４０～５５によって包含される領域内のＤＭＤ遺伝子座内の変異に対処するための製品及び方法を提供する。いくつかの態様において、変異は、ＤＭＤエクソン１～１９、２～１９、又は４１～５５に関与するか、それを取り囲むか、又は影響を及ぼす。いくつかの態様において、変異は、ＤＭＤプロモーター、５’非翻訳領域、並びにエクソン１～イントロン１９によって包含される。いくつかの態様において、本開示は、ＤＭＤエクソン４１～５５、エクソン１～１９、又はエクソン２～１９の置き換えのための製品及び方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、合成プロモーター及びＤＭＤエクソン１～１９の天然又は修飾されたコード配列のノックインのための製品及び方法を提供する。しかしながら、本開示は、ＤＭＤ遺伝子の他の領域にも同様に適用可能である方法を提供する。
より詳細には、本開示は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸、転写成熟に必要なスプライス部位を含む天然又は合成イントロンに隣接する内部イントロンを欠くコード配列を含む核酸、及び核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。本明細書に提供される製品及び方法は、ＤＭＤ遺伝子の様々な領域に関与する、領域を取り囲む、又は領域に影響を与える変異に起因する筋ジストロフィーの治療に使用するためのジストロフィンタンパク質の改変形態を提供する。いくつかの態様において、変異は、イントロン１～１９及びイントロン４０～５５に包含される領域内のＤＭＤ遺伝子座内の変異に関与する、それを取り囲む、又はそれに影響を及ぼす。いくつかの態様において、変異は、ＤＭＤエクソン１～１９、２～１９、又は４１～５５に関与するか、それを取り囲むか、又はそれに影響を及ぼす。いくつかの態様において、変異は、ＤＭＤプロモーター、５’非翻訳領域、並びにエクソン１～イントロン１９によって包含される。
本明細書で使用されるように本明細書で記載される「相同性非依存的標的化組み込み」（ＨＩＴＩ）という用語は、本開示の方法がｉ）ユーザが選択した部位でＤＮＡ二本鎖切断を生成するためのＣａｓ９、ｉｉ）ＤＭＤ遺伝子上のユーザが選択したＤＮＡ部位にＣａｓ９をガイドするためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及びｉｉｉ）ｇＲＮＡ標的部位のうちの１つ以上に隣接する所望のノックインＤＭＤ配列を含有するドナーＤＮＡ、の３つの構成要素を含む。重要なことに、ＨＩＴＩは、細胞内の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路を使用して、Ｃａｓ９切断部位におけるゲノム内への直鎖ＤＮＡ配列のノックインを触媒する。
本開示は、配列番号１～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸、又は配列番号１～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、又は配列番号１１２～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤをコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を提供する。
本開示は、配列番号１４９、１５２、１５５、１５８、１７２、１７６、１８７、若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列を含む核酸、又は配列番号１４９、１５２、１５５、１５８、１７２、１７６、１８７、若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、を提供する。
いくつかの態様において、これらの核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターのうちのいずれかである。
本開示は、これらの核酸を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、これらの核酸を含むベクターを提供する。一部の態様において、ベクターは、アデノ随伴ウイルスである。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠く。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、又はＡＡＶｒｈ．７４である。いくつかのより具体的な態様において、ＡＡＶは、ｒＡＡＶ９である。本開示は、そのようなＡＡＶ及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
本開示は、細胞内のＤＭＤ遺伝子内の１つ以上の欠損、重複、異常、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンを置き換える方法であって、細胞を、イントロン１を標的とする第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸及びイントロン１９を標的とする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又はイントロン１の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸及びイントロン１９中の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸を含む核酸、ゲノムＣａｓ９切断部位よってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン２～１９のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列含む核酸、及びＣａｓ９又はその機能断片をコードする核酸、でトランスフェクトすることを含む、方法を提供する。本開示はまた、細胞内のＤＭＤ遺伝子内の１つ以上の欠損、重複、異常、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンを置き換える方法であって、細胞を、イントロン１を標的とする第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸及びイントロン１９を標的とする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又はイントロン１の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸及びイントロン１９中の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸を含む核酸、ゲノムＣａｓ９切断部位よってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン２～１９のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列含む核酸、及びＣａｓ９又はその機能的断片をコードする核酸、を含むベクターでトランスフェクトすることを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９酵素は、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示されるヌクレオチド配列、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示される配列と少なくとも約８０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる。いくつかの態様において、イントロン１を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン１の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１２１～１３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１２１～１３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン１９を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン１９の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、エクソン２～１９のノックインドナー配列をコードする核酸は、配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。
本開示は、細胞内のＤＭＤ遺伝子内の１つ以上の欠損、重複、異常、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンを置き換える方法であって、細胞を、イントロン４０を標的とする第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸及びイントロン５５を標的とする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又はイントロン４０の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸及びイントロン５５の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸を含む核酸、ゲノムＣａｓ９切断部位よってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列含む核酸、及びＣａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、でトランスフェクトすることを含む、方法を提供する。本開示はまた、細胞内のＤＭＤ遺伝子内の１つ以上の欠損、重複、異常、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンを置き換える方法であって、細胞を、イントロン４０を標的とする第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸及びイントロン５５を標的とする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又はイントロン４０の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸及びイントロン５５の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸を含む核酸、ゲノムＣａｓ９切断部位よってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列含む核酸、及びＣａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を含むベクターでトランスフェクトすることを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９酵素は、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示されるヌクレオチド配列、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示される配列と少なくとも約８０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる。いくつかの態様において、イントロン４０を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン４０内の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１１２～１１７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１１２～１１７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン５５を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン５５内の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１１８～１２０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１１８～１２０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、エクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードする核酸は、配列番号１４９、１５２、１８７若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１４９、１５２、１８７若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡをコードする核酸の発現又はＣａｓ９酵素をコードする核酸の発現は、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターの制御下である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様において、ヒト細胞は、ヒト対象内に存在する。いくつかの態様において、ヒト対象は、筋ジストロフィーを有するか、又は筋ジストロフィーに罹患している。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、デュシェン筋ジストロフィー（ＤＭＤ）又はベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）ある。
本開示は、細胞内のＤＭＤ遺伝子内の１つ以上の欠損、重複、異常、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンに罹患している対象を治療する方法であって、細胞を、イントロン１を標的とする第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸及びイントロン１９を標的とする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又はイントロン１の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸及びイントロン１９中の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸を含む核酸、ゲノムＣａｓ９切断部位よってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン２～１９のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列含む核酸、及びＣａｓ９又はその機能断片をコードする核酸、を対象に投与することを含む、方法を提供する。本開示はまた、細胞内のＤＭＤ遺伝子内の１つ以上の欠損、重複、異常、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンに罹患している対象を治療する方法であって、有効量の、イントロン１を標的とする第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸及びイントロン１９を標的とする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸又はイントロン１の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸及びイントロン１９の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸を含む核酸、ゲノムＣａｓ９切断部位よってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン２～１９のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列含む核酸、及びＣａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９酵素は、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示されるヌクレオチド配列、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示される配列と少なくとも約８０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる。いくつかの態様において、イントロン１を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン１の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１２１～１３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１２１～１３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン１９を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン１９の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、エクソン２～１９のノックインドナー配列をコードする核酸は、配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。
本開示は、細胞内のＤＭＤ遺伝子中の１つ以上の欠損、重複、異常、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンに罹患している対象を治療する方法であって、有効量の、イントロン４０を標的とする第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸及びイントロン５５を標的とする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又はイントロン４０の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸及びイントロン５５の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸を含む核酸、ゲノムＣａｓ９切断部位よってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列含む核酸、及びＣａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を対象に投与することを含む、方法を提供する。本開示はまた、細胞内のＤＭＤ遺伝子内の１つ以上の欠損、重複、異常、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンに罹患している治療する方法であって、有効量の、イントロン４０を標的とする第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸及びイントロン５５を標的とする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又はイントロン４０の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸及びイントロン５５の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸を含む核酸、ゲノムＣａｓ９切断部位よってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列含む核酸、及びＣａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を含むベクターを対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９酵素は、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示されるヌクレオチド配列、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示される配列と少なくとも約８０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる。いくつかの態様において、イントロン４０を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン４０内の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１１２～１１７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１１２～１１７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン５５を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン５５内の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１１８～１２０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１１８～１２０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、エクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードする核酸は、配列番号１４９、１５２、１８７若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１４９、１５２、１８７若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡをコードする核酸の発現又はＣａｓ９酵素をコードする核酸の発現は、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターの制御下である。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。いくつかの態様において、ヒト対象は、筋ジストロフィーに罹患している。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、デュシェン筋ジストロフィー（ＤＭＤ）又はベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）ある。
本開示はまた、細胞を、イントロン１を標的とする第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸及びイントロン１９を標的とする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又はイントロン１の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸及びイントロン１９の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸を含む核酸、ゲノムＣａｓ９切断部位よってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン２～１９のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列含む核酸、及びＣａｓ９又はその機能的断片をコードする核酸、を含む組換え遺伝子編集複合体であって、複合体の標的核酸への結合が増加したＤＭＤ遺伝子の発現をもたらす、遺伝子編集複合体を提供する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９酵素は、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示されるヌクレオチド配列、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示される配列と少なくとも約８０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる。いくつかの態様において、イントロン１を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン１の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１２１～１３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１２１～１３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン１９を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン１９の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、エクソン２～１９のノックインドナー配列をコードする核酸は、配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡをコードする核酸又はＣａｓ９酵素をコードする核酸は、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターを更に含む。いくつかの態様において、１つ以上の核酸は、ベクター内に存在する。いくつかの態様において、ベクターは、ＡＡＶである。
本開示は、細胞を、イントロン４０を標的とする第４０のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸及びイントロン５５を標的とする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又はイントロン１の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸及びイントロン５５の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸を含む核酸、ゲノムＣａｓ９切断部位よってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列含む核酸、及びＣａｓ９又はその機能的断片をコードする核酸、を含む組換え遺伝子編集複合体であって、複合体の標的核酸への結合が増加したＤＭＤ遺伝子の発現をもたらす、遺伝子編集複合体を提供する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９酵素は、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示されるヌクレオチド配列、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示される配列と少なくとも約８０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる。いくつかの態様において、イントロン４０を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン４０内の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１１２～１１７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１１２～１１７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン５５を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン５５内の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１１８～１２０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１１８～１２０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、エクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードする核酸は、配列番号１４９、１５２、１８７若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１４９、１５２、１８７若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡをコードする核酸又はＣａｓ９酵素をコードする核酸は、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターを更に含む。いくつかの態様において、１つ以上の核酸は、ベクター内に存在する。いくつかの態様において、ベクターは、ＡＡＶである。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を欠く。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、又はＡＡＶｒｈ．７４である。いくつかのより具体的な態様において、ＡＡＶは、ｒＡＡＶ９である。
本開示は、配列番号１～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又は配列番号１～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、又は配列番号１１２～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤをコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、をコードする核酸の使用を提供する。本開示は、配列番号１４９、１５２、１５５、１５８、１７２、１７６、１８７、若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列、又は配列番号１４９、１５２、１５５、１５８、１７２、１７６、１８７、若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、を含む核酸の使用を提供する。いくつかの態様において、これらの使用には、細胞内のＤＭＤ遺伝子内の１つ以上の欠損、重複、異常、又は異常に接続されたエクソン、又は欠損若しくは異常なイントロンを処置する際の治療剤が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、治療剤は、薬剤である。いくつかの態様において、薬剤は、ヒト対象の細胞内のＤＭＤ遺伝子における１つ以上の欠損、重複、異常、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンを治療するために有用である。
本開示は、細胞内のＤＭＤ遺伝子の発現を増加させる、又は機能的ジストロフィンの発現を増加させる方法であって、細胞を、（ａ）イントロン１９を標的とするＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸、又はイントロン１９の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、（ｂ）ゲノムＣａｓ９切断部位よってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン１～１９のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列含む核酸、及び（ｃ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、と接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９酵素は、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示されるヌクレオチド配列、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示される配列と少なくとも約８０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる。いくつかの態様において、イントロン１９を標的化するＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン１９内の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、エクソン１～１９のノックインドナー配列をコードする核酸は、（ａ）配列番号１７３又は１７８に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７３又は１７８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、（ｂ）配列番号１７４に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、（ｃ）配列番号１７５に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、（ｄ）配列番号１７６に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７６に示されるヌクレオチド配列に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、（ｅ）配列番号１７７に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７７に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、エクソン１～１９のノックインドナー配列をコードする核酸は、配列番号１７２に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡをコードする核酸の発現又はＣａｓ９酵素をコードする核酸の発現は、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターの制御下である。いくつかの態様において、核酸は、ベクター内にある。いくつかの態様において、ベクターは、ＡＡＶである。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。いくつかの態様において、ヒト対象は、筋ジストロフィーに罹患している。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、デュシェン筋ジストロフィー（ＤＭＤ）又はベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）ある。
本開示はまた、細胞内のＤＭＤ遺伝子内の１つ以上の欠損、重複、異常、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンに罹患している対象を治療する方法であって、有効量の、（ａ）イントロン１９を標的とするＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸、又はイントロン１９の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、（ｂ）ゲノムＣａｓ９切断部位においてドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン１～１９のノックインドナー配列をコードするドナー配列を含む核酸、及び（ｃ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９酵素は、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示されるヌクレオチド配列、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示される配列と少なくとも約８０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる。いくつかの態様において、イントロン１９を標的化するＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、イントロン１９内の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、エクソン１～１９のノックインドナー配列をコードする核酸は、（ａ）配列番号１７３又は１７８に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７３又は１７８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、（ｂ）配列番号１７４に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、（ｃ）配列番号１７５に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、（ｄ）配列番号１７６に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７６に示されるヌクレオチド配列に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、（ｅ）配列番号１７７に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７７に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、エクソン１～１９のノックインドナー配列をコードする核酸は、配列番号１７２に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡをコードする核酸の発現又はＣａｓ９酵素をコードする核酸の発現は、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターの制御下である。いくつかの態様において、核酸は、ベクター内にある。いくつかの態様において、ベクターは、ＡＡＶである。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。いくつかの態様において、ヒト対象は、筋ジストロフィーに罹患している。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、デュシェン筋ジストロフィー（ＤＭＤ）又はベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）ある。
本開示はまた、配列番号１７９に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、若しくは配列番号１７９に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体を含む核局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号１８０に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、若しくは配列番号１８０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体をその５’末端に含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素をコードする核酸を提供する。いくつかの態様において、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ９又はＣａｓ１３である。
本開示の更なる態様及び利点は、図面と合わせて、以下の詳細な説明の概説から、当業者には明らかであろう。しかしながら、詳細な説明（図面、及び特定の例を含む）は、開示される主題の実施形態を示すが、本開示の趣旨及び範囲内にある様々な変更及び修正がこの詳細な説明から当業者には明らかになるため、単に例示としてのみ与えられることを理解されたい。
ジストロフィンの特性を示す。図１Ａは、筋肉細胞における力伝達軸の概略図を示す。ジストロフィンは、細胞骨格アクチンを膜貫通型ジストログリカン複合体に結合させ、細胞骨格をラミニンを介して細胞外マトリックスに結合させる。図１Ｂは、主要ドメインが標識されたジストロフィンタンパク質の概略図を示す。図１Ｃは、ジストロフィンの各ドメインに対応するエクソンのＤＭＤ遺伝子図の概略図を示す。各エクソンの形状は、リーディングフレームのフェージングを示し、赤いボックスで囲まれたエクソンは、ＤＭＤ遺伝子内の変異ホットスポット（例えば、エクソン６～７、４３～４６、及び５０～５３）を示す。 同上。 同上 ゲノムＤＮＡの一部に相補的なｇＲＮＡの使用によるＣａｓ９標的化の描写を示す。ｇＲＮＡによって結合されたゲノムＤＮＡは、赤色で示されている。青はＰＡＭサイトである。ＳａＣａｓ９タンパク質は、オレンジ色で示されている。 （図３Ａ）エクソン２置き換え及び（図３Ｂ）エクソン２＋３置き換えのＨＩＴＩ戦略を示す概略図である。２つのゲノム遺伝子座及び断片中のノックの適切な切断は、３つの可能な結果のうちの１つをもたらし得る。隣接エクソンの単純な欠失、ノックイン断片の逆組み込み、又は適切な前方ノックイン。逆ノックインは、切断部位の再構築をもたらし、再切断を可能にする。 同上。 ノックイン特異的プライマーで処置されたＨＥＫ２９３ゲノムＤＮＡが、ＰＣＲ後のＨＩＴＩドナーのノックインに成功したことを示すゲル画像を提供する。これは、（図４Ａ）エクソン２置き換え及び（図４Ｂ）エクソン２～３置き換えの両方について示された。配列決定データは、（図４Ｃ）ＨＩＴＩ挿入の５’末端、並びに（図４Ｄ）ＨＩＴＩ挿入の３’末端との完全な結合があったことを示した。ｎ＝３個の生物学的複製。 同上。 同上。 同上。 ＣＲＩＳＰＲ：ドナー用量設定実験を示すゲル画像を示す。ＣＲＩＳＰＲ量と比較してドナー量を増加させること（図５Ａ）と、ドナー量と比較してＣＲＩＳＰＲ量を増加させること（図５Ｂ）と、の両方の結果。これらの実験は、このトリプルプラスミド共トランスフェクト系には１：１の比率が最適であることを示した。 同上。 （図６Ａ）内因性スペクトリン様反復２２及び（図６Ｂ）ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬを使用して構築されたエクソン４０及び５６の接合から産生されるハイブリッドスペクトリン様反復の予測構造の相同性モデルを示す。青い領域はより好ましい全体的な推定値を表し、赤い領域はより好ましくない全体的な推定値を表す。 同上。 （図７Ａ）エクソン４１～５５ＨＩＴＩ置き換え戦略に使用されるプラスミドの描写、及び（図７Ｂ）このＨＩＴＩ戦略に関連する編集結果を示す概略図を示す。エクソン４３～４６及び５０～５３を取り囲む赤い箱は、ＤＭＤ遺伝子内の変異ホットスポットを示している。ＤＭＤエクソン４１～５５ＣＤＳは、転写産物へのスプライシングを確実にするために、天然又は合成隣接イントロンの１００ｂｐに隣接していることに留意されたい。 同上。 （図８Ａ）ＪＨＩ５５Ａ標的化シリーズ及び（図８Ｂ）ＪＨＩ４０標的化シリーズのＴ７Ｅ１アッセイ（ＥｎＧｅｎ（登録商標）変異検出キット、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）のポリアクリルアミドゲル画像を示す。「Ｕｎｔ．」は未処置のＤＮＡを表し、「ｃｏｎｔ．」は、ＥｎＧｅｎ（登録商標）変異検出キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）とともに提供される陽性対照を表す。黄色い点は、それぞれの標的部位での編集を伴う予想されるバンドサイズを示す。「＋」及び「－」は、それぞれ、Ｔ７Ｅ１酵素の有、無での反応を示す。活性ｇＲＮＡは緑色の文字で示される。 同上。 ２つのＨＩＴＩプラスミドの、計数された細胞の総量と比較した二重陽性細胞の割合の共トランスフェクションを示す蛍光顕微鏡画像を示す。 ＨＩＴＩドナー配列におけるノッキングの結果を示す。図１０Ａは、５’ノックイン特異的プライマーセットを使用して、４１～５５部位でのＨＩＴＩドナーのノックインの成功を示すゲル画像を示す。図１０Ｂは、強調表示された接合部に基づいたＨＩＴＩドナー配列のシームレスな組み込みを示すサンガー配列決定クロマトグラムを示す。ｎ＝３個の生物学的複製物。 同上。 ３つの可能性のある遺伝子編集の結果を有する、ＨＩＴＩを使用したＤＭＤ遺伝子修正への概略アプローチを示す。矢印は、遺伝的要素及び発現カセットの方向性を示す。ＤＭＤエクソン４１～５５ＣＤＳは、転写産物へのスプライシングを確実にするために、天然又は合成隣接イントロンの１００ｂｐに隣接していることに留意されたい。 ＨＥＫ２９３細胞におけるＤＭＤエクソン２の代わりにＧＦＰカセットのＨＩＴＩノックインを示すゲル画像を提供する。プライマー位置は各ゲル画像の横に示される。「非ドナー」は、Ｃａｓ９切断部位を欠くＧＦＰカセットを有するプラスミドである。ｎ＝３個の生物学的複製物。 ＨＥＫ２９３細胞におけるＤＭＤエクソン２～３の代わりにＧＦＰカセットのＨＩＴＩノックインを示すゲル画像を提供する。プライマー位置は各ゲル画像の横に示される。「非ドナー」は、Ｃａｓ９切断部位を欠くＧＦＰカセットを有するプラスミドである。ｎ＝３個の生物学的複製物。 ｉ）ＣＭＶＰ駆動ＳａＣａｓ９、及びｉｉ）ＤＭＤエクソン２～１９及び合成スプライス部位（配列番号１５５のような）、並びにＵ６プロモーター駆動ｇＲＮＡＤＳＡｉ１－０３及びＤＳＡｉ１９－００４をコードするＨＩＴＩドナー配列をコードするプラスミド有（＋）又はなし（－）でトランスフェクションした７２時間後のＨＥＫ２９３細胞内の天然ＤＭＤエクソン２－１９遺伝子座の代わりに、ＤＭＤエクソン２～１９のＨＩＴＩノックインのゲル画像を提供する。順方向（Ｆ）及び逆方向（Ｒ）プライマーアニーリング位置は各ゲル画像の横に示される。ｎ＝３個の生物学的複製。 ＨＥＫ２９３細胞における天然のＤＭＤエクソン４１～５５遺伝子座の代わりに、プラスミド由来のＤＭＤエクソン４１～５５ＣＤＳのノックインに成功したデータを提供する。図１５Ａは、示されるプライマーアニーリング部位を有するＨＥＫ２９３細胞における天然のＤＭＤエクソン４１～５５遺伝子座の代わりに、プラスミド由来のＤＭＤエクソン４１～５５ＣＤＳのノックインの成功に対応するゲノムＤＮＡ ＰＣＲアンプリコンのゲル画像を提供する。Ｍは、ＤＮＡサイズマーカーである。ｎ＝３個の生物学的複製。図１５Ｂは、パネル図１５Ａからのノックインアンプリコンのサンガー配列決定を提供する。標的遺伝子座の上流にある天然又は合成イントロン配列、及びそれぞれ青及び黄色で強調表示されるノックイン誘導配列。黒い矢印は、所望のＨＩＴＩノックインによって切断されたＣａｓ９標的部位を示す。 同上。 各バーの下に示されるように、ｇＲＮＡのそれぞれの標的部位におけるＨＥＫ２９３細胞における遺伝子編集のＴＩＤＥ定量を示す。他に示されない限り、値は、標準偏差誤差バーで平均を反映しており、ｎ＝３個の生物学的反復。アスタリスクで示された試料は、ＤＮＡ配列決定読み取りが不十分であり、分析されなかった。 ＭＨＣＫ７プロモーター、続いてＤＭＤエクソン１～１９をイントロン１９にノックインするための戦略、並びにこのＨＩＴＩ戦略に関連する潜在的な結果を示す。ＤＭＤエクソン１～１９ＣＤＳの後に、転写産物へのスプライシングを確実にするためのスプライスドナー配列が続く。 Ｓａ Ｃａｓ９、Ｕ６駆動ｇＲＮＡＪＨＩ４０－００８、及びＪＨＩ５５Ａ－００４をコードするＡＡＶ１、並びにスプライス部位に隣接し、ＪＨＩ４０－００８及びＪＨＩ５５Ａ－００４標的部位によって挟まれるＤＭＤエクソン４１－５５をコードするドナーＤＮＡ配列を使用した、処置を有する（処置された）及び有さない（処置されなかった）、ｄｅｌ４５患者由来細胞からのＲＴ－ＰＣＲアンプリコンのゲル画像を示す。プライマーは、ＤＭＤエクソン４３及びエクソン４６にアニールされた。未処置細胞は、エクソン４５の欠失に起因して、野生型よりも少ないアンプリコンを有する。患者細胞内の欠陥エクソン４１～５５遺伝子座の、ＨＩＴＩドナー配列内のメガエクソンでの置き換えは、野生型に対応するより大きなアンプリコンをもたらす。ｎ＝３個の生物学的複製。
本開示は、複数のＤＭＤエクソンを包含するＤＭＤ遺伝子の大きな領域に関与する、領域を取り囲む、又は領域に影響を及ぼす変異を伴う筋ジストロフィーの治療、緩和、進行の遅延、及び／又は予防のための製品、方法、及び使用を提供する。
本明細書に提供される製品及び方法は、ＤＭＤ遺伝子の様々な領域に関与する、領域を取り囲む、又は領域に影響を与える変異に起因する筋ジストロフィーの治療に使用するためのジストロフィンタンパク質の改変形態を提供する。最大の既知のヒト遺伝子であるＤＭＤは、ジストロフィンと呼ばれるタンパク質を作製するための指示を提供する。ジストロフィンは主に、運動に使用される筋肉（骨格筋）および心臓（心）筋に位置する。いくつかの態様において、変異は、イントロン１～１９及びイントロン４０～５５に包含される領域内のＤＭＤ遺伝子座に関与する、遺伝子座を取り囲む、又は遺伝子座に影響を及ぼす。いくつかの態様において、変異は、ＤＭＤエクソン１～１９、２～１９、又は４１～５５に関与するか、それを取り囲むか、又はそれに影響を及ぼす。いくつかの態様において、変異は、ＤＭＤプロモーター、５’非翻訳領域、並びにエクソン１～イントロン１９によって包含される。
本開示の製品、方法、及び使用による治療のために含まれる変異としては、限定されないが、大規模及び小規模の重複、欠失、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、又は他の変異などの変異又は再配列が挙げられる。いくつかの態様において、本開示は、イントロン１～１９（又は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２～１９に関与する、それを取り囲む、又は影響を与える）、イントロン４０～５５（又は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４１～５５に関与する、それを取り囲む、又は影響を与える）、ＤＭＤプロモーター（すなわち、ＤＭＤＤｐ４２７ｍプロモーター）、５’非翻訳領域、又はエクソン１～イントロン１９によって包含される領域におけるＤＭＤ遺伝子座に関与する、それを取り囲む、又は影響を与える変異を含む筋ジストロフィーの治療、改善、進行の遅延、及び／又は予防のための製品、方法、及び使用を提供する。いくつかの態様において、変異は、ＤＭＤエクソン１～１９、２～１９、又は４１～５５に関与するか、それを取り囲むか、又はそれに影響を及ぼす。いくつかの態様において、変異は、ＤＭＤプロモーター、５’非翻訳領域、並びにエクソン１～イントロン１９によって包含される。
いくつかの態様において、本開示は、エクソン２～１９遺伝子座内の１つ以上のエクソンの完全若しくは部分的な複製若しくは欠失、エクソン２～１９のうちのいずれか１つ以上の１つ以上の塩基対の挿入若しくは欠失、エクソン２～１９のうちのいずれか１つ以上のナンセンス若しくはミスセンス点変異、又はエクソン２～１９のうちのいずれか１つ以上の適切なスプライシング若しくは翻訳に影響を及ぼすイントロン１～１９のうちのいずれか１つ内、又は複数にまたがる挿入、欠失、複製若しくは点変異、を治療若しくは改善するための製品、方法、及び使用を提供する。いくつかの態様において、本開示は、エクソン４１～５５遺伝子座内の１つ以上のエクソンの完全若しくは部分的な複製若しくは欠失、エクソン４１～５５のうちのいずれか１つ以上の１つ以上の塩基対の挿入若しくは欠失、エクソン４１～５５のうちのいずれか１つ以上のナンセンス若しくはミスセンス点変異、又はエクソン４１～５５のうちのいずれか１つ以上の適切なスプライシング若しくは翻訳に影響を及ぼすイントロン４０～５５のうちのいずれか１つ内、又は複数にまたがる挿入、欠失、複製若しくは点変異、を治療若しくは改善するための製品、方法、及び使用を提供する。
いくつかの態様において、変異は、エクソン３の欠失、エクソン３～７の欠失、エクソン３～１１の欠失、エクソン７の欠失、エクソン８～９の欠失、エクソン８～１１の欠失、エクソン８～１３の欠失、エクソン１０～１１の欠失、エクソン１８の欠失、ＤＭＤエクソン２の重複、エクソン２～６の重複、エクソン２～７の重複、エクソン２～１９の重複、ＤＭＤエクソン２～１１の重複、エクソン３～４の重複、エクソン３～７の重複、エクソン５～７の重複、エクソン８～９の重複、エクソン８～１１の重複、エクソン８～１３の重複、エクソン１２の重複、エクソン１２～１３の重複、エクソン１８の重複、エクソン１９の重複、エクソン６におけるナンセンス点変異、エクソン７におけるナンセンス点変異、エクソン８におけるナンセンス点変異、エクソン９におけるナンセンス点変異、エクソン１０におけるナンセンス点変異、エクソン１１におけるナンセンス点変異、エクソン１２におけるナンセンス点変異、エクソン１３におけるナンセンス点変異、エクソン１４におけるナンセンス点変異、エクソン１５におけるナンセンス点変異、エクソン１６におけるナンセンス点変異、エクソン１７におけるナンセンス点変異、エクソン１８におけるナンセンス点変異、又はエクソン１９におけるナンセンス点変異、エクソン６におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン７におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン８におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン９におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１０におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１１におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１２におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１３におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１４におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１５におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１６におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１７におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１８におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、又はエクソン１９におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、を含むがそれらに限定されない、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２～１９又はイントロン１～１９によって包含される領域に関与する、それを取り囲む、又は影響する。
いくつかの態様において、変異は、エクソン３の欠失、エクソン３～７の欠失、エクソン３～１１の欠失、エクソン７の欠失、エクソン８～９の欠失、エクソン８～１１の欠失、エクソン８～１３の欠失、エクソン１０～１１の欠失、エクソン１８の欠失、ＤＭＤエクソン２の重複、エクソン２～６の重複、エクソン２～７の重複、エクソン２～１９の重複、ＤＭＤエクソン２～１１の重複、エクソン３～４の重複、エクソン３～７の重複、エクソン５～７の重複、エクソン８～９の重複、エクソン８～１１の重複、エクソン８～１３の重複、エクソン１２の重複、エクソン１２～１３の重複、エクソン１８の重複、エクソン１９の重複、エクソン６におけるナンセンス点変異、エクソン７におけるナンセンス点変異、エクソン８におけるナンセンス点変異、エクソン９におけるナンセンス点変異、エクソン１０におけるナンセンス点変異、エクソン１１におけるナンセンス点変異、エクソン１２におけるナンセンス点変異、エクソン１３におけるナンセンス点変異、エクソン１４におけるナンセンス点変異、エクソン１５におけるナンセンス点変異、エクソン１６におけるナンセンス点変異、エクソン１７におけるナンセンス点変異、エクソン１８におけるナンセンス点変異、又はエクソン１９におけるナンセンス点変異、エクソン６におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン７におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン８におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン９におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１０におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１１におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１２におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１３におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１４におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１５におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１６におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１７におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、エクソン１８におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、又はエクソン１９におけるフレームシフト挿入若しくは欠失変異、を含むがそれらに限定されない、ＤＭＤエクソン１～１９又はＤＭＤプロモーターによって包含される領域、５’非翻訳領域並びにエクソン１～イントロン１９に関与する、それを取り囲む、又は影響する。
いくつかの態様において、変異は、ＤＭＤエクソン４４の重複、エクソン４３、４４、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５２、若しくは５３の欠失、エクソン４５～５０の欠失、エクソン４５～５２の欠失、エクソン４５～５４の欠失、エクソン４６～４７の欠失、エクソン４６～４８の欠失、エクソン４６～５０の欠失、エクソン４６～５１の欠失、エクソン４６～５２の欠失、エクソン４８～５０の欠失、エクソン４８～５４の欠失、エクソン４９～５０の欠失、エクソン４９～５２の欠失、エクソン４９～５４の欠失、エクソン５０～５２の欠失、エクソン５２～５４の欠失、エクソン５３～５４の欠失、エクソン４２～４３の重複、エクソン４３の重複、エクソン４４の重複、エクソン４４～５１の重複、エクソン４５の重複、エクソン４６の重複、エクソン４６～４７の重複、エクソン５３の重複、エクソン４１におけるナンセンス点変異、エクソン４２におけるナンセンス点変異、エクソン４３におけるナンセンス点変異、エクソン４４におけるナンセンス点変異、エクソン４５におけるナンセンス点変異、エクソン４６におけるナンセンス点変異、エクソン４７におけるナンセンス点変異、エクソン４８におけるナンセンス点変異、エクソン４９におけるナンセンス点変異、エクソン５０におけるナンセンス点変異、エクソン５１におけるナンセンス点変異、エクソン５２におけるナンセンス点変異、エクソン５３におけるナンセンス点変異、エクソン５４におけるナンセンス点変異、エクソン５５におけるナンセンス点変異、エクソン４１におけるフレームシフト挿入又は欠失変異、エクソン４２におけるフレームシフト挿入又は欠失変異、エクソン４３におけるフレームシフト挿入又は欠失変異、エクソン４４におけるフレームシフト挿入又は欠失変異、エクソン４５におけるフレームシフト挿入又は欠失変異、エクソン４６におけるフレームシフト挿入又は欠失変異、エクソン４７におけるフレームシフト挿入又は欠失変異、エクソン４８におけるフレームシフト挿入又は欠失変異、エクソン４９におけるフレームシフト挿入又は欠失変異、エクソン５０におけるフレームシフト挿入又は欠失変異、エクソン５１におけるフレームシフト挿入又は欠失変異、エクソン５２におけるフレームシフト挿入又は欠失変異、エクソン５３におけるフレームシフト挿入又は欠失変異、エクソン５４におけるフレームシフト挿入又は欠失変異、又はエクソン５５におけるフレームシフト挿入又は欠失変異、を含むがそれらに限定されない、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４１～５５又はイントロン４１～５５によって包含される領域に関与する、それを取り囲む、又は影響する。
より詳細には、本開示は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、相同性非依存的標的化挿入（ＨＩＴＩ）でノックインされるＤＭＤ遺伝子の複数のエクソンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ＤＮＡノックインを誘導する、又はゲノムＤＭＤ ＤＮＡの大規模な置き換えを行うためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの戦略、及び様々なＤＭＤ領域のＨＩＴＩノックインを行うための核酸を含むベクターを提供する。したがって、本開示は、ＤＭＤ遺伝子の多様な変異を有する膨大な筋ジストロフィー患者のコホートに、機能的ジストロフィンを回復させるための製品、方法、及び使用を提供する。
ジストロフィン及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー
本開示は、ＤＭＤ遺伝子の変異から生ずる筋ジストロフィーを治療するための製品、方法、及び使用を提供する。そのような筋ジストロフィーとしては、限定されないが、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）が挙げられる。ＤＭＤは、合計７９個のエクソンと、ジストロフィンタンパク質の４２７ｋＤａ筋肉アイソフォームのコードを含むＤＭＤ遺伝子内の無数の変異によって引き起こされるＸ連鎖遺伝性障害である（図１Ａ～Ｃ）（Ｆｌａｎｉｇａｎ，Ｎｅｕｒｏｌ Ｃｌｉｎ ３２，６７１－６８８，ｖｉｉｉ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｃｌ．２０１４．０５．００２（２０１４））。ＤＭＤ遺伝子は、知られている最長のヒト遺伝子の１つであるジストロフィンタンパク質をコードする。ジストロフィンは、細胞骨格アクチンフィラメントとジストログリカン複合体（ＤＧＣ）との間の接続を介して形質膜を強化する役割を果たす構造タンパク質である（図１Ａ）（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ５，１２２３－１２３９，ＤＯＩ：１０．１００２／ｃｐｈｙ．ｃ１４００４８（２０１５））。したがって、ジストロフィンは、Ｎ末端アクチン結合ドメイン、第２のアクチン結合ドメインを有するスペクトリン様反復からなる中央ロッドドメイン、及びＤＧＣと直接相互作用するＣ末端ドメインを含むいくつかの重要なドメインを有する（図１Ｂ）（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，上記）。ジストロフィンは、正常な筋肉の収縮中にショックアブソーバーとして動作し、通常活動中に筋肉の損傷及び変性を防ぐために必要とされる。ジストロフィンが不在の場合、筋肉変性は衰弱を引き起こし、最終的に１０代前半の歩行の喪失に進行する。一旦車椅子に乗ると、ＤＭＤの早期死亡特性の主な原因である心臓機能及び呼吸機能の急激な低下（それぞれ心臓及び横隔膜の関与による）を有する。
ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子であるＤＭＤ遺伝子は、遺伝子の大きさに部分的に起因する多様な変異プロファイルを有する（Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ ６，３９５－４０２，ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｕｍｕ．２２７５８（２０１５））。ＤＮＡ配列の一塩基対変化の結果である一塩基点変異は、ＤＭＤを引き起こす変異の約１０．５％を占める（Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．上記）。エクソン重複は、ＤＭＤ変異の約１０．９％を占め、遺伝子の一部が重複し、元の遺伝子断片に直接隣接して配置されるときに生じる（Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．上記）。エクソン欠失は、１つ以上のエクソンを含有する遺伝子の一部が遺伝子から完全に切除される場合であり、ＤＭＤ変異の約６８．５％を占める（Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．上記）。エクソン欠失及び重複の両方は、通常、機能的ジストロフィンタンパク質の喪失をもたらすフレームシフト変異をもたらす。別の６．９％のＤＭＤ変異は、一般にフレームシフト変異ももたらすサブエクソン挿入及び欠失（インデル）からなる（Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．上記）。ＤＭＤ変異の別の２．７％は、特定のエクソンのスプライス部位に影響を及ぼす変異からなる（Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．上記）。最後の０．５％の変異は、ＤＭＤ遺伝子のイントロン領域全体にわたる可変かつ高度に特異的な変異からなる（Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．上記）。この広範な変異プロファイルにもかかわらず、遺伝子編集は、上記の多くのタイプの変異を修正する大きな可能性を示している。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート及び関連するタンパク質９（「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９」又は「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９」）は、ウイルス侵入者から細菌を保護するために、ＲＮＡプログラム可能なエンドヌクレアーゼを利用する細菌に見られる適応免疫系である。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質からなるこの系は、ｇＲＮＡに相補的な部位で、かつプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位として知られる短い認識配列の近くで、正確な二本鎖切断（ＤＳＢ）を行うために再利用されている（図２）。Ｃａｓ９（以前はＣａｓ５、Ｃｓｎ１、又はＣｓｘ１２と呼ばれていたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）は、ＤＮＡウイルス及びプラスミドに対する特定の細菌の免疫学的防御において重要な役割を果たし、遺伝子工学用途で多用されている１６０キロダルトンのタンパク質である。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ配列を、ＣＲＩＳＰＲ配列に相補的なＤＮＡの特定の鎖を認識し、切断するためのガイドとして使用する酵素である。Ｃａｓ９酵素は、ＣＲＩＳＰＲ配列とともに、生物内の遺伝子を編集するために使用され得るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９として知られる技術の基礎を形成する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２３（Ｒ１）：Ｒ４０－６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｕ１２５．ＰＭＩＤ ２４６５１０６７）。この編集プロセスは、基礎的な生物学的研究、バイオテクノロジー製品の開発、及び疾病の治療を含む幅広い用途を有する。
本開示は、本明細書に開示される遺伝子編集複合体、方法及び用途においてＣａｓ９を利用する。本開示には、その機能的断片を含む、Ｃａｓ９の全ての種、ホモログ、及び変異体の使用が含まれた。大きさ及びＰＡＭ認識配列に差異を有する、異なる細菌由来のＣａｓ９タンパク質のいくつかの異なるホモログが存在する。最もよく特徴付けられた変異体は、１，３７１個のアミノ酸によってコードされ、５’－ＮＧＧ－３’のＰＡＭ認識配列を有する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）由来のＣａｓ９である（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２５８２９（２０１２）、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ８，２２８１－２３０８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１３．１４３（２０１３）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ ９８、１２０５－１２４０、ｄｏｉ：１０．１１５２／ｐｈｙｓｒｅｖ．０００４６．２０１７（２０１８））。あまり一般的には使用されていないＣａｓタンパク質は、ＳｐＣａｓ９とは対照的に、１，０５３個のアミノ酸によってコードされ、５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’（配列番号１６３）のＰＡＭ認識配列を有するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）由来である（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６－１９１，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４２９９（２０１５））。より小さいＳａＣａｓ９タンパク質の使用は、いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９，９９３３－９９４４，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７９．１５．９９３３－９９４４．２００５（２００５））等のウイルスベクターに関連する限られたカーゴ空間（約５ｋｂ）のためウイルス送達遺伝子療法に好ましい。それにもかかわらず、本開示には、Ｃａｓ９の全ての様々な種、ホモログ、及び変異体の使用が含まれ、本明細書に例示される特定のＣａｓ９に限定されない。例示的な態様において、本開示は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（配列番号１６１）又は核局在化シグナルを有するＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（配列番号１８１）、及びＣ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（配列番号１６２）又は核局在化シグナルを有するＣ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（配列番号１８３）をコードするヌクレオチド配列を提供する。
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ホモログ、Ｃａｓ９オルソログ、及び操作されたＣａｓ９変異体を含むＣａｓ９相同体、並びに当該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ９相同体、Ｃａｓ９オルソログ、及び操作されたＣａｓ９変異体を含むＣａｓ９変異体を使用する方法（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＮａｔＣｏｍｍｕｎ １１，３５７６（２０２０）、ＷＯ２０１４／１９１５２１）及びｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９（例えば、ＷＯ２０１６／１１２２４２、ＷＯ２０１７／１９７２３８）を含む。本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ９」という用語は、分割Ｃａｓ９を含む、Ｃａｓ９の任意の種、ホモログ、オルソログ、操作された、又は変異体、又はその機能的断片である。大きさ及びＰＡＭ認識配列に差異を有する、異なる細菌由来のＣａｓ９タンパク質のいくつかの異なるホモログが存在する。本開示の種々の例示的な態様において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）が提供される。本開示は、これらの特定の種のＣａｓ９に限定されない。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、哺乳動物コドン最適化される。いくつかの態様において、例えば、ＳａＣａｓ９は、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５，２０１９ １１６（４２）２０９６９－２０９７６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１９０６８４３１１６）によって記述される。いくつかの態様において、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９は市販されており、例えばＡｄｄｇｅｎｅのＰＸ４０４（カタログ番号６８３３８、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／６８３３８／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／）である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９は、文献（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ１ＪＨ４３（Ｑ１ＪＨ４３＿ＳＴＲＰＤ））に記載されている。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、核局在化シグナルで修飾される（例えば、配列番号１８１又は１８３に記載されるように）。
相同性非依存的標的化組み込み
本開示は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路使用した高効率なノックアウトを達成するために、相同性非依存的標的化組み込み（ＨＩＴＩ）を利用する（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５４０，１４４－１４９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２０５６５（２０１６）、Ｚａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｐｒｏｃｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ．２０：２１（２０１８）ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２５７５－０１８－００８６－５、Ｒｏｍａｎ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２５（５）：６０７－２１（２０１９））。ＨＩＴＩは、ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びｉｉ）所望のノックイン断片に隣接するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断部位を含有するドナーＤＮＡ（図３）（Ｓｕｚｕｋｉ，上記）の２つの構成要素を必要とする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ドナーＤＮＡも切断し、それをゲノムＤＳＢに組み込むためのＮＨＥＪ基質として活性化しながら、ゲノムＤＮＡ切断を生成する。ＨＩＴＩは、当初、単一の標的部位で設計され、色素性網膜炎のラットモデル（Ｓｕｚｕｋｉ、上記）に関与する遺伝子であるＭｅｒｔｋの欠損エクソンをノックするために利用されてきた。ＨＩＴＩ処置ラットは、処置されていない又はＨＤＲ処置された対応物と比較したとき、改善された眼機能を示した（Ｓｕｚｕｋｉ、上記）。Ｓｕｚｕｋｉの研究では、マウスを使用した、全身性ＡＡＶ媒介性のレポーター遺伝子のＨＩＴＩノックインのインビボ効率が、大腿四頭筋で約１０％、心筋で約３～４％であることを示した（Ｓｕｚｕｋｉ、上記）。ＨＩＴＩを使用した遺伝子編集も、国際特許公開第ＷＯ２０１７／１９７２３８号に記載されており、その全体が本明細書に援用される。
本開示は、ＨＩＴＩベースの遺伝子編集戦略を利用して、ＤＭＤ遺伝子の欠損、重複、異常、又は異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンを置き換える。本明細書に開示されるＨＩＴＩに基づく遺伝子編集戦略は、ジストロフィン欠乏症に罹患している患者における、全長ジストロフィンを含むジストロフィンの回復を可能にするように設計された。現在の治療法に対するこの遺伝子編集アプローチの利点には、ジストロフィンタンパク質の回復、及びいくつかの態様において、ＤＭＤに罹患した人々の機能的転帰に対するジストロフィンの切断されたアイソフォームの既知の長期的な結果に起因する魅力的な概念である全長ジストロフィンタンパク質の回復が含まれる。このアプローチは、ゲノムレベルでジストロフィンを補正するため、この療法は、所望の効果を有するために生涯にわたる投与を必要とする療法とは対照的に１回投与である可能性がある。ゲノム補正を目的とする他の療法に対するこの療法の更なる利点は、利益を得るであろう患者コホートの範囲である。特定の変異を標的とするアプローチではなく、本開示は、イントロン１～１９及びイントロン４０～５５に包含される領域内のＤＭＤ遺伝子座に関与する、周囲にある、又は影響を及ぼす変異を含むがこれらに限定されない、ＤＭＤ遺伝子のより大きな標的領域内の任意の変異を効果的に補正する方法を提供する。いくつかの態様において、変異は、ＤＭＤ遺伝子のＤＭＤエクソン１～１９、２～１９、又は４１～５５に関与している、周囲にある、又は影響を及ぼしている。いくつかの態様において、変異は、ＤＭＤ Ｄｐ４２７ｍプロモーター、５’非翻訳領域、並びにエクソン１～イントロン１９によって包含される。他の研究者は、ＤＭＤ遺伝子の小さな領域の置き換え（すなわち、ＵＳ２０１６／０２０１０８９、ＵＳ２０１９／０１３４２２１）について発表しているが、本開示は、ＨＩＴＩベースの遺伝子編集戦略を使用して、１５個を超えるエクソンをカバーするＤＭＤ遺伝子の大きな領域を置き換える製品及び方法を対象とする。
ＨＩＴＩは、３つの成分を含む：ｉ）目的の遺伝子、すなわち、ＤＭＤ遺伝子上のユーザ選択部位でＤＮＡ二本鎖切断を生成するためのＣａｓ９、ｉｉ）Ｃａｓ９をユーザが選択したＤＮＡ部位にガイドするためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及びｉｉｉ）ｇＲＮＡ標的部位のうちの１つ以上に隣接する所望のノックイン配列を含有するドナーＤＮＡ（図１１）。重要なことに、ＨＩＴＩは、ＮＨＥＪ ＤＮＡ修復経路を使用し、これは、ｉ）ドナー組み込みなしでのＤＮＡ末端の再結合、ｉｉ）ドナーの正しい組み込み、及びｉｉｉ）逆ドナー組み込み（図１１）を含む、多くの潜在的な修復結果をもたらす可能性がある。正しいドナー組み込みの可能性を向上させるために、ＨＩＴＩドナーＤＮＡ内の標的部位は、ゲノム標的部位の逆相補物として操作され、逆組み込みは、これらの標的部位を再構成し、Ｃａｓ９による切断及びＮＨＥＪによる潜在的なノックインの追加ラウンドを可能にする（図１１）。正しく組み込まれると、標的部位は切除され、したがって、Ｃａｓ９による更なる切断を防止する。エクソン４１～５５の置き換えについて、ドナー組み込みなしのエクソン４１～５５の欠失は、一貫したリーディングフレームをもたらし、潜在的にベッカー様ジストロフィンアイソフォームの発現をもたらし（図１１）、この転帰の治療可能性を増加させる。
ガイドＲＮＡ、標的部位、及びドナーＤＮＡ
本開示は、ユーザが選択したＤＮＡ部位にＣａｓ９をガイドするためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ標的化のためのＤＭＤ遺伝子上の標的部位、ｇＲＮＡ標的部位のうちの１つ以上に隣接する所望のノックイン配列を含有するドナーＤＮＡ、及びＤＭＤ遺伝子上のユーザが選択した部位でＤＮＡ二本鎖切断を生成するためのＣａｓ９を含む。
本開示は、本明細書に記載の様々なヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる様々な核酸を含む。いくつかの態様において、核酸は、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸は、本質的に、ヌクレオチド配列からなる。いくつかの態様において、核酸は、ヌクレオチド配列からなる。
本明細書で使用される場合、「標的」又は「標的配列」又は「標的核酸」は、標的配列と呼ばれる、本明細書で提供される配列の前方鎖又は後方鎖のいずれかである。したがって、特許請求の範囲に記載される標的核酸は、コード鎖又はその相補体である。例えば、表１及び３において、標的配列は、ＤＭＤ遺伝子のコード鎖として提供される。表２及び４には、完全な配列がコード鎖として示されているが、ｇＲＮＡ標的部位は、ＨＩＴＩが非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路を使用して高効率ノックインを達成するために必要とされるコード鎖配列の逆相補体に変更されている。
本明細書で以下に提供する表１は、完全なｇＲＮＡ配列、ｇＲＮＡのスペーサー配列、直接反復ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及びガイドＲＮＡが標的化するように設計されている標的配列を含む、ヒトＤＭＤイントロン４０又は５５を標的とするＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｇＲＮＡを提供する。ｇＲＮＡは、ＤＭＤ遺伝子のコード鎖又は非コード鎖のみに結合するように設計されておらず、一方に結合するものもあれば、他方に結合するものもある。Ｃａｓ９は、結合及び切断するために二本鎖ＤＮＡを必要とするが、ｇＲＮＡは、２本鎖のうちの１本のみにアニールする。それにもかかわらず、Ｃａｓ９は、所与の配列の両方の鎖に結合し、切断する。天然のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９系は、２つのＲＮＡを含有し、１つは、ｃｒＲＮＡと呼ばれ、スペーサー（その標的化特異性を割り当てる）直接反復（ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣａｓ９と結合するのを助ける）と呼ばれる配列と、ｃｒＲＮＡ直接反復に相補的な領域を含有し、それらがＣａｓ９に結合するｄｓＲＮＡを形成するようにｃｒＲＮＡ直接反復配列にアニールするｔｒａｃｒＲＮＡとを含有する。ガイドＲＮＡは、コード鎖又は非コード鎖のいずれかを標的にすることができる。ｇＲＮＡが結合するように設計されるべき鎖は、ＰＡＭ配列がどの鎖上にあるかに依存する。ＰＡＭを含有する鎖（例えば、ＳａＣａｓ９の５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’））は、非標的鎖と呼ばれ、ｇＲＮＡの対応するスペーサー領域の配列と一致するプロトスペーサー配列を含有する。したがって、ｇＲＮＡのスペーサー領域は、非ＰＡＭ含有鎖（標的鎖）に結合する。表に示される標的配列は、ＤＭＤ遺伝子のコード配列であり、したがって、標的鎖又は非標的鎖のいずれかであり得る。例えば、ｇＲＮＡ配列番号１（ＧＵＡＵＵＣＡＵＵＣＡＡＣＡＵＵＡＣＧＵＣＡＡ）は、表に提示された鎖（コード鎖）上の標的配列配列番号１１２（ＡＴＴＣＡＡＴＴＧＡＣＧＴＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＴＡ）に結合し、ｇＲＮＡ配列番号６は、表に提示された鎖とは反対の鎖（非コード鎖）上の標的配列配列番号１１７に結合する。Ｃａｓ９は、一方の鎖がＰＡＭを含有し、他方が標的配列（すなわち、標的鎖）を含有する二本鎖ＤＮＡを必要とする。本開示の態様において、イントロン４０を標的とするように設計されたＪＨＩ４０ ｇＲＮＡのうちの１つは、イントロン５５を標的とするように設計されたＪＨＩ５５ ｇＲＮＡのうちの１つとともに使用される。例示的な態様において、ＪＨＩ４０－００８は、ＪＨＩ５５Ａ－００４と組み合わせて使用される。
本明細書において以下に提供する表２は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４１～５５の置き換えのためのドナー配列を提供する。表２は、完全なドナー配列、ＪＨＩ５５Ａ－００４標的部位配列、分岐点、ポリピリミジントラクト、及びスプライスアクセプターを含有するイントロン４０断片の配列、ＤＭＤエクソン４１～５５コード配列、スプライスドナー部位を含有するイントロン５５断片、並びにＪＨＩ４０－００８標的部位を提供する。完全なドナー配列は、１）エクソンのコード配列、２）隣接するイントロンエレメント（下流スプライスドナー及び上流スプライスアクセプター、ポリピリミジントラック、及び分岐点配列）、並びに３）末端のＣａｓ９標的部位を含有する。
本明細書において以下に提供する表３は、完全なｇＲＮＡ配列、ｇＲＮＡのスペーサー配列、直接反復ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及びガイドＲＮＡが標的とするように設計されている標的配列を含む、ヒトＤＭＤイントロン１又は１９を標的とするＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｇＲＮＡ配列を提供する。本開示の態様において、イントロン１を標的とするように設計されたＤＳＡｉ１又はＤＣＪｉ１ ｇＲＮＡのうちの１つは、イントロン１９を標的とするように設計されたＤＳＡｉ１９又はＤＳＪｉ１９ ｇＲＮＡのうちの１つとともに使用される。例示的な態様において、ＤＳＡｉ１－０３は、ＤＳＡｉ１９－００４と組み合わせて使用される。
本明細書において下に提供する表４は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２～１９の置き換えのためのドナー配列を提供する。表４は、完全なドナー配列、ＤＳＡｉ１９－００４標的部位配列、分岐点、ポリピリミジントラック、及びスプライスアクセプターを含有する上流イントロン断片の配列、ＤＭＤエクソン２～１９コード配列、スプライスドナー部位を含有する下流イントロン断片、並びにＤＳＡｉ１－０３標的部位を提供する。完全なドナー配列は、１）エクソンのコード配列、２）隣接するイントロンエレメント（下流スプライスドナー及び上流スプライスアクセプター、ポリピリミジントラック、及び分岐点配列）、並びに３）末端のＣａｓ９標的部位を含有する。
本明細書において以下に提供される表５は、本開示の方法で使用される例示的なＣａｓ９コード配列を提供する。本明細書におけるこれらの配列の提供は、例示的な目的のためのものであり、本開示の方法をこれらの特定のＣａｓ９配列に限定することを意図するものではない。上記に記載されるように、本開示の方法は、任意のＣａｓ９タンパク質又はその機能的断片を用いて実施されることを意図している。




































本明細書において上に記載されるように、本開示は、相同性非依存的標的化組み込み（ＨＩＴＩ）を利用して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路を使用して高効率ノックインを達成する。したがって、いくつかの態様において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが二本鎖切断を作製することができるように、特定のゲノム領域での標的部位へのガイドＲＮＡを利用し、提供する。いくつかの態様において、本開示は、ヒトＤＭＤイントロン４０又は５５を標的とするＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｇＲＮＡを含む。いくつかの態様において、本開示は、ヒトＤＭＤイントロン４０又は５５を標的とするＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｇＲＮＡを含む。いくつかの態様において、本開示は、ヒトＤＭＤイントロン４０又は５５を標的とするＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡを含む。いくつかの態様において、本開示は、ヒトＤＭＤイントロン１又は１９を標的とするＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｇＲＮＡを含む。いくつかの態様において、本開示は、ヒトＤＭＤイントロン１又は１９を標的とするＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｇＲＮＡを含む。いくつかの態様において、本開示は、ヒトＤＭＤイントロン１又は１９を標的とするＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡを含む。
いくつかの態様において、本開示は、ＤＭＤイントロン４０又は５５を標的とするガイドＲＮＡを提供し、ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１～９のうちのいずれか、又は配列番号１～９のうちのいずれかに示される配列に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むその変異体を含む。表１を参照されたい。
いくつかの態様において、本開示は、ＤＭＤイントロン１又は１９を標的とするガイドＲＮＡを提供し、ｇＲＮＡをコードする核酸は、配列番号１～９のうちのいずれか、又は配列番号１０～３７のうちのいずれかに示される配列に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むその変異体を含む。表１を参照されたい。
いくつかの態様において、本開示は、配列番号１５５に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１５５に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むその変異体を含む、エクソン２～１９の置き換えのための完全ドナー配列を提供する。いくつかの態様において、本開示は、配列番号１５８に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１５８に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むその変異体、をコードするＤＭＤエクソン２～１９を提供する。表４を参照されたい。
いくつかの態様において、本開示は、ＤＭＤイントロン４０又は５５のヒトゲノム標的配列を提供し、ｇＲＮＡをコードする核酸は、標的化するように設計される。いくつかの態様において、このようなＤＭＤ標的配列は、配列番号１１２～１２０のうちのいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む。表３を参照されたい。
いくつかの態様において、本開示は、ＤＭＤイントロン１又は１９のヒトゲノム標的配列を提供し、ｇＲＮＡをコードする核酸は、標的化するように設計されている。いくつかの態様において、このようなＤＭＤ標的配列は、配列番号１２１～１４８のうちのいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む。表３を参照されたい。
いくつかの態様において、本開示は、配列番号１４９又は１８７に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１４９又は１８７に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むその変異体を含む、エクソン４１～５５の置き換えのための完全ドナー配列を提供する。いくつかの態様において、本開示は、配列番号１５２又は１８８に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１５２又は１８８に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むその変異体を含む配列、をコードするＤＭＤエクソン４１～５５を提供する。表２及び１０を参照されたい。
いくつかの態様において、本開示は、配列番号１７２又は１７６に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７２又は１７６に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むその変異体を含む、エクソン１～１９の置き換えのための完全ドナー配列を提供する。表８を参照されたい。
いくつかの態様において、本開示は、エクソン１～１９の置き換えのためのドナー配列の様々なサブ部分に対する固有の配列を提供し、そのような配列は、配列番号１７３～１７５、１７７、及び１７８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７３～１７５、１７７、及び１７８に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むその変異体を含む。表８を参照されたい。
本開示は、配列番号１７９に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、又は配列番号１７９に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％の同一性を含むその変異体を含むヌクレオチド配列を含む核局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号１８０に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号１８０に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％の同一性を含むその変異体、をその５’末端に含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａ）酵素をコードする核酸を提供する。いくつかの態様において、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ９又はＣａｓ１３である。
いくつかの態様において、本開示は、Ｃａｓ９コード配列を提供する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、哺乳動物コドン最適化される。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、核局在化配列で修飾される。いくつかの態様において、本開示は、核局在化シグナルで修飾された任意のＣａｓ配列を提供する。
例示的な態様において、Ｃａｓ９は、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示されるヌクレオチド配列（表５を参照）を含む核酸、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示される配列に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる。いくつかの態様において、本開示の方法は、配列番号１６１又は１８１に示されるヌクレオチド配列を含むものなどのＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、配列番号１６１又は１８１に示される配列に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片を含む。いくつかの態様において、本開示の方法は、配列番号１６２又は１８３に示されるヌクレオチド配列を含むものなどのＣ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９、配列番号１６２又は１８３に示される配列に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片を含む。
本明細書において上に記載されるように、本開示は、相同性非依存的標的化組み込み（ＨＩＴＩ）を利用して、ドナー配列をノックするために非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路を使用して高効率ノックインを達成する。したがって、いくつかの態様において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼがドナー配列の挿入のために二本鎖切断を作製することができるように、特定のゲノム領域の標的部位へのガイドＲＮＡを利用し、提供する。いくつかの態様において、ドナー配列は、エクソン４１～５５を置き換えるように設計される。いくつかの態様において、ドナー配列は、配列番号１４９又は１５２、又は１８７又は１８８に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１４９又は１５２、又は１８７又は１８８に示される配列に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むそれらのいずれかの変異体を含むエクソン４１～５５を置き換えるように設計される。いくつかの態様において、ドナー配列は、エクソン２～１９を置き換えるように設計される。例示的な態様において、エクソン２～１９を置き換えるように設計されたドナー配列は、配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１５５若しくは１５８に示される配列に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含むその変異体を含む。
いくつかの態様において、Ｃａｓ９をコードする核酸は、細胞における発現のためのウイルスベクターを含む、哺乳動物発現ベクターに挿入される。いくつかの態様において、Ｃａｓ９の哺乳動物ｇＲＮＡをコードする核酸は、細胞における発現のためのウイルスベクターを含む哺乳動物発現ベクターにクローニングされる。
いくつかの態様において、ガイドＲＮＡ及び／又はＣａｓ９をコードするＤＮＡは、プロモーターの発現下にある。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターである。
いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーターである。内因性Ｕ６プロモーターは、通常、スプライシングに関与する小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）であるＵ６ ＲＮＡの発現を制御し、十分に特徴付けられている［Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３２２（６０７４）：７３－７（１９８６）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２（２）：１９６－２０４（１９８８）、Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（６）：１２８３－９８（２０００）］。いくつかの態様において、Ｕ６プロモーターは、哺乳動物細胞におけるｓｈＲＮＡ分子のベクターベースの発現を制御するために使用される［Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（３）：１４４３－８（２００２）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（５）：５０５－８（２００２）］、なぜならば、（１）プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ポリＩＩＩ）によって認識され、ｓｈＲＮＡの高レベルで構成的な発現を制御し、（２）プロモーターは、ほとんどの哺乳動物細胞型において活性であるためである。いくつかの態様において、プロモーターは、ｓｈＲＮＡの発現を制御するために必要な全ての要素が転写開始部位の上流に位置するという点で、ＩＩＩ型Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである（Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（６）：１２８３－９８（２０００））。本開示は、マウス及びヒトＵ６プロモーターの両方を含む。ループによって接続された標的遺伝子からのセンス及びアンチセンス配列を含有するｓｈＲＮＡは、核から細胞質に輸送され、そこでダイサーは、それを小／短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に処置する。
本開示の実施形態は、ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ随伴ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、及びワクシニアウイルスなどのウイルスベクター）を利用して、本明細書に開示されるＤＭＤ ＲＮＡ（ドナー配列）、ＤＭＤ ｇＲＮＡ、及びＣａｓ９酵素をコードするポリヌクレオチドを送達する。いくつかの態様において、ＤＭＤ ｇＲＮＡ及びＤＭＤドナー配列のセットをベクターにクローニングする。いくつかの態様において、ＤＭＤ ｇＲＮＡ、ＤＭＤドナー配列、及びＣａｓ９配列のセットをベクターにクローニングする。いくつかの態様において、ＤＭＤ ｇＲＮＡ、ＤＭＤドナー配列、及びＣａｓ９配列のそれぞれは、それぞれ独自のベクターに個別にクローニングされる。したがって、いくつかの態様において、本開示は、本開示において上記に記載されるヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含むベクターを含む。いくつかの態様において、ベクターは、ＡＡＶベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、一本鎖ＡＡＶベクターである。いくつかの態様において、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を欠く。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶである。
いくつかの態様において、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を利用して、ｇＲＮＡをコードする核酸、ドナーＤＭＤ配列をコードする核酸、及び／又はＣａｓ９をコードする核酸、若しくそのオルソログ若しくは変異体を送達する。ＡＡＶは、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含み長さが約４．７ｋｂである。ＡＡＶの複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）に提供されており、ＡＡＶ３の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ４の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ６の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００ １８６２に提供されており、ＡＡＶ７及びＡＡＶ８ゲノムの少なくとも一部はＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ａ．ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９にそれぞれ提供されており（ＡＡＶ８に関する米国特許番号７，２８２，１９９及び７，７９０，４４９も参照されたい）、ＡＡＶ ９ゲノムはＧａｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ１０ゲノムはＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており、ＡＡＶ１１ゲノムはＶｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組み込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を推進する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）が産生される。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連キャプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。
ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染はサイレントおよび無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミドにおいてクローニングされたＤＮＡとして感染性であり、組換えゲノムの構築を実現可能にする。更に、ＡＡＶ複製及びゲノムカプシド形成及び組み込みを指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるために、内部の約４．３ｋｂのゲノム（複製及び構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部又は全てが、外来ＤＮＡで置き換えられてもよい。ｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定かつ頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６°～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥されてもよく、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。
本開示の組換えＡＡＶゲノムは、少なくとも１つのＤＭＤ標的化ポリヌクレオチド構築物に隣接している１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ＤＭＤを標的とする他のポリヌクレオチド構築物とともに投与される。したがって、いくつかの態様において、ＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ＤＭＤドナー配列をコードするポリヌクレオチドとともに投与される。様々な態様において、ｇＲＮＡは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターなどのプロモーターを含むがこれらに限定されない様々なプロモーターの下で発現される。詳細には、この戦略は、様々な態様において、単一のバックボーンにおける複数のコピーにおける同じｇＲＮＡのより効率的な発現を達成するために使用される。ｒＡＡＶゲノム内のＡＶＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、限定するものではないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、又はＡＡＶｒｈ．７４が挙げられる。本明細書において上に示されるこれらの様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野において既知である。
本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組み立てのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に移行される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ８０、及びＡＡＶｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ｒＡＡＶゲノム内のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来し、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、又はＡＡＶｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも本開示に含まれる。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上に示される、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野において既知である。同族成分の使用が、特に企図される。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０１／８３６９２に開示される。
本開示の組換えＡＡＶゲノムは、例えば、１つ以上のガイドＲＮＡ、ドナーＤＮＡ配列、又はＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。実施形態は、配列番号１～３９のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む核酸を含むｒＡＡＶゲノムを含む。
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要なすべての成分を安定して発現する細胞株を作成することである。例えば、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、又は直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順により細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。適切な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムおよび／またはｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。
ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５、並びに対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。
したがって、本開示は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態において、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定に形質転換されたがん細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、及びＷＯ９８／０９６５７に開示される方法を含む。
別の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の構築物のいずれかを含むｒＡＡＶを含む組成物を含む。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載されるｇＲＮＡを送達するためのｒＡＡＶを含む組成物を含む。いくつかの態様において、本開示は、ｒＡＡＶが、本明細書に記載のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列、ＤＭＤドナー配列をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列及び／又はＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物を含む。本開示の組成物は、ｒＡＡＶ及び１つ以上の薬学的又は生理学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含む。許容される担体および希釈剤は、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量および濃度では不活性であり、リン酸塩、クエン酸塩、もしくは他の有機酸塩などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、プルロニック（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
いくつかの態様において、本開示は、ゲノムＣａｓ９切断部位及び２つのｇＲＮＡによってドナー配列の各側面に隣接するノックインドナー配列を含む１つのプラスミド、並びにｇＲＮＡスペーサー配列によって決定されるＤＮＡ遺伝子座で二本鎖ＤＮＡ切断を生成することができるＣａｓ９酵素又はその機能的断片を含む第２のプラスミドを含む、二重プラスミド系を含む。いくつかの態様において、プラスミドは、送達のためにｒＡＡＶに導入される。いくつかの態様において、プラスミドは、ベクトル化されていない送達を介して細胞に導入される。
滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌されている注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、治療目標、標的化された個体、および細胞型に応じて異なり、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍＬ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３～約１×１０１４、またはそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投与量はまた、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位（例えば、それぞれ１×１０７ｖｇ、１×１０８ｖｇ、１×１０９ｖｇ、１×１０１０ｖｇ、１×１０１１ｖｇ、１×１０１２ｖｇ、１×１０１３ｖｇ、１×１０１４ｖｇ）で表されてもよい。
一実施形態において、本開示は、ｇＲＮＡをコードする核酸、ドナーＤＭＤ配列をコードする核酸、及び／又はＣａｓ９又はその機能的断片をコードする核酸の非ベクトル化送達を含む。いくつかの態様において、この文脈では、核酸と複合体を形成し、細胞外及び細胞内ヌクレアーゼからそれらを保護することができる合成担体は、ウイルスベクターの代替物である。本開示は、そのような非ベクトル化送達を含む。本開示はまた、本明細書に記載の構築物のいずれかを単独で又は組み合わせて含む組成物を含む。
いくつかの態様において、本開示は、（ｉ）配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、若しくは配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体、又は配列番号１１２～１１７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体を含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号１１８～１２０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号１４９、又は１５２、又は１８７、又は１８８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むエクソン４１～５５の置き換えのためのドナー配列、又は配列番号１４９、又は１５２、又は１８７、又は１８８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそれらのいずれかの変異体、並びに（ｉｖ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片コードする核酸、を含む任意の１つ以上の核酸を、それを必要とする細胞又は対象に送達する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、（ｉ）ＤＭＤ ｇＲＮＡ（イントロン４０及び５５のそれぞれを標的とする１つのｇＲＮＡ）、（ｉｉ）ＤＭＤドナー配列、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片、をコードする核酸を含むＡＡＶを対象に投与することを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸は、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示されるヌクレオチド配列、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片を含む。いくつかの態様において、方法は、（ｉ）少なくとも２つのＤＭＤ ｇＲＮＡ（少なくとも１つのｇＲＮＡはイントロン４０を標的とし、他のｇＲＮＡはイントロン５５を標的とする）、（ｉｉ）ＤＭＤドナー配列、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片、をコードする核酸を対象に投与することを含み、いくつかの態様において、方法は、１つ以上のＡＡＶベクター内で核酸を送達することを含む。いくつかの態様において、方法は、核酸を非ベクター化送達で送達することを含む。
いくつかの態様において、本開示は、（ｉ）配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体、又は配列番号１２１～１３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡコードするヌクレオチド、又は配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体、又は配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むエクソン２～１９の置き換えのためのドナー配列、又は配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むその変異体、並びに（ｉｖ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を含む任意の１つ以上の核酸をそれを必要とする細胞又は対象に送達する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、（ｉ）ＤＭＤ ｇＲＮＡ（イントロン１及び１９のそれぞれを標的とする１つのｇＲＮＡ）、（ｉｉ）ＤＭＤドナー配列、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片、をコードする核酸を含むＡＡＶを対象に投与することを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸は、配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示されるヌクレオチド配列、配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片を含む。いくつかの態様において、方法は、（ｉ）少なくとも２つのＤＭＤ ｇＲＮＡ（少なくとも１つのｇＲＮＡはイントロン１を標的とし、他のｇＲＮＡはイントロン１９を標的とする）、（ｉｉ）ＤＭＤドナー配列、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片、をコードする核酸を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、方法は、１つ以上のＡＡＶベクター内で核酸を送達することを含む。いくつかの態様において、方法は、核酸を非ベクター化送達で送達することを含む。
更に別の態様において、本開示は、細胞におけるＤＭＤ遺伝子の発現を増加させる、又は機能的ジストロフィンの発現を増加させる方法を提供し、（ｉ）配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体、又は配列番号１１２～１１７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体を含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号１１８～１２０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号１４９、又は１５２、又は１８７、又は１８８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むエクソン４１～５５の置き換えのためのドナー配列、又は配列番号１４９、又は１５２、又は１８７、又は１８８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそれらのいずれかの変異体、並びに（ｉｖ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片コードする核酸、を含む核酸を有する細胞を、それを必要とする細胞又は対象に接触させることを含む。いくつかの態様において、方法は、（ｉ）ＤＭＤ ｇＲＮＡ（イントロン４０及び５５のそれぞれを標的とする１つのｇＲＮＡ）、（ｉｉ）ＤＭＤドナー配列、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片、をコードする核酸を含むＡＡＶを対象に投与することを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸は、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示されるヌクレオチド配列、配列番号１６１、１６２、１８１、又は１８３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片を含む。いくつかの態様において、方法は、（ｉ）少なくとも２つのＤＭＤ ｇＲＮＡ（少なくとも１つのｇＲＮＡはイントロン４０を標的とし、他のｇＲＮＡはイントロン５５を標的とする）、（ｉｉ）ＤＭＤドナー配列、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片、をコードする核酸を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、方法は、１つ以上のＡＡＶベクター内で核酸を送達することを含む。いくつかの態様において、方法は、核酸を非ベクター化送達で送達することを含む。
更に別の態様において、本開示は、細胞におけるＤＭＤ遺伝子の発現を増加させる、又は機能的ジストロフィンの発現を増加させる方法を提供し、（ｉ）配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体、又は配列番号１２１～１３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体、又は配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むエクソン２～１９の置き換えのためのドナー配列、又は配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むその変異体、並びに（ｉｖ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を含む核酸を有する細胞を、それを必要とする細胞又は対象に接触させることを含む。いくつかの態様において、方法は、（ｉ）ＤＭＤ ｇＲＮＡ（イントロン１及び１９のそれぞれを標的とする１つのｇＲＮＡ）、（ｉｉ）ＤＭＤドナー配列、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片、をコードする核酸を含むＡＡＶを対象に投与することを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸は、配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示されるヌクレオチド配列、配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片を含む。いくつかの態様において、方法は、（ｉ）少なくとも２つのＤＭＤ ｇＲＮＡ（少なくとも１つのｇＲＮＡはイントロン１を標的とし、他のｇＲＮＡはイントロン１９を標的とする）、（ｉｉ）ＤＭＤドナー配列、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片、をコードする核酸を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、方法は、１つ以上のＡＡＶベクター内で核酸を送達することを含む。いくつかの態様において、方法は、核酸を非ベクター化送達で送達することを含む。
いくつかの態様において、ＤＭＤの発現又は機能的ジストロフィンの発現は、本明細書において提供される方法によって、細胞又は対象において少なくとも若しくは約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、又は１００パーセント増加される。
いくつかの態様において、本開示は、（ｉ）配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体、又は配列番号１１２～１１７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体を含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号１１８～１２０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号１４９、又は１５２、又は１８７、又は１８８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むエクソン４１～５５の置き換えのためのドナー配列、又は配列番号１４９、又は１５２、又は１８７、又は１８８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそれらのいずれかの変異体、並びに（ｉｖ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片コードする核酸、を含む核酸を含む組換え遺伝子編集複合体であって、それらが細胞又は対象に送達されてＤＭＤ遺伝子を編集し、ＤＭＤドナー配列を挿入して、細胞又は対象内の機能的ジストロフィンの発現を回復、又は増加させる、組換え遺伝子編集複合体を提供する。このような遺伝子編集複合体は、ＤＭＤの発現を操作し、機能的ジストロフィン発現を増加させ、そして、特にＤＭＤ遺伝子のものなどの疾患関連配列が相反して発現されるＲＮＡレベルで、筋ジストロフィーなどの異常なＤＭＤ発現に関連する遺伝子疾患を治療するために使用される。
いくつかの態様において、本開示は、（ｉ）配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体、又は配列番号１２１～１３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体、又は配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むエクソン２～１９の置き換えのためのドナー配列、又は配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むその変異体、並びに（ｉｖ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を含む核酸を含む組換え遺伝子編集複合体であって、それらが細胞又は対象に送達されてＤＭＤ遺伝子を編集し、ＤＭＤドナー配列を挿入して、細胞又は対象内の機能的ジストロフィンの発現を回復、又は増加させる、組換え遺伝子編集複合体を提供する。このような遺伝子編集複合体は、ＤＭＤの発現を操作し、機能的ジストロフィン発現を増加させ、そして、特にＤＭＤ遺伝子のものなどの疾患関連配列が相反して発現されるＲＮＡレベルで、筋ジストロフィーなどの異常なＤＭＤ発現に関連する遺伝子疾患を治療するために使用される。
いくつかの態様において、本開示は、少なくとも２つのＤＭＤ ｇＲＮＡ（１つは、各イントロン、すなわち、１及び１９、又は４０及び５５を標的とする）、ＤＭＤドナー配列、及び／又はＣａｓ９酵素、又はその機能的断片をコードする核酸を送達するためのＡＡＶ形質導入細胞を提供する。インビボ又はインビトロで、ｒＡＡＶで標的細胞を形質導入する方法が、本開示に含まれる。方法は、有効用量、又は有効複数回用量の、本開示のｒＡＡＶを含む組成物を、それを必要とする動物を含む対象（ヒトを含む）に投与するステップを含む。用量が筋ジストロフィーの発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が筋ジストロフィーの発症後に投与される場合、投与は治療的である。本開示の実施形態において、有効用量は、治療される筋ジストロフィーに関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除若しくは低減）する、筋ジストロフィーの進行を遅延若しくは予防する、筋ジストロフィーの進行を遅延若しくは予防する、疾病の程度を軽減する、筋ジストロフィーの寛解（部分又は完全）をもたらす、及び／又は生存を延長する用量である。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、ＤＭＤである。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、ＢＭＤである。
併用療法も本開示によって企図される。本明細書で使用する組み合わせは、同時治療または連続治療を含む。本開示の方法と標準的な医学的治療（例えば、コルチコステロイドおよび／または免疫抑制薬）との組み合わせは、参照によって本明細書にその全体が組み込まれる、国際公開第２０１３／０１６３５２号に開示されるものなどの他の療法との組み合わせと同様に、具体的に企図される。
有効用量の組成物の投与は、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、口腔、鼻腔、肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、直腸又は膣を含むが、これらに限定されない、当該技術分野における標準的な経路により得る。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、治療される疾病状態、及びＤＭＤを発現する細胞などの標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合され得る。いくつかの実施形態では、投与経路は筋肉内投与である。いくつかの実施形態では、投与経路は静脈内投与である。
特に、本開示のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送するであろう任意の物理的方法を使用することによって達成される。本開示による投与には、筋肉、血流、中枢神経系への注入、及び／又は脳又は他の器官への直接注入が含まれるが、これらに限定されない。単純にリン酸塩緩衝生理食塩水にｒＡＡＶを再懸濁させることは、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するために十分であることが実証されており、担体又はｒＡＡＶと共投与することができる他の成分に既知の制限はない（しかしながら、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを伴う通常の方法では回避されるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾される。例えば、本開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。薬学的組成物は、注射可能な製剤として、又は経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製される。筋肉内注射および経皮輸送の両方のための多数の製剤が先行して開発されており、本開示を実施する際に使用され得る。ｒＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。
筋肉内注射を目的として、ゴマ若しくはピーナツ油などのアジュバント中、又はプロピレングリコール水溶液中の溶液、並びに滅菌水溶液が用いられる。そのような水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水又はグルコースで等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸塩基を含有する）又は薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合される、水中で調製される。ｒＡＡＶの分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製される。通常の保存状態および使用下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は、全て当該技術分野における標準的な技法によって容易に入手可能である。
注射可能な使用に好適な薬学的形態は、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射可能溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。すべての場合において、この形態は、滅菌でなければならず、容易なシリンジ注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。製造及び貯蔵の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒体である。いくつかの態様において、適切な流動性は、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には、必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持される。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされる。
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるＤＭＤ ｇＲＮＡ、ＤＭＤドナー配列、及びＣａｓ９の発現をもたらす本開示の複製欠損ｒＡＡＶを介するインビボ又はインビトロのいずれかでのレシピエント細胞へのｇＲＮＡ、ＤＭＤドナー配列、及び１つ以上のＣａｓ９コードポリヌクレオチドを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つ以上のＤＭＤ又はＣａｓ９構築物の投与／送達を指すために使用される。
一態様において、ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで行われる。一実施形態において、所望の標的筋細胞は、対象から除去され、ｒＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。あるいは、同系又は異種細胞は、これらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合に使用され得る。
対象への形質導入および形質導入細胞の再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態において、細胞は、例えば、適切な培地において、ｒＡＡＶを細胞と組み合わせ、サザンブロット及び／若しくはＰＣＲなどの従来の技法を使用して、又は選択可能なマーカーを使用することによって、目的のＤＮＡを有する細胞についてスクリーニングすることによってインビトロで形質導入される。形質導入された細胞は、次いで、薬学的組成物に製剤化され、組成物は、筋肉内、静脈内、皮下、及び／若しくは腹腔内注射による、又は例えば、カテーテルを使用した、平滑筋及び心筋への注射によるなどの、様々な技法によって対象に導入される。
本開示は、ＤＭＤ発現を復元することを標的とする、ＤＭＤ ｇＲＮＡ及びＤＮＡドナー配列をコードするＤＮＡと、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡとを含む、ｒＡＡＶの有効用量（又は本質的に同時に投与される用量又は間隔を置いて投与される用量）を投与して、細胞又はそれを必要とする対象へのＤＭＤドナー配列の切断及び挿入をもたらす方法を提供する。
本開示のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ＤＭＤ発現、ＤＭＤドナー配列、及びＣａｓ９酵素を標的とするガイドＲＮＡの持続発現をもたらす。したがって、本開示は、ジストロフィン発現を細胞又は対象に復元するためのｒＡＡＶの投与／送達方法を提供する。いくつかの態様において、細胞は、対象中にある。いくつかの態様において、細胞は、動物対象である。いくつかの態様において、動物対象は、ヒト対象である。
これらの方法は、血液及び血管系、中枢神経系、並びに組織（筋細胞及びニューロン、骨格筋を含む筋などの組織、心臓、能、皮膚、眼、及び内分泌系器官、並びに内分泌系及び唾液腺などの腺を含むが、これらに限定されない）に、本開示の１つ以上のｒＡＡＶで形質導入することを含む。いくつかの態様において、形質導入は、組織特異的制御要素を含む遺伝子カセットで行われる。例えば、本開示の一実施形態は、筋肉特異的制御要素によって指向される筋細胞及び筋肉組織を形質導入する方法を提供し、これには、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーなどのアクチン及びミオシン遺伝子ファミリー［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：４８５４－４８６２（１９９１）］、ヒト骨格アクチン遺伝子由来の制御エレメント［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，７：４０８９－４０９９（１９８７）］、心臓アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列要素［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，９：３３９３－３３９９（１９８９）］及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子に由来する制御エレメント、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子及び遅筋トロポニンＩ遺伝子：低酸素誘導性核因子［Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６８０－５６８４（１９９１）］、グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むステロイド誘発性要素及びプロモーター［Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３－５６０７（１９９３）］、ｔＭＣＫプロモーター［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１５：１４８９－１４９９（２００８）］、ＣＫ６プロモーター［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，上記］及び他の制御要素、に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
ＡＡＶは、ＤＭＤを発現する全ての影響を受けた臓器を標的とするため、本開示は、対象の全ての細胞、組織、及び臓器への本明細書に記載のＤＮＡの送達を含む。いくつかの態様において、骨格筋組織を含む筋肉組織は、インビボＤＮＡ送達の魅力的な標的である。本開示は、形質導入された細胞からのジストロフィンを発現するためのＤＭＤ遺伝子の持続的発現を含む。いくつかの態様において、本開示は、形質導入された筋原線維由来のジストロフィンの持続発現を含む。「筋細胞」または「筋肉組織」とは、あらゆる種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管、または心臓組織に由来する、骨格筋および平滑筋）に由来する細胞または細胞群を意味する。こうした筋細胞はいくつかの態様では、筋原細胞、ミオサイト、筋管、心筋細胞および心筋原細胞などに区別されるか、または区別されない。
「治療すること」は、筋肉消耗、筋力低下、筋緊張症、骨格筋の問題、網膜の異常、腰の脱力感、顔の脱力感、腹部の筋力低下、関節及び脊髄の異常、下肢の脱力感、肩の脱力感、聴力喪失、筋肉炎症、及び非対称的な脱力感を含むが、これらに限定されない、筋ジストロフィーの１つ以上の症状を緩和又は阻害することを含む。
分子的、生化学的、組織学的、及び機能的エンドポイントは、ＤＭＤ遺伝子の発現を増加させるための、本明細書に開示される製品及び方法の治療上の有効性を実証する。本開示によって企図されるエンドポイントには、ＤＭＤ（ジストロフィン）タンパク質発現を増加させることが含まれ、これは、ＤＭＤ及びＢＭＤ、並びにＤＭＤ発現の不在又は減少に関連する他の障害を含むがこれらに限定されない、筋ジストロフィーの治療に適用される。
本開示はまた、本明細書に記載の障害の治療に使用するためのキットを提供する。そのようなキットには、薬学的に許容される担体中の、本明細書において上に記載の核酸のいずれか、又は本明細書において上に記載のウイルスベクターのいずれかを含む、少なくとも第１の滅菌組成物が含まれる。別の成分は、治療用組成物の投与のための好適な容器及びビヒクルとともに、障害の治療のための任意選択の第２の治療剤である。キットは、任意選択で、第１及び第２の組成物を懸濁する、希釈する、又は送達をもたらすための溶液又は緩衝液を含む。
一実施形態において、そのようなキットは、密封されたボトルなどの容器又は容器にパッケージングされた希釈剤中の核酸又はベクターを含み、ラベルが容器に貼られているか、又は核酸又はベクターの使用を説明するパッケージに含まれる。一実施形態において、希釈剤は、容器内のヘッドスペースの量（例えば、液体製剤と容器の上部との間の空気の量）が非常に少なくなるように、容器内にある。好ましくは、ヘッドスペースの量は無視できる（すなわち、ほとんどない）。
いくつかの態様において、製剤は、安定剤を含む。「安定剤」という用語は、加熱又は凍結中に生じるものなどの有害な条件から製剤を保護する、及び／又は安定状態で製剤の安定性又は保存期間を延長する物質又は賦形剤を指す。安定剤の例としては、限定されないが、スクロース、ラクトース、及びマンノースなどの糖、マンニトールなどの糖アルコール、グリシン又はグルタミン酸などのアミノ酸、並びにヒト血清アルブミン又はゼラチンなどのタンパク質が挙げられる。
いくつかの態様において、製剤は、抗菌防腐剤を含む。「抗菌保存剤」という用語は、組成物に加えられて、使用されるバイアル又は容器の反復穿刺時に導入され得る微生物の増殖を阻害する任意の物質を指す。抗菌防腐剤の例としては、限定されないが、チメロサール、２－フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、及びフェノールなどの物質が挙げられる。
いくつかの態様において、キットは、キット中に提供される試薬の使用を説明するラベル及び／又は説明書を含む。キットはまた、本明細書に記載の方法で使用される組成物のうちの１つ以上を送達するためのカテーテル、シリンジ、又は他の送達デバイスを任意選択で含む。
この文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、特徴の組み合わせがこの文書と同じ文章、又は段落、又はセクションで一緒に見られない場合でも、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが企図されることを理解されたい。本開示はまた、例えば、上で具体的に言及される変形よりもいくらか範囲が狭い本開示の全ての実施形態を含む。属として記載される本開示の態様に関して、全ての個々の種は、本開示の別個の態様とみなされる。「ａ」又は「ａｎ」とともに記載又は特許請求される本開示の態様に関して、これらの用語は、文脈がより限定された意味を明確に必要としない限り、「１つ以上」を意味することを理解されたい。本開示の態様が特徴を「含む」と記載される場合、実施形態もまた、特徴「からなる」又は「本質的になる」と企図される。
上記又は下記に関わらず、本明細書の本文全体で引用されている全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様、説明書などを含む）は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。参照により組み込まれた材料が本明細書と矛盾するか、又は矛盾する範囲では、本明細書が、そのような材料に優先する。
本開示及びその利点のより良い理解は、例示のみを目的として提供される以下の実施例から得られる。実施例は、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示のみを目的としており、それに照らして様々な修正または変更が、当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の請求項の範囲に含まれることが理解される。
本開示のさらなる態様および詳細は、限定的ではなく例示的であることが意図される以下の実施例から明白であろう。
実施例１
ＨＩＴＩエクソン置き換えの実現可能性研究
上で本明細書に記載されるＨＩＴＩ方法は、単一部位での欠損エクソン及びレポーター遺伝子の挿入のためだけでなく、ヒトがん細胞におけるＣＣＡＴ１遺伝子の小さな（約１．３ｋｂ）部分の置き換えのためにも利用されている（Ｚａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｐｒｏｃｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ ２０、２１、ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２５７５－０１８－００８６－５（２０１８））。同様のアプローチがＤＭＤ遺伝子座で機能することを確実にするために、エクソン２の上流及び下流を標的とする以前に検証されたｇＲＮＡを利用して、このエクソンを除去し、その後、外因性ＤＮＡ配列をノックインした（図３Ａ）。以前に発表された他のＨＩＴＩ研究をレビューしたところ、ＨＩＴＩを使用してより大きな置き換えが可能かどうかは判断できなかった。この目的のために、以前に検証されたｇＲＮＡのセット、エクソン２の上流の１つ及びエクソン３の下流の１つを、欠失及びその後のＨＩＴＩ実験において利用して、以前に記載されたよりも大きなゲノムの置き換えの実現可能性を確認した（図３Ｂ）。
エクソン２（小さな置き換え、約１ｋｂ）の置き換えのために、このエクソンに隣接する２つのｇＲＮＡを利用して、ＨＩＴＩドナーベクターと同様にゲノム内で切断した。ドナーベクター上の切断部位を、ゲノム文脈におけるそれらの切断部位の逆相補体であるように操作し、互いの反対側の５’及び３’末端に配置した（図３Ａ）。これは、ＨＩＴＩドナー断片の逆組み込みの場合、Ｃａｓ９切断部位が再構築され、再切断が可能になり、より大きな割合の組み込みが前方配向になるように行われた（図３Ａ）。エクソン２及び３（中程度の置き換え、約１７５ｋｂ）を、エクソン２の上流及びエクソン３の下流の１つを標的とするｇＲＮＡ（表６を参照）、並びに同様に設計されたＨＩＴＩドナー断片（表７を参照）（図３Ｂ）で置き換えるために、同様の戦略を使用した。

これらの実験は、１つのプラスミドが、２つのｇＲＮＡ切断部位に隣接する外因性ノックインドナーＤＮＡ配列をコードし、２つの追加のプラスミドが、ＳａＣａｓ９をコードし、２つのｇＲＮＡが、ゲノムＤＮＡ及びドナープラスミドの切断に利用された「三重プラスミド系」を利用した。
材料及び方法
分子クローニング
これらの研究で使用されたプラスミドの生成は、いくつかの異なる伝統的及び現代的なクローニング技術によって達成された。ｇＲＮＡの交換のために、ＰＣＲを利用して、変化を取り巻くＤＮＡコンテキストへの２つの相補性領域に隣接する所望の変化を含有する２つのメガプライマーでプラスミド全体を増幅する、制限なしクローニング（ＲＦＣ）として知られる技術を使用した。他の全てのクローニングは、製造元の推奨に従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）で完了した。
細胞培養及び処置
ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を、ＨＥＫ完全培地（１０％のｃｏｓｍｉｃ仔ウシ血清、１％の１００倍の抗真菌剤／抗菌剤、及び１％の１００倍の修飾イーグル培地非必須アミノ酸を補充したダルベッコの修飾イーグル培地高グルコース）で、約８０～９０％のコンフルエントになるまで、１０ｃｍ２の皿で培養した。次いで、０．０２５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用して、細胞を皿から分離し、血球測定器でカウントした。細胞を１２ウェルディッシュ（２００，０００細胞／ウェル）の各ウェルに播種し、実験に使用する前に１日増殖させた。細胞を、１００％の湿度及び５％のＣＯ２で３７℃で培養した。
プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクションは、ＤＮＡの示された量、５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ、及びμｇのＤＮＡ当たり１μＬのＰｌｕｓ試薬を用いて、製造業者の推奨に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸを使用して達成した。トランスフェクション後、細胞を６時間インキュベートした後、培地を新しいＨＥＫ完全培地に置き換えた。分析のためにゲノムＤＮＡを抽出する前に、細胞を３日間培養した。
ゲノムＤＮＡ ＰＣＲ分析
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、５’Ｃａｓ９切断部位の上流にアニールするフォワードプライマー及びノックイン断片内でアニールするリバースプライマー、並びに０．０８Ｕ／μＬのＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼの添加を用いて、製造業者の推奨に従って、Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘマスターミックスを使用して行った。小サイズ及び中サイズのＤＭＤ遺伝子断片のＨＩＴＩの置き換えを実施する際に実施したアッセイでは、ＰＣＲ生成物を示されるように、１％アガロース－ＴＡＥ又は１０％ポリアクリルアミド－ＴＢＥゲルのいずれか上の電気泳動を使用して分割し、臭化エチジウムで染色した。画像は、自動で最適な露光時間を有するＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して収集した。ＰＣＲに利用されるプライマーは、アッセイによって異なる。小サイズ及び中サイズのＤＭＤ遺伝子断片のＨＩＴＩ置き換えを実施する際に実施したアッセイでは、５’末端アンプリコンを、５’Ｃａｓ９切断部位の上流にアニールするフォワードプライマーと、ノックイン断片内にアニールするリバースプライマーとを用いて生成した。３’末端アンプリコンを、ノックイン断片内でアニールするフォワードプライマーと、３’Ｃａｓ９切断部位の下流でアニールするリバースプライマーと、を用いて生成した。最後に、小サイズ及び中サイズの置き換えのためのＨＩＴＩプラスミド比の最適化を実施する際に実施されたアッセイでは、バルクアンプリコンは、ノックイン全体を包含する前のアッセイからの５’フォワードプライマー及び３’リバースプライマーによって生成された。プライマーのＴｍは、ＮＥＢのＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ２Ｘマスターミックスのオンラインでの提案に基づいて計算し、伸長時間は、１キロベースのアンプリコン当たり３０秒を利用して、アンプリコンの長さに基づいて計算した。
ＥｎＧｅｎ（登録商標）変異検出アッセイ
活性ｇＲＮＡの確認に使用されるＴ７Ｅ１アッセイ（ＥｎＧｅｎ（登録商標）変異検出キット；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）酵素を使用して、ミスマッチＤＮＡの部位で切断する。まず、ゲノムＤＮＡ ＰＣＲを使用して、期待される編集部位を取り囲むアンプリコンを生成した。これらのアンプリコンをゲル精製し、その後、９５℃でインキュベートし、続いて、約０．１℃／秒のランプ速度で遅いアニーリングを行い、編集を示す不均一なＤＮＡを再アニーリングさせた。次に、Ｔ７Ｅ１酵素を再アニールされたＤＮＡに加え、３７℃で１５分間インキュベートさせた。得られた切断されたＤＮＡを、臭化エチジウムで染色したポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析した。
結果及び考察
ｇＲＮＡを標的とするエクソン２及び３
本研究で実施される実験の前に、所与のエクソンに影響を及ぼす欠失及び重複変異は、エクソンに最も近い周囲のイントロン配列も含む可能性が高いため、標的エクソンの１０００塩基対（ｂｐ）内のＳａＣａｓ９ ＰＡＭ配列（５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’（配列番号１６３））を最初に同定することによって、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２及び３を標的とするｇＲＮＡを新たに設計した。重要なことに、ＮＨＥＪ ＤＮＡ修復経路に共通するインデルは、非コード領域において有害である可能性が低いため、イントロン標的化が好ましい。エクソン２標的化ｇＲＮＡの設計において、上流の標的化配列は、おそらく３’スプライスエレメントの均質性に起因して、はるかに大きなオフターゲットプロファイルを有する傾向があることが指摘され、したがって、ｇＲＮＡは、エクソン３の下流のみを設計しながら、エクソン２の上流及び下流の両方を設計した。
除外基準を使用して、最適な候補ｇＲＮＡを確保した。まず、推定されるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結シグナル（コード鎖中の４つ以上の連続したチミジン残基）を含有するｇＲＮＡ配列を除外した。これは、Ｕ６プロモーターからの転写中に成熟前終結につながる可能性があるためである。次に、ＣＣＴｏｐバイオインフォマティクスソフトウェアによって予測されるように、ヒトゲノム内の３０を超える予測されるオフターゲット部位又は任意の数のエクソンオフターゲット部位を有するｇＲＮＡを排除した（Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０，ｅ０１２４６３３，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２４６３３（２０１５））。残りのｇＲＮＡの予測されるオフターゲットが留意された。この情報は、オフターゲットプロファイルの分析を支援するために利用されている。最後に、標的ＤＮＡとｇＲＮＡ又は最適でないＰＡＭ配列との間のミスマッチが遺伝子編集を阻害し得るため、ｇＲＮＡは、それらの標的配列又はＰＡＭが、ＣｌｉｎＶａｒ及びｄｂＳＮＰデータベースに基づいて、１％を超えるマイナー対立遺伝子頻度を有する一塩基多型（ＳＮＰ）又は変異（Ｖａｒ）を含有する場合、拒絶された（Ｌａｎｄｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４６，Ｄ１０６２－Ｄ１０６７，ＤＯＩ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｘ１１５３（２０１８）、Ｓｈｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９，３０８－３１１，ＤＯＩ：１０．１０９３／ｎａｒ／２９．１．３０８（２００１））。
最初のスクリーニングの後、候補ｇＲＮＡ（表６を参照）を、サイトメガロウイルス即時早期エンハンサー及びプロモーター（ＣＭＶＰ）によって駆動されるＳａＣａｓ９発現カセットとともに、Ｕ６プロモーターの下流のプラスミドにそれぞれ個別にクローニングして、高レベルの構成的発現を得た。プラスミドはＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒによってカスタムメイドされた。これらのプラスミドを使用し、ＨＥＫ２９３細胞を形質導入して、期待されるゲノム遺伝子座での効率的な切断を試験した。期待される編集部位に隣接するゲノムＤＮＡからアンプリコンを生成した。ＤＮＡミスマッチ部位で切断するＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）酵素を利用したＥｎＧｅｎ（登録商標）変異検出キットを使用して、適切な編集を確認した。これらの実験は、リードｇＲＮＡ候補が、上流エクソン２標的化のためのｈＤＳＡ００１、下流エクソン２標的化のためのｈＤＳＡ０２７、及び下流エクソン３標的化のためのＪＨＩ３０１２であったことを明らかにした（表６を参照）。
小サイズ及び中サイズのＤＭＤ遺伝子断片のＨＩＴＩ置き換え
まず、ＤＮＡ断片を使用して、上記のように、ノックイン断片の両端にゲノムＣａｓ９切断部位を含有するＨＩＴＩドナーベクターを作製した（図３Ａ～Ｂ）。ＤＭＤ遺伝子の小サイズ及び中サイズの断片がＨＩＴＩドナーで置き換えされ得るかどうかを試験するために、ＨＥＫ２９３細胞を、３つのプラスミド（ＳａＣａｓ９発現カセット及び選択されたｇＲＮＡを含有する２つ、及びＧＦＰ発現カセットに隣接する対合したｇＲＮＡ切断部位を含有するＨＩＴＩドナープラスミド）で共トランスフェクトした。小規模の置き換えのｇＲＮＡ対は、ｈＤＳＡ００１及びｈＤＳＡ０２７であり、中規模の置き換えのｇＲＮＡ対は、ｈＤＳＡ００１及びＪＨＩ３０１２であった（図３Ａ～Ｂ）。
エクソン２置き換えのためのゲノムＤＮＡ ＰＣＲ（約１ｋｂの小規模置き換え）からのゲル画像は、ノックイン特異的プライマーを使用するときに、予想される遺伝子座で適切な組み込みが起こったことを明らかにした（図４Ａ）。ＰＣＲについての同様の方法を使用したエクソン２及び３の置き換え（約１７５ｋｂの中規模置き換え）について同様の結果が見られた（図４Ｂ）。両方の実験において、予想されるノックインバンドは、ＣＲＩＳＰＲのみで処置された細胞には存在しなかったか、又はドナーがこれらの成分だけではノックインに十分ではないことを示すだけであった。ＣＲＩＳＰＲと非テンプレートドナー（Ｃａｓ９切断部位を欠く同一のドナー）との組み合わせで処置された細胞もまた、予想されるノックインバンドを示さず、ドナーのＣａｓ９切断が、ＨＩＴＩノックインが生じるために必要であることを確認した。エクソン２及び３の置き換えからの予想されるバンドを抽出し、配列決定し、挿入の５’及び３’末端でのシームレスな組み込みを確認した（図４Ｃ及び４Ｄ）。
小サイズ及び中サイズの置き換えのためのＨＩＴＩプラスミド比の最適化
可能な限り多くの欠失及び組み込みイベントを得るために、Ｃａｓ９プラスミド対ドナープラスミドの最適な比率が使用されていることを確実にするために、可変量のＣａｓ９：ドナープラスミドを使用してＨＥＫ２９３細胞を形質導入し、その後、図４Ａ～Ｂに記載される本明細書にて上に記載されるＰＣＲ条件を使用してスクリーニングした。Ｃａｓ９：ドナー比率を低下させる実験は、小さな置き換えで完了し、１：１の比率であったときに最も多くの組み込みが起こることを示した（図５Ａ）。これは、置き換えのサイズに関係なく適用可能であると予想されたため、Ｃａｓ９：ドナーを増加させる実験は、中サイズの置き換えを用いて実施されることが決定された（図５Ｂ）。このＰＣＲはまた、ノックイン遺伝子座全体の検出が可能であったかどうかを試験するために、ノックイン特異的プライマーの代わりに、ノックイン領域全体に隣接するプライマーを用いて実施した（図５Ｂ）。ゲル画像は、最適比が１：１であることを示し、ノックイン遺伝子座全体の検出が可能であるかどうかを試験するために、ノックイン特異的プライマーよりも低い効率ではあるが、全ノックインアンプリコンの検出が可能であることを示した（図５Ｂ）。ゲル画像は、最適比が１：１であることを示し、ノックインアンプリコン全体の検出が可能であることを示したが、ノックイン特異的プライマーよりも低い効率であった（図５Ｂ）。この実験セットアップにおける制限因子は３つのプラスミドの共送達であると仮定されたため、この潜在的な治療戦略のその後の開発には２重プラスミド系が使用された。二重プラスミド系は、ゲノムＣａｓ９切断部位及び２つのｇＲＮＡによってドナー配列の各側に隣接するノックインドナー配列を含む１つのプラスミドと、ｇＲＮＡスペーサー配列によって決定されるＤＮＡ遺伝子座で二本鎖ＤＮＡ切断を生成することができるＣａｓ９酵素又はその機能的断片を含む第２のプラスミドと、を含む。
この実施例で実施された実験は、ＳａＣａｓ９、２つのｇＲＮＡ、及び上記のようないずれかの端部及び方向にゲノムＣａｓ９切断部位を含有するＨＩＴＩドナー断片の利用を介して、小（約１ｋｂ）スケール及び大（約１７５ｋｂ）スケールの両方で、ＤＭＤ遺伝子内で遺伝子断片のＨＩＴＩ置き換えが可能であることを示す。
実施例２
ＤＭＤエクソン４１～５５のＨＩＴＩ置き換え
実施例１に記載される基本的な方法論を使用して、より多くの患者において全長ジストロフィンの回復を可能にするように、大きな（約７１５ｋｂ）ＨＩＴＩベースの遺伝子編集戦略が設計された。この目的のために、エクソン置き換えのための効率的な標的を選択するために、ＤＭＤ遺伝子に対してバイオインフォマティクス解析が行われた。イントロンを含むネイティブ遺伝子座は約７１５ｋｂである。ｅ４１～５５の合成「メガエクソン」は、約２．５ｋｂ（すなわち、２４７８塩基）であり、イントロンを含まないエクソンのみを含む。合成メガエクソンは、スプライシング転写産物に含めるための合成又は天然のイントロンスプライス部位に隣接している。
エクソン４１～５５は２つの変異ホットスポットを包含し、この領域の効率的な置き換えは、ＤＭＤ患者の約３７％に利益をもたらす可能性がある。したがって、この領域は、この実施例（図１Ｃ）で本明細書に記載される実験のために選択された標的であった（Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ ３０，１６５７－１６６６，ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｕｍｕ．２１１１４（２００９））。組み込みではなく欠失が領域内で生じる場合、非本質的なドメインを欠き、ＤＭＤ動物モデルで症状を改善することが示され、合成された、小型化されたジストロフィンのアイソフォームに類似した、切断された、潜在的に治療的なジストロフィンのアイソフォームを作成するオープンリーディングフレームが維持され、現在ヒト治験で試験されている（Ｂａｃｈｒａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：３５８１－３５８６，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０４００３７３１０１（２００４）、Ｌｅ Ｇｕｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８，１６１０５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１６１０５（２０１７））。４１～５５の切除は、２つの異なるスペクトリン様反復を切り捨てるが、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬオンライン相当性モデリングサーバを使用して、エクソン４０及び５６の接合から形成される、得られるハイブリッドスペクトリン様反復の構造を予測した。グローバル品質推定に基づいて、内因性スペクトリン様リピート２２に類似するらせん状バンドル構造にモデル化された予測ハイブリッドスペクトリン様リピート（図６）。Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５，１２２３－１２３９，ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｐｈｙ．ｃ１４００４８（２０１５）、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４６，Ｗ２９６－Ｗ３０３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｙ４２７（２０１８）、Ｂｉｅｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４５、Ｄ３１３－Ｄ３１９，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ１１３２（２０１７）、Ｇｕｅｘ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ３０ Ｓｕｐｐｌ １、Ｓ１６２－１７３，ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｌｐｓ．２００９００１４０（２００９）、Ｂｅｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２７，３４３－３５０，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｑ６６２（２０１１）、Ｂｅｒｔｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，１０４８０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１７－０９６５４－８（２０１７））。
ＨＩＴＩドナーベクターは、エクソン４１～５５（約２．５ｋｂ）のコード配列（ＣＤＳ）を、内因性イントロン配列の約１００ｂｐの２つの領域の間に配置して、５’及び３’スプライスエレメントを含むように設計した。Ｃａｓ９切断部位を再構成することによって逆組み込みの発生率を低減するために、両側のイントロン配列を過ぎたところに、ゲノム切断部位を配置し、上記と同じ方向に再度置いた（図７）。２つのｇＲＮＡをＨＩＴＩドナーとともに１つのプラスミドに含め、２つのｇＲＮＡを有するＨＩＴＩドナーのプラスミド及びＳａＣａｓ９発現カセットを含有するプラスミドが存在する２つのプラスミド系を可能にした。
材料及び方法
分子クローニング
これらの実験のためのプラスミドを、逆ＰＣＲを含む様々なクローニング方法によって構築し、プライマーを使用して、欠失される部分を除くプラスミド全体を増幅した。これらの直鎖化ＤＮＡ断片を、次いで、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングキットとともに、製造業者の推奨に従って使用し、新しいプラスミドを作製した。
細胞培養及び処置
ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞の培養は、上記の実施例１に記載されるものと同様の方法を使用して達成された。トランスフェクションはまた、本明細書においての実施例１に記載されるように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸを使用して達成されたが、使用されたプラスミドは、これらの実験に対して異なっていた。本実施例におけるトランスフェクションは、実施例１で利用されたトリプルプラスミドトランスフェクションシステムとは対照的に、二重プラスミドトランスフェクションシステムも使用した。
蛍光顕微鏡検査
蛍光顕微鏡検査は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、室温で、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｏｒｃａ Ｆｌａｓｈ４．０カメラを用いて、ニコンＴｉ２－Ｅ反転広視野システム上で撮像することによって達成した。解析された画像の寸法は１０２２×１０２４ピクセルであり、１．６３ミクロン／ピクセルとなるようにスケーリングされた。ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３モジュールを用いたカスタム分析を用いて蛍光画像を定量化した。バックグラウンド補正後に、無視できない信号強度の明るいスポットを自動検出することにより、細胞を同定した。次いで、明るいスポット各々について、赤及び緑の信号の平均強度を測定し、記録した。Ｏｔｓｕ法に基づく閾値を使用して各チャネルにおける高及び低信号を区別し、スポットを２つのフルオロフォアの各々について、それらの発現カテゴリに従ってカウントした。二重陽性パーセントは、緑色及び赤色の両方のシグナルを有する細胞の数を、赤色及び緑色の両方のシグナル、緑色のシグナル単独、及び赤色のシグナル単独を有する細胞の総数で割り、次いで、分数に１００％を乗じることによって計算した。
ゲノムＤＮＡ ＰＣＲ分析
抽出されたＨＥＫ２９３ゲノムＤＮＡのＰＣＲは、実施例１に記載されるものと同様の方法を使用して達成された。主な違いは、使用されるプライマー、及びサイクル条件を含む。この研究で行われた実験では、ゲノムＣａｓ９切断部位の上流でフォワードプライマーを利用し、ＨＩＴＩノックイン内でリバースプライマーを利用するように、ノックイン特異的プライマーを使用した。Ｔｍは、ＮＥＢのＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ２Ｘマスターミックスのオンライン提案に基づいて再度計算され、伸長時間は、増幅されるべきキロベースごとに３０秒を再度利用して、アンプリコン長に基づいて計算された。
結果と考察
ＤＭＤエクソン４１～５５の置き換えのためのリードｇＲＮＡの同定
実施例１に記載されるように、エクソン４１（ＪＨＩ４０シリーズ）の上流及びエクソン５５（ＪＨＩ５５シリーズ）の下流を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計した。イントロン４０又はイントロン５５（図２）を標的とする９つのｇＲＮＡは、ＳａＣａｓ９の５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’（配列番号４０）ＰＡＭ配列について、エクソン４０の５０ｂｐ超下流であり、エクソン５５の５０ｂｐ超であるが１０００ｂｐ未満下流のイントロン配列を検索することによって設計された。これらを、Ｃａｓ９発現カセットを含有するプラスミド骨格内にサブクローニングし、次いで、脂質媒介性トランスフェクションを介してＨＥＫ２９３細胞における活性について試験した。７２時間後、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）アッセイ（図８）を使用して、非ソート集団における変異を検出した。この初期スクリーニングから、イントロン４０又はイントロン５５内で標的となる８つの活性ｇＲＮＡが同定された。
表１に、これらのｇＲＮＡの配列を示す。ＪＨＩ４０－００１、ＪＨＩ４０－００２、及びＪＨＩ４０－００５ ｇＲＮＡは、Ｔ７Ｅ１アッセイ（ＥｎＧｅｎ（登録商標）変異検出キット、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）において不活性であることが見出された。しかしながら、活性についての更なる試験が決定されている。
ＪＨＩ４０シリーズのｇＲＮＡは、より大きな患者コホート（イントロン４０内に変異を有するものを含む）を含むように、可能な限りエクソン４０に近いイントロン４０内を標的とする。ＪＨＩ５５ＡシリーズのｇＲＮＡについては、代替のＤＭＤ遺伝子プロモーターがイントロン５５の３’末端付近に存在し、シュワン細胞に対する重要なジストロフィンアイソフォーム（Ｄｐ１１６）の発現を駆動する（Ｍａｔｓｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）８，ｄｏｉ：１０．３３９０／ｇｅｎｅｓ８１００２５１（２０１７））。この代替プロモーターを除去しないように、ＪＨＩ５５Ａ ｇＲＮＡを、エクソン５５の近くのイントロン５５の５’末端で設計した。これらのｇＲＮＡを、実施例１に記載される実験と同様に、Ｕ６プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡを用いて、ＣＭＶＰによって駆動されるＳａＣａｓ９発現カセットを含むプラスミドにクローニングした。
上記のプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、ｇＲＮＡの編集能力を試験した。ＪＨＩ５５Ａシリーズから編集可能なｇＲＮＡが５つあり、ＪＨＩ４０シリーズから編集可能なｇＲＮＡが３つあったことが明らかになった（図８）。ＨＩＴＩ編集のために選択されたリード候補は、ＪＨＩ４０－００８及びＪＨＩ５５Ａ－００４（図８）であった。
共送達の効率
リードｇＲＮＡが選択されると、それらを、ドナーの両側の適切なＣａｓ９切断部位とともに、ＨＩＴＩドナープラスミドにクローニングしたが、ＳａＣａｓ９発現カセットは、別個のプラスミド中で単独であった。エクソン４１～５５の置き換えのためのドナー配列を表２に示す。
共トランスフェクション効率を最適化するために、ｇＲＮＡを有するＨＩＴＩドナープラスミドに赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をタグ付けし、ＳａＣａｓ９プラスミドに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をタグ付けし、これらのプラスミドを使用して、１：１の比率で、可変量の各プラスミド（０．５μｇ、１．０μｇ、又は２．０μｇの各プラスミド）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞を共トランスフェクションした。ＲＦＰ及びＧＦＰの共局在化によって共トランスフェクションの効率を測定するために、蛍光顕微鏡を使用して細胞をイメージングし、推定される細胞コンフルエンシーのパーセントによって生存率を測定した（図９）。結果は、１．０μｇ処置された細胞は、３１．４０％の二重陽性細胞で最高の共トランスフェクション効率を有し、２．０μｇ処置された細胞は、２５．１０％の二重陽性細胞でより低い効率を有し、０．５μｇ細胞は、わずか７．６２％の二重陽性細胞で最も低い効率を有したことを示した（図９）。
二重プラスミド系によるＨＩＴＩノックインの検出
次に、実験を行い、二重プラスミド系が適切なＨＩＴＩノックインをもたらしたかどうかを判定した。上記本明細書に記載の１．０μｇ処置細胞から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、ノックイン特異的プライマーを用いてＰＣＲを行った。結果は、ＣＲＩＳＰＲ及びドナー処置細胞におけるＨＩＴＩドナーの組み込みに成功したことを示した（図１０Ａ）。ＣＲＩＳＰＲのみの処置及びドナーのみの処置は、予想されるノックインバンドを有しておらず、再び、両方の成分がＨＩＴＩ媒介ノックインに必要であることを示した（図１０Ａ）。未処置の細胞も、予想されるノックインバンドを示さず、内因性ゲノム内のノックインバンドの欠如を確認した（図１０Ａ）。ノックインバンドを配列決定し、配列決定はシームレスな組み込みを明らかにした（図１０Ｂ）。
これらの実験は、エクソン４１から５５の切除を標的とするｇＲＮＡを設計し、確認することから始まり、その後、ＨＩＴＩ遺伝子編集を用いてこれらのエクソンを置き換えるための実験に使用された。その後、トランスフェクトされるＤＮＡの量を、新しいデュアルプラスミドＨＩＴＩシステムを用いて、ＨＥＫ２９３細胞において１．０μｇであるように最適化した。得られたゲノムＤＮＡを、ＨＩＴＩドナーのゲノムへの組み込みに成功したことを示したＰＣＲにおいて利用した。これらの実験は、エクソン４１～５５内で生じるＤＭＤを引き起こす多様な変異に同時に達しながら、全長ジストロフィンを回復させる治療の基礎を築く。
別の実験では、脂質媒介性トランスフェクションを用いて、３つのプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に共送達した。２つのプラスミドは、ＣＭＶプロモーター駆動型ＳａＣａｓ９、及びＵ６プロモーター駆動型ＪＨＩ４０－００８又はＪＨＩ５５Ａ－００４のうちの１つをコードした。第３のプラスミドは、天然イントロン配列の１００ｂｐに隣接し、ＪＨＩ４０－００８及びＪＨＩ５５Ａ－００４切断部位（図１１のドナーＡＡＶゲノムに類似）に挟まれたＤＭＤエクソン４１～５５ＣＤＳをコードした。７２時間後、非ソート集団からのゲノムＤＮＡを使用して、ＰＣＲを行った。ドナーＤＮＡプラスミド（図１５Ａ）にコードされた約２．５ｋｂエクソン４１～５５ＣＤＳによるこの７１５ｋｂ領域の置き換えに対応する堅牢なアンプリコン（約１．６ｋｂのサイズ）であり、アンプリコンの配列決定によって確認された（図１５Ｂ）。
この研究は、ＨＩＴＩ法で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、これまで探索されていなかったゲノムＤＮＡの大きな領域を置き換える能力を確立する。このような大規模な置き換えのためのこの先例を確立することによって、多様な変異を有する患者の膨大なコホートに全長ジストロフィンを回復させるＤＭＤ療法の基礎が設定される。本研究は、天然のＤＭＤエクソン４１－５５遺伝子座（約７１５ｋｂ）を、ＤＭＤ患者の変異の約３７％を修正するスプライシングに必要なイントロン要素が隣接するエクソン４１－５５コード配列を含む、約２．７ｋｂの単一の合成エクソンで置き換える成功したＨＩＴＩアプローチを確立する。ヒト細胞におけるプラスミドトランスフェクションを使用して、本研究は、合成コード配列によるＨＩＴＩ媒介性ＤＭＤエクソン４１～５５置き換えが実行可能であり、結果として生じる転写産物の遺伝子補正及び発現のインビボ効率を決定するための並行した開発を保証することを示す。
実施例３
ＤＭＤエクソン２～１９のＨＩＴＩ置き換え
実施例１及び２に記載される基本的な方法論を用いて、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２～１９を置き換えるために、大規模なＨＩＴＩベースの遺伝子編集戦略を設計した。エクソン２～１９の置き換えについて、イントロン１及びイントロン１９内の全ての潜在的なＳａＣａｓ９及びＣｊＣａｓ９ ＰＡＭ部位（それぞれ、５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’（配列番号１６３）及び５’－ＮＮＮＮＲＹＡＣ－３’（配列番号１６４））を検索した。次いで、これらのＰＡＭの完全な２８又は３０ｂｐの標的部位配列を収集し、マウスＤｍｄイントロン１及びイントロン１９内の同一の配列をアラインメントして見つけ、表３に示されるように、ＤＳＡｉ１、ＤＣＪｉ１、ＤＳＡｉ１９、及びＤＣＪｉ１９ｇＲＮＡを生成した。したがって、表３のｇＲＮＡは、マウス及びヒトの両方において、イントロン１又はイントロン１９の同じイントロン領域を標的にするように設計され、したがって、マウスからヒトへの治療の橋渡しを可能にした。これらのｇＲＮＡを、上記本明細書の実施例２に記載されるＪＨＩ４０及びＪＨＩ５５ＡシリーズｇＲＮＡについて記載されるようにクローニングし、試験した。ヒトＤＭＤイントロン１又は１９を標的とするｇＲＮＡ配列、及びＤＭＤイントロン１又は１９上でｇＲＮＡを標的とするように設計した配列を表３に提供する。エクソン２－１９のドナー配列は、表４のエクソン２～１９のＨＩＴＩ置き換えのための他の関連する配列とともに提供される。
ＨＥＫ２９３細胞（ウェル当たり２０，０００個）を９６ウェル皿に配置した。２４時間後、細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸを使用して調製されたリポフェクションミックス、及びＴ２Ａペプチドを介してＥｇｆｐに融合されたＣＭＶ駆動型Ｓａ又はＣｊＣａｓ９をコードするプラスミド、並びに示されるｇＲＮＡのＵ６発現カセットで処置した。７２時間後、細胞をＴＥ緩衝液中で再懸濁し、約１０，０００個の細胞を、ｇＲＮＡ標的部位に隣接するプライマーを利用するＰＣＲ反応で直接使用した。ＰＣＲ反応からのアンプリコンをカラム精製し、サンガー配列決定によって配列決定した。次いで、配列決定トレースファイルをＴＩＤＥソフトウェアを使用して分析し、シーケンストレースの分解に基づいて編集効率及び結果を推定した（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅａｓｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｒａｃｅ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）。
ほとんどのｇＲＮＡは、バックグラウンドレベル（＜５％）に近い編集効率をもたらし、したがって、リードとはみなされなかった。いくつかのｇＲＮＡは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＤＭＤ遺伝子の標的遺伝子座において堅牢な編集（＞１５％の編集効率）を示した。いくつかの配列決定トレースは、対照又は試験試料の少なくとも１つ（赤いバー）のトレース全体にわたる高い異常なベースコールをもたらし、おそらく品質の悪いアンプリコンに起因する。質の低い読み取りを伴わずに５％を超える最も高い編集効率を有するリードｇＲＮＡを各シリーズ（緑色のバー）から選択し、その結果、ＤＳＡｉ１－３、ＤＳＡｉ１９－４、及びＤＣＪｉ１－０７が、それぞれ、イントロン１標的化ｇＲＮＡ及びイントロン１９標的化ｇＲＮＡのそれぞれのシリーズからリードとして識別された（図１６）。
活性なｇＲＮＡを決定した後、ＤＳＡｉ１－０３及びＤＳＡｉ１９－００４と名付けられたｇＲＮＡを、ＤＭＤエクソン２～１９のＨＩＴＩ置き換えの標的部位として選択した。ＨＥＫ２９３細胞（２００，０００細胞）を、製造業者の提案に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸを使用して、２つのプラスミドのそれぞれ１ｕｇでトランスフェクトした。１つのプラスミドは、ＣＭＶＰ駆動ＳａＣａｓ９をコードし、他のプラスミドは、Ｕ６プロモーター駆動ｇＲＮＡであるＤＳＡｉ１－０３及びＤＳＡｉ１９－００４、並びに合成スプライス部位に隣接し、ＤＳＡｉ１－０３及びＤＳＡｉ１９－００４標的部位によって挟まれたＤＭＤエクソン２～１９（配列番号１５５）をコードするＨＩＴＩドナー配列をコードした。７２時間後、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ反応を行って、非コード集団における遺伝子編集結果を検出した（図１４）。５’末端（イントロン１）及び３’末端（イントロン１９）上の特定のノックイン接合部の堅牢な増幅が検出された（図１４）。エクソン２～１９欠失特異的アンプリコンも検出された（図１４）。
この研究は、天然のＤＭＤエクソン２～１９遺伝子座（約７００ｋｂ）を、約２．５ｋｂの単一の合成エクソンで置き換えるための、ＨＩＴＩ方法論で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の能力を確立し、これには、ＤＭＤ患者の変異の約２５％を補正するスプライシングに必要なイントロン要素が隣接するエクソン２～１９コード配列が含まれる。ヒト細胞におけるプラスミドトランスフェクションを使用して、本研究は、合成コード配列によるＨＩＴＩ媒介性ＤＭＤエクソン２～１９置き換えが実行可能であり、結果として生じる転写産物の遺伝子補正及び発現のインビボ効率を決定するための並行した開発を保証することを示す。
実施例４
インビボ実験のためのＤＭＤ ＨＩＴＩ編集
マウスＤｍｄノックアウト（ｍｄｘ）バックグラウンド上にエクソン４５を欠くヒトＤＭＤ遺伝子のノックインを含むＤＭＤのマウスモデルを使用して（ｈｕＤＭＤｄｅｌ４５（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓ ４：１３９－１４５，ｄｏｉ：１０．３２３３／ＪＮＤ－１７０２１８（２０１７）））、インビボでのＨＩＴＩ遺伝子編集を調べるための実験を実施する。このマウスモデルは、ｍｄｘマウスと表現型的に同一であり、ヒト又はマウスのジストロフィンタンパク質を発現しない。対照マウスは、ヒトＤＭＤ遺伝子の無傷なコピーを有し、またマウスジストロフィンを欠くヘテロ接合ｈｕＤＭＤマウスである（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｈｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８３：５８９９－５９０７，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ７０９４１０２００（２００８））。これらのマウスにおけるヒトＤＭＤ遺伝子コピーは、対応するマウスのイントロンと相同ではないヒトＤＭＤイントロンを標的とするｇＲＮＡの使用を可能にする。
以下に記載されるマウス及びウイルス投与量の数は、マウスにおける並行研究における他の同様の公表された研究及び専門知識に基づいて決定された。（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １３：６５９－６６２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１３．１０．０１６（２０１３）、Ｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ａｄｖ ５，ｅａａｖ４３２４，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．ａａｖ４３２４（２０１９）、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ，Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０：９９２－１０００，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３６２８（２０１４））。
図１１に示されるように、ｉ）Ｃａｓ９単独（ｒＡＡＶ９－Ｃａｓ９）及びｉｉ）ＨＩＴＩドナー断片（ｒＡＡＶ９－ｇＲＮＡ－ＨＩＴＩ）とともにコードするｇＲＮＡ発現カセット、の２つのｒＡＡＶ血清型９ウイルス（ｒＡＡＶ９）は、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって産生される。これらの２つのｒＡＡＶ９は、脛骨前筋（ＴＡ）筋肉への筋肉内（ＩＭ）注射のための最大１０１２個の合計ウイルス粒子、及び全身注射のための最大１０１４個のウイルス粒子を使用して、ｈｕＤＭＤｄｅｌ４５マウス（処置群当たり３～６匹のマウス）中で一緒に注射される。ＩＭ注射はＴＡ筋内で各側に行われ、全身注射は尾静脈を介して行われる。マウスは、筋肉組織の採取及び分析のために、注射の２、４、及び８週間後に屠殺される。ＩＭ注射では、ＴＡ筋肉のみが分析される。全身注射の場合、ＤＭＤ療法の評価の標準である心臓、ＴＡ、腓腹筋、及び横隔膜でジストロフィン再発現が検査される。遺伝子修復効率は、組織断面のエンドポイントＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、及び免疫蛍光顕微鏡法を伴う以前に公開された、ジストロフィン発現を定量する方法（Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０：９９２－１０００，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３６２８（２０１４））を使用して測定される。
ＨＩＴＩ遺伝子編集成分の最適な比率は、全身注射中に使用するように決定される。ｒＡＡＶ９－Ｃａｓ９対ｒＡＡＶ９－ｇＲＮＡ－ＨＩＴＩの比の最適化を開始するために、筋肉組織における最大の蓄積のために必要なｒＡＡＶ－ｇＲＮＡ－ＨＩＴＩ用量を決定する。ｒＡＡＶ９－ｇＲＮＡ－ＨＩＴＩは、１２週齢のｈｕＤＭＤｄｅｌ４５マウス（１群当たりｎ＝３～６）において、１０１２、１０１３、及び１０１４のウイルス粒子の３つの用量で尾静脈を介して全身的に注射される。マウスを、組織の採取のために注射の２週間後に屠殺し、ベクターゲノムのコピー数を、標準曲線法を用いてｑＰＣＲを介して測定して、分析された組織におけるＡＡＶの最大の蓄積をもたらすために必要な最小のＡＡＶ量を決定する。心臓、ＴＡ、腓腹筋、及び横隔膜筋から抽出されたＤＮＡを、それぞれ、ｒＡＡＶ９－ｇＲＮＡ－ＨＩＴＩゲノムの独自領域及びマウスゲノム標的に対して、試験及び対照プライマープローブセットで分析する。測定された最適用量でのｒＡＡＶ９－ｇＲＮＡ－ＨＩＴＩは、全身注射を介して１０１２、１０１３、及び１０１４のウイルス粒子の用量でｒＡＡＶ９－Ｃａｓ９を用量設定しながら一定に保たれる。例えば、１０１３が最大の組織蓄積のための最小用量であると決定される場合、１０１３のドナーＡＡＶを様々な量のＣａｓ９ ＡＡＶウイルスと混合し、両方をマウスに一緒に注射して、最大のノックイン効率をもたらす２つのＡＡＶの最適な比率を決定する。
マウスは、２～８週の間の時点で屠殺される。ジストロフィンの回復は、組織断面のエンドポイントＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、及び免疫蛍光顕微鏡検査を用いて、心臓、ＴＡ、腓腹筋、及び横隔膜で測定される（Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０，９９２－１０００，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３６２８（２０１４））。
全身的ｒＡＡＶ９注射後のＨＩＴＩ媒介性ＤＭＤ遺伝子修復の用量応答を測定する。用量応答曲線は、全ウイルス粒子の３つ用量（１０１２、１０１３、及び１０１４）で、２つのｒＡＡＶ９を１２週齢のｈｕＤＭＤｄｅｌ４５マウス（群当たりｎ＝３～６）の尾静脈に全身注射した後、ｈｕＤＭＤｄｅｌ４５から収集したデータを用いて、で準備する。本明細書において上記で論じたように、マウスを様々な時点で組織採取のために屠殺し、分析を心臓、ＴＡ、腓腹筋、及び横隔膜筋組織に対して実施する。ジストロフィンの回復は、組織断面のエンドポイントＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、及び免疫蛍光顕微鏡法によって、心臓、ＴＡ、腓腹筋、及び横隔膜で測定される（Ｗｅｉｎ（２０１４）、上記）。
ＤＭＤエクソンの４１～５５遺伝子座を、ｒＡＡＶ９ゲノムのうちの１つによって提供される合成コード配列で置き換えることによって、ＨＩＴＩ遺伝子編集成分をコードする２つのｒＡＡＶ９で処置したｈｕＤＭＤｄｅｌ４５マウスのいくつかの筋線維において、全長ジストロフィン発現が回復する。これらの結果は、本開示が、全長ジストロフィン発現又は機能的ジストロフィン発現を回復させるＤＭＤの遺伝子治療戦略を提供することを示す。
実施例５
エクソン１～１９のノックインコード配列のためのＤＭＤ ＨＩＴＩ編集
遺伝子の５’末端でのＤＭＤ変異を修正するために、配列番号１４９、１５２、１８７、又は１８８に示されるヌクレオチド配列を有するドナーＤＮＡで使用するために記載されるような、ＤＭＤ遺伝子の大きなセグメントの置き換えに依存しない代替のＨＩＴＩ媒介戦略が可能である。この代替アプローチでは、図１７に示されるように、プロモーター、エクソン１～１９の合成コード配列（イントロンなし）、及びスプライスドナー配列からなるドナーＤＮＡを、天然イントロン１９内でノックインすることができる。したがって、ノックインドナー配列のプロモーターは、合成エクソン１～１９のコード配列及びスプライスドナー、並びにＤＭＤの天然ＤＭＤエクソン２０～７９の転写を駆動する。合成エクソン１～１９コード配列及び天然エクソン２０～７９のスプライシングの後、結果は、プロモーター又は５’ＵＴＲ内の変異を含む、イントロン１９標的部位の上流、並びにエクソン１～イントロン１９のいずれかにおいて、実質的に任意のＤＭＤ変異を有する個体、全長のジストロフィンの発現である。
この目的のために、ドナーＤＮＡ配列を、本明細書に記載され、図１７に示されるアプローチで使用するように設計した。完全ドナー配列は、ＭＨＣＫ７プロモーターのノックインのためのドナー配列、続いてＤＭＤ Ｄｐ４２７ｍ転写物５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びにＤＭＤ遺伝子のエクソン１～１９を含む。したがって、完全ドナー配列は、ＤＳＡｉ１９－００４標的部位配列、ＭＨＣＫ７プロモーター配列、ｄｐ４２７ｍ ５’ＵＴＲ、開始コドンの後のＫｏｚａｋコンセンサス配列及びアラニンアミノ酸挿入によって修飾されたＤＭＤエクソン１～１９コード配列、スプライスドナー部位を含む下流イントロン断片、及びＤＳＡｉ１９－００４標的部位配列の第２のコピーを含む。したがって、完全ドナー配列は、１）エクソンのコード配列、２）スプライスドナーイントロン要素、及び３）末端のＣａｓ９標的部位を含む。
本明細書で上記のように、完全ドナー配列（配列番号１７２）は、ＤＳＡｉ１９－００４ゲノム標的部位（配列番号１７３）、ＭＨＣＫ７プロモーター（配列番号１７４）、ｄｐ４２７ｍ転写産物の５’ＵＴＲ（配列番号１７５）、修飾ＤＭＤエクソン１～１９コード配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）（配列番号１７６）、ヒトヘモグロビンサブユニットベータ遺伝子イントロン１由来のスプライスドナー配列（配列番号１７７）、及びＤＳＡｉ１９－００４ゲノム標的部位（配列番号１７８）の第２のコピーを、以下の表８に示すように全て含む。



ドナーＤＮＡ中のＤＳＡｉ１９－００４標的部位は、ＤＭＤイントロン１９中の天然標的部位の逆相補体であり、その結果、逆ノックインは、標的部位を再構成し、Ｃａｓ９による再切断を可能にして、逆ノックインを除去し、潜在的に所望のノックイン方向を駆動する（図１７）。ＭＨＣＫ７プロモーターは、その強い筋肉特異的発現のために選択され、開始コドンの後にアラニンアミノ酸挿入を加えて、開始コドンにＫｏｚａｋコンセンサス配列を設置し、効率的な翻訳を駆動した。このアプローチは、所望の結果をもたらすゲノムＤＮＡ欠失が生じないため、本明細書に記載の他の２つとは異なる。代わりに、ドナーＤＮＡは、イントロン１９内でノックインされ、完全長ジストロフィンの発現を駆動する独自のプロモーターを含む。
エクソン２重複変異を有する新生児ジストロフィーマウスを使用して、ＤＭＤを形成するノックインコード配列へのインビボＨＩＴＩ遺伝子編集を調べるための実験を実施する。表８及び図１７に示されるように、ｉ）ＭＨＣＫ７駆動Ｃａｓ９（ｒＡＡＶ９－Ｃａｓ９）及びｉｉ）ＤＳＡｉ１９－００４ｇＲＮＡ発現カセット並びに配列番号１７２（ｒＡＡＶ９－ｇＲＮＡ－ＨＩＴＩ）を含むＨＩＴＩドナー断片、をコードする２つのｒＡＡＶ血清型９ウイルス（ｒＡＡＶ９）は、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって製造される。これらの２つのｒＡＡＶ９は、脛骨前筋（ＴＡ）筋肉への筋肉内（ＩＭ）注射のための最大１０１２個の合計ウイルス粒子、及び全身注射のための最大１０１４個のウイルス粒子を使用して、ｄｕｐ２新生児マウス（１治療群当たり３～６個のマウス）に一緒に注射される。ＩＭ注射はＴＡ筋内で各側に行われ、全身注射は尾静脈又は腹腔内で行われる。マウスは、筋肉組織の採取及び分析のために、注射の４週間後に屠殺される。ＩＭ注射では、ＴＡ筋肉のみが分析される。全身注射の場合、ＤＭＤ療法の評価の標準である心臓、ＴＡ、腓腹筋、及び横隔膜でジストロフィン再発現が検査される。遺伝子修復効率は、以前に公開された、組織断面のデジタルＰＣＲ、定量ＰＣＲ、エンドポイントＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、及び免疫蛍光顕微鏡法（Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０：９９２－１０００，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３６２８（２０１４））を伴う、ジストロフィン発現を定量する方法を使用して測定される。
完全長ジストロフィン発現は、ｒＡＡＶ９ゲノムのうちの１つによって提供されるＭＨＣＫ７プロモーター駆動型ＤＭＤエクソン１～１９コード配列をノックするために、ＨＩＴＩ遺伝子編集成分をコードする２つのｒＡＡＶ９で処置したｄｕｐ２マウスのいくつかの筋線維において回復される。これらの結果は、本開示が、全長ジストロフィン発現又は機能的ジストロフィン発現を回復させるＤＭＤの遺伝子治療戦略を提供することを示す。
実施例６
核局在化のためのＣａｓ９の修飾
予備的なインビトロ研究に基づいて、Ｃａｓ９は、類人猿ウイルス４０大型Ｔ抗原のＮ末端ＮＬＳ及びＣ末端核プラスミン核局在化配列（ＮＬＳ）にもかかわらず、ＨＥＫ２９３細胞内の核に完全に局在化しないことが同定されている。したがって、いくつかの態様において、効率は、核局在化を改善することによって改善され得る。
Ｃａｓ９切断の効率を改善するために、ＮＬＳを、ＤＮＡポリメラーゼラムダ（ＰｏｌＬ）を用いた以前の作業に基づいて、Ｃａｓ９コード配列に融合させるように操作した。モジュラー３６アミノ酸ＮＬＳは、そのＮ末端上のＣａｓ９に融合されるように設計された。このＮＬＳモジュールは、他のタンパク質に融合したときに堅牢な核局在化を駆動することが決定され、したがって、Ｃａｓ９切断を改善するためにＣａｓ９に融合された。
表９は、核局在化配列（配列番号１７９）をコードするＤＮＡ配列、核局在化配列（配列番号１８０）のアミノ酸配列、核局在化配列を含むＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９及びＣ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９のＤＮＡ配列（それぞれ配列番号１８１及び１８３）、並びに核局在化配列を含むＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９及びＣ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１８２及び１８４）を提供する。




したがって、Ｃａｓ９発現カセットは、インビボ発現及び核局在を改善するように改変される。遺伝子編集及びジストロフィン発現は、新生児マウスにおける改変システムの注射後に測定され、その結果は、改変システムを含まない（すなわち、改変Ｃａｓ９を含まない）新生児マウスで得られたものと比較される。
修飾システムは、Ｃａｓ９切断の効率を改善し、ジストロフィンの発現を増加させる。筋肉及び心臓組織を、免疫蛍光イメージング及びジストロフィン特異的抗体によるウェスタンブロッティングを使用してジストロフィンの発現について分析する。組織から抽出されたＤＮＡを定量的ＰＣＲアッセイによって分析して、遺伝子編集効率を測定する。予想される結果は、修飾Ｃａｓ９とともに本明細書に記載されるＨＩＴＩシステムを使用した、ジストロフィン性マウスにおけるより高い遺伝子編集効率及びジストロフィンの回復である。
実施例７
エクソン４５欠失を有する患者由来細胞におけるＨＩＴＩエクソン４１～５５ｓノックイン
材料及び方法
分子クローニング及びＡＡＶ製造
市販の骨格（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＩｎｃからのｐＡＡＶ－ｍｃｓ）を使用して、ＡＡＶプラスミドを作製した。ＭＨＣＫ７プロモーターに続いて、ＳａＣａｓ９を、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ制限部位を使用して、ヒト成長ホルモンのポリアデニル化シグナルの上流にライゲーションした。このプラスミドを使用して、ＡＡＶ１－ＳａＣａｓ９を産生した。ＨＩＴＩドナー及びｇＲＮＡ ＡＡＶプラスミドを、同じｐＡＡＶ－ｍｃｓ骨格を使用してクローニングし、ＨＩＴＩドナー配列（配列番号１４９）、続いてＵ６プロモーター駆動ＪＨＩ４０－００８ｇＲＮＡカセット、及びＵ６プロモーター駆動ＪＨＩ５５Ａ－００４ｇＲＮＡカセットをＸｂａＩ制限部位でライゲーションした。このプラスミドを使用して、ＡＡＶ１－ＨＩＴＩｅ４１－５５－ｇＲＮＡを製造した。ＡＡＶ１は、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって製造された。
細胞培養及び処置
前述のように、エクソン４５欠失（ｄｅｌ４５）を有する患者由来の線維芽細胞を、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ｃｏｒｅにおいてドキシサイクリン誘導性筋芽細胞決定タンパク質１（ＭｙｏＤ）で改変した［Ｃｈａｏｕｃｈ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，２０：７８４－７９０（２００９）を参照されたい］。細胞は、約８０～９０％のコンフルエントになるまで、ＦＭ完全培地（２０％ウシ胎児血清及び１％１００倍の抗真菌剤／抗菌剤を補充されたダルベッコ改変イーグル培地高グルコース）中で、１０ｃｍ２皿中で培養した。次いで、０．０２５％トリプシン－ＥＤＴＡを使用して、細胞を皿から分離し、血球測定器でカウントした。細胞を、１２ウェル皿（５０，０００細胞／ウェル）の各ウェル中に播種し、８０％コンフルエンスまで増殖させた。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、筋芽細胞培地（８ｕｇ／ｍＬドキシサイクリンを補充したＰｒｏｍｏＣｅｌｌ骨格筋細胞増殖培地）に切り替えた。３日後、細胞を、Ｍｙｏｔｕｂｅ Ｍｅｄｉｕｍ（８μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを補充した骨格筋分化培地）に切り替え、１細胞当たり４×１０６ウイルスの合計用量で、１：１の比率のＡＡＶ１－ＳａＣａｓ９及びＡＡＶ１－ＨＩＴＩｅ４１－５５ｇＲＮＡで処置した。培地を２～３日ごとに交換し、細胞を１００％湿度及び５％ＣＯ２で３７℃に維持した。細胞をＭｙｏｔｕｂｅ Ｍｅｄｉｕｍ中で１４日後に採取した。
ＲＮＡ精製
細胞を溶解し、製造業者に提案されたプロトコールに従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬中で均質化した。クロロホルムの添加後の水相の単離後、ＲＮＡを、１：１０体積比の３Ｍ酢酸ナトリウム及び１：３体積比のエタノールの添加によって沈殿させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、水に溶解した。試料を、１ＵのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＤＮａｓｅ Ｉ，ＲＮａｓｅフリー（１Ｕ／μＬ）で３７℃で３０分間処置した。Ｚｙｍｏ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキットを使用してＲＮＡを精製した。
ＤＭＤ転写産物のＲＴ－ＰＣＲ分析
ＲＮＡ（１μｇ）を使用して、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡを生成した。ｃＤＮＡ（９０ｎｇのＲＮＡ当量）は、ＤＭＤエクソン４３（５’－ＡＧＣＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＡＧＴＴＡＡＣＡＡ－３’（配列番号１８５）及びエクソン４６（５’－ＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＴＡＡＡＡＣ－３’（配列番号１８６）にアニールするプライマーを用いた１５μＬのＰＣＲ反応において、Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘマスターミックスを用いて使用していた。熱サイクルは、製造業者の推奨に従って実施した。ＰＣＲ生成物を、臭化エチジウムで染色した１％アガロース－ＴＡＥゲルで分析した。
結果及び考察
未処置のｄｅｌ４５患者試料では、ＲＴ－ＰＣＲアンプリコンサイズは、エクソン４５を欠く予想サイズに対応した（図１８）。ＨＩＴＩシステムをコードするＡＡＶ１又はエクソン４１～５５の置き換えによる処置は、ＤＭＤ転写産物の野生型サイズへの堅牢な修正をもたらした（図１８）。したがって、本明細書に開示されるＨＩＴＩシステムは、ｄｅｌ４５患者細胞内の欠陥エクソン４１～５５遺伝子座を、成熟ＤＭＤ転写産物にスプライシングされ、全長ジストロフィンの堅牢な回復をもたらしたメガエクソンコードであるエクソン４１～５５で効率的に置き換えた。
この研究は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、患者由来の細胞株におけるゲノムＤＮＡの広い領域を置き換えるために、ＨＩＴＩ方法論とともに使用される能力を確立する。このデータは、ＤＭＤエクソン４１～５５をコードするメガエクソンが成熟ＤＭＤ転写産物にスプライシングされることを実証することによって、本開示の製品及び方法を更に支持する。このデータは、インビボでの全長ジストロフィンの遺伝子補正及び発現のインビボ効率を探索するための並行開発を更に保証する。
実施例８
ＤＭＤエクソン４１～５５の代替ＨＩＴＩ置き換え
ヒトゲノム中のほとんどのエクソンは、長さが２００ｂｐ未満である（Ｓａｋｈａｒｋａｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４，３８７－３９３，（２００４））。したがって、エクソンサイズは、スプライシング効率に影響を及ぼし得る。ＤＭＤｅ４１－５５ドナーＤＮＡノックインのエクソン認識及びスプライシングを潜在的に改善するために、代替ドナーＤＮＡ配列を設計した。このドナー配列、すなわち、配列番号１８７に示される配列は、上記の配列番号１４９に示されるドナー配列（＞Ｃｏｍｐｌｅｔｅ＿ＤＭＤｅ４１－５５＿ｄｏｎｏｒ＿ｗｉｔｈ＿ＴＴＮ＿Ｉｎｔｒｏｎｓ）と同様に使用される。このドナー配列、すなわち、配列番号１８７に示される配列は、１９０ｂｐ～３７８ｂｐの長さの範囲の個々のエクソンに分割され、ヒトチチン遺伝子（ＴＴＮ）転写産物アイソフォームＮ２－Ｂから８６ｂｐ～１４２ｂｐの長さの小さなイントロンによって分離された、ＤＭＤエクソン４１～５５のコード配列を含有する。より具体的には、配列番号１４９で使用される天然イントロン４０及び５５スプライス部位（すなわち、配列番号１５１及び１５３）は、強い分岐点、ポリピリミジントロビジントラック、及びスプライス受容体配列によってヒト免疫グロビン重鎖遺伝子イントロン１（＞Ｉｇ＿ＨＣ＿イントロン＿１＿ＳＡ＿断片）によって、及びヒトβグロビンイントロン１（＞β－ｇｌｏｂｉｎ＿ｉｎｔｒｏｎ＿１＿ＳＤ＿ｆｒａｇｍｅｎｔ）からの強いスペーサースプライスドナーによって、配列番号１８７（＞Ｃｏｍｐｌｅｔｅ＿ＤＭＤｅ４１－５５＿ｄｏｎｏｒ＿ｗｉｔｈ＿ＴＴＮ＿Ｉｎｔｒｏｎｓ）中で置き換えられる。配列番号１８８は、ＤＭＤエクソン４１～５５のコード配列及びイントロンのみを含み、配列番号１８７は、ｇＲＮＡ標的部位を含む（配列番号１４９及び１５２と同様に）。ドナー配列（配列番号１８７及び１８８）及びそれらの標的部位は、以下の表１０に示される。




本発明の範囲内の修正は、当業者には明らかであり得るため、前述の説明は、理解の明確さのためだけに与えられ、そこから不必要な制限は理解されないべきである。
本明細書及びその後の特許請求の範囲全体を通して、文脈が別段必要としない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形例は、記載された整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群を含むことを意味するが、任意の他の整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群を除外することを意味しないと理解されたい。
本明細書全体にわたって、組成物が成分又は材料を含むと記載される場合、別段の記載がない限り、組成物は、記載された成分又は材料の任意の組み合わせから本質的になるか、又はそれからなることもできることが企図される。同様に、方法が特定のステップを含むと記載される場合、別途記載されない限り、方法はまた、列挙されたステップの任意の組み合わせから本質的になるか、又はそれからなることができることが企図される。本明細書に例示的に開示される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素又はステップの不在下で好適に実施され得る。
本明細書に開示される方法の実施、及びその個々のステップは、手動で及び／又は電子機器によって提供される自動化の助けとともに実行することができる。特定の実施形態を参照してプロセスが記載されているが、当業者であれば、方法に関連する行為を実行する他の方法を使用し得ることを容易に理解するであろう。例えば、別途記載されていない限り、様々なステップの順序を、方法の範囲又は趣旨から逸脱することなく変更することができる。加えて、個々のステップのうちのいくつかは、組み合わせるか、省略するか、又は更に追加のステップに細分化することができる。
本明細書で引用される全ての特許、刊行物、及び参考文献は、参照により完全に組み込まれる。本開示と組み込まれた特許、刊行物、及び参考文献との間に矛盾がある場合、本開示に従う。

Claims (90)

  1. デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸であって、
    （ａ）配列番号１～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、あるいは
    （ｂ）配列番号１１２～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤをコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む、核酸。
  2. 配列番号１４９、１５２、１５５、１５８、１７２、１７６、１８７、若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１４９、１５２、１５５、１５８、１７２、１７６、１８７、若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、ＤＭＤ遺伝子のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列を含む、核酸。
  3. プロモーター配列を更に含む、請求項１又は２に記載の核酸。
  4. 前記プロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターのうちのいずれかである、請求項３に記載の核酸。
  5. 前記プロモーターが、Ｕ６プロモーターである、請求項３又は４に記載の核酸。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸を含む、組成物。
  7. 請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
  8. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスである、請求項７に記載のベクター。
  9. 前記ウイルスが、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を欠く、請求項８に記載のアデノ随伴ウイルス。
  10. 前記ウイルスが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項８又は９に記載のアデノ随伴ウイルス。
  11. 前記ウイルスが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、又はＡＡＶｒｈ．７４である、請求項８～１０のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス。
  12. 前記ウイルスが、ｒＡＡＶ９である、請求項８～１１のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス。
  13. 請求項８～１２のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスと、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
  14. 細胞内のＤＭＤ遺伝子中の１つ以上の欠損した、重複した、異常な、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンを置き換える方法であって、前記細胞を、
    ａ）ｉ）イントロン１を標的化する第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コードする核酸、及びイントロン１９を標的化する第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又は
    ｉｉ）イントロン１中の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、及びイントロン１９中の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、
    ｂ）ゲノムＣａｓ９切断部位によってドナー配列の各側に隣接する前記ＤＭＤ遺伝子のエクソン２～１９のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列を含む核酸、並びに
    ｃ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、でトランスフェクトすることを含む、方法。
  15. 細胞内のＤＭＤ遺伝子中の１つ以上の欠損した、重複した、異常な、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した又は異常なイントロンを置き換える方法であって、前記細胞を
    ａ）ｉ）イントロン１を標的化する第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コードする核酸、及びイントロン１９を標的化する第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又は
    ｉｉ）イントロン１中の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、及びイントロン１９中の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、
    ｂ）ゲノムＣａｓ９切断部位によってドナー配列の各側に隣接する前記ＤＭＤ遺伝子のエクソン２～１９のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列を含む核酸、並びに
    ｃ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を含むベクターでトランスフェクトすることを含む、方法。
  16. 前記Ｃａｓ９酵素が、配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示されるヌクレオチド配列、前記配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示される配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる、請求項１５又は１６に記載の方法。
  17. イントロン１を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対してと少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記核酸が、配列番号１２１～１３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１２１～１３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、を含む、イントロン１中の標的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズするｇＲＮＡをコードする、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
  19. イントロン１９を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
  20. イントロン１９の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
  21. エクソン２～１９の前記ノックインドナー配列をコードする核酸が、配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 細胞内のＤＭＤ遺伝子中の１つ以上の欠損した、重複した、異常な、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンを置き換える方法であって、前記細胞を、
    ａ）ｉ）イントロン４０を標的化する第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸、及びイントロン５５を標的化する第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又は
    ｉｉ）イントロン４０の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、及びイントロン５５の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、
    ｂ）ゲノムＣａｓ９切断部位によってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードする前記ドナーＤＮＡ配列を含む核酸、並びに
    ｃ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、でトランスフェクトすることを含む、方法。
  23. 細胞内のＤＭＤ遺伝子中の１つ以上の欠損した、重複した、異常な、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した又は異常なイントロンを置き換える方法であって、前記細胞を
    ａ）ｉ）イントロン４０を標的化する第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸、及びイントロン５５を標的化する第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又は
    ｉｉ）イントロン４０の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、及びイントロン５５の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、
    ｂ）ゲノムＣａｓ９切断部位によってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードする前記ドナーＤＮＡ配列を含む核酸、並びに
    ｃ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を含むベクターでトランスフェクトすることを含む、方法。
  24. 前記Ｃａｓ９酵素が、配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示されるヌクレオチド配列、前記配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示される配列に対して少なくとも約８０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる、請求項２２又は２３に記載の方法。
  25. イントロン４０を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１～６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１～６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、を含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. イントロン４０中の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１１２～１１７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１１２～１１７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
  27. イントロン５５を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号７～９のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. イントロン５５の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１１８～１２０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１１８～１２０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法。
  29. エクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードする前記核酸が、配列番号１４９、１５２、１８７若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１４９、１５２、１８７若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記ｇＲＮＡをコードする前記核酸の発現又はＣａｓ９酵素をコードする前記核酸の発現が、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターの制御下にある、請求項２２～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１４～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記ヒト細胞が、ヒト対象中にある、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ヒト対象が、筋ジストロフィーに罹患している、請求項３２に記載の方法。
  34. 細胞内のＤＭＤ遺伝子中の１つ以上の欠損した、重複した、異常な、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンに罹患している対象を治療する方法であって、有効量の：
    ａ）ｉ）イントロン１を標的化する第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コードする核酸、及びイントロン１９を標的化する第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又は
    ｉｉ）イントロン１中の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、及びイントロン１９中の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、
    ｂ）ゲノムＣａｓ９切断部位によってドナー配列の各側に隣接する前記ＤＭＤ遺伝子のエクソン２～１９のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列を含む核酸、並びに
    ｃ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を前記対象に投与することを含む、方法。
  35. 細胞内のＤＭＤ遺伝子中の１つ以上の欠損した、重複した、異常な、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンに罹患している対象を治療する方法であって、有効量の：
    ａ）ｉ）イントロン１を標的化する第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コードする核酸、及びイントロン１９を標的化する第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又は
    ｉｉ）イントロン１中の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、及びイントロン１９中の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、
    ｂ）ゲノムＣａｓ９切断部位によってドナー配列の各側に隣接する前記ＤＭＤ遺伝子のエクソン２～１９のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列を含む核酸、並びに
    ｃ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を含むベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
  36. 前記Ｃａｓ９酵素が、配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示されるヌクレオチド配列、前記配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示される配列に対して少なくとも約８０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる、請求項３４又は３５に記載の方法。
  37. イントロン１を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. イントロン１の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１２１～１３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１２１～１３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  39. イントロン１９を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. イントロン１９内の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。
  41. エクソン２～１９のノックインドナー配列をコードする前記核酸が、配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 細胞内のＤＭＤ遺伝子中の１つ以上の欠損した、重複した、異常な、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンに罹患している対象を治療する方法であって、有効量の：
    ａ）ｉ）イントロン４０を標的化する第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸、及びイントロン５５を標的化する第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又は
    ｉｉ）イントロン４０の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、及びイントロン５５の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、
    ｂ）ゲノムＣａｓ９切断部位によってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列を含む核酸、並びに
    ｃ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を前記対象に投与することを含む、方法。
  43. 細胞内のＤＭＤ遺伝子中の１つ以上の欠損した、重複した、異常な、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンに罹患している対象を治療する方法であって、有効量の：
    ａ）ｉ）イントロン４０を標的化する第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸、及びイントロン５５を標的化する第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又は
    ｉｉ）イントロン４０の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、及びイントロン５５の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、
    ｂ）ゲノムＣａｓ９切断部位によってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列を含む核酸、並びに
    ｃ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を含むベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
  44. 前記Ｃａｓ９酵素が、配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示されるヌクレオチド配列、前記配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示される配列に対して少なくとも約８０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる、請求項４２又は４３に記載の方法。
  45. イントロン４０を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、を含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. イントロン４０の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１１２～１１７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１１２～１１７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  47. イントロン５５を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. イントロン５５内の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１１８～１２０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１１８～１２０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の方法。
  49. エクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードする前記核酸が、配列番号１４９、１５２、１８７若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１４９、１５２、１８７若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項４２～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記ｇＲＮＡをコードする前記核酸の発現又は前記Ｃａｓ９酵素をコードする前記核酸の発現が、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターの制御下である、請求項４２～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記対象が、ヒト対象である、請求項３４～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記ヒト対象が、筋ジストロフィーに罹患している、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記筋ジストロフィーが、デュシェン筋ジストロフィー（ＤＭＤ）又はベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）である、請求項５２に記載の方法。
  54. ａ）ｉ）イントロン１を標的化する第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コードする核酸、及びイントロン１９を標的化する第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又は
    ｉｉ）イントロン１中の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、及びイントロン１９中の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、
    ｂ）ゲノムＣａｓ９切断部位によってドナー配列の各側に隣接する前記ＤＭＤ遺伝子のエクソン２～１９のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列を含む核酸、並びに
    ｃ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を含む、組換え遺伝子編集複合体であって、
    前記複合体の標的核酸配列への結合が、ＤＭＤ遺伝子発現の増加をもたらす、遺伝子編集複合体。
  55. 前記Ｃａｓ９酵素が、配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示されるヌクレオチド配列、前記配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示される配列に対して少なくとも約８０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる、請求項５４に記載の遺伝子編集複合体。
  56. イントロン１を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１０～２８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項５４又は５５に記載の遺伝子編集複合体。
  57. イントロン１の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１２１～１３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１２１～１３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項５４又は５５に記載の遺伝子編集複合体。
  58. イントロン１９を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号２９～３７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の遺伝子編集複合体。
  59. イントロン１９の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の遺伝子編集複合体。
  60. エクソン２～１９のノックインドナー配列をコードする前記核酸が、配列番号１５５若しくは１５８にしめされるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１５５若しくは１５８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項５４～５９のいずれか一項に記載の遺伝子編集複合体。
  61. 前記ｇＲＮＡをコードする前記核酸又は前記Ｃａｓ９酵素をコードする前記核酸が、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターを更に含む、請求項５４～６０のいずれか一項に記載の遺伝子編集複合体。
  62. １つ以上の前記核酸がベクター中にある、請求項５４～６１のいずれか一項に記載の遺伝子編集複合体。
  63. 前記ベクターが、ＡＡＶである、請求項６２に記載の遺伝子編集複合体。
  64. ａ）ｉ）イントロン４０を標的化する第１のＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸、及びイントロン５５を標的化する第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、又は
    ｉｉ）イントロン４０の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、及びイントロン５５の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第２のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、
    ｂ）ゲノムＣａｓ９切断部位によってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードする前記ドナーＤＮＡ配列を含む核酸、並びに
    ｃ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を含む、組換え遺伝子編集複合体であって、
    前記複合体の標的核酸配列への結合が、ＤＭＤ遺伝子発現の増加をもたらす、遺伝子編集複合体。
  65. 前記Ｃａｓ９酵素が、配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示されるヌクレオチド配列、前記配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示される配列に対して少なくとも約８０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる、請求項６４に記載の遺伝子編集複合体。
  66. イントロン４０を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１～６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項６４又は６５に記載の遺伝子編集複合体。
  67. イントロン４０の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１１２～１１７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１１２～１１７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項６４又は６５に記載の遺伝子編集複合体。
  68. イントロン５５を標的化する第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号７～９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項６４～６７のいずれか一項に記載の遺伝子編集複合体。
  69. イントロン５５の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする第１のＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号１１８～１２０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１１８～１２０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項６４～６７のいずれか一項に記載の遺伝子編集複合体。
  70. エクソン４１～５５のノックインドナー配列をコードする前記核酸が、配列番号１４９、１５２、１８７若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１４９、１５２、１８７若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項６４～６９のいずれか一項に記載の遺伝子編集複合体。
  71. 前記ｇＲＮＡをコードする前記核酸又は前記Ｃａｓ９酵素をコードする前記核酸が、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターを更に含む、請求項６４～７０のいずれか一項に記載の遺伝子編集複合体。
  72. １つ以上の前記核酸がベクター中にある、請求項６４～７１のいずれか一項に記載の遺伝子編集複合体。
  73. 前記ベクターが、ＡＡＶである、請求項７２に記載の遺伝子編集複合体。
  74. 細胞における、ＤＭＤ遺伝子の発現を増加させる又は機能的ジストロフィンの前記発現を増加させる方法であって、前記細胞を：
    ａ）ｉ）イントロン１９を標的化するＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸又は
    ｉｉ）イントロン１９内の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、
    ｂ）ゲノムＣａｓ９切断部位によってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン１～１９のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列を含む核酸、並びに
    ｃ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を含む核酸と接触させることを含む、方法。
  75. 細胞内のＤＭＤ遺伝子中の１つ以上の欠損した、重複した、異常な、若しくは異常にスプライシングされたエクソン、又は欠損した若しくは異常なイントロンに罹患している対象を治療する方法であって、有効量の：
    ａ）ｉ）イントロン１９を標的化するＤＭＤ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸、又は
    ｉｉ）イントロン１９内の標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする核酸、
    ｂ）ゲノムＣａｓ９切断部位によってドナー配列の各側に隣接するＤＭＤ遺伝子のエクソン１～１９のノックインドナー配列をコードするドナーＤＮＡ配列を含む核酸、並びに
    ｃ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする核酸、を前記対象に投与することを含む、方法。
  76. 前記Ｃａｓ９酵素が、配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示されるヌクレオチド配列、前記配列番号１６１、１６２、１８１、若しくは１８３に示される配列に対して少なくとも約８０％の同一性を含むその変異体、又はその機能的断片によってコードされる、請求項７４又は７５に記載の方法。
  77. イントロン１９を標的化するＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、配列番号２９～３７のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号２９～３７のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記ＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードする前記核酸が、イントロン１９の標的配列に特異的にハイブリダイズする核酸配列を含み、配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１４０～１４８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の方法。
  79. エクソン１～１９のノックインドナー配列をコードする前記核酸が、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列：
    （ａ）配列番号１７３若しくは１７８に示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１７３若しくは１７８に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、
    （ｂ）配列番号１７４に示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１７４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、
    （ｃ）配列番号１７５に示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１７５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、
    （ｄ）配列番号１７６に示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１７６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、及び
    （ｅ）配列番号１７７に示されるヌクレオチド配列、又は前記配列番号１７７に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体、を含む、請求項７４～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. エクソン１～１９のノックインドナー配列をコードする前記核酸が、配列番号１７２に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約８０％の同一性を含むその変異体を含む、請求項７４～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記ｇＲＮＡをコードする前記核酸の発現又は前記Ｃａｓ９酵素をコードする前記核酸の発現が、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターの制御下である、請求項７４～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記核酸が、ベクター中にある、請求項７４～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記ベクターが、ＡＡＶである、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記対象が、ヒト対象である、請求項７４～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記ヒト対象が、筋ジストロフィーに罹患している、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記筋ジストロフィーが、デュシェン筋ジストロフィー（ＤＭＤ）又はベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）である、請求項８５に記載の方法。
  87. ５’末端に：
    （ａ）配列番号１７９に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むヌクレオチド配列、又は
    （ｂ）配列番号１８０に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むヌクレオチド配列、を含むヌクレオチド配列を含む核局在化シグナルをコードするポリヌクレオチドを含む、Ｃａｓ酵素をコードする、核酸。
  88. ５’末端に：
    （ａ）配列番号１７９に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、又は配列番号１７９に示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体、又は
    （ｂ）配列番号１８０に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号１８０に示されるアミノ酸配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むその変異体、を含むヌクレオチド配列を含む核局在化シグナルをコードするポリヌクレオチドを含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素をコードする、核酸。
  89. 前記Ｃａｓ酵素が、Ｃａｓ９又はＣａｓ１３である、請求項８８に記載の核酸。
  90. 前記Ｃａｓ酵素が、Ｃａｓ９である、請求項８９に記載の核酸。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023240157A2 (en) * 2022-06-08 2023-12-14 Scribe Therapeutics Inc. Compositions and methods for the targeting of dmd
CN115806989B (zh) * 2022-11-25 2023-08-08 昆明理工大学 针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA及载体和应用

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
DE69433592T2 (de) 1993-11-09 2005-02-10 Targeted Genetics Corp., Seattle Die erzielung hoher titer des rekombinanten aav-vektors
EP0728214B1 (en) 1993-11-09 2004-07-28 Medical College Of Ohio Stable cell lines capable of expressing the adeno-associated virus replication gene
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
WO1996017947A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
CA2625279A1 (en) 1995-08-30 1997-03-06 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adenovirus and aav
JPH11514853A (ja) 1995-09-08 1999-12-21 ジエンザイム コーポレイション 遺伝子治療のための改良されたａａｖベクター
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
EP1696036B1 (en) 1996-09-06 2010-04-21 The Trustees of The University of Pennsylvania Use of recombinant adeno-associated virus in the manufacture of a medicament for gene therapy via muscle cells
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
PT1944362E (pt) 1997-09-05 2016-01-27 Genzyme Corp Métodos de produção de preparações de alto título de vetores aav recombinantes desprovidos de adjuvantes
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US7056502B2 (en) 2000-04-28 2006-06-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with AAV5 capsids and AAV5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
WO2002053703A2 (en) 2001-01-05 2002-07-11 Children's Hospital, Inc. Aav2 vectors and methods
PT1453547T (pt) 2001-12-17 2016-12-28 Univ Pennsylvania Sequências do vírus adeno-associado (aav) do serotipo 8, vetores contendo as mesmas, e utilizações destas
FR2874384B1 (fr) 2004-08-17 2010-07-30 Genethon Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables
WO2011113889A1 (en) 2010-03-17 2011-09-22 Association Institut De Myologie Modified u7 snrnas for treatment of neuromuscular diseases
AU2012286994B2 (en) 2011-07-25 2017-08-10 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of DUX4
DE102012007232B4 (de) 2012-04-07 2014-03-13 Susanne Weller Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen
JP6670743B2 (ja) 2013-05-29 2020-03-25 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｉｉ型ｃｒｉｓｐｒシステムにおける新規のコンパクトなｃａｓ９足場
EP3417880A1 (en) 2013-06-05 2018-12-26 Duke University Rna-guided gene editing and gene regulation
JP2015092462A (ja) 2013-09-30 2015-05-14 Tdk株式会社 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池
WO2015141521A1 (ja) 2014-03-21 2015-09-24 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及び記録媒体
JP6197169B2 (ja) 2014-09-29 2017-09-20 東芝メモリ株式会社 半導体装置の製造方法
US20180155708A1 (en) 2015-01-08 2018-06-07 President And Fellows Of Harvard College Split Cas9 Proteins
US11369692B2 (en) * 2015-10-28 2022-06-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of Duchenne Muscular Dystrophy
ES2957660T3 (es) 2016-05-05 2024-01-23 Univ Duke Composiciones relacionadas con crispr/cas para tratar la distrofia muscular de duchenne
US20190345483A1 (en) 2016-05-12 2019-11-14 President And Fellows Of Harvard College AAV Split Cas9 Genome Editing and Transcriptional Regulation
CA3030587A1 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 Salk Institute For Biological Studies Methods and compositions for genome editing in non-dividing cells
EP3749768A1 (en) * 2018-02-05 2020-12-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
JP2022529424A (ja) * 2019-04-14 2022-06-22 デューク ユニバーシティ ジストロフィン機能を修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたゲノム編集組成物
EP4076539A1 (en) * 2019-12-16 2022-10-26 President and Fellows of Harvard College Methods and compositions for correction of dmd mutations
WO2021222268A1 (en) * 2020-04-27 2021-11-04 Duke University Crispr/cas9 therapies for correcting duchenne muscular dystrophy by targeted genomic integration

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