ES2957660T3 - Composiciones relacionadas con crispr/cas para tratar la distrofia muscular de duchenne - Google Patents

Abstract

En el presente documento se describen vectores que se dirigen a un gen de distrofina, que codifica al menos una molécula de Cas9 o una proteína de fusión de Cas9, y al menos una molécula de ARNg (por ejemplo, dos moléculas de ARNg), y composiciones y células que comprenden dichos vectores. También se proporcionan métodos para usar los vectores, composiciones y células para la ingeniería genómica (por ejemplo, corregir un gen de distrofina mutante) y para tratar la DMD. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones relacionadas con crispr/cas para tratar la distrofia muscular de duchenne

Listado de secuencias

La presente memoria descriptiva hace referencia a un listado de secuencias (presentado electrónicamente como un archivo.txt llamado “ 028193-9231-WO00 As Filed Sequence Listing” el 5 de mayo de 2017). El archivo.txt se generó el 5 de mayo de 2017 y tiene un tamaño de 62.346 bytes.

Campo técnico

La presente divulgación se relaciona con el campo de la alteración de la expresión génica, la ingeniería genómica y la alteración genómica de genes utilizando sistemas basados en Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas Regularmente Interespaciadas (CRISPR)/asociadas a CRISPR (Cas) 9 y sistemas de administración viral. La presente divulgación también se refiere al campo de la ingeniería genómica y la alteración genómica de genes en el músculo, tales como el músculo esquelético y el músculo cardíaco.

Antecedentes

Los factores de transcripción sintéticos se han diseñado para controlar la expresión génica para muchas aplicaciones médicas y científicas diferentes en sistemas de mamíferos, que incluyen la regeneración de tejido estimulante, el cribado de fármacos, la compensación de defectos genéticos, la activación de supresores tumorales silenciados, el control de la diferenciación de células madre, realizando cribados genéticos y creando circuitos genéticos sintéticos. Estos factores de transcripción pueden dirigirse a promotores o potenciadores de genes endógenos, o están diseñados intencionadamente para reconocer secuencias ortogonales a genomas de mamífero para la regulación transgénica. Las estrategias más comunes para diseñar nuevos factores de transcripción dirigidos a secuencias definidas por el usuario se han basado en los dominios de unión a ADN programables de proteínas de dedos de zinc y efectores similares a activador de la transcripción (TALE). Ambos enfoques implican aplicar los principios de las interacciones proteína-ADN de estos dominios para diseñar nuevas proteínas con especificidad única de unión al ADN. Aunque estos métodos han sido ampliamente satisfactorios para muchas aplicaciones, la ingeniería de proteínas necesaria para manipular las interacciones proteína-ADN puede ser laboriosa y requerir experiencia especializada.

Además, estas nuevas proteínas no siempre son eficaces. Las razones de esto no se conocen aún, pero pueden relacionarse con los efectos de las modificaciones epigenéticas y el estado de la cromatina en la unión de proteínas al sitio diana genómico. Además, existen desafíos para asegurar que estas nuevas proteínas, así como otros componentes, se administran a cada célula. Los métodos existentes para suministrar estas nuevas proteínas y sus múltiples componentes incluyen el suministro a las células en plásmidos o vectores separados que conduce a niveles de expresión altamente variables en cada célula debido a diferencias en el número de copias. Además, la activación génica después de la transfección es transitoria debido a la dilución del ADN plasmídico, y la expresión génica temporal puede no ser suficiente para inducir efectos terapéuticos. Además, este enfoque no es susceptible a tipos de células que no se transfectan fácilmente. Por lo tanto, otra limitación de estas nuevas proteínas es la potencia de activación transcripcional.

Las nucleasas específicas de sitio se pueden usar para introducir rupturas bicatenarias específicas de sitio en loci genómicos diana. Esta escisión del ADN estimula la maquinaria natural de reparación del ADN, lo que conduce a una de las dos posibles vías de reparación. En ausencia de una plantilla donante, la ruptura se reparará mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ), una ruta de reparación propensa a errores que conduce a pequeñas inserciones o deleciones de ADN. Este método puede usarse para interrumpir, deletar o alterar intencionadamente el marco de lectura de las secuencias de genes diana. Sin embargo, si se proporciona una plantilla de donante junto con las nucleasas, entonces la maquinaria celular reparará la ruptura mediante recombinación homóloga, que aumenta varios órdenes de magnitud en presencia de escisión de ADN. Este método puede usarse para introducir cambios específicos en la secuencia de ADN en los sitios diana. Las nucleasas modificadas se han usado para la edición de genes en una variedad de células madre humanas y líneas celulares, y para la edición génica en el hígado de ratón. Sin embargo, el obstáculo importante para la implementación de estas tecnologías es el suministro a los tejidos particulares in vivo de una manera que es eficaz, eficiente y facilita la modificación del genoma exitosa.

Las enfermedades genéticas hereditarias tienen efectos devastadores en niños en los Estados Unidos. Estas enfermedades actualmente no tienen cura y solo pueden administrarse por intentos de aliviar los síntomas. Durante décadas, el campo de la terapia génica ha prometido una cura a estas enfermedades.

Sin embargo, los obstáculos técnicos con respecto a la administración segura y eficiente de genes terapéuticos a las células y pacientes han limitado este enfoque. La Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) es la enfermedad monogénica hereditaria más común y se produce en 1 de cada 3.500 hombres. DMD es el resultado de mutaciones heredadas o espontáneas en el gen de la distrofina. La distrofina es un componente clave de un complejo de proteínas responsable de regular la integridad y función de las células musculares. Los pacientes con DMD típicamente pierden la capacidad de apoyarse físicamente en sí durante la infancia, se vuelven progresivamente más débiles durante la adolescencia y mueren entre veinte o treinta años de edad. Las actuales estrategias experimentales de terapia génica para DMD requieren la administración repetida de vehículos de administración de genes transitorios o se basan en la integración permanente de material genético foráneo en el ADN genómico. Ambos métodos tienen problemas de seguridad graves. Además, estas estrategias se han limitado por una incapacidad para suministrar la grane y compleja secuencia génicade la DMD.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un vector que codifica una primera molécula de ARN guía (ARNg), una segunda molécula de ARNg y al menos una molécula Cas9 que reconoce un Motivo Adyacente Protoespaciador (PAM) de NNGRRT (Id. de sec. n°: 24) o NNGRRV (Id. de sec. n°: 25), en donde la al menos una molécula Cas9 es una molécula Cas9 deS.aureus.y en donde la primera molécula de ARNg comprende un dominio de direccionamiento que consiste en una secuencia de nucleótidos como se establece en la Id. de sec. n°: 1, y la segunda molécula de ARNg comprende un dominio de direccionamiento que consiste en una secuencia de nucleótidos como se establece en la Id. de sec. n°: 2.

En algunas realizaciones, el vector se configura para formar una primera y una segunda ruptura de cadena doble en un primer y un segundo intrón flanqueante del exón 51 del gen humano deDMD,respectivamente, eliminando de este modo un segmento del gen de la distrofina que comprende el exón 51. En ciertas realizaciones, el segmento tiene una longitud de aproximadamente 800-900, aproximadamente 1.500-2.600, aproximadamente 5.200-5.500, aproximadamente 20.000-30.000, aproximadamente 35.000-45.000, o aproximadamente 60.000-72.000 pares de bases.

En ciertas realizaciones, la al menos una molécula Cas9 es una molécula Cas9 deS.aureus mutante.

En ciertas realizaciones, el vector es un vector viral. En ciertas realizaciones, el vector es un vector de virus adenoasociado (AAV).

La presente invención también proporciona una célula que comprende un vector descrito anteriormente. La presente invención proporciona además una composición que comprende un vector descrito anteriormente.

La presente invención proporciona además el vector descrito anteriormente para su uso en un medicamento.

La presente invención proporciona además el vector descrito anteriormente para su uso en el tratamiento de la Distrofia Muscular de Duchenne.

La presente invención proporciona además un sistema basado en CRISPR/Cas9 que comprende una primera molécula de ARN guía (ARNg), una segunda molécula de ARNg y al menos una molécula Cas9 que reconoce un Motivo Adyacente Protoespaciador (PAM) de NNGRRT (Id. de sec. n°: 24) o

NNGRRV (Id. de sec. n°: 25), en donde la al menos una molécula Cas9 es una molécula Cas9 deS.aureus.y en donde la primera molécula de ARNg comprende un dominio de direccionamiento que consiste en una secuencia de nucleótidos como se establece en la Id. de sec. n°: 1, y la segunda molécula de ARNg comprende un dominio de direccionamiento que consiste en una secuencia de nucleótidos como se establece en la Id. de sec. n°: 2.

En algunas realizaciones, el sistema basado en CRISPR/Cas-9 se configura para formar una primera y una segunda ruptura de cadena doble en un primer y un segundo intrón flanqueante del exón 51 del gen humano deDMD,respectivamente, eliminando de este modo un segmento del gen de la distrofina que comprende el exón 51. En ciertas realizaciones, el segmento tiene una longitud de aproximadamente 800-900, aproximadamente 1.500-2.600, aproximadamente 5.200-5.500, aproximadamente 20,000-30,000, aproximadamente 35,000-45,000 o aproximadamente 60,000-72,000 pares de bases.

En ciertas realizaciones, la al menos una molécula Cas9 es una molécula Cas9 deS.aureusmutante.

La presente invención proporciona además el sistema basado en CRISPR/Cas9 para su uso en un medicamento.

La presente invención proporciona además el sistema basado en CRISPR/Cas9 para su uso en el tratamiento de Distrofia Muscular de Duchenne.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa la eficacia de deleción de los vectores actualmente descritos en células HEK293T.

La Figura 2 representa la eficacia de deleción de los vectores actualmente descritos en mioblastos DMD.

La Figura 3 representa los resultados de secuenciación de un vector actualmente descrito en muestras de mioblastos DMD.

Descripción detallada

Las construcciones genéticas, las composiciones y los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para la edición del genoma, por ejemplo, corregir o reducir los efectos de las mutaciones en el gen de ladistrofinainvolucrado en enfermedades genéticas, por ejemplo, DMD. Las construcciones genéticas (por ejemplo, vectores) comprenden al menos un par de moléculas de ARN guía que proporcionan la especificidad de direccionamiento al ADN para el gen de ladistrofina,y al menos una molécula Cas9.

La materia aquí descrita también proporciona construcciones genéticas, composiciones y métodos para administrar el sistema basado en CRISPR/CRISPR (Cas) 9 y ARNg para dirigirse al gen de ladistrofina.La materia aquí descrita también proporciona la administración de las construcciones genéticas (por ejemplo, vectores) o composiciones que comprenden los mismos al músculo esquelético y el músculo cardíaco. El vector puede ser un AAV, que incluye vectores de AAV modificados. La materia objeto actualmente divulgada proporciona un medio para reescribir el genoma humano para aplicaciones terapéuticas y especies modelo diana para aplicaciones de ciencia básica.

La edición génica es altamente dependiente del ciclo celular y las complejas rutas de reparación del ADN que varían de tejido a tejido. El músculo esquelético es un entorno muy complejo, que consiste en grandes fibras de mio con más de 100 núcleos por célula. La terapia génica y la biología en general han estado limitadas durante décadas por obstáculos de administración in vivo. Estos desafíos incluyen estabilidad del portador in vivo, dirigidos al tejido correcto, obteniendo suficiente expresión génica y producto génico activo, y evitando la toxicidad que podría superar la actividad, lo que es común con las herramientas de edición de genes. Otros vehículos de administración, tales como la inyección directa de ADN plasmídico, funcionan para expresar genes en el músculo esquelético y el músculo cardíaco en otros contextos, pero no funcionan bien con estas nucleasas específicas de sitio para lograr niveles detectables de edición del genoma.

Si bien muchas secuencias de genes son inestables en vectores de AAV y, por lo tanto, no pueden ser administrables, los sistemas CRISPR/Cas son estables en los vectores de AAV. Cuando los sistemas CRISPR/Cas se administran y expresan, permanecieron activos en el tejido del músculo esquelético. La estabilidad de la proteína y la actividad de los sistemas CRISPR/Cas son altamente dependientes del tipo de tejido y del tipo de célula. Estos sistemas CRISPR/Cas activos y estables pueden modificar las secuencias genéticas en el entorno complejo del músculo esquelético. La materia aquí descrita describe una forma de administrar formas activas de esta clase de productos terapéuticos al músculo esquelético o músculo cardíaco que es eficaz, eficiente y facilita una modificación del genoma exitosa.

Los encabezados de sección que se usan en esta sección y la descripción completa en la presente descripción son simplemente para fines organizativos y no pretenden ser limitantes.

1. Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica. En caso de conflicto, prevalecerá el presente documento, incluidas las definiciones. Los métodos y materiales preferidos se describen a continuación, aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica o prueba de la materia objeto actualmente divulgada. Los materiales, métodos y ejemplos descritos en la presente descripción son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

A menos que se defina lo contrario en la presente descripción, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente descripción tendrán los significados que comúnmente entienden los expertos en la técnica. Por ejemplo, cualquier nomenclatura usada en relación con, y técnicas de cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en el presente documento son aquellas que son bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. El significado y el alcance de los términos deben ser claros; sin embargo, en el caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones proporcionadas en la presente descripción tienen prioridad sobre cualquier diccionario o definición extrínseca. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular.

Los términos “ comprender” , “ incluye(n)” , “ que tiene” , “ tiene” , “ puede” , “ contiene(n)” y variantes de los mismos, como se usan en el presente documento, pretenden ser frases, términos o palabras de transición de extremos abiertos que no excluyen la posibilidad de actos o estructuras adicionales. Las formas singulares “ un” , “ uno/a” y “ el//la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La presente divulgación también contempla otras realizaciones “ que comprenden” , “ que consiste en” , y “ que consiste esencialmente en” , las realizaciones o elementos presentados en el presente documento, ya sean explícitamente establecidos o no.

Para la mención de intervalos numéricos en el presente documento, cada número intermedio entre ellos con el mismo grado de precisión se contempla explícitamente. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, los números 7 y 8 se contemplan además de 6 y 9, y para el intervalo 6,0-7,0, el número 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0 se contemplan explícitamente.

Como se usa en la presente descripción, el término “ aproximadamente” o “ cerca de” significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular como lo determina un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor, esdecir.,las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, “ cerca de” puede significar dentro de 3 o más de 3 desviaciones estándar, según la práctica en la técnica. Alternativamente, “ cerca de” puede significar un intervalo de hasta 20 %, preferentemente hasta 10 %, más preferentemente hasta 5 %, y más preferentemente hasta 1 % de un valor dado. Alternativamente, particularmente con respecto a los sistemas o procesos biológicos, el término puede significar dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces, y más preferentemente dentro de 2 veces, de un valor.

“ Desplazamiento de marco” o “ mutación de cambio de marco” , como se usa indistintamente en la presente descripción, se refiere a un tipo de mutación génica en donde la adición o deleción de uno o más nucleótidos provoca un cambio en el marco de lectura de los codones en el ARNm. El desplazamiento en el marco de lectura puede conducir a la alteración en la secuencia de aminoácidos en la traducción de proteínas, tal como una mutación sin sentido o un codón de parada prematuro.

“ Proteína de fusión” , como se usa en la presente descripción, se refiere a una proteína quimérica creada a través de la unión de dos o más genes que originalmente se codifican para proteínas separadas. La traducción del gen de fusión da como resultado un solo polipéptido con propiedades funcionales derivadas de cada una de las proteínas originales.

“ Construcción genética” , como se usa en el presente documento, se refiere a las moléculas de ADN o ARN que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína. La secuencia codificante incluye señales de iniciación y terminación unidas operativamente a elementos reguladores que incluyen un promotor y una señal de poliadenilación capaz de dirigir la expresión en las células del individuo al que se administra la molécula de ácido nucleico.

Como se usa en la presente descripción, el término “ forma expresable” se refiere a construcciones génicas que contienen los elementos reguladores necesarios que funcionan unidos a una secuencia codificante que codifica una proteína de manera que cuando está presente en la célula del individuo, la secuencia codificante se expresará.

“ Gen mutante” o “ gen mutado” como se usa indistintamente en el presente documento se refiere a un gen que se ha sometido a una mutación detectable. Un gen mutante ha experimentado un cambio, tal como la pérdida, ganancia o intercambio de material genético, que afecta la transmisión normal y la expresión del gen. Un “ gen interrumpido” , como se usa en la presente descripción, se refiere a un gen mutante que tiene una mutación que causa un codón de parada prematuro. El producto génico alterado se trunca en relación con un producto génico no interrumpido de longitud completa.

“ Gen Normal” , como se usa en el presente documento, se refiere a un gen que no se ha sometido a un cambio, tal como una pérdida, ganancia o intercambio de material genético. El gen normal experimenta una transmisión génica y una expresión génica normal.

“Ácido nucleico” u “ oligonucleótido” o “ polinucleótido” como se usa en el presente documento significa al menos dos nucleótidos unidos covalentemente entre sí. La representación de una sola cadena también define la secuencia de la cadena complementaria. Por lo tanto, un ácido nucleico también abarca la cadena complementaria de una cadena individual representada. Muchas variantes de un ácido nucleico pueden usarse para el mismo propósito que un ácido nucleico determinado. Por lo tanto, un ácido nucleico también abarca ácidos nucleicos sustancialmente idénticos y complementos de los mismos. Una sola cadena proporciona una sonda que puede hibridarse con una secuencia diana en condiciones de hibridación rigurosas. Por lo tanto, un ácido nucleico también abarca una sonda que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas.

Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, o pueden contener porciones tanto de secuencia bicatenaria como monocatenaria. El ácido nucleico puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, ARN o un híbrido, donde el ácido nucleico puede contener combinaciones de desoxinucleótidos y ribonucleótidos, y combinaciones de bases que incluyen uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Los ácidos nucleicos pueden obtenerse mediante métodos de síntesis química o mediante métodos recombinantes.

“ Unido operativamente” como se usa en el presente documento significa que la expresión de un gen está bajo el control de un promotor con el que está conectado espacialmente. Se puede colocar un promotor 5' (corriente arriba) o 3' (corriente abajo) de un gen bajo su control. La distancia entre el promotor y un gen puede ser aproximadamente la misma que la distancia entre ese promotor y el gen que controla en el gen del que se deriva el promotor. Como se conoce en la técnica, la variación en esta distancia puede acomodarse sin pérdida de función del promotor.

“ Codón de parada prematuro” o “ codón de parada fuera de marco” como se usa indistintamente en el presente documento se refiere a la mutación sin sentido en una secuencia de ADN, que da como resultado un codón de parada en la ubicación que no se encuentra normalmente en el gen de tipo salvaje. Un codón de parada prematuro puede hacer que una proteína sea truncada o más corta en comparación con la versión de longitud completa de la proteína.

“ Promotor” , como se usa en el presente documento, significa una molécula sintética o de origen natural que es capaz de conferir, activar o mejorar la expresión de un ácido nucleico en una célula. Un promotor puede comprender una o más secuencias reguladoras de la transcripción específicas para mejorar aún más la expresión y/o para alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de la misma. Un promotor también puede comprender elementos potenciadores o represores distales, que pueden ubicarse hasta varios miles de pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción. Un promotor puede derivarse de fuentes que incluyen virus, bacterias, hongos, plantas, insectos y animales. Un promotor puede regular la expresión de un componente génico constitutivamente, o diferencialmente con respecto a la célula, el tejido u órgano en el que se produce la expresión o, con respecto a la etapa de desarrollo en la que se produce la expresión, o en respuesta a estímulos externos tales como tensiones fisiológicas, patógenos, iones metálicos o agentes inductores. Ejemplos representativos de promotores incluyen el promotor T7 bacteriófago, el promotor T3 bacteriófago, el promotor SP6, el operador-promotor lac, el promotor tac, el promotor tardío SV40, el promotor precoz SV40, el promotor RSV-LTR, el promotor IE de CMV, el promotor precoz SV40 o el promotor tardío de SV40 y el promotor IE de CMV.

“ Músculo esquelético” , como se usa en la presente descripción, se refiere a un tipo de músculo estriado, que está bajo el control del sistema nervioso somático y se une a los huesos mediante haces de fibras de colágeno conocidas como tendones. El músculo esquelético está compuesto por componentes individuales conocidos como miocitos, o “ células musculares” , a veces se denominan coloquialmente llamadas “ fibras musculares” Los miocitos se forman a partir de la fusión de los mioblastos del desarrollo (un tipo de célula progenitora embrionaria que da lugar a una célula muscular) en un proceso conocido como miogénesis. Estas células largas, cilíndricas, multinucleadas también se denominan miofibras. En ciertas realizaciones, “ afección del músculo esquelético” se refiere a una afección relacionada con el músculo esquelético, tales como distrofias musculares, envejecimiento, degeneración muscular, cicatrización de heridas y debilidad o atrofia muscular.

“ Músculo cardíaco” o “ miocardio” , como se usa indistintamente en la presente descripción, significa un tipo de músculo dividido involuntario que se encuentra en las paredes y la base histológica del corazón, el miocardio. El músculo cardíaco está hecho de cardiomiocitos o miocardiocitos. Los miocardiocitos muestran estrías similares a las de las células del músculo esquelético pero contienen solo un núcleo único, a diferencia de las células esqueléticas multinucleadas. En ciertas realizaciones, “ afección muscular cardíaca” se refiere a una afección relacionada con el músculo cardíaco, tal como cardiomiopatía, insuficiencia cardíaca, arritmia y enfermedad cardíaca inflamatoria.

“ Sujeto” y “ paciente” , como se usa en el presente documento, se refiere indistintamente a cualquier vertebrado, que incluye, pero no se limita a, un mamífero {por ejemplo, vaca, cerdo, camello, llama, caballo, cabra, conejo, oveja, hámsteres, cobaya, gato, perro, rata y ratón, un primate no humano (por ejemplo, un mono, tal como un mono cinomolgo o rhesus, chimpancé, etc.) y un ser humano). En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano. El sujeto o paciente puede someterse a otras formas de tratamiento.

“ Gen diana” , como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico conocido o putativo. El gen diana puede ser un gen mutado involucrado en una enfermedad genética. En ciertas realizaciones, el gen diana es un gen humano dedistrofina.En ciertas realizaciones, el gen diana es un gen humano mutante dedistrofina.

“ Región diana” , como se usa en la presente descripción, se refiere a la región del gen diana al que se diseña la molécula de ARNg para unirse y escindirse.

“ Variante” usada en la presente memoria con respecto a un ácido nucleico significa (i) una parte o fragmento de una secuencia de nucleótidos referenciada; (ii) el complemento de una secuencia de nucleótidos mencionada o porción del mismo; (iii) un ácido nucleico que es sustancialmente idéntico a un ácido nucleico referenciado o al complemento del mismo; o (iv) un ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con el ácido nucleico mencionado, el complemento del mismo o una secuencia sustancialmente idéntica a los mismos. “ Variante” con respecto a un péptido o polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos por la inserción, deleción o sustitución conservadora de aminoácidos, pero conservan al menos una actividad biológica. Variante también puede significar una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína a la que se hace referencia con una secuencia de aminoácidos que conserva al menos una actividad biológica. Una sustitución conservadora de un aminoácido, es decir, reemplazar un aminoácido con un aminoácido diferente de propiedades similares (por ejemplo, hidrofilicidad, grado y distribución de regiones cargadas) se reconoce en la técnica como que implica típicamente un cambio menor. Estos cambios menores pueden identificarse, en parte, considerando el índice hidropático de aminoácidos, como se entiende en la técnica. Kyte y col., J. Mol.Biol.157: 105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su hidrofobicidad y carga. Se conoce en la técnica que los aminoácidos de índices hidropáticos similares pueden ser sustituidos y aún retener la función de proteínas. En un aspecto, los aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ±2 están sustituidos. La hidrofilicidad de los aminoácidos también se puede utilizar para revelar sustituciones que darían como resultado que las proteínas conserven su función biológica. Una consideración de la hidrofilicidad de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo de la mayor hidrofilicidad promedio local de ese péptido. Las sustituciones pueden realizarse con aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad dentro de ±2 entre sí. Tanto el índice de hidrofobicidad como el valor de hidrofilicidad de los aminoácidos están influenciados por la cadena lateral particular de ese aminoácido. De acuerdo con esa observación, se entiende que las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos, y particularmente las cadenas laterales de esos aminoácidos, como lo revela la hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y otras propiedades.

“ Vector” como se usa en el presente documento significa una secuencia de ácido nucleico que contiene un origen de replicación. Un vector puede ser un vector viral, bacteriófago, cromosoma artificial bacteriano o cromosoma artificial de levadura. Un vector puede ser un vector de ADN o ARN. Un vector puede ser un vector extracromosómico autorreplicante, por ejemplo, un plásmido de ADN. Por ejemplo, el vector puede codificar una molécula Cas9 y un par de moléculas de ARNg.

2. Construcciones genéticas para la edición genómica de la Distrofina

La materia objeto actualmente divulgada proporciona construcciones genéticas para la edición genómica o la alteración genómica de un gen dedistrofina(p. ej., gen humano dedistrofina).

En ciertas realizaciones, la distrofina se refiere a una proteína citoplasmática en forma de bastón que es parte de un complejo de proteínas que conecta el citoesqueleto de una fibra muscular a la matriz extracelular circundante a través de la membrana celular. La distrofina proporciona estabilidad estructural al complejo de distroglicano de la membrana celular que es responsable de regular la integridad y función de las células musculares. En determinadas realizaciones, el gen de ladistrofina(o un “ gen deDMD” )es 2,2 megabases en el locus Xp21. La transcripción primaria mide aproximadamente 2.400 kb con el ARNm maduro siendo de aproximadamente 14 kb. 79 exones codifican la proteína que tiene más de 3.500 aminoácidos.

Una construcción genética actualmente divulgada codifica un sistema CRISPR/Cas9 que comprende al menos una molécula Cas9 y dos moléculas ARNg. La materia objeto actualmente divulgada también proporciona composiciones que comprenden tales construcciones genéticas. La construcción genética puede estar presente en una célula como una molécula extracromosómica funcional. La construcción genética puede ser un minicromosoma lineal que incluye centrómero, telómeros o plásmidos o cósmidos.

La construcción genética puede ser parte de un genoma de un vector viral recombinante, que incluye lentivirus recombinante, adenovirus recombinante y virus asociado a adenovirus recombinante. La construcción genética puede ser parte del material genético en microorganismos vivos atenuados o vectores microbianos recombinantes que viven en células. Las construcciones genéticas pueden comprender elementos reguladores para la expresión génica de las secuencias codificantes del ácido nucleico. Los elementos reguladores pueden ser un promotor, un potenciador, un codón de iniciación, un codón de parada o una señal de poliadenilación.

La construcción genética es un vector. El vector puede ser un vector de virus adenoasociado (AAV), que codifica al menos una molécula Cas9 y un par de dos moléculas de ARNg; el vector es capaz de expresar la al menos una molécula Cas9 y la al menos molécula de ARNg, en la célula de un mamífero. El vector puede ser un plásmido. Los vectores pueden usarse para terapia génicain vivo.

En ciertas realizaciones, un vector AAV es un virus pequeño que pertenece al género Deendovirus de la familia Parvoviridae que infecta a seres humanos y algunas otras especies de primates.

Las secuencias codificantes pueden optimizarse para estabilidad y altos niveles de expresión. En ciertos casos, los codones se seleccionan para reducir la formación de la estructura secundaria del ARN tal como el formado debido a la unión intramolecular.

El vector puede comprender además un codón de iniciación, que puede estar corriente arriba del sistema basado en CRISPR/Cas9, y un codón de parada, que puede estar aguas abajo del sistema basado en CRISPR/Cas9 o la secuencia codificante de nucleasa específica del sitio. El codón de iniciación y terminación puede estar en marco con el sistema basado en CRISPR/Cas9 o la secuencia codificante de nucleasa específica del sitio. El vector también puede comprender un promotor que está unido operativamente al sistema basado en CRISPR/Cas9. El promotor unido operativamente al sistema basado en CRISPR/Cas9 puede ser un promotor del virus de simio 40 (SV40), un promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV), un promotor del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tal como el virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV), promotor de repetición terminal larga (LTR), un promotor del virus de Moloney, un promotor del virus de la leucosis aviaria (ALV), un promotor del citomegalovirus (CMV), tal como el promotor precoz inmediato del CMV, el promotor del virus de Epstein Barr (EBV) o promotor de un virus del sarcoma de Rous (RSV). El promotor también puede ser un promotor de un gen humano tal como la ubiquitina C humana (hUbC), la actina humana, la miosina humana, la hemoglobina humana, la creatina muscular humana o el metalotioneína humana. El promotor también puede ser un promotor específico de tejido, tal como un promotor específico de músculo o piel, natural o sintético. Ejemplos de tales promotores se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm.<u>S-20040175727.

El vector también puede comprender una señal de poliadenilación, que puede estar aguas abajo del sistema basado en CRISPR/Cas9. La señal de poliadenilación puede ser una señal de poliadenilación de SV40, una señal de poliadenilación de LTR, una señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina (bGH), una señal de poliadenilación de hormona de crecimiento humana (hGH) o una señal de poliadenilación de p-globina humana. La señal de poliadenilación de SV40 puede ser una señal de poliadenilación de un vector pCEPP4 (Invitrogen, San Diego, CA).

El vector también puede comprender un potenciador corriente arriba del sistema basado en CRISPR/Cas9 para la expresión de ADN. El potenciador puede ser actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana o un potenciador viral tal como uno de CMV, HA, RSV o EBV. Los potenciadores de la función de polinucleótidos se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 5.593.972, 5.962.428 y documento WO94/016737. El vector también puede comprender un origen de replicación de mamífero para mantener el vector extracromosómicamente y producir múltiples copias del vector en una célula. El vector también puede comprender una secuencia reguladora, que puede ser adecuada para la expresión génica en una célula de mamífero o humana en la que se administra el vector. El vector también puede comprender un gen indicador, tal como la proteína fluorescente verde (“ GFP” ) y/o un marcador seleccionable, tal como higromicina (“ Hygro” ).

Los vectores pueden ser vectores de expresión o sistemas para producir proteínas mediante técnicas de rutina y materiales de partida fácilmente disponibles que incluyen Sambrook y col., Molecular Cloning and Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor (1989).

Los vectores actualmente descritos se pueden usar para la edición del genoma de un gen de ladistrofinaen el músculo esquelético o músculo cardíaco de un sujeto. Los vectores actualmente descritos se pueden usar para corregir o reducir los efectos de las mutaciones en el gen de ladistrofinainvolucrado en enfermedades genéticas y/u otras afecciones musculares esqueléticas o cardíacas, por ejemplo, DMD.

2.1 Distrofina

La distrofina es una proteína citoplasmática con forma de bastón que es parte de un complejo de proteínas que conecta el citoesqueleto de una fibra muscular a la matriz extracelular circundante a través de la membrana celular. La distrofina proporciona estabilidad estructural al complejo de distroglicano de la membrana celular. El gen de la distrofina es 2,2 megabases en el locus Xp21. La transcripción primaria mide aproximadamente 2.400 kb con la m NA madura de aproximadamente 14 kb. 79 exones codifican la proteína que tiene más de 3.500 aminoácidos. El tejido muscular del esqueleto normal contiene solo pequeñas cantidades de distrofina, pero su ausencia de expresión anormal conduce al desarrollo de síntomas graves e incurables. Algunas mutaciones en el gen de la distrofina conducen a la producción de distrofina defectuosa y fenotipo distrófico grave en pacientes afectados. Algunas mutaciones en el gen de la distrofina conducen a la proteína distrofina parcialmente funcional y a un fenotipo distrófico mucho más leve en pacientes afectados.

En ciertas realizaciones, un gen funcional se refiere a un gen transcrito a ARNm, que se traduce en una proteína funcional.

En ciertas realizaciones, una proteína “ parcialmente funcional” se refiere a una proteína codificada por un gen mutante (por ejemplo, un gen mutante de ladistrofina)y tiene menos actividad biológica que una proteína funcional pero más de una proteína no funcional.

DMD es el resultado de mutaciones heredadas o espontáneas que causan mutaciones sin sentido o de cambio de trama en el gen de ladistrofina.Las mutaciones de origen natural y sus consecuencias son relativamente bien entendidas por DMD. Se sabe que las deleciones en el marco que se producen en la región del exón 45-55 (por ejemplo, exón 51) contenida dentro del dominio del bastón pueden producir proteínas de distrofina altamente funcionales, y muchos portadores son asintomáticos o presentan síntomas leves. Además, más del 60 % de los pacientes pueden tratarse teóricamente alcanzando el o los exones en esta región del gen de ladistrofina(por ejemplo, alcanzando al exón 51). Se han realizado esfuerzos para restablecer la interrupción del marco de lectura de ladistrofinaen pacientes con DMD por omisión de exón o exones no esenciales (por ejemplo, salto del exón 51) durante el empalme de ARNm para producir proteínas de distrofina deletadas internamente pero funcionales. La deleción de la parte interna del exón o exones dedistrofina(por ejemplo, la deleción del exón 51) conservan el marco de lectura adecuado, pero causan la distrofia muscular de Becker menos grave.

En ciertas realizaciones, la modificación del exón 51 (por ejemplo, deleción o escisión del exón 51 por, por ejemplo, NHEJ) para restaurar el marco de lectura mejora el fenotipo de hasta el 17 % de los sujetos con DMD, y hasta el 21 % de los sujetos con DMD con mutaciones de deleción (Flanigan y col., Human Mutation 2009; 30:1657-1666. Aartsma-Rus y col., Human Mutation 2009; 30:293-299. Bladen y col., Human Mutation 2015; 36(2)).

En determinadas realizaciones, el exón 51 del gen de ladistrofina serefiere a 51er exón del gen de ladistrofina.El exón 51 es frecuentemente adyacente a las deleciones que alteran la trama en pacientes con DMD y se ha alcanzado en ensayos clínicos para salto de exón basado en oligonucleótidos. Un ensayo clínico para el compuesto de salto de exón 51 Eteplirsen presentó un beneficio funcional significativo a través de 48 semanas, con un promedio de 47 % de fibras positivas de distrofina en comparación con el valor inicial. Las mutaciones en el exón 51 son ideales para la corrección permanente por edición genómica basada en NHEJ.

2.2. Sistema CRISPR/Cas específico para un gen de Distrofina

El vector actualmente descrito codifica un sistema CRISPR/Cas que es específico para el gen de ladistrofina(p. ej., gen humano de ladistrofina).“ Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas” y “ CRISPR” , como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a loci que contienen múltiples repeticiones cortas directas que se encuentran en los genomas de aproximadamente el 40 % de las bacterias secuenciadas y el 90 % de las arqueas secuenciadas. El sistema CRISPR es un sistema de nucleasa microbiana involucrado en la defensa contra fagos invasores y plásmidos que proporcionan una forma de inmunidad adquirida. Los loci CRISPR en huéspedes microbianos contienen una combinación de genes asociados a CRISPR (Cas) así como elementos de ARN no codificantes capaces de programar la especificidad de la escisión de ácido nucleico mediada por CRISPR. Se incorporan segmentos cortos de ADN extraño, denominados espaciadores, en el genoma entre repeticiones CRISPR, y sirven como “ memoria” de exposiciones pasadas. Cas9 forma un complejo con el extremo 3' del ARNsg, y el par de proteínas-ARN reconoce su diana genómica mediante apareamiento de bases complementarias entre el extremo 5' de la secuencia de ARNsg y una secuencia de ADN de 20 pb predefinida, conocida como protoespaciador. Este complejo se dirige a loci homólogos de ADN de patógeno a través de regiones codificadas dentro del ARNcr, es decir, los protoespaciadores y motivos adyacentes protoespaciador (PAM) dentro del genoma de patógeno. La matriz CRISPR no codificante se transcribe y se escinde dentro de repeticiones directas en ARNcr cortos que contienen secuencias espaciadoras individuales, que dirigen las nucleasas Cas al sitio diana (protoespaciador). Al intercambiar simplemente la secuencia de reconocimiento de 20 pb del ARNsg expresado, la nucleasa Cas9 puede dirigirse a nuevas dianas genómicas. Los espaciadores CRISPR se usan para reconocer y silenciar elementos genéticos exógenos de manera análoga al ARNi en organismos eucariotas.

En ciertas realizaciones, la complementariedad se refiere a una propiedad compartida entre dos secuencias de ácido nucleico, de manera que cuando están alineadas antiparalelos entre sí, las bases de nucleótidos en cada posición serán complementarias.

Se conocen tres clases de sistemas CRISPR (sistemas efectores de tipos I, II y III). El sistema efector de tipo II lleva a cabo la ruptura bicatenaria dirigida de ADN en cuatro etapas secuenciales, mediante el uso de una única enzima efectora, Cas9, para escindir ADNbc. En comparación con los sistemas efectores de tipo I y Tipo III, que requieren múltiples efectores distintos que actúan como un complejo, el sistema efector de tipo II puede funcionar en contextos alternativos tales como células eucariotas. El sistema efector de tipo II consiste en un pre-ARNcr largo, que se transcribe a partir del locus CRISPR que contiene espaciador, la proteína Cas9 y un ARNcrtra, que está involucrado en el procesamiento pre-ARNcr. Los ARNcrtra hibridan con las regiones de repetición que separan los espaciadores del pre-ARNcr, iniciando así la escisión de ARNbc por RNasa III endógena. Esta escisión es seguida por un segundo evento de escisión dentro de cada espaciador por Cas9, produciendo ARNcr maduros que permanecen asociados con el ARNcrtra y Cas9, formando un complejo Cas9:ARNcr-ARNcrtra.

El complejo Cas9:ARNcr-ARNtracr desenrolla el dúplex de ADN y busca secuencias que coincidan con el ARNcr para escindir. El reconocimiento diana se produce tras la detección de complementariedad entre una secuencia “ protoespaciadora” en el ADN diana y la secuencia espaciadora restante en el ARNcr. Cas9 media la escisión del ADN diana si también está presente un motivo adyacente protoespaciador (PAM) correcto en el extremo 3'del protoespaciador. Para el direccionamiento protoespaciador, la secuencia debe ser seguida inmediatamente por el motivo adyacente al protoespaciador (PAM), una secuencia corta reconocida por la nucleasa Cas9 que se requiere para la escisión del ADN. Los diferentes sistemas de Tipo II tienen diferentes requisitos de PAM. El sistema CRIS<p>de S.pyogenespuede tener la secuencia PAM para esta Cas9 (SpCas9) como 5 “ -NRG-3” , donde R es A o G, y caracterizado por la especificidad de este sistema en células humanas. Una capacidad única del sistema CRISPR/Cas9 es la capacidad directa de dirigir simultáneamente múltiples loci genómicos distintos al coexpresar una sola proteína Cas9 con dos o más ARNg. Por ejemplo, el sistemaStreptococcus pyogenesde Tipo II prefiere naturalmente usar una secuencia “ NGG” , donde “ N” puede ser cualquier nucleótido, pero también acepta otras secuencias de PAM, tales como “ NAG” en sistemas manipulados por ingeniería molecular (Hsu y col., Nature Biotechnology (2013) doi: 10.1038/nbt.2647). De manera similar, la Cas9 derivada deNeisseria meningitidis(NmCas9) normalmente tiene un PAM nativo de NNNNGATT (Id. de sec. n°: 17), pero tiene actividad a través de una variedad de PAM, que incluyen un NNNNGNNN altamente degenerado (Id. de sec. n°: 18) PAM (Esvelt y col. Nature Methods (2013) doi: 10.1038/nmeth.2681). Una molécula Cas9 deS.aureusreconoce el motivo de secuencia NNGRR (R = A o G) (Id. de sec. n°: 22) y dirige la escisión de una secuencia de ácido nucleico diana 1 a 10, por ejemplo, 3 a 5, pb corriente arriba de esa secuencia. Una molécula Cas9 deS.aureusreconoce el motivo de secuencia NNGRRN (R = A o G) (Id. de sec. n°: 23) y dirige la escisión de una secuencia de ácido nucleico diana 1 a 10, por ejemplo, 3 a 5, pb corriente arriba de esa secuencia. En ciertas realizaciones, una molécula Cas9 deS.aureusreconoce el motivo de secuencia NNGRRT (R = A o G) (Id. de sec. n°: 24) y dirige la escisión de una secuencia de ácido nucleico diana 1 a 10, por ejemplo, 3 a 5, pb corriente arriba de esa secuencia. En ciertas realizaciones, una molécula Cas9 deS.aureusreconoce el motivo de secuencia NNGRRV (R = A o G) (Id. de sec. n°: 25) y dirige la escisión de una secuencia de ácido nucleico diana 1 a 10, por ejemplo, 3 a 5, pb corriente arriba de esa secuencia. En las realizaciones mencionadas anteriormente, N puede ser cualquier residuo de nucleótido, por ejemplo, cualquiera de A, G, C o T. Las moléculas de Cas9 pueden diseñarse para alterar la especificidad de PAM de la molécula de Cas9.

Una forma modificada por ingeniería del sistema efector de Tipo II deStreptococcus pyogenesse demostró que funciona en células humanas para la ingeniería genómica. En este sistema, la proteína Cas9 se dirigió a sitios diana genómicos mediante un “ARN guía” reconstituido sintéticamente (“ARNg” , también usado indistintamente en el presente documento como un ARN guía individual quimérico (“ARNsg” ), que es una fusión ARNcr-ARNcrtra que evita la necesidad de un procesamiento de ARNasa III y ARNcr en general. En el presente documento se proporcionan sistemas manipulados por ingeniería molecular basados en CRISPR/Cas9 para su uso en la edición del genoma y el tratamiento de enfermedades genéticas. Los sistemas manipulados por ingeniería molecular basados en CRISPR/Cas9 pueden diseñarse para dirigirse a cualquier gen, incluyendo genes implicados en una enfermedad genética, envejecimiento, regeneración de tejidos o cicatrización de heridas. Los sistemas basados en CRISPR/Cas9 pueden incluir una proteína Cas9 y al menos un ARNg. El sistema comprende dos moléculas de ARNg. La proteína Cas9 puede ser parte de una proteína de fusión Cas9. El vector puede codificar además una proteína de fusión Cas9. La proteína de fusión Cas9 puede incluir, por ejemplo, un dominio que tiene una actividad diferente de lo que es endógeno a Cas9, tal como un dominio de transactivación. El gen diana (p. ej., un gen dedistrofina,p. ej., gen humano dedistrofina)puede estar involucrado en la diferenciación de una célula o cualquier otro proceso en el que pueda desearse la activación de un gen, o puede tener una mutación tal como una mutación de cambio de marco o una mutación sin sentido. Si el gen diana tiene una mutación que causa un codón de parada prematuro, un sitio aceptor de empalme aberrante o un sitio donante de empalme aberrante, el sistema basado en CRISPR/Cas9 puede diseñarse para reconocer y unirse a una secuencia de nucleótidos aguas arriba o aguas abajo del codón de parada prematuro, el sitio aceptor de empalme aberrante o el sitio donante de empalme aberrante. El sistema basado en CRISPR-Cas9 también se puede usar para interrumpir el empalme de genes normales mediante el direccionamiento de aceptores de empalme y donantes para inducir la omisión de codones de parada prematuros o restablecer un marco de lectura interrumpido. El sistema basado en CRISPR/Cas9 puede o no mediar cambios fuera de la diana en regiones codificantes de proteínas del genoma.

2.2.1 Moléculas Cas9 y proteínas de fusión Cas9

El sistema basado en CRISPR/Cas9 puede incluir una proteína Cas9 o una proteína de fusión Cas9. La proteína Cas9 es una endonucleasa que escinde el ácido nucleico y está codificada por los loci CRISPR y está implicada en el sistema CRISPR de Tipo II. En la presente descripción, la molécula Cas9 es una molécula Cas9 deStaphylococcus aureus.

Alternativa o adicionalmente, el sistema basado en CRISPR/Cas9 puede incluir una proteína de fusión. La proteína de fusión puede comprender dos dominios polipeptídicos heterólogos, en donde el primer dominio polipeptídico comprende una proteína Cas y el segundo dominio polipeptídico tiene una actividad tal como actividad de activación de la transcripción, actividad de represión de la transcripción, actividad del factor de liberación de la transcripción, actividad de modificación de histonas, actividad nucleasa, actividad de asociación de ácidos nucleicos, actividad de metilasa o actividad de desmetilasa. La proteína de fusión puede incluir una proteína Cas9 o una proteína Cas9 mutada, fusionada a un segundo dominio polipeptídico que tiene una actividad tal como la actividad de activación de la transcripción, actividad de represión de la transcripción, actividad del factor de liberación de la transcripción, actividad de modificación de histonas, actividad nucleasa, actividad de asociación de ácidos nucleicos, actividad de metilasa o actividad de desmetilasa.

(1) Actividad de Activación de Transcripción

El segundo dominio polipeptídico puede tener actividad de activación de la transcripción, es decir, un dominio de transactivación. Por ejemplo, la expresión génica de genes endógenos de mamífero, tales como genes humanos, puede lograrse dirigiendo una proteína de fusión de iCas9 y un dominio de transactivación a promotores de mamífero mediante combinaciones de ARNg. El dominio de transactivación puede incluir una proteína VP 16, múltiples proteínas VP 16, tales como un dominio VP48 o dominio VP64, o dominio p65 de la actividad del activador de la transcripción de NF kappa B. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser iCas9-VP64.

(2) Actividad de Represión de Transcripción

El segundo dominio polipeptídico puede tener actividad de represión de la transcripción. El segundo dominio polipeptídico puede tener una actividad de la caja asociada Kruppel, tal como un dominio KRAB, actividad del dominio represor ERF, actividad del dominio represor de Mxil, actividad del dominio represor SID4X, actividad del dominio represor de Mad-SID o actividad de la proteína de unión a la caja TATA. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser dCas9-KRAB.

(3) Actividad del Factor de Liberación de Transcripción

El segundo dominio polipeptídico puede tener actividad del factor de liberación de transcripción. El segundo dominio polipeptídico puede tener actividad del factor de liberación eucariota 1 (ERF1) o actividad del factor de liberación eucariota 3 (ERF3).

(4) Actividad de Modificación de Histonas

El segundo dominio polipeptídico puede tener actividad de modificación de histonas. El segundo dominio polipeptídico puede tener histona desacetilasa, histona acetiltransferasa, histona desmetilasa o actividad metiltransferasa de histonas. La histona acetiltransferasa puede ser proteína de unión a p300 o CREB (CBP), o fragmentos de las mismas. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser dCas9-p300.

(5) Actividad de Nucleasa

El segundo dominio polipeptídico puede tener actividad nucleasa que es diferente de la actividad nucleasa de la proteína Cas9. Una nucleasa, o una proteína que tiene actividad nucleasa, es una enzima capaz de escindir los enlaces fosfodiéster entre las subunidades de nucleótidos de los ácidos nucleicos. Las nucleasas generalmente se dividen adicionalmente en endonucleasas y exonucleasas, aunque algunas de las enzimas pueden caer en ambas categorías. Las nucleasas bien conocidas son desoxirribonucleasa y ribonucleasa.

(6) Actividad de Asociación de Ácido Nucleico

El segundo dominio polipeptídico puede tener actividad de asociación de ácido nucleico o dominio de unión a ADN-ADN de unión a ácido nucleico (d Bd ) es un dominio de proteína plegado independientemente que contiene al menos un motivo que reconoce ADN monocatenario o bicatenario. Un DBD puede reconocer una secuencia de ADN específica (una secuencia de reconocimiento) o tener una afinidad general por ADN. La región de asociación de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en una región hélice-vuelta-hélice, una región de cremallera de leucina, una región hélice de tipo mariposa, una región de hélice-vuelta-hélice de tipo mariposa, una región de hélice-buclehélice, un pliegue de inmunoglobulina, un dominio B3, un dedo de cinc, un decodificador de HMG, un dominio de Wor3, un dominio de unión al ADN efector TAL.

(7) Actividad de Metilasa

El segundo dominio polipeptídico puede tener actividad metilasa, que implica transferir un grupo metilo a ADN, ARN, proteína, molécula pequeña, citosina o adenina. El segundo dominio polipeptídico puede incluir una ADN metiltransferasa.

(8) Actividad de Demetilasa

El segundo dominio polipeptídico puede tener actividad de desmetilasa. El segundo dominio polipeptídico puede incluir una enzima que elimina los grupos metilo (CH3-) de ácidos nucleicos, proteínas (en particular histonas) y otras moléculas. Alternativamente, el segundo polipéptido puede cubrir el grupo metilo a la hidroximetilcitosina en un mecanismo para desmetilar ADN. El segundo polipéptido puede catalizar esta reacción. Por ejemplo, el segundo polipéptido que cataliza esta reacción puede ser Tet1.

Una molécula de Cas9 o una proteína de fusión Cas9 puede interactuar con una o más moléculas de ARNg y, en concierto con la o las moléculas ARNg, se localiza en un sitio que comprende un dominio diana y una secuencia PAM. La capacidad de una molécula de Cas9 o una proteína de fusión Cas9 para reconocer una secuencia de PAM puede determinarse, por ejemplo, usando un ensayo de transformación como se describió anteriormente (Jinek 2012).

La capacidad de una molécula Cas9 o una proteína de fusión Cas9 para interactuar con y escindir un ácido nucleico diana es dependiente de la secuencia PAM. Una secuencia PAM es una secuencia en el ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la escisión del ácido nucleico diana se produce corriente arriba de la secuencia PAM. Las moléculas Cas9 de diferentes especies bacterianas pueden reconocer diferentes motivos de secuencia (por ejemplo, secuencias de PAM). Una molécula Cas9 deS.pyogenesreconoce el motivo de secuencia NGG y dirige la escisión de una secuencia de ácido nucleico diana 1 a 10, por ejemplo, de 3 a 5, pb corriente arriba de esa secuencia (véase, por ejemplo, Mali2013). Una molécula Cas9 deS.thermophilusreconoce el motivo de secuencia NGGNG (Id. de sec. n°: 19) y/o NNAGAAW (W = A o T) (Id. de sec. n°: 20) y dirige la escisión de una secuencia de ácido nucleico diana 1 a 10, por ejemplo, 3 a 5, pb corriente arriba de estas secuencias (véase, por ejemplo, Horvath 2010; Deveau 2008). Una molécula Cas9 de S.mutanspuede reconocer el motivo de secuencia NGG y/o NAAR (R = A o G) (Id. de sec. n°: 21) y la escisión directa de una secuencia de ácido nucleico diana 1 a 10, por ejemplo, de 3 a 5 pb, corriente arriba de esta secuencia (véase, por ejemplo, Deveau 2008). Una molécula Cas9 deS.aureusreconoce el motivo de secuencia NNGRR (R = A o G) (Id. de sec. n°: 22) y dirige la escisión de una secuencia de ácido nucleico diana 1 a 10, por ejemplo, 3 a 5, pb corriente arriba de esa secuencia. Una molécula Cas9 deS.aureusreconoce el motivo de secuencia NNGRRN (R = A o G) (Id. de sec. n°: 23) y dirige la escisión de una secuencia de ácido nucleico diana 1 a 10, por ejemplo, 3 a 5, pb corriente arriba de esa secuencia. Una molécula Cas9 deS.aureusreconoce el motivo de secuencia NNGRRT (R = A o G) (Id. de sec. n°: 24) y dirige la escisión de una secuencia de ácido nucleico diana 1 a 10, por ejemplo, 3 a 5, pb corriente arriba de esa secuencia aS.aureusreconoce el motivo de secuencia NNGRRV (R = A o G) (Id. de sec. n°: 25) y dirige la escisión de una secuencia de ácido nucleico diana 1 a 10, por ejemplo, 3 a 5, pb corriente arriba de esa secuencia. En la divulgación mencionada anteriormente, N puede ser cualquier residuo de nucleótido, por ejemplo, cualquiera de A, G, C o T. Las moléculas de Cas9 pueden diseñarse para alterar la especificidad de PAM de la molécula de Cas9.

En la presente divulgación, el vector codifica al menos una molécula Cas9 que reconoce un Motivo Adyacente Protoespaciador (PAM) de NNGRRT (Id. de sec. n°: 24) o NNGRRV (Id. de sec. n°: 25). La al menos una molécula Cas9 es una molécula Cas9 deS.aureus.En ciertas realizaciones, la al menos una molécula Cas9 es una molécula Cas9 deS.aureusmutante.

La proteína Cas9 puede mutarse de manera que la actividad nucleasa esté inactivada. Una proteína Cas9 inactivada (“ iCas9” , también denominada “ dCas9” ) sin actividad de endonucleasa se ha dirigido recientemente a genes en bacterias, levaduras y células humanas por ARNg para silenciar la expresión génica a través de impedimento estérico. Mutaciones ilustrativas con referencia a la secuencia Cas9 deS.pyogenesincluyen: D10A, E762<a>, H840A, N854A, N863A y/o D986A. Mutaciones ilustrativas con referencia a la secuencia Cas9 deS.aureusincluyen D10A y N580A. En ciertas realizaciones, la molécula Cas9 es una molécula Cas9 deS.aureusmutante. En determinadas realizaciones, la molécula Cas9deS.aureusmutante comprende una mutación D10A. La secuencia de nucleótidos que codifica esta Cas9 deS.aureusmutante se expone en la Id. de sec. n°: 34, que se proporciona a continuación.

En determinadas realizaciones, la molécula Cas9 deS.aureusmutante comprende una mutación N580A. La secuencia de nucleótidos que codifica esta molécula Cas9 deS.aureusmutante se expone en la Id. de sec. n°: 35, que se proporciona a continuación.

Un ácido nucleico que codifica una molécula Cas9 puede ser una secuencia de ácido nucleico sintética. Por ejemplo, la molécula sintética de ácido nucleico puede modificarse químicamente. La secuencia de ácido nucleico sintética puede estar optimizada en codones, por ejemplo, al menos un codón no común o un codón menos común se ha reemplazado por un codón común. Por ejemplo, el ácido nucleico sintético puede dirigir la síntesis de un ARNm mensajero optimizado, por ejemplo, optimizado para la expresión en un sistema de expresión de mamífero, por ejemplo, descrito en el presente documento.

Adicionalmente o alternativamente, un ácido nucleico que codifica una molécula de Cas9 o polipéptido de Cas9 puede comprender una secuencia de localización nuclear (NLS). Las secuencias de localización nuclear son conocidas en la técnica.

Una secuencia de ácido nucleico optimizada por codones ilustrativa que codifica una molécula Cas9 de S. pyrogenes<se establece en la Id. de sec. n°:>26<, que se proporciona a continuación.>

La secuencia de aminoácidos correspondiente de una molécula Cas9 deS.pyogenes seexpone en la Id. de sec. n°: 27, que se proporciona a continuación.

Secuencias de ácido nucleico con codones optimizados ejemplares que codifican una molécula Cas9 deS.aureusse exponen en las Id. de sec. n°: 28-32, que se proporcionan a continuación.

Id. de sec. n°: 28 se expone a continuación:

Id. de sec. n°: 29 se expone a continuación.

Id. de sec. n°: 30 se expone a continuación.

Id. de sec. n°: 31 se expone a continuación.

Id. de sec. n°: 32 se expone a continuación.

Una secuencia de aminoácidos de una molécula Cas9 deS.aureusse expone en la Id. de sec. n°: 33, que se proporciona a continuación.

2.2.2. Moléculas de ARNg

El sistema CRISPR/Cas9 incluye al menos dos moléculas de ARNg. Las moléculas de ARNg proporcionan el objetivo del sistema basado en CRISPR/Cas9. El gRNA es una fusión de dos ARN no codificantes: un crRNA y un tracrRNA. El gRNA puede apuntar a cualquier secuencia de ADN deseada intercambiando la secuencia que codifica un protoespaciador de 20 pb que confiere especificidad de direccionamiento a través del emparejamiento de bases complementarias con el objetivo de ADN deseado. El gRNA imita el dúplex natural crRNA:tracrRNA involucrado en el sistema efector tipo II. Este dúplex, que puede incluir, por ejemplo, un ARNcr de 42 nucleótidos y un ARNcrtra de 75 nucleótidos, actúa como una guía para la Cas9 para escindir el ácido nucleico diana. La “ región diana” , “ secuencia diana” o “ protoespaciador” , como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a la región del gen diana (por ejemplo, un gen dedistrofina)al que se dirige el sistema basado en CRISPR/Cas9. El sistema basado en CRISPR/Cas9 puede incluir dos o más moléculas de ARNg, que se dirigen a diferentes secuencias de ADN. Las secuencias de ADN diana pueden superponerse. La secuencia diana o protoespaciador es seguida por una secuencia PAM en el extremo 3’ del protoespaciador. Los diferentes sistemas de Tipo II tienen diferentes requisitos de PAM.

El número de moléculas de ARNg codificadas por una construcción genética actualmente divulgada (por ejemplo, un vector de AAV) puede ser al menos 2 ARNg diferentes, al menos 3 ARNg diferentes, al menos 4 ARNg diferentes, al menos 5 ARNg diferentes, al menos 6 ARNg diferentes, al menos 7 gRNA diferentes, al menos 8 gRNA diferentes, al menos 9 gRNA diferentes, al menos 10 gRNA diferentes, al menos 11 gRNA diferentes, al menos 12 gRNA diferentes, al menos 13 gRNA diferentes, al menos 14 gRNA diferentes, al menos 15 gRNA diferentes, al menos 16 gRNA diferentes, al menos 17 gRNA diferentes, al menos 18 gRNA diferentes, al menos 18 gRNA diferentes, al menos 20 gRNA diferentes, al menos 25 gRNA diferentes, al menos 30 gRNA diferentes, al menos 35 gRNA diferentes gRNA, al menos 40 gRNA diferentes, al menos 45 gRNA diferentes o al menos 50 gRNA diferentes. En la presente descripción, la construcción genética (por ejemplo, un vector de AAV) codifica dos moléculas de ARNg, esdecir,una primera molécula de ARNg, y una segunda molécula de ARNg.

La molécula de ARNg comprende un dominio de direccionamiento, que es una secuencia de polinucleótidos complementaria de la secuencia de ADN diana seguida de una secuencia de PAM. La molécula de ARNg puede comprender una “ G” en el extremo 5’ del dominio de direccionamiento. Los dominios de direccionamiento de las moléculas de ARNg tienen 21 nucleótidos de longitud.

ARNg puede dirigirse al menos a uno de los exones, intrones, la región promotora, la región potenciadora, la región transcrita del gen de ladistrofina.En determinadas realizaciones, la molécula de ARNg se dirige al intrón 51 del gen humano de ladistrofina.En determinadas realizaciones, la molécula de ARNg se dirige al exón 51 del gen humano de ladistrofina.

2.2.3. Alteración del gen de laDistrofina

El vector actualmente descrito codifica moléculas de ARNg que se dirigen al gen de ladistrofina(p.ej., gen humano de ladistrofina).Las moléculas de ARNg pueden unirse y reconocer una región diana. Las regiones diana se pueden elegir inmediatamente aguas arriba de posibles codones de parada fuera del marco de manera que las inserciones o eliminaciones durante el proceso de reparación restauren la trama de lectura de distrofina mediante conversión de trama. Las regiones diana también pueden ser sitios aceptores de corte y empalme o sitios donantes de empalme, de manera que las inserciones o deleciones durante el proceso de reparación alteran el corte y empalme y restauran el marco de lectura de la distrofina mediante la ruptura del sitio de corte y empalme y la exclusión por exones. Las regiones diana también pueden ser codones de parada aberrantes de manera que las inserciones o deleciones durante el proceso de reparación restauren el marco de lectura de la distrofina eliminando o interrumpiendo el codón de parada.

ARNg simples o multiplexados pueden diseñarse para restaurar el marco de lectura de distrofina dirigiendo el punto de acceso mutacional en el exón 51 o introduciendo inserciones y deleciones intraexónicas pequeñas, o la escisión del exón 51. Después del tratamiento con un vector actualmente descrito, la expresión de distrofina se puede restablecer en células musculares de pacientes con Duchennein vitro.Se detectó distrofina humanain vivodespués del trasplante de células del paciente genéticamente corregidas en ratones inmunodeficientes. De manera significativa, las capacidades únicas de edición de genes multiplex del sistema CRISPR/Cas9 permiten generar eficientemente grandes deleciones de esta región de punto de contacto mutacional que puede corregir hasta 62 % de las mutaciones del paciente por enfoques de edición de genes universales o específicos de pacientes.

Los vectores actualmente descritos pueden generar deleciones en el gen de ladistrofina,p. ej., el gen humano de ladistrofina.En ciertas realizaciones, el vector se configura para formar dos rupturas de doble cadena (una primera ruptura de cadena doble y una segunda ruptura de cadena doble) en dos intrones (un primer intrón y un segundo intrón) que flanquean una posición diana del gen de ladistrofina,deletando así un segmento del gen de ladistrofinaque comprende la posición diana de la distrofina. Una “ posición diana de la distrofina” puede ser una posición de diana exónica de distrofina o una posición diana intragónica de distrofina, tal como se describe en el presente documento. Deleción de posición diana exónica de ladistrofinapuede optimizar la secuencia dedistrofinade un sujeto que padece distrofia muscular de Duchenne, por ejemplo, puede aumentar la función o actividad de la proteína distrofina codificada, o da como resultado una mejora en el estado patológico del sujeto. En ciertas realizaciones, la escisión de la posición diana exónica de ladistrofinarestaura el marco de lectura. La posición diana exónica de ladistrofinapuede comprender uno o más exones del gen de ladistrofina.En ciertas realizaciones, la posición diana de la distrofina comprende el exón 51 del gen de ladistrofina(p. ej.,gen humano de ladistrofina).

En ciertas realizaciones, la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) se refiere a un trastorno recesivo, mortal, ligado a X que da como resultado degeneración muscular y muerte eventual. DMD es una enfermedad monogénica hereditaria común y se produce en 1 de cada 3.500 hombres. DMD es el resultado de mutaciones heredadas o espontáneas que causan mutaciones sin sentido o de cambio de trama en el gen de la distrofina. La mayoría de las mutaciones de la distrofina que causan DMD son deleciones de exones que alteran el marco de lectura y provocan una terminación prematura de la traducción en el gen de la distrofina. Los pacientes con DMD típicamente pierden la capacidad de apoyarse físicamente en sí durante la infancia, se vuelven progresivamente más débiles durante la adolescencia y mueren entre veinte o treinta años de edad.

El vector actualmente descrito puede mediar la edición génica altamente eficiente en el exón 51 de un gen de ladistrofina(por ejemplo, el gen humano de ladistrofina).El vector actualmente descrito restaura la expresión de la proteína distrofina en células de pacientes con DMD.

El exón 51 es frecuentemente adyacente a las deleciones que alteran la trama en DMD. La eliminación del exón 51 de ladistrofinatranscrito por salto de exón se puede usar para tratar aproximadamente el 15 % de todos los pacientes con DMD. Esta clase demutaciones de ladistrofinason ideales para la corrección permanente por edición genómica basada en NHEJ y HDR. Las construcciones genéticas (por ejemplo, vectores) descritos en el presente documento se han desarrollado para la modificación dirigida del exón 51 en el gen humano de ladistrofina.El vector actualmente descrito puede transfectarse en células DMD humanas y media la modificación génica eficiente y la conversión en el marco de lectura correcto. La restauración de proteínas es concomitante con la restauración de la trama y se detecta en una población a granel de células tratadas con sistema basada en CRISPR/Cas9.

En la presente descripción, el vector codifica una primera molécula de ARNg y una segunda molécula de ARNg, y al menos una molécula Cas9 deS.aureusque reconoce un PAM de NNGRRT (Id. de sec. n°:24) o NNGRRV (Id. de sec. n°:25). En algunas realizaciones, el vector se configura para formar una primera y una segunda ruptura de cadena doble en un primer y un segundo intrón flanqueante del exón 51 del gen humano de distrofina, respectivamente, deletando de este modo un segmento del gen dedistrofinaque comprende el exón 51.

La eficacia de deleción de los vectores actualmente divulgados puede relacionarse con el tamaño de la deleción,es decir,el tamaño del segmento deletado por los vectores. En ciertas realizaciones, la longitud o el tamaño de las deleciones específicas se determina por la distancia entre las secuencias de PAM en el gen diana (p.ej., un gen de ladistrofina).En ciertas realizaciones, una deleción específica de un segmento del gen de ladistrofina,que se define en términos de su longitud y una secuencia que comprende (por ejemplo, exón 51), es el resultado de las rupturas hechas adyacentes a secuencias de PAM específicas dentro del gen diana (p.ej., un gen de ladistrofina).

En ciertas realizaciones, el tamqw cz k,iaño de deleción es aproximadamente 800-72.000 pares de bases (pb), por ejemplo, aproximadamente 800-900, aproximadamente 900-1.000, aproximadamente 1.200-1.400, aproximadamente 1.500-2.600, aproximadamente 2.600-2.700, aproximadamente 3.000-3.300, aproximadamente 5.200-5.500, aproximadamente 20.000-30.000, aproximadamente 35.000-45.000, o aproximadamente 60.000-72.000. En ciertas realizaciones, el tamaño de la deleción es aproximadamente 800-900, aproximadamente 1.500-2.600, aproximadamente 5.200-5.500, aproximadamente 20.000-30.000, aproximadamente 35.000-45.000, o aproximadamente 60.000-72.000 pb. En ciertas realizaciones, el tamaño de la deleción es 806 pares de bases, 867 pares de bases, 1.557 pares de bases, 2.527 pares de bases, 5.305 pares de bases, 5.415 pares de bases, 20.768 pares de bases, 27.398 pares de bases, 36.342 pares de bases, 44.269 pares de bases, 60.894 pares de bases o 71.832 pares de bases. En ciertas realizaciones, el tamaño de la deleción es de aproximadamente 900-1.000, aproximadamente 1.200-1.400, aproximadamente 1.500-2.600, aproximadamente 2.600-2.700 pb, o aproximadamente 3.000-3.300. En ciertas realizaciones, el tamaño de la deleción se selecciona del grupo que consiste en 972 pb, 1.723 pb, 893 pb, 2.665 pb, 1.326 pb, 2.077 pb, 1.247 pb, 3.019 pb, 1.589 pb, 2.340 pb, 1.852 pb y 3.282 pb. En determinadas realizaciones, el tamaño de la deleción es mayor que aproximadamente 150 kilopares de bases (kb), por ejemplo, aproximadamente 300-400 kb. En determinadas realizaciones, el tamaño de la deleción es de aproximadamente 300-400 kb. En determinadas realizaciones, el tamaño de la deleción es de 341 kb. En determinadas realizaciones, el tamaño de la deleción es de aproximadamente 100-150 kb. En ciertas realizaciones, el tamaño de la deleción es de 146.500 pb.

En la presente descripción, el vector codifica al menos una molécula Cas9 deS.aureusy un par de dos moléculas de ARNg como se muestra en la primera entrada en la Tabla 1.

Tabla 1

En ciertas realizaciones, el vector es un vector AAV. En ciertas realizaciones, el vector AAV es un vector AAV modificado. El vector AAV modificado puede tener un tropismo del tejido del músculo cardíaco y cardíaco mejorado. El vector AAV modificado puede administrar y expresar el sistema CRISPR/Cas9 descrito en el presente documento en la célula de un mamífero. Por ejemplo, el vector AAV modificado puede ser un vector AAV-SASTG (Piacentino y col. (2012) Human Gene Therapy 23:635-646). El vector AAV modificado puede suministrar el sistema CRISPR/Cas9 descrito en el presente documento a músculo esquelético y cardíacoin vivo.El vector AAV modificado puede basarse en uno o más de varios tipos de cápside, que incluyen AAVl, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8 y AAV9. El vector AAV modificado se puede basar en el pseudotipo AAV2 con cápsides de AAV trotrópicas musculares alternativas, tales como AAV2/1, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/8, AAV2/9, AAV2,5 y AAV/SASTG vectores que transducen eficientemente músculo esquelético o músculo cardíaco por administración sistémica y local (Seto y col. Current Gene Therapy (2012) 12: 139-151).

3. Composiciones

La materia objeto actualmente divulgada proporciona composiciones que comprenden los vectores genéticos descritos anteriormente. Las composiciones pueden estar en una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de acuerdo con el modo de administración a usar. En los casos en que las composiciones farmacéuticas son composiciones farmacéuticas inyectables, son estériles, libres de pirógenos y libres de partículas. Se usa preferiblemente una formulación isotónica. Generalmente, los aditivos para la isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En ciertas realizaciones, se prefieren soluciones isotónicas tales como solución salina tamponada con fosfato. Los estabilizadores incluyen gelatina y albúmina. En determinadas realizaciones, se añade un agente de vasoconstricción a la formulación.

La composición puede comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable. El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser moléculas funcionales como vehículos, adyuvantes, vehículos o diluyentes. El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un agente de facilitación de la transfección, que puede incluir agentes tensioactivos, tales como complejos inmunoestimuladores (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freunds, análogo de LPS que incluye monofosforil lípido A, péptidos de muramilo, análogos de quinona, vesículas tales como escualeno y escualeno, ácido hialurónico, lípidos, liposomas, iones de calcio, proteínas virales, polianiones, policationes o nanopartículas, u otros agentes facilitadores de la transfección conocidos.

El agente facilitador de la transfección es un polianión, policatión, que incluye poli-L-glutamato (LGS) o lípido. El agente facilitador de la transfección es poli-L-glutamato, y más preferiblemente, el poli-L-glutamato está presente en la composición para la edición del genoma en el músculo esquelético o el músculo cardíaco a una concentración inferior a 6 mg/ml. El agente facilitador de la transfección también puede incluir agentes tensioactivos tales como complejos inmunoestimuladores (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freunds, análogo de LPS que incluye monofosforil lípido A, péptidos de muramilo, análogos de quinona y vesículas tales como escualeno y escualeno, y también puede usarse ácido hialurónico administrado junto con la construcción genética. En ciertas realizaciones, el vector de ADN que codifica la composición también puede incluir un agente que facilita la transfección tal como lípidos, liposomas, que incluyen liposomas de lecitina u otros liposomas conocidos en la técnica, como una mezcla de ADN-liposoma (véase, por ejemplo, el documento WO9324640), iones de calcio, proteínas virales, polianiones, policationes o nanopartículas, u otros agentes facilitadores de la transfección conocidos. Preferentemente, el agente facilitador de la transfección es un polianión, policatión, que incluye poli-L-glutamato (LGS) o lípido. 17.

4. Corrección de un gen mutante

El vector actualmente descrito puede usarse para corregir un gen mutante en un sujeto.

La corrección comprende cambiar un gen mutante que codifica una proteína truncada o ninguna proteína en absoluto, de manera que se obtiene una expresión de proteína funcional de longitud completa o parcialmente completa. La corrección de un gen mutante puede comprender reemplazar la región del gen que tiene la mutación o reemplazar todo el gen mutante con una copia del gen que no tiene la mutación con un mecanismo de reparación tal como la reparación dirigida por homología (HDR). La corrección de un gen mutante también puede comprender reparar una mutación de desplazamiento de marco que causa un codón de parada prematuro, un sitio aceptor de corte y empalme aberrante o un sitio donante de empalme aberrante, generando una ruptura bicatenaria en el gen que luego se repara usando unión de extremos no homólogos (NHEJ). La NHEJ puede añadir o eliminar al menos un par de bases durante la reparación que puede restaurar el marco de lectura adecuado y eliminar el codón de parada prematuro. La corrección de un gen mutante también puede comprender interrumpir un sitio aceptor de corte y empalme aberrante o una secuencia donante de empalme. La corrección puede comprender también eliminar un segmento génico no esencial por la acción simultánea de dos nucleasas en la misma cadena de ADN para restaurar el marco de lectura adecuado eliminando el ADN entre los dos sitios diana de nucleasa y reparar la ruptura del ADN mediante NHEJ.

En ciertas realizaciones, “ reparación dirigida por homología” o “ HDR” se refiere a un mecanismo en células para reparar lesiones de ADN de cadena doble cuando una pieza homóloga de ADN está presente en el núcleo, principalmente en la fase G2 y S del ciclo celular. HDR usa una plantilla de ADN donante para guiar la reparación y puede usarse para crear cambios de secuencia específicos en el genoma, que incluyen la adición dirigida de genes completos. Si se proporciona una plantilla de donante junto con los sistemas basados en CRISPR/Cas9, entonces la maquinaria celular reparará la ruptura mediante recombinación homóloga, que aumenta varios órdenes de magnitud en presencia de escisión de<a>D<n>. Cuando la pieza homóloga de ADN está ausente, la unión de extremos no homólogos puede tener lugar en su lugar.

En ciertas realizaciones, un ADN donante o una plantilla donante se refiere a un fragmento o molécula de ADN bicatenario que incluye al menos una parte del gen de interés, por ejemplo, el gen de la distrofina. El ADN donante puede codificar una proteína funcional completa o una proteína parcialmente funcional.

En ciertas realizaciones, la “ ruta de unión de extremos no homólogos (NHEJ)” se refiere a una ruta que reúne rupturas de cadena doble en el ADN ligando directamente los extremos de ruptura sin la necesidad de una plantilla homóloga. La religación independiente de plantilla de los extremos de ADN por NHEJ es un proceso de reparación estocástica propenso a errores que introduce microinserciones y microdeleciones aleatorias (indels) en el punto de ruptura del ADN. Este método puede usarse para interrumpir, eliminar o alterar intencionadamente el marco de lectura de las secuencias de genes diana. La NHEJ normalmente usa secuencias de ADN homólogas cortas llamadas microhomologías para la reparación de la guía. Estas microhomologías a menudo están presentes en salientes monocatenarios en el extremo de las rupturas bicatenarias. Cuando los salientes son perfectamente compatibles, la NHEJ generalmente reparó la ruptura con precisión, pero también puede producirse una reparación imprecisa que conduce a la pérdida de nucleótidos, pero es mucho más común cuando los salientes no son compatibles. En ciertas realizaciones, NHEJ es una NHEJ mediada por nucleasas, que en ciertas realizaciones, se refiere a NHEJ que se inicia una molécula de Cas9, corta ADN bicatenario. El vector actualmente descrito o una composición que comprende el mismo se puede administrar al músculo esquelético o músculo cardíaco del sujeto para la edición del genoma en el músculo esquelético o el músculo cardíaco. La edición del genoma comprende la desactivación de un gen, tal como un gen mutante o un gen normal. La edición del genoma se puede usar para tratar la enfermedad o mejorar la reparación muscular cambiando el gen de interés.

El uso de los vectores o composiciones que comprenden los mismos para administrar el sistema CRISPR/Cas9 descrito en la presente memoria al músculo esquelético o músculo cardíaco puede restablecer la expresión de una proteína funcional completa o parcialmente funcional con una plantilla de reparación o ADN donante, que puede reemplazar todo el gen o la región que contiene la mutación. El sistema CRISPR/Cas9 se puede usar para introducir rupturas bicatenarias específicas de sitio en loci genómicos diana. Se crean rupturas bicatenarias específicas de sitio cuando el sistema CRISPR/Cas9 se une a una secuencia de ADN diana, permitiendo así la escisión del ADN diana. El sistema basado en CRISPR/Cas9 tiene la ventaja de la edición avanzada del genoma debido a su alta tasa de modificación genética exitosa y eficiente. Esta escisión del ADN puede estimular la maquinaria natural de reparación del ADN, lo que conduce a uno de dos posibles vías de reparación: reparación dirigida por homología (HDR) o la vía de unión final no homóloga (NHE J).

La presente descripción se refiere a la edición genómica con un sistema CRISPR/Cas9 sin una plantilla de reparación, que puede corregir eficientemente el marco de lectura y restaurar la expresión de una proteína funcional involucrada en una enfermedad genética. El sistema CRISPR/Cas9 divulgado puede implicar el uso de enfoques de corrección basados en reparación dirigida por homología o unión de extremos no homólogos (NHEJ) mediada por nucleasa, que permiten una corrección eficiente en líneas celulares primarias de proliferación limitada que pueden no ser susceptibles de recombinación homóloga o corrección genética basada en la selección. Esta estrategia integra el ensamblaje rápido y robusto de los sistemas CRISPR/Cas9 activos con un método de edición de genes eficiente para el tratamiento de enfermedades genéticas causadas por mutaciones en regiones codificantes no esenciales que causan desplazamientos de marco, codones de parada prematuros, sitios donantes de empalme aberrantes o sitios aceptores de empalme aberrantes.

La restauración de la expresión de proteínas a partir de un gen mutado endógeno puede ser a través de la reparación del ADN mediada por NHEJ sin plantilla. A diferencia de un método transitorio dirigido al ARN del gen diana, la corrección del marco de lectura del gen diana en el genoma por un sistema CRISPR/Cas9 expresado transitoriamente puede conducir a la expresión génica diana restaurada permanentemente por cada célula modificada y toda su progenie.

La corrección génica de NHEJ mediada por nucleasas puede corregir el gen diana mutado y ofrece varias ventajas potenciales sobre la ruta HDR. Por ejemplo, NHEJ no requiere una plantilla donante, que puede causar mutagénesis de inserción inespecífica. Contrariamente a HDR, NHEJ funciona eficientemente en todas las etapas del ciclo celular y, por lo tanto, puede explotarse eficazmente en células tanto de ciclo como postmitóticas, tales como fibras musculares. Esto proporciona una alternativa robusta y permanente de restauración génica al salto de exón basado en oligonucleótidos o a la lectura farmacológica forzada de codones de parada y teóricamente podría requerir tan poco como un tratamiento farmacológico. La corrección génica basada en NHEJ mediante el uso de un sistema basado en CRISPR/Cas9 puede combinarse con otras plataformas exvivoein vivopara terapias basadas en células y genes, además del enfoque de electroporación del plásmido descrito aquí. Por ejemplo, el suministro de un sistema basado en CRISPR/Cas9 mediante transferencia génica basada en ARNm o como proteínas purificadas de células purificadas podría permitir un enfoque de edición del genoma libre de ADN que evitaría cualquier posibilidad de mutagénesis por inserción.

La restauración de la expresión de proteínas a partir de un gen mutado endógeno puede implicar la reparación dirigida por homología. La presente divulgación incluye además administrar una plantilla donante a la célula. La plantiolla donante puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína funcional completa o una proteína parcialmente funcional. Por ejemplo, la plantilla de donante puede incluir una construcción de distrofina miniaturizada, denominada minidistrofia (“ minidys” ), una construcción de distrofina funcional completa para restaurar un gen de distrofina mutante, o un fragmento del gen de la distrofina que después de la reparación dirigida por homología conduce a la restauración del gen de la distrofina mutante.

El vector y la composición descritos actualmente pueden usarse para corregir un gen dedistrofinamutante (por ejemplo, un gen humano mutante dedistrofina)en una célula y tratar a un sujeto que padece una enfermedad genética, tal como DMD.

5. Uso del Vector actualmente descrito para tratar una enfermedad -

La materia objeto actualmente divulgada se puede usar para tratar a un sujeto que lo necesita. El vector o composición descritos se pueden administrar a un tejido de un sujeto. El vector o composición se puede administrar al músculo esquelético o músculo cardíaco del sujeto. El sujeto puede padecer una afección del músculo esquelético o una afección del músculo cardíaco que causa degeneración o debilidad o una enfermedad genética. El sujeto puede padecer distrofia muscular de Duchenne, como se describió anteriormente.

El vector o composición descritos se pueden usar para corregir el gen de ladistrofinay recuperar la expresión de proteínas con función completa o parcialmente funcional de dicho gen de ladistrofina.El uso del vector o composición descritos puede reducir los efectos (por ejemplo, síntomas clínicos/indicaciones) de DMD en un paciente.

6. Suministro del Vector o composición

El suministro de un vector o una composición que comprende el mismo a una célula puede ser mediante la transfección o electroporación del vector o composiciones que comprenden los mismos como una molécula de ácido nucleico que se expresa en la célula y se administra a la superficie de la célula. Las moléculas de ácido nucleico pueden electroporarse usando dispositivos BioRad Gene Pulser Xcell o Amaxa Nucleofector lib. Se pueden utilizar varios tampones diferentes, incluida la solución de electroporación BioRad, el producto salino tamponado con fosfato Sigma n.° D8537 (PBS), Invitrogen OptiMEM I (OM) o la solución Amaxa Nucleofector V (N.V.). Las transfecciones pueden incluir un reactivo de transfección, tal como Lipofectamine 2000.

T ras la entrega al tejido, y posteriormente el vector a las células del mamífero, las células transfectadas expresarán al menos una molécula de Cas9 y las dos moléculas de ARNg. Las construcciones o composiciones genéticas que comprenden las mismas pueden administrarse a un mamífero para alterar la expresión génica o para rediseñar o alterar el genoma. Por ejemplo, las construcciones o composiciones genéticas que comprenden las mismas pueden administrarse a un mamífero para corregir el gen de ladistrofinaen un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, un primate no humano, una vaca, un cerdo, una oveja, una cabra, un antílope, un bisonte, un búfalo de agua, un bóvido, un ciervo, un erizo, un elefante, una llama, una alpaca, un ratón, una rata o un pollo, y preferentemente un ser humano, una vaca., cerdo o pollo.

El vector que codifica al menos una molécula Cas9 y un par de dos moléculas de ARNg se puede administrar al mamífero mediante inyección de ADN (también denominada vacunación con ADN) con y sin electroporaciónin vivo,mediada por liposomas, facilitada por nanopartículas y/o vectores recombinantes. El vector recombinante puede ser suministrado por cualquier modo viral. El modo viral puede ser lentivirus recombinante, adenovirus recombinante y/o virus adenoasociado recombinante.

El vector descrito o una composición que comprende el mismo se puede introducir en una célula para corregir genéticamente un gen dedistrofina(p. ej., gen humano dedistrofina).El vector o composición divulgado puede introducirse en una célula de mioblastos de un paciente con DMD. El vector o composición que comprende el mismo puede introducirse en una célula de fibroblastos de un paciente con DMD, y la célula de fibroblastos genéticamente corregida puede tratarse con MyoD para inducir la diferenciación en mioblastos, que pueden implantarse en sujetos, tales como los músculos dañados de un sujeto para verificar que la proteína distrofina corregida es funcional y/o para tratar al sujeto. Las células modificadas también pueden ser células madre, tales como células madre pluripotentes inducidas, progenitores derivados de la médula ósea, progenitores del músculo esquelético, mioblastos esqueléticos humanos de pacientes con DMD, CD 133 células, mesoangioblastos y células transducidas con MyoD- o Pax 7-, u otras células progenitoras miogénicas. Por ejemplo, el sistema basado en CRISPR/Cas9 puede causar diferenciación neuronal o miogénica de una célula madre pluripotente inducida.

6. Rutas de administración

El vector descrito o una composición que comprende el mismo se puede administrar a un sujeto por diferentes vías que incluyen vía oral, parenteral, sublingual, transdérmica, rectal, transmucosa, tópica, por inhalación, mediante administración bucal, intrapleuralmente, intravenosa, mediante administración intraarterial, mediante administración intraperitoneal, subcutánea, mediante administración intramuscular, mediante administración intranasal, mediante administración intratecal, a través de administración intraarticular y combinaciones de los mismos. El vector o una composición actualmente descritos puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un sujeto que padece DMD) de forma intramuscular, intravenosa o una combinación de los mismos. Para uso veterinario, el vector o composición actualmente divulgados puede administrarse como una formulación adecuadamente aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria normal. El veterinario puede determinar fácilmente el régimen de dosificación y la vía de administración que es más apropiado para un animal en particular. Un vector actualmente divulgado o una composición que lo comprende se puede administrar mediante jeringas tradicionales, dispositivos de inyección sin aguja, “ pistolas de bombardeo con microproyectiles” u otros métodos físicos tales como electroporación (“ EP” ), “ método hidrodinámico” o ultrasonido.

El vector actualmente descrito o una composición que comprende el mismo puede administrarse al mamífero mediante varias tecnologías que incluyen la inyección de ADN (también denominada vacunación de ADN) con y sin electroporación invivo,mediada por liposomas, facilitadas por nanopartículas, vectores recombinantes tales como lentivirus recombinante, adenovirus recombinante y virus asociado a adenovirus recombinante. El vector actualmente descrito o una composición que comprende el mismo puede inyectarse en el músculo esquelético o el músculo cardíaco. Por ejemplo, el vector actualmente descrito o una composición que comprende el mismo puede inyectarse en el músculo tibial anterior.

7. Tipos de células

Cualquiera de estos métodos de administración y/o vías de administración se puede utilizar con una multitud de tipos de células, por ejemplo, aquellos tipos de células actualmente bajo investigación para terapias basadas en células de DMD, que incluyen, entre otras, células de mioblastos inmortalizados, tales como líneas celulares de tipo salvaje y derivadas de pacientes con DMD, por ejemplo líneas celulares A48-50 DMD, DMD 8036 (del48-50), C25C14 y d Md -7796, fibroblastos dérmicos de DMD primarios, células madre pluripotentes inducidas, progenitores derivados de médula ósea, células esqueléticas, progenitores musculares, mioblastos esqueléticos humanos de pacientes con DMD, células CD 133+, mesoangioblastos, cardiomiocitos, hepatocitos, condrocitos, células progenitoras mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células de músculo liso y células transducidas con MyoD o Pax7, u otras células progenitoras miogénicas. La inmortalización de células miogénicas humanas puede usarse para la derivación clonal de células miogénicas genéticamente corregidas. Las células pueden modificarseex vivopara aislar y expandir las poblaciones clonales de mioblastos DMD inmortalizados que inducen un gen dedistrofinagenéticamente corregido y están libres de otras mutaciones introducidas por nucleasas en las regiones codificantes de proteínas del genoma.

EJEMPLOS

Habiendo descrito ahora la presente descripción en detalle, lo mismo se entenderá más claramente por referencia a los siguientes ejemplos, que simplemente pretenden ilustrar algunos aspectos y realizaciones de la descripción, y no deben considerarse como limitantes del alcance de la descripción.

La materia objeto actualmente divulgada tiene múltiples aspectos, ilustrados mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 - Deleción del exón 51 de genes de distrofina humana por vectores de AAV en mioblastos de pacientes con DMD inmortalizados

Se crearon 12 vectores plasmídicos de AAV, cada uno de los cuales codifica una molécula Cas9 de S.aureusy un par de moléculas de ARNg seleccionadas de la lista de 12 pares de ARNg de la Tabla 1. La secuencia de ácido nucleico con codones optimizados que codifica la molécula Cas9 de S.aureus seestablece en la Id. de sec. n°: 29. Entre los 12 vectores de AAV de plásmido, tres vectores de AAV de plásmido que codifican pares de ARNg (84+ 68), (82+ 68) y (62+ 38), respectivamente, se transfectaron en células HEK293T y se sometieron a electroporación en mioblastos humanos inmortalizados de pacientes con DMD. Las células se diferenciaron, y se recogieron ARN y proteínas. La PCR de punto final y la PCR digital de gota se realizaron en ADNg y ADNc, transferencia western en la proteína.

Métodos y Materiales

Los mioblastos de pacientes con DMD humanos inmortalizados que incluyen una deleción de los exones 48-50 se cultivaron en medio de músculo esquelético (PromoCell) suplementado con 20 % de FBS, 1 % de antibiótico, 1 % de GlutaMAX, 50 μg/mL de fetuina, 10 ng/ul de factor de crecimiento epidérmico humano, 1 ng/ml de factor básico de crecimiento de fibroblastos humano básico y 10 μg/ml de insulina humana. Los plásmidos se sometieron a electroporación en mioblastos de pacientes con DMD humano inmortalizados, por ejemplo, los mioblastos de pacientes con DMD humano inmortalizados se sometieron a electroporación con 10 μg de plásmido usando el Gene Pulser XCell con PBS como tampón de electroporación usando condiciones previamente optimizadas. Las células se incubaron durante tres días después de la electroporación, y después el ADN genómico se recogió y se recogió usando el Kit DNEasy Blood and Tissue. Se usaron 50 ng de ADN genómico para la PCR digital de gotas (“ ddPCR” ). Las eficiencias de deleción de los plásmidos se midieron por ddPCR, como se describe en la Solicitud PCT No. PCT/US16/025738. Se usaron 100 ng de ADN gemómico para la PCR de punto final para detectar bandas de deleción. La secuenciación se realizó para bandas de deleción detectadas.

Los mioblastos electroporados restantes se diferenciaron en miofibras reemplazando el medio de cultivo convencional con DMEM suministrado con un 1 % de antibiótico y 1 % de insulina-transferina-selenio. Las células se diferenciaron durante 6-7 días, luego se aisló el ARN mediante el uso del Mini Kit RNEasy Plus. El ARN se transcribió de forma inversa a ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc VILO. La proteína se cosechó de células diferenciadas mediante recolección y lisis en tampón RIPA con cóctel inhibidor de proteasa. Las muestras se realizaron en un gel NuPAGE Bis-Tris al 4-12 % en tampón MES. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, después la transferencia Western se bloqueó durante al menos 1 hora. El anticuerpo primario usado para la expresión de distrofina fue MADYS8 en 1: 1000.

Resultados

Las eficiencias de deleción de los tres vectores de AAV plásmicos que codifican pares de ARNg (84+ 68), (82+ 68) y (62+ 38), respectivamente, en células HEK293T transfectadas se muestran en la Figura 1. Las eficiencias de deleción de estos tres vectores de AAV plásmicos en mioblastos de pacientes con DMD inmortalizados se muestran en la Figura 2. Tanto para las células H293T transfectadas como para los mioblastos inmortalizados de pacientes con DMD, se utilizó S.aureusCas9 como control negativo. La eficiencia de deleción de mioblastos se correlacionó bien con la eficiencia de deleción de células HEK293T.

Se detectaron bandas de deleción para los vectores de AAV de plásmido. El resultado de secuenciación para la banda de deleción por los vectores de<a>A<v>de plásmido que codifican el par de ARNg (84+ 68) se muestra en la Figura 3. Como se muestra en la Figura 3, el vector de AAV plasmídico que codifica el par de ARNg (84+ 68) de la deleción prevista precisa mediada del exón 51 del gen dedistrofinahumano.

Ejemplo 2 - Deleción del exón 51 de genes de distrofina humanos por vectores de AAV en ratones humanizados que incluyen el gen de la distrofina humana

Los modelos de ratón, incluidos los modelos de ratón humanizados, se consideran útiles para evaluar y adaptar composiciones y métodos, tales como los descritos en la presente descripción, para el tratamiento o prevención de enfermedades en sujetos humanos y animales.Ver, p.ej.,E. Nelson Y COl., Science 10.1126/science.aad5143 (2015),M. Tabebordbar Y COl., Science (2015). 10.1126/science.aad5177, Y Long Y COl., Science (2016;Ene 22); 351 (6271):400-403. Por ejemplo, los expertos en la técnica apreciarán que los cambios en el genotipo y/o el fenotipo observados en modelos de ratón humanizados de DMD pueden predecir cambios en el genotipo y/o fenotipo en pacientes humanos tratados con las composiciones y métodos de la presente descripción. En particular, un método o composición que es eficaz para rescatar un genotipo o fenotipo de enfermedad (o similar a una enfermedad) en un modelo de ratón humanizado puede adaptarse fácilmente por los expertos en la técnica al uso terapéutico en sujetos humanos, y tales adaptaciones están dentro del alcance de la presente divulgación.

Un modelo humanizado de DMD de ratón se basa en el modelo de ratónmdxdescrito por C. E. Nelson y col., Science 10.1126/science.aad5143 (2015). El ratónmdxporta una mutación sin sentido en el exón 23 del gen dedistrofinade ratón, que da como resultado la producción de un transcrito de ARNm de distrofina de longitud completa y codifica una proteína distrofina truncada. Estos cambios moleculares están acompañados por cambios funcionales que incluyen una contracción reducida y una fuerza tetánica en el músculo delmdx. El ratónmdxse ha humanizado mediante la adición de un transgén dedistrofinahumana completo que comprende una deleción del exón 52 (“ ratón A52mdx” ).

Los ratones A52mdxse crearon inyectando un sistema CRISPR/Cas9 que incluye una molécula Cas9 de S.pyogenesy un par de ARNg dirigidos al intrón 51 y al intrón 52 del gen de ladistrofinahumana, respectivamente, en los embriones de ratonesmdxque contienen el transgén de ladistrofinahumana. No se detectó proteína distrofina en el corazón y el músculo tibial anterior de los ratones A52mdx.

En un experimento, un vector AAV codifica un S.aureusCas9 y un par de ARNg que comprenden secuencias diana establecidas en la Tabla 1 se administra, por ejemplo, al tibial derecho de cada uno de una pluralidad de ratones A52mdx.Los músculos tibiales izquierdos anteriores de los ratones A52mdxse usan como controles contralaterales, que no reciben tratamiento o un vector vacío. En diversos puntos temporales después de la administración del vector, los ratones se sacrifican y se recogen tejidos para histología, extracción de proteínas y/o extracción de ácido nucleico. El grado de edición y los cambios celulares y moleculares después del tratamiento pueden evaluarse como se describió anteriormente y en Nelsony col.

En otro experimento, los vectores de AAV que codifican Cas9 y pares de ARNg como se describió anteriormente se administran sistemáticamente a la ratones A52mdx,por ejemplo mediante inyección intravascular, y se analizan en más o menos de la misma manera descrita anteriormente. Los resultados de este experimento, el experimento descrito anteriormente y/u otros experimentos similares pueden usarse para evaluar y pares de guías particulares de orden de clasificación para la eficacia terapéutica, para diseñar y/u optimizar los vectores de AAV y los protocolos de dosificación, y para evaluar la posible utilidad clínica de composiciones o métodos particulares de acuerdo con la presente descripción.

Se entiende que la descripción detallada anterior y los ejemplos adjuntos son meramente ilustrativos y no deben tomarse como limitaciones al alcance de la materia objeto actualmente divulgada, que se define únicamente por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes. Varios cambios y modificaciones de las realizaciones descritas serán evidentes para los expertos en la técnica.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un vector que codifica:

(a) una primera molécula de ARN guía (ARNg),

(b) una segunda molécula de ARNg, y

(c) al menos una molécula Cas9 que reconoce un motivo adyacente a protoespaciador (PAM) de NNGRRT (Id. de sec. n°: 24) o NNGRRV (Id. de sec. n°: 25),

en donde la al menos una molécula Cas9 es una molécula Cas9de S.aureus;

y en donde la primera molécula de ARNg comprende un dominio de direccionamiento que consiste en una secuencia de nucleótidos como se establece en Id. de sec. n°: 1, y la segunda molécula de ARNg comprende un dominio de direccionamiento que consiste en una secuencia de nucleótidos como se establece en Id. de sec. n°: 2.

2. El vector de la reivindicación 1, en donde el vector está configurado para formar una primera y una segunda ruptura de cadena doble en un primer y un segundo intrón flanqueante del exón 51 del gen DMDhumano,respectivamente, deletando de este modo un segmento del gen de la distrofina que comprende el exón 51.

3. El vector de la reivindicación 2, en donde el segmento tiene una longitud de aproximadamente 800-900, aproximadamente 1500-2600, aproximadamente 5200-5500, aproximadamente 20.000-30.000, aproximadamente 35.000-45.000, o aproximadamente 60.000-72.000 pares de bases.

4. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la al menos una molécula Cas9 es una molécula Cas9 mutantede S.aureus.

5. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el vector es un vector viral.

6. El vector de la reivindicación 5, en donde el vector es un vector de virus adenoasociado (AAV).

7. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en un medicamento.

8. Una composición que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

9. Una célula que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

10. Un sistema basado en CRISPR/Cas9 que comprende:

(a) una primera molécula de ARN guía (ARNg),

(b) una segunda molécula de ARNg, y

(c) al menos una molécula Cas9 que reconoce un motivo adyacente a protoespaciador (PAM) de NNGRRT (Id. de sec. n°: 24) o NNGRRV (Id. de sec. n°: 25),

en donde la al menos una molécula Cas9 es una molécula Cas9 deS.aureus;

y en donde la primera molécula de ARNg comprende un dominio de direccionamiento que consiste en una secuencia de nucleótidos como se establece en Id. de sec. n°: 1, y la segunda molécula de ARNg comprende un dominio de direccionamiento que consiste en una secuencia de nucleótidos como se establece en Id. de sec. n°: 2.

11. El sistema basado en CRISPR/Cas9 de la reivindicación 10, en donde el sistema basado en CRISPR/Cas9 está configurado para formar una primera y una segunda ruptura de cadena doble en un primer y un segundo intrón flanqueante del exón 51 del gen DMDhumano,respectivamente, deletando de este modo un segmento del gen de la distrofina que comprende el exón 51.

12. El sistema basado en CRISPR/Cas9 de la reivindicación 11, en donde el segmento tiene una longitud de 800 900, 1500-2600, 5200-5500, 20.000-30.000, 35.000-45.000 o 60.000-72.000 pares de bases.

13. El sistema basado en CRISPR/Cas9 de cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en donde la al menos una molécula Cas9 es una molécula Cas9 mutante deS.aureus.

14. El sistema basado en CRISPR/Cas9 de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, para su uso en un medicamento.

15. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o el sistema basado en CRISPR/Cas9 de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, para su uso en el tratamiento de Distrofia Muscular de Duchenne.