JP7075597B2 - デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ関連の方法および組成物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１６年５月５日に出願された米国仮特許出願第６２／３３２，２９７号明細書に対する優先権を主張する。

配列表
本明細書は、配列表（２０１７年５月５日に「０２８１９３－９２３１－ＷＯ００ Ａｓ Ｆｉｌｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」という名前のテキストファイルとして電子的に提出されたもの）を参照する。この「．ｔｘｔ」ファイルは、２０１７年５月５日に作成され、サイズは６２，３４６バイトである。配列表の内容全体を、参照により本明細書に組み込む。

本開示は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９に基づくシステムおよびウイルス送達システムを使用する遺伝子発現の改変、遺伝子のゲノム操作およびゲノム改変の分野に関する。本開示はまた、筋肉（例えば骨格筋および心筋）での遺伝子のゲノム操作およびゲノム改変の分野にも関する。

合成転写因子は、哺乳動物システムにおける多くの異なる医学的用途および科学的用途（例えば、組織再生の刺激、薬物スクリーニング、遺伝的欠陥の補償、抑制された腫瘍抑制因子の活性化、幹細胞分化の制御、遺伝子スクリーニングの実施および合成遺伝子回路の作成）のために遺伝子発現を制御するように操作されている。これらの転写因子は、内因性遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーを標的とし得る、または導入遺伝子の調節のために哺乳動物のゲノムに直交する配列を認識するように意図的に設計され得る。ユーザーにより定義される配列を標的とする新規転写因子を設計するための最も一般的な戦略は、ジンクフィンガータンパク質および転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインをベースとしている。これらのアプローチの両方は、これらのドメインのタンパク質－ＤＮＡ相互作用の原理を、独自のＤＮＡ結合特異性を有する新規のタンパク質の設計に適用することが含まれる。これらの方法は多くの用途で広く成功しているが、タンパク質－ＤＮＡ相互作用を操作するために必要なタンパク質工学は面倒な可能性があり、且つ専門知識を必要とする。

加えて、この新規のタンパク質は必ずしも有効であるとは限らない。この理由はまだ分かっていないが、ゲノム標的部位へのタンパク質結合に対するエピジェネティックな改変およびクロマチン状態の効果に関連している可能性がある。加えて、この新規のタンパク質および他の成分が各細胞に送達されることを確実にすることには課題が存在する。この新規のタンパク質およびその複数の成分を送達するための既存の方法として、コピー数の差異に起因して各細胞中での高度に可変な発現レベルに至る別々のプラスミドおよびベクターの細胞への送達が挙げられる。加えて、遺伝子導入後の遺伝子活性化はプラスミドＤＮＡの希釈に起因して一過性であり、一時的な遺伝子発現は、治療効果を誘導するのに十分ではない可能性がある。さらに、このアプローチは、容易には遺伝子導入されない細胞型には適していない。そのため、この新規のタンパク質の別の制限は転写活性化の効力である。

部位特異的なヌクレアーゼを使用して、標的とするゲノム遺伝子座で部位特異的な二本鎖切断を導入することができる。このＤＮＡ開裂は天然のＤＮＡ修復機構を刺激し、２種の可能な修復経路のうちの一方に至る。ドナー鋳型の非存在下では、この切断は、ＤＮＡの小さい挿入または欠失が起こるエラーが発生し易い修復経路である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される。この方法を使用して、標的とする遺伝子配列の読み枠を意図的に破壊し得る、欠失させ得る、または改変し得る。しかしながら、ドナー鋳型がヌクレアーゼと共に提供される場合、細胞機構は、この切断を相同組換えにより修復し、この相同組換えは、ＤＮＡ切断の存在下では桁違いに増強される。この方法を使用して、標的部位でＤＮＡ配列中に特定の変化を導入することができる。遺伝子操作されたヌクレアーゼは、様々なヒト幹細胞および細胞株での遺伝子編集ならびにマウス肝臓での遺伝子編集に使用されている。しかしながら、これらの技術の実施での大きな障害は、有効で効率的であり且つゲノム改変の成功を容易にする方法によるインビボでの特定の組織への送達である。

遺伝性の遺伝子疾患は、米国では、子供への破壊的な影響を与える。これらの疾患は、現在、治療法がなく、症状を軽減する試みによって管理することしかできない。数十年間、遺伝子治療の分野は、これらの疾患に対する治療法を約束してきた。

しかし、細胞および患者への治療遺伝子の安全かつ効率的な送達に関する技術的な障害により、この手法は制限されてきた。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、最も一般的な遺伝性の単一遺伝子疾患であり、男性の３５００人に１人が発症する。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子内の遺伝性突然変異または自然突然変異の結果である。ジストロフィンは、筋細胞の完全性および機能の調節に関与するタンパク質複合体の重要な構成要素である。ＤＭＤ患者は概して、小児期には自身を身体的に支える能力を失い、十代にはますます弱まり、二十代には死亡する。ＤＭＤのための現在の実験的遺伝子治療戦略は、一過性の遺伝子送達媒体の反復投与を必要とする、または外来遺伝子物質のゲノムＤＮＡへの永続的な組込みに依存する。これらの方法は両方とも、安全性に深刻な懸念を有する。さらに、これらの戦略は、大きく且つ複雑なＤＭＤ遺伝子配列を送達することができないことにより制限されている。

本開示の主題は、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子と、第２のｇＲＮＡ分子と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する少なくとも１つのＣａｓ９分子とをコードするベクターを提供し、ここでは、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子のそれぞれは、１９～２４ヌクレオチド長のターゲティングドメインを有し、かつベクターは、ヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン５１にそれぞれ隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成することによって、エクソン５１を含むジストロフィン遺伝子のセグメントを欠失させるように構成される。特定の実施形態では、セグメントは、約８００～９００、約１５００～２６００、約５２００～５５００、約２０，０００～３０，０００、約３５，０００～４５，０００、または約６０，０００～７２，０００塩基対の長さを有する。特定の実施形態では、セグメントは、約８０６塩基対、約８６７塩基対、約１，５５７塩基対、約２，５２７塩基対、約５，３０５塩基対、約５，４１５塩基対、約２０，７６８塩基対、約２７，３９８塩基対、約３６，３４２塩基対、約４４，２６９塩基対、約６０，８９４塩基対、および約７１，８３２塩基対からなる群から選択される長さを有する。特定の実施形態では、セグメントは、８０６塩基対、８６７塩基対、１，５５７塩基対、２，５２７塩基対、５，３０５塩基対、５，４１５塩基対、２０，７６８塩基対、２７，３９８塩基対、３６，３４２塩基対、４４，２６９塩基対、６０，８９４塩基対、および７１，８３２塩基対からなる群から選択される長さを有する。

さらに、本開示の主題は、第１のガイドＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と、少なくとも１つのＣａｓ９分子とをコードするベクターを提供し、ここでは、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、以下からなる群から選択される：
（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉ）配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉｉ）配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｖ）配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖ）配列番号７に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉ）配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉｉ）配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｘ）配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｘ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｘｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに
（ｘｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＣａｓ９分子は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である。特定の実施形態では、少なくとも１つのＣａｓ９分子は、変異黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である。

特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。特定の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

本開示の主題はまた、上記のベクターを含む細胞を提供する。本開示の主題はさらに、上記のベクターを含む組成物を提供する。

本開示の主題はさらに、細胞中で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法であって、上記のベクターを細胞に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドン、遺伝子欠失による破壊された読み枠、異所性スプライス受容部位、または異所性スプライス供与部位を含む。特定の実施形態では、変異ジストロフィン遺伝子の修正は、相同組換え修復を含む。特定の実施形態では、本方法はさらに、ドナーＤＮＡを細胞に投与することを含む。特定の実施形態では、変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドンおよび切断された遺伝子産物をもたらすフレームシフト変異を含む。特定の実施形態では、変異ジストロフィン遺伝子の修正は、ヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合を含む。特定の実施形態では、変異ジストロフィン遺伝子の修正は、未成熟終止コドンの欠失、破壊された読み枠の修正、またはスプライス受容部位の破壊もしくはスプライス供与配列の破壊によるスプライシングの調節を含む。特定の実施形態では、変異ジストロフィン遺伝子の修正は、エクソン５１の欠失を含む。特定の実施形態では、細胞は、筋芽細胞である。特定の実施形態では、細胞は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している対象由来である。特定の実施形態では、細胞は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患しているヒト対象由来の筋芽細胞である。特定の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、以下からなる群から選択される：（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉ）配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに（ｉｉｉ）配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子。特定の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含み、かつ、第２のｇＲＮＡ分子が、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む。

さらに、本開示の主題は、変異ジストロフィン遺伝子を有する、その必要がある対象を治療する方法であって、上記のベクターを対象に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、対象は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している。特定の実施形態では、本方法は、対象の筋肉にベクターを投与することを含む。特定の実施形態では、筋肉は、骨格筋または心筋である。特定の実施形態では、骨格筋は、前脛骨筋である。特定の実施形態では、ベクターは、対象の骨格筋に注射される。特定の実施形態では、ベクターは、対象に全身的に注射される。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における本開示のベクターの欠失効率を示す。 ＤＭＤ筋芽細胞における本開示のベクターの欠失効率を示す。 ＤＭＤ筋芽細胞試料における本開示のベクターの配列決定の結果を示す。

本明細書に記載した遺伝子コンストラクト、組成物、および方法は、ゲノムを編集する、例えば、遺伝子疾患、例えばＤＭＤに関与するジストロフィン遺伝子内の変異の影響を修正または低減するために使用することができる。遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、ジストロフィン遺伝子に対するＤＮＡターゲティング特異性を提供する少なくとも１対のガイドＲＮＡ分子と、少なくとも１つのＣａｓ９分子とを含む。

本開示の主題はまた、ジストロフィン遺伝子を標的にするために、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９に基づくシステムおよび複数のｇＲＮＡを送達するための、遺伝子コンストラクト、組成物、および方法を提供する。本開示の主題はまた、骨格筋および心筋に、遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはそれを含む組成物を送達するための方法を提供する。ベクターは、改変されたＡＡＶベクターを含めたＡＡＶであり得る。本開示の主題は、治療用途のためにヒトゲノムを書き換えるための手段、および基礎科学用途のための標的モデル種を提供する。

遺伝子編集は、組織ごとに異なる細胞周期および複雑なＤＮＡ修復経路に大きく依存している。骨格筋は、細胞あたり１００個超の核を有する大きな筋線維からなる、非常に複雑な環境である。遺伝子治療および生物学は、概して、数十年間、インビボ送達の障害によって制限されてきた。これらの課題には、インビボでの担体の安定性、正しい組織を標的にすること、十分な遺伝子発現および活性な遺伝子産物を得ること、ならびに遺伝子編集ツールによく見られる、活性に打ち勝つ可能性がある毒性を回避することが含まれる。プラスミドＤＮＡの直接注射などの他の送達ビヒクルは、他の状況における骨格筋および心筋では、遺伝子を発現するように働くが、検出可能なレベルのゲノム編集を達成するためのこれらの部位特異的ヌクレアーゼと共には働かない。

ＡＡＶベクター内では、多くの遺伝子配列が、不安定、したがって送達不可能であるが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＡＡＶベクター内で安定である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、送達および発現される場合、骨格筋組織中で活性なままである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのタンパク質安定性および活性は、組織型および細胞型に大きく依存する。これらの活性かつ安定なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、骨格筋の複雑な環境における遺伝子配列を改変することが可能である。本開示の主題は、効率的でありかつ成功裡のゲノム改変を容易にする活性な形態のこのクラスの治療薬を、骨格筋または心筋に送達する方式を記載する。

このセクションおよび本明細書での開示全体で使用するセクションの表題は、単に構成を目的とするだけであり、限定することを意図するものではない。

１．定義
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本文書が支配する。好ましい方法および材料が以下に説明されているが、本明細書で説明されたものと類似のまたは等価の方法および材料を本開示の主題の実施または試験で使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書で開示された材料、方法および例は一例に過ぎず、限定することを意図するものではない。

本明細書で別に定義されない限り、本開示に関して使用される科学および技術用語は、当業者によって普通に理解される意味を有するものとする。例えば、本明細書に記載した細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関して使用される、あらゆる学術用語、およびこれらの技術は、周知でありかつ当技術分野で普通に使用されるものである。用語の意味および範囲は、明確であるべきである；しかし、いずれかの潜在的あいまい性の場合には、本明細書で提供する定義が、あらゆる辞書または外部の定義よりも先行する。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数の用語には、複数形が含まれるものとし、複数の用語には、単数形が含まれるものとする。

用語「含む」、「含まれる」、「有すること」、「有する」、「することができる」、「含有する」、およびこれらの異形は、本明細書で使用する場合、追加の作用または構造可能性を排除しない、制約のない移り変わる語句、用語、または単語であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈によって他に明確に指示しない限り、複数の指示内容が含まれる。本開示はまた、明確に説明してもしなくても、本明細書で提供される実施形態または要素を「含む」、「～からなる」、および「本質的に～からなる」、他の実施形態を意図する。

本明細書の数値範囲の列挙については、それぞれその間にある数が、同じ程度の正確性で、明確に意図される。例えば、６～９の範囲については、６および９に加えて、数値７および８が意図され、範囲６．０～７．０については、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が、明確に意図される。

本明細書で使用する場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者によって決定される特定の値に関して許容される誤差範囲内を意味し、この誤差範囲は、この値がどのようにして測定されるかまたは決定されるか（即ち、測定システムの限界）によってある程度決まるだろう。例えば、「約」は、当分野での慣習に従って、３または３超の標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％の範囲を意味し得、好ましくは最大１０％の範囲を意味し得、より好ましくは最大５％の範囲を意味し得、より好ましくはさらに最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物系または生物学的プロセスに関して、この用語は、ある値の１桁内を意味し得、好ましくは５倍以内を意味し得、より好ましくは２倍以内を意味し得る。

本明細書で互換的に使用される「フレームシフト」または「フレームシフト変異」は、１つ以上のヌクレオチドの付加または欠失がｍＲＮＡ内のコドンの読み枠のずれをもたらす、遺伝子変異の種類を指す。読み枠のずれは、ミスセンス変異または未成熟終止コドンなどの、タンパク質翻訳でのアミノ酸配列の変更をもたらす可能性がある。

本明細書で使用される「融合タンパク質」は、元々は別のタンパク質をコードしている２つ以上の遺伝子の連結を介して作製されたキメラタンパク質を指す。融合体遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能特性をもつ単一のポリペプチドをもたらす。

本明細書で使用される「遺伝子コンストラクト」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列には、核酸分子が投与される個人の細胞における発現を誘導することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節エレメントに作動可能に連結された開始および停止シグナルが含まれる。

本明細書で使用する場合、用語「発現可能な形態」は、個人の細胞内に存在する場合にコード配列が発現されることとなるような、タンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結された必須の調節エレメントを含有する遺伝子コンストラクトを指す。

本明細書で互換的に使用される「変異遺伝子」または「変異した遺伝子」は、検出可能な変異を受けている遺伝子を指す。変異遺伝子は、遺伝子の正常な伝達および発現に影響を与える、遺伝材料の喪失、獲得、または交換などの変化を受けている。本明細書で使用される「破壊された遺伝子」は、未成熟終止コドンをもたらす変異を有する変異遺伝子を指す。破壊された遺伝子産物は、完全長の破壊されていない遺伝子産物に対して切断されている。

本明細書で使用される「正常遺伝子」は、遺伝材料の喪失、獲得、または交換などの変化を受けていない遺伝子を指す。正常遺伝子は、正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を受ける。

本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、共有結合によって共に連結された、少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。単鎖の描写はまた、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、描写した単鎖の相補鎖も包含する。所与の核酸と同一の目的のために、核酸の多くのバリアントを使用することができる。したがって、核酸は、実質的に同一な核酸およびその相補体も包含する。単鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリッド形成することができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成するプローブも包含する。

核酸は、一本鎖または二本鎖であり得るし、二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含有することもできる。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ここでは、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含めた塩基の組み合わせを含有することができる。核酸は、化学合成方法によって、または組換え方法によって得ることができる。

本明細書で使用される「作動可能に連結された」は、遺伝子の発現が、遺伝子と空間的に連結されたプロモーターの制御下であることを意味する。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置することができる。プロモーターと遺伝子との距離は、プロモーターが由来する遺伝子における、プロモーターと、プロモーターが制御する遺伝子との距離とほぼ同じであり得る。当技術分野で公知であるように、この距離のバリエーションは、プロモーター機能の喪失を伴わずに適応させることができる。

本明細書で互換的に使用される「未成熟終止コドン」または「アウトオブフレーム終止コドン」は、野生型遺伝子には通常見られない位置での終止コドンをもたらす、ＤＮＡの配列内のナンセンス変異を指す。未成熟終止コドンは、完全長型のタンパク質と比較して切断されているまたは短いタンパク質をもたらす可能性がある。

本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与する、活性化する、または促進することが可能である、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに促進するための、かつ／または、空間的発現および／または同じものの時間的発現を変更するための、１以上の特異的な転写調節配列を含むことができる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置することができる遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含むことができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含めた起源から得ることができる。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織、または器官に対して、または発現が起こる発生段階に対して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘発物質などの外部刺激に応答して、遺伝子成分の発現を恒常的または変動的に調節することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。

本明細書で使用される「骨格筋」は、体性神経系の制御下にあり、かつ腱として公知のコラーゲン線維の束によって骨に付着している、横紋筋の種類を指す。骨格筋は、時として口語的に「筋肉線維（ｍｕｓｃｌｅ ｆｉｂｅｒ）」と呼ばれる、筋細胞（ｍｙｏｃｙｔｅ）として公知の個々の成分、または「筋肉細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）」で構成されている。筋細胞は、筋形成として公知のプロセスにおいて、発達性の筋芽細胞（筋肉細胞をもたらす、ある種類の胚性前駆細胞）の融合体から形成される。これらの長い円柱形の多核細胞は、筋線維（ｍｙｏ ｆｉｂｅｒ）とも呼ばれる。特定の実施形態では、「骨格筋状態」は、筋ジストロフィー、老化、筋変性、創傷治癒、および筋力低下または筋萎縮症などの、骨格筋に関連する状態を指す。

本明細書において互換的に使用される「心筋（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ）」または「心筋（ｈｅａｒｔ ｍｕｓｃｌｅ）」は、心臓の壁および組織学的基礎で見られる一種の不随意性の横紋筋（心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ））を意味する。心筋は、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）または心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉｏｃｙｔｅ）で作られている。心筋細胞は骨格筋細胞上の条線と同様の条線を示すが、多核骨格筋とは異なり唯一の固有の核を含む。特定の実施形態では、「心筋状態」は、心筋に関連する状態（例えば、心筋症、心不全、不整脈および炎症性心疾患）を指す。

本明細書で互換的に使用される「対象」および「患者」は、限定はされないが、哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジーなどのサル）、およびヒト）を含めた、あらゆる脊椎動物を指す。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。対象または患者は、他の形態の治療を受けていてもよい。

本明細書で使用される「標的遺伝子」は、既知のまたは推定上の遺伝子産物をコードする、あらゆるヌクレオチド配列を指す。標的遺伝子は、遺伝子疾患に関与する変異した遺伝子であり得る。特定の実施形態では、標的遺伝子は、ヒトジストロフィン遺伝子である。特定の実施形態では、標的遺伝子は、変異ヒトジストロフィン遺伝子である。

本明細書で使用される「標的領域」は、それに対するガイドＲＮＡが結合および切断するように設計される、標的遺伝子の領域を指す。

核酸に関して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）参考ヌクレオチド配列の一部もしくは断片；（ｉｉ）参考ヌクレオチド配列の相補体、もしくはその一部；（ｉｉｉ）参考核酸と実質的に同一である核酸、もしくはその相補体；または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で参考核酸とハイブリッド形成する核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一な配列を意味する。ペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持する。バリアントは、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参考タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味することができる。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、類似の性質（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の別のアミノ酸と置き換えることは、典型的には微小な変化を伴うものと当技術分野で認識されている。これらの微小な変化は、当技術分野で理解されている通り、アミノ酸の疎水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）を考慮することによって、ある程度特定することができる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性指標は、その疎水性および電荷の考慮に基づいている。類似の疎水性指標のアミノ酸が、置換されてもまだ、タンパク質機能を保持できることが、当技術分野で公知である。一態様では、±２の疎水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、生体機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするために使用することができる。ペプチドという状況でのアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大の局所的平均親水性の算出を可能にする。互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸での置換を実施することができる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値はどちらも、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。この知見と一致して、生体機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさ、および他の性質によって明らかにされる、アミノ酸、特にそのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することが理解されよう。

本明細書で使用される「ベクター」は、複製開始点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製する染色体外のベクター、例えば、ＤＮＡプラスミドであり得る。例えばベクターは、１つのＣａｓ９分子と、一対のｇＲＮＡ分子をコードすることができる。

２．ジストロフィン遺伝子のゲノム編集のための遺伝子コンストラクト
本開示の主題は、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）のゲノム編集またはゲノム変更のための遺伝子コンストラクトを提供する。

特定の実施形態では、ジストロフィンは、筋肉線維の細胞骨格を、細胞膜を通して周囲の細胞外基質に連結するタンパク質複合体の一部である、棒状の細胞質タンパク質を指す。ジストロフィンは、筋肉細胞の完全性および機能の調節を担う細胞膜のジストログリカン複合体に、構造安定性を提供する。特定の実施形態では、ジストロフィン遺伝子（または「ＤＭＤ遺伝子」）は、遺伝子座Ｘｐ２１の２．２メガ塩基である。一次転写物は、約２，４００ｋｂであり、成熟したｍＲＮＡは、約１４ｋｂである。７９個のエクソンが、３５００超のアミノ酸であるタンパク質をコードする。

本開示の遺伝子コンストラクトは、少なくとも１つのＣａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質と、少なくとも１つの（例えば２つの）ｇＲＮＡ分子とを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムをコードする。本開示の主題はまた、こうした遺伝子コンストラクトを含む組成物を提供する。遺伝子コンストラクトは、機能的な染色体外分子として、細胞内に存在することができる。遺伝子コンストラクトは、線状ミニ染色体（セントロメアを含めて）、テロメア、またはプラスミドもしくはコスミドであり得る。

遺伝子コンストラクトはまた、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスを含めた、組換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、細胞内で生存する弱毒化した生きている微生物または組換え微生物ベクター中の遺伝材料の一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節エレメントを含むことができる。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。

特定の実施形態では、遺伝子コンストラクトは、ベクターである。ベクターは、少なくとも１つのＣａｓ９分子と、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子（例えば、２個で一組のｇＲＮＡ分子）とをコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得；ベクターは、哺乳類の細胞において、少なくとも１つのＣａｓ９分子と、少なくともｇＲＮＡ分子とを発現させることが可能である。ベクターは、プラスミドであり得る。ベクターは、インビボ遺伝子治療のために使用することができる。

特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ヒトおよびいくつかの他の霊長類の種を感染させる、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属する、小さいウイルスである。

コード配列は、安定性および高レベルの発現のために最適化することができる。ある種の場合には、コドンは、分子内結合が原因で形成されるものなどの、ＲＮＡの二次構造形成を低下させるように選択される。

ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムの上流であり得る開始コドン、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムまたは部位特異的ヌクレアーゼコード配列の下流であり得る終止コドンをさらに含むことができる。開始および停止コドンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムまたは部位特異的ヌクレアーゼコード配列と共に、フレーム内であり得る。ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムに作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムに作動可能に連結されたプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニ―ウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどの、ヒト遺伝子由来のプロモーターであり得る。プロモーターはまた、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的なプロモーターなどの、組織特異的プロモーターであり得る。こうしたプロモーターの例は、その内容全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号明細書に記載されている。

ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムの下流であり得るポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）由来のポリアデニル化シグナルであり得る。

ベクターはまた、ＤＮＡ発現のための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムの上流のエンハンサーを含むことができる。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはウイルスエンハンサー、例えばＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、またはＥＢＶに由来するものなどであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、それぞれの内容が参照によって完全に組み込まれる米国特許第５，５９３，９７２号明細書、米国特許第５，９６２，４２８号明細書、および国際公開第９４／０１６７３７号パンフレットに記載されている。ベクターはまた、ベクターを染色体外に維持するために、哺乳類の複製開始点を含むことができ、細胞内でベクターの複数のコピーを産生することができる。ベクターはまた、調節配列を含むことができ、調節配列は、ベクターが投与される哺乳類またはヒト細胞における遺伝子発現のために十分に適合させることができる。ベクターはまた、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）などのレポーター遺伝子および／またはハイグロマイシン（「Ｈｙｇｒｏ」）などの選択可能マーカーを含むことができる。

ベクターは、常用の技術、および容易に入手可能な出発材料によってタンパク質を産生するための、発現ベクターまたはシステムであり得る（参照によって完全に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９））。

本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、対象の骨格筋または心筋におけるジストロフィン遺伝子をゲノム編集するために使用することができる。本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、遺伝子疾患および／または他の骨格筋もしくは心筋状態、例えばＤＭＤに関与するジストロフィン遺伝子内の変異の影響を修正または低減することにおいて使用することができる。

２．１ ジストロフィン
ジストロフィンは、筋線維の細胞骨格を、細胞膜を通して周囲の細胞外基質に連結するタンパク質複合体の一部である、棒状の細胞質タンパク質である。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に、構造安定性を提供する。ジストロフィン遺伝子は、遺伝子座Ｘｐ２１の２．２メガ塩基である。一次転写物は、約２，４００ｋｂであり、成熟したｍＲＮＡは、約１４ｋｂである。７９個のエクソンが、３５００超のアミノ酸であるタンパク質をコードする。正常な骨格筋組織は、ほんの少しの量のジストロフィンしか含有しないが、ジストロフィンの欠如または異常発現により、重度および不治の症状が発症する。ジストロフィン遺伝子内のいくつかの変異により、罹患した患者では、ジストロフィン欠損および重度のジストロフィー表現型がもたらされる。ジストロフィン遺伝子内のいくつかの変異により、罹患した患者では、部分的に機能性のジストロフィンタンパク質およびかなり軽度のジストロフィー表現型がもたらされる。

特定の実施形態では、「機能性遺伝子」は、機能性タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡに転写される遺伝子を指す。

特定の実施形態では、「部分的に機能性の」タンパク質は、変異遺伝子（例えば、変異ジストロフィン遺伝子）によってコードされ、かつ、機能性タンパク質よりも低いが非機能性タンパク質よりも高い生物活性を有するタンパク質を指す。

ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子内のナンセンスまたはフレームシフト変異をもたらす、遺伝性突然変異または自然突然変異の結果である。天然に存在する変異およびその結果は、ＤＭＤについて、比較的よく理解されている。桿状ドメイン内に含有されるエクソン４５～５５領域（例えばエクソン５１）内に生じるインフレーム欠失は、高度に機能性のジストロフィンタンパク質を産生することができ、多くの保因者は無症候であるか、軽い症状を呈することが公知である。さらに、６０％超の患者は、理論上は、ジストロフィン遺伝子のこの領域内のエクソンを標的にする（例えば、エクソン５１を標的にする）ことによって治療することができる。ｍＲＮＡスプライシング中に非必須エクソンをスキップし（例えば、エクソン５１スキッピング）、内部的に欠損しているが機能性のジストロフィンタンパク質を産生させることによって、ＤＭＤ患者における破壊されたジストロフィン読み枠を修復する取り組みが行われている。内部ジストロフィンエクソンの欠失（例えば、エクソン５１の欠失）は、適切な読み枠を保持するが、それほど重症ではないベッカー型筋ジストロフィーを引き起こす。

特定の実施形態では、読み枠を修復するためのエクソン５１の改変（例えば、例えばＮＨＥＪによるエクソン５１の欠失または切除）は、ＤＭＤ対象の最大１７％、また、欠失変異を有するＤＭＤ対象の最大２１％の表現型を回復させる（Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ２００９；３０：１６５７－１６６６．Ａａｒｔｓｍａ－Ｒｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ２００９；３０：２９３－２９９．Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ２０１５；３６（２））。

特定の実施形態では、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１は、ジストロフィン遺伝子の５１番目のエクソンを指す。エクソン５１は、ＤＭＤ患者では、フレーム破壊欠失に頻繁に隣接しており、オリゴヌクレオチドに基づくエクソンスキッピングについての臨床試験において標的とされている。エクソン５１スキッピング化合物エテプリルセンについての臨床試験は、最近、ベースラインと比較して平均４７％のジストロフィン陽性線維を伴う、４８週にわたる有意な機能性の利益を報告した。エクソン５１の変異は、ＮＨＥＪに基づくゲノム編集による永続的な修正に理想的に適している。

２．２．ジストロフィン遺伝子に特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）に特異的であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする。「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート」および「ＣＲＩＳＰＲ」は、本明細書で互換的に使用される場合、配列決定された細菌の約４０％および配列決定された古細菌の９０％のゲノムで見られる複数の短いダイレクトリピートを含む遺伝子座を指す。ＣＲＩＳＰＲ系は、ある形態の獲得免疫を提供する、侵入するファージおよびプラスミドに対する防御に関与する、微生物ヌクレアーゼ系である。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ介在性の核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子と、ノンコーディングＲＮＡエレメントとの組み合わせを含有する。スペーサーと呼ばれる、外来ＤＮＡの短い部分が、ゲノムのＣＲＩＳＰＲリピート間に組み込まれ、過去の曝露の「メモリー」として働く。Ｃａｓ９は、ｓｇＲＮＡの３’末端との複合体を形成し、このタンパク質－ＲＮＡ対は、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端と、プロトスペーサーとして公知であるあらかじめ定義された２０ｂｐ ＤＮＡ配列との間の相補的塩基対合によって、そのゲノム上の標的を認識する。この複合体は、ｃｒＲＮＡ内のコードされた領域を介して、病原体ＤＮＡの相同遺伝子座、すなわち、病原体ゲノム内のプロトスペーサー、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）（ＰＡＭ）に誘導される。ノンコーディングＣＲＩＳＰＲアレイは、ダイレクトリピート内で転写および切断されて、個々のスペーサー配列を含有する短いｃｒＲＮＡとなり、これが、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位（プロトスペーサー）に誘導する。発現されるｓｇＲＮＡの２０ｂｐ認識配列を単に交換することによって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、ゲノム上の新しい標的に誘導することができるようになる。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、真核生物におけるＲＮＡｉと同様の方式で外来性遺伝因子を認識および発現停止させるために使用される。

特定の実施形態では、相補性は、互いに逆平行に整列させた時に各位置のヌクレオチド塩基が相補的となるような、２つの核酸配列間に共有される性質を指す。

３つのクラスのＣＲＩＳＰＲ系（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型エフェクター系）が公知である。ＩＩ型エフェクター系は、単一のエフェクター酵素、Ｃａｓ９を使用して、４つの連続的ステップで、標的ＤＮＡ二本鎖破壊を行って、ｄｓＤＮＡを切断する。複合体として作用する複数の異なるエフェクターを必要とするＩ型およびＩＩＩ型エフェクター系と比較して、ＩＩ型エフェクター系は、真核細胞などの代替状況において機能することができる。ＩＩ型エフェクター系は、長い前駆‐ｃｒＲＮＡ（これは、スペーサー含有ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される）、Ｃａｓ９タンパク質、およびｔｒａｃｒＲＮＡ（これは、前駆‐ｃｒＲＮＡプロセシングに関与する）からなる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、前駆‐ｃｒＲＮＡのスペーサーを隔てている反復領域とハイブリッド形成し、したがって、内在性ＲＮａｓｅ ＩＩＩによるｄｓＲＮＡ切断を開始する。この切断に、Ｃａｓ９による各スペーサー内の第２の切断現象が続き、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９と結合されたままである成熟ｃｒＲＮＡが産生され、Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が形成される。

Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ＤＮＡ二重鎖をほどき、ｃｒＲＮＡとの配列マッチングを探索して切断する。標的認識は、標的ＤＮＡ内の「プロトスペーサー」配列と、ｃｒＲＮＡ内の残存するスペーサー配列との間の相補性の検出時に発生する。Ｃａｓ９は、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）もプロトスペーサーの３’末端に存在する場合に、標的ＤＮＡの切断を媒介する。プロトスペーサーターゲティングについては、配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、すなわちＤＮＡ切断に必要とされるＣａｓ９ヌクレアーゼによって認識される短い配列の直後でなければならない。別のＩＩ型系は、異なるＰＡＭ要件を有する。化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ系は、５’－ＮＲＧ－３’（ここで、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかである）としての、かつ、ヒト細胞におけるこの系の特異性を特徴付ける、このＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）のためのＰＡＭ配列を有することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの独自の能力は、２つ以上のｇＲＮＡを伴う単一のＣａｓ９タンパク質を同時発現させることによって、複数の異なるゲノム上遺伝子座を同時に標的にする、直接的な能力である。例えば、遺伝子改変された系において、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型系は、本来は「ＮＧＧ」配列（ここで、「Ｎ」は、いずれかのヌクレオチドであり得る）を使用することを好むが、「ＮＡＧ」などの他のＰＡＭ配列も受け入れられる（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１３）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７）。同様に、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）は、通常、ＮＮＮＮＧＡＴＴ（配列番号１７）という天然のＰＡＭを有するが、高度に縮重したＮＮＮＮＧＮＮＮ（配列番号１８）ＰＡＭを含めた様々なＰＡＭにわたって活性を有する（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１３）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２６８１）。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２２）を認識し、この配列の１～１０（例えば３～５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２３）を認識し、この配列の１～１０（例えば３～５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２４）を認識し、この配列の１～１０（例えば３～５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２５）を認識し、この配列の１～１０（例えば３～５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。上述の実施形態では、Ｎは任意のヌクレオチド残基であり得、例えばＡ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれかであり得る。Ｃａｓ９分子を操作して、このＣａｓ９分子のＰＡＭ特異性を変更することができる。

化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の遺伝子改変された形態のＩＩ型エフェクター系は、ゲノム工学のために、ヒト細胞において機能することが示された。この系では、Ｃａｓ９タンパク質は、合成によって再構成された「ガイドＲＮＡ」（「ｇＲＮＡ」、また、本明細書ではキメラ一本鎖ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）と互換的に使用され、一般に、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ およびｃｒＲＮＡプロセシングの必要性を不要にするｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ融合体である）によって、ゲノム上の標的部位に誘導された。本明細書で提供するのは、ゲノム編集、および遺伝性疾患の治療における使用のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく編集システムである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく編集システムは、遺伝性疾患、老化、組織再生、または創傷治癒に関与する遺伝子を含めた、あらゆる遺伝子を標的にするように設計することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質と、少なくとも１つのｇＲＮＡとを含むことができる。特定の実施形態では、システムは２種のｇＲＮＡ分子を含む。Ｃａｓ９融合タンパク質は、例えば、トランス活性化ドメインなどの、Ｃａｓ９にとって内在性であるものとは異なる活性を有するドメインを含むことができる。
標的遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子、例えばヒトジストロフィン遺伝子）は、細胞の分化にもしくは遺伝子の活性化が所望され得る任意の他のプロセスに関与し得る、または変異（例えばフレームシフト変異もしくはナンセンス変異）を有し得る。この標的遺伝子が、未成熟終止コドン、異所性スプライス受容部位または異所性スプライス供与部位を生じる変異を有する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムを、この未成熟終止コドン、異所性スプライス受容部位または異所性スプライス供与部位の上流または下流のヌクレオチド配列を認識してこの配列に結合するように設計することができる。このＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９に基づくシステムを使用して、スプライス受容体またはスプライス供与体を標的として未成熟終止コドンのスキッピングを誘導することによりまたは破壊された読み枠を回復させることにより正常な遺伝子スプライシングを破壊することもできる。このＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９に基づくシステムは、ゲノムのタンパク質コード領域へのオフターゲット変化を媒介する場合もあるし媒介しない場合もある。

２．２．１ Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９融合タンパク質
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質を含むことができる。Ｃａｓ９タンパク質は核酸を開裂するエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座によりコードされ、且つＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに関与する。Ｃａｓ９タンパク質は、以下が挙げられるがこれらに限定されないあらゆる細菌または古細菌の種に由来し得る：化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、アシドボラックス・アヴェナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ）、アクチノマイセス種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シクリフィルス・デニトリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．）、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンゲン（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレン（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコチイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリアセアエ・バクテリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロシスチス種（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）、メチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．）、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス種（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム種（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．）、シモンシエラ・ムエレ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、スポロラクトバチルス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、サブドリグラヌルム種（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｓｐ．）、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．）またはベルミネフロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子である。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である。

あるいはまたはさらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムは、融合タンパク質を含むことができる。融合タンパク質は、第１のポリペプチドドメインが、Ｃａｓタンパク質を含み、かつ第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、核酸会合活性、メチル化酵素活性、または脱メチル化酵素活性などの活性を有する、２つの異種ポリペプチドドメインを含むことができる。融合タンパク質は、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、核酸会合活性、メチル化酵素活性、または脱メチル化酵素活性などの活性を有する第２のポリペプチドドメインと融合された、Ｃａｓ９タンパク質または変異したＣａｓ９タンパク質を含むことができる。

（１）転写活性化活性
第２のポリペプチドドメインは、転写活性化活性、すなわち、トランス活性化ドメインを有することができる。例えば、ヒト遺伝子などの内在性の哺乳類遺伝子の遺伝子発現は、ｉＣａｓ９とトランス活性化ドメインとの融合タンパク質を、ｇＲＮＡの組み合わせを介して哺乳類のプロモーターに標的化させることによって達成することができる。トランス活性化ドメインには、ＶＰ１６タンパク質、ＶＰ１６の倍数タンパク質、例えばＶＰ４８ドメインもしくはＶＰ６４ドメインなど、またはＮＦ κＢ転写活性化因子活性のｐ６５ドメインが含まれ得る。例えば、融合タンパク質は、ｉＣａｓ９－ＶＰ６４であり得る。

（２）転写抑制活性
第２のポリペプチドドメインは、転写抑制活性を有することができる。第２のポリペプチドドメインは、クルッペル関連ボックス（Ｋｒｕｐｐｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｏｘ）活性、例えばＫＲＡＢドメインなど、ＥＲＦリプレッサードメイン活性、Ｍｘｉｌリプレッサードメイン活性、ＳＩＤ４Ｘリプレッサードメイン活性、Ｍａｄ－ＳＩＤリプレッサードメイン活性、またはＴＡＴＡボックス結合タンパク質活性を有することができる。例えば、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢであり得る。

（３）転写終結因子活性
第２のポリペプチドドメインは、転写終結因子活性を有することができる。第２のポリペプチドドメインは、真核生物翻訳終結因子（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｅｌｅａｓｅ ｆａｃｔｏｒ）１（ＥＲＦ１）活性または真核生物翻訳終結因子３（ＥＲＦ３）活性を有することができる。

（４）ヒストン修飾活性
第２のポリペプチドドメインは、ヒストン修飾活性を有することができる。第２のポリペプチドドメインは、ヒストン脱アセチル化酵素、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱メチル化酵素、またはヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有することができる。ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、ｐ３００もしくはＣＲＥＢ－結合タンパク質（ＣＢＰ）タンパク質、またはその断片であり得る。例えば、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９－ｐ３００であり得る。

（５）ヌクレアーゼ活性
第２のポリペプチドドメインは、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性とは異なるヌクレアーゼ活性を有することができる。ヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼ活性を有するタンパク質は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することが可能な酵素である。ヌクレアーゼは、通常、さらにエンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼに分類されるが、いくつかの酵素は、どちらのカテゴリーにも属することができる。よく知られているヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼである。

（６）核酸会合活性
第２のポリペプチドドメインは、核酸会合活性を有することができる。または、核酸結合タンパク質－ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、二本鎖または一本鎖ＤＮＡを認識する少なくとも１つのモチーフを含有する、独立に折り畳まれたタンパク質ドメインである。ＤＢＤは、特定のＤＮＡ配列（認識配列）を認識する、またはＤＮＡに対する一般的親和性を有することができる。核酸会合領域は、ヘリックス－ターン－ヘリックス領域、ロイシンジッパー領域、ウィングドヘリックス領域、ウィングドヘリックス－ターン－ヘリックス領域、ヘリックス－ループ－ヘリックス領域、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、ジンクフィンガー、ＨＭＧ－ボックス、Ｗｏｒ３ドメイン、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインからなる群から選択される。

（７）メチル化酵素活性
第２のポリペプチドドメインは、メチル基を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、小分子、シトシン、またはアデニンに転移させることと関与するメチル化酵素活性を有することができる。第２のポリペプチドドメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含むことができる。

（８）脱メチル化酵素活性
第２のポリペプチドドメインは、脱メチル化酵素活性を有することができる。第２のポリペプチドドメインは、核酸、タンパク質（特にヒストン）、および他の分子から、メチル（ＣＨ３－）基を除去する酵素を含むことができる。あるいは、第２のポリペプチドは、ＤＮＡを脱メチル化するための機構において、メチル基をヒドロキシメチルシトシンに変換することができる。第２のポリペプチドは、この反応を触媒することができる。例えば、この反応を触媒する第２のポリペプチドは、Ｔｅｔ１であり得る。

Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質は、１種または複数種のｇＲＮＡ分子と相互作用し得、このｇＲＮＡ分子と共同して、標的ドメインを含む部位に局在化し、特定の実施形態ではＰＡＭ配列に局在化する。Ｃａｓ９分子またはＣａ９融合タンパク質のＰＡＭ配列を認識する能力を、例えば既に説明されている形質転換アッセイ（Ｊｉｎｅｋ ２０１２）を使用して決定することができる。

特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質の標的核酸と相互作用してこの標的核酸を開裂する能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は標的核酸中の配列である。特定の実施形態では、標的核酸の開裂はＰＡＭ配列の上流で起こる。異なる細菌種由来のＣａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えばＰＡＭ配列）を認識することができる。特定の実施形態では、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａ９分子は配列モチーフＮＧＧを認識し、この配列の１～１０（例えば３～５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する（例えばＭａｌｉ ２０１３を参照されたい）。特定の実施形態では、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＧＧＮＧ（配列番号１９）および／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）（配列番号２０）を認識し、これらの配列の１～１０（例えば３～５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する（例えばＨｏｒｖａｔｈ ２０１０；Ｄｅｖｅａｕ ２００８を参照されたい）。特定の実施形態では、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＧＧおよび／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２１）を認識し、この配列の１～１０（例えば３～５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する（例えばＤｅｖｅａｕ ２００８を参照されたい）。特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２２）を認識し、この配列の１～１０（例えば３～５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２３）を認識し、この配列の１～１０（例えば３～５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２４）を認識し、この配列の１～１０（例えば３～５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２５）を認識し、この配列の１～１０（例えば３～５）ｂｐ上流の標的核酸配列の開裂を指示する。上述の実施形態では、Ｎはあらゆるヌクレオチド残基であり得、例えばＡ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれかであり得る。Ｃａｓ９分子を操作して、このＣａｓ９分子のＰＡＭ特異性を変更することができる。

特定の実施形態では、ベクターは、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する少なくとも１種のＣａｓ９分子をコードする。特定の実施形態では、この少なくとも１種のＣａｓ９分子は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である。特定の実施形態では、この少なくとも１種のＣａｓ９分子は変異黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である。

Ｃａｓタンパク質を、ヌクレアーゼ活性が不活性化されるように変異させることができる。エンドヌクレアーゼ活性を有しない不活性化Ｃａｓ９タンパク質（「ｉＣａｓ９」、「ｄＣａｓ９」とも称される）は最近、立体障害を介して遺伝子発現を抑制するために、ｇＲＮＡによって細菌、酵母およびヒト細胞において遺伝子を標的としている。化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列に関連する例示的な変異として、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａおよび／またはＤ９８６Ａが挙げられる。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９配列に関連する例示的な変異として、Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａが挙げられる。特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子は変異黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である。特定の実施形態では、変異黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子はＤ１０Ａ変異を含む。この変異黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列を配列番号３４に示し、以下に記載する。

特定の実施形態では、変異黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子はＮ５８０Ａ変異を含む。この変異黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子をコードするヌクレオチド配列を配列番号３５に示し、以下に記載する。

Ｃａｓ９分子をコードする核酸は合成核酸配列であることができる。例えば、この合成核酸分子を化学的に改変することができる。この合成核酸配列はコドン最適化され得、例えば、少なくとも１つの非共通（ｎｏｎ－ｃｏｍｍｏｎ）コドンまたは低共通（ｌｅｓｓ－ｃｏｍｍｏｎ）コドンが共通コドンで置き換えられている。例えば、この合成核酸は、最適化されたメッセンジャーｍＲＮＡ（例えば、例えば本明細書で説明されている哺乳類の発現系での発現に最適化されている）の合成を指示することができる。

加えて、またはあるいは、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸は核局在化配列（ＮＬＳ）を含むことができる。核局在化配列は当分野で既知である。

化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子をコードする例示的なコドン最適化核酸配列を配列番号２６示し、以下に記載する。

化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子の対応するアミノ酸配列を配列番号２７に示し、以下に記載する。

黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子をコードする例示的なコドン最適化核酸配列を配列番号２８～３２に示し、以下に記載する。

配列番号２８を以下に記載する。

配列番号２９を以下に示す。

配列番号３０を以下に示す。

配列番号３１を以下に示す。

配列番号３２を以下に示す。

黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列を、以下に提供する配列番号３３に示す。

２．２．２．ｇＲＮＡ分子
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、例えば、２つのｇＲＮＡ分子を含む。ｇＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムのターゲティングを提供する。ｇＲＮＡは、２種のノンコーディングＲＮＡ：ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの融合体である。ｇＲＮＡは、相補的塩基対形成を介して、ターゲティング特異性を付与する２０ｂｐプロトスペーサーをコードする配列を所望のＤＮＡ標的と交換することによって、任意の所望のＤＮＡ配列を標的にすることができる。ｇＲＮＡは、ＩＩ型エフェクターシステムに含まれる天然に存在するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣する。この二重鎖は、例えば、４２ヌクレオチドのｃｒＲＮＡと７５ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡを含むことができ、Ｃａｓ９が標的核酸を切断するためのガイドとして作用する。本明細書で互換的に使用される「標的領域」、「標的配列」、または「プロトスペーサー」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムが標的にする標的遺伝子（例えばジストロフィン遺伝子）の領域を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムは、異なるＤＮＡ配列を標的にする、２つ以上のｇＲＮＡを含むことができる。これらの標的ＤＮＡ配列は、オーバーラップしていることが可能である。標的配列またはプロトスペーサーの後に、プロトスペーサーの３’末端のＰＡＭ配列が続く。別のＩＩ型システムは、異なるＰＡＭ要件を有する。

本開示の遺伝子コンストラクト（例えばＡＡＶベクター）によりコードされるｇＲＮＡ分子の数は、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも６個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも７個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも９個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１１個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１２個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１３個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１４個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１６個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１７個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４５個の異なるｇＲＮＡまたは少なくとも５０個の異なるｇＲＮＡであることができる。本開示のベクターによりコードされるｇＲＮＡの数は、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも５０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも４５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも４０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも３５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも３０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも２５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも２０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも１６個の異なるｇＮＲＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも１２個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ～少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個のｇＲＮＡ～少なくとも５０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも４５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも４０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも３５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも３０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも２５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも２０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも１６個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも１２個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも５０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも４５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも４０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも３５個の異なるｇＲＮＡ、８個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも３０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも２５個の異なるｇＲＮＡ、８個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも２０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも１６個の異なるｇＲＮＡ、または８個の異なるｇＲＮＡ～少なくとも１２個の異なるｇＲＮＡであることができる。特定の実施形態では、この遺伝子コンストラクト（例えばＡＡＶベクター）は、１種のｇＲＮＡ分子（即ち第１のｇＲＮＡ分子）と任意選択でＣａｓ９分子とをコードする。特定の実施形態では、遺伝子コンストラクト（例えばＡＡＶベクター）は、２つのｇＲＮＡ分子、すなわち、第１のｇＲＮＡ分子、および第２のｇＲＮＡ分子をコードする。

ｇＲＮＡ分子はターゲティングドメインを含み、このターゲティングドメインは、ＰＡＭ配列が続く標的ＤＮＡ配列の相補ポリヌクレオチド配列である。ｇＲＮＡは、ターゲッティングドメインの５’末端で「Ｇ」を含むことができる。ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、少なくとも１０個の塩基対、少なくとも１１個の塩基対の少なくとも１２個の塩基対、少なくとも１３個の塩基対、少なくとも１４個の塩基対、少なくとも１５個の塩基対、少なくとも１６個の塩基対、少なくとも１７個の塩基対、少なくとも１８個の塩基対、少なくとも１９個の塩基対、少なくとも２０個の塩基対、少なくとも２１個の塩基対、少なくとも２２個の塩基対、少なくとも２３個の塩基対、少なくとも２４個の塩基対、少なくとも２５個の塩基対、少なくとも３０個の塩基対、または少なくとも３５個の塩基対であることができる。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは１９～２４個のヌクレオチドの長さを有する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは２１個のヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは２２個のヌクレオチドの長さである。

ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子のエクソン、イントロン、プロモーター領域、エンハンサー領域、転写領域のうちの少なくとも１つを標的とすることができる。特定の実施形態では、このｇＲＮＡ分子はヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５０を標的とする。特定の実施形態では、このｇＲＮＡ分子はヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５１を標的とする。

２．２．３．ジストロフィン遺伝子を変更すること
本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）を標的にする少なくとも１つのｇＲＮＡ分子をコードする。この少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、標的領域と結合および認識することができる。標的領域は、修復プロセス中の挿入または欠失が、フレーム変換によってジストロフィン読み枠を修復するように、潜在的なアウトオブフレーム終止コドンのすぐ上流に選択することができる。標的領域はまた、修復プロセス中の挿入または欠失が、スプライス部位破壊およびエクソン排除によって、スプライシングを妨害し、ジストロフィン読み枠を修復するような、スプライス受容部位またはスプライス供与部位であり得る。標的領域はまた、修復プロセス中の挿入または欠失が、終止コドンを除去または破壊することによってジストロフィン読み枠を修復するような、異所性終止コドンであり得る。

単一のまたは多重のｇＲＮＡを、エクソン５１での変異ホットスポットを標的とすることにより、またはおよびエクソン内の小さい挿入および欠失を導入することにより、またはエクソン５１の排除により、ジストロフィン読み枠を回復させるように設計することができる。本開示のベクターによる処理後、インビトロで、デュシェンヌ患者の筋肉細胞中においてジストロフィン発現を回復させることができる。遺伝的に修正された患者細胞の免疫不全マウスへの移植後に、ヒトジストロフィンをインビボで検出した。意義深いことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの特有の多重遺伝子編集能力は、普遍的なまたは患者特異的な遺伝子編集アプローチにより患者の変異の最大６２％を修正し得る、この変異ホットスポット領域の大きな欠失を効率的に生じさせることを可能にする。

本開示のベクターは、ジストロフィン遺伝子、例えばヒトジストロフィン遺伝子内の欠失をもたらすことができる。特定の実施形態では、このベクターは、ジストロフィン遺伝子の標的位置に隣接する２つのイントロン（第１のイントロンおよび第２のイントロン）内に２つの二本鎖切断（第１の二本鎖切断および第２の二本鎖切断）を形成することによってジストロフィン標的位置を含むジストロフィン遺伝子のセグメントを欠失させるように構成される。「ジストロフィン標的位置」は、本明細書に記載した通りのジストロフィンエクソン標的位置またはジストロフィンエクソン内標的位置であり得る。ジストロフィンエクソン標的位置の欠失は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している対象のジストロフィン配列を最適化することができる。例えば、これは、コードされるジストロフィンタンパク質の機能または活性を増大させる、または、対象の疾患状態の改善をもたらすことができる。特定の実施形態では、ジストロフィンエクソン標的位置の切除は、読み枠を修復する。ジストロフィンエクソン標的位置は、ジストロフィン遺伝子の１つ以上のエクソンを含むことができる。特定の実施形態では、ジストロフィン標的位置は、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）のエクソン５１を含む。

特定の実施形態では、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、筋変性および最終的に死をもたらす、劣性遺伝の致死的なＸ連鎖性障害を指す。ＤＭＤは、一般的な遺伝性の単一遺伝子性疾患であり、男性の３５００人に１人に発症する。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子のナンセンスまたはフレームシフト変異をもたらす、遺伝性変異または自然突然変異の結果である。ＤＭＤを引き起こすジストロフィン変異の大多数は、ジストロフィン遺伝子において読み枠を破壊して早期翻訳終結を引き起こす、エクソンの欠失である。ＤＭＤ患者は、典型的には、小児期に自分自身の身体を支える能力を失い、１０代の間に次第に筋力が低下するようになり、２０代で死亡する。

本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）のエクソン５１での非常に効率的な遺伝子編集を媒介することができる。本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、ＤＭＤ患者由来の細胞におけるジストロフィンタンパク質発現を修復する。

エクソン５１は、ＤＭＤでは、フレーム破壊欠失に頻繁に隣接している。エクソンスキッピングによる、ジストロフィン転写物からのエクソン５１の除去を使用して、全てのＤＭＤ患者のおよそ１５％を治療することができる。このクラスのジストロフィン変異は、ＮＨＥＪに基づくゲノム編集およびＨＤＲによる永続的な修正に理想的に適している。本明細書に記載した遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、ヒトジストロフィン遺伝子内のエクソン５１の標的とされる改変のために開発されてきた。本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、ヒトＤＭＤ細胞に導入され、読み枠を修正するための効率的な遺伝子改変および変換を媒介する。タンパク質修復は、フレーム修復に伴い、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムで処理された細胞の混合集団（ｂｕｌｋ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）において検出される。

特定の実施形態では、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、２個で一組のｇＲＮＡ分子、すなわち、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子と、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのＰＡＭを認識する少なくとも１つのＣａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質とをコードし、ここでは、ベクターは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１にそれぞれ隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成することによってエクソン５１を含むジストロフィン遺伝子のセグメントを欠失させるように構成される。

本開示のベクターの欠失効率は、欠失サイズ、すなわち、ベクターによって欠失されるセグメントのサイズに関連し得る。特定の実施形態では、具体的な欠失の長さまたはサイズは、標的とされる遺伝子（例えばジストロフィン遺伝子）内のＰＡＭ配列間の距離によって決定される。特定の実施形態では、ジストロフィン遺伝子のセグメントの具体的な欠失は、その長さ、およびそれが含む配列（例えばエクソン５１）に関して定義され、標的遺伝子（例えばジストロフィン遺伝子）内の特定のＰＡＭ配列に隣接して作製される切断の結果である。

特定の実施形態では、欠失サイズは、約８００～７２，０００塩基対（ｂｐ）、例えば、約８００～９００、約９００～１０００、約１２００～１４００、約１５００～２６００、約２６００～２７００、約３０００～３３００、約５２００～５５００、約２０，０００～３０，０００、約３５，０００～４５，０００、または約６０，０００～７２，０００である。特定の実施形態では、欠失サイズは、約８００～９００、約１５００～２６００、約５２００～５５００、約２０，０００～３０，０００、約３５，０００～４５，０００、または約６０，０００～７２，０００ｂｐである。特定の実施形態では、欠失サイズは、８０６塩基対、８６７塩基対、１，５５７塩基対、２，５２７塩基対、５，３０５塩基対、５，４１５塩基対、２０，７６８塩基対、２７，３９８塩基対、３６，３４２塩基対、４４，２６９塩基対、６０，８９４塩基対、または７１，８３２塩基対である。特定の実施形態では、欠失サイズは、約９００～１０００、約１２００～１４００、約１５００～２６００、約２６００～２７００ｂｐ、または約３０００～３３００である。特定の実施形態では、欠失サイズは、９７２ｂｐ、１７２３ｂｐ、８９３ｂｐ、２６６５ｂｐ、１３２６ｂｐ、２０７７ｂｐ、１２４７ｂｐ、３０１９ｂｐ、１５８９ｂｐ、２３４０ｂｐ、１８５２ｂｐ、および３２８２ｂｐからなる群から選択される。特定の実施形態では、欠失サイズは、約１５０キロ塩基対（ｋｂ）よりも大きい、例えば、約３００～４００ｋｂである。特定の実施形態では、欠失サイズは、約３００～４００ｋｂである。特定の実施形態では、欠失サイズは、３４１ｋｂである。特定の実施形態では、欠失サイズは、約１００～１５０ｋｂである。特定の実施形態では、欠失サイズは、１４６，５００ｂｐである。

特定の実施形態では、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、少なくとも１つのＣａｓ９分子またはＣａｓ９融合タンパク質と、それぞれその内容全体が参照によって組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１６／０２５７３８号明細書に開示されている、表１から選択される２個で一組のｇＲＮＡ分子とをコードする。

特定の実施形態では、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、少なくとも１つのＣａｓ９分子、第１のｇＲＮＡ分子、および第２のｇＲＮＡ分子をコードし、ここでは、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、以下からなる群から選択される：
（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉ）配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｉｉ）配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｖ）配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖ）配列番号７に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉ）配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉｉ）配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｖｉｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｉｘ）配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｘ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
（ｘｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに（ｘｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子からなる群から選択される。

特定の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、改変されたＡＡＶベクターである。改変されたＡＡＶベクターは、増進された心筋および骨格筋組織指向性を有することができる。改変されたＡＡＶベクターは、哺乳類の細胞において、本明細書に記載したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達および発現させることができる。例えば、改変されたＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－ＳＡＳＴＧベクターであり得る（Ｐｉａｃｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：６３５－６４６）。改変されたＡＡＶベクターは、本明細書に記載したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを、骨格筋および心筋にインビボで送達することができる。改変されたＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９を含めた１つ以上のいくつかのカプシド型に基づくことができる。改変されたＡＡＶベクターは、全身および局所送達によって骨格筋または心筋に効率的に形質導入する、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧベクターなどの、代替の筋肉指向性のＡＡＶカプシドを有するＡＡＶ２シュードタイプに基づくものであり得る（Ｓｅｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１２：１３９－１５１）。

３．組成物
本開示の主題は、上に記載した遺伝子ベクターを含む組成物を提供する。この組成物は、医薬組成物中であり得る。この医薬組成物は、使用される投与方式に従って製剤化することができる。医薬組成物が、注射用医薬組成物である場合、これは、無菌、パイロジェンフリー、かつ粒子状物質フリーである。等張性製剤が使用されることが好ましい。一般に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含むことができる。特定の実施形態では、リン酸緩衝生理食塩水などの等張性溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。特定の実施形態では、血管収縮剤が、製剤に添加される。

上記組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含むことができる。薬学的に許容し得る賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤としての機能性分子であり得る。薬学的に許容し得る賦形剤は、遺伝子導入促進剤（これには界面活性剤が含まれ得る）、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体（モノホスホリルリピドＡを含めて）、ムラミルペプチド、キノン類似体、ベシクル、例えばスクアレンおよびスクアレン、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知の遺伝子導入促進剤であり得る。

遺伝子導入促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めて）、または脂質である。遺伝子導入促進剤は、ポリ－Ｌ－グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ－Ｌ－グルタミン酸は、骨格筋または心筋におけるゲノム編集のための組成物中に、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。遺伝子導入促進剤はまた、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体（モノホスホリルリピドＡを含めて）、ムラミルペプチド、キノン類似体、およびベシクル、例えばスクアレンおよびスクアレンを含むことができ、また、遺伝子コンストラクトと共に、ヒアルロン酸も使用することができる。特定の実施形態では、上記組成物をコードするＤＮＡベクターはまた、遺伝子導入促進剤、例えば脂質、リポソーム（レシチンリポソーム、もしくは当技術分野で公知の他のリポソームを含めて）、ＤＮＡ－リポソーム混合物としてのもの（例えば国際公開第０９３２４６４０号パンフレット参照）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、または他の公知の遺伝子導入促進剤を含むことができる。好ましくは、遺伝子導入促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めて）、または脂質である。１７．

４．変異遺伝子を修正するおよび対象を治療する方法
本開示の主題は、対象における変異遺伝子を修正する方法を提供する。

特定の実施形態では、修正することは、切断されているタンパク質をコードするまたはタンパク質をまったくコードしない変異遺伝子を、完全長の機能性または部分的に完全長の機能性タンパク質発現が得られるように変化させることを含む。変異遺伝子を修正することは、変異を有する遺伝子の領域を置き換えること、または変異遺伝子全体を、相同組換え修復（ＨＤＲ）などの修復機構を用いて、変異を有しない遺伝子のコピーと置き換えることを含むことができる。変異遺伝子を修正することはまた、この遺伝子内の二本鎖切断をもたらし、次いでこの遺伝子を非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用して修復することによって、未成熟終止コドン、異所性スプライス受容部位、または異所性スプライス供与部位をもたらすフレームシフト変異を修復することを含むことができる。ＮＨＥＪは、修復中に少なくとも１つの塩基対を付加または欠失させることができ、これは、適切な読み枠を修復するおよび未成熟終止コドンを除去することができる。変異遺伝子を修正することはまた、異所性スプライス受容部位またはスプライス供与配列を破壊することを含むことができる。修正することはまた、２つのヌクレアーゼ標的部位間のＤＮＡを除去することによって、適切な読み枠を修復するために、同じＤＮＡ鎖上での２種のヌクレアーゼの同時作用によって、非必須遺伝子セグメントを欠失させることと、ＮＨＥＪによってＤＮＡ切断を修復することとを含むことができる。

特定の実施形態では、「相同組換え修復」または「ＨＤＲ」は、大抵は細胞周期のＧ２およびＳ期において、ＤＮＡの相同の断片が核内に存在する場合に、二本鎖ＤＮＡ損傷を修復するための、細胞における機構を指す。ＨＤＲは、修復を誘導するためのドナーＤＮＡ鋳型を使用し、また、ゲノムに対する特定の配列変化（全遺伝子の、標的とされる付加を含めて）を作り出すために使用することができる。ドナー鋳型が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムと共に提供される場合、細胞機構は、相同組換えによって切断を修復することとなり、これは、ＤＮＡ切断の存在下で、数桁増強される。相同のＤＮＡ断片が存在しない場合、代わりに非相同末端結合が起こり得る。

特定の実施形態では、ドナーＤＮＡまたはドナー鋳型は、対象となる遺伝子の少なくとも一部分を含む二本鎖ＤＮＡ断片または分子を指す。ドナーＤＮＡは、完全に機能性のタンパク質または部分的に機能性のタンパク質をコードすることができる。

特定の実施形態では、「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路」は、相同の鋳型を必要とせずに、切断末端を直接的に連結することによって、ＤＮＡ内の二本鎖切断を修復する経路を指す。ＮＨＥＪによる、鋳型に依存しないＤＮＡ末端の再連結は、ＤＮＡ切断点にランダムな微小挿入および微小欠失（インデル）を導入する、確率的な、誤りがちな修復プロセスである。この方法は、標的とされる遺伝子配列を意図的に破壊する、欠失させる、または読み枠変更するために使用することができる。ＮＨＥＪは、典型的には、修復を誘導するための、マイクロホモロジーと呼ばれる短い相同のＤＮＡ配列を使用する。これらのマイクロホモロジーは、しばしば、二本鎖切断の末端の単鎖オーバーハング中に存在する。このオーバーハングが完璧に適合する場合、ＮＨＥＪは通常、切断を正確に修復し、一方で、ヌクレオチドの喪失をもたらす不正確な修復も起こり得るが、これは、オーバーハングが適合しない場合には、はるかに一般的である。特定の実施形態では、ＮＨＥＪは、ヌクレアーゼ介在性のＮＨＥＪであり、これは、特定の実施形態では、Ｃａｓ９分子が二本鎖ＤＮＡを切断して開始されるＮＨＥＪを指す。本方法は、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはそれを含む組成物を、骨格筋または心筋におけるゲノム編集のために、対象の骨格筋または心筋に投与することを含む。特定の実施形態では、ゲノム編集は、変異遺伝子または正常遺伝子などの遺伝子をノックアウトすることを含む。ゲノム編集は、対象となる遺伝子を変化させることによって、疾患を治療する、または筋肉修復を増強するために使用することができる。

本明細書に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを骨格筋または心筋に送達するための遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはそれを含む組成物の使用は、修復鋳型またはドナーＤＮＡ（これらは、遺伝子全体、または変異を含有する領域を置き換えることができる）と共に、完全に機能性または部分的に機能性のタンパク質の発現を修復することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、標的とされるゲノム遺伝子座に部位特異的二本鎖切断を導入するために使用することができる。部位特異的二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、標的ＤＮＡ配列に結合し、それによって標的ＤＮＡの切断が可能になる場合にもたらされる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムは、その高速の成功裡かつ効率的な遺伝子改変のおかげで、ゲノム編集の進歩という利点を有する。このＤＮＡ開裂は天然のＤＮＡ修復機構を刺激し得、以下の２つの可能な修復経路のうちの１つをもたらす：相同組換え修復（ＨＤＲ）経路または非相同末端結合（ＮＨＥ Ｊ）経路。

本開示の主題は、修復鋳型を伴わないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによる遺伝子編集を対象とし、この遺伝子編集により、読み枠を効率的に修正し、遺伝性疾患に関与する機能的タンパク質の発現を回復させることができる。本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、相同組換え修復またはヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に基づく修正手法（これらは、相同組換えまたは選択に基づく遺伝子修正を受け入れない可能性がある、増殖が制限された初代細胞株における効率的な修正を可能にする）の使用を含むことができる。この戦略は、活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの迅速且つ頑強なアセンブリを、フレームシフト、未成熟終止コドン、異所性スプライス供与部位または異所性スプライス受容部位を生じる非必須コード領域中の変異により生じる遺伝性疾患の処置に効率的な遺伝子編集方法と統合する。

内因性の変異遺伝子からのタンパク質発現の回復は、鋳型なしのＮＨＥＪ介在性のＤＮＡ修復によるものであることができる。標的遺伝子ＲＮＡを標的とする一過性の方法とは対照的に、過渡的に発現されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるゲノム中の標的遺伝子読み枠の修正により、それぞれ改変された細胞およびその後代の全てによって、永久に回復された標的遺伝子発現をもたらすことができる。

ヌクレアーゼ介在性のＮＨＥＪ遺伝子修正は、変異した標的遺伝子を修正し、ＨＤＲ経路に勝る、いくつかの潜在的利点を提供することができる。例えば、ＮＨＥＪは、非特異的挿入変異をもたらす可能性があるドナー鋳型を必要としない。ＨＤＲと対照的に、ＮＨＥＪは、細胞周期の全ての期において効率的に作動するので、循環と、有糸分裂後の細胞（筋線維など）との両方において効率的に利用することができる。これは、オリゴヌクレオチドに基づくエクソンスキッピング、または終止コドンの薬物によって強いられるリードスルーに代わる、頑強な永続的な遺伝子修復を提供し、理論上はわずか１つの薬物治療しか必要としない可能性がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムを使用する、ＮＨＥＪに基づく遺伝子修正は、本明細書に記載したプラスミド電気穿孔手法に加えて、細胞および遺伝子に基づく療法のための他の既存のエクスビボおよびインビボプラットフォームと組み合わせることができる。例えば、ｍＲＮＡに基づく遺伝子導入による、または、精製された細胞透過性タンパク質としてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムの送達は、挿入変異のいかなる可能性も回避するであろうＤＮＡフリーのゲノム編集手法を可能にすることができる。

内在性の変異した遺伝子からのタンパク質発現の修復は、相同組換え修復を含むことができる。上に記載した通りの方法は、細胞にドナー鋳型を投与することをさらに含む。ドナー鋳型は、完全に機能性または部分的に機能性のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、ドナー鋳型は、小型化されたジストロフィンコンストラクト（ミニジストロフィン（「ｍｉｎｉｄｙｓ」）と呼ばれる）、変異ジストロフィン遺伝子を修復するための完全に機能性のジストロフィンコンストラクト、または相同組換え修復後に変異ジストロフィン遺伝子の修復をもたらすジストロフィン遺伝子の断片を含むことができる。

本開示の主題は、細胞における変異遺伝子（例えば、変異ジストロフィン遺伝子、例えば、変異ヒトジストロフィン遺伝子）を修正し、ＤＭＤなどの遺伝子疾患に罹患している対象を治療する方法を提供する。この方法は、上に記載した通りの本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはそれを含む組成物を、細胞または対象に投与することを含むことができる。

５．疾患を治療する方法
本開示の主題は、その必要がある対象を治療する方法を提供する。この方法は、上に記載した通りの本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはそれを含む組成物を、対象の組織に投与することを含む。特定の実施形態では、この方法は、上に記載した通りの本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはそれを含む組成物を、対象の骨格筋または心筋に投与することを含む。特定の実施形態では、対象は、変性もしくは筋力低下を引き起こす骨格筋または心筋状態、または遺伝子疾患に罹患している。特定の実施形態では、対象は、上に記載した通りのデュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している。ａ．デュシェンヌ型筋ジストロフィー

本方法は、上に記載した通り、ジストロフィン遺伝子を修正し、上記変異したジストロフィン遺伝子の完全に機能性または部分的に機能性のタンパク質発現を回復させるために使用することができる。ある種の態様および実施形態では、本開示の主題は、患者におけるＤＭＤの影響（例えば、臨床症状／徴候）を低減するための方法を提供する。ある種の態様および実施形態では、本開示の主題は、患者におけるＤＭＤを治療するための方法を提供する。ある種の態様および実施形態では、本開示の主題は、患者におけるＤＭＤを予防するための方法を提供する。ある種の態様および実施形態では、本開示の主題は、患者におけるＤＭＤのさらなる進行を予防するための方法を提供する。

６．送達の方法
本明細書で提供されるのは、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはそれを含む組成物を細胞に送達するための方法である。この送達は、細胞において発現され、かつ細胞の表面に送達される核酸分子としての、遺伝子コンストラクトまたはそれを含む組成物の遺伝子導入または電気穿孔であり得る。これらの核酸分子は、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅｌｌまたはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｌｉｂ装置または他の電気穿孔装置を使用して電気穿孔することができる。ＢｉｏＲａｄ電気穿孔溶液、Ｓｉｇｍａリン酸緩衝生理食塩水（製品＃Ｄ８５３７）（ＰＢＳ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（ＯＭ）、またはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｎ．Ｖ．）を含めた、いくつかの様々な緩衝液を使用することができる。遺伝子導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００などの遺伝子導入試薬を含むことができる。

遺伝子導入細胞は、組織への、したがってベクターの哺乳類の細胞への送達時に、少なくとも１つのＣａｓ９分子と２つのｇＲＮＡ分子を発現することとなる。遺伝子コンストラクトまたはそれを含む組成物を、哺乳類に投与して、遺伝子発現を変更する、またはゲノムを再操作もしくは変更することができる。例えば、遺伝子コンストラクトまたはそれを含む組成物を、哺乳類に投与して、哺乳類におけるジストロフィン遺伝子を修正することができる。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、スイギュウ、ウシ科動物（ｂｏｖｉｄ）、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。

少なくとも１つのＣａｓ９分子および２個で一組のｇＲＮＡ分子をコードする遺伝子コンストラクト（例えばベクター）を、インビボでの電気穿孔を伴うおよび伴わないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも称される）、リポソーム介在、ナノ粒子促進、ならびに／または組換えベクターにより哺乳類に送達することができる。この組換えベクターを任意のウイルス型により送達することができる。このウイルス型は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスおよび／または組換えアデノ随伴ウイルスであることができる。

本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を細胞に導入して、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）を遺伝的に修正することができる。特定の実施形態では、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を、ＤＭＤ患者由来の筋芽細胞に導入する。特定の実施形態では、遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物をＤＭＤ患者由来の繊維芽細胞に導入し、遺伝的に修正された繊維芽細胞をＭｙｏＤで処理して筋芽細胞への分化を誘導し得、この筋芽細胞を対象（例えば、対象の損傷を受けた筋肉）に移植して、修正されたジストロフィンタンパク質が機能することを検証し得る、および／または対象を処置し得る。この改変された細胞は、幹細胞（例えば、誘導された多能性幹細胞）、骨髄由来前駆細胞、骨格筋前駆細胞、ＤＭＤ患者由来のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３⁺細胞、中胚葉性血管芽細胞（ｍｅｓｏａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）、およびＭｙｏＤ形質導入細胞もしくはＰａｘ７形質導入細胞、または他の筋原性前駆細胞であることもできる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくシステムは、誘導された多能性幹細胞のニューロン分化または筋原性分化を引き起こすことができる。

６．投与の経路
本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはそれを含む組成物は、経口的に、非経口的に、舌下に、経皮的に、直腸内に、経粘膜的に、局所的に、吸入を介して、頬側投与を介して、胸膜内に、静脈内に、動脈内投与を介して、腹腔内投与を介して、皮下に、筋肉内投与を介して、鼻腔内投与を介して、くも膜下腔内投与を介して、関節内投与を介して、およびこれらの組み合わせを含めた、様々な経路によって、対象に投与することができる。特定の実施形態では、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）または組成物は、筋肉内に、静脈内に、またはこれらの組み合わせで、対象（例えば、ＤＭＤに罹患している対象）に投与される。獣医学的使用については、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）または組成物は、通常の獣医学診療に従って、適切に許容される製剤として投与することができる。獣医師は、ある特定の動物にとって最も適した投薬レジメンおよび投与の経路を容易に決定することができる。本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはそれを含む組成物は、従来のシリンジ、無針注射装置、「微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎｓ）」、または他の物理的方法、例えば電気穿孔（「ＥＰ」）、「水力学的方法」、または超音波によって投与することができる。

本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはそれを含む組成物は、インビボ電気穿孔を伴うおよび伴わないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）、リポソーム介在、ナノ粒子促進、組換えベクター（組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスなど）を含めたいくつかの技術によって、哺乳類に送達することができる。本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはそれを含む組成物は、骨格筋または心筋に注射することができる。例えば、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはそれを含む組成物は、前脛骨筋に注射することができる。

７．細胞型
これらの送達方法および／または送達の経路のいずれかを無数の細胞型（例えば、ＤＭＤの細胞に基づく治療用に現在研究中の細胞型）と共に利用することができ、この細胞型として以下が挙げられるがこれらに限定されない：不死化筋芽細胞、例えば野生型およびＤＭＤ患者由来の株、例えばΔ４８－５０ ＤＭＤ、ＤＭＤ８０３６（ｄｅｌ４８－５０）、Ｃ２５Ｃ１４およびＤＭＤ－７７９６細胞株、原発性ＤＭＤ皮膚線維芽細胞、誘導された多能性幹細胞、骨髄由来前駆細胞、骨格筋前駆細胞、ＤＭＤ患者由来のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３⁺細胞、中胚葉性血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉系前駆細胞、造血性幹細胞、平滑筋細胞、およびＭｙｏＤ形質導入細胞もしくはＰａｘ７形質導入細胞、または他の筋原性前駆細胞。ヒト筋原性細胞の不死化を使用して、遺伝的に修正された筋原性細胞のクローンを誘導することができる。細胞をエクスビボで改変して、遺伝的に修正されたジストロフィン遺伝子を含み且つゲノムのタンパク質コード領域中に他のヌクレアーゼ導入変異がない不死化ＤＭＤ筋芽細胞のクローン集団を単離して増殖させることができる。

本明細書で説明された本開示の方法の他の適切な改変および適応が容易に適用可能であり且つ認識可能であり、ならびに本開示または本明細書で開示された態様および実施形態の範囲から逸脱することなく適切な等価物を使用して行なわれ得ることが当業者に容易に明らかであるだろう。これまで本開示を詳細に説明したが、以下の実施例を参照することにより本開示がより明確に理解されるだろう。この実施例は、本開示のいくつかの態様および実施形態を説明することのみを単に意図しており、本開示の範囲を限定するとみなすべきではない。本明細書で言及される全ての学術誌参考文献、米国特許および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示の主題は複数の態様を有し、以下の非限定的な実施例により説明される。

実施例１－不死化ＤＭＤ患者筋芽細胞におけるＡＡＶベクターによるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１の欠失
それぞれが、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子と表１における１２種のｇＲＮＡ対リストから選択される一対のｇＲＮＡ分子とをコードする１２種のプラスミドＡＡＶベクターを作製した。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子Ｃａｓ９分子をコードする、コドン最適化された核酸配列は、配列番号２９に記載されている。１２種のプラスミドＡＡＶベクターのうち、ｇＲＮＡ対（８４＋６８）、（８２＋６８）、および（６２＋３８）をコードする３種のプラスミドＡＡＶベクターを、それぞれ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に遺伝子導入し、不死化ヒトＤＭＤ患者筋芽細胞に電気穿孔した。細胞を分化させ、ＲＮＡおよびタンパク質を収集した。ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡに対してエンドポイントＰＣＲおよびドロップレットデジタルＰＣＲを、タンパク質に対してウエスタンブロットを実施した。

方法および材料
エクソン４８～５０の欠失を含む不死化ヒトＤＭＤ患者筋芽細胞を、２０％ ＦＢＳ、１％抗生物質、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ、５０μｇ／ｍＬフェチュイン、１０ｎｇ／ｕｌヒト上皮増殖因子、１ｎｇ／ｍｌ塩基性ヒト線維芽細胞増殖因子、および１０μｇ／ｍｌヒトインスリンを添加した骨格筋培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）内で培養した。プラスミドを、不死化ヒトＤＭＤ患者筋芽細胞に電気穿孔した。例えば、不死化ヒトＤＭＤ患者筋芽細胞を、以前に最適化された条件を使用して、電気穿孔緩衝液としてＰＢＳを用いるＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸＣｅｌｌを使用して、１０μｇプラスミドを電気穿孔した。電気穿孔後、細胞を３日間インキュベートし、次いで、ゲノムＤＮＡを、ＤＮＥａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを使用して回収および収集した。ドロップレットデジタルＰＣＲ（「ｄｄＰＣＲ」）のために、５０ｎｇのゲノムＤＮＡを使用した。プラスミドの欠失効率を、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１６／０２５７３８号明細書に記載されている通りに、ｄｄＰＣＲによって測定した。欠失バンドを検出するためのエンドポイントＰＣＲのために、１００ｎｇのゲノムＤＮＡを使用した。検出された欠失バンドについて、配列決定を実施した。

残りの電気穿孔した筋芽細胞を、標準の培養培地を、１％抗生物質と１％インスリン－トランスフェリン－セレンを添加したＤＭＥＭと置き換えることによって、筋線維に分化させた。細胞を、６～７日間、分化させ、次いで、ＲＮＥａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用してＲＮＡを単離した。ＲＮＡを、ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キットを使用してｃＤＮＡに逆転写した。タンパク質を、収集、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＲＩＰＡ緩衝液への溶解によって、分化した細胞から回収した。試料を、４～１２％ ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（ＭＥＳ緩衝液中）に流した。タンパク質を、ニトロセルロース膜に転写し、次いで、ウエスタンブロットを、少なくとも１時間ブロッキングした。ジストロフィン発現のために使用した一次抗体は、１：１０００のＭＡＮＤＹＳ８であった。

結果
遺伝子導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ｇＲＮＡ対（８４＋６８）、（８２＋６８）、および（６２＋３８）をそれぞれコードする３種のプラスミドＡＡＶベクターの欠失効率を、図１に示す。不死化ＤＭＤ患者筋芽細胞における、これらの３種のプラスミドＡＡＶベクターの欠失効率を、図２に示す。遺伝子導入したＨ２９３Ｔ細胞と不死化ＤＭＤ患者筋芽細胞の両方について、陰性対照として黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を使用した。筋芽細胞欠失効率は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞欠失効率とよく相関していた。

プラスミドＡＡＶベクターに対して、欠失バンドを検出した。ｇＲＮＡ対（８４＋６８）をコードするプラスミドＡＡＶベクターによる、欠失バンドについての配列決定結果を、図３に示す。図３に示す通り、ｇＲＮＡ対（８４＋６８）をコードするプラスミドＡＡＶベクターは、ヒトジストロフィン遺伝子の正確な予測されたエクソン５１の欠失を媒介した。

実施例２－ヒトジストロフィン遺伝子を含むヒト化マウスにおけるＡＡＶベクターによるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１の欠失
ヒト化マウスモデルを含めたマウスモデルは、ヒトおよび動物対象における疾患の治療または予防のための本明細書に開示するものなどの組成物および方法を、評価するおよび適合させるのに有用であると考えられる。例えば、Ｅ．Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５１４３（２０１５）、Ｍ．Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１５）．１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５１７７、およびＬｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１６；Ｊａｎ ２２）；３５１（６２７１）：４００－４０３（これらは全て、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。例えば、当業者は、ＤＭＤのヒト化マウスモデルにおいて観察される遺伝子型および／または表現型の変化が、本開示の組成物および方法で治療されたヒト患者における遺伝子型および／または表現型の変化を予測するものであり得ることを認識するであろう。特に、ヒト化マウスモデルにおいて疾患（または疾患様）遺伝子型または表現型を取り返すのに効果的である方法または組成物を、当分野の技術者が、ヒト対象における治療用途に容易に適合させることができ、こうした適合は、本開示の範囲内である。

ＤＭＤの、あるヒト化マウスモデルは、Ｃ．Ｅ．Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５１４３（２０１５）によって記載されているｍｄｘマウスモデルに基づいている。ｍｄｘマウスは、完全長のジストロフィンｍＲＮＡ転写物の産生をもたらし、かつ、切断されているジストロフィンタンパク質をコードする、マウスジストロフィン遺伝子のエクソン２３内のナンセンス変異を保有する。これらの分子的変化は、ｍｄｘ筋肉における攣縮および強縮力の低下を含めた機能変化を伴う。ｍｄｘマウスは、エクソン５２の欠失を含む全長ヒトジストロフィン導入遺伝子の付加によってヒト化された（「ｍｄｘ △５２マウス」）。

ｍｄｘ △５２マウスは、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子と、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５１およびイントロン５２をそれぞれ標的にする一対のｇＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを、ヒトジストロフィン導入遺伝子を含有するｍｄｘマウスの胚に注射することによって作製した。ｍｄｘ △５２マウスの心臓および前脛骨筋には、ジストロフィンタンパク質は検出されなかった。

ある実験では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９と、表１に記載のターゲティング配列を含む一対のｇＲＮＡとをコードするＡＡＶベクターが、例えば、複数のｍｄｘ △５２マウスのそれぞれの右の脛骨に投与される。これらのｍｄｘ △５２マウスの左の前脛骨筋は、対側対照として使用し、治療も空ベクターも受けない。ベクターの投与後の様々な時点で、マウスを安楽死させ、組織診断、タンパク質抽出、および／または核酸抽出のために、組織を回収する。治療後の編集、および細胞および分子的な変化の程度は、上に記載した通りにおよびＮｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．に記載されている通りに判定することができる。

別の実験では、Ｃａｓ９と、上に記載した通りのｇＲＮＡ対とをコードするＡＡＶベクターが、例えば血管内注射によって、ｍｄｘ △５２マウスに全身的に投与され、上に記載したのとほぼ同じ方式で分析される。この実験、上に記載した実験、および／または他の類似の実験の結果を使用して、特定のガイド対を治療効果について評価および順位付けする、またＡＡＶベクターおよび投薬プロトコルを設計および／または最適化する、また本開示による特定の組成物および方法の臨床的有用性の可能性を判定することができる。

前述の詳細な説明および付随する実施例は、単に実例に過ぎず、本開示の主題の範囲への制限と受け取るべきではなく、本開示の主題の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ定義されることが理解されよう。

開示された実施形態に対する様々な変更および改変は、当業者には明らかであろう。限定はされないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、または使用の方法に関するものを含めた、こうした変更および改変を、その趣旨および範囲から逸脱せずに行うことができる。

Claims (12)

1. （ａ）第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子と、
   （ｂ）第２のｇＲＮＡ分子と、
   （ｃ）ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する少なくとも１つのＣａｓ９分子と
   を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムであって、
   前記第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子のそれぞれが、１９～２４ヌクレオチド長のターゲティングドメインを有し、かつ、前記システムが、ヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン５１にそれぞれ隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成することによってエクソン５１を含むジストロフィン遺伝子のセグメントを欠失させるように構成され、
   前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子が、以下からなる群から選択される、システム：
   （ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
   （ｉｉ）配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
   （ｉｉｉ）配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
   （ｉｖ）配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
   （ｖ）配列番号７に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
   （ｖｉ）配列番号６に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号８に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
   （ｖｉｉ）配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
   （ｖｉｉｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
   （ｉｘ）配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
   （ｘ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
   （ｘｉ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに
   （ｘｉｉ）配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子；および配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子。
2. 前記セグメントが、約８００～９００、約１５００～２６００、約５２００～５５００、約２０，０００～３０，０００、約３５，０００～４５，０００、または約６０，０００～７２，０００塩基対の長さを有する、請求項１に記載のシステム。
3. 前記少なくとも１つのＣａｓ９分子が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である、請求項１又は２に記載のシステム。
4. 前記少なくとも１つのＣａｓ９分子が、変異黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である、請求項３に記載のシステム。
5. ウイルスベクターによりコードされる、請求項１～４のいずれか一項に記載のシステム。
6. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項５に記載のシステム。
7. 医薬品に使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載のシステム。
8. デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載のシステム。
9. 請求項１～６のいずれか一項に記載のシステムを含む組成物。
10. 請求項１～６のいずれか一項に記載のシステムを含む細胞。
11. 細胞中での変異ジストロフィン遺伝子の修正に使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載のシステムであって、ヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン５１にそれぞれ隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成することによってエクソン５１を含むジストロフィン遺伝子のセグメントを欠失させるように構成される、システム。
12. 前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子が、
    （ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；
    （ｉｉ）配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに
    （ｉｉｉ）配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子
    からなる群から選択される、請求項１１に記載のシステム。

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