CN116997658A - 用于治疗包括肢带型2I（LGMD2I）的抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的fukutin相关蛋白（FKRP）的治疗性腺相关病毒递送 - Google Patents

用于治疗包括肢带型2I（LGMD2I）的抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的fukutin相关蛋白（FKRP）的治疗性腺相关病毒递送 Download PDF

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CN116997658A CN202180082194.2A CN202180082194A CN116997658A CN 116997658 A CN116997658 A CN 116997658A CN 202180082194 A CN202180082194 A CN 202180082194A CN 116997658 A CN116997658 A CN 116997658A
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马丁·K·奇尔德斯
豪尔赫·奥马尔·亚内斯库纳
胡安·曼努埃尔·伊格莱西亚斯·冈萨雷斯
辛克莱·库珀
安东尼亚·埃夫里皮奥蒂
迈克尔·L·罗伯茨
安娜·特里亚科娃
雷斯特·苏亚雷斯
阮英
罗萧惠
肖啸
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Abstract

本文公开了编码fukutin相关蛋白(FKRP)的各种优化的核酸。还公开了用于(例如在骨骼肌和心肌中)表达蛋白质的包含所述优化的核酸(例如与肌肉特异性启动子可操作地连接)的重组载体(例如重组腺相关病毒载体)，以及含有所述载体的治疗组合物。还公开了给予受试者所述载体以治疗患有抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱(例如肢带型肌营养不良2I)的受试者的治疗方法。

Description

用于治疗包括肢带型2I(LGMD2I)的抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱 的fukutin相关蛋白(FKRP)的治疗性腺相关病毒递送
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2020年10月7日提交的美国临时申请No.63/088,757、2021年6月23日提交的美国临时申请No.63/214,123以及2021年8月5日提交的美国临时申请No.63/229,726的权益，通过引用将其中每个的内容以其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及基因疗法和抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱(dystroglycanopathydisorders)的治疗的领域。
背景技术
肢带型肌营养不良(Limb girdle muscular dystrophy)或LGMD代表了二十多种罕见的一大类遗传性肌病，与连接肩部或髋部的肌肉(通常被称为肢带)的无力和萎缩有关。根据遗传性肌病分别作为显性疾病遗传还是作为隐性疾病遗传，将其细分为LGMD1组和LGMD2组。每一种LGMD都是由不同基因的突变引起的。
与LGMD2I相关的症状通常在儿童晚期出现，彼时受困扰的儿童开始出现跑步和行走困难。随着时间的推移，症状和行动问题逐渐恶化，患者通常在发病后23到26年之间依赖轮椅。肩部和手臂无力会给握持、搬运和举起物体带来挑战，并可导致需要辅助设备。该疾病还可导致呼吸困难、心肌疾病和心律失常，以及收缩诱导的对肌纤膜的剪切损伤，这是导致LGMD2I表型的主要病变。抗肌萎缩蛋白聚糖是dystrophin-糖蛋白复合物(或DGC)的中心蛋白，其糖基化对于将肌肉细胞的结构元件灵活连接到其周围的结构(称为细胞外基质(或ECM)至关重要。FKRP将核糖醇-5-P附接到逐步修饰α-DG的聚糖序列上。一项使用高效液相色谱(或HPLC)、质谱和核磁共振(或NMR)相结合的权威研究表明，fukutin相关蛋白(FKRP)是一种转移酶，它将两种核糖醇-5-磷酸中的第二个插入聚糖链的配体结合部分紧前的聚糖链中。该聚糖链的任何部分的缺失导致α-DG无法与其ECM靶标结合，从而导致肌纤膜或细胞膜上的反复应力，这是许多LGMD(包括LGMD2I)的标志。根据对公开可用的基因组数据库的分析，估计每百万人中有4.3人患有LGMD2I。LGMD2I在北欧最为普遍，这是由于群体建立者突变效应，其中，在为地理或文化上隔离的群体或曾为地理或文化上隔离的群体中，编码FKRP的基因发生了高频率的基因改变，并且一个或多个祖先是经改变的基因的携带者。
编码FKRP的基因突变导致广泛的疾病表型，包括轻度肢带型肌营养不良2I(LGMD2I)、严重Walker-Warburg综合征和肌眼脑疾病。目前，尚不清楚涉及α-DG糖基化减少的抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的有效疗法(Xu等，Mol.therapy 21:10doi:10.1038/mt.2013.156(2013年7月2日))。目前还没有批准的用于LGMD2I的疗法，治疗旨在症状管理，包括支持性护理和移动辅助设备。
发明内容
本发明的各方面涉及重组腺病毒相关(AAV)载体，该载体在其基因组中以5'至3'的方向包含a)5'AAV反向末端重复(ITR)；b)肌肉特异性启动子；c)内含子序列；d)编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的核酸，所述核酸具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，并与所述肌肉特异性启动子可操作地连接；e)polyA信号序列，所述polyA信号序列与所述编码FKRP的核酸可操作地连接；f)3'AAV ITR。
在本文所述的rAAV载体和方法的一些实施方式中，5'ITR为ITR2m。
在本文所述的rAAV载体和方法的一些实施方式中，3'ITR为ITR2。
在本文所述的rAAV载体和方法的一些实施方式中，肌肉特异性启动子为Syn100(SEQ ID NO：3)。
在本文所述的rAAV载体和方法的一些实施方式中，内含子序列为VH4-Ig内含子3(SEQ ID NO：4)或其衍生物。
在本文所述的rAAV载体和方法的一些实施方式中，polyA信号序列为SEQ ID NO：5。
在本文所述的rAAV载体和方法的一些实施方式中，肌肉特异性启动子、内含子序列、编码FKRP的核酸和polyA信号序列包含在SEQ ID NO：1中。
在本文所述的rAAV载体和方法的一些实施方式中，血清型为AAV9。
本发明的各方面还涉及包含上述所述和本文所述的重组AAV载体的各种实施方式的药物组合物。
本发明的各方面还涉及治疗患有抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的受试者的方法，所述方法包括向受试者系统性给予治疗有效量的本文所述的重组AAV载体和/或本文所述的药物组合物的各种实施方式，从而增加受试者的肌肉组织中的功能性FKRP的表达。
在本文所述方法的一些实施方式中，抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱为肢带型肌营养不良2I。
在本文所述方法的一些实施方式中，给予受试者单剂量。
在本文所述方法的一些实施方式中，通过静脉输注给予。
在本文所述方法的一些实施方式中，给予剂量为约1E13vg/kg至约6E13 vg/kg(例如约3E13 vg/kg)。
在本文所述方法的一些实施方式中，给予后受试者发生以下中的一种或多种：a)受试者的骨骼肌和/或心肌中α-DG的功能性糖基化显著增加；b)受试者的血清肌酸激酶水平显著降低；c)受试者的骨骼肌中的胶原沉积显著降低；d)受试者的肌肉组织(例如比目鱼肌、膈膜和/或EDL)的体外肌力分析显著增加；e)受试者的潮气量显著增加；和/或f)受试者可在平板运动试验中显著地跑得更远。
在本文所述方法的一些实施方式中，受试者为成年受试者、青少年受试者或婴儿受试者。在本文所述方法的一些实施方式中，受试者为雄性/男性或雌性/女性。
本发明的各方面还涉及编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的合成核酸，其中：a)相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述核酸的CpG位点含量降低；b)相对于SEQ ID NO：6的GC含量，GC含量降低了大于10％；和/或c)所述核酸与SEQ ID NO：2具有至少80％的同一性。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少50％。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少75％、80％、85％、90％、95％。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，所述编码序列的CpG位点含量为0％。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述GC含量降低大于15％。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，所述核酸与SEQ ID NO：2具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，所述核酸具有SEQ IDNO：2所示的序列。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，合成核酸与启动子可操作地连接。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，启动子为肌肉特异性启动子。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，启动子为合成启动子。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，启动子为Syn100。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，启动子选自表1-表4中列出的启动子。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，启动子为肌酸激酶(CK)启动子、鸡β-肌动蛋白启动子(CB)。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，合成核酸进一步包含增强子序列。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，增强子序列包括CMV增强子、肌肉肌酸激酶增强子和/或肌球蛋白轻链增强子。
本发明的各方面还涉及包含如下的核酸：5'和3'AAV反向末端重复(ITR)；编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的编码序列，所述编码序列可操作地连接至位于5'ITR和3'ITR之间的肌肉特异性启动子，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低；相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述编码序列的GC含量降低大于10％；和/或
所述编码序列与SEQ ID NO：2具有至少80％的同一性。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，所述核酸进一步包含位于肌肉特异性启动子和编码序列之间的内含子序列。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，内含子序列为VH4-Ig内含子3(SEQ ID NO：4)或其衍生物。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，所述核酸进一步包含位于编码序列下游的至少一个polyA信号序列。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，polyA信号序列为SEQ IDNO：5。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，5'ITR为ITR2m。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，3'ITR为ITR2。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述编码序列的GC含量降低大于15％。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，所述编码序列与SEQ IDNO：2具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量减低至少50％。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少75％、80％、85％、90％、95％。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，所述编码序列的CpG位点含量为0％。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，所述编码序列为SEQ IDNO：2。
本发明的各方面还涉及包含上述所述和本文所述的合成核酸的载体。
在本文描绘的核酸、载体和方法的一些实施方式中，所述载体为病毒载体。
在本文描绘的核酸、载体和方法的一些实施方式中，所述载体为重组腺相关病毒(AAV)载体。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，AAV载体为表6中列出的任何血清型(例如，AAV9)。
本发明的各方面还涉及重组腺病毒相关(AAV)载体，所述载体在其基因组中包含：a)5'AAV反向末端重复(ITR)和3'AAV ITR；b)位于5'ITR和3'ITR之间的编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的核酸，其中：i)相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述核酸的CpG位点含量降低；ii)相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述核酸的GC含量降低大于10％；和/或iii)所述核酸与SEQ ID NO：2具有至少80％的同一性，并且所述核酸可操作地连接至肌肉特异性启动子。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，AAV基因组以5'至3'的方向包含：5'ITR、肌肉特异性启动子、内含子序列、编码FKRP的核酸；以及3'ITR。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，肌肉特异性启动子选自于由如下启动子所组成的组：MCK启动子、dMCK启动子、tMCK启动子、enh358MCK启动子、CK6启动子和Syn100启动子、表1-表4或8-12中列出的任意启动子，及它们的衍生物。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码FKRP的核酸的CpG位点含量降低。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码FKRP的核酸的CpG位点含量降低至少50％。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码FKRP的核酸的CpG位点含量降低至少75％、80％、85％、90％、95％。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，编码FKRP的核酸的CpG位点含量为0％。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述编码FKRP的核酸的GC含量降低大于10％。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，编码FKRP的核酸与SEQID NO：2具有至少80％的同一性。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，编码FKRP的核酸具有SEQID NO：2所示的序列。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，重组AAV载体进一步包含位于编码FKRP多肽的核酸的3'和3'ITR序列的5'的至少一个polyA信号序列。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，polyA信号序列为SEQ IDNO：5。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，ITR包含插入、缺失或置换。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，将ITR中的一个或多个CpG位点移除。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，5'ITR为ITR2m。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，3'ITR为ITR2。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，内含子序列为VH4-Ig内含子3(SEQ ID NO：4)或其衍生物。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，重组AAV载体为嵌合AAV载体、单倍体AAV载体，杂合AAV载体或多倍体AAV载体。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，重组AAV载体为表6中列出的任何AAV血清型，例如AAV9。
在本文描绘的核酸、rAAV载体和方法的一些实施方式中，重组AAV载体包含选自表7的衣壳蛋白或由表6中所列的血清型所组成的组中的任何AAV血清型，及它们的组合。
本发明的各方面还涉及药物组合物，所述药物组合物包含处于药学上可接受的运载体中的上述和本文所述的重组AAV载体。
本发明的各方面还涉及经转化的细胞，所述经转化的细胞包含上述所述和本文所述的核酸和/或上述所述和本文所述的载体。
本发明的各方面还涉及转基因动物，所述转基因动物包含上述所述和本文所述的核酸和/或上述所述和本文所述的载体(例如rAAV)，和/或上述所述和本文所述的转化细胞。
本发明的各方面还涉及在有需要的受试者中增加α-抗肌萎缩蛋白聚糖(α-DG)的糖基化的方法，所述方法包括：向所述受试者给予治疗有效量的上述所述和本文所述的核酸、上述所述和本文所述的载体(例如rAAV)、上述所述和本文所述的药物组合物、和/或上述所述和本文所述的经转化的细胞，其中所述合成核酸在所述受试者中表达，从而产生人FKRP并增加α-DG的糖基化。
在本文描绘的方法的一些实施方式中，受试者具有抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱或处于发展为抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的风险中。
本发明的各方面还涉及治疗受试者的抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的方法，所述方法包括向受试者给予治疗有效量的上述所述和本文所述的核酸、上述所述和本文所述的载体(例如rAAV)、上述所述和本文所述的药物组合物、和/或上述所述和本文所述的经转化的细胞，其中所述合成核酸在所述受试者中表达，从而治疗受试者的抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱与FKRP异常有关。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱包含编码FKRP的核酸的突变和/或α-抗肌萎缩蛋白聚糖(α-DG)的糖基化缺乏。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱为肢带型肌营养不良2I、先天性肌营养不良(CMD1C)、Walker-Warburg综合征、肌眼脑疾病，或它们的任意组合。
本发明的各方面还涉及治疗患有抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的受试者的方法，所述方法包括向受试者给予治疗有效量的前述权利要求中任一项所述的重组AAV载体、rAAV基因组、核酸序列和/或药物组合物中的任一种，从而增加受试者的肌肉组织中功能性FKRP的表达。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，给予受试者单剂量。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，给予是系统性的。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，通过静脉输注给予。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，给予后受试者的骨骼肌和/或心肌中α-DG的功能性糖基化显著增加。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，在给予后，所述受试者的血清肌酸激酶水平显著降低。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，给予后，受试者的骨骼肌中的胶原沉积显著降低。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，受试者肌肉组织(例如比目鱼肌、膈膜和/或EDL)的体外肌力分析显著增加。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，受试者的潮气量显著增加。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，受试者可在平板运动试验中显著地跑得更远。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，受试者为成年受试者。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，受试者为青少年受试者。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，受试者为婴儿受试者。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，在给予前受试者表现出显著的疾病病理。
在本文所描绘方法的一些实施方式中，在给予前受试者没有表现出显著的疾病病理。
附图说明
图1为所进行的剂量探索和毒理学研究的概要。
图2显示了与接受空媒介的小鼠相比，受体小鼠的膈膜和四头肌中的代表性表达水平。
图3显示了作为阳性对照的正常BL6小鼠(左上照片)、接受1E14 vg/kg(右上)和3E13 vg/kg(左下)AAV9-FKRP的P448L小鼠以及接受空媒介(右下)作为阴性对照的P448L小鼠中代表性的α-抗肌萎缩蛋白聚糖表达。
图4显示了使用DAPI的P448L小鼠四头肌横截面区域中功能性α-DG表达的代表性免疫荧光图像。左上图为野生型BL6小鼠的α-抗肌萎缩蛋白聚糖。右上图为给予1E14 vg/kg的P448L小鼠中的α-抗肌萎缩蛋白聚糖。左下图为给予3E13 vg/kg的P448L小鼠中的α-抗肌萎缩蛋白聚糖。右下图为给予空媒介的P448L小鼠。
图5显示了四头肌肌肉横截面中胶原沉积的天狼星红染色的代表性图像(顶部)。显示了雄性图像。在没有处理的情况下，P448小鼠(中上)表现出大量胶原沉积和不规则的肌肉纤维形状。这些特征在不同剂量的AAV9-FKRP下逐渐恢复正常。(底部)为P448L小鼠中量化的胶原沉积的图示。胶原沉积显示为四头肌肌肉总面积的百分比。雄性和雌性的数据合并在一起。在所有剂量下胶原沉积都减少。###非配对t检验，p＜0.001，n≥13；*单因素ANOVA与Dunnett多重比较检验，p＜0.05，n≥12；**单因素ANOVA和Dunnett多重比较检验，p<0.01，n≥12。胶原百分比计算为：(红色染色总面积/活检总面积)*100。
图6显示了从研究接受了不同量的AAV9-FKRP的小鼠的血清肌酸激酶水平获得的数据的两个图示。左边，在雄性小鼠中获得结果，右边，在雌性小鼠中获得结果。BL6媒介受体小鼠作为阳性对照，P448L小鼠作为阴性对照。P448L小鼠接受1E13、3E13、1E14或3E14vg/kg AAV9-FKRP。
图7显示了来自分离的趾长伸肌的比力响应的两个图示。左-雄性响应，右-雌性响应。BL6媒介受体小鼠作为阳性对照，P448L小鼠作为阴性对照。P448L小鼠接受1E13、3E13、1E14或3E14 vg/kg AAV9-FKRP。在大多数情况下，骨骼肌的恢复是在1E13的剂量下实现的。超过该剂量观察到阈值效应。#BL6不同于P448L媒介(p＜0.05)，##BL6不同于P448L媒介(p＜0.01)，###BL6不同于P448L媒介(p＜0.001)，*治疗组不同于P448媒介(p＜0.05)，**治疗组不同于P448媒介(p＜0.01)，***治疗组不同于P448媒介(p＜0.001)。
图8显示了来自分离的膈肌的比力响应的两个图示。左-雄性响应，右-雌性响应。BL6媒介受体小鼠作为阳性对照，P448L小鼠作为阴性对照。P448L小鼠接受1E13、3E13、1E14或3E14 vg/kg AAV9-FKRP。在大多数情况下，骨骼肌的恢复是在1E13的剂量下实现的。超过该剂量观察到阈值效应。#BL6不同于P448L媒介(p＜0.05)，##BL6不同于P448L媒介(p＜0.01)，###BL6不同于P448L媒介(p＜0.001)，*治疗组不同于P448L媒介(p＜0.05)，**治疗组不同于P448L媒介(p＜0.01)，***治疗组不同于P448L媒介(p＜0.001)。
图9显示了来自分离的比目鱼肌的比力的两个图示。左-雄性响应，右-雌性响应。BL6媒介受体小鼠作为阳性对照，P448L小鼠作为阴性对照。P448L小鼠接受1E13、3E13、1E14或3E14 vg/kg AAV9-FKRP。在大多数情况下，骨骼肌的恢复是在1E13的剂量下实现的。超过该剂量观察到阈值效应。#BL6不同于P448L媒介(p＜0.05)，##BL6不同于P448L媒介(p＜0.01)，###BL6不同于P448L媒介(p＜0.001)，*治疗组不同于P448L媒介(p＜0.05)，**治疗组不同于P448L媒介(p＜0.01)，***治疗组不同于P448L媒介(p＜0.001)。
图10显示了P448小鼠的耗竭平板运动距离。除了3E14的最大剂量外，所有剂量下的总距离都得到恢复。#BL6不同于P448L媒介(p＜0.05)，##BL6不同于P448L媒介(p＜0.01)，###BL6不同于P448L媒介(p＜0.001)，*治疗组不同于P448L媒介(p＜0.05)，**治疗组不同于P448L媒介(p＜0.01)，***治疗组不同于P448L媒介(p＜0.001)。
图11显示了P448小鼠的转轮距离。除了3E14的最大剂量外，所有剂量下的总距离都得到恢复。#BL6不同于P448L媒介(p＜0.05)，##BL6不同于P448L媒介(p＜0.01)，###BL6不同于P448L媒介(p＜0.001)，*治疗组不同于P448L媒介(p＜0.05)，**治疗组不同于P448L媒介(p＜0.01)，***治疗组不同于P448L媒介(p＜0.001)。
图12显示了雄性(左)和雌性(右)受体小鼠的体积描记研究。BL6媒介受体小鼠作为阳性对照，P448L小鼠作为阴性对照。P448L小鼠接受1E13、3E13、1E14或3E14 vg/kgAAV9-FKRP。
图13为dsAAV-Syn100-FKRP的示意性质粒图谱。还显示了质粒的各种组分的核苷酸序列，包括ITR(ITR2m、ITR2)、启动子(Syn100)、内含子(VH4-Ig内含子3)、FKRP的优化编码序列(Opti-hu-FKRP-CpG(-))、polyA信号序列(sPolyA)和各种间隔区。
图14显示了编码图13的质粒的人FKRP蛋白的合成核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。核酸具有0％的CpG位点。
图15显示了图13的质粒的启动子(Syn100)的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。
图16显示了图13的质粒的内含子(VH4-Ig内含子3)的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。
图17显示了图13的质粒的polyA信号序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。
图18显示了编码人FKRP的天然核苷酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)。
图19显示了图13的质粒的其它核苷酸序列、ITR2M序列(SEQ ID NO：7)、ITR2序列(SEQ ID NO：8)、间隔区序列(SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：13)。
图20显示了根据本发明一些实施方式的合成肌肉特异性启动子在分化为心肌管的H9C2细胞系中的平均活性。误差棒为标准偏差。CBA和CK8为对照启动子。
图21显示了来自短合成肌肉特异性启动子的结果，其显示了分化为心肌管的H9C2细胞系中如下11个所选的合成肌肉特异性启动子的平均活性(归一化至CBA对照启动子)：SP0497、SP0500、SP0501、SP0506、SP0508、SP0510、SP0514、SP0519、SP0520、SP0521和SP4169。误差棒为来自三重复的标准偏差。CBA和CK8为对照启动子。
图22显示了在所指示的MOI下48小时和72小时人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMC或HASMC)存活的条形图。
图23A和图23B显示了转导后48小时HASMC细胞裂解物中的FKRP。(图23A)FKRP和GAPDH的蛋白表达。(图23B)归一化至蛋白的FKRP活性，以及每个载体基因组的FKRP(vg)。
图24A和图24B显示转导后72小时HASMC细胞裂解物中的FKRP。(图24A)FKRP和GAPDH的蛋白表达。(图24B)归一化至蛋白的FKRP活性和每个载体基因组的FKRP(vg)。
图25显示了在所指示的MOI下HASMC细胞的72小时存活。
图26A和图26B显示了转导后72小时HASMC细胞裂解物中的FKRP。(图26A)FKRP和GAPDH的蛋白表达。(图26B)归一化至蛋白的FKRP活性和每个载体基因组的FKRP(vg)。
上述附图在本发明的至少一个示例性实施方式中说明了本发明的多个方面，这些实施方式在以下描述中进一步详细定义。根据一个或多个实施方式，在不同附图中由相同数字表示的本发明的特征、元素和方面表示相同、等效或相似的特征、元素或方面。
具体实施方式
肢带型肌营养不良(LGMD)是一组不同的疾病，有许多按疾病基因和遗传分类的亚型。导致结构蛋白或酶缺陷的多种基因突变已被鉴定为导致LGMD。肢带型肌营养不良2I(LGMD2I)，在本领域中也称为肌营养不良肢带、常染色体隐性9、LGMDR9型肌营养不良、肢带型2I、肌营养不良-抗肌萎缩相关糖蛋白病肢带，和FRKP相关的肢带，是一种单基因、极为罕见的孤儿疾病。
LGMD2I被归类为常染色体隐性肌营养不良，由fukutin相关蛋白(FKRP)基因中的突变引起，所述FKRP是α-抗肌萎缩蛋白聚糖(α-DG)糖基化所需的。在没有FKRP的情况下，α-DG的糖基化受损减少与细胞外基质中层粘连蛋白的结合，从而导致肌肉细胞肌纤膜的剪切损伤、慢性炎症以及肌肉纤维的分解随着时间的推移而增加。LGMD2I是进展缓慢的疾病，在青少年/成年人中具有严重的残疾和早期死亡。这些患者容易发生心脏纤维化、呼吸系统并发症和吞咽困难，可导致早期死亡。种群建立者L276I突变(纯合)约占欧洲病例的70％。L276I杂合子(25％)具有更严重的表型(第二等位基因上的多种突变)。
本发明的各方面涉及编码Fukutin相关蛋白的核酸的开发，所述核酸用于治疗诸如肢带型肌营养不良2I等疾病的基因疗法。
如本文所用，“FKRP”指的是fukutin相关蛋白。本文所述的核酸、载体、组合物和方法旨在提高细胞(例如肌肉细胞)中FKRP的水平。例如，此类方法可能对糖基化α-抗肌萎缩蛋白聚糖缺乏(本文称为抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱)的受试者有益。
如本文所使用的术语“核酸”通常是指基本上由核苷酸组成的任何长度的寡聚物或聚合物(优选线性聚合物)。核苷酸单元通常包括杂环碱基、糖基和至少一个(例如一个、两个或三个)磷酸基团，包括修饰的或取代的磷酸基团。杂环碱基除其它外可以包括嘌呤和嘧啶碱基，例如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，它们广泛存在于天然存在的核酸中，其他天然存在的碱基(例如黄嘌呤、肌苷、次黄嘌呤)以及化学或生物化学修饰(例如甲基化)、非天然或衍生的碱基。糖基除其他外可以包括戊糖(戊呋喃糖)基团，例如优选天然存在的核酸中常见的核糖和/或2-脱氧核糖，或阿拉伯糖、2-脱氧阿拉伯糖、苏糖或己糖糖基，以及经修饰的或取代的糖基。如本文所指的核酸可包括天然存在的核苷酸、经修饰的核苷酸或其混合物。经修饰的核苷酸可包括经修饰的杂环碱基、经修饰的糖部分、经修饰的磷酸基团或其组合。可以引入磷酸基团或糖的修饰以提高稳定性、对酶降解的抗性或一些其他有用的性质。术语“核酸”进一步优选地包括DNA、RNA和DNA RNA杂交分子，特别包括hnRNA、pre-mRNA、mRNA、cDNA、基因组DNA、扩增产物、寡核苷酸和合成的(例如，化学合成的)DNA、RNA或DNA RNA杂交物。核酸可以是天然存在的，例如存在于自然界中或从自然界中分离出来的；或者可以是非天然存在的，例如重组的，即通过重组DNA技术产生的，和/或部分或全部化学或生物化学合成的。“核酸”可以是双链的、部分双链的或单链的。在单链的情况下，核酸可以是有义链或反义链。此外，核酸可以是环状的或线状的。
术语“同一性”和“相同的”等是指两个聚合分子之间的序列相似性，例如两个核酸分子之间(例如两个DNA分子之间)。可以使用如下完成序列比对和序列同一性的确定：例如最初由Altschul等于1990年(J Mol Biol 215:403-10)描述的基本局部比对搜索工具(BLAST)，例如由Tatusova和Madden于1999年(FEMS Microbiol Lett 174:247-250)描述的“Blast 2序列”算法。
用于比较的序列比对方法在本领域中是众所周知的。各种程序和比对算法描述于例如：Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson等(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana等(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174:247-50。关于序列比对方法和同源计算的详细考量可见于例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。
美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLASTTM；Altschul等(1990))可以从多个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)和在互联网上，用于与多个序列分析程序结合。如何使用该程序确定序列同一性的描述在互联网上的BLASTTM的“帮助”部分可得。对于核酸序列的比较，可以使用默认参数利用BLASTTM(Blastn)程序的“Blast 2序列”功能。当通过这种方法评估时，与参考序列具有更大相似性的核酸序列将显示出增加的百分比同一性。通常，在序列的整个长度上计算百分比序列同一性。
例如，通过Needleman-Wunsch算法适当地找到全局最优比对，所述Needleman-Wunsch算法具有以下评分参数：匹配得分：+2，错配得分：-3；空位罚分：空位开放5，空位扩展2。通过经比对的碱基数与比对总长度(其中比对长度包括匹配和错配两者)的比率乘以100来适当地计算得到的最优全局比对的百分比同一性。
术语“杂交”是指在杂交过程中使两个至少部分互补的核苷酸序列退火。为了使杂交发生，互补核酸分子通常被热变性或化学变性，从而将双链熔解成两条单链和/或从单链核酸中去除发夹或其它二级结构。杂交的严格性受到诸如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成等条件的影响。常规杂交条件描述于例如Sambrook(2001)MolecμLar Cloning:alaboratory manual，第三版，Cold Spring Harbor laboratory Press，CSH，New York，但熟练的技术人员将理解，可根据核酸序列的已知或预期同源性和/或长度来设计许多不同的杂交条件。杂交的高严格性条件包括高温和/或低钠/盐浓度(盐包括钠，例如在NaCl和柠檬酸钠中)和/或在杂交缓冲液中包含甲酰胺和/或降低杂交缓冲液的化合物(如SDS(十二烷基硫酸钠去污剂))的浓度和/或排除杂交缓冲液中的化合物如葡聚糖硫酸盐/酯或聚乙二醇(促进分子拥挤)。作为非限制性示例，严格杂交的代表性盐和温度条件为：在65℃下，1×SSC、0.5％ SDS。缩写SSC指的是用于核酸杂交溶液中的缓冲液。一升20×(浓缩20倍)SSC储备缓冲溶液(pH 7.0)含有175.3g氯化钠和88.2g柠檬酸钠。实现杂交的代表性时间段为12小时。
“共有序列”的含义在本领域中是众所周知的。在本申请中，共有序列使用以下符号，除非上下文另有规定。考虑以下的示例性DNA序列：
A[CT]N{A}YR
A意指在该位置总是发现A；[CT]代表该位置的C或T；N代表该位置的任何碱基；并且{A}意指在该位置发现的除A之外的任何碱基。Y代表任何嘧啶，并且R代表任何嘌呤。
本申请中的“合成的”意指自然界中不存在的核酸分子。本发明的合成的核酸表达构建体是人工生产的，通常是通过重组技术合成。此类合成的核酸可能包含天然存在的序列(例如启动子、增强子、内含子和其它此类调控序列)，但这些存在于非天然存在的环境中。例如，合成的基因(或基因的一部分)通常包含一个或多个在自然界中不连续的核酸序列(嵌合序列)，和/或可以包含转、插入和缺失及其组合。本文使用的术语“合成的启动子”涉及在自然界中不存在的启动子。
如本文所使用的“互补的”或“互补性”是指两个核酸序列的沃森-克里克碱基配对。例如，对于序列5'-AGT-3'与互补序列3'-TCA-5'结合。两个核酸序列之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些碱基与其互补体结合，或者它可以是完整的，当序列中的每个碱基都与其互补碱基结合时。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。
如本文所使用的“间隔区序列”或“间隔区”是分隔两个功能性核酸序列的核酸序列。它基本上可以具有任何序列，前提是它不阻止功能性核酸序列(例如顺式调控元件)按所期望的发挥作用(例如，如果它包含沉默子序列，阻止期望的转录因子的结合等，则可能发生这种情况)。通常，它是非功能性的，因为它的存在只是为了将相邻的功能性核酸序列彼此间隔开。
如本文所用，术语“氨基酸”包括任何天然存在的氨基酸、其修饰形式、以及合成氨基酸。
“载体”是指用作媒介将外来遗传物质携带到另一细胞中的化合物，在该细胞中所述遗传物质可复制和/或表达。含有外来核酸的克隆载体被称为重组载体。核酸载体的实例为质粒、病毒载体、粘粒和人工染色体。重组载体通常包含复制起点、多克隆位点和选择性标记。核酸序列通常由插入物(重组核酸或转基因)和作为载体的“骨架”的较大序列组成。将遗传信息转移到另一细胞的载体的目的通常是在靶标细胞中分离、繁殖或表达插入物。表达载体(表达构建体)用于在靶标细胞中表达外源基因，并且通常具有驱动外源基因/ORF表达的启动子序列。将载体插入靶标细胞是指对细菌和真核细胞的转化或转染，尽管病毒载体的插入通常被称为转导。术语“载体”通常也可用于描述用于将外来遗传物质携带到另一细胞中的物品，例如但不限于经转化的细胞或纳米颗粒。
“递送载体”用于将其核酸货物递送到细胞中，通常用于在细胞中表达核酸。在一个实施方式中，本发明的递送载体包括但不限于病毒载体。本领域已知多种病毒载体(例如，衍生自疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、逆转录病毒、杆状病毒、腺病毒或细小病毒(如腺相关病毒)的病毒载体)。非病毒递送载体也是本领域已知的，它们的用途也包括在本发明中。在一个实施方式中，病毒载体为重组腺相关病毒(AAV)。此类的病毒载体包含AAV衣壳，并且可包装AAV或rAAV基因组或任何其它核酸，包括病毒核酸。或者，在某些情况下，术语“载体”、“病毒载体”、“递送载体”(和类似术语)可用于指在没有病毒粒子的情况下的载体基因组(例如，vDNA)和/或指作为转运蛋白递送与衣壳相连或包装在衣壳内的分子的病毒衣壳。
如本文所用，术语“病毒载体”(例如，AAV载体)、“病毒递送载体”(和类似术语)在具体实施方式中通常是指起核酸递送媒介作用的病毒颗粒，其包括包装在病毒粒子内的病毒核酸(即，载体基因组)。
本发明的病毒载体还可为国际专利公开WO 01/92551中所述的双链细小病毒颗粒(通过引用将其公开内容以其整体并入本文)。因此，在一些实施方式中，可包装双链(双链体)基因组。
“重组AAV载体基因组”或“rAAV基因组”是包含至少一个反向末端重复(例如一个、两个或三个反向末端重复)和一个或多个异源核苷酸序列的AAV基因组(即vDNA)。rAAV载体通常以顺式保留145个碱基的反向末端重复(ITR)以产生病毒；然而，包含部分或完全合成序列的经修饰的AAV TR和非AAV TR也可用于此目的。所有其它病毒序列都是可有可无的，并且可以以反式提供(Muzyczka，(1992)Curr.Topics Microbiol.Immunol.158：97)。rAAV载体任选地包含两个ITR(例如，AAV ITR)，其通常位于异源核苷酸序列的5'和3'端，但不需要与其相邻。ITR可彼此相同，也可彼此不同。载体基因组也可在其3'或5'端包含单个ITR。
如本文所用，术语“病毒载体”、“病毒性载体”、“载体”或“基因递送载体”是指起核酸递送媒介作用的病毒(如AAV)颗粒，其包含包装在病毒粒子内的载体基因组(如病毒DNA[vDNA])。
如本文所用，术语“病毒载体“可指包含至少一种病毒来源的元件并具有包装成病毒载体颗粒的能力的核酸载体构建体。病毒载体可包含编码本文所述的多肽的核酸，以代替非必需的病毒基因。载体和/或颗粒可用于在体外或体内将本文所述的合成核酸转移到细胞中的目的。多种形式的病毒载体是本领域已知的，并在本文中提供。
“rAAV载体基因组”或“rAAV基因组”是包含一个或多个异源核酸序列的AAV基因组(即，vDNA)。rAAV载体通常只需要处于顺式的反向末端重复(TR(s))来生成病毒。所有其他病毒序列都是可有可无的，并且可以反式提供(Muzyczka,(1992)Curr.TopicsMicrobial.Immunol.158:97)。通常，rAAV载体基因组将仅保留一个或多个TR序列，以便最大化可被载体有效包装的转基因的大小。可以以反式提供结构和非结构蛋白编码序列(例如，从载体(例如质粒)，或通过将序列稳定地整合到包装细胞中)。在本发明的实施方式中，rAAV载体基因组包含至少一个ITR序列(例如，AAV TR序列)，任选地两个ITR(例如，两个AAVTR)，它们通常位于载体基因组的5'和3'端并侧接于于异源核酸，但不必与其相邻。TR可以彼此相同或不同。
术语“末端重复”或“TR”包括形成发夹结构并起反向末端重复作用的任何病毒末端重复或合成的序列(即介导期望的功能(如复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等)的ITR)。TR可以是AAV TR或非AAV TR。例如，如其他细小病毒(例如，犬细小病毒(CPV)、小鼠细小病毒(MVM)、人细小病毒B-19)或任何其它合适的病毒序列(例如，充当SV40复制的起点的SV40发夹)的非AAV TR序列可被用作TR，其可以通过截短、置换、缺失、插入和/或添加而被进一步修改。此外，TR可以是部分或完全合成的，例如Samulski等在美国专利号5,478,745中描述的“双D序列”。
包括“AAV反向末端重复”或“AAV ITR”的“AAV末端重复”或“AAV TR”可以来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或现在已知或以后发现的任何其它AAV(参见例如表3)。AAV末端重复不需要具有天然的末端重复序列(例如，天然的AAV TR或AAV ITR序列可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变来改变)，只要末端重复介导期望的功能，例如复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等。
AAV蛋白VP1、VP2和VP3是衣壳蛋白，它们一起相互作用以形成二十面体对称的AAV衣壳。VP1.5是美国公开号2014/0037585中描述的AAV衣壳蛋白。衣壳蛋白可为天然存在的或修饰的，这在本领域是众所周知的。
此外，病毒衣壳或基因组元件可以包含其它修饰，包括插入、缺失和/或置换。
如本文所使用的“嵌合”衣壳蛋白意指，相对于野生型，已通过在衣壳蛋白的氨基酸序列中的一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个等)氨基酸残基的置换而被修饰的AAV衣壳蛋白，以及相对于野生型，已通过在氨基酸序列中的一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个等)氨基酸残基的插入和/或缺失而被修饰的AAV衣壳蛋白。在一些实施方式中，来自一种AAV血清型的完整或部分结构域、功能区、表位等可以以任意组合替换不同AAV血清型的相应的野生型结构域、功能区、表位等，以产生本发明的嵌合的衣壳蛋白。嵌合的衣壳蛋白的产生可以根据本领域熟知的方案进行，并且文献和本文中描述了大量的可包含在本发明的衣壳中的嵌合衣壳蛋白。
如国际专利公开WO 00/28004和Chao等,(2000)Molecular Therapy 2:619中所述的，本发明的病毒载体还可以是“靶向的”病毒载体(例如，具有定向趋向性)和/或“杂交的”细小病毒(即，其中病毒TR和病毒衣壳来自不同的细小病毒)。
如国际专利公开WO 01/92551(通过引用的方式将其公开内容以其整体并入本文)中所述的，本发明的病毒载体还可以是双链细小病毒颗粒。因此，在一些实施方式中，双链(双链体)基因组可以被包装到本发明的病毒衣壳中。
如本文所使用的，术语“单倍体AAV”应意指如PCT/US18/22725中所述的AAV，将其并入本文。
术语“杂交的”AAV载体或细小病毒是指rAAV载体，其中病毒TR或ITR和病毒衣壳来自不同的细小病毒。杂交载体在国际专利公开WO 00/28004和Chao等，(2000)MolecularTherapy 2：619中描述。例如，杂交的AAV载体通常包含足以进行腺病毒复制和包装的腺病毒5'和3'的顺式ITR序列(即，腺病毒末端重复和PAC序列)。
术语“多倍体AAV”是指AAV载体，所述AAV载体由来自两种以上的AAV血清型的衣壳组成，例如，可以利用个体血清型进行更高的转导，但在某些实施例中不会消除来自亲本的趋向性。
术语“顺式调控元件”或“CRE”是为技术人员熟知的术语，并且意指能够调控或调节相邻基因(即处于顺式)的转录的核酸序列(例如增强子、启动子、绝缘子或沉默子)。CRE见于它们调控的基因附近。CRE通常通过与TF结合来调控基因转录，即，它们包含TFBS。单个TF可与许多CRE结合，并从而控制许多基因的表达(多效性)。CRE通常但不总是位于它们调控的基因的转录起始位点(TSS)的上游。“增强子”是增强(即上调)与它们可操作地连接的基因的转录的CRE，并且可见于它们调控的基因的上游、下游以及甚至内含子中。多个增强子可以以协调的方式起作用来调控一个基因的转录。在这种情况下，“沉默子”是指与被称为阻遏物的TF结合的CRE，阻遏物发挥作用来阻止或下调基因的转录。术语“沉默子”也可以指信使RNA的3'非翻译区中的区域，其结合阻遏该mRNA分子翻译的蛋白质，但这种用法不同于其在描述CRE中的用途。通常，本发明的CRE是肌肉特异性增强子(通常称为肌肉特异性CRE、或肌肉特异性CRE增强子等)。在该上下文中，优选CRE位于距离转录起始位点(TSS)1500个核苷酸或更少，更优选地距离TSS 1000个核苷酸或更少，更优选地距离TSS 500个核苷酸或更少，并且合适地距离TSS 250个、200个、150个或100个核苷酸或更少。本发明的CRE优选地长度相对较短，优选长度为100个核苷酸以下，例如它们长度可为90个、80个、70个、或60个核苷酸以下。
术语“顺式调控元件”或“CRM”意指通常包含两个以上的CRE的功能性模块；在本发明中，CRE通常是肝脏特异性增强子。因此，在本申请中，CRM通常包含多个肌肉特异性增强子CRE。通常，CRM内的多个CRE共同地(例如相加地或协同地)起作用以增强与CRM可操作地关联的基因的转录。CRM内的CRE的改组(shuffle)(即重新排序)、倒位(即反向取向)和改变间距存在相当大的范围。因此，本发明的CRM的功能变体包括参考的CRM的变体，其中它们内的CRE已经被打改组和/或倒位，和/或CRE之间的间距已经改变。
如本文所使用的，短语“启动子”是指通常位于发生转录所需的待转录核酸序列上游的DNA区域，即所述DNA区域起始转录。启动子允许在其控制下的恰当激活或抑制编码序列的转录。启动子通常包含被多个TF识别和结合的特定序列。TF结合至启动子序列并引起RNA聚合酶的募集，所述RNA聚合酶是从基因的编码区合成RNA的酶。本领域已知许多不同的启动子。
如本文所使用的，术语“合成的启动子”是指自然界中不存在的启动子。在该上下文中，它通常包含可操作地连接至最小(或核心)启动子或近端启动子(例如肌肉特异性的)的本发明的合成CRE和/或CRM。本发明的CRE和/或CRM用于增强与启动子可操作地连接的基因的肌肉特异性转录。合成的启动子的部分可以是天然存在的(例如最小启动子或启动子中的一个或多个CRE)，但合成的启动子作为完整实体不是天然存在的。
如本文所使用的，“最小启动子”(也称为“核心启动子”)是指自身无活性或很大程度上无活性，但在与其它转录调控元件组合时可以介导转录的短DNA区段。最小启动子序列可以源自各种不同的来源，包括原核基因和真核基因。最小启动子的实例如上所讨论，包括多巴胺β-羟化酶基因最小启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻早期基因最小启动子(CMV-MP)和疱疹胸苷激酶最小启动子(MinTK)。最小启动子通常包含转录起始位点(TSS)和直接在上游的元件、RNA聚合酶II的结合位点和一般转录因子结合位点(通常是TATA盒)。
如本文所使用的，“近端启动子”涉及最小启动子加上通常趋向于包含主要调控元件的基因上游的近端序列。它通常在TSS的上游延伸大约250个碱基对，并包含特定的TFBS。在该情况中，近端启动子是可以与本发明的一种或多种CRE或CRM组合的天然存在的近端启动子(例如，肝脏特异性或CNS特异性)。然而，近端启动子也可以是合成的。
在本发明的上下文中，顺式调控元件、反式调控元件、启动子或其它核酸序列的“功能变体”是参考序列的变体，该变体保留了以与参考序列相同的方式(例如作为肌肉特异性顺式调控增强子元件、肌肉特异性顺式调控木块或肌肉特异性启动子)发挥功能的能力。此类功能变体的替代术语包括“生物等同物”或“等同物”。
将理解的是，给定的顺式调控元件作为肌肉特异性增强子发挥功能的能力很大程度上由序列结合至与参考序列结合的相同的肌肉特异性TF的能力确定。因此，在大多数情况下，顺式调控元件的功能变体将包含与参考顺式调控元件相同的TF的TFBS。优选但非必需的，功能变体的TFBS与参考顺式调控元件处于相同的相对位置(即顺序)。也优选但非必需的，功能变体的TFBS与参考序列的方向相同(将注意的是，TFBS在一些情况下可以以相反的方向存在，例如作为相对于参考序列中的序列的反向互补体)。也优选但非必需的，功能变体的TFBS与参考序列位于相同的链上。因此，在优选的实施方式中，功能变体包含以相同的顺序、相同的方向和位于与参考序列相同的链上的用于相同TF的TFBS。还将理解的是，位于TFBS之间的序列(在一些情况下称为间隔区序列等)对顺式调控元件的功能影响较小。此类序列通常可以有相当大的不同，并且它们的长度可以改变。然而，在优选的实施方式中，间距(即相邻TFBS之间的距离)在功能变体中与它在参考序列中基本相同(例如，其差异不超过20％，优选不超过10％，且更优选大致相同)。明显的是，在一些情况下，顺式调控元件的功能变体可以以相反的方向存在，例如它可以是如上所述的顺式调控增强子元件的反向互补体、或其变体。
功能变体和参考序列之间的序列同一性水平也可以是指示物或保留的功能。顺序调控元件的TFBS中的高水平的序列同一性通常比间隔区序列(其中很少或不需要序列的任何保守性)中的序列同一性更重要。然而，将理解的是，考虑到功能性TFBS的序列不需要与共有序列完全匹配，即使在TFBS内，也可以容许相当程度的序列变异。
一种或多种TF结合至给定功能变体中的TFBS的能力可以通过本领域已知的任何相关手段来确定，包括但不限于电泳迁移测定(EMSA)、结合测定、染色质免疫沉淀(ChIP)和ChIP测序(ChIP-seq)。在优选的实施方式中，一种或多种TF结合给定的功能变体的能力由EMSA确定。进行EMSA的方法在本领域中是众所周知的。上文引用的Sambrook等中描述了合适的方法。描述此过程的许多相关文章都可用，例如Hellman和Fried，Nat Protoc.2007；2(8):1849-1861。
“肌肉特异性启动子”是指相比其它组织，在肌肉组织中促进更高表达的启动子。肌肉特异性启动子的实例包括但不限于肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、dMCK启动子、tMCK启动子，enh358MCK启动子和CK6启动子(Wang等，Gene Ther 15，1489-1499(2008))；以及Syn100启动子(Qiao等，MolecμLar Therapy，第22卷，第11期，第1890-1899页(2014))。本文提供了另外的肌肉特异性启动子。
“肌肉特异性”或“肌肉特异性表达”是指与其它组织(例如脾、肝、肺、血液和脑)相比，顺式调控元件、顺式调控模块或启动子增强或驱动基因在肌肉中(或在源自肌肉的细胞中)以优先或主导的方式表达的能力。所述基因的表达可以处于mRNA或蛋白质的形式。在优选的实施方式中，肌肉特异性表达使得在其它(即非肌肉)组织或细胞中的表达可忽略不计，即表达是高度肌肉特异性的。在一些实施方式中，肌肉特异性启动子促进骨骼肌和/或心肌中的表达。在一些实施方式中，相比在一个或多个其它组织中，肌肉特异性启动子在肌肉组织中促进30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的表达。在一些实施方式中，肌肉特异性启动子在一个或多个非肌肉组织中没有显著或可检测到的表达。
如本文所使用的术语“药学上可接受的”与本领域一致，并且意指与药物组合物的其它成分相容并且对其接受者无害。
术语“有效量”与“治疗有效量”、“有效剂量”或“治疗有效剂量”同义。本文所用的“治疗有效”量是指足以为受试者提供一些改善或益处的量。或者说，“治疗有效”量是指将对受试者的至少一种临床症状提供一些缓解、减轻、减少或稳定的量。本领域技术人员将意识到，治疗效果不需要是完全的或治愈的，只要给受试者提供一些益处即可。在实施方式中，可通过基于一种或多种临床症状和/或与该病症相关的生理指标观察个体的改善来确定本文公开的治疗性化合物治疗抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的有效性，但不限于此。在实施方式中，可通过减少对同步疗法的需求来指示与紊乱相关的症状的改善。
如本文所使用的“预防有效”量是相对于在不存在本发明方法的情况下发生的那些，足以预防和/或延迟受试者的疾病、紊乱和/或临床症状的发作，和/或减轻和/或延迟受试者的疾病、紊乱和/或临床症状的发作的严重程度的量。本领域技术人员将理解的是，预防水平不需要是完全的，只要为受试者提供一些预防益处即可。
编码FKRP的核酸
本发明的一个方面涉及编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的合成核酸。FKRP是被鉴定为DG糖基化途径中的蛋白之一。它参与α-DG中O连接的甘露糖的糖基化(Qiao等，Molecular Therapy 22，第1890-1899页(2014))。人FKRP具有良好的特征。编码FKRP的基因中的突变导致广泛的疾病表型，包括轻度肢带型肌营养不良2I(LGMD2I)、严重Walker-Warburg综合征、先天性肌营养不良1C型(CMD1C)和肌眼脑疾病。FKRP基因的突变也可导致伴有脑和眼异常的严重先天性肌营养不良-抗肌萎缩相关糖蛋白病(A5型；MDDGA5)以及伴有或不伴有智力发育受损的先天性肌肉营养不良-抗肌萎缩相关糖蛋白病(B5型；MDDGB5)。将功能性FKRP基因引入患有此类疾病的受试者中以增加受试者肌肉组织中的表达和功能性FKRP水平将对受试者具有治疗益处。对引入受试者的编码FKRP蛋白的核酸进行优化使表达最大化，从而增加对受试者的治疗益处。优化包括但不限于CpG位点的减少和编码FKRP的核酸的GC含量的总体减少。
在一个实施方式中，受试者具有导致FKRP缺乏的FKRP突变。导致FKRP缺乏的示例性FKRP突变描述于例如Liang，W-C等，Orphanet Journal of Rare Diseases(2020)15：160；Liu，W，等，bioRxiv preprint,doi:10.1101/502708；发布于2019年2月7日；Nallamili，B等，Annals of Clinical and Translational Neurology 2018，5(12)：1574-1587；Murphy，L.B.等，Annals of Clinical and Translational Neurology 2020；7(5)：757-766，并在本文的表13中提供。
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此外，在万维网uniprot.org/uniprot/Q9H9S5上进一步描述了已知的FKRP突变。
CpG位点或CG位点是DNA的区域，其中在碱基的线性序列中沿其5'→3'方向，胞嘧啶核苷酸后面是鸟嘌呤核苷酸。CpG位点数量的缺失或减少可降低受试者中引入的编码序列的免疫原性。这是由于TLR-9与DNA序列结合的减少或完全抑制，这种结合发生在CpG位点。众所周知，CpG基序的甲基化导致转录沉默。序列中CpG基序的去除预计导致TLR-9识别降低和/或甲基化降低，从而降低转基因沉默。在一些实施方式中，从FKRP编码序列中省略了一个或多个CpG位点。在一些实施方式中，从FKRP编码序列中省略了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或所有CpG位点。在一些实施方式中，从FKRP编码序列中省略了所有CpG(或100％CpG)位点。通过用不同的核苷酸进行置换来实现CpG位点的去除或缺失，保留所编码的蛋白的氨基酸序列。
FKRP编码序列的另一种优化形式是降低核酸的总GC含量。这是通过从序列中消除鸟嘌呤和胞嘧啶并根据需要替换它们来保存FKRP蛋白的编码氨基酸序列来实现的。可通过与减少前的FKRP编码序列(例如天然序列SEQ ID NO：6)进行比较来定量GC含量的减少。在一些实施方式中，与天然序列(SEQ ID NO：6)相比，FKRP编码序列的总GC含量减少了大于10％。在一些实施方式中，编码FKRP的合成多核苷酸包含编码FKRP核苷酸序列、基本上由编码FKRP核苷酸序列组成或由编码FKRP核苷酸序列组成，其中，GC含量与SEQ ID NO：6的GC含量相比减少约11％至约15％(例如10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％或其中的任何范围或值)。在一些实施方式中，GC含量减少约15％或更多(例如，15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％、20％或更多)。在一些实施方式中，与SEQ ID NO：6的GC含量相比，GC含量减少约20％至约30％(例如，20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％)。在一些实施方式中，与SEQ IDNO：6的GC含量相比，GC含量减少约30％-40％(例如，30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％或40％)。在一些实施方式中，与SEQ ID NO：6的GC含量相比，GC含量减少了约40％-50％、约50％-60％、约60％-70％。本发明人惊奇地发现，与其中增加GC含量被理解为增加表达(Kudla等，PLos Biology DOI:10.1371/journal.pbio.0040180(2006))这种核酸表达和蛋白生产领域中通常理解的相反，，与编码FKRP的天然多核苷酸相，减少由SEQ ID NO：6编码的多核苷酸的GC含量大于10％使所述多核苷酸的表达增加，从而与编码FKRP的天然多核苷酸相比使FKRP的产生增加。
如本文所用，“coFKRP”是指密码子优化的FKRP，包含0％的CpG耗尽FKRP。
在一些实施方式中，合成核酸具有SEQ ID NO：2中列出的核苷酸序列。在一些实施方式中，合成核酸具有与SEQ ID NO：2具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，合成核酸具有与SEQ ID NO：2具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，合成核酸与SEQ ID NO：2具有所指示的序列同一性，并且进一步具有本文所述的本文所指示的减少的CpG位点(例如，0％)和/或减少的GC含量(例如，相对于SEQ ID NO：6，大于10％或者15％或更多)。
在一些实施方式中，合成核酸具有SEQ ID NO：407中列出的核苷酸序列。在一些实施方式中，合成核酸具有与SEQ ID NO：407具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，合成核酸具有与SEQ ID NO：407具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，合成核酸与SEQ ID NO：407具有所指示的序列同一性，并且进一步具有本文所述的本文所指示的减少的CpG位点(例如，0％)和/或减少的GC含量(例如，相对于SEQ ID NO：6，大于10％或者15％或更多)。
在一些实施方式中，编码FKRP的合成核酸进一步包含启动子(例如，肌肉特异性启动子)。优选地，FKRP可操作地连接到启动子。在一个实施方式中，肌肉特异性启动子为Syn100。本文描述了用于包含在合成核酸中的各种肌肉特异性启动子(例如，合成的)(例如，表1-表4中的启动子)。在一些实施方式中，包含SEQ ID NO：2的rAAV进一步包含肌肉特异性启动子(例如Syn100)；或者，选自表1-表4的合成肌肉特异性启动子或其片段，和/或增强子，和/或顺式调控元件(CRE；参见例如表1-表4)，或它们的任意组合；或者，选自表8-表12的缩短的肌肉特异性启动子或其片段，和/或顺式调控元件(CRE；参见例如表8-表12)，或它们的任意组合。在一些实施方式中，包含SEQ ID NO：407的rAAV进一步包含肌肉特异性启动子(例如Syn100)；或者，选自表1-表4的合成肌肉特异性启动子或其片段，和/或增强子，和/或顺式调控元件(CRE；参见例如表1-表4)，或它们的任意组合；或者，选自表8-表12的缩短的肌肉特异性启动子或其片段，和/或顺式调控元件(CRE；参见例如表8-表12)，或它们的任意组合。
在一些实施方式中，如本文所述，合成核酸进一步包含一种或多种额外的调控组分和/或载体(例如病毒载体)的组分。在一些实施方式中，额外的调控组分为增强子序列(例如，CMV增强子、肌肉肌酸激酶增强子、肌球蛋白轻链增强子等，及其组合)。在一些实施方式中，合成核酸进一步包含本文公开的一种或多种AAV基因组元件，例如反向末端重复。在一些实施方式中，该核酸进一步包含5'和3'AAV ITR。
包含编码FKRP的核酸的载体
本发明的另一个方面涉及包含本文公开的编码FKRP的合成核酸的载体。此类载体和包含所述载体的组合物用于合成核酸的生产、载体的生产以及提高细胞(例如，有需要的受试者的肌肉细胞)中功能性FKRP水平的治疗用途。在各种实施方式中，包含核酸的载体将进一步包含可操作地连接至核酸的调控序列，视情况而定。本文描述了这样的调控序列的实例。
在一些实施方式中，载体(例如，病毒载体如AAV)可进一步包含减少肝脏中表达的核酸元件。在代表性的实施方式中，载体进一步包含mir122结合元件。mir122序列及其用于减少肝脏中的表达在本领域中是众所周知的(参见，例如，Qiao等，Gene Therapy 18，403-410(2011年4月)doi:10.1038/gt.2010.157)。
在一些实施方式中，载体为非病毒载体，例如质粒。本文提供了非病毒载体的实例。在一些实施方式中，载体为病毒载体。
重组病毒载体及生产
在本发明的一些实施方式中，载体为DNA或RNA病毒。本发明的病毒载体的非限制性实例包括AAV载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体和嵌合病毒载体。
本领域已知的任何病毒载体均可用于本发明。此类病毒载体的实例包括但不限于源自以下病毒的载体：腺病毒科(Adenoviridae)；双RNA病毒科(Birnaviridae)；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)；杯状病毒科(Caliciviridae)；毛状病毒组(Capillovirus group)；香石竹潜病毒组(Carlavirus group)；香石竹斑驳病毒组(Carmovirus virus group)；花椰菜花叶病毒组(Group Caulimovirus)；长线形病毒组(Closterovirus Group)；鸭跖草黄斑驳病毒组(Commelina yellow mottle virus group)；豇豆花叶病毒组(Comovirusvirus group)；冠状病毒科(Coronaviridae)；PM2噬菌体组；Corcicoviridae；隐潜病毒组(Group Cryptic virus)；隐病毒组(group Cryptovirus)；黄瓜花叶病毒组家族(Cucumovirus virus group Family)；[PHgr]6噬菌体组；Cysioviridae；康乃馨环斑病组；香石竹病毒组(Dianthovirus virus group)；蚕豆萎蔫病组(Group Broad bean wilt)；豆科病毒组(Fabavirus virus group)；丝状病毒科(Filoviridae)；黄病毒科(Flaviviridae)；真菌传杆状病毒组(Furovirus group)；双生病毒组(GroupGerminivirus)；贾第虫病毒组(Group Giardiavirus)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)；疱疹病毒科(Herpesviridae)；大麦病毒组(Hordeivirus virus group)；Illarvirus病毒组；丝杆状病毒科(lnoviridae)；虹彩病毒科(Iridoviridae)；光滑病毒科(Leviviridae)；脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)；黄矮病毒组(Luteovirus group)；Marafivirus病毒组；玉米褪绿矮缩病毒组(Maize chlorotic dwarf virus group)；icroviridae；肌病毒科(Myoviridae)；坏死病毒组(Necrovirus group)；线虫传多面体病毒组(Nepovirus virusgroup)；野田村病毒科(Nodaviridae)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)；乳多空病毒科(Papovaviridae)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)；欧防风黄点病毒组(Parsnip yellowfleck virus group)；双分体病毒科(Partitiviridae)；细小病毒科(Parvoviridae)；豌豆耳突花叶病毒组(Pea enation mosaic virus group)；藻类DNA病毒科(Phycodnaviridae)；微小RNA病毒科(Picornaviridae)；Plasmaviridae；Prodoviridae；多分DNA病毒科(Polydnaviridae)；马铃薯x病毒组(Potexvirus group)；马铃薯y病毒组(Potyvirus)；痘病毒科(Poxviridae)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)；逆转录病毒科(Retroviridae)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)；根前毛壶菌病毒组(GroupRhizidiovirus)；长尾病毒科(Siphoviridae)；南方菜豆花叶病毒组(Sobemovirusgroup)；SSV 1型噬菌体；复层病毒科(Tectiviridae)；纤细病毒属(Tenuivirus)；四病毒科(Tetraviridae)；烟草花叶病毒组(Group Tobamovirus)；烟草脆裂病毒组(GroupTobravirus)；披膜病毒科(Togaviridae)；番茄丛矮病毒组(Group Tombusvirus)；GroupTobovirus；整体病毒科(Totiviridae)；芜菁黄花叶病毒组(Group Tymovirus)；和植物病毒卫星(Plant virus satellites)。
产生的病毒载体可部分或全部包含任何天然存在和/或重组病毒载体核苷酸序列(如AAV、腺病毒、慢病毒等)或变体的基因组。病毒载体变体可在核酸和氨基酸水平上具有显著同源性的基因组序列，产生通常是物理和功能等价物的病毒载体，通过类似机制复制，并通过类似机制组装。
可通过本领域已知的任何手段生产包含本文所述FKRP转基因盒的病毒载体。不受限制，生产病毒颗粒的方法的一个实例为包括以下的方法：(a)提供本文所述的任何稳定细胞系(例如，具有在病毒表达系统中处于诱导型启动子的控制下的异源毒蛋白的稳定表达的细胞系)；(b)在表达至少一种毒蛋白的条件下对细胞进行培养，其中所述至少一种毒蛋白可操作地连接至至少一种诱导型启动子；(c)在生产病毒颗粒的条件下对细胞进行培养；以及(d)任选地分离病毒颗粒。
可以在例如Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.等，(编著)Greene Publishing Associates,(1989)和其它标准实验室手册(例如Vectors forGene Therapy,In:Current Protocols in Human Genetics.John Wiley and Sons,Inc.:1997)中找到用于产生重组病毒载体和用于使用病毒载体进行核酸递送的方案。此外，AAV载体的生产进一步描述于例如美国专利号9,441,206中，通过引用的方式将其内容整体并入本文。
可以使用任何标准技术来释放病毒表达系统中产生的病毒载体(即，使其从产生该载体的细胞中游离)。例如，可以通过机械方法(例如微流化、离心或超声)或化学方法(例如裂解缓冲液和去污剂)来释放病毒载体。然后，使用本领域的标准方法回收(即收集)和纯化所释放的病毒载体以获得纯的群体。例如，可以通过纯化方法将病毒载体从所述病毒载体被释放入其中的缓冲液中回收，包括使用深度过滤或切向流过滤(TFF)的澄清步骤。如本文实施例中所述，可以通过超声将病毒载体从细胞中释放，并通过使用柱层析对澄清裂解物进行纯化来回收。
变体病毒载体序列可用于在本文所述的病毒表达系统中生产病毒载体。例如，更多序列与给定载体(例如AAV、腺病毒、慢病毒等)具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或更多的核苷酸和/或氨基酸序列同一性(例如具有约75％-99％核苷酸序列同一性的序列)。
应当理解的是，病毒表达系统将进一步经修饰以包含在使用本文描述的方法生产给定病毒载体期间补充给定病毒载体所需的任何必要元件。例如，在某些实施方式中，核酸盒侧接有末端重复序列。在一个实施方式中，对于rAAV载体的生产，AAV表达系统将进一步包含重组AAV质粒、表达Rep的质粒、表达Cap的质粒和腺病毒辅助质粒中的至少一种。用于给定病毒载体的补充(complementary)元件是本领域众所周知的，并且熟练的从业者将能够相应地修改本文所述的病毒表达系统。
用于制备AAV载体的病毒表达系统(例如AAV表达系统)可以进一步包含例如处于诱导型启动子控制下的反式的复制(Rep)基因和/或衣壳(Cap)基因。Rep和Cap的表达可以处于一种诱导型启动子的控制下，使得这些基因的表达一起“开启”，或处于两个单独的诱导型启动子的控制下，这些启动子由不同的诱导物“开启”。在AAV基因组的左侧有称为p5和p19的两个启动子，从中可以产生不同长度的两个重叠信使核糖核酸(mRNA)。这些中的每一个都包含可剪接出或不可剪接出的内含子，使得产生四个潜在的Rep基因；Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep基因(特别是Rep78和Rep68)与由ITR在自启动行为中形成的发夹结合，并在发夹内的指定末端解析位点切割。它们对于AAV基因组的AAVS1特异性整合是必需的。所有四种Rep蛋白均示出了结合ATP并具有解旋酶活性。正义AAV基因组的右侧编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠序列，它们从一个启动子(指定p40)开始。cap基因产生额外的非结构蛋白，称为组装激活蛋白(AAP)。这种蛋白质由ORF2产生，并且对衣壳组装过程至关重要。用于制备AAV载体的必要元件在本领域中是已知的，并且可进一步综述于例如美国专利号US5478745A；US5622856A；US5658776A；US6440742B1；US6632670B1；US6156303A；US8007780B2；US6521225B1；US7629322B2；US6943019B2；US5872005A；和美国专利申请号US2017/0130245；US20050266567A1；US20050287122A1；通过引用的方式将其各自的内容整体并入本文。
使用本文所述的方法制备慢病毒的病毒表达系统将进一步包含侧接核酸盒的长末端重复(LTR)。LTR是相同的DNA序列，其在逆转录转座子或由逆转录病毒RNA逆转录形成的前病毒DNA的任一末端重复数百或数千次。LTR通过LTR特异性整合酶介导宿主染色体与逆转录病毒DNA整合。用于制备慢病毒载体的LTR和方法进一步描述于例如美国专利号US7083981B2；US6207455B1；US6555107B2；US8349606B2；US7262049B2；和美国专利申请号US20070025970A1；US20170067079A1；US20110028694A1；通过引用的方式将其各自的内容整体并入本文。
使用本文描述的方法制备腺病毒的病毒表达系统将进一步包含侧接核酸盒的大约90-140个碱基对(确切长度取决于血清型)的相同的反向末端重复(ITR)。病毒的复制起点确切地位于基因组末端的ITR内。腺病毒基因组是大约36000个碱基对的线性双链DNA分子。通常，用于基因疗法的腺病毒载体在E1区域中具有缺失，在其中可以引入新遗传信息；E1缺失使重组病毒复制有缺陷。用于制备腺病毒载体的ITR和方法进一步描述于例如美国专利号US7510875B2；US7820440B2；US7749493B2；US7820440B2；US10041049B2；国际专利申请号WO2000070071A1；和美国专利申请号WO2000070071A1；US20030022356A1；US20080050770A1，通过引用的方式将其各自的内容整体并入本文。
在一个实施方式中，病毒表达系统可为宿主细胞(例如病毒、哺乳动物细胞或昆虫细胞)。示例性昆虫细胞包括但不限于Sf9、Sf21、Hi-5和S2昆虫细胞系。例如，如果病毒表达系统是昆虫细胞，则用于制备AAV载体的病毒表达系统可以进一步包含杆状病毒表达系统。杆状病毒表达系统被设计用于从杆状病毒感染的昆虫细胞中高效地进行大规模病毒生产和重组蛋白表达。杆状病毒表达系统进一步描述于例如美国专利号US6919085B2；US6225060B1；US5194376A；通过引用的方式将其各自的内容整体并入本文。
在另一实施方式中，病毒表达系统是无细胞系统。用于病毒载体生产的无细胞系统进一步描述于例如Cerqueira A.等，Journal of Virology,2016；Sheng J.等，TheRoyal Society of Chemistry,2017；以及Svitkin Y.V.和Sonenberg N.Journal ofVirology,2003；通过引用的方式将其内容整体并入本文。在一些实施方式中，通过包含至少一种DD-ITR的非病毒DNA构建体递送本文公开的核酸序列。通过引用的方式将WO 2019/246554中描述的非病毒DNA构建体以其整体并入本文。
rAAV载体和生产
本发明的各方面涉及重组AAV载体，所述重组AAV载体包含本文所述的编码FKRP的合成核酸。在一个实施方式中，本文公开的rAAV载体(也称为rAAV病毒粒子)包含衣壳蛋白和衣壳蛋白内的rAAV基因组。在本文所述的载体和方法中使用的rAAV病毒粒子的rAAV衣壳为表6中列出的任一种，或其任意组合。在一个实施方式中，本发明的rAAV包含来自表6中描述的AAV血清型的衣壳蛋白中的至少一个衣壳蛋白序列。
表6：AAV血清型和示例性公布的相应衣壳序列
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表7描述了可用作本文所述的rAAV载体以及生产所述AAV载体的方法的AAV衣壳的示例性嵌合或变体衣壳蛋白，或者可与野生型衣壳蛋白和/或现在已知或以后鉴别的其它嵌合或变体衣壳蛋白任意组合；通过引用的方式将表7中所述的参考文献并入本文。在一些实施方式中，rAAV载体为嵌合载体，例如，9,012,224和US 7,892,809中公开的嵌合载体，通过引用的方式将其整体并入本文。在一些实施方式中，rAAV包含来自表7中列出的嵌合或变体衣壳的至少一个衣壳。
在一些实施方式中，rAAV载体为多倍体rAAV载体(如PCT/US2018/022725中所公开)，或合理的多倍体(或单倍体)rAAV载体(例如，如2018年7月31日提交的PCT/US2018/044632和美国专利号10,550,405中所公开)，通过引用的方式将其中每一个以其整体并入本文。在一些实施方式中，rAAV载体为rAAV3载体(如美国专利号9,012,224和WO 2017/106236中所公开，通过引用的方式将其整体并入本文)。
表7：示例性嵌合和rAAV变体衣壳
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在一个实施方式中，本文公开的rAAV载体包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与USPTO授权的专利和公开的申请的文件包装器中列出的以下生物学序列文件中的任一项相关，所述文件描述了可以以与野生型衣壳蛋白和/或目前已知或以后鉴别的其它嵌合或变体衣壳蛋白的任意组合并入本发明的AAV衣壳中的嵌合衣壳蛋白或变体衣壳蛋白(出于说明性目的，11486254对应于美国专利申请号11/486,254，并且其它生物序列文件将以类似的方式解读)：11486254.raw、11932017.raw、12172121.raw、12302206.raw、1238959.raw、12679144.raw、13036343.raw、13121532.raw、13172915.raw、13583920.raw、13668120.raw、13673351.raw、13679684.raw、14006954.raw、14149953.raw、14192101.raw、14194538.raw、14225821.raw、14468108.raw、14516544.raw、14603469.raw、14680836.raw、14695644.raw、14878703.raw、14956934.raw、15191357.raw、15284164.raw、15368570.raw、15371188.raw、15493744.raw、15503120.raw、15660906.raw和15675677.raw。
在实施方式中，本发明的AAV衣壳蛋白和病毒衣壳可以是嵌合的，其中，它们可以包含来自另一种病毒的衣壳亚基的全部或部分，所述另一种病毒可选地为另一种细小病毒或AAV，例如，如国际专利公开WO 00/28004中所述的，以引用的方式将其并入。
在一些实施方式中，rAAV载体基因组是单链的或单体的双链体，如美国专利号8,784,799所述的，通过引用的方式将其并入本文。
作为进一步的实施方式，本发明的AAV衣壳蛋白和病毒衣壳可以是多倍体(也称为单倍体)，其中，它们可以在单个AAV衣壳中包含VP1、VP2和VP3 AAV血清型的不同组合，如PCT/US18/22725所述的，以引用的方式将其并入。
在一个实施方式中，衣壳可为任何衣壳，但优选为肌肉向性衣壳，例如，设计为优先为骨骼肌特异性和/或心肌特异性的合理单倍体衣壳。
在一个实施方式中，用于制造缺乏细菌序列的rAAV的核酸具有SEQ ID NO：406中列出的核苷酸序列。在一个实施方式中，用于制造缺乏细菌序列的rAAV的核酸具有与SEQID NO：406具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，本发明的rAAV由质粒DNA模板制造，例如如图13所示。在一些实施方式中，本发明的rAAV由封闭端线性双链体DNA(例如，如SEQ IDNO：406中所述)制造。
为了促进它们向细胞中的引入，对于本发明有用的rAAV载体基因组为包含如下的重组核酸构建体：(1)待表达的异源序列(在一个实施方式中，编码FKRP多肽的多核苷酸)和(2)促进异源基因整合和表达的病毒序列元件。病毒序列元件可包含AAV载体基因组中将DNA复制和包装(例如功能ITR)到AAV衣壳中所需的顺式序列。
优化的rAAV载体基因组
在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，由本文公开的元件中的任一种以任意组合创建优化的rAAV载体基因组，包含编码启动子、ITR、poly-A尾的核酸序列、能够增加或减少异源基因表达的元件；并且在一个实施方式中，包含对FKRP在体内的表达进行密码子优化的核酸序列，和任选的降低免疫原性的一种或多种元件。此类优化的rAAV载体基因组可与对组织和细胞(例如骨骼肌和心肌)具有向性的任何AAV衣壳一起使用，在所述组织和细胞中rAAV载体基因将被转导和表达。
重组AAV载体生产
可通过本领域已知的任何方法生产本文所述的重组AAV载体。不受限制，生产腺相关病毒(AAV)颗粒的此类方法的一个实例包括(a)提供本文所述的稳定细胞中的任一种，例如具有AAV表达系统中的处于诱导型启动子控制下的AAV载体生产所需的至少一种异源毒蛋白(例如rep或cap)的稳定表达的细胞系；(b)在表达至少一种毒蛋白的条件下对所述细胞进行培养；(c)在产生AAV颗粒的条件下对所述细胞进行培养；以及(d)任选地分离AAV颗粒。
在一个实施方式中，在产生AAV颗粒的条件下对细胞进行培养的步骤仅在毒蛋白充分表达后发生。例如，在细胞与诱导物接触或对细胞施加合适的诱导条件后的至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时或更多小时。如本文所使用的，“充分表达”是指正常功能所需的蛋白质表达水平，例如细胞中诱导复制所需的rep蛋白水平。
如果细胞包含多于一种不同的诱导型启动子，则可以诱导多于一种诱导型启动子以在基本上相同的时间或在不同的时间驱动蛋白质的表达。或者，如果细胞包含多于一种不同的诱导型启动子，则可以诱导多于一种诱导型启动子以驱动在相同时间段或不同时间段内诱导的蛋白质的表达。在一个实施方式中，细胞与至少两种诱导物在基本上相同的时间和相同的持续时间中培养。在一个实施方式中，当用第二诱导物进行的培养开始时，用第一诱导物进行的培养正在发生，从而在培养方面具有重叠。这有时在本文中被称为“同步”或“同时培养”。在其它实施方式中，用第一诱导物进行的培养在用第二诱导物进行的培养开始之前结束。当培养基本上同时或同步进行时，可在相同的培养基中提供第一诱导物和第二诱导物。或者，当培养基本上同时或同步进行时，可在不同的培养基中提供第一诱导物和第二诱导物。
在一个实施方式中，细胞处于悬浮下进行培养。在另一实施方式中，细胞在无动物组分的条件下进行培养。无动物组分培养基可为与给定细胞系(例如HEK293细胞)相容的任何无动物组分培养基(例如无血清培养基)。实例包括但不限于SFM4Transfx-293(Hyclone)、Ex-Cell 293(JRH Biosciences)、LC-SFM(Invitrogen)和Pro293-S(Lonza)。
足以进行AAV颗粒复制和包装的条件可为例如存在足以复制AAV模板和封装成AAV衣壳的AAV序列(例如AAV rep序列和AAV cap序列)和来自腺病毒和/或疱疹病毒的辅助序列。在特定实施方式中，AAV模板包含两个AAV ITR序列，它们位于异源核酸序列的5'侧和3'侧，尽管它们不需要与异源核酸序列直接邻接。
在一些实施方式中，AAV模板包含如国际专利公开WO01/92551和美国专利号8,784,799中所述的不被Rep解析(revolved)以制备双链AAV载体的ITR。
AAV模板和AAV Rep和/或Cap序列在使得包含包装在AAV衣壳内的AAV模板的病毒载体在细胞中产生的条件下提供。该方法可以进一步包括从培养物中收集病毒载体的步骤。在一个实施方式中，可以例如在将细胞从培养基中移除之后，通过裂解细胞来收集病毒载体(例如通过沉淀细胞)。在另一实施方式中，可以从培养细胞的培养基中收集病毒载体，例如以分离从细胞分泌的载体。例如在用于收集rAAV的培养步骤期间以固定间隔(例如每12小时、18小时、24小时或36小时，或与细胞活力和载体生产相容的更长时间)(例如从转染后约48小时开始)，可以一次或多于一次从培养物中去除培养基的部分或全部。去除培养基后，可以将具有或不具有额外营养补充剂的新鲜培养基添加到培养物中。在一个实施方式中，细胞可以在灌注系统中培养，使得培养基不断流过细胞并被收集以分离分泌的rAAV。只要转染的细胞保持活力(例如转染后48小时、72小时、96小时或120小时或更长时间)或者在使用表达毒蛋白的诱导型启动子的情况下(例如诱导后48小时、72小时、96小时或120小时或更长时间)，就可以持续地从培养基中收集rAAV。在某些实施方式中，用不结合或仅松散结合所述生产细胞的AAV血清型(例如AAV8和AAV9)进行分泌的rAAV的收集。在其它实施方式中，用结合AAV血清型(例如AAV2)的肝素进行分泌的rAAV的收集，其经修饰而不与产生它们的细胞结合。合适的修饰以及rAAV收集技术的实例在美国公开号2009/0275107中公开，通过引用的方式将其整体并入本文。
如果稳定细胞系并不稳定地或瞬时地表达Rep或Cap，这些序列将被提供给AAV表达系统。AAV Rep或Cap序列可以通过本领域已知的任何方法来提供。目前的方案通常在单个质粒上表达AAV Rep/Cap基因。AAV复制和包装序列不需要一起提供，尽管这样做可能很方便。AAV Rep和/或Cap序列可以由任意病毒或非病毒载体提供。例如，rep/cap序列可由杂合腺病毒或疱疹病毒载体提供(例如插入至缺失的腺病毒载体的Ela或E3区域中)。EBV载体也可用于表达AAV Rep和Cap基因。该方法的一个优点是EBV载体是附加型的，但在连续的细胞分裂中仍将保持高拷贝数(即作为染色体外元件稳定整合到细胞中，指定为“基于EBV的核附加体”，参见Margolski,Curr.Top.Microbial.Immun.158:67(1992))。
通常，AAV Rep/Cap序列将不侧接有TR，以阻止这些序列的挽救和/或包装维持。
可以使用本领域已知的任何方法将AAV模板提供至细胞。例如，模板可以由非病毒(例如质粒)或病毒载体提供。在特定实施方式中，AAV模板由疱疹病毒或腺病毒载体提供(例如插入至缺失的腺病毒的Ela或E3区域中)。作为另一说明，Palombo等，J.Virol.72:5025(1998)描述了携带侧接有AAV TR的报告基因的杆状病毒载体。如上文关于rep/cap基因所述，EBV载体也可用于递送模板。
在另一代表性实施方式中，AAV模板由复制型rAAV病毒提供。在其它实施方式中，包含AAV模板的AAV前病毒稳定地整合到细胞染色体中。
为了提高病毒滴度，可以向细胞提供促进生产性AAV感染的辅助病毒功能(例如腺病毒或疱疹病毒)。AAV复制所必需的辅助病毒序列是本领域已知的。通常，这些序列将由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。或者，腺病毒或疱疹病毒序列可以由另一非病毒或病毒载体(例如作为携带促进有效AAV生产的所有辅助基因的非感染性腺病毒微型质粒)提供，如Ferrari等，Nature Med.3:1295(1997)和美国专利号6,040,183和6,093,570中所述，通过引用的方式将其并入本文。
此外，辅助病毒功能可由具有嵌入染色体中或作为稳定的染色体外元件维持的辅助序列的包装细胞提供。通常，辅助病毒序列不能被包装到AAV病毒粒子中，例如不侧接有TR。
本领域技术人员能够理解的是，在单个辅助构建体上提供AAV Cap和Rep序列以及辅助病毒序列(例如腺病毒序列)可能是有利的。在一个实施方式中，由单个辅助构建体编码的至少一种基因产物的表达由诱导型启动子控制。该辅助构建体可为非病毒构建体或病毒构建体。作为一个非限制性说明，辅助构建体可为包含AAV Rep和/或Cap基因的杂合腺病毒或杂合疱疹病毒。
在一个具体实施方式中，AAV Rep和/或Cap序列以及腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。该载体可以进一步包含AAV模板。AAV Rep和/或Cap序列和/或AAV模板可以插入到腺病毒的缺失区域(例如E1a或E3区域)中。在一个实施方式中，由AAV模板编码的至少一种基因产物的表达由诱导型启动子控制。
在又一实施方式中，AAV Rep和/或Cap序列以及腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。根据该实施方式，AAV模板可作为质粒模板提供。
在另一说明性实施方式中，AAV Rep和/或Cap序列以及腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供，并且AAV模板作为前病毒整合到细胞中。或者，AAV模板作为染色体外元件由维持在细胞内的EBV载体提供(例如作为基于EBV的核附加体)。
本文所述的诱导型和阻抑型启动子的使用可用于实现病毒载体生产所需的任何毒蛋白(例如Rep和Cap)的时间调控。在一个实施方式中，诱导型和/或阻抑型启动子提供了对毒蛋白表达的精细微调，使得可以在生产期间调整表达的开始和停止以达到期望的表达水平和在期望的时间点表达。
在另一示例性实施方式中，AAV Rep和/或Cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。AAV模板可以作为单独的复制型病毒载体提供。例如，AAV模板可以由AAV颗粒或第二重组腺病毒颗粒提供。
根据前述方法，杂合腺病毒载体通常包含足以用于腺病毒复制和包装的腺病毒5'和3'顺式序列(即腺病毒末端重复和PAC序列)。AAV rep和/或cap序列和AAV模板(如果存在的话)嵌入到腺病毒骨架中并且侧接有5'和3'顺式序列，因此这些序列可被包装到腺病毒衣壳中。如上所述，腺病毒辅助序列以及AAV rep和/或cap序列通常不侧接有TR，因此这些序列不被包装到AAV病毒粒子中。Zhang等，Gene Ther.18:704((2001))描述了包含腺病毒以及AAV rep和/或cap基因二者的嵌合辅助体。
疱疹病毒也可用作AAV包装方法中的辅助病毒。编码AAV Rep蛋白的杂合疱疹病毒可有利地促进可扩展的AAV载体生产方案。已经描述了表达AAV-2rep和cap基因的杂合单纯疱疹病毒I型(HSV-1)载体(Conway等，Gene Ther.6:986(1999)和WO 00/17377)。
可以通过本领域已知的任何方法获得不含污染性辅助病毒的AAV载体原种(stock)。例如，AAV和辅助病毒可以很容易地根据大小进行区分。基于对肝素底物的亲和力，AAV也可以与辅助病毒分离(Zolotukhin等，Gene Ther.6:973(1999))。可以使用缺失的复制缺陷型辅助病毒，以使任何污染性辅助病毒都无法复制。作为又一替代方案，可以使用缺乏晚期基因表达的腺病毒辅助体，因为只需要腺病毒早期基因表达来介导AAV的包装。对于晚期基因表达呈缺陷性的腺病毒突变体是本领域已知的(例如ts100K和ts149腺病毒突变体)。
在各种实施方式中，生产本发明AAV病毒载体的方法是完全可扩展的，因此它可以在任何期望体积的培养基中进行，例如从10mL(例如在摇瓶中)到10L、50L、100L或更多(例如在生物反应器中(如Wave生物反应器系统和搅拌罐))。在一个实施方式中，rAAV使用封闭端线性双链核酸进行生产。在其它实施方式中，rAAV使用其它形式的核酸(例如质粒DNA)进行生产。
所述方法适用于生产AAV的所有血清型和嵌合体，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13及其任意嵌合体。
在某些实施方式中，所述方法在纯化之前提供每细胞至少约1×104个含载体基因组的颗粒，例如，在纯化之前每细胞至少约2×104个、3×104个、4×104个、5×104个、6×104个、7×104个、8×104个、9×104个或1×105个或更多个含载体基因组的颗粒。在其它实施方式中，所述方法提供每升细胞培养物至少约1×1012个经纯化的含载体基因组的颗粒，例如，每升细胞培养物至少约5×1012个、1×1013个、5×1013个、或1×1014个或更多个经纯化的含载体基因组的颗粒。
rAAV基因组元件
如本文所公开的，本发明的各方面涉及包含编码FKRP的合成核酸的rAAV载体。rAAV载体包含衣壳，并且其衣壳内的核苷酸序列称为“rAAV载体基因组”。rAAV载体基因组(也称为“rAAV基因组”)包含多个元件，包括但不限于两个反向末端重复(ITR，例如5'-ITR和3'-ITR)。通常，位于ITR之间的是额外的元件，包括以下一种或多种：可操作地连接至编码FKRP的合成核酸(作为异源基因)的启动子(例如肌肉特异性启动子)，和可操作地连接至所述合成核酸的polyA信号序列。通常，polyA信号序列在功能上位于编码序列的下游。在一些实施方式中，polyA信号具有SEQ ID NO：5中所示的核酸序列。可使用的其它polyA信号序列不受限地包括bGH、hGH、SV40早期、SV40晚期、合成polyA、rBG polyA、TK polyA、牛生长激素、兔β珠蛋白和SV40 polyA信号。本文提供了polyA信号序列的额外实例。
在一些实施方式中，异源核酸序列可进一步包含一个或多个额外元件(例如，调控元件、间隔区元件)，例如内含子序列和polyA信号序列。在一些实施方式中，内含子序列位于启动子和编码FKRP的核酸之间，并且可操作地定位以促进表达(例如，在受试者中)。在一些实施方式中，内含子序列为VH4-Ig内含子3(SEQ ID NO：4)。其它可能的内含子序列的实例不受限地包括嵌合pro mega内含子、cmv内含子、嵌合鸡β肌动蛋白-人珠蛋白内含子、mvm内含子、人ubB内含子、人UbC内含子、人β珠蛋白IVS2。本文提供了额外的内含子序列。
本文讨论了rAAV基因组中的每个元件。
内含子序列
在一些实施方式中，rAAV基因型包含位于启动子序列的3'端的内含子序列。内含子序列用于增加以下的一种或多种：mRNA稳定性、mRNA运输出细胞核和/或表达和/或调控所表达的FKRP蛋白产物。本领域技术人员将理解，可对内含子的核苷酸序列进行修饰或调整，并同时基本上保留功能。内含子序列的此类衍生物也包含在本文所述的本发明的各种实施方式中。
在一些实施方式中，内含子序列为MVM内含子序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性的核酸序列。
在一些实施方式中，内含子序列为HBB2内含子序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性的核酸序列。
在一些实施方式中，内含子序列选自于由如下所组成的组中：人β珠蛋白b2(或HBB2)内含子、FIX内含子、鸡β-珠蛋白内含子和SV40内含子。在一些实施方式中，内含子任选地是经修饰的内含子，例如经修饰的HBB2内含子(参见例如，WO2018046774A1的SEQ IDNO：17)、经修饰的FIX内含子(参见例如，WO2018046774A1中的SEQ ID NO：19)、或经修饰的鸡β-珠蛋白内含子(例如参见WO2018046774A1中的SEQ ID NO：21)或WO2015/162302中公开的经修饰的HBB2或FIX内含子，以引用的方式将它们的内容以其整体并入本文。
Poly-A信号序列
在一些实施方式中，含有编码FKRP的合成核酸的rAAV载体基因组包含至少一个polyA信号序列。通常，此类序列位于3'端并位于编码FKRP序列的下游。在一些实施方式中，间隔区序列位于编码序列和polyA信号序列之间。在一些实施方式中，polyA信号是如本文所定义的稳定性序列或CS序列的3'端。可以使用任何polyA序列，包括但不限于hGH polyA、synpA polyA等(例如SEQ ID NO：5)。在一些实施方式中，polyA是合成polyA信号序列。在一些实施方式中，rAAV载体基因组包含两个polyA信号序列，例如SEQ ID NO：5和另一polyA序列，其中间隔区核酸序列位于两个polyA信号序列之间。在一些实施方式中，rAAV基因组在编码FKRP的核酸的3'端、或者在CS序列的3'端包含以下元件：第一polyA信号序列、间隔区核酸序列(100-400bp之间，或约250bp)、第二poly A信号序列、间隔区核酸序列和3'ITR。在一些实施方式中，第一和第二poly A序列是SEQ ID NO：5，并且在一些实施方式中，第一和第二poly A序列是合成poly A序列。在一些实施方式中，第一poly A序列是SEQ ID NO：5，且第二poly A序列是合成序列，反之亦然——也就是说，在替代的实施方式中，第一poly A序列是合成poly A序列，且第二poly A序列是SEQ ID NO：5。示例性的poly A序列为例如SEQ ID NO：15或与SEQ ID NO：15具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列同一性的poly A信号序列。
在一些实施方式中，polyA尾被工程化以使从rAAV载体基因组转录的FKRP RNA转录物稳定。在替代实施方式中，polyA信号序列可被工程化以包含在RNA转录物中去稳定的元件。
在实施方式中，可以通过改变poly-A尾的长度将polyA信号序列工程化为去稳定元件。在实施方式中，poly-A尾可以延长或缩短。在另一实施方式中，可以延长或缩短位于FKRP编码序列与poly-A序列之间的3'非翻译区，以改变FKRP的表达水平或改变产生的最终的多肽。
在另一实施方式中，去稳定元件是microRNA(miRNA)，其具有沉默(阻抑翻译和促进降解)RNA转录物的能力，miRNA结合至编码异源基因的RNA转录物。可以通过修饰、添加或删除miRNA所结合的poly-A尾内的种子区来进行FKRP转基因的表达的调节。在实施方式中，在poly-A尾内的种子区的添加或删除可以增加或减少FKRP的表达。在进一步的实施方式中，由种子区的添加或删除引起的此类表达增加或减少取决于包含rAAV载体基因组的AAV所转导的细胞类型。例如，对于在肌肉和心脏细胞中表达但在肝细胞中未发现的miRNA具有特异性的种子区可用于允许在肝细胞中、而不是肌肉细胞或心脏细胞中产生FKRP。
在另一实施方式中，种子区也可以被工程化到位于FKRP转基因和poly-A尾之间的3'非翻译区中。在进一步的实施方式中，去稳定剂可以是siRNA。siRNA的编码区可以被包含在rAAV载体基因组中，并通常位于下游，poly-A尾的3'端。在实施方式中，FKRP转基因的表达可以通过在rAAV盒中(例如下游，poly-A尾的3'端、)包含siRNA的编码区来进行。在进一步的实施方式中，诱导siRNA表达的启动子可以是组织特异性的，从而使得siRNA在不期望FKRP转基因表达的组织中沉默，且在期望FKRP转基因的表达的组织中不发生siRNA表达。
间隔区元件
在一些实施方式中，一个或多个间隔区元件或序列位于AAV基因组序列内。在一些实施方式中，间隔区元件包含编码至少1个氨基酸的间隔区的一种或多种核酸。在一些实施方式中，间隔区元件不用于编码任何氨基酸。
在本文公开的方法和组合物的所有方面中，rAAV基因组还可包含位于本文所述的各种组分之间的一个或多个填充片段或间隔区DNA核酸序列(见图13和图19)。在一些实施方式中，间隔区序列位于5'ITR和启动子之间(例如，SEQ ID NO：9)。在一些实施方式中，间隔区序列位于启动子和内含子之间(例如，SEQ ID NO：10)。在一些实施方式中，间隔区序列位于内含子和FKRP编码序列之间(例如，SEQ ID NO：11)。在一些实施方式中，间隔区序列位于FKRP编码序列和polyA信号序列之间(例如，SEQ ID NO：12)。在一些实施方式中，间隔区序列位于polyA信号序列和3'ITR之间(例如SEQ ID NO：13)。示例性填充片段DNA序列为SEQID NO：13，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性的核酸序列。在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，填充片段核酸片段在20-50bp、50-100bp、100-200bp、200-300bp、300-500bp之间，或20-500bp之间的任何整数。示例性填充片段(或间隔区)核酸序列包含SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：13，或与其至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。
例如，填充片段序列可位于poly A信号序列的3'端，并且位于3'ITR序列的5'端。在一些实施方式中，填充片段DNA序列包含处于反向方向的合成的poly A信号。在一些实施方式中，填充片段核酸序列(也称为“间隔区”核酸片段，参见图13和图19)可位于polyA序列和3'ITR之间(即，填充片段核酸序列位于polyA序列的3'端和3'ITR的5'端)(参见例如图8-图10)。此类填充片段核酸序列可为约30bp、50bp、75bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp或长过300bp。
AAV ITR
本文公开的rAAV基因组包含AAV ITR，其具有所需的特征，并可被设计为调节并入了ITR的载体的活性以及细胞对其的反应。在另一实施方式中，AAV ITR为合成的AAV ITR，其具有期望的特性，并且可被设计为操纵包含一个或两个合成型ITR的载体的活性以及细胞对该载体的反应，包括如美国专利号9,447,433中所述的，通过引用的方式将其并入本文。在一些实施方式中，ITR之一具有允许形成自互补AAV载体的突变，下文将进一步讨论。在一些实施方式中，本发明的rAAV包括如国际专利申请WO2001092551；美国专利号US7465583、US7790154、US8361457、US8784799中公开的自互补基因组；通过引用的方式将所有这些文献以其整体并入本文。
如本文所公开的，用于rAAV基因组中的AAV ITR可以具有适合于特定应用的任何血清型。在一些实施方式中，AAV载体基因组侧接有AAV ITR。在一些实施方式中，ITR包含全长ITR序列、具有包含去除的CpG位点/基序/岛的序列的ITR、具有包含添加的CpG序列的序列的ITR、截短的ITR序列、具有ITR内的一个或多个缺失的ITR序列、具有ITR内的一个或多个添加的ITR序列、或包含前述ITR的任意部分连接在一起以形成杂合ITR的组合。
为了促进长期表达，在实施方式中，将编码FKRP的合成核酸插入AAV反向末端重复(ITR)(例如，第一或5'和第二3'AAV ITR)之间。AAV ITR见于WT rAAV载体基因组的两端，并充当DNA复制的起点和引物。ITR需要处于顺式以用于AAV DNA复制以及从原核质粒中拯救或切除。在实施方式中，包含在rAAV基因组的核酸内的AAV ITR序列可以衍生自任意AAV血清型(例如1、2、3、3b、4、5、6、7、8、9和10，表6中示出的任意血清型)，或可以衍生自多于一种的血清型，包括组合两种以上的AAV血清型的部分以构建ITR。在实施方式中，为用于包括rAAV载体基因组的rAAV载体中，第一ITR和第二ITR应至少包含包装和复制所必需的WT ITR或经工程化的ITR的最小部分。
在一些实施方式中，rAAV载体基因组包含至少一个AAV ITR，其中，所述ITR包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)AAV rep结合元件；(b)AAV末端解析序列(resolution sequence)；以及(c)AAV RBE(Rep结合元件)；其中，所述ITR不包含任何其它AAV ITR序列。在另一实施方式中，元件(a)、(b)和(c)来自AAV2 ITR，并且ITR不包含任何其它AAV2 ITR序列。在进一步的实施方式中，元件(a)、(b)和(c)来自任何AAV ITR，包括但不限于AAV2、AAV8和AAV9。在一些实施方式中，多核苷酸包含可能相同或不同的两个合成型ITR。
在一些实施方式中，包含rAAV载体基因组的rAAV载体中的多核苷酸包含可以相同或不同的两个ITR。已确定ITR中的三个元件对于ITR功能而言是足够的。这种最小功能性ITR可用于AAV载体生产和转导的所有方面。额外的缺失可能定义甚至更小的最小功能性ITR。更短的长度有利地允许较大的转基因盒的包装和转导。
在另一实施方式中，存在于合成型ITR中的每个元件可以是天然存在的AAV ITR中存在的确切序列(WT序列)，或者可以稍有不同(例如，通过添加、删除和/或置换1个、2个、3个、4个、5个或更多个核苷酸而不同)，只要AAV ITR元件的功能继续以足够与在天然存在的AAV ITR中存在的元件相同的元件的功能没有实质性差异的水平起作用。
在另一实施方式中，ITR相对于天然存在的ITR(例如来自AAV2的ITR2)表现出修饰的转录活性。已知ITR2序列固有地具有启动子活性。它也固有地具有与poly(A)序列相似的终止活性。尽管相对于ITR2处于降低的水平，本发明的最小功能性ITR表现出如实施例中所示的转录活性。因此，在一些实施方式中，ITR具有转录功能。在其它实施方式中，ITR对于转录而言是缺陷的。在某些实施方式中，ITR可以充当转录绝缘子，例如，当载体整合到宿主染色体中时，阻止载体中存在的转基因盒的转录。
本发明的一个方面涉及包含至少一个合成型AAV ITR的rAAV载体基因组，其中，相对于天然存在的AAV ITR(例如ITR2)的序列而言，ITR中的一个或多个转录因子结合位点的核苷酸序列被删除和/或置换。在一些实施方式中，其中一个或多个转录因子结合位点被删除和/或置换的是最小功能性ITR。在一些实施方式中，至少一个转录因子结合位点被删除和/或置换，例如，至少5个或更多或者10个或更多的转录因子结合位点，例如，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个转录因子结合位点。
另一实施方式中，包含本文所述的rAAV载体基因组的rAAV载体包含含有至少一个合成型AAV ITR的多核苷酸，其中，通常出现在ITR中的转录起始位点处或其附近的一个或多个CpG位点/基序(胞嘧啶碱基紧随着鸟嘌呤碱基(CpG)，其中这样排列的胞嘧啶倾向于被甲基化)被删除和/或置换。在实施方式中，CpG位点数量的缺失或减少可降低rAAV载体的免疫原性。这是由于TLR-9结合rAAV载体DNA序列(发生在CpG位点处)的减少或完全抑制。CpG基序的甲基化导致转录沉默也是众所周知的。预期ITR中的CpG基序的去除将导致TLR-9识别的降低和/或甲基化的降低，以及因此转基因沉默的降低。在一些实施方式中，其中一个或多个CpG位点被删除和/或置换的是最小功能性ITR。在实施方式中，已知AAV ITR2包含16个CpG位点，其中一个或多个或全部16个可以被删除。
在一些实施方式中，至少1个CpG基序被删除和/或置换，例如至少4个或更多或者8个或更多的CpG基序，例如至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个CpG基序。本文所用的短语“删除和/或置换”意味着CpG基序中的一个或两个核苷酸被删除、被不同的核苷酸置换、或删除和置换的任意组合。
在一些实施方式中，合成型ITR包含以下所列核苷酸序列之一，基本上由以下所列核苷酸序列之一组成或由以下所列核苷酸序列之一组成。在其它实施方式中，合成型ITR包含如下核苷酸序列，基本上由如下核苷酸序列组成或由如下核苷酸序列组成：所述核苷酸序列与以下所列核苷酸序列之一至少80％相同(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同)。
MH-257
MH-258
MH Delta 258
MH端粒-1ITR
MH端粒-2ITR
MH PolII 258ITR
MH 258Delta D保守
在某些实施方式中，本文所述的rAAV载体基因组包含能够产生可转导宿主细胞的AAV病毒颗粒的合成型ITR。此类ITR可以用于例如异源核酸的病毒递送。此类ITR的实例包括上面列出的MH-257、MH-258和MH Delta 258。
在其它实施方式中，包含合成型ITR的如本文所述的rAAV载体基因组不能产生AAV病毒颗粒。此类ITR可以用于例如异源核酸的非病毒转移。此类ITR的实例包括上面列出的MH端粒-1、MH端粒-2和MH Pol II 258。
在进一步的实施方式中，包含本发明的合成型ITR的如本文所述的rAAV载体基因组进一步包含可以与第一ITR相同或不同的第二ITR。在一些实施方式中，ITR之一(例如，5'ITR)不能被Rep蛋白解析，即，促进双链病毒DNA的形成。此类ITR在美国专利号8,784,799中进行了描述，通过引用将其内容并入本文。此类ITR的存在导致单链病毒DNA的产生。
在一些实施方式中，第二ITR为ITR2m(SEQ ID NO：7)。在一些实施方式中，5'ITR为ITR2m(SEQ ID NO：7)，3'ITR为ITR2(SEQ ID NO：8)。在一些实施方式中，5'ITR为ITR2(SEQID NO：8)，3'ITR为ITR2m(SEQ ID NO：7)。
在实施方式中，rAAV载体基因组包含含有本发明的合成型ITR的多核苷酸。在进一步的实施方式中，病毒载体可以是细小病毒载体，例如AAV载体。在另一实施方式中，重组细小病毒颗粒(例如，重组AAV颗粒)包含合成型ITR。
在一些实施方式中，rAAV载体包含没有细菌序列的核酸，和/或，缺乏替代的开放读码框，和/或缺乏来自编码序列的CpG，和/或具有双链RNA阻断剂。在一些实施方式中，本发明的重组AAV由封闭端线性双链DNA模板产生。在一些实施方式中，本发明的重组AAV由质粒DNA模板产生。
本发明的另一实施方式涉及增加AAV衣壳的转基因DNA包装能力的方法，所述方法包括生成包含编码FKRP的合成核酸并进一步包含至少一个合成型AAV ITR的rAAV载体基因组，其中，所述ITR包含：(a)AAV rep结合元件；(b)AAV终端解析序列；以及(c)AAV RBE元件；其中，所述ITR不包含任何其它AAV ITR序列。本发明涵盖了此类的rAAV载体。
本发明的进一步的实施方式涉及通过rAAV载体基因组改变对感染的细胞应答的方法，所述方法包括生成包含编码FKRP的合成核酸并进一步包含至少一个合成型ITR的rAAV载体基因组，其中，所述ITR中的一个或多个转录因子结合位点的核苷酸序列被删除和/或置换，并且进一步地，其中，rAAV载体基因组包含至少一个合成型ITR，其产生对感染的改变的细胞应答。本发明涵盖了此类的rAAV载体。
本发明的另外的实施方式涉及通过rAAV载体基因组改变对感染的细胞应答的方法，所述方法包括生成包含编码FKRP的合成核酸并进一步包含至少一个合成型ITR的rAAV载体基因组，其中，所述ITR中的一个或多个CpG基序被删除和/或置换，其中，包含至少一个合成型ITR的载体产生对感染的改变的细胞应答。
肌肉特异性启动子
在一些实施方式中，本发明的组合物和方法中使用的启动子是在骨骼肌和心肌二者中都具有活性的合成的肌肉特异性启动子。在骨骼肌和心肌中具有活性的肌肉特异性启动子的实例包括下表1中所示的那些，例如SP0010、SP0020、SP0033、SP0038、SP0040、SP0042、SP0051、SP0057、SP0058、SP0061、SP0062、SP0064、SP0065、SP0066、SP0068、SP0070、SP0071、SP0076、SP0132、SP0133、SP0134、SP0136、SP0146、SP0147、SP0148、SP0150、SP0153、SP0155、SP0156、SP0157、SP0158、SP0159、SP0160、SP0161，SP0162、SP0163、SP0164、SP0165、SP0166、SP0169、SP0170、SP0171、SP0173、SP0228、SP0229、SP0230、SP0231、SP0232、SP0257、SP0262、SP0264、SP0265、SP0266、SP0267、SP0268、SP0270、SP0271、SP0279、SP0286、SP0305、SP0306、SP0307、SP0309、SP0310、SP0311、SP0312、SP0313、SP0314、SP0315、SP0316、SP0320、SP0322、SP0323、SP0324、SP0325、SP0326、SP0327、SP0328、SP0329、SP0330、SP0331、SP0332、SP0333、SP0334、SP0335、SP0336、SP0337、SP0338、SP0339、SP0340、SP0341、SP0343、SP0345、SP0346、SP0347、SP0348、SP0349、SP0350、SP0351、SP0352、SP0353、SP0354、SP0355、SP0356、SP0358、SP0359、SP0361、SP0362、SP0363、SP0364、SP0365、SP0366、SP0367、SP0368、SP0369、SP0370、SP0371、SP0372、SP0373、SP0374、SP0375、SP0376、SP0377、SP0378、SP0379、SP0380、SP0381、SP0382、SKM_14、SKM_18、SKM_20、SP0357、SP0437-SP0445、SP0447和SP0453-SP0471、SP0473-474。在骨骼肌和心肌中都有活性的优选合成的肌肉特异性启动子的实例为SP0057、SP0134、SP0173、SP0279、SP0286、SP0310、SP0316、SP0320和SP0326。
SP0057及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含顺式调控元件CRE0029和CRE0071的组合、或其功能变体。通常，CRE可操作地连接至启动子元件。在一些优选的实施方式中，肌肉特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0029、CRE0071、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序以上游至下游的方向给出)。在一些优选的实施方式中，肌肉特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0071、CRE0029、然后是启动子元件的顺序。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0070或其功能变体。CRE0070是肌肉特异性近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：CRE0029、CRE0071和CRE0070，或其功能变体。
如本文提供的表所示，CRE0029具有根据SEQ ID NO：206的序列。其功能性变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
CRE0029的功能变体是具有不同于CRE0029的序列的调控元件，但其基本上保留了作为肌肉特异性CRE的活性。技术人员将理解的是，能够在保留其结合至必需转录因子(TF)以及增强表达的能力同时，改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的置换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能。
在一些实施方式中，CRE0029的功能变体可以被视为当取代启动子中的CRE0029而进行置换时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0029而进行置换的CRE0029功能变体的肌肉特异性启动子优选地保留其活性的80％，更优选地保留其活性的90％，更优选地保留其活性的95％，还更优选地保留其活性的100％。例如，以启动子SP0057为例，可以用CRE0029的功能变体替换SP0057中的CRE0029，并且所述启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意的是，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0029或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：206或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：206的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
如本文提供的表所示，CRE0071具有根据SEQ ID NO：216的序列。其功能性变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
CRE0071的功能变体是具有不同于CRE0071的序列的调控元件，但其基本上保留了作为肌肉特异性CRE的活性。技术人员将理解的是，能够在保留其结合至必需转录因子(TF)并增强表达的能力同时，改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的置换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能。
在一些实施方式中，CRE0071的功能变体可以被视为当取代启动子中的CRE0071而进行置换时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0071而进行置换的CRE0029功能变体的肌肉特异性启动子优选地保留其活性的80％，更优选地保留其活性的90％，更优选地保留其活性的95％，还更优选地保留其活性的100％。例如，以启动子SP0057为例，可以用CRE0071的功能变体替换SP0057中的CRE0071，并且所述启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意的是，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0071或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：216或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：216的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
CRE0070的序列(SEQ ID NO：42)及其变体在本文其它地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：87的序列或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。如本文所提供的表中所示，具有根据SEQ ID NO：87的序列的启动子被称为SP0057。在一些实施方式中，特别优选SP0057启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0134及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含顺式调控元件CRE0020和CRE0071的组合、或其功能变体。通常，CRE可操作地连接至启动子元件。在一些优选的实施方式中，肌肉特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0020、CRE0071、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序以上游至下游的方向给出)。在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0071、CRE0020、然后是启动子元件的顺序。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0070或其功能变体。CRE0070是肌肉特异性近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：CRE0020、CRE0071和CRE0070，或其功能变体。
如本文提供的表所示，CRE0020具有根据SEQ ID NO：203的序列。其功能性变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
CRE0020的功能变体是具有不同于CRE0020的序列的调控元件，但其基本上保留了作为肌肉特异性CRE的活性。技术人员将理解的是，能够在保留其结合至必需转录因子(TF)并增强表达的能力同时，改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的置换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能。
在一些实施方式中，CRE0020的功能变体可以被视为当取代启动子中的CRE0020而进行置换时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0020而进行置换的CRE0020功能变体的骨骼肌特异性启动子优选地保留其活性的80％，更优选地保留其活性的90％，更优选地保留其活性的95％，还更优选地保留其活性的100％。例如，以启动子SP0227为例，可以用CRE0020的功能变体替代SP0227中的CRE0020，并且所述启动子基本上保持其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意的是，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0020或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：203或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：203的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE0020或其功能变体具有300个以下核苷酸的长度、250个以下核苷酸的长度、200个以下核苷酸的长度、150个以下核苷酸的长度、125个以下核苷酸的长度、或100个以下核苷酸的长度。
CRE0071的序列及其变体在上文列出。
CRE0070及其变体的序列在本文其它地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据本文提供的表中所示序列的序列或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。如本文提供的表中所示，具有根据SEQ ID NO：100的序列的启动子被称为SP0134。SP0134启动子在一些实施方式中是特别优选的。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0173及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含肌肉特异性近端启动子CRE0010和顺式调控元件CRE0035的组合、或其功能变体。通常，肌肉特异性近端启动子CRE0010和顺式调控元件CRE0035可操作地连接至进一步的启动子元件。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含所述近端启动子和CRE、或其功能变体，处于CRE0010、CRE0035、然后是进一步的启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序以上游至下游的方向给出)。在一些实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含所述近端启动子和CRE或其功能变体，处于CRE0035、CRE0010、然后是进一步的启动子元件的顺序。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：CRE0010、CRE0035和SKM_18，或其功能变体。
CRE0010具有根据SEQ ID NO：264的序列。其功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
如上所讨论的，CRE0010的功能变体基本上保留了CRE0010充当肌肉特异性启动子元件的能力。例如，当将CRE0010的功能变体置换入肌肉特异性启动子SP0320中时，经修饰的启动子保留其活性的至少80％，更优选地保留其活性的至少90％，更优选地保留其活性的至少95％，并且还更优选地保留SP0320的活性的100％。适当地，CRE0010的功能变体包含与SEQ ID NO：264具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列，如本文提供的表中所示。
在一些优选的实施方式中，包含CRE0010或其功能变体或由CRE0010或其功能变体组成的启动子元件具有400个以下核苷酸的长度、300个以下核苷酸的长度、250个以下核苷酸的长度、200个以下核苷酸的长度、150个以下核苷酸的长度、125个以下核苷酸的长度、110个以下核苷酸的长度、或95个以下核苷酸的长度。
如本文提供的表所示，CRE0035具有根据SEQ ID NO：208的序列。其功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
CRE0035的功能变体是具有不同于CRE0035的序列的调控元件，但其基本上保留了作为肌肉特异性CRE的活性。技术人员将理解的是，能够在保留其结合至必需转录因子(TF)并增强表达的能力同时，改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的置换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能。
在一些实施方式中，CRE0035的功能变体可以被视为当取代启动子中的CRE0035而进行置换时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0035而进行置换的CRE0035功能变体的肌肉特异性启动子优选地保留其活性的80％，更优选地保留其活性的90％，更优选地保留其活性的95％，还更优选地保留其活性的100％。例如，以启动子SP0173为例，可以用CRE0035的功能变体替换SP0173中的CRE0035，并且所述启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意的是，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0035或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：208或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：208的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
SKM_18及其变体的序列在本文其它地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：122的序列或其功能变体，如本文提供的表中所示。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ IDNO：122的序列的启动子被称为SP0173。在一些实施方式中，特别优选SP0173启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0279及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含顺式调控元件CRE0020和CRE0071的组合、或其功能变体。通常，CRE可操作地连接至启动子元件。在一些优选的实施方式中，肌肉特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0020、CRE0071、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序以上游至下游的方向给出)。在一些优选的实施方式中，肌肉特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0071、CRE0020、然后是启动子元件的顺序。在一些优选的实施方式中，肌肉特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0020、CRE0071、启动子元件以及CMV-IE 5'UTR和内含子的顺序(如本领域常规的，顺序以上游至下游的方向给出)。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0070或其功能变体。CRE0070是肌肉特异性近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：CRE0020、CRE0071、CRE0070和CMV-IE 5'UTR和内含子，或其功能变体。
CRE0020的序列及其变体在上文列出。
CRE0071的序列及其变体在上文列出。
CRE0070及其变体的序列在本文其他地方列出。
CMV-IE 5'UTR和内含子的序列及其变体在本文其他地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：137的序列或其功能变体，如本文提供的表中所示。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ IDNO：137的序列的启动子被称为SP0279。在一些实施方式中，特别优选SP0279启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0286及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含可操作地连接至启动子元件的CRE0071。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0071。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0071以及CMV-IE 5'UTR和内含子。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0070或其功能变体。CRE0070是肌肉特异性近端启动子。
在一些实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0071、CRE0070，然后是CMV-IE 5'UTR和内含子。
CRE0071的序列及其变体在上文列出。
CRE0070的序列及其变体在本文其他地方列出。
CMV-IE 5'UTR和内含子的序列及其变体在本文其他地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：138的序列或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：138的序列的启动子被称为SP0286。在一些实施方式中，特别优选SP0286启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0310及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含可操作地连接至启动子元件的CRE0035。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0035。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0035，然后是SKM_18。
CRE0035的序列及其变体在上文列出。
SKM_18的序列及其变体在本文其他地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：143的序列(如本文提供的表中所示)或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ IDNO：143的序列的启动子被称为SP0310。在一些实施方式中，特别优选SP0310启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0316及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含可操作地连接至启动子元件的CRE0050。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0050。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0050，然后是SKM_18。
CRE0050具有根据SEQ ID NO：211的序列。其功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
CRE0050的功能变体是具有不同于CRE0050的序列的调控元件，但其基本上保留了作为肌肉特异性CRE的活性。技术人员将理解的是，能够在保留其结合至必需转录因子(TF)并增强表达的能力同时，改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的置换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能。
在一些实施方式中，CRE0050的功能变体可以被视为当取代启动子中的CRE0050而进行置换时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0050而进行置换的CRE0035功能变体的肌肉特异性启动子优选地保留其活性的80％，更优选地保留其活性的90％，更优选地保留其活性的95％，还更优选地保留其活性的100％。例如，以启动子SP0316为例，可以用CRE0050的功能变体替换SP0316中的CRE0050，并且所述启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意的是，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0050或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：211或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：211的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
SKM_18的序列及其变体在本文其他地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：149的序列(如本文所提供的表中所示)或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ IDNO：149的序列的启动子被称为SP0316。在一些实施方式中，特别优选SP0316启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0320及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含肌肉特异性近端启动子CRE0010和顺式调控元件CRE0035的组合、或其功能变体。通常，肌肉特异性近端启动子CRE0010和顺式调控元件CRE0035可操作地连接至进一步的启动子元件。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含所述近端启动子和CRE、或其功能变体，处于CRE0010、CRE0035、然后是进一步的启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序以上游至下游的方向给出)。在一些实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含所述近端启动子和CRE、或其功能变体，处于CRE0035、CRE0010、然后是进一步的启动子元件的顺序。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含所述近端启动子和CRE、或其功能变体，处于CRE0010、CRE0035、后随着CMV-IE 5'UTR和内含子的进一步的启动子元件的顺序。
进一步的启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：CRE0010、CRE0035、SKM_18以及CMV-IE 5'UTR和内含子，或其功能变体。
CRE0010的序列及其变体在上文列出。
CRE0035的序列及其变体在上文列出。
SKM_18的序列及其变体在本文其他地方列出。
CMV-IE 5'UTR和内含子的序列及其变体在本文其他地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：150的序列(如本文提供的表中所示)或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ IDNO：150的序列的启动子被称为SP0320。在一些实施方式中，特别优选SP0320启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0326及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含可操作地连接至启动子元件的CRE0071。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0071。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0071，然后是SKM_18。
CRE0071的序列及其变体在上文列出。
SKM_18的序列及其变体在本文其他地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：155的序列(如本文提供的表中所示)或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ IDNO：155的序列的启动子被称为SP0326。在一些实施方式中，特别优选SP0326启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
表1-心肌和骨骼肌中具有活性的肌肉特异性启动子
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表8-心肌和骨骼肌中具有活性的截短肌肉特异性启动子
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表2在表1的启动子中存在的CRE和其它元件
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表9根据本发明的实施方式，表8中心肌和骨骼肌中具有活性的截短肌肉特异性启动子的图示，以及所示的顺式调控元件和最小或近端启动子
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表3表1和表2的启动子中包含的顺式调控元件
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表10表8和表9的启动子的CRE。
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表4由表1、表2和表3的启动子所包含的最小/近端启动子
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表11表8截短的合成启动子的启动子元件
表5其它元件(例如内含子/UTR)
表12来自表8启动子的CRM
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肌肉特异性启动子的功能变体
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子的功能变体可被视为启动子元件，当取代启动子中的参考启动子元件进展置换时，该启动子元件基本上保持其活性。例如，包括本文公开的给定启动子的功能变体的肌肉特异性启动子的功能变体优选保留其活性的至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少70％或至少80％，更优选其活性的至少90％，更优选所述未改变的启动子的活性的至少95％，还更优选所述活性的100％(与包含未修饰的启动子元件的未改变的启动子序列相比)。用于评估肌肉特异性启动子活性的合适测定是本领域已知的。
在一些实施方式中，本文公开的肌肉特异性启动子的功能变体或功能片段与原始未修饰序列具有至少约75％的序列同一性、或至少约80％的序列同一性、至少约90％的序列同一性、至少约95％的序列同一性、至少约98％的序列同一性，并同时具有所述相应的未修饰启动子序列的启动子活性的至少35％、或所述启动子活性的至少约45％、或所述启动子活性的至少约50％、或所述启动子活性的至少约60％、或所述启动子活性的至少约75％、或所述启动子活性的至少约80％、或所述启动子活性的至少约85％、或所述启动子活性的至少约90％、或所述启动子活性的至少约95％。
含有FKRP核酸和载体的组合物
本发明的另一方面涉及包含本发明的合成核酸和/或含有本发明的合成核酸的载体的细胞(例如，分离的细胞、经转化的细胞、重组细胞等)。因此，本发明的各种实施方式涉及包含含有本发明的合成核酸的载体(例如表达盒)的重组宿主细胞。这样的细胞可分离和/或存在于动物(例如转基因动物)中。细胞的转化将在下文中进一步描述。
本发明的另一方面涉及包含本发明的合成核酸、载体和/或经转化的细胞的转基因动物。转基因动物可包括但不限于家畜(例如，猪、山羊、绵羊、牛、马、兔子等)、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠和豚鼠)和家养宠物(例如，猫和狗)。在一些实施方式中，转基因动物不是人类。
可通过将编码FKRP的本发明合成核酸以如下那样的方式引入单细胞胚胎中来生产转基因动物：合成核酸稳定地整合到成熟动物的生殖系细胞的DNA中，并以正常的孟德尔方式遗传。本发明的转基因动物将具有在体液和/或组织中产生FKRP的表型。在一些实施方式中，可从这些流体和/或组织中移除FKRP并对其进行加工，例如用于治疗用途。(参见，例如，Clark等，“Expression of human anti-hemophilic factor IX in the milk oftransgenic sheep”，Bio/Technology 7：487-492(1989)；Van Cott等，“Haemophilicfactors produced by transgenic livestock:abundance can enable alternativetherapies worldwide”，Haemophilia 10(4)：70-77(2004)，通过引用的方式将其全部内容并入本文)。
可通过多种方式将DNA分子引入细胞和胚胎，包括但不限于显微注射、磷酸钙介导的沉淀、脂质体融合或全能或多能干细胞的逆转录病毒感染。然后可将经转化的细胞引入胚胎中，并将其掺入其中以形成转基因动物。制造转基因动物的方法描述于例如L.M.Houdebine的Transgenic Animal Generation and Use，Harwood Academic Press，1997。也可用使用胚胎或成体细胞系的核转移或克隆的方法产生转基因动物，如Campbell等，Nature 380：64-66(1996)和Wilmut等，Nature 385：810-813(1997)中所述。此外，如美国专利号5,523,222所述，可使用利用DNA细胞质注射的技术。
通过引入包含本发明的合成核酸的嵌合构建体可以获得产生FKRP的转基因动物。获得转基因动物的方法是众所周知的。例如，参见Hogan等，Manipulating the MouseEmbryo，(Cold Spring Harbor Press1986)；Krimpenfort等，Bio/Technology 9:88(1991)；Palmiter等，Cell41:343(1985)；Kraemer等，Genetic Manipulation of theEarly Mammalian Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1985)；Hammer等，Nature315:680(1985)；Wagner等，U.S.Pat.No.5,175,385；Krimpenfort et al.,U.S.Pat.No.5,175,384；Janne等，Ann.Med.24:273(1992)；Brem等，Chim.Oggi.11:21(1993)；Clark等，U.S.Pat.No.5,476,995，通过引用的方式将其全部以其整体并入本文。
编码FKRP的合成核酸、或包含所述合成多核苷酸的载体和/或细胞可包含在药物组合物中。本发明包括此类药物组合物的容器。一些实施方式涉及试剂盒，该试剂盒包含所述合成核酸、或包含本发明的所述合成核酸的载体和/或细胞、和/或使用该试剂盒例如以实施本发明的方法的试剂和/或说明。
本发明的进一步方面涉及编码FKRP的合成核酸、或包含一个或多个编码FKRP的合成核酸的载体、表达盒和/或细胞的用途。因此，一个方面涉及在细胞或受试者中产生FKRP多肽的方法，包括将本发明的合成核酸、载体和/或经转化的细胞递送到细胞或受试者中，从而在所述细胞或所述受试者中产生FKRP多肽。在一定的条件下递送合成核酸、载体和/或转化的细胞，借此使得编码FKRP的合成核酸表达产生FKRP多肽。这样的条件在本领域中是众所周知的。
在一些实施方式中，药物组合物包含在约pH 7.0至约pH 8.0的缓冲液(例如，赋形剂)中的重组AAV载体。在一些实施方式中，缓冲液的pH为约7.0至约7.5。在优选的实施方式中，缓冲液的pH小于7.5。在数个实施方式中，缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在某些实施方式中，缓冲液或赋形剂包含选自于由钠、钾、磷酸盐、氯化物、钙、镁、硫酸盐、柠檬酸盐及其任意组合所组成的组中的离子。药物组合物还包含多元醇、糖或类似物。在一些实施方式中，药物组合物包含甘油或丙二醇或聚乙二醇或山梨糖醇或甘露醇。在数个实施方式中，山梨糖醇的浓度范围为约1％(w/v)至约10％(w/v)。在一些实施方式中，山梨糖醇的浓度范围为约2％(w/v)至约8％(w/v)。在优选的实施方式中，山梨糖醇的浓度范围为约3％(w/v)至约6％(w/v)。在某些实施方式中，山梨糖醇的浓度为1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)、9％(w/v)或10％(w/v)。药物组合物还包含非离子表面活性剂。在一些实施方式中，非离子表面活性剂选自于由聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、烷基葡糖苷、烷基酚乙氧基化物、聚山梨醇酯、聚氧乙烯烷基苯基醚及其任意组合所组成的组。在一些实施方式中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆188或Ecosurf SA-15。在某些实施方式中，泊洛沙姆188或Ecosurf SA-15的浓度为0.0005％(w/v)、0.0008％(w/v)、0.0009％(w/v)、0.001％(w/v)、0.002％(w/v)、0.0025％(w/v)、0.003％(w/v)、0.0035％(w/v)、0.004％(w/v)、0.0045％(w/v)、0.005％(w/v)、0.006％(w/v)、0.007％(w/v)、0.008％(w/v)、0.009％(w/v)或0.01％(w/v)。
药物组合物包含至少1×1010vg/ml本发明公开的重组AAV载体。在一些实施方式中，药物组合物包含约1×1011vg/ml至约1×1014vg/ml的重组AAV载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包含约1×1012vg/ml至约8×1013vg/ml的重组AAV载体。在数个实施方式中，所述药物组合物包含约1e13vg/ml至约6e13vg/ml的重组AAV9sc载体，所述载体包含本发明中公开的编码FKRP多肽的核酸，其中所述核酸与选自于由如下所组成的组中的启动子可操作地连接：MCK启动子、dMCK启动子、tMCK启动子、enh358MCK启动子、CK6启动子和Syn100启动子、表1-表4或表8-表12中列出的任意启动子、及它们的衍生物。
在一些实施方式中，给予患有肢带疾病或紊乱的受试者或有需要的受试者本发明的rAAV，其中所述rAAV以约5e12vg/kg至约6e13vg/kg的剂量给予。在一些实施方式中，rAAV以5e12vg/kg、9e12 vg/kg、1e13 vg/kg、2e13 vg/kg、3e13 vg/kg、4e13 vg/kg、5e13 vg/kg或6e13 vg/kg的剂量给予。在一些实施方式中，所给予的rAAV的总剂量为2e14 vg、3e14 vg、5e14vg、6e14 vg、7e14 vg、8e14 vg、9e14 vg、1e15 vg、2e15 vg或3e15 vg。
在一些实施方式中，本发明的rAAV以随时间增加的剂量给予。例如，rAAV可以以1e13 vg/kg的第一剂量递送，然后以3e13 vg/kg的第二剂量递送。在一个实施方式中，受试者以1e13vg/kg给予至少2剂，以3e13vg/kg给予至少1剂(例如，至少2剂、3剂、4剂或更多)。在一个实施方式中，所述剂量以间隔给予，例如，间隔至少45天。
示例性制剂药物组合物：
在本发明的各个方面中，所述药物组合物包含含有rAAV-FKRP(例如，AAV9sc.Syn100.coHuFKRP)的重组AAV载体，其处于30mM磷酸盐pH 7.4、200mM NaCl、5mMKCl、1％(w/v)甘露醇、0.0005％(w/v)IGEPAL CA 720中，灌装体积为5mL。在一些实施方式中，灌装体积为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。
在本发明的一个方面，所述药物组合物包含含有rAAV-FKRP(例如，AAV9sc.Syn100.coHuFKRP)的重组AAV载体，其处于20mM磷酸盐pH 7.4、300mM NaCl、3mMKCl、3％(w/v)甘露醇、0.001％(w/v)Brij S20中，灌装体积为5mL。在一些实施方式中，灌装体积为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。
在本发明的数个方面中，所述药物组合物包含含有rAAV-FKRP(例如，AAV9sc.Syn100.coHuFKRP)的重组AAV载体，其处于20mM磷酸盐pH 7.4、300mM NaCl、3mMKCl、3％(w/v)山梨糖醇、0.001％(w/v)Ecosurf SA-15中，灌装体积为5mL。在一些实施方式中，灌装体积为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。
在本发明的各个方面中，所述药物组合物包含含有rAAV-FKRP(例如，AAV9sc.Syn100.coHuFKRP)的重组AAV载体，其处于10mM磷酸盐pH 7.4、350mM NaCl、2.7mMKCl、5％(w/v)山梨糖醇、0.001％(w/v)泊洛沙姆188中，灌装体积为5mL。在一些实施方式中，灌装体积为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。
本文提供的本发明的数个方面，所述药物组合物包含含有rAAV-FKRP(例如，AAV9sc.Syn100.coHuFKRP)的重组AAV载体，其处于15mM磷酸盐pH 7.4、375mM NaCl、3.5mMKCl、5％(w/v)山梨糖醇、0.0005％(w/v)Tergitol NP-10中，灌装体积为5mL。在一些实施方式中，灌装体积为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。
在本发明的一个方面中，所述药物组合物包含含有rAAV-FKRP(例如，AAV9sc.Syn100.coHuFKRP)的重组AAV载体，其处于15mM磷酸盐pH 7.4、375mM NaCl、3.5mMKCl、3％(w/v)甘油、0.0005％(w/v)吐温80中，灌装体积为5mL。在一些实施方式中，灌装体积为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。
治疗和疗法
本发明的方面涉及编码FKRP的合成核酸以及包含该合成核酸的载体和组合物在增加细胞(例如肌肉细胞)或有需要的受试者的细胞和组织(例如骨骼肌和/或心肌等肌肉细胞)中的功能性FKRP的量方面的用途。在本发明的一个方面，可将编码FKRP的合成核酸、包含所述合成核酸的载体和组合物在适合FKRP表达的条件下递送到细胞(例如肌肉细胞，如骨骼肌和/或心肌)，从而增加细胞中功能性FKRP的量。在一些实施方式中，增加细胞中的功能性FKRP也将增加细胞中α-抗肌萎缩蛋白聚糖的糖基化。在一个实施方式中，所述细胞是在体外的细胞。在一些实施方式中，细胞是在体内的细胞。
离体(ex vivo)调节细胞中FKRP水平
本文所述的核酸、载体和病毒粒子可用于调节细胞中功能性FKRP的水平。如本文所述，该方法包括将组合物给予细胞的步骤，该组合物包含编码本文所述的FKRP的合成核酸，该合成核酸插入两个AAV ITR之间。所述细胞可来自任何可给予本发明的核酸的动物。来自FKRP异常受试者的哺乳动物细胞(例如，人、狗、猫、猪、绵羊、小鼠、大鼠、兔子、牛、山羊等)是用于本发明的典型靶标细胞。在一些实施方式中，所述细胞为骨骼肌或心肌细胞。
在另一个方面，本文公开了将编码FKRP的核酸给予细胞的方法，所述方法包括在将核酸引入细胞并表达以产生FKRP的条件下，使细胞与本文公开的rAAV载体和/或rAAV基因组接触。在一些实施方式中，所述细胞为培养的细胞。在一些实施方式中，所述细胞为体内的细胞。在一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞(例如人)。在一些实施方式中，所述细胞为肌肉细胞(例如骨骼肌或心肌)。
本发明的另一方面涉及用本文公开的rAAV载体转导的细胞(例如，表达编码的FKRP蛋白)的离体递送。这种离体基因递送可用于将最初从用本文公开的rAAV载体转导的受试者获得的细胞移植回受试者中。在进一步的实施方式中，离体干细胞(例如，间充质干细胞)疗法可用于将用本文公开的rAAV载体转导的细胞移植回受试者中。合适的离体方案可包括数个步骤。例如，可从受试者收获靶标组织(例如，肌肉)的片段，并且将本文所述的rAAV载体用于将编码FKRP的核酸转导到组织的细胞中。然后可将这些经基因修饰的细胞移植回受试者中。可使用数种方法将细胞重新引入受试者中，包括静脉注射、腹膜内注射、皮下注射或原位注射到靶标组织(肌肉组织)中。用本文所述的rAAV载体转导或感染的经修饰的离体细胞的微胶囊化是可用于本发明的另一种技术。根据本发明，可使用自体和同种异体细胞移植。
本文所述的此类方法可用于治疗有需要的受试者(例如，患有FKRP异常的受试者)。在一个实施方式中，该方法包括处于药学上可接受的运载体中并以治疗有效量向受试者给予通过上述方法产生的表达FKRP的细胞。在一些实施方式中，所述受试者为人。
使受试者中的FKRP水平和活性增加
本文所述的核酸、载体和病毒粒子可用于调节受试者中功能性FKRP的水平。该方法包括将包含rAAV载体的组合物给予受试者，所述rAAV载体包含本文所述的rAAV基因组，所述rAAV基因组包含插入在两个AAV ITR之间的编码FKRP的合成核酸，其中hFKRP与肌肉特异性启动子可操作地连接。在一个实施方式中，受试者需要这样的调节。
如本文所用，“有需要的受试者”是指受试者的即时或预期状况。此类受试者可能患有所诊断的抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱(例如，由FKRP异常所引起，如LGMD2I)，或者处于发展为此类障碍的风险中。受试者可为任何动物，例如哺乳动物(例如人、狗、猫、猪、绵羊、小鼠、大鼠、兔子、牛、山羊等)。本发明的方法和组合物特别适用于FKRP缺陷的人受试者，其将受益于其一种或多种肌肉(例如骨骼肌和/或心肌)中α-抗肌萎缩蛋白聚糖的糖基化增加。在一个实施方式中，受试者具有FKRP异常(例如，FKRP缺乏)。FKRP异常是指导致与正常受试者的同一组织中的功能性FKRP水平相比，受试者肌肉组织中的功能性FKRP水平降低的情况。这可能导致糖基化α-抗肌萎缩蛋白聚糖的缺乏。此类情况可由受试者的FKRP基因的直接突变引起，或者可导致内源FKRP的表达和/或加工的间接破坏。已经发现FKRP基因的突变导致各种疾病/紊乱，例如肢带型肌营养不良2I。已知受益于功能性FKRP水平增加的紊乱包括但不限于肢带型肌营养不良2I、先天性肌营养不良、Walker-Warburg综合征和肌眼脑疾病。有需要的受试者可患有此类病症或紊乱的一种或组合，或者处于发展为此类病症或紊乱的一种或组合的风险中。患有或处于发展为可能会导致因其肌肉组织中功能性FKRP水平的增加而改善的抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的另一病症的受试者也可构成“有需要”的受试者。可通过本领域已知的各种手段来确定受试者处于发展出病症的风险中，例如基因分析、家族史和/或与疾病或紊乱的易感性相关的先决条件。
在一些实施方式中，受试者为成年受试者。在一些实施方式中，受试者为青少年受试者。在一些实施方式中，受试者为婴儿受试者。在一些实施方式中，受试者表现出所述紊乱的一种或多种症状。在一些实施方式中，受试者未表现出所述紊乱的一种或多种症状。在一些实施方式中，在给药之前受试者表现出显著的疾病病理。在一些实施方式中，在给药之前受试者没有表现出显著的疾病病理。
此外，可将本文所述的核酸、载体和病毒粒子通过任何合适的方法以任何合适的制剂给予包括人在内的动物。例如，在本文公开的方法和组合物的任何实施方式中，可将本文公开的rAAV载体或rAAV基因组直接引入受试者中，用于递送至受试者的骨骼肌和心脏肌肉。可通过导致FKRP转基因在靶标组织(肌肉)中表达的任何方式给予。在一些实施方式中，给予是系统性的(例如，静脉输注)。各种系统性给予途径是本领域技术人员已知的，并在本文中提供。适当的系统性途径将取决于载体和受试者。在一些实施方式中，给予为局部的(例如，直接给予至肌肉靶标)。
在本文公开的方法和组合物的任何实施方式中，该方法针对治疗受试者中的紊乱(例如，抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱和/或LGMD2I或由功能性FKRP蛋白缺乏引起的其它紊乱)，其中，将本文公开的治疗有效量的rAAV载体和/或rAAV基因组给予患有所述紊乱的患者。给药后，外源性FKRP核酸在受试者的靶标细胞(肌肉)中表达，从而增加肌肉组织中的功能性FKRP蛋白水平。可直接(例如活检)或间接(例如功能方面)地检测此类增加。在一个实施方式中，功能性FKRP蛋白水平的增加补偿了促成所述紊乱的功能性FKRP缺乏。在一些实施方式中，可通过基于一种或多种临床症状和/或与该紊乱相关的生理指标观察个体的改善来确定本文公开的治疗性化合物治疗该紊乱(例如，LGMD2I)的有效性，但不限于此。在一些实施方式中，与紊乱(例如，LGMD2I)相关的症状的改善可通过对同步疗法的需求减少来指示。
在一些实施方式中，受试者的骨骼肌和/或心肌中α-抗肌萎缩蛋白聚糖的功能性糖基化显著增加。可通过直接的(例如活检)或间接的手段(例如功能方面)来检测此类增加。在一些实施方式中，与接受治疗前的受试者血清肌酸激酶水平相比，接受治疗的受试者表现出血清肌酸激酶的显著或大幅(持续的、统计学上显著量的)降低。在一些实施方式中，与接受治疗前的受试者的胶原沉积相比，接受治疗的受试者的受体骨骼肌中的胶原沉积显著或大幅减少。在一些实施方式中，该治疗导致受试者的受体肌肉组织(例如比目鱼肌、膈膜和/或EDL)的体外肌力显著增加。在一些实施方式中，治疗导致受试者具有执行物理任务更好或时间更长的能力，例如显著地跑得更远(例如，在平板运动试验中)。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，与给予前相比或与未接受相同治疗的受试者相比，，如本文所公开给予本文所述的rAAV FKRP构建体(例如，表6中所述的任何血清型的AAV载体，包括AAV9)、AAV载体或AAV基因组能够使受体受试者(例如，患有本文所述的抗肌萎缩相关糖蛋白病)中的以下一种或多种降低：血清肌酸激酶水平、胶原沉积水平，例如，降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，与给予前相比或与未接受相同治疗的受试者相比，如本文所公开给予本文所述的rAAV FKRP构建体(例如，表6中所述的任何血清型的AAV载体，包括AAV9)能够使受体受试者(例如，患有本文所述的抗肌萎缩相关糖蛋白病)中的以下一种或多种降低：血清肌酸激酶水平、胶原沉积水平、疼痛和/或嗜睡，例如降低约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、60％至约90％、约70％至约90％、约10％至约80％、约20％至约80％、约30％至约80％、约40％至约80％、约50％至约80％、或约60％至约80％、约10％至约70％、约20％至约70％、约30％至约70％、约40％至约70％、或约50％至约70％。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，如本文额所公开给予本文所述的rAAV FKRP构建体(例如，表6中所述的任何血清型的AAV载体，包括AAV9)、AAV载体或AAV基因组能够使与抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱相关的不良影响降低至少10％、至少15％，至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，并且将与抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱相关的不良影响的严重程度降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在另一实施方式中，与给予前相比或与未接受相同治疗的受试者相比，与抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱相关的不良影响降低约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约10％至约80％、约20％至约80％、约30％至约80％、约40％至约80％、约50％至约80％、或约60％至约80％、约10％至约70％、约20％至约70％、约30％至约70％、约40％至约70％、约50％至约70％。此类不良影响包括但不限于肌肉力量受限、肌肉活动受限、肌肉痉挛、心脏问题、视力问题、呼吸困难、吞咽困难、面部肌肉无力、站立困难、爬楼梯困难、跑步困难、跳跃困难。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，与给予前相比或与未接受相同治疗的受试者相比，如本文所公开给予本文所述的rAAV FKRP构建体(例如，表6中所述的任何血清型的AAV载体，包括AAV9)、AAV载体或AAV基因组能够使受试者的骨骼肌和/或心肌中功能性FKRP的表达增加和/或α-抗肌萎缩蛋白聚糖的功能性糖基化增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
在另一实施方式中，与给予前相比或与未接受相同治疗的受试者相比，受试者的骨骼肌和/或心肌中功能性FKRP的表达和/或α-抗肌萎缩蛋白聚糖的功能性糖基化水平增加了约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、60％n至约90％、约70％至约90％、约10％至约80％、约20％至约80％、约30％至约80％、约40％至约80％、约50％至约80％、或约60％至约80％、约10％至约70％、约20％至约70％、约30％至约70％、约40％至约70％、或约50％至约70％。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，与给予前相比或与未接受相同治疗的受试者相比，如本文所公开给予本文所述的rAAV FKRP构建体(例如，表6中所述的任何血清型的AAV载体，包括AAV9)、AAV载体或AAV基因组能够使受体受试者执行给定物理任务(例如，步行或跑步)的能力提高至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％，或提高约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约10％至约80％、约20％至约80％、约30％至约80％、约40％至约80％、约50％至约80％、约60％至约80％、约10％至约70％、约20％至约70％、约30％至约70％、约40％至约70％、或约50％至约70％。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，与给予前相比或与未接受相同治疗的受试者相比，如本文公开给予本文所述的rAAV FKRP构建体(例如，表6中所述的任何血清型的AAV载体，包括AAV9)、AAV载体或AAV基因组能够使受体受试者执行给定物理任务(例如，步行或跑步)的能力提高约100％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％等。换句话说，与给予前相比或与未接受相同治疗的受试者相比，执行给定物理任务的能力提高了2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、10X或更多。
“潮气量”是指当没有施加额外的努力时，代表正常吸气和呼气之间排出的正常空气量的肺容量。在健康的年轻成人中，每次吸气的潮气量约为500mL，或7mL/kg体重。患有抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱(如LGMD2I)的受试者的潮气量受损。在本发明的一些实施方式中，将治疗有效量的rAAV FKRP构建体给予患有抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱(如LGMD2I)的受试者显著改善了受试者的潮气量。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，与给予前相比或与未接受相同治疗的受试者中的肌肉相比或与未接受相同治疗的受试者的肌肉相比，如本文所公开给予本文所述的rAAV FKRP构建体(例如，表6中所述的任何血清型的AAV载体，包括AAV9)、AAV载体或AAV基因组能够使体外肌力(例如比目鱼肌、膈膜和/或EDL肌肉)和/或潮气量(例如，如本文所分析的)增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，或约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约10％至约80％、约20％至约80％、约30％至约80％、约40％至约80％、约50％至约80％、或约60％至约80％、约10％至约70％、约20％至约70％、约30％至约70％、约40％至约70％、或约50％至约70％。
免疫抑制
在本文公开的方法和组合物的任何实施方式中，向正在被给予本文公开的包含FKRP转基因的rAAV载体或rAAV基因组的受试者给予免疫抑制剂。已知引起给予AAV的患者的免疫应答的免疫抑制的多种方法。本领域已知的方法包括向患者给予免疫抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂。本领域已知的一种此类蛋白酶体抑制剂是硼替佐米，例如美国专利号9,169,492和美国专利申请号15/796,137(二者均以引用的方式并入本文)中所公开。在另一实施方式中，免疫抑制剂可以是抗体，包括能够通过例如消除或抑制产生抗体的细胞来抑制免疫应答的多克隆抗体、单克隆抗体、scfv或其它由抗体衍生而来的分子。在进一步的实施方式中，免疫抑制元件可以是短发夹RNA(shRNA)。在此类实施方式中，shRNA的编码区被包含在rAAV盒中，并且通常位于poly-A尾的3'端下游。可使shRNA进行靶向以减少或消除免疫刺激剂的表达，所述免疫刺激剂例如细胞因子、生长因子(包括转化生长因子β1和β2、TNF和其它公知的因子)。
用于抑制受试者免疫系统的免疫抑制剂和方法描述于例如美国专利号10,028,993、9,592,247、8,809,282、9,186,420，和10,098,905。
在一些实施方式中，免疫调节剂为免疫球蛋白降解酶，如IdeS、IdeZ、IdeS/Z、EndoS或其功能变体。此类免疫球蛋白降解酶及其用途的参考文献的非限制性实例描述于US 7,666,582、US 8,133,483、US 20180037962、US 20180023070、US 20170209550、US 8,889,128、WO 2010057626、US 9,707,279、US 8,323,908、US 20190345533、US 20190262434和WO2020016318中，通过引用的方式将其每一个整以其体并入。
类固醇
在一个实施方式中，进一步给予受试者类固醇和AAV或本文所述的任何治疗剂。在一个实施方式中，所述类固醇为泼尼松。在一个实施方式中，所述类固醇为糖皮质激素。示例性糖皮质激素包括(1)氢化可的松/可的松；(2)泼尼松龙/泼尼松/甲基强的松龙；(3)倍他米松/地塞米松；和(4)曲安奈德。在一个实施方式中，所述类固醇选自于由如下所组成的组：阿氯米松、二丙酸阿氯米松、安西奈德、增强型倍他米松、增强型二丙酸倍他米松、倍氯米松、二丙酸倍氯米松、倍他米松、苯甲酸倍他米松、二丙酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、戊酸倍他米松、布地奈德、氯倍他索、丙酸氯倍他索、氯氟吐龙、氯氟吐龙新戊酸酯、可的松、地奈德、去氧米松、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、二氟拉松、醋酸二氟拉松(diflorasone acetonide)、双醋酸二氟拉松、flucinolone、氟羟缩松、氟尼缩松、氟轻松、氟轻松醋酸酯、氟氢缩松、氟替卡松、氟替卡松丙酸酯、氯氟松、卤倍他索、卤倍他索丙酸酯、氢化可的松、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、戊酸氢化可的松、甲基强的松龙、醋酸甲基强的松龙、甲基强的松龙琥珀酸钠、莫米松、糠酸莫米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠、泼尼松龙叔丁基乙酸酯、泼尼松、曲安奈德、酸酯曲安奈德(triamcinolone acetonide)、二醋酸曲安奈德、己曲安奈德(tiamcinolonehexacetonide)、乌倍他索，两种或多种这些类固醇的组合，或这些类固醇的商业产品。
在一个实施方式中，口服给予类固醇。本发明的类固醇可通过定义的系统性或局部给予所包含的任何途径进行给予。例如，本发明的类固醇可局部应用于皮肤，局部应用于眼睛，口服摄入，直接吸入肺，注射到静脉或肌肉，或直接注射到发炎的关节。可通过口服途径给药的类固醇包括但不限于以下类固醇：倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安奈德，两种或多种这些类固醇的组合，以及这些类固醇的商业产品。可通过胃肠外途径给予(如胃肠外注射)的类固醇包括但不限于以下类固醇：倍他米松、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙、曲安奈德，两种或多种这些类固醇的组合，以及这些类固醇的商业产品。可通过吸入给予的类固醇包括但不限于以下类固醇：倍氯米松、布地奈德、氟尼缩松、氟替卡松、莫米松、曲安奈德，两种或多种这些类固醇的组合，以及这些类固醇的商业产品。可通过局部途径给予的类固醇包括但不限于以下类固醇：阿氯米松、安西奈德、增强型倍他米松、倍他米松、氯倍他索、氯氟吐龙、地奈德、去氧米松、地塞米松、二氯拉松、flucinolone、氟轻松醋酸酯、氟氢缩松、氟替卡松、氯氟松、卤倍他索、氢化可的松、甲基强的松龙、莫米松、泼尼卡酯、曲安奈德，两种或多种这些类固醇的组合，以及这些类固醇的商业产品。本领域技术人员将理解，可通过多于一种途径给予特定的类固醇，例如局部制剂中使用的类固醇可适用于静脉内或口服给予。
在一个实施方式中，类固醇与本文所述的AAV或治疗剂基本上同时给予。在一个实施方式中，在给予本文所述的AAV或治疗剂后至少8小时、16小时、24小时、32小时、40小时以上，给予类固醇。在一个实施方式中，在给予本文所述的AAV或治疗剂之前至少8小时、16小时、24小时、32小时、40小时以上，给予类固醇。在一个实施方式中，以每天1mg/kg体重的剂量给予类固醇(例如泼尼松)，最高总剂量为60mg，持续4周，然后每周以～0.08mg/kg逐渐减少(例如，如果服用60mg，则为5mg)到最接近1mg，持续至少12周。
本领域普通技术人员应当理解，类固醇具有各种医药用途，包括但不限于：(1)抗炎用途，例如倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙、泼尼松和曲安奈德；(2)止吐用途，如地塞米松、氢化可的松和泼尼松；(3)诊断用途，如地塞米松，用于检测库欣氏综合征；以及(4)免疫抑制剂用途，例如倍他米松、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松、泼尼松龙、泼尼松和曲安奈德。此外，本领域普通技术人员将理解，糖皮质激素药物可用作眼部产品(用于治疗各种眼部病症)、吸入器(用于治疗哮喘或支气管疾病)、滴鼻剂和喷雾剂(用于治疗多种鼻部病症)、以及局部产品(如软膏和乳膏)(用于治疗各类皮肤病症)中所含的成分。
本领域普通技术人员将理解，类固醇的效力可能会有所不同。例如，与系统性给予相联合时，倍他米松和地塞米松表现出高的整体效力和高的抗炎效力；甲基强的松龙、曲安奈德、泼尼松龙和泼尼松表现出中等的整体效力和中等的抗炎效力；氢化可的松和可的松表现出低的整体效力和抗炎效力。
核糖醇
在一个实施方式中，本文所述的rAAV或治疗剂与核糖醇同时给予。核糖醇是由核糖还原而成的结晶戊糖醇。核糖醇增强了d-葡萄糖在酿酒酵母中向戊糖磷酸途径中的通量，以生产D-核糖和核糖醇。在营养不良小鼠模型中，核糖醇先前已经被证明影响a-抗肌萎缩蛋白聚糖的糖基化；例如，Cataldi,MP等，Molecular Therapy:Methods and ClinicalDev.，第17卷，2020年6月中进一步描述了这种影响，通过引用的方式将其并入本文。
核糖醇为市售的，例如通过Selleck Chem(Houston，TX)，其化学结构为
在一个实施方式中，核糖醇与本文所述的AAV或治疗剂基本上同时给予。在一个实施方式中，在给予本文所述的AAV或治疗剂后至少8小时、16小时、24小时、48小时、72小时、124小时或更长时间，给予核糖醇。在一个实施方式中，在给予本文所述的AAV或治疗剂之前至少8小时、16小时、24小时、48小时、72小时、124小时或更长时间，给予核糖醇。
在一个实施方式中，给予核糖醇至少1次。在一个实施方式中，给予核糖醇至少2次，例如至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次或更多次。在一个实施方式中，每天至少一次、每周至少一次、每月至少一次、每年至少一次给予核糖醇。当与本文所述的包含FKRP治疗剂的rAAV联合给予时，示例性的核糖醇方案包括每天一次或两次口服给予约6克至约12克的核糖醇。在一些实施方式中，在与本发明所述的包含FKRP治疗剂的rAAV一起给予或在其之前或之后给予的联合给予方案中，口服给予约1克、约2克、约3克、约4克、约5克、约6克、约7克、约8克、约9克、约10克、约11克或约12克的核糖醇。在一些实施方式中，在与本发明所述的包含FKRP治疗剂的rAAV一起给予或在其之前或之后给予的联合给予方案中，口服给予核糖醇超过约12克。在一个实施方式中，每天两次联合给予核糖醇。在一个实施方式中，每天三次联合给予核糖醇。在一个实施方式中，每天超过三次联合给予核糖醇。在一些实施方式中，核糖醇通过如下方式联合给予：口服、或鼻内、或通过静脉内途径、或通过皮下途径、或通过肌内途径、或通过鞘内途径、或通过舌下和颊途径、或通过直肠途径、或通过鼻途径、或通过吸入途径、或通过雾化途径、或通过皮肤途径、或通过经皮途径。在优选的实施方式中，当与本发明所述的包含FKRP治疗剂的rAAV一起给予或在其之前或之后给予时，口服联合给予核糖醇。
剂量
待向受试者给予的本文所公开的rAAV载体或rAAV基因组的剂量将取决于给予方式、待治疗和/或预防的疾病或病症、个体受试者状况、特定病毒载体或衣壳以及待递送的核酸等，并且可以以常规方式确定。用于实现治疗效果的示例性剂量为至少约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015个转导单位、任选约108至约1013个转导单位的滴度。在本发明的一些实施方式中，剂量为约1E13 vg/kg至约6E13 vg/kg。在一些实施方式中，剂量为约1E13 vg/kg至约3E13 vg/kg。在一些实施方式中，剂量为约3E13vg/kg至约6E13vg/kg。在一些实施方式中，剂量为约1E13 vg/kg、1.5E13 vg/kg、2E13 vg/kg、2.5E13 vg/kg、3E13 vg/kg、3.5E13 v/kg、4E13 vg/kg、4.5E13 vg/kg、5E13 vg/kg、5.5E13vg/kg或6E13vg/kg。在一些实施方式中，剂量为约1E14 vg/kg至约6E14vg/kg。在一个实施方式中，剂量为3E14 vg/kg。
给予途径和方案
给予途径包括但不限于口服给予、直肠给予、经粘膜给予、鼻内给予、吸入给予(例如通过气溶胶)、颊给予(例如舌下)、阴道给予、鞘内给予、眼内给予、经皮给予、子宫内(或卵内)给予、胃肠外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌内[包括向骨骼肌、膈肌和/或心肌的给予]、皮内、胸膜内、大脑内和关节内)给予、局部给予(例如，向皮肤和粘膜表面两者给予，包括气道表面和经皮给予)、淋巴内给予等，以及直接的组织或器官注射(例如，向骨骼肌、心肌、膈肌注射)或其它胃肠外途径，取决于期望的给予途径和所靶向的组织。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，根据本发明向骨骼肌局部给予包括但不限于向四肢(例如，上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背部、颈部、头部(例如，舌)、胸部、腹部、骨盆/会阴和/或指(趾)(digit)中的骨骼肌的给予。合适的骨骼肌包括但不限于小指展肌(在手中)、小趾展肌(在脚中)、拇展肌、第五跖骨外展肌、拇短展肌、拇长展肌、短收肌、拇趾收肌(adductor hallucis)、长收肌、大收肌、拇指收肌(adductor pollicis)、肘肌、前斜角肌、膝关节肌、肱二头肌、股二头肌、肱肌、肱桡肌、颊肌、喙肱肌、皱眉肌、三角肌、降口角肌、降下唇肌、二腹肌、骨间背侧肌(在手中)、骨间背侧肌(在脚中)、桡侧腕短伸肌、桡侧腕长伸肌、尺侧腕伸肌、小指伸肌、指伸肌、趾短伸肌、趾长伸肌、拇趾短伸肌(extensorhallucis brevis)、拇趾长伸肌(extensor hallucis longus)、食指伸肌、拇指短伸肌(extensor pollicis brevis)、拇指长伸肌(extensor pollicis longus)、桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、小指短屈肌(在手中)、小趾短屈肌(在脚中)、趾短屈肌、趾长屈肌、指深屈肌、指浅屈肌、拇趾短屈肌(flexor hallucis brevis)、拇趾长屈肌(flexor hallucis longus)、拇指短屈肌(flexor pollicis brevis)、拇指长屈肌(flexor pollicis longus)、额肌、腓肠肌、颏舌骨肌、臀大肌、臀中肌、臀小肌、股薄肌、颈髂肋肌、腰髂肋肌、胸髂肋肌、髂肌、下孖肌、下斜肌、下直肌、冈下肌、棘间肌、横突间肌、翼外肌、外直肌、背阔肌、提口角肌、提上唇肌、提上唇鼻翼肌、上睑提肌、肩胛提肌、长回旋肌、头最长肌、颈最长肌、胸最长肌、头长肌、颈长肌、蚓状肌(在手中)、蚓状肌(在脚中)、咬肌、翼内肌、内直肌、中斜角肌、多裂肌、下颌舌骨肌、头下斜肌、头上斜肌、闭孔外肌、闭孔内肌、枕肌、肩胛舌骨肌、小指对掌肌(opponens digiti minimi)、拇对掌肌、眼轮匝肌、口轮匝肌、骨间掌侧肌、掌短肌、掌长肌、耻骨肌、胸大肌、胸小肌、腓骨短肌、腓骨长肌、第三腓骨肌、梨状肌、骨间足底肌、跖肌、颈阔肌、腘肌、后斜角肌、旋前方肌、旋前圆肌、腰大肌、股方肌、足底方肌、头前直肌、头外侧直肌、头后大直肌、头后小直肌、股直肌、大菱形肌、小菱形肌、笑肌、缝匠肌、小斜角肌、半膜肌、头半棘肌、颈半棘肌、胸半棘肌、半腱肌、前锯肌、短回旋肌、比目鱼肌、头棘肌、颈棘肌、胸棘肌、头夹肌、颈夹肌、胸锁乳突肌、胸骨舌骨肌、胸骨甲状肌、茎突舌骨肌、锁骨下肌、肩胛下肌、上孖肌、上斜肌、上直肌、旋后肌、冈上肌、颞肌、阔筋膜张肌、大圆肌、小圆肌、胸肌(thoracis)、甲状舌骨肌、胫骨前肌、胫骨后肌、斜方肌、肱三头肌、股中间肌、股外侧肌、股内侧肌、颧大肌和颧小肌以及本领域已知的任何其它合适的骨骼肌。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，向心肌局部给予包括向左心房、右心房、左心室、右心室和/或间隔(septum)给予。病毒载体和/或衣壳可以通过静脉内给予、动脉内给予(例如主动脉内给予)、直接心脏注射(例如，注入左心房、左心房、左心室、右心室)和/或冠状动脉灌注而递送至心肌。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，向膈肌的给予可以通过任何合适的方法进行，包括静脉内给予、动脉内给予和/或腹膜内给予、以及直接肌肉注射。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，将本文公开的rAAV载体和/或rAAV基因组给予至受试者的骨骼肌、膈肌、肋肌和/或心肌细胞。例如，可以使用常规的注射器和针头将rAAV病毒粒子悬剂局部或系统性地注射入受试者中。通过注射的rAAV载体和/或rAAV基因组的胃肠外给予可以通过例如团注(bolus injection)或持续输注进行。注射制剂可以以单位剂量形式存在，例如随着加入的防腐剂存在于多剂量容器或安瓿中。该组合物可以采取诸如在油性或水性介媒中的悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且可以包含用于药物制剂的试剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，本文公开的rAAV载体和/或rAAV基因组可以呈粉末形式(例如经冻干的)，以在使用前与合适的媒介(例如灭菌无热原水)一起构成。
在一些实施方式中，采用了单次给予。在一些实施方式中，可以采用多于一次的给予(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次等，或更多次给予)，以在不同的时间间隔的时间段(如每小时、每天、每周、每月、每年等)内达到期望的基因表达水平。给药可以是单剂量或累积剂量(连续给药)，并且可以由本领域从业者容易地确定。例如，疾病或紊乱的治疗可以包含一次给予有效剂量的本文公开的药物组合物病毒载体。或者，疾病或紊乱的治疗可包含在时间段的范围内进行的有效剂量的病毒载体的多次给予，例如每天一次、每天两次、每天三次、每数天一次或每周一次。在一些实施方式中，给予受试者本文公开的rAAV载体或rAAV基因组为每天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月，11个月、12个月或更长。
取决于个体的年龄和/或个体症状的严重程度等因素，给予时机可因个体而异。例如，可以在不确定的时间段内每六个月一次向个体给予有效剂量的本文公开的病毒载体，或者直到个体不再需要治疗为止。本领域从业者将认识到，可以在整个治疗过程中监测个体的状况，并且可以相应地调节所给予的本文公开的病毒载体的有效量。
在一些实施方式中，给予受试者本文公开的rAAV载体或rAAV基因组导致FKRP蛋白的产生循环半衰期为2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月或更长时间。
可评估本领域已知的各种测定的给药疗效，例如，North Star Assessment forLimb Girdle Muscular Dystrophies(NSAD)(例如，如Jacobs MB等，Ann Neurol.，2021年5月；89(5)：967-978，doi:10.1002/ana.26044，Epub 2021年2月26日中所述)；疾病改善、严重程度和治疗功效的临床总体印象(CGI)；10米步行测试(10MWT)(例如，如McDonald CM等，Muscle Nerve，2013年9月；48(3)：357-68，doi:10.1002/mus.23905，Epub 2013年7月17日所述)；100米步行测试(100MWT)(例如，如Mendel等，JAMA Neurol.，2020；77(9):1122-1131，doi:10.1001/jamaneurol.2020.1484中所述)；4-爬楼梯(4SC)；起立行走计时(TUG)；上肢性能(PUL)(例如，如Gandolla M等，PLoS One，2020年9月28日；15(9)：e0239064，doi:10.1371/journal.pone.0239064中所述)；和/或患者报告的结果测量(例如，个体化生活质量、疲劳、嗜睡、抑郁评分)。
在一个实施方式中，接受本文所述的包含FKRP治疗剂的rAAV的受试者显示了距离基线至少或约1.73分的NSAD评分。在一个实施方式中，接受本文所述的治疗剂的受试者显示NSAD评分距离基线为至少或约0.1分、0.2分、0.3分、0.4分、0.5分、0.6分、0.7分、0.8分、0.9分、1分、1.1分、1.2分、1.3分、1.4分、1.5分、1.6分、1.7分、1.8分、1.9分、2分、2.1分、2.2分、2.3分、2.4分、2.5分、2.6分、2.7分、2.8分、2.9分、3分、3.1分、3.2分、3.3分、3.4分、3.5分、3.6分、3.7分、3.8分、3.9分、4分、4.1分、4.2分、4.3分、4.4分、4.5分、4.6分、4.7分、4.8分、4.9分、5分或更多分。如本文所用，“基线”是指受试者在给予治疗剂之前的NSAD评分。本领域技术人员将理解如何评估NSAD评分，例如，如Jacobs MB等，AssessingDysferlinopathy Patients Over Three Years With a New Motor Scale.Ann Neurol.，2021年5月；89(5)：967-978中所述，通过引用的方式将其并入本文。
在一个实施方式中，接受本文所述的包含FKRP治疗剂的rAAV的受试者显示10MWT评分为至少或约31％(例如，2.3秒)的基线。在一个实施方式中，接受本文所述的治疗剂的受试者显示10MWT评分为距基线至少或约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。如本文所用，“基线”是指受试者在给予治疗剂前的10MWT评分。本领域技术人员将理解如何评估10MWT评分，例如，如McDonald CM等，The 6-minute walk test and otherclinical endpoints in duchenne muscular dystrophy:reliability,concurrentvalidity,and minimal clinically important differences from a multicenterstudy.Muscle Nerve，2013年9月；48(3)：357-68中所述，通过引用的方式将其并入本文。
在一个实施方式中，接受本文所述的包含FKRP治疗剂的rAAV的受试者显示距基线至少或约6秒的100MWT评分。在一个实施方式中，接受本文所述的治疗剂的受试者显示100MWT评分为距基线至少或约0.5秒、1秒、2秒、3秒、4秒、5秒、6秒、7秒、8秒、9秒、10秒、11秒、12秒、13秒、14秒、15秒、16秒、17秒、18秒、19秒、20秒、21秒、22秒、23秒、24秒、25秒、26秒、27秒、28秒、29秒、30秒、31秒、32秒、33秒、34秒、35秒、36秒、37秒、38秒、39秒、40秒、41秒、42秒、43秒、44秒、45秒、46秒、47秒、48秒、49秒、50秒、51秒、52秒、53秒、54秒、55秒、56秒、57秒、58秒、59秒、60秒或更长时间。如本文所用，“基线”是指受试者在给予治疗剂前的100MWT评分。本领域技术人员将理解如何评估100MWT评分，例如，如Mendel JR等，Assessment of System Delivery of rAAVrh74.MHCK7.micro-dystrophin in ChildrenWith Duchenne Muscular Dystrophy:A Nonrandomized Controlled Trial.JAMANeurol.，2020；77(9)：1122-1131中所述，通过引用将其并入本文。
在一个实施方式中，接受本文所述的包含FKRP治疗剂的rAAV的受试者显示4SC评分为至少或约30％的基线。在一个实施方式中，接受本文所述的治疗剂的受试者显示4SC评分为距基线至少或约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。如本文所用，“基线”是指受试者在给予治疗剂之前的4SC评分。本领域技术人员将理解如何评估4SC评分。
在一个实施方式中，接受本文所述的包含FKRP治疗剂的rAAV的受试者显示TUG评分为至少或约30％的基线。在一个实施方式中，接受本文所述的治疗剂的受试者显示TUG评分为距基线至少或约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。如本文所用，“基线”是指受试者在给予治疗剂前的TUG评分。本领域技术人员将理解如何评估TUG分数。
在一个实施方式中，接受本文所述的包含FKRP治疗剂的rAAV的受试者显示PUL评分为距基线至少或约4分。在一个实施方式中，接受本文所述的治疗剂的受试者显示PUL评分为距基线至少或约0.1分、0.2分、0.3分、0.4分、0.5分、0.6分、0.7分、0.8分、0.9分、1分、1.1分、1.2分、1.3分、1.4分、1.5分、1.6分、1.7分、1.8分、1.9分、2分、2.1分、2.2分、2.3分、2.4分、2.5分、2.6分、2.7分、2.8分、2.9分、3分、3.1分、3.2分、3.3分、3.4分、3.5分、3.6分、3.7分、3.8分、3.9分、4分、4.1分、4.2分、4.3分、4.4分、4.5分、4.6分、4.7分、4.8分、4.9分、5分、5.1分、5.2分、5.3分、5.4分、5.5分、5.6分、5.7分、5.8分、5.9分、6分、6.1分、6.2分、6.3分、6.4分、6.5分、6.6分、6.7分、6.8分、6.9分、7分、7.1分、7.2分、7.3分、7.4分、7.5分、7.6分、7.7分、7.8分、7.9分、8.0或更多分。如本文所用，“基线”是指受试者在给予治疗剂之前的PUL评分。本领域技术人员将理解如何评估PUL评分，例如，如Gandolla M等，Test-retestreliability of the Performance of Upper Limb(PUL)module for musculardystrophy patients.PLoS One，2020年9月28日；15(9)：e02390，通过引用的方式将其并入本文。
病毒脱落测定(Viral Shedding Assay)：
针对产物scAAV9-Syn100-coFKRP或其任何衍生物(例如，其中，选自表1-表4中任一项或选自表8-表12的合成肌肉启动子取代Syn100启动子)开发病毒脱落测定。脱落测定通常为了收集有关传播给未经治疗的个体的可能性的信息而进行。在辉瑞公司于2020年7月6日发布的关于AAV基因疗法治疗杜兴肌营养不良的公开展示会中，病毒脱落现象被证明是接受治疗的人的家庭成员(例如，未接受治疗的兄弟姐妹)血清转化的可能性。血清转化表示没有抗体到有抗体的变化，即对治疗产品的变化，例如对治疗中使用的AAV血清型的变化。在作为基因治疗的一部分给予病毒后，它通过体液(例如通过唾液)离开身体很短一段时间，如果没有接受治疗的人在脱落期内接触到了该流体，未经治疗的人可能会产生针对该病毒的抗体，从而妨碍他们在未来接受基因治疗(如果需要的话)。
通常在受试者的临床样品中测试脱落产物的存在，例如来自粪便、尿液、鼻拭子、唾液的临床样品。分析测定将通过检测编码治疗产品的核酸或通过感染性病毒颗粒的存在来测量临床样品中的脱落。病毒脱落分析结果将有助于确定治疗产品是否脱落，脱落产品是否具有感染性，临床样品中的感染性的量是否与引起第三方感染所需的相当，含有脱落产品的临床样品是否代表自然传播途径。病毒脱落测定的细节，包括其目的、测定设计和分析，在2015年8月美国卫生与公众服务部、食品药品监督管理局、生物制品评价与研究中心的基于病毒或细菌的基因治疗和溶瘤产品脱落研究的设计和分析中进行了讨论，通过引用的方式将其以其全部并入本文。
效力测定开发
本发明人为治疗产品scAAV9-syn100-coFKRP或其衍生物开发了体外效力测定，以支持可比性研究和不同批号或不同批次的治疗产品制剂，和/或以比较供试品对指定参考的反应，和/或以反映FKRP的复杂生物活性(例如，α-DG的糖基化、层粘连蛋白结合)。计划可在数种细胞中开发该测定，例如人主动脉血管平滑肌细胞系(HA-VSMC或HASMC细胞)、LGMD2I患者来源的FKRP缺陷的椎旁骨骼肌细胞、待分化为心肌或骨骼肌细胞系的iPSC干细胞系、FKRP敲减或敲除细胞系。
例如，本文所述的测定可量化肌肉活检组织内的载体病毒基因组拷贝；肌肉活检组织中的mRNA表达和转基因蛋白表达(通过蛋白质印迹和/或免疫组织化学测量的蛋白表达)；肌肉活检组织中转基因表达的特征下游效应(例如，α-DG的糖基化、活检组织中的层粘连蛋白结合)。
例如，本文所述的测定可进一步测量开放性肌肉活检中的靶标活性程度，例如是否有足够的高于基线的靶标活性。确定(scAAV9-syn100-coFKRP)治疗的肌肉活检中的靶标活性的关键输出肌肉测定和感兴趣的生物标志物(例如，新生肌肉生物标志物)包括：肌肉中转导的证据(例如，肌肉组织内大量的AAV9-Syn100-FKRP载体基因组拷贝)、肌肉中hFKRP(人FKRP)转基因的mRNA表达的证据、高于基线的mRNA水平、肌肉中健康FKRP酶水平增加的证据(例如，通过免疫荧光、蛋白质印迹、ELISA等)(高于基线)、与FKRP酶水平升高直接相关的下游活性增加的证据(例如α-DG亚基末端糖基化增加；层粘连蛋白结合增加)(高于基线)。基线是指治疗前的水平。在某些情况下，基线是指未接受感兴趣的治疗产品(例如scAAV9-sun100-coFKRP)的模拟治疗所获得的水平。
剂型
在一些实施方式中，本文公开的rAAV载体和/或rAAV基因组可以以足以溶解本文公开的rAAV载体的量在溶剂、乳剂或其它稀释剂中配制。在该实施方式的其它方面，本文公开的rAAV载体和/或rAAV基因组可以以如下的量在溶剂、乳剂或稀释剂中配制，例如小于约90％(v/v)、小于约80％(v/v)、小于约70％(v/v)、小于约65％(v/v)、小于约60％(v/v)、小于约55％(v/v)、小于约50％(v/v)、小于约45％(v/v)、小于约40％(v/v)、小于约35％(v/v)、小于约30％(v/v)、小于约25％(v/v)、小于约20％(v/v)、小于约15％(v/v)、小于约10％(v/v)、小于约5％(v/v)或小于约1％(v/v)。在其它方面，本文公开的rAAV载体和/或rAAV基因组可以以处于如下范围内的量包含溶剂、乳剂或其它稀释剂，例如约1％(v/v)至90％(v/v)、约1％(v/v)至70％(v/v)、约1％(v/v)至60％(v/v)、约1％(v/v)至50％(v/v)、约1％(v/v)至40％(v/v)、约1％(v/v)至30％(v/v)、约1％(v/v)至20％(v/v)、约1％(v/v)至10％(v/v)、约2％(v/v)至50％(v/v)、约2％(v/v)至40％(v/v)、约2％(v/v)至30％(v/v)、约2％(v/v)至20％(v/v)、约2％(v/v)至10％(v/v)、约4％(v/v)至50％(v/v)、约4％(v/v)至40％(v/v)、约4％(v/v)至30％(v/v)、约4％(v/v)至20％(v/v)、约4％(v/v)至10％(v/v)、约6％(v/v)至50％(v/v)、约6％(v/v)至40％(v/v)、约6％(v/v)至30％(v/v)、约6％(v/v)至20％(v/v)、约6％(v/v)至10％(v/v)、约8％(v/v)至50％(v/v)、约8％(v/v)到40％(v/v)、约8％(v/v)到30％(v/v)、约8％(v/v)至20％(v/v)、约8％(v/v)至15％(v/v)或约8％(v/v)至12％(v/v)。
为了促进本文公开的rAAV载体和/或rAAV基因组的递送，可以将其与运载体或赋形剂混合。可能使用的运载体和赋形剂包括盐水(特别是灭菌的无热原盐水)、盐水缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨糖醇和甘油。USP级运载体和赋形剂对于将病毒粒子递送至人类受试者特别有用。
除了前述的剂型之外，本文公开的rAAV载体和/或rAAV基因组也可以被配制成长效制剂。此类长期作用剂型可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过IM注射来给予。因此，例如，本文公开的rAAV载体和/或rAAV基因组可以用合适的聚合材料或疏水材料(例如作为可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂或作为微溶衍生物来配制。
注射剂可以以常规形式制备，作为液体溶液剂或悬剂、注射前的适合于溶液剂或悬剂的固体形式，或作为乳剂。或者，可以以局部而非系统性的方式(例如以长效制剂或缓释剂型)给予本发明的病毒载体和/或病毒衣壳。此外，病毒载体和/或病毒衣壳可以附着到外科可植入基质而进行递送(例如，如美国专利公开号US-2004-0013645-A1中所述)。本文公开的病毒载体和/或病毒衣壳可以通过任何合适的方式给予至受试者的肺部，任选地通过给予由病毒载体和/或病毒衣壳构成的可吸入颗粒的气溶胶悬剂，由受试者吸入所述悬剂。可吸入颗粒可以是液体或固体。如本领域技术人员已知的，包含病毒载体和/或病毒衣壳的液体颗粒的气溶胶可以通过任何合适的方法产生，例如利用压力驱动的气溶胶雾化器或超声雾化器。参见例如，美国专利号4,501,729。包含病毒载体和/或衣壳的固体颗粒的气溶胶也可以同样地通过制药领域已知的技术用任何固体颗粒药物气溶胶发生器产生。
本文公开的技术的组合物和方法的所有方面可在以下编号的段落中的任何一个或多个段落中定义：
1.一种重组腺病毒相关(AAV)载体，所述载体在其基因组中以5'至3'的方向包含：
a)5'AAV反向末端重复(ITR)；
b)肌肉特异性启动子；
c)内含子序列；
d)编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的核酸，所述核酸具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，并与肌肉特异性启动子可操作地连接；
e)polyA信号序列，所述polyA信号序列与编码FKRP的核酸可操作地连接；
f)3'AAV ITR。
2.如段落1所述的重组AAV载体，其中，所述5'ITR为ITR2m。
3.如段落1-2中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述3'ITR为ITR2。
4.如段落1-3中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述肌肉特异性启动子为Syn100(SEQ ID NO：3)。
5.如段落1-4中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述内含子序列为VH4-Ig内含子3(SEQ ID NO：4)或其衍生物。
6.如段落1-5中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述polyA信号序列为SEQ IDNO：5。
7.如段落1-6中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述肌肉特异性启动子、内含子序列、编码FKRP的核酸和polyA信号序列包含在SEQ ID NO：1内。
8.如段落1-7中任一项所述的重组AAV载体，其中，血清型为AAV9。
9.一种药物组合物，所述药物组合物包含段落1-8中任一项所述的重组AAV载体。
10.一种治疗患有抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的受试者的方法，所述方法包括向受试者系统性给予治疗有效量的段落1-8中任一项所述的重组AAV载体和/或段落9所述的药物组合物，从而增加受试者的肌肉组织中功能性FKRP的表达。
11.如段落10所述的方法，其中，所述抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱为肢带型肌营养不良2I。
12.如段落10-11中任一项所述的方法，其中，给予受试者单剂量。
13.如段落10-12中任一项所述的方法，其中，通过静脉输注给予。
14.如段落10-13中任一项所述的方法，其中，所述给予剂量为约1E13 vg/kg至约6E13 vg/kg(例如约3E13 vg/kg)。
15.如段落10-14中任一项所述的方法，其中，在给予后在受试者中发生以下中的一种或多种：
a)受试者的骨骼肌和/或心肌中α-DG的功能性糖基化显著增加；
b)受试者的血清肌酸激酶水平显著降低；
c)受试者的骨骼肌中的胶原沉积显著降低；
d)受试者肌肉组织(例如比目鱼肌、膈膜和/或EDL)的体外肌力分析显著增加；和/或
e)受试者能够在平板运动试验中显著跑得更远。
16.如段落10-15中任一项所述的方法，其中，所述受试者为成年受试者。
17.一种编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的合成核酸，其中：
a)相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述核酸的CpG位点含量降低；
b)相对于SEQ ID NO：6的GC含量，GC含量降低了大于10％；和/或
c)所述核酸与SEQ ID NO：2具有至少80％的同一性。
18.如段落17所述的核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少50％。
19.如段落17-18中任一项所述的核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少75％、80％、85％、90％、95％。
20.如段落17-19中任一项所述的核酸，其中，所述编码序列的CpG位点含量为0％。
21.如段落17中任一项所述的合成核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述GC含量降低大于15％。
22.如段落17中任一项所述的合成核酸，其中，所述核酸与SEQ ID NO：2具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
23.如段落17所述的合成核酸，其中，所述核酸具有SEQ ID NO：2中所示的序列。
24.如段落17-23中任一项所述的合成核酸，所述合成核酸与启动子可操作地连接。
25.如段落24所述的合成核酸，其中，所述启动子为肌肉特异性启动子。
26.如段落24-25中任一项所述的合成核酸，其中，所述启动子为合成启动子。
27.如段落24-26中任一项所述的合成核酸，其中，所述启动子为Syn100。
28.如段落23-26中任一项所述的合成核酸，其中，所述启动子选自表1-表4中列出的启动子。
29.如段落24-25中任一项所述的合成核酸，其中，所述启动子为肌酸激酶(CK)启动子、鸡β-肌动蛋白启动子(CB)。
30.如段落17-29中任一项所述的合成核酸，所述合成核酸进一步包含增强子序列。
31.如段落30所述的合成核酸，其中，所述增强子序列包含CMV增强子、肌肉肌酸激酶增强子和/或肌球蛋白轻链增强子。
32.一种核酸，所述核酸包含：
a)5'和3'AAV反向末端重复(ITR)；
b)编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的编码序列，所述编码序列可操作地连接至位于5'ITR和3'ITR之间的肌肉特异性启动子，其中：
i)相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点的含量降低；
ii)相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述编码序列的GC含量降低大于10％；和/或
iii)所述编码序列与SEQ ID NO：2具有至少80％的同一性。
33.如段落32所述的核酸，所述核酸进一步包含位于肌肉特异性启动子和编码序列之间的内含子序列。
34.如段落33所述的核酸，其中，所述内含子序列为VH4-Ig内含子3(SEQ ID NO：4)或其衍生物。
35.如段落32-34中任一项所述的核酸，所述核酸进一步包含位于所述编码序列下游的至少一个polyA信号序列。
36.如段落35所述的核酸，其中，所述polyA信号序列为SEQ ID NO：5。
37.如段落32-36中任一项所述的核酸，其中，所述5'ITR为ITR2m。
38.如段落32-37中任一项所述的核酸，其中，所述3'ITR为ITR2。
39.如段落32-38中任一项所述的核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述编码序列的GC含量降低大于15％。
40.如段落32-40中任一项所述的核酸，其中，所述编码序列与SEQ ID NO：2具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
41.如段落32-40中任一项所述的核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少50％。
42.如段落32-41中任一项的核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少75％、80％、85％、90％、95％。
43.如段落32-42中任一项的核酸，其中，所述编码序列的CpG位点含量为0％。
44.如段落32-43中任一项所述的核酸序列，其中，所述编码序列为SEQ ID NO：2。
45.一种载体，所述载体包含段落17-44中任一项所述的合成核酸。
46.如段落45所述的载体，其中，所述载体为病毒载体。
47.如段落46所述的载体，其中，所述载体为重组腺相关病毒(AAV)载体。
48.如段落47所述的载体，其中，AAV载体为表6中列出的任何血清型。
49.如段落47或段落48所述的载体，其中，所述AAV载体为AAV9载体。
50.重组腺病毒相关(AAV)载体，在其基因组中包含：
a)5'AAV反向末端重复(ITR)和3'AAV ITR；
b)位于5'ITR和3'ITR之间的编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的核酸，其中：
i)相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述核酸的CpG位点含量降低；
ii)相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述核酸的GC含量降低大于10％；和/或
iii)所述核酸与SEQ ID NO：2具有至少80％的同一性，
并且所述核酸可操作地连接至肌肉特异性启动子。
51.如段落50所述的重组AAV载体，其中，所述AAV基因组以5'至3'的方向包含：
a)5'ITR，
b)肌肉特异性启动子，
c)内含子序列，
d)编码FKRP的核酸；以及
e)3'ITR。
52.如段落50-51中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述肌肉特异性启动子选自于由如下启动子所组成的组：MCK启动子、dMCK启动子、tMCK启动子、enh358MCK启动子、CK6启动子和Syn100启动子、表1-表4或表8-表12中列出的任意启动子，及它们的衍生物。
53.如段落50-52中任一项所述的重组AAV载体，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码FKRP的核酸的CpG位点含量降低。
54.如段落50-53中任一项所述的重组AAV载体，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码FKRP的核酸的CpG位点含量降低至少50％。
55.如段落50-53中任一项所述的重组AAV载体，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码FKRP的核酸的CpG位点含量降低至少75％、80％、85％、90％、95％。
56.如段落50-55中任一项所述的重组AAV载体，其中，编码FKRP的核酸的CpG位点含量为0％。
57.如段落50-56中任一项所述的重组AAV载体，其中，相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述编码FKRP的核酸的GC含量降低大于10％。
58.如段落50-57中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述编码FKRP的核酸与SEQID NO：2具有至少80％的同一性。
59.如段落50-58中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述编码FKRP的核酸具有SEQ ID NO：2所示的序列。
60.如段落50-59中任一项所述的重组AAV载体，所述重组AAV载体进一步包含位于编码FKRP多肽的核酸的3'和3'ITR序列的5'的至少一个polyA信号序列。
61.如段落60所述的重组AAV载体，其中，所述polyA信号序列为SEQ ID NO：5。
62.如段落50-61中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述ITR包括插入、缺失或置换。
63.如段落50-62中任一项所述的重组AAV载体，其中，ITR中的一个或多个CpG位点被移除。
64.如段落50-63中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述5'ITR为ITR2m。
65.如段落50-64中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述3'ITR为ITR2。
66.如段落50-65中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述内含子序列为VH4-Ig内含子3(SEQ ID NO：4)或其衍生物。
67.如段落50-66中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述重组AAV载体为嵌合AAV载体、单倍体AAV载体、杂合AAV载体或多倍体AAV载体。
68.如段落50-66中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述重组AAV载体为表6中列出的任何AAV血清型。
69.如段落68所述的重组AAV载体，其中，所述血清型为AAV9。
70.如段落50-69中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述重组AAV载体包含选自表7的衣壳蛋白或由表6中所列的血清型组成的组中的任何AAV血清型，及它们的组合。
71.一种药物组合物，所述药物组合物包含处于药学上可接受的运载体中的段落50-70中任一项所述的重组AAV载体。
72.一种经转化的细胞，所述经转化的细胞包含段落17-44中任一项所述的核酸和/或段落45-70中任一项所述的载体。
73.一种转基因动物，所述转基因动物包含段落17-44中任一项所述的核酸、段落45-70中任一项所述的载体和/或段落72所述的经转化的细胞。
74.一种在有需要的受试者中增加α-抗肌萎缩蛋白聚糖(α-DG)糖基化的方法，所述方法包括：向所述受试者给予治疗有效量的段落17-44中任一项所述的核酸、段落45-70中任一项所述的载体、段落71所述的药物组合物和/或段落72所述的经转化的细胞，其中，所述合成核酸在所述受试者中表达，从而产生人FKRP并增加α-DG的糖基化。
75.如段落74所述的方法，其中，所述受试者患有抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱或处于发展为抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的风险中。
76.一种在受试者中治疗抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的方法，所述方法包括向受试者给予治疗有效量的段落17-44中任一项所述的核酸、段落45-70中任一项所述的载体、段落71所述的药物组合物和/或段落72所述的经转化的细胞，其中，所述合成核酸在所述受试者中表达，从而治疗受试者的抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱。
77.如段落75或76中任一项所述的方法，其中，所述抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱与FKRP异常相关。
78.如段落75-77中任一项所述的方法，其中，所述抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱包含编码FKRP的核酸的突变和/或α-抗肌萎缩蛋白聚糖(α-DG)的糖基化缺乏。
79.如段落75-78中任一项所述的方法，其中，所述抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱为肢带型肌营养不良2I、先天性肌营养不良(CMD1C)、Walker-Warburg综合征、肌眼脑疾病，或它们的任意组合。
80.一种治疗患有抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的受试者的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的前述段落中任一项所述的重组AAV载体、rAAV基因组、核酸序列和/或药物组合物中的任一种，从而增加受试者肌肉组织中功能性FKRP的表达。
81.如段落74-80中任一项所述的方法，其中，给予所述受试者单剂量。
82.如段落74-81中任一项所述的方法，其中，给予为系统性的。
83.如段落82中任一项所述的方法，其中，通过静脉输注进行给予。
84.如段落74-83中任一项所述的方法，其中，在给予后，所述受试者的骨骼肌和/或心肌中α-DG的功能性糖基化显著增加。
85.如段落74-84中任一项所述的方法，其中，在给予后，所述受试者的血清肌酸激酶水平显著降低。
86.如段落74-85中任一项所述的方法，其中，在给予后，所述受试者的骨骼肌中的胶原沉积显著降低。
87.如段落74-86中任一项所述的方法，其中，所述受试者为成年受试者。
88.如段落74-86中任一项所述的方法，其中，所述受试者为青少年受试者。
89.如段落74-86中任一项所述的方法，其中，所述受试者为婴儿受试者。
90.如段落74-89中任一项所述的方法，其中，在给予前所述受试者表现出显著的疾病病理。
91.如段落74-89中任一项所述的方法，其中，在给予前所述受试者没有表现出显著的疾病病理。
除非本文另有定义，否则与本申请相关的科学术语和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。
应该理解，本发明不限于本文所述的特定方法学、方案和试剂等，因此可能会有所不同。本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不旨在限制仅由权利要求限定的本发明的范围。
除了在操作实例中，或在另有说明的情况下，本文中使用的所有表示成分量或反应条件的数字在所有情况下都应理解为用术语“约”修饰。术语“约”在用于与百分比结合描述本发明时指±1％。
在一个方面，本发明涉及本文所述的组合物、方法及其各自的组分，它们对本发明至关重要，但仍对包含未指明的元素(至关重要的或未包含)保持开放(“包含/包括/含有”)。在一些实施方式中，包含在组合物、方法或其各自的组分的描述中的其它元素仅限于对本发明的基本特性和新颖性特性没有实质性影响的那些元素(“基本上由……组成”)。这同样适用于所描述的方法中的步骤以及其中的组合物和组分。在其它实施方式中，本文所述的发明、组合物、方法及其各自的组分旨在排除任何不被视为该组分、组合物或方法的必要元素的元素(“由……组成”)。
出于描述和公开的目的，将标明的所有专利、专利申请和出版物以引用的方式明确并入本文，例如，在此类出版物中描述的可与本发明结合使用的方法学。这些出版物仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面，任何内容都不应解释为承认本发明人由于在先的发明或任何其它原因而无权将此公开内容提前。关于这些文件的日期的所有声明或关于这些文件的内容的所有描述均基于申请人可获取的信息，而并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认
仅出于说明性目的提供以下非限制性实施例，以促进对现在所考虑的代表性实施方式的更完善理解。这些实施例仅意在作为可以利用AAV病毒粒子和rAAV载体的所有可能情况的子集。因此，这些实施例不应被解释为限制本申请文件中描述的任何实施方式，包括与AAV病毒粒子和rAAV载体和/或其方法和用途有关的实施方式。最后，AAV病毒粒子和载体几乎可以在需要基因递送的任何情况下使用。
实施例
仅处于说明目的来提供以下非限制性实施例，以便于更全面地理解当前考虑的代表性实施例。这些实施例旨在作为AAV病毒粒子和rAAV载体可被利用的所有可能情况的仅一个子集。因此，这些实施例不应被解释为限制本说明书中描述的任何实施方式，包括与AAV病毒粒子和rAAV载体和/或其方法和用途有关的那些实施方式。最终，可在几乎任何需要基因递送的情况下使用AAV病毒粒子和载体。
实施例1：用于治疗LGMD的载体构建体
开发了含有FKRP的AAV基因治疗候选产品，用于治疗LGMD2I。LGMD2I被归类为抗肌萎缩相关糖蛋白病，是罕见的肌营养不良症，由编码fukutin相关蛋白的FKRP基因中的突变引起，fukutin为一种高尔基体结合转移酶，与α-抗肌萎缩蛋白聚糖或α-DG的糖基化、结构和活性的细胞修饰有关。目前没有FDA批准的治疗LGMD2I的疗法。本文所述的实验表明，向人类患者给与的本文所述的AAV基因治疗产品将为患者提供显著的治疗结果，从而产生显著改善的结果。
编码本文所述实验中递送的治疗性FKRP的AAV9载体如图13所示。
还提供了整个FKRP转基因盒的核酸序列(图13，SEQ ID NO：1)。该盒包含Syn100启动子(SEQ ID NO：3)，其为合成的肌肉特异性启动子(Qiao等，Molecular Therapy，第22卷，第11期，p.1890-1899(2014))。该盒进一步包含VH4-Ig内含子3(SEQ ID NO：4)，以及poly A序列(SEQ ID NO：5)，在启动子和内含子之间(actagta)、在内含子和编码序列之间(ccgcgggccacc)、以及在编码序列和polyA序列之间(gtcgac)具有间隔区序列。该盒侧接有两个ITR(ITR2m和ITR2)(图13)。
还显示了编码FKRP蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：2)。该序列已被密码子优化，并且进一步具有0％ CpG。此外，FKRP编码序列的总GC含量为％，与编码人FKRP的天然核苷酸序列相比，GC含量减少了15％(图18，SEQ ID NO：6)。
实施例2：LGMD2I的小鼠模型给药
AAV9 FKRP载体的递送通过并入载体中的Syn-100启动子的作用使得主要在肌肉组织中表达FKRP蛋白。在小鼠模型系统中进行以下实验，以确定AAV9-FKRP的递送是否可改善LGMD2I患者的肌肉病理，从而作为有效的疗法。图1概述了进行的剂量探索和毒理学研究。
在这些研究中使用了两种小鼠模型。在小鼠等位基因中携带人类亮氨酸276向异亮氨酸(L276I)突变的纯合敲入小鼠模型(L276IKI)模拟了骨骼肌和心肌二者中LGMD2I的经典晚发表型(Qiao等，Mol Ther.，2014年11月；22(11)：1890-1899)。这最初用于毒理学和生物分布研究。在FKRP基因(FKRPP448L突变体)中含有纯合错义突变(c.1343C>T，p.Pro448Leu)的LGMD2I小鼠模型(Chan等，(2010)Hum.Mol.Genet，19，3995-1006；Blaeser等(2013)Hum.Genet.，132，923-934)用于证明构建体功效和剂量探索功能。
在接受不同剂量(3E13 vg/kg、1E14 vg/kg)AAV9-FKRP载体的小鼠模型小鼠中，与接受空媒介的小鼠相比，在不同肌肉组织中观察到FKRP蛋白表达。图2显示了与接受空媒介的小鼠相比，受体小鼠膈膜和四头肌中代表性表达水平的照片。治疗性FKRP蛋白表达与骨骼肌中α-抗肌萎缩蛋白聚糖表达的功能性糖基化增加相关。图3显示了作为阳性对照的正常BL6小鼠(左上照片)、接受1E14 vg/kg(右上)和3E13 vg/kg(左下)AAV9-FKRP的P448L小鼠、以及作为阴性对照的接受空媒介的P448L小鼠(右下)中的代表性α-抗肌萎缩蛋白聚糖表达的照片。来自四头肌切片的免疫荧光染色显示出针对AAV9-FKRP的明显反应，并且与未经治疗的BL6小鼠相比，假手术注射的P448L小鼠显示出α-DG的表达降低(图4)。与未经治疗的P448小鼠相比，在所有剂量水平下用AAV9-FKRP治疗的小鼠显示出α-DG的表达增加，这表明FKRP的有效表达和随后的α-DG糖基化。
胶原含量的增加反映了营养不良病理导致的持续纤维化。在给予不同量的AAV9-FKRP或媒介的P448L小鼠中进行四头肌的天狼星红染色和定量分析。四头肌横截面的代表性结果在图5中的照片示出(左)。在未经治疗的情况下，P448L小鼠(中上照片)表现出大量胶原沉积和不规则的肌肉纤维形状。这些特征在不同剂量的AAV9-FKRP下逐渐恢复至正常。结果在图5所示的图示中进行了定量(右)。观察到营养不良病理学的减少和纤维化的减少。与正常BL6小鼠相比，假手术注射的P448L小鼠显示出胶原含量增加。用AAV9-FKRP在所有剂量水平下处理的小鼠的胶原表达减少(胶原百分比减少)，这表明收缩诱导的损伤和纤维化物质的沉积较少。
骨骼肌受损时释放肌酸激酶。肌酸激酶的水平是正在进行的LGMD疾病病理学的读数。对P448L小鼠的血清肌酸激酶水平进行分析。结果在图6中呈现。已经接受空媒介的BL6小鼠表现出正常的肌酸激酶水平。接受空媒介的P448L小鼠表现出肌酸激酶疾病状态水平。令人惊讶的是，接受任一剂量AAV9-FKRP的所有P448L小鼠的血清肌酸激酶水平都降低到了正常的点。
对受体小鼠的肌肉力量、耐力和身体活动进行功能性测量，以检查是否可以实现这些测量恢复到基线。如图7-图9所示，与BL6媒介小鼠相比，仅给予媒介的P448L小鼠显示出显著更低的膈肌肌力和比目鱼肌肌力。所有剂量水平下的AAV9-FKRP治疗使得膈肌和比目鱼肌的肌力显著高于BL6媒介小鼠。在EDL肌肉中也观察到类似的趋势。
如图11所示，在用雄性和雌性小鼠进行的终点自主转轮研究中在绝对基础上并且是当将数据归一化至体重时，P448L媒介小鼠的跑步距离明显短于BL6媒介小鼠。此外，与P448L媒介小鼠相比，用AAV9-FKRP治疗的小鼠跑得的距离较远。在平板运动力竭状态下的小鼠中也获得了类似的结果(图10)，尽管当将数据归一化至体重时，在用AAV9-FKRP治疗的雌性小鼠中没有观察到统计学显著性。虽然小鼠性别之间反应差异的原因尚不清楚，但这些结果表明，P448L小鼠对AAV9-FKRP的反应是有意义的，提高耐力和身体活动。
如图12所示，进行的体积描记研究揭示，呼吸有剂量依赖性改善，表现为归一化的潮气量增加。这在雌性身上比在雄性身上更容易观察到。
讨论
这些临床前剂量探索和毒理学研究的结果表明，AAV9-FKRP在以类似剂量系统性给予后对人类患者将具有治疗益处，包括骨骼肌收缩功能恢复、骨骼肌中α-抗肌萎缩蛋白聚糖的功能性糖基化的全身性表达，可收缩组织(肌肉)的渐进性损失减少并且非收缩组织(纤维化和脂肪)的出现减少，以及如身体能力和耐力等功能测量的改善。
实施例3-临床试验
这项试验性/关键临床研究是AAV9-FKRP在人类患者中进行的多中心、双盲、随机、安慰剂对照的1/2期临床试验，这些患者具有编码fukutin相关蛋白的基因中的罕见的常染色体隐性突变(基因型证实的LGMD21/R9)。该试验将在两部分中进行：研究第1部分将为试验性研究，评价安全性、靶向活性和初步功效，以帮助确定基因疗法的推荐2期剂量(RP2D)；研究第2部分将为关键研究，以确认R2PD下的基因疗法的安全性和功效。
该临床研究将招募L2761/R9(c.826C>A)突变为纯合的人类受试者(试验性研究，第1部分)，以及随后L2761/R9(c.826C>A)突变为纯合或杂合的人类受试者(关键研究，第2部分)，以评估1El3vg/kg和3El3 vg/kg的单次IV输注剂量。试验性试验将有两个剂量递增队列，其中队列1中有4名患者(低剂量，1El3 vg/kg)，队列2中有6名患者(高剂量，3El3 vg/kg)。
关键研究预计招募51名受试者，以R2PD给药。在试验性研究和关键研究中，如果将被随机分配到安慰剂组的受试者在其各自的研究部分结束时仍符合条件，将给他们提供基因疗法。
接受治疗时，受试者将接受免疫抑制药物。将在第1天载体给药前24小时+/-8小时开始类固醇预防应用；口服泼尼松将以每日1mg/kg体重的剂量给予，最高总剂量为60mg，持续4周；然后每周～0.08mg/kg的逐渐减少(至最近接1mg)，或者如果服用60mg，则减少5mg，持续12周。受试者将记录类固醇依从性日记，并由研究团队在现场、家访和电话访问期间进行监测。
预先指定的联合主要终点包括安全性和功效。功效将通过主要和次要功能终点进行评价，包括但不限于：关于肢带型肌营养不良的北极星评价(NSAD)；疾病改善、严重程度和治疗功效的临床总体印象(CGI)；10米步行测试(10MWT)；100米步行测试(100MWT)；4-爬楼梯(4SC)；起立行走计时(TUG)；上肢性能(PUL)；和/或患者报告的结果测量(例如，个体化生活质量、疲劳、嗜睡、抑郁评分)。
此外，将评估心脏和呼吸功能的生理学评价，以检查心脏和肺部疾病的进展。将对下肢进行MRI评价，以评价急性或慢性肌肉损伤和疾病进展(如肌肉水肿、脂肪替代和消瘦)。受体受试者的肌肉、隔膜和心脏组织将被靶向并通过肌肉活检分析来分析FKRP的表达，α-抗肌萎缩蛋白聚糖含量，糖基化的(α-抗肌萎缩蛋白聚糖)含量、胶原含量。还将分析血清肌酸激酶水平和其它蛋白质组学和代谢组学生物标志物。
对于所有这些终点，将在不同的时间点测量与基线的变化，例如，在基线、16周、24周、40周和52周。这些终点是探索性的，因此会记录与基线相比有统计学上的显著差异。此外，血清CK水平的统计学显著降低(例如，接近正常)可能是肌肉损伤减少的替代物，即表明本文所述饿治疗产品的功效。将在一个或多个所述时间点测量L VEF舒张和收缩容积以及心输出量与基线的变化。此外，将分析B细胞和T细胞免疫应答(总/循环和中和抗腺相关病毒血清型9(AAV9)抗体滴度)；和/或T细胞对AAV和FKRP的反应性(从基线直到12个月)；和/或AAV9载体脱落。
此外，将测量探索性终点，其包括对以下中的一项或多项的分析；B细胞和T细胞的免疫表型；将在24周、40周和52周时观察肺功能自基线的变化(通过用力呼吸肺活量(FVC)测量)；将在24周、40周、52周时观察第1秒用力呼气量(FEV1)方面自基线的改变；将在24周、40周、52周时观察最大吸气压(MIP)方面自基线的变化；将在24周、40周和52周时观察最大呼气压(MEP)方面自基线的变化；将在8周、24周和52周观察心脏结构和功能自基线的改变(通过射血分数(EF)测量)；将观察左心室收缩末期容积指数(LVESVI)自基线的变化至52周；将在8周、24周和52周时通过超声心动图观察心肌峰值周向应变与基线相比的变化；将在52周时观察下肢肌肉质量和数量(通过MRI T2w(STIR)测量)、脂肪抑制的水肿信号方面自基线的变化；集中评分，观察与对照组相比积极治疗组的下肢肌肉在基线和52周的变化(通过MRI三点dixon脂肪分数序列来测量)。
与安慰剂相比，预计经治疗的患者的一个或多个主要/次要终点(如肌酸激酶水平)将随着时间的推移得到改善。例如，预计对于经治疗的患者，肌酸激酶水平将随着时间的推移而降低，令人惊讶地接近大约正常水平。
使用本发明所述的基因疗法，预计将观察到本文所述终点的临床上有意义的变化。例如，在NSAD中，将观察到与基线约1.73分的可观测且具有临床意义的差异1。在10MWT中，将观察到距离基线(例如2.3秒)约31％的可观测且具有临床意义的变化2。在100MWT中，将观察到距离基线约6秒的可观测且具有临床意义的变化3。在4SC中，将观察到距离基线(例如2.1秒)约30％的可观测且具有临床意义的变化。在TUG中，与DM-1患者中观察到的情况类似，将观察到距离基线约30％的可观测且具有临床意义的变化。在PUL中，在LGMD患者中所见，将观察到距离基线约4分的可观测且具有临床意义的变化4。
实施例3的参考文献
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实施例4-使用HEK293细胞生产包含编码FKRP多肽的核酸的病毒载体，所述编码FKRP多肽的核酸可操作地连接到肌肉特异性启动子
丛粘附的HEK293 Qualified Master Cell Bank衍生悬浮HEK293细胞。在10000级洁净室设施中从亲本HEK293 Master Cell Bank(MCB)衍生悬浮细胞系。悬浮细胞系的衍生在两阶段过程中进行，该过程包括首先使细胞脱离含有牛血清的培养基，然后使细胞适应与HEK293细胞相兼容的无血清悬浮培养基。悬浮细胞系的创建如下。首先，将一小瓶合格的Master Cell Bank(MCB)解冻，并将其置于含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养，并培养几天，以使细胞从冷冻/解冻循环中恢复。将MCB细胞培养并传代4周的时间段，同时组织培养基中FBS的量从10％逐渐减少到2.5％。然后将细胞从DMEM 2.5％ FBS转移到无血清悬浮培养基中，并在摇瓶中生长。然后将细胞在无血清培养基中再培养3周，同时监测其生长速率和活力。然后将适应的细胞扩增并冷冻。随后将该细胞库中的多个小瓶解冻，并在工艺开发研究中使用，以使用摇瓶和波浪生物反应器系统来产生rAAV载体，从而创建可扩展的制造工艺。悬浮HEK293细胞在无血清悬浮培养基中生长，该培养基在摇瓶和波浪生物反应器袋中同时支持生长和高转染效率。Multitron Shaker孵育器(ATR)用于在特定rpm振荡速度(基于细胞培养体积)、80％湿度和5％ CO2下维持细胞和产生rAAV载体。
悬浮HEK293细胞的转染。转染当天，使用ViCell XR活力分析仪(Beckman Colter)对细胞进行计数，并稀释以进行转染。为了混合转染共混物，将以下试剂按顺序添加到锥形管中：质粒DNA、I(Gibco)或OptiPro SFM(Gibco)、或其它无血清的兼容转染介质，然后与质粒DNA为特定比例的转染试剂。质粒DNA具有包含编码FKRP蛋白的异源核酸序列的序列，所述编码FKRP蛋白的异源核酸序列与具有其它所需调控序列的肌肉特异性启动子(SEQ ID NO：1)可操作地连接。此外，还添加了AAV rep和AAV cap基因以及腺病毒辅助基因(例如，编码在一个或多个额外的质粒上)。在室温下孵育之前，将共混物颠倒混合。然后将转染共混物移液到瓶中，并将其放回振荡器/培养箱中。所有优化研究均在30mL培养体积下进行，然后在较大培养体积下验证。转染后48小时收获细胞。
使用波浪生物反应器系统生产rAAV。在转染前2天接种波浪袋。接种波浪袋后两天，进行细胞培养计数，然后在转染前扩增/稀释细胞培养物。然后对波浪生物反应器细胞培养物进行转染。转染后48小时，在诱导rep和cap蛋白表达的条件下培养波浪生物反应器细胞培养物。这种rep表达的条件需要在波浪生物反应器细胞培养物中以1μM至100μM(例如8μM)的浓度给予NKH 477。这种cap表达的条件需要在低氧条件下，即5％的氧下培养细胞。在诱导后至少48小时从波浪生物反应器袋中收获细胞培养物。
使用流式细胞术分析转染效率。诱导后约24小时，从每个瓶或波浪生物反应器袋以及未诱导的对照中移取1mL细胞培养物。使用Dako Cyan流式细胞仪对样品进行分析，以确认质粒DNA。
从摇瓶和波浪生物反应器袋中收获悬浮细胞。诱导后48小时，通过从摇瓶中倾倒或从波浪生物反应器袋中泵送，将细胞培养物收集到500mL聚丙烯锥形管(Corning)中。然后使用Sorvall RC3C plus离心机和H6000A转子将细胞培养物以655×g离心10min。丢弃上清液，将细胞重悬于1×PBS中，转移到50mL锥形管中，并以655×g离心10min。此时，可将沉淀储存在NLT-60℃中，也可继续纯化。
使用qPCR从细胞裂解物中滴定rAAV。移取10mL细胞培养物，并使用Sorvall RC3Cplus离心机和H6000A转子以655×g离心10min。将上清液从细胞沉淀中倾倒出来。然后将细胞沉淀重悬于5mL DNase缓冲液(5mM CaCl2、5mM MgCl2、50mM Tris-HCl pH 8.0)中，然后超声处理以有效裂解细胞。然后移取300μL，并将其放入1.5mL的微量离心管中。然后将140单位的DNase I添加到每个样品中，并在37℃下孵育1小时。为了确定DNase消化的有效性，将4-5μg的质粒DNA掺入添加和不添加DNase的未转染细胞裂解物中。然后向每个管中加入50μLEDTA/Sarkosyl溶液(6.3％sarkosyl，62.5mM EDTA pH 8.0)，并在70℃下孵育20分钟。然后加入50μL蛋白酶K(10mg/mL)，并在55℃下孵育至少2小时。然后将样品煮沸15分钟以使蛋白酶K失活。从每个样品中移取出等分试样以通过qPCR进行分析。进行两次qPCR反应，以便有效地确定每个细胞产生多少rAAV载体。
从粗裂解物中纯化rAAV。将每个细胞沉淀调节至10mL的最终体积。将沉淀短暂涡旋并在1秒开、1秒关的爆发中，以30％的输出超声处理4分钟。超声处理后，添加550U的DNase，并在37℃下孵育45分钟。然后使用Sorvall RCSB离心机和HS-4转子以9400×g离心沉淀，以将细胞碎片沉淀，并将澄清的裂解物转移到Type70Ti离心管(Beckman 361625)中。关于收获和裂解悬浮HEK293细胞以分离rAAV，本领域技术人员可使用机械方法(例如微流化)或化学方法(例如去污剂)等，然后使用深度过滤或切向流过滤(TFF)进行澄清步骤。
AAV载体纯化。如本领域技术人员所知并在以下手稿中描述的，通过柱色谱法纯化澄清的AAV裂解物(Allay等、Davidoff等、Kaludov等、Zolotukhin等、Zolotukin等及其它)。
使用斑点印迹对rAAV进行滴定。将100μL DNase缓冲液(140单位DNase、5mMCaCl2、5mM MgCl2、50mM Tris-HCl pH 8.0)添加到96孔微量滴定板的每个孔中。将1-3μL或系列稀释的病毒加入每个孔中，并在37℃下孵育30min。然后用15μL Sarkosyl/EDTA溶液(6.3％sarkosyl，62.5mM EDTA pH 8.0)补充样品，并在70℃下放置20min。接下来，加入15μL蛋白酶K(10mg/mL)，并在50℃下孵育至少2小时。将125μL的NaOH缓冲液(80mM NaOH，4mMEDTA pH 8.0)加入到每个孔中。通过稀释系列创建了一系列转基因具体标准品。然后加入NaOH缓冲液并孵育。在RT下将尼龙膜在0.4M Tris-HCl、pH 7.5中孵育，然后放置在斑点印迹设备上。在NaOH缓冲液中孵育10-15分钟后，将样品和标准品装载到斑点印迹设备中，至GeneScreen PlusR杂交转移膜(PerkinElmer)上。然后使用真空将样品施加到膜上。将尼龙膜浸泡在0.4M Tris-HCl中、pH 7.5，然后使用UV层连接剂1800(Stratagene)在600ujou1s×100下交联。然后将膜在CHURCH缓冲液(1％ BSA，7％SDS，1mM EDTA，0.5M Na3PO4，pH 7.5)中预杂交。预杂交后，将膜与32P-CTP标记的转基因探针(Roche Random Prime DNA标记试剂盒)杂交过夜。第二天，用低严格性(1×SSC、0.1％ SDS)和高严格性(0.1×SSC、0.1％ SDS)SSC缓冲液洗涤膜。然后将其暴露在磷光成像仪屏幕上，并使用STORM840扫描仪(GE)进行密度测量分析。
使用银染法分析rAAV载体纯度。将来自纯化的载体的样品加载到NuPage 10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上，并使用l×NuPage运行缓冲液运行。通常，每个孔装载1×1010个颗粒。用SilverXpress银染色试剂盒#LC6100(Invitrogen)处理凝胶。
使用碱性凝胶电泳和southern印迹对自身互补基因组进行分析。简言之，将纯化的自互补rAAV加入200μl DNase I缓冲液(140单位DNase、5mM CaCl2、5mM MgCl2、50mMTris-HCl pH 8.0)中，并在37℃下孵育60分钟，然后通过添加30μL EDTA Sarkosyl/EDTA溶液(6.3％sarkosyl，62.5mM EDTA pH 8.0)并在70℃下放置20min使DNase失活。然后向样品中加入20μL蛋白酶K(10mg/mL)，并在50℃下孵育至少2小时。苯酚/氯仿以1:1的比例加入，然后乙醇沉淀病毒载体DNA。然后将沉淀的DNA重悬于碱性缓冲液(50mM NaOH、1mM EDTA)中进行变性，加载到1％碱性琼脂糖凝胶上，并在25V下运行过夜。然后将凝胶在碱性转移缓冲液(0.4M NaOH，1M NaCl)中平衡，并通过将载体DNA过夜转移到GeneScreen PlusR杂交转移膜(PerkinElmer)上进行southern印迹。然后使用0.5M Tris pH 7.5和1M NaCl中和膜，并用32P-CTP标记的转基因探针杂交过夜。如前所述洗涤膜后，将膜暴露于磷光成像仪屏幕，并使用STORM840扫描仪进行分析。
转导分析。将HeLaRC-32细胞(Chadeuf等，J Gene Med.，2：260(2000))以24孔板的2×105个细胞/孔进行铺板，并在37℃下孵育过夜。观察细胞的汇合度为90％-100％。将50mL的含有2％ FBS、1％Pen/Strep的DMEM预热，并以MOI为10添加腺病毒(d1309)。将含有d1309的培养基等分为900μL的小部分，并用于以一系列十倍稀释来稀释rAAV。然后将rAAV以400μL铺板，并使得在37℃下孵育48小时。
浓度分析。将起始载体原液取样并加载到vivaspin柱上，并以470×g(SorvallH1000B)以10分钟间隔离心。一旦达到所需的体积/浓度，就用渗余物(retentate)冲洗膜的两侧，然后收获。采集预浓缩和浓缩rAAV的样品以确定物理滴度和转导单位。
负染色rAAV颗粒的透射电子显微镜(TEM)。电子显微镜使得病毒颗粒直接可视化。通过将格栅倒置在20μL的病毒滴上将纯化的透析rAAV载体放置在400目辉光放电碳格栅上。然后，通过在20μLddH2O滴上倒置，随后将格栅在20μL 2％乙酸铀滴上倒置30秒，将格栅洗涤2次。通过将Whatman纸轻轻地触碰到格栅的边缘，以将格栅擦干。使用Zeiss EM 910电子显微镜对每个载体进行可视化。
实施例5-使用Pro10细胞生产包含编码FKRP多肽的核酸的病毒载体，所述编码FKRP多肽的核酸可操作地连接到肌肉特异性启动子
包含FKRP表达盒(SEQ ID NO：1)的核酸构建体(例如，在图13的质粒中)用于制造在用于AAV生产的稳定细胞系Pro10细胞中的病毒载体。这些用于AAV生产的稳定Pro10细胞(例如，如美国专利号9,441,206中所述)是AAV载体的可扩展生产的典范。通过转染使细胞系与FKRP核酸构建体(例如图13所示的质粒)接触以接收核酸。使用质粒特异性引物通过基于PCR的测定来确认核酸构建体的存在。
转染。用FKRP核酸构建体转染稳定的Pro10细胞，也用编码Rep和血清型特异性Cap的包装质粒转染：或者，作为自退火环状核酸提供AAV Rep/Cap，和/或在一个或多个质粒上提供Ad-Helper质粒(XX680：编码腺病毒辅助序列)，或作为自退火环形核酸提供。
转染当天，使用ViCell XR活力分析仪(Beckman Coulter)对细胞进行计数，并稀释以进行转染。为了混合转染共混物，将以下试剂按顺序添加到锥形管中：质粒DNA、I(Gibco)或OptiPro SFM(Gibco)、或其它无血清的兼容转染介质，然后与质粒DNA为特定比例的转染试剂。在室温下孵育之前，将共混物颠倒混合。将转染共混物移液到瓶中，并将其放回振荡器/培养箱中。所有优化研究均在30mL培养体积下进行，然后在较大培养体积下验证。转染后48小时收获细胞。
使用波浪生物反应器系统生产rAAV。在转染前2天接种波浪袋。接种波浪袋后两天，进行细胞培养计数，然后在所述转染前扩增/稀释细胞培养物。然后对波浪生物反应器细胞培养物进行转染。转染后48小时，从波浪生物反应器袋中收货细胞培养物。
滴度：使用对照标准曲线(AAV ITR特异性)的qPCR和对因子IX核酸构建体具有特异性的引物，在DNase消化后计算AAV滴度。
从摇瓶和60波浪生物反应器袋中收获悬浮细胞。转染后48小时，通过从摇瓶中倾倒或从波浪生物反应器袋中泵送，将细胞培养物收集到500mL聚丙烯锥形管(Corning)中。然后使用Sorvall RC3C plus离心机和H6000A转子将细胞培养物以655×g离心10min。弃去上清液，将细胞重悬于1×PBS中，转移到50mL锥形管中，并以655×g离心10mM。此时，沉淀可储存在NLT-60℃中，也可继续纯化。
使用qPCR从细胞裂解物中滴定rAAV。移取10mL细胞培养物，并使用Sorvall RC3Cplus离心机和H6000A转子以655×g离心10min。将上清液从细胞沉淀中倾倒出来。然后将细胞沉淀重悬于5mL DNase缓冲液(5mM CaCl2、5mM MgCl2、50mM Tris-HCl pH 8.0)中，然后超声处理以有效裂解细胞。然后移取300μL，并将其放入1.5mL的微量离心管中。然后将140单位的DNase I添加到每个样品中，并在37℃下孵育1小时。为了确定DNase消化的有效性，将4-5mg的因子IX核酸构建体掺入添加和不添加DNase的未转染细胞裂解物中。然后向每个管中加入50μL EDTA/Sarkosyl溶液(6.3％sarkosyl，62.5mM EDTA pH8.0)，并在70℃下孵育20分钟。然后加入50μL蛋白酶K(10mg/mL)，并在55℃下孵育至少2小时。将样品煮沸15分钟以使蛋白酶K失活。从每个样品中移取出等分试样以通过qPCR进行分析。进行两次qPCR反应，以便有效地确定每个细胞产生多少rAAV载体。使用一组引物2s建立一个qPCR反应，所述引物2s被设计为与质粒XX680、pXR2和因子IX核酸构建体的主链上的同源序列结合。第二个qPCR反应使用结合和扩增因子IX小基因内的一个区域的一组引物来建立。使用来自30Roche的Light循环仪480和Sybr绿色试剂进行qPCR。样品在95℃下变性10分钟，然后进行45个循环(90℃10秒、62℃10秒和72℃10秒)和熔融曲线(1个循环99℃30秒、65℃连续1分钟)。
从粗裂解物中纯化rAAV。将每个细胞沉淀调节至10mL的最终体积。将沉淀短暂涡旋并在1秒开、1秒关的爆发中，以30％的输出超声处理4分钟。超声处理后，添加550U的DNase，并在37℃下孵育45分钟。然后使用Sorvall RCSB离心机和HS-4转子以9400×g离心沉淀，以将细胞碎片沉淀，并将澄清的裂解物转移到Type70Ti离心管(Beckman 361625)中。关于收获和裂解悬浮HEK293细胞以分离rAAV，本领域技术人员可使用机械方法(例如微流化)或化学方法(例如去污剂)等，然后使用深度过滤或切向流过滤(TFF)进行澄清步骤。
AAV载体纯化。如本领域技术人员所知并在以下手稿中描述的，通过柱色谱法纯化澄清的AAV裂解物(Allay等、Davidoff等、Kaludov等、Zolotukhin等、Zolotukin等及其它)，以引用的方式将其以其整体并入本文。
实施例6体外测试
通过将根据本发明某些实施方式的合成肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动因子可操作地连接到报告基因萤光素酶，来测试它们的强度。将包含待测试的肌肉特异性启动子或骨骼肌特异性启动子和荧光素酶基因的表达盒插入合适的质粒中，然后将其转染到细胞中，以测试启动子在这些细胞中的表达。
材料和方法
将DNA制剂转染到H9C2(大鼠BDIX心脏成肌细胞细胞系，可从ATCC获得)中以评估转录活性。使用H9C2细胞系，因为先前的实验已经表明它是体内骨骼肌和心肌活动的良好预测物。
H9C2细胞培养和转染
H9C2是大鼠BDIX心脏成肌细胞细胞系。它们具有心肌特性，例如汇合处形成的肌管对乙酰胆碱有反应。
细胞维持
在T-75瓶中，在具有1％ FBS(热灭活-Gibco 10270-106，批号42G2076K)、1％Glutamax(35050-038，Gibco)、1％青霉素-链霉素溶液(15140-122，Gibco)的DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma)中培养H9C2细胞。细胞在亚汇合阶段(70-80％)传代，以避免细胞汇合并融合形成肌管的风险。
为了在细胞维持期间传代，移除培养基，用5mL不含CaCl2、不含MgCl2的DPBS(14190-094，Gibco)洗涤细胞两次。通过与1mL胰蛋白酶EDTA(25200-056，Gibco)孵育约5分钟，将细胞从瓶分离。然后，将4mL培养基添加到瓶中，轻轻地上下移液混合物，以帮助将细胞从瓶表面分离。将细胞在100g、3分钟下进行沉淀。处理掉上清液，并将细胞重悬于3mL培养基中。在Countess自动细胞计数器上对细胞进行计数，以1:3至1:10接种，即接种1-3×10,000个细胞/cm2，并在37℃、5％CO2下孵育。
细胞转染和分化
如上所述，通过用DPBS洗涤，用1mL胰蛋白酶EDTA从瓶中分离，用4mL培养基冲洗瓶表面，并在100g、3分钟下进行沉淀，从两个约70-80％汇合度的T-75瓶中收集H9C2细胞。将细胞重悬于45mL培养基中，并在48孔平底板(300μL/孔)(353230，Corning)中以40,000个细胞/孔的密度进行接种。48孔板中的细胞在37℃、5％ CO2下孵育。
24小时后，将细胞上的培养基替换为300μL不含抗生素的培养基(即DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma)，其中具有1％ FBS(热灭活-Gibco 10270-106，批号42G2076K)，1％Glutamax(35050-038，Gibco))。用viafect(E4981，Promega)转染每个孔300ng的DNA，总复合物体积为每个孔30μL。转染后将平板轻轻混合，并在37℃、5％ CO2下孵育。
24小时后，从转染细胞中移取培养基，并用300μL分化培养基代替，该培养基由DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma)、1％ Glutamax(35050-038，Gibco)、1％ FBS(热灭活-Gibco10270-106，批号42G2076K)、1％青霉素/链霉素溶液(15140-122，Gibco)和0.1％视黄酸(Sigma-R2625)组成。将板在37℃、5％ CO2下孵育7天以诱导分化。分化后，观察细胞形态以确认分化为肌管。
然后用500μL DPBS洗涤细胞，并用100μL萤光素酶细胞培养物裂解5×试剂(E1531，Promega)进行裂解，该试剂使用Milli-Q水稀释至1×。将细胞裂解试剂上下移液十次，然后将板在中等功率下涡旋30分钟以促进细胞裂解。在完成荧光素酶测定之前，将板密封并储存在-80℃下。在H9C2细胞中转染后从荧光素酶测定中收集的数据基于至少一个生物重复的三个技术重复。
荧光素酶活性的测量
-使用LARII(双萤光素酶报告1000测定系统，Promega，E1980)测量萤光素酶活性
-转染后24h，从细胞中移取培养基
-细胞在300μL DPBS中洗涤一次
-使用100μL被动裂解缓冲液裂解细胞，并在振荡下孵育15分钟。
-通过在台式离心机中以最大速度离心板1min，将细胞碎片进行沉淀
-将10μL样品转移到白色96孔板中，并通过在BMG LabtechFLUOstar Omega读板器上注射50μL LARII基质来测量发光。
这些细胞培养物产生的结果在图20中示出。该图显示，合成启动子SP0500、SP0510、SP0514和SP0519在肌肉细胞系H9C2中显示出良好的活性。本文所述的其它类似的启动子预期具有相同或更好的性能。
实施例6的参考文献
Llanga，·T.et·al.·(2017)·‘Structure-Based·Designed·Nano-Dysferlin·Significantly·Improves·Dysferlinopathy·in·BLA/J·Mice’·Molecular·Therapy.·Elsevier·Ltd.，·25(9)，pp.·2150-2162.·doi：10.1016/j.ymthe.2017.05.013.
实施例7-短骨骼肌特异性启动子的体外测试
材料和方法
将DNA制剂转染到H9C2(大鼠BDIX心脏成肌细胞细胞系，可从ATCC获得)中以评估转录活性。使用H9C2细胞系，因为先前的实验已经表明它是体内骨骼肌和心肌活动的良好预测物。
H9C2细胞培养和转染
H9C2是大鼠BDIX心脏成肌细胞细胞系。它们具有心肌特性，例如汇合处形成的肌管对乙酰胆碱有反应。
细胞维持
在T-75瓶中，在具有1％FBS(热灭活-Gibco 10270-106，批号42G2076K)、1％Glutamax(35050-038，Gibco)、1％青霉素-链霉素溶液(15140-122，Gibco)的DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma)中培养H9C2细胞。细胞在亚汇合阶段(70-80％)传代，以避免细胞汇合并融合形成肌管的风险。
为了在细胞维持期间传代，移除培养基，用5mL不含CaCl2、不含MgCl2的DPBS(14190-094，Gibco)洗涤细胞两次。通过与1mL胰蛋白酶EDTA(25200-056，Gibco)孵育约5分钟，将细胞从瓶分离。然后，将4mL培养基添加到瓶中，轻轻地上下移液混合物，以帮助将细胞从瓶表面分离。将细胞在100g、3分钟下进行沉淀。处理掉上清液，并将细胞重悬于3mL培养基中。在Countess自动细胞计数器上对细胞进行计数，以1:3至1:10接种，即接种1-3×10,000个细胞/cm2，并在37℃、5％CO2下孵育。
细胞转染和分化
如上所述，通过用DPBS洗涤，用1mL胰蛋白酶EDTA从瓶中分离，用4mL培养基冲洗瓶表面，并在100g、3分钟下进行沉淀，从两个约70-80％汇合度的T-75瓶中收集H9C2细胞。将细胞重悬于45mL培养基中，并在48孔平底板(300μL/孔)(353230，Corning)中以40,000个细胞/孔的密度进行接种。48孔板中的细胞在37℃、5％ CO2下孵育。
24小时后，将细胞上的培养基替换为300μL不含抗生素的培养基(即DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma)，其中具有1％ FBS(热灭活-Gibco 10270-106，批号42G2076K)，1％Glutamax(35050-038，Gibco))。用viafect(E4981，Promega)转染每个孔300ng的DNA，总复合物体积为每个孔30μL。转染后将平板轻轻混合，并在37℃、5％ CO2下孵育。
24小时后，从转染细胞中移取培养基，并用300μL分化培养基代替，该培养基由DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma)、1％ Glutamax(35050-038，Gibco)、1％ FBS(热灭活-Gibco10270-106，批号42G2076K)、1％青霉素/链霉素溶液(15140-122，Gibco)和0.1％视黄酸(Sigma-R2625)组成。将板在37℃、5％ CO2下孵育7天以诱导分化。分化后，观察细胞形态以确认分化为肌管。
然后用500μL DPBS洗涤细胞，并用100μL萤光素酶细胞培养物裂解5×试剂(E1531，Promega)进行裂解，该试剂使用Milli-Q水稀释至1×。将细胞裂解试剂上下移液十次，然后将板在中等功率下涡旋30分钟以促进细胞裂解。在完成荧光素酶测定之前，将板密封并储存在-80℃下。在H9C2细胞中转染后从荧光素酶测定中收集的数据基于三个生物重复，其各自为三个技术重复的平均值。
荧光素酶活性的测量
-使用LARII(双萤光素酶报告1000测定系统，Promega，E1980)测量萤光素酶活性
-转染后24h，从细胞中移取培养基
-细胞在300μL DPBS中洗涤一次
-使用100μL被动裂解缓冲液裂解细胞，并在振荡下孵育15分钟。
-通过在台式离心机中以最大速度离心板1min，将细胞碎片进行沉淀
-将10μL样品转移到白色96孔板中，并通过在BMG Labtech FLUOstar Omega读板器上注射50μL LARII基质来测量发光。
结果
由这些细胞培养物产生的结果显示在图21中。图21显示合成启动子SP0497、SP0500、SP0501、SP0506、SP0508、SP0510、SP0514、SP0519、SP0520、SP0521和SP4169在肌肉细胞系H9C2中具有良好的活性。启动子SP0498、SP0499、SP0502、SP0503、SP0504、SP0505、SP0507、SP0509、SP0511、SP0512、SP0513、SP0515、SP0516、SP0517、SP0518、SP0522、SP0523和SP0524也在H9C2细胞系中进行了实验测试，但显示出较低的活性(数据未显示)。实验以三重复进行。
实施例8使用HA-VSMC测定FKRP活性的制备
人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMC或HASMC细胞)购自美国模式培养物保藏中心(ATCC)
试剂制备
将25mL FBS和血管平滑肌细胞补充试剂盒解冻。将解冻的FBS和平滑肌细胞补充试剂盒(组分见表2)添加到无菌0.22μm PES过滤系统的分级过滤器中。用F-12K培养基将分级过滤器填充至500mL，然后对过滤器进行消毒。表14血管平滑肌细胞生长试剂盒组分
组分 体积 终浓度
rh FGF-碱性 0.5mL 5ng/mL
rh胰岛素 0.5mL 5μg/mL
抗坏血酸 0.5mL 50μg/mL
L-谷氨酰胺 0.5mL 5ng/mL
rh EGF 0.5mL 5ng/mL
胎牛血清 25mL 5％
分离和计数HASMC细胞的程序
细胞制备包括以下步骤：
1.将生长培养基升至室温(约30分钟)，从HA-VSMC瓶中吸出生长培养基，用PBS将瓶洗涤两次，然后加入胰蛋白酶(1.5mL胰蛋白酶用于75cm2的瓶)，以将细胞从生长表面分离。
2.一旦细胞大约在室温下分离≤5分钟，加入9.5mL生长培养基以中和胰蛋白酶并冲洗瓶的表面，然后将细胞悬浮液以1200rpm离心5分钟以沉淀细胞，然后将细胞沉淀重悬于1mL生长培养基中，并使用Countess II Automated Cell Counters用台盼蓝测试检查细胞活力。
3.在96孔板的每孔铺板10,000个细胞，最终体积为150μL/孔。
4.将测定板在37℃/5％ CO2培养箱中孵育22±2小时
程序载体制备和转导
确定了所需的AAV9-syn-coFKRP储液的量。移取在≤-80℃下储存的参考标准储液，并在室温下解冻。将解冻的储液平衡到室温。
制备低血清培养基(5％)，将血管平滑肌细胞补充试剂盒添加到无菌0.22μm PES过滤系统的分级过滤器中。用F-12K培养基将分级过滤器填充至500mL。
使用调整后的滴度4.67E+12制备载体溶液，如表15(结果在图22、图23和图24中示出)以及表16(结果在图25和26中示出)。
表中的注释：所有这些都需要将稀释缓冲液添加到与最高剂量队列相同的体积。
表15 96孔板中每个孔的rAAV(scAAV9-syn100-coFKRP)稀释液。
表16 96孔板中每孔rAAV(scAAV9-syn100-coFKRP)稀释度。
值得注意的是，研究级载体滴度被过高估计(约10倍)，原始滴度4.67E+13未检测到剂量反应。
用于测定FKRP活性的HASMC细胞裂解物
收获的细胞裂解物的制备
转导后48小时和72小时后，移除150μL/孔的低血清培养基，并用150μL/孔PBS代替。再重复三次除去培养基和加入PBS。在最后的洗涤之后，去除所有的液体，注意不要干扰细胞层。向每个孔中加入具有蛋白酶抑制剂的50μL RIPA缓冲液，并在室温下孵育5分钟。将板密封并在≤-80℃下冷冻。当准备好测试样品时，将样品解冻。小心地将细胞裂解物移到ddPCR板中，并在2-8℃下以4.7k RPM离心20分钟。将裂解物保持在冰上。
细胞裂解物的FKRP测定
通过完成以下来制备EZ标准包装(蛋白质简单型)中包含的试剂：
1.将40μL去离子(DI)水添加到二硫苏糖醇(DTT)中以制备400mM浓度的溶液。
2.将20μL 10×样品缓冲液和20μL 400mM DTT溶液添加到荧光5×Master Mix中以制备1×溶液。
3.将20μL DI水加入到Biotinylated Ladder中。将试剂涡旋混合并在冰上保持直到使用。
4.裂解液由1.5μL荧光Master Mix和6μL裂解液混合而成。然后将它们在一组干净的管子中汇合，并将样品涡旋以混合。
5.通过将样品置于95℃的加热块装置中5分钟，使其变性。
6.再次对样品进行涡旋。然后，短暂离心，在管底部收集样品，并将其保存在冰上，直到准备使用。
7.通过用抗体稀释剂2稀释制备抗FKRP(PA5-65349，Invitrogen；1:250)和抗GAPDH(NB100-56875，Novus Bio；1:5000)一抗。
8.通过混合100μL鲁米诺-S和100μL过氧化物制备底物。
9.根据提供的板布局图，将5μL Biotin Ladder、5μL制备的样品、20μL抗体稀释剂2、各15μL的一抗和二抗、15μL的鲁米诺-过氧化物底物移液到384孔板中。
10.首先移液15μL Stacking Matrix，然后是30μLDI水，最后是15μL的分离Matrix。
11.将板在室温下以2500rpm(～1000×g)离心5分钟。
12.打开所需的分析模板ProteinCompass Western软件。
13.然后按照剩余的指令开始运行，以使机器准备好进行分析运行。
14.运行完成时进行保存。
运行分析—运行完成后，通过ProteinCompass for Simple Western程序对数据进行分析。荧光尺寸标准品。
结果
细胞活力测定
制备相同条件和MOI下的额外的一组转导细胞用于细胞活力测定。用胰蛋白酶轻轻地将细胞从培养板中取出。将正在测试活力的细胞悬浮液等分试样在1000×g下离心5min。将沉淀重悬在200μL的PBS中。将10μL细胞悬浮液与10μL台盼蓝混合，并在室温下孵育2min。然后将10μL悬浮液置于一次性载玻片中，并在孵育结束后3分钟内使用Countess II自动细胞计数器(ThermoFisher Scientific)对细胞进行计数。
图22表明，无论MOI如何，在48小时和72小时孵育时，细胞存活率/细胞活力均不受转导的影响。
细胞裂解物中FKRP的活性
如图23A、图23B、图24A、图24B、图26A和图26B所示，细胞裂解物中的FKRP活性随48小时和72小时以及MOI的增加而增加。
对于细胞裂解物，当归一化至蛋白时，FKRP活性随着MOI的增加而增加(图23A、图23B、图24A、图24B和图26A)，当MOI增加时，每个载体基因组的FKRP活性降低(图23B、图23A、图24A和图26B)。
根据图24A和图24B，转导后72小时的数据显示出比转导后48小时更好的剂量反应(图23A和图23B)，因此接下来进行更多的MOI水平，以进一步检查细胞在更高MOI下对(scAAV9-syn-coFKRP)的反应。根据表16，在1.3E+05至7.6E+06之间进行载体制备和稀释。
图25表明，无论MOI如何，在72小时孵育时，细胞存活率/细胞活力不受转导的影响。
讨论
开发了一种用于包含FKRP的治疗性rAAV(scAAV9syn-coFKRP)的体外效力测定。该测定在每次测定4.4E5至7.5E6载体基因组的范围内是可重复的和线性的，并且可用于评估多个独立的合成载体批次的相对效力。因此，该测定适用于释放测试和评估载体批次随时间的稳定性。
结果支持以下结论：(1)裂解物中FKRP的最大产生发生在72小时；(2)归一化的FKRP显示出在4.4E5至7.5E6 MOI范围内的活性；和(3)细胞存活不受载体转导的影响。
这些结果表明，该测定用于确定药物产物scAAV9-syn-coFKRP的活性，用于临床给药以取代目前的体内测定的验证和使用。如果载体发生变化，或者启动子发生变化，或者转基因发生变化(例如，转基因的密码子优化)，或者包含表达盒的rAAV的任何组分发生变化，则本发明人开发的体外效力测定也可用作桥接测定，并且将有助于验证与亲本产品或参考产品相比，改变的治疗产品的效力。如果rAAV是由质粒模板或封闭端线性双链DNA(celDNA)模板制造的，则这也可适当地作为桥接测定进行，从而可验证从每种形式获得的治疗产品的效力。
实施例9-使用LGMD2I患者来源的细胞系测定FKRP活性的制备
LGMD2I患者来源的细胞系为α-抗肌萎缩蛋白聚糖缺乏并且表达降低水平的FKRP。
试剂制备
将25mL FBS和肌肉细胞补充试剂盒解冻。将解冻的FBS和平滑肌细胞补充试剂盒(组分见表2)添加到无菌0.22μm PES过滤系统的分级过滤器中。用F-12K培养基将分级过滤器填充至500mL。无菌过滤并在瓶子上贴上试剂名称、试剂批号、有效期、首字母缩写、日期和储存条件。生长培养基将在1个月后到期。
表17肌肉细胞生长试剂盒组分。
组分 体积 终浓度
rh FGF-碱性 0.5mL 5ng/mL
rh胰岛素 0.5mL 5μg/mL
抗坏血酸 0.5mL 50μg/mL
L-谷氨酰胺 0.5mL 5ng/mL
rh EGF 0.5mL 5ng/mL
胎牛血清 25mL 5％
分离和计数LGMD2I患者来源细胞的程序
细胞制备包括以下步骤：
1.使生长培养基至室温(约30分钟)。
2.确定将收获哪一瓶LGMD2I患者来源的细胞。
3.从LGMD2I患者来源的细胞的瓶中抽吸生长培养基。
4.用10mL PBS冲洗每个75cm2的瓶中的细胞两次。
5.向每个75cm2的瓶中加入1.5mL胰蛋白酶。摇动瓶使胰蛋白酶均匀分布。
6.将细胞在室温下培养≤5分钟。轻敲瓶的侧面以释放细胞。
7.加入9.5mL生长培养基以中和胰蛋白酶，在加入过程中冲洗瓶的生长表面。
8.将细胞悬浮液转移到无菌的15mL离心管中。如果收获多瓶细胞，将细胞悬浮液汇集在50mL离心管中。
9.在室温下以1200rpm离心细胞悬浮液5分钟以使细胞沉淀。
10.吸取上清液，并使用p1000移液管将细胞沉淀重悬于1mL生长培养基中。上下移液5-20次，以打碎细胞团块。
11.将10μL细胞悬浮液移液到1.5mL Eppendorf中，加入10μL台盼蓝，在室温下孵育2min。
12.然后移液10μL悬浮液，放入一次性载玻片中，并在孵育结束后3分钟内使用Countess II自动细胞计数器计数细胞活力数
13.以10000个细胞每孔铺板到96孔板中，最终体积为150μL/孔。
14.将测定板在37℃/5％ CO2培养箱中孵育22±2小时。
程序载体制备和转导
确定了所需的AAV9-syn-coFKRP储备量。移除在≤-80℃下储存的参考标准储液，并在室温下解冻。将解冻的储液平衡到室温。
制备低血清培养基(5％)，解冻肌肉细胞补充试剂盒，并将平滑肌细胞补充试剂添加到无菌0.22μm PES过滤系统的分级过滤器中。用F-12K培养基填充分级过滤器至500mL。
使用调整后的滴度4.67E+12制备载体溶液，如表18和表19。
表中的注释：所有这些都需要将稀释缓冲液添加到与最高剂量队列相同的体积。
表18 96孔板中每个孔的rAAV稀释液。
表19 96孔板中每孔rAAV稀释度。
值得注意的是，研究级载体滴度被过高估计(约10倍)，原始滴度4.67E+13未检测到剂量反应。
用于测定FKRP活性的LGMD2I患者来源的细胞裂解物
收获的细胞裂解物的制备
转导后48小时和72小时后，移除150μL/孔的低血清培养基，并用150μL/孔PBS代替。再重复三次除去培养基和加入PBS。在最后的洗涤之后，去除所有的液体，注意不要干扰细胞层。向每个孔中加入具有蛋白酶抑制剂的50μL RIPA缓冲液。并在室温下孵育5分钟。将板密封并在≤-80℃下冷冻。当准备好测试样品时，将样品解冻。小心地将裂解物移到ddPCR板中，并在2-8℃下以4.7k RPM离心20分钟。将裂解物保持在冰上。
细胞裂解物的FKRP测定
通过完成以下来制备EZ标准包装(蛋白质简单型)中包含的试剂：
15.将40μL去离子(DI)水添加到二硫苏糖醇(DTT)中以制备400mM浓度的溶液。
16.将20μL 10×样品缓冲液和20μL 400mM DTT溶液添加到荧光5×Master Mix中以制备1×溶液。
17.添加20μLDI水至Biotinylated Ladder中。将试剂涡旋混合并保持在冰上，直到使用。
18.裂解液由1.5μL荧光Master Mix和6μL裂解液混合而成。然后将它们在一组干净的管子中汇合，并将样品涡旋以混合。
19.通过将样品置于95℃的加热块装置中5分钟，使其变性。
20.再次对样品进行涡旋。然后，短暂离心，在管底部收集样品，并将其保存在冰上，直到准备使用。
21.通过用抗体稀释剂2稀释制备抗FKRP(PA5-65349，Invitrogen；1:250)和抗GAPDH(NB100-56875，Novus Bio；1:5000)一抗。
22.通过混合100μL鲁米诺-S和100μL过氧化物制备底物。
23.根据提供的板布局图，将5μL Biotin Ladder、5μL制备的样品、20μL抗体稀释剂2、各15μL的一抗和二抗、15μL的鲁米诺-过氧化物底物移液到384孔板中。
24.首先移液15μL Stacking Matrix，然后是30μLDI水，最后是15μL的分离Matrix。
25.将板在室温下以2500rpm(～1000×g)离心5分钟。
26.打开所需的分析模板ProteinCompass Western软件。
27.按下开始，然后按照剩余的说明为机器的分析运行做好准备。
28.运行完成时进行保存。
运行分析—运行完成后，可通过ProteinCompass for Simple Western程序对数据进行分析。荧光尺寸标准品。
结果
细胞活力测定
制备相同条件和MOI下的额外的一组转导细胞用于细胞活力测定。用胰蛋白酶轻轻地将细胞从培养板中取出。将正在测试活力的细胞悬浮液等分试样在1000×g下离心5min。将沉淀重悬在200μL的PBS中。将10μL细胞悬浮液与10μL台盼蓝混合，并在室温下孵育2min。然后将10μL悬浮液置于一次性载玻片中，并在孵育结束后3分钟内使用Countess II自动细胞计数器(ThermoFisher Scientific)对细胞进行计数。
无论MOI如何，在48小时和72小时孵育时，细胞存活率/细胞活力均不受转导的影响。
细胞裂解物中FKRP的活性
细胞裂解物中的FKRP活性随着48小时和72小时以及MOI的增加而增加。对于细胞裂解物，当归一化至蛋白时，FKRP活性随着MOI的增加而增加，当MOI增加时，每个载体基因组的FKRP活性降低。
转导后72小时的数据显示，与转导后48小时相比，剂量反应更好，因此接下来进行MOI水平，以进一步检查在更高MOI中对AAV9-syn-coFKRP的细胞反应。根据表19，在1.3E+05至7.6E+06之间进行载体制备和稀释。
无论MOI如何，在72小时孵育时，细胞存活率/细胞活力不受转导的影响。
讨论
开发了LGMD2I患者来源的细胞中的治疗性AAV9syn-coFKRP的体外效力测定。该测定在每次测定4.4E5至7.5E6载体基因组的范围内是可重复的和线性的，并且可用于评估多个独立的合成载体批次的相对效力。因此，该测定适用于释放测试和评估载体批次随时间的稳定性。
结果支持以下结论：(1)裂解物中FKRP的最大产生发生在72小时；(2)归一化的FKRP显示出在4.4E5至7.5E6 MOI范围内的活性；和(3)细胞存活不受载体转导的影响。
这些结果表明，该测定用于确定药物产物scAAV9-syn-coFKRP的活性，用于临床给药以取代目前的体内测定的验证和使用。
预计本文中所述的体外效力测定将对待分化为心脏或骨骼肌细胞系的iPSC干细胞系、或FKRP敲低细胞系或FKRP敲除细胞系有效。该测定将用于实施例8和实施例9中所述的任何一种或多种细胞系，并将用作测定治疗产品scAAV9-syn100-coFKRP的活性的平台，以及用于临床给药以替代当前的体内测定。如果载体发生变化，或者启动子发生变化，或者转基因发生变化(例如，转基因的密码子优化)，或者包含表达盒的rAAV的任何组分发生变化，则该测定可用作桥接测定，并且将验证与亲本产品或参考产品相比，改变的治疗产品的效力。
实施例9-LGMD2i构建体的封闭端线性DNA序列
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SEQ ID NO：406为LGMD2i构建体的封闭端线性DNA序列，包括主链序列。SEQ IDNO：406中所述的核酸序列用于制造缺乏细菌序列的rAAV。
SEQ ID NO：406(SEQ ID NO：407)的碱基对1922-3412是CpG缺失的FKRP编码序列的序列。如SEQ ID NO：407或SEQ ID NO：2所述的FKRP编码序列的FKRP表达可由不同的肌肉启动子驱动，包括合成和合成的短启动子，例如启动子和/或顺式调控元件，选自表1-表4、或表8-表12，或其任何组合。SEQ ID NO：407或SEQ ID NO：2中所述的FKRP编码序列的FKRP表达可由不同的肌肉启动子(例如Syn100)驱动。
/>
SEQ ID NO：406(SEQ ID NO：408)的碱基对1295-3633为rAAV的序列，所述rAAV包含左ITR(LITRm自互补)至右ITR序列。在一些实施例中，包含SEQ ID NO：408的rAAV包含如SEQ ID NO：3所述的Syn100启动子，其中SEQ ID NO：408的Syn100启动子被任何合成肌肉启动子和/或选自从表1-表4、或表8-表12的顺式调控元件，或其任意片段，或其任意组合所取代。
/>

Claims (91)

1.一种重组腺病毒相关(AAV)载体，所述载体在其基因组中以5'至3'方向包含：
a)5'AAV反向末端重复(ITR)；
b)肌肉特异性启动子；
c)内含子序列；
d)编码人fukutin-相关蛋白(FKRP)的核酸，所述核酸具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：407中所示的核苷酸序列，并与所述肌肉特异性启动子可操作地连接；
e)与所述编码FKRP的核酸可操作地连接的polyA信号序列；
f)3'AAV ITR。
2.如权利要求1所述的重组AAV载体，其中，所述5'ITR为ITR2m。
3.如权利要求1-2中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述3'ITR为ITR2。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述肌肉特异性启动子为Syn100(SEQ ID NO：3)。
5.如权利要求1-4中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述内含子序列为VH4-Ig内含子3(SEQ ID NO：4)或其衍生物。
6.如权利要求1-5中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述polyA信号序列为SEQ IDNO：5。
7.如权利要求1-6中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述肌肉特异性启动子、内含子序列、编码FKRP的核酸以及polyA信号序列包含在SEQ ID NO：1内。
8.如权利要求1-7中任一项所述的重组AAV载体，其中，血清型为AAV9。
9.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-8中任一项所述的重组AAV载体。
10.一种治疗患有抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者系统性给予治疗有效量的如权利要求1-8中任一项所述的重组AAV载体和/或如权利要求9所述的药物组合物，从而增加所述受试者的肌肉组织中功能性FKRP的表达。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱为肢带型肌营养不良2I。
12.如权利要求10-11所述的方法，其中，给予所述受试者单剂量。
13.如权利要求10-12所述的方法，其中，通过静脉输注进行g给予。
14.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中，所述给予剂量为约1E13 vg/kg至约6E13 vg/kg(例如约3E13 vg/kg)。
15.如权利要求10-14所述的方法，其中，以下中的一种或多种在给予后在所述受试者中发生：
a)所述受试者的骨骼肌和/或心肌中α-DG的功能性糖基化显著增加；
b)所述受试者的血清肌酸激酶水平显著降低；
c)所述受试者的骨骼肌中的胶原沉积显著降低；
d)所述受试者的肌肉组织(例如比目鱼肌、膈膜和/或EDL)的体外肌力分析显著增加；
e)所述受试者的潮气量显著增加；和/或
f)所述受试者能够在平板运动试验中显著跑得更远。
16.如权利要求10-15所述的方法，其中，所述受试者为成年受试者。
17.一种编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的合成核酸，其中：
a)相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述核酸的CpG位点含量降低；
b)相对于SEQ ID NO：6的GC含量，GC含量降低了大于10％；和/或
c)所述核酸与SEQ ID NO：2具有至少80％的同一性。
18.如权利要求17所述的核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少50％。
19.如权利要求17-18所述的核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少75％、80％、85％、90％、95％。
20.如权利要求17-19所述的核酸，其中，所述编码序列的CpG位点含量为0％。
21.如权利要求17所述的合成核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的GC含量，GC含量降低大于15％。
22.如权利要求17所述的合成核酸，其中，所述核酸与SEQ ID NO：2具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
23.如权利要求17所述的合成核酸，其中，所述核酸具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：407中所示的序列。
24.如权利要求17-23所述的合成核酸，所述合成核酸与启动子可操作地连接。
25.如权利要求24所述的合成核酸，其中，所述启动子为肌肉特异性启动子。
26.如权利要求24-25中任一项所述的合成核酸，其中，所述启动子为合成启动子。
27.如权利要求24-26中任一项所述的合成核酸，其中，所述启动子为Syn100。
28.如权利要求23-26中任一项所述的合成核酸，其中，所述启动子选自表1-表4或表8-表12所列的启动子。
29.如权利要求24-25中任一项所述的合成核酸，其中，所述启动子为肌酸激酶(CK)启动子、鸡β-肌动蛋白启动子(CB)。
30.如权利要求17-29中任一项所述的合成核酸，所述合成核酸进一步包含增强子序列。
31.如权利要求30所述的合成核酸，其中，所述增强子序列包含CMV增强子、肌肉肌酸激酶增强子和/或肌球蛋白轻链增强子。
32.一种核酸，所述核酸包含：
a)5'和3'AAV反向末端重复(ITR)；
b)编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的编码序列，所述编码序列可操作地连接至位于5'ITR和3'ITR之间的肌肉特异性启动子，其中：
i)相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低；
ii)相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述编码序列的GC含量降低大于10％；和/或
iii)所述编码序列与SEQ ID NO：2具有至少80％的同一性。
33.如权利要求32所述的核酸，所述核酸进一步包含位于所述肌肉特异性启动子与所述编码序列之间的内含子序列。
34.如权利要求33所述的核酸，其中，所述内含子序列为VH4-Ig内含子3(SEQ ID NO：4)或其衍生物。
35.如权利要求32-34所述的核酸，所述核酸进一步包含位于所述编码序列下游的至少一个polyA信号序列。
36.如权利要求35所述的核酸，其中，所述polyA信号序列为SEQ ID NO：5。
37.如权利要求32-36所述的核酸，其中，所述5'ITR为ITR2m。
38.如权利要求32-37所述的核酸，其中，所述3'ITR为ITR2。
39.如权利要求32-38所述的核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述编码序列的GC含量降低大于15％。
40.如权利要求32-40所述的核酸，其中，所述编码序列与SEQ ID NO：2具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
41.如权利要求32-40所述的核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少50％。
42.如权利要求32-41所述的核酸，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码序列的CpG位点含量降低至少75％、80％、85％、90％、95％。
43.如权利要求32-42所述的核酸，其中，所述编码序列的CpG位点含量为0％。
44.如权利要求32-43所述的核酸序列，其中，所述编码序列为SEQ ID NO：2。
45.一种载体，所述载体包含如权利要求17-44中任一项所述的合成核酸。
46.如权利要求45所述的载体，其中，所述载体为病毒载体。
47.如权利要求46所述的载体，其中，所述载体为重组腺相关病毒(AAV)载体。
48.如权利要求47所述的载体，其中，所述AAV载体来自表6中列出的任何血清型。
49.如权利要求47或权利要求48所述的载体，其中，所述AAV载体为AAV9载体。
50.一种重组腺病毒相关(AAV)载体，所述载体在其基因组中包含：
a)5'AAV反向末端重复(ITR)和3'AAV ITR；
b)位于5'ITR和3'ITR之间的编码人fukutin相关蛋白(FKRP)的核酸，
i)相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述核酸的CpG位点含量降低；
ii)相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述核酸的GC含量降低大于10％；和/或
iii)所述核酸与SEQ ID NO：2具有至少80％的同一性，
并且所述核酸可操作地连接至肌肉特异性启动子。
51.如权利要求50所述的重组AAV载体，其中，所述AAV基因组以5'至3'的方向包含：
a)所述5'ITR，
b)所述肌肉特异性启动子，
c)所述内含子序列，
d)所述编码FKRP的核酸；以及
e)所述3'ITR。
52.如权利要求50-51中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述肌肉特异性启动子选自于由如下启动子所组成的组：MCK启动子、dMCK启动子、tMCK启动子、enh358MCK启动子、CK6启动子和Syn100启动子、表1-表4或表8-表12中列出的任意启动子，及它们的衍生物。
53.如权利要求50-52中任一项所述的重组AAV载体，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码FKRP的核酸的CpG位点含量降低。
54.如权利要求50-53中任一项所述的重组AAV载体，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码FKRP的核酸的CpG位点含量降低至少50％。
55.如权利要求50-53中任一项所述的重组AAV载体，其中，相对于SEQ ID NO：6的CpG位点含量，所述编码FKRP的核酸的CpG位点含量降低至少75％、80％、85％、90％、95％。
56.如权利要求50-55中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述编码FKRP的核酸的CpG位点含量为0％。
57.如权利要求50-56中任一项所述的重组AAV载体，其中，相对于SEQ ID NO：6的GC含量，所述编码FKRP的核酸的GC含量降低大于10％。
58.如权利要求50-57中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述编码FKRP的核酸与SEQID NO：2具有至少80％的同一性。
59.如权利要求50-58所述的重组AAV载体，其中，所述编码FKRP的核酸具有SEQ ID NO：2所示的序列。
60.如权利要求50-59中任一项所述的重组AAV载体，所述重组AAV载体进一步包含位于所述编码FKRP多肽的核酸的3'和所述3'ITR序列的5'的至少一个polyA信号序列。
61.如权利要求60所述的重组AAV载体，其中，所述polyA信号序列为SEQ ID NO：5。
62.如权利要求50-61中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述ITR包括插入、缺失或置换。
63.如权利要求50-62所述的重组AAV载体，其中，所述ITR中的一个或多个CpG位点被移除。
64.如权利要求50-63中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述5'ITR为ITR2m。
65.如权利要求50-64中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述3'ITR为ITR2。
66.如权利要求50-65中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述内含子序列为VH4-Ig内含子3(SEQ ID NO：4)或其衍生物。
67.如权利要求50-66中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述重组AAV载体为嵌合AAV载体、单倍体AAV载体、杂合AAV载体或多倍体AAV载体。
68.如权利要求50-66中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述重组AAV载体为表6中列出的任何AAV血清型。
69.如权利要求68所述的重组AAV载体，其中，所述血清型为AAV9。
70.如权利要求50-69中任一项所述的重组AAV载体，其中，所述重组AAV载体包含选自表7的衣壳蛋白或由表6中所列的AAV血清型所组成的组中的任何AAV血清型，及它们的组合。
71.一种药物组合物，所述药物组合物包含在药学上可接受的运载体中的如权利要求50-70中任一项所述的重组AAV载体。
72.一种经转化的细胞，所述经转化的细胞包含如权利要求17-44中任一项所述的核酸和/或如权利要求45-70中任一项所述的载体。
73.一种转基因动物，所述转基因动物包含如权利要求17-44中任一项所述的核酸、如权利要求45-70中任一项所述的载体和/或如权利要求72所述的经转化的细胞。
74.一种在有需要的受试者中增加α-抗肌萎缩蛋白聚糖(α-DG)的糖基化的方法，所述方法包括：向所述受试者给予治疗有效量的如权利要求17-44中任一项所述的核酸、如权利要求45-70中任一项所述的载体、如权利要求71所述的药物组合物和/或如权利要求72所述的经转化的细胞，其中，所述合成核酸在所述受试者中表达，从而产生人FKRP并增加α-DG的糖基化。
75.如权利要求74所述的方法，其中，所述受试者患有抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱或处于发展为抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的风险中。
76.一种在受试者中治疗抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的如权利要求17-44中任一项所述的核酸、如权利要求45-70中任一项所述的载体、如权利要求71所述的药物组合物和/或如权利要求72所述的经转化的细胞，其中，所述合成核酸在所述受试者中表达，从而治疗所述受试者的抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱。
77.如权利要求75或76所述的方法，其中，所述抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱与FKRP异常相关。
78.如权利要求75-77所述的方法，其中，所述抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱包含编码FKRP的核酸的突变和/或α-抗肌萎缩蛋白聚糖(α-DG)的糖基化缺乏。
79.如权利要求75-78所述的方法，其中，所述抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱为肢带型肌营养不良2I、先天性肌营养不良(CMD1C)、Walker-Warburg综合征、肌眼脑疾病，或它们的任意组合。
80.一种治疗患有抗肌萎缩相关糖蛋白紊乱的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的前述权利要求中任一项所述的重组AAV载体、rAAV基因组、核酸序列和/或药物组合物中的任一种，从而增加所述受试者的肌肉组织中功能性FKRP的表达。
81.如权利要求74-80所述的方法，其中，给予所述受试者单剂量。
82.如权利要求74-81所述的方法，其中，给予为系统性的。
83.如权利要求82所述的方法，其中，通过静脉输注给予。
84.如权利要求74-83所述的方法，其中，在给予后，所述受试者的骨骼肌和/或心肌中α-DG的功能性糖基化显著增加。
85.如权利要求74-84所述的方法，其中，在给予后，所述受试者的血清肌酸激酶水平显著降低。
86.如权利要求74-85所述的方法，其中，在给予后，所述受试者的骨骼肌中的胶原沉积显著降低。
87.如权利要求74-86所述的方法，其中，所述受试者为成年受试者。
88.如权利要求74-86所述的方法，其中，所述受试者为青少年受试者。
89.如权利要求74-86所述的方法，其中，所述受试者为婴儿受试者。
90.如权利要求74-89所述的方法，其中，在给予前，所述受试者表现出显著的疾病病理。
91.如权利要求74-89所述的方法，其中，在给予前，所述受试者没有表现出显著的疾病病理。
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