JP7202895B2 - ジスフェリン異常症の治療のためのトランケートされたジスフェリン - Google Patents

Description

優先権の陳述
本出願は、２０１６年６月１７日に出願された米国仮出願番号６２／３５１，７０１の利益を主張し、その内容全体は、参照により本明細書中に援用される。

本発明の分野
本発明は、トランケートされたジスフェリン核酸およびタンパク質、核酸を含むベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）、および、細胞または対象へのジスフェリンの送達およびジスフェリン異常症の治療のためにそれを用いる方法に関する。

ジスフェリン異常症は、臨床症状にかかわらず、ジスフェリン遺伝子における突然変異によって引き起こされる筋ジストロフィーである。ジスフェリン異常症の症候は、個体間で大いに異なる。ジスフェリン異常症と最も一般に関連する臨床症状は、肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ２Ｂ）、三好型ミオパチー、前脛骨発症を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＡＴ）、遠近虚弱化（ｐｒｏｘｉｍｏｄｉｓｔａｌ ｗｅａｋｎｅｓｓ）、偽代謝（ｐｓｅｕｄｏｍｅｔａｂｏｌｉｃ）ミオパチー、およびｈｙｐｅｒＣＫｅｍｉａを含む。最も一般に、患者は、１０代に遠位筋力の虚弱化を、次の１０年以内の遠位運動機能の喪失とともに報告する。患者は一般に、動くために車椅子を必要として、全身制御の程度が異なる。ジスフェリン異常症はしばしば誤診されるので、その発生率は決定されていない。現在までに、筋肉機能の喪失を遅延またはジストロフィー表現型を逆転／改善するための効果的な治療は存在しない。

ジスフェリンは、膜の完全性の維持に関与する、小胞および膜関連のタンパク質である。ジスフェリンは、膜損傷時に細胞内シグナリング修復ネットワークをトリガーする可能性のあるカルシウム感知ドメインを提示する。ジスフェリンを含む細胞内小胞は、膜損傷の部位へ輸送して、通常は小胞の融合が膜の完全性をもたらすと考えられる。ジスフェリン機能の機能はあまり特徴付けられていないが、それが不存在だと、筋肉膜は、軽度のストレス形態をより起こしやすい。

ジスフェリンタンパク質のコード配列は＞６．５ｋｂであり、それは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターキャプシドのパッケージング容量を超えていて、単一のＡＡＶが仲介する遺伝子付加ストラテジーによるジスフェリン異常症の治療を不可能にさせている。したがって、宿主酵素によってアセンブルされなければならないトランスジェニックＤＮＡ断片を保有する多数のキャプシドに依拠する、ＡＡＶが仲介するジスフェリン送達に関して、独創的な細胞内遺伝子の構築アプローチが研究されている。この「オーバーサイズのＡＡＶ遺伝子療法」のアプローチは、診療所において未だ検証されておらず、いくつかのレベルにおいて本質的により効率的でない。ジスフェリンの「オーバーサイズの」ＡＡＶ形質導入での以前の試みは、検出可能なレベルのジスフェリンがインビボで復元されることの困難性に直面した。

本発明は、単一のＡＡＶ内にパッケージされることができてインビボで効果的であることが示されている、トランケートされた複合型ジスフェリン遺伝子を提供することによって、当該分野における短所を克服する。

本発明は、トランケートされたジスフェリンポリペプチド、および、それをコードするポリヌクレオチドを提供する。トランケートされたポリペプチドは、野生型ジスフェリンの生物学的活性の少なくとも一部を保持し、ポリヌクレオチドは、野生型ポリヌクレオチドと比較して低減されたそれらの長さに起因して、ウイルスゲノムおよびウイルスベクターの中にパッケージされることが可能である。

本発明の一態様は、トランケートされた哺乳類ジスフェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、ポリペプチドのＣ２ＤおよびＣ２Ｆドメインのそれぞれの少なくとも実質的な部分は、欠失している。本発明は、さらに、本発明のポリヌクレオチドを含む発現カセット、ベクター（例えば、ウイルスベクター）、および、組み換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）、および、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、または、ベクターを含む、形質転換された細胞およびトランスジェニック動物に関する。本発明のウイルス粒子を薬学的に許容できる担体中に含む医薬製剤がさらに提供される。

本発明のさらなる態様は、トランケートされた哺乳類ジスフェリンポリペプチドに関し、ポリペプチドのＣ２ＤおよびＣ２Ｆドメインのそれぞれの少なくとも実質的な部分は、欠失している。

本発明のさらなる態様は、組み換えＡＡＶ粒子を生産する方法に関し、ＡＡＶ複製を許容する細胞に、（ａ）（ｉ）本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセット、および（ｉｉ）逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む、組み換えＡＡＶテンプレート；（ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含む、ポリヌクレオチドを；組み換えＡＡＶテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件下で、提供するステップを含み；それにより、細胞において組み換えＡＡＶ粒子が生産される。

本発明のさらなる態様は、細胞にジスフェリンを送達する方法に関し、細胞を、本発明の組み換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）と接触させるステップを含み、それにより、細胞にジスフェリンを送達する。

本発明の別の態様は、哺乳類対象にジスフェリンを投与する方法に関し、哺乳類対象に、本発明の組み換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）と接触された細胞を投与するステップを含み、それにより、哺乳類対象にジスフェリンを投与する。

本発明のさらなる態様は、それを必要とする哺乳類対象においてジスフェリン異常症を治療する方法に関し、哺乳類対象に、本発明の組み換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）と接触された細胞を投与するステップを含み、それにより、ジスフェリン異常症を治療する。

本発明の別の態様は、哺乳類対象にジスフェリンを投与する方法に関し、哺乳類対象に、本発明の組み換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）を投与するステップを含み、それにより、哺乳類対象にジスフェリンを投与する。

本発明のさらなる態様は、それを必要とする哺乳類対象においてジスフェリン異常症を治療する方法に関し、哺乳類対象に、本発明の組み換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）を投与するステップを含み、それにより、ジスフェリン異常症を治療する。

本発明の別の態様は、細胞にジスフェリンを送達するための、本発明の組み換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）の使用に関する。

本発明のさらなる態様は、哺乳類対象にジスフェリンを送達するための、本発明の組み換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）と接触された細胞の使用に関する。

本発明のさらなる態様は、哺乳類対象にジスフェリンを送達するための、本発明の組み換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）の使用に関する。

本発明のさらなる態様は、哺乳類対象においてジスフェリン異常症を治療するための、本発明の組み換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）の使用に関する。

本発明の別の態様は、細胞にジスフェリンを送達するための薬品の製造のための、本発明の組み換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）の使用に関する。

本発明のさらなる態様は、哺乳類対象にジスフェリンを送達するための薬品の製造のための、本発明の組み換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）と接触された細胞の使用に関する。

本発明のさらなる態様は、哺乳類対象にジスフェリンを送達するための薬品の製造のための、本発明の組み換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）の使用に関する。

本発明のさらなる態様は、哺乳類対象においてジスフェリン異常症を治療するための薬品の製造のための、本発明の組み換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）の使用に関する。

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明においてより詳細に示される。

ナノ－ジスフェリンの設計および哺乳類細胞における発現を示す。（図１Ａ）ナノ－ジスフェリンが得られた親ｃＤＮＡであるヒトジスフェリンアイソフォーム８は、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、Ｄｙｓｆ、Ｃ２Ｄ、Ｃ２Ｅ、Ｃ２Ｆ、Ｃ２Ｇ、および膜貫通ドメインを含み、６，２４０ｎｔのサイズである。ナノ－ジスフェリンは、Ｃ２Ｄ、Ｃ２Ｅ、およびＣ２Ｆドメインが欠失していて、４，３５６ｎｔにサイズダウンしたｃＤＮＡを保有する。（図１Ｂ）トランスフェクトされたｃ２ｃ１２マウス筋芽細胞のウエスタンブロット分析は、可溶性タンパク質溶解物が、ナノ－ジスフェリンまたは全長ジスフェリンを含まないことを明らかにした。対照的に、膜に関連するタンパク質溶解物は、ジスフェリンおよびナノ－ジスフェリンの両方を含む。（図１Ｃ）ＨｅＬａ細胞における免疫蛍光イメージングは、ジスフェリンおよびナノ－ジスフェリンの同様の細胞内分布を明らかにした。スケールバー、２０μｍ。（図１Ｄ）ナノ－ジスフェリンは、低（０．５ｍｇ）、中（１ｍｇ）、または高（１．５ｍｇ）プラスミド投与量でアラマーブルー吸光度によって測定されるように、ジスフェリン欠損患者細胞において有意な毒性を示さなかった。０．５％次亜塩素酸塩ナトリウムを、陽性の死滅陽性コントロールとして用いた。平均＋ＳＤが示される。 弱いプロモーターを用いた無傷のＡＡＶ形質導入は、強いプロモーターを用いたフラグメントＡＡＶよりも効率的であることを示す。（図２Ａ）プロモーターおよびポリアデニル化（ポリＡ）配列に基づき、サイズが異なる２つのナノ－ジスフェリンＡＡＶ－ＩＴＲカセットを設計した。ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンは４，８４９ｎｔのサイズであり、一方で、ＣＭＶ－ナノ－ジスフェリンは５，５９７ｎｔである。（図２Ｂ）２９３細胞における、（図２Ａ）に示される構築物のトランスフェクション後の、示された抗体によって染色された、ウエスタンブロット（ジスフェリンおよびＧＦＰコントロールを伴う）。（図２Ｃ）ＡＡＶウイルスパッケージングを、アルカリゲル電気泳動およびＳＹＢＲゴールド染色によって分析した。無傷のパッケージングがＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンカセットに関して観察されて、一方で、断片化されたパッケージングがＣＭＶ－ナノ－ジスフェリンカセットに関して見られた（数字は、それぞれのＣｓＣｌ勾配画分において見られるパッケージングされたゲノムを示した）。（図２Ｄ）細胞ごとに、示された量で示されたＡＡＶベクターによって処置された、２９３細胞のウエスタンブロット分析。 ＡＡＶ－ナノ－ジスフェリンが、筋肉内注入後に筋肉組織学を有意に改善することを示す。（図３Ａ）ＢＬＡ／Ｊジスフェリン欠損マウスのＴＡ筋に、ＡＡＶ１－ＣＭＶ－ＧＦＰまたはＡＡＶ１－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンのいずれかを対側性に注入した。エバンスブルー色素を、屠殺の４０時間前に腹腔内に投与した。エバンスブルー色素陽性の線維を、全線維に対して標準化した。マッチド・ペア統計分析は、対側コントロールと比較してＡＡＶ１－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンによって処置されたＴＡにおけるエバンスブルー色素陽性の線維の有意な減少を明らかにした。（図３Ｂ）筋肉ターンオーバーに関するマーカーである中心に核のある線維は、ＡＡＶ１－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンによって処置された１つの筋肉を除いて全てにおいて減少して、統計分析は、ナノ－ジスフェリンによって処置された筋肉の中心の核形成の有意な低減を示した（ｐ＝０．０１２５）。（図３Ｃ）代表的な画像は、ＡＡＶ１－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンが注入された筋肉において改善された筋肉組織学を示し、それは、ＢＬＡ／Ｊジスフェリン欠損筋肉よりも密接にＷＴ筋肉に似ている。スケールバー、４０μｍ。（図３Ｄ）Ｒｏｍｅｏジスフェリン抗体ＩＦ染色は、内因性ジスフェリンとナノ－ジスフェリンとの間の異なる分布パターンを明らかにした。線維のおよそ３０％が、ナノ－ジスフェリンに関して陽性に染色された（全線維ｎ＝４５５）。スケールバー、４０μｍ。平均＋ＳＤが示される。 ＡＡＶ－ナノ－ジスフェリンが、全身注入後に運動機能を改善させることを示す。（図４Ａ）クレアチンキナーゼ活性は、ＡＡＶ９－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンによって処置されたマウスと比較して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰによって処置されたマウスにおいて、より高いことがわかった。（図４Ｂ）立ち上がり行動（ｒｅａｒｉｎｇ）の能力は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰによって処置されたマウスと比較して、ＡＡＶ９ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンを注入されたＢＬＡ／Ｊマウスにおいて、１時間の評価にわたって有意に改善された。（図４Ｃ）経時的な立ち上がり行動の分析は、ＡＡＶ９－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンによって処置されたマウスが増大した持久力を有することを示し、ＡＡＶ９ＣＭＶ－ＧＦＰコントロールマウスと比較して１時間にわたる一貫した立ち上がり行動によって示された。平均＋ＳＤが示される。 全身注入後の筋肉組織学に対するＡＡＶ－ナノ－ジスフェリンの効果を示す。（図５Ａ）中心に核のある線維（その存在は、再生およびターンオーバーを示す）は、ＧＦＰによって処置された筋肉と比較して、ナノ－ジスフェリンによって処置された筋肉において、有意でないが減少する傾向があった（ｐ＝０．０８３５）。（図５Ｂ）筋肉損傷の尺度であるエバンスブルー色素の全筋肉吸光度アッセイは、ＡＡＶ９－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンを注入されたマウスの臀筋において有意に低減した（ｐ＝０．０３７）。（図５Ｃ）エバンスブルー色素陽性の線維の組織学の代表的な画像は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰによって処置されたコントロールと比較して、ＡＡＶ９－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンによって処置された筋肉の、筋肉損傷における顕著な低減を示す。統計分析は、ＡＡＶ９－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンによって処置されたマウスの臀筋において、エバンスブルー色素陽性の線維のほぼ有意な減少（ｐ＝０．０５６）を示した。スケールバー、１００μｍ。（図５Ｄ）線維サイズの尺度である最小Ｆｅｒｅｔ径を、臀筋のＷＧＡレクチンによって染色された筋肉断面から得て、独立ｔ検定によって処置間に有意差があった（ｐ＜０．０００１）。（図５Ｅ）疎水性および負電荷脂質（矢印）に関するＯｉｌ－Ｒｅｄ－Ｏ染色；この代表的な画像は、処置間の著しい違いを示した。スケールバー、３００μｍ。平均＋ＳＤが示される。 さらなるデータを示す。（図６Ａ）水平活性を、ＩＶによって処置されたマウスにおいて測定して、最初の３０分では処置間に違いはなく（ｐ＝０．５８）、一方で、有意ではないが（ｐ＝０．１３）、観察の最後の３０分にわたって、ナノ－ジスフェリンによって処置されたマウスにおいて、より高い水平活性の傾向があった。（図６Ｂ）Ｈ＆Ｅ染色を臀筋および腰筋において行なって全線維に対して標準化された全中心核に関して分析し、中心の核形成を測定するこの方法によって、処置間で違いは見られなかった。平均＋ＳＤが示される。 線維サイズの分布を示す。筋線維サイズのアーチファクトの弾力の尺度である最小Ｆｅｒｅｔ径を、ＩｍａｇｅＪプロトコルに読み込まれた、ＷＧＡレクチンによって標識された大殿筋断面に対して行なった。ナノ－ジスフェリンによって処置されたマウス線維サイズの分布（ｎ＝６１０）は、ＧＦＰによって処置されたマウス線維サイズ分布（ｎ＝６１９）より大きな線維サイズを示し、野生型の未処置の分布（ｎ＝４６７）と比較して、部分的な補正を示した。範囲内の総計を示す。スケールバー＝１００μｍ。 免疫蛍光によるナノ－ジスフェリン検出を示す。ジスフェリン抗体を用いた示されたマウス由来の臀筋の免疫蛍光染色、Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色、および小麦胚芽アグルチニン膜染色。膜および細胞質の全体を通したナノ－ジスフェリン局在が顕著であったが、一方で、内因性ジスフェリンは、膜に特有に局在化される。筋線維のおよそ１０％が、ナノ－ジスフェリンに関して陽性に染色された（全線維ｎ＝４４１）。スケールバー、１００μｍ。 ＲＴ－ＰＣＲによる検出を示す。（図９Ａ）ＲＴ－ＱＰＣＲに関する予想されるアンプリコンは、筋肉内処置された脛骨筋において、ナノ－ジスフェリンに関して観察されたが、一方で、よりかすかなシグナルが、ネガティブコントロールでは観察されないがそれらの対側コントロールでも観察されて、注入部位からのベクターの漏れを示唆した。アンプリコンサイズに起因して、ＰＣＲサンプルをＥｘｏ－Ｓａｐ Ｉｔで処理してプライマーダイマーを除去して、臀筋におけるナノ－ジスフェリンに関するＲＴ－ＱＰＣＲにもこれを行ない（図９Ｂ）、単一の全身注入のほぼ８ヶ月後に転写ｍＲＮＡの存在を確認するシグナルを示した。

ここで、本発明は、本発明の好ましい実施態様が示される添付の図面に関して説明される。しかしながら、本発明は異なる形で具体化され得て、本明細書中に示される実施態様に制限されると解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施態様は、本開示が徹底的かつ完全であるように提供されて、本発明の範囲を当業者に完全に届ける。

別段の定義がされない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者の一人により一般に理解されるのと同一の意味を有する。本発明において、本発明の説明に用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、本発明の限定を意図しない。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体で参照により援用される。

ヌクレオチド配列は、本明細書において、特に別段の指示がない限り、左から右へ５’から３’への方向で、一本鎖によってのみ提供される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される様式で、または、（アミノ酸については）一文字コードまたは三文字コードのいずれかによって、どちらも３７ ＣＦＲ §１．８２２および確立された使用に従って示される。例えば、ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ，９９－１０２（Ｎｏｖ．１９９０）（米国特許商標庁）を参照。

別段の指示がある場合を除き、当業者に公知の標準的な方法が、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）構築物、ＡＡＶ Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ配列を発現するパッケージングベクター、および、一時的および安定的にトランスフェクトされたパッケージング細胞の構築のために用いられ得る。そのような技術は、当業者に公知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；ＡＵＳＵＢＥＬ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。

さらに、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書に示される任意の特性または特性の組み合わせは、除外または省略され得ることも検討される。

さらに説明するために、仮に例えば、明細書が、特定のアミノ酸はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶから選択され得ると示す場合、この言葉は、アミノ酸は、これらのアミノ酸（単数または複数）の任意のサブセット、例えばＡ、Ｇ、ＩまたはＬ；Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ；ＡまたはＧ；Ｌのみ；などから、あたかもそのようなサブコンビネーションのそれぞれが本明細書において明示的に示されるかのように、選択され得ることも示す。さらに、そのような言葉は、規定のアミノ酸の１つまたは複数が放棄され得ることも示す。例えば、特定の実施態様では、アミノ酸は、あたかもそのようなあり得る放棄のそれぞれが本明細書において明示的に示されるかのように、Ａ、ＧまたはＩではない；Ａではない；ＧまたはＶではない；などである。

定義
以下の用語は、本明細書における説明および添付の特許請求の範囲において用いられる。

単数形「ａ」および「ａｎ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形を同様に含むことが意図される。

さらに、本明細書において用いられる用語「約」は、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さの量、投与量、時間、温度などの、測定可能な値を言及する場合、規定の量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、または実に０．１％の変動を包含することを意味する。

また、本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある列挙された項目の１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、選択的に（「または」）と解釈された場合は組み合わせの欠失を指し、および包含する。

本明細書において用いられる移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許請求の範囲に記載された発明（例えば、ジスフェリンの生産）の、列挙された材料またはステップ、および、基礎的および新規の特徴（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈されるべきである。したがって、本明細書において用いられる用語「から本質的になる」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されるべきでない。

本明細書において用いられる用語「パルボウイルス」は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーを包含し、自律複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む。自律的パルボウイルスは、パルボウイルス、エリスロウイルス、デンソウイルス、イテラウイルス、および、コントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）属のメンバーを含む。例示的な自律的パルボウイルスは、限定されないが、マウスの微小ウイルス、ウシのパルボウイルス、イヌのパルボウイルス、ニワトリのパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコのパルボウイルス、ガチョウのパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、バリケンのパルボウイルス、ヘビのパルボウイルス、およびＢ１９ウイルスを含む。他の自律的パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻、第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照）。

ディペンドウイルス属は、制限されないが、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、ＡＡＶタイプ１２、ＡＡＶタイプ１３、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含む、アデノ付随ウイルス（ＡＡＶ）を含む。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）；および表１を参照。

本明細書において用いられる用語「アデノ付随ウイルス」（ＡＡＶ）は、制限されないが、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、ＡＡＶタイプ１２、ＡＡＶタイプ１３、ヘビＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、および、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。多くの相対的に新しいＡＡＶ血清型およびクレードが同定されている（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３－：３７５；および表１を参照）。

本発明のＡＡＶ粒子およびゲノムは、任意のＡＡＶ由来であってよい。様々な血清型のＡＡＶのゲノム配列、ならびに、ネイティブのＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当技術分野で知られている。そのような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋのような公共データベースに見られ得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＡＹ６３１９６６、ＡＸ７５３２５０、ＥＵ２８５５６２、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２およびＡＹ５３０５７９を参照；その開示は、ＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列を教示するために本明細書において参照により援用される。また、例えば、Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３９；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３０９；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３－：３７５－３８３；Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３０：３７５；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌ．２２１：２０８；Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３３８５；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２：３０９；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：８９１１；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４；国際特許公報ＷＯ ００／２８０６１、ＷＯ ９９／６１６０１、ＷＯ ９８／１１２４４；および米国特許第６，１５６，３０３号も参照；その開示は、ＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列を教示するために本明細書において参照により援用される。表１も参照。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３ ＩＴＲ配列の初期の説明は、Ｘｉａｏ、 Ｘ．，（１９９６）「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」（Ｐｈ．Ｄ．学位論文、ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）によって提供される（本明細書においてその全体で援用される）。

本明細書において用いられる用語「向性」は、細胞へのウイルスの侵入を指し、任意選択で、および好ましくは、細胞においてウイルスゲノムによって保有される配列の発現（例えば、転写、および任意選択で、翻訳）、例えば、組み換えウイルスについては、異種ヌクレオチド配列（単数または複数）の発現が続く。当業者は、ウイルスゲノム由来の異種核酸配列の転写は、例えば、誘導性プロモーターまたは他の方法で制御される核酸配列に関するトランス作用因子が不存在では開始され得ないことを理解している。ＡＡＶの場合は、ウイルスゲノム由来の遺伝子発現は、安定的に組み込まれたプロウイルス、非組込みのエピソーム、ならびに、ウイルスが細胞内に取り込み得る任意の他の形態由来であってよい。

本明細書において用いられる、ＡＡＶによる細胞の「形質導入」は、ＡＡＶが介在する細胞中への遺伝物質の移行を指す。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９章（第３版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）参照。

用語「５’部分」および「３’部分」は、２以上のエレメント間の空間的関係を定義するための相対的用語である。したがって、例えば、ポリヌクレオチドの「３’部分」は、別のセグメントの下流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「３’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの３’末にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの３’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。同様に、ポリヌクレオチドの「５’部分」は、別のセグメントの上流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「５’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの５’末にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの５’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。

本明細書において用いられる用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。

本明細書において用いられる用語「トランケートされたポリペプチド」は、野生型ポリペプチド内に存在するアミノ酸残基の１つまたは複数が欠失されているポリペプチドを指す。欠失された残基は、Ｎ末端、Ｃ末端、中央、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。

「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然起源および非天然起源ヌクレオチドの両方を含む）であってよく、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ配列のいずれかであってよい。

本明細書において用いられる用語「配列同一性」は、当技術分野における標準的な意味を有する。当技術分野で知られているように、多くの異なるプログラムを用いて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが公知配列と配列同一性または類似性を有するかどうか同定することができる。配列同一性または類似性は、制限されないが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズムを含む当技術分野で知られている標準的な技術を用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター化された実行によって、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４）により記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、好ましくはデフォルト設定を用いて、または調査によって、判定され得る。

有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ、ペアワイズアライメントを用いて、関連のある配列のグループから多数の配列アライメントを作る。また、アライメントを作るために用いられるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１（１９８７）のプログレッシブアライメント法の簡易化を用いて；その方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１（１９８９）により記載される方法に似ている。

有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３（１９９３）に記載の、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０（１９９６）；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから取得した。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメーターを用いて、それらは好ましくは、デフォルト値に設定されている。パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の構成、および、目的の配列が検索されている特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立されるが；感度を増大させるために値を調節してよい。

さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９（１９９７）により報告されるギャップ化ＢＬＡＳＴである。

アミノ酸配列同一性のパーセンテージの値は、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より長い」配列の残基の合計数で割って決定される。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の残基を有するものである（アライメントスコアを最大化するためにＷＵ－Ｂｌａｓｔ－２により導入されるギャップは無視する）。

同様の様式で、核酸配列同一性パーセントは、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチド内のヌクレオチドと同一である候補配列内のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。

アライメントは、並べられる配列内のギャップの導入を含み得る。加えて、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチドよりも多いまたは少ないヌクレオチドを含む配列に関して、一実施態様では、配列同一性のパーセンテージは、ヌクレオチドの合計数に対する、同一のヌクレオチドの数に基づいて決定されることが理解される。したがって、例えば、本明細書に具体的に開示される配列よりも短い配列の配列同一性は、一実施態様では、より短い配列におけるヌクレオチドの数を用いて決定される。同一性のパーセンテージの計算においては、相対的重量は、配列変動、例えば挿入、欠失、置換などの様々な発現に割り当てられない。

一実施態様では、同一性のみが正にスコアされて（＋１）、ギャップを含む全ての形態の配列変動は「０」の値に割り当てられて、配列類似性計算のための、以下に記載される加重したスケールまたはパラメーターの必要性を取り除く。配列同一性パーセントは、例えば、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より短い」配列の残基の合計数で割って、１００を掛けることにより、計算され得る。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の残基を有するものである。

本明細書において用いられる「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素、またはポリヌクレオチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、ポリヌクレオチドを意味する。

同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素、またはポリペプチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、ポリペプチドを意味する。

「治療的ポリペプチド」は、細胞または対象内のタンパク質の不存在または欠陥に起因する症候を緩和または減少し得るポリペプチドである。あるいは、「治療的ポリペプチド」は、抗癌効果または移植生存性の改善のような、他の方法で対象に利益を与えるものである。

ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に適用される本明細書において用いられる用語「改変」は、１つまたは複数の欠失、付加、置換、またはそれらの任意の組み合わせに起因して、野生型配列とは異なる配列を指す。

本明細書において用いられる、ウイルスベクターを「単離する」または「精製する」（または文法的等価物）によって、ウイルスベクターが、出発原料内の他の構成要素の少なくとも一部から、少なくとも部分的に分離されることを意味する。

用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「～の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ）」（およびそれらの文法的変形）によって、対象の状態の重症度が低減され、少なくとも部分的に改善または安定化されること、および／または、少なくとも１つの臨床症候における一部の軽減、緩和、低減または安定化が達成され、および／または、疾患または障害の進行に遅れがあることを意味する。

用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（およびそれらの文法的変形）は、対象における疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発症の予防および／または遅延、および／または、本発明の方法の不存在下で生じるであろうものと比較した疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発症の重症度の減少を指す。予防は、完全であってよく、例えば、疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の全体的な不存在であってよい。また、予防は、対象における疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発生および／または発症の重症度が、本発明の不存在下で生じるであろうものよりも低いような、部分的であってもよい。

本明細書において用いられる「治療効果的な」量は、対象に何らかの改善または利益を提供するのに十分な量である。別の言い方をすると、「治療効果的な」量は、対象における少なくとも１つの臨床症候に何らかの軽減、緩和、低減、または安定化を提供する量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り、治療的効果は完全または治療的である必要はないことを理解している。

本明細書において用いられる「予防効果的な」量は、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症を予防および／または遅延するのに十分な、および／または、本発明の方法の不存在下で生じるであろうものと比較して、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症の重症度を減少および／または遅延するのに十分な量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り、予防のレベルは完全である必要はないことを理解している。

用語「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸」は、本明細書において相互交換可能に用いられて、ウイルスにおける天然起源でない配列を指す。一部の実施態様では、異種核酸は、ポリペプチドまたは翻訳されていない目的ＲＮＡ（例えば、細胞または対象への送達のため）をコードするオープンリーディングフレームを含む。

本明細書において用いられる用語「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」は、核酸送達ビヒクルとして機能するウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を指し、ビリオン内にパッケージされたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含む。あるいは、一部の文脈では、用語「ベクター」は、ベクターゲノム／ｖＤＮＡ単独、またはプラスミドを指すために用いられてよい。

本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１に記載される二重のＡＡＶ粒子であってよい（その開示はその全体で参照により本明細書中に援用される）。したがって、一部の実施態様では、二本鎖（二重）ゲノムがパッケージされ得る。

「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、１つまたは複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、一般に、ウイルスを生産するためにシスで１４５塩基ＩＴＲのみを必要とする。典型的に、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージされ得る導入遺伝子のサイズを最大化するように、１つまたは複数のＩＴＲ配列のみ保持する。構造的および非構造的タンパク質コード配列は、トランスで提供され得る（例えば、プラスミドのようにベクターから、または、配列をパッケージング細胞内に安定的に組み込むことによって）。本発明の実施態様では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ配列）、任意選択で２つのＩＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＩＴＲ）を含み、それは典型的に、ベクターゲノムの５’および３’末にあって異種核酸と隣接するが、それと連続している必要はない。ＩＴＲは、同一または互いに異なってよい。

「ＡＡＶ逆位末端配列」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、制限されないが、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１３、ヘビＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む任意のＡＡＶ由来であってよい（例えば、表１を参照）。末端反復が、例えば、複製、ウイルスパッケージング、持続性、および／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を仲介する限り、ＡＡＶ ＩＴＲは、ネイティブの末端反復配列を有する必要はない（例えば、ネイティブのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更されてよい）。

本発明のウイルスベクターは、さらに、「標的化された」ウイルスベクター（例えば、方向付けられた向性を有する）および／または国際特許公報ＷＯ００／２８００４およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に記載される「ハイブリッド」ＡＡＶ（すなわち、ウイルスＩＴＲおよびウイルスキャプシドは、異なるＡＡＶ由来である）であってよい。

さらに、ウイルスキャプシドまたはゲノムのエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む他の改変を含んでよい。

用語「テンプレート」または「基質」は、本明細書において、ＡＡＶウイルスＤＮＡを生産するために複製され得るポリヌクレオチド配列を指すために用いられる。ベクター生産の目的のために、テンプレートは、典型的に、制限されないが、プラスミド、ネイキッドＤＮＡベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＡＡＶ、バキュロウイルス、レトロウイルスベクターなど）を含む、より大きなヌクレオチド配列または構築物内に埋め込まれる。あるいは、テンプレートは、パッケージング細胞の染色体内に安定的に組み込まれ得る。

本明細書において用いられる、ＡＡＶ「Ｒｅｐコード配列」は、ウイルス複製および新たなウイルス粒子の生産を仲介するＡＡＶの非構造的タンパク質をコードする核酸配列を示す。ＡＡＶ複製遺伝子およびタンパク質は、例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９＆７０章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。

「Ｒｅｐコード配列」は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の全てをコードする必要はない。例えば、ＡＡＶに関しては、Ｒｅｐコード配列は、４つのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の全てをコードする必要はなく、実際に、ＡＡＶ５は、スプライスされたＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質のみを発現すると考えられている。代表的な実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、ウイルスゲノム複製および新たなビリオン中へのパッケージングに必要な、少なくともこれらの複製タンパク質をコードする。Ｒｅｐコード配列は、一般に、少なくとも１つの大きなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８／６８）および１つの小さなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ５２／４０）をコードする。特定の実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質およびＡＡＶ Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。他の実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。さらに、さらなる実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２タンパク質、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質、またはＲｅｐ７８およびＲｅｐ４０タンパク質をコードする。

本明細書において用いられる用語「大きなＲｅｐタンパク質」は、Ｒｅｐ６８および／またはＲｅｐ７８を指す。特許請求の範囲に記載される発明の大きなＲｅｐタンパク質は、野生型または合成のいずれかであってよい。野生型の大きなＲｅｐタンパク質は、制限されないが、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１３を含む任意のＡＡＶ、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶ由来であってよい（例えば、表１を参照）。合成の大きなＲｅｐタンパク質は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更され得る。

当業者は、複製タンパク質は同一のポリヌクレオチドによってコードされる必要はないことをさらに理解する。例えば、ＡＡＶに関しては、ｐ１９プロモーターは不活化され得て、大きなＲｅｐタンパク質（単数または複数）は１つのポリヌクレオチドから発現され得て、小さなＲｅｐタンパク質（単数または複数）は異なるポリヌクレオチドから発現され得る。しかしながら典型的に、単一の構築物から複製タンパク質を発現することがより便利である。一部のシステムでは、ウイルスプロモーター（例えば、ＡＡＶ ｐ１９プロモーター）は、細胞によって認識されなくてよく、したがって、別個の発現カセットから大きなおよび小さなＲｅｐタンパク質を発現する必要がある。他の例では、大きなＲｅｐおよび小さなＲｅｐタンパク質を、別個に、すなわち、別個の転写および／または翻訳制御エレメントの制御下で発現することが望ましくあり得る。例えば、小さなＲｅｐタンパク質に対する大きな方の比を低減させるように、大きなＲｅｐタンパク質の発現を制御することが望ましくあり得る。昆虫細胞の場合は、細胞に対する毒性を避けるために、大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８／６８）の発現を下方制御することが有利であり得る（例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５を参照）。

本明細書において用いられる、ＡＡＶ「ｃａｐコード配列」は、機能性ＡＡＶキャプシドを形成する構造タンパク質をコードする（すなわち、ＤＮＡをパッケージおよび標的細胞を感染することができる）。典型的に、ｃａｐコード配列は、ＡＡＶキャプシドサブユニットの全てをコードするが、機能性キャプシドが生産される限り、全てよりも少ないキャプシドサブユニットがコードされてよい。典型的に、必ずしもではないが、ｃａｐコード配列は、単一の核酸分子上に存在する。

ＡＡＶのキャプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９＆７０章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）により詳細に説明される。

ポリペプチドドメインに関して本明細書において用いられる用語「実質的な部分」は、ドメイン内のアミノ酸残基の大部分（すなわち、少なくとも５０％）、例えば、少なくとも約８０％またはそれよりも多くの残基、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％の残基を指す。欠失されるドメインの実質的な部分に関して、ドメインの残りの残基は、野生型ドメインの生物学的活性の約２０％未満、例えば、生物学的活性の約１５％、１０％、または５％未満を維持する。存在しているドメインの実質的な部分に関して、ドメインの残基は、野生型ドメインの生物学的活性の少なくとも約７０％、例えば、生物学的活性の少なくとも約８０％、９０％、または９５％を維持する。

トランケートされたジスフェリンポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明は、トランケートされたジスフェリンポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。トランケートされたポリペプチドは、野生型ジスフェリンの生物学的活性の少なくとも一部を維持して、ポリヌクレオチドは、野生型ポリヌクレオチドと比較して低減されたそれらの長さに起因して、ウイルスゲノムおよびウイルスベクターの中にパッキングされることが可能である。特定の実施態様では、トランケートされたポリペプチドは、野生型ジスフェリンの生物学的活性の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％またはそれよりも多くを維持する。維持される生物学的活性は、筋肉の膜完全性の保持であってよく、当技術分野でよく知られていて本明細書において開示される技術を用いて測定することができる。

本発明の一態様は、トランケートされた哺乳類ジスフェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、ポリペプチドのＣ２ＤおよびＣ２Ｆドメインのそれぞれの少なくとも実質的な部分は、欠失している。一部の実施態様では、ポリペプチドのＣ２Ｅドメインの少なくとも実質的な部分も欠失している。一部の実施態様では、ポリペプチドのＣ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、およびＣ２Ｄドメインの１つまたは複数の少なくとも実質的な部分も欠失している。欠失は、ドメインの一部または全部、例えば、ドメインの８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも多くの欠失であってよい。欠失は、ドメインのＮ末端の境界、ドメインのＣ末端の境界、ドメインの中央、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。

特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｇ、およびＴＭドメインの少なくとも実質的な部分を含む、から本質的になる、またはからなる、トランケートされたジスフェリンポリペプチドをコードする。特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｇ、およびＴＭドメインの少なくとも実質的な部分、例えば、それぞれのドメインの大部分、例えば、ドメインの８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも多くを含む、から本質的になる、またはからなる、トランケートされたジスフェリンポリペプチドをコードする。特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、Ｃ２Ａ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｇ、およびＴＭドメインの少なくとも実質的な部分を含む、から本質的になる、またはからなる、トランケートされたジスフェリンポリペプチドをコードする。

特定の実施態様では、トランケートされたジスフェリンをコードするポリヌクレオチドは、約５ｋｂまたはそれ未満、例えば、約４．５ｋｂ、４ｋｂ、またはそれ未満の長さを有する。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、非天然起源のポリヌクレオチドである。

一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、哺乳類ジスフェリンポリペプチド、例えば、ヒトジスフェリンポリペプチドである、トランケートされたジスフェリンポリペプチドをコードする。

ジスフェリンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、当技術分野でよく知られていて、ＧｅｎＢａｎｋのようなデータベースに見ることができる。例えば、ヒトジスフェリンヌクレオチド配列は、アクセッション番号ＡＦ０７５５７５．１に見られて、ヒトジスフェリンアミノ酸配列は、アクセッション番号ＮＰ＿００３４８５．１に見られる。他の哺乳類ジスフェリンアミノ酸配列は、ラット（ＮＰ＿００１１０１３３９．１）、マウス（ＡＡＧ１７０４６．２）、ウシ（ＮＰ＿００１０９５９６０．１）、ヤギ（ＸＰ＿０１３８２２９９８．１）、ウマ（ＸＰ＿００８５３４１５９．１）、ヒツジ（ＸＰ＿０１４９４９９３６．１）、およびイヌ（ＸＰ＿００３４３２２８２．１）を含む。

ジスフェリンポリペプチドのドメイン構造は、当技術分野でよく知られている。図１Ａに示されるように、ジスフェリンは、以下のドメイン：Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｄ、Ｃ２Ｅ、Ｃ２Ｆ、Ｃ２Ｇ、およびＴＭを含む。それぞれのドメインの正確な境界は、オルソログおよび変異間で異なってよい。ヒトジスフェリン内のそれぞれのドメインに関する概算のアミノ酸範囲を表２に示す（アミノ酸のナンバリングは、配列番号１１に基づく。挙げられたドメイン境界は、約２０残基まで、例えば、約５、１０、１５、または２０残基異なってよい。

一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）の配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６～１０のいずれか１つと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド；または
（ｃ）コドン縮退に起因して（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド、である。

一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１～５のいずれか１つと同一の配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６～１０のいずれか１つと同一のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド；または
（ｃ）コドン縮退に起因して（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド、である。

本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現カセットである。発現カセットは、トランケートされたジスフェリンポリペプチドの発現を高めるためのエレメントをさらに含んでよい。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、プロモーター、例えば、普遍的プロモーター、または筋肉特異的または筋肉好適プロモーターに動作可能に連結される。

また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含む、ウイルスベクターなどのベクターも提供する。ウイルスベクターは、パルボウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターであってよい。本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含む、組み換えパルボウイルス粒子（例えば、組み換えＡＡＶ粒子）をさらに提供する。ウイルスベクターおよびウイルス粒子は、以下にさらに述べられる。ウイルス粒子は、例えば、改変されたキャプシドタンパク質の存在に起因して、野生型粒子と比較して変更された向性を有してよい。変更された向性は、制限されずに、増大された筋肉標的化および／または低減された肝臓標的化であってよい。

本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターを含む、形質転換された細胞に関する。

本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を含む、トランスジェニック動物に関する。一部の実施態様では、トランスジェニック動物は、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳類、例えば、実験動物、例えば、マウス ラット、イヌ、またはサルである。一部の実施態様では、動物は、疾患のモデルである。

本発明の別の態様は、トランケートされた哺乳類ジスフェリンポリペプチドに関し、ポリペプチドのＣ２ＤおよびＣ２Ｆドメインのそれぞれの少なくとも実質的な部分は、欠失している。一部の実施態様では、ポリペプチドのＣ２Ｅドメインの少なくとも実質的な部分も欠失している。一部の実施態様では、ポリペプチドのＣ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、およびＣ２Ｄドメインの１つまたは複数の少なくとも実質的な部分も欠失している。本発明のトランケートされたポリペプチドは、野生型ジスフェリンの少なくとも１つの生物学的活性の少なくとも約２０％を維持し、例えば、筋肉完全性を、例えば、少なくとも１つの生物学的活性の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも多くを保持する。一部の実施態様では、ポリペプチドは、非天然起源のポリペプチドである。

特定の実施態様では、ポリペプチドは、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｇ、およびＴＭドメインの少なくとも実質的な部分を含む、から本質的になる、またはからなる。特定の実施態様では、ポリペプチドは、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｇ、およびＴＭドメインの少なくとも実質的な部分を含む、から本質的になる、またはからなる。特定の実施態様では、ポリペプチドは、Ｃ２Ａ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｇ、およびＴＭドメインの少なくとも実質的な部分を含む、から本質的になる、またはからなる。

一部の実施態様では、ジスフェリンポリペプチドは、哺乳類ジスフェリンポリペプチド、例えば、ヒトジスフェリンポリペプチドである。

一部の実施態様では、ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号６～１０のいずれか１つと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一）の配列を含むポリペプチド、である。

一部の実施態様では、ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１～５のいずれか１つと同一の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号６～１０のいずれか１つと同一の配列を含むポリペプチド、である。

ウイルスベクターを生産する方法
本発明は、ウイルスベクターを生産する方法をさらに提供する。１つの特定の実施態様では、本発明は、組み換えＡＡＶ粒子を生産する方法を提供し、ＡＡＶ複製を許容する細胞に：（ａ）（ｉ）本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセット、および（ｉｉ）ＩＴＲを含む、組み換えＡＡＶテンプレート；（ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含む、ポリヌクレオチドを；組み換えＡＡＶテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件下で、提供するステップを含み；それにより、細胞において組み換えＡＡＶ粒子が生産される。組み換えＡＡＶテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件は、例えば、ＡＡＶテンプレートの複製およびＡＡＶキャプシド中へのキャプシド形成に十分なＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ配列およびＡＡＶ ｃａｐ配列）およびアデノウイルスおよび／またはヘルペスウイルス由来のヘルパー配列の存在であり得る。特定の実施態様では、ＡＡＶテンプレートは、２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、それは、本発明のポリヌクレオチドに対して５’および３’に位置するが、それに直接的に連続している必要はない。

一部の実施態様では、組み換えＡＡＶテンプレートは、Ｒｅｐによって分解されないＩＴＲを含み、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１において記載される二重のＡＡＶベクターを作る。

ＡＡＶテンプレートおよびＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたＡＡＶテンプレートを含むウイルスベクターが細胞において生産されるような条件下で提供される。当該方法は、細胞からウイルスベクターを回収するステップをさらに含んでよい。ウイルスベクターは、培地から、および／または、細胞を溶解させることによって、回収され得る。

細胞は、ＡＡＶウイルス複製を許容する細胞であってよい。当技術分野で知られている任意の適切な細胞が用いられ得る。特定の実施態様では、細胞は、哺乳類細胞（例えば、霊長類またはヒト細胞）である。別の選択肢として、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失された機能を与えるトランス補完パッケージング細胞株、例えば、２９３細胞または他のＥ１ａトランス補完細胞であってよい。

ＡＡＶ複製およびキャプシド配列は、当技術分野で知られている任意の方法によって提供され得る。現行のプロトコルは、典型的に、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を単一のプラスミド上に発現する。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列は、一緒に与えられる必要はないが、そうすることが便利であり得る。ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供され得る（例えば、欠失されたアデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域内に挿入される）。また、ＥＢＶベクターを用いてＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現してもよい。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターがエピソームであり、さらに、継続的な細胞分裂にわたって高いコピー数を維持することである（すなわち、「ＥＢＶに基づく核エピソーム」と指定される染色体外エレメントとして細胞内に安定して組み込まれる。Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７を参照）。

さらなる代替として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞内に安定的に組み込まれ得る。

典型的に、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージングを防ぐために、ＴＲによって隣接されない。

ＡＡＶテンプレートは、当技術分野で知られている任意の方法を用いて細胞に提供され得る。例えば、テンプレートは、非ウイルス（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給され得る。特定の実施態様では、ＡＡＶテンプレートは、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスベクターによって供給される（例えば、欠失されたアデノウイルスのＥ１ａまたはＥ３領域内に挿入される）。別の説明として、Ｐａｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５０２５は、ＡＡＶ ＴＲによって隣接されたレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルスベクターを記載する。ＥＢＶベクターは、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上述のように、テンプレートを送達するために用いられてもよい。

別の代表的な実施態様では、ＡＡＶテンプレートは、複製ｒＡＡＶウイルスによって提供される。さらに他の実施態様では、ＡＡＶテンプレートを含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体に安定的に組み込まれる。

ウイルス力価を高めるために、生産的なＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が細胞に提供され得る。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野で知られている。典型的に、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供される。あるいは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスまたはウイルスベクターによって、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５、および、米国特許第６，０４０，１８３号および第６，０９３，５７０号によって説明されるように、効率的なＡＡＶ生産を促進するヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして、提供され得る。

さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体内に埋め込まれた、または、安定した染色体外エレメントとして維持された、ヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供され得る。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン内にパッケージングされ得ず、例えば、ＩＴＲによって隣接されない。

当業者は、ＡＡＶ複製およびキャプシド配列およびヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を単一のヘルパー構築物上に提供することが有利であり得ることを理解する。このヘルパー構築物は、非ウイルスまたはウイルス構築物であってよい。１つの非限定的な例示として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであってよい。

特定の一実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターは、ＡＡＶテンプレートをさらに含んでよい。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはＡＡＶテンプレートは、アデノウイルスの欠失された領域（例えば、Ｅ１ａまたはＥ３領域）へ挿入され得る。

さらなる実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施態様によれば、ＡＡＶテンプレートは、プラスミドテンプレートとして提供され得る。

別の実例となる実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供されて、ＡＡＶテンプレートは、プロウイルスとして細胞内に組み込まれる。あるいは、ＡＡＶテンプレートは、染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶに基づく核エピソームとして）細胞内に維持されるＥＢＶベクターによって提供される。

さらなる例示的な実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。ＡＡＶテンプレートは、別個の複製ウイルスベクターとして提供され得る。例えば、ＡＡＶテンプレートは、ＡＡＶ粒子または第二の組み換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。

前述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、典型的に、アデノウイルスの複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス５’および３’シス配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列、および存在する場合は、ＡＡＶテンプレートは、アデノウイルス主鎖に埋め込まれて、これらの配列がアデノウイルスキャプシド内にパッケージされ得るように、５’および３’シス配列によって隣接される。上述のように、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、一般に、ＩＴＲによって隣接されないので、これらの配列はＡＡＶビリオン内にパッケージされない。

Ｚｈａｎｇら（（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４－１２）は、アデノウイルスおよびＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方を含む、キメラヘルパーを記載する。

また、ヘルペスウイルスが、ＡＡＶパッケージング方法においてヘルパーウイルスとしても用いられ得る。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（単数または複数）をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、スケーラブルなＡＡＶベクター生産スキームを有利に促進し得る。ＡＡＶ－２ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスタイプＩ（ＨＳＶ－１）ベクターが記載されている（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９８６およびＷＯ００／１７３７７。

さらなる代替として、本発明のウイルスベクターは、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１９３５－４３によって説明されるように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびＡＡＶテンプレートを送達するために、バキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞内に生産され得る。

ヘルパーウイルスの汚染がないＡＡＶベクターストックは、当技術分野で知られている任意の方法によって得ることができる。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別され得る。また、ＡＡＶは、ヘパリン基質に関する親和性に基づいて、ヘルパーウイルスから区別され得る（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９７３）。いかなる汚染ヘルパーウイルスも複製能力がないように、欠失された複製欠損ヘルパーウイルスが用いられ得る。さらなる代替として、アデノウイルス初期遺伝子発現のみがＡＡＶのパッケージングを仲介するのに必要とされるので、後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルスヘルパーが用いられ得る。後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルス突然変異体は、当技術分野で知られている（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス突然変異体）。

組み換えウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、細胞に、ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドを、インビトロ、エクスビボで、およびインビボで送達するのに有用である。特に、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドを、動物（哺乳類細胞を含む）に送達または移行するために有利に用いられ得る。

ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドは、適切な制御配列と動作可能に関連し得ることが当業者によって理解される。例えば、ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドは、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、および／またはエンハンサーなどのような、発現制御エレメントと動作可能に関連し得る。

当業者は、所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントが用いられ得ることを理解する。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて、構成的または誘導性であってよい。プロモーター／エンハンサーは、ネイティブまたは外来であってよく、天然または合成の配列であってよい。外来とは、転写開始領域が導入される野生型宿主内に転写開始領域が見られないことを意図する。

特定の実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞または治療される対象にネイティブであってよい。代表的な実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドに対してネイティブであってよい。プロモーター／エンハンサーエレメントは、一般に、目的の標的細胞（単数または複数）内でそれが機能するように選択される。さらに、特定の実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳類のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的または誘導性であってよい。一部の実施態様では、プロモーターは、筋肉特異的または好適（心筋、骨格筋および／または平滑筋特異的または好適を含む）プロモーターである。

誘導性発現制御エレメントは、典型的に、異種核酸配列（単数または複数）の発現に対して制御を提供することが望ましい適用において有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または好適プロモーター／エンハンサーエレメントであってよく、筋肉特異的または好適（心筋、骨格筋および／または平滑筋特異的または好適を含む）プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、限定されないが、Ｔｅｔ ｏｎ／ｏｆｆエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、および、メタロチオネインプロモーターを含む。

ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドが転写されて、その結果、標的細胞内で翻訳される実施態様では、特異的な開始シグナルが、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために一般に含まれる。これらの外因性の翻訳制御配列は、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含んでよく、天然および合成の両方の様々な由来であってよい。

本発明に係るウイルスベクターは、分裂および非分裂細胞を含む広範な細胞内にジスフェリンをコードするポリヌクレオチドを送達するための手段を提供する。ウイルスベクターは、例えばインビトロでポリペプチドを生産するためにジスフェリンをコードするポリヌクレオチドを細胞にインビトロで送達するために、または、エクスビボでの遺伝子療法のために、用いられ得る。ウイルスベクターは、例えば、ジスフェリンを発現するために、それを必要とする対象に、ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドを送達する方法においてさらに有用である。このようにして、ジスフェリンは、対象においてインビボで生産され得る。対象は、ポリペプチドが不足しているのでジスフェリンを必要とし得る。さらに、当該方法は、対象でのジスフェリンの生産が何らかの有益な効果を与え得るので実行され得る。

また、ウイルスベクターは、培養細胞または対象においてジスフェリンを生産するために用いられてもよい（例えば、ポリペプチドを生産するためのバイオリアクターとして対象を用いる）。

一般に、本発明のウイルスベクターは、ジスフェリンを送達することが有益である任意の病状を治療および／または予防するために、ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドを送達するために用いられ得る。一部の実施態様では、病状は、ジスフェリン異常症および／またはジスフェリン異常症と関連する任意の症候である。本明細書において用いられる用語「ジスフェリン異常症」は、ジスフェリンの異常な発現と関連する任意の疾患、障害、または状態を指す。ジスフェリン異常症と最も一般的に関連する臨床症状は、肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ２Ｂ）、三好型ミオパチー、前脛骨発症を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＡＴ）、遠近虚弱化、偽代謝ミオパチー、およびｈｙｐｅｒＣＫｅｍｉａを含む。

本発明に係るウイルスベクターは、診断およびスクリーニング方法における用途を見いだし、それにより、ジスフェリンは、細胞培養系、またはあるいは、トランスジェニック動物モデルにおいて一時的または安定的に発現される。

また、本発明のウイルスベクターは、制限されないが、当業者に明らかなように、遺伝子ターゲッティング、クリアランス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコルでの使用を含む、様々な非治療的目的のためにも用いられ得る。また、ウイルスベクターは、安全性（拡散、毒性、免疫原性など）を評価する目的のためにも用いられ得る。そのようなデータは、例えば、臨床有効性の評価の前に規制上の承認プロセスの一部として米国食品医薬品局によって考慮される。

対象、医薬製剤、および投与モード
本発明に係るウイルスベクターおよびキャプシドは、獣医および医療用途の両方において使用を見いだす。適切な対象は、鳥類および哺乳類の両方を含む。本明細書において用いられる用語「鳥類」は、制限されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ターキー、キジ、オウム、インコなどを含む。本明細書において用いられる用語「哺乳類」は、制限されないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどを含む。ヒト対象は、新生児、幼児、未成年および成人を含む。対象は、本発明の方法を必要としていてよく、すなわち、ジスフェリン異常症であると診断されていて、または、その疑いがある。

特定の実施態様では、本発明は、薬学的に許容できる担体中に、本発明のウイルスベクターおよび／またはキャプシド、および、任意選択で、他の医療薬剤、医薬品、安定化剤、バッファー、担体、アジュバント、希釈剤などを含む、医薬組成物を提供する。注入のために、担体は典型的に液体である。他の投与方法のために、担体は、固体または液体のいずれかであってよい。吸入投与のために、担体は呼吸用であり、任意選択で、固体または液体微粒子形態であってよい。

「薬学的に許容できる」によって、毒性または他の方法で望ましくないようなものでない材料を意味し、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに対象に投与され得る。

本発明の一態様は、ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドを細胞にインビトロで移行または送達する方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適切である標準的な形質導入方法に従って、適切な感染多重度で細胞内に導入され得る。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞のタイプおよび数、および特定のウイルスベクターに応じて変化し得て、過度の実験をせずに当業者によって決定され得る。代表的な実施態様では、少なくとも約１０^３感染単位、より好ましくは少なくとも約１０^５感染単位が細胞に導入される。

ウイルスベクターが導入される細胞（単数または複数）は、制限されないが、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞および／または横隔膜筋細胞）を含む任意のタイプであってよい。代表的な実施態様では、細胞は、任意の前駆細胞であってよい。さらなる可能性として、細胞は、幹細胞（例えば、筋肉幹細胞）であってよい。さらに、細胞は、上記の記載の任意の種の起源由来であってよい。

ウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細胞内に導入され得る。特定の実施態様では、細胞は対象から取り出されていて、ウイルスベクターがその中に導入されて、それから、細胞は元の対象内に投与される。エクスビボでの操作のために対象から細胞を取り出して、その後に元の対象に導入する方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照）。あるいは、組み換えウイルスベクターは、ドナー対象から細胞内に、培養細胞内に、または、任意の他の適切な由来から細胞内に導入され得て、細胞は、それを必要とする対象（すなわち、「レシピエント」対象）に投与される。

エクスビボでの遺伝子送達に適切な細胞は、上述されるとおりである。対象へ投与する細胞の用量は、対象の年齢、症状および種、細胞のタイプ、細胞によって発現される核酸、投与モードなどによって変化する。典型的に、少なくとも約１０^２～約１０^８細胞または少なくとも約１０^３～約１０^６細胞が、薬学的に許容できる担体において投与量あたり投与される。特定の実施態様では、ウイルスベクターを用いて形質導入された細胞は、調剤担体と組み合わせて治療有効量または予防有効量で対象に投与される。

本発明のさらなる態様は、ウイルスベクターを対象に投与する方法である。それを必要とするヒト対象または動物への本発明に係るウイルスベクターおよび／またはキャプシドの投与は、当技術分野で知られている任意の手段によるものであってよい。任意選択で、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、薬学的に許容できる担体において治療効果的または予防効果的な投与量で送達される。

対象に投与されるウイルスベクターおよび／またはキャプシドの用量は、投与モード、治療および／または予防されるべき疾患または症状、個々の対象の症状、特定のウイルスベクターまたはキャプシド、および、送達されるべき核酸などに依存し、日常的な様式で決定され得る。治療的効果を達成するための例示的な投与量は、少なくとも約１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５ １０^１６、１０^１７、１０^１８形質導入単位、任意選択で、約１０^８～１０^１５形質導入単位の力価である。

特定の実施態様では、１よりも多い投与（例えば、２、３、４またはそれよりも多い投与）が、様々な間隔、例えば、毎時間、毎日、毎週、毎月、毎年などの期間にわたって所望のレベルの遺伝子発現を達成するために用いられ得る。

例示的な投与モードは、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介する）、口腔（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼球内、経皮、内皮内、子宮内（または胚内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内［骨格筋、横隔膜筋および／または心筋への投与を含む］、胸膜内、脳内、および関節内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚および粘膜表面の両方、および経皮投与）、リンパ内など、ならびに、直接的な組織または臓器注入（例えば、肝臓、眼へ［硝子体内および網膜下を含む］、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳）を含む。

投与は、制限されずに、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、および眼からなる群より選択される部位を含む、対象内の任意の部位に対するものであってよい。

本発明に係る骨格筋への投与は、制限されないが、四肢（例えば、上腕、前腕，上脚、および／または下脚），背中，首、頭部（例えば、舌）、胸部、腹部、骨盤／会陰、および／または指の骨格筋への投与を含む。適切な骨格筋は、限定されないが、小指外転筋小指外転筋（手）、小指外転筋小指外転筋（足）、母指外転筋、第五中足骨外転筋、短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転、長内転筋、大内転筋、母指内転筋、肘筋、前斜角筋、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、烏口腕筋、皺眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、二腹筋、背側骨間筋（手）、背側骨間筋（足）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、指伸筋、短指伸筋、長指伸筋、短母指伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋、短母指伸筋、長母指伸筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（手）、短小指屈筋（足）、短趾屈筋、長趾屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋、長母指屈筋、前頭筋、腓腹筋、オトガイ舌骨筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、薄筋、頚腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸肋筋、腸骨筋、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘間筋、横突間筋、外側翼突筋、外側直筋、広背筋、口角挙筋、眼窩下筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長回旋筋、頭最長筋、頸最長筋、胸最長筋、頭長筋、頸長筋、虫様筋（手）、虫様筋（足）、咬筋、内側翼突筋、内側直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第三腓骨筋、梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頸筋、膝窩筋、後斜角筋、方形回内筋、円回内筋、大腰筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半膜様筋、頭半棘筋、頚半棘筋、胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短回旋筋、ヒラメ筋、頭棘筋、頚棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頚板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸郭、甲状舌骨、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋、および小頬骨筋、および任意の他の適切な当技術分野で知られている骨格筋を含む。

ウイルスベクターは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流、（任意選択で、足および／または腕の単離された四肢灌流；例えばＡｒｒｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８－３４６４を参照）、および／または、直接的な筋肉内注入によって、骨格筋に送達され得る。特定の実施態様では、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、四肢灌流、任意選択で、単離された四肢灌流（例えば、静脈内または関節内投与によって、対象（例えば、ジスフェリン異常症を有する対象）の四肢（腕および／または足）に投与される。本発明の実施態様では、本発明のウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、「流体力学」技術を用いずに有利に投与され得る。従来技術ベクターの組織送達（例えば、筋肉への）は、血管系内の圧力を増大させてベクターが内皮細胞バリアを横切る能力を促進する流体力学技術（例えば、大量の静脈内／静脈内投与）によって、しばしば高められる。特定の実施態様では、本発明のウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、大量インフュージョンおよび／または高められた血管内圧力（例えば、正常の収縮期圧よりも高い、例えば、正常の収縮期圧よりも、血管内圧が５％、１０％、１５％、２０％、２５％以下の増加）のような流体力学技術の不存在下で投与され得る。そのような方法は、浮腫、神経損傷および／またはコンパートメント症候群のような、流体力学技術と関連する副作用を減少または防止し得る。

心筋への投与は、左心房、右心房、左心室、右心室および／または隔膜への投与を含む。ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、静脈内投与、動脈内投与、例えば、大動脈内投与、直接的な心臓注入（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室へ）、および／または冠動脈灌流によって、心筋に送達され得る。

横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹膜内投与を含む任意の適切な方法によるものであってよい。

平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹膜内投与を含む任意の適切な方法によるものであってよい。一実施態様では、投与は、平滑筋内、付近および／または上に存在する内皮細胞に対するものであってよい。

標的組織への送達は、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドを含むデポーを送達することによっても達成され得る。代表的な実施態様では、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドを含むデポーは、骨格筋、平滑筋、心筋および／または横隔膜筋組織へ移植されて、または、組織は、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドを含むフィルムまたは他のマトリックスと接触され得る。そのような移植可能なマトリックスまたは基材は、米国特許第７，２０１，８９８号に記載される。

特定の実施態様では、本発明に係るウイルスベクターは、骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与される（例えば、ジスフェリン異常症を治療および／または予防するため）。

代表的な実施態様では、本発明は、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋の障害を治療および／または予防するために用いられる。

代表的な実施態様では、本発明は、それを必要とする対象においてジスフェリン異常症を治療および／または予防する方法を提供し、当該方法は、治療的または予防的有効量の本発明のウイルスベクターを、哺乳類対象に投与するステップを含み、ここで、ウイルスベクターは、ジスフェリン、ミニ－ジスフェリン、または、マイクロ－ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施態様では、ウイルスベクターは、本明細書における他のどこかに記載されるように、骨格筋、横隔膜および／または心筋に投与され得る。

注入剤は、従来の形態で、液体の溶液または懸濁液のいずれかとして、注入前の液体での溶液または懸濁液に適切な固体形態、またはエマルションとして、調製され得る。あるいは、本発明のウイルスベクターおよび／またはウイルスキャプシドは、全身性よりむしろ局所的に、例えば、デポーまたは徐放性製剤において投与し得る。さらに、ウイルスベクターおよび／またはウイルスキャプシドは、外科的に移植可能なマトリックス（例えば、米国特許公報番号２００４－００１３６４５に記載）に付着されて送達され得る。

本発明を説明したが、同様のものが、以下の実施例においてより詳細に説明されて、それは、説明目的のみのために本明細書に含まれて、本発明を制限することを意図しない。

実施例１
トランケートされたジスフェリン
いくつかのトランケートされたヒトジスフェリンクローンが調製された。配列およびドメインを以下に開示する。残基のナンバリングは、ヒトジスフェリンアイソフォーム８（ＮＰ＿００３４８５．１）（配列番号１１）に基づく。クローンのアミノ酸配列のアライメントを表３に示す（配列番号６～１１）。クローンのそれぞれは、インビトロで細胞において発現されて、ジスフェリンポリペプチドを生産することが示された。

野生型ヒトジスフェリン（アイソフォーム８）（配列番号１１）
［Ｃ２Ａ，１：１２４］；［１２５：２１８］；［Ｃ２Ｂ，２１９：３５２］；［３５３：３６５］；［Ｃ２Ｃ，３６６：５１５］；［５１６：６６９］；
［ＦｅｒＡ，６７０：７８２］；［７８３：８６３］；［ＤｙｓＦ，８６４：１０９７］；［１０９８：１１３６］；［Ｃ２Ｄ，１１３７：１２８１］；
［１２８２：１３１３］；［Ｃ２Ｅ，１３１４：１４６５］；［１４６６：１５７８］；［Ｃ２Ｆ，１５７９：１６９６］；［１６９７：１７８８］；
［Ｃ２Ｇ，１７８９：１９９４］；［１９９５：２０４４］；［ＴＭ，２０４５：２０６７］；［２０６８：２０８０］
野生型ジスフェリンドメインの概要：Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｄ、Ｃ２Ｅ、Ｃ２Ｆ、Ｃ２Ｇ、ＴＭ

クローン＿３１８ Ｎｏ Ｆｌａｇ（４３３）（配列番号６）
［Ｃ２Ａ，１：１２４］；［１４７：１５５］；［１５７：１６６］；［１７２：１８０］；［１８７：１９２］；［１９９：２０５］；［Ｃ２Ｂ，２２２：３５２］；
［３５３：３６５］；［Ｃ２Ｃ，３６６：５１５］；［５６６：６１９］；［ＦｅｒＡ，６７０：７８２］；［８３１：８６３］；［ＤｙｓＦ－ａ，８６４：８９１］；
［ＤｙｓＦ－ｂ，９４２：１０９７］［１０９８：１１０４］［１２８２：１３１３］；［Ｃ２Ｅ，１３１４：１４６５］；［１４９６：１５１７］；
［１５２３：１５３２］；［１５３８：１５４８］；［Ｃ２Ｆ，１５７９：１６９６］；［１７１８］；［１７２４：１７４１］；［１７４７：１７６５］；
［Ｃ２Ｇ，１７９２：１９９４］；［２０００：２００３］；［２０１８：２０３０］；［２０３６：２０４４］；［ＴＭ，２０４５：２０６７］；
［２０６８：２０８０］
クローン＿３１８ドメインの概要：Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ^＊、Ｃ２Ｅ、Ｃ２Ｆ、Ｃ２Ｇ、ＴＭ

クローン＿４３１ Ｎｏ Ｆｌａｇ（４３１）（配列番号７）
［Ｃ２Ａ，１：１２４］；［１２５：２１８］；［Ｃ２Ｂ，２１９：３５２］；［３５３：３６５］；［Ｃ２Ｃ，３６６：５１５］；［５１６：６６９］；
［ＦｅｒＡ，６７０：７８２］；［７８３：８６３］；［ＤｙｓＦ，８６４：１０９７］；［１０９８：１１３６］；［Ｃ２Ｇ，１７８９：１８２３］；
［Ｃ２Ｇ^＊，１８２４：１８３６＝ＴＫＧＡＦＧＤＭＬＤＴＰ－］；［Ｃ２Ｇ，１８３７：（Ｃ１８８４Ａ）：１９９４］；
［１９９５：２０４４］；［ＴＭ，２０４５：２０６７］；［２０６８：２０８０］
クローン＿４３１ドメインの概要：Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｇ^＊、ＴＭ

クローン＿４３０ Ｎｏ Ｆｌａｇ（４３０）（配列番号８）
［Ｃ２Ａ，１：１２４］；［１２５：２１８］；［３５７：３６５］；［Ｃ２Ｃ，３６６：５１５］；［５１６：６６９］；［ＦｅｒＡ，６７０：７８２］；
［７８３：８６３］；［ＤｙｓＦ，８６４：１０９７］；［１０９８：１１３６］；［Ｃ２Ｇ，１７８９：（Ｃ１８８４Ａ）：１９９４］；［１９９５：２０４４］；
［ＴＭ，２０４５：２０６７］；［２０６８：２０８０］
クローン＿４３０ドメインの概要：Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｇ、ＴＭ

クローン＿３４２ Ｎｏ Ｆｌａｇ（４２６）（配列番号９）
［Ｃ２Ａ，１：１２４］；［１２５：２１８］；［Ｃ２Ｃ，３６６：５１５］；［５１６：６６９］；［ＦｅｒＡ，６７０：７８２］；［７８３：８６３］；
［ＤｙｓＦ，８６４：１０９７］；［１０９８：１１３６］；［Ｃ２Ｆ，１５７９：１６９６］；［１６９７：１７８８］；
［Ｃ２Ｇ，１７８９：（Ｃ１８８４Ａ）：１９９４］；［１９９５：２０４４］；［ＴＭ，２０４５：２０６７］；［２０６８：２０８０］
クローン＿３４２ドメインの概要：Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｆ、Ｃ２Ｇ、ＴＭ

クローン＿４２５ Ｎｏ Ｆｌａｇ（４２５）（以前は３４１）（配列番号１０）
［Ｃ２Ａ，１：１２４］；［１２５：２１８］；［Ｃ２Ｂ，２１９：３５２］；［３５３：３６５］；［Ｃ２Ｃ，３６６：５１５］；［５１６：６６９］；
［ＦｅｒＡ，６７０：７８２］；［７８３：８６３］；［ＤｙｓＦ，８６４：１０９７］；［１０９８：１１３６］；
［Ｃ２Ｇ，１７８９：（Ｃ１８８４Ａ）：１９９４］；［１９９５：２０４４］；［ＴＭ，２０４５：２０６７］；［２０６８：２０８０］
クローン＿４２５ドメインの概要：Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｇ、ＴＭ

^＊－野生型ドメインの範囲と比較した、ドメイン範囲における中断を示す

実施例２
トランケートされたジスフェリンのインビボ効果
より小さなジスフェリン遺伝子を構築する以前の試みは、部分的に折り畳まれたタンパク質ドメインが、不適当なトランケーションの結果として、より小さな遺伝子の任意の治療的価値を覆い得るという事実を無視していた。この問題を緩和するために、ジスフェリンのそれぞれのドメインを合理的に規定するためにＣ２ドメインの構造的特徴に対して注意深い配慮が払われた。ジスフェリン内の７つのＣ２ドメインを、ぞれぞれ、８個の予測のｂ鎖、Ｃ２ドメイントポロジー、Ｃａ^２＋－結合部位の完全性（適切ならば）、および、ドメインのコアにおける疎水性パッキングの連続性によって規定した（表２）。ナノ－ジスフェリンを構築するための全体的な哲学は、３つのルールに基づく。第一に、フェーリンファミリーメンバー、ＦｅｒＡおよびＤｙｓＦの中心的な特性は、全ての構築物において無傷に維持された。第二に、最初のＣ２Ａドメイン、および、膜貫通スパンの隣のＣ２ドメインであるＣ２Ｇは、全ての構築物において保存された。第三に、多数のタンデムＣ２ドメインは、全体的な膜結合性に個々に寄与する。これらのテナントを考慮して、Ｃ２ドメインは、折り畳まれたドメインおよびそれを他の潜在的に折り畳まれたドメインに連結するフレキシブルなリンカーの知識によって、その後に切除された。これらの３つのルールは、小型の潜在的に治療的なジスフェリン変異体（ナノ－ジスフェリン（クローン４２５））の構築を導き、それは、単一のＡＡＶキャプシド内に効率的にパッケージされると予測された（オープンリーディングフレーム［ＯＲＦ］４，３５６ｎｔ）。

哺乳類細胞におけるナノ－ジスフェリンの発現
ナノ－ジスフェリンは、野生型（ＷＴ）ジスフェリンアイソフォーム８のｃＤＮＡ（６，２４０ｎｔ）に基づき、それは、ドメインＣ２Ａ－Ｃ２Ｂ－Ｃ２Ｃ－ＦｅｒＡＤｙｓＦ－Ｃ２Ｄ－Ｃ２Ｅ－Ｃ２Ｆ－Ｃ２Ｇ－ＴＭを含む（図１Ａ）。はじめに、膜関連、または可溶性の、タンパク質溶解物のウエスタンブロッティングを行なって、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞におけるトランスフェクション後のナノ－ジスフェリン局在を決定した。これらの実験に関して、全長ジスフェリンおよびＧＦＰ発現カセットは、それぞれポジティブおよびネガティブコントロールとして働いた。結果は、ナノ－ジスフェリンが、その予測サイズ（１６０ｋＤａ）で単一バンドとして生産されて、および、その親分子ジスフェリン同様に、ナノ－ジスフェリンは、膜および膜小胞関連のタンパク質であることを示す（図１Ｂ）。トランスフェクトされたヒトＨｅＬａ細胞におけるナノ－ジスフェリンの免疫蛍光は、野生型ジスフェリン同様に大量であることおよびタンパク質局在化を示し、両方とも、以前に報告されたように（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７：１８０５（２００７）；Ｂａｎｓａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４２３：１６８（２００３））、膜小胞と同様に細胞全体にわたって分布していた（図１Ｃ）。ジスフェリン患者の筋芽細胞におけるインビトロの毒性実験は、プラスミドＤＮＡの増加するトランスフェクション投与量でのナノ－ジスフェリンまたはジスフェリン過剰発現後のアラマーブルーによって、毒性を示さなかった（図１Ｄ）。

弱いプロモーターを用いた無傷のＡＡＶ形質導入は、強力なプロモーターを用いたフラグメントＡＡＶよりも効率的である
インビボ試験に関する最も効率的な治療法を見つけるために、ナノ－ジスフェリンタンパク質生産に関して、強力なＣＭＶプロモーターによるフラグメントＡＡＶを、小さくて弱いＪｅＴプロモーターによる無傷のＡＡＶに対して評価した。ＣＭＶ－ナノ－ジスフェリンは、５，５９７ｎｔのカセットサイズを有し、一方で、ＪｅＴナノ－ジスフェリンは、４，８４９ｎｔで理論的にＡＡＶキャプシドパッケージング容量内である（Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２９７：２１（２００２））（図２Ａ）。プラスミドのコンテキストにおいてそれぞれのカセットからのナノ－ジスフェリンタンパク質生産を決定するために、ウエスタンブロッティングをＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション後に行なった。予期されたとおり、より大きなＣＭＶプロモーターは、小さなＪｅＴプロモーターよりもおよそ１５倍多くのナノ－ジスフェリンを生産した（Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２９７：２１（２００２））（図２Ｂ）。既存のＡＡＶパッケージングの定説を考慮に入れれば、５．６ｋｂでのＣＭＶ－ナノ－ジスフェリンカセットは、フラグメントＡＡＶを生産するが、一方で、より小さなＪｅＴカセットは、４．８５ｋｂの無傷のゲノムとしてＡＡＶ２キャプシド内にパッケージされ得ると仮定された。これを調べるために、キャプシドによってパッケージされたＤＮＡ種をアルカリゲル電気泳動によって分離して、それから、ＳＹＢＲゴールドによって染色した。意図されたサイズの単一のＤＮＡ種が、より小さなＪｅＴによって駆動されるカセットに関して観察されたが、一方で、より大きなＣＭＶプロモーターから発現されるナノ－ジスフェリンは、意図された５．６ｋｂゲノムよりもずっと小さな、およそ３．５～４．５ｋｂのサイズ範囲内の異種ＤＮＡ種のパッケージングをもたらした（図２Ｃ）。無傷のＡＡＶと比較してフラグメントＡＡＶ形質導入の効率は、５～１００倍に劇的に減少する（Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１：２２０５（２０１３）；Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ４：ｅ７７０５（２００９））。ＪｅＴプロモーターよりもずっと強力なＣＭＶプロモーター（図２Ｂ）が、フラグメントＡＡＶの低減された効率を克服することができるかどうかを決定するために、ナノ－ジスフェリンの多さを、増加する投与量での形質導入後にウエスタンブロットにより決定した。ＣＭＶに好適なプロモーター強度の違いにかかわらず、無傷のＡＡＶ２－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンベクター形質導入は、増加する投与量で投与された場合、フラグメントＡＡＶ２－ＣＭＶ－ナノ－ジスフェリンと比較して優れたタンパク質生産を示した（図２Ｄ）。パッケージされたトランスジェニックＤＮＡの規定された性質（図２Ｃ）、無傷のＡＡＶベクター形質導入の増大された効率（図２Ｄ）、想定された全身性臨床静脈内（ＩＶ）投与、および、診療所での高い投与量でのベクターに対する不要な免疫学的応答に関する潜在性を考慮に入れれば、より高い効率の無傷のＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンに基づくベクターを、残りのインビボ試験のために選択した。

ＡＡＶ－ナノ－ジスフェリンは、筋肉内注入後に筋肉完全性を改善する
次に、ＡＡＶ－ナノ－ジスフェリンの安全性および有効性を、ＡＡＶ１キャプシドを広範な筋肉形質導入に関するその能力に起因して用いて、筋肉内注入後に盲目実験で調べた。６週齢ジスフェリン－欠損（ＢＬＡ／Ｊ）マウスのＴＡにＡＡＶ１－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンを注入して、対側の足はＡＡＶ１－ＣＭＶ－ＧＦＰをコントロールとして受け取った。屠殺の４０時間前に、９週において、線維内アルブミンに結合する筋肉損傷マーカーであるエバンスブルー色素を腹腔内にマウスに注入して、損傷した筋肉線維の筋線維鞘内の裂け目の検出を助けた（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：９５９（１９９５））。横断面において全線維に対して標準化された陽性の線維をカウントする際に、ＡＡＶ１－ＧＦＰコントロール筋肉におけるエバンスブルー色素陽性の線維の変動が個々のＢＬＡ／Ｊマウス間で観察されて、遺伝学的に同一のマウスにおける異なる疾患重症度を示唆した（図３Ａ、「ＧＦＰ」）。これは、以前に報告されたように、ヒトジスフェリン異常症患者での初期疾患の変動性と一致する（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２６：１６５（２００５））。マウス間では、コントロールベクターによって処置されたＴＡ間のベースラインの変動にもかかわらず、それぞれのマウス内で、ＡＡＶ１－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンによって処置された全ての筋肉は、それぞれの対側ＧＦＰコントロールと比較して、より少ないエバンスブルー色素陽性の線維を示した（図３Ａ）。まとめると、マウスコホートは、対応両側ｔ検定によって、処置およびコントロール筋肉の間に有意差を示した（ｐ＝０．００５）（図３Ａ）。筋肉再生およびしたがって間接的に筋肉線維ターンオーバーに関するマーカーである中心の核形成を、断面のＨ＆Ｅ染色の際に定量化した。データは、内部ＡＡＶ１－ＧＦＰコントロールと比較して、ＡＡＶ１－Ｊｅｔ－ナノ－ジスフェリンが注入されたＴＡ筋肉の１つを除く全てにおける中心の核形成の低減を示す（図３Ｂ；両側ｔ検定、ｐ＝０．０１２５）。ＡＡＶによって処置された筋肉も、視覚的に改善された組織学を示した（図３Ｃ）。免疫蛍光は、筋肉線維のおよそ３０％においてナノ－ジスフェリンを検出したが；それぞれの筋肉線維におけるその局在は、内因性ジスフェリンに関して観察された筋線維鞘優勢と比較して、より分散していた。これは不可解であるが、ジスフェリン欠損マウスにおけるジスフェリン遺伝子付加試験に関して一貫して報告された一般的な観察である（Ｌｏｓｔａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９：１８９７（２０１０）；Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌ．２：２５６（２０１５）；Ｇｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＷＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ３９２３３（２０１２））（図３Ｄ）。

ＡＡＶ－ナノ－ジスフェリンは、全身注入後に運動機能を改善する
ジスフェリン異常症のＢＬＡ／Ｊマウスモデルは、およそ１２月齢において、運動チャレンジ（ｍｏｔｏｒ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）および獲得の感覚（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）に応じて、有意に現れる軽度の運動欠陥のみを有し、ヒトの状態とは異なる（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：ｅ１３１７３（２０１７））。一貫して、ヒトジスフェリン異常症は、人生のより初期の正常または実に高められた運動競技熱とともに、通常、１２才の後に明らかになる。診断のタイミングおよびその後のヒト治療的な処置ウインドウを模倣する試みにおいて、ＢＬＡ／Ｊマウスを、１ｅ^１１ウイルスゲノムの投与量で、ＡＡＶ９－ＪｅＴ－ナノジスフェリン（ｎ＝６）またはＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰコントロールベクター（ｎ＝４）によって全身的に処置した。筋ジストロフィーにおいてしばしば上昇するマーカーである血液クレアチンキナーゼ活性（Ｃａｂａｎｉｓｓ（１９９０）．Ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ．Ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ Ｈｉｓｔｏｒｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈ．Ｋ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｗ．Ｄ．Ｈａｌｌ，ａｎｄ Ｊ．Ｗ．Ｈｕｒｓｔ，ｅｄｓ．（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ））を、３９週に測定して、ＡＡＶ９－ナノ－ジスフェリンコホートは、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定によって、有意ではないが低減する傾向を示した（ｐ＝０．１３）（図４Ａ）。より高齢のＢＬＡ／Ｊマウスにおける経時的な、腕／頭を空中に保って２本の後足で立つ能力である立ち上がり行動の減少の以前の知見に基づき、このコホートの立ち上がり行動の活性は、４３週齢に、注入後だいたい５ヶ月半後に観察された（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：ｅ１３１７３（２０１７））。データは、ウェルチの補正を伴うｔ検定によって、ＡＡＶ９－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンを受け取ったマウスにおいてのみ１時間以内に平均して＞２００回よりも多く、合計の立ち上がり行動において有意な増大を示す。（ｐ＝０．０３７）（図４Ｂ）。さらに、経時的な立ち上がり行動の能力の分析は、ＡＡＶ９－Ｊｅｔ－ナノ－ジスフェリンを注入されたマウスが疲労せず、一定レベルで立ち上がり行動を維持することを示唆して、一方で、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰが注入されたマウスの能力は、繰り返し測定でＡＮＯＶＡによって分析した場合に経時的に低減した（ｐ＝０．０３９）（図４Ｃ）。水平活性は、最初の３０分にわたって違いを示さなかったが（ｐ＝０．５８）；評価の最後の３０分にわたって、有意でないが（ｐ＝０．１３）、より高い水平活性の傾向が、ｔ検定によって、ナノ－ジスフェリンによって処置されたマウスにおいて観察された。早期の「疲労」に対するこの傾向は、Ｃ５６Ｂ７マウスと比較した場合に、ＢＬＡ／Ｊジスフェリン異常症マウスモデルにおいて観察されている（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：ｅ１３１７３（２０１７））。

ＡＡＶ－ナノ－ジスフェリンは、全身注入後の筋肉完全性を改善する
運動機能に関して上述の全身性に処置されたコホートは、４．５月齢における単回注入後５４週、およそ８ヶ月に屠殺された。エバンスブルー色素を安楽死の前に投与して、損傷した筋肉の指標である色素の取り込みを、全筋肉アッセイにおいて、組織学後に線維ごとの様式で別個に分析した（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：９５９（１９９５））。全筋肉エバンスブルー色素アッセイを、以前に研究でＢＬＡ／Ｊマウスにおいて最も影響を受けると決定された臀筋および腰筋を用いて行なった（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：ｅ１３１７３（２０１７））。このアッセイでは、より高い吸光度は、色素取り込みの増大、および、より多くの筋肉損傷を示す（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：９５９（１９９５））。我々の以前の研究によってＢＬＡ／Ｊマウスモデルにおいて最も影響を受けると考えられた臀筋は（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：ｅ１３１７３（２０１７））、ウェルチの補正を伴うｔ検定によって、コントロールと比較して、ＡＡＶ９－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンによって処置されたマウスにおいて、有意により低いエバンスブルー色素の取り込みを示した（ｐ＝０．０３７）（図５Ｂ）。一方、腰筋の分析は、ウェルチの補正を伴うｔ検定によって、コントロール（ｎ＝４）と比較して、ＡＡＶ９－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンによって処置されたマウス（ｎ＝６）において、減少されたエバンスブルー色素の全筋肉の取り込みの有意でない傾向を示した（ｐ＝０．１１）（図６Ａ～６Ｂ）。エバンスブルー色素の全筋肉の分析を確認するために、エバンスブルー色素陽性の線維を、組織学後に直接カウントして、全線維に対して標準化して、ＡＡＶ９－Ｊｅｔ－ナノ－ジスフェリンによって処置された筋肉は、エバンスブルー色素陽性の線維のほぼ有意な（ｐ＝０．０５６）減少を示した（図５Ｃ）。筋肉再生およびターンオーバーの指標である中央に核のある線維もまた、ＡＡＶ９－Ｊｅｔ－ナノ－ジスフェリンによって処置された臀筋において、有意ではないが強い減少傾向を明らかにした（ｐ＝０．０８３５）（図５Ａ）。全中心核／全線維も評価して、処置間で有意差は見られなかった（図６Ａ～６Ｂ）。筋線維の健康のさらなる尺度として、臀筋の線維サイズを、小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）レクチンによって染色された筋肉断面由来の最小Ｆｅｒｅｔ径によって測定して（Ｂｒｉｇｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．１４：６７５（２００４））、ＩｍａｇｅＪを用いて分析した。過去の試験は、野生型遺伝的背景マウスと比較した場合、ジスフェリン－ヌルマウスの筋肉における平均線維サイズの低減および変動性の増大を見いだした（Ｂａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３：１６８（２００３）。本結果は、全身性に処置された、ＡＡＶ９－Ｊｅｔ－ナノ－ジスフェリンによって処置されたマウス由来の筋線維が、ＧＦＰ－マウス－処置の筋線維よりも有意に大きいことを見いだして（ｐ＜０．０００１）（図５Ｄ）、線維サイズ分布グラフは、ＡＡＶ９－Ｊｅｔ－ナノ－ジスフェリンによって処置されたコホートにおいて右にシフトした正規分布曲線を示した（図７）。以前の研究（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：ｅ１３１７３（２０１７））での、臀筋において観察された有意な脂肪浸潤を考慮して、脂質のオイルレッド染色を臀筋断面において行ない、染色の徹底的な低減を観察して、ＡＡＶ９－Ｊｅｔ－ナノジスフェリンによって処置されたマウスの臀筋における、より少ない脂質蓄積を示唆した。完全性の改善をもたらす臀筋におけるナノ－ジスフェリン生産の程度を決定するために、ウエスタンブロットを行なったが、ナノ－ジスフェリンは、このアッセイによる検出限界よりも低く、これらのブロットは陰性であった。この後に、筋肉断面に対して蛍光免疫染色を行ない、小麦胚芽アグルチニンレクチンを、筋肉の筋線維鞘を染色するために用いた。発現は、筋線維のおよそ１０％において明らかであった（ナノ－ジスフェリン全線維、ｎ＝２５６；未処置の全線維、ｎ＝１８５）（図８）。ナノ－ジスフェリンの存在も、ＲＴ－ｑＰＣＲによって、処置されたマウスの臀筋において確認した（図９Ａ～９Ｂ）。ナノ－ジスフェリンは、筋線維鞘局在の傾向があると考えられて、一部のタンパク質は、ＩＭ注入（図３）およびいくつかの以前の報告（Ｌｏｓｔａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９：１８９７（２０１０）；Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌ．２：２５６（２０１５）；Ｇｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＷＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ３９２３３（２０１２））と同様に、明らかに細胞基質の全体にわたって局在した。

考察
ＡＡＶによって仲介される遺伝子療法は、現在のところ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびジスフェリン異常症のような疾患を治療するための有望な方法であると考えられている（Ｌｏｓｔａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９：１８９７（２０１０）；Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌ．２：２５６（２０１５）；Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１：２２０５（２０１３）；Ｇｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＷＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ３９２３３（２０１２））。しかしながら、これらの筋消耗の疾患の両方とも、ＡＡＶベクターの主な欠陥を強調し：ウイルスキャプシドは小さすぎて、単純な遺伝子付加ストラテジーのために全長ｃＤＮＡをパッケージすることができない（Ｐｒｙａｄｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．２：１５００９（２０１５））。この制限を克服するために、我々およびその他は、多数のＡＡＶキャプシドが大きな遺伝子の部分を核へ送達する能力を研究して、ここで、宿主のＤＮＡ損傷応答は、大きな遺伝子の再建に関する可能性を仲介する（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：８０（２０１０）；Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１：２２０５（２０１３）；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１８：８７（２０１０）；Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１８：７５（２０１０））。興味深いことであるが、ＡＡＶの大きな遺伝子の送達に関するこれらのＤＮＡ修復依存性の多数のベクターのフォーマットは（Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１８：６（２０１０））、無傷のトランスジェニックゲノムを有する単一のＡＡＶ粒子と比較して、劇的に減少された形質導入効率に悩まされる（Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１：２２０５（２０１３）；Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ４：ｅ７７０５（２００９））。単一細胞を感染する１つの粒子に理論的に依拠する単一粒子ＡＡＶ遺伝子付加ストラテジーとは異なり、ＡＡＶオーバーサイズの遺伝子形質導入は、特に全身性に送達される場合に、非常に非効率である（Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１：２２０５（２０１３）；Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ４：ｅ７７０５（２００９））。これは、主に、（１）いくつかの異なるベクターゲノムが、単一の核内で脱コーティングされる必要性、および（２）非相同末端結合に向かう傾向がある、筋線維のような非分裂細胞における非効率な相同性に向けられた修復（それにより、異常な非機能性かつ潜在的に免疫原性の導入遺伝子産物が生じる）のせいである。オーバーサイズのＡＡＶ形質導入アプローチの低減された効率に起因して、（単一粒子ＡＡＶ形質導入と比較して）より高い効果的な投与量が必要とされる（Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１：２２０５（２０１３））。多くの場合において、ウイルスの用量の増大は、望ましくない免疫学的合併症を生じさせて治療的失敗をもたらすことによって、問題を悪化させる。さらに、単一のＡＡＶベクター形質導入のみを必要とする他の筋肉疾患に関する臨床グレードＡＡＶベクター製剤の現在の生産力価は、治療され得る患者数を限定する重大な制限である。ＡＡＶの大きな遺伝子の形質導入に関するこれらの２つの主な関心事にもかかわらず、ジスフェリン欠損マウスにおける前臨床データは、ジスフェリン異常症の治療のためのＡＡＶオーバーサイズの形質導入の使用を提唱するフェーズ１臨床試験に関するジスフェリン異常症患者の動員をもたらしている（Ｇｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＷＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ３９２３３（２０１２））。とりわけ、これは、単一細胞の多数のベクター形質導入、および、臨床成功のための筋線維における相同性に向けられた修復に関する患者のＤＮＡ損傷応答の能力に意図的に依拠する最初のＡＡＶ試験である。ジスフェリン異常症を有する患者に代替の治療ストラテジーを提供するために、我々は、ＤＭＤ共同体との先例に従って（ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｓｕｉｔ ｗｉｔｈ）、単一ＡＡＶベクターゲノムのパッケージングおよび形質導入を受け入れることが可能な、小型のジスフェリン様のオープンリーディングフレームであるナノ－ジスフェリンを合理的に設計した。

一般に、Ｃ２ドメインは、リン脂質膜の内葉に結合することのできるモジュール式タンパク質ドメインである（Ｄａｖｌｅｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２６３８６（１９９３））。ほとんどのＣ２ドメインは、Ｃａ^２＋－依存性の様式で膜に結合するが、そうでないものが一部存在する。野生型ジスフェリンは７つのタンデムＣ２ドメインを保有し、それぞれが長いリンカーによって分離されている（Ａｂｄｕｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１０６：３８２（２０１４））。より小型のジスフェリンタンパク質の構築における我々の中心的な仮説は、多数のタンデムＣ２ドメインが、タンパク質全体の膜結合の結合活性に対して個々に寄与するということである。したがって、より少ないドメインが膜に結合してもなお、それらの機能を依然として提供するが、無傷のＡＡＶパッケージングを受け入れることによって治療的利益を提供することができるポイントがあるはずである。このストラテジーは、Ｃ２ドメインを作り上げるものについて知識を与える。ジスフェリンの全体的なサイズを最小化する他の試みが存在している（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：７７（２０１１））；しかしながら、これらの実験は、Ｃ２ドメインの構造の徹底的な理解をせずに行なわれた。明確なドメインの定義がないと、単一の折り畳まれたドメインの、折り畳まれた意図しないトランケーションでさえ、タンパク質全体をミスフォールドし得て、それにより、分解、機能喪失、または凝集さえもたらす。いくつかの構築物を試験した後に、我々は、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｇ、および膜貫通ドメインに加えて、アミノ末端Ｃ２ドメイン、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、およびＣ２Ｃをそれらのドメイン内リンカーとともに維持することが、ジスフェリン欠損マウスモデルにおけるジスフェリン機能の不存在に関して、分子補正をもたらすことを発見した。

ＡＡＶのトランスジェニックＤＮＡパッケージングの制限（＜５ｋｂ）は、全長ジスフェリンｃＤＮＡのパッケージングを妨げるだけでなく、ナノ－ジスフェリン発現に関する我々のプロモーターサイズも制限する。パッケージされたＡＡＶゲノムの実験は、ＪｅＴプロモーターから発現されたナノ－ジスフェリン（４，８４９ｎｔ）は、単一種としてパッケージされて；対照的に、ＣＭＶを用いた場合（５，５９７ｎｔ）、３～５ｋｂの範囲のサイズである異種ＤＮＡ種がキャプシド形成されることを明らかに示した（Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２９７：２１（２００２））（図２Ｃ）。このフラグメントＡＡＶベクターは、ＪｅＴプロモーターと比較した場合、ＣＭＶプロモーターの＞１０倍増大された発現にもかかわらず、ＡＡＶ単一ベクターの形質導入よりも非効率的であった（図２Ｂおよび２Ｄ）。

以前の実験において、我々は、フラグメントＡＡＶオーバーサイズの遺伝子の形質導入は、ＡＡＶの大きな遺伝子の形質導入の他のアプローチよりも良い、または同様であることを示し、それは一般に「デュアルベクター」アプローチと呼ばれる（Ｐｒｙａｄｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．２：１５００９（２０１５）；Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１８：６（２０１０）；Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２１：２２０５（２０１３）によって概説される）。フラグメントＡＡＶおよびデュアルＡＡＶの形質導入効率を調べる我々の公表された研究では、無傷のＡＡＶは、単一のＡＡＶベクターの形質導入に依拠するＡＡＶキャプシドパッケージよりも５～１００倍の効率を維持した。

したがって、インビボ分析に関する我々の焦点は、単一ＡＡＶベクター形質導入に関するＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンカセットに依拠した。本明細書における我々の努力の限界は、無傷のゲノムパッケージングに必要とされる場合に、ＪｅＴプロモーターは小さくて、さらに相対的に弱くて事実上遍在することであり、それは、骨格筋療法によって送達されるＩＶにとって理想的でない（Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２９７：２１（２００２））（図２Ａ～２Ｄ）。現在のところ、小さな筋肉特異的プロモーターＣ２－２７およびＣ５－１２が試験中であり、それは、ＡＡＶコンテキストにおいてナノ－ジスフェリンと組み合わせた場合に、筋肉における有意に高い転写活性を同様に有しながら、無傷のゲノムパッケージングを可能にすると仮定される（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２４１（１９９９））。

ジスフェリン欠損骨格筋への直接のＡＡＶ１－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンの対側投与は、低減されたエバンスブルー色素線維染色によって決定されるように、試験された全てのマウス、および、中央に核のある線維によって試験された１匹を除くすべてのマウスにおいて、筋肉完全性の増大をもたらした（図３Ａ～３Ｂ）。このマウス間の対側の比較は、動物間のジスフェリン表現型（図３Ａ～３Ｂ、黒いバー）が、おそらく環境的コンテキスト（すなわち、特定のマウスに関する個々の活性の増大）に起因して変動したため、重要である。このマウス間の疾患重症度における変動にもかかわらず、結果は、処置された線維のおよそ３０％において、免疫蛍光（ＩＦ）によって明らかな、ナノ－ジスフェリンの結果としての増大した完全性および有意に改善された筋肉表現型を明確に示した（図３Ｃ）。興味深いことに、我々は、遺伝子送達後のナノ－ジスフェリン局在が、ＷＴマウスにおけるネイティブのジスフェリンに関して観察されるように、主に筋線維鞘に制限されないことに注目する（図３Ｄ）。以前の報告（Ｌｏｓｔａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９：１８９７（２０１０）；Ｇｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＷＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ３９２３３（２０１２））によって明らかにされたように、多数のベクターアプローチを介したＷＴジスフェリンの復元もまた異常な細胞内分布をもたらしたので、この結果はナノ－ジスフェリンに特異的でなく依然として不可解である。この異常な局在の理由は、ジスフェリンは分化中に制御されることが示唆されているので、最終分化した筋線維へのジスフェリン（またはナノ－ジスフェリン）の復元に起因すると推測されるが、線維あたりの変更された多さなどの他の理論も考慮される。

奇妙なことに、ヒト患者におけるジスフェリン異常症の発症は、以前は無症状であって運動選手であることの多い個人において、１０代の間に一般に始まる。報告は、これに関する理由は、この期間中の細胞呼吸における酸化から解糖系優勢への代謝スイッチに関与し得ることを示唆している（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｅｘｅｒｃ．Ｓｃｉ．２１：１３０（２００９）；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔ Ｎｕｔｒ．Ｅｘｅｒｃ．Ｍｅｔａｂ．１６：１６６（２００６）；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：３２１（１９９７）；Ｔｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．３２：４１６（２００７）；Ｔｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９４：２７８（２００３））。これは、１５週齢に始まるＢＬＡ／Ｊジスフェリン欠損マウスにおける筋ジストロフィー表現型の出現と一致する（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：ｅ１３１７３（２０１７））。実際に、研究は、ジスフェリン－欠損ＢＬＡ／Ｊマウスおよび一次ヒト筋芽細胞の両方とも、グルコースおよび脂質取り込み／代謝が損なわれていることを見いだした（Ｋｅｌｌｅｒ（２０１４）Ｔｈｅｓｉｓ（Ｂｅｒｌｉｎ：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｓｍｅｄｉｚｉｎ Ｂｅｒｌｉｎ））。さらに、以前の報告は、脂質蓄積が、カルパイノパチー（ｃａｌｐａｉｎｏｐａｔｈｙ）、ＤＭＤ、および筋強直性ジストロフィーのような他の筋ジストロフィーにおいて未だ報告されていない、ヒトおよびＢＬＡ／Ｊマウスジスフェリン異常症において観察される性質であることを示した（Ｇｒｏｕｎｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８４：１６６８（２０１４））。この考えのラインと一致して、我々の以前の研究は、臀筋のＭＲＩ画像における目に見える脂肪浸潤によって、臀筋および腰筋ＢＬＡ／Ｊマウスの筋肉（ＢＬＡ／Ｊマウスモデルにおける最も影響を受けた筋肉）における筋細胞外脂質（ＥＭＣＬ）の増大を見いだした（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：ｅ１３１７３（２０１７））。以前の研究においてＨ＆Ｅによって染色された筋肉断面の分析後、潜在的な脂肪浸潤の違いは、処置間で明らかになった。これを確認するために、我々は、脂質に関するオイルレッドＯ染色を行ない、ＡＡＶ９Ｊｅｔ－ナノ－ジスフェリンによって処置されたマウスにおける脂肪浸潤の徹底的な減少を明らかにした（図５Ｅ）。

本明細書において設計された実験は、単回投与のＡＡＶ９－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリンを用いて、進行性の筋肉疾患をすでに示している６ヶ月の動物を全身性に処理することによって、潜在的臨床状況を模倣することを試みた。盲目実験の結果は、ＡＡＶ９－Ｊｅｔ－ナノ－ジスフェリンによって処置されたＢＬＡ／Ｊマウスが、１時間の評価の間に平均２００回よりも多く立ち上がり、コントロール処置マウスの活性のほぼ２倍の合計であったことを示す。以前の研究において、我々は、ＷＴマウスと比較した立ち上がり行動の不足が経時的に増大することを観察し、ＢＬＡ／Ｊマウスにおける疲労のより早期の発生を示唆した（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：ｅ１３１７３（２０１７））。本明細書における研究は、経時的に分析すると、我々の以前の研究において観察されたように（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：ｅ１３１７３（２０１７））、処置されたマウスの能力が、疲労の補正を強く示唆して、ＷＴマウスのものと同様の立ち上がり行動のレベルを示したので、ＡＡＶ９－Ｊｅｔナノ－ジスフェリンの治療的効果と一致する。治療の将来的な歩行運動の評価のための、この研究とは別の１つのさらなる見解（ｔａｋｅ）は、ＢＬＡ／Ｊマウスの観察された「疲労」を考慮すれば、６０分を超えて活動試験の時間を延ばす歩行運動実験を適切に設計することは、ジスフェリン異常症に関するこのモデルに存在する、より強くてより徹底的な不足を明らかにし得るということである。このことは、将来的な研究において試験される必要がある（図４Ｃ）。

従来のエバンスブルー色素組織学（図５Ｃ）、中央に核のある線維（図５Ａ）、および、Ｆｅｒｅｔ径による半自動化の線維サイズ分析（図５Ｄおよび図７）による、全筋肉アッセイ（図５Ｂ）を用いたエバンスブルー色素取り込みの検死解剖分析は、ＡＡＶ９－Ｊｅｔ－ナノ－ジスフェリンによって処置されたＢＬＡ／Ｊマウスは、最も影響を受けたＢＬＡ／Ｊ筋肉群である臀筋において、筋肉完全性が増大したことと一致して（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：ｅ１３１７３（２０１７））、ここで、筋線維のおよそ１０％が免疫蛍光によってナノ－ジスフェリンに関して陽性に染色されて（図８）、少しのジスフェリン（または、この場合はナノ－ジスフェリン）が、筋肉完全性の維持において十分である（ｇｏｅｓ ａ ｌｏｎｇ ｗａｙ）という観念と一致した（Ｌｏｓｔａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９：１８９７（２０１０））。本明細書におけるいずれの場合においても、ジスフェリン欠損患者の筋芽細胞またはＢＬＡ／Ｊモデルにおける制限されない生産であろうとなかろうと、ナノ－ジスフェリンまたはＡＡＶベクター形質導入に関して毒性を確認しなかった。しかしながら再度、我々は、遍在するＪｅＴプロモーターは相対的に弱く、検出可能であるが低いレベルのナノ－ジスフェリンをもたらすことに注目する。

より強くて筋肉に限定されたプロモーターを用いたさらなる実験が、この結果を確認するために必要である。加えて我々は、単一の新規のエピトープが、Ｃ２Ｄ、Ｅ、およびＦドメインの欠失によって生産されたことに注目し、それは、患者の突然変異の性質に応じて、ナノ－ジスフェリン特異的な細胞介在免疫応答の潜在性を高める。これは、ＤＭＤ患者に対するマイクロ－またはミニ－ジストロフィンの適用、または、無数のあり得る突然変異に起因してジスフェリン異常症患者への全長ジスフェリンの投与にさえも似たシナリオである。これらの標準的な治療的関心事にもかかわらず、ナノ－ジスフェリンは、ジスフェリン欠損マウスにおいて運動機能を復元する、唯一の単一のＡＡＶ－ベクターに適したジスフェリン変異体を表わし、そして、診療所におけるジスフェリン異常症の治療のための魅力的な候補を表わす。

材料および方法
研究設計：本研究は、ジスフェリン異常症に関して治療的なＡＡＶを生産するように設計された。これを試験するために、短縮されたジスフェリン様分子であるナノ－ジスフェリンを作って、ＡＡＶ技術を用いてインビボでの機能を試験した。現在のところジスフェリン異常症の最も良い動物モデルであるＢＬＡ／Ｊマウスを、その臨床的に関連のある表現型の特徴に起因して選択した。全てのマウス実験は、処置のタイプの観点から取扱者に見えないようになされて、統計分析後にのみ結果が見えるようにされた。実験的エンドポイントおよび最初の処置の時点は、ＢＬＡ／Ｊモデルのより早い特性化に基づいた（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：ｅ１３１７３（２０１７））。インビトロ実験を少なくとも離れた２日で繰り返して、それぞれの場合に関して３回のリプリケートを最小限とした。動物実験は、指示されたリプリケート数および持続時間で１回行なわれた。筋肉内の実験のために、同腹子は、対側コントロールによって、無作為に割り当てられた処置を施された。全身性の実験のために、マウスは処置が無作為に割り当てられた。全ての動物相互作用およびデータ収集を行なう研究者は見えないようにされた。αは、有意性に関して伝統的な０．０５に設定された。立ち上がり行動の行動能力アッセイの事後のパワー分析を、Ｇ－Ｐｏｗｅｒ ３．１．９．２ソフトウェアにおいて行なって、１．７７の効果サイズがグループ平均を用いて得られて、それぞれのグループ内の標準偏差は、プールされた標準偏差の等式によって見積もられて、０．７６のパワー（１－ｂ誤差確率）であった。１匹のマウスは、標的化されたＴＡ筋肉内に墨汁が無いことによって証明されるように、誤ったナノ－ジスフェリン注入のせいで筋肉内実験から除外された。全身性の実験では、ナノ－ジスフェリンによって処置された１匹のマウスは、他のナノ－ジスフェリンによって処置されたマウスの全体に関するメジアンの立ち上がり行動の能力の半分未満であったため、異常値として除外された。行なわれた実験全体にわたって、ｐ値における主な変更は、この除外から生じなかった。

ナノ－ジスフェリンの設計：ナノ－ジスフェリン遺伝子は、ドメインＣ２Ａ－Ｃ２ＢＣ２Ｃ－ＦｅｒＡ－ＤｙｓＦ－Ｃ２Ｄ－Ｃ２Ｅ－Ｃ２Ｆ－Ｃ２Ｇ－ＴＭを含む、野生型ジスフェリンアイソフォームの８個のｃＤＮＡ（６，２４０ｎｔ）に基づいた。野生型ドメインは、以下のように利用可能な一次配列の観点から定義された。表２におけるそれぞれのＣ２ドメイン範囲は、予測のｂ鎖含有量、潜在的Ｃａ^２＋－結合残基、Ｃ２ドメイントポロジー、全体的なＣ２ドメインの長さ、および、ドメインのコアの疎水性パッキングの連続性に関して分析された。これが完了した時点で、ジスフェリンは、それぞれのＣ２ドメインのＮ末端リンカーからＣ末端リンカーまで伸びる切除部位を規定することによって、インシリコで編集され得る。全ての省略されたタンパク質構築物は、タンパク質の短い細胞外の部分に加えて、Ｃ２Ａドメイン、ＦｅｒＡドメイン、ＤｙｓＦドメイン、Ｃ２Ｇドメイン、および膜貫通へリックスを維持した。全ての他のＣ２ドメインは不必要であった。最後に、新規のタンパク質に対応する遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによってアセンブルして、ヒト合成のためにコドン最適化した。ナノ－ジスフェリン自体は、４，３５６ｎｔの合計長さのドメインＣ２Ａ－Ｃ２Ｂ－Ｃ２ＣＦｅｒＡ－ＤｙｓＦ－Ｃ２Ｇ－ＴＭを保有する。

細胞株および培地：ＨｅＬａ細胞を免疫蛍光に用いて、１０％ Ｓｉｇｍａウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｆ７５２４）および１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ抗生物質で補充されたＤＭＥＭ中で増殖させた。ジスフェリンエクソン４４：ｃ．４８８２Ｇ＞Ａ ＨＭＺ，ｐ．Ｇ１６２８Ｒホモ接合型突然変異を保有する不死化ヒト患者「ＥＲ」筋芽細胞をＤｒ．Ｅ．Ｇａｌｌａｒｄｏから得て、１５％ Ｓｉｇｍａ ＦＢＳ（Ｆ７５２４）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ由来の２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ（３５０５０）、および、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ由来の１００ｍｇ／ｍＬ Ｐｒｉｍｏｃｉｎ（ａｎｔ－ｐｍ－１）で補充されたＰｒｏｍｏｃｅｌｌ骨格筋細胞増殖培地キット（Ｃ－２３０６０）中で増殖させた。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞をＡＴＣＣから得て（ＣＲＬ１７７２）、１０％ Ｓｉｇｍａ ＦＢＳ（Ｆ７５２４）および１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ抗生物質で補充されたＤＭＥＭ中で増殖させた。ウエスタンブロットおよびＡＡＶベクター生産のために用いたＨＥＫ２９３細胞は、ＡＴＣＣから得られて（ＣＲＬ１５７３）、１０％ Ｓｉｇｍａ ＦＢＳ（Ｆ７５２４）および１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ抗生物質で補充されたＤＭＥＭ中で培養した。

プラスミドおよびウイルス生産：ナノ－ジスフェリンヌクレオチド配列は、我々のアミノ酸配列サブミッションおよびそれらのヒトコドン最適化アルゴリズムに基づきＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって生産された。ＰＣＲサブクローニングは、３Ｘ ＦＬＡＧタグを３^０ＯＲＦに付加して、ナノ－ジスフェリン配列をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位においてｐＳＪＧ－ＪｅＴ－ＧＦＰ－ｓｙｎｐｏｌｙＡ自己相補プラスミド（ノースカロライナ大学［ＵＮＣ］のＤｒ．Ｓ．Ｇｒａｙより寄贈）に移動させた。このカセットをそれから、ＫｐｎＩおよびＭｌｕＩを用いて切除して、末端を平滑化して、それから、ｐＴＲｅＧＦＰの平滑化ＫｐｎＩ／ＳｐｈＩ部位にクローニングした（一本鎖ＡＡＶプラスミド）（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４６４６（１９９６））。それから、この結果として生じるプラスミド上のＡＡＶ２逆位末端配列の間由来の領域を、シーケンシングによって確認した。これらの実験のために、ｐｈｐａＴＲＳＫ－ＣＭＶ－ＧＦＰを用いてＧＦＰコントロールＡＡＶベクターを生産した（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８（２００１））。ウイルスを、ＨＥＫ２９３細胞において三重トランスフェクションプロトコルによって生産した（Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：１４１２（２００６））。この方法は、ｐＸＸ６８０ヘルパー（Ｄｒ．Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉより寄贈）と一緒に、ｐＸＲ１、ｐＸＲ２、およびｐＸＲ９プラスミドを用いた。全てのベクタープレップの力価をサザンドットブロットによって決定して、ｑＰＣＲによって確認した。適切な場合は、パッケージされたゲノム種を、アルカリゲル電気泳動およびＳＹＢＲゴールド染色（Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：１４１２（２００６））によって確認した。

ナノ－ジスフェリンの筋肉内および全身投与：筋肉内実験のために（データは図３Ａ～３Ｄに示される）、ＡＡＶ１ナノ－ジスフェリンまたはＡＡＶ１－ＣＭＶ－ＧＦＰを、６週齢において１回、対側ＴＡ筋肉へ筋肉内注入した。イソフルランによって鎮静されたマウスに、２％墨汁（Ａｍｅｒｉｃａ Ｍａｓｔｅｒ Ｔｅｃｈ Ｃａｔ：ＳＴＩＩＮ２５）を含む、ＴＡあたり投与される５０μｌの合計容量（５ｅ１０合計ウイルスゲノム）で、ＢＤ ８ｍｍ ３１ゲージ針を用いて注入した。全身性実験のために、ＡＡＶ９－ＪｅＴ－ナノ－ジスフェリン（ｎ＝６）またはＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ（ｎ＝４）を、２００μｌ（２ｅ１１合計ウイルスゲノム）の合計容量で、ＢＤ ８ｍｍ ３１ゲージ針を用いて、４ヵ月半の月齢において１回、尾静脈注入によって投与した。

ウエスタンブロット：リポフェクタミン３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ：Ｌ３０００００１）を商品プロトコルに記載のとおりに用いて、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞のトランスフェクション後４８時間に、ＣＭＶナノ－ジスフェリンプラスミドを、ＣＭＶ野生型ジスフェリンと一緒に、ウエスタンブロットによって最初に試験した。哺乳類のタンパク質抽出試薬（ＭＰＥＲ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ：７８５０１）を用いて、全タンパク質溶解物ウエスタンブロットのためにタンパク質を抽出した。単離された細胞質および膜関連タンパク質溶解物を、Ｍｅｍ－ＰＥＲＰｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ：８９８４２）を介して得た。筋肉内および静脈内実験のために、筋肉を採取して、哺乳類のタンパク質抽出試薬プロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ：７８５０１）を続けた。続いて、全タンパク質溶解物を変性させて、５％ β－メルカプトエタノールの最終濃度で４Ｘ ＮｕＰａｇｅ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ：ＮＰ０００８）に添加して、プレキャスト４％～１２％ＢＩＳ－ＴＲＩＳ勾配ゲルで泳動させた（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ：ＮＰ０３２１）。全ジスフェリンおよびナノ－ジスフェリン検出実験は、Ｒｏｍｅｏ一次抗体（Ａｂｃａｍ Ｃａｔ：１２４６８４）を１：２，０００濃度で用いて、その後に二次抗ウサギＨＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ Ｃａｔ：ａｂ６７２１）を１：１０，０００濃度で用いた。Ｓｉｒｉｕｓ化学発光キット（Ａｄｖａｎｓｔａ Ｃａｔ：Ｋ－１２０４３－Ｄ２０）を全てのブロットに関して用いて、ブロットをＡｍｅｒｓｈａｍ Ａ６００撮像装置によって画像化した。

毒性アッセイ：Ｊａｉｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの厚意によるジスフェリン－欠損（ＥＲ）ヒト患者細胞を２４ウェルプレートに蒔いて、１５％ Ｓｉｇｍａ ＦＢＳ（Ｆ７５２４）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ由来の２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ（３５０５０）、および、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ由来の１００ｍｇ／ｍＬ Ｐｒｉｍｏｃｉｎ（ａｎｔ－ｐｍ－１）で補充されたＰｒｏｍｏｃｅｌｌ骨格筋細胞増殖培地キット（Ｃ－２３０６０）中で増殖させた。細胞は、リポフェクタミン３０００が、推奨されるプロトコルを用いてトランスフェクションに用いられた場合、およそ７０％コンフルエントであった。低、中、および高投与量は、０．５ｍｇ、１ｍｇ、および１．５ｍｇのｐＣＭＶ－ＧＦＰ、ｐＣＭＶ－ナノ－ジスフェリン、またはｐＣＭＶ－ジスフェリンのＤＮＡプラスミドから構成された。細胞の培地は、トランスフェクションの２４時間後に交換されて、５０μｌのアラマーブルー細胞生存能力試薬（ＤＡＬ１１００）を、トランスフェクションの４８時間後に各ウェルに添加して；商品プロトコルに従って読み出しを続けた。蛍光プレートリーダーでの分析のために、トランスフェクションの７２時間後に各ウェルから１００μｌの培地を取り出した。

動物および動物管理：全てのインビボ実験に関する対象は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから元々得られたマウスから飼育された、Ｃ５７ＢＬ／６７バックグラウンド上の合計１５匹のＢＬＡ／Ｊマウスであった。筋肉内実験は、等しい数の雄および雌の同腹子を用いた。静脈内実験は、両方の群に関して３匹の雌、ナノ－ジスフェリン群に関して２匹の雄、および、コントロール群に関して１匹の雄を用いた。対象は、換気されたケージ内に群で収容されて、水およびマウス固形飼料に自由にアクセスできた。収容部屋は、午前７時に明かりを付けて１２Ｌ：１２Ｄの概日スケジュールに維持された。全ての試験手順は、「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ，１９９６）を厳密に順守して行なわれて、ＵＮＣのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。

エバンスブルー色素分析：屠殺の４０時間前に、エバンスブルー色素（１０ｍｇ／ｍＬ）を５ｍＬ／ｇ体重でマウスに腹腔内注入した。屠殺の前の最終日にマウスを新しい環境内に収容して、相対的に軽度のジスフェリン欠損表現型を悪化させた。陽性の線維カウントアッセイのために、筋肉を、筋肉全体にわたって少なくとも５００ｍｍ離れた７つの位置の上で１０ｍｍの厚さで横に断面化した。蛍光顕微鏡を用いて、全線維をカウントして、陽性の線維に対して比較した。エバンスブルー色素吸光度アッセイのために、筋肉片を重量によって標準化して、エッペンドルフチューブ内においた。１ｍＬのホルムアミドを添加して、５５℃で２時間インキュベートした。１２，０００ｒｐｍで２分間サンプルを遠心分離してデブリを除去して、上清を、それぞれの筋肉に関してトリプリケートで９６ウェルプレートに添加した。吸光度を６２０ｎｍでプレートリーダーにおいて測定した。１匹の静脈内マウスは、エバンスブルー色素を受け取らず、免疫蛍光染色を定量化するために用いられた。

Ｈ＆Ｅの中心の核形成：上述の筋肉横断面を、ＵＮＣ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ＣｏｒｅによってＨ＆Ｅに関して染色した。中央に核のある線維を、文献（Ｌｏｓｔａｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ３８０３６（２０１２））において以前に評価されたように、面積（ｍｍ^２）に対してカウントした。さらに、合計の中心核に対してカウントされる合計の無傷の線維を比較する、中心の核形成の代替の尺度も評価された（Ｄｕｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｋｅｌｅｔ．Ｍｕｓｃｌｅ ５：１６（２０１５））。

オイルレッドＯ染色：上述の筋肉横断面を、ＵＮＣ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ＣｏｒｅによってオイルレッドＯに関して染色した。

線維サイズ分析：筋肉断面を、ＷＧＡレクチンを用いて染色して、最初にＲＧＢチャネルを分割して、グリーンチャネルによるエッジ検索機能（ｆｉｎｄ ｅｄｇｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用いることによって、ＩｍａｇｅＪで分析した。これの後に、自動Ｈｕａｎｇ閾値を適用して、二成分オプションのオープン機能セットを１０回の反復にわたって「４」カウントで用いた（黒いバックグラウンド）。これの後に、二成分オプションのフィルホール（ｆｉｌｌ ｈｏｌｅ）機能を続けて、残りの開いている線維エッジを手作業で閉めた。これの後に、分析粒子機能を続けて、最小Ｆｅｒｅｔ径の測定をミクロンに変換した。

免疫蛍光：筋肉内および静脈内コホート由来の筋組織を、最適な切断温度（ＯＣＴ）を用いて、液体窒素によって冷却されたイソペンタン中に浸漬することによって、Ｓａｋｕｒａ ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ Ｃｒｙｏｍｏｌｄｓ（ＲＥＦ４５５７）において急速冷凍した。それから、Ｌｅｉｃａ ＣＭ３０５０－Ｓクリオスタットを用いて組織を１０ｍｍでスライスして、８０℃で保管した。それから、室温にて湿度チャンバー内で組織を解凍した。解凍された組織を、４％パラホルムアルデヒド／４％スクロース溶液中で１５分間固定した。それから、ＷＧＡ－Ａｌｅｘａ ４８８コンジュゲートを５０ｍｇ／ｍＬの濃度で用いて室温で１０分間、筋肉を染色した。１０％ＢＳＡを用いて組織をブロックして、Ａｂｃａｍ ａｂ１２４６８４抗－ジスフェリン抗体を１：２００希釈で３７℃にて２時間用いた。二次抗体ヤギ抗ウサギ５９４ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａ１１０３７）を１：１，０００希釈で用いた。Ｈｏｅｃｈｓｔ染色（Ｈ３５６９）を１：１０，０００希釈で室温にて５分間用いた。カバースリップをマウントして、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ－８３蛍光顕微鏡において画像化した。

免疫蛍光の線維カウント：筋肉内実験のために、ナノ－ジスフェリンに関してバックグラウンドより上の線維染色を、ＩｍａｇｅＪ細胞カウンタおよびマルチポイント分析ツールを用いて、線維外形に基づいて、全線維に対して手作業でカウントした。この手順は、ナノ－ジスフェリンおよびその対側ＧＦＰコントロールの両方において行なわれた。それから、ＧＦＰコントロール「偽陽性」も引いて、およそのナノ－ジスフェリン発現を見積もった。ベクター全身性シェディングが、ＡＡＶによる一般的な発生であることを述べるのは価値があり、それは、対側の足の形質導入を説明し得る。全身性の実験のために、予測されるより弱い染色に起因して、１匹の処置されたマウスは、エバンスブルー色素を注入されなかった。この場合、ＷＧＡによって染色された外形は、全線維を決定するために用いられて、それは、観察された合計の陽性の線維を標準化するために用いられた。未処置のコントロールマウスにおいて観察された陽性の線維は、「偽陽性」を引くために用いられた。

クレアチンキナーゼアッセイ：顎下静脈から引いたおよそ２００μＬの血液をＥＤＴＡチューブ内に入れて、１，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、血液固形物を分離した。プロトコルの指示に従ってクレアチンキナーゼ活性比色分析法キット（Ａｂｃａｍ Ｃａｔ：１５５－９０１）を用いて血漿を処理した。サンプルをＰｅｒｋｉｎｓ比色分析プレートリーダーにおいて測定した。

立ち上がり行動の行動アッセイ：マウスが２本足で立つ回数（立ち上がり行動と呼ばれる）を、５分間隔で６０分にわたって定量化した。新規の環境における立ち上がり行動は、光電セルを備えたオープンフィールド自動機（ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ａｕｔｏｍａｔｉｃ）（４１ｃｍ ４１ｃｍ ３０ｃｍ；Ｖｅｒｓａｍａｘ ｓｙｓｔｅｍ，Ａｃｃｕｓｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）において評価された。活性チャンバー自体を、ファンおよびハウスライトを備える消音コンテナー内に置いた。

水平活性の行動アッセイ：マウスの水平活性を、５分間隔で５０分にわたって定量化した。新規の環境における水平活性を、光電セルを備えたオープンフィールド自動機（４１ｃｍ×４１ｃｍ×３０ｃｍ；Ｖｅｒｓａｍａｘ ｓｙｓｔｅｍ，Ａｃｃｕｓｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）において評価した。活性チャンバー自体を、ファンおよびハウスライトを備える消音コンテナー内に置いた。

線維サイズ分析：筋肉断面を、ＷＧＡレクチンによって染色して、最初にＲＧＢチャネルを分割して、グリーンチャネルによるエッジ検索機能を用いることによって、ＩｍａｇｅＪで分析した。これの後に、自動Ｈｕａｎｇ閾値を適用して、二成分オプションのオープン機能セットを１０回の反復にわたって「４」カウントで用いた（黒いバックグラウンド）。これの後に、二成分オプションのフィルホール機能を続けて、残りの開いている線維エッジを手作業で閉めた。これの後に、分析粒子機能を続けて、最小Ｆｅｒｅｔ径の測定をミクロンに変換した（Ｂｒｉｇｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＮＭＤ １４：６７５（２００４）；Ｂａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２３：１６８（２００３）。

ＲＴ－ＰＣＲによる検出：評価されたマウス筋肉由来の抽出された組織をドライアイス内に直ちに保管して、それから、１．５ｍｌエピチューブ内で－８０℃のフリーザー内に保管した。それから、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ：１５５９６０２６）をサンプルに加えて溶かした。機械的な均質化後に、溶解および相分離を商品プロトコルに従って行った。それから、商品プロトコルによってＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ線維組織キット（Ｃａｔ Ｎｏ．／ＩＤ：７４７０４）によってＲＮＡを精製した。逆転写を行なって、Ｒｏｃｈｅ ＵＰＬプライマー設計ライブラリから得られたプライマーｃｃｇａｃａｃｇｃｃｔａｃｃｔｇａｇ（配列番号１３）およびｃｃｇｇｃａｃｔａａａａｔｃｇｔｃａｇ（配列番号１４）を用いて、６０ヌクレオチドのアンプリコンを生産した。サンプルをＥｘｏ－Ｓａｐ－ｉｔ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ７８２００．２００）によって処理して、２％アガロースゲル上で泳動して、続いて画像化した。

前述は本発明の例示であり、その限定と解釈されるべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義されて、特許請求の範囲の等価物はそれに含まれるべきである。

Claims (41)

1. トランケートされた哺乳類ジスフェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
   前記のポリペプチドのＣ２ＤおよびＣ２Ｆドメインのそれぞれにおいて少なくとも９５％のアミノ酸残基は、欠失しており、
   前記のポリペプチドは、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｇ、およびＴＭドメインの少なくとも９５％のアミノ酸残基を含む、または前記のポリペプチドは、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｇ、およびＴＭドメインのそれぞれにおいて少なくとも９５％のアミノ酸残基を含み、前記トランケートされた哺乳類ジスフェリンポリペプチドは、野生型ジスフェリンの生物学的活性の少なくとも約２０％を維持する、
   ポリヌクレオチド。
2. 請求項１のポリヌクレオチドであって、
   前記のポリペプチドのＣ２Ｅドメインの少なくとも９５％のアミノ酸残基は、欠失している、
   ポリヌクレオチド。
3. 請求項１のポリヌクレオチドであって、
   前記ポリペプチドは、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２ＧおよびＴＭドメインを含む、
   ポリヌクレオチド。
4. 請求項１のポリヌクレオチドであって、
   前記ポリペプチドのＣ２Ｄ、Ｃ２ＥおよびＣ２Ｆドメインの各々は、欠失している、
   ポリヌクレオチド。
5. 請求項１のポリヌクレオチドであって、
   前記ポリペプチドは、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２ＧおよびＴＭドメインを含み、前記ポリペプチドのＣ２Ｄ、Ｃ２ＥおよびＣ２Ｆドメインの各々は、欠失している、
   ポリヌクレオチド。
6. 請求項１から５のいずれか一項のポリヌクレオチドであって、
   前記のジスフェリンポリペプチドは、ヒトジスフェリンポリペプチドである、
   ポリヌクレオチド。
7. 請求項１から６のいずれか一項のポリヌクレオチドであって、
   前記のポリヌクレオチドは：
   （ａ）配列番号２または５のいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含むポリヌクレオチド；
   （ｂ）配列番号７または１０のいずれか１つと少なくとも９５％同一のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド；または
   （ｃ）コドン縮退に起因して（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドである、
   ポリヌクレオチド。
8. 請求項１から７のいずれか一項のポリヌクレオチドであって、
   前記のポリヌクレオチドは：
   （ａ）配列番号２または５のいずれか１つと同一の配列を含むポリヌクレオチド；
   （ｂ）配列番号７または１０のいずれか１つと同一のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド；または
   （ｃ）コドン縮退に起因して（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドである、
   ポリヌクレオチド。
9. 請求項１から８のいずれか一項のポリヌクレオチドを含む、
   発現カセット。
10. 請求項９の発現カセットであって、
    前記のポリヌクレオチドは、プロモーターに動作可能に連結される、
    発現カセット。
11. 請求項１から８のいずれか一項のポリヌクレオチド、または、請求項９または１０の発現カセットを含む、
    ベクター。
12. 請求項１１のベクターであって、
    ウイルスベクターである、
    ベクター。
13. 請求項１２のベクターであって、
    アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、
    ベクター。
14. 請求項１から８のいずれか一項のポリヌクレオチド、請求項９または１０の発現カセット、および／または、請求項１１から１３のいずれか一項のベクターを含む、
    形質転換された細胞。
15. 請求項１から８のいずれか一項のポリヌクレオチド、請求項９または１０の発現カセット、請求項１１から１３のいずれか一項のベクター、および／または、請求項１４の形質転換された細胞を含む、
    トランスジェニック動物。
16. トランケートされた哺乳類ジスフェリンポリペプチドであって、
    前記のポリペプチドのＣ２ＤおよびＣ２Ｆドメインのそれぞれにおいて少なくとも９５％のアミノ酸残基は、欠失しており、
    前記のポリペプチドは、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｇ、およびＴＭドメインの少なくとも９５％のアミノ酸残基を含む、または、前記のポリペプチドは、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２Ｇ、およびＴＭドメインのそれぞれにおいて少なくとも９５％のアミノ酸残基を含み、前記トランケートされた哺乳類ジスフェリンポリペプチドは、野生型ジスフェリンの生物学的活性の少なくとも約２０％を維持する、
    ポリペプチド。
17. 請求項１６のポリペプチドであって、
    前記のポリペプチドのＣ２Ｅドメインの少なくとも９５％は、欠失している、
    ポリペプチド。
18. 請求項１６のポリペプチドであって、
    Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２ＧおよびＴＭドメインを含む、
    ポリペプチド。
19. 請求項１６のポリペプチドであって、
    前記ポリペプチドのＣ２Ｄ、Ｃ２ＥおよびＣ２Ｆドメインの各々は、欠失している、
    ポリペプチド。
20. 請求項１６のポリペプチドであって、
    Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ２Ｃ、ＦｅｒＡ、ＤｙｓＦ、Ｃ２ＧおよびＴＭドメインを含み、前記ポリペプチドのＣ２Ｄ、Ｃ２ＥおよびＣ２Ｆドメインの各々は、欠失している、
    ポリペプチド。
21. 請求項１６から２０のいずれか一項のポリペプチドであって、
    前記のジスフェリンポリペプチドは、ヒトジスフェリンポリペプチドである、
    ポリペプチド。
22. 請求項１６から２１のいずれか一項のポリペプチドであって、
    前記のポリペプチドは：
    （ａ）配列番号２または５のいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；または
    （ｂ）配列番号７または１０のいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドである、
    ポリペプチド。
23. 請求項１６から２２のいずれか一項のポリペプチドであって、
    前記のポリペプチドは：
    （ａ）配列番号２または５のいずれか１つと同一の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；または
    （ｂ）配列番号７または１０のいずれか１つと同一の配列を含むポリペプチドである、
    ポリペプチド。
24. 請求項１から８のいずれか一項のポリヌクレオチド、または、請求項９または１０の発現カセットを含む、
    組み換えＡＡＶ粒子。
25. 組み換えＡＡＶ粒子を生産する方法であって、
    ＡＡＶ複製を許容する細胞に、
    （ａ）（ｉ）請求項１から８のいずれか一項のポリヌクレオチドまたは請求項９または１０の発現カセット、および（ｉｉ）逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む、組み換えＡＡＶテンプレート；
    （ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含む、ポリヌクレオチドを；
    前記組み換えＡＡＶテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件下で、提供するステップを含み；
    それにより、前記細胞において組み換えＡＡＶ粒子が生産される、
    方法。
26. 請求項２５の方法であって、
    前記のＲｅｐコード配列およびＣａｐコード配列は、前記組み換えＡＡＶ粒子にパッケージされることができない、
    方法。
27. 請求項２５または２６の方法であって、
    前記のＲｅｐコード配列および／またはＣａｐコード配列は、プラスミドによって提供される、
    方法。
28. 請求項２５または２６の方法であって、
    前記のＲｅｐコード配列および／またはＣａｐコード配列は、ウイルスベクターによって提供される、
    方法。
29. 請求項２８の方法であって、
    前記のウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターからなる群より選択される、
    方法。
30. 請求項２５から２９のいずれか一項の方法であって、
    前記のＲｅｐコード配列は、前記細胞内に安定して組み込まれる、
    方法。
31. 請求項２５から３０のいずれか一項の方法であって、
    前記のＣａｐコード配列は、前記細胞内に安定して組み込まれる、
    方法。
32. 請求項２５から３１のいずれか一項の方法であって、
    前記組み換えＡＡＶテンプレートは、プラスミドまたはウイルスベクターによって提供されて、または、プロウイルスとして前記細胞内に安定して組み込まれる、
    方法。
33. 細胞にジスフェリンを送達するインビトロの方法であって、
    前記細胞を、請求項２４の組み換えＡＡＶ粒子と接触させるステップを含み、
    それにより、前記細胞にジスフェリンを送達する、
    方法。
34. 請求項３３の方法であって、
    前記細胞は、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、生殖細胞、前駆細胞、および、幹細胞からなる群より選択される、
    方法。
35. 哺乳類対象にジスフェリンを投与する方法において使用するための請求項２４に記載の組み換えＡＡＶ粒子を含む医薬組成物であって、
    前記方法は、前記哺乳類対象に、請求項２４の組み換えＡＡＶ粒子と接触された細胞を投与するステップを含み、
    それにより、前記哺乳類対象にジスフェリンを投与する、
    医薬組成物。
36. それを必要とする哺乳類対象においてジスフェリン異常症を治療する方法において使用するための請求項２４に記載の組み換えＡＡＶ粒子を含む医薬組成物であって、
    前記方法は、前記哺乳類対象に、請求項２４の組み換えＡＡＶ粒子と接触された細胞を投与するステップを含み、
    それにより、前記ジスフェリン異常症を治療する、
    医薬組成物。
37. 哺乳類対象にジスフェリンを投与する方法において使用するための請求項２４に記載の組み換えＡＡＶ粒子を含む医薬組成物であって、
    前記方法は、前記哺乳類対象に、請求項２４の組み換えＡＡＶ粒子を投与するステップを含み、
    それにより、前記哺乳類対象にジスフェリンを投与する、
    医薬組成物。
38. それを必要とする哺乳類対象においてジスフェリン異常症を治療する方法において使用するための請求項２４に記載の組み換えＡＡＶ粒子を含む医薬組成物であって、
    前記方法は、前記哺乳類対象に、請求項２４の組み換えＡＡＶ粒子を投与するステップを含み、
    それにより、前記ジスフェリン異常症を治療する、
    医薬組成物。
39. 請求項３５から３８のいずれか一項の使用のための医薬組成物であって、
    前記対象は、ヒト対象である、
    医薬組成物。
40. 請求項３７から３９のいずれか一項の使用のための医薬組成物であって、
    前記ＡＡＶ粒子は、経口、直腸、経粘膜、経皮、吸入、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内、内皮内、関節内投与、および、局所的な四肢灌流からなる群より選択される経路によって投与される、
    医薬組成物。
41. 請求項３７から３９のいずれか一項の使用のための医薬組成物であって、
    前記ＡＡＶ粒子は、骨格筋、平滑筋、心臓、および、横隔膜からなる群より選択される部位に投与される、
    医薬組成物。

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