CZ293947B6 - Způsob přípravy rekombinantních virů a rekombinantní virus - Google Patents

Způsob přípravy rekombinantních virů a rekombinantní virus Download PDF

Info

Publication number
CZ293947B6
CZ293947B6 CZ19991822A CZ182299A CZ293947B6 CZ 293947 B6 CZ293947 B6 CZ 293947B6 CZ 19991822 A CZ19991822 A CZ 19991822A CZ 182299 A CZ182299 A CZ 182299A CZ 293947 B6 CZ293947 B6 CZ 293947B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
baculovirus
genome
recombinant
region
defective
Prior art date
Application number
CZ19991822A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ182299A3 (cs
Inventor
Leblois@Prehaudáhélene
Perricaudetámichel
Vigneáemmanuelle
Yehápatrice
Original Assignee
Gencellása
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9497899&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ293947(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gencellása filed Critical Gencellása
Publication of CZ182299A3 publication Critical patent/CZ182299A3/cs
Publication of CZ293947B6 publication Critical patent/CZ293947B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pens And Brushes (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Řešení se týká způsobu přípravy rekombinantního viru@ Způsob je založen na použití bakuloviruŹ který poskytuje komplementační funkce@ Rovněž se týká konstruktů potřebných pro provádění tohoto způsobuŹ produkčních buněk a také výsledného viruŕ

Description

Způsob přípravy rekombinantních virů a rekombinantní virus
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu přípravy rekombinantních virů. Týká se také konstruktů potřebných k provádění takového způsobu, přípravy buněk a viru připraveného tímto způsobem. Tyto viry mohou být použity jako vektory pro klonování a/nebo expresi genů in vitro, ex vivo nebo in vivo.
Dosavadní stav techniky
Vektory virového původu jsou široce využívány pro klonování, přenos a expresi genů in vitro (pro přípravu rekombinantních proteinů, pro provádění screeningu a testů, pro výzkum regulace genů apod.), ex vivo nebo in vivo (pro vytváření zvířecích modelů, pro terapeutické použití). K takovým virům patří zejména adenoviry, adeno-asociované viry (AAV), retroviry, herpetické viry nebo virus vakcínie.
Virová čeleď Adenoviridae je široce rozšířena u savců a ptáků a patří do ní více než sto sérotypů virů, které jsou tvořeny dvojřetězcovou DNA bez obalu a vytvářejí kapsidu s ikosaherickou symetrií (Horwitz, In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, ed. Virology. Third edition ed. Philadelphia: Raven Publishers, 1996: 2149-2171). Kromě toho, že jsou bezpečné, mají adenoviry ještě široký buněčný tropismus. Na rozdíl od retrovirů, jejichž životní cyklus je závislý na buněčném dělení, mohou infikovat jak aktivně se dělící buňky, tak i klidové buňky, a jejich genom je udržován v episomické formě. Navíc mohou být produkovány ve velmi vysokém titru (1011 píu/ml). Tyto hlavní vlastnosti z nich činí zvláště výhodný vektor pro klonování a expresi heterologních genů. Skupina C adenovirů, zvláště typy 2 a 5, a také psí adenovirus typu CAV-2, jehož molekulární biologie je nejlépe známa, jsou zdroji vektorů dnes běžně používaných.
Adenovirus má lineární genom velikosti 36 kb, který je zakončen na každém konci invertovanou terminální repeticí (ITR), což je sekvence velikosti 103 bp obsahující replikační počátek, a obsahuje také enkapsidační signál situovaný v blízkosti levé ITR (Shenk, Adenoviridae: The Viruses and Their Replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, ed. Virology. Philadelphia: Raven publishers, 1996: 2111-2148). V průběhu životního cyklu viru jsou exprimovány tři rodiny genů:
Bezprostředně časné geny („immdiate-early genes“, El, E2, E3 a E4), které se účastní regulace buněčných genů, zejména umožňují vstup buňky do S fáze buněčného cyklu (E1A) a inhibují apoptózu (E1B). Podílejí se také na regulaci časných nebo pozdních virových genů na úrovni transkripce, sestřihu nebo transportu (ElA, E2A, E4) mRNA (messenger RNA). Hrají také roli při replikaci a při úniku imunitní odpovědi.
Opožděně časné geny („delayed-early genes“, pIX a IVa2) jsou spojeny s regulací transkripce pozdních genů (IVa2) nebo s vytvářením virionů (pIX).
- Pozdní geny („latě genes“, LI až L5) jsou transkribovány ze silného promotoru (MLP). Primární transkript velikosti 28 kb umožňuje vytvářet transkripty odpovídající různým strukturním proteinům (jaderný protein, penton, hexon) a nestruktumím proteinům podílejícím se na vytváření a zrání virových částic, tak, že dochází k alternativnímu sestřihu s využitím 5-polyadenylačního místa.
Adenovirové vektory byly využity pro klonování a expresi genů in vitro (Gluzman et al., Cold Spring Harbor, New York 11724, p. 187), pro vytvoření transgenních zvířat (WO95/22616), pro přenos genů do buněk ex vivo (WO95/14785; W095/06120) a pro přenos genů do buněk in vivo (viz zejména WO93/19191, WO94/24297, W094/08026).
-1 CZ 293947 B6
Pokud se týká adeno-asociovaných virů. AAV, jsou to relativně malé DNA viry, které se integrují do genomu buněk, které infikují, stálým a relativně místně-specifickým způsobem. Jsou schopny infikovat široké spektrum buněk, aniž by nějak ovlivnily buněčný růst, diferenciaci a morfologii. Zdá se, že se dosud u nich neprojevily žádné patologické účinky na člověka. Genom AAV byl klonován, sekvencován a popsán. Obsahuje asi 4 700 bází a na každém konci má úsek ivertované terminální repetice (ITR) velikosti 145 bp, který slouží jako replikační počátek pro virus. Zbytek genomu je rozdělen do dvou nezbytných částí nesoucích enkapsidační funkci: levá část genomu obsahuje gen rep účastnící se virové replikace a exprese virových genů a pravá část genomu obsahuje gen cap, kódující proteiny virové kapsidy.
Použití vektorů odvožených od AAV pro přenos genů in vitro a in vivo bylo již popsáno (zvláště viz WO91/18088; WO93/09239; US 4 797 368, US 5 139 941, EP 488 528).
Retroviry jsou integrativní viry, které selektivně infikují dělící se buňky. Představují proto zajímavé vektory pro použití např. v léčbě rakoviny nebo restenóz. Genom kódujících úseků (gag, pol a env). Konstrukce rekombinantních vektorů a jejich použití in vitro a in vivo bylo již podrobně popsán, viz např. Breakfield et al., New Biologist3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bemstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689).
Z virů již byly připraveny různé konstrukty pro použití jako rekombinantní vektory obsahující různé požadované geny. V každém z těchto konstruktů byl virový genom modifikován tak, aby virus nebyl schopen autonomní replikace v infikovaných buňkách. Takže dosud známé konstrukty odpovídající dosavadnímu stavu techniky jsou viry, které jsou defektní v určité oblasti svého genomu, která je nezbytná pro replikaci. Konkrétně pokud se týká adenovirů, první generace konstruktů měla deleci v úseku El nebo deletovaný celý úsek El, který je nezbytný pro virovou replikaci, a to v místě, kde byla vložena heterologní sekvence DNA ((Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). Kromě toho pro zlepšení vlastnosti takového vektoru bylo navrženo vytvořit jiné delece nebo modifikace adenovirového genomu. Tak byla např. vnesena teplotně senzitivní mutace do mutantatsl25, což umožnilo inaktivovatDNA vazebný protein (DBP) velikosti 72 kD (Van der Cliet et al., 1975). Jiné vektory obsahují delece jiných oblastí nezbytných pro virovou replikaci a/nebo šíření, a sice oblasti E4. Adenovirové vektory, které mají odstraněné oblasti Ela E4, mají značně redukovaný transkripční „šum“, a také expresi virových genů. Takové vektory byly např. popsány v patentových přihláškách WO94/28152, WO95/02697, WO96/22378. Byly také popsány vektory nesoucí modifikace na úrovni genu IVa2 (W096/10088). Kromě toho byly také popsány (WO94/12649, WO94/28152, WO95/02697) tzv. „minimální adenoviry“ nebo „pseudoadenovirové“ vektory (alternativně AdA) obsahující pouze úseky nezbytné v cis pro produkci viru (ITR a enkapsidační sekvence) a postrádající jakoukoliv virovou kódující sekvenci, ačkoliv příprava takových vektorů je obtížná, jak bude vysvětleno dále.
Pokud se týká AAV, popisované vektory obecně postrádají celou kódující oblast Rep a Cap, které jsou nahrazeny požadovanou nukleovou kyselinou.
V rekombinantních vektorech odvozených z retrovirů jsou obecně odstraněny geny gag, pol a env, buďto částečně, nebo úplně, a jsou nahrazeny heterologní sekvencí požadované nukleové kyseliny. Kromě toho rekombinantní retroviry mohou obsahovat modifikace na úrovni LTR k potlačení transkripční aktivity a na úrovni velké enkapsidační sekvence, obsahující část genu gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639).
Vzhledem k jejich defektnímu charakteru ve vztahu k replikaci, příprava těchto různých rekombinantních virů zahrnuje možnost transkomplementace funkcí odstraněných z genomu. A právě transkomplementace je zdrojem hlavních potíží při přípravě těchto virů, zvláště pak poskytování transkomplementačních funkcí.
-2CZ 293947 B6
Byly vyvinuty dva přístupy řešení tohoto problému, první je založen na konstrukci transkomplementačních linií, čili v podstatě enkapsidačních linií. Druhý přístup je založen na použití pomocného („helper“) adenoviru nebo pomocného plazmidu.
Byly zkonstruovány různé enkapsidační linie různých defektních virů. Tyto linie jsou schopné poskytnout funkci, která chybí virovému vektoru. Obecně tyto linie obsahují, integrované ve svém genomu, úseky odstraněné z virového genomu (tedy např. El, E2 a/nebo E4 u adenovirů, gag, pol a/nebo env u retrovirů a rep a/nebo cap u AAV).
Jedna linie, známá tím, že produkuje defektní adenoviry, je linie 293, do které byla integrována část adenovirového genomu. Podrobněji řečeno, linie 293 je linie buněk lidských embryonálních ledvin, která obsahuje levý konec (asi 11 až 12 %) genomu adenoviru sérotypu 5 (Ad5), obsahující levou ITR, enkapsidační úsek, úsek El, včetně Ela a Elb, úsek kódující protein pIX a část úseku kódujícího protein pIVa2. Tato linie je schopna transkomplementovat rekombinantní adenovirus defektní v úseku El, čili postrádající buď celý úsek El, nebo jeho část, a produkovat virus s vysokým titrem. Tato linie je také schopna produkovat v permisivní teplotě (32 °C) virus, obsahující navíc teplotně sensitivní mutaci E2. Byly popsány i další buněčné linie schopné komplementovatEl, založené na lidských buňkách plicního karcinomu A549 (WO94/28152) nebo lidských retinoblastech (Hum. Gen. Ther. (1996)215). Byly také popsány linie schopné komplementovat několik funkcí adenovirů. Zejména je třeba uvést linie komplementující úseky El a E4 (Yeh et al., J. Virol. 70 (1996) 559; Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 322; Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) a linie komplementující úseky El a E2 (WO94/28152, WO95/02697, WO95/27071).
Byly také popsány různé linie produkující defektní retroviry, obecně schopné exprimovat geny gag, pol a env. K takovým liniím patří např. linie PA317 (US 4 861 719), linie PsiCRIP (W090/02806), linie GP+envAm-12 (W089/07150) nebo linie BOSC (WO94/19478) a další. Pro konstrukci rekombinantních retrovirů obsahujících požadovanou nukleovou kyselinu, je třeba zkonstruovat plazmid obsahující zejména LTR, enkapsidační sekvence a danou nukleovou kyselinu, a pak užít tento konstrukt pro transfekci enkapsidační linie, jak byla popsána výše, schopné poskytnout v trans retrovirové funkce chybějící v plazmidu. Produkované retroviry jsou pak purifikovány obvyklou technikou.
Použití linií však má určité nevýhody. Tak např. je obtížné, drahé a značně omezující konstruovat a ověřovat takové linie v průmyslovém měřítku, přitom tyto linie by vskutku měly být slučitelné s průmyslovým využitím. Kromě toho tyto linie zamezí produkci replikujících se kontaminujících virů (RCA). Navíc tyto linie v současné době neumožňují komplementovat v měřítku dostatečném pro průmyslové využití vysoce defektní viry, jako jsou např. minimální adenoviry popsané výše. Skutečně adenoviry mají genom organizovaný do různých transkripčních jednotek, jejichž časoprostorová regulace je velice složitá. Nebylo proto dosud možné provádět dostatečně transkomplementaci adenovirů, ve kterých byly odstraněny všechny virové kódující sekvence, tím, že by se separátně exprimovaly všechny transkripční jednotky buďto konstitutivním, nebo podmíněným způsobem, pomocí buněčné linie. Takže dosud pouze malé úseky genomu odpovídající úsekům El, E4 a pIX, a třem proteinům kódovaným E2 (pol, DBP, p-TP) byly konstitutivně exprimovány pomocí buněčných linií. Zbytek genomu odpovídá hlavní pozdní transkripční jednotce (MLTU), která produkuje všechny transkripty pro strukturní i nestruktumí proteiny z primárního transkriptu velikosti 28 kb a je aktivována po replikaci genomu. Pro vytvoření minimálního adenoviru je transkomplementace těchto úseků nezbytná.
Druhý přístup spočívá ve společné transfekci (kotransfekci) defektním virovým genomem a konstruktem (plazmidem nebo adenovirem) poskytujícím komplementační funkce. Obecně se připravují zejména defektní rekombinantní AAV v buněčné linii infikované lidským pomocným virem (například adenovirem) kotransfekci plazmidem obsahujícím požadovanou nukleovou sekvenci ohraničenou dvěma úseky invertované terminální repetice (ITR) z AAV a plazmidem nesoucím AAV komplementační funkce (geny rep a cap). Varianty byly popsány v přihláškách
-3CZ 293947 B6
WO95/14771; WO95/13365; WO95/13392 nebo WO95/06743. Nevýhoda použití pomocného adenoviru spočívá hlavně ve zvýšeném riziku rekombinace mezi adenovirovým vektorem s pomocným adenovirem, a tak v obtížnosti oddělit rekombinantu od pomocného viru během produkce a purifíkace virových kmenů. Nevýhoda použití pomocného plazmidu například plazmidu Rep/cap, spočívá v získaném stupni transfekce, který neumožňuje produkovat vysoké titry viru.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje nový systém pro produkci virů, který umožňuje překonat výše zmíněné nevýhody. Systém podle vynálezu je založen na tom, že pro poskytnutí komplementačních funkcí se používá bakulovirus.
Produkční systém podle vynálezu umožňuje obejít se, a to obzvláště výhodným způsobem, bez použití zavedených komplementačních linií, vyhnout se problémům s RCA a transkomplementovat vysoce defektivní genomy. Kromě toho je systém podle vynálezu použitelný pro každou buňku schopnou infekce požadovaným virem a bakulovirem, a tedy nabízí velmi flexibilní použití.
První předmět vynálezu tedy spočívá ve způsobu přípravy defektivních rekombinantních virů, podle kterého je zaveden do populace komplementních buněk genom defektivního rekombinantního viru a bakulovirus obsahující všechny nebo některé funkce nutné pro transkomplementaci defektního rekombinantního genomu.
Způsob vynálezu je tudíž založen na použití bakuloviru pro zajištění komplementačních funkcí. Jsou možné různé přístupy. Především je možné použít komplementní buňky, které neexprimují žádnou transkomplementační funkci defektního rekombinantního genomu. V tomto případě je možné použít buď bakulovirus obsahující všechny funkce nezbytné pro transkomplementaci defektního rekombinantního genomu, nebo několik bakulovirů, z nichž každý nese jednu nebo více funkcí nezbytných pro transkomplementaci defektního rekombinantního genomu. Je také možné použít populaci komplementních buněk, které jsou samy již schopné transkomplementovat jednu nebo více funkcí defektního rekombinantního genomu (enkapsidační linie). V tomto případě použitý(-é) bakulovirus(-y) zajistí pouze funkce nezbytné pro transkomplementaci defektního rekombinantního genomu, které ještě nejsou transkomplementovány kompetentními buňkami.
Jak bylo již uvedeno výše, mnohé výhody systému podle vynálezu jsou významné jak pro průmyslovou využitelnost (žádná potřena linií, žádné kontaminující viry, RCA, apod.), tak pro aplikace (produkce rekombinantních virů nesoucích jakýkoliv typ delece, zejména vysoce defektních rekombinantních adenovirů). Navíc, jelikož se bakulovirus nereplikuje v lidských buňkách, získané virové přípravky nejsou bakulovirem kontaminovány. Kromě toho je bakulovirus fylogeneticky od adenovirů velmi vzdálený, tudíž mezi těmito viry není žádné riziko rekombinace nebo transkomplementace. tento systém tedy umožňuje produkovat výhodným způsobem koncentrované kmeny defektních virů, bezRCA. Systém je nejvýhodnější zejména pro produkci defektních rekombinantních adenovirů.
Bakuloviry jsou opouzdřené, cirkulámí dvojřetězcové DNA viry specifické pro obratlovce. Jejich prototyp, AcNPV, má genom velikosti 133 kb. Je široce používán jako vektor pro expresi eukaryotických genů v hmyzích buňkách, začínající dvěma silnými promotory [polyhedrin (Ph) aPlO], (King a Possee, The baculovirus expression systém, london: Chapman & Halí, 1992). AcNPV je schopný infekce některých savčích buněk, ale genom není ani transkribován ani translatován. Nedávno Hofmann et al. (PNAS 92 (1995) 10099) ukázali, že hepatocyty mohou být in vitro transdukovány purifikovaným rekombinantním bakulovirem exprimujícím gen LacZ. Buněčná toxicita nebyla popsána, ani při násobku infekce 1000, a účinnost transfekce popsaná v tomto článkuje přibližně 50 % pro MOI 100.
-4CZ 293947 B6
Původce nyní ukázal, že je možné infikovat různé buněčné typy rekombinantními balukoviry. Původce konkrétně ukázal, že rekombinantními bakuloviry bylo možné infikovat buňky lidského původu, jako jsou imortalizované embryonální buňky. Původce ukázal také, že je možné získat velmi vysokou účinnost transdukce (> 80 %). Původce také ukázal, že je možné do bakuloviru zavést funkce pro komplementaci adenoviru a exprimovat tyto funkce v populaci kompetentních buněk. Původce tedy poskytl důkaz, že bakulovirus tvoří inertní vektor, který může být výhodně použitý pro přenos a expresi virových komplementačních funkcí do savčích, zejména lidských buněk, dalšími výhodami systému vynálezu jsou zejména:
i) velká klonovací kapacita, která umožňuje komplementovat celý adenovirový genom, a ii) pokročilý rozvoj technologie bakulovirů.
Bakulovirus nesoucí funkce pro komplementaci viru je v následujícím textu označován také pomocný bakulovirus. Může obsahovat různé funkce pro komplementaci viru.
Tak pomocný bakulovirus může obsahovat úsek El adenoviru. Bakulo-El může být použit pro produkci první generace adenovirů, tj. adenovirů defektních pro úsek El (AdAEl), bez ohledu na stav jejich E3 (tj. defektní AdAEl, ΔΕ3, či nikoliv). Produkce první generace defektních rekombinantních adenovirů (defektních v úseku El a případně E3) tvoří první obzvláště výhodnou aplikaci způsobu podle vynálezu. Jak je uvedeno výše, v literatuře byly popsány různé linie, které jsou schopné transkomplementace funkce El (buňky 293, buňky A549, buňky 911, apod.). Ale mezi úsekem nesoucím transkomplementační funkce, které jsou integrovány do genomu linie, a DNA rekombinantního viru, kterou je žádoucí produkovat, existují různé oblasti homologie. Proto mohou nastat během produkce různé rekombinance, vytvářející replikativní virové částice, zejména typu E1+ adenovirů. Může to být jediná rekombinantní událost následované zlomem chromozomu, nebo dvojitá rekombinace. Tyto dva typy modifikace vedou k reintegraci úseku El obsaženého v buněčném genomu do jeho počátečního lokusu v adenovirovém genomu. Navíc při daných vysokých titrech rekombinantního vektoru, které jsou produkovány linií 293 (větší než 1012), je vysoká pravděpodobnost, že tyto rekombinantní jevy nastanou. Bylo vskutku pozorováno, že četné série defektivních rekombinantních adenovirových vektorů první generace byly kontaminovány replikativními virovými částicemi, které tak mohou představovat hlavní nevýhodu pro farmaceutické použití. Výskyt takových částic v terapeutických přípravcích by vskutku mohl vyvolat in vivo nekontrolované rozmnožování viru a jeho šíření s rizikem zánětlivé reakce, rekombinace apod. Kontaminované série pak nemohou být použity v humánní terapii.
Předkládaný vynález umožňuje překonat tyto nevýhody. Vskutku v jednom provedení způsobu podle vynálezu je genom rekombinantního adenoviru defektivního v úseku El, a případně E3, zaveden do kompetentních buněk, tyto buňky jsou infikovány, simultánně či jinak, bakulovirem obsahujícím úsek El, přičemž úsek El adenoviru přítomný v bakuloviru a genom defektního rekombinantního adenoviru neobsahují žádnou oblast homologie (překryvu) schopnou vyvolat rekombinaci. Podle tohoto provedení je tedy možné rychle produkovat, bez potřeby zavedené linie, kmeny pevní generace rekombinantních adenovirů prostých RCA. Kromě toho, jak je uvedeno níže, kmeny takto vzniklých rekombinantních adenovirů prostých RCA, mohou být použity jako počáteční materiál pro novou produkci společnou infekci kompetentních buněk bakulovirem.
Pomocný bakulovirus může také obsahovat úsek E2 adenoviru, úplný nebo částečný, zejména úsek E2 a/nebo E2b. Bakulo-E2 může být použit pro produkci adenovirů defektních v seku E2 (Ad-AE2) a případně v úseku E3 (Ad-AE2,AE3) v kompetentních buňkách. Navíc v kompetentních buňkách schopných komplementace úseku El adenoviru může bakulo-E2 umožnit produkci rekombinantních adenovirů defektních v úsecích El a E2 (Ad-AE1,AE2) a případně E3 (AdAEl, ΔΕ2,ΔΕ3). Podobně v kompetentních buňkách schopných komplementace úseků El a E4
-5CZ 293947 B6 adenoviru (například v buňkách IGRP2) může bakulo-E2 umožnit produkci rekombinantních adenovirů defektních v úsecích El, E2 a E4 (Ad-AE1,AE2,ÁE4) a případně E3 ( Ad-ΔΕΙ,ΔΕ2,ΔΕ3,ΔΕ4).
Pomocný bakulovirus může také obsahovat úsekE4 (úplný nebo část) adenoviru. Bakulo-E4 může být použit pro produkci, adenovirů defektních v úseku E4 (Ad-AE4) a případně v úseku E3 (Αύ-ΔΕ4,ΔΕ3) v kompetentních buňkách. Navíc v kompetentních buňkách schopných komplementace úseku El adenoviru může bakulo-E4 umožnit produkci rekombinantních adenovirů defektních v úsecích El a E4 (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ4) a případně E3 (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ4,ΔΕ3).
Pomocný bakulovirus může také obsahovat úseky El a E4 (úplné nebo části) adenoviru. Baculo-E1,E4 může být použit ktomu, aby v kompetentních buňkách produkoval adenoviry defektních v úsecích El a E4 (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ4) a případně E3 (Ad-AEl,AE4,z\E3), jak je uvedeno na obrázku 1.
Kromě toho je také možné, aby vznikly viry defektní v úsecích El a E4, použít dva pomocné bakuloviry, jeden exprimující funkci El a druhý funkci E4, úplně nebo částečně.
Stejně tak může pomocný bakulovirus obsahovat úseky El, E2 a E4 (úplně nebo části), a případně úseku nesoucí pozdní geny (LI a L5).
Pomocný bakulovirus může také obsahovat úseky AAV Rep a/nebo Cap. Bakulo-Rep/Cap tak umožňuje komplementovat v linii komplementních buněk genom AAV postrádající jakoukoliv kódující virovou sekvenci (obrázek 5).
Bakulovirus může také obsahovat úseky gag, pol a/nebo env retroviru. Bakulo-gag/pol/env tak umožňuje komplementovat v linii kompetentních buněk retrovirový genom postrádající jakoukoliv kódující virovou sekvenci.
Je také možné použít bakulovirus obsahující úseky gag/pol a druhý bakulovirus obsahující úsek env.
Obecně je výhodné, když se genom defektního rekombinantního viru a komplementační úseky přítomné v bakuloviru nepřekrývají. To vskutku umožňuje vyhnout se rizikům rekombinace, atak vzniku RCA. To je obzvláště důležité pro vznik první generace adenovirů (Ad-ΔΕΙ). V tomto případě je úsek El zavedený do bakuloviru definován tak, že nemá žádnou společnou sekvenci s rekombinantním genomem. Aby se tak stalo, je možné například odstranit z rekombinantního genomu úsek větší než komplementační úsek vložený do bakuloviru, jak je ukázáno v příkladech. To je výhodné také pro vznik adenoviru Ad-ΔΕΙ,ΔΕ4.
Tedy v určitém provedení vynálezu je genom defektního rekombinantního viru zaveden do kompetentních buněk, tyto buňky jsou infikovány, současně či jinak, bakulovirem obsahujícím všechny nebo některé funkce nezbytné pro komplementaci defektního genomu, přičemž komplementační funkce přítomné v bakuloviru a genomu defektního rekombinantního viru neobsahují žádnou oblast hamologie schopnou vyvolat rekombinaci. Výhodně je virový genom rekombinantní adenovirový genom defektní v úseku El a bakulovirus nese úsek adenoviru schopný transkomplementace úseku El. Podle jiné varianty je virový genom rekombinantní adenovirový genom defektní v úsecích El a E4 a bakulovirus nese dva adenovirové úseky schopné transkomplementace uvedených úseků nebo jsou použity dva bakuloviry jeden nesoucí úsek adenoviru schopný transkomplementace úseku El a druhý úsek adenoviru schopný transkomplementace úseku E4, bez úseků homologie s defektním adenovirovým genomem.
Podle specifického provedení vynálezu jsou všechny kódující úseky adenoviru neseny jedním nebo více pomocnými bakuloviry. Podle jiného provedení je použít pouze jeden pomocný baku
-6CZ 293947 B6 lovirus obsahující všechny kódující úseky adenoviru. Takový pomocný bakulovirus může být tedy použit pro transkomplementaci minimálního rekombinantního adenoviru. Takový bakulovirus může obsahovat konkrétně celý adenovirový genom, s výjimkou enkapsidačního úseku a případně ITR, jak je ukázáno v příkladech.
Příprava komplementačních funkcí
Komplemantační funkce zavedené do pomocného bakuloviru mohou pocházet z virů různých sérotypů.
Co se týče adenovirů, existují různé sérotypy, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud liší, ale které projevují srovnatelné genetické uspořádání. Konkrétně komplementační funkce použité pro konstrukci bakulovirů podle vynálezu pocházejí z adenoviru lidského nebo zvířecího původu.
Co se týče adenovirů lidského původu, mohou být zmíněny zejména adenoviry zařazené do skupiny C. Výhodněji se mezi různými sérotypy lidských adenovirů preferuje použití adenoviru typu 2 nebo 5 (Ad2 nebo Ad5) v rámci předkládaného vynálezu. Je také možné použít úseky pocházející z adenoviru typu 7 nebo 12, patřících do skupin A a B. Mezi různými adenoviry zvířecího původu se preferuje použití adenovirů psího původu, zejména všech kmenů adenovirů CAV2 [kmen manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800)] v rámci vynálezu. Další adenoviry zvířecího původu jsou konkrétně uvedeny v přihlášce WO94/26914, na kterou se tímto odkazuje.
Ve výhodném provedení vynálezu pochází komplementační funkce z genomu lidského adenoviru skupiny C. výhodněji pochází z genomu adenoviru Ad2 nebo Ad5.
Úseky nesoucí různé komplementační funkce mohou být z adenovirového genomu získány enzymovým štěpením metodami odborníkům známými. Tyto úseky mohou být volitelně modifikovány tak, aby se zmenšila jejich velikost nebo aby se nahradily určité regulační prvky (promotor, zesilovač apod.) heterologními prvky. Obecně jsou tyto úseky připraveny následujícím způsobem: DNA adenoviru se purifikuje stočením v gradientu chloridu česného nebo je získána in vitro z prokaryotického (WO96/25506) nebo eukaryotického (W095/03400) plazmidu. DNA je poté štěpena příslušnými restrikčními enzymy a získané fragmenty nesoucí požadované komplementační funkce jsou identifikovány a vybrány. Výběr použitých restrikčních enzymů závisí na požadovaných restrikčních funkcích. Výběr se tedy řídí restrikčními mapami a publikovanými sekvencemi adenovirových genomů. Tak může být izolován úsek El ve formě fragmentů nesoucích všechny čtecí rámce El A a E1B po směru od promotoru El A. ÚsekE4 může být izolován ve formě fragmentů nesoucích celé čtecí rámce nebo pouze jejich část, výhodně rámce ORF3 nebo ORF6 nebo ORF6-ORF6/7.
Podobné metody jsou použity pro přípravu komplementačních úseků AAV a rekombinantních retrovirů. Pak mohou být úseky AAV cep a/nebo cap získány enzymovým štěpením z virové DNA izolované z různých sérotypů AAV. To je výhodně AAV-2. U retrovirů mohou být úseky gag, pol a/nebo env získány také obvyklými technikami molekulární biologie Moloney Leukaemia Virus“, virus myší Moloneyovy leukemia; také nazýván MoMLV), MSV („Murine Moloney Sarcoma Virus“, virus myšího Moloneyova sarkomu), HaSV („Harvey Sarcoma Virus“, virus nekrózy sleziny), RSV („Rous Sarcoma Necrosis Virus“, virus nekrózy sleziny), RSV („Rous Sarcoma Virus“, virus Rousova sarcomu) nebo Friendův virus.
Konstrukce pomocného bakuloviru
Fragmenty nesoucí komplementační úseky jsou pak subklonovány do plazmidového vektoru umožňujícího jejich další manipulaci (jemnější štěpení, PCR, přidání regulačních sekvencí, apod.), například v prokaryotickém nebo eukaiyotickém organismu. Získaný konečný fragment kódující komplementační fúnkci(e) je poté vnesen do pomocného bakuloviru za použití obvyklých technik molekulární biologie. Specificky je fragment klonován mezi dvě sekvence homolog
-7CZ 293947 B6 ní k úseku genomu bakuloviru, a poté je výsledný fragment nebo plazmid kotransfekován s genomem bakuloviru do hmyzích buněk (obvykle buněk Sf9 and Sf21 (Spodoptera frugiperda), ale také buněk Tn-368 a Hing-Five™ BTI-TN-5B1-4 (Gibco) (Trichopulsia) nebo do jakékoliv jiné hmyzí buňky permisivní pro bakuloviry a schopné použití pro jejich produkci). Homologní rekombinace mezi plazmidem nebo fragmentem a genomem bakuloviru dává vznik požadovanému rekombinantnímu bakuloviru, který může být znovu získán a purifikován obvyklými metodami (viz zejména King a Possee: The Baculovirus Expression Systém. London: Chapman &Hall, 1992). Pro konstrukci rekombinantních bakulovirů jsou komerčně dostupné různé soupravy obsahující kyvadlové vektory a mohou být použity podle doporučení výrobců. Zejména je možné použít kyvadlové vektory dodávané společností Clontech, vektory pAc (Veme et al., Bio/Technology, 6 (1988) 47, Pharmingen, USA), vektory pBlue-Bac (Invitrogen) nebo vektory pBSV (Boehringer). Komplementační funkce mohou být tedy vloženy na různá místa bakuloviru, zejména do lokusu polyhedrinového genu nebo genu plO. Kromě toho mohou být použity různé kmeny bakulovirů, jako je konkrétně AcNPV nebo Bombyx moři (Maeda et al., Nátuře, 315(1988)592). Dále může být použitý bakulovirus modifikován, aby se zvýŠil/změnil jeho tropismus. Je vskutku možné modulovat tropismus virových vektorů modifikací jejich povrchových proteinů tak, že se
i) omezí fúzí virových proteinů se specifickým ligandem (lehký řetězec imunoglobulinu, peptid uvolňující gastrin), nebo ii) rozšíří tvoření pseudotypů s heterologním virovým glykoproteinem [G viru puchýřkové stomatitidy, „Vesicular Stomatitis Virus“ (VSV)J, [Liu et al., J. Virol 70(4) (1996) 2497; Michael et al., Gene Ther. 2 (1995) 660]. Nedávno bylo prokázáno, že povrchový glykoprotein bakuloviru (gp64) fúzovaný s gpl20 viru HIV schopný vázat se na receptor CD4 (Boublik et al., Bio/Technology, 13 (1995) 1079). Tato modifikace gp64 neovlivňuje životaschopnost bakuloviru ve hmyzích buňkách. Podobný konstrukt s G z VSV by umožnil zesílit tropismus bakuloviru pro savčí buňky, a tudíž zvýšit transdukční účinnost buněk Huh7, jakož i jiných buněčných linií.
U pomocných virů jsou komplementační funkce výhodně umístěny tak, že jsou pod kontrolou heterologního promotoru (tj. jiného původu než bakulovirového), který je funkční v kompetentních buňkách. Opravdu se zdá, že bakulovirové promotory neumožňují získat postačující hladiny exprese komplementačních funkcí v buňkách jiných než hmyzího původu, a nejsou proto nejvýhodnější pro aplikace vynálezu. Promotor může být především dosavadní promotor (homologní promotor) komplementačních funkcí viru (El A, E4, E2, MLP promotor pro adenovirus, P5 nebo P19 promotory z AAV, LTR promotor z RSV, apod.). Může to také být jakýkoliv promotor odlišného původu, který je funkční v použitých kompetentních buňkách. Pro tento účel mohou být zmíněny například promotory genů exprimované v této buňce nebo známé běžné promotory, jako je například promotor genu PGK, časný promotor CMV, promotor genu TK herpesviru nebo alternativně LTR promotor z RSV. Může to být také regulovaný promotor, jako například promotor viru MMTV, promotor odpovídající na hormony, například typu GRE5, nebo promotor regulovaný tetracyklinem. Výhodně to je indukovatelný nebo silný, běžný homologní promotor.
Další předmět předkládaného vynálezu se týká rekombinantního bakuloviru obsahujícího, vloženou do svého viru umístěnou pod kontrolu heterologního promotoru. Konkrétněji, komplementační funkce je protein nezbytný pro produkci uvedeného viru, jehož kódující úsek je inaktivní (mutovaný, deletovaný apod.) v defektním virovém genomu. Pro adenoviry je komplementační funkce vybrána zejména ze všech nebo některých funkcí kódovaných úseky El, E2, E4, LI až L5, pIX a IVa2 adenoviru, samotného nebo v kombinaci. Pro AAV jsou to funkce kódované úseky Rep a/nebo Cap a pro retroviry gag, pol a/nebo env. Výhodně nukleová kyselina odpovídá úseku virového genomu obsahujícímu úsek kódující vybranou komplementační funkci. Je to obzvláště fragment genomu adenoviru sérotypu Ad2 nebo Ad5, MoMLV nebo AAV-2. Obzvláště výhodně obsahuje nukleová kyselina také úsek promotoru, který je přirozeně zodpovědný za expresi vybrané komplementační funkce.
-8CZ 293947 B6
Jakožto specifický příklad předkládaného vynálezu lze uvést bakulovirus obsahující celý nebo část úseku El adenoviru. Je to zejména bakulovirus obsahující úsek Ela, Elb nebo Ela a Elb. Usek El adenoviru je lokalizovaný na úrovni nukleotidů 104 (promotor Ela) až 4070 (polyA Elb) z Ad5. Konkrétně je TATA box promotoru Ela lokalizován na úrovni nukleotidu 407, ATG kodon Ela na úrovni nukleotidu 560 a stopovací kodon zmíněn bakulovirus obsahující fragment 391 až 3511. Tento pomocný bakulovirus je obzvláště vhodný pro produkci rekombinantních adenovirů defektních v úseku El, nesoucích deleci větší než je tento fragment 391 až 3511. Je zejména vhodný pro produkci první generace adenovirů bez RCA nesoucí deleci v úseku El pokrývající nukleotidy 383 až 3512 včetně.
Dalším specifickým příkladem vynálezu je bakulovirus, který obsahuje například všechny nebo některé úseky El a E4 adenoviru. ÚsekE4 adenoviru se skládá ze 7 otevřených čtecích rámců označených ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 a ORF6/7. Zdá se, že z proteinů kódovaných těmito různými ORF, ty proteiny, které jsou tvořené ORF3 a ORF6, umožňují „replikaci“ viru, a tudíž transkomplementaci adenovirů defektních v úseku E4, dokonce v celém. Tudíž výsledný pomocný bakulovirus podle vynálezu výhodně obsahuje celý úsek E4 nebo pouze jeho část obsahující alespoň rámec ORF3 nebo ORF6. Různé části úseku E4 mohou být získány enzymovým štěpením nebo modifikovány metodami odborníkům známými. Konkrétně čtecí rámec ORF6 může být izolován z úseku E4 ve formě fragmentu BglII-PvuII, odpovídajícímu nukleotidům 34115 až 33126, a čtecí rámce ORF6-ORF6/7 mohou být izolovány z úseku E4 ve formě fragmentu BglII—BglII odpovídajícímu nukleotidům 34115 až 32490 zgenomu Ad5. Baculovirus může také obsahovat celé čtecí rámce ORF1-ORF7 (například ve formě fragmentu 32800 až 35826 nebo 32811 až 35614 nebo 32811 až 35640). Rozumí se, že další fragmenty mohou být určeny na základě publikovaných sekvencí adenovirových genomů. Použití bakulovirů nesoucích redukovanou jednotku úseku E4 je výhodné, protože umožňuje transkomplementaci defektního adenovirového genomu nesoucího větší deleci úseku E4, tudíž bez oblasti homologie, a tedy zabrání jakékoliv možnosti rekombinace.
Podle prvního provedení vynálezu je zavedena nukleová kyselina kódující komplementační funkci(e) do pomocného bakuloviru ve formě expresní kazety. Toto provedení je nejsnadnější pro použití. Je zejména výhodné pro produkci rekombinantních adenovirů defektních v časných genech a pro produkci defektních rekombinantních AAV a retrovirů.
Podle dalšího provedení je zavedena nukleová kyselina kódující komplementační fúnkci(e) do pomocného bakuloviru ve formě vystřihnutelné kazety vytvářející replikativní molekulu v kompetentní buňce. Replikace kazety v buňce umožňuje výhodně zvýšit počet kopií komplementujících genů, a tak zvýšit produkční hladiny systému. Toto provedení je zejména vhodné pro produkci velmi vysoce defektních rekombinantních adenovirů, defektních konkrétně ve strukturních genech. Toto provedení je obzvláště vhodné pro produkci „minimálních“ adenovirů. Kvantita strukturního proteinu je vskutku limitující faktor pro produkci vysokých titrů vysoce defektivních adenovirů (typu minimálního adenoviru). Toto provedení umožňuje poprvé podstatně zvýšit intracelulámí hladiny transkomplementačních proteinů, zejména strukturních proteinů adenoviru (kódovaných úseky LI až L5), až na hladiny kompatibilní a transkomplementaci minimálních adenovirů.
Původce tedy ukázal, že je možné konstruovat rekombinantní bakuloviiy obsahující heterologní úsek, který je možné v buňce vystřihnout, výhodně indukovatelným a regulovaným způsobem, aby vznikla cirkulámí a replikativní molekula (epizomálního typu).
Excise (vystřižení) se výhodně provádí místně-specifickým rekombinačním mechanismem a replikace v buňce je vyvolána replikačním počátkem nezávisle na stavu buněčného dělení.
Výhodněji je místně-specifická rekombinace použitá podle způsobu vynálezu získána pomocí dvou specifických sekvencí, které jsou schopné rekombinace se sebou navzájem v přítomnosti specifického proteinu, obecně nezývaného rekombináza. Tyto specifické sekvence uspořádané
-9CZ 293947 B6 v příslušné orientaci ohraničují v bakuloviru sekvence kódující komplementační funkce. Tedy předmětem vynálezu je také rekombinantní bakulovirus obsahující, vložený do svého genomu, alespoň jeden úsek DNA ohraničený dvěma sekvencemi umožňujícími místě-specifickou rekombinaci, a umístěný v přímé orientaci, uvedený úsek DNA obsahuje alespoň jeden replikační počátek funkční v kompetentních buňkách a nukleovou kyselinu kódující komplementační funkci viru.
Sekvence umožňují rekombinaci, které jsou použity podle vynálezu, obecně obsahují od 5 do 100 párů bází, výhodněji méně než 50 párů bází. Mohou patřit do různých strukturních skupin, zejména do rodiny rekombinázy PÍ bakteriofága nebo resolvázy transpozonu.
Z rekombináz patřících do rodiny integrázy bakteriofága 1 mohou být uvedeny zejména integráza fágů lambda (Landy et al., Science, 197(1977) 1147), P22 a F80 (Leong et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HP1 z Haemophilus influenzae (Hauser et al., J. Biol. CHem. 267 (1992) 6859), integráza Cre z fága Pl, integráza plazmidu z kvasinek Saccharomyces cerevisiae.
Z rekombináz patřících do rodiny transpozonu Tn3 mohou být uvedeny zejména resolváza transpozonu Tn3 nebo transpozonů gd, Tn21 a Tn522 (Stark et al., 1992); invertáza Gin z bacteriofága mu nebo resolváza plazmidů, jako je fragment par z RP4 (Abert et al., Mol. Microbiol., 12(1994) 131).
Podle výhodného provedení sekvence umožňují místně-specifickou rekombinaci v rekombinantních bakulovirech předkládaného vynálezu pocházející z bakteriofága. Výhodněji jsou připojovací sekvence (sekvence attp a attB) z bakteriofága nebo odvozené sekvence. Tyto sekvence jsou schopné specifické rekombinace se sebou navzájem v přítomnosti rekombinázy nezývané intergráza. Jako specifické příklady mohou být uvedeny zejména sekvence pro připojení fágů lambda, P22, F80, Pl, HP1 z Haemophihis influenzae nebo z plazmidu pSAM2, nebo 2 pm.
Ještě výhodněji jsou sekvence umožňující místně-specifickou rekombinaci představované rekombinačním systémem fágaPl. Fág Pl má rekombinázu nazývanou Cre, která specificky rozpoznává nukleotidovou sekvenci 34 párů bází nazývanou místo loxP (stemberg et al., J. Mol. Biol. 150 (1981) 467). Tato sekvence je složena ze dvou palindromických sekvenci o 13 bp oddělených konzervativní sekvencí o 8 bp. Místně-specifická rekombinace je výhodně získána za použití sekvencí LoxP nebo odvozených sekvencí a rekombinázy Cre.
Termín odvozená sekvence zahrnuje sekvence získané modifikací (modifikacemi) rekombinantních sekvencí výše uvedených, přičemž zachovává kapacitu specifické rekombinace v přítomnosti příslušné rekombinázy. Může tedy zahrnovat redukované fragmenty těchto sekvencí nebo naopak fragmenty rozšířené přidáním jiných sekvencí (restrikční místa apod.). Může také zahrnovat varianty získané mutací (mutacemi), zejména bodovou mutací (bodovými mutacemi).
Ve výhodném provedení vynálezu jsou proto sekvence umožňující místně specifickou rekombinaci sekvence LoxP bakteriofága Pl a rekombinace je získána v přítomnosti proteinu Cre. Z tohoto hlediska může být rekombinace dosaženo tak, že se kompetentní buňky přivedou do přímého kontaktu s rekombinázou Cre nebo expresí genu kódujícího rekombinázu Cre v kompetentních buňkách. Výhodně je rekombináza Cre produkována v buňce indukcí exprese odpovídajícího genu. Tak je gen kódující rekombinázu výhodně umístěn pod kontrolu indukovatelného promotoru nebo konstruován v regulovatelné formě. Z tohoto hlediska je výhodně použita fúze mezi Cre a vazebnou doménou steroidního hormonu (estradiol, progesteron, apod.) umožňující regulaci aktivity Cre, a tudíž vyvolání rekombinace (Metzger et al., PNAS 92 (1995) 6991). Obecněji může být exprese rekombinázy kontrolována každým silným promotore,, regulovaným nebo jiným. Expresní kazeta může být transfekována do kompetentních buněk nebo integrována do genomu kompetentních buněk, jak je ukázáno v příkladech.
-10CZ 293947 B6
Tento systém tedy umožňuje vytvářet replikativní molekuly, které produkují v kompetentních buňkách vysokou úroveň virové, zejména adenovirové, komplementační funkce. Tento typ konstruktu je obzvláště vhodný pro komplementaci vysoce defektních genomů, zejména adenovirových genomů defektních v pozdních genech. Tak je specifický konstrukt podle vynálezu představován bakulovirem obsahujícím, vložený do svého genomů, alespoň jeden úsek DNA ohraničený dvěma sekvencemi LoxP umístěnými v přímé orientaci, přičemž uvedený úsek DNA obsahuje alespoň jeden replikační počátek funkční v kompetentních buňkách a jednu nukleovou kyselinu kódující komplementační funkci adenoviru. Komplementační funkce výhodně obsahují všechny nebo některé z časných genů přítomných v úsecích El, E2 a E4. Ještě výhodněji zahrnují komplementační funkce všechny nebo některé z časných genů a z pozdních časných genů. Výhodně umožňují komplementační funkce komplementaci rekombinantního adenoviru postrádajícího konkrétně zahrnují celý adenovirový genom s výjimkou ITR a sbalovacího (pakážovacího) úseku. Podle specifické varianty komplementační funkce zahrnují kompletní adenovirový genom, který ale postrádá sbalovací úsek (Ad.Psi-). Tento genom obsahuje zejména úseky ITR, které slouží pro replikaci genomů v kompetentních buňkách po excisi.
Aby se vyvolala replikace epizomální molekuly, obsahuje proto tato molekula replikační počátek funkční v použitých kompetentních buňkách. Tento replikační počátek výhodně zahrnuje aktuální sekvence ITR adenoviru, které umožňují podstatnou amplifikaci molekuly. Může to být také jiný replikační počátek umožňující výhodně amplifikaci virové DNA v kompetentní buňce faktorem větším než 20. Jako příklad může být uveden počátek OriP/EBNAl viru EBV nebo úsek E2 papiloma viru. Přitom se rozumí, že sekvence ITR adenoviru představuje výhodné provedení.
Pro provádění způsobu podle vynálezu se pomocný bakulovirus (bakuloviry) obecně používá v mnohonásobku infekce („Multiplicity of Infection“, MOI), umožňující, že je infikována velká populace buněk, bez významného zhoršení životaschopnosti buněk. Obecně je hodnota MOI nejlépe mezi 10 a 1000. MOI odpovídá počtu virových částic na buňku. MOI může být snadno upravena odborníkem v závislosti na použitých kompetentních buňkách, v podstatě na základě dvou kritérií: infekční účinnost a možná toxicita. Výhodně je MOI použitá pro pomocný bakulovirus mezi 20 a 500.
Vnesení virového genomů
Jak je uvedeno výše, způsob podle vynálezu zahrnuje vnesení pomocného bakuloviru a rekombinantního virového genomů do kompetentních buněk. Z tohoto hlediska může být genom defektního rekombinantního adenoviru vnesen do kompetentní buňky různými způsoby.
Především se může jednat o puntíkovaný defektní rekombinantní adenovirus, výhodně bez RCA. V tomto případě jsou kompetentní buňky infikovány defektním rekombinantním adenovirem a pomocným bakulovirem. Infekce rekombinantním adenovirem umožňuje zavést do kompetentní buňky odpovídající genom, který je poté amplifikován a enkapsidován, aby genom, který je poté amplifikován a enkapsidován, aby produkoval kmeny ve vysokém titru, a to bez RCA. Toto provedení je zejména výhodné pro tvoření první generace virů (Ad-ΔΕΙ; Ad-ÁE1,AE3). Je vskutku obtížné tyto viry produkovat ve vysokých titrech bez kontaminace s RCA. Způsobem podle vynálezu je nyní možné začít s první generací defektního rekombinantního adenoviru a společnou infekcí kompetentní buňky bakulovirem obsahujícím úsek El získat koncentrované kmeny vysoké kvality. Toto provedení je také výhodné pro produkci virů defektních ve dvou nebo třech základních úsecích svého genomů (zejména El, E2, E4). Obecně je toto provedení výhodné, protože účinnost infekce adenovirem je velmi vysoká (větší než účinnost transfekce DNA), a proto umožňuje vytvořit koncentrované kmeny. V tomto provedení jsou použity rekombinantní adenovirus a rekombinantní bakuloviry v násobku infekce (MOI) umožňujícím infikovat velkou populaci buněk aniž by se významně zhoršila jejich životaschopnost. MOI použitá pro bakulovirus je tatáž jak byla uvedena výše (mezi 10 a 1000). Co se týče adenoviru, je výhodně mezi 1 a 1000, výhodněji mezi 1 a 500, ještě výhodněji mezi 1 a 100. MOI použitá pro adenovirus je také upravena podle vybraného buněčného typu. Rozsah MOI může být snadno
-11 CZ 293947 B6 určen odborníkem za použití například adenoviru a bakuloviru obsahujícího oddělený gen markéru, aby se stanovila účinnost infekce a případně jakákoliv kompetice. Výhodněji je MOI adenoviru menší než 50, například mezi 1 a 20.
V dalším obzvláště výhodném provedení vynálezu je genom defektního rekombinantního adenoviru vnesen ve formě DNA. V tomto případě je genom zaveden transfekcí, violitelně v přítomnosti činidla usnadňujícího transfekci (lipidy, fosforečnan vápenatý apod.). Tak zavedený rekombinantní genom může být připraven in vitro různými technikami, zejména např. v E. coli (WO96/25506) nebo v kvasince (W095/03400). Toto provedení je obzvláště užitečné pro vytvoření první řady defektního rekombinantního viru bez RCA, která může být opět dále použita pro produkci kmenů s vysokým titrem podle předchozího provedení.
Genom defektního rekombinantního adenoviru může být také zaveden za použití dalšího rekombinantního bakuloviru. Podle tohoto provedení je genom defektivního rekombinantního adenoviru připraven in vitro, například je uveden výše, a poté je zaveden do bakuloviru ve formě kazety schopné excise v kompetentní buňce. Podle tohoto provedeni jsou kompetentní buňky přivedeny do přítomnosti bakuloviru nesoucího genom defektního rekombinantního adenoviru a jednoho nebo více pomocných bakulovirů (nesoucích komplementační funkce). Toto provedení je obzvláště výhodné pro produkci vysoce defektních rekombinantních adenovirů. Na základě tohoto systému je opravdu možné vnést do populace kompetentních buněk velké množství obou vysoce defektních rekombinantních genomů a odpovídající komplementační funkce.
Vzhledem k tomu způsob podle vynálezu tedy zahrnuje koinfekci kompetentních buněk bakulovirem nesoucím genom defektního rekombinantního adenoviru a jedním nebo několika pomocnými bakuloviry nesoucími komplementační funkce. Hodnoty MOI použité v tomto provedení jsou také mezi 10 a 1000 pro každý použitý bakulovirus.
V dosavadním stavu techniky byly připraveny dva typy konstruktů pro produkci minimálních adenovirů:
1) transgen (β-galaktosidáza) klonovaný mezi ITR, ohraničený jedinečným restrikčním místem nebo
2) pravá a levá ITR klonovaná v přímé orientaci v 5' od transgenu (Fischer et al., Virology 217 (1996) 11; Kumar-Singh et al., Hum. Mol. Genet. 5 (1996) 913).
Minimální adenoviry byly produkovány v buňkách 293 transfekcí Iinearizovné (1) nebo cirkulámí (2) DNA, virové proteiny nezbytné pro replikaci a pro enkapsidaci minigenomu byly poskytnuty v trans pomocným virem (AdAEl). Minimální adenoviry se chovají jako interferující defektní (ID) částice a jsou progresivně amplifikovány během postupných pasáží. Hlavní problém předložená touto metodologií je separace dvou typů vytvářených částic zodpovědných za kontaminaci kmenů pomocným virem a velmi nízké titry minimálních adenovirů takto získaných (méně než 108 pfu/ml).
Předkládaná přihláška vynálezu umožňuje poprvé vytvořit minimální adenoviry za použití bakuloviru, který dodá adenovirový minigenom, a bakuloviru, který poskytne všechny transkomplementační funkce (komplementující genom).
Rekombinantní adenovirový genom je výhodně vložen do bakuloviru mezi dvě sekvence umožňující místně-specifickou rekombinaci v kompetentních buňkách, jak bylo již popsáno pro pomocný bakulovirus.
Předkládaná přihláška popisuje zejména systém pro produkci minimálního adenoviru za použití bakuloviru pro dodání adenovirového minigenomu s pomocí systému loxP/Cre a bakuloviru pro
-12CZ 293947 B6 poskytnutí všech transkomplementačních funkcí (komplementující genom), také s pomocí systému Cre/loxP (viz obrázky 2 až 4).
Podle dalšího provedení je místně-specifický rekombinační systém použitý pro dodání komplementačních funkcí odlišný od systému použitému pro dodání genomu rekombinantních adenovirů. Konkrétně systém LoxP/Cre může být použit pro dodání defektního adenovirového genomu a systém AttP/AttB pro dodání komplementační funkce(í).
Způsob podle vynálezu tak umožňuje konstruovat adenovirový vektor zbavený všech kódujících virových sekvencí a obsahující pouze ITR a enkapsidační signál (minimální adenoviry). Tento vektor může teoreticky pojmout až 37 kb exogenní sekvence, zatímco klonovací kapacita současných vektorů nepřesahuje 8,5 kb. To tedy umožňuje klonovat geny velké velikosti jako je gen dystrofinu (14 kb) se všemi jejich regulačními prvky (promotor, zesilovač, introny apod.) tak, aby se získala optimální exprese v cílové tkáni. Navíc nepřítomnost jakékoliv imunogenní virové sekvence by měla zvýšit trvání exprese transgenu v klidové tkáni.
Genom AAV nebo defektivního retroviru může být také zaveden ve formě viru, genomu nebo plazmidu některým ze způsobů popsaných výše.
Kompetentní buňky
Způsob podle vynálezu se může provádět s různým typem buněk. Pro účely vynálezu se „kompetentní buňkou“ rozumí buňka permisivní k infekci bakulovirem a virem, který se má tvořit, a umožňující produktivní virový cyklus pro tento vytvářený virus. Kapacita infekce buněk těmito viry může být určena za použití rekombinantních virů exprimujících markerový gen, jako je gen LacZ v E. coli. Je to výhodně savčí buňka, ještě výhodněji buňka lidského původu. Použité kompetentní buňky mohou být klidové buňky nebo aktivně se dělící buňky, zavedené stabilizované linie nebo primární kultury. Jsou to výhodně savčí slučitelné s průmyslovým využitím, tj. bez známého patogenního charakteru, schopné kultivace, a je-li to nutné, schopné uschování v patřičných podmínkách. Výhodně jsou použité buňky jatemí, svalové, fíbroblastové, embryonální, nervové, epitelové (plicní) nebo oční (retinální) buňky. Jako neomezující příklad mohou být uvedeny buňky 293 nebo jakákoliv odvozená buňka obsahující přídatnou komplementační funkci (293E4, 293E2a, apod.), buňky A549, buňky HuH7, buňky Hep3B, buňky HepG2, buňky lidského retinoblastomu (HER, 911), buňky HeLa, buňky 3T3 nebo buňky KB.
Pro provádění způsobu podle vynálezu může být genom rekombinantního viru bakuloviru vnesen do populace kompetentních buněk současně nebo časově oddělen. Výhodně jsou buňky přivedeny do kontaktu jak s rekombinantním genomem, tak s pomocným bakulovirem. V případě systému tvořícího replikativní molekuly in vivo je vnesena také rekombináza nebo je exprimována předem, současně nebo postupně.
Produkce virů obecně vede k lýzi buněk. Tvořené viiy mohou být tudíž sklizeny po buněčné lýzi známými purifíkačními metodami. Mohou být poté různými způsoby sbalovány v závislosti na požadovaném použití. Navíc, aby se zabránilo riziku kontaminace kmene možnou příměsí bakulovirů, které nepronikly do kompetentních buněk (pomocný bakulovirus nebo bakulovirus poskytující rekombinantní virový genom), je možné aplikovat následující techniky:
- je možné purifikovat adenoviry chromatografíí podle metody popsané v přihlášce FR96/08164. Tato technika umožňuje separovat adenovirus od jakéhokoliv možného reziduálního bakuloviru;
- je také možné nechat působit na kmeny purifikovaného adenoviru organická rozpouštědla (například éter, chloroform). Vskutku, bakulovirus je opouzdřený virus (má glykoproteinový obal), a je proto velice citlivý na jakékoliv organické rozpouštědlo (které extrahuje lipidy z jeho obalu); na rozdíl od toho adenovirus není opouzdřen a stejná rozpouštědla na něj neúčinkují;
- 13 CZ 293947 B6
- je také možné separovat podle hustoty purifikací gradientu CsCl jakýkoliv reziduální bakulovirus a rekombinantní virus.
Tyto tři metody mohou být použity nezávisle nebo společně. Navíc může být také použita jakákoliv další metoda odborníkovi známá.
Použití virů
Viry takto připravené mohou být použity pro klonování, přenos a exprese genů in vitro, ex vivo nebo in vivo. Takové požadované geny jsou například geny kódující enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny: interleukiny, interferony, TNF apod. (FR 9203120), růstové faktory, neutrotransmitery nebo jejich prekurzory v syntéze enzymů, trofícké faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3,NT5, apod., apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE, apod. (WO94/25073), dystrofin nebo minidystrofm (WO93/06223), nádorové supresorové geny: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, apod. WO94/24297), geny kódující faktory zapojené do koagulace: faktory VII, VIII, IX apod., sebevražedné geny: tymidinkinázu, cytosindeaminázu apod., nebo celý či část přirozeného nebo syntetického imunoglobulinu (Fab, ScFV, apod., WO94/29446Ú, apod. Požadovaný gen může být také gen nebo „antisense“ (s opačnou orientací) sekvence, jejichž exprese v cílové buňce umožňuje řídit expresi genů nebo transkripci buněčných mRNA. Takové sekvence mohou být v cílové buňce transkribovány například do RNA komplementárních k buněčným mRNA, a tak blokovat jejich translaci do proteinu, podle techniky popsané v patentu EP 140 308. Požadovaný gen může být také gen kódující antigenní peptid, schopný vyvolat imunitní odpověď, pro produkci vakcín. Mohou to být zejména antigenní peptidy specifické pro virus Epstein-Barrové, virus HTV, virus hepatitidy Β (EP 185 573), virus preudorabies nebo peptidy specifické pro nádory (EP 259 212). Gen může být každá DNA (gDNA, cDNA apod.) kódující požadovaný produkt, potenciálně zahrnující příslušné expresní signály (promotor, terminátor apod.)
Takové viry mohou být použity in vitro pro tvorbu těchto rekombinantních proteinů. Mohou být také použity in vitro ke studování mechanismů působení těchto proteinů nebo je studování regulace exprese genů nebo aktivity promotorů. Mohou být také použity in vivo pro vytvoření zvířecích modelů nebo transgenních zvířat. Mohou být použity také pro přenos a expresi genů in vivo, u zvířat nebo u lidí, v postupech genové nebo buněčné terapie.
Předkládaný vynález bude detailněji popsán a vysvětlen pomocí následujících příkladů, které je třeba považovat za ilustrativní a neomezující.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1: schematické znázornění produkce třetí generace defektního rekombinantního adenoviru (defektního ve funkcích El a E4) za použití bakulo-El, E4.
Obrázky 2 až 4: schematické znázornění produkce minimálního adenoviru za použití prvního bakuloviru k zavedení neúplného adenovirového genomu a druhého bakuloviru k zavedení komplementačních funkcí.
Obrázek 5: schematické znázornění produkce rekombinantního AAV defektního ve funkci Rep a Cap za použití bakulo-Rep/Cap.
- 14CZ 293947 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Použité buňky
Buňky použité v rámci vynálezu mohou být získány z jakékoliv buněčné linie nebo populace schopné infekce adenovirem nebo AAV nebo retrovirem nebo bukalovirem, kompatibilní s použitím pro léčebné účely. Výhodně to je savčí, zejména lidská, buňka. Konkrétněji se mohou zmínit:
- Buňky linie 293:
Linie 293 je buněčná linie lidských embryonálních ledvin obsahující levý konec (přibližně 11 až 12 %) genomu adenoviru sérotypu 5 (Ad5), obsahující levý ITR, enkapsidační oblast, oblast El, včetně Ela, Elb, oblast kódující protein pIX a část oblasti kódující protein pIVa2 (Graham et al., J. Gen. Virol., 36, 59, 1977). Tato linie je schopná transkomplementace rekombinantních adenovirů defektních v oblasti El, jinými slovy postrádajících celou nebo část oblasti El, a produkuje kmeny virů s vysokými titry.
- Buňky linie A549
Buňky komplementující oblast El adenoviru byly konstruovány z buněk A549 (Imler et al., Gene Ther., 75,1966). Tyto buňky obsahují restrikční fragment oblasti El, postrádající levý ITR, umístěný pod kontrolou indukovatelného promotoru.
- Buňky linie HER
Buňky lidské embryonální retiny (HER) mohou být infikovány adenovirem (Byrd et al., Oncogene, 2,477, 1988). Adenovirové enkapsidační buňky připravené z těchto buněk byly popsány například v patentové přihlášce WO94/28152 nebo v článku Fallauxe et al. (Hum. Gene Ther., 215,1996). Konkrétně může být uvedena linie 911 obsahující oblast El genomu adenoviru Ad5, od nukleotidu 79 k nukleotidu 5789, tato oblast je integrována do genomu buněk HER. Tato buněčná linie umožňuje produkci virů defektních v oblasti El.
- Buňky IGRP2
Buňky IGRP2 jsou buňky získané z buněk 293 integrací funkční jednotky oblasti E4 pod kontrolou indukovatelného promotoru. Tyto buňky umožňují produkci virů defektních v oblastech El a E4 (Yeh et al., J. Virol., 70, 1966).
- Buňky VK
Buňky VK (VK2-20 a VK10-9) jsou buňky získané z buněk 293 integrací celé oblasti E4 pod kontrolou indukovatelného promotoru a oblasti kódující protein pIX. Tyto buňky umožňují produkci virů defektních v oblastech El a E4 (Krougliak et al., Hum. Gene Ther., 6, 1575, 1995).
- Buňky 293E4
Buňky 293E4 jsou buňky získané z buněk 293 integrací celé oblasti E4. Tyto buňky umožňují produkci virů defektních v oblastech El a E4 (WO95/02697, Cancer Gene Ther., 322, 1995).
-15 CZ 293947 B6
- Buňky SÍ9 a Sf21 jsou buňky embryonálních Lepidopter. Tyto buňky jsou zpřístupněné ve sbírkách (v ATCC pod č. CRL-1711), společně s podmínkami jejich kultivace. Jsou také komerčně dostupné (Gibco). Viz také Kong a Possee: The baculovirus expression systém, London: Chapman and Halí, 1992.
- Lidské hepatocyty
Buňky HepG2 a Hep3B a HuH7 jsou lidské linie pocházející z karcinomů jater. Jsou zpřístupněné v depozitních sbírkách a jejich vlastnosti byly popsány například v patentech US 4 393 133 a 4 393 133.
- Lidská buněčná linie KB
Linie KB pochází z lidského epidermoidního karcinomu, je přístupná v ATCC (č. CCL17), jakož i podmínky umožňující její pěstování.
- Lidská buněčná linie Hela
Tato linie pochází z karcinomu lidského epitelu, je přístupná v ATCC (č. CCL2), jakož i podmínky umožňující její pěstování.
- Buněčná linie W162
Tyto buňky jsou buňky Věro obsahující oblast E4 adenoviru Ad2 integrovanou do svého genomu. Tyto buňky byly popsány Weinbergem et al., (PNAS, 80, 5383, 1983).
Příklad 2
Infekce lidských buněk rekombinantním bakulovirem
Tento přiklad popisuje kapacitu bakuloviru infikovat buňky lidského původu.
Lidské buňky (zejména 293 nebo jejich deriváty) jsou infikovány různými ředěními roztoku rekombinantního bakuloviru exprimujícího gen LacZ pod kontrolou RSV LTR. 48 hodin po infekci se objevují modré buňky, což dokazuje, že tyto buňky lze infikovat bakulovirem.
Příklad 3
Konstrukce bakulovirů exprimujících oblast El adenoviru a odpovídajícího defektního adenoviru
3-1. Klonování dvou kazet pro expresi El
Plazmid AE2 je získán z klonování v PCRII (Invitrogen) produktu PCR (polymerázová řetězcová reakce) prováděné na pBREl a s oligonukleotidy 5'-TCCTTGCATTTGGGTAACAG-3' a 5'-GCGGCCGCTCAATCTGTATCTTC-3', tento produkt PCR obsahuje nukleotidy 3198 až 3511 z Ad5, tj. 3' konec oblasti E1B. plazmid pBREl obsahuje nukleotidy 1 až 5788 a Ad5 klonované do pBR322, zbaveného zhruba nukleotidů 1300 až 2300.
Plazmid AE3 pochází z klonování fragmentu Notl-KpnI z AE2, obsahujícího produkt PCR, do pCDNA3 (Invitrogen) naštěpeného sNotl-Kpnl. Obsahuje nukleotidy 3198 až 3511 a Ad5 následované polyadenylačním místem BGH.
-16CZ 293947 B6
Plazmid AE4 pochází z klonování fragmentu BglII-PvuII zAE3 do pBREl, AE4 je plazmid obsahující následující El expresní kazetu:
- nukleotidy 1 až 3511 z Ad5, tj. levý ITR, enkapsidační sekvence, promotor El A, gen El A, promotor E1B, gen E1B
- polyA z bovinního růstového hormonu (BGH) získaného z pCDNA3.
pBREl byl naštěpen s BstNI, a poté reagoval s T4 DNA polymerázou, aby se doplnil přečnívající 5' konec, a pak se štěpil s Xbal. Takto vzniklý fragment obsahující nukleotidy 391 až 1339 z Ad5 byl vložen do pic20H naštěpeného s Smal-Xbal (nemetylované místo) z a vzniku plazmidu AE5.
Plazmid AE6 pochází z klonování fragmentu EcoRI-Smal z AE5 do AE4 štěpeného s EcoRISmal. AE6 je plazmid obsahující následující expresní kazetu El:
- nukleotidy 391 až 3511 z Ad5, tj. „redukovaný“ promotor z El A, gen El A, promotor E1B, gen E1B,
- polyA z bovinního růstového hormonu (BGH) získaného z pCDNA3.
3-2. Klonování dvou kazet El do bakuloviru
Fragmenty EcoRI-Sphl (Sphl přečnívající 5' konec byl předem zatupen digescí sT4DNA polymerázou) z plazmidů AE4 a AE6 jsou klonovány do plazmidu pAcSG2 (Pharmingen) mezi místa EcoRI a EcoRV. Tak vznikají plazmidy AE14 a AE15. V obou případech je oblast El zavedena do lokusu polyhedrinového genu (polyhedrinový gen + odstraněný polyhedrinový promotor).
Plazmidy AE14 a 15 jsou společně transfekovány (kontrasfekovány) s DNA bakuloviru BaculoGold pocházejícího z kmene AcNPV (Pharmingen) do hmyzích buněk SÍ9, aby vznikly dva odpovídající rekombinantní bakuloviry BacAE14 a BacAE14, nesoucí dvě kazety pro expresi El integrované do lokusu polyhedrinového genu.
3-3. Klonování rekombinantního adenoviru nesoucího novou deleci El
Plazmid pCOl (WW096/10088) se štěpil BstXI, a poté s T4 DNA polymerázou, aby se odstranil přečnívající 3' konec, a pak byl štěpen Rsal. Takto vzniklý fragment obsahující nukleotidy 3513 až 4607 z Ad5 byl zaveden do pBS-SK+ (Stratagene) linearizovaného s EcoRV, a poté se štěpil telecí alkalickou fosfatázou za vzniku plazmidu ΑΕ0.
Plazmid pMA37 se získal ligací fragmentů:
- EcoRV-Nsil zpXL2756, obsahující sacB. pXL2756 má protiselekční gen SacB bez míst EcoRI a KpnI, gen pro rezistenci ke kanamycinu, mnohočetné klonovací místo a replikační počátek ColEl,
- Ndel-Nsil z pCOl (obsahující adeno sekvence)
- Sáli (přečnívající 5' konec doplněný T4 DNA polymerázou)
- AseL z pXL2756 (vektor rezistentní na kanamycin).
pMA37 tedy obsahuje:
- gen rezistence ke kanamycinu
- 17CZ 293947 B6
- gen SacB propůjčující citlivost k sacharóze bakteriím, které jej exprimují
- sekvence 1 až 382 (Hinfl) z Ad5 následované sekvencemi 3446 až 4415 (NsiL) z Ad5, není přítomen žádný transgen.
Plazmid AE11 byl sestrojen zavedením fragmentu Xhol-Nsil zAEO do pMA37 štěpeného Sall-Nsil. Obsahuje tedy:
- gen rezistence na kanamycin
- gen SacB propůjčující citlivost k sacharóze bakteriím, které jej exprimují
- sekvence 1 až 382 (Hinfl) z Ad5 následované sekvencemi 3513 až 4415 (Nsil) z Ad5, není přítomen žádný transgen.
Z plazmidu ΑΕΙ 1 jsou poté konstruovány sebevražedné kyvadlové vektory (vložením požadovaného transgenu) umožňující konstrukci rekombinantních adenovirů rekombinací v E. coli. ΑΕΙ 1 neobsahuje sekvence homologní s plazmidem AE6. Plaznmidy ΑΕΙ 1 a AE4 mají společné sekvence 1 až 382 (Hinfl) z Ad5 v protisměru od El A, ale není zde žádná homologie po směru od kazety El mezi těmito dvěma plazmidy. Tak zde nemůže vznikat RCA homologní rekombinací mezi adenovirem nesoucím deleci El existující vAEll (tj. 382 až 3513) abakuloviry BacAE14 nebo BacAE15.
3-4. Konstrukce první generace rekombinantních adenovirů
Nejdříve je obvyklými technikami připraven kmen BavAE14 nebo 15. Dále jsou komplementní buňky (například HuH7) transfekovány 5 gg plazmidu pXL2822 štěpeného PacI (plazmid pXL2822 obsahuje celý Ad5 s odstraněnou oblastí El (382 až 3446 nebo 382 až 3513) a E3 (28592 až 30470) a nese kazetu CMV-pGal), a infikovány, současně nebo jinak, při MOI10 až 1000, BacAE14 nebo 15. Když jsou buňky lyžovány, sesbírá se transfekční supematant, a pak se použije na „čerstvé“ kompetentní buňky předem nebo současně infikované BacAE14 nebo 15 (MOI 10 až 1000), aby se amplifíkoval adenovirus Ad2822, a tak dále, dokud se nezíská kmenAd2822. Sledování amplifikace Ad2822 je usnadněno přítomností lacZ v tomto viru. Při každé amplifikaci je tedy supematant pseudotitrován na W162. Genom viru se analyzuje během amplifikaci, aby se kontrolovala jeho integrita. Tato strategie má konečně tu výhodu, že v takto tvořené adenovirovém kmeni nevznikají RCA. Nepřítomnost kontaminace se také ještě ověřuje.
Příklad 4
Konstrukce bakuloviru exprimujícího oblasti El a E4 (Bac.El-E4)
Použitý protokol je následující: oblast El a E4 se klonují v opačné orientaci k lokusu polyhydrinového (Ph) genu do kyvadlového vektoru pBacPAK8 (Clontech, USA) za vzniku pBacEl-E4. Rekombinantní bakulovirus se poté izoluje pomocí obvyklých technik kontrasfekcí pBacEl-E4 a DNA bakuloviru BacPAK6 do buněk Sf9 (Kittsa Possee, Biotechniques, 14(5),810,1993). Výskyt El a E4 v genomu rekombinantních bakulovirů se poté kontroluje PCR za použití infikovaných buněk Sf9. Transkripce El a E4 v buňkách Huh7 infikovaných purifikovaným rekombinantním bakulovirem se analyzuje RT-PCR za použití cytoplazmatických RNA.
Pro konstrukci bakuloviru E1-E4 mohou být zavedeny různé fragmenty nesoucí El. Fragmenty použité v tomto příkladě jsou ty, které jsou popsané v příkladu 3 pro konstrukci bakuloviru-El,
-18CZ 293947 B6 obsahující oblasti El pod kontrolou jejich vlastního promotoru (redukovaný promotor Ela a promotor Elb). Použité fragmenty E4 jsou následující:
- fragment Maell-MscI 32720 až 35835 nesoucí celou E4
- fragment BglII-PvuII 34115 až 33126 nesoucí rámec ORF6
- fragment BglII—BglII 34115 až 32490 nesoucí rámce ORF6-ORF6/7
- fragment PvuII-AluI 34801-33329 nesoucí rámec ORF3.
Tyto fragmenty jsou umístěny alternativně pod kontrolu promotoru E4 nebo jiných promotorů, konkrétně HSV-TK nebo promotoru CMV nebo RSV-LTR.
Pozice udané výše se vztahují na sekvenci divokého typu Ad5 adenoviru, jak je publikována a přístupná v databázi. Ačkoliv mohou existovat některé menší odchylky mezi různými adenovirovými sérotypy, tyto pozice jsou obecně přenosné na jiné sérotypy, konkrétně na Ad2, Ad7, Adl2aAdCAV-2.
4-2 Transkomplementace AdAElAE4-LacZ s Bac.El-E4
Produkce adenoviru AdAElAE4-LacZ se získá zavedením bakuloviru El, E4 připraveného v příkladu 4-1 a adenovirového genomu defektního v El a E4 do kompetentních buněk (viz obrázek 1). Analyzují se optimální podmínky pro produkci AdAElAE4-LacZ v kompetentních buňkách transkomplementací s purifikovaným Bac.El-E4. Titr AdAElAE4 se určuje jako počet transdukčních jednotek (t.d.u.) β-galaktosidázy v linii W162 a získaná transkomplementační účinnosti je srovnána s účinností enkapsidační linie IGRP2.
Příklad 5
Konstrukce bakuloviru komplementujícího celý adenovirové genom
Ačkoliv byla publikována současná exprese několika protienů, které mohou představovat až sekvenci o velikosti 13 kb, jedním virem (Belyaev a Roy, NAR, 21,1219,1993), maximální klonovací kapacita není dostatečně doložena. Tento příklad nyní ukazuje, že je možné klonovat adenovirový genom s odstraněným enkapsidačním signálem (Ad.Psi-), který je ohraničený dvěma místy LoxP [losP-ITR-ITR až E4-loxP], do bakuloviru. Infekce kompetentních buněk exprimujících rekombinázu Cre, indukovatelným nebo jiným způsobem, (linie Cre nebo Cre-ER, viz příklad 7), tímto rekombinantním bakulovirem, a aktivace rekombinázy Cre umožňuje excisi a cirkularizaci adenovirového genomu. Ten je poté schopný transdukce časných genů, replikace a aktivace pozdních genů, ale neschopný enkapsidace, a tudíž slouží jako pomocník pro produkci minimálního adenoviru (viz obrázky 2-4). V tomto systému je produkce minimálních adenovirů založena na společné infekci dvěma bakuloviry a realizaci 2 rekombinantních jevů mezi dvěma místy loxP. Tento přístup má výhodu, že nevznikají adenovirové částice z pomocného viru.
Konstrukce genomu Ad.Psi- se provádí z E. coli. Ta tím účelem se kompletní genom adenoviru Ad5 klonuje do prokaryotického klonovacího vektoru, s připojenými ITR. Sekvence Psi je odstraněna enzymatickým štěpením a ligací, nebo místně cílenou mutagenezí. Sekvence LoxP je poté zavedena na každou stranu adenovirového genomu, v paralelní orientaci. Výsledný konstrukt [loxP-ITR-ITR, APsi až E4-loxP] je poté klonován do kyvadlového vektoru umožňujícího rekombinaci s bakulovirem podle strategie popsané v příkladu 3. Získaný rekombinantní bakulovirus, nazvaný BacAd.Psi-, poté izolován pomocí obvyklých metod.
-19CZ 293947 B6
Příklad 6
Konstrukce bakuloviru obsahujícího genom defektního rekombinantního adenoviru v odstranitelné formě
Tento příklad popisuje konstrukci bakuloviru, který umožňuje poskytnout genom defektního rekombinantního adenoviru v kompetentních buňkách. Konkrétněji je rekombinantní virus defektní pro celou kódující oblast a obsahuje pouze oblasti ITR a Psi (minimální adenovirus, nebo AdA).
6-1. Konstrukce minigenomu (AdA) v E. coli
Sestrojí se plazmid p[loxP-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA)-loxP]. Za tím úsekem se izoluje sekvence kopie sekvence ITR adenoviru enzymovým štěpením a/nebo se amplifíkuje pomocí PCR, a pak se klonuje v protisměru sekvence ITR-Psi obsažené v kyvadlovém vektoru z adenoviru pGY63. Tento vektor pochází z pCOl (W096/10088) a má gen LacZ pod kontrolou časného promotoru cytomegaloviru (P.CMV) zakončený polyadenylačním signálem viru SV40 (pA), klonovaným mezi sekvenci ITR-Psi a gen kódující pIX. Oblast (ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZpA) tohoto vektoru (odpovídající minimálnímu adenovirovém genomu) je poté izolován enzymovým štěpením a klonována mezi místa LoxP do mnohočetného klonovacího místa plazmidu pBS246 (Gibco) za vzniku plazmidu p[loxP-(ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA)-loxP]. Kapacita produkce adenovirových minigenomů z cirkulámí DNA a jejich enkapsilace se poté testuje transfekcí tohoto plazmidu do linie IGRP2 infikované s AdAElAE4 exprimujícím rekombinázu Cre (AdCre). Minimální adenoviry se amplifikují několika postupnými pasážemi supematantů z transfekce linie IGRP2. Pak jsou purifikovány stočením v izopyknickém gradientu chloridu česného a kvantifikovány pseudotitrací linie W162. Rozumí se, že gen LacZ může být snadno nahrazen jakoukoliv požadovanou nukleovou kyselinou obvyklými technikami molekulární biologie.
6-2. Klonování odstranitelného minigenomu do bakuloviru
Konstrukt nesoucí minigenom AdA ohraničený dvěma místy loxP popsaný výše se klonuje do lokusu P10 bakuloviru do kyvadlového vektoru pAcUWl (Pharmingen, USA). Bakulovirus Bac.AdA se poté produkuje a izoluje obvyklou technikou kontransfekce do výše uvedených buněk Sf9, a vybírá podle svého fágového fenotypu (bílý) po označení s X-Gal. Tento bakulovirus proto nese vysoce defektní adenovirový genom, ohraničený dvěma oblastmi loxP v přímé orientaci.
6-3. Produkce AdA transkomplementací s bakulovirem BacAdPsi“
Kompetentní buňky se současně společně infikují (koinfikují) bakulovirem BacAdPsi- (popsaným v příkladu 5), nesoucí transkomplementační funkce celého adenovirového genomu, a bakulovirem Bac.AdA nesoucím genom PseudoAdenoviru (popsaným výše). Rekombináza Cre je zajištěna buď přidáním proteinu do kultivačního média, nebo transfekcí buněk s plazmidem nebo virem (bakulovirem) exprimujícím Cre, nebo expresí kazety trvale integrované do genomu linie (jak je popsáno v příkladu 7). Minimální adenovirus se amplifíkuje postupnou pasáží supematantu tkáňové kultury buněk společně infikovaných s BacAd.Psi- a se supematantem, a poté se purifíkuje a titruje pomocí technik uvedených výše. Tato technika umožňuje získat AdA jako jediný virus, což umožňuje jeho izolaci a purifíkaci obvyklými technikami. Kromě toho získané titry jsou slučitelné s průmyslovým použitím.
-20CZ 293947 B6
Příklad 7
Konstrukce linie exprimující protein Cre
Tvoří se linie exprimující Cre, indukovatelným způsobem nebo jinak, aby se zvýšila účinnost rekombinace mezi místy loxP v bakuloviru vynálezu (například Bac.AdA and Bac.Ad.Psi-) a aby se kontrolovala exprese Cre. V tomto konstruktu je Cre exprimován samotný nebo ve formě fuzního proteinu C-koncové části s vazebnou doménou estradiolového receptoru (ER) (Metzger 10 et al., 1996, citovaný výše) pod kontrolou běžného promotoru, výhodně silného promotoru indukovatelného nebo jiného. Výhodněji použité promotory jsou promotor pGRE5, promotor metalothioninu, promotor SV40 nebo promotor genu HSV-TK.
Aby se vytvořily tyto linie Cre, kotransfekují se kompetentní buňky dvěma plazmidy, kdy jeden 15 obsahuje expresní kazetu Cre (Cre nebo Cre-ER) a druhý markér pro selekci (Neo). Vybírají se klony G418 rezistentní, aktivita Cre v těchto klonech se testuje transfekci plazmidu p(P.CMVloxP-ATG-stop-pA-LoxP-LacZ). Tento plazmid obsahuje gen LacZ inaktivovaný zavedením mezi promotor (P.CMV) a začátek LacZ, řadu stopovacích kodonů ve třech čtecích rámcích, signál pro terminaci transkripce a polyadenylační signál viru SV40 ohraničený dvěma místy 20 loxP. Exprese Cre ve klonech, v přítomnosti či nepřítomnosti induktoru (estradiol), se poté odhaluje aktivitou β-galaktosidázy vyvolanou rekombinací mezi dvěma místy loxP. Vybírá se tedy několik klonů trvale exprimujících tužní protein Cre-ER nebo samotný protein Cre bez promotorů a níže specifikované kompetentní buňky. Tyto klony mohou být použity pro produkci virů podle vynálezu.
Kompetentní. Promotor Promotor SV40 Promotor MMTV Promotor GRE5
buňka HSV-TK
Rekcmbináza Cre Cre- Cre Cre- Cre Cre- Cre Cre-
ER ER ER ER
253 C · — č. 7 č. 13 č. 19 č. 25 č. 31 č. 37 č. 43
IGRP2 č. 2 č. 8 č. 14 ó. 20 č. 26 č. 32 č. 38 č. 44
Huf7 č. 3 č. 9 č. 15 č. 21 č. 27 č. 33 č. 39 č. 45
HepG2 č. 4 č. 10 č. 16 č. 22 ó. 28 Č. 34 č. 40 č.. 46
HER č. 5 č. 11 č. 17 č. 23 č. 29 č. 35 č. 41 č. 47
Věro č. 6 č. 12 č. 18 č. 24 č. 30 č. 36 č. 42 č. 48

Claims (39)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob přípravy defektních rekombinantních virů, vyznačující se tím, že genom defektního rekombinantního viru a bakulovirus obsahující funkce nezbytné pro transkomplementaci defektního rekombinantního genomu se vnese do populace kompetentních buněk.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že bakulovirus obsahuje všechny funkce nezbytné pro transkomplementaci defektního rekombinantního genomu.
  3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že bakulovirus obsahuje některé funkce nezbytné pro transkomplementaci defektního rekombinantního genomu, přičemž zbylé funkce poskytuje komplementní buňka.
  4. 4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že funkce nezbytné pro transkomplementaci defektního rekombinantního genomu poskytuje několik bakulovirů.
  5. 5. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že defektní rekombinantní virus je defektní rekombinantní adenovirus.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že genom rekombinantního adenoviru je defektní v jedné nebo několika funkcích vybraných z El, E2, E3, E4, LI až L5, pIX, a IVa2, a bakulovirus obsahuje všechny funkce nezbytné pro transkomplementaci defektního rekombinantního genomu.
  7. 7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že genom rekombinantního adenoviru je defektní v jedné nebo několika funkcích vybraných z El, E2, E3, E4, LI až L5, pIX a IVa2, a bakulovirus obsahuje některé funkce nezbytné pro transkomplementaci defektního rekombinantního genomu, přičemž zbylé funkce poskytuje jeden nebo několik bakulovirů a/nebo kompetentní buňka.
  8. 8. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že pomocný bakulovirus obsahuje celý nebo část úseku El z adenoviru, což umožňuje komplementaci rekombinantního adenovirového genomu defektního v úseku El.
  9. 9. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že pomocný bakulovirus obsahuje celý nebo část úseku E2 z adenoviru, což umožňuje komplementaci rekombinantního adenovirového genomu defektního v úseku E2.
  10. 10. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že pomocný bakulovirus obsahuje celou nebo část úseku E4 z adenoviru, což umožňuje komplementaci rekombinantního adenovirového genomu defektního v úseku E4.
  11. 11. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že pomocný bakulovirus obsahuje celé nebo části úseků El a E4 z adenoviru, což umožňuje komplementaci rekombinantního adenovirového genomu defektního v úsecích Ela E4.
  12. 12. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že rekombinantní adenovirový genom postrádá všechny kódující virové úseky a pomocný bakulovirus obsahuje všechny funkce umožňující jeho komplementaci.
  13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že bakulovirus obsahuje celý adenovirový genom kromě enkapsidačního úseku a případně úseků ITR.
    -22CZ 293947 B6
  14. 14. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že komplementační funkce přítomné v bakuloviru a genom defektního rekombinantního viru neobsahující úsek homologie, který by byl schopen vyvolat rekombinaci.
  15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že rekombinantní adenovirový genom defektní v úseku El a případně v E3 se vnese do kompetentních buněk, a tyto buňky jsou infikovány, současně nebo jinak, bakulovirem obsahujícím úsek El, přičemž adenovirový úsek El přítomný v bakuloviru a genom defektního rekombinantního viru neobsahují úsek homologie, který by byl schopen vyvolat rekombinaci.
  16. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že bakulovirus obsahuje fragment 391 až 3511 adenoviru Ad5, a v genomu rekombinantního adenoviru defektního v úseku El je rozsáhlejší delece.
  17. 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že bakulovirus obsahuje fragment 391 až 3511 adenoviru Ad5, a v genomu rekombinantního adenoviru defektního v úseku El je delece zasahující nukleotidy 383 až 3512 včetně.
  18. 18. Rekombinantní bakulovirus pro použití ve způsobu podle nároku 1, který obsahuje, vloženou do svého genomu, komplementační funkci, řízenou heterologním promotorem, přičemž tato funkce je vybrána ze všech nebo některých, a to buď sama, nebo v kombinacích, funkcí kódovaných adenovirovými úseky El, E2, E4, LI až L5, pIX a IVa2.
  19. 19. Rekombinantní bakulovirus pro použití ve způsobu podle nároku 1, který obsahuje, vloženou do svého genomu, komplementační funkci, řízenou heterologním promotorem, přičemž tato funkce je vybrána ze všech nebo některých, a to buď sama, nebo v kombinacích, funkcí kódovaných úseky Rep a Cap z AAV.
  20. 20. Rekombinantní bakulovirus pro použití ve způsobu podle nároku 1, který obsahuje, vloženou do svého genomu, komplementační funkci, řízenou heterologním promotorem, přičemž tato funkce je vybrána ze všech nebo některých, a to buď sama, nebo v kombinacích, funkcí kódovaných úseky gag, pol a env retrovirů.
  21. 21. Bakulovirus podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, kde promotorem je promotorový úsek přirozeně odpovídající za expresi komplementačních funkcí.
  22. 22. Bakulovirus podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20, kde promotor je silný buněčný nebo virový promotor, buďto regulovaný, nebo jiný.
  23. 23. Bakulovirus podle nároku 18, kde komplementační funkce obsahuje úsek El adenovirového genomu nebo jenom jeho část, která obsahuje alespoň úsek Ela.
  24. 24. Bakulovirus podle nároku 18, kde komplementační funkce obsahuje úsek E4 adenovirového genomu nebo jenom jeho část, která obsahuje alespoň rámec ORF3 nebo ORF6.
  25. 25. Bakulovirus podle nároku 18, který obsahuje všechny kódující úseky adenovirového genomu.
  26. 26. Bakulovirus podle nároku 25, který obsahuje úplný adenovirový genom postrádající enkapsidační úsek.
  27. 27. Bakulovirus podle kteréhokoliv z nároků 18 až 26, který je bakulovirus kmene AcNPV.
  28. 28. Bakulovirus podle kteréhokoliv z nároků 18 až 27, kde nukleová kyselina kódující komplementační funkci je vnesena v úrovni polyhedrinového lokusu nebo lokusu plO.
    -23CZ 293947 B6
  29. 29. Bakulovirus podle kteréhokoliv z nároků 18 až 28, kde nukleová kyselina kódující komplementační funkci je vnesena ve formě kazety, která je schopna vystřižení v kompetentních buňkách.
  30. 30. Rekombinantní bakulovirus pro použití ve způsobu podle nároku 1, který obsahuje, a sice vložený do svého genomu, alespoň jeden úsek DNA obklopený dvěma sekvencemi, které umožňují místně-specifickou rekombinaci, umístěnými v přímé orientaci, přičemž uvedený úsek DNA obsahuje alespoň jeden replikační počátek funkční v kompetentních buňkách a nukleovou kyselinu kódující komplementační funkci viru, kterým je adenovirus nebo AAV.
  31. 31. Bakulovirus podle nároku 30, kde sekvence, které umožňují místně-specifickou rekombinaci, jsou sekvence LoxP bakteriofága Pl, a rekombinace je dosaženo v přítomnosti proteinu Cre.
  32. 32. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že defektní rekombinantní genom je vnesen do buňky infekcí adenovirem, který obsahuje uvedený genom.
  33. 33. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že defektní rekombinantní genom je vnesen do buňky transfekcí.
  34. 34. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že defektní rekombinantní genom je vnesen do buňky rekombinantním bakulovirem, který je odlišný od bakuloviru nesoucího komplementační funkce.
  35. 35. Rekombinantní bakulovirus pro použití ve způsobu podle nároku 1, který obsahuje, a sice vložený do svého genomu, alespoň jeden úsek DNA obklopený dvěma sekvencemi, které umožňují místně-specifickou rekombinaci, umístěnými v přímé orientaci, přičemž uvedený úsek DNA obsahuje alespoň jeden replikační počátek funkční v kompetentních buňkách a defektní adenovirový genom.
  36. 36. Bakulovirus podle nároku 35, kde defektní rekombinantní adevirový genom obsahuje nezbytně úsek ITR, enkapsidační sekvenci a požadovanou nukleovou kyselinu.
  37. 37. Způsob přípravy defektních rekombinantních adenovirů podle nároku 1,vyznačující se tí m, že se populace komplementníchbuněk infikuje bakulovirempodle nároku 30 nebo 31 a bakulovirem podle nároku 35 nebo 36, v buňkách se v přítomnosti rekombinázy provede místně-specifická rekombinace, a pak se získají produkované adenoviry.
  38. 38. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že populace kompetentních buněk je populace jatemích nebo svalových buněk, fibroblastů, embryonálních nebo epitelových buněk (zvláště plicních), buněk oka (zvláště retiny) nebo nervových buněk.
  39. 39. Způsob podle nároku 3 8, vyznačující se t í m , že populace kompetentních buněk se vybere z buněk 293 nebo jakýchkoliv odvozených buněk, obsahujících další komplementační funkce, A549, HuH7, Hep3B, HepG2, HER, 911, HeLa nebo KB.
CZ19991822A 1996-11-22 1997-11-18 Způsob přípravy rekombinantních virů a rekombinantní virus CZ293947B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9614278A FR2756297B1 (fr) 1996-11-22 1996-11-22 Procede de production de virus recombinants
PCT/FR1997/002073 WO1998022607A1 (fr) 1996-11-22 1997-11-18 Procede de production de virus recombinants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ182299A3 CZ182299A3 (cs) 1999-08-11
CZ293947B6 true CZ293947B6 (cs) 2004-08-18

Family

ID=9497899

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19991822A CZ293947B6 (cs) 1996-11-22 1997-11-18 Způsob přípravy rekombinantních virů a rekombinantní virus

Country Status (18)

Country Link
US (2) US6387670B1 (cs)
EP (1) EP0946741B1 (cs)
JP (1) JP4686670B2 (cs)
KR (1) KR100719645B1 (cs)
AT (1) ATE317908T1 (cs)
AU (1) AU731106B2 (cs)
BR (1) BR9713388B1 (cs)
CA (1) CA2271438C (cs)
CZ (1) CZ293947B6 (cs)
DE (1) DE69735274T2 (cs)
ES (1) ES2260803T3 (cs)
FR (1) FR2756297B1 (cs)
HU (1) HU224713B1 (cs)
IL (1) IL129686A (cs)
NO (2) NO323937B1 (cs)
SK (1) SK286900B6 (cs)
WO (1) WO1998022607A1 (cs)
ZA (1) ZA9710516B (cs)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003501042A (ja) * 1999-05-27 2003-01-14 ジェノボ， インコーポレイテッド 非哺乳動物ウイルス由来のキャリアベクターを使用する、組換えウイルスの産生のための組成物および方法
US6793926B1 (en) 1999-05-27 2004-09-21 Genovo, Inc. Methods for production of a recombinant adeno-associated virus
AU5448400A (en) * 1999-05-28 2000-12-18 Mount Sinai School Of Medicine, The A novel baculovirus/adenovirus hybrid vector for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors
GB9919409D0 (en) 1999-08-18 1999-10-20 Univ Oxford Brookes Baculovirus expression system
EP1572943B1 (en) 2002-08-29 2015-04-22 The Board of Trustees of The Leland S. Stanford Junior University Circular nucleic acid vectors, and methods for making and using the same
GB0702694D0 (en) * 2007-02-12 2007-03-21 Ark Therapeutics Ltd Vectors
GB0702695D0 (en) * 2007-02-12 2007-03-21 Ark Therapeutics Ltd Production of vectors
EP2019143A1 (en) 2007-07-23 2009-01-28 Genethon CNS gene delivery using peripheral administration of AAV vectors
EP2058401A1 (en) 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
WO2009110001A1 (en) * 2008-03-05 2009-09-11 Council Of Scientific & Industrial Research A polymeric hybrid membrane
EP2287323A1 (en) 2009-07-31 2011-02-23 Association Institut de Myologie Widespread gene delivery to the retina using systemic administration of AAV vectors
EP2292781A1 (en) 2009-08-17 2011-03-09 Genethon Baculovirus-based production of biopharmaceuticals free of contaminating baculoviral virions
CN102884196B (zh) * 2010-04-01 2015-05-06 肖卫东 重组病毒载体的结构及其制备
BR112012026095A2 (pt) 2010-04-14 2015-09-15 Emd Millipore Corp métodos de produção de estoques de vírus de alta pureza e altos títulos e métodos de uso dos mesmos.
EP2847337A4 (en) 2012-05-09 2016-04-27 Univ Oregon Health & Science PLASMIDS AND VIRAL VECTORS ASSOCIATED WITH ADENOVIRUS
TWI775096B (zh) 2012-05-15 2022-08-21 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
WO2013190059A1 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Association Institut De Myologie Widespread gene delivery of gene therapy vectors
US11078464B2 (en) * 2013-08-30 2021-08-03 Amgen Inc. High titer recombinant AAV vector production in adherent and suspension cells
IL259321B2 (en) 2014-03-17 2023-10-01 Univ Washington Preparations and methods for increasing gene expression in frogs
CN114480502A (zh) 2015-03-02 2022-05-13 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 用于将多核苷酸玻璃体内递送到视网膜视锥的组合物和方法
GB2545763A (en) 2015-12-23 2017-06-28 Adverum Biotechnologies Inc Mutant viral capsid libraries and related systems and methods
US10538571B2 (en) 2017-11-27 2020-01-21 Coda Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for neurological diseases
US10610606B2 (en) 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
CN112041437A (zh) 2018-02-19 2020-12-04 同源药物公司 用于恢复f8基因功能的腺相关病毒组合物和其使用方法
US20230193315A1 (en) 2019-01-31 2023-06-22 Oregon Health & Science University Methods for using transcription-dependent directed evolution of aav capsids
US20220348635A1 (en) 2019-08-21 2022-11-03 Coda Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for neurological diseases
TW202140791A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
TW202208632A (zh) 2020-05-27 2022-03-01 美商同源醫藥公司 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法
GB202013940D0 (en) 2020-09-04 2020-10-21 Synpromics Ltd Regulatory nucleic acid sequences
US20230374542A1 (en) 2020-10-07 2023-11-23 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus delivery of fukutin related protein (fkrp) for treating dystroglycanopathy. disorders including limb girdle 21 (lgmd21)
WO2023212298A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Bispecific antibodies and methods of treating ocular disease
WO2023212294A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Angiopoietin-related protein 7-specific antibodies and uses thereof
WO2023212293A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Complement factor h related 4-specific antibodies and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL92298A (en) * 1988-11-14 2001-04-30 Us Secretary U S Dept Of Comme Method for producing isolated empty b19 parvovirus capsids, introducing genes into cells utilizing the same, diagnostic assays for detecting parvovirus infection and an anti-parvovirus vaccine containing said capsids
US5559099A (en) * 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
CA2200835A1 (en) * 1994-09-23 1996-03-28 Frederick M. Boyce Use of a non-mammalian dna virus to express an exogenous gene in a mammalian cell

Also Published As

Publication number Publication date
AU5226198A (en) 1998-06-10
BR9713388B1 (pt) 2009-01-13
HUP0001762A2 (hu) 2000-09-28
JP2001503993A (ja) 2001-03-27
CZ182299A3 (cs) 1999-08-11
US20030022356A1 (en) 2003-01-30
JP4686670B2 (ja) 2011-05-25
BR9713388A (pt) 2000-03-21
ATE317908T1 (de) 2006-03-15
EP0946741B1 (fr) 2006-02-15
ZA9710516B (en) 1998-06-10
DE69735274D1 (de) 2006-04-20
HU224713B1 (en) 2006-01-30
NO323937B1 (no) 2007-07-23
ES2260803T3 (es) 2006-11-01
SK66699A3 (en) 2000-02-14
KR100719645B1 (ko) 2007-05-17
NO992464D0 (no) 1999-05-21
US6387670B1 (en) 2002-05-14
DE69735274T2 (de) 2006-10-12
WO1998022607A1 (fr) 1998-05-28
SK286900B6 (sk) 2009-07-06
FR2756297A1 (fr) 1998-05-29
CA2271438C (fr) 2010-10-26
HUP0001762A3 (en) 2002-01-28
IL129686A0 (en) 2000-02-29
CA2271438A1 (fr) 1998-05-28
EP0946741A1 (fr) 1999-10-06
AU731106B2 (en) 2001-03-22
NO992464L (no) 1999-06-23
IL129686A (en) 2005-12-18
NO2013009I1 (no) 2013-04-29
FR2756297B1 (fr) 1999-01-08
KR20000057202A (ko) 2000-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100719645B1 (ko) 재조합 바이러스 생성방법
EP1226264B1 (en) Cell lines and constructs useful in production of e1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
SK174297A3 (en) Recombinant adenoviruses, use thereof for preparing aavs, complementary cell line, and pharmaceutical compositions containing said adenoviruses
JP2002507897A (ja) 遺伝子治療で用いるべきヒト組換えアデノウイルス用のパッケージングシステム
SK99097A3 (en) Cells for the production of recombinant adenoviruses
SK282843B6 (sk) Defektný rekombinantný adenovírus a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom
US20100008947A1 (en) Porcine adenovirus e1 and e4 regions
AU2437200A (en) Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use
MXPA99004449A (en) Method for producing recombinant virus
WO2000073424A1 (en) A novel baculovirus/adenovirus hybrid vector for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors
AU7560500A (en) Modified adenoviral vectors for use in gene therapy
JP2002535961A (ja) ヘルパー依存性アデノウイルスベクター生産用細胞の製法およびその使用法
EP1083228A1 (en) Modified adenoviral vectors for use in gene therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20171118