JP2001503993A - 組換えウイルスの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は組換えウイルスの製造方法に関する。本方法は特に、相補機能を導入するためにバキュロウイルスを使用するものである。本発明は更に、本方法を実施するために使用される構築物、生産された細胞及びこうして製造したウイルスにも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えウイルスの製造方法 本発明は組換えウイルスの製造方法に関する。本発明は前記方法を実施するた めに使用される構築物、産生細胞及びこうして製造されたウイルスにも関する。 これらのウイルスはｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ viｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子 クローニング及び／又は発現用ベクターとして使用可能である。 ウイルス起源ベクターは（組換えタンパク質の製造、スクリーニング試験の実 施、遺伝子調節研究用等に）ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又は（動物モデ ルの作出用又は治療アプローチで）ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子クローニング、導入及 び発現に広く使用されている。これらのウイルスとしては、アデノウイルス、ア デノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニ アウイルスを特に挙げることができる。 アデノウイルス科は哺乳動物と鳥類に広く分布しており、正二十面体対称キャ プシドをもつエンベロープなし２本鎖ＤＮＡウイルスの百種類以上の血清型を含 む(Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ ＢＮ，Ｋｎｉｐｅ ＤＭ，Ｈｏｗｌ ｅｙ ＰＭ 編，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．第３版，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｉａ：Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂ ｌｉｓｈｅｒｓ，１９９６：２１４９−２１７１)。アデノウイルスは安全性に 加え、非常に広い細胞親和性をもつ。細胞周期が細胞分裂に依存するレトロウイ ルスとは異なり、活性分裂細胞だけでなく休止細胞にも感染することができ、そ のゲノムはエピソーム形態で維持される。更に、高力価（１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌ） で生産され得る。これらの主要利点により、異種遺伝子のクローニング及び発現 用ベクターとして選択されている。Ｃ亜属（特に２及び５型）のアデノウイルス とＣＡＶ−２型イヌアデノウイルスは分子生物学が最もよくわかっており、実用 されているベクターに利用されている。 アデノウイルスは複製起点を含む各末端の１０３ｂｐの逆方向反復配列（ＩＴ Ｒ）と、左側ＩＴＲの近傍に配置されたパッケージングシグナルを含む３６ｋｂ の直鎖状ゲノムをもつ（Ｓｈｅｎｋ，Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉ ｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄ ｓ ＢＮ，Ｋｎｉｐｅ ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ ＰＭ編，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｐｈ ｉｌａｄｅｌｐｉａ：Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９６：２１１１ −２１４８）。ウイルス周期中に次の３群 の遺伝子群が発現される。 −細胞遺伝子の調節に関与し、特に細胞のＳ期導入（Ｅ１Ａ）とアポトーシスの 阻害（Ｅ１Ｂ）を可能にする極初期遺伝子（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４）。これ らの遺伝子はメッセンジャーＲＮＡの転写、スプライシング又は輸送のレベルで 初期又は後期ウイルス遺伝子の調節にも関与している（Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４） 。また、複製と免疫応答エスケープにも役割を果たす。 −後初期遺伝子（ｐＩＸ及びＩＶａ２）は後期遺伝子の転写の調節（ＩＶａ２） とビリオンの組立て（ｐＩＸ）に関係がある。 −後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５）は強力なプロモーター（ＭＬＰ）から転写される。 ２８ｋｂの一次転写産物は交互スプライシングと５個のポリアデニル化部位の使 用により、ウイルス粒子の組立て及び成熟に関与する種々の構造（コア、ペント ン、ヘキソン）及び非構造タンパク質に対応する転写産物を生成することができ る。 アデノウイルスベクターはｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子クローニング及び発現（Ｇ ｌｕｚｍａｎら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １１７２４，ｐ．１８７）、トランスジェニック動物の作出（ＷＯ９５／２２６ １６）、遺 伝子のｅｘ ｖｉｖｏ細胞導入（ＷＯ９５／１４７８５；ＷＯ９５／０６１２０ ）又は遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ細胞導入（特にＷＯ９３／１９１９１，ＷＯ９４ ／２４２９７，ＷＯ９４／０８０２６参照）に使用されている。 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、比較的小寸法のＤＮＡをもつウイルスであ り、これに感染する細胞のゲノムに比較的部位特異的に安定に組込まれる。アデ ノ随伴ウイルスは細胞増殖、形態又は分化に影響することなく広範な細胞に感染 することができる。また、ヒトで疾病に関与しないと思われる。ＡＡＶのゲノム は既にクローニングされ、配列及び特性を決定されている。前記ゲノムは約４７ ００塩基を含み、ウイルスの複製起点として機能する約１４５塩基の逆方向反復 領域（ＩＴＲ）各末端に含む。ゲノムの残余はパッケージング機能をもつ２つの 主領域に分けられ、ゲノムの左側部分はウイルス複製とウイルス遺伝子の発現に 関与するｒｅｐ遺伝子を含み、ゲノムの右側部分はウイルスのキャプシドタンパ ク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む。 ＡＡＶに由来するベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入 に利用することは文献に記載されている （特にＷＯ９１／１８０８８；ＷＯ９３／０９２３９；米国特許第４，７９７， ３６８号、５，１３９，９４１号、ヨーロッパ特許第４８８５２８号参照）。 レトロウイルスは分裂細胞に選択的に感染する組込みウイルスである。従って 、例えば癌や再発狭窄症に適用するのに有利なベクターである。レトロウイルス のゲノムは主に２つのＬＴＲと、パッケージング配列と、３つのコーディング領 域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を含む。組換えベクターの構築とそのｉｎ ｖ ｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ使用については文献に広く記載されており、特にＢ ｒｅａｋｆｉｅｌｄら，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ３（１９９１）２０３； ヨーロッパ特許第４５３２４２号及び１７８２２０号、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら， Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７（１９８５）２３５；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，ＢｉｏＴｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ ３（１９８５）６８９等を参照されたい。 組換えベクターとして使用するために、種々の目的遺伝子を組込んだ種々のウ イルス由来構築物が作製されている。これらの構築物はいずれもウイルスが感染 細胞で自己複製できないようにウイルスゲノムを改変している。従って、従来技 術に記載 されている構築物は、複製に必須のゲノムの所定領域を欠損するウイルスである 。特に、アデノウイルスについては、第１世代構築物はウイルス複製に必須のＥ １領域に欠失があり、このレベルに異種ＤＮＡ配列を挿入している（Ｌｅｖｒｅ ｒｏら，Ｇｅｎｅ １０１（１９９１）１９５；Ｇｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ら，Ｇｅｎｅ ５０（１９８６）１６１）。また、ベクターの性質を改良するた めに、アデノウイルスのゲノム内に他の欠失又は変異を形成することも提案され ている。例えば、突然変異株ｔＳ１２５に感熱性点突然変異を導入し、Ｅ２領域 によりコードされる７２ｋＤａのＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）を不活化して いる（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔら，１９７５）。この他、ウイルス複製及び ／又は増殖に必須の別の領域であるＥ４領域の欠失を含むベクターもある。Ｅ１ 及びＥ４領域を欠失するアデノウイルスベクターは転写バックグラウンドノイズ とウイルス遺伝子発現が非常に低い。このようなベクターは例えば国際出願ＷＯ ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９６／２２３７８に記載されて いる。また、ＩＶａ２遺伝子のレベルに変異をもつベクターも記載されている（ ＷＯ９６／１００８８）。更に、ウイルス生産にシスで必 要な領域（ＩＴＲ及びパッケージング配列）しか含まず、全コーディングウイル ス配列を欠失する「最小アデノウイルス」又は「偽アデノウイルス」（又はＡｄ Δ）と呼ばれるベクターも記載されている（ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９４／ ２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７）が、以下に説明するようにそれらの製造は まだ非常に困難である。 ＡＡＶについては、記載されているベクターは一般にコーディング領域Ｒｅｐ 及びＣａｐを完全に除去し、目的核酸で置換している。 レトロウイルスに由来する組換えベクターでは、一般にｇａｇ、ｐｏｌ及びｅ ｎｖ遺伝子を全部又は一部除去し、目的異種核酸配列で置換している。また、組 換えレトロウイルスは転写活性を抑制するようにＬＴＲのレベルに変異を加えた り、ｇａｇ遺伝子の一部を含む拡張パッケージング配列にすることもできる（Ｂ ｅｎｄｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１９８７）１６３９）。 これらの種々の組換えウイルスは複製欠損性であるため、ゲノムの欠失機能を トランス相補できるように製造する必要がある。これらのウイルスの製造、特に トランス相補機能の導入を非常に困難にしているのはトランス相補に他ならない 。 この点では２種のアプローチが開発されている。第１はパッケージング系と呼 ばれるトランス相補系の構築である。第２はヘルパーアデノウイルス又はヘルパ ープラスミドの使用に基づく。 種々の欠損ウイルスパッケージング系が構築されている。これらの系はウイル スベクターに欠損する機能を生成することができる。一般に、これらの系はウイ ルスゲノムの欠失領域（例えばアデノウイルスではＥ１、Ｅ２及び／又はＥ４、 レトロウイルスではｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ、ＡＡＶではｒｅｐ及び／ 又はｃａｐ）をそのゲノムに組み込んでいる。 欠損アデノウイルスの製造用として知られている細胞系の１例は例えば、アデ ノウイルスのゲノムの一部を組み込んだ２９３系である。より詳細には、２９３ 系はアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のゲノムの左側末端（約１１〜１２％） を含むヒト胎児腎細胞系であり、左側ＩＴＲ、パッケージング領域、Ｅ１ａとＥ １ｂを含むＥ１領域、ｐＩＸタンパク質をコードする領域及びｐＩＶａ２タンパ ク質をコードする領域の一部を含む。この系はＥ１領域を欠損即ちＥ１領域の全 部又は一部を欠失する組換えアデノウイルスをトランス相補することができ、高 力 価をもつウイルスストックを生産することができる。この系は、感熱性Ｅ２突然 変異を更に含むウイルスストックを許容温度（３２℃）で生産することもできる 。Ｅ１領域を相補することが可能な他の細胞系としては、特にヒト肺癌細胞Ａ５ ４９（ＷＯ９４／２８１５２）やヒト網膜芽細胞（Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ． （１９９６）２１５）に由来するものも記載されている。また、アデノウイルス の複数の機能をトランス相補することが可能な細胞系も記載されている。特に、 Ｅ１及びＥ４領域を相補する系（Ｙｅｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９９６） ５５９；Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．２（１９９５）３２２；Ｋｒｏｕｇ ｌｉａｋら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６（１９９５）１５７５）と、Ｅ１及 びＥ２領域を相補する系（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ ９５／２７０７１）を挙げることができる。 欠損レトロウイルスの製造用細胞系も種々のものが記載されており、一般にｇ ａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を発現することができる。このような系は例えば ＰＡ３１７系（米国特許第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ系（ＷＯ９ ０／０２８０６）、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２系（ＷＯ８９／０７１ ５０）、ＢＯＳＣ系（ＷＯ９４／１９４７８）等である。目的核酸を含む組換え レトロウイルスを構築するためには、特にＬＴＲとパッケージング配列と目的核 酸を含むプラスミドを構築した後、このプラスミドを使用して、プラスミドに欠 失するレトロウイルス機能をトランス導入することが可能な上記のようなパッケ ージング系にトランスフェクトする。生成した組換えレトロウイルスをその後、 慣用技術により精製する。 しかし、細胞系の使用にはいくつかの欠点がある。例えばこのような細胞系を 工業規模で構築及び評価するのは困難であり、費用がかかり、制約がある。実際 に、これらの系は安定で且つ工業的利用に適合できなければならない。更に、記 載されている系は汚染性複製ウイルス（ＲＣＡ）の生産を避け難い。また、これ らの系は現状では例えば上記最小アデノウイルスのような欠損度の非常に高いウ イルスゲノムを工業的利用に十分にトランス相補することができない。実際に、 アデノウイルスは空間時間的調節が非常に複雑な種々の転写単位から編成される ゲノムをもつ。細胞系から各転写単位を別々に構成的又は条件付きで発現させる ことにより全コーディングウイルス配列を欠失するアデノウイルスをトランス相 補することはまだ十分に実施で きていない。例えば細胞系から構成的に発現されているのは、Ｅ１、Ｅ４、ｐＩ Ｘ領域及びＥ２によりコードされる３種のタンパク質（ｐｏｌ、ＤＢＰ及びｐ− ＴＰ）に対応するゲノムのごく一部に過ぎない。ゲノムの残余は２８ｋｂの一次 転写産物から構造及び非構造タンパク質の全メッセンジャーを生産し、ゲノムの 複製後に活性化される主要後期転写単位（ＭＬＴＵ）に対応する。しかし、最小 アデノウイルスを作製するためには、これらの領域のトランス相補は不可欠であ る。これらの系から非常に高力価の組換えレトロウイルスを得ることはできない 。 第２のアプローチは、相補機能を導入する構築物（プラスミド又はアデノウイ ルス）を欠損ウイルスゲノムと共にコトランスフェクトするものである。特に、 欠損組換えＡＡＶは一般に、ヒト補助ウイルス（例えばアデノウイルス）に感染 させた細胞系に、ＡＡＶの２つの逆方向反復領域（ＩＴＲ）で挟まれた目的核酸 を含むプラスミドと、ＡＡＶの相補機能（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）をもつプラ スミドを同時トランスフェクトすることにより作製される。変異体は国際出願Ｗ Ｏ９５／１４７７１、ＷＯ９５／１３３６５、ＷＯ９５／１３３９２又はＷＯ９ ５／０６７４３に記載されている。ヘルパーアデノウイルスを使用 する欠点は主に、アデノウイルスベクターとヘルパーアデノウイルスの組換えの 危険が大きく、ウイルスストックの生産及び精製時にヘルパーの組換え体を分離 しにくいという点にある。例えばＲｅｐ／ｃａｐプラスミド等のヘルパープラス ミドを使用する欠点は、得られるトランスフェクションレベルが高力価のウイル スを生産するには不十分であるという点にある。 本願はこれらの欠点を解決することが可能な新規ウイルス製造システムに関す る。本発明のシステムは相補機能を導入するためにバキュロウイルスを使用する ものである。 本発明による製造システムは、樹立相補系を使用する必要がなく、ＲＣＡの問 題がなく、高度欠損ゲノムをトランス相補できるという点が特に有利である。更 に、本発明のシステムは所望ウイルスとバキュロウイルスにより感染可能な全細 胞に適用可能であり、従って幅広い利用性を提供する。 従って、本発明の第１の目的は、欠損組換えウイルスのゲノムと、欠損組換え ゲノムのトランス相補に必要な機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスをコ ンピテント細胞集団に導入することを特徴とする欠損組換えウイルスの製造方法 にある。 従って、本発明の方法は相補機能を導入するためにバキュロ ウイルスを使用する。種々のアプローチが可能である。まず欠損組換えゲノムの トランス相補機能を発現しないコンピテント細胞を使用することができる。この 場合には、欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な全機能を含むバキュロウイ ルス又は欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の１種以上を各々もつ数 個のバキュロウイルスを使用することができる。欠損組換えゲノムの１種以上の 機能を既にトランス相補することが可能なコンピテント細胞集団（パッケージン グ系）も使用できる。その場合には、使用する１種以上のバキュロウイルスは欠 損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能のうちでコンピテント細胞によりま だトランス相補されていない機能のみを導入する。 上述のように、本発明のシステムは工業化（細胞系が不要、ＲＣＡを生産しな い等）と応用性（全欠失型をもつ組換えウイルス、特に高度欠損組換えアデノウ イルスの製造）に多数の利点がある。また、バキュロウイルスはヒト細胞で複製 しないので、得られるウイルス調製物はバキュロウイルスに汚染されない。更に 、バキュロウイルスはアデノウイルスとは系統分類的に非常に離れているため、 両者間の組換え又はトランス相補の 危険がない。従って、このシステムはＲＣＡのない欠損ウイルスの濃縮ストック を生産できるという利点がある。このシステムは欠損組換えアデノウイルスの製 造に特に有利である。 バキュロウイルスは脊椎動物に固有のエンベロープ付き環状２本鎖ＤＮＡウイ ルスである。その典型例であるＡｃＮＰＶは１３３ｂｋのゲノムをもつ。このウ イルスは２種の強力プロモーター［多面体（Ｐｈ）及びＰ１０］からの真核遺伝 子の昆虫細胞発現ベクターとしてよく使用されている（ＫｉｎｇとＰｏｓｓｅｅ ，Ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｌ ｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｍｐａｍｎ ＆ Ｈａｌｌ，１９９２）。ＡｃＮＰＶは所定 の哺乳動物細胞に感染することができるが、ゲノムは転写も翻訳もされない。最 近、Ｈｏｆｍａｎｎら（ＰＮＡＳ ９２（１９９５）１００９９）は、ＬａｃＺ 遺伝子を発現する精製組換えバキュロウイルスにより肝細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ で形質導入できることを示している。１０００という高い感染多重度でも細胞毒 性は報告されておらず、この論文に記載されているトランスフェクション効率は ＭＯＩ１００で約５０％である。 本願出願人は、種々の細胞型に組換えバキュロウイルスを感 染できることを示した。特に、本願出願人は、不死化胎児細胞等のヒト起源の細 胞に組換えバキュロウイルスを感染できることを示した。本願出願人は、非常に 高い導入効率（＞８０％）を得られることも示した。本願出願人は更に、アデノ ウイルスの相補機能をバキュロウイルスに導入し、コンピテント細胞集団でこれ らの機能を発現できることも示した。従って本願出願人は、バキュロウイルスが ウイルス相補機能の哺乳動物、特にヒト細胞導入及び発現に特に有利に使用可能 な不活性ベクターであることを示すことができた。本発明のシステムの他の利点 は、特に（ｉ）完全アデノウイルスゲノムを相補可能なクローニング能が高いこ とと、（ｉｉ）バキュロウイルス技術の前進である。 以下の文中では、ウイルスの相補機能をもつバキュロウイルスをヘルパーバキ ュロウイルスとも言う。ヘルパーバキュロウイルスはウイルスの相補のための種 々の機能を含むことができる。 例えば、ヘルパーバキュロウイルスはアデノウイルスのＥ１領域を含むことが できる。第１世代アデノウイルス即ちＥ３状態に関係なく（即ち欠損ＡｄΔＥ１ ，ΔＥ３、またはそうでない）、Ｅ１領域を欠損するアデノウイルス（ＡｄΔＥ １）の製造には Ｂａｃｕｌｏ−Ｅ１を使用することができる。第１世代欠損組換えアデノウイル ス（Ｅ１領域と場合によりＥ３を欠損）の製造は本発明の方法の特に有利な第１ の適用である。上述のように、Ｅ１機能をトランス相補することが可能な種々の 細胞系が文献に記載されている（２９３細胞、Ａ５４９細胞、９１１細胞等）。 しかし、細胞系のゲノムに組み込まれたトランス相補機能をもつ領域と、製造し ようとする組換えウイルスのＤＮＡの間には相同ゾーンが存在する。このため、 製造中に種々の組換えイベントが生じ、複製ウイルス粒子、特にＥ１＋型のアデ ノウイルスを生成する恐れがある。例えば単純組換えイベント後に染色体が切れ たり、二重組換えが生じることがある。これらの２種の変異の結果、細胞ゲノム に含まれるＥ１領域がアデノウイルスゲノム中の元の遺伝子座に再組み込みされ る。更に、２９３系により製造される組換えベクターは力価が高い（＞１０¹²） ため、これらの組換えイベントが生じる確率は高い。従って、第１世代欠損組換 えアデノウイルスベクターの多くのバッチは複製ウイルス粒子で汚染されている ことが認められ、医薬用途に重大な欠点となっている。実際に、このような粒子 が治療用組成物中に存在すると、ウイルス増殖と無制御の 伝播をｉｎ ｖｉｖｏ誘導し、炎症反応、組換え等の危険を伴う。従って、汚染 したバッチはヒト治療に使用することができない。 本発明はこれらの欠点を解決することができる。実際に、本発明の方法の１実 施態様によると、Ｅ１領域と場合によりＥ３を欠損する組換えアデノウイルスの ゲノムをコンピテント細胞に導入し、バキュロウイルスと欠損組換えアデノウイ ルスのゲノムに存在するアデノウイルスのＥ１領域が組換えを生じる恐れのある 相同（オーバーラップ）ゾーンをもたないように、これらの細胞にＥ１領域をも つバキュロウイルスを同時に又は非同時に感染させる。従って、この実施態様に よると、樹立細胞系を用いずにＲＣＡのない第１世代組換えアデノウイルススト ックを迅速に生産することができる。更に、後述するように、こうして生産した ＲＣＡのない組換えアデノウイルスストックは、コンピテント細胞にバキュロウ イルスと共に同時インフェクトすることにより新規製造用出発材料として使用す ることができる。 ヘルパーバキュロウイルスは更にアデノウイルスのＥ２領域の全部又は一部、 特にＥ２ａ及び／又はＥ２ｂ領域を含んでい てもよい。Ｅ２領域（Ａｄ−ΔＥ２）と場合によりＥ３領域（Ａｄ−ΔＥ２，Δ Ｅ３）を欠損するアデノウイルスをコンピテント細胞で製造するにはｂａｃｕｌ ｏ−Ｅ２を使用することができる。更に、アデノウイルスのＥ１領域を相補する ことが可能なコンピテント細胞でｂａｃｕｌｏ−Ｅ２を使用すると、Ｅ１及びＥ ２領域（Ａｄ−ΔＥ１，ΔＥ２）と場合によりＥ３領域（Ａｄ−ΔＥ１，ΔＥ２ ，ΔＥ３）を欠損する組換えアデノウイルスを製造することができる。同様に、 アデノウイルスのＥ１及びＥ４領域を相補することが可能なコンピテント細胞（ 例えばＩＧＲＰ２細胞）でｂａｃｕｌｏ−Ｅ２を使用すると、Ｅ１、Ｅ２及びＥ ４領域（Ａｄ−ΔＥ１，ΔＥ２，ΔＥ４）と場合によりＥ３（Ａｄ−ΔＥ１，Δ Ｅ２，ΔＥ３，ΔＥ４）を欠損する組換えアデノウイルスを製造することができ る。 ヘルパーバキュロウイルスは更にアデノウイルスのＥ４領域を（全部又は一部 ）含んでいてもよい。Ｅ４領域（Ａｄ−ΔＥ４）と場合によりＥ３領域（Ａｄ− ΔＥ４，ΔＥ３）を欠損するアデノウイルスをコンピテント細胞で製造するには ｂａｃｕｌｏ−Ｅ４を使用することができる。更に、アデノウイルスのＥ１領域 を相補することが可能なコンピテント細胞でｂａｃｕ ｌｏ−Ｅ４を使用すると、Ｅ１及びＥ４領域（Ａｄ−ΔＥ１，ΔＥ４）と場合に よりＥ３領域（Ａｄ−ΔＥ１，ΔＥ４，ΔＥ３）を欠損する組換えアデノウイル スを製造することができる。 ヘルパーバキュロウイルスは更にアデノウイルスのＥ１及びＥ４領域を（全部 又は一部）含んでいてもよい。図１に示すように、Ｅ１及びＥ４領域（Ａｄ−Δ Ｅ１，ΔＥ４）と場合によりＥ３領域（Ａｄ−ΔＥ１，ΔＥ４，ΔＥ３）を欠損 するアデノウイルスをコンピテント細胞で製造するにはｂａｃｕｌｏ−Ｅ１，Ｅ ４を使用することができる。 更に、Ｅ１及びＥ４領域を欠損するウイルスを作製するためには、夫々Ｅ１機 能とＥ４機能の全部又は一部を発現する２種のヘルパーバキュロウイルスを使用 することもできる。 同様に、ヘルパーバキュロウイルスはＥ１、Ｅ２及びＥ４領域（全部又は一部 ）と、場合により後期遺伝子をもつ領域（Ｌ１〜Ｌ５）を含んでいてもよい。 ヘルパーバキュロウイルスは更にＡＡＶのＲｅｐ及び／又はＣａｐ領域を含ん でいてもよい。例えば、ｂａｃｕｌｏ−Ｒｅｐ／Ｃａｐは全コーディングウイル ス配列を欠失するＡＡＶゲノムを相補することができる（図５）。 バキュロウイルスは更にレトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ領 域を含んでいてもよい。例えば、ｂａｃｕｌｏ−ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖは全コ ーディングウイルス配列を欠失するレトロウイルスゲノムをコンピテント細胞系 で相補することができる。ｇａｇ／ｐｏｌ領域を含むバキュロウイルスとｅｎｖ 領域を含む第２のバキュロウイルスを使用することもできる。 一般に、欠損組換えウイルスのゲノムとバキュロウイルスに存在する相補領域 はオーバーラップをもたないことが好ましい。こうすると、実際に組換えとＲＣ Ａの生成の危険が避けられる。これは第１世代アデノウイルス（Ａｄ−ΔＥ１） の生産に特に重要である。この場合には、バキュロウイルスに導入されるＥ１領 域は、組換えゲノムと共通配列をもたないように規定される。このためには、例 えば実施例に記載するように、バキュロウイルスに挿入される相補領域よりも大 きい領域を組換えゲノムから除去することができる。これはアデノウイルスＡｄ −ΔＥ１，ΔＥ４の作製にも有利である。 このように、本発明の方法の特定実施態様では、欠損組換えウイルスのゲノム をコンピテント細胞に導入し、バキュロウイ ルスと欠損組換えウイルスのゲノムに存在する相補機能が組換えを生じる恐れの ある相同ゾーンをもたないように、欠損ゲノムの相補に必要な機能の全部又は一 部を含むバキュロウイルスをこれらの細胞に同時又は非同時に感染させる。有利 な態様では、ウイルスゲノムはＥ１領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノ ムであり、バキュロウイルスはＥ１領域をトランス相補することが可能なアデノ ウイルスの領域をもつ。別の態様によると、ウイルスゲノムはＥ１及びＥ４領域 を欠損する組換えアデノウイルスゲノムであり、バキュロウイルスは前記領域を トランス相補することが可能なアデノウイルスの２つの領域をもつか、又は夫々 Ｅ１領域とＥ４領域をトランス相補することが可能なアデノウイルスの領域をも ち、欠損アデノウイルスゲノムと相同ゾーンをもたない２種のバキュロウイルス を使用する。 特定実施態様によると、１個以上のヘルパーバキュロウイルスがアデノウイル スの全コーディング領域をもつ。より特定的な実施態様によると、アデノウイル スの全コーディング領域をもつ単一ヘルパーバキュロウイルスを使用する。従っ て、このようなヘルパーバキュロウイルスは最小組換えアデノウイルス をトランス相補するために使用可能である。このようなバキュロウイルスは実施 例に示すように、パッケージング領域と場合によりＩＴＲ以外は特にアデノウイ ルスゲノム全体を含むことができる。相補機能の作製 ヘルパーバキュロウイルスに導入する相補機能は種々の血清型ウイルスから得 られる。 アデノウイルスについては、構造と性質が少しずつ異なるが、類似の遺伝子地 図をもつ種々の血清型が実際に存在する。より詳細には、本発明によりバキュロ ウイルスを構築するために使用される相補機能はヒト又は動物起源のアデノウイ ルスに由来する。 ヒト起源のアデノウイルスについては、Ｃ亜属に分類されるものを好適例とし て挙げることができる。種々のヒトアデノウイルス血清型のうち、本発明の範囲 では特に２又は５型（Ａｄ２又はＡｄ５）のアデノウイルスを使用すると好まし い。Ａ及びＢ亜属の７又は１２型アデノウイルスに由来する領域を使用すること もできる。動物起源の種々のアデノウイルスのうちでは、イヌ起源のアデノウイ ルス、特に全アデノウイルスＣＡＶ２ 株［例えばマンハッタン株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）］を使 用すると好ましい。動物起源の他のアデノウイルスは、参考資料として本明細書 の一部とする国際出願ＷＯ９４／２６９１４に特に記載されている。 本発明の１好適実施態様では、相補機能はＣ亜属のヒトアデノウイルスゲノム に由来する。アデノウイルスＡｄ２又はＡｄ５のゲノムに由来するものが特に好 ましい。 種々の相補機能をもつ領域は当業者に公知の方法に従って酵素切断によりアデ ノウイルスゲノムから得られる。これらの領域は場合により修飾し、短縮したり 、所定の調節エレメント（プロモーター、エンハンサー等）を異種エレメントで 置換してもよい。一般に、これらの領域は次のように作製される。アデノウイル スのＤＮＡは塩化セシウム勾配遠心分離により精製するが、又は原核（ＷＯ９６ ／２５５０６）もしくは真核（ＷＯ９５／０３４００）プラスミドからｉｎ ｖ ｉｔｒｏで得られる。次にＤＮＡを適当な制限酵素で開裂し、得られたフラグメ ントから所望相補機能をもつものを同定及び選択する。使用する制限酵素の選択 は所望の相補機能に依存する。次に、アデノウイルスゲノムの公表されている制 限地図と配列に従う。例えば、 Ｅ１領域はＥ１Ａプロモーターの下流にＥ１Ａ及びＥ１Ｂの全オープンリーディ ングフレームをもつフラグメントとして単離することができる。Ｅ４領域はオー プンリーディングフレーム全体又はその一部のみ、好ましくはＯＲＦ３又はＯＲ Ｆ６又はＯＲＦ−ＯＲＦ６／７をもつフラグメントとして単離することができる 。 同様の方法を実施して組換えＡＡＶ及びレトロウイルスの相補領域を作製する 。例えば、ＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐ領域は種々のＡＡＶ血清型から単離 したウイルスＤＮＡから酵素切断により得られる。ＡＡＶ−２が好ましい。レト ロウイルスの場合には、ｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ領域は同様に種々のレ トロウイルス、例えば特にＭｏＭｕＬＶ（「モロニーマウス白血病ウイルス」、 別称ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＶ（「モロニーマウス肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「 ハーベー肉腫ウイルス」）、ＳＮＶ（「牌壊死ウイルス」）、ＲＳＶ（「ラウス 肉腫ウイルス」）又はフレンドウイルス等のレトロウイルスから慣用分子生物学 技術により得られる。ヘルパーバキュロウイルスの構築 次に、相補領域をもつフラグメントをその操作（微細消化、 ＰＣＲ、調節配列付加等）が可能なプラスミドベクター、例えば原核又は真核生 物にサブクローニングする。その後、相補機能をコードする得られた最終フラグ メントを慣用分子生物学技術によりヘルパーバキュロウイルスに導入する。詳細 には、バキュロウイルスのゲノムのある領域に相同な２つの配列の間にフラグメ ントをクローニングした後、得られたフラグメント又はプラスミドをバキュロウ イルスのゲノムと共に昆虫細胞（一般にはｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐ ｅｒｄａ細胞Ｓｆ９及びＳｆ２１であるが、ｔｒｉｃｈｏｐｕｌｓｉａ ｎｉ細 胞Ｔｎ−３６８及びＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ（登録商標）ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４ （Ｇｉｂｃｏ）、又はバキュロウイルスに許容可能でその製造に使用可能な他の 任意の昆虫細胞でもよい）に同時トランスフェクトする。プラスミド又はフラグ メントとバキュロウイルスのゲノムの相同組換えにより所望の組換えバキュロウ イルスが生成され、慣用方法により回収及び精製することができる（特にＫｉｎ ｇとＰｏｓｓｅｅ：ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ，１９９２参照） 。組換えバキュロウイルスを構築するためには、シャトルベクターを 含む種々のキットが市販されており、製造業者の指示に従って使用することがで きる。特に、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製品シャトルベクターｐＢＡＣ、ベクターｐＡ ｃ（Ｖｅｍｅら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１９８８）４７，Ｐｈａ ｒｍｉｎｇｅｎ，米国）、ベクターｐＢｌｕｅ−Ｂａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ）又はベクターｐＢＳＶ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用することができる。こ うして相補機能はバキュロウイルスの種々の部位に挿入することができ、特に多 面体の遺伝子又は遺伝子ｐ１０の遺伝子座に挿入することができる。また、Ａｃ ＮＰＶ又はＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（Ｍａｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ ３１５（１ ９８８）５９２）等の種々のバキュロウイルス株を使用することができる。他方 、使用するバキュロウイルスを変異させ、その親和性を改善／変化させてもよい 。実際に、（ｉ）ウイルスタンパク質と特異的リガンド（免疫グロブリンＬ鎖、 ガストリン放出ペプチド）の融合により短縮するか又は（ｉｉ）異種ウイルス糖 タンパク質［水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧ］との偽型の形成により拡大 するように表面タンパク質を修飾することにより、ウイルスベクターの親和性を 調節することができる［Ｌｉｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７０（４）（１９９６）２４９７；Ｍｉｃｈａｅｌら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２ （１９９５）６６０］。最近では、ＨＩＶウイルスのｇｐ１２０に融合したバキ ュロウイルスの表面糖タンパク質（ｇｐ６４）はＣＤ４レセプターに固定できる ことが立証されている（Ｂｏｕｂｌｉｋら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １ ３（１９９５）１０７９）。ｇｐ６４のこの修飾は昆虫細胞でバキュロウイルス の生存率に影響を与えない。ＶＳＶのＧを用いて同様に構築しても、バキュロウ イルスの哺乳動物細胞親和性を改善し、従ってＨｕｈ７細胞や他の細胞系のトラ ンスダクション効率を向上できると思われる。 ヘルパーバキュロウイルスでは、コンピテント細胞中で機能的な異種（即ちバ キュロウイルスとは異なる起源の）プロモーターの制御下に相補機能をおくと有 利である。実際に、バキュロウイルスのプロモーターから昆虫細胞以外の細胞で 相補機能の十分な発現レベルは得られないと思われる。プロモーターはまずウイ ルスの相補機能の固有プロモーター（同種プロモーター）であり得る（アデノウ イルスにはＥＡ１、Ｅ４、Ｅ２、ＭＬＰプロモーター、ＡＡＶにはＰ５又はＰ１ ９プロモーター、ＲＳＶにはＬＴＲのプロモーター等）。使用するコンピテント 細胞中で機能的であれば別の起源の任意プロモーターを使用できる。この点では 、例えばこの細胞で発現される遺伝子のプロモーター又は公知ユビキチンプロモ ーター（例えばＰＧＫ遺伝子のプロモーター、ＣＭＶの極初期プロモーター、ヘ ルペスウイルスのＴＫ遺伝子のプロモーター又はＲＳＶのＬＴＲのプロモーター ）が挙げられる。調節プロモーターでもよく、例えばＭＭＴＶウイルスのプロモ ーター、例えばＧＲＥ５型のホルモン応答プロモーター又はテトラサイクリン（ ＷＯ）により調節されるプロモーターが挙げられる。同種、強力ユビキチン又は 誘導プロモーターが有利である。 従って、本発明の別の目的は、異種プロモーターの制御下におかれたウイルス の相補機能をコードする核酸をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスに 関する。より詳細には、相補機能は前記ウイルスの生産に必要なタンパク質であ り、そのコーディング領域は欠損ウイルスゲノム中で不活化（突然変異、欠失等 ）されている。アデノウイルスでは、相補機能は特にアデノウイルスのＥ１、Ｅ ２、Ｅ４、Ｌ１〜Ｌ５、ｐＩＸ及びＩＶａ２領域単独又はその組み合わせにより コードされる機能の全部又は一部から選択される。ＡＡＶでは、Ｒｅｐ及び／又 はＣａｐ領域によりコードされる機能であり、レトロウイルスではｇａｇ、ｐｏ ｌ及び／又はｅｎｖである。核酸は選択された相補機能をコードする領域を含む ウイルスゲノムの領域に対応するものが有利である。特に、血清型Ａｄ２もしく はＡｄ５のアデノウイルス、ＭｏＭＬＶ又はＡＡＶ−２のゲノムのフラグメント が挙げられる。核酸は選択される相補機能の発現に天然に関与するプロモーター 領域も含むことが特に好ましい。 特定例として、本発明はアデノウイルスのＥ１領域の全部又は一部を含むバキ ュロウイルスに関する。より詳細には、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ又はＥ１ａとＥ１ｂ領域 を含むバキュロウイルスである。アデノウイルスのＥ１領域はＡｄ５のヌクレオ チド１０４（Ｅ１ａプロモーター）〜４０７０（ポリＡ Ｅ１ｂ）のレベルに局 在する。特に、Ｅ１ａプロモーターのＴＡＴＡボックスはヌクレオチド４７０の レベルに局在し、Ｅ１ａのＡＴＧコドンはヌクレオチド５６０のレベル、Ｅ１ｂ ストップコドンはヌクレオチド３５１１のレベルに局在する。厳密な例として３ ９１〜３５１１フラグメントを含むバキュロウイルスを挙げることができる。こ のヘルパーバキュロウイルスはこの３９１〜３５１１フラグメントよりも大きい 欠失をもつＥ１領域欠損組換えアデ ノウイルスの製造に特に適している。特に、ＲＣＡがなく、３８３〜３５１２ヌ クレオチド（両端を含む）の範囲のＥ１領域に欠失をもつ第１世代アデノウイル スの製造に適している。 本発明によるバキュロウイルスの別の特定例は例えばアデノウイルスのＥ１及 びＥ４領域の全部又は一部を含む。アデノウイルスのＥ４領域はＯＲＦ１、ＯＲ Ｆ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ３／４、ＯＲＦ６及びＯＲＦ６／７と呼ばれ る７個のオープンリーディングフレームから構成される。これらの種々のＯＲＦ によりコードされるタンパク質のうちでは、ＯＲＦ３とＯＲＦ６により生産され るタンパク質がウイルスの「複製」を可能にし、従って、完全に欠損する場合で あってもＥ４領域を欠損するアデノウイルスのトランス相補を可能にすると思わ れる。従って、本発明のヘルパーバキュロウイルスはＥ４領域の全部又は少なく ともＯＲＦ３もしくはＯＲＦ６フレームを含む一部のみを含むと有利である。Ｅ ４領域の種々の部分は当業者に公知の方法により酵素切断により得られ、修飾し てもよい。特に、オープンリーディングフレームＯＲＦ６はヌクレオチド３４１ １５〜３３１２６に対応するＢｇｌＩＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントとしてＥ４領 域から単離することができ、オープン リーディングフレームＯＲＦ６−ＯＲＦ６／７はＡｄ５のゲノムのヌクレオチド ３４１１５〜３２４９０に対応するＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントとして Ｅ４領域から単離することができる。バキュロウイルスは（例えばフラグメント ３２８００〜３５８２６又は３２８１１〜３５６１４又は３２８１１〜３５６４ ０として）オープンリーディングフレームＯＲＦ１〜ＯＲＦ７全体を含んでいて もよい。当然のことながら、アデノウイルスゲノムの公表配列に基づいて他のフ ラグメントを決定することもできる。Ｅ４領域の短い単位をもつバキュロウイル スを使用すると、Ｅ４領域のより大きい欠失をもち、従って相同ゾーンのない欠 損アデノウイルスゲノムのトランス相補が可能になり、組換えの可能性が全くな くなるので有利である。 第１の実施態様によると、相補機能をコードする核酸を発現カセットの形態で ヘルパーバキュロウイルスに導入する。この実施態様は最も簡単に実施できる。 極初期遺伝子を欠損する組換えアデノウイルスの製造と、欠損組換えレトロウイ ルス及びＡＡＶの製造に特に適している。 別の実施態様によると、相補機能をコードする核酸を切除可能なカセットの形 態でヘルパーバキュロウイルスに導入し、コ ンピテント細胞で複製分子を生成する。細胞でカセットを複製すると、相補遺伝 子のコピー数を増し、システムの生産レベルを改善できるという利点がある。こ の実施態様は、欠損度が高く、特に構造遺伝子を欠損する組換えアデノウイルス の製造に特に適している。特に、この実施態様は「最小」アデノウイルスの製造 に特に適している。実際に、構造タンパク質の量は欠損度の高いアデノウイルス （最小アデノウイルス型）を高力価で生産するのを制限している要因である。こ の実施態様によると、トランス相補タンパク質、特に（Ｌ１〜Ｌ５領域によりコ ードされる）アデノウイルスの構造タンパタの細胞内レベルを最小アデノウイル スのトランス相補に適合可能なレベルまで大幅に増加することが初めて可能にな った。 このように、本願出願人は、（エピソーム型）環状複製分子を生成するように 、好ましくは誘導及び調節下に細胞で切除可能な異種領域を含む組換えバキュロ ウイルスを構築できることを示した。 切除は部位特異的組換えメカニズムにより実施すると有利であり、細胞内の複 製は細胞分裂状態から独立した複製起源によりなし遂げられる。 より好ましくは、本発明の方法により使用される部位特異的組換えは、一般に リコンビナーゼと呼ばれる特定タンパク質の存在下に組換え可能な２種の特定配 列により得られる。これらの特定配列は適当な向きに配置され、バキュロウイル ス内で相補機能をコードする配列の両側に配置される。従って、本発明は部位特 異的組換えを可能にする２種の配列により挟まれ、順方向に配置された少なくと も１個のＤＮＡ領域をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスにも関し、 前記ＤＮＡ領域はコンピテント細胞で機能的な少なくとも１個の複製起点とウイ ルスの相補機能をコードする核酸を含む。 本発明の範囲で使用される組換えを可能にする配列は一般に５〜１００塩基対 、より好ましくは５０塩基対未満を含む。これらの配列は種々の構造クラス、特 にＰ１バクテリオファージのリコンビナーゼ又はトランスポゾンのリゾルベース のファミリーに分類できる。 バクテリオファージ１のインテグラーゼのファミリーに属するリコンビナーゼ としては、特にλファージのインテグラーゼ（Ｌａｎｄｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９７（１９７７）１１４７）、Ｐ２２及びＦ８０（Ｌｅｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏ ｌ．Ｃｈｅｍ． ２６０（１９８５）４４６８）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ の ＨＰ１（Ｈａｕｓｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１９９２）６８ ５９）、Ｐ１ファージのＣｒｅインテグラーゼ、プラスミドｐＳＡＭ２のインテ グラーゼ（ＥＰ３５０３４１）又は酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅのプラスミド２μｍのＦＬＰリコンビナーゼを挙げることができる。 Ｔｎ３トランスポゾンのファミリーに属するリコンビナーゼとしては、特にＴ ｎ３トランスポゾン又はｇｄ、Ｔｎ２１及びＴｎ５２２トランスポゾンのリゾル ベース（Ｓｔａｒｋら，１９９２）、ｍｕバクテリオファージのＧｉｎインベル ターゼ又はＲＰ４のｐａｒフラグメントのリゾルベースのようなプラスミドのリ ゾルベース（Ａｂｅｒｔら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２（１９９４）１ ３１）を挙げることができる。 好ましい実施態様によると、本発明の組換えバキュロウイルスにおいて部位特 異的組換えを可能にする配列はバクテリオファージから誘導される。バクテリオ ファージの付着配列（ａｔｔｐ及びａｔｔＢ配列）又は誘導配列がより好ましい 。これらの配列は特にインテグラーゼと呼ばれるリコンビナーゼの存在 下で相互に特異的に組換えが可能である。厳密な例としては、特にファージλ、 Ｐ２２、Ｆ８０、Ｐ１、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＨＰ １又はプラスミドｐＳＡＭ２もしくは２μｍの付着配列を挙げることができる。 更に好ましくは、部位特異的組換えを可能にする配列は、Ｐ１ファージの組換 え系である。Ｐ１ファージはｌｏｘ Ｐ部位と呼ばれる３４塩基対のヌクレオチ ド配列を特異的に認識するＣｒｅと呼ばれるリコンビナーゼをもつ（Ｓｔｅｒｎ ｂｅｒｇら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０（１９８１）４６７）。この配列は ８ｂｐの保存配列に分離された２個の１３ｂｐのパリンドローム配列から構成さ れている。ＬｏｘＰ配列又は誘導配列とＣｒｅリコンビナーゼを使用することに より部位特異的組換えを得ると有利である。 誘導配列なる用語は、適当なリコンビナーゼの存在下に特異的に組換えを行う 能力を維持しながら、上記組換え配列の修飾により得られる配列を意味する。例 えば、これらの配列の短縮フラグメントでもよいし、逆に他の配列（制限部位等 ）の付加により拡張したフラグメントでもよい。また、突然変異、特に点突然変 異により得られる変異体でもよい。 従って、本発明の好ましい態様によると、部位特異的組換えを可能にする配列 はＰ１バクテリオファージのＬｏｘＰ配列であり、組換えはＣｒｅタンパク質の 存在下に得られる。この点では、組換えはコンピテント細胞とＣｒｅリコンビナ ーゼの直接接触又はコンピテント細胞におけるＣｒｅリコンビナーゼをコードす る遺伝子の発現により得られる。対応する遺伝子の発現の誘導により細胞でＣｒ ｅリコンビナーゼを生産すると有利である。例えばリコンビナーゼをコードする 遺伝子を誘導プロモーターの制御下におくか、又は調節可能な形態で構築すると 有利である。この点では、ＣｒｅとＣｒｅの活性を調節することが可能なステロ イドホルモン（エストラジオール、プロゲステロン等）の固定ドメインの融合を 使用し、組換えイベントを誘導すると有利である（Ｍｅｔｚｇｅｒら，ＰＮＡＳ ９２（１９９５）６９９１）。より一般には、リコンビナーゼの発現は調節下 又は非調節下の任意強カプロモーターにより制御することができる。発現カセッ トは実施例に記載するようにコンピテント細胞にトランスフェクトしてもよいし 、コンピテント細胞のゲノムに組み込んでもよい。 従って、このシステムはウイルス、特にアデノウイルスの高 レベルの相補機能をコンピテント細胞で生成する複製分子を作製することができ る。この種の構築物は高度欠損ゲノム、特に後期遺伝子を欠損するアデノウイル スゲノムの相補に特に適している。従って、本発明の特定構築物は、順方向に配 置された２個のＬｏｘＰ配列に挟まれた少なくとも１個のＤＮＡ領域をそのゲノ ムに挿入したバキュロウイルスであり、前記ＤＮＡ領域はコンピテント細胞で機 能的な少なくとも１個の複製起点と、アデノウイルスの相補機能をコードする核 酸を含む。相補機能はＥ１、Ｅ２及びＥ４領域に存在する極初期遺伝子の全部又 は一部を含むと有利である。より好ましくは、相補機能は極初期遺伝子と後初期 遺伝子の全部又は一部を含む。好ましくは、相補機能は全コーディングウイルス 配列を欠失する組換えアデノウイルスの相補を可能にする。特に、相補機能はＩ ＴＲとパッケージング領域を除くアデノウイルスゲノム全体から構成される。特 定態様によると、相補機能はパッケージング領域を欠失する以外は完全なアデノ ウイルスゲノム（Ａｄ．Ｐｓｉ−）から構成される。このゲノムは特に、切除後 にコンピテント細胞でゲノムの複製に利用されるＩＴＲを含む。 従って、エピソーム分子の複製をなし遂げるためには、エピ ソーム分子は使用するコンピテント細胞で機能する複製起点を含む。この複製起 点は分子の大量増幅を可能にするアデノウイルスの固有ＩＴＲ配列から構成され ることが好ましい。好ましくはコンピテント細胞で２０倍を越えるウイルスＤＮ Ａ増幅を可能にする別の複製起点でもよい。例えばＥＢＶウイルスの起点Ｏｒｉ Ｐ／ＥＢＮＡ１又はパピローマウイルスのＥ２領域を挙げることができる。当然 のことながら、アデノウイルスのＩＴＲ配列は好ましい実施態様を構成する。 本発明の方法を実施するためには、一般に細胞生存率をさほど損なわずに大き な細胞集団に感染することが可能な感染多重度（ＭＯＩ）でヘルパーバキュロウ イルスを使用する。一般に、感染多重度は特に１０〜１０００である。ＭＯＩは 細胞１個当たりのウイルス粒子数に対応する。ＭＯＩは、使用するコンピテント 細胞に応じて主に感染効率と毒性の２つの基準に基づいて当業者により容易に調 整可能である。ヘルパーバキュロウイルスに使用するＭＯＩは２０〜５００が有 利である。ウイルスゲノムの導入 上述のように、本発明の方法はヘルパーバキュロウイルスと組換えウイルスゲ ノムをコンピテント細胞に導入するものであ る。この点では、欠損組換えアデノウイルスのゲノムを種々の方法でコンピテン ト細胞に導入することができる。 まず、有利にはＲＣＡを除去した精製欠損組換えアデノウイルスを利用できる 。この場合には、コンピテント細胞に欠損組換えアデノウイルスとヘルパーバキ ュロウイルスを感染させる。組換えアデノウイルスの感染により、対応するゲノ ムをコンピテント細胞に導入することができ、その後、増幅及びパッケージング し、ＲＣＡを含まない高力価ストックを生成する。この実施態様は第１世代のウ イルス（Ａｄ−ΔＥ１；Ａｄ−ΔＥ１，Ｅ３）を製造するのに特に有利である。 実際に、これらのウイルスはＲＣＡの汚染なしに高力価で製造するのは難しい。 本発明の方法によると、第１世代の欠損組換えアデノウイルスから出発し、Ｅ１ 領域を含むバキュロウイルスと共にコンピテント細胞に同時感染することにより 、高品質の濃縮ストックを得ることが可能になった。この実施態様はそのゲノム の２又は３個の主要領域（特にＥ１、Ｅ２、Ｅ４）を欠損するウイルスの製造に も有利である。一般に、この実施態様はアデノウイルス感染効率が非常に高く（ ＤＮＡトランスフェクション効率を上回る）、従って濃縮ストックを生成できる ので有利である。この 実施態様では、細胞生存率をさほど損なわずに大きい細胞集団に感染可能な感染 多重度（ＭＯＩ）で組換えアデノウイルスと組換えバキュロウイルスを使用する ことができる。バキュロウイルスに使用するＭＯＩは上記の通りである（１０〜 １０００）。アデノウイルスについては、１〜１０００が有利であり、好ましく は１〜５００、より好ましくは１〜１００である。アデノウイルスに使用するＭ ＯＩは選択する細胞型によっても異なる。ＭＯＩ範囲は例えば別個のマーカー遺 伝子を含むバキュロウイルスとアデノウイルスを使用して感染効率と競合を測定 することにより、当業者により容易に決定することができる。より好ましくは、 アデノウイルスのＭＯＩは５０未満、例えば１〜２０である。 特に有利な実施態様によると、欠損組換えアデノウイルスのゲノムをＤＮＡと して導入する。この場合には、場合によりトランスフェクションを助長する物質 （脂質、リン酸カルシウム等）の存在下でトランスフェクションによりゲノムを 導入する。このように導入する組換えゲノムは種々の技術によりｉｎｖｉｔｒｏ 作製することができ、特に大腸菌（ＷＯ９６／２５５０６）又は酵母（ＷＯ９５ ／０３４００）で作製できる。この実施態 様はＲＣＡのない第１世代の欠損組換えウイルスを製造するのに特に有用であり 、その後、前記実施態様により高力価ストックを製造するために使用することが できる。 別の組換えバキュロウイルスを使用することにより欠損組換えアデノウイルス のゲノムを導入することもできる。この実施態様によると、例えば上述のように 欠損組換えアデノウイルスのゲノムを作製した後、コンピテント細胞で切除可能 なカセットの形態でバキュロウイルスに導入する。この実施態様によると、欠損 組換えアデノウイルスのゲノムをもつバキュロウイルスと（相補機能をもつ）１ 個以上のヘルパーバキュロウイルスの存在下にコンピテント細胞をおく。この実 施態様は高度欠損組換えアデノウイルスの製造に特に有利である。このシステム によると、実際に高度欠損組換えゲノムと対応する相補機能をコンピテント細胞 集団に同時に多量に導入することができる。 従って、この点では、本発明の方法は欠損組換えアデノウイルスのゲノムをも つバキュロウイルスと、相補機能をもつ１個以上のヘルパーバキュロウイルスを コンピテント細胞に同時感染するものである。この実施態様で使用するＭＯＩも 、使用するバキュロウイルスの各々について１０〜１０００である。 従来技術では最小アデノウイルスの製造に、（１）ＩＴＲ間にクローニングし 、固有制限部位により挟まれた導入遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）又は（２） 導入遺伝子の５’に順方向にクローニングした右及び左ＩＴＲの２種の構築が実 施されている（Ｆｉｓｈｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１７（１９９６）１１； Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｇｈら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５（１９９６）９ １３）。最小アデノウイルスは直鎖状（１）又は環状（２）ＤＮＡのトランスフ ェクションにより２９３細胞で生産されており、ミニゲノムの複製及びパッケー ジングに必要なウイルスタンパク質はヘルパーウイルス（ＡｄΔＥ１）によりト ランス導入される。最小アデノウイルスは干渉欠損（ＩＤ）粒子として挙動し、 連続継代中に漸進的に増幅される。この方法の使用による主な問題は、ヘルパー ウイルスによるストックの汚染の原因となる２種の生成粒子の分離と、こうして 得られる最小アデノウイルスの力価が非常に低い（１０⁸ｐｆｕ／ｍｌ末満）こ とである。 本発明によると、アデノウイルスミニゲノムを送達するためのバキュロウイル スと、トランス相補機能全体（相補ゲノム）を導入するためのバキュロウイルス を使用することにより、最 小アデノウイルスをを製造することが初めて可能になった。 組換えアデノウイルスゲノムはヘルパーバキュロウイルスについて記載したよ うに、コンピテント細胞で部位特異的組換えを可能にする２つの配列の間でバキ ュロウイルスに導入すると有利である。 本発明は特に、ｌｏｘＰ／Ｃｒｅ系によりアデノウイルスミニゲノムを送達す るためのバキュロウイルスと、同様にＣｒｅ／ｌｏｘＰ系によりトランス相補機 能全体（相補ゲノム）を導入するためのバキュロウイルスを使用する最小アデノ ウイルスの製造システムに関する（図２〜４参照）。 別の実施態様によると、相補機能を送達するために使用する部位特異的組換え システムは組換えアデノウイルスのゲノムを送達するために使用するシステムと 異なる。特に、欠損アデノウイルスゲノムを送達するためにＬｏｘＰ／Ｃｒｅ系 を使用し、相補機能を送達するためにＡｔｔＰ／ＡｔｔＢ系を使用することがで きる。 従って、本発明の方法は、全コーディングウイルス配列を欠失し、ＩＴＲとパ ッケージングシグナルのみを含むアデノウイルスベクター（最小アデノウイルス ）を構築することができる。 このベクターは理論的には３７ｋｂまでの外来配列を含むことができるが、実際 のベクターのクローニング能は８．５ｋｂ以下である。従って、それらの全調節 エレメント（プロモーター、エンハンサー、イントロン等）を使用してジストロ フィン遺伝子（１４ｋｂ）等の大きい寸法の遺伝子をクローニングすることがで き、標的組織で最適発現が得られる。更に、免疫原ウイルス配列が全く存在しな いため、休止組織で導入遺伝子の発現期間を延ばすことができる。 欠損ＡＡＶ又はレトロウイルスのゲノムも上記方法によりウイルス、ゲノム又 はプラスミドとして導入することができる。コンピテント細胞 本発明の方法は種々の細胞で実施することができる。本発明の意味で「コンピ テント細胞」とは、バキュロウイルスと製造しようとするウイルスの感染が可能 であり、後者の生産ウイルス周期を可能にする細胞を意味する。細胞のこれらの ウイルスの感染能は、大腸菌のＬａｃＺ遺伝子等のマーカー遺伝子を発現する組 換えウイルスを使用することにより決定することができる。このような細胞とし ては哺乳動物細胞が好ましく、ヒト起源の細胞がより好ましい。使用するコンピ テント細胞は休止 細胞でも活性分裂細胞でもよく、樹立細胞系でも一次培養物でもよい。工業用途 に適合可能な哺乳動物細胞、即ち病原性が認められず、培養可能であり、場合に より適当な条件下で保存可能なものが有利である。使用する細胞は肝、筋、繊維 芽、胚、神経、上皮（肺）又は眼（網膜）細胞が有利である。非限定的な例とし て、２９３細胞もしくは補助相補機能を含む任意誘導細胞（２９３Ｅ４、２９３ Ｅ２ａ等）、Ａ５４９細胞、ＨｕＨ７細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、 ヒト網膜芽細胞（ＨＥＲ、９１１）、ＨｅＬＡ細胞、３Ｔ３細胞又はＫＢ細胞を 挙げることができる。 本発明の方法を実施するためには、組換えウイルスのゲノムとバキュロウイル スを同時又は時間的に間をおいてコンピテント細胞集団に導入することができる 。細胞を組換えゲノムとヘルパーバキュロウイルスに同時に接触させると有利で ある。複製分子をｉｎ ｖｉｖｏ生成するシステムの場合には、リコンビナーゼ を前以て、同時又は後で導入又は発現させる。 ウイルスが生産されると、一般に細胞が溶解する。従って、生産されたウイル スは細胞溶解後に公知精製法により回収することができる。その後、目的用途に 応じて種々の方法でパック することができる。また、場合によりコンピテント細胞に浸透しなかった微量の バキュロウイルス（ヘルパーバキュロウイルス又は組換えウイルスゲノムを導入 するバキュロウイルス）によるウイルスストックの汚染の危険を避けるためには 、次の方法を適用することができる。 −出願ＦＲ９６／０８１６４に記載の方法に従い、クロマトグラフィーによりア デノウイルスを精製することができる。この方法は場合により残留するバキュロ ウイルスからアデノウイルスを完全に分離することができる。 −有機溶剤（例えばエーテル、クロロホルム）を精製アデノウイルスストックに 作用させてもよい。実際に、バキュロウイルスはエンベロープ（糖タンパクエン ベロープ）をもつウイルスであるため、（そのエンベロープから脂質を抽出する ）全有機溶剤に非常に感受性であるが、アデノウイルスはエンベロープをもたな いので、同一溶剤の作用が全くない。 −ＣｓＣｌ勾配精製により場合により残留するバキュロウイルスと組換えウイル スを密度により分離することもできる。 これらの３種の方法は独立して使用してもよいし、併用してもよい。更に、当 業者に公知の他の任意の方法も使用すること ができる。ウイルスの使用 こうして製造したウイルスはｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖ ｉｖｏ遺伝子クローニング、導入及び発現に使用することができる。このような 目的遺伝子は例えば酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン（例えばインタ ーロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ等）（ＦＲ９２０３１２０）、成長因子 、神経伝達物質又はその前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子（例えばＢＤＮＦ 、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５等 ）、アポリポタンパク質（例えばＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ等）（Ｗ Ｏ９４／２５０７３）、ジストロフィン又はミニジストロフィン（ＷＯ９３／０ ６２２３）をコードする遺伝子、腫瘍抑制遺伝子（例えばｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ １Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｆ等）（ＷＯ９４／２４２９７）、因子ＶＩＩ、ＶＩＩ Ｉ、ＩＸ等の凝血関与因子をコードする遺伝子、自殺遺伝子（例えばチミジンキ ナーゼ、シトシンデアミナーゼ等）、更には天然又は人工免疫グロブリン（Ｆａ ｂ、ＳｃＦｖ等、ＷＯ９４／２９４４６）の全部又は一部等を挙げることができ る。目的遺伝子は標的細 胞で発現されると遺伝子の発現又は細胞ｍＲＮＡの転写を制御することが可能な アンチセンス遺伝子又は配列でもよい。このような配列はヨーロッパ特許第１４ ０３０８号に記載の方法に従い、例えば標的細胞で細胞ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡ に転写すると、そのタンパク質翻訳を阻止することができる。目的遺伝子はワク チン製造の目的では、免疫応答を生じることが可能な抗原性ペプチドをコードす る遺伝子でもよい。このような遺伝子としては特に、エプスタイン−バールウイ ルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＥＰ１８５５７３）、疑狂犬病ウイ ルスの特異抗原ペプチド、又は腫瘍特異抗原ペプチド（ＥＰ２５９２１２）が挙 げられる。遺伝子は目的産物をコードする任意ＤＮＡ（ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ等） であり得、場合により適当な発現シグナル（プロモーター、ターミネーター等） を含む。 これらのウイルスはこれらの組換えタンパク質の製造にｉｎｖｉｔｒｏ使用す ることができる。これらのタンパクの作用メカニズムを研究するため又は遺伝子 発現もしくはプロモーター活性の調節を研究するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ使用す ることもできる。動物モデル又はトランスジェニック動物の作出のためにｉｎ ｖｉｖｏで使用することもできる。遺伝子又は細胞治 療アプローチで動物又はヒトに遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏ導入及び発現させるため にも使用することができる。 以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は単に例 示であり、発明を限定するものではない。 図面の説明 図１：ｂａｃｕｌｏ−Ｅ１，Ｅ４を使用した第３世代欠損組換えアデノウイル ス（Ｅ１及びＥ４機能を欠損）の製造スキーム。 図２〜４：欠損アデノウイルスゲノムを導入するための第１のバキュロウイル スと相補機能を導入するための第２のバキュロウイルスを使用した最小アデノウ イルスの製造スキーム。 図５：ｂａｃｕｌｏ−Ｒｅｐ／Ｃａｐを使用したＲｅｐ及びＣａｐ機能を欠損 する組換えＡＡＶの製造スキーム。 実施例１．使用した細胞 本発明の範囲で使用する細胞はアデノウイルス、ＡＡＶ又はレトロウイルスと バキュロウイルスにより感染可能であり、治療目的の使用に適合可能な任意細胞 系又は細胞集団に由来するものを利用できる。哺乳動物、特にヒト細胞が好まし い。特に 以下の細胞を挙げることができる。 −２９３系細胞 ２９３系はアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のゲノムの左側末端（約１１〜 １２％）を含むヒト胎児腎細胞系であり、左側ＩＴＲ、パッケージング領域、Ｅ １ａ，Ｅ１ｂを含むＥ１領域、ｐＩＸタンパク質をコードする領域及びｐＩＶａ ２タンパク質をコードする領域の一部を含む（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ ｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）。この系はＥ１領域を欠損即ちＥ１領域の全 部又は一部を欠失する組換えアデノウイルスをトランス相補することができ、高 力価をもつウイルスストックを生産することができる。 −Ａ５４９系細胞 アデノウイルスのＥ１領域を相補する細胞をＡ５４９細胞から構築した（Ｉｍ ｌｅｒら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９６）７５）。これらの細胞は、誘導プ ロモーターの制御下におかれたＥ１領域から左側ＩＴＲを除去したフラグメント を含む。 −ＨＥＲ系細胞 ヒト胎児網膜細胞（ＨＥＲ）はアデノウイルスにより感染可能である（Ｂｙｒ ｄら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２（１９８８） ４７７）。これらの細胞から作製したアデノウイルスパッケージング細胞は例え ば国際出願ＷＯ９４／２８１５２又はＦａｌｌａｕｘらの論文（Ｈｕｍ．Ｇｅｎ ｅ Ｔｈｅｒ．（１９９６）２１５）に記載されている。具体的には、ＨＥＲ細 胞のゲノムに組み込まれたヌクレオチド７９〜ヌクレオチド５７８９のアデノウ イルスＡｄ５のゲノムのＥ１領域を含む９１１系を挙げることができる。この細 胞系はＥ１領域を欠損するウイルスを生産することができる。 −ＩＧＲＰ２細胞 ＩＧＲＰ２細胞は誘導プロモーターの制御下のＥ４領域の機能ユニットを組み 込むことにより２９３細胞から得られる細胞である。これらの細胞はＥ１及びＥ ４領域を欠損するウイルスを生産することができる（Ｙｅｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ （１９９６）７０）。 −ＶＫ細胞 ＶＫ（ＶＫ２−２０及びＶＫ１０−９）細胞は誘導プロモーターの制御下のＥ ４領域全体とｐＩＸタンパク質をコードする領域を組み込むことにより２９３細 胞から得られる細胞である。これらの細胞はＥ１及びＥ４領域を欠損するウイル スを生産す ることができる（Ｋｒｏｕｇｌｉａｋら，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．６（１９ ９５）１５７５）。 −２９３Ｅ４細胞 ２９３Ｅ４細胞はＥ４領域全体を組み込むことにより２９３細胞から得られる 細胞である。これらの細胞はＥ１及びＥ４領域を欠損するウイルスを生産するこ とができる（ＷＯ９５／０２６９７；Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１ ９９５）３２２）。 −Ｓｆ９及びＳｆ２１細胞は鱗翅目胚細胞である。これらの細胞は寄託菌（Ｎ ｏ．ＣＲＬ−１７１１ ＡＴＣＣ）とその培養条件で入手できる。市販品もある （Ｇｉｂｃｏ）。ＫｉｎｇとＰｏｓｓｅｅ：Ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｐｍａｎ＆ Ｈａ ｌｌ，１９９２も参照されたい。 −ヒト肝細胞 ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ及びＨｕＨ７細胞は肝細胞癌に由来するヒト細胞系 である。これらの細胞は寄託菌から入手でき、その性質は例えば米国特許第４， ３９３，１３３号及び４，３９３，１３３号に記載されている。 −ヒトＫＢ細胞系：ヒト上皮癌に由来し、ＡＴＣＣ（ＣＣＬ１７）及びその培 養条件から入手可能である。 −ヒトＨｅｌａ細胞系：ヒト上皮癌に由来し、ＡＴＣＣ（ＣＣＬ２）及びその 培養条件から入手可能である。 −Ｗ１６２細胞系：これらの細胞はアデノウイルスＡｄ２のＥ４領域をそのゲ ノムに組み込んだｖｅｒｏ細胞である。これらの細胞はＷｅｉｎｂｅｒｇら（Ｐ ＮＡＳ８０（１９８３）５３８３）により記載されている。２．ヒト細胞の組換えバキュロウイルス感染 本実施例はバキュロウイルスのヒト起源細胞への感染能に関する。 ＲＳＶのＬＴＲの制御下にＬａｃＺ遺伝子を発現する組換えバキュロウイルス の溶液の種々の希釈液をヒト細胞（特に２９３又はその誘導体）に感染させる。 感染から４８時間後に青色細胞の出現が認められ、これらの細胞にバキュロウイ ルスを感染できることが判明する。３．アデノウイルスのＥ１領域を発現するバキュロウイルスおよび対応する欠損 アデノウイルスの構築 ３−１ ２種のＥ１発現カセットのクローニング プラスミドＡＥ２はオリゴヌクレオチド５’−ＴＣＣＴＴＧＣＡＴＴＴＧＧＧ ＴＡＡＣＡＧ−３’及び５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＴＴ Ｃ−３’を用いてｐＢＲＥ３１で実施したＰＣＲの産物をＰＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉ ｔｒｏｇｅｎ）にクローニングすることにより得られ、このＰＣＲ産物はＡｄ５ のヌクレオチド３１９８〜３５１１即ちＥ１Ｂ領域の３’末端を含む。プラスミ ドｐＢＲＥ１はほぼヌクレオチド１３００〜２３００を欠失するｐＢＲ３２２に クローニングしたＡｄ５のヌクレオチド１〜５７８８を含む。 プラスミドＡＥ３はｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＮｏｔＩ−Ｋｐ ｎＩで消化し、ＰＣＲ産物を含むＡＥ２のＮｏｔＩ−ＫｐｎＩフラグメントをク ローニングすることにより得られる。ＡＥ３はＡｄ５のヌクレオチド３１９８〜 ３５１１とそれに後続するＢＧＨのポリアデニル化部位を含む。 プラスミドＡＥ４はｐＢＲＥ１にＡＥ３のＢｇｌＩＩ−ＰｖｕＩＩフラグメン トをクローニングすることにより得られる。ＡＥ４は以下のＥ１発現カセットを 含むプラスミドである。 −Ａｄ５のヌクレオチド１〜３５１１、即ち左側ＩＴＲ、パッケージング配列、 Ｅ１Ａプロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ プロモーター、Ｅ１Ｂ遺伝子、 −ｐＣＤＮＡ３に由来するウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリＡ。 ｐＢＲＥ１をＢｓｔＮＩで消化した後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで消化して ５’付着末端を平らにした後、ＸｂａＩで消化した。こうして作製したＡｄ５の ヌクレオチド３９１〜１３３９を含むフラグメントをＳｍａＩ−ＸｖａＩ（非メ チル化部位）で消化したｐｉｃ２０Ｈに導入し、プラスミドＡＥ５を作製した。 プラスミドＡＥ６はＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩで消化したＡＥ４にＡＥ５のＥｃｏ ＲＩ−ＳｍａＩフラグメントをクローニングすることにより得られる。ＡＥ６は 以下のＥ１発現カセットを含むプラスミドである。 −Ａｄ５のヌクレオチド３９１〜３５１１、即ちＥ１Ａの「短縮」プロモーター 、Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂプロモーター、Ｅ１Ｂ遺伝子、 −ｐＣＤＮＡ３に由来するウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリＡ。 ３−２ 前記２種のＥ１カセットのバキュロウイルスクロー ニング プラスミドＡＥ４及びＡＥ６の（付着５’末端ＳｐｈＩをＴ４ ＤＮＡポリメ ラーゼ消化により予め平滑にしておいた）ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩフラグメントを プラスミドｐＡｃＳＧ２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶ 部位間にクローニングする。こうして夫々プラスミドＡＥ１４及びＡＥ１５を作 製する。いずれの場合も、多面体遺伝子の遺伝子座にＥ１領域を導入する。 プラスミドＡＥ１４及び１５をＡｃＮＰＶ株（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に由来 するバキュロウイルスＢａｃｕｌｏＧｏｌｄのＤＮＡと共に昆虫細胞Ｓｆ９に同 時トランスフェクトし、多面体の遺伝子の遺伝子座に組み込まれた２種のＥ１発 現カセットをもつ対応する２種の組換えバキュロウイルスＢａｃＡＥ１４及びＢ ａｃＡＥ１５を作製する。 ３−３ 新規Ｅ１欠失をもつ組換えアデノウイルスのクローニング プラスミドｐＣ０１（ＷＯ９６／１００８８）をＢＳｔＸＩで消化した後、Ｔ ４ ＤＮＡポリメラーゼで消化して付着３’末端を除去した後、ＲｓａＩで消化 した。こうして作製された Ａｄ５のヌクレオチド３５１３〜４６０７を含むフラグメントを、ＥｃｏＲＶで 直鎖化してウシアルカリホスファターゼで消化しておいたｐＢＳ−ＳＫ＋（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ）に導入し、プラスミドＡＥ０を作製した。 プラスミドｐＭＡ３７は以下のフラグメントの連結により得られる。 −ｓａｃＢを含むｐＸＬ２７５６のＥｃｏＲＶ−ＮｓｉＩはそのＥｃｏＲＩ及び ＫｐｎＩ部位を除去した逆選択遺伝子ＳａｃＢと、カナマイシン耐性遺伝子と、 クローニング多重部位と、Ｃｏ１Ｅ１複製起点をもつ。 −（アデノ配列を含む）ｐＣＯ１のＮｄｅＩ−ＮｓｉＩ。 −ｐＸＬ２７５６（カナマイシン耐性ベクター）のＳａｌＩ（Ｔ４ ＤＮＡポリ メラーゼにより平らにした付着５’末端）−ＡｓｅＩ。 従って、ｐＭＡ３７は、 −カナマイシン耐性遺伝子と、 −これを発現する細菌にスクロース感受性を付与するＳａｃＢ遺伝子と、 −Ａｄ５の１〜３８２配列（ＨｉｎｆＩ）とそれに続くＡｄ５ の３４４６〜４４１５配列（ＮｓｉＩ）を含み、導入遺伝子は存在しない。 ＳａｌＩ−ＮｓｉＩで消化したｐＭＡ３７にＡＥ０のＸｈｏＩ−ＮｓｉＩフラ グメントを導入することによりプラスミドＡＥＩＩを構築した。従って、このプ ラスミドは、 −カナマイシン耐性遺伝子と、 −これを発現する細菌にスクロース感受性を付与するＳａｃＢ遺伝子と、 −Ａｄ５の１〜３８２配列（ＨｉｎｆＩ）とそれに続くＡｄ５の３５１３〜４４ １５配列（ＮｓｉＩ）を含み、導入遺伝子は存在しない。 次に、プラスミドＡＥ１１から（目的導入遺伝子の挿入により）大腸菌で組換 えにより組換えアデノウイルスの構築を可能にする自殺シャトルベクターを構築 する。ＡＥ１１はプラスミドＡＥ６と相同の配列を含まない。プラスミドＡＥ１ １及びＡＥ４は共通してＥ１Ａの上流にＡｄ５の１〜３８２配列（Ｈｉｎｆ）を 含むが、これらの２種のプラスミド間でＥ１カセットの下流に相同は存在しない 。従って、ＡＥ１１に存在するＥ１欠失（即ち３８２〜３５１３）をもつアデノ とバキュロウイル スＢａｃＡＥ１４又はＢａｃＡＥ１５の間の相同組換えによりＲＣＡが発生する 可能性はない。 ３−４ 第１世代組換えアデノウイルスの構築 まず、慣用技術に従ってＢａｃＡＥ１４又は１５のストックを調製する。次に 、ＰａｃＩで消化したプラスミドｐＸＬ２８２２（プラスミドｐＸＬ２８２２は 完全Ａｄ５からＥ１（３８２〜３４４６又は３８２〜３５１３）とＥ３（２８５ ９２〜３０４７０）を欠失し、カセットＣＭＶ−βＧａｌをもつ）５ｇをコンピ テント細胞（例えばＨｕＨ７）にトランスフェクトし、同時又は非同時に、ＭＯ Ｉ １０〜１０００でＢａｃＡＥ１４又は１５を感染させる。細胞が溶解したら 、トランスフェクション上清を回収し、その後、予め又は同時にＢａｃＡＥ１４ 又は１５（ＭＯＩ １０〜１０００）を感染させた「新規」コンピテント細胞に 加えてアデノウイルスＡｄ２８２２を増幅し、Ａｄ２８２２のストックが得られ るまで同様に操作する。Ａｄ２８２２の増幅のモニターはこのウイルスにおける ｌａｃＺの存在によりできる。各増幅毎に上清をＷ１６２で疑似力価測定する。 増幅時にウイルスのゲノムを分析し、その完全性を確認する。最後に、このスト ラテジーは、こうして製造したアデノ ウイルスストックにＲＣＡを生じる可能性がないという利点がある。この汚染の 不在も確認する。４．アデノウイルスのＥ１及びＥ４領域を発現するバキュロウイルスの構築 ４−１ バキュロウイルスＥ１，Ｅ４（Ｂａｃ．Ｅ１−Ｅ４）の構築 以下のプロトコールを使用する。シャトルベクターｐＢａｃＰＡＫ８（Ｃｌｏ ｎｔｅｃｈ，米国）の多面体の遺伝子（Ｐｈ）の遺伝子座にＥ１及びＥ４領域を 逆向きにクローニングし、ｐＢａｃＥ１−Ｅ４を得る。次に、慣用技術によりｐ ＢａｃＥ１−Ｅ４とバキュロウイルスＢａｃＰＡＫ６のＤＮＡをＳｆ９細胞にコ トランスフェクトすることにより組換えバキュロウイルスを単離する（Ｋｉｔｔ ｓとＰｏｓｓｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４（５）（１９９３）８１ ０）。次に、感染Ｓｆ９細胞からＰＣＲにより組換えバキュロウイルスのゲノム 中のＥ１及びＥ４の存在を確認する。精製組換えバキュロウイルスを感染させた Ｈｕｈ７細胞へのＥ１及びＥ４の転写を細胞質ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより分 析する。 バキュロウイルスＥ１−Ｅ４を構築するためには、Ｅ１をも つ種々のフラグメントを導入することができる。本実施例で使用するフラグメン トはバキュロウイルス−Ｅ１の構築に関して実施例３に記載したものであり、適 正なプロモーター（短縮Ｅ１ａプロモーター及びＥ１ｂプロモーター）に制御下 のＥ１領域を含む。使用するＥ４フラグメントは以下の通りである。 −完全なＥ４をもつＭａｅＩＩ−ＭｓｃＩ ３２７２０〜３５８３５フラグメン ト、 −ＯＲＦ６をもつＢｇｌＩＩ−ＰｖｕＩＩ ３４１１５〜３３１２６フラグメン ト、 −ＯＲＦ６−ＯＲＦ６／７をもつＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ３４１１５〜３２４９ ０フラグメント、 −ＯＲＦ３をもつＰｖｕＩＩ−ＡｌｕＩ ３４８０１〜３３４３２９フラグメン ト。 これらのフラグメントはＥ４プロモーターの制御下においてもよいし、他のプ ロモーター、特にＨＳＶ−ＴＫ、ＣＭＶ又はＬＴＲ−ＲＳＶプロモーターの制御 下においてもよい。 上記位置はデータベースから入手可能なアデノウイルスＡｄ５の公表配列に基 づく。種々の血清型のアデノウイルスには多少の相違が存在する場合もあるが、 これらの位置は一般に他の 血清型、特にＡｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２及びＡｄＣＡＶ−２にも適用できる。 ４−２ Ｂａｃ．Ｅ１−Ｅ４によるＡｄΔＥ１ΔＥ４−ＬａｃＺのトランス相 補 アデノウイルスＡｄΔＥ１ΔＥ４−ＬａｃＺの生産は、実施例４−１で調製し たバキュロウイルスＥ１，Ｅ４とＥ１及びＥ４を欠損するアデノウイルスゲノム をコンピテント細胞に導入することにより得られる（図１参照）。精製Ｂａｃ． Ｅ１−Ｅ４のトランス相補によるコンピテント細胞におけるＡｄΔＥ１ΔＥ４− ＬａｃＺの最適生産条件を分析する。Ｗ１６２系におけるβ−ガラクトシダーゼ のトランスダクション単位（ｔ．ｄ．ｕ．）数としてＡｄΔＥ１ΔＥの力価を測 定し、得られたトランスン相補効率をパッケージング系ＩＧＲＰ２の効率と比較 する。５．アデノウイルスのゲノムの全体を相補するバキュロウイルスの構築 １３ｋｂまでの配列に相当し得る数種のタンパク質を単一ウイルスから同時発 現することは報告されている（ＢｅｌｙａｅｖとＲｏｙ，ＮＡＲ ２１（１９９ ３）１２１９）が、バキュロ ウイルスの最大クローニング能は十分に実証されていない。本実施例は、パッケ ージングシグナルを欠失し（Ａｄ．Ｐｓｉ−）、２個のＬｏｘＰ部位で挟まれた アデノウイルス（ｌｏｘＰ−ＩＴＲ−ＩＴＲ〜Ｅ４−ｌｏｘＰ）のゲノムをバキ ュロウイルスにクローニングできることを立証する。Ｃｒｅリコンビナーゼを誘 導的又は非誘導的（Ｃｒｅ又はＣｒｅ−ＥＲ系、実施例７参照）に発現するコン ピテント細胞にこの組換えバキュロウイルスを感染させ、Ｃｒｅリコンビナーゼ を活性化させると、アデノウイルスゲノムの切除と環化が可能になる。以後、ア デノウイルスゲノムは初期遺伝子の導入、複製、後期遺伝子の活性化が可能にな るが、パッケージングはできないので最小アデノウイルスの製造用ヘルパーとし て利用する（図２〜４参照）。このシステムでは、２種のバキュロウイルスのコ インフェクションと、ｌｏｘＰ部位間の２回の組換えイベントの実施により最小 アデノウイルスを製造する。このアプローチは、ヘルパーウイルスからアデノウ イルス粒子を生成しないという利点がある。 ゲノムＡｄ．Ｐｓｉ−の構築は大腸菌で実施する。このために、アデノウイル スＡｄ５の完全ゲノムを原核クローニングベ クターにクローニングし、ＩＴＲを結合する。酵素開裂と連結又は部位特異的突 然変異誘発によりＰｓｉ配列を除去する。次に、アデノウイルスゲノムの両側に 同じ向きにＬｏｘＰ配列を導入する。得られた構築物［ｌｏｘＰ−ＩＴＲ−ＩＴ Ｒ，ΔＰｓｉ〜Ｅ４−ｌｏｘＰ］を次に、実施例３に記載したストラテジーに従 ってバキュロウイルスとの組換えを可能にするシャトルベクターにクローニング する。その後、得られた組換えバキュロウイルスＢａｃＡｄ．Ｐｓｉ−を慣用方 法により単離する。６．切除可能な形態で欠損組換えアデノウイルスのゲノムを含むバキュロウイル スの構築 本実施例は欠損組換えアデノウイルスのゲノムをコンピテント細胞に導入する ことが可能なバキュロウイルスの構築に関する。より詳細には、組換えアデノウ イルスはコーディング領域全体を欠損し、ＩＴＲ及びＰｓｉ領域のみを保存して いる（最小アデノウイルス又はＡｄΔ）。 ６−１ 大腸菌におけるミニゲノム（ＡｄΔ）の構築 プラスミドｐ［ｌｏｘＰ−（ＩＴＲ−ＩＴＲ−Ｐｓｉ−Ｐ．ＣＭＶ−ＬａｃＺ −ｐＡ）−ｌｏｘＰ］を構築する。このために、アデノウイルスのＩＴＲ配列の コピーを酵素切断により単 離及び／又はＰＣＲにより増幅した後、アデノウイルスのシャトルベクターｐＧ Ｙ６３に含まれるＩＴＲ−Ｐｓｉ配列の上流にクローニングする。このベクター はｐＣＯ１（ＷＯ９６／１００８８）に由来し、ＩＴＲ−Ｐｓｉ配列とｐＩＸを コードする遺伝子の間にクローニングしたＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化シ グナル（ｐＡ）を末端にもつサイトメガロウイルスの極初期プロモーター（Ｐ． ＣＭＶ）の制御下のＬａｃＺ遺伝子をもつ。次に、（最小アデノウイルスのゲノ ムに対応する）このベクターの（ＩＴＲ−ＩＴＲ−Ｐｓｉ−Ｐ．ＣＭＶ−Ｌａｃ Ｚ−ｐＡ）領域を酵素切断により単離した後、プラスミドｐＢＳ２４６（Ｇｉｂ ｃｏ）のクローニング多重部位のＬｏｘＰ部位間にクローニングし、プラスミド ｐ［ｌｏｘＰ−（ＩＴＲ−ＩＴＲ−Ｐｓｉ−Ｐ．ＣＭＶ−ＬａｃＺ−ｐＡ）−ｌ ｏｘＰ］を作製する。次に、Ｃｒｅリコンビナーゼ（ＡｄＣｒｅ）を発現するＡ ｄ．ΔＥ１ΔＥ４を感染させたＩＧＲＰ２系にこのプラスミドをトランスフェク トすることにより、環状ＤＮＡからアデノウイルスのミニゲノムを生産してパッ ケージングする能力を試験する。ＩＧＲＰ２系でトランスフェクション上清を数 世代連続継代することにより、最小アデノウイルスを増幅する。 その後、塩化セシウム勾配等密度遠心分離により精製し、Ｗ１６２系で偽滴定に より定量する。当然のことながら、慣用分子生物学技術により、ＬａｃＺ遺伝子 を他の任意の目的核酸に容易に置き換えることができる。 ６−２ 切除可能なミニゲノムのバキュロウイルスクロー二ング ２つのｌｏｘＰ部位に挟まれた上記ミニゲノムＡｄΔをもつ構築物をシャトル ベクターｐＡｃＵＷ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，米国）でバキュロウイルスのＰ １０遺伝子座にクローニングする。次に、バキュロウイルスＢａｃ．ＡｄΔを生 産し、上記Ｓｆ９細胞で慣用同時トランスフェクション技術により単離し、Ｘ− Ｇａｌ染色後にプラーク表現型（白色）により選択する。従って、このバキュロ ウイルスは順方向に２つのｌｏｘＰ領域により挟まれた高度欠損アデノウイルス ゲノムをもつ。 ６−３ バキュロウイルスＢａｃＡｄＰｓｉ−のトランス相補によるＡｄΔの 生産。 アデノウイルスゲノム全体のトランス相補機能をもつバキュロウイルスＢａｃ Ａｄ．Ｐｓｉ−（実施例５に記載）と、（上記）偽アデノウイルスのゲノムをも つバキュロウイルスＢａｃ． ＡｄΔをコンピテント細胞に同時にコンイフェクトする。培地にタンパク質を加 えるか、又はＣｒｅを発現するプラスミドもしくはウイルス（バキュロウイルス ）を細胞にトランスフェクトするか、又は（実施例７に記載するような）系のゲ ノムに安定に組み込んだカセットの発現によりＣｒｅリコンビナーゼを導入する 。ＢａｃＡｄ．Ｐｓｉ−と上清をコインフェクトした細胞の培養上清の連続継代 により最小アデノウイルスを増幅した後、上記技術により精製及び滴定する。こ の方法によるとＡｄΔを単独ウイルスとして得られるので、慣用技術によりこれ を単離及び精製ずればよい。更に、得られる力価は工業用途に適合可能である。７．Ｃｒｅタンパク質を発現する系の構築 誘導的又は非誘導的にＣｒｅを発現する系を構築し、本発明のバキュロウイル ス（例えばＢａｃ．ＡｄΔ及びＢａｃＡｄ．Ｐｓｉ−）におけるｌｏｘＰ部位間 の組換え効率を増加すると共に、Ｃｒｅの発現を制御する。この構築物において 、Ｃｒｅは誘導的又は非誘導的で好ましくは強力なユビキチンプロモーターの制 御下に、エストラジオールレセプター（ＥＲ）結合ドメインとのＣ末端融合タン パク質として又は単独で発現される。 より詳細には、使用するプロモーターはｐＧＲＥ５プロモーター、メタロチオニ ンプロモーター、ＳＶ４０プロモーター又はＨＳＶ−ＴＫ遺伝子のプロモーター である。 これらのＣｒｅ系を構築するために、Ｃｒｅ発現カセット（Ｃｒｅ又はＣｒｅ− ＥＲ）を含むプラスミドと、選択マーカー（Ｎｅｏ）のプラスミドの２種のプラ スミドをコンピテント細胞にコトランスフェクトする。Ｇ４１８耐性クローンを 選択し、これらのクローンにおけるＣｒｅの活性をプラスミドｐ（Ｐ．ＣＭＶ− ｌｏｘＰ−ＡＴＧ−ｓｔｏｐ−ｐＡ−ＬｏｘＰ−ＬａｃＺ）のコトランスフェク ションにより試験する。このプラスミドは、３個のオープンリーディングフレー ムにおける一連のストップコドンと、２個のｌｏｘＰ部位に挟まれたＳＶ４０ウ イルスの転写開始及びポリアデニル化シグナルをプロモーター（Ｐ．ＣＭＶ）と ＬａｃＺの始点の間に導入することにより不活化したＬａｃＺ遺伝子を含む。次 に、２個のｌｏｘＰ部位間の組換えにより誘導したβ−ガラクトシダーゼ活性に よりインデューサー（エストラジオール）の存在下又は不在下でのクローンにお けるＣｒｅの発現を試験する。こうして上記プロモーター及びコンピテント細胞 から融合タンパク質Ｃｒｅ−ＥＲ又 はＣｒｅタンパク質単独を安定に発現する数個のクローンを選択する。これらの クローンは本発明によるウイルスの製造に使用可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ， ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ (72)発明者 ビーニユ，エマニユエル フランス国、エフ―94200・イブリ・スユ ル・セーヌ、リユ・ベルナール・パリシ、 ２ (72)発明者 イエ，パトリス フランス国、エフ―75005・パリ、リユ・ ラセペードウ、11・ビス

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．欠損組換えウイルスのゲノムと、欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な 機能の全部又は一部を含むバキュロウイルスをコンピテント細胞集団に導入する ことを特徴とする欠損組換えウイルスの製造方法。 ２．バキュロウイルスが欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の全部を 含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．バキュロウイルスが欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の一部を 含み、残りの部分はコンピテント細胞により導入されることを特徴とする請求項 １に記載の方法。 ４．欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能が数種のバキュロウイルスに より導入されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ５．欠損組換えウイルスが欠損組換えアデノウイルスであることを特徴とする請 求項１に記載の方法。 ６．組換えアデノウイルスのゲノムがＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１〜Ｌ５、ｐ ＩＸ及びＩＶａ２から選択される１種以上の機能を欠損しており、バキュロウイ ルスが欠損組換えゲノムのト ランス相補に必要な機能の全部を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。 ７．組換えアデノウイルスのゲノムがＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１〜Ｌ５、ｐ ＩＸ及びＩＶａ２から選択される１種以上の機能を欠損しており、バキュロウイ ルスが欠損組換えゲノムのトランス相補に必要な機能の一部を含み、残りの部分 は１種以上の他のバキュロウイルス及び／又はコンピテント細胞により導入され ることを特徴とする請求項５に記載の方法。 ８．ヘルパーバキュロウイルスがアデノウイルスのＥ１領域をの全部又は一部を 含み、Ｅ１領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相補を可能にするこ とを特徴とする請求項５に記載の方法。 ９．ヘルパーバキュロウイルスがアデノウイルスのＥ２領域をの全部又は一部を 含み、Ｅ２領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相補を可能にするこ とを特徴とする請求項５に記載の方法。 １０．ヘルパーバキュロウイルスがアデノウイルスのＥ４領域をの全部又は一部 を含み、Ｅ４領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相補を可能にする ことを特徴とする請求項５ に記載の方法。 １１．ヘルパーバキュロウイルスがアデノウイルスのＥ１及びＥ４領域の全部又 は一部を含み、Ｅ１及びＥ４領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムの相 補を可能にすることを特徴とする請求項５に記載の方法。 １２．組換えアデノウイルスのゲノムが全コーディングウイルス領域を欠失して おり、ヘルパーバキュロウイルスがその相補を可能にする機能の全体を含むこと を特徴とする請求項５に記載の方法。 １３．バキュロウイルスがパッケージング領域と場合によりＩＴＲを除き、アデ ノウイルスゲノムの全体を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。 １４．バキュロウイルスと欠損組換えウイルスのゲノムに存在する相補機能が組 換えを生じる可能性のある相同ゾーンを含まないことを特徴とする請求項１に記 載の方法。 １５．Ｅ１領域と場合によりＥ３を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムをコ ンピテント細胞に導入し、バキュロウイルスと欠損組換えアデノウイルスのゲノ ムに存在するアデノウイルスのＥ１領域が組換えを生じる可能性のある相同ゾー ンを含ま ないように、これらの細胞にＥ１領域を含むバキュロウイルスを同時又は非同時 に感染させることを特徴とする請求項１４に記載の方法。 １６．バキュロウイルスがアデノウイルスＡｄ５の３９１〜３５１１フラグメン トを含み、Ｅ１領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムがより大きい欠失 をもつことを特徴とする請求項１５に記載の方法。 １７．バキュロウイルスがアデノウイルスＡｄ５の３９１〜３５１１フラグメン トを含み、Ｅ１領域を欠損する組換えアデノウイルスのゲノムがヌクレオチド３ ８３〜３５１２（両端を含む）をカバーする欠失をもつことを特徴とする請求項 １６に記載の方法。 １８．異種プロモーターの制御下におかれた欠損ウイルスの相補機能をコードす る核酸をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルス。 １９．相補機能がアデノウイルスのＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１〜Ｌ５、ｐＩ Ｘ及びＩＶａ２領域単独又はその組み合わせによりコードされる機能の全部又は 一部から選択されることを特徴とする請求項１８に記載のバキュロウイルス。 ２０．相補機能がＡＡＶのＲｅｐ及びＣａｐ領域単独又はその組み合わせにより コードされる機能の全部又は一部から選択されることを特徴とする請求項１８に 記載のバキュロウイルス。 ２１．相補機能がレトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ領域単独又はその 組み合わせによりコードされる機能の全部又は一部から選択されることを特徴と する請求項１８に記載のバキュロウイルス。 ２２．相補機能をコードする核酸が対応する領域を含むウイルスのゲノムのフラ グメントに対応するＤＮＡから構成されることを特徴とする請求項１８に記載の バキュロウイルス。 ２３．相補機能をコードする核酸が血清型Ａｄ２又はＡｄ５のアデノウイルスの ゲノムのフラグメントに対応するＤＮＡから構成されることを特徴とする請求項 ２２に記載のバキュロウイルス。 ２４．プロモーターが相補機能の発現に天然に関与するプロモーター領域により 構成されることを特徴とする請求項１８に記載のバキュロウイルス。 ２５．プロモーターが調節又は非調節下の強力な細胞又はウイルスプロモーター であることを特徴とする請求項１８に記載の バキュロウイルス。 ２６．相補機能がアデノウイルスゲノムのＥ１領域又は少なくともＥ１ａ領域を 含む前記領域の一部のみを含むことを特徴とする請求項１９に記載のバキュロウ イルス。 ２７．相補機能がアデノウイルスゲノムのＥ４領域又は少なくともＯＲＦ３もし くはＯＲＦ６を含む前記領域の一部のみを含むことを特徴とする請求項１９に記 載のバキュロウイルス。 ２８．アデノウイルスゲノムのコーディング領域全体を含むことを特徴とする請 求項19に記載のバキュロウイルス。 ２９．パッケージング領域を欠失する完全アデノウイルスゲノムを含むことを特 徴とする請求項２８に記載のバキュロウイルス。 ３０．ＡｃＮＰＶ株であることを特徴とする請求項１８に記載のバキュロウイル ス。 ３１．核酸が多面体の遺伝子座又はｐ１０遺伝子座のレベルに導入されているこ とを特徴とする請求項１８に記載のバキュロウイルス。 ３２．核酸がコンピテント細胞で切除可能なカセットの形態で導入されているこ とを特徴とする請求項１８に記載のバキュロ ウイルス。 ３３．順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする２つの配列に挟まれた 少なくとも１個のＤＮＡ領域をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスで あって、前記ＤＮＡ領域がコンピテント細胞で機能的な少なくとも１個の複製起 点と、ウイルスの相補機能をコードする核酸を含む前記バキュロウイルス。 ３４．部位特異的組換えを可能にする配列がＰ１バクテリオファージのＬｏｘＰ 配列であり、組換えがＣｒｅタンパク質の存在下に得られることを特徴とする請 求項３３に記載のバキュロウイルス。 ３５．欠損組換えゲノムを含むアデノウイルスの感染により前記ゲノムを細胞に 導入することを特徴とする請求項５に記載の方法。 ３６．欠損組換えゲノムをトランスフェクションにより細胞に導入することを特 徴とする請求項５に記載の方法。 ３７．相補機能をもつバキュロウイルスとは異なる組換えバキュロウイルスと共 に欠損組換えゲノムを細胞に導入することを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３８．順方向に配置された部位特異的組換えを可能にする２つの配列に挟まれた 少なくとも１個のＤＮＡ領域をそのゲノムに挿入した組換えバキュロウイルスで あって、前記ＤＮＡ領域がコンピテント細胞で機能的な少なくとも１個の複製起 点と、欠損アデノウイルスのゲノムを含む前記バキュロウイルス。 ３９．欠損組換えアデノウイルスのゲノムが主にＩＴＲ領域と、パッケージング 配列と、目的核酸を含むことを特徴とする請求項３８に記載のバキュロウイルス 。 ４０．請求項３３に記載のバキュロウイルスと請求項３８に記載のバキュロウイ ルスをコンピテント細胞集団に感染させ、部位特異的組換えを可能にするリコン ビナーゼの存在下に前記細胞をおき、その後、生産されたアデノウイルスを回収 することを特徴とする欠損組換えアデノウイルスの製造方法。 ４１．コンピテント細胞集団が肝、筋、繊維芽、胚、上皮（特に肺）、眼（特に 網膜）又は神経細胞集団であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ４２．コンピテント細胞集団が２９３細胞もしくは付加相補機能を含む任意誘導 細胞、Ａ５４９、ＨｕＨ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＨＥＲ、９１１、ＨｅＬ ａ又はＫＢから選択され ることを特徴とする請求項４１に記載の方法。 ４３．請求項１に記載の方法を実施することにより得られる精製ウイルス調製物 。