JP6417322B2 - 遺伝子治療ベクターの広範な遺伝子送達 - Google Patents
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Description
脊髄性筋萎縮症(SMA)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、Kennedy病のような、運動神経(MN)疾患は、脊髄、脳幹及び/又は運動皮質におけるMNの選択的変性を特徴とする神経変性疾患である (Monani 2005; Pasinelli and Brown 2006); (MacLean, Warne et al. 1996)。主に全身性注射によるMNへの薬物送達は、「脳血液関門」(BBB)の存在によって妨げられることから、これらの疾患には治療法がない。この解剖学的かつ生理的バリアーは、中枢神経系(CNS)キャピラリーの内皮細胞間のタイトジャンクションによって形成され、血行とCNSの間の分子の容易な通過を防いでいる(Scherrmann 2002)。CNS実質内に直接注射した組換えタンパク質でのMNの代替サプライも、神経実質内へのタンパク質の拡散が低いために困難であり、反復注射の必要性(又は浸透圧ポンプの留置やが、外科的処置の侵襲性が臨床適用の可能性を妨げている。
本発明は、伝達性ウイルスベクターを用いるインビボでの治療産物の送達のための新規方法に関する。より具体的には、本発明は、対象のCSF及び血液内への伝達性ウイルスベクターの組み合わせの投与による哺乳動物対象の神経系及び末梢組織内への治療遺伝子の送達及び発現のための組成物及び方法に関する。
神経系及び末梢組織の両者への広範な遺伝子送達は、MN疾患(たとえば、脊髄性筋萎縮症(SMA)又は筋萎縮性側索硬化症(ALS))又はリソソーム病のような多全身性疾患の処置について重要なチャレンジである。ここに、哺乳動物の血液及びCSF内へのウイルスベクターの単回の組み合わせ注射後に神経系(中枢及び末梢の両者)及び末梢器官の効率的な形質導入を可能にする新たな遺伝子導入方法を記載する。より具体的には、tAAVベクターをマウスに静脈内(“i.v.”又は“IV”)及び脳室内(“i.c.v.”又は“ICV”)で注射し、SMAの重度(hSMN2)及び軽症(SMNdelta7)マウスモデルの両者において単回のICV注射後に比べてより高く、大幅な臨床有用性が得られた。SMNdelta7マウスについて体重増加、そしてhSMN2において生存及び体重増加が認められた。さらなる有用性が、軽症SMNdelta7マウスにおいてIV注射マウスに比べて回復した生殖能について観察された。治療用遺伝子発現を脊髄のMN及びグリア細胞において、背面知覚線維(dorsal sensory fibers)において、背根神経節(dorsal root ganglions)及び心臓又は肝臓において見出すことができた。
本発明において、用語「ウイルスベクター」は、ウイルスを含むか又はウイルスの成分に由来し、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞を感染することに適した任意のベクターを意味する。典型的には、ウイルスベクターは、ウイルスカプシド又はエンベロープにパッケージされた組換えウイルスゲノムを含む。
− AAV9由来カプシド中にAAV9由来ゲノム(治療タンパク質、好ましくは二つのAAV9由来ITRフランキングAAV9由来ITR及びAAV9由来パッケージング配列及び治療タンパク質をコードする核酸に動作可能にリンクした、AAV9由来ITR及びAAV9由来パッケージング配列を含む核酸分子)を含むベクター;
− AAV10由来カプシド中にAAV10由来ゲノムを含むベクター;
− AAV10由来カプシド中にAAV9由来ゲノムを含むベクター;
− AAV9由来カプシド中にAAV10由来ゲノムを含むベクター;
− AAV10由来カプシド中にAAV2由来ゲノムを含むベクター;
− AAV9由来カプシド中にAAV2由来ゲノムを含むベクター;
− ウシAAV由来カプシド中にウシAAV由来ゲノムを含むベクター
である。
本発明は、とりわけ、伝達性ウイルスベクターを用い、対象の血液及び脳脊髄液(CSF)の両者に送達したとき、改善されたウイルス介在遺伝子発現及び疾患是正を得ることができるという予想外の発見に基づく。驚くべきことに、この結果は、この組み合わせの投与が一つの単一投与部位におけるウイルスの同一用量と比べて大幅に増加した治療用遺伝子発現を導くことを示す。本発明は、さらに、組み合わせの投与が処置した対象における治療有用性を改善すること、たとえば、生存及び体重増加の大幅な改善及び生殖能力の回復を示す。
本発明は、また、組成物及びキットにも関する。これに関して、本発明のさらなる目的は、治療用遺伝子を含む伝達性ウイルスベクターの二つのユニタリー用量、全身注射に適合させた一つのユニタリー用量、CSF内への注射に適切な一つのユニタリー用量を含む組成物又はキットである。i.c.v./全身用量比率は、好ましくは、0.3〜3であり、なおより好ましくは、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0又は1.25から選択される。
本発明は、治療産物の大量及び広範な送達によって種々の障害を処置するために用いることができる。治療産物は、疾患の原因又は症状を緩和又は減少させるか又は対象に利益を与えることができる、任意のタンパク質、ペプチド又はRNAであることができる。治療タンパク質の例は、成長因子、サイトカイン、ホルモン、神経伝達物質、酵素、抗アポトーシス因子、血管新生因子、生存運動ニューロンタンパク質(SMN)のような病理障害において突然変異していることが知られている任意のタンパク質を含む。治療RNAの例は、以下に記載の任意の疾患において治療目的を有するタンパク質をコードするメッセンジャーRNAを標的にするアンチセンスRNA又はRNAiを含む。たとえば、スーパーオキシドジスムターゼ酵素を標的にするRNAiは、ALSの処置を考慮して、上で定義したとおりのAAVベクターがコードすることができる。
SMN (SMA)
IGHMBP2 (SMA-RD)
VAPB (SMA or ALS)
SMN2 (SMA)のpre-mRNAスプライシング部位を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列
SOD1(ALS)又はATX (Spinocerebellar ataxia)又はUBQLN2 (ALS)又はATAXIN2 (ALS)又はC9又はf72 (ALS)又はTARDBP (ALS)又はTDP-43、FUS、(ALS and FTD)のpre-mRNAスプライシング部位を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列
SOD1 (ALS)又はATX (Spinocerebellar ataxia)又はUBQLN2 (ALS)又はATAXIN2 (ALS)又はC9orf72 (ALS又はfrontotemporal lobar degeneration [FTD])又はTARDBP (ALS)又はTDP-43 (ALS及びFTD)又はFUS、(ALS及びFTD)又はCHMP2B (ALS)のmRNAを標的にするshRNA(microRNA又はsiRNA)
ATX (Spinocerebellar ataxia)又はUBQLN2 (ALS)又はATAXIN2 (ALS)又はC9orf72 (ALS又はfrontotemporal lobar degeneration [FTD]) 又はTARDBP (ALS) 又はTDP-43又はFUS, (ALS及びFTD) 又はCHMP2B (ALS)
MECP2又はMECP2 (Rett syndrome)を標的にするshRNA
HEXB (Sandhoff disease)
材料及び方法
動物
SMNdelta7マウスを(SMA type Iのモデルと考えられる) をJackson Laboratoryから購入した(SMN2+/+, SMNdelta7+/+, Smn-/-, JACKSON no. SN 5025)。これらのマウスはExon 2の標的突然変異によって外来性マウスSmn遺伝子を無効にされたトリプル突然変異体であり、二つのトランスジェニックアレル(ヒトSMN2 cDNA [exon 7を欠く]及び全ヒトSMN2遺伝子)を有する(Le T.T. Hum Mol Genet 2005)。野生型マウスは、[SMN2+/+, SMNdelta7+/+, Smn+/+]同腹子及び[SMN2+/+, SMNdelta7+/+, Smn+/-]同腹子にヘテロ接合性(Ht)に相当する。マウスを飼育し、自立コロニーを作り、そしてコントロールされた条件下で維持した(22±1℃, 60±10% 相対湿度、 12 h/12 h 明/暗サイクル、飼料及び水を自由に)。全ての動物実験を実験動物の世話と使用のための欧州ガイドラインにしたがって行った。
CMVプロモーターのコントロール下のGFP導入遺伝子又はホスホグリセラートキナーゼ(PGK)プロモーターのコントロール下のhSMN1 (SMNopti)のコドン最適化配列のいずれかを発現するAAV2プラスミドを用いて、若干改変して、以前に記載のとおり対応する偽型AAV9ベクターを作った(Duque et al., Mol Ther 2009; Dominguez et al., Hum Mol Genet 2011)。簡略には、(i)アデノウイルスヘルパープラスミド、(ii) rep2及びcap9遺伝子をコードするAAVパッケージングプラスミド(p5E18-VD2/9)及びGFP又はSMNoptiを発現するAAV2プラスミドを用いる、AAV9-SMNをHEK293細胞中のヘルパーウイルスフリー3プラスミドトランスフェクションによって作った。この組換えベクターをイオジキサノール密度勾配での超遠心によって精製した。ウイルス調製品を脱塩し、Amicon Ultra-Ultra cell 100 K フィルターユニット(Millipore)を用いて濃縮した。アリコートを使用まで−80℃で保存した。ベクター力価をリアルタイムPCRによって決定し、ミリリットル当たりのウイルスゲノムとして表した(vg/ml)。
新生仔:
i.v.注射を眼の近くの側頭部静脈の血流中に33G針のハミルトンシリンジを用いて行った。i.c.v.注射を前1mm、ラムダまで横1mmそして深さ2mm、33G針のハミルトンシリンジを用いて行った。IV及びICV注射の両者を青色染料溶液を用いて確認した。
1月齢野生型マウス(n=4)を右側脳室内にscAAV9-GFP (4.8 × 10e10 vg, 20 μl)を注射した。注射を腹膜内麻酔下でおこなった(ケタミン(100mg/Kg)、キシラジン(10mg/kg))。
定位的注射を左側脳室内に直接行った(後ろ0.34 mm、十字縫合まで横1.0 mm及び脳の頂点から深さ1.8 mm)。
マウスを、それぞれ、SMN及びGFP発現分析のために注射15日及び1月後に安楽死させた。マウスを安楽死させ(10 mg/kgキシラジン、100 mg/kgケタミン)、0.1 mol/l PBS、次いで、PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)で心臓内で還流した。筋をPBS還流のみの後に凍結した(P15新生仔を除く)。組織を除去し、同じPBS-4% PFA溶液中で24時間インキュベーションすることによってポストフィックスした。次いで、これを、冷イソペンタン(-50℃)中で凍結する前に、脳及び非神経器官についてPBS-15%ショ糖溶液中、脊髄についてPBS-30%ショ糖溶液中4℃で少なくとも24時間インキュベーションした。連続切片をクリオスタットで切り出し、さらなる分析のために-80℃で保存した(脳について16μm切片; 脊髄及び心臓について14μm; 脾臓及び腎臓について12μm; 肝臓について10μm; 筋肉について8μm)。
AAV9-GFP注射マウスからの組織におけるGFPの免疫組織化学検出のために、切片を最初にPBS Triton X-100 0.1%中で洗浄し、次いで、過酸化水素1%、メタノール20%及びTriton X-100 0.1%と一緒にPBSバッファー溶液(又は過酸化水素溶液[Peroxidase Blocking Solution; Dako, Trappes, France])で20分間インキュベーションし、内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。切片を4%ヒツジ血清(Dako)、4%ウシ血清アルブミン(Sigma)及び0.1%Triton X-100でPBSバッファー中室温で1時間ブロックした。次いで、切片をウサギポリクローナル抗GFP(1/5000; Abcam)で一晩インキュベーションした。リンスの後、切片を西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)ビオチン化抗ウサギ抗体(1/250; Vectastain, Vector Laboratories)で2時間、次いで、アビジン−ビオチン複合体(Vectastain Elite ABC kit, Vector Laboratories)で30分間インキュベーションした。0.1% PBS Triton X-100でのリンスの後、ジアミノベンジジン(DAB)染色をVector Laboratoriesからのペルオキダーゼ3.3'-DAB基質キットで明らかにした。反応を水で止め、切片をオイキットでマウントする前にアルコールとキシレンで脱水した。
タンパク質抽出液を14日齢の未処置SMNdelta7マウス(n=3)、AAV9-SMNopti処置SMNdelta7マウス(n=3)及びWTマウス(n=3)から、そして1及び2月齢のAAV9-GFP注射又は非注射WTマウスからの脳、脊髄、心臓、肝臓、腎臓及び脾臓から調製した。組織抽出物を製造者のプロトコール(Qiagen)にしたがってQproteome FFPE 組織キットを用いて調製した。筋肉を、プロテアーゼインヒビターカクテル(Complete Mini, Roche Diagnostics)を添加したRIPAEバッファー(150 mm NaCl、50 mm Tris-HCl、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、1% NP40、1% SDS)中で溶解した。85又は(肝臓について)70μgの全タンパク質をSDS10%ポリアクリルアミドゲルに流し、Immobilon-pメンブラン(Millipore)に移した。このメンブランをTBSTブロッキングバッファー(5%脱脂粉乳を添加した0.2% Tween 20を含むTris-buffered saline)で希釈した、ウサギ抗GFP抗体(1:2000; AbCam)又はマウス抗SMN抗体(1:1000; BD transduction)及びマウス抗αチューブリン(1:10000; Sigma)で連続的にインキュベーションした。TBSTバッファー中での4回の洗浄後に、メンブランをブロッキングバッファーで希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウス又は抗ウサギ抗体(GE Healthcare, 1:10 000)でインキュベーションした。メンブランを化学蛍光Super Signal Ultra試薬(Pierce)を用いてさらに処理した。
ベクター: AAV9-PGK-SMN (CsCl勾配精製)
力価: 6,7x10e12vg/ml
SMAマウス: SMNdelta7 (軽症SMA, SMA type 2モデル)
生存中央値 13.6日(最大平均余命18日)
用量
ICV (n=10): マウス当たり4.5x10e10vg
IV (n=10): マウス当たり4.5x10e10vg
ICV+IV (n=9): 2.5x10e10vg IV + 2x10e10vg ICV
ベクター: AAV9-PGK-SMN (CsCl勾配精製)
力価: 6.7x10e12vg/ml
SMAマウスモデル: [Smn-/- ; hSmn1 +/+] (≪ KO ≫) (重度SMA, SMA type 1モデル)
生存中央値3.6日(最大平均余命6日)
用量
KO ICV (n=7): マウス当たり4,7.1010 vg (7μl)
KO IV (n=4): マウス当たり3,35.1011vg (50μl)
KO ICV+IV (n=4): (4,7.1010 vg ICV + 4,7.1010 vg IV) , マウス当たり全9,4.1010 vg
・ i.c.v.対i.v.AAV9-SMNopti注射SMNΔ7マウスの生存及び表現型
我々は、翻訳効率及び導入遺伝子(AAV9-SMN)発現を改善するために、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターのコントロール下でヒトコドン最適化されたヒトSMN1遺伝子を発現し、PBKプロモーターのとSMN1 cDNAの間にキメライントロンを含む最適化scAAV9ベクターを用いた(Dominguez, Hum. Mol. Genet. 2011)。
i.v.及びi.c.v. AAV9-SMN注射マウスの両者は、試験期間を通じて体重を増加させ、それらの体重は、14日(疾患の末期)での非注射SMNΔ7マウスのそれに比べて有意に高かった(i.v.及びi.c.v.について、それぞれ、非注射マウスの3.1gに対して4.7g及び5.5gの平均体重)(図2)。注射の6週間後に、i.c.v.注射マウスの平均体重は、ヘテロマウスのそれに近かったが、対照的に、i.v.注射マウスは有意に小さかった(i.v.及びi.c.v.注射マウスの体重が、ヘテロマウスの18.3±0.6に対して、それぞれ、11.0±1.3及び16.3±1.2であった。)。
ウェスタンブロット分析は、ICV注射SMNdelta7マウス(n=3)におけるSMNの脳及び脊髄発現が、非注射SMNdelta7 (n=2)、及びさらに野生型動物(n=2)に比べて有意に高かったことを立証した(図3A)。i.c.v.注射マウスのCNSにおけるSMN発現レベルの増加は、同濃度のベクターのi.v.注射後(P0での, 側頭静脈における)に以前に報告されたそれよりも優れていた(Duque et al., Mol. Ther. 2009)。i.c.v.注射によって誘発される高CNS発現を、GFPコードscAAV9ベクターでi.c.v.注射したマウスの脳及び脊髄におけるGFP陽性アストログリア及び神経細胞の数の存在によって確認した(図3B)。これは、CNSにおけるSMN発現が、SMA病理からSMNdelta7マウスを救うために十分であることができることを示唆する。
予想外にも、SMNの発現が、P0でのscAAV9-PGK-SMNのi.c.v.送達後に末梢器官において検出された。
具体的には、SMNタンパク質がICV注射SMNdelta7マウス(n=3)の心臓、腎臓及び肝臓において見出された(図4A)。これらの結果は、GFPコードscAAV9ベクターで同一条件において注射されたマウスにおけるGFP免疫蛍光分析によって確認された(図4B)。
ICV/IV注射マウスの100%が、注射50日後でもまだ生存した(IV後40%(図5)。しかし、ICVとIV/ICV群間の生存における差を検出するにはまだ早すぎる。
ICV/IV同時注射SMNdelta7マウスの体重減少表現型は、IV又はICV注射SMNdelta7マウスのそれに比べて改善された(Ht:コントロールヘテロマウス; NI:非注射SMNdelta7マウス(図6)。
AAV9-SMN注射マウス平均生存は、ICV (8.1 ± 2, n=7)又はIV (9 ± 2.7, n=4)注射のいずれかの後で、非注射マウスのそれに比べて増加した(3.7 ± 0.4, n=14) (図7)。しかし、IV/ICVマウスの寿命中央値(17日)は、IV(12日)注射又はICV(9日)のみ注射マウスのそれに比べて優れていた。組み合わせのIV/ICV注射の治療効果は、重度SMAマウスの個体間変動性(ICVの平均生存27 ± 13日)のために、変動した(7〜60日を超えて)。4匹中の1匹は、組み合わせのIV/ICV群においてまだ生きている(注射後60を超えて)。
図9は、SMNレベルがICV単独注射マウスと比べてCo-ICV/IV注射マウスにおいて減少していることを示す。SMN陽性細胞の数及び染色強度もICV単独注射マウスと比べてCo-ICV/IV注射マウスにおいて減少した。
明らかな利点がIV注射マウスに比べて回復された生殖能力がICV又はICV/IV注射後のSMNdelta7雌マウスにおいて観察された(図10)。100%の雌がICV/IV及びICV処理群において繁殖性であったが、対照的に、IV処理マウスでは、生殖することはできなかった。
Co-ICV/IV AAV10 注射マウスの体重減少表現型と生存が、特に209及び36日齢の2匹のマウスにおいて、非処理マウスに比べて相当に改善した(図11)。非処理マウスは、決して6日齢を超えなかった(生存中央≒3日)。
Claims (19)
- 哺乳動物において治療遺伝子を発現させるためのキットであって、該哺乳動物の脳脊髄液内及び血液内への投与のための、該遺伝子を含む伝達性ウイルスベクターの組み合わせを含み、該伝達性ウイルスベクターが、AAV9ベクター又はAAV10ベクタ―からなる群より選択される、キット。
- 多全身性疾患の処置に有効な治療遺伝子の投与による哺乳動物における多全身性疾患を処置するためのキットであって、該治療遺伝子が、伝達性ウイルスベクターに含まれ、該キットが、該哺乳動物の脳脊髄液及び血液内への投与のためのベクターの組み合わせを含み、該伝達性ウイルスベクターが、AAV9ベクター又はAAV10ベクタ―からなる群より選択される、キット。
- 該ベクターのゲノムが、一本鎖又は二本鎖である、請求項1又は2記載のキット。
- 該ベクターが、機能的Rep及びCapをコードするウイルス配列を欠く複製欠損AAVゲノムを含む、請求項1〜3のいずれか1項記載のキット。
- 該ベクターが、ssAAV9ベクター、scAAV9ベクター、又はAAV10ベクターである、請求項1〜4のいずれか1項記載のキット。
- 伝達性ウイルスベクターの哺乳動物の脳脊髄液(CSF)への投与が、脳室内(ICV)注射、くも膜下腔内注射、又は大槽内注射である、請求項1又は2に記載のキット。
- 少なくとも一つの側脳室内への投与のためのベクターを含む、請求項6に記載のキット。
- 伝達性ウイルスベクターの哺乳動物の血液内への投与が、静脈内注射(IV)、筋肉内注射、動脈内注射、腹腔内注射、又は皮下注射である、請求項1又は2に記載のキット。
- 静脈内注射のためのベクターを含む、請求項8に記載のキット。
- 該ベクターの組み合わせのICV及びIV注射を含む、請求項1又は2に記載のキット。
- 組み合わせの投与が、互いに72時間未満内の、好ましくは、48時間未満内の、より好ましくは、24時間未満内の、さらにより好ましくは、1時間未満内の該哺乳動物のCSF及び血液内の投与のための、請求項1又は2に記載のキット。
- 組み合わせの投与が、実質的に同時の投与である、請求項11に記載のキット。
- 比率:CSF中に投与された用量/血液中に投与された用量が、0.2と5の間、好ましくは、0.2と1.5の間に含まれる、請求項1又は2に記載のキット。
- 該比率が、0.4、0.6、0.8、1.0、又は1.25である、請求項13に記載のキット。
- 治療遺伝子が、成長因子、サイトカイン、ホルモン、神経伝達物質、酵素、抗アポトーシス因子、血管新生因子、生存運動ニューロンタンパク質(SMN)のような病理障害において突然変異していることが知られている任意のタンパク質から選択される治療RNA又はタンパク質をコードする、請求項1〜14のいずれか1項記載のキット。
- 多全身性疾患が、神経変性疾患、神経筋疾患、疼痛、リソソーム病、トラウマ、骨髄疾患、神経系の癌、脱髄性疾患、神経系の自己免疫疾患、神経毒性症候群、睡眠障害から選択される、請求項2〜15のいずれか1項記載のキット。
- 単回の組み合わせのCSF−血液投与のための、請求項1〜16のいずれか1項記載のキット。
- それを必要とする哺乳動物においてSMAを処置するためのキットであって、該哺乳動物の脳脊髄液及び血液内への投与のためのSMN遺伝子を含むAAV9ベクター及びAAV10ベクターから選択されるtAAVベクターの組み合わせを含み、該組み合わせの投与が、神経系及び末梢組織及び器官におけるSMNタンパク質の発現を導き、SMAの処置を可能にする、キット。
- 二つのユニタリー用量の、治療遺伝子を含むAAV9ベクター及びAAV10ベクターから選択されるtAAVベクターを含むキットであって、一つのユニタリー用量は、全身注射のために適応し、一つのユニタリー用量は、CSF内への注射に適応する、キット。
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