KR20230009383A - 근위축성 측삭경화증을 치료하기 위한 안티센스 서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은 안티센스 서열, 상기 안티센스 서열을 포함하는 핵산 구축물 및 벡터, 및 C9orf72 헥사뉴클레오티드 리피트 익스팬션 관련 질환 예컨대 근위축성 측삭경화증 또는 전두측두엽치매를 치료하기 위한 그들의 용도에 관한 것이다.

Description

근위축성 측삭경화증을 치료하기 위한 안티센스 서열

본 발명은 핵산, 조성물 및 질환, 특히 근위축성 측삭경화증 또는 전두측두엽치매의 치료 방법에 관한 것이다.

근위축성 측삭경화증 (ALS) 은 성인에서 가장 흔한 운동 뉴런 장애이며, 매년 발병률이 1-2/100,000 이고 유병률이 4-6/100,000 이다. 상위 및 하위 운동 뉴런 둘 모두의 진행성 퇴화는 전형적으로 진단 후 3 내지 5년 내에 호흡 부전에 대한 사망을 초래한다. ALS 환자의 약 15% 가 전두측두엽 치매 (FTD) 의 징후도 발생한다. FTD 는 알츠하이머병 다음으로 가장 흔한 치매의 원인으로, 인격과 행동의 변화 및 언어장애로 이어진다. 그것은 뇌의 전두엽과 전방 측두엽에서의 진행성 뉴런 소실을 특징으로 한다.

ALS, FTD 및 ALS/FTD 의 가장 빈번한 유전적 원인은 인간 염색체 9 오픈 리딩 프레임 72 (C9orf72) 유전자의 돌연변이에서 확인되었다 (Renton et al., 2011). C9orf72 유전자의 인트론 1 (비코딩 엑손 1a 와 1b 사이) 의 헥사뉴클레오티드 리피트 익스팬션 (hexanucleotide repeat expansion) (HRE) G4C2 는 유전성 및 산발성 ALS/FTD 및 다른 신경계 장애의 원인이 되는 것으로 밝혀졌다 (Souza et al., 2015). HRE 관련 신경독성을 설명하기 위해 3가지 발병 메카니즘이 제안되었다. 첫째로, 리피트 익스팬션의 존재는 C9 유전자 발현의 하향 조절을 야기하여 기능 상실을 초래한다. 둘째로, HRE 는 G4C2 리피트 (센스) 및 C4G2 리피트 (안티센스) 를 함유하는 RNA 로 양방향으로 전사되고, 이들은 세포의 핵에서 응집하여, RNA-결합 단백질 (RBP) 을 핵내 RNA 포커스 (focus) 로 격리시킨다. 또다른 제안된 발병 메카니즘은 리피트-관련 비-AUG-의존성 (RAN) 번역으로서 공지된 비-정규 번역 메카니즘을 통해 센스 또는 안티센스 RNA 전사물로부터 번역된 디펩티드 리피트 단백질 (DPR) 의 직접적인 독성이다.

현재, ALS 및 FTD 는 임상 징후 및 유전 결정인자가 중복되는 질병 연속체로 간주된다. 지난 수십 년 동안 수행된 많은 수의 전임상 및 임상 시험에도 불구하고, 현재 이러한 치명적인 질환에 대해 효과적인 치료가 가능하지 않다. 따라서 효과적인 치료가 시급하게 필요하다.

ALS 를 치료하려는 목적으로, 본 발명자들은 C9orf72 유전자의 리피트의 전사 및 번역을 차단하여 RNA 포커스의 형성을 방해하는 효과적인 안티센스 서열 (AS) 을 개발하였다.

본 발명의 제 1 양태는 C9orf72 전사물을 표적으로 하는 안티센스 핵산 분자로서, 안티센스 핵산 분자는 센스 C9orf72-RNA 포커스 및 안티센스 C9orf72-RNA 포커스의 수준을 감소시킬 수 있는, 안티센스 핵산 분자에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 상기 안티센스 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 6 을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다.

본 발명은 또한 C9orf72 전사물을 표적으로 하는 안티센스 핵산 분자로서, 안티센스 핵산 분자는 SEQ ID NO: 3 에 제시된 또는 SEQ ID NO: 5 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지는, 안티센스 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 C9orf72 전사물을 표적으로 하는 안티센스 핵산 분자로서, 안티센스 핵산 분자는 SEQ ID NO: 21 에 제시된 또는 SEQ ID NO: 22 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지는, 안티센스 핵산 분자에 관한 것이다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 작은 핵 RNA 예컨대 U7 작은 핵 RNA 에 융합되어 있다.

본 발명은 또한 적어도 두 개의 본 발명의 안티센스 핵산 분자를 포함하는 핵산 구축물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 핵산 구축물은 센스 C9orf72 전사물을 표적으로 하는 제 1 안티센스 핵산 분자 및 안티센스 C9orf72 전사물을 표적으로 하는 제 2 안티센스 핵산 분자를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 제 1 안티센스 핵산 분자는 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지고, 제 2 안티센스 핵산 분자는 SEQ ID NO: 3 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다.

본 발명은 추가로 본 발명의 안티센스 핵산 분자 또는 핵산 구축물을 전달하기 위한 벡터에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 벡터는 상기 안티센스 서열 또는 상기 핵산 구축물을 코딩하는 바이러스 벡터이다. 특히, 상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터, 특히 AAV9 벡터 또는 AAV10 벡터 예컨대 AAVrh10 벡터일 수 있다. 특히, 상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터, 특히 AAV9 또는 AAV10 벡터일 수 있다.

본 발명은 또한 C9orf72 관련 질환, 특히 C9orf72 헥사뉴클레오티드 리피트 익스팬션 관련 질환의 치료에서 사용하기 위한 안티센스 핵산 분자, 핵산 구축물 또는 벡터에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 질환은 근위축성 측삭경화증 (ALS) 또는 전두측두엽치매 (FTD), 특히 근위축성 측삭경화증 (ALS) 이다. 특정 실시형태에서, 상기 안티센스 핵산 분자, 상기 핵산 구축물 또는 상기 벡터는 정맥내 및/또는 뇌실내 경로를 통한 투여를 위한 것이다.

도 1: C9orf72 유전자 및 특정 영역에 대한 안티센스 서열의 도식적 표현. 엑손은 박스로서 표현되고, GGGGCC 리피트 익스팬션의 위치는 인트론 1 에 도시된다. 안티센스 서열 (AS) 은 HRE 를 포함하는 C9orf72 유전자 영역에서의추정 스플라이싱 사일런서 영역 (SSR) 을 표적으로 하도록 디자인되었다. AS-1 은 C9orf72 의 안티센스 프리-트랜스크립트 (pre-transcript) 의 엑손 1a 에서의 SSR 을 표적으로 하도록 디자인된다. AS-2, AS-3, AS-5 및 AS-7 은 안티센스 프리-트랜스크립트의 인트론 1 에서의 SSR 을 표적화하도록 디자인된다. AS-4, AS-6 및 AS-8 은 C9orf72 의 센스 프리-트랜스크립트의 인트론 1 을 표적화하도록 디자인된다.
도 2: 하나 또는 두 개의 안티센스 (각각 상위 또는 하위 디자인) 를 전달하는 렌티바이러스 벡터 게놈 (A) 및 AAV 벡터 게놈 (B) 의 도식적 표현. 센스 또는 안티센스 HRE 에 대해 유도된 안티센스 (안티센스) 서열은 최적화된 뮤린 U7 작은 핵 RNA (U7 프로모터) 내로 내포되고, 증강된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 과 함께 포스포글리세레이트 키나아제 프로모터 (PGK) 의 제어 하에, 2 개의 자가-불활성화 (SIN) 장 말단 리피트 서열 (LTR) (A) 또는 2 개의 AAV 역 말단 리피트 (ITR) (B) 사이에 클로닝된다.
도 3: 2 명의 건강한 공여자 (대조군, CTRL-1 및 CTRL-2) 및 C9 돌연변이를 보유하는 2 명의 ALS 환자 (ALS-1 및 ALS-2) 로부터의 진피 불멸화된 섬유아세포의 TYE-563-LNA (CCCCGG)3CC (센스 포커스를 검출) 및 (GGGGCC)3GG (안티센스 포커스를 검출) 프로브를 사용하는 센스 및 안티센스 포커스에 대한 RNA-FISH 분석. 핵을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) 로 염색했다. 스케일 바 10㎛. 이미지는 스피닝 디스크 공초점 현미경 Nikon Ti2 를 사용하여 획득했다.
도 4: ALS-2 섬유아세포의 렌티바이러스 형질도입 후 센스 (위쪽 그래프) 또는 안티센스 (아래쪽 그래프) RNA 포커스를 발현하는 핵의 수의 정량화. ALS-2 섬유아세포를 C9orf72 전사물의 HRE 부분에 가까운 영역을 표적으로 하는 안티센스 서열 (AS-1, AS-2, AS-3, AS-4, AS-5, AS-6, AS-7 및 AS-8) 및 랜덤 서열 (CTRL) 을 보유하는 렌티바이러스 벡터 (렌티-AS) 로 형질도입했다. 데이터는 ≥3 독립적 형질도입 실험의 평균 +/- SEM 으로 표현했다. RNA 포커스의 백분율 (%) 은 100% 로 주어진 총 핵에 대한 하나 이상의 포커스를 함유하는 핵의 비로서 계산되었고, 적어도 300 개의 핵이 각 플레이트에 대해 계수되었다. AS-CTRL 과 비교하여 각각의 AS-C9 에 대한 포커스 감소의 % 가 표에 보고된다. 그룹 간의 차이는 스튜던트 t 검정으로 분석했다. 통계적 유의성은 각각의 AS 를 형질도입 실험의 동일한 세트 내의 대조군 조건과 비교하여 보고된다 (* p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; 및 ****p < 0.0001).
도 5: 불멸화된 섬유아세포에서 웨스턴 블롯에 의해 드러난 C9 단백질. (A) 두 명의 건강한 대조군 (CTRL-1 및 CTRL-2) 또는 두 명의 C9 ALS 환자 (ALS-1 및 ALS-2) 에서 유래한 진피 불멸화된 섬유아세포에서 C9orf72 발현 (C9orf72, 클론 2E1) 의 웨스턴 블롯 분석. 빈쿨린을 로딩 대조군으로서 사용했다. 세포로부터의 단백질 용해물 20 ㎍ 을 로딩했다 (n=1). (B) ALS-2 섬유아세포에 랜덤 서열 (CTRL) 또는 상이한 AS-C9 (AS-1, AS-2, AS-3, AS-4, AS-5, AS-6) 을 발현하는 렌티바이러스 벡터 (렌티-AS) 를 형질도입하고, C9orf72 의 수준을 웨스턴 블롯에 의해 분석했다. 세 개의 독립적 실험 (exp1, exp2 및 exp3) 의 이미지는 (C) C9orf72 단백질과 빈쿨린 사이의 비를 보여주는 웨스턴 블롯 결과의 농도측정 분석으로 제시된다. 데이타는 세 개의 독립적 트랜스펙션 실험의 평균 +/- SEM 으로서 표현된다. 군 사이의 차이를 일원 ANOVA 및 그 후 터키 다중 비교 시험에 의해 분석했다. 군 사이에 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
도 6. 주입하지 않은 (NI, n=4) 및 AAV-U7-AS 대조군 (U7-CTRL, n=5), AAV-U7-AS-6 (U7-AS-6, n=5) 또는 AAV-U7-AS-9 (U7-AS-9, n=4) 를 주입한 3-월령 C9 담체 마우스 (오직 암컷) 로부터의 경부 척수 용해물에서 C9orf72 변이체 1, 변이체 2, 변이체 3 의 mRNA 발현 수준. 데이타는 상대 배수 변화로 제시되며, C9orf72 mRNA 수준은 마우스 HPRT 로 정규화되어 있다. 군 사이의 차이를 일원 ANOVA 및 그 후 터키 다중 비교 시험에 의해 분석했다. 각각의 U7-AS 를 NI 및 U7-CTRL 조건과 비교하여 통계적 유의성이 보고되어 있다. 오차 바는 평균의 표준 오차 (sem) 에 해당한다. (p-값 < 0.05: * ; p-값 < 0.01: **; p-값 < 0.0001: ****, n= 마우스의 수). NI 또는 AS-CTRL 와 비교되는 두 개의 AS-C9 에 대한 HRE-함유 전사물 (V1 및 V3) 감소의 % 가 표에 보고되어 있다.

발명의 상세한 설명

안티센스 서열

본 발명의 제 1 양태는 C9orf72 전사물을 표적으로 하는 안티센스 서열에 관한 것이다.

본 출원에서, 표현 "안티센스 서열", "AS", "AS 서열" 또는 "안티센스 핵산 분자" 는 C9orf72 유전자에 의해 코딩되는 pre-mRNA 또는 mRNA 의 일부에 상보적인 단일 가닥 핵산 분자를 의미한다. 따라서, 본 발명의 AS 은 수소 결합을 통해 표적 C9orf72 전사물에 혼성화할 수 있는 단일-가닥 올리고머 서열이다.

본 발명의 AS 은 길이가 적어도 13 개 뉴클레오티드, 적어도 20 개 뉴클레오티드, 적어도 25 개 뉴클레오티드, 적어도 30 개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 35 개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 39 개 뉴클레오티드 또는 적어도 40 개 뉴클레오티드일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 길이가 13 내지 50 개 뉴클레오티드이다. AS 은 길이가, 예를 들어, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 또는 45 개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, AS 은 길이가 13, 15, 20, 25, 30, 35, 39, 40 또는 45 개 뉴클레오티드이다. 바람직하게는, AS 은 35 내지 50 개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 39 내지 50 개 뉴클레오티드 또는 40 내지 50 개 뉴클레오티드이다.

특정 실시형태에서, 안티센스 서열은 단리된 안티센스 서열이다. 특정 실시형태에서, 상기 단리된 서열은 화학적으로 합성된다. 단리된 서열은 혈청 리보뉴클레아제에 의한 그것의 분해를 방지하기 위해, 아래 추가로 기재된 바와 같이 화학적으로 변형될 수 있으며, 이는 그것의 생체내 효능을 증가시킬 수 있다. 특히, 상기 단리된 안티센스 서열은 길이가 13 개 뉴클레오티드내지 25 개 뉴클레오티드일 수 있다. 특히, 단리된 AS 은 길이가 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 개 뉴클레오티드일 수 있다.

또다른 특정 실시형태에서, 안티센스 서열은 세포 내로 그것의 발현을 가능하게 하는 엘리먼트를 포함하는 벡터에 의해 코딩된다. 특정 실시형태에서, 벡터에 의해 코딩되는 상기 안티센스 서열은 길이가 13 내지 50 개 뉴클레오티드이다. AS 은 길이가, 예를 들어, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 또는 45 개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, AS 은 길이가 13, 15, 20, 25, 30, 35, 39, 40 또는 45 개 뉴클레오티드이다. 바람직하게는, AS 은 길이가 35 내지 50 개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 39 내지 50 개 뉴클레오티드 또는 40 내지 50 개 뉴클레오티드이다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 인간 C9orf72 유전자 또는 인간 C9orf72 전사물을 표적으로 한다.

본 발명의 특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 인간 C9orf72 전사물을 표적화한다.

본 발명의 AS 은 C9orf72 전사물의 임의의 코딩 또는 비-코딩 부분을 표적으로 하도록 디자인될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "C9orf72 전사물" 은 C9orf72 pre-mRNA 및 C9orf72 mRNA 를 포함한다.

C9orf72 (염색체 9 오픈 리딩 프레임 72) 는 유전자 C9orf72 (C9) 에 의해 코딩되는 단백질이다. 인간 C9orf72 유전자는 염기쌍 27,546,542 로부터 염기쌍 27,573,863 까지 염색체 9 오픈 리딩 프레임 72 의 짧은 (p) 아암 (arm) 상에 위치한다. 인간 C9orf72 유전자는 잘 특성분석되어 있다. 그것의 서열은 SEQ ID NO :18 (NCBI ref seq: NG_031977.1) 에 보고되어 있다. C9orf72 유전자는 11 개 엑손으로 구성되고, 세 개의 mRNA 로 전사될 수 있다: 변이체 1 (V1) (NM_145005), 변이체 2 (V2) (NM_018325) 및 변이체 3 (V3) (NM_001256054). 전사물 V2 및 V3 은 긴 형태의 C9orf72 단백질을 코딩하지만, 전사물 V1 은 짧은 것을 코딩한다. C9orf72 는 양방향으로 전사되므로 안티센스 전사물이 또한 생성된다 (Zu et al., 2013).

본 발명의 AS 은 병원성 리피트 익스팬션을 함유하는 C9orf72 전사물을 표적화하는데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 표적화된 C9orf72 전사물은 병원성 헥사뉴클레오티드 리피트 익스팬션 (HRE) 을 함유한다. "헥사뉴클레오티드 리피트 익스팬션" 은 적어도 두 번 반복되는 일련의 여섯 개의 염기, 특히 GGGGCC (G4C2) 또는 CCCCGG (C4G2) 를 의미한다. 헥사뉴클레오티드 리피트 익스팬션은 특히 C9orf72 핵산의 인트론 1 에 위치한다. 본 발명의 맥락에서, 병원성 헥사뉴클레오티드 리피트 익스팬션은 C9orf72 핵산에 헥사뉴클레오티드, 예컨대 G4C2 또는 C4G2 의 적어도 30 리피트를 포함하고, 질환과 관련된다. 특정 실시형태에서, 리피트는 연속적이다. 특정 실시형태에서, 리피트는 1 개 이상의 핵염기에 의해 개입된다. 실제로, ALS 또는 FTD 환자에서 C9orf72 유전자는 건강한 대상 (30 미만 HRE) 에서보다 제 1 인트론에서 더 긴 G4C2 또는 C4G2 HRE (>70 HRE) 를 특징으로 한다. 추가의 특정 실시형태에서, 병원성 HRE 는 헥사뉴클레오티드의 적어도 70 리피트, 예컨대 G4C2 또는 C4G2 의 적어도 70 리피트를 포함한다.

특정 실시형태에서, AS 은 C9orf72 전사물의 HRE 내에 또는 근처에 위치하는 서열을 표적화할 수 있다.

특히, AS 은 C9orf72 전사물의 인트론 1 또는 엑손 1A 내에 위치하는 서열에 상보적일 수 있다.

특정 실시형태에서, AS 은 C9orf72 전사물의 HRE 내에 위치하는 서열을 표적화할 수 있다. 다시 말하면, AS 은 HRE 로 이루어지는 서열에 상보적이다.

본 발명의 AS 은 또한 C9orf72 전사물의 HRE 의 측부에 있는 다른 영역을 표적화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 HRE 의 업스트림에 있는 319 개 뉴클레오티드로부터 HRE 의 다운스트림에 있는 18 개 뉴클레오티드까지의 영역에 위치하는 서열을 표적으로 한다.

특정 실시형태에서, AS 은 HRE 의 업스트림에 있는 영역, 즉 HRE 의 5' 에 있는 영역을 표적으로 한다.

또다른 특정 실시형태에서, AS 은 HRE 와 중첩되는 서열 및 HRE 의 측부에 있는 C9orf72 전사물의 영역을 표적화할 수 있다. 특정 실시형태에서, AS 은 HRE 의 5' 측부 영역 및 HRE 의 일부를 포함하는 서열을 표적화할 수 있다 (즉 AS 은 HRE 및 HRE 의 5' 영역과 중첩된다). 또다른 특정 실시형태에서, AS 은 HRE 의 3' 측부 영역 및 HRE 의 일부를 포함하는 서열을 표적화할 수 있다 (즉 AS 은 HRE 및 HRE 의 3' 영역과 중첩된다).

또다른 특정 실시형태에서, AS 은 추정 스플라이싱 사일런서 영역 (SSR) 을 표적으로 한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 SEQ ID NO: 18 의 C9orf72 게놈 서열의 위치 5002 내지 5041, 위치 5128 내지 5167, 위치 5200 내지 5239 또는 위치 5299 내지 5338 의 영역에 포함된 SSR 을 표적으로 한다. 특정 실시형태에서, AS 은 엑손 1a 에 위치하는 SSR 을 표적으로 한다. 또다른 특정 실시형태에서, AS 은 인트론 1 에, 바람직하게는 인트론 1 의 HRE 의 업스트림에 위치하는 SSR 을 표적으로 한다.

본 발명의 AS 은 센스 또는 안티센스 C9orf72 전사물을 표적화할 수 있다. 실제로, HRE 는 센스 및 안티센스 가닥 모두로부터 그것의 병리적 효과를 발휘한다고 기재된 바 있다 (Haeusler et al., 2016). 다시 말하면, HRE 는 RNA 로 양방향으로 전사되고 응집하여 핵내 포커스를 형성하고 RNA-결합 단백질 (RBP) 을 격리한다. 특히, G4C2 및 C4G2 리피트를 함유하는 HRE 는 G4C2 및 C4G2 리피트를 함유하는 RNA 로 양방향으로 전사될 수 있다. 본 발명의 AS 은 이러한 센스 또는 안티센스 RNA 를 표적화하도록 디자인될 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 센스 C9orf72-RNA 포커스 및/또는 안티센스 C9orf72-RNA 포커스의 수준을 감소시키도록 디자인된다. "센스 C9orf72-RNA 포커스" 는 센스 헥사뉴클레오티드 리피트-함유 C9orf72 RNA, 예컨대 G4C2 리피트-함유 C9orf72 RNA 의 응집으로부터 초래되는 핵내 포커스를 의미한다. By "안티센스 C9orf72-RNA 포커스" 는 안티센스 헥사뉴클레오티드 리피트-함유 C9orf72 RNA, 예컨대 C4G2 리피트-함유 C9orf72 RNA 의 응집으로부터 초래되는 핵내 포커스를 의미한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 센스 포커스 및 안티센스 포커스 둘 모두를 감소시킬 수 있다.

"센스 또는 안티센스 RNA 포커스의 수준의 감소" 는 포커스의 수를 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 만큼 감소 또는 저하시키는 것을 의미한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 포커스의 수를 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더욱더 바람직하게는 적어도 60% 만큼 감소시킬 수 있다.

센스 또는 안티센스 RNA 포커스의 수준을 확인하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 특히, 형광 인 시추 (in situ) 혼성화 (FISH) 가 사용될 수 있다. 예를 들어, 센스 또는 안티센스 RNA 포커스의 수준 센스 포커스를 검출하기 위한 TYE563-(C4G2)3 잠긴 (locked) 핵산 (LNA) 프로브 및 안티센스 포커스를 검출하기 위한 TYE563-(G4C2)3 LNA 프로브를 사용하여 FISH 에 의해 확인될 수 있다.

리피트-함유 RNA 는 세포질로 이동할 수 있고, 여기서 이들은 리피트-관련 비-AUG-의존성 (RAN) 번역으로 공지된 비-정규 번역 메카니즘을 통해 독성 디펩티드 리피트 단백질 (DPR) 로 번역될 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 센스 HRE-함유 RNA 및/또는 안티센스 HRE-함유 RNA 로부터 번역된 디펩티드 리피트 단백질의 수준을 감소시킬 수 있다. 센스 RNA 로부터 번역된 디펩티드 리피트 단백질은 폴리[GA], 폴리[GR] 및 폴리[GP] 펩티드를 포함한다. 안티센스 RNA 로부터 번역된 디펩티드 리피트 단백질은 폴리[PR], 폴리[PA] 및 폴리[GP] 펩티드를 포함한다. "DPR 의 수준의 감소" 는 DPR 의 수를 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 만큼 감소 또는 저하시키는 것을 의미한다.

또다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 센스 및 / 또는 안티센스 HRE-함유 C9orf72 전사물의 수준을 감소시킬 수 있다. "센스 및 / 또는 안티센스 HRE-함유 C9orf72 전사물의 수준의 감소" 는 센스 및 / 또는 안티센스 병원성 전사물의 수준을 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 만큼 감소 또는 저하시키는 것을 의미한다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 병원성 HRE-함유 전사물의 수준을 감소시키는 한편, 전체 C9orf72 전사물의 수준을 보존할 수 있다. 다시 말하면, 본 발명의 AS 은 병원성 전사물의 수준을 감소시키는 한편, 전체 C9orf72 단백질 수준을 보존할 수 있다.

본 발명의 실시를 위한 대표적인 AS 가 표 1 에 열거되어 있다:

표 1 :

AS-1, AS-2, AS-3 및 AS-5 는 안티센스 C9orf72 전사물을 표적화하도록 디자인된다. AS-4 및 AS-6 은 센스 C9orf72 전사물을 표적화하도록 디자인된다.

SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2 의 역상보성 서열이 또한 사용될 수 있다. 따라서 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO:2 에 역상보성인 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지는 AS 이 또한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 따라서, AS 은 하기를 포함하거나 또는 그것으로 이루어질 수 있다 :

- SEQ ID NO:21 : 5' TGACGCACCTCTCTTTCCTAGCGGGACACCGTAGGTTACG 3' (SEQ ID NO:1 의 역상보성 서열) ; 또는

- SEQ ID NO:22 : 5' AACACACACCTCCTAAACCCACACCTGCTCTTGCTAGACC 3' (SEQ ID NO:2 의 역상보성 서열).

특정 실시형태에서, AS 은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열을 포함한다. 바람직하게는, AS 은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열을 포함한다.

또다른 특정 실시형태에서, AS 은 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열로 이루어진다. 바람직하게는, AS 은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열로 이루어진다.

특정 실시형태에서, AS 은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열 중 어느 하나의 13 내지 25 개 연속 뉴클레오티드를 갖는 서열을 포함한다. 바람직하게는 AS 은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열 중 어느 하나의 13 내지 25 개 연속 뉴클레오티드를 갖는 서열을 포함한다.

특정 실시형태에서, AS 은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열 중 어느 하나의 13 내지 25 개 연속 뉴클레오티드를 갖는 서열로 이루어진다. 바람직하게는 AS 은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열 중 어느 하나의 13 내지 25 개 연속 뉴클레오티드를 갖는 서열로 이루어진다.

특정 실시형태에서, AS 은 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 바람직하게는, AS 은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다.

특정 실시형태에서, AS 은 SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 22 에 제시된 서열을 포함한다.

또다른 특정 실시형태에서, AS 은 SEQ ID NO:21 또는 SEQ ID NO: 22 에 제시된 서열로 이루어진다.

특정 실시형태에서, AS 은 SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 22 에 제시된 서열의 13 내지 25 개 연속 뉴클레오티드를 갖는 서열을 포함한다.

특정 실시형태에서, AS 은 SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 22 에 제시된 서열의 13 내지 25 개 연속 뉴클레오티드를 갖는 서열로 이루어진다.

특정 실시형태에서, AS 은 SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 22 에 제시된 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다.

본 발명의 AS 은 임의의 적합한 화학물일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 DNA 또는 RNA 핵산 분자일 수 있다. 생체내에서 사용하기 위해, 단리된 AS 은 몇몇 화학적 수식, 예를 들어 포스페이트 백본 수식에 의해 안정화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 안정화된 단리된 AS 은 수식된 백본을 가질 수 있으며, 예를 들어 포스포로티오에이트 연결을 가질 수 있다. 다른 가능한 안정화 수식은 포스포디에스테르 수식, 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 수식의 조합, 메틸포스포네이트, 메틸포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, p-에톡시, 및 이들의 조합을 포함한다. 단리된 AS 의 화학적으로 안정화된, 수식된 형태는 또한 2'-O-메틸 (2'OME), 2'-O-메톡시에틸 (2'MOE), 2'-플루오르화 (2'F) 및 2'-O-아미노프로필 유사체와 같은 당 부분의 2'-위치에서의 화학적 수식을 포함한다. 화학적 수식은 발달되었고, 모르폴리노 (포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머, PMO), 잠긴 핵산 (LNA), 2',4'-구속된 에틸 (cEt), 펩티드 핵산 (PNA), 트리사이클로-DNA, 트리사이클로-DNA-포스포로티오에이트 AON 분자 (WO2013/053928) 또는 U 작은 핵 (sn) RNA 와 같은 새로운 세대의 분자가 디자인되었다.

단리된 AS 를 그것의 특정 작용 부위에 전달하기 위해, 비-바이러스 유전자 전달 방법 예컨대 미세주입, 유전자 총, 전기천공, 및/또는 N-아세틸갈락토사민, 옥타구아니딘 덴드리머, 세포-침투 펩티드, 리포좀 또는 나노입자와 같은 다양한 담체를 사용하는 화학적 방법이 사용될 수 있다.

특정 실시형태에서, 안티센스 서열은 작은 핵 RNA 예컨대 U7 작은 핵 RNA 로 수식된다. 특정 실시형태에서, 상기 AS 은 작은 핵 RNA 분자 예컨대 U1, U2, U6, U7 또는 임의의 다른 작은 핵 RNA, 또는 키메라 작은 핵 RNA 에 연결된다 (Donadon et al., 2019; Imbert et al., 2017). snRNA 는 pre-mRNA 의 프로세싱에 관여하고, Sm 코어라고 불리는 특정 단백질과 회합되어 작은 핵 리보핵단백질 (snRNP) 의 복합체를 형성한다. U7 수식에 대한 정보는 특히 Goyenvalle, et al., 2004; WO11113889; 및 WO06021724 에서 찾을 수 있다.

U7 작은 핵 RNA (U7 snRNA) 는 작은 핵 리보핵단백질 복합체 (U7 snRNP) 의 성분이고, Sm/Lsm (Sm-유사) 단백질에 대한 결합 부위를 변형시켜 pre-mRNA 스플라이싱 조절을 위한 도구로 사용될 수 있다 (Imbert et al., 2017). 특정 실시형태에서, D. Schumperli 에 의해 기재된 U7 카세트가 사용된다 (Schumperli and Pillai, 2004). 그것은 천연 U7-프로모터 (위치 -267 에서 +1), U7smOpt snRNA 및 위치 116 까지의 다운스트림 서열을 포함한다. U7smOpt 에서 히스톤 pre-mRNA 에 상보적인 18 nt 천연 서열이, 예를 들어, 이미 기재된 바와 같은 (Goyenvalle et al., 2004) PCR-매개 돌연변이유발을 사용하여 선택된 AS 서열의 1 개 또는 2 개 (2 회 사용된 동일한 서열, 또는 2 개의 상이한 서열) 또는 그 이상의 리피트로 대체된다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 SEQ ID NO: 9 내지 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 17 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 바람직하게는, 본 발명의 AS 은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 17 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다.

특정 실시형태에서, AS 은 SEQ ID NO: 9 내지 SEQ ID NO: 14 및 SEQ ID NO: 17 에 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 바람직하게는, 본 발명의 AS 은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 17 에 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14 에 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다.

표 2 : U7 snRNA 와 융합된 AS 에 해당하는 서열

특정 실시형태에서, 본 발명의 AS 은 SEQ ID NO: 23 또는 SEQ ID NO: 24 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다.

특정 실시형태에서, AS 은 SEQ ID NO: 23 또는 SEQ ID NO: 24 에 제시된 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다.

표 3 : U7 snRNA 와 융합된 AS 에 해당하는 서열

특히 혈액-뇌-장벽을 통해, 안정하고 효율적인 생체내 전달을 위해, 단리된 AS 은 또한 임의의 세포-투과성 펩티드 및 단백질 분비를 매개하는 신호 펩티드에 융합되거나 그와 공동-투여될 수 있다. 세포-투과성 펩티드 can be RVG 펩티드 (Kumar et al., 2007), PiP (Betts et al., 2012), P28 (Yamada et al., 2013), 또는 단백질 형질도입 도메인 예컨대 TAT (Malhotra et al., 2013) 또는 VP22 (Lundberg et al., 2003) 일 수 있다.

핵산 구축물

본 발명의 제 2 양태는 위에 기재된 바와 같은 안티센스 핵산 분자 적어도 두 개를 포함하는 핵산 구축물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 상기 핵산 구축물은 상술된 AS 을 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 개 또는 그 이상 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 핵산 구축물은 위에 기재된 바와 같은 동일한 AS 핵산 분자의 반복을 포함한다. 특정 실시형태에서, 핵산 구축물은 동일한 AS 서열의 반복을 포함하며, AS 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 6 으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 핵산 구축물은 동일한 AS 서열의 반복을 포함하며, AS 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO :4 또는 SEQ ID NO: 6, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6 이다.

특정 실시형태에서, 핵산 구축물의 각각의 AS 은 위에 기재된 바와 같은 U7 작은 핵 RNA 에 융합되어 있다.

특정 실시형태에서, 핵산 구축물은 위에 기재된 바와 같은 두 개의 상이한 AS 을 포함한다. 특정 실시형태에서, 핵산 구축물은 두 개의 상이한 AS 을 포함하며, AS 은 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 핵산 구축물은 두 개의 상이한 AS 을 포함하며, AS 은 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO: 6 중 어느 하나에 제시된 서열로 이루어진다.

특정 실시형태에서, 핵산 구축물은 센스 C9orf72 전사물을 표적으로 하는 제 1 AS 및 안티센스 C9orf72 전사물을 표적으로 하는 제 2 AS 를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제 1 AS 및 제 2 AS 은 각각 위에 기재된 바와 같은 U7 작은 핵 RNA 와 융합되어 있다.

특정 실시형태에서, 핵산 구축물은 하기를 포함한다:

(i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 5, 특히 SEQ ID NO: 3 에 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지는 제 1 AS; 및

(ii) SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6, 특히 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열 중 어느 하나와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지는 제 2 AS.

특정 실시형태에서, 핵산 구축물은 하기를 포함한다:

(i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 5 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지는 제 1 AS; 및

(ii) SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지는 제 2 AS.

특정 실시형태에서, 제 1 안티센스 서열은 SEQ ID NO: 3 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지고, 제 2 안티센스 서열은 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 제 1 안티센스 서열은 U7 작은 핵 RNA 에 융합된 SEQ ID NO: 3 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지고, 제 2 안티센스 서열은 U7 작은 핵 RNA 에 융합된 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다.

특정 실시형태에서, 핵산 구축물은 SEQ ID NO: 17 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 핵산 구축물은 SEQ ID NO: 17 와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다.

AS 전달

본 발명의 안티센스 서열 또는 핵산 구축물은 생체내에서 단독으로 또는 벡터와 함께 전달될 수 있다. 가장 넓은 의미에서, "벡터" 는 안티센스 서열의 세포로의 전달을 용이하게 할 수 있는 임의의 비히클이다. 본 발명에서 유용한 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바이러스, 및 AS 서열(들)의 삽입 또는 혼입에 의해 조작된 바이러스 또는 박테리아 공급원으로부터 유래된 다른 비히클을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

바이러스 벡터는 바람직한 유형의 벡터이고, 하기 바이러스로부터의 핵산 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 렌티바이러스 예컨대 HIV-1, 레트로바이러스, 예컨대 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스, 아데노바이러스, 파르보바이러스 예컨대 아데노-관련 바이러스 (AAV); SV40-유형 바이러스; 헤르페스 바이러스 예컨대 HSV-1 및 박시니아 바이러스. 명명되지 않았지만 당업계에 공지된 다른 벡터를 용이하게 이용할 수 있다. 임상적 적용에 대해 입증되고 안티센스 서열을 전달하는데 사용될 수 있는 벡터 중에서, 렌티바이러스, 레트로바이러스 및 AAV 는 더 큰 잠재력을 나타낸다.

복제-결핍성인 (즉, 원하는 AS 의 합성을 지시할 수 있지만, 감염성 입자를 생성할 수 없는) 레트로바이러스-기반 및 렌티바이러스-기반 벡터는 인간 유전자 요법 시험에 대해 승인되었다. 이들은 표적 세포 게놈으로 통합되는 특성을 가지며, 따라서 표적 세포 및 그들의 자손에서 지속적인 이식유전자 발현을 허용한다.

특정 실시형태에서, AS 은 AAV 벡터를 사용하여 전달된다. 인간 파르보바이러스 아데노-관련 바이러스 (AAV) 는 감염된 세포의 게놈 내로 통합되어 잠복 감염을 확립할 수 있는 복제에 관해 자연적으로 결함이 있는 데펜도바이러스이다. 마지막 특성은 포유동물 바이러스 중에서 독특해 보이며, 그 이유는 염색체 19 (19q13.3-qter) 상에 위치하는, AAVS1 로 호칭되는, 인간 게놈에서의 특정 자리에서 통합이 일어나기 때문이다. AAV-기반 재조합 벡터는 Rep 단백질을 결여하고 낮은 효율로 통합되고, 주로 표적 세포에서 수개월 및 어쩌면 수년 동안 지속될 수 있는 안정적인 원형 에피솜으로서 존재한다. 따라서 AAV 는 인간 유전자 요법의 잠재적 벡터로서 상당한 관심을 불러일으켰다. 이 바이러스의 유리한 특성 중 하나는 임의의 인간 질환과 그것의 연관성의 결여 및 감염될 수 있는 상이한 조직으로부터 유래된 광범위한 세포주이다. 실제로 12 개의 AAV 혈청형 (AAV1 내지 12) 및 최대 수백 개의 변이체가 기재되었으며, 이들 중 다수는 특정 조직에 대한 증가하는 표적화를 보였다 (Hester et al., 2009). 또한, AAV-PHP.eB 및 AAV-F 와 같은 효능이 개선된 신규한 캡시드를 디자인하고 특성분석하기 위한 AAV 벡터 분야에서의 협력이 있어 왔다. 상이한 혈청형은 조직 향성, 분포, 뿐만 아니라 순환 항체에 대한 감수성에 관여하는 캡시드의 단백질 아미노산 구조에 의해 정의된다 (Deverman et al., 2018). 따라서, 본 발명은 위에 기재된 AS 을 코딩하는 AAV 벡터로서, 인간 C9orf72 전사물을 표적으로 하고 상기 인간 C9orf72 전사물에서의 병리학적 리피트 익스팬션을 표적으로 하는데 적합한 AAV 벡터에 관한 것이다. 특정 실시형태에 따르면, AAV 게놈은 AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 (예를 들어 시노몰구스 AAV10 또는 레서스 원숭이 AAVrh10), 11 또는 12 혈청형으로부터 유래된다. 바람직한 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 (예를 들어 시노몰구스 AAV10 또는 AAVrh10), 11, 12, 혈청형 또는 AAV 변이체로부터 유래된다. 추가의 특정 실시형태에서, AAV 벡터는 슈도타입 (pseudotyped) 벡터이며, 즉 그것의 게놈 및 캡시드는 상이한 혈청형의 AAV 로부터 유래된다. 예를 들어, 슈도타입 AAV 벡터는 그것의 게놈은 AAV2 혈청형으로부터 유래되고, 그것의 캡시드는 AAV1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 (예를 들어 시노몰구스 AAV10 또는 AAVrh10), 11, 12 혈청형으로부터 또는 AAV 변이체로부터 유래되는 벡터일 수 있다. 또한, AAV 벡터의 게놈은 단일 가닥 또는 자기-상보적 이중 가닥 게놈일 수 있다 (McCarty et al., 2001). 자기-상보적 이중 가닥 AAV 벡터는 AAV 말단 리피트 중 하나로부터 말단 분해 자리 (trs) 를 결실시킴으로써 생성된다. 복제하는 게놈이 야생형 AAV 게놈 길이의 절반인 이들 변형된 벡터는 DNA 이합체를 패키징하는 경향을 갖는다.

바람직하게는, 본 발명의 실시에서 구현되는 AAV 벡터는 CNS 뉴런 (운동 뉴런 및 뇌, 뇌간 및 척수에서의 신경교세포를 포함한다) 및 근육 세포 (Ilieva et al., 2009) 를 표적으로 하는 벡터이다. 가장 많이 알려지고 연구된 AAV 는 유전자 전달을 위한 재조합 벡터로 최초로 변형된 혈청형 2 이고, 실제로 이들 천연 혈청형의 캡시드는 특성이 향상된 신규한 AAV 캡시드를 생성하도록 조작될 수 있다. 다른 혈청형 예컨대 rAAV1, AAV5, AAV9 및 AAVrh.10 은 높은 형질도입 효율을 나타내고, AAV2 보다 CNS 에서 더 광범위하게 퍼진다 (Deverman et al., 2018; Tanguy et al., 2015). 이들 혈청형은, rAAV6, 7, 8 와 함께, 또한 효율적 근육 형질도입을 보였다 (Wang et al., 2014; Zincarelli et al., 2008). 흥미롭게도, 2017 년에, Ai J 등은 복강내 투여 후 rAAVrh.10 의 우수한 근육 형질도입을 보였다 (Ai et al., 2017). 최근에, 신규한 재조작된 AAV 캡시드, AAV-AS, AAV-PHP.B, AAV-PHP.eB 및 AAV-F 는 정맥내 투여에 의한 고효율 CNS 형질도입을 갖는 것으로 나타났다 (Chan et al., 2017; Choudhury et al., 2016; Deverman et al., 2016; Hanlon et al., 2019). 바람직한 실시형태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh39, AAVrh43, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9 또는 AAV10 캡시드를 가지며, 이 벡터는 선택적으로 슈도타입이다. 특정 실시형태에서, AAV 벡터는 AAV9 또는 AAV10 (예를 들어 시노몰구스 AAV10 또는 AAVrh10) 캡시드를 갖고, 선택적으로 슈도타입이다. 특정 실시형태에서, AAV 벡터는 Nonnenmacher et al., 2020 에 기재된 바와 같은 캡시드, 예컨대 Nonnenmacher et al., 2020 에 기재된 바와 같은 캡시드 변이체 9P03, 9P08, 9P09, 9P13, 9P16, 9P31, 9P32, 9P33, 9P36 또는 9P39 를 갖는다.

특정 실시형태에서, AS 은 작은 핵 RNA 분자 예컨대 U1, U2, U6, U7 또는 임의의 다른 작은 핵 RNA, 또는 키메라 작은 핵 RNA 와 조합하여 벡터에 의해 코딩된다 (Cazzella et al., 2012; De Angelis et al., 2002, Donadon et al., 2019; Imbert et al., 2017). U7 수식에 대한 정보는 특히 Goyenvalle, et al. (Goyenvalle et al., 2004); WO11113889; 및 WO06021724 에서 찾을 수 있다. 특정 실시형태에서, D. Schumperli 에 의해 기재된 U7 카세트가 사용된다 (Schumperli and Pillai, 2004). 그것은 천연 U7-프로모터 (위치 -267 에서 +1), U7smOpt snRNA 및 위치 116 까지의 다운스트림 서열을 포함한다. U7smOpt 에서 히스톤 pre-mRNA 에 상보적인 18 nt 천연 서열이, 예를 들어, 이미 기재된 바와 같은 (Goyenvalle et al., 2004) PCR-매개 돌연변이유발을 사용하여 선택된 AS 서열의 1 개 또는 2 개 (2 회 사용된 동일한 서열, 또는 2 개의 상이한 서열) 또는 그 이상의 리피트로 대체된다.

특정 실시형태에서, 작은 핵 RNA-수식된 AS, 특히 U7-수식된 AS 은 바이러스 벡터에서, 더욱 특히 AAV 벡터에서 벡터화된다.

전형적으로, 벡터는 또한, 예를 들어, 프로모터, 인핸서 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 단백질 형질도입 도메인 (PTD) 을 코딩하는 서열 등과 같은 코딩된 AS 의 발현을 허용하는 조절 서열을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 벡터는 가장 바람직하게는 AS 의 발현을 유발 또는 개선하기 위한, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된, 프로모터 영역을 포함한다. 이러한 프로모터는 AS 의 효율적이고 적합한 생산을 허용하기 위해 유비쿼터스, 조직-특이성, 강, 약, 조절성, 키메라 등일 수 있다. 프로모터는 세포, 바이러스, 진균, 식물 또는 합성 프로모터일 수 있다. 본 발명에 사용하기에 가장 바람직한 프로모터는 신경 및 근육 세포, 더욱 바람직하게는 운동 뉴런 및 신경교 세포에서 기능성일 것이다. 프로모터는 작은 핵 RNA 프로모터 예컨대 U1, U2, U6, U7 또는 다른 작은 핵 RNA 프로모터, 또는 키메라 작은 핵 RNA 프로모터로부터 선택될 수 있다. 다른 대표적인 프로모터는 RNA 폴리머라제 III-의존성 프로모터, 예컨대 H1 프로모터, 또는 RNA 폴리머라제 II-의존성 프로모터를 포함한다. 조절성 프로모터의 예는 Tet 온/오프 엘리먼트-함유 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 운동 뉴런에 특이적인 프로모터의 예는 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP), 콜린 아세틸 트랜스퍼라제 (ChAT), 또는 호메오박스 9 (HB9) 의 프로모터를 포함한다. 운동 뉴런에서 기능성인 다른 프로모터는 뉴런 특이적 에놀라제 (NSE), 시냅신의 프로모터, 또는 뉴런-특이적 사일런서 엘리먼트 (NRSE) 를 포함하는 유비쿼터스 프로모터를 포함한다. 신경교 세포에 특이적인 프로모터, 예컨대 신경교 원섬유 산성 단백질 (GFAP) 의 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 유비쿼터스 프로모터의 예는 바이러스 프로모터, 특히 CMV 프로모터, RSV 프로모터, SV40 프로모터, 하이브리드 CBA (닭 베타 액틴/ CMV) 프로모터 등 및 세포성 프로모터 예컨대 PGK (포스포글리세레이트 키나아제) 또는 EF1alpha (신장 인자 1알파) 프로모터를 포함한다.

조성물

본 발명은 또한 약제학적으로 허용가능한 담체에 AS 을 포함하는 조성물, 동일한 것을 포함하는 핵산 구축물 또는 벡터에 관한 것이다. AS, 핵산 구축물 또는 벡터 외에, 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체 예컨대 식염수, 인산나트륨 등을 포함할 수 있다. 조성물은 일반적으로 액체 형태일 것이지만, 이것이 항상 그럴 필요는 없다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 인산칼슘, 알기네이트, 트라가칸트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 및 프로필히드록시벤조에이트, 미네랄 오일 등을 포함한다. 제제는 또한 윤활제, 습윤제, 유화제, 보존제, 완충제 등을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명은 AS 의 투여를 수반하고, 따라서 유전자 요법과 다소 유사하다. 당업자는 핵산이 종종 지질 (예를 들어 양이온성 지질 또는 중성 지질, 또는 이들의 혼합물) 과 함께, 종종 리포솜 또는 다른 적합한 마이크로- 또는 나노-구조화된 물질 (예를 들어, 미셀, 리포복합체, 덴드리머, 에멀젼, 큐빅 상 등) 의 형태로 전달된다는 것을 이해할 것이다.

본 발명의 조성물은 일반적으로 경장 또는 비경구 경로, 예를 들어 정맥내 (i.v.), 동맥내, 피하, 근육내 (i.m.), 뇌내, 뇌실내 (i.c.v.), 경막내 (i.t.), 복강내 (i.p.), 연막하, 설내, 흉강내, 흉막내, 및 이들 및 다른 전달 경로의 조합을 통해 투여된다. 예를 들어, 흡입, 비강내, 국소, 경구 (per os), 직장, 골내, 점안액, 이어 드롭 투여 등을 통하는, 다른 유형의 투여가 배제되지 않는다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 WO2013/190059 에 기재된 바와 같이 뇌척수액 (CSF) 및/또는 환자의 혈액 내의 투여를 조합하여 투여된다. 이 실시형태의 특정 변형에서, 포유동물의 CSF 내로의 바이러스 벡터의 투여는 뇌실내 (i.c.v. 또는 ICV) 주입, 경막내 (i.t. 또는 IT) 주입, 또는 수조내 주입에 의해 수행되고, 혈액 내로의 투여는 바람직하게는 비경구 전달, 예컨대 i.v. (또는 IV) 주입, i.m. 주입, 동맥내 주입, i.p. 주입, 피하 주입, 피내 주입, 비내 전달, 경피 전달 (예를 들어 패치) 에 의해, 또는 장내 전달 (경구 또는 직장) 에 의해 수행된다. 특정 실시형태에서, AAV 벡터는 i.c.v. (또는 i.t.) 및 i.v. (또는 i.m.) 경로 둘 모두를 통해 투여된다. 특정 실시형태에서, 바이러스 벡터의 투여는 뇌실내 (i.c.v. 또는 ICV) 주입에 의해 수행된다.

주사용 제제, 예를 들어, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 적절한 분배 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 비독성 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 전달은 국소적 (즉, 인 시추, 근육 조직과 같은 조직 내로 직접) 또는 전신적일 수 있지만, 통상적으로 전달은 영향을 받은 근육 조직, 예를 들어 골격근, 평활근, 심근 등에 국소적일 것이다. 투여되는 AS 의 형태 및 표적화되는 조직 또는 세포 유형에 따라, 전기천공법, 소노포레이션 (sonoporation), "유전자 총" (핵산-코팅된 금 입자를 전달) 등과 같은 기술이 이용될 수 있다.

당업자는 투여될 AS, AS 를 함유하거나 발현하는 핵산 구축물 또는 벡터의 양이 원치 않는 질환 증상, 특히 ALS 증상의 개선을 유도하기에 충분한 양일 것임을 인식할 것이다. 이러한 양은 그 중에서도 성별, 연령, 체중, 환자의 전반적인 신체 상태 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있으며, 케이스 바이 케이스로 결정될 수 있다. 양은 또한 치료 프로토콜의 다른 구성 요소 (예를 들어, 다른 약제의 투여 등) 에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 적합한 도스는 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 보다 일반적으로는 약 2 ㎎/㎏/일 내지 약 10 ㎎/㎏ 의 범위이다. AS 의 바이러스-기반 전달이 선택되는 경우, 적합한 도스는 이용되는 바이러스, 전달 경로 (근육내, 정맥내, 동맥내 등) 와 같은 상이한 인자에 따라 좌우될 것이지만, 전형적으로 10e9 내지 10e15 바이러스 입자/㎏ 의 범위일 수 있다. 당업자는 이러한 파라미터가 일반적으로 임상 시험 동안 수행된다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 질환 증상이 본원에 기재된 치료에 의해 완전히 완화될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 심지어 부분적 또는 간헐적인 증상 완화가 수령자에게 큰 도움이 될 수 있다. 또한, 환자의 치료는 단일 사건 (수식된 AS 또는 AAV 벡터로) 일 수 있거나, 또는 환자는 AS 를 여러 차례 투여받는데, 이는 수득된 결과에 따라 수일 간격, 수주 간격, 또는 수개월 간격, 또는 심지어 수년 간격일 수 있다.

본 발명의 방법은 여러 가지 상이한 방식 중 임의의의 방식으로 구현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 AS 은 외인성 야생형 C9orf72 단백질, 바람직하게는 인간 C9orf72 단백질을 코딩하는 벡터와 함께 투여될 수 있다. AS 은 또한 신경보호를 유도하는 신경영양 인자, 예컨대 신경교 세포주 유래 신경영양 인자 (GDNF), 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 뉴레귤린 (Neuregulin) 1 또는 뉴튜린 (Neuturin) 을 코딩하는 벡터와 함께 투여될 수 있다. 상이한 연구는 이들 신경영양 인자의 AAV 매개 발현이 SOD1 마우스 모델에서 질환 발병을 지연시키고 생존을 연장시켰다는 것을 보여줬다 (Azzouz et al., 2004; Dodge et al., 2008, 2010; Kaspar et al., 2003; Lepore et al., 2007; Gross et al., 2020; Lasiene et al., 2016). 더욱이, C9orf72 HRE RNA 를 감소시키기 위한 상보적 접근법으로서, 유용한 치료 전략은 다운스트림 메카니즘을 표적화하는 것일 수 있다. AS 은 또한 C9orf72 환자에 존재하는 TAR DNA-결합 단백질-43 (TDP-43) 을 표적으로 하는 항체 및/또는 GA 또는 GP RAN 단백질과 같은 디펩티드 리피트 단백질을 표적으로 하는 항체와 조합하여 투여될 수 있다.

AS 은 또한 C9orf72 리피트 RNA 의 2 차 구조를 표적화하거나 병리학적 C9orf72 리피트 전사물의 핵 외수송을 억제하는 소분자와 조합하여 투여될 수 있다. 상이한 그룹들은 DPR 의 번역을 차단하는 및/또는 아마도 격리된 RNA 결합 단백질의 방출을 통해 병리학적 결함의 구조를 유도하는 C9orf72 의 G-사중체 구조를 표적으로 하는 소분자를 개발하려고 시도했다 (Alniss et al., 2018; Simone et al., 2018; Su et al., 2014; Yang et al., 2015; Zamiri et al., 2014). 2017 년에, Hautbergue 등은 드로소필라 (Drosophila), 환자-유래 뉴런 및 뉴런 세포 모델에서 어떻게 세린/아르기닌-풍부 스플라이싱 인자 1 (SRSF1) 과 같은 핵 외수송 어댑터의 고갈이 병리학적 C9orf72 전사물의 핵 외수송, 디펩티드-리피트 단백질의 생산을 억제하고 신경독성을 완화시키는지를 입증했다 (Hautbergue et al., 2017).

치료 효율을 개선하고 C9orf72-ALS 의 상이한 특징을 표적화하기 위해서 본 발명의 AS 은 이들 접근법 중 임의의 것, 특히 외인성 C9 단백질, DPR 또는 TDP43 에 대한 항체, G-사중체 C9 구조에 대한 소분자, 핵 외수송의 억제와 조합될 수 있다.

추가의 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 부분들의 키트 (kit-of-parts) 에 관한 것이다:

- 위에 기재된 바와 같은, 본 발명의 AS, 핵산 구축물 또는 상기 AS 또는 상기 핵산 구축물을 코딩하는 벡터; 및

- 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한, 야생형 C9orf72 단백질 (예컨대 야생형 인간 C9orf72 단백질) 을 코딩하는 벡터.

용도

본 발명은 또한 C9orf72-관련 질환, 특히 C9orf72 HRE-관련 질환의 치료에서 사용하기 위한 위에 기재된 바와 같은 안티센스 서열, 핵산 구축물 또는 벡터에 관한 것이다.

C9orf72 관련 질환은 신경변성 질환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 신경변성 질환은 근위축성 측삭경화증 (ALS) 또는 전두측두엽치매 (FTD) 일 수 있다. 특정 실시형태에서, 질환은 근위축성 측삭경화증 (ALS) 이다. 또다른 특정 실시형태에서, 치료될 대상은 ALS 및 FTD 를 갖는다. 특정 실시형태에서, 신경변성 질환은 가족성 또는 산발성일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "요법" 은 치유적 및/또는 예방적 치료를 포함한다. 보다 구체적으로, 치유적 치료는 증상의 완화, 개선 및/또는 제거, 감소 및/또는 안정화 (예를 들어, 더 진행된 단계로 진행하는데 실패), 뿐만 아니라 특정 장애의 증상의 진행의 지연 중 임의의 것을 지칭한다. 예방적 치료는 발병 중지, 발병 지연, 발달 감소, 발달 위험 감소, 발생 감소, 중증도 감소, 뿐만 아니라 증상의 발병 시간 증가 및 주어진 장애에 대한 생존 증가 중 임의의 것을 지칭한다.

따라서 이를 필요로 하는 대상체에서 C9orf72 관련 질환, 예컨대 ALS 또는 FTD 를 치료하는 방법이 기재되며, 상기 방법은 상기 환자에게 본 발명의 핵산 분자, 핵산 구축물 또는 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 맥락 내에서, "대상" 또는 "환자" 는 C9orf72 관련 질환, 예컨대 ALS 또는 FTD 을 앓고 있는, 그의 연령 또는 성별이 무엇이든, 포유동물, 특히 인간을 의미한다. 상기 용어는 구체적으로 비-인간 영장류, 고양이, 개, 말, 돼지, 소, 염소, 양, 토끼, 랫트 및 마우스와 같은 가축 및 일반적인 실험실 포유동물을 포함한다. 바람직하게는 치료할 환자는 인간이다.

본 발명의 추가적인 양태 및 이점은 본 출원의 범위를 한정하지 않고 예시적인 것으로만 간주되어야 하는 다음의 실험 섹션에 개시될 것이다.

실시예

물질 및 방법

U7-AS 을 발현하는 AAV 및 렌티바이러스 플라스미드의 생산

AS 서열은 이미 기재된 바와 같이 (Goyenvalle et al, 2004) AS-SOD1 을 AS-C9 로 대체함으로써 PCR-매개 돌연변이유발을 이용하여 (Biferi et al., 2017) 에 기재된 자기-상보적 pAAV-U7-SOD1 플라스미드 내로 클로닝했다. 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위해, U7-AS 삽입물을 EcoRV 에 대한 절단 부위를 보유하는 U7-AS-C9 의 5' 및 3' 서열에 특이적인 프라이머 (정방향: 5'-GGGGATATCTAACAACATAGGAGCTGTGA-3', 역방향: 5'-GGGGATATCCACATACGCGTTTCCTAGGA-3') 를 사용하여, U7-AS-C9 서열을 발현하는 pAAV 로부터 PCR 에 의해 증폭시켰다. U7-AS 구축물을 pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE (Addgene) 의 EcoRV 부위 내로 클로닝했다.

세포 배양 및 바이러스 감염

C9-ALS 환자 (ALS-1 및 ALS-2) 및 건강한 대조군 (CTRL-1 및 CTRL-2) 으로부터 유래된 일차 진피 섬유아세포는 D. Bohl (Brain and Spine Institute, ICM, Paris, France) 에 의해 제공되었다. CTRL-1 은 33 세 남성인 반면, CTRL-2 는 69 세 여성이었다; ALS-1 및 ALS-2 세포는 C9 유전자에서 60 개 이상의 HRE 를 발현하는 2 명의 남성으로부터 유래했다. 일차 섬유아세포를 Myoline facility (Dr. Bigot, Center of Research in Myology, Paris, France) 에 의해 확립된 프로토콜 (Chaouch et al., 2009) 을 사용하여 불멸화시켰다. 불멸화된 섬유아세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% 의 비필수 아미노산을 함유하는 피루베이트가 첨가된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) 에서 37 ℃ 에서 5% CO₂ 에서 배양했다. HEK-293T 세포를 10% FBS 가 보충된 피루베이트가 없는 DMEM 에서 성장시키고 렌티바이러스 생산에 사용했다. U7-AS-C9 를 운반하는 렌티바이러스의 생산을 위해, 100-mm 플레이트 당 5x10^6 세포를 플레이팅하고, 다음날 Lipofectamine 2000 시약을 사용하여 렌티바이러스 구축물 플라스미드 및 패키징 믹스 플라스미드 (pMD2.G, pMDLg/RRE and pRSVRev (Addgene)) 로 형질감염시켰다. 48h 및 72h 후에 바이러스 입자를 상청액으로부터 수집하고, 불멸화된 섬유아세포를 형질도입하는데 사용했다.

바이러스 형질도입

불멸화된 섬유아세포를 12mm 직경의 슬라이드/웰을 함유하는 24-웰 플레이트에 8x10^4 세포/웰로 플레이팅하고, RNA FISH 실험을 위해 콜라겐 타입 I 래트 테일 (A10483-01 - Life Technologies) 로 전처리하거나, 웨스턴 블롯 분석을 위해 10mm 디쉬에 2.4x10^6 세포의 밀도로 처리했다. 다음날 세포를 렌티바이러스 벡터 및 2㎍/㎖ 의 폴리브렌으로 형질감염시켰다. 37℃ 에서 5 시간 후, 완전 배지의 절반을 첨가하여 형질감염을 중지시켰다. 다음날, 세포를 0.1% FBS, 1% P/S 및 1% NEAA 를 함유하는 DMEM 에서 휴지시켰다. 다음날, 24-웰 플레이트 내의 세포를 RNA-FISH 분석을 위해 2% 포름알데히드로 고정시켰다. 10mm 디쉬로부터의 셀 펠렛을 4℃ 에서 5 분 동안 3000 rpm 으로 2 회 원심분리하여 얻었고, -80℃ 에서 저장했다. 바이러스 발현을 GFP 의 면역형광 분석에 의해 모니터링했다.

RNA-FISH

세포를 4℃ 에서 30분 동안 2% 포름알데하이드로 고정시키고, 실온에서 10 분 동안 1X-PBS 중 TRITON X-100 (Biorad) 0.4%, 2 mM 바나딜 (Vanadyl) 리보뉴클레오시드 복합체 용액 (Vanadyl, Sigma - 94742-10ML) 으로 투과화시켰다. 세포를 실온에서 5 분 동안 1X-PBS 에서 2 회 세척하고, 실온에서 10 분 동안 2X 염수-시트르산나트륨 완충제 (SSC - Invitrogen 15557-044) 로 2 회 세척했다. 그 후, 세포를 55℃ 에서 혼성화전 완충제 (40% 포름아미드 (Life Technologies - AM9342), 2X SSC, 0.2% 초순수 소 혈청 알부민 (BSA, Life Technologies - AM2618), 0.2 ㎎/㎕ 효모 tRNA (Life Technologies - 15401029), H₂O DEPC 중 2mM 바나딜) 와 함께 30 분 동안 인큐베이션했다. 한편, 센스 및 안티센스 RNA 헥사뉴클레오티드 리피트에 대한 2 개의 LNA 프로브 (TYE-563-LNA (CCCCGG)3CC 및 (GGGGCC)3GG 프로브 - Qiagen) 를 변성시키고 (100℃ 에서 10 분) 그 후 혼성화전 완충제에 최종 농도 40nM 로 첨가했다. 혼성화를 55℃ 에서 2 시간 30 분 동안 또는 밤새 수행하고, 그 후 55℃ 에서 혼성화후 완충제 (40% 포름아미드, H₂O DEPC 중 0.5X SSC) 로 30 분 길이 세척을 2 회 수행하고, 실온에서 10 분 동안 0.5X SSC 로 2 회 세척하고, 실온에서 5 분 동안 1X-PBS 로 2 회 세척했다. 핵을 DAPI (Sigma-Aldrich) 로 시각화했다. 샘플을 스피닝 디스크 공초점 현미경 Nikon Ti2 로 조사했다. 세포 스코어링 (scoring) 을 공개 도메인 소프트웨어 ImageJ 를 사용하여 수행했다.

전세포 추출물 및 웨스턴 블롯 분석

세포 펠릿을 1mM PMSF 및 프로테아제 억제제 칵테일 (Complete Mini, Roche Diagnostics) 이 보충된 NP40 용해 완충액 (FNN0021, Invitrogen, ThermoFicher Scientific) 에서 용해시켰다. 20㎍ 을 12% 폴리아크릴아미드 겔 (Criterion XT 10% bis-Tris, Biorad) 상에서 분리했다. 웨스턴 블롯을 하기 항체를 사용하여 수행했다: Dr. Charlet-Berguerand (Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology, IGBMC, Strasbourg, France) 에 의해 생성되고 친절하게 제공된 마우스 모노클로날 항체 (클론 2E1) 항-C9orf72 및 항-빈쿨린 (V9131 Sigma Aldrich). 빈쿨린을 검출하기 위한 홀스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 양 항-마우스를 Amersham Pharmacia Biotech 로부터 구입했고, 항-C9orf72 에 대한 이차로서 특이적인 퍼옥시다제 AffiniPure 염소 항-마우스 IgG 경쇄 (115-035-174, Jackson ImmunoResearch) 를 구입했다. SuperSignal West Dura kit (Thermoscientific) 를 이용하여 웨스턴 블롯을 개발했다. 밴드의 이미지화 및 정량은 ImageLab 4.0 소프트웨어를 사용하여 ChemiDoc 웨스턴 블롯 이미지화 시스템에 의해 수행했다.

C9orf72 마우스에서 AAV 생산 및 주입

U7-AS 를 발현하는 자기-상보적 AAVrh10 벡터를 Biferi et al. 2017 에 기재된 프로토콜에 따라 HEK-293T 세포에서 일시적 형질감염을 통해 생산했다. 각각의 생산을 실시간 qPCR 에 의해 정량화했고, 벡터 역가를 바이러스 게놈 (vg) /㎖ 로 표현했다. 인간 C9 BAC 를 500 개 반복으로 보유하는 C9orf72 마우스를 Jackson Laboratory (JAX stock #029099) 로부터 구입했다. 동물을 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 유럽 규정에 따라 유지했다. 실험 프로토콜은 Charles Darwin N.5 Ethics Committee on Animal Experiments 에 의해 승인되었다. 마우스를 EOPS 건강 상태 (특정 병원균이 없음) 를 갖는 A1 시설에서, 물이 자동 배급되고 먹이가 지속적으로 입수가능한 닫힌 환기되는 케이지에 수용했다. 운반자 수컷과 비운반자 암컷을 교배하여 반접합성 자손 (C9orf72 운반자) 을 수득했다.

AAV 주입

이미 기재한 바와 같이 (Biferi et al., 2017 and Besse et al., 2020) 오직 C9orf72-담체 암컷 (병리학적 표현형을 갖는 것으로 보고됨, Liu et al, 2016) 에게 출생시에 AAVrh10 벡터를 뇌실내 (ICV) 주입했다. 4 마리의 마우스에게 대조군 AAV (AAV-U7-CTRL) 를 주입하고, 6 마리에게 2.2e14 VG/Kg 의 도스로 치료적 구축물 (AAV-U7-AS-6 또는 AAV-U7-AS-9) 을 주입했다. 처리 3 개월 후 마우스를 희생시키고, 그 후 C9 전사물 수준에 대해 분석했다.

마우스 조직으로부터의 RNA 추출

C9orf72 mRNA 발현 수준을 분석하기 위해, 생후 3개월의 마우스로부터의 경부 척수를 액체 질소 중에서 스냅 냉동시켰다. 샘플을 -80℃ 에서 저장한 후, FastPrep 장치에서 속도 5 에서 30 초 동안 Trizol 시약 (Ambion by Life Technologies) 을 사용하여 특수 비드 (Lysing Matrix D tubes RNase/FNase free, mpbio, USA) 를 함유하는 즉시 사용 가능한 2 ㎖ 튜브에서 개별적으로 용해시켰다. 그 후, 용해물을 실온 (RT) 에서 5 분 동안 인큐베이션하고, 용해 과정을 계속하기 위해 빈번하게 볼텍싱했다. 튜브 당 200 ㎕ 의 클로로포름을 첨가한 후, 샘플을 15 초 동안 볼텍싱하고, 실온에서 1 분 동안 인큐베이션했다. 그 후, 용해물을 4℃ 에서 15,000 g 에서 10 분 동안 원심분리했다. RNA 를 함유하는 상청액 분획을 새로운 튜브에 수집하고, RNA 를 제조사의 프로토콜에 따라 RNeasy Mini Kit (Qiagen) 를 사용하여 정제했다. RNA 를 물에 용출시키고, 나노드롭 (Nanodrop) 을 이용하여 정량했다.

역전사 및 정량적 PCR

고용량 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems by ThermoFisher Scientific) 를 제조사의 지시에 따라 사용하여 1000 ng 의 RNA 로부터 cDNA 를 합성했다. cDNA 를 RNase 비함유 물로 희석했다. cDNA (50 ng) 를 10 ㎕ 의 Taqman Universal PCR Master Mix II - 2X (Applied Biosystem), 각각의 C9 전사물 변이체 (V1, V2 및 V3) 에 특이적인 프로브 및 프라이머와 혼합했다. V1 및 V3 에 대한 프라이머 및 6-카르복시플루오레세인 (FAM) 프로브를 Applied Biosystem (각각, NM_145005.5 - Hs00331877 및 NM_001256054.1 - Hs00948764) 에서 구입했으며, V2 에 대해서는 맞춤 제작했다 (정방향: 5'-CGGTGGCGAGTGGATATCTC-3', 역방향: 5'-TGGGCAAAGAGTCGACATCA-3', FAM 프로브: 5'-TAATGTGACAGTTGGAATGC-3'). 마우스 하이포크산틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT) (Taqman 유전자 발현 어세이 Mm00446968_m1, Life Technologies) 유전자에 대한 2'-클로로-7'페닐-1,4-디클로로-6-카르복시-플루오레세인 (VIC) 프로브를 내인성 대조군으로 사용했다. 각각의 샘플을 96-웰 플레이트에 세 차례 (in triplicate) 로딩했다. 열 사이클링 조건은 StepOne Plus Real Time PCR System (Applied Biosystems) 에서 55℃ 에서 2 분, 95℃ 에서 3 분, 그 후 95℃ 에서 30 초 및 60℃ 에서 30 초의 40 사이클이었다. 각 전사물 변이체의 상대적인 양은 대조군 샘플의 신호에 상대적인 각 샘플의 표적 유전자 전사물의 PCR 신호 (내인성 대조군에 대해 정규화됨) 를 고려하여 ΔCt/ΔCt 방법을 사용하여 계산했다. qPCR 분석은 StepOne 소프트웨어 v2.3 (Life Technologies) 을 사용하여 수행했다.

결과

U7-AS 바이러스 벡터의 디자인 및 생산

질환과 관련된 병리학적 메카니즘 (단백질 손실, RNA 포커스 및/또는 DPR 의 축적) 을 다루기 위해, 본 발명자들은 하기 표에 기재된 바와 같이 8 개의 40-뉴클레오티드 (nt) 길이의 AS 서열을 디자인했다 :

본 발명자들은 각각 안티센스 C9 프리-트랜스크립트의 엑손 1a (AS1) 및 인트론 1 (AS2) 에서 추정 스플라이싱 사일런서 영역을 표적화하기 위해 2 개의 AS 서열을 디자인했다. 본 발명자들은 인트론 1 에서 HRE 의 업스트림에 또다른 서열 (잠재적 스플라이싱 사일런서 영역을 포함함) 을 위치시키고 안티센스 (AS 3) 또는 센스 프리-트랜스크립트 (AS4) 에 대해 지향시켰다. 본 발명자들은 또한 (유전자를 함유하는 다른 G4C2 의 표적화를 피하기 위해) HRE 의 5' 영역을 커버하고 HRE 의 일부 내에 AS 서열을 제조했다. 이 AS 은 안티센스 (AS 5) 또는 센스 프리-트랜스크립트 (AS6) 에 대해 지향되었다. 또다른 AS 은 도 1 에 도식적으로 나타낸 바와 같이, HRE 의 3' 영역에 배치되었다 (각각 안티센스 및 센스에 대한 AS7 및 AS8). 안티센스 (AS3) 및 센스 전사물 (AS6) 을 표적으로 하는 2개의 AS 서열을 조합하는 하나의 이중 구축물 (AS 9 로 호칭됨, 표 2 에 제시된 서열 SEQ ID NO: 17) 을 또한 디자인했다. 더욱이, 단일 AS 대조군 서열 및 이미 기술한 대조군 서열을 갖는 이중 서열을 디자인했다 (Biferi, M. G. et al. 2017).

AS 서열은 U7 작은 핵 RNA (SEQ ID NO: 9-17) 와 융합되어 생체내 전달을 위해 이들을 보호할 뿐만 아니라, 가공 전에 이들을 pre-mRNA 수준으로 되게 했다. 이들 U7-AS 은 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자를 발현하고 AAV 플라스미드 (pAAV) 의 ITR 사이에 pRRL 3세대 렌티바이러스 백본으로의 클로닝을 위한 제한 효소 부위를 보유하는 특이적 프라이머를 사용하여 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 생성되었다 (도 2). 렌티바이러스 및 AAV 입자를 각각 Dull et al., 1998 및 Biferi et al., 2017 에 기재된 바와 같이 생성했다.

환자-유래 섬유아세포에서 RNA 포커스의 분석

C9 돌연변이를 갖는 두 명의 환자 (ALS-1 및 ALS-2) 및 두 명의 건강한 대조군 (CTRL-1 및 CTRL-2) 으로부터의 불멸화된 일차 섬유아세포를 사용하여 시험관내 구축을 시험했다. C9-ALS 시험관내 모델을 특성분석하기 위해, 질환의 주요 특성을 검출하기 위해 상이한 분석을 수행했다. 먼저, 불멸화된 일차 섬유아세포에서 포커스의 존재를 분석했다. RNA 형광 인 시추 혼성화 (FISH) 분석을 수행했다. 20% 의 센스 RNA 포커스가 있는 세포와 25% 의 안티센스 RNA 포커스가 있는 세포가 환자 1 (ALS1, n≥3) 의 섬유아세포에서 검출되었고, 30% 의 센스 RNA 포커스가 있는 세포와 35% 의 안티센스 RNA 포커스가 있는 세포가 환자 2 (ALS2, n≥3) 의 섬유아세포에서 검출되었다 (도 3). 대조적으로, 대조군 섬유아세포 (CTRL-1 및 CTRL-2) 둘 다에서 센스 또는 안티센스 포커스가 검출되지 않았다 (도 3). 이들 세포의 특성분석을 완료하기 위해, C9 단백질의 발현을 모노클로날 항체 (클론 2E1) 를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 불멸화된 섬유아세포에서 평가했다.. C9-ALS1 또는 C9-ALS2 섬유아세포에서, 두 명의 건강한 대조군으로부터의 세포에 비해 C9 단백질의 더 낮은 발현이 관찰되었다 (도 5A).

환자-유래 섬유아세포에서 센스 및 안티센스 RNA 포커스에 대한 치료 효과

U7-AS 서열의 시험관내 치료 효과를 시험하기 위해, ALS-2 섬유아세포를 상이한 U7-AS 를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입했다. 각각의 렌티바이러스 벡터의 형질도입 효능은 GFP 양성 세포를 계수함으로써 평가했다. 형질도입된 세포의 백분율은 각각의 실험에서 약 80% 였다. 그 후, RNA-FISH 를 수행하여 센스 및 안티센스 포커스의 축적을 변경하는 이들 AS 의 효과를 검출했다. 하나 이상의 RNA 포커스를 갖는 세포의 수를 계수하고, 전체 세포수와 비교했다. 이 분석은 평균 300개 세포/사진을 세어 각 조건에 대해 적어도 세차례 수행했다. 렌티-AS-C9 또는 렌티-AS-CTRL 로 처리 후 포커스를 보이는 세포의 백분율을 비교함으로써 포커스 형성에 대항하는 AS 서열의 능력을 확인했다.

벡터에 포함된 AS 에 따라, 대조군과 비교하여 치료 벡터로 형질도입된 환자-유래 세포에서 각각 최대 66% 또는 55% 의 센스 또는 안티센스 포커스 수의 감소가 관찰되었다 (도 4). 결과는 특히 렌티-AS-3 으로 인해 ALS-2 세포에서 센스 포커스의 유의한 감소를 보였다 (최대 66%). 또한 안티센스 RNA 포커스를 분석하였는데, 이는 렌티-AS-1, 렌티-AS-2, 렌티-AS-4 및 렌티-AS-6 이 대조군 처리된 세포와 비교하여 각각 44%, 50%, 42% 및 55% 만큼 안티센스 RNA 포커스 감소를 유의하게 매개할 수 있었음을 보여준다 (도 4). 렌티-AS-7 및 렌티-AS-8 은 RNA 포커스를 감소시키는데 비효과적이었으며, 이는 리피트의 업스트림에 있는 서열을 표적화하는 것이 더 유망하다는 것을 시사한다.

환자-유래 섬유아세포에서 C9orf72 단백질 수준에 대한 치료 효과

상이한 AS 을 보유하는 렌티바이러스로 형질도입된 ALS-2 섬유아세포를 추가로 분석하여 C9 단백질의 발현에 대한 AS 처리의 효과를 평가했다. 도 5B 및 5C 에 나타난 바와 같이, AS 을 이용한 처리는 C9orf72 단백질 수준에서 유의한 변화를 유도하지 않았다.

C9 마우스 모델에서 C9orf72 전사물 변이체에 대한 치료 효과

생체내 치료 효과를 시험하기 위해, C9 암컷 마우스에게 출생시에 ICV 주입을 통해 대조군 벡터 (AAV-U7-CTRL) 또는 2 개의 치료 구축물을 주입했다. 마우스를 생후 3 개월에 희생시켰다. 경부 척수에서의 C9 이소폼의 발현 수준에 대한 유전자 치료 접근법의 효과를 RT-qPCR 에 의해 분석했다. 담체 C9 마우스에서 AAV-U7-AS-6 또는 AAV-U7-AS-9 로 처리한 후 대조군으로 처리한 비-주입 (NI) 또는 tp 마우스와 비교하여, 리피트를 운반하는 전사물 변이체 V1 및 V3 의 유의한 감소가 관찰되었다. 중요하게는, V2 mRNA 발현 수준에 대한 본 발명의 AAV-U7-AS 구축물의 유의한 영향은 관찰되지 않았다 (도 6C). 이 결과는 유전자 치료 접근법이 비-병리학적 V2 mRNA 의 전사를 보존할 수 있음을 시사하며, 이는 섬유아세포에서 관찰되는 단백질 수준에 대한 효과를 확인시켜준다.

결론

이 연구의 전체적인 목표는 C9orf72 유전자에서 HRE 에 의해 야기되는, ALS 의 가장 흔한 유전자 형태에 대한 효율적인 유전자 치료 접근법을 개발하는 것이었다. AS 서열은 RNA 포커스의 형성, DPR 에서의 번역을 감소시키고/시키거나 C9 전사 수준을 보존하기 위해 C9-전사물 상의 특정 영역을 표적화하도록 디자인되었다. 이 접근법은 성숙 mRNA 의 파괴를 유도하고 C9-ALS 에서 관찰되는 일배체 부족을 잠재적으로 악화시킬 수 있는 RNAi 의 사용에 비해 이점을 나타낸다.

AS 서열을 발현하는 렌티바이러스 벡터의 치료 효과를 불멸화된 섬유아세포에서 시험했다. AS-1, AS-2, AS-3, AS-4, AS-5 및 AS-6 서열은 센스 RNA 포커스의 수준을 감소시킬 수 있었고 (AS-3 의 경우 최대 66%), AS-1, AS-2, AS-4, 및 AS6 도 안티센스 포커스를 유의하게 감소시킬 수 있었다 (AS-6 의 경우 최대 55%). 이전에 발표된 어떠한 작업도 AS 를 사용하여 센스 및 안티센스 포커스 둘 모두의 감소를 나타내지 않았다. 이들 결과를 종합하면, 이러한 접근법이 환자-유래 세포에서 센스 및 안티센스 포커스를 감소시키는데 어떻게 효율적인지를 입증했다. AS 가 센스 및 안티센스 포커스 둘 다에 대항할 수 있다는 사실은 이러한 접근법이 생체내에서 향상된 치료 효과를 초래할 수 있음을 시사한다. 이는 V1 전사물 (각각 AS-6 및 AS-9 의 경우에 44% 및 55%) 및 V3 전사물 (각각 AS-6 및 AS-9 의 경우에 82% 및 87%) 의 감소를 보여주는 C9 마우스에서 수득된 결과에 의해 확인된다.

또한, RNA 포커스에 대한 효과에도 불구하고, AS 서열은 시험관내에서 나타낸 바와 같이 C9 단백질 수준을 감소시키지 않는다. 또한, AS 서열은 생체 내에서 비-병리학적 전사물 변이체 (V2) 의 수준을 감소시키지 않는다. 이는 현재의 접근법이 질환의 원인이 되는 기능 병리학적 메카니즘의 득실을 모두 다루고 있음을 시사한다.

참고문헌

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cgccactgca ctttagcctg gtgacagagc tagactccgt 30000 ctcaaaaaaa aaaaaaaata tcagattgtt cctacaccta gtgcttctat accacactcc 30060 tgttaggggg catcagtgga aatggttaag gagatgttta gtgtgtattg tctgccaagc 30120 actgtcaaca ctgtcataga aacttctgta cgagtagaat gtgagcaaat tatgtgttga 30180 aatggttcct ctccctgcag gtctttcagc tgaaacctgg cttatctctc agaagtactt 30240 tccttgcaca gtttctactt gtccttcaca gaaaagcctt gacactaata aaatatatag 30300 aagacgatac gtgagtaaaa ctcctacacg gaagaaaaac ctttgtacat tgtttttttg 30360 ttttgtttcc tttgtacatt ttctatatca taatttttgc gcttcttttt tttttttttt 30420 tttttttttt tccattattt ttaggcagaa gggaaaaaag ccctttaaat ctcttcggaa 30480 cctgaagata gaccttgatt taacagcaga gggcgatctt aacataataa tggctctggc 30540 tgagaaaatt aaaccaggcc tacactcttt tatctttgga agacctttct acactagtgt 30600 gcaagaacga gatgttctaa tgacttttta aatgtgtaac ttaataagcc tattccatca 30660 caatcatgat cgctggtaaa gtagctcagt ggtgtgggga aacgttcccc tggatcatac 30720 tccagaattc tgctctcagc aattgcagtt aagtaagtta cactacagtt ctcacaagag 30780 cctgtgaggg gatgtcaggt gcatcattac attgggtgtc tcttttccta gatttatgct 30840 tttgggatac agacctatgt ttacaatata ataaatatta ttgctatctt ttaaagatat 30900 aataatagga tgtaaacttg accacaacta ctgttttttt gaaatacatg attcatggtt 30960 tacatgtgtc aaggtgaaat ctgagttggc ttttacagat agttgacttt ctatcttttg 31020 gcattctttg gtgtgtagaa ttactgtaat acttctgcaa tcaactgaaa actagagcct 31080 ttaaatgatt tcaattccac agaaagaaag tgagcttgaa cataggatga gctttagaaa 31140 gaaaattgat caagcagatg tttaattgga attgattatt agatcctact ttgtggattt 31200 agtccctggg attcagtctg tagaaatgtc taatagttct ctatagtcct tgttcctggt 31260 gaaccacagt tagggtgttt tgtttatttt attgttcttg ctattgttga tattctatgt 31320 agttgagctc tgtaaaagga aattgtattt tatgttttag taattgttgc caacttttta 31380 aattaatttt cattattttt gagccaaatt gaaatgtgca cctcctgtgc cttttttctc 31440 cttagaaaat ctaattactt ggaacaagtt cagatttcac tggtcagtca ttttcatctt 31500 gttttcttct tgctaagtct taccatgtac ctgctttggc aatcattgca actctgagat 31560 tataaaatgc cttagagaat atactaacta ataagatctt tttttcagaa acagaaaata 31620 gttccttgag tacttccttc ttgcatttct gcctatgttt ttgaagttgt tgctgtttgc 31680 ctgcaatagg ctataaggaa tagcaggaga aattttactg aagtgctgtt ttcctaggtg 31740 ctactttggc agagctaagt tatcttttgt tttcttaatg cgtttggacc attttgctgg 31800 ctataaaata actgattaat ataattctaa cacaatgttg acattgtagt tacacaaaca 31860 caaataaata ttttatttaa aattctggaa gtaatataaa agggaaaata tatttataag 31920 aaagggataa aggtaataga gcccttctgc cccccaccca ccaaatttac acaacaaaat 31980 gacatgttcg aatgtgaaag gtcataatag ctttcccatc atgaatcaga aagatgtgga 32040 cagcttgatg ttttagacaa ccactgaact agatgactgt tgtactgtag ctcagtcatt 32100 taaaaaatat ataaatacta ccttgtagtg tcccatactg tgttttttac atggtagatt 32160 cttatttaag tgctaactgg ttattttctt tggctggttt attgtactgt tatacagaat 32220 gtaagttgta cagtgaaata agttattaaa gcatgtgtaa acattgttat atatcttttc 32280 tcctaaatgg agaattttga ataaaatata tttgaaattt tgcctctttc agttgttcat 32340 tcagaaaaaa atactatgat atttgaagac tgatcagctt ctgttcagct gacagtcatg 32400 ctggatctaa acttttttta aaattaattt tgtcttttca aagaaaaaat 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tgaatccctg ctgtgctgct 33300 tggagaagtt acttaaccta tgcaaggttc attttgtaaa tattggaaat ggagtgataa 33360 tacgtacttc accagaggat ttaatgagac cttatacgat ccttagttca gtacctgact 33420 agtgcttcat aaatgctttt tcatccaatc tgacaatctc cagcttgtaa ttggggcatt 33480 tagaacattt aatatgatta ttggcatggt aggttaaagc tgtcatcttg ctgttttcta 33540 tttgttcttt ttgttttctc cttacttttg gattttttta ttctactatg tcttttctat 33600 tgtcttatta actatactct ttgatttatt ttagtggttg ttttagggtt atacctcttt 33660 ctaatttacc agtttataac cagtttatat actacttgac atatagctta agaaacttac 33720 tgttgttgtc tttttgctgt tatggtctta acgtttttat ttctacaaac attataaact 33780 ccacacttta ttgtttttta attttactta tacagtcaat tatcttttaa agatatttaa 33840 atataaacat tcaaaacacc ccaattaaaa gtcagagatt gttaatacca catgatctca 33900 cttacacaca gaattgaaaa acttggaact catagaagca gagagtaaaa acatggttac 33960 caggtgctgg ggagaggcgg tgggctgggg agatgttggt caaagttaga caggaggaat 34020 aagttcaaga gatctattgt acaacttatt cagttagata ggaggaataa gctaaagatc 34080 aagagatcta ttgtacaatg tgactataac caacaacata tattgtacac ttgaaaattg 34140 ctaacagtat cttttaagtg ttctctctac aaataaatat gtgaggtaat gtatatatta 34200 attaactgta gtcatttcac aatgtatact tatttcaaaa catcatattg tatgctataa 34260 atatatacaa cttttatttt tcaattttag aaatgtcctt aaaaaatcag attttcagat 34320 ca 34322 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> forward primer <400> 19 ggggatatct aacaacatag gagctgtga 29 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> reverse primer <400> 20 ggggatatcc acatacgcgt ttcctagga 29 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> reverse-complement AS1 <400> 21 tgacgcacct ctctttccta gcgggacacc gtaggttacg 40 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Reverse complement AS2 <400> 22 aacacacacc tcctaaaccc acacctgctc ttgctagacc 40 <210> 23 <211> 448 <212> DNA <213> artificial <220> <223> U7 + reverse-complement AS1 <400> 23 taacaacata ggagctgtga ttggctgttt tcagccaatc agcactgact catttgcata 60 gcctttacaa gcggtcacaa actcaagaaa cgagcggttt taatagtctt ttagaatatt 120 gtttatcgaa ccgaataagg aactgtgctt tgtgattcac atatcagtgg aggggtgtgg 180 aaatggcacc ttgatctcac cctcatcgaa agtggagttg atgtccttcc ctggctcgct 240 acagacgcac ttccgcaagt gacgcacctc tctttcctag cgggacaccg taggttacga 300 atttttggag caggttttct gacttcggtc ggaaaacccc tcccaatttc actggtctac 360 aatgaaagca aaacagttct cttccccgct ccccggtgtg tgagaggggc tttgatcctt 420 ctctggtttc ctaggaaacg cgtatgtg 448 <210> 24 <211> 448 <212> DNA <213> artificial <220> <223> U7 + reverse-complement AS2 <400> 24 taacaacata ggagctgtga ttggctgttt tcagccaatc agcactgact catttgcata 60 gcctttacaa gcggtcacaa actcaagaaa cgagcggttt taatagtctt ttagaatatt 120 gtttatcgaa ccgaataagg aactgtgctt tgtgattcac atatcagtgg aggggtgtgg 180 aaatggcacc ttgatctcac cctcatcgaa agtggagttg atgtccttcc ctggctcgct 240 acagacgcac ttccgcaaga acacacacct cctaaaccca cacctgctct tgctagacca 300 atttttggag caggttttct gacttcggtc ggaaaacccc tcccaatttc actggtctac 360 aatgaaagca aaacagttct cttccccgct ccccggtgtg tgagaggggc tttgatcctt 420 ctctggtttc ctaggaaacg cgtatgtg 448

Claims (17)

1. C9orf72 전사물을 표적으로 하는 안티센스 핵산 분자로서, 안티센스 핵산 분자는 센스 C9orf72-RNA 포커스 및 안티센스 C9orf72-RNA 포커스의 수준을 감소시킬 수 있는, 안티센스 핵산 분자.
2. 제 1 항에 있어서, 안티센스 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 6 을 포함하는, 안티센스 핵산 분자.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 안티센스 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 6 으로 이루어지는, 안티센스 핵산 분자.
4. C9orf72 전사물을 표적으로 하는 안티센스 핵산 분자로서, 안티센스 핵산 분자는 SEQ ID NO: 3 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지는, 안티센스 핵산 분자.
5. C9orf72 전사물을 표적으로 하는 안티센스 핵산 분자로서, 안티센스 핵산 분자는 SEQ ID NO: 5 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지는, 안티센스 핵산 분자.
6. C9orf72 전사물을 표적으로 하는 안티센스 핵산 분자로서, 안티센스 핵산 분자는 SEQ ID NO: 21 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지는, 안티센스 핵산 분자.
7. C9orf72 전사물을 표적으로 하는 안티센스 핵산 분자로서, 안티센스 핵산 분자는 SEQ ID NO: 22 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지는, 안티센스 핵산 분자.
8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 핵산 분자는 작은 핵 RNA 예컨대 U7 작은 핵 RNA 에 융합되어 있는, 안티센스 핵산 분자.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 핵산 분자 적어도 두 개를 포함하는 핵산 구축물.
10. 제 9 항에 있어서, 핵산 구축물은 센스 C9orf72 전사물을 표적으로 하는 제 1 안티센스 핵산 분자 및 안티센스 C9orf72 전사물을 표적으로 하는 제 2 안티센스 핵산 분자를 포함하는, 핵산 구축물.
11. 제 10 항에 있어서, 제 1 안티센스 핵산 분자는 SEQ ID NO: 6 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지고, 제 2 안티센스 핵산 분자는 SEQ ID NO: 3 에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지는, 핵산 구축물.
12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 핵산 분자 또는 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구축물을 전달하기 위한 벡터.
13. 제 12 항에 있어서, 벡터는 상기 안티센스 핵산 분자 또는 상기 핵산 구축물을 코딩하는 바이러스 벡터인, 벡터.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터, 특히 AAV9 또는 AAV10 벡터인, 벡터.
15. C9orf72 관련 질환, 특히 C9orf72 헥사뉴클레오티드 리피트 익스팬션 관련 질환의 치료에서 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 핵산 분자, 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구축물 또는 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 벡터.
16. 질환은 근위축성 측삭경화증 (ALS) 또는 전두측두엽치매 (FTD), 특히 근위축성 측삭경화증 (ALS) 인, 제 15 항에 따른 용도를 위한, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 핵산 분자, 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구축물 또는 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 벡터.
17. 상기 안티센스 핵산 분자 또는 상기 벡터는 정맥내 및/또는 뇌실내 경로를 통한 투여를 위한 것인, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 핵산 분자, 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구축물 또는 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 벡터.

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