JP2023520730A - 筋萎縮性側索硬化症を治療するためのアンチセンス配列 - Google Patents

Abstract

本発明は、筋萎縮性側索硬化症又は前頭側頭型認知症等のC9orf72ヘキサヌクレオチド反復伸長関連疾患を治療するためのアンチセンス配列、核酸構築物及び前記アンチセンス配列を含むベクター、並びにその使用に関する。

Description

本発明は、疾患、特に筋萎縮性側索硬化症又は前頭側頭型認知症を治療するための核酸、組成物及び方法に関する。

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、成人において最も一般的な運動ニューロン障害であり、発生率は1～2人/100,000人、毎年の有病率は4～6人/100,000人である。上位と下位両方の運動ニューロンの進行性変性は、一般に診断後3～5年で呼吸不全による死に至る。ALS患者の約15%は、前頭側頭型認知症(FTD)の徴候も発症する。FTDは、アルツハイマー病に次いで2番目に一般的な認知症の原因であり、人格及び行動の変化並びに言語障害をもたらす。FTDは、脳の前頭葉及び前側頭葉における進行性のニューロン消失によって特徴付けられる。

ALS、FTD及びALS/FTDで最も頻度が高い遺伝的原因は、ヒト9番染色体のオープンリーディングフレーム72(C9orf72)遺伝子における変異に同定されている(Rentonら、2011年)。C9orf72遺伝子のイントロン1(非コードエクソン1aと1bの間)内のヘキサヌクレオチド反復伸長(HRE) G4C2が、遺伝及び散発性ALS/FTD並びに他の神経障害に関与することが示されている(Souzaら、2015年)。HRE関連の神経毒性を説明するために3つの発病機序が提案されてきた。第1に、反復伸長の存在が、C9遺伝子発現の下方調節を引き起こし、機能喪失に至る。第2に、HREは、G4C2反復(センス)及びC4G2反復(アンチセンス)を含有するRNAへと双方向に転写され、細胞核内で凝集し、核内RNA凝集体内にRNA結合タンパク質(RBP)を捕捉する。示唆される別の病因の機序は、反復関連非AUG依存的(RAN)翻訳として公知の非標準翻訳機序による、センス又はアンチセンスいずれかのRNA転写産物から翻訳されるジペプチド反復タンパク質(DPR)の直接的な毒性である。

WO2013/053928 WO11113889 WO06021724 WO2013/190059

今日では、ALS及びFTDは、臨床所見及び遺伝的決定因子が重複する連続した疾患と考えられている。過去数十年間に実行されてきた臨床前及び臨床試験の多さにもかかわらず、これら致死的疾患に対し現在のところ利用できる有効な治療は存在しない。従って、有効な治療が、緊急に必要とされている。

本発明者らは、ALSを治療する目的で、有効なアンチセンス配列(AS)を開発して、C9orf72遺伝子の反復の転写及び翻訳を遮断し、それによりRNA凝集体(RNA foci)の形成を防止した。

本発明の第1の態様は、C9orf72転写産物を標的するアンチセンス核酸分子であって、センスC9orf72-RNA凝集体及びアンチセンスC9orf72-RNA凝集体のレベルを減少させることができる、アンチセンス核酸分子に関する。特定の実施形態において、前記アンチセンス核酸分子は、配列番号1、配列番号2、配列番号4若しくは配列番号6を含む又はそれで構成される。

本発明は、C9orf72転写産物を標的するアンチセンス核酸分子であって、配列番号3に示す若しくは配列番号5に示す配列を含む又はそれで構成される、アンチセンス核酸分子に関する。

本発明は、C9orf72転写産物を標的するアンチセンス核酸分子であって、配列番号21に示す若しくは配列番号22に示す配列を含む又はそれで構成される、アンチセンス核酸分子にも関する。

特定の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、U7核内低分子RNA等の核内低分子RNAに融合される。

本発明は、本発明のアンチセンス核酸分子を少なくとも2つ含む核酸構築物にも関する。特定の実施形態において、核酸構築物は、センスC9orf72転写産物を標的する第1のアンチセンス核酸分子及びアンチセンスC9orf72転写産物を標的する第2のアンチセンス核酸分子を含む。好ましい実施形態において、第1のアンチセンス核酸分子は、配列番号6に示す配列を含む又はそれからなり、第2のアンチセンス核酸分子は、配列番号3に示す配列を含む又はそれからなる。

本発明は、本発明のアンチセンス核酸分子又は核酸構築物を送達するためのベクターに更に関する。特定の実施形態において、ベクターは、前記アンチセンス配列又は前記核酸構築物をコードするウイルスベクターである。特に、前記ウイルスベクターは、AAVベクター、特にAAV9ベクター又はAAVrh10ベクター等のAAV10ベクターであってもよい。特に、前記ウイルスベクターは、AAVベクター、特にAAV9又はAAV10ベクターであってもよい。

本発明は、C9orf72関連疾患、特にC9orf72ヘキサヌクレオチド反復伸長関連疾患の治療における使用のためのアンチセンス核酸分子、核酸構築物又はベクターにも関する。特定の実施形態において、疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)又は前頭側頭型認知症(FTD)、特に筋萎縮性側索硬化症(ALS)である。特定の実施形態において、前記アンチセンス核酸分子、前記核酸構築物又は前記ベクターは、静脈内及び/又は脳室内経路による投与用である。

C9orf72遺伝子及び特定の領域に対して指向されたアンチセンス配列の略図である。エクソンがボックスとして表され、GGGGCC反復伸長の位置が、イントロン1内に示される。アンチセンス配列(AS)は、HREを含有するC9orf72遺伝子の領域の推定スプライシングサイレンサ領域(SSR)を標的するように設計された。AS-1は、C9orf72のアンチセンス転写産物前駆体のエクソン1a中のSSRを標的するように設計される。AS-2、AS-3、AS-5及びAS-7は、アンチセンス転写産物前駆体のイントロン1中のSSRを標的するように設計される。AS-4、AS-6及びAS-8は、C9orf72のセンス転写産物前駆体のイントロン1を標的するように設計される。 1つ又は2つのアンチセンスを送達するレンチウイルス)ベクターゲノム(A)及びAAVベクターゲノム(B)の略図である(それぞれ上又は下の設計)。センス又はアンチセンスHREに対して指向されたアンチセンス(ANTISENSE)配列は、最適化されたマウスU7核内低分子 RNA(U7プロモーター)に組み込まれ、2つの自己不活性化(SIN)長い末端反復配列(LTR)(A)又は2つのAAV逆位末端反復(ITR)(B)の間でホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター(PGK)の制御下にある強化緑色蛍光タンパク質(eGFP)と一緒にクローニングされる。 健康なドナー2名(対照、CTRL-1及びCTRL-2)並びにC9変異を保有するALS患者2名(ALS-1及びALS-2)由来の皮膚不死化線維芽細胞の、TYE-563-LNA(CCCCGG)3CC(センス凝集体を検出する)及び(GGGGCC)3GG(アンチセンス凝集体を検出する)プローブを用いるセンス及びアンチセンス凝集体に対するRNA-FISH分析を示す図である。核は、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で染色された。スケールバー10μm。画像は、スピニングディスク型共焦点顕微鏡ニコンTi2を使用して取得された。 ALS-2線維芽細胞のレンチウイルス形質導入後のセンス(上のグラフ)又はアンチセンス(下のグラフ) RNA凝集体を発現している核の数の定量化を示す図である。ALS-2線維芽細胞が、C9orf72転写産物のHRE部分に近い領域を標的するアンチセンス配列(Lenti-AS)(AS-1、AS-2、AS-3、AS-4、AS-5、AS-6、AS-7及びAS-8)及びランダム配列(CTRL)を保有するレンチウイルスベクターで形質導入された。データは、≧3の独立した形質導入実験の平均+/-SEMとして表される。RNA凝集体のパーセンテージ(%)は、100%として与えられる合計の核に対する1つ又は複数の凝集体を含有する核の比として算出され、少なくとも300個の核が、各プレートについて計数された。各AS-C9に対する凝集体減少の%は、AS-CTRLと比較して表に報告される。群間の差異は、スチューデントt検定により分析された。統計的有意性は、各ASを形質導入実験の同じ組内の対照条件と比較して報告される(*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001;及び****p<0.0001)。 不死化線維芽細胞におけるウエスタンブロット法により明らかにされたC9タンパク質を示す図である。(A) 健康な対照者2名(CTRL-1及びCTRL-2)又はC9 ALS患者2名(ALS-1及びALS-2)から得られた皮膚不死化線維芽細胞におけるC9orf72発現(C9orf72、クローン2E1)のウエスタンブロット分析を示す図である。ビンキュリンが、ローディング対照として使用された。細胞由来のタンパク質溶解物20マイクログラムが、ロードされた(n=1)。(B) ALS-2線維芽細胞が、ランダム配列(CTRL)又は異なるAS-C9(AS-1、AS-2、AS-3、AS-4、AS-5、AS-6)を発現するレンチウイルスベクター(Lenti-AS)で形質導入され、C9orf72のレベルが、ウエスタンブロット法により分析された。独立した3回の実験(exp1、exp2及びexp3)の画像が示される。(C)C9orf72タンパク質とビンキュリンの間の比を示すウエスタンブロット法の結果のデンシトメトリー分析を示す図である。データは、独立した3回のトランスフェクション実験の平均+/- SEMとして表される。群間の差異は、一元配置分散分析に続くテューキーの多重比較検定により分析された。群間に有意差は観察されなかった。 注射なし(NI、n=4)及びAAV-U7-AS対照(U7-CTRL、n=5)、AAV-U7-AS-6(U7-AS-6、n=5)又はAAV-U7-AS-9(U7-AS-9、n=4)を用い注射した月齢3カ月のC9キャリアマウス(雌のみ)の頸髄溶解物におけるC9orf72バリアント1、バリアント2、バリアント3のmRNA発現レベルを示す図である。データは、相対倍率変化として示され、C9orf72 mRNAレベルは、マウスHPRTに対して標準化される。群間の差異は、一元配置分散分析に続くテューキーの多重比較検定により分析された。統計的有意性は、各U7-ASをNI及びU7-CTRL条件と比較して報告される。エラーバーは、平均値の標準誤差(sem)に対応する。(p値<0.05: *; p値<0.01: **; p値<0.0001: ****、n=マウス数)。NI又はAS-CTRLと比較した、2つのAS-C9のHRE含有転写産物(V1及びV3)の減少の%が、表において報告される。

アンチセンス配列
本発明の第1の態様は、C9orf72転写産物を標的するアンチセンス配列に関する。

本出願において、表現「アンチセンス配列」、「AS」、「AS配列」又は「アンチセンス核酸分子」は、C9orf72遺伝子によりコードされるmRNA前駆体又はmRNAの一部に相補的な一本鎖核酸分子を意味する。従って、本発明のASは、水素結合によって標的C9orf72転写産物にハイブリダイズできる一本鎖オリゴマー配列である。

本発明のASは、長さ少なくとも13ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチドのものでもよく、好ましくは少なくとも35ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも39ヌクレオチド又は少なくとも40ヌクレオチドのものであってもよい。特定の実施形態において、本発明のASは、長さ13～50ヌクレオチドである。ASは、例えば、長さ13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43若しくは45ヌクレオチド又はより長くてもよい。本発明の特定の実施形態において、ASは、長さ13、15、20、25、30、35、39、40又は45ヌクレオチドである。好ましくは、ASは、35～50ヌクレオチド、より好ましくは39～50ヌクレオチド又は40～50ヌクレオチドである。

特定の実施形態において、アンチセンス配列は、単離されたアンチセンス配列である。特定の実施形態において、前記単離された配列は、化学的に合成される。単離された配列は、血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぐために以下で更に記載されるように化学修飾されてもよく、それによりin vivoでの効力を増大させうる。特に、前記単離されたアンチセンス配列は、長さ13ヌクレオチド～25ヌクレオチドであってもよい。特に、単離されたASは、長さ13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25ヌクレオチドのものであってもよい。

別の特定の実施形態において、アンチセンス配列は、細胞内での発現を可能にする要素を含むベクターにコードされる。特定の実施形態において、ベクターにコードされる前記アンチセンス配列は、長さ13～50ヌクレオチドである。ASは、例えば、長さ13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43若しくは45ヌクレオチド又はより長くてもよい。本発明の特定の実施形態において、ASは、長さ13、15、20、25、30、35、39、40又は45ヌクレオチドである。好ましくは、ASは、35～50ヌクレオチド、より好ましくは39～50ヌクレオチド又は40～50ヌクレオチドである。

特定の実施形態において、本発明のASは、ヒトC9orf72遺伝子又はヒトC9orf72転写産物を標的する。

本発明の特定の実施形態において、本発明のASは、ヒトC9orf72転写産物を標的する。

本発明のASは、C9orf72転写産物の任意のコード又は非コード部分を標的するように設計されうる。

本発明の文脈において、用語「C9orf72転写産物」は、C9orf72 mRNA前駆体及びC9orf72 mRNAを含む。

C9orf72(9番染色体オープンリーディングフレーム72)は、遺伝子C9orf72(C9)にコードされるタンパク質である。ヒトC9orf72遺伝子は、9番染色体の短腕(p)にあるオープンリーディングフレーム72、塩基対27,573,863～塩基対27,546,542に位置する。ヒトC9orf72遺伝子は、よく特徴付けられている。その配列は、配列番号18(NCBI ref seq: NG_031977.1)に報告されている。C9orf72遺伝子は、11個のエクソンで構成され、3種のmRNA:バリアント1(V1)(NM_145005)、バリアント2(V2)(NM_018325)及びバリアント3(V3)(NM_001256054)へと転写されうる。転写産物V2及びV3は、C9orf72タンパク質の長い形態をコードし、一方で転写産物V1は短い形態をコードしている。C9orf72は双方向に転写される(Zuら、2013年)ので、アンチセンス転写産物も産生される。

本発明のASを使用して、病原性反復伸長を含有するC9orf72転写産物を標的することができる。特定の実施形態において、標的されたC9orf72転写産物は、病原性ヘキサヌクレオチド反復伸長(HRE)を含有する。「ヘキサヌクレオチド反復伸長」は、少なくとも2回反復される一連の6塩基、特にGGGGCC(G4C2)又はCCCCGG(C4G2)を意味する。ヘキサヌクレオチド反復伸長は、C9orf72核酸のイントロン1に特に位置する。本発明の文脈において、病原性ヘキサヌクレオチド反復伸長は、C9orf72核酸中にG4C2又はC4G2等のヘキサヌクレオチドの反復を少なくとも30個含み、疾患に関連している。特定の実施形態において、反復は連続的である。特定の実施形態において、反復は、1つ又は複数の核酸塩基により中断される。実際に、ALS又はFTD患者におけるC9orf72遺伝子の第1イントロン内のG4C2又はC4G2 HREが、健康な対象(30個未満のHRE)より長い(HRE>70)ことによって特徴付けられる。更なる特定の実施形態において、病原性HREは、少なくとも70個のG4C2又はC4G2反復等少なくとも70個のヘキサヌクレオチド反復を含む。

特定の実施形態において、ASは、C9orf72転写産物のHRE内又はすぐ近くに位置する配列を標的することができる。

特に、ASは、C9orf72転写産物のイントロン1又はエクソン1A内に位置する配列に相補的であってもよい。

特定の実施形態において、ASは、C9orf72転写産物のHRE中に位置する配列を標的することができる。換言すれば、ASは、HREからなる配列に相補的である。

本発明のASは、C9orf72転写産物のHREに隣接する他の領域を標的してもよい。特定の実施形態において、本発明のASは、HREの上流319ヌクレオチドからHREの下流18ヌクレオチドの領域に位置する配列を標的する。

特定の実施形態において、ASは、HREの上流の領域、即ちHREの5'領域を標的する。

別の特定の実施形態において、ASは、HREと重なる配列及びHREに隣接するC9orf72転写産物の領域を標的することができる。特定の実施形態において、ASは、HREの5'隣接領域及びHREの一部を含む配列を標的することができる(即ち、ASは、HRE及びHREの5'領域に重なる)。別の特定の実施形態において、ASは、HREの3'隣接領域及びHREの一部を含む配列を標的することができる(即ち、ASは、HRE及びHREの3'領域に重なる)。

別の特定の実施形態において、ASは、推定のスプライシングサイレンサ領域(SSR)を標的する。特定の実施形態において、本発明のASは、配列番号18のC9orf72ゲノム配列の5002～5041位、5128～5167位、5200～5239位又は5299～5338位の領域に含まれるSSRを標的する。特定の実施形態において、ASは、エクソン1aに位置するSSRを標的する。別の特定の実施形態において、ASは、イントロン1、好ましくはイントロン1中のHREの上流に位置するSSRを標的する。

本発明のASは、センス又はアンチセンスC9orf72転写産物を標的してもよい。実際に、HREは、センス及びアンチセンス鎖両方からその病理学的効果を発揮することが記載されている(Haeuslerら、2016年)。換言すれば、HREは、凝集し、RNA結合タンパク質(RBP)を捕捉する核内凝集体を形成するRNAへと双方向に転写される。特に、G4C2及びC4G2反復を含有するHREは、G4C2及びC4G2反復を含有するRNAへと双方向に転写されうる。本発明のASは、そのようなセンス又はアンチセンスRNAを標的するように設計されうる。

特定の実施形態において、本発明のASは、センスC9orf72-RNA凝集体及び/又はアンチセンスC9orf72-RNA凝集体のレベルを減少させるように設計される。「センスC9orf72-RNA凝集体」によって、G4C2反復含有C9orf72 RNA等のセンスヘキサヌクレオチド反復含有C9orf72 RNAの凝集から生じる核内凝集体が意味される。「アンチセンスC9orf72-RNA凝集体」によって、C4G2反復含有C9orf72 RNA等のアンチセンスヘキサヌクレオチド反復含有C9orf72 RNAの凝集から生じる核内凝集体が意味される。特定の実施形態において、本発明のASは、センス凝集体とアンチセンス凝集体の両方を減少させうる。

「センス又はアンチセンスRNA凝集体のレベルを減少させる」とは、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%若しくは少なくとも90%、凝集体の数を減少又は低下させることを意味する。特定の実施形態において、本発明のASは、少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、更により好ましくは少なくとも60%凝集体の数を減少させうる。

センス又はアンチセンスRNA凝集体のレベルを決定するために、当業者に公知のあらゆる方法が使用されうる。特に、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)が、使用されうる。例えば、センス又はアンチセンスRNA凝集体のレベルは、センス凝集体を検出するためのTYE563-(C4G2)3ロック核酸(LNA)プローブ及びアンチセンス凝集体のためのTYE563-(G4C2)3 LNAプローブを使用するFISHによって決定することができる。

反復含有RNAは、細胞質へ移動することができ、それらは反復関連非AUG依存的(RAN)翻訳として公知の非標準翻訳機序によって毒性ジペプチド反復タンパク質(DPR)に翻訳されうる。従って、特定の実施形態において、本発明のASは、センスHRE含有RNA及び/又はアンチセンスHRE含有RNAから翻訳されるジペプチド反復タンパク質のレベルを減少させうる。センスRNAから翻訳されるジペプチド反復タンパク質は、ポリ[GA]、ポリ[GR]及びポリ[GP]ペプチドを含む。アンチセンスRNAから翻訳されるジペプチド反復タンパク質は、ポリ[PR]、ポリ[PA]及びポリ[GP]ペプチドを含む。「DPRのレベルを減少させる」とは、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%若しくは少なくとも90%、DPRの数を減少又は低下させることを意味する。

別の特定の実施形態において、本発明のASは、センス及び/又はアンチセンスHRE含有C9orf72転写産物のレベルを減少させうる。「センス及び/又はアンチセンスHRE含有C9orf72転写産物のレベルを減少させる」とは、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%若しくは少なくとも90%、センス及び/若しくはアンチセンス病原性転写産物のレベルを減少又は低下させることを意味する。

特定の実施形態において、本発明のASは、総(total)C9orf72転写産物のレベルを維持しながら病原性HRE含有転写産物のレベルを減少させうる。換言すれば、本発明のASは、総C9orf72タンパク質レベルを維持しながら病原性転写産物のレベルを減少させることができうる。

本発明を実施するための代表的なASが、Table 1(表1)に記載される:

AS-1、AS-2、AS-3及びAS-5は、アンチセンスC9orf72転写産物を標的するように設計されている。AS-4及びAS-6は、センスC9orf72転写産物を標的するように設計されている。

配列番号1及び配列番号2の逆相補配列が使用されてもよい。従って、配列番号1若しくは配列番号2に対して逆相補である配列を含む又はそれからなるASも、本発明の文脈において使用されうる。従って、ASは:
- 配列番号21:5' TGACGCACCTCTCTTTCCTAGCGGGACACCGTAGGTTACG 3'(配列番号1の逆相補配列);若しくは
- 配列番号22:5' AACACACACCTCCTAAACCCACACCTGCTCTTGCTAGACC 3'(配列番号2の逆相補配列)
を含む又はそれからなりうる。

特定の実施形態において、ASは、配列番号1～配列番号6に示す配列を含む。好ましくは、ASは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4又は配列番号6、より好ましくは配列番号1、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に示す配列を含む。

別の特定の実施形態において、ASは、配列番号1～配列番号6に示す配列からなる。好ましくは、ASは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4又は配列番号6、より好ましくは配列番号1、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に示す配列からなる。

特定の実施形態において、ASは、配列番号1～配列番号6に示される配列のいずれか1つの連続した13～25ヌクレオチドを有する配列を含む。好ましくは、ASは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4若しくは配列番号6、より好ましくは配列番号1、配列番号2、配列番号4若しくは配列番号6に示される配列のいずれか1つの連続した13～25ヌクレオチドを有する配列を含む。

特定の実施形態において、ASは、配列番号1～配列番号6に示される配列のいずれか1つの連続した13～25ヌクレオチドを有する配列からなる。好ましくは、ASは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4若しくは配列番号6、より好ましくは配列番号1、配列番号2、配列番号4若しくは配列番号6に示される配列のいずれか1つの連続した13～25ヌクレオチドを有する配列からなる。

特定の実施形態において、ASは、配列番号1～配列番号6に示す配列のいずれか1つと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含む又はそれからなる。好ましくは、ASは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4若しくは配列番号6、より好ましくは配列番号1、配列番号2、配列番号4若しくは配列番号6に示す配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含む又はそれからなる。

特定の実施形態において、ASは、配列番号21又は配列番号22に示す配列を含む。

別の特定の実施形態において、ASは、配列番号21又は配列番号22に示す配列からなる。

特定の実施形態において、ASは、配列番号21又は配列番号22に示す配列の連続した13～25ヌクレオチドを有する配列を含む。

特定の実施形態において、ASは、配列番号21又は配列番号22に示す配列の連続した13～25ヌクレオチドを有する配列からなる。

特定の実施形態において、ASは、配列番号21若しくは配列番号22に示す配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含む又はそれからなる。

本発明のASは、任意の適切な化学物質のものであってもよい。特定の実施形態において、本発明のASは、DNA又はRNA核酸分子であってもよい。in vivoでの使用のために、単離されたASはいくつかの化学修飾、例えばリン酸骨格修飾によって安定化されてもよい。例えば、本発明の安定化された単離されたASは、修飾された骨格を有してもよく、例えばホスホロチオエート連結を有してもよい。他の可能な安定化修飾には、リン酸ジエステル修飾、リン酸ジエステルとホスホロチオエート修飾の組合せ、メチルホスホン酸、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、p-エトキシ、及びその組合せがある。単離されたASの化学的に安定化され、修飾されたバージョンは、2'-O-メチル(2'OME)、2'-O-メトキシエチル(2'MOE)、2'フッ化(2'F)及び2'-O-アミノプロピル類似体等、糖部分の2'-位に化学修飾を含む。化学修飾は進化しており、モルホリノ(ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー、PMO)、ロック核酸(LNA)、2',4拘束エチル(cEt)、ペプチド核酸(PNA)、トリシクロDNA、トリシクロDNAホスホロチオエートAON分子(WO2013/053928)又はU核内低分子(sn) RNA等の新世代分子が設計されてきた。

単離されたASを特定の作用部位に送達するために、マイクロインジェクション、遺伝子銃、エレクトロポレーション等の非ウイルス遺伝子送達方法、及び/又はNアセチルガラクトサミン、オクタグアニジンデンドリマー、細胞貫通ペプチド、リポソーム若しくはナノ粒子等の様々な担体を使用する化学的方法が使用されうる。

特定の実施形態において、アンチセンス配列は、U7核内低分子RNA等の核内低分子RNAで修飾される。特定の実施形態において、上に記載のASは、U1、U2、U6、U7等の核内低分子RNA分子若しくは他の任意の核内低分子RNA又はキメラ核内低分子RNAに連結される(Donadonら、2019年; Imbertら、2017年)。snRNAは、mRNA前駆体のプロセッシングに関係し、Smコアと呼ばれる特定のタンパク質と会合して、核内低分子リボ核タンパク(snRNP)の複合体を形成する。U7修飾に関する情報は、Goyenvalleら、2004年; WO11113889;及びWO06021724に特に見ることができる。

U7核内低分子RNA(U7 snRNA)は、低分子リボ核タンパク複合体(U7 snRNP)の成分であり、Sm/Lsm(Sm様)タンパク質の結合部位を修飾することによりmRNA前駆体スプライシングモジュレーションのツールとして使用されうる(Imbertら、2017年)。特定の実施形態において、D. Schumperliによって記載されるU7カセットが、使用される(Schumperli及びPillai、2004年)。それは、天然のU7プロモーター(-267～+1位)、U7smOpt snRNA及び116位までの下流配列を含む。U7smOpt内のヒストンmRNA前駆体に相補的な18ntの天然の配列は、例えば、既に記載されているPCR媒介変異誘発法を使用して選択されたAS配列のうち1つ若しくは2つ(同じ配列が2回使用されるか又は2つの異なる配列のいずれか)又はより多くの反復によって置きかえられる(Goyenvalleら、2004年)。

特定の実施形態において、本発明のASは、配列番号9～配列番号14若しくは配列番号17に示す配列を含む又はそれからなる。好ましくは、本発明のASは、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号14若しくは配列番号17に示す配列を含む又はそれからなる。特定の実施形態において、本発明のASは、配列番号9、配列番号10、配列番号12若しくは配列番号14に示す配列を含む又はそれからなる。

特定の実施形態において、ASは、配列番号9～配列番号14及び配列番号17に示す配列のいずれか1つと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含む又はそれからなる。好ましくは、本発明のASは、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号14若しくは配列番号17に示す配列のいずれか1つと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含む又はそれからなる。特定の実施形態において、本発明のASは、配列番号9、配列番号10、配列番号12若しくは配列番号14に示す配列のいずれか1つと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含む又はそれからなる。

特定の実施形態において、本発明のASは、配列番号23若しくは配列番号24に示す配列を含む又はそれからなる。

特定の実施形態において、ASは、配列番号23若しくは配列番号24に示す配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含む又はそれからなる。

特に血液脳関門を通る安定且つ効率的なin vivo送達のために、単離されたASは、任意の細胞透過性ペプチド及びタンパク質分泌を媒介するシグナルペプチドに融合されてもよく又は同時投与されてもよい。細胞透過性ペプチドは、RVGペプチド(Kumarら、2007年)、PiP(Bettsら、2012年)、P28(Yamadaら、2013年)若しくはタンパク質形質導入ドメイン様TAT(Malhotraら、2013年)又はVP22(Lundbergら、2003年)でありうる。

核酸構築物
本発明の第2の態様は、上記のアンチセンス核酸分子を少なくとも2つ含む核酸構築物に関する。特定の実施形態において、前記核酸構築物は、上記ASを2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個又はより多く含みうる。特定の実施形態において、核酸構築物は、上記の同じAS核酸分子の反復を含む。特定の実施形態において、核酸構築物は、同じAS配列の反復を含み、AS配列は、配列番号1～配列番号6から選択される。特定の実施形態において、核酸構築物は、同じAS配列の反復を含み、AS配列は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4又は配列番号6、好ましくは配列番号1、配列番号2、配列番号4又は配列番号6である。

特定の実施形態において、上記の通り、核酸構築物のASのそれぞれは、U7核内低分子RNAに融合される。

特定の実施形態において、核酸構築物は、上記の異なる2つのASを含む。特定の実施形態において、核酸構築物は、異なる2つのASを含み、ASは、配列番号1～配列番号6に示す配列のいずれか1つと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含む又はそれからなる。特定の実施形態において、核酸構築物は、異なる2つのASを含み、ASは、配列番号1～配列番号6に示される配列のうちいずれか1つからなる。

特定の実施形態において、核酸構築物は、センスC9orf72転写産物を標的する第1のAS及びアンチセンスC9orf72転写産物を標的する第2のASを含む。特定の実施形態において、上記の通り、第1のAS及び第2のASは、それぞれU7核内低分子RNAと融合される。特定の実施形態において、核酸構築物は、
(i)配列番号1、配列番号2、配列番号3若しくは配列番号5に示す配列のうちいずれか1つ、特に配列番号3と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含む又はそれからなる第1のAS ;と
(ii)配列番号4若しくは配列番号6に示す配列のうちいずれか1つ、特に配列番号6と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含む又はそれからなる第2のASとを含む。

特定の実施形態において、核酸構築物は、
(i)配列番号1、配列番号2、配列番号3若しくは配列番号5に示す配列を含む又はそれからなる第1のAS;と
(ii)配列番号4若しくは配列番号6に示す配列を含む又はそれからなる第2のASとを含む。
特定の実施形態において、第1のアンチセンス配列は、配列番号3に示す配列を含む又はそれからなり、第2のアンチセンス配列は、配列番号6に示す配列を含む又はそれからなる。特定の実施形態において、第1のアンチセンス配列は、U7核内低分子RNAに融合された配列番号3に示す配列を含む又はそれからなり、第2のアンチセンス配列は、U7核内低分子RNAに融合された配列番号6に示す配列を含む又はそれからなる。

特定の実施形態において、核酸構築物は、配列番号17に示す配列を含む又はそれからなる。特定の実施形態において、核酸構築物は、配列番号17と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含む又はそれからなる。

AS送達
本発明のアンチセンス配列又は核酸構築物は、単独で又はベクターに関連してin vivoで送達されてもよい。最も広義には、「ベクター」とは、細胞へのアンチセンス配列の移送を容易にする能力がある任意の媒体である。本発明において有用なベクターには、プラスミド、ファージミド、ウイルス、及びAS配列の挿入若しくは組み込みによって操作されたウイルス又は細菌供給源から得られる他の媒体があるが、これに限定されない。

ウイルスベクターが、ベクターの好ましい型であり、以下のウイルス: HIV-1等のレンチウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス等のレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)等のパルボウイルス; SV40型ウイルス; HSV-1等のヘルペスウイルス及びワクシニアウイルス(Vacciniavirus)由来の核酸配列を含むが、これに限定されない。命名されていないが、当業者に公知の他のベクターも容易に利用することができる。臨床適用のために検証されており、アンチセンス配列を送達するために使用されうるベクターの中では、レンチウイルス、レトロウイルス及びAAVが、より大きい潜在性を示す。

複製欠損性(即ち、所望のASの合成を指令する能力はあるが、感染性粒子を産生する能力はない)のレトロウイルスに基づく及びレンチウイルスに基づくベクターが、ヒト遺伝子治療臨床試験用として承認されている。それらは、標的細胞ゲノムに組み込まれる特性を有しており、従って標的細胞及びその後代において導入遺伝子の持続的な発現が可能になる。

特定の実施形態において、ASは、AAVベクターを使用して送達される。ヒトパルボウイルスアデノ随伴ウイルス(AAV)は、複製が天然に欠損しており、感染した細胞のゲノムに組み込まれて潜伏感染を確立することができるディペンドウイルスである。組み込みは、AAVS1と呼ばれ、19番染色体に位置するヒトゲノム内の特定の部位(19q13.3-qter)で起こるので、この特性は、哺乳動物のウイルスの中では固有であるように見える。AAVに基づく組換えベクターは、Repタンパク質を欠いており、組み込みの有効性が低く、安定な環状エピソームとして主に存在し、標的細胞中で数カ月間、場合によっては数年間存続しうる。そのため、AAVはヒト遺伝子治療用の潜在的ベクターとして大きな関心を喚起してきた。ウイルス特性の中で好ましいのは、いかなるヒト疾患とも関連がないこと及び感染させうる異なる組織から得られる細胞系が多様なことである。実際に12種のAAV血清型(AAV1～12)及び数百種に及ぶバリアントが記載されており、これらの多くは、特定の組織に対する標的化を増大させることを示してきた(Hesterら、2009年)。更に、AAV-PHP.eB及びAAV-Fのような、有効性が改善された新しいカプシドを設計し、特徴付けるための協調した試みが、AAVベクターの分野に存在する。異なる血清型は、組織向性、分布及び循環抗体に対する感受性に関与するカプシドのタンパク質アミノ酸構造によって定義される(Devermanら、2018年)。従って、本発明は、ヒトC9orf72転写産物を標的し、前記ヒトC9orf72転写産物内の病理学的反復伸長を標的するように構成された上に記載のASをコードしているAAVベクターに関する。特定の実施形態によると、AAVゲノムは、AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(例えばカニクイザルAAV10又はアカゲザルAAVrh10)、11又は12血清型から得られる。好ましい実施形態において、AAVカプシドは、AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(例えばカニクイザルAAV10又はAAVrh10)、11、12血清型又はAAVバリアントから得られる。更なる特定の実施形態において、AAVベクターは偽型ベクターであり、即ちそのゲノムとカプシドは異なる血清型のAAVから得られる。例えば、偽型AAVベクターは、ゲノムが、AAV2血清型から得られ、カプシドが、AAV1、3、4、5、6、7、8、9、10(例えばカニクイザルAAV10又はAAVrh10)、11、12血清型又はAAVバリアントから得られるベクターでありうる。加えて、AAVベクターのゲノムは、一本鎖又は自己相補的な二本鎖ゲノムのいずれであってもよい(McCartyら、2001年)。自己相補的な二本鎖AAVベクターは、AAV末端反復の一方から末端分離部位(trs)を欠失させることよって生成される。複製するゲノムが野生型AAVゲノムの半分の長さであるこれらの修飾されたベクターは、DNA二量体をパッケージングする傾向がある。

好ましくは、本発明の実施において実行されるAAVベクターは、CNSニューロン(脳、脳幹及び脊髄における運動ニューロン並びにグリア細胞を含める)及び筋細胞を標的するベクターである(Ilievaら、2009年)。血清型2は、遺伝子送達用の組換えベクターへと修飾された最初のものなので、最もよく知られ研究されているAAVは血清型2であり、実際に、これら天然の血清型のカプシドを操作して特性を増強させた新規のAAVカプシドを生成することができる。rAAV1、AAV5、AAV9及びAAVrh.10のような他の血清型は、高い形質導入効率を示し、CNSにおいてAAV2より広く伝播する(Devermanら、2018年; Tanguyら、2015年)。これら血清型は、rAAV6、7、8と共に、効率的な筋肉形質導入も示した(Wangら、2014年; Zincarelliら、2008年)。興味深いことに、2017年に、Ai Jらは、腹膜内投与後のrAAVrh.10の優れた筋肉形質導入を示した(Aiら、2017年)。近年、新しく再操作されたAAVカプシド、AAV-AS、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB及びAAV-Fが、静脈内投与よって高効率でCNS形質導入されることが示された(Chanら、2017年; Choudhuryら、2016年; Devermanら、2016年; Hanlonら、2019年)。好ましい実施形態において、AAVベクターは、AAV1、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh39、AAVrh43、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9又はAAV10カプシドを有し、このベクターは、任意選択で偽型である。特定の実施形態において、AAVベクターは、AAV9又はAAV10(例えばカニクイザルAAV10又はAAVrh10)カプシドを有し、任意選択で偽型である。特定の実施形態において、AAVベクターは、Nonnenmacherら、2020年に記載のカプシドバリアント9P03、9P08、9P09、9P13、9P16、9P31、9P32、9P33、9P36又は9P39等、Nonnenmacherら、2020年に記載のカプシドを有する。

特定の実施形態において、ASは、U1、U2、U6、U7等の核内低分子RNA分子若しくは他の任意の核内低分子RNA又はキメラ核内低分子RNAと組み合わせてベクターにコードされる(Cazzellaら、2012年; De Angelisら、2002年、Donadonら、2019年; Imbertら、2017年)。U7修飾に関する情報は、Goyenvalleら(Goyenvalleら、2004年); WO11113889;及びWO06021724に特に見ることができる。特定の実施形態において、D. Schumperliによって記載されるU7カセットが、使用される(Schumperli及びPillai、2004年)。それは、天然のU7プロモーター(-267～+1位)、U7smOpt snRNA及び116位までの下流配列を含む。U7smOpt内のヒストンmRNA前駆体に相補的な18ntの天然の配列は、例えば、既に記載されているPCR媒介変異誘発法を使用して選択されたAS配列のうち1つ若しくは2つ(同じ配列が2回使用されるか又は2つの異なる配列のいずれか)又はより多くの反復によって置きかえられる(Goyenvalleら、2004年)。

特定の実施形態において、核内低分子RNA修飾されたAS、特にU7修飾されたASは、ウイルスベクター、特にAAVベクターにベクター化される。

一般に、ベクターは、例えばプロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位(IRES)、タンパク質形質導入ドメイン(PTD)をコードしている配列等、コードされているASの発現を可能にする調節配列を含みうる。この点で、ベクターは、コード配列に作動的に連結されて、ASの発現を引き起こす又は改善するプロモーター領域を最も好ましくは含む。そのようなプロモーターは、遍在的、組織特異的、強い、弱い、調節される、キメラ、等でもよく、ASの効率的且つ適切な産生を可能にする。プロモーターは、細胞性、ウイルス性、真菌性、植物性又は合成プロモーターであってもよい。本発明における使用のための最も好ましいプロモーターは、神経及び筋肉細胞、より好ましくは運動ニューロン及びグリア細胞において機能的である。プロモーターは、U1、U2、U6、U7若しくは他の核内低分子RNAプロモーター、又はキメラ核内低分子RNAプロモーター等の核内低分子RNAプロモーターから選択されてもよい。他の代表的なプロモーターには、H1プロモーター等のRNAポリメラーゼIII依存的プロモーター、又はRNAポリメラーゼII依存的プロモーターがある。調節されるプロモーターの例には、Tetオン/オフエレメント含有プロモーター、ラパマイシン誘導可能なプロモーター及びメタロチオネインプロモーターがあるがこれに限定されない。運動ニューロンに特異的なプロモーターの例には、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)又はホメオボックス9(HB9)のプロモーターがある。運動ニューロンに機能的な他のプロモーターには、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、シナプシンのプロモーター等のニューロン特異的、又はニューロン特異的サイレンサエレメント(NRSE)を含めた遍在的プロモーターがある。グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)のプロモーター等グリア細胞の特異的プロモーターも使用されうる。遍在的プロモーターの例には、ウイルスプロモーター、特にCMVプロモーター、RSVプロモーター、SV40プロモーター、ハイブリッドCBA(ニワトリベータアクチン/CMV)プロモーター、等及びPGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ)又はEF1アルファ(伸長因子1アルファ)プロモーター等の細胞性プロモーターがある。

組成物
本発明は、薬学的に許容可能な担体中にAS、核酸構築物又はそれを含むベクターを含む組成物にも関する。AS、核酸構築物又はベクターに加えて、本発明の医薬組成物は、生理食塩水、リン酸ナトリウム、等の薬学又は生理的に許容可能な担体も含みうる。組成物は、一般に液体形態になるが、必ずしもその必要はない。適切な担体、賦形剤及び希釈剤には、ラクトース、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、トラガカントゴム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水シロップ、メチルセルロース、メチル及びプロピルヒドロキシ安息香酸、鉱油、等がある。製剤は、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤、保存剤、緩衝剤、等を含むこともできる。特に、本発明は、ASの投与を含み、従って遺伝子治療とやや類似している。当業技術者は、核酸が、高頻度で、リポソーム形態で脂質(例えば陽イオン性脂質若しくは中性脂質、又はこれらの混合物)、又は他の適切なマイクロ若しくはナノ構造材料(例えばミセル、脂質複合体、デンドリマー、乳剤、立方相、等)と一緒にしばしば送達されることを認識することになる。

本発明の組成物は、腸内又は非経口経路、例えば静脈内(i.v.)、動脈内、皮下、筋肉内(i.m.)、大脳内、脳室内(i.c.v.)、硬膜下腔内(i.t.)、腹膜内(i.p.)、軟膜下、舌内、胸腔内、胸膜内、及びこれらと他の送達経路の組合せによって一般に投与される。例えば、吸入、鼻腔内、局所、経口、直腸、骨内、点眼、点耳投与、等による他の型の投与は、排除されない。

特定の実施形態において、WO2013/190059に記載の通り、本発明のAAVベクターは、患者の脳脊髄液(CSF)及び/又は血液中投与を組み合わせることよって投与される。本実施形態の特定のバリアントにおいて、哺乳動物のCSFへのウイルスベクターの投与は、脳室内(i.c.v.又はICV)注射、くも膜下腔内(i.t.又はIT)注射、又は大槽内注射によって実行され、血液への投与は、i.v.(又は、IV)注射、i.m.注射、動脈内注射、i.p.注射、皮下注射、真皮内注射、経鼻送達、経皮送達(例えばパッチ)等の非経口投与、又は腸内送達(口腔又は直腸)によって好ましくは実行される。特定の実施形態において、AAVベクターは、i.c.v.(又はi.t.)とi.v.(又はi.m.)両方の経路によって投与される。特定の実施形態において、ウイルスベクターの投与は、脳室内(i.c.v.又はICV)注射によって実行される。

注射可能な製剤、例えば、無菌の注射可能な水性又は油性懸濁剤は、適切な分散又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して公知の技術に従って処方されうる。無菌の注射可能な製剤は、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒、例えば、1,3-ブタンジオール、中の溶液である無菌の注射可能な液剤若しくは懸濁剤でありうる。送達は、局所的(即ち、in situで、筋組織等の組織に直接)又は全身的のいずれであってもよいが、通常、送達は、罹患した筋組織、例えば骨格筋、平滑筋、心筋、等への局所になる。投与されるASの形態及び標的される組織又は細胞型に応じて、エレクトロポレーション、ソノポレーション、「遺伝子銃」(核酸で被覆した金粒子を送達する)、等の技術が利用されうる。

投与されるべきAS、核酸構築物又はASを含有若しくは発現するベクターの量は、望まれない疾患病徴、特にALS病徴の回復を誘導するのに十分な量になることを当業者は認識することになる。そのような量は、患者の性別、年齢、体重、全体の身体的状態、等の因子に応じてとりわけ変動する場合があり、個別的原則で決定されてもよい。量は、治療プロトコルの他の成分(例えば他の医薬の投与、等)によっても変動しうる。一般に、適切な用量は、約1mg/kg～約100mg/kg、より通常には約2mg/kg/日～約10mg/kgの範囲である。ASのウイルスによる送達が選択される場合、適切な用量は、利用されるウイルス、送達経路(筋肉内、静脈内、動脈内、その他)等異なる因子によって決まることになるが、一般に10⁹～10¹⁵ウイルス粒子/kgの範囲でありうる。当業技術者は、そのようなパラメータが、臨床試験の間に通常算定されることを認識することになる。更に、当業技術者は、本明細書に記載される治療によって疾患病徴が完全に緩和される場合もあるが、そうである必要はないことを認識することになる。病徴の部分又は断続的な軽減でさえ、レシピエントにとっては大きな利益になる場合がある。加えて、患者の治療は、1回の事象(修飾されたAS又はAAVベクターによる)でもよく、又は患者は、得られる結果に応じて、数日間隔、数週間隔若しくは数カ月間隔若しくは更に数年間隔でありうる複数の機会でASを投与される。

本発明の方法は、いくつかの異なる方法のいずれかで実行されうる。例えば、本発明のASは、外来性の野生型C9orf72タンパク質、優先的にはヒトC9orf72タンパク質をコードしているベクターと一緒に投与されてもよい。ASは、膠細胞系由来神経栄養因子(GDNF)、インシュリン様成長因子1(IGF-1)、血管内皮成長因子(VEGF)、ニューレグリン1又はニュールツリン等の神経保護を誘導する神経栄養因子をコードしているベクターと一緒に投与されてもよい。異なる研究は、これら神経栄養因子のAAV媒介性発現が、SOD1マウスモデルにおいて疾患の発症を遅延させ、生存期間を延長することを示した(Azzouzら、2004年; Dodgeら、2008年、2010年; Kasparら、2003年; Leporeら、2007年; Grossら、2020年; Lasieneら、2016年)。更に、C9orf72 HRE RNAを減少させるための相補的な手法として、有用な治療戦略は下流の機序を標的する場合がある。ASは、C9orf72患者に包含されて存在するTAR DNA結合タンパク質43(TDP43)を標的する抗体及び/又はGA若しくはGP RANタンパク質のようなジペプチド反復タンパク質を標的する抗体と組み合わせて投与されてもよい。

また、ASは、C9orf72反復RNAの二次構造を標的する又は病理学的C9orf72反復転写産物の核外輸送を阻害する小分子と組み合わせて投与されてもよい。異なるグループは、おそらく、捕捉されたRNA結合タンパク質の放出及び/又はDPRの翻訳の遮断によって病理学的欠損の救済を誘導するC9orf72のG-4重構造を標的する小分子を開発しようと試みた(Alnissら、2018年; Simoneら、2018年; Suら、2014年; Yangら、2015年; Zamiriら、2014年)。2017年に、Hautbergueらは、ショウジョウバエ、患者由来ニューロン及び神経細胞モデルにおいてセリン/アルギニンリッチスプライシング因子1(SRSF1)様の核外輸送アダプターの枯渇が、いかにして病理学的C9orf72転写産物の核外輸送及びジペプチド反復タンパク質の産生を阻害し、神経毒性を軽減するかを実証した(Hautbergueら、2017年)。本発明のASと、これら手法のいずれか、特に外来性C9タンパク質、DPR又はTDP43に対する抗体、G-4重C9構造に対する小分子、核外輸送の阻害とを組み合わせて治療効率を改善し、C9orf72-ALSの異なる特質を標的することができる。

更なる態様において、本発明は:
- 上記のような、本発明のAS、核酸構築物又は前記AS若しくは前記核酸構築物をコードしているベクター;及び
- 同時、別々又は逐次使用のための野生型C9orf72タンパク質(野生型ヒトC9orf72タンパク質等)をコードしているベクター
を含むキットオブパーツに関する。

使用
本発明は、C9orf72関連疾患、特にC9orf72 HRE関連疾患の治療における使用のための上記アンチセンス配列、核酸構築物又はベクターにも関する。

C9orf72関連疾患には、神経変性疾患がある。特定の実施形態において、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)又は前頭側頭型認知症(FTD)でありうる。特定の実施形態において、疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)である。別の特定の実施形態において、治療されるべき対象は、ALS及びFTDを有する。特定の実施形態において、神経変性疾患は、家族性又は散発性でありうる。

本明細書では、用語「治療」又は「療法」は、治癒的及び/又は予防的治療を含む。より具体的には、治癒的治療とは、病徴の緩和、回復及び/若しくは除去、減少及び/又は安定化(例えば、より進んだ段階へ進行しない)のいずれか、並びに特定の障害の病徴の進行の遅延のことを指す。予防的治療とは:所与の障害に対する発病の停止、発病の遅延、進展の減少、進展の危険性の減少、発生率の減少、重症度の減少、並びに病徴の発病までの時間及び生存率の増大のいずれかを指す。

従って、それを必要とする対象においてALS又はFTD等のC9orf72関連疾患を治療する方法について記載され、その方法は、本発明の核酸分子、核酸構築物又はベクターを前記患者に投与する工程を含む。本発明の文脈の中で、「対象」又は「患者」は、年齢若しくは性別に関わらずALS又はFTD等のC9orf72関連疾患を患っている哺乳動物、特にヒトを意味する。用語は、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ラット及びマウス等の家畜並びに一般的な実験哺乳動物を特に含む。好ましくは、治療すべき患者は、ヒトである。

本発明の更なる態様及び優位性は、以下の実験の項において開示されることになるが、これは単なる例示であり、本出願の範囲を限定しないものとする。

材料及び方法
U7-ASを発現するAAV及びレンチウイルスプラスミドの作製
既に記載されている通り(Goyenvalleら、2004年)、AS配列を、PCR媒介変異誘発法を使用して、AS-SOD1をAS-C9と置きかえることによって(Biferiら、2017年)に記載されている自己相補的pAAV-U7-SOD1プラスミドにクローニングした。レンチウイルスベクターを作製するために、U7-ASインサートを、EcoRV切断部位を保有するU7-AS-C9の5'及び3'配列に特異的なプライマー(フォワード: 5'-GGGGATATCTAACAACATAGGAGCTGTGA-3'、リバース: 5'-GGGGATATCCACATACGCGTTTCCTAGGA-3')を使用して、U7-AS-C9配列を発現するpAAVからPCRによって増幅した。U7-AS構築物を、pRRLSIN.cPPT.PGKGFP.WPRE(Addgene)のEcoRV部位にクローニングした。

細胞培養及びウイルス感染
C9-ALS患者(ALS-1及びALS-2)及び健康な対照者(CTRL-1及びCTRL-2)から得た初代真皮線維芽細胞は、D. Bohl(Brain and Spine Institute、ICM、パリ、フランス)によって提供された。CTRL-1は、33歳の男性、CTRL-2は、69歳の女性であり; ALS-1及びALS-2細胞は、C9遺伝子内に60個より多いHREを発現している男性2名から得られた。初代線維芽細胞を、Myoline施設(Dr. Bigot、Center of Research in Myology、パリ、フランス)によって確立されたプロトコル(Chaouchら、2009年)を使用して不死化した。不死化線維芽細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン及び1%非必須アミノ酸を含有するピルビン酸塩を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で、5% CO2、37℃で培養した。HEK-293T細胞を、10% FBSで補充したピルビン酸塩を含まないDMEM中で成長させ、レンチウイルス作製に使用した。U7-AS-C9を保有するレンチウイルスを作製するために、100mmプレート当たり5×10⁶個の細胞を平板培養し、翌日リポフェクタミン2000試薬を使用してレンチウイルス構築物プラスミド及びパッケージング混合物プラスミド[pMD2.G、pMDLg/RRE及びpRSVRev(Addgene)]でトランスフェクトした。ウイルス粒子を、48時間及び72時間後に上清から採集し、不死化線維芽細胞を形質導入するために使用した。

ウイルス形質導入
不死化線維芽細胞を、RNA FISH実験のためにI型コラーゲンRat Tail(A10483-01、Life Technologies)で前処理した直径12mmのスライド/ウェルを含有する24ウェルプレートに8×10⁴個細胞/ウェルで、又はウエスタンブロット分析のために10mmディッシュ中に2.4×10⁶個細胞の密度で平板培養した。細胞を、レンチウイルスベクター及び2μg/mLポリブレンで翌日にトランスフェクトした。37℃で5時間後に、完全培地の半分を添加することによってトランスフェクションを停止させた。翌日、細胞を、0.1% FBS、1% P/S及び1% NEAAを含むDMEM中で静止させた。その翌日、24ウェルプレート中の細胞を、RNA FISH分析のために2%ホルムアルデヒドで固定した。10mmディッシュから細胞ペレットを、細胞を4℃で5分間、3000rpmで2回遠心分離することによって採取し、-80℃で貯蔵した。ウイルス発現をGFPの免疫蛍光分析によって監視した。

RNA-FISH
細胞を、2%ホルムアルデヒド中で、4℃で30分間固定し、1×PBS中の0.4% TRITON X-100(Biorad社)、2mMバナジルリボヌクレオシド複合体溶液(Vanadyl、Sigma、94742-10ML)を用いてRTで10分間透過化した。細胞を、1×PBS中で、RTで5分間、2回及び2×生理食塩水-クエン酸ナトリウム緩衝液(SSC、Invitrogen社 15557-044)で、RTで10分間、2回洗浄した。細胞を、プレハイブリダイゼーション緩衝液[DEPC H2O中に40%ホルムアミド(Life Technologies社、AM9342)、2×SSC、0.2% UltraPureウシ血清アルブミン(BSA、Life Technologies社、AM2618)、0.2mg/μL酵母tRNA(Life Technologies社、15401029)、2mMバナジル]と55℃で30分間次いでインキュベートした。同時に、センス及びアンチセンスRNAヘキサヌクレオチド反復に対する2つのLNAプローブ[TYE-563-LNA(CCCCGG)3CC及び(GGGGCC)3GGプローブ、Qiagen社]を変性させ(100℃で10分間)、次いで終濃度40nMでプレハイブリダイゼーション緩衝液に添加した。ハイブリダイゼーションを、55℃で2時間30分間又は終夜実行し、続いてポストハイブリダイゼーション緩衝液(DEPC H2O中の40%ホルムアミド、0.5×SSC)により55℃で長さ30分間、2回洗浄し、0.5×SSCを用いてRTで10分間、2回及び1×PBSを用いてRTで5分間、2回洗浄した。核を、DAPI(Sigma-Aldrich社)で可視化した。試料を、スピニングディスク型共焦点顕微鏡、Nikon Ti2で調べた。細胞のスコア化を、公有ソフトウェアImageJを使用して実施した。

全細胞抽出物及びウエスタンブロット解析
細胞ペレットを、1mM PMSF及びプロテアーゼ阻害剤カクテル(Complete Mini、Roche Diagnostics社)で補充したNP40溶解緩衝液(FNN0021、Invitrogen社、ThermoFicher Scientific社)中に溶解した。20μgを、12%ポリアクリルアミドゲル(Criterion XT 10%ビストリス、Biorad社)で分離した。ウエスタンブロットを、以下の抗体: Charlet-Berguerand博士(Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology、IGBMC、ストラスブール、フランス)によって生成され、好意で提供されたマウスモノクローナル抗体(クローン2E1)抗C9orf72、及び抗ビンキュリン(V9131 Sigma Aldrich社)を使用して実施した。ビンキュリンを検出するためのホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヒツジ抗マウスをAmersham Pharmacia Biotech社から購入し、抗C9orf72に対する二次抗体としてペルオキシダーゼAffiniPureヤギ抗マウスIgG軽鎖特異的抗体(115-035-174、Jackson ImmunoResearch社)を購入した。ウエスタンブロットを、SuperSignal West Duraキット(Thermoscientific社)を使用して現像した。バンドの画像化及び定量化を、ImageLab 4.0ソフトウェアを使用してChemiDoc Western Blot Imaging Systemによって実施した。

C9orf72マウスにおけるAAV作製及び注射
U7-ASを発現する自己相補的なAAVrh10ベクターを、Biferiら2017年に記載されているプロトコルに従ってHEK-293T細胞における一過性トランスフェクションによって作製した。各作製を、リアルタイムqPCRによって定量化し、ベクター力価を、ウイルスゲノム(vg)/mLとして表した。500個の反復を含むヒトC9 BACを保有するC9orf72マウスを、Jackson Laboratory社(JAX stock #029099)から購入した。動物を、実験動物の管理及び使用に関する欧州規則に従って維持した。実験プロトコルは、動物実験に関するチャールズダーウィンN.5倫理委員会によって承認された。マウスを、EOPS健康状態(特定病原体を含まない)のA1施設で、自動配水及び常時利用可能な飼料のある密閉型個別換気ケージ内で飼育した。ヘミ接合性後代(C9orf72キャリア)を、キャリア雄と非キャリア雌との育種によって得た。

AAV注射
C9orf72キャリアの雌(病理学的表現型を有すると報告されている、Liuら、2016年)のみを、これまでに記載されているように出生時にAAVrh10ベクターで脳室内(ICV)注射した(Biferiら、2017年及びBesseら、2020年)。用量2.2e14 VG/Kgで、マウス4匹を対照AAV(AAV-U7-CTRL)で注射し、6匹を治療的構築物(AAV-U7-AS-6又はAAV-U7-AS-9)で注射した。処置3カ月後にマウスを屠殺し、C9転写産物レベルについてその後分析した。

マウス組織からのRNA抽出
C9orf72 mRNA発現レベルを分析するために、月齢3カ月でマウス頸髄を液体窒素中で急速凍結させた。試料を-80℃で貯蔵し、その後専用ビーズを含有するすぐに使える2mL管(RNase/FNase不含Lysing Matrix D管、mpbio社、USA)中でTrizol試薬(Life Technologies社によるAmbion社)を使用して、FastPrepデバイス中で、速度5で30秒間個々に溶解させた。溶解物を、次いで室温(RT)で5分間インキュベートし、頻繁にボルテックスして溶解過程を続けた。管当たりクロロホルム200μLを添加し、次いで試料を15秒間ボルテックスし、RTで1分間インキュベートした。次いで溶解物を、4℃で、15000gで10分間遠心分離した。RNAを含有する上清画分を新しい管に収集し、RNAを製造業者のプロトコルに従ってRNeasy Mini Kit(Qiagen社)を使用して精製した。RNAを水に溶出させ、Nanodropを使用して定量化した。

逆転写及び定量的PCR
cDNAを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(ThermoFisher Scientific社のApplied Biosystems社)を使用して、製造業者の指示に従ってRNA 1000ngから合成した。cDNAを、RNase不含の水に希釈した。cDNA(50ng)を、Taqman Universal PCR Master Mix II 2×(Applied Biosystem社)10μL、プローブ及び各C9転写産物バリアント(V1、V2及びV3)に特異的なプライマーと混合した。V1及びV3に対するプライマー及び6-カルボキシフルオレセイン(FAM)プローブを、Applied Biosystem社(それぞれ、NM_145005.5-Hs00331877及びNM_001256054.1-Hs00948764)によって購入し、一方、V2用としてそれらを特別に注文した(フォワード: 5'-CGGTGGCGAGTGGATATCTC-3'、リバース: 5'-TGGGCAAAGAGTCGACATCA-3'、FAMプローブ: 5'-TAATGTGACAGTTGGAATGC-3')。マウスヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)(Taqman遺伝子発現アッセイMm00446968_m1、Life Technologies社)遺伝子に対する2'-クロロ-7'-フェニル-1,4-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(VIC)プローブを、内在性対照として使用した。各試料を、96ウェルプレート中に3つ組でロードした。熱サイクル条件は: StepOne Plus Real Time PCR System (Applied Biosystems社)において55℃で2分間、95℃で3分間、その後95℃で30秒間及び60℃で30秒間を40サイクルであった。各転写産物バリアントの相対量を、対照試料と比較して各試料の標的遺伝子転写産物のPCRシグナル(内在性対照に対して標準化した)を考慮して、ΔCt/ΔCt法を使用して算出した。qPCR分析を、StepOneソフトウェアv2.3(Life Technologies社)で実行した。

結果
U7-ASウイルスベクターの設計及び作製
疾患に関連した病理学的機序(タンパク質消失、RNA凝集体及び/又はDPRの蓄積)を解決する目的で、以下の表に記載の通り長さ40ヌクレオチド(nt)のAS配列を8個設計した:

アンチセンスC9転写産物前駆体のエクソン1a(AS1)及びイントロン1(AS2)のそれぞれの推定スプライシングサイレンサ領域を標的するようにAS配列を2つ設計した。別の配列(潜在的スプライシングサイレンサ領域を含有する)をイントロン1内のHREの上流に配置し、アンチセンス(AS3)又はセンス転写産物前駆体(AS4)に対して指向した。HREの5'領域及びHREの部分の中を網羅するAS配列も調製した(他のG4C2含有遺伝子の標的化を回避するため)。このASは、アンチセンス(AS5)又はセンス(AS6)転写産物前駆体に対して指向した。図1に概略的に表す通り、別のASをHREの3'領域に配置した(それぞれアンチセンス及びセンスに対してAS7及びAS8)。アンチセンス(AS3)及びセンス(AS6)転写産物を標的する2つのAS配列を組み合わせた1つの二重構築物[AS9と呼ぶ、Table 2(表2)に示す配列番号17]も設計した。更に、単一のAS対照配列及び既に記載されている対照配列を保有する二重ASを設計した(Biferi, M. G.ら、2017年)。

AS配列を、in vivo送達のためにそれを保護するためだけでなく、プロセッシング前にmRNA前駆体レベルで合体させるために、U7核内低分子RNA(配列番号9～17)と融合した。これらU7-ASを、緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を発現するpRRL第3世代レンチウイルス骨格内、及びAAVプラスミド(pAAV)のITR同士の間にクローニングするための制限酵素部位を保有する特異的プライマーを使用してPCR媒介変異誘発法によって作製した(図2)。Dullら、1998年及びBiferiら、2017年にそれぞれ記載の通り、レンチウイルス及びAAV粒子を作製した。

患者由来線維芽細胞におけるRNA凝集体の分析
C9変異のある患者2名(ALS-1及びALS-2)及び健康な対照者2名(CTRL-1及びCTRL-2)由来の不死化初代線維芽細胞を使用して、in vitroで構築を試験した。C9-ALSのin vitroモデルを特徴付けるために異なる分析を実行して、疾患の主要な特質を検出した。第1に、不死化初代線維芽細胞中の凝集体の存在を分析した。RNA蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)分析を実行した。患者1由来線維芽細胞において、センスRNA凝集体を含む細胞が20%及びアンチセンスRNA凝集体を含む細胞が25%検出され(ALS1、n≧3)、患者2由来線維芽細胞において、センスRNA凝集体を含む細胞が30%及びアンチセンスRNA凝集体を含む細胞が35%検出された(ALS2、n≧3) (図3)。それに対し、両方の対照線維芽細胞(CTRL-1及びCTRL-2)において、センス又はアンチセンス凝集体は全く検出されなかった(図3)。これら細胞の特徴付けを完了するために、C9タンパク質の発現を、モノクローナル抗体(クローン2E1)を使用するウエスタンブロットによって不死化線維芽細胞において評価した。健康な対照者2名の細胞と比較して、C9タンパク質のより低い発現が、C9-ALS1又はC9-ALS2線維芽細胞において観察された(図5A)。

患者由来線維芽細胞におけるセンス及びアンチセンスRNA凝集体に対する治療的効果
U7-AS配列の治療的効果をin vitroで試験するために、ALS-2線維芽細胞を、異なるU7-ASを発現するレンチウイルスベクターで形質導入した。各レンチウイルスベクターの形質導入有効性を、GFP陽性細胞を計数することによって評価した。各実験において形質導入された細胞のパーセンテージは、約80%であった。RNA-FISHを次いで実行して、これらASがセンス及びアンチセンス凝集体の蓄積を改変する効果を検出した。1つ又は複数のRNA凝集体を有する細胞数を計数し、合計細胞数と比較した。この分析を、各条件について少なくとも3つ組で実行し、300個細胞/画像の平均を計数した。凝集体形成を防止するAS配列の能力を、Lenti-AS-C9又はLenti-AS-CTRLによる処置後に凝集体を示す細胞のパーセンテージを比較することによって決定した。

対照と比較して、治療的ベクターで形質導入した患者由来細胞ではベクターに含まれるASに応じてセンス又はアンチセンス凝集体の数にそれぞれ最大66%若しくは55%の減少が観察された(図4)。結果は、特にLenti-AS-3により、ALS-2細胞におけるセンス凝集体の有意な低下を示した(最高66%)。また、アンチセンスRNA凝集体を分析し、対照処置細胞と比較して、Lenti-AS-1、Lenti-AS-2、Lenti-AS-4及びLenti-AS-6が、アンチセンスRNA凝集体のそれぞれ44%、50%、42%及び55%の減少を有意に媒介できることを示した(図4)。Lenti-AS-7及びLenti-AS-8は、RNA凝集体の減少に有効ではなく、このことは、反復の上流の配列を標的することが、より有望であることを示唆している。

患者由来線維芽細胞のC9orf72タンパク質レベルに対する治療的効果
異なるASを保有するレンチウイルスで形質導入したALS-2線維芽細胞を更に分析して、C9タンパク質の発現に対するAS処置の効果を評価した。図5B及び図5Cに示すように、ASによる処置は、C9orf72タンパク質レベルにおいてどんな有意な変化も誘導しなかった。

C9マウスモデルにおけるC9orf72転写産物バリアントに対する治療的効果
in vivoでの治療的効果を試験するために、C9雌マウスに対照ベクター(AAV-U7-CTRL)又は2つの治療的構築物を出生時にICV注射によって注射した。マウスを月齢3カ月で屠殺した。頸髄におけるC9アイソフォームの発現レベルに対する遺伝子治療手法の効果を、RT-qPCRによって分析した。注射していない(NI)又は対照で処置したtpマウスと比較して、反復を保有する転写産物バリアントV1及びV3の有意な減少が、AAV-U7-AS-6若しくはAAV-U7-AS-9による処置後のキャリアC9マウスにおいて観察された。重要なことに、V2 mRNA発現レベルに対してAAV-U7-AS構築物の有意な影響は、観察されなかった(図6C)。この結果は、遺伝子治療手法が、非病理学的V2 mRNAの転写を維持できることを示しており、線維芽細胞において観察されるタンパク質レベルに対する効果が確認された。

結論
本研究の全体の目的は、C9orf72遺伝子内のHREによって引き起こされるALSの最も一般的な遺伝的形態の効率的な遺伝子治療手法を開発することである。AS配列は、C9転写産物上の特異的領域を標的して、RNA凝集体の形成、DPRにおける翻訳を減少させ及び/又はC9転写レベルを維持するように設計された。本手法は、成熟mRNAの破壊を誘導し、C9-ALSにおいて観察されるハプロ不全を潜在的に悪化させる可能性があるRNAiの使用に対して優位性を表す。

AS配列を発現するレンチウイルスベクターの治療的効果を、不死化線維芽細胞において試験した。AS-1、AS-2、AS-3、AS-4、AS-5及びAS-6配列は、センスRNA凝集体のレベルを減少させることができ(AS-3で最高66%)、またAS-1、AS-2、AS-4及びAS-6は、アンチセンス凝集体を有意に減少させることができた(AS-6で最高55%)。これまでに公開されたどの研究も、ASを使用してセンスとアンチセンス両方の凝集体を減少させることを示さなかった。これらの結果を総合すると、本手法が、患者由来細胞においてセンス及びアンチセンス凝集体の減少においてどれ程効率的かが実証された。ASが、センスとアンチセンス両方の凝集体を防止できたという事実は、本手法が、in vivoで治療的効果の増強をもたらす可能性があることを示唆する。このことは、V1転写産物(AS-6及びAS-9でそれぞれ44%及び55%)及びV3転写産物(AS-6及びAS-9でそれぞれ82%及び87%)の減少を示すC9マウスにおいて得られる結果によって確認される。

更に、RNA凝集体に対する効果にもかかわらず、in vitroで示した通り、AS配列は、C9タンパク質レベルを減少させない。加えてAS配列は、in vivoで非病理学的転写産物バリアント(V2)のレベルを減少させない。これは、本手法が、疾患の原因である機能の獲得と消失両方の病理学的機序を解決することを示唆するものである。

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Claims (17)

1. C9orf72転写産物を標的するアンチセンス核酸分子であって、センスC9orf72-RNA凝集体及びアンチセンスC9orf72-RNA凝集体のレベルを減少させることができる、アンチセンス核酸分子。
2. 配列番号1、配列番号2、配列番号4又は配列番号6を含む、請求項1に記載のアンチセンス核酸分子。
3. 配列番号1、配列番号2、配列番号4又は配列番号6で構成される、請求項1又は2に記載のアンチセンス核酸分子。
4. C9orf72転写産物を標的するアンチセンス核酸分子であって、配列番号3に示す配列を含む又はそれで構成される、アンチセンス核酸分子。
5. C9orf72転写産物を標的するアンチセンス核酸分子であって、配列番号5に示す配列を含む又はそれで構成される、アンチセンス核酸分子。
6. C9orf72転写産物を標的するアンチセンス核酸分子であって、配列番号21に示す配列を含む又はそれで構成される、アンチセンス核酸分子。
7. C9orf72転写産物を標的するアンチセンス核酸分子であって、配列番号22に示す配列を含む又はそれで構成される、アンチセンス核酸分子。
8. U7核内低分子RNA等の核内低分子RNAに融合される、請求項1から5のいずれか一項に記載のアンチセンス核酸分子。
9. 請求項1から8のいずれか一項に記載のアンチセンス核酸分子を少なくとも2つ含む、核酸構築物。
10. センスC9orf72転写産物を標的する第1のアンチセンス核酸分子及びアンチセンスC9orf72転写産物を標的する第2のアンチセンス核酸分子を含む、請求項9に記載の核酸構築物。
11. 前記第1のアンチセンス核酸分子が、配列番号6に示す配列を含む又はそれからなり、前記第2のアンチセンス核酸分子が、配列番号3に示す配列を含む又はそれからなる、請求項10に記載の核酸構築物。
12. 請求項1から8のいずれか一項に記載のアンチセンス核酸分子又は請求項9から11のいずれか一項に記載の核酸構築物を送達するためのベクター。
13. 前記アンチセンス核酸分子又は前記核酸構築物をコードするウイルスベクターである、請求項12に記載のベクター。
14. 前記ウイルスベクターが、AAVベクター、特にAAV9又はAAV10ベクターである、請求項13に記載のベクター。
15. C9orf72関連疾患、特にC9orf72ヘキサヌクレオチド反復伸長関連疾患の治療における使用のための、請求項1から8のいずれか一項に記載のアンチセンス核酸分子、請求項9から11に記載の核酸構築物又は請求項12から14のいずれか一項に記載のベクター。
16. 疾患が、筋萎縮性側索硬化症(ALS)又は前頭側頭型認知症(FTD)、特に筋萎縮性側索硬化症(ALS)である、請求項15に規定の使用のための請求項1から8のいずれか一項に記載のアンチセンス核酸分子、請求項9から11に記載の核酸構築物又は請求項12から14のいずれか一項に記載のベクター。
17. 前記アンチセンス核酸分子又は前記ベクターが、静脈内及び/又は脳室内経路による投与用である、請求項1から8のいずれか一項に記載のアンチセンス核酸分子、請求項9から11に記載の核酸構築物又は請求項12から14のいずれか一項に記載のベクター。

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