JP2021534794A - 変異型ｇａｒｓタンパク質の発現を阻害するための生成物および方法 - Google Patents

Abstract

変異型グリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧＡＲＳ）遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡ干渉ベースの方法および生成物を提供する。組換えアデノ随伴ウイルスなどの送達媒体は、ＧＡＲＳマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡ、およびマイクロＲＮＡによるノックダウンに耐性のある置換ＧＡＲＳ遺伝子を送達する。この方法は、シャルコー・マリー・トゥース病２Ｄ型（ＣＭＴ２Ｄ）を含むがこれらに限定されない、変異型ＧＡＲＳに関連する疾患または障害の処置に適用される。

Description

変異型グリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧＡＲＳ）遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡ干渉ベースの方法および生成物を提供する。組換えアデノ随伴ウイルスなどの送達媒体は、ＧＡＲＳマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡ、およびマイクロＲＮＡによるノックダウンに耐性のある置換ＧＡＲＳ遺伝子を送達する。この方法は、シャルコー・マリー・トゥース病２Ｄ型（ＣＭＴ２Ｄ）の処置に応用されている。

配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：２０１９年８月２９日に作成された５３２８４Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、６４，９３７バイト、ＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

遠位脊髄性筋萎縮症Ｖ（ｄＳＭＡＶ）としても知られるＣＭＴ２Ｄは、グリシル−ｔＲＮＡシンテターゼをコードする必須のハウスキーピング遺伝子であるＧＡＲＳ優性変異によって引き起こされる、まれで進行性の遺伝性軸索ニューロパチーである［Ａｎｔｏｎｅｌｌｉｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、７２：１２９３−１２９９（２００３年）］。ＣＭＴ２Ｄまたは他の８０を超える遺伝性末梢性ニューロパチーの遺伝的形態の処置法はない。現在までに、ＧＡＲＳの少なくとも１２の個々の変異が、ＣＭＴ２Ｄの患者で同定されており、そのすべてが、グリシル−ｔＲＮＡシンテターゼの異なる機能ドメインで単一アミノ酸の変化をもたらしている［Ａｎｔｏｎｅｌｌｉｓら、前出、ＡｂｅおよびＨｙａｓａｋａ、Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、５４：３１０−３１２（２００９年）、Ｊａｍｅｓら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、６７：１７１０−１７１２（２００６年）、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．、１７：４１８−４２１（２０１２）、Ｒｏｈｋａｍｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．、２６３：１００−１０６（２００７年））。ＧＡＲＳの疾患関連変異はすべて、タンパク質全体に分布するフレーム内のアミノ酸の変化または小さな内部欠失である。しかし、ＧＡＲＳの変異型が軸索変性を引き起こすメカニズムは不明なままであり、標的小分子療法の開発を制限している。

これまでに研究されたすべての疾患関連ＧＡＲＳ変異は、インビトロでグリシンをｔＲＮＡ^Ｇｌｙにチャージする際の酵素活性の障害、および／または酵母相補性アッセイでの細胞生存率の低下を引き起こし、機能喪失効果と一致する。しかし、マウスおよびヒトのタンパク質ヌル対立遺伝子は、ドミナントニューロパチーを引き起こさず、ハプロ不全を除外し、ドミナントネガティブ（アンチモルフ）メカニズムを示唆している。さらに、野生型ＧＡＲＳのトランスジェニック過剰発現は、マウスモデルのニューロパチーを救うことはなく、ＧＡＲＳの変異型は、野生型タンパク質が打ち負かすことのできない毒性機能獲得（ネオモルフ）活性をとることを示唆している。提案された新形態のメカニズムの１つは、変異型ＧＡＲＳの発生受容体ニューロピリン１（ＮＲＰ１）への異常な結合を含む。この相互作用は、ＮＲＰ１の内因性リガンドである血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の正常な結合を妨害し、その神経栄養効果は、神経の発達と生存に重要である。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、研究者がさまざまな疾患の処置に適応するために取り組んできた真核細胞の遺伝子調節のメカニズムである。ＲＮＡｉは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）によって媒介される遺伝子発現の転写後制御を指す。ｍｉＲＮＡは、小さく（２１〜２５ヌクレオチド長）、配列相同性を共有し、同族のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と塩基対を形成する非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の相互作用は、細胞の遺伝子サイレンシング機構に、ｍＲＮＡの翻訳を妨げるように指示する。ＲＮＡｉ経路は、Ｄｕａｎ（Ｅｄ．）、Ｍｕｓｃｌｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙの第７章セクション７．３、シュプリンガー・サイエンス・アンド・ビジネス・メディア社（２０１０年）に要約されている。セクション７．４は、ドミナントな神経筋障害のＲＮＡｉの処置のための原理証明を実証するために、マウスにおけるＣＭＴ２ＤのＧＡＲＳのＲＮＡｉ療法を言及している。

自然のＲＮＡｉ経路の理解が深まるにつれて、研究者らは、疾患を処置するために、標的遺伝子の発現を調節するのに使用する人工ｍｉＲＮＡを設計した。上記のＤｕａｎのセクション７．４で説明されているように、人工ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡ発現カセットから転写することができる。標的遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡ配列は、細胞内でのｍｉＲＮＡのプロセシングを指示するために必要な配列と共に転写される。アデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターは、ｍｉＲＮＡを筋肉に送達するために使用されてきた。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長である。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ−１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ−２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４５：５５５−５６４（１９８３年）に提供されており、ＡＡＶ−３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ−４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ−５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ−６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており、ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８ゲノムの少なくとも部分は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供されており、ＡＡＶ−９ゲノムは、Ｇａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７８：６３８１〜６３８８（２００４年）に提供されており、ＡＡＶ−１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１３（１）：６７〜７６（２００６年）に提供されており、ＡＡＶ−１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３３０（２）：３７５〜３８３（２００４年）に提供されており、ＡＡＶ−１２ゲノムの部分は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＤＱ８１３６４７に提供されており、ＡＡＶ−１３ゲノムの部分は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＵ２８５５６２に提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，４３４，９２８号に提供されている。ＡＡＶ−Ｂ１ゲノムの配列は、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅ．，２４（７）：１２４７−１２５７（２０１６年）に提供されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、単一のＡＡＶイントロン（ヌクレオチド２１０７および２２２７で）の差次的スプライシングと相まって、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）の産生をもたらす。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５８：９７−１２９（１９９２年）において概説されている。

ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外因子）としてそれらの細胞の寿命にわたって本質的に存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成および組込みを指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、ゲノムの内部の約４．３ｋｂ（複製および構造カプシドタンパク質ｒｅｐ−ｃａｐをコードする）の一部またはすべてが、外来ＤＮＡで置換されてもよい。ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、イントランスで提供することができる。ＡＡＶの別の重要な特徴は、極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃〜６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥されてもよい。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性でない。
したがって、ＣＭＴ２Ｄの処置に対する当該技術分野における必要性が残っている。

Ａｎｔｏｎｅｌｌｉｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、７２：１２９３−１２９９（２００３年）

ＲＮＡｉは、優性遺伝性障害の効果的な長期処置として本明細書に記載されている。一例として、ＲＮＡｉ耐性置換遺伝子も送達しながら、関与する遺伝子の野生型および変異型の両方をノックダウンすることによって、優性遺伝性ニューロパチーまたは優性遺伝性運動ニューロン疾患を有する任意の患者を処置するための方法および生成物が提供される。

一例として、患者における変異型ＧＡＲＳ遺伝子および野生型ＧＡＲＳ遺伝子の発現をノックダウンするための方法および生成物が本明細書に記載されている。この方法では、ＲＮＡｉを利用して発現をノックダウンする。この方法はまた、ＲＮＡｉ耐性の置換ＧＡＲＳ遺伝子を提供する。この方法および生成物の使用は、例えば、ＣＭＴ２Ｄの予防または処置において示される。

この方法は、野生型および変異型ＧＡＲＳ遺伝子の両方の発現をノックダウンする抑制性ＲＮＡを提供する。意図されるＧＡＲＳ阻害性ＲＮＡとしては、アンチセンスＲＮＡ、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、または野生型および変異型ＧＡＲＳ遺伝子の発現を阻害する人工マイクロＲＮＡ（ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。

ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡ、ならびに１つまたは複数のＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの態様では、本開示は、配列番号１〜５０のいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＲＮＡコードヌクレオチド配列およびガイド鎖コードヌクレオチド配列を含む核酸を含む。

例示的なＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡは、配列番号１〜２５のいずれか１つに示される全長ｍｉＲＮＡアンチセンスガイド鎖、または配列番号１〜２５のいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を含むその変異体を含む。対応する最終的なプロセシングされたガイド鎖配列は、それぞれ配列番号２６〜５０に示されるか、または配列番号２６〜５０のいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を含むその変異体である。アンチセンスガイド鎖は、最終的に配列特異的遺伝子サイレンシングに関与するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体のＲＮＡ成分となる成熟ｍｉＲＮＡ二本鎖の鎖である。上記のＤｕａｎのセクション７．３を参照する。

ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡは、ヒトＧＡＲＳ遺伝子によってコードされるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のセグメント（ヒトＧＡＲＳ ｃＤＮＡである配列番号６９によって表される）に特異的に結合することができ、セグメントは、野生型マウスＧＡＲＳ遺伝子（マウスＧＡＲＳ ｃＤＮＡである配列番号７０によって表される）によりコードされるｍＲＮＡに対して保存され、セグメントは、ＣＭＴ２Ｄに関連するアミノ酸変異を含む配列をコードしない。例えば、ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡは、配列番号６９のヌクレオチド１３６〜３２３、３２７〜３３９、５４４〜５９０、７２０〜７８５、９９６〜１４０６、１７３４〜１９１３または１９５０〜２１８７内の配列に相補的なｍＲＮＡセグメントに特異的に結合することができる。より具体的には、ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡは、配列番号６９のヌクレオチド９９６〜１４０６内の配列に相補的なｍＲＮＡセグメントに特異的に結合することができる。

ＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子が提供される。「ＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子」は、その発現が本明細書に記載のＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡによってノックダウンされないヌクレオチド配列を有するが、ヌクレオチド配列は、ｇｌｙｃｌ−ｔＲＮＡシンテターゼ活性を有するＧＡＲＳタンパク質を依然としてコードする。例示的なＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子は、配列番号５１〜５７に示されている。

ＧＡＲＳ阻害性ＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子をコードするＤＮＡの送達は、ＤＮＡを神経細胞に送達する送達媒体を使用して達成することができる。例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを使用して、ＧＡＲＳ阻害性ＲＮＡおよびＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子をコードするＤＮＡを送達することができる。他のベクター（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ウマ関連ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルスおよびワクシニアウイルスなどの他のウイルスベクター）を使用して、ＧＡＲＳ阻害性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを送達することもできる。したがって、１つまたは複数のＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子をコードするウイルスベクターも提供される。ウイルスベクターがｒＡＡＶの場合、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いている。ｒＡＡＶは、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶであってもよい。別の例として、脂質ナノ粒子などの非ウイルスベクターを送達に使用することができる。

本明細書において、それぞれがＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子をコードするｒＡＡＶが提供される。１つまたは複数のＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードするｒＡＡＶも提供される。１つまたは複数のＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードするｒＡＡＶ（一本鎖ゲノムを含む）は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードすることができるが、別のｒＡＡＶはＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子をコードする。１つまたは複数のＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードするｓｃＡＡＶは、１つ、２つ、３つ、または４つのＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードすることができるが、別のｒＡＡＶはＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子をコードする。ＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子を含むｒＡＡＶも本明細書で提供される。

本明細書に記載の核酸またはウイルスベクターを含む組成物が提供される。

細胞を、ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードする送達媒体（ｒＡＡＶなど）と接触させることを含む、細胞におけるＧＡＲＳ遺伝子の発現を防止または阻害する方法がさらに提供され、送達媒体がｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いている。この方法では、変異型ＧＡＲＳ対立遺伝子の発現は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％阻害される。この方法では、野生型ＧＡＲＳ対立遺伝子の発現は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％阻害される。

ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子をコードするＤＮＡをそれを必要とする動物に送達する方法がさらに提供され、ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子をコードするＤＮＡを含む送達媒体（ｒＡＡＶなど）を動物に投与することを含み、送達媒体がｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いている。ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子をコードするＤＮＡをそれを必要とする動物に送達する他の方法は、１つまたは複数のＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含む送達媒体（ｒＡＡＶなど）およびＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子を含む送達媒体（ｒＡＡＶなど）を動物に投与することを含み、送達媒体がｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いている。

ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子をコードするＤＮＡを含む送達媒体（ｒＡＡＶなど）を投与することを含む、ＣＭＴ２Ｄを予防または処置する方法も提供され、送達媒体がｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いている。ＣＭＴ２Ｄを予防または処置する他の方法は、１つまたは複数のＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含む送達媒体（ｒＡＡＶなど）およびＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子を含むｒＡＡＶを投与することを含み、送達媒体がｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いている。この方法により、非罹患個体における正常なＧＡＲＳグリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ発現の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％以上までのＧＡＲＳグリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ発現の回復をもたらす。

本開示は、配列番号１〜２５のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードする核酸、配列番号２６〜５０のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＧＡＲＳガイド鎖をコードする核酸、あるいは配列番号１〜２５のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードする核酸、および配列番号５１〜５７のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＲＮＡｉ耐性ＧＡＲＳ遺伝子を含む核酸とを含む核酸を提供する。

本開示は、本明細書に記載の核酸および／またはそれらのいずれか１つまたは複数の組み合わせを含むウイルスベクターを提供する。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または合成ウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様では、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）または自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、ＡＡＶ−ａｎｃ８０、およびＡＡＶ ｒｈ．７４である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ−９である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、偽型ＡＡＶである。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９である。いくつかの態様では、ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードする核酸の発現は、Ｕ６プロモーターの制御下にある。いくつかの態様では、ＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子の発現は、ニワトリβ−アクチンプロモーターの制御下にある。

本開示は、本明細書に記載の核酸および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に記載の核酸および／またはそれらのいずれか１つまたは複数の組み合わせを含むウイルスベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

本開示は、神経細胞に薬剤を送達することができる送達媒体、および（ａ）ＲＮＡｉ耐性ヒトＧＡＲＳ遺伝子を含む核酸、（ｂ）ｍｉＲＮＡをコードする核酸、ｍｉＲＮＡはヒトＧＡＲＳ遺伝子によってコードされるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のセグメントに結合し、セグメントは野生型マウスＧＡＲＳ遺伝子に対して保存され、セグメントはＣＭＴ２Ｄに関連する変異を含む配列をコードせず、または（ａ）および（ｂ）の核酸の組み合わせ、および場合により、薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、組成物中の核酸は、配列番号５１〜５７のいずれか１つの配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むポリヌクレオチドを含むＲＮＡｉ耐性ヒトＧＡＲＳ遺伝子を含む。いくつかの態様では、ヒトＧＡＲＳ遺伝子は、配列番号６９の配列、あるいは配列番号６９の配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様では、マウスＧＡＲＳ遺伝子は、配列番号７０の配列、あるいは配列番号７０の配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むその変異体を含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡセグメントは、配列番号６９の配列を含むヒトＧＡＲＳ遺伝子のヌクレオチド１３６〜３２３、３２７〜３３９、５４４〜５９０、７２０〜７８５、９９６〜１４０６、１７３４〜１９１３または１９５０〜２１８７内の配列に相補的である。いくつかの態様では、ｍＲＮＡセグメントは、配列番号６９のヌクレオチド９９６〜１４０６内の配列に相補的である。

いくつかの態様では、組成物中の送達媒体は、ウイルスベクターである。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または合成ウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様では、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）または自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、ＡＡＶ−ａｎｃ８０、およびＡＡＶ ｒｈ．７４からなる群から選択されるカプシド血清型であるか、またはそれを有する。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ−９のカプシド血清型であるか、またはそれを有する。いくつかの態様では、ＡＡＶは、偽型ＡＡＶである。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９である。いくつかの態様では、ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードする核酸の発現は、Ｕ６プロモーターの制御下にある。いくつかの態様では、ＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子の発現は、ニワトリβ−アクチンプロモーターの制御下にある。

本開示は、変異型ＧＡＲＳ遺伝子を含む神経細胞に送達する方法を提供し、この方法は、神経細胞に、（ａ）配列番号１〜２５のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードする核酸、配列番号２６〜５０のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＧＡＲＳガイド鎖をコードする核酸、あるいは配列番号１〜２５のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードする核酸、および配列番号５１〜５７のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＲＮＡｉ耐性ＧＡＲＳ遺伝子を含む核酸とを含む核酸（ｂ）本明細書に記載の核酸のいずれか１つまたは複数を含むベクター、あるいは（ｃ）本明細書に記載の核酸またはベクターのいずれか１つまたは複数を含む組成物を投与することを含む。

本開示は、変異型ＧＡＲＳ遺伝子に罹患する対象を処置する方法を提供し、この方法は、対象に、（ａ）配列番号１〜２５のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードする核酸、配列番号２６〜５０のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＧＡＲＳガイド鎖をコードする核酸、あるいは配列番号１〜２５のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードする核酸、および配列番号５１〜５７のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＲＮＡｉ耐性ＧＡＲＳ遺伝子を含む核酸とを含む核酸（ｂ）本明細書に記載の核酸のいずれか１つまたは複数を含むベクター、あるいは（ｃ）本明細書に記載の核酸またはベクターのいずれか１つまたは複数を含む組成物を投与することを含む。

いくつかの態様では、対象は、シャルコー・マリー・トゥース病２Ｄ型（ＣＭＴ２Ｄ）または遠位遺伝性運動ニューロパチーに罹患している。いくつかの態様では、神経細胞は、ヒト神経細胞である。いくつかの態様では、対象は、哺乳動物対象である。いくつかの態様では、対象は、ヒト対象である。

本開示はまた、変異型グリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧＡＲＳ）遺伝子に罹患している対象を処置するための医薬品の製造、または処置における、本明細書に記載の少なくとも１つの核酸、本明細書に記載の少なくとも１つのウイルスベクター、または本明細書に記載の組成物の使用を提供する。

本開示はまた、処置を必要としている対象におけるシャルコー・マリー・トゥース病２Ｄ型（ＣＭＴ２Ｄ）または遠位遺伝性運動ニューロパチーを処置するための医薬品の製造、または処置における、本明細書に記載の少なくとも１つの核酸、本明細書に記載の少なくとも１つのウイルスベクター、または本明細書に記載の組成物の使用を提供する。

本開示の他の特徴および利点は、以下の図面の説明および詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、図面、詳細な説明、および実施例は、開示された主題の実施形態を示しているが、図面、詳細な説明、および実施例から、本開示の精神および範囲内の様々な変更および修正が明らかになるので、例示としてのみ与えられることを理解されたい。

特許または出願ファイルには、カラーで作成された図面が少なくとも１つ含まれている。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、要請および必要な料金の支払いに応じて、米国特許商標庁により提供される。

図１Ａは、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異は、遺伝子発現に影響を与えないことを示している。 図１Ｂは、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異は、遺伝子発現に影響を与えないことを示している。 図１Ａは、ＲＮＡおよびｃＤＮＡライブラリーが、患者の線維芽細胞から生成されたことを示している。続いて、変異にわたるＲＴ−ＰＣＲ産物をディープシーケンシング分析に供した。ＧＡＲＳエクソン７−エクソン８接合部を表す図を示し、野生型（青色）および変異型（赤色）のＰＣＲ産物を示す。マップされた配列読み取りデータは、変異の影響を受けたヌクレオチドにわたっている場合、有益であると見なされた。有益な読み取りデータの５３．７パーセントは、野生型（ＷＴ）転写産物からのものであり、４６．３％は、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ転写産物からのものであった。図１Ｂは、ウエスタンブロットの結果を示している。ウエスタンブロット分析は、示されているように、抗ＧＡＲＳ遺伝子または抗アクチン抗体を使用して、罹患した（患者）および罹患していない（対照）個体からの線維芽細胞株由来の総タンパク質溶解物を用いて行った。サンプル名は上部にあり、タンパク質サイズマーカー（ｋＤａ）は左側に示されている。

図２Ａは、ＧＡＲＳ変異、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異のインビトロおよびインビボでの特徴付けを示している。 図２Ａは、ＧＡＲＳ変異、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異のインビトロおよびインビボでの特徴付けを示している。 図２Ａは、ＧＡＲＳ変異、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異のインビトロおよびインビボでの特徴付けを示している。 図２Ａは、ＧＡＲＳ変異、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異のインビトロおよびインビボでの特徴付けを示している。 図２Ａは、ＧＡＲＳ変異、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異のインビトロおよびインビボでの特徴付けを示している。 図２Ａは、ＧＡＲＳ変異、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異のインビトロおよびインビボでの特徴付けを示している。 図２Ａは、ＧＡＲＳ変異、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異のインビトロおよびインビボでの特徴付けを示している。 図２Ａは、ＧＡＲＳ変異、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異のインビトロおよびインビボでの特徴付けを示している。 図２Ａは、ＧＡＲＳ変異、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異のインビトロおよびインビボでの特徴付けを示している。 図２Ａは、ＧＡＲＳ変異、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異のインビトロおよびインビボでの特徴付けを示している。 図２Ａには、ΔＥＴＡＱ（赤色）とＰ２３４ＫＹ（緑色）のＧＡＲＳ変異の位置と進化的保存が、隣接するアミノ酸残基とともに示されている。図２Ｂは、ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスおよび同腹仔対照の体重が１２週目に測定されたことを示している。体重が２７．４±４．８４グラムであるＧＡＲＳ^{ｈｕＥｘ８／＋}対照（ｎ＝７）と比較して、ＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８）}マウスは大幅に軽量で、体重は１９±１．９グラム（ｐ＝０．０００６、ｎ＝８）であった。図２Ｃは、ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスの総運動能力が、ワイヤーハング試験を使用して定量化されたことを示している。手を放す前のＧＡＲＳ^{ｈｕＥｘ８／＋}マウスの平均は５５±９．５７秒であったが、ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウス（ｎ＝８）はわずか１７．３±１１．３秒後に落下した。図２Ｄは、大腿神経の運動分枝における軸索数が、同腹仔対照における５５１±４５軸索からＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}における４３８±９２軸索へと２１％減少したことを示している（ｎ＝６マウス／遺伝子型）。図２Ｅは、軸索の直径の累積ヒストグラムに示されているように、軸索径も小さくなっており（ｐ＝ｐ＜０．０００１、ＫＳ試験）、ＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８）}マウス（平均直径＝１．６±０．８μｍ、ｎ＝６）では、ＧＡＲＳ^{（＋／ｈｕＥｘ８）}同腹仔（３．３±２．１９８μｍ、ｎ＝６）と比較して、大直径の軸索が完全に欠如していた。図２Ｆは、これらの変化が神経断面の画像で明らかであることを示している。図２Ｇは、神経伝導速度（ＮＣＶ）が、同腹子対照における３５±６．２９ｍ／ｓから、ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスにおける１３．５±４．１ｍ／ｓへと有意に低下したことを示している（ｐ＝０．０００２、ｎ＝６ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}、ｎ＝７ＧＡＲＳ^{ｈｕＥｘ８／＋}）。図２Ｈは、足底筋からの神経筋接合部（ＮＭＪ）が、シナプス前染色とシナプス後染色の重複に基づいてスコア付けされた、部分的な神経支配および除神経を示したことを示している。対照ＮＭＪの９８．０％が完全に神経支配されていたのに対し、ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスでは３２．６％のみが完全に神経支配され、６０％が部分的に神経支配され、８．５％が完全に除神経された。神経フィラメントおよびシナプス小胞（緑色）ならびにα−ブンガロトキシンに対する抗体で標識した後のＮＭＪの形態および神経支配の代表的な画像を示している（図２Ｉ〜Ｊ）。体重、握力、伝導、遺伝子型間の軸索数の違いは、双方向スチューデントのｔ検定を使用して統計的に評価され、軸索径は、コルモゴロフ−スミルノフ検定によって評価した。全体的な％ＮＭＪ神経支配の有意差は、ＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後比較を使用した二元配置分散分析によって決定した。すべての分析で、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１は、遺伝子型間の事後有意性を表す。値は平均±Ｓ．Ｄである。すべてのスケールバー＝１００μｍである。

図３Ａは、ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを示している。 図３Ｂは、ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを示している。 図３Ａは、坐骨神経から単離されたｃＤＮＡを使用して産生されたＲＴ−ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシング分析からのクロマトグラムを示し、ＧＡＲＳエクソン８の最初の３４塩基を示している（ｎ＝３マウス／遺伝子型）。ＧＡＲＳ^{＋／ｈｕＥｘ８}およびＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}内で発現されるヒト特異的ヌクレオチドは黒矢印で示している。ΔＥＴＡＱ変異（ΔＥＴＡＱ変異によって欠損された１２ｂｐは赤色で強調されている）は、上の配列のボックスで示され、塩基１３から始まる二重配列によって示されている。図３Ｂは、示されたマウス系統におけるＧＡＲＳ発現についての脳ホモジネートのウエスタンブロット分析を示している。ブロットを抗ＮｅｕＮ抗体で再プローブして、タンパク質負荷の変動性を制御した。

図４Ａは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱがＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ ８）}マウスのニューロパチーの発症を予防することを示している。 図４Ｂは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱがＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ ８）}マウスのニューロパチーの発症を予防することを示している。 図４Ｃは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱがＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ ８）}マウスのニューロパチーの発症を予防することを示している。 図４Ｄは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱがＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ ８）}マウスのニューロパチーの発症を予防することを示している。 図４Ｅは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱがＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ ８）}マウスのニューロパチーの発症を予防することを示している。 図４Ｆは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱがＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ ８）}マウスのニューロパチーの発症を予防することを示している。 図４Ｇは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱがＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ ８）}マウスのニューロパチーの発症を予防することを示している。 図４Ｈは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱがＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ ８）}マウスのニューロパチーの発症を予防することを示している。 図４Ａは、治療用ｍｉＧＡＲＳマイクロＲＮＡが、標的細胞において、自然に発生するＲＮＡｉ生合成および遺伝子サイレンシング経路を利用していることを示している。各ｍｉＧＡＲＳまたは対照配列を、Ｕ６プロモーターの下流にあるＤＮＡテンプレートとしてクローン化し、次いで、プラスミドトランスフェクション（インビトロ）を介して細胞に送達するか、またはインビボでｓｃＡＡＶ９粒子内に送達した（ここに示す）。標的細胞の核に入ると、一次マイクロＲＮＡ構築物が転写され、次いで、ＲＮＡ分解酵素ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒならびに核外移行因子Ｅｘｐｏｒｔｉｎ−５（Ｅｘｐ５）によってプロセシングされる。成熟したアンチセンス鎖（赤色線）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、変異型ＧＡＲＳ ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発する。図４Ｂは、個々のＵ６−ｍｉＧＡＲＳ、または対照、プラスミドｍｉＲＮＡ、およびウミシイタケルシフェラーゼの３’ＵＴＲにクローニングされた４つの標的遺伝子である野生型ヒトＧＡＲＳ、ヒトΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ、野生型マウスＧＡＲＳ、または同じＥＴＡＱ欠失を含有するマウスＧＡＲＳ遺伝子のうちの１つを含有する二重ルシフェラーゼレポータープラスミドでＨＥＫ２９３細胞を同時トランスフェクトすることによって、ｍｉＲＮＡがインビトロで効力試験されたことを示す。次いで、ウミシイタケ対ホタルルシフェラーゼの比率を測定することにより、標的遺伝子サイレンシングを決定した。値は平均比±ＳＥＭとして報告し、ノックダウン効率の有意性は二元配置分散分析を使用して分析した。また、リードｍｉΔＥＴＡＱのガイド鎖の配列ならびに野生型およびΔＥＴＡＱＧＡＲＳ遺伝子の両方に対するその相補性を示している。４つのアミノ酸の欠失は赤色で示している。ｍｉＲＮＡと標的遺伝子との間の塩基対形成は垂直線で示され、赤色線はＲＮＡ二重鎖に存在するゆらぎＧ−Ｕ結合を示している。図４Ｃ〜図４Ｅは、新生仔マウスにＩＣＶ注射によって送達されたインビボｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱ処置が、未処置または賦形剤処置ＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕｅｘ８）}マウスと比較して、ワイヤーハング試験によって定量化された総運動能力における４週齢での欠損（ｐ＝０．０００１）ならびにＭＷ：ＢＷ比（ｐ＝０．０３１５）およびＮＣＶ（＜０．０００１）の低下を有意に予防したことを示す。図Ｆ〜Ｈは、大腿神経の運動分枝の断面に示されるように、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＬａｃＺ処置ΔＥＴＡＱマウスと比較して、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱが軸索喪失（ｐ＝０．０２７２）および軸索径の減少（ｐ＝＜０．０００１）を部分的に防止することができることを示した軸索数および軸索サイズの定量化を示す。軸索径はＫＳ正規性検定を使用して分析し、他のすべての結果の測定値は、ＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後比較を使用した二元配置分散分析を使用して分析した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１は、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱとｓｃＡＡＶ９．ｍｉＬａｃＺ処置ΔＥＴＡＱマウスとの間の事後有意性を表す。値は平均±Ｓ．Ｄである。すべてのスケールバー＝１００μｍである。未処置ＧＡＲＳ^{（ｈｕＥｘ８／ｈｕＥｘ８）}ｎ＝４、ｍｉＬａｃＺ処置ＧＡＲＳ^{（ｈｕＥｘ８／ｈｕＥｘ８）}ｎ＝３、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱ処置ＧＡＲＳ^{（ｈｕＥｘ８／ＨｕＥｘ８）}ｎ＝５、ｍｉ．ＬａｃＺ処置ＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}）ｎ＝５、およびｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱ処置ＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８）}ｎ＝５。

図５Ａは、インビトロで試験したΔＥＴＡＱ疾患対立遺伝子を標的とするすべてのｍｉＲＮＡを示している。 図５Ｂは、インビトロで試験したΔＥＴＡＱ疾患対立遺伝子を標的とするすべてのｍｉＲＮＡを示している。 図５Ｃは、インビトロで試験したΔＥＴＡＱ疾患対立遺伝子を標的とするすべてのｍｉＲＮＡを示している。 図５Ｄは、インビトロで試験したΔＥＴＡＱ疾患対立遺伝子を標的とするすべてのｍｉＲＮＡを示している。 図５Ｅは、インビトロで試験したΔＥＴＡＱ疾患対立遺伝子を標的とするすべてのｍｉＲＮＡを示している。 図５Ａは、ヒトＧＡＲＳ遺伝子のΔＥＴＡＱ変異を標的として最初に試験した５つのｍｉＲＮＡヘアピンを示している。ガイド鎖は青色で示し、パッセンジャー鎖は赤色で示す。灰色と黒色の矢印は、それぞれＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒの切断部位を示している。図５Ｂは、二重ルシフェラーゼアッセイで試験したｍｉＲＮＡの最初のセットを示している。ＨＥＫ２９３細胞を、単一のｍｉＲＮＡと、ウミシイタケルシフェラーゼの３’ＵＴＲとしてクローニングされた野生型またはΔＥＴＡＱヒトＧＡＲＳのいずれかを含有する二重ルシフェラーゼレポーターとで同時トランスフェクトした。遺伝子サイレンシングは、ウミシイタケ対ホタルルシフェラーゼの比率を測定することによって決定し、三連のデータを平均平均比±ＳＥＭとして表す。ヒトの疾患対立遺伝子の効率的なノックダウンおよび野生型対立遺伝子の保存に基づいて、ｍｉＥｘ８Ｄ１２−１Ａをリード候補として選択した。図５Ｃは、リード候補ｍｉＥｘ８Ｄ１２−１Ａが、マウスΔＥＴＡＱ変異遺伝子に対する追加の二重ルシフェラーゼアッセイで試験されたことを示している。ヒト疾患対立遺伝子の効果的なサイレンシングにもかかわらず、ΔＥＴＡＱマウスＧＡＲＳ ｍＲＮＡを標的することができなかった。三重のデータを平均化し、平均±ＳＥＭとして示した。図５Ｄは、初期リードｍｉＲＮＡのガイド鎖ならびにヒトおよびマウスΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳの両方の標的領域に対するその相補性を示す。塩基対形成は、Ｇ−Ｕ結合が赤色で示されている垂直線で示されている。図５Ｅは、ｍｉＥｘ８Ｄ１２−１Ａの６つの変異体のヘアピン構造を示している。ＤｒｏｓｈａとＤｉｃｅｒの切断部位は、灰色と黒色の矢印で示されている。ガイド鎖は青色で示され、元のｍｉＲ配列への変更は赤色で示されている。Ｇ−Ｕ塩基対形成は、赤色の垂直線で示されている。これらのｍｉＲＮＡのインビトロ試験結果を図２Ａ〜図２Ｊに示す。リードｍｉＲＮＡにはアスタリスクが付いており、以降のすべての試験のためにｍｉ．ΔＥＴＡＱに名前が変更された。

図６Ａは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱの発症後の治療効果を示している。図６Ａは、変異型ＧＡＲＳ発現の減少が、初期および後期症候性ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスの握力を改善し、体重を増加させることを示している。 図６Ｂは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱの発症後の治療効果を示している。図６Ｂは、変異型ＧＡＲＳ発現の減少が、初期および後期症候性ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスの握力を改善し、体重を増加させることを示している。 図６Ｃは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱの発症後の治療効果を示している。 図６Ｄは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱの発症後の治療効果を示している。 図６Ｅは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱの発症後の治療効果を示している。 図６Ｆは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱの発症後の治療効果を示している。 図６Ａは、ｍｉ．ΔＥＴＡＱ処置の初期および後期症候性ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスが、処置後約５週間で握力の強化および体重の有意な増加を示すことを示している。図６Ｂは、ニューロパチーの一次徴候について処置後７週間で評価した場合、これらのデータが、ｍｉ．ΔＥＴＡＱ処置で処置した後期症候性ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスにおけるＭＷ：ＢＷ比の上昇傾向および神経伝導速度の有意な改善と相関することを示している。さらに、図６Ｂは、ｍｉ．ΔＥＴＡＱで処置した初期症候性ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスが、有意により高いＭＷ：ＢＷ比およびより速い神経伝導速度を示したことを示し、これは、軸索径の改善は観察されなかったが、大腿神経の運動分枝の断面において観察されたより多数の運動軸索に起因する可能性が最も高い（図６Ｃ〜Ｄ）。軸索喪失の予防は、ｍｉ．ΔＥＴＡＱで処置した後期症候性ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスでは観察されなかった（図６Ｅ）。しかし、初期症状および後期症状の両方が全体的にＮＭＪ神経支配の有意な増加を示した（図６Ｆ）。一元配置分散分析とそれに続くＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後比較を使用してデータを分析した。軸索径内の有意な変化（図６Ｅ）は、コルモゴロフ−スミルノフ検定で決定した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１は、ｍｉＬａｃＺ処置マウスとｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱ処置ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスとの間の事後有意性を表す。Ａ＝完全に神経支配されたＮＭＪの有意差、Ｂ＝部分的に神経支配されたＮＭＪの有意差、およびＣ＝除神経されたＮＭＪの有意差。後期症候性コホート：ＭｉＬａｃＺ処置ＧＡＲＳ^{（ｈｕＥｘ８／ｈｕＥｘ８）}ｎ＝５〜７、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱ処置ＧＡＲＳ^{（ｈｕＥｘ８／ＨｕＥｘ８）}ｎ＝３〜５、ｍｉ．ＬａｃＺ処置ＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８）}ｎ＝６、およびｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱ処置ＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８）}ｎ＝７。初期症候性コホート：ＧＡＲＳ^{（ｈｕＥｘ８／ｈｕＥｘ８）}ｎ＝６〜７、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱ処置ＧＡＲＳ^{（ｈｕＥｘ８／ＨｕＥｘ８）}ｎ＝３〜５、ｍｉ．ＬａｃＺ処置ＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}）ｎ＝７、およびｓｃＡＡＶ９．ｍｉΔＥＴＡＱ処置ＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８）}ｎ＝９−１１。値は平均±Ｓ．Ｄである。すべてのスケールバー＝１００μｍである。

図７Ａは、Ｕ６．ｍｉＰ２７８ＫＹマイクロＲＮＡが、インビトロでＰ２７８ＫＹマウスＧＡＲＳ ｍＲＮＡを特異的にノックダウンできることを示している。 図７Ｂは、Ｕ６．ｍｉＰ２７８ＫＹマイクロＲＮＡが、インビトロでＰ２７８ＫＹマウスＧＡＲＳ ｍＲＮＡを特異的にノックダウンできることを示している。 図７Ｃは、Ｕ６．ｍｉＰ２７８ＫＹマイクロＲＮＡが、インビトロでＰ２７８ＫＹマウスＧＡＲＳ ｍＲＮＡを特異的にノックダウンできることを示している。 図７Ａは、Ｐ２７８ＫＹマウスＧＡＲＳ ｍＲＮＡを標的とする全てのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのヘアピン構造を示している。ガイド鎖は青色で示し、パッセンジャー鎖は赤色で示す。ＤｒｏｓｈａとＤｉｃｅｒの切断部位は、それぞれ灰色および黒色の矢印で示されている。インビトロで最高の性能を発揮するｍｉＲＮＡにはアスタリスクが付いており、さらに試験するために名前がｍｉＰ２７８ＫＹに短縮されている。図７Ｂは、最高の性能を発揮するｍｉＰ２７８ＫＹのガイド鎖の配列ならびに野生型および変異型マウスＧＡＲＳの両方に対するその相補性を示している。Ｐ２７８ＫＹ変異は赤色で示している。垂直線は、ｍｉＲＮＡと標的遺伝子との間の塩基対形成を示し、弱いＧ−Ｕ結合は赤色で示している。対立遺伝子特異性は、ｍｉＲＮＡと変異対立遺伝子の効果的な塩基対形成によって達成されるが、野生型に対する相補性ははるかに低くなる。図７Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞を、単一のｍｉＲＮＡと、ウミシイタケシフェラーゼの３’ＵＴＲとしてクローニングされた野生型またはＰ２７８ＫＹマウスＧＡＲＳのいずれかを含有する二重ルシフェラーゼレポーターとで同時トランスフェクトすることにより、ｍｉＲＮＡをインビトロで試験したことを示している。ウミシイタケ対ホタルルシフェラーゼの比率を測定することにより、標的遺伝子サイレンシングを決定した。三重のデータを平均化し、平均比率±ＳＥＭとして示した。

図８Ａは、ＲＮＡｉによる変異型ＧＡＲＳの減少が、ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ ／＋）}マウスのニューロパチーを予防することを示している。 図８Ｂは、ＲＮＡｉによる変異型ＧＡＲＳの減少が、ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ ／＋）}マウスのニューロパチーを予防することを示している。 図８Ｃは、ＲＮＡｉによる変異型ＧＡＲＳの減少が、ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ ／＋）}マウスのニューロパチーを予防することを示している。 図８Ｄは、ＲＮＡｉによる変異型ＧＡＲＳの減少が、ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ ／＋）}マウスのニューロパチーを予防することを示している。 図８Ｅは、ＲＮＡｉによる変異型ＧＡＲＳの減少が、ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ ／＋）}マウスのニューロパチーを予防することを示している。 図８Ｆは、ＲＮＡｉによる変異型ＧＡＲＳの減少が、ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ ／＋）}マウスのニューロパチーを予防することを示している。 図８Ｇは、ＲＮＡｉによる変異型ＧＡＲＳの減少が、ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ ／＋）}マウスのニューロパチーを予防することを示している。 図８Ｈは、ＲＮＡｉによる変異型ＧＡＲＳの減少が、ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ ／＋）}マウスのニューロパチーを予防することを示している。 図８Ａは、ＩＣＶ送達によるｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処置が、ワイヤーハング試験によって４週齢で定量された総運動能力の欠損を新生仔期に予防したことを示し（ｐ＝０．０００１）、図８Ｂは、未処置および賦形剤処置Ｐ２７８ＫＹマウスと比較したＭＷ：ＢＷ比の減少を示しているｐ＝０．０４６３）。図８Ｃは、処置Ｐ２７８ＫＹマウスで神経伝導速度も有意に改善されたことを示している（ｐ＝＜０．０００１）。図８Ｄは、大腿神経の運動分枝の断面内の軸索数の定量化が、対照処置Ｐ２７８ＫＹマウスにおいて軸索数が１７％減少したが、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処置Ｐ２７８ＫＹマウス（５８９±１５軸索）における軸索数は、未処置対照同腹仔（６００±１１軸索）と同様であったことを示したことを示している。図８Ｅは、軸索径の累積ヒストグラムにおいて、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処置はまた、大径軸索の存在を回復し、対照処置Ｐ２７８ＫＹマウス内の平均軸索径は、１．９８±４．４７μｍであり、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処置Ｐ２７８ＫＹマウスでは２．７１±３．７１μｍ、および未処置ＧＡＲＳ^{（＋／＋）}では３．８４±３．７４であったことを示している。軸索萎縮の予防は、未処理ＧＡＲＳ^{（＋／＋）}およびＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}マウスならびにｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処理ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}マウスから単離された大腿神経の運動分枝の断面の代表的な画像において明らかである（図８Ｆ）。神経フィラメントおよびシナプス小胞（緑色）ならびにα−ブンガロトキシン（赤色）に対する抗体で標識した後の足底筋から単離された神経筋接合部（ＮＭＪ）の形態の代表的な画像を示している（図８Ｇ）。ＮＭＪの７０％超が、対照処置ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}マウスにおいて４週齢までに部分的または完全に脱神経化されるが（図８Ｈ）、ＮＭＪの３０％未満が、任意の程度の脱神経化ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処置ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}マウスを示す。すべての結果の測定値のＮｓには、未処置ＧＡＲＳ^{（＋／＋）}ｎ＝５、対照処置ＧＡＲＳ^{（＋／＋）}ｎ＝４、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処置ＧＡＲＳ^{（＋／＋）}ｎ＝８、未処置ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}ｎ＝６、対照処置ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}ｎ＝５、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処置ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}ｎ＝７が含まれる。（図８Ａ〜図８Ｄ、図８Ｈ）の有意性は、ＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後比較を使用した二元配置分散分析によって決定した。軸索径内の有意な変化（Ｅ）は、コルモゴロフ−スミルノフ検定で決定した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１は、ｍｉＬａｃＺ処理マウスとｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処理ＧＡＲＳ^{Ｐ２７８ＫＹ／＋}マウスとの間の事後有意性を表す。値は平均±Ｓ．Ｄである。すべてのスケールバー＝１００μｍである。

図９Ａは、変異型ＧＡＲＳ発現の低下がまた、疾患発症後のＧＡＲＳ^{（Ｐ２７ ８ＫＹ／＋）}マウスのニューロパチーを軽減することを示している。 図９Ｂは、変異型ＧＡＲＳ発現の低下がまた、疾患発症後のＧＡＲＳ^{（Ｐ２７ ８ＫＹ／＋）}マウスのニューロパチーを軽減することを示している。 図９Ｃは、変異型ＧＡＲＳ発現の低下がまた、疾患発症後のＧＡＲＳ^{（Ｐ２７ ８ＫＹ／＋）}マウスのニューロパチーを軽減することを示している。 図９Ｄは、変異型ＧＡＲＳ発現の低下がまた、疾患発症後のＧＡＲＳ^{（Ｐ２７ ８ＫＹ／＋）}マウスのニューロパチーを軽減することを示している。 図９Ｅは、変異型ＧＡＲＳ発現の低下がまた、疾患発症後のＧＡＲＳ^{（Ｐ２７ ８ＫＹ／＋）}マウスのニューロパチーを軽減することを示している。 図９Ｆは、変異型ＧＡＲＳ発現の低下がまた、疾患発症後のＧＡＲＳ^{（Ｐ２７ ８ＫＹ／＋）}マウスのニューロパチーを軽減することを示している。 （図９Ａ−Ｂ）５週間（早発性）または９週間（遅発性）のｍｉ−Ｐ２７８ＫＹ処置は、初期症候性（図９Ａ）および後期症候性（図９Ｂ）のＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}マウスの両方において、処置後５週目に開始するワイヤーハング試験によって決定されるように、握力の有意な増加をもたらす。処置Ｐ２７８ＫＹマウスはまた、初期症候性マウスでの処置の３週間後（Ａ）および後期症候性マウスでの処置の１週間後から体重が増加する（図９Ｂ）。処置の７週間後に評価した場合、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．Ｐ２７８ＫＹ初期症候性ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}マウス内のＭＷ：ＢＷの増加が観察されたが（図９Ｃ）、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処置は、このコホート内のＮＣＶを改善することも、後期症候性Ｐ２７８ＫＹマウスにおけるＭＷ：ＢＷもＮＣＶも改善することができなかった（図９Ｃ〜図９Ｄ）。しかし、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処置は、初期（図９Ｅ）および後期（図９Ｅ）の症候性ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}マウスの両方でＮＭＪ破壊を有意に予防または逆転させた。すべての統計は、Ｔｕｋｅｙ事後比較を使用した一元配置分散分析で完了した。星印は、ＭｉＬａｃＺおよびＭｉＰ２７８ＫＹ処置ＧＡＲＳ^{Ｐ２７８ＫＹ／＋}マウス間の有意性を表す（＊＝＜０．０５＊＊＝＜０．００５＊＊＊＝＜０．００１）。Ａ＝完全に神経支配されたＮＭＪの有意差、Ｂ＝部分的に神経支配されたＮＭＪの有意差、およびＣ＝除神経されたＮＭＪの有意差。後期症候性コホート：ＭｉＬａｃＺ処置ＧＡＲＳ^{（＋／＋）}ｎ＝６、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処置ＧＡＲＳ^{（＋／＋）}ｎ＝５〜６、ｍｉ．ＬａｃＺ処置ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}ｎ＝６、およびｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＹＫ処置ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}ｎ＝７。初期症候性コホート：ｍｉＬａｃＺ処置ＧＡＲＳ^{（＋／＋）}ｎ＝３、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処置ＧＡＲＳ^{（＋／＋）}ｎ＝３〜４、ｍｉ．ＬａｃＺ処置ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ）}ｎ＝６、およびｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処置ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}ｎ＝７。値は平均±Ｓ．Ｄである。すべてのスケールバー＝１００μｍである。

図１０Ａは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹがＩＶと比較してＩＣＶによって送達された場合に、後根神経節内の変異型ＧＡＲＳ発現の減少が増大することを示している。 図１０Ｂは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹがＩＶと比較してＩＣＶによって送達された場合に、後根神経節内の変異型ＧＡＲＳ発現の減少が増大することを示している。 図１０Ｃは、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹがＩＶと比較してＩＣＶによって送達された場合に、後根神経節内の変異型ＧＡＲＳ発現の減少が増大することを示している。 （図１０Ｃ）対照的に、末梢神経機能のこれらの増加は、肝臓内の変異型ＧＡＲＳ発現の減少とは相関していなかった。すべての実験群でＮ＝５。ＩＶ＝１ｘ１０^１１ｖｇ／マウスの静脈内送達、ＩＣＶ＝脳室内送達、ＬＤ＝低用量の８．７５ｘ１０^９ｖｇ／マウス、ＭＤ＝中用量の５．００ｘ１０^１０ｖｇ／マウス、およびＨＤ＝１ｘ１０^１１ｖｇ／マウス。（図１０Ａ）データは一元配置分散分析とそれに続くＴｕｋｅｙの事後比較によって分析した。ａ＝未処置野生型対照から有意、ｂ＝未処置Ｐ２７８ＫＹ対照から有意。（図１０Ｂ−Ｃ）これらのデータは、Ｔｕｋｅｙの事後比較を使用した二元配置分散分析で分析した。星印は、実験群ごとの野生型および変異型ＧＡＲＳ発現間の有意性を表す（＊＝＜０．０５＊＊＝＜０．００５＊＊＊＝＜０．００１）。値は平均±Ｓ．Ｄである。

図１１Ａは、新生仔ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．Ｐ２７８ＫＹ処置の長期治療効果を示している。図１１Ｂは、新生仔ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．Ｐ２７８ＫＹ処置の長期治療効果を示している。 図１１Ｃは、新生仔ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．Ｐ２７８ＫＹ処置の長期治療効果を示している。図１１Ｄは、新生仔ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．Ｐ２７８ＫＹ処置の長期治療効果を示している。 ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．Ｐ２７８ＫＹ処置の長期的効果を評価するために、体重およびワイヤーハング試験によって決定された握力の両方を、Ｐ０においてｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ｌａｃＺまたはｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．Ｐ２７８ＫＹを注射した後、６週間毎に、ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}マウスおよび同腹仔対照の両方から１年間記録した。注目すべきことに、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処置Ｐ２７８ＫＹは、賦形剤対照処置Ｐ２７８ＫＹマウスと比較して、処置２４週間後に開始する体重（図１１Ａ）の有意な増加および１年の経過を通して握力（図１１Ｂ）の有意な増加を示した。処置後１年でニューロパチーの一次徴候について評価した場合、処置Ｐ２７８ＫＹマウスは、有意により大きなＭＷ：ＢＷ比（図１１Ｃ）およびより速いＮＣＶ（図１１Ｄ）を示した。図１１Ａの有意性は、ＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後比較を使用した一元配置分散分析によって決定した。図１１Ｂの有意性は、ＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後比較を使用した一元配置分散分析によって決定した。図１１Ｃの有意性は、ＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後比較を使用した二元配置分散分析によって決定した。図１１Ｄの有意性は、ＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後比較を使用した二元配置分散分析によって決定した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１は、すべての分析において、ｍｉＬａｃＺ処置マウスとｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処置ＧＡＲＳ^{Ｐ２７８ＫＹ／＋}マウスとの間の事後有意性を表す。ＭｉＬａｃＺ処置ＧＡＲＳ^{（＋／＋）}ｎ＝３、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＫＹ処置ＧＡＲＳ^{（＋／＋）}ｎ＝３、ｍｉ．ＬａｃＺ処置ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}ｎ＝５、およびｓｃＡＡＶ９．ｍｉＰ２７８ＹＫ処置ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}ｎ＝７。値は平均±Ｓ．Ｄである。

図１２Ａは、表現型の改善が後根神経節における変異型ＧＡＲＳ発現の減少と負の相関関係にあることを示している。 図１２Ｂは、表現型の改善が後根神経節における変異型ＧＡＲＳ発現の減少と負の相関関係にあることを示している。 図１２Ｃは、表現型の改善が後根神経節における変異型ＧＡＲＳ発現の減少と負の相関関係にあることを示している。 図１２Ｄは、表現型の改善が後根神経節における変異型ＧＡＲＳ発現の減少と負の相関関係にあることを示している。 図１２Ｅは、表現型の改善が後根神経節における変異型ＧＡＲＳ発現の減少と負の相関関係にあることを示している。 図１２Ｆは、表現型の改善が後根神経節における変異型ＧＡＲＳ発現の減少と負の相関関係にあることを示している。 図１２Ｇは、表現型の改善が後根神経節における変異型ＧＡＲＳ発現の減少と負の相関関係にあることを示している。 図１２Ｈは、表現型の改善が後根神経節における変異型ＧＡＲＳ発現の減少と負の相関関係にあることを示している。（図１２Ａ−Ｂ）後根神経節内のΔＥＴＡＱ変異体発現のパーセンテージと、後期（図１２Ａ）および初期（図１２Ｂ）症候性コホート内のｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱ処置ＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８）}マウスから定量された神経伝導速度との間の負の相関を示す散布図。（図１２Ｃ−Ｄ）肝臓内のΔＥＴＡＱ変異体発現のパーセンテージと、後期（図１２Ｃ）および（図１２Ｄ）初期（図１２Ｄ）症候性コホート内のｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱ処置ＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８）}マウスから定量された神経伝導速度との間の関係を示す散布図。（図１２Ｅ−Ｆ）後根神経節内のＰ２７８ＫＹ ＧＡＲＳ変異体発現のパーセンテージと、後期（図１２Ｅ）および初期（図１２Ｆ）症候性コホート内のｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．Ｐ２７８ＫＹ処置ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}マウスから定量された神経伝導速度との間の負の相関を示す散布図。（図１２Ｇ−Ｈ）肝臓内の後根神経節内のＰ２７８ＫＹ ＧＡＲＳ変異体発現のパーセンテージと、後期（図１２Ｅ）および初期（図１２Ｆ）症候性コホート内のｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．Ｐ２７８ＫＹ処置ＧＡＲＳ^{（Ｐ２７８ＫＹ／＋）}マウスから定量された神経伝導速度との間の関連を示す散布図。

図１３Ａは、ＣＭＴ２Ｄに関連する既知のＧＡＲＳ変異を含む任意の配列を回避しながら、マウスおよびヒトＧＡＲＳ ｃＤＮＡ間の共通領域を標的とするように設計されたｍｉＲＮＡ（パネル図１３Ａ中の赤色ブロック）を概略的に示す。 図１３Ｂは、ＣＭＴ２Ｄに関連する既知のＧＡＲＳ変異を含む任意の配列を回避しながら、マウスおよびヒトＧＡＲＳ ｃＤＮＡ間の共通領域を標的とするように設計されたｍｉＲＮＡ（パネル図１３Ａ中の赤色ブロック）を概略的に示す。

図１４は、ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡの配列を示しており、それぞれが野生型および変異型ＧＡＲＳ遺伝子の両方を標的としている。

図１５は、例示的なＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子の配列を示している。 図１５は、例示的なＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子の配列を示している。 図１５は、例示的なＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子の配列を示している。 図１５は、例示的なＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子の配列を示している。 図１５は、例示的なＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子の配列を示している。 図１５は、例示的なＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子の配列を示している。 図１５は、例示的なＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子の配列を示している。

図１６Ａは、新生仔マウスを野生型ＧＡＲＳ（ｍｉＷＴ）を標的とするｓｃＡＡＶ９−ＲＮＡｉで全身的に処置した実験の結果を示している。 図１６Ｂは、新生仔マウスを野生型ＧＡＲＳ（ｍｉＷＴ）を標的とするｓｃＡＡＶ９−ＲＮＡｉで全身的に処置した実験の結果を示している。 図１６Ｃは、新生仔マウスを野生型ＧＡＲＳ（ｍｉＷＴ）を標的とするｓｃＡＡＶ９−ＲＮＡｉで全身的に処置した実験の結果を示している。 図１６Ｄは、新生仔マウスを野生型ＧＡＲＳ（ｍｉＷＴ）を標的とするｓｃＡＡＶ９−ＲＮＡｉで全身的に処置した実験の結果を示している。 図１６ＥＢは、新生仔マウスを野生型ＧＡＲＳ（ｍｉＷＴ）を標的とするｓｃＡＡＶ９−ＲＮＡｉで全身的に処置した実験の結果を示している。 （図１６Ａ）ＡＡＶ９によって形質導入された組織（後根神経節および肝臓）では、総ＧＡＲＳ発現が約７０％に減少した（図１６Ｂ）。（図１６Ｃ−Ｄ）ｍｉＷＴで処置した１２週齢のマウスは、ニューロパチーまたは明白な有害作用の徴候を示さなかった。＊＊＝ｐ＜０．０１対照マウスまたは１２週齢のｍｉＷＴ Ｇａｒｓで処置したマウスからの大腿神経の運動分枝の断面を示す（図１６Ｅ）。軸索喪失、脱髄、または軸索萎縮の明白な徴候はなかった。

図１７は、ヒトおよびマウスのＧＡＲＳ遺伝子配列のアライメントであり、各ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡが標的とするように設計された配列の一部を示している。 図１７は、ヒトおよびマウスのＧＡＲＳ遺伝子配列のアライメントであり、各ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡが標的とするように設計された配列の一部を示している。 図１７は、ヒトおよびマウスのＧＡＲＳ遺伝子配列のアライメントであり、各ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡが標的とするように設計された配列の一部を示している。

本明細書に記載の生成物および方法は、変異型グリシルｔＲＮＡ−シンテターゼ（ＧＡＲＳ）遺伝子に関連する疾患または状態の処置に使用される。いくつかの態様では、本開示は、ＧＡＲＳの優性変異によって引き起こされるシャルコー・マリー・トゥース病２Ｄ型（ＣＭＴ２Ｄ）を含むＧＡＲＳに関連する変異を処置するための潜在的な治療薬としての対立遺伝子特異的ＲＮＡｉの有効性を示す。ＧＡＲＳのｄｅ ｎｏｖｏ変異は、重度の末梢ニューロパチーのある患者で同定し、変異を正確に再現するマウスモデルを作成した。これらのマウスは、３〜４週齢までにニューロパチーを発症し、変異の病原性を検証した。変異型ＧＡＲＳ ｍＲＮＡを標的とするが野生型ＧＡＲＳを標的としないＲＮＡｉ配列を最適化し、次いで、ウイルスベクターにパッケージ化してインビボ送達を行い、出生時に処置した対象のニューロパチーの予防における有効性および疾患発症後に処置した対象における改善を実証した。

ＧＡＲＳは、同族のアミノ酸でｔＲＮＡを負荷するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの１つである。ＧＡＲＳ遺伝子に関する追加情報は、例えば、ＨＧＮＣ（４１６２）、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ（２６１７）、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ＥＮＳＧ０００００１０６１０５）、ＯＭＩＭ（６００２８７）、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ（Ｐ４１２５０）で見られる。コードされた酵素は、ｔＲＮＡシンテターゼのクラスＩＩファミリーに属するα２二量体である。ＧＡＲＳは、ヒトの自己免疫疾患、多発性筋炎または皮膚筋炎における自己抗体の標的であることが示されている。ＧＡＲＳに関連する疾患には、ＣＭＴ２Ｄおよび遠位遺伝性運動ニューロパチーが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの態様では、ヒトＧＡＲＳをコードする核酸は、配列番号６９に示されるヌクレオチド配列に示される。様々な態様では、本開示の生成物および方法はまた、配列番号６９に示されるヌクレオチド配列のアイソフォームおよび変異体を標的とする。いくつかの態様では、変異体は、配列番号６９に示されるヌクレオチド配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、および７０％の同一性を含む。

いくつかの態様では、マウスＧＡＲＳをコードする核酸は、配列番号７０に示されるヌクレオチド配列に示される。様々な態様では、本開示の生成物および方法はまた、配列番号７０に示されるヌクレオチド配列のアイソフォームおよび変異体を標的とする。いくつかの態様では、変異体は、配列番号７０に示されるヌクレオチド配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、および７０％の同一性を含む。

本開示は、変異型ＧＡＲＳ遺伝子および結果として生じるｍＲＮＡの改変体に起因する疾患または障害を有する対象を改善および／または処置するために、発現変異型ＧＡＲＳを阻害または干渉するためのＲＮＡ干渉の使用を含む。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、様々な疾患の処置で考えられている真核細胞の遺伝子調節のメカニズムである。ＲＮＡｉは、抑制性ＲＮＡによって媒介される遺伝子発現の転写後制御を指す。

自然のＲＮＡｉ経路の理解が深まるにつれて、研究者らは、疾患を処置するために、標的遺伝子の発現を調節するのに使用する人工ｓｈＲＮＡおよびｓｎＲＮＡを設計した。低分子（または小分子）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ならびに低分子（または小分子）ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、いくつかのクラスの小分子ＲＮＡは、哺乳動物細胞においてＲＮＡｉプロセスを誘発することが公知であり、これらは、類似のクラスのベクター発現トリガーを構成する［Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１２：３２９−４０、２０１１年、Ｈａｒｐｅｒ、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６６：９３３−８、２００９年］。ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、プラスミドまたはウイルスベースのベクターからインビボで発現され、したがって、ベクターが標的細胞核内に存在し、駆動プロモーターが活性である限り、単回投与で長期遺伝子サイレンシングを達成することができる（Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３９２：１４５−７３、２００５年）。重要なことに、このベクター発現アプローチは、筋肉遺伝子療法分野で既に行われた数十年にわたる進歩を活用しているが、タンパク質コード遺伝子を発現する代わりに、ＲＮＡｉ治療戦略におけるベクターカーゴは、目的の疾患遺伝子を標的とする人工ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡカセットである。

いくつかの実施形態では、本開示の生成物および方法は、ＧＡＲＳ発現に影響を与える（例えば、ノックダウンまたは発現を阻害する）ための低分子ヘアピンＲＮＡまたは小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ／ヘアピンベクター）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができる、密なヘアピンターンを有する人工ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、分解およびターンオーバーの速度が比較的低いという点でＲＮＡｉの有利なメディエーターであるが、発現ベクターの使用を必要とする。ベクターが宿主ゲノムに形質導入されると、ｓｈＲＮＡは、プロモーター選択に依存して、ポリメラーゼＩＩまたはポリメラーゼＩＩＩによって核内で転写される。この生成物はｐｒｉ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を模倣し、Ｄｒｏｓｈａによってプロセシングされる。得られたｐｒｅ−ｓｈＲＮＡは、Ｅｘｐｏｒｔｉｎ５によって核から輸送される。次いで、この生成物はＤｉｃｅｒによってプロセシングされ、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードする。センス（パッセンジャー）鎖が分解される。アンチセンス（ガイド）鎖は、相補的配列を有するｍＲＮＡにＲＩＳＣを向ける。完全な相補性の場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡを切断する。不完全な相補性の場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡの翻訳を抑制する。いずれの場合も、ｓｈＲＮＡは標的遺伝子のサイレンシングにつながる。いくつかの態様では、本開示は、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを介したＧＡＲＳアンチセンス配列を発現するウイルスベクターの産生および投与を含む。ｓｈＲＮＡの発現は、様々なプロモーターの使用によって調節される。プロモーターの選択は、堅牢なｓｈＲＮＡ発現を達成するために不可欠である。様々な態様では、Ｕ６およびＨ１などのポリメラーゼＩＩプロモーター、およびポリメラーゼＩＩＩプロモーターが使用される。いくつかの態様では、Ｕ６ ｓｈＲＮＡが使用される。

いくつかの態様では、本開示は、遺伝子発現を阻害、ノックダウン、または干渉するためにＵ６ ｓｈＲＮＡ分子を使用する。従来の小分子／低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列は通常、Ｕ６などのＰｏｌ ＩＩＩプロモーターを含むベクターから細胞核内で転写される。内因性Ｕ６プロモーターは通常、スプライシングに関与する核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）であるＵ６ ＲＮＡの発現を制御し、十分に特徴付けられている［Ｋｕｎｋｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ．３２２（６０７４）：７３−７（１９８６年）、Ｋｕｎｋｅｌら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２（２）：１９６−２０４（１９８８年）、Ｐａｕｌｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ−ｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（６）：１２８３−９８（２０００年）］。いくつかの態様では、Ｕ６プロモーターは、哺乳動物細胞におけるｓｈＲＮＡ分子のベクターベースの発現を制御するために使用され［Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９（３）：１４４３−８（２００２年）、Ｐａｕｌら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０（５）：５０５−８（２００２年）］、なぜなら、（１）プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌｙ ＩＩＩ）によって認識され、ｓｈＲＮＡの高レベルの構成的発現を制御し、（２）プロモーターはほとんどの哺乳類細胞型で活性であるためである。いくつかの態様では、プロモーターは、ｓｈＲＮＡの発現を制御するために必要なすべての要素が転写開始部位の上流に位置するＩＩＩ型Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである（Ｐａｕｌｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８（６）：１２８３−９８（２０００年））。本開示には、マウスおよびヒトの両方のＵ６プロモーターが含まれる。ループで連結された標的遺伝子由来のセンス配列およびアンチセンス配列を含むｓｈＲＮＡは、核から細胞質に輸送され、そこでＤｉｃｅｒがそれを低分子／短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にプロセシングする。

本開示は、ＧＡＲＳ遺伝子の発現を防止および阻害するための阻害性ＲＮＡをコードする配列を含む。阻害性ＲＮＡは、ＧＡＲＳ遺伝子の発現を阻害するアンチセンス配列を含む。本開示は、ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡおよびガイド鎖をコードする核酸、ならびにＲＮＡｉ耐性ＧＡＲＳ遺伝子を提供する。本開示は、配列番号１〜２５のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードする核酸を提供する。本開示は、配列番号２６〜５０のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも約７０％、７５、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＧＡＲＳガイド鎖をコードする核酸を提供する。本開示は、配列番号５１〜５７のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＲＮＡｉ耐性ＧＡＲＳ遺伝子を含む核酸を提供する。本開示は、配列番号１〜２５のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードする核酸および配列番号５１〜５７のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＲＮＡｉ耐性ＧＡＲＳ遺伝子を含む核酸を提供する。

例示的なＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡは、配列番号１〜２５のいずれか１つまたは複数に示されるポリヌクレオチド配列を含む完全長ｍｉＲＮＡアンチセンスガイド鎖、あるいは配列番号１〜２５のいずれか１つに少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むその変異体を含む。対応する最終的にプロセシングされたガイド鎖配列は、それぞれ、配列番号２６〜５０のいずれか１つまたは複数に示されるポリヌクレオチド配列、あるいは配列番号２６〜５０のいずれか１つに少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むその変異体である。例示的なＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子は、配列番号５１〜５７のいずれか１つまたは複数に示されるか、あるいは配列番号５１〜５７のいずれか１つに少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むその変異体である。

いくつかの態様では、これらの配列の１つまたは複数のコピーは、単一のベクターに結合される。したがって、本開示は、本開示の核酸または本開示の核酸の組み合わせを含むベクターを含む。本開示の実施形態は、ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ関連ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、または合成ウイルス、例えばキメラウイルス、モザイクウイルス、もしくは偽型ウイルス、および／または外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、もしくは小分子を含むウイルスなどのウイルスベクター）を利用して、本明細書に開示される核酸を送達する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様では、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）または自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、ＡＡＶ−ａｎｃ８０、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．８、およびＡＡＶｒｈ．１０からなる群から選択されるカプシド血清型を有する。

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１（すなわち、ＡＡＶ１逆方向末端反復（ＩＴＲ）およびＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ２（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ３（すなわち、ＡＡＶ３ ＩＴＲおよびＡＡＶ３カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ４（すなわち、ＡＡＶ４ ＩＴＲおよびＡＡＶ４カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ５（すなわち、ＡＡＶ５ ＩＴＲおよびＡＡＶ５カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ６（すなわち、ＡＡＶ６ ＩＴＲおよびＡＡＶ６カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ７（すなわち、ＡＡＶ７ ＩＴＲおよびＡＡＶ７カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ８（すなわち、ＡＡＶ８ ＩＴＲおよびＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ９（すなわち、ＡＡＶ９ ＩＴＲおよびＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ７４（すなわち、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．８（すなわち、ＡＡＶｒｈ．８ ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ．８カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．１０（すなわち、ＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲおよびＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１１（すなわち、ＡＡＶ１１ ＩＴＲおよびＡＡＶ１１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１２（すなわち、ＡＡＶ１２ ＩＴＲおよびＡＡＶ１２カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、またはＡＡＶ１３（すなわち、ＡＡＶ１３ ＩＴＲおよびＡＡＶ１３カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）などのＡＡＶである。

本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、感染性ウイルス粒子へのｒＡＡＶゲノムの組込みのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）による感染に許容される細胞に導入される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分であるｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、ｒＡＡＶゲノム中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型由来であってもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型由来であってもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、ＡＡＶ−ａｎｃ８０、およびＡＡＶ ｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、ｒＡＡＶゲノム内のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型由来であってもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、ＡＡＶ−ａｎｃ８０、およびＡＡＶ ｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶもまた、本開示に含まれる。例えば、Ｍａｒｓｉｃら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２２（１１）：１９００〜１９０９（２０１４年）を参照されたい。上記のように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において公知である。同族の構成要素の使用が特に企図されている。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、あるＡＡＶ血清型からのＩＴＲおよび異なるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質を含む、偽型ＡＡＶである。いくつかの実施形態では、偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／９（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／８（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／１（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）である。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ．８、またはＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３からの１つまたは複数のカプシドタンパク質のキメラを含むカプシドタンパク質などの組換えカプシドタンパク質を含む。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図されている。例えば、Ｍａｒｓｉｃら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２２（１１）：１９００〜１９０９（２０１４年）を参照されたい。上記の背景技術の部分に記載されたように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において公知である。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＡＶを利用して、ＧＡＲＳ ｍＲＮＡを標的とし、変異型ＧＡＲＳ発現を阻害する阻害性ＲＮＡを送達する。ＡＡＶは、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂの長さである。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。他の例として、例えば、ＡＡＶ−１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ−２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４５：５５５−５６４（１９８３年）に提供されており、ＡＡＶ−３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ−４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ−５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ−６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており、ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８ゲノムの少なくとも部分は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９（ＡＡＶ−８に関連する米国特許第７，２８２，１９９号および米国特許第７，７９０，４４９号も参照）に提供されており、ＡＡＶ−９ゲノムは、Ｇａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７８：６３８１〜６３８８（２００４年）に提供されており、ＡＡＶ−１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１３（１）：６７〜７６（２００６年）に提供されており、ＡＡＶ−１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３３０（２）：３７５〜３８３（２００４年）に提供されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、単一のＡＡＶイントロン（ヌクレオチド２１０７および２２２７で）の差次的スプライシングと相まって、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）の産生をもたらす。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５８：９７−１２９（１９９２年）において概説されている。

ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外因子）としてそれらの細胞の寿命にわたって本質的に存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成および組込みを指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、ゲノムの内部の約４．３ｋｂ（複製および構造カプシドタンパク質ｒｅｐ−ｃａｐをコードする）の一部またはすべてが、外来ＤＮＡで置換されてもよい。ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、トランスで提供することができる。ＡＡＶの別の重要な特徴は、極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは凍結乾燥されてもよく、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性でない。いくつかの態様では、ＡＡＶを使用して、Ｕ６プロモーターの制御下でｓｈＲＮＡを送達する。いくつかの態様では、ＡＡＶを使用して、Ｕ７プロモーターの制御下でｓｎＲＮＡを送達する。いくつかの態様では、ＡＡＶを使用して、ニワトリ −アクチンプロモーターの制御下でＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子を送達する。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、組換え直鎖ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、一本鎖ＡＡＶ、または組換え自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。

本開示の組換えＡＡＶゲノムは、例えば、１つまたは複数のＧＡＲＳ阻害性ＲＮＡまたはＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに隣接する１つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲを含む。本明細書で提供されるｒＡＡＶのゲノムは、ＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子をさらに含むか、またはＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子が別個のｒＡＡＶに存在するかのいずれかである。ｍｉＲＮＡおよび置換ＧＡＲＳをコードするポリヌクレオチドは、標的細胞において機能的である転写制御ＤＮＡ、例えばプロモーターＤＮＡに作動可能に連結されている。Ａｍｂｉｏｎ社（テキサス州オースティン）、Ｄａｒｍａｃｏｎ社（コロラド州ラファイエット）、インビトロジェン社（カリフォルニア州サンディエゴ）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（バージニア州ハーンドン）などの商業的提供者は、カスタム阻害性ＲＮＡ分子を産生する。さらに、ＳＩＬＥＮＣＥＲ（商標）ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社、テキサス州オースティン）またはｐｓｉＲＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、カリフォルニア州サンディエゴ）などのカスタムｓｉＲＮＡ分子を産生するための市販のキットが利用可能である。

本明細書に提供されるＤＮＡプラスミドは、本明細書に記載のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、感染性ウイルス粒子へのｒＡＡＶゲノムの組込みのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）による感染に許容される細胞に導入される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分であるｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、ｒＡＡＶゲノム中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型由来であってもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型由来であってもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、ＡＡＶ−Ｂ１およびＡＡＶ ｒｈ７４が挙げられるが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ−９カプシドタンパク質およびＡＡＶ−２ ＩＴＲを含む例示的なｒＡＡＶが提供される。

パッケージング細胞を産生する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要なすべての成分を安定して発現する細胞株を作成することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子はｒＡＡＶゲノムから分離され、およびネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）を、細胞のゲノムに組み込む。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ、７９：２０７７〜２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９８３年、Ｇｅｎｅ、２３：６５〜７３）、または直接平滑末端ライゲーション（ＳｅｎａｐａｔｈｙおよびＣａｒｔｅｒ、１９８４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９：４６６１〜４６６６）などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。適切な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムおよび／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するために、プラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用する。

ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ、１９９２年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５３３〜５３９、およびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９９２年、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９７〜１２９）に概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４：２０７２（１９８４年）、Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６４６６（１９８４年）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：３２５１（１９８５年）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３（１９８８年）、およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７：３４９（１９８８年）、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：３８２２〜３８２８（１９８９年）、米国特許第５，１７３，４１４号、国際公開第９５／１３３６５号および対応する米国特許第５，６５８．７７６号、国際公開第９５／１３３９２号、国際公開第９６／１７９４７号、国際出願ＵＳ９８／１８６００号、国際公開第９７／０９４４１号（国際出願ＵＳ９６／１４４２３号）、国際公開第９７／０８２９８号（国際出願ＵＳ９６／１３８７２号）、国際公開第９７／２１８２５（国際出願ＵＳ９６／２０７７７号）、国際公開第９７／０６２４３号（国際出願ＦＲ９６／０１０６４号）、国際公開第９９／１１７６４号、Ｐｅｒｒｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１３：１２４４〜１２５０（１９９５年）、Ｐａｕｌら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、４：６０９〜６１５（１９９３年）、Ｃｌａｒｋら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、３：１１２４〜１１３２（１９９６年）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、米国特許第６，２５８，５９５号、およびＭｃＣａｒｔｙ、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１６（１０）：１６４８〜１６５６（２００８年）に記載される。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。自己相補的（ｓｃ）ｒＡＡＶの産生および使用は、具体的に企図され、例示されている。

本明細書でさらに提供されるのは、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞である。パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＰｅｒＣ．６細胞（同族２９３株）などの安定して形質転換された癌細胞であってもよい。別の実施形態では、パッケージング細胞は、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ−３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、およびＦＲｈＬ−２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）などの形質転換された癌細胞ではない細胞である。

したがって、組換えＡＡＶ（すなわち、感染性のカプシド形成されたｒＡＡＶ粒子）が本明細書で提供される。ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠いており、すなわち、ｒＡＡＶのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐまたはｃａｐ ＤＮＡが存在しない。

ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配などの当該技術分野で標準的な方法によって、精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０（６）：１０３１〜１０３９（１９９９年）、ＳｃｈｅｎｐｐおよびＣｌａｒｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、６９ ４２７〜４４３（２００２年）、米国特許第６，５６６，１１８号、および国際公開第９８／０９６５７号に開示される方法が含まれる。

本開示の核酸およびウイルスベクターを含む組成物が提供される。本明細書に記載の送達媒体（ｒＡＡＶなど）を含む組成物が提供される。様々な態様では、そのような組成物はまた、薬学的に許容される担体を含む。組成物はまた、希釈剤およびアジュバントなどの他の成分を含んでもよい。許容される担体、希釈剤、およびアジュバントは、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量および濃度で不活性であり、リン酸、クエン酸、または他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、および／またはＴｗｅｅｎ、プルロニック（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

本発明の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、処置目標、個体、および標的とされる細胞型に応じて変化し、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍＬ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３、約１×１０^１４、約１×１０^１６、またはそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）［またはウイルスゲノム（ｖｇ）］の範囲であり得る。

インビボまたはインビトロで、送達媒体（ｒＡＡＶなど）を用いて標的細胞を形質導入する方法が企図されている。インビボ方法は、送達媒体（ｒＡＡＶなど）を含む組成物の有効用量または有効複数用量を、それを必要とする動物（ヒト患者を含む）に投与するステップを含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。「有効用量」は、処置される障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除または低減）する用量、障害／疾患状態への進行を遅らせるかまたは防止する用量、障害／疾患状態の進行を遅らせるかまたは防止する用量、疾患の程度を減少させる用量、疾患の寛解（部分的または完全）をもたらす用量、および／または生存を延長させる用量である。本発明の方法による予防または処置のために企図される疾患の例は、ＣＭＴ２Ｄである。病理学的ＧＡＲＳ変異を担持することが知られている家族では、方法は病気の発症前に実行することができる。他の患者では、方法は診断後に実行される。

分子的、生化学的、組織学的、および機能的結果の測定は、方法の治療効果を示している。結果の測定は、例えば、ＤｙｃｋおよびＴｈｏｍａｓ、Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓａｕｎｄｅｒｓ、ペンシルベニア州フィラデルフィア、^第４版、第１巻（２００５年）の第３２、３５および４３章、ならびにＢｕｒｇｅｓｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、６０２：３４７〜３９３（２０１０年）に記載されている。結果の測定としては、罹患組織における変異型ＧＡＲＳ ｍＲＮＡまたはタンパク質の減少または排除、ＧＡＲＳ遺伝子ノックダウン、体重増加および筋力の改善のうちのの１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。その他としては、神経組織学（軸索数、軸索サイズおよび髄鞘形成）、神経筋接合部分析、および筋肉重量および／または筋肉組織学が挙げられるが、これらに限定されない。その他としては、神経伝導速度−ｎｃｖ、筋電図−ｅｍｇ、およびシナプス生理学が挙げられるが、これらに限定されない。

本開示の方法では、変異型ＧＡＲＳ対立遺伝子の発現は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％阻害される。この方法では、野生型ＧＡＲＳ対立遺伝子の発現は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％阻害される。

併用療法も本発明により企図される。本明細書で使用される組合せは、同時処置および逐次的処置の両方を含む。本明細書に記載の方法と標準的な医学的処置および支持療法との組み合わせは、ＨＤＡＣ６阻害などの治療との組み合わせと同様に、特に企図されている［Ｂｅｎｏｙら、Ｂｒａｉｎ、１４１（３）：６７３−６８７（２０１８年）］。

本開示の核酸、ウイルスベクター、または組成物の有効用量の投与は、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、口腔、鼻腔、肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、眼内、直腸、または膣を含むがこれらに限定されない、当技術分野で標準的な経路によるものであってもよい。様々な態様では、有効用量は、経路の組み合わせによって送達される。例えば、様々な態様では、有効用量は、静脈内および／または筋肉内、あるいは静脈内および脳室内などに送達される。いくつかの態様では、有効用量は、順に、または連続して送達される。いくつかの態様では、有効用量は、同時に送達される。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（具体的には、ＡＡＶ ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の投与経路および血清型は、処置される感染症および／または疾患状態、ならびにｍｉＲＮＡを発現する標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択および／または適合され得る。

特に、送達媒体（ｒＡＡＶなど）の実際の投与は、送達媒体（ｒＡＡＶなど）を動物の標的細胞に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本発明による投与としては、筋肉、血流への注射、および／または神経系または肝臓への直接注射が挙げられるが、これらに限定されない。ｒＡＡＶをリン酸緩衝生理食塩水中に単に再懸濁することは、筋肉組織での発現に有用な媒体を提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与することができる担体または他の成分に対する公知の制限は存在しない（しかし、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いる通常の方法では回避されるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが神経等の目的とする特定の標的組織を標的とするように改変され得る。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０２／０５３７０３号を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射と経皮輸送の両方のための多数の製剤がこれまでに開発されており、本発明の実施において使用することができる。送達媒体（ｒＡＡＶなど）は、投与および取扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体と共に使用することができる。

送達媒体（ｒＡＡＶなど）の分散液はまた、グリセロール、ソルビトール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中、ならびに油中で調製することができる。通常の保存および使用の条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含む。これに関連して、使用される滅菌水性媒体はすべて、当業者に公知の標準的な技術により容易に入手可能である。

注射可能な使用に適した薬学的形態としては、滅菌水溶液または分散液、および滅菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。すべての場合において、形態は滅菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。製造および保管の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。

滅菌の注射可能な溶液は、必要量のｒＡＡＶを適切な溶媒中に、必要に応じて上記に列挙した様々な他の成分と共に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、滅菌した活性成分を、基本的な分散媒および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌媒体に組み込むことによって調製される。滅菌の注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それは、予め滅菌濾過したその溶液から、活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる。

本発明のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子の持続的発現をもたらす。したがって、本発明は、ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子を発現するｒＡＡＶを動物、好ましくはヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法は、細胞および組織（末梢運動ニューロン、感覚運動ニューロン、筋肉などの組織、ならびに肝臓および脳などの器官を含むが、これらに限定されない）を、本明細書に記載の１つまたは複数のｒＡＡＶで形質導入することを含む。形質導入は、組織特異的制御要素を含む遺伝子カセットで行われ得る。

「形質導入」というは、一例として、標的細胞によるＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子の発現をもたらす、本明細書に記載の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボまたはインビトロでの標的細胞へのＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子の投与／送達を指すために使用される。

したがって、本明細書に記載のｒＡＡＶの有効用量（または本質的に同時に投与される用量、または間隔を置いて与えられる用量）を、それを必要とする動物に投与する方法が提供される。

本発明の態様および実施形態は、以下の例によって示される。例１は、ＣＭＴ２Ｄ患者の臨床評価および変異分析について記載する。例２は、ＧＡＲＳ発現研究について記載する。例３は、ＣＭＴ２Ｄマウスモデルについて記載する。例４は、ＧＡＲＳ遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡについて記載する。例５は、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱの産生について記載する。例６は、マウスへのｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．Ｐ２７８ＫＹおよびｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱの新生仔送達について記載する。例７は、発症後のマウスへの遺伝子療法構築物の送達について記載する。例８は、ｒＡＡＶ９−ｍｉＧＡＲＳ／ｒＧＡＲＳベクターおよび使用について記載する。例９は、正常な表現型をもたらすＧＡＲＳ発現のレベルに関連する実験について記載する。例１０は、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳが酵素の主要な機能に影響を与えることを示す。例１１は、例１１が、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳがＮＲＰ１とのわずかに異常な相互作用を示したことを示す。

例１
ＣＭＴ２Ｄ患者の臨床評価および変異分析
患者特異的ＧＡＲＳ変異を選択して、本明細書において提供される方法および生成物を例示した。ＧＡＲＳ変異は、筋緊張の低下、頭の遅れ、腋窩の滑り、軽度の舌萎縮、手足の靭帯弛緩、および１３ヶ月齢から始まる胸壁の過剰な退縮を示すことによって臨床的に現れた現在６歳の女性において同定された。１５ヶ月での筋生検は、ニューロパチーと一致する神経原性変化を示した。これには、Ｉ型およびＩＩ型線維の顕著な萎縮が含まれ、筋線維壊死、変性、または再生の証拠はなく、ジストロフィー性または炎症性ミオパシーの証拠も含まれなかった。ＥＭＧおよび神経伝導研究はまた、運動ニューロン疾患と一致した。脊髄性筋萎縮症の陰性検査の後、全エクソンシーケンシング分析により、患者が、グリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧＡＲＳ）遺伝子（ｃ．８９４＿９０５ｄｅｌ、ＮＭ＿００２０４７．２）のエクソン８における１２ヌクレオチド欠失についてインフレームでヘテロ接合性であることが明らかになった。

より具体的には、発端者は、テキサス小児科病院（テキサス州ヒューストン）で、施設内審査委員会が承認したプロトコルの下で臨床的に評価された。臨床データは、発端者の両親からの書面によるインフォームドコンセントの後に得られた。診断用の全エクソームシーケンシング（ＸｏｍｅＤｘＰｌｕｓ）は、ＧｅｎｅＤｘ（メリーランド州ゲイザースバーグ）によって実行された。対立遺伝子特異的サンガーシーケンシングでは、本発明者らはまず、患者由来初代線維芽細胞からＤＮＡを単離した。Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社）プロトコルに従って、細胞をトリプシンで処理した。ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用してＰＣＲ増幅を行い、ＧＡＲＳエクソン８を含む３８１ｂｐの領域を得た。ＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔプロトコルに従ってＰＣＲ産物を洗浄し、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用してｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。次いで、ベクターをＯｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換し、アンピシリン含有ＬＢ寒天プレートに播種した。６つの単離されたコロニーからのプラスミドＤＮＡを精製し、ＰＣＲプライマーを使用してサンガー配列決定を行った。５つのコロニーには野生型対立遺伝子のアンプリコンを持つプラスミドが含まれ、１つのコロニーには変異型対立遺伝子のアンプリコンを有するプラスミドが含まれていた。ＰＣＲ反応に使用されるプライマーは、フォワードが５’ＧＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡＧＴＡＧＴＡＣＴＧＣ３’（配列番号５８）であり、リバースが５’ＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＡＴＣＡＧＴＣＣＡＧＡＴＣＧ３’（配列番号５９）である。

この変異は、ＧＡＲＳタンパク質（ｐ．Ｇｌｕ２９９＿Ｇｌｎ３０２ｄｅｌ、ＮＰ＿００２０３８．２）中の４つのアミノ酸の欠失をもたらし、以後ΔＥＴＡＱと呼ぶ。他の潜在的な病原性変異は、二重分子診断によってニューロパチーの重症度を潜在的に説明することができる別の遺伝子座で同定されなかった。いずれの親も同定されたＧＡＲＳ変異を保有せず、患者の双子兄弟も保有せず、デノボ変異を示す。ＧＡＲＳは、グリシンを同族のｔＲＮＡ分子にライゲーションする二量体として機能する。基質のグリシンは、各単量体のポケット内に結合し、１つのｔＲＮＡ分子が二量体の各半分に結合する。重要なことには、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異は、ヒトから細菌まで保存され、グリシン結合ポケット内に存在する４つのアミノ酸残基の欠失をもたらす（図２Ａ）［Ｑｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８９：２０３５９〜２０３６９（２０１４年）］。

例２
ＧＡＲＳ発現研究
ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異がｍＲＮＡ発現または安定性に影響を及ぼすかどうかを決定するために、ＲＮＡ−ｓｅｑを実施して、患者の初代皮膚線維芽細胞における野生型および変異型対立遺伝子の発現を評価した。

ＲＮＡ発現研究のために、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を製造業者のプロトコルに従って使用して、患者の線維芽細胞からＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡサンプルを、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライドバイオシステムズ社）を製造業者の説明書に従って使用して、１μｇのＲＮＡから生成した。得られたｃＤＮＡを使用して、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異を有する領域に隣接する２２４塩基対の産物を増幅した。反応物をカラム精製し、生成物をゲル電気泳動により品質について分析した。次世代シーケンシング用のサンプルを調製するために、生成物を消化し、Ｔｎ５トランスポザーゼを使用して「タグ付け」した。ライブラリーは、Ｋａｐａ Ｈｉｆｉ ＤＮＡポリメラーゼおよびイルミナ互換のインデックスプライマーを使用したＰＣＲによって増幅した。最終的なライブラリーフラグメントのサイズおよび純度をゲル電気泳動によって決定し、フラグメントをカラム精製し、ペアの１５５ｂｐ読み取りを使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑでシーケンシングした。すべてのプライマー配列は、要求に応じて利用可能である。重複する読み取りを、ＰＥＡＲ（ｖ０．９．６）を使用してマージし、ｂｗａ ｍｅｍ（ｖ０．７．１２）を使用して、野生型エクソン−７：エクソン−８接合部またはΔＥＴＡＱ含有等価物を含むカスタム参照にアラインメントさせた。カスタムｐｙｔｈｏｎスクリプト（要求に応じて利用可能）を使用して、各接合部へのより高いスコアのアラインメントを有する読み取りをカウントした。情報量の少ない読み取り（例えば、変異にまたがらない読み取り）は無視した。

これらの分析により、野生型（５３．７％）およびΔＥＴＡＱ（４６．３％）ＲＮＡ−ｓｅｑ読み取りの均一な分布が明らかになり、ΔＥＴＡＱＧＡＲＳが転写産物レベルに劇的に影響しないことを示した（図１Ａ）。

ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳがＧＡＲＳタンパクレベルに影響を与えるかどうかを決定するために、本発明者らは、対照初代皮膚線維芽細胞株（すなわち、ＧＡＲＳ変異を有さない）と比較して、患者細胞由来の全細胞溶解物についてウエスタンブロット分析を行った。

タンパク質発現研究のために、細胞を通常の条件下で培養および回収した。タンパク質を、１ｍＬの細胞溶解緩衝液［９９０μＬのＲＩＰＡ溶解緩衝液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）＋１０μＬの１００Ｘ Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）］で分離した。タンパク質濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して定量し、サンプルあたり１０μｇのタンパク質をウエスタンブロットで分析した。各タンパク質サンプルを、１Ｘ ＳＤＳサンプル緩衝液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）および５μＬの２−ｍｅベータメルカプトエタノール（β−ＭＥ）中で調製し、９９℃で１０分間煮沸した。サンプルを、プレキャスト４〜２０％トリス−グリシンゲル（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で１５０Ｖで１時間電気泳動した。タンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに２５Ｖで１．５時間転写した。メンブレンを、ブロッキング溶液中の以下の希釈、抗ＧＡＲＳ１：１，０００、抗ニューロピリン−１（アブカム社）１：１，０００、および抗アクチン（シグマアルドリッチ社）１：５，０００の各一次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。次いで、メンブレンを１Ｘ ＴＢＳＴで３回リンスして未結合の抗体を除去し、それぞれのＨＲＰ標識二次抗体および１：１０，０００でインキュベートした。メンブレンを１Ｘ ＴＢＳＴでリンスし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ基質およびエンハンサー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して露光させた。

これらの実験では、対照細胞株と比較して、影響を受けた線維芽細胞における総ＧＡＲＳタンパク質レベルの観察可能な差を明らかにせず、変異タンパク質が発現され安定であることと一致した（図１Ｂ）。

例３
マウスモデル
ＧＡＲＳに優性変異を有し、末梢ニューロパチーを引き起こすＣＭＴ２Ｄの３つのマウスモデルが本明細書に提供されている。これらのうちの２つは、マウス特異的対立遺伝子を担持し、Ｓｅｂｕｒｎら、Ｎｅｕｒｏｎ、５１：７１５−７２６（２００６年）およびＡｃｈｉｌｌｉら、Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ＆Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ、２：３５９−３７３（２００９年）に以前に記載されており、３番目は、例１に記載されるヒト疾患関連変異を有し、その作成は以下に記載されている。同時に、モデルは、様々な重症度を提供し、ヒト対立遺伝子を含む複数の対立遺伝子を前臨床試験で使用できるようにする。すべてのモデルは、長さに依存する末梢ニューロパチーを伴う優れた表面的妥当性を有し、表現型の根底にあるマウスＧａｒｓ遺伝子の優性変異を伴う構成概念妥当性を有する。

２つのマウス固有の対立遺伝子は、それらの神経筋表現型に基づいて同定された。Ｐ２７８ＫＹ対立遺伝子（別名Ｎｍｆ２４９）は、ジャクソン研究所で見出され、有髄末梢軸索の約２５％の喪失、軸索径の減少、神経伝導速度の低下、握力の低下、筋萎縮、ならびに神経筋接合部（ＮＭＪ）における除神経、部分的神経支配、および伝達欠損を伴う重度のニューロパチーを引き起こす。より軽度のＣ２０１Ｒ対立遺伝子は、英国における化学的変異誘発プログラムにおいて見出され、軸索の喪失は、ほとんどまたはまったくないが、軸索径の減少、伝導速度の減少、握力の減少、筋萎縮、および類似であるがより軽度のＮＭＪ欠損を示す。両株は比較的早期に影響を受け、Ｐ２７８ＫＹは２〜３週齢までに顕性表現型を示し、Ｃ２０１Ｒは４〜６週齢までに顕性表現型を示す。いずれも、長さ依存性運動神経支配欠損を有する。重度のＰ２７８ＫＹ対立遺伝子は、近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドにおいて約８週間で遺伝的バックグラウンド依存性の致死性を示す。混合遺伝的バックグラウンドのＣ２０１ＲマウスおよびＰ２７８ＫＹマウスは、１年以上生存する。これらの対立遺伝子は、ＣＭＴ２Ｄ患者には見られないが、Ｃ２０１およびＰ２７８残基は、保存されている。

例１に記載されるように、ヒト疾患関連変異体は、ヒトＧＡＲＳ遺伝子のエクソン８における１２塩基対の欠失であり、タンパク質の２４５〜８位の４つのアミノ酸（ΔＥＴＡＱまたはＥｘ８Ｄ１２）を除去する。（ヒトタンパク質は、ミトコンドリアアイソフォームを産生する第１のＡＴＧではなく、ＧＡＲＳの細胞質ゾル形態である第２のＡＴＧから番号付けされることに留意されたい。したがって、ＥＴＡＱ２４５〜８は、マウスＰ２７８ＫＹ対立遺伝子−ヒトではＰ２３４のＣ末端にある１１アミノ酸である。）

ΔＥＴＡＱＧＡＲＳの病原性をインビボで明確に検証するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術を用いて、患者由来の変異をマウスＧＡＲＳ遺伝子のエクソン８に導入したマウスモデル（ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／＋}）を操作した。

対照として、野生型ヒトＧＡＲＳエクソン８（ｈｕＥｘ８）の配列もマウスゲノムに導入した。ＧＡＲＳ^{ｈｕＥｘ８／＋}について、マウスエクソン８配列を、ヒトエクソン８配列を含む二本鎖ドナーベクターで置換した。ドナーベクターは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＢＡＣライブラリーから単離された２．８ｋｂ長の５’ホモロジーアームおよび７ｋｂ長の３’ホモロジーアームに隣接するマウスエクソン８配列を含む１０ｋｂ配列を、このフラグメントに対する短い相同アームを含む回収ベクターに組換え操作することによって合成した。次いで、マウスエクソン８配列をベクターから除去し、制限消化およびその後のＴ４リガーゼによるライゲーションを介してヒトエクソン８配列に置き換えた。ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／＋}の場合、ドナー構築物は、ΔＥＴＡＱと呼ばれる１２塩基欠失（エクソン８の塩基１２〜２３）を含む短いホモロジーアーム（配列については下記参照）を有するマウスエクソン８の最初の５２塩基にわたるｓｓ−オリゴヌクレオチド配列からなっていた。

Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９試薬の調製およびマイクロインジェクションは、（Ｑｉｎら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｕｓｅ Ｂｉｏｌ．２０１６年、６（１）：３９−６６．）に記載のように行った。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ、ＴｒｉＬｉｎｋまたはインビトロ転写により合成）、ｓｇＲＮＡ、ガイド１４４および１３４０（５０ｎｇ／μｌ、以下のガイド配列）、および各ドナーベクター（２０ｎｇ／μｌプラスミドＤＮＡまたは１００ｎｇ／ｕｌ ｓｓＯＤＮ）を含むすべての成分を、前核段階で約３００接合体の雄性前核および細胞質に注入した。すべての接合体を、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ（ＪＡＸストック＃００５３０４）雄と交配した過剰排卵したＦＶＢ／ＮＪ（ＪＡＸストック＃００１６００）雌から単離した。その後、１５〜２５個の胚盤胞の群を偽妊娠雌の子宮に移した。
ｓｓＯＤＮドナー：ＡＧＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＡＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＴＴＴＡＴＴＧＧＡＡＧＣＡＣＡＴＴＧＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＴＡＧＡＴＡＣＴＴＧＡＧＡＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＴＣｔＴＧＡＡＴＴＴＣＡＡＡＣＧＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣ（配列番号６０）
ｓｇＲＮＡ １４４：ａａａａｔｔｃｃｃｔｇｔｇｃａｇｔｔｔｃ（配列番号６１）
ｓｇＲＮＡ １３４０：ｔｃａｇａａａｔｇａｇａｔｃｔｃａｃｃｔ（配列番号６２）

トランスジェニックマウスを、ヒト化エクソン８またはΔＥＴＡＱ構築物のいずれかの存在に基づいて遺伝子型決定した。ゲノムＤＮＡは、プロテイナーゼＫインキュベーションで溶解した尾部生検から調製した。ＧＡＲＳエクソン８の３’末端に対して２．８ｋｂの５’ホモロジーアームにわたるプライマーＨｕＥｘ８Ｆ０＿Ｆ：ＣＡＴＡＡＣＡＴＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号６３）およびＨｕＥｘ８Ｒ０＿Ｒ：ＣＡＡＧＴＧＴＧＧＣＧＧＴＴＴＣＣＡＴＣ（配列番号６４）、ならびにその後のＨｕＥｘ８Ｒ０＿Ｒを用いたサンガーシーケンシングを使用して、ＧＡＲＳ^{ｈｕＥｘ８}創始者およびその後の世代内のＧＡＲＳのエクソン８におけるヒト一塩基多型を同定した。プライマーｄｅｌＥＴＡＱＦ０＿Ｆ：ＧＧＣＣＡＴＡＡＧＣＡＴＡＡＴＴＴＴＡＣＴＧＴＧ（配列番号６５）およびΔＥＴＡＧＦ０＿Ｒ：ＴＡＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡ（配列番号６６）、続いてΔＥＴＡＧＦ０＿Ｒを用いたサンガーシーケンシングを行い、ＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／＋）}創始者およびその後の世代における塩基１３〜２４における１２塩基対欠失を検出する。

その後の前臨床試験のために、ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／＋}マウスをＧＡＲＳ^{ｈｕＥｘ８／ｈｕＥｘ８}と交配し、マウス遺伝子中に「ヒト化」野生型ＧＡＲＳエクソン８置換を有する対照マウスモデルを操作した。ＧＡＲＳ遺伝子は、イントロン／エクソン構造を含めて高度に保存されており、エクソン８によってコードされる５０個のアミノ酸は、マウスとヒトの間で１００％同一であるが、マウスとヒトのＧＡＲＳ／ＧＡＲＳエクソン８の間には、遺伝子サイレンシングの対立遺伝子特異性に影響を及ぼす可能性があるいくつかのサイレントな単一ヌクレオチドの相違があり、それによって野生型マウスエクソンをヒト化する必要がある。

この交配により、ＧＡＲＳ^{ｈｕＥｘ８／＋}同腹仔対照を有するＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスのコホートを作製した。ヘテロ接合マウスの坐骨神経から単離されたｃＤＮＡを用いた逆転写酵素ＰＣＲにより、ΔＥＴＡＱおよび野生型ＧＡＲＳの共発現が明らかになった（図Ｓ３Ａ）。プライマーＧＡＲＳ２Ｆ＿ＣＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＧＧＣＡＡＴＧＡＣ（配列番号６７）およびＧＡＲＳ２Ｒ＿ＣＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣ（配列番号６８）を使用して、ＧＡＲＳ^{（＋／ｈｕＥｘ８）}およびＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８）}マウスから単離した座骨神経ＲＮＡから産生した第１鎖ｃＤＮＡからＧＡＲＳエクソン８にわたるＧＡＲＳオープンリーディングフレームの一部を増幅した。ヒト化エクソン８およびΔＥＴＡＱ転写物の配列を、サンガーシーケンシングおよびプライマーＧＡＲＳ２Ｆを用いて同定した。

マウスを、ジャクソン研究所の研究動物施設の加圧個別換気（ＰＩＶ）ラックに収容し、食餌および水を自由に与えた。すべてのマウスの飼育および実験手順は、ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従って行い、Ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって審査および承認された。ＧＡＲＳ（ＣＡＳＴ、Ｂ６−ＧＡＲＳ^{Ｎｍｆ２４９}／Ｒｗｂ（ＧＡＲＳ^{Ｐ２７８ＫＹ／＋}と呼ばれる）は、（１７）に以前に記載されている。新たに操作されたマウスモデルの公式の系統指定は、Ｂ６、ＦＶＢ−ＧＡＲＳ＜ｅｍ１Ｒｗｂ＞／Ｒｗｂ（ＧＡＲＳ^{ｈｕＥｘ８}と呼ばれる）およびＢ６、ＦＶＢ−ＧＡＲＳ＜ｅｍ２Ｒｗｂ＞／Ｒｗｂ（ＧＡＲＳ^{（ΔＥＴＡＱ／＋）}と呼ばれる）である。特に明記しない限り、直接比較に使用したすべての実験コホートは、可能な最大限度まで系統および年齢を一致させる同腹子動物からなった。

タンパク質レベルでは、ポリクローナル抗ＧＡＲＳ抗体を用いたマウス脳ホモジネートのウエスタンブロット分析により、ΔＥＴＡＱＧＡＲＳがＧＡＲＳタンパク質レベルを変化させないことが確認され、患者の線維芽細胞を用いた本発明者らの結果と同様に、安定な転写物およびタンパク質産物がΔＥＴＡＱ対立遺伝子から産生されることが示唆された（図３Ｂ）。全脳サンプルを、ＣＯ２吸入によって安楽死させた直後に動物から単離した。組織を液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。乳鉢および乳棒を使用してサンプルをホモジナイズし、続いて、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（ロシュ社、スイス、バーゼル）を補充したリン酸緩衝生理食塩水中の１％ＮＰ−４０中でＤｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用してホモジナイズし、次いで、１４０００ｇで２回、５分間、４℃で遠心分離した。次いで、清澄化したホモジネートを４℃で超音波処理し、１４，０００ｇで５分間再度遠心分離した。次いで、２０μｇのタンパク質をイムノブロットで分析した。タンパク質溶解物をＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ４〜１５％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（バイオラド社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で分離し、ウエスタンブロット分析のためにＩｎｖｉｔｒｏｌｏｎ＆Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ ＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンをＴＢＳＴ中の５％スキムミルク（１ｘ Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロックし、ブロッキング溶液で希釈した抗ＧＡＲＳ（ウサギ、アブカム社、１：１０００希釈）および抗ＮｅｕＮ（マウスモノクローナル、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、１：１０００）と共に４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄した後、ブロッキング溶液で希釈した適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（パーキンエルマー社、マサチューセッツ州ボストン）と共にブロットをインキュベートした。ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄した後、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ−ＥＣＬ、エンハンスド化学発光基質（パーキンエルマー社、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用してブロットを展開した。

１２週齢で、ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}およびＧＡＲＳ^{ｈｕＥｘ８／＋}同腹仔を、ＣＭＴ２Ｄの他のマウスモデルにおいて観察されるように、原発性ニューロパチーの特徴について評価した（Ｓｅｂｕｒｎら、前出、Ａｃｈｉｌｌｉら、前出）。握力は、総筋力と持久力を評価するために、ワイヤーハング試験［Ｍｏｔｌｅｙら、ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．、７：ｅ１００２３９９（２０１１年）］によって評価した。神経伝導検査、運動神経組織学および分析、神経筋接合部免疫蛍光法および分析、ならびに体重評価を、［Ｍｏｔｌｅｙら、前出、Ｍｏｒｅｌｌｉら、Ｃｅｌｌ．Ｒｅｐ．、１８：３１７８−３１９１（２０１７年）］に以前に記載されたように完了した。これらの以前のモデルと同様に、ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスは、ｈｕＥｘ８／＋対照と比較して、明白な神経筋機能障害、ならびに体重（ｐ＝０．０００６）および握力（ｐ＝０．０００２）の有意な減少を示した（図２Ｂ〜図２Ｃ）。ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスにおける組織学的変化は、軸索数（ｐ＝０．０２９３）および軸索径（ｐ＝＜０．０００１）の全体的な減少を含む、大腿神経の運動分枝の断面において観察された（図２Ｄ〜図２Ｆ）。神経伝導速度（ＮＣＶ）も６２％減少し、対照動物の３５±６．２９ｍ／ｓから変異マウスの坐骨神経の１３．５±４．１ｍ／ｓ（ｐ＝０．０００２）に低下した（図２Ｇ）。この減少は、他のマウスＧＡＲＳニューロパチーモデルおよびＧＡＲＳ媒介末梢ニューロパシー（ＣＭＴ２Ｄ）の一部の患者で観察されたＮＣＶと一致していた。運動軸索の喪失は、遠位筋の神経筋接合部（ＮＭＪ）の同時破壊をもたらした。足底筋におけるＮＭＪのシナプス後受容体野は、対照同腹仔において運動神経末端によって完全に占有されたが、ΔＥＴＡＱ変異を発現したマウスでは、ＮＭＪの６０％±１４．２％が部分的に占有され、８．５％±９．９％が完全に除神経された（図２Ｈ〜図２Ｊ）。したがって、ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスは、ＣＭＴ２Ｄの確立されたマウスモデルで観察されたものと同様の末梢ニューロパチーの主要な特徴を示し、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ変異が実際に病原性であり、例１に記載の患者で観察されたニューロパチーの原因であることが確認される。

例４
ＧＡＲＳ遺伝子に特異的なマイクロＲＮＡ
ＲＮＡｉを使用して変異型ＧＡＲＳの対立遺伝子特異的ノックダウンを達成するために、本発明者らはまず、ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスでの分解のためにΔＥＴＡＱ転写産物を特異的に標的とするように設計されたｍｉＲＮＡシャトルを操作した（図４Ａ〜図４Ｂ、図５）。具体的には、本発明者らは、分解のためにヒトおよびマウス変異型ＧＡＲＳΔＥＴＡＱ ｍＲＮＡの両方を特異的に標的とするように設計された成熟ガイド鎖を有する６つの異なるｍｉｒ−３０ベースの人工マイクロＲＮＡシャトル（ｍｉ．ΔＥＴＡＱ１−６）を設計した（図４Ｂ、図５）。

人工マイクロＲＮＡには、アンチセンス５’末端の最後の４ヌクレオチドはＡ：Ｕリッチであり、アンチセンス３’末端の最後の４ヌクレオチドはＧ：Ｃリッチであるように、２２ｎｔの成熟ｍｉＲＮＡ長、標的ｍＲＮＡに対する完全なアンチセンス相補性（ＧＡＲＳ、ＧＡＲＳ）、成熟二重鎖の６０％未満のＧＣ含有量、およびガイド鎖バイアスを含んでいた。変異型ＧＡＲＳ標的化マイクロＲＮＡ構築物は、変異体Ｐ２７８ＫＹまたはΔＥＴＡＱ対立遺伝子に存在する異なるヌクレオチドに集中したシードマッチ領域を有し、成熟ｍｉＲＮＡガイド鎖と野生型ＧＡＲＳ／ＧＡＲＳとの間に意図的なミスマッチを有した。ｍｉｃｒｏＲＮＡ構築物をコードするＤＮＡを、Ｕ６Ｔ６ベクターに（ＸｈｏＩおよびＸｂａＩを介して）一晩ライゲーションした。このベクターは、マウスＵ６プロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結シグナル（６チミジンヌクレオチド）を含む。ＤＮＡを、Ｕ６プロモーターの３’末端と終結シグナルとの間に位置するＸｈｏＩ＋ＸｂａＩ制限部位にクローニングした（各ｍｉＲＮＡについてのＤＮＡ鋳型の３’末端上のＳｐｅＩは、ＸｂａＩ部位と相補的な付着末端を有する）。ライゲーション産物を４２℃の熱ショックで化学的にコンピテントなＥ−ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、３７℃で１時間振とうした後、カナマイシン選択プレートに播種した。コロニーを３７Ｃで一晩増殖させた。翌日、それらをミニプレップし、正確に配列決定した。

得られたベクターは、ΔＥＴＡＱまたは野生型ＧＡＲＳ標的配列をウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼの３’ＵＴＲにクローニングし、ホタルルシフェラーゼを標準として使用する初期インビトロ二重ルシフェラーゼスクリーニングアッセイ［Ｂｏｕｄｒｅａｕら、Ｈａｒｐｅｒ編、ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１巻、１９〜３７ページ、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク（２０１１年）］に使用した。二重ルシフェラーゼプラスミドを、Ｐｓｉｃｈｅｃｋ２ベクター（プロメガ社）を使用して作成し、トランスフェクション対照として機能するホタルルシフェラーゼカセット使用し、様々なＧＡＲＳ遺伝子の標的領域をウミシイタケルシフェラーゼのストップコドンの下流にクローニングすることで、３’ＵＴＲとして使用した。ＨＥＫ２９３細胞を、適切な二重ルシフェラーゼレポーターおよび個々のＵ６．ｍｉＲＮＡ発現プラスミドを１：５のモル比で共トランスフェクトした（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００、インビトロジェン社）。ＧＡＲＳサイレンシングは、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を使用して、トランスフェクションの２４時間後にホタルおよびウミシイタケ活性を測定することにより決定した。三連のデータを平均、二元配置分散分析を使用してノックダウンの有意性を分析した。結果は、ウミシイタケ対ホタル±ＳＥＭの平均比率として表される。

これらの構築物のいくつかは、ΔＥＴＡＱ変異対立遺伝子を特異的にサイレンシングするのに効果的であることが証明され、ｍｉＥｘ８Ｄ１２−１Ａをリード候補として選択した（図５Ｂ）。しかし、マウスΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ遺伝子を標的としてこのルシフェラーゼアッセイを繰り返した場合、リードｍｉＲＮＡは変異対立遺伝子をノックダウンできなかった（図５Ｃ）。これは、アミノ酸配列が同一であるにもかかわらず、ヒトと比較してマウスのｍＲＮＡ配列がわずかに異なるためである可能性がある（図５Ｄ）。マウスモデルで試験できるｍｉＲＮＡを有するために、本発明者らは、ｍｉΔＥＴＡＱ１−６と命名されたｍｉＥｘ８Ｄ１２−１Ａの６つの変異体を作成した（図５Ｅ）。これらのｍｉＲＮＡは、ヒトΔＥＴＡＱＧＡＲＳを標的とする能力を失うことなく、マウスΔＥＴＡＱ遺伝子に対する相補性を増加させるために、元の配列に対して１つまたは２つの点変異を有していた。ｍｉΔＥＴＡＱ−５は、ヒトおよびマウス変異対立遺伝子の両方に対して非常に効果的であり、「ｍｉΔＥＴＡＱ」と改名され、以降のすべてのインビトロ研究で使用された（図４）。

例５
ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱの産生
インビトロ試験が完了した後、ｍｉ．ΔＥＴＡＱ（図４Ｂ）を、インビボでの送達のためにｓｃＡＡＶ９にクローン化した。「ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱ」と命名されたｓｃＡＡＶ９はまた、ＣＭＶプロモーター駆動ｅＧＦＰレポーター遺伝子を含んでいた。ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱは、変異型ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）および自己相補的ＡＡＶゲノムのパッケージングを可能にする野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。

ｓｃＡＡＶ９は、二本鎖ＡＡＶ２−ＩＴＲベースのベクターを用いて、アデノウイルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（ストラタジーン社、カリフォルニア州サンタクララ）と共に、以前に記載されたようなＲｅｐ２Ｃａｐ９配列をコードするプラスミド［Ｇａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７８：６３８１〜６３８８（２００４年）］を用いて２９３細胞において産生した。ウイルスを、実験のために３つの別個のバッチで産生し、２つの塩化セシウム密度勾配精製工程によって精製し、ＰＢＳに対して透析し、ウイルス凝集を防ぐために０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８と配合し、４℃で保存した。すべてのベクター調製物を、Ｔａｑ−Ｍａｎ技術を使用した定量的ＰＣＲによって力価測定した。ベクターの純度は、４〜１２％ドデシル硫酸ナトリウム−アクリルアミドゲル電気泳動および銀染色（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）によって評価した。

ｓｃＡＡＶ９ウイルスを産生し、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌの研究所のＶｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって力価測定した。

例６
ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．Ｐ２７８ＫＹおよびｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱの新生仔送達
インビトロでのこのアプローチの原理証明を最初に確立するために、本発明者らは、疾患発症前の変異型ＧＡＲＳ発現の減少が、ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスにおけるニューロパチーの発症を防ぐことができるかどうかを試験した。総用量約２．６×１０^１１ｖｇのｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱまたはｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ｌａｃＺ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ遺伝子を標的とする対照マイクロＲＮＡを発現する）を、生後０〜１日目（Ｐ０〜１）に脳室内（ＩＣＶ）注射で、ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}および同腹仔対照（ＧＡＲＳ^{ｈｕＥｘ８／ｈｕＥｘ８}）仔に送達した。

Ｐ０〜Ｐ１でのマウスの全ての注射の前に、全ての仔を寒冷麻酔によって麻酔した。適切に麻酔をかけた後、３２ゲージ針を備えたハミルトンシリンジ（カタログ番号６５４６０＿０３）を使用して、すべての脳室内注射を行った。すべての遺伝子療法ベクターは、矢状縫合に対して直接外側に、新生仔冠状縫合に対して吻側に針を配置することにより、側脳室に注射した。静脈内注射の場合、３２ゲージ針を備えたハミルトンシリンジ（カタログ番号７６５５−０１）を使用して、すべての寒冷麻酔マウスに、１×１０^１１ＤＲＰＳ／マウスを尾側方向に浅側頭静脈に直接注射した。

すべてのマウスを、４週齢で、ニューロパチーの明白な徴候の最初の発症から約１．５週間後、確立されたニューロパチーの徴候について評価した。ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱで処置したＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスは、対照処置ΔＥＴＡＱマウスと比較して、握力のワイヤーハング試験における有意な改善、筋肉対体重比（ＭＷ：ＢＷ）の増加、および坐骨神経伝導速度（ＮＣＶ）の改善を示した（図４Ｃ〜図４Ｅ）。大腿神経の運動分枝の断面の検査により、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱ処置が、未処置および賦形剤対照処置ΔＥＴＡＱマウスにおいて観察された軸索喪失が防止され、軸索径の減少を軽減したことを明らかにした（図４Ｆ〜図４Ｈ）。重要なことに、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱ（またはｓｃＡＡＶ９．ＬａｃＺ）の注射は、これらの結果測定のいずれによっても、または明白な反応についての観察によっても、対照マウスにおいて有害作用を引き起こさなかった。まとめると、これらのデータは、疾患発症前の変異型ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ発現の対立遺伝子特異的ノックダウンが有意な治療効果を有し、ニューロパチーの行動的、生理学的、組織学的徴候をほぼ完全に予防することを示し、ウイルス送達ＲＮＡｉを使用する対立遺伝子特異的ノックダウンがＣＭＴ２Ｄを処置するための有効なアプローチであり得るという概念実証データを提供する。

例７
発症後のマウスへの遺伝子療法構築物の髄腔内送達
この戦略の翻訳的性質を実証するために、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱを、初期（５週齢）および後期（９週齢）の症候性ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスおよび同腹仔対照の両方のコホートに、腰髄への単回髄腔内（ＩＴ）注射によって送達した。３２ゲージ針を備えたハミルトンシリンジ（カタログ番号７６５５−０１）を使用して、全成人発症後マウスに、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（約１０μｌ）に希釈したｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．Ｐ２７８ＫＹまたはｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱの約１×１０^１１ＤＲＰＳ／マウスを腰椎穿刺による髄腔内注射で注射した。ここでは、すべてのマウスをイソフルランで麻酔し、３２ゲージ針を備えたハミルトンシリンジを使用して、Ｌ６棘突起に適切なベクターを注射した。各ベクターをゆっくりと注射し、針を抜去する前に５〜１０秒間そのままにした。

処置せずに放置すると、５週齢の初期症候性ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスは活発な軸索喪失を受けるが、９週齢の後期症候性ΔＥＴＡＱマウスでは軸索喪失が遅くなり、筋萎縮が加速する。

ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱで処置した初期症候性ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスは、未処置対照と比較して、処置の約５週間後で握力の強化および体重の有意な増加を示した（図６Ａ）。処置後７週間でニューロパチーの一次徴候について分析した場合、初期症候性ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスはまた、未処置ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスと比較して、ＭＷ：ＢＷ比の有意な増加、神経伝達速度、ＮＭＪ神経支配および軸索喪失の減少を示したが、軸索サイズの改善はなかった（図６Ｂ〜図６Ｄ、図６Ｆ）。９週齢でｓｃＡＡＶ９−ｍｉ．ΔＥＴＡＱで処置した場合、ＧＡＲＳ^{ΔＥＴＡＱ／ｈｕＥｘ８}マウスは体重が増加し、処置後５〜７週目に開始して握力の増強を示した（図６Ａ）。ＭＷ：ＢＷ比は改善されず、軸索喪失および萎縮は予防されなかったが、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱは、神経伝導速度およびＮＭＪ神経支配を改善した（図６Ｂ、Ｅ〜Ｆ）。

統計的試験は、ＧｒａｐｈＰａｄのＰｒｉｓｍ７ソフトウェアを使用して行った。両側ｔ検定、一元配置分散分析または二元配置分散分析、続いてＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後比較検定（図の凡例に示す）を使用して、軸索カウント、伝導速度、握力、および体重についての処置および／または遺伝子型間の有意差を決定した。軸索径は、ノンパラメトリックなコルモゴロフ−スミルノフ２標本検定およびシャピロ−ウィルクの正規性検定を使用して比較した。遺伝子型とカテゴリー（完全に神経支配されている、部分的に神経支配されている、および除神経されている）との間のＮＭＪ神経支配状態を、二元配置分散分析、続いてＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後比較検定で評価した。

全肝臓および腰椎後根神経節サンプルは、頸椎脱臼により安楽死させた直後に動物から単離した。組織を液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。乳鉢および乳棒、続いてＤｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用してサンプルをホモジナイズし、Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャー社、カタログ番号１５５９６０１８）を使用して肝臓から、およびＲＮｅａｓｙＭｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社、カタログ番号７４１０４および７４１０６）またはｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号ＡＭ１５６０）のいずれかを使用して後根神経節から、ＲＮＡを単離した。すべてのＲＮＡサンプルは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号１８０８００５１）を使用して逆転写した。野生型および変異型ＧＡＲＳの対立遺伝子特異的発現を定量化するために、ＥｐｉｇｅｎＤｘ（ｈｔｔｐ：／／ｅｐｉｇｅｎｄｘ．ｃｏｍ／ｄ／）は、カスタムアッセイを使用して、製造元の指示に従ってＰＳＱ９６ ＨＳ Ｓｙｓｔｅｍ（キアゲン社）でパイロシーケンシングを行った。ｓｃＡＡＶ９によっても形質導入された感覚後根神経節（ＤＲＧ）からのｍＲＮＡのパイロシーケンシングによる分析は、変異型ＧＡＲＳ ｍＲＮＡレベルがｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．ΔＥＴＡＱ処置マウスにおいて有意に低下したことを示した。以下の表１を参照されたい。

本発明者らのアプローチがＣＭＴ２Ｄに一般的に適用可能であることを確立するために、本発明者らは、ＣＭＴ２Ｄの２番目のマウスモデルであるＧＡＲＳ^{Ｐ２７８ＫＹ／＋}でその有効性を確認した。マウスＰ２７８ＫＹ対立遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡシャトルを、本発明者らのルシフェラーゼアッセイにおいて最適化し、以前と同様にｓｃＡＡＶ９にパッケージングした（図７）。同様の改善が、ＩＣＶ（新生仔）またはＩＶ（成体）注射によって送達されたｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．Ｐ２７８ＫＹの１ｘ１０^１１ウイルスゲノムで処置された新生仔、初期および後期症候性ＧＡＲＳ^{Ｐ２７８ＫＹ／＋}マウスで観察された（図８、図９）。さらに、ｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．Ｐ２７８ＫＹの治療効果は用量依存的であり、同じ総用量を送達する全身静脈内注射と比較して、ＩＣＶ送達の方が大きかった（図１０）。Ｐ０での高用量（１ｘ１０^１１ｖ．ｇ．）のｓｃＡＡＶ９．ｍｉ．Ｐ２７８ＫＹのＩＣＶ送達の有益な効果は、少なくとも１年続いた（図１１）。

後根神経節内の変異型ＧＡＲＳ転写産物のノックダウン効果（表１〜３）は、両方の発症後研究（図１２Ａ〜図１２Ｂ、図１２Ｅ〜図１２Ｆ）内の治療結果と強く相関した。

この相関は、ｓｃＡＡＶ９によって形質導入された別の末梢組織である肝臓における変異型ＧＡＲＳ ｍＲＮＡレベルと結果を比較した場合よりも、ＤＲＧでより強かった（図１２Ｃ〜図１２Ｄ、図１２Ｇ〜図１２Ｈ）。これは、細胞自律メカニズムを介してニューロパチーを引き起こすＧＡＲＳの変異型と一致している。

これらのデータは、ＣＭＴ２Ｄ患者の一般的な治療戦略としての対立遺伝子特異的ノックダウンを示している。まとめると、これらのデータは、対立遺伝子特異的ＲＮＡｉベースの遺伝子療法が、「ヒト化」モデルを含むＣＭＴ２Ｄのマウスモデルにおけるニューロパチーの症状を改善することができ、さらには疾患の発症後の段階でも改善することができることを確認する。

例８
ｒＡＡＶ９−ｍｉＧＡＲＳ／ｒＧＡＲＳベクターおよび使用
ＲＮＡｉにより変異型および野生型Ｇａｒｓ発現をノックダウンし、また、ＲＮＡｉ耐性ｃＤＮＡ（ｒＧＡＲＳ）により野生型Ｇａｒｓ発現を回復させるｒＡＡＶ９（ｒＡＡＶ９−ｍｉＧＡＲＳ／ｒＧＡＲＳベクター）を作成する。ベクターには２つの重要な構成要素である（１）ＧＡＲＳ標的化マイクロＲＮＡをコードするカセット、（２）ＲＮＡｉ耐性置換ヒトＧＡＲＳ ｃＤＮＡカセット（２．２ｋｂ）がある。ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含むペイロードの合計サイズは約４．０ｋｂであり、それによりｓｓＡＡＶベクターの使用が必要となる。２つのカセットは、ヘッドトゥーテールの方向（プロモーターが５’末端であり、そしてターミネーターまたはポリＡが３’である）で並んでクローニングされる。

人工ｍｉＲＮＡは天然のｍｉｒ−３０に基づいており、正常なｍｉＲＮＡ生合成に必要な重要な構造要素および配列要素を維持するが、成熟ｍｉｒ−３０配列をＧＡＲＳ遺伝子と完全に相補的な２２ｎｔで置換する。さらに、「ｍｉＧＡＲＳ」は、マウスおよびヒトＧＡＲＳ遺伝子間の共通領域を標的とする一方で、ＣＭＴ２Ｄに関連する既知のＧＡＲＳ変異を含む任意の配列を回避する。図１３Ａを参照されたい。この設計戦略には、２つの主要な利点である（１）非対立遺伝子特異的ＧＡＲＳ遺伝子サイレンシング、および（２）ヒトで直接翻訳可能なマウスでの有効性の試験がある。ｍｉＧＡＲＳは、Ｕ６プロモーターから転写される。ｍｉＲＮＡ発現カセットのサイズは、約５００ｂｐである。ｍｉＧＡＲＳの配列を図１４に示す。

約２．２ｋｂの完全長ヒトＧＡＲＳ ｃＤＮＡを改変して、ｍｉＧＡＲｓによるノックダウンに対して耐性にする。これを行うために、ｃＤＮＡによってコードされる野生型ＧＡＲＳアミノ酸を変化させることなく、ｍｉＧＡＲＳの結合性部位内のｃＤＮＡ中のヌクレオチドゆらぎ位置を変異させる。図１３Ｂを参照されたい。例示的なｃＤＮＡ配列を図１５に示す。ＲＮＡｉ耐性ＧＡＲＳ ｃＤＮＡ（「ｒＧＡＲＳ」と呼ばれる）は、８００ｂｐのニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターから転写される。約２００ｂｐのＳＶ４０ポリＡシグナルがＯＲＦの３’末端に配置される。ｒＧＡＲＳ発現カセットの合計サイズは、３，２００ｂｐである。短い人工３’ＵＴＲを付着させて、ｒＧＡＲＳを特異的に検出し、それを内因性マウスまたはヒトＧＡＲＳ対立遺伝子と区別できるようにする。＜ｂ＞

ＧＡＲＳＣＭＴ２Ｄ ΔＥＴＡＱマウスモデルに、ｒＡＡＶ９−ｍｉＧＡＲＳ／ｒＧＡＲＳベクターを、発症前（Ｐ０でのＩＣＶ）および発症後（髄腔内）の２つの時点で最大有効用量で投与する。Ｐ２７８ＫＹおよびＣ２０１Ｒマウスも投与することができる。コホートのサイズは、１群あたり最大２０匹のマウスである。群は、処置、陰性対照（ＡＡＶ９−ＬａｃＺ）および陽性対照（ΔＥＴＡＱについての対立遺伝子特異的ノックダウンベクター）群に無作為に割り当てられたＧａｒｓ変異マウスおよび同腹仔対照を含む。行動試験（握力）、非侵襲的ＮＣＶ／ＥＭＧ、および体重を用いてマウスを長期的にモニタリングする。各遺伝子型のマウスの１つのコホートを、短期間の有効性を示すために、処置の１〜２ヶ月後に詳細に分析する。第２のコホートを加齢させて、効果の持続性を決定する。最終結果の測定には、神経組織学、神経筋接合部分析、および筋肉重量および／または筋肉組織学が含まれる。

例９
ＧＡＲＳ交換活動レベルの目標
正常な機能に必要な野生型Ｇａｒｓ遺伝子発現の下限を定義するために実験を行った。

ＣＭＴ２Ｄは、ヒト患者とマウスの両方における常染色体優性疾患である。したがって、野生型対立遺伝子を乱さないまま変異対立遺伝子を特異的に減少させると、ＧＡＲＳ遺伝子発現の通常の半分の量になる。ホモ接合型ＧＡＲＳヌルマウスは胚として死亡するが、ヘテロ接合型Ｇａｒｓ^＋／ヌルマウスは正常な表現型を示し、正常な表現型に十分な１００パーセント未満のＧＡＲＳ活性レベルが存在することが実証される。

正常な表現型に十分な野生型ＧＡＲＳ活性の下限を決定するために、野生型マウスＧＡＲＳ（ｍｉＷＴ）（図１６Ａ）を標的とするマイクロＲＮＡを担持するＡＡＶ９ベクターを新生仔ＧＡＲＳ^＋／＋およびＧＡＲＳ^ヌル／＋マウスに送達した。ｍｉＷＴ処置ＧＡＲＳ^ヌル／＋マウスは処置後２４時間以内に死亡したが、ｓｃＡＡＶ９によって形質導入された組織内の総ＧＡＲＳ発現の約７０％の減少は、ＧＡＲＳ^{（＋／＋）}マウスによってその発育全体を通して許容された（図１６Ｂ）。

このような総ＧＡＲＳの減少がニューロパチーを引き起こさなかったことを確認するために、成体ｍｉＷＴ処置ＧＡＲＳ^＋／＋を、握力および神経伝達速度の減少の可能性、ならびに軸索萎縮を含むニューロパチーの徴候について分析した。注目すべきことに、ＣＭＴ２Ｄのすべて確立されたマウスモデルでニューロパチーの発症が発生する年齢である１２週齢では、ｍｉＷＴ処置ＧＡＲＳ^{（＋／＋）}は表現型的に正常であり、軸索変性のいかなる徴候も示さなかった（図１６Ｃ〜図１６Ｄ）。

したがって、これらのデータは、野生型ＧＡＲＳ発現の約３０％が正常な表現型に十分であることを示している。さらに、これらのデータは、ＧＡＲＳ関連のＣＭＴ２Ｄが、標準的なＧＡＲＳ活動の喪失だけでなく、毒性の機能獲得またはドミナントネガティブメカニズムによって引き起こされることを裏付けている。

例１０
ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳは、酵素の主要な機能に影響を与える。
ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳが酵素の主要な機能に影響を与えるかどうかを評価するために、実験を行った。アミノアシル化アッセイおよび酵母相補性試験の両方を行った。

アミノアシル化アッセイでは、野生型および変異型ＧＡＲＳタンパク質を、Ｃ末端にＨｉｓタグを付けてＥ．ｃｏｌｉで発現させ、ニッケルアフィニティー樹脂（ノバジェン社）で精製した。ヒトｔＲＮＡ ^{Ｇｌｙ／ＣＣＣ}（ＣＣＣ、アンチコドン）のＴ７転写産物を調製し、以前に記載されたように精製し（Ｈｏｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３年、９０（１４）：６７７６〜８０）、８５℃で３分間熱変性させ、使用前に３７℃で２０分間アニーリングさせた。定常状態アミノアシル化アッセイを、３７℃で、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ２８ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＡＴＰ、および５０μＭ ３Ｈ−グリシン（パーキンエルマー社）中、１６５００ｄｐｍ／ｐｍｏｌｅの比活性でモニタリングした。ＧＡＲＳ酵素（ＷＴ酵素では２０ｎＭ、ΔＥＴＡＱおよびＰ２３４ＫＹ変異型では６００ｎＭ）を様々な濃度のｔＲＮＡ（０．３〜２０μＭ）と混合することにより、反応を開始した。反応混合物のアリコートを濾紙上にスポットし、５％トリクロロ酢酸でクエンチし、洗浄し、乾燥させ、液体シンチレーションカウンター（ＬＳ６０００ＳＣ、ベックマン・コールター社）を使用して放射能を測定した。フィルターパッドに保持された放射能の量を、Ｇｌｙ−ｔＲＮＡ Ｇｌｙの合成量を決定するためにクエンチ効果について補正した。定常状態速度は、ｔＲＮＡ濃度の関数としてのアミノアシル化の初期速度をミカエリス−メンテン式に適合させることによって決定した（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９７２年、１１（９）：１５８２〜９）。

内因性ＧＲＳ１遺伝子座が欠失し、野生型ＧＲＳ１遺伝子を発現するｐＲＳ３１６ベクターを介して生存能力が維持された一倍体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を使用して酵母相補性アッセイを行った（Ａｎｔｏｎｅｌｌｉｓら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００６年、２６（４１）：１０３９７〜４０６、Ｔｕｒｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００年、２７５（３６）：２７６８１〜８）。野生型および変異型ＧＡＲＳ対立遺伝子が細胞増殖を支持する能力を評価するために、一倍体酵母株を野生型または変異型構築物ト、またはＧＡＲＳインサートを有しない構築物で形質転換した。形質転換された酵母細胞を、ロイシンおよびウラシルを欠く固体培地上での増殖により、維持ベクターおよび実験ベクターの両方の存在について選択した。コロニーは、ロイシンおよびウラシルを欠く２ｍＬの液体培地で、３０℃、２７５ｒｐｍで４８時間飽和するまで増殖させた。未希釈培養物ならびに１：１０および１：１００の希釈物を、０．１％５−ＦＯＡ（Ｔｅｋｎｏｖａ社、カリフォルニア州ホリスター）を含有する完全固体培地上にスポットし、５−ＦＯＡは、維持ベクターを自然に失った細胞を選択する（Ｂｏｅｋｅら、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９８４年、１９７（２）：３４５−６）。３０℃で４日間培養した後、酵母の生存率を評価した。形質転換ごとに少なくとも２つのコロニーをアッセイし、各形質転換を少なくとも２回繰り返した。

ｔＲＮＡ基質濃度の関数としてのアミノアシル化の初期速度の分析は、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳが野生型ＧＡＲＳと比較して０．０１％未満のアミノアシル化活性を保持することを示し、それが機能的ヌル対立遺伝子であることを示す。並行して、前述のマウス対立遺伝子であるＰ２３４ＫＹ（マウスにおけるＰ２７８ＫＹ、２３４は４４アミノ酸ミトコンドリア標的化配列を含まずに番号付けされる）を、タンパク質内の近くの位置を考慮して試験した（Ｓｅｂｕｒｎら、Ｎｅｕｒｏｎ．２００６年、５１（６）：７１５〜２６）。Ｐ２３４ＫＹ対立遺伝子は、飽和ｔＲＮＡおよびグリシン基質濃度を用いたアッセイで活性を示したが（Ｓｅｂｕｒｎ、前出）、ミカエリス−メンテン条件下での速度論的特性の再評価は、酵素活性の著しい低下を示し、ＤＥＴＡＱ ＧＡＲＳをＰ２３４ＫＹ ＧＡＲＳと高度に類似させた。ΔＥＴＡＱ対立遺伝子の機能低下は、この変異タンパク質が酵母オルソログＧＲＳ１の欠失に関連する除去された細胞増殖を補完できないことによってさらに裏付けられた。この後者のアッセイからのデータはまた、Ｐ２７８ＫＹ ＧＡＲＳに関連するＬｏＦ効果も支持しており、マウスＰ２７８ＫＹ対立遺伝子がＧａｒｓのＲＮＡヌル対立遺伝子を相補しないことと一致する（Ｓｅｂｕｒｎ、前出）。

例１１
ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳは、ＮＲＰ１とのわずかに異常な相互作用を示した。
ニューロパチー関連ＧＡＲＳ変異は、ニューロピリン−１（ＮＲＰ１）への不適切な結合を引き起こし、運動ニューロンにおけるＮＲＰ１／ＶＥＧＦシグナル伝達の障害をもたらす（２３）。ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳとＮＲＰ１との間の結合を直接試験するために、Ｖ５タグ付き野生型、Ｐ２３４ＫＹ、およびΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳをマウス運動ニューロン細胞株ＮＳＣ−３４で発現させた。

ＮＳＣ−３４細胞株はＡＴＣＣから購入し、標準的な条件下で培養した。トランスフェクションの前に、細胞を７０％の集密度まで増殖させた。ヒト野生型、Ｐ２３４ＫＹ、またはΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳ ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ６プラスミドにクローニングし、Ｖ５タグを使用してＧＡＲＳをインフレームで発現させた。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（インビトロジェン社）を製造元の指示に従って使用して行った。細胞溶解物の調製では、ＮＳＣ−３４細胞（トランスフェクションの３６時間後）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＰＢＳにこすり落とし、ペレット化し、Ｐｉｅｒｃｅ ＩＰ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（サーモサイエンティフィック社）に３０分間再懸濁し、１２０００×ｇで７分間遠心分離し、不溶性画分を廃棄した。プロテインＧビーズ（インビトロジェン社）を抗ＮＲＰ１抗体（アブカム社）またはウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）と３０分間プレインキュベートした後、細胞溶解物と一晩混合した。次いで、ビーズを緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５％グリセロール）で３回洗浄した。免疫沈降物を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｐｌｕｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（インビトロジェン社）で分画し、ｉＢｌｏｔドライブロッティングシステム（インビトロジェン社）を使用してＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンは、５％脱脂粉乳を含有するＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で１時間ブロックした。野生型および変異型ＧＡＲＳタンパク質を、インビトロジェン社から購入したマウスモノクローナルＶ５抗体を使用して検出した。ＮＲＰ１を、共免疫沈降に同じ抗体を利用することによって検出した。一次抗体とのインキュベーション後、メンブレンを洗浄し、ＨＲＰ標識抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）とインキュベートした後、ＥＣＬウエスタンブロッティング基質（サーモサイエンティフィック社）を使用して検出し、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ Ｍイメージャー（プロテインシンプル社）を使用して露光した。

抗ＮＲＰ１抗体で免疫沈降した後、タンパク質を、抗Ｖ５抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した。報告されている（２３）ように、Ｐ２３４ＫＹ ＧＡＲＳに関連する強いＶ５シグナルとは対照的に、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳに関連するＶ５シグナルは、Ｖ５シグナルを示さなかった野生型ＧＡＲＳよりも強いが、はるかに弱かった。それにもかかわらず、ＦＬＡＧタグ付き野生型またはＶ５タグ付きΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳを発現するマウス神経芽細胞腫（ＭＮ１）細胞から免疫沈降したタンパク質の不偏質量分析では、ΔＥＴＡＱ ＧＡＲＳとＮＲＰ１との間の相互作用は検出されなかった。要約すると、ΔＥＴＡＱは、アミノアシル化活性に深刻な欠陥を示し、ＮＲＰ１との相互作用は最良でもわずかに異常であった。

本発明は特定の実施形態に関して記載されてきたが、当業者には変更および修正が行われることが理解される。したがって、特許請求の範囲に見られるそのような制限のみが、本発明に課せられるべきである。

本出願で参照されるすべての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (38)

1. 核酸であって、
   （ａ）配列番号１〜２５のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むグリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧＡＲＳ）ｍｉＲＮＡをコードする核酸、
   （ｂ）配列番号２６〜５０のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＧＡＲＳガイド鎖をコードする核酸、あるいは
   （ｃ）配列番号１〜２５のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードする核酸、および配列番号５１〜５７のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むＲＮＡｉ耐性ＧＡＲＳ遺伝子を含む核酸を含む、核酸。
2. 請求項１に記載の核酸またはそれらのいずれか１つまたは複数の組み合わせを含むウイルスベクター。
3. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または合成ウイルスである、請求項２に記載のウイルスベクター。
4. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶである、請求項３に記載のウイルスベクター。
5. 前記ＡＡＶが、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いている、請求項４に記載のウイルスベクター。
6. 前記ＡＡＶが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）または自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項４または５に記載のウイルスベクター。
7. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、ＡＡＶ−ａｎｃ８０、およびＡＡＶ ｒｈ．７４からなる群から選択されるカプシド血清型を有する、請求項４から６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
8. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ−９のカプシド血清型を有する、請求項４から７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
9. 前記ＡＡＶが、偽型ＡＡＶである、請求項４から８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
10. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９である、請求項９に記載のウイルスベクター。
11. 前記ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードする核酸の発現が、Ｕ６プロモーターの制御下にある、請求項４から１０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
12. 前記ＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子の発現が、ニワトリβ−アクチンプロモーターの制御下にある、請求項４から１０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
13. 請求項１に記載の核酸と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
14. 請求項２から１２のいずれか一項に記載のウイルスベクターと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
15. 神経細胞に薬剤を送達することができる送達媒体と、
    （ａ）ＲＮＡｉ耐性ヒトＧＡＲＳ遺伝子を含む核酸、
    （ｂ）ｍｉＲＮＡをコードする核酸であって、前記ｍｉＲＮＡは、ヒトグリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧＡＲＳ）遺伝子によってコードされるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のセグメントに結合し、前記セグメントは、野生型マウスＧＡＲＳ遺伝子に対して保存され、前記セグメントは、ＣＭＴ２Ｄに関連する変異を含む配列をコードしない、核酸、または
    （ｃ）（ａ）と（ｂ）の組み合わせと、場合により、
    （ｄ）薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
16. 前記ＲＮＡｉ耐性ヒトＧＡＲＳ遺伝子を含む核酸が、配列番号５１〜５７のいずれか１つの配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の組成物。
17. 前記ヒトＧＡＲＳ遺伝子が、配列番号６９の配列、あるいは配列番号６９の配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むその変異体を含む、請求項１５または１６に記載の組成物。
18. 前記マウスＧＡＲＳ遺伝子が、配列番号７０の配列、あるいは配列番号７０の配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むその変異体を含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の組成物。
19. 前記ｍＲＮＡセグメントが、配列番号６９の配列を含むヒトＧＡＲＳ遺伝子のヌクレオチド１３６〜３２３、３２７〜３３９、５４４〜５９０、７２０〜７８５、９９６〜１４０６、１７３４〜１９１３または１９５０〜２１８７内の配列に相補的である、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の組成物。
20. 前記ｍＲＮＡセグメントが、配列番号６９のヌクレオチド９９６〜１４０６内の配列に相補的である、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記送達媒体が、ウイルスベクターである、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の組成物。
22. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または合成ウイルスである、請求項２１に記載の組成物。
23. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶである、請求項２２に記載の組成物。
24. 前記ＡＡＶが、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いている、請求項２３に記載の組成物。
25. 前記ＡＡＶが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）または自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項２３または２４に記載の組成物。
26. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、ＡＡＶ−ａｎｃ８０、およびＡＡＶ ｒｈ．７４からなる群から選択されるカプシド血清型を有する、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の組成物。
27. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ−９のカプシド血清型を有する、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の組成物。
28. 前記ＡＡＶが、偽型ＡＡＶである、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の組成物。
29. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９である、請求項２８に記載の組成物。
30. 前記ＧＡＲＳ ｍｉＲＮＡをコードする核酸の発現が、Ｕ６プロモーターの制御下にある、請求項２１から２９のいずれか一項に記載の組成物。
31. 前記ＲＮＡｉ耐性置換ＧＡＲＳ遺伝子の発現が、ニワトリβアクチンプロモーターの制御下にある、請求項２１から２９のいずれか一項に記載の組成物。
32. 変異型グリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧＡＲＳ）遺伝子を含む神経細胞に送達する方法であって、前記方法が、前記神経細胞に、
    （ａ）請求項１に記載の核酸、
    （ｂ）請求項２から１２のいずれか一項に記載のベクター、または
    （ｃ）請求項１３から３１のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
33. 変異型グリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧＡＲＳ）遺伝子に罹患している対象を処置する方法であって、前記方法が、前記対象に、
    （ａ）請求項１に記載の核酸、
    （ｂ）請求項２から１２のいずれか一項に記載のベクター、または
    （ｃ）請求項１３から３１のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
34. 前記対象が、シャルコー・マリー・トゥース病２Ｄ型（ＣＭＴ２Ｄ）または遠位遺伝性運動ニューロパチーに罹患している、請求項３３に記載の方法。
35. 前記神経細胞が、ヒト神経細胞である、請求項３２に記載の方法。
36. 前記対象が、ヒト対象である、請求項３３または３４に記載の方法。
37. 変異型グリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧＡＲＳ）遺伝子に罹患している対象の処置における、請求項１に記載の少なくとも１つの核酸、請求項２から１２のいずれか一項に記載のウイルスベクター、または請求項１３から３１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
38. 処置を必要としている対象におけるシャルコー・マリー・トゥース病２Ｄ型（ＣＭＴ２Ｄ）または遠位遺伝性運動ニューロパチーの処置における、請求項１に記載の少なくとも１つの核酸、請求項２から１２のいずれか一項に記載のウイルスベクター、または請求項１３から３１のいずれか一項に記載の組成物の使用。

Images