JP2023553005A

JP2023553005A - 末梢ミエリンタンパク質２２の発現の阻害のための生成物及び方法

Info

Publication number: JP2023553005A
Application number: JP2023534050A
Authority: JP
Inventors: クエントンハーパー、スコット; クレオパ、クレオパス; スタヴロウ、マリナ
Original assignee: Cyprus Foundation For Muscular Dystrophy Research D/b/a Cyprus Institute Of Neurology And Genetics
Current assignee: Cyprus Foundation For Muscular Dystrophy Research D/b/a Cyprus Institute Of Neurology And Genetics
Priority date: 2020-12-01
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2023-12-20
Also published as: CA3203748A1; WO2022119826A1; IL303308A; CN116917492A; KR20230134477A; AU2021390471A9; AU2021390471A1; EP4256069A1

Abstract

末梢ミエリンタンパク質２２遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡ干渉ベースの方法及び生成物が提供される。末梢ミエリンタンパク質２２遺伝子を阻害するＲＮＡ、並びにＲＮＡをコードするＤＭＡが提供される。組換えアデノ随伴ウイルスなどの送達ビヒクルは、末梢ミエリンタンパク質２２遺伝子を阻害するＲＮＡをコードするＤＭＡを送達する。これらの方法は、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）などのシャルコー・マリー・トゥース病を治療する。【選択図】図１

Description

末梢ミエリンタンパク質２２遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡ干渉ベースの方法及び生成物が提供される。末梢ミエリンタンパク質２２の遺伝子を阻害するＲＮＡ、並びにそのＲＮＡをコードするＤＮＡが提供される。組換えアデノ随伴ウイルスなどの送達ビヒクルが、末梢ミエリンタンパク質２２の遺伝子を阻害するＲＮＡをコードするＤＮＡを送達する。これらの方法は、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）などのシャルコー・マリー・トゥース病を治療する。

配列表の参照による援用
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５６２０４＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；６，１５９，６７７バイト－ＡＳＣＩＩテキストファイル、２０２１年１１月３０日付け）を含み、参照によりその全体が本明細書に援用される。

シャルコー・マリー・トゥース病（Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈｄｉｓｅａｓｅ）（ＣＭＴ）は、２５００人に１人が罹患する遺伝性末梢神経障害の異種群を指す。最も一般的なタイプ、ＣＭＴ１型は、脱髄性末梢神経障害である。全てのＣＭＴ症例の５０％以上及びＣＭＴ１型症例の約７０～８０％に影響を及ぼすＣＭＴ１型サブタイプは、常染色体優性の脱髄性ＣＭＴ神経障害１Ａ型である［ＣＭＴ１Ａ（ＭＩＭ１１８２２０）］。

ＣＭＴ１Ａは、最も頻繁に、染色体１７ｐ１１．２－ｐ１２上の優性遺伝の１．４Ｍｂのタンデム染色体内重複によって引き起こされる。重複は、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）に翻訳されるＰＭＰ２２遺伝子の３つのコピーをもたらす［非特許文献１及び非特許文献２］。場合によっては、ＰＭＰ２２における点変異はまた、優性ＣＭＴ１Ａにつながる可能性があり、一般に、最も重度の表現型で存在する［非特許文献３，非特許文献４，Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら（上記非特許文献１）］。ＣＭＴ１Ａを有する患者は、徐々に進行性の遠位筋の脱力及び萎縮、感覚の喪失、及び反射の欠如を発症し、典型的には思春期に発症する。ＣＭＴ１Ａは、同じ家族内でも疾患の重症度に高いばらつきを示す。感覚応答は通常、運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）が前腕で５～３５ｍ／ｓの範囲で遅くなる一方で、ほとんどは、平均約２０ｍ／ｓであり、異なる神経で均一かつ対称的な所見を有する。ＭＮＣＶは数十年にわたって有意に変化しないが、運動振幅と運動単位数はゆっくりと減少し、臨床障害と相関する軸索喪失を反映する。

ＰＭＰ２２タンパク質は、発生中にシュワン細胞（ＳＣ）をミエリン化することによって主に産生される２２ｋＤａの内因性４回膜貫通糖タンパク質であり、末梢神経系（ＰＮＳ）コンパクトミエリンの２～５％を占める。このタンパク質は、ＳＣの成長と分化、骨髄形成、ミエリンの厚さ、並びにＰＮＳ軸索及びミエリンの維持に不可欠である。ＰＭＰ２２はまた、細胞骨格アクチンと形質膜との連結に関与し、脂質ラフト（ｌｉｐｉｄｒａｆｔ）におけるコレステロール含有量の調節因子として機能する。ＰＭＰ２２ｍＲＮＡがほぼ全ての組織において発現されているという事実にもかかわらず、ＰＭＰ２２タンパク質は、髄鞘形成ＳＣにおいてのみ見出され、ＰＭＰ２２ｍＲＮＡの組織特異的転写後調節を示唆している［非特許文献５及び非特許文献６］。

ＰＭＰ２２遺伝子の５’－ＵＴＲは、２つの既知のプロモーター、Ｐ１及びＰ２を含む。それぞれの転写産物は、それらの５’非コード領域においてのみ異なる［非特許文献７及び非特許文献８］が、組織特異的発現パターンを示す６つのスプライスバリアントをもたらす［非特許文献９］。ＰＭＰ２２の調節は、そのイントロン領域及びそれら内のエンハンサーエレメントによって達成される［非特許文献１０、非特許文献１１、及び非特許文献１２］。Ｐ１プロモーターの転写産物は、ＳＣ特異的であるが、Ｐ２プロモーターの転写産物は、非ＰＮＳ組織で発現される。したがって、ＰＭＰ２２遺伝子又はその重要な転写結合部位の重複は、スプライシングアイソフォームの比率をシフトさせ、メチル化、マイクロＲＮＡ結合、及び翻訳後修飾部位を変化させる［非特許文献１３及び非特許文献１４］。正常な髄鞘形成及び非髄鞘形成ＳＣでは、新しく合成されたＰＭＰ２２の約２０％がグリコシル化され、一方、残りの約８０％がプロテアソーム小胞体（ＥＲ）関連分解（ＥＲＡＤ）を標的化する。

ＣＭＴ１Ａ患者では、腓骨神経生検におけるＰＭＰ２２ｍＲＮＡレベル［非特許文献１５］及びタンパク質レベル［非特許文献１６］が増加しているため、ＣＭＴ１ＡはＰＭＰ２２の遺伝子投与量効果に依存すると考えられている。１つの欠失した及び１つの重複したＰＭＰ２２アレルの組み合わせを有する個体は、バランスの取れた遺伝子投与量を有するため、ＣＭＴ１Ａ様表現型を提示しない。いくつかのＣＭＴ１Ａ表現型は、ＰＭＰ２２発現に影響を与える染色体１７ｐ上の異なるサイズ又は異なるタイプの重複からも生じ得る［Ｐａｎｔｅｒａ（上記非特許文献１２）］。１．４Ｍｂ重複を有するＣＭＴ１Ａ患者は、皮膚生検においてＰＭＰ２２レベルが異なっている場合があり、必ずしも疾患重症度と相関しない［非特許文献１７及び非特許文献１８］。それにもかかわらず、ＣＭＴ１Ａの駆動機構としてＰＭＰ２２遺伝子投与効果を支持する。ＰＭＰ２２を過剰発現するげっ歯類モデルは、ＣＭＴ１Ａ様表現型を再現した［非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、及び非特許文献２５］。ＣＭＴ１Ａ様表現型は、ＰＭＰ２２の過剰発現を中断した後に改善された［非特許文献２６、Ｌｅｅ（上記非特許文献１４）、Ｐｅｒｅａ（上記非特許文献２３）、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２、非特許文献３３、及び非特許文献３４］。

過剰発現したＰＭＰ２２は、分解に対するプロテアソームの能力を飽和させ、核周囲又は細胞質でのＰＭＰ２２蓄積、全体的なプロテアソーム活性の低下、及びＥＲストレスをもたらすことが示されている。ＰＭＰ２２はまた、ミエリンの厚さ及び維持の決定において、ミエリン形成の初期段階に関与する。ＰＭＰ２２重複は、ミエリン鞘及びＳＣの構造、タンパク質化学量論及び機能を不安定にし、脱髄、再ミエリン形成、特徴的なオニオンバルブ形成、及びＳＣアポトーシスにつながる。結果として、ＳＣ軸索相互作用の障害及び機能不全のニューロフィラメント構造は、より遅い軸索輸送及びミエリン形成速度を伴うニューロフィラメントのより高いパッキング密度及びより少ないリン酸化をもたらす。

ＣＭＴ１Ａの現在の治療は、理学療法又は矯正手術の形態での一般的な症状管理に向けられたままである。
したがって、当技術分野では、ＣＭＴ１Ａの治療のための生成物及び方法の必要性が存在する。

Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，１（３）：１７１－１７５（１９９２）Ｖａｌｅｎｔｉｊｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，１（３）：１６６－１７０（１９９２）Ｍａｔｓｕｎａｍｉｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，１（３）：１７６－１７９（１９９２）Ｐａｔｅｌｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，１（３）：１５９－１６５（１９９２）Ｍａｉｅｒｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２４（３）：８０３－８１７（２００３）Ｒｏｕｘｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４７４（４）：５７８－５８８（２００４）Ｂｏｓｓｅｅｔａｌ．，Ｊ．ＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＲｅｓ．，３７（４）：５２９－５３７（１９９４）Ｓｕｔｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（４１）：２５７９５－２５８０８（１９９４）Ｖｉｓｉｇａｌｌｉｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．，３７（１）：９８－１０９（２０１５）Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２１（７）：１５８１－１５９１（２０１２）Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎｅｔａｌ．，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，４０（１４）：６４４９－６４６０（２０１２）Ｐａｎｔｅｒａｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２７（１６）：２８３０－２８３９（２０１８）Ｖｅｒｒｉｅｒｅｔａｌ．，Ｇｌｉａ，５７（１２）：１２６５－１２７９（２００９）Ｌｅｅｅｔａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２８（２）：２７９－２８８（２０１９）Ｙｏｓｈｉｋａｗａｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３５（４）：４４５－４５０（１９９４）Ｇａｂｒｉｅｌｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４９（６）：１６３５－１６４０（２０１５）Ｎｏｂｂｉｏｅｔａｌ．，Ｂｒａｉｎ，１３７（Ｐｔ６）：１６１４－１６２０（２０１４）Ｋａｔｏｎａｅｔａｌ．，Ｂｒａｉｎ，１３２（Ｐｔ７）：１７３４－１７４０（２０１４）Ｓｅｒｅｄａｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１６（５）：１０４９－６０（１９９６）Ｈｕｘｌｅｙｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，５（５）：５６３－５６９（１９９６）Ｈｕｘｌｅｙｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７（３）：４４９－４５８（１９９８）Ｍａｇｙａｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１６（１７）：５３５１－５３６０（１９９６）Ｐｅｒｅａｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０（１０）：ｐ．１００７－１０１８（２００１）Ｒｏｂａｇｌｉａ－Ｓｃｈｌｕｐｐｅｔａｌ．，Ｂｒａｉｎ，１２５（Ｐｔ１０）：２２１３－２２２１（２００２）Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｎａｔ．，２００（４）：３７７－３９０（２００２）Ｆｌｅｄｒｉｃｈｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２０（９）：１０５５－１０６１（２０１４）Ｓｅｒｅｄａｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９（１２）：１５３３－１５３７（２００３）Ｐａｓｓａｇｅｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１０（４）：３９６－４０１（２００４）Ｍｅｙｅｒｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６１（１）：６１－７２（２００７）Ｃｈｕｍａｋｏｖｅｔａｌ．，ＯｒｐｈａｎｅｔＪｏｕｒｎａｌｏｆＲａｒｅＤｉｓｅａｓｅｓ，９（１）：２０１（２０１４）Ｌｅｅｅｔａｌ．，ＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆＤｉｓｅａｓｅ，１００：９９－１０７（２０１７）Ｚｈａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２８（１）：３５９－３６８（２０１８）Ｐｒｕｋｏｐｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ，１４（１）：ｅ０２０９７５２（２０１９）Ｌｅｅｅｔａｌ．，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，４８（１）：１３０－１４０（２０２０）

本明細書の開示は、ＰＭＰ２２ｍＲＮＡを標的化する人工阻害性ＲＮＡを発現するベクターを使用して、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による過剰発現されたＰＭＰ２２のサイレンシングを特異的に誘導する方法を提供する。企図される人工阻害性ＲＮＡには、ＰＭＰ２２遺伝子の発現を阻害する、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（短鎖干渉ＲＮＡ、低分子阻害性ＲＮＡ、又は短鎖阻害性ＲＮＡとも称される）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びｍｉＲＮＡシャトル（人工ｍｉＲＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。人工阻害性ＲＮＡは、本明細書ではｍｉＰＭＰ２２と称される。ｍｉＰＭＰ２２は、小さな調節配列であり、例えば、ＰＭＰ２２ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを逆相補的な様式で標的化することによって転写後に作用し、ＰＭＰ２２のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを低下させる。本方法及び生成物の使用は、例えば、ＣＭＴ１Ａの予防又は治療に適応される。

ＰＭＰ２２阻害性ＲＮＡ並びにｍｉＰＭＰ２２のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドが提供される。本開示は、配列番号１～８のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含むＲＮＡをコードする鋳型ヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

例示的なｍｉＰＭＰ２２は、配列番号９～１６のうちのいずれか１つに示される全長配列、又は配列番号９～１６のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を含むそのバリアントを含む。対応する最終的にプロセシングされたアンチセンスガイド鎖配列は、配列番号１７～２４にそれぞれ記載されているか、又は配列番号１７～２４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を含むそのバリアントである。プロセシングされたアンチセンスガイド鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体のＲＮＡ成分となる成熟ｍｉＲＮＡ二重鎖であり、最終的に配列特異的遺伝子サイレンシングに関与する。本開示は更に、図４８に示されるアンチセンスガイド鎖を提供し、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である、これらのアンチセンスガイド鎖の各々のバリアントを企図する。本開示は更に、図５０に示されるアンチセンスガイド鎖を提供し、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である、これらのアンチセンスガイド鎖の各々のバリアントを企図する。

ｍｉＰＭＰ２２は、ヒトＰＭＰ２２遺伝子（ヒトＰＭＰ２２ｃＤＮＡである配列番号２５によって表される）によってコードされるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のセグメントに特異的に結合することができ、セグメントは、野生型マウスＰＭＰ２２遺伝子（マウスＰＭＰ２２ｃＤＮＡである配列番号２７によって表される）によってコードされるｍＲＮＡと比較して保存されている。例えば、ｍｉＰＭＰ２２は、配列番号２５のヌクレオチド１～２４２３内の配列に相補的であるｍＲＮＡセグメントに特異的に結合することができる。より具体的には、ｍｉＰＭＰ２２は、配列番号２５のヌクレオチド１４１２～１４３３（例えば、ｍｉＰＭＰ２２～８６８が結合するヌクレオチド）又は配列番号２５の１４１５～１４３６（例えば、ｍｉＰＭＰ２２～８７１が結合するヌクレオチド）内の配列に相補的であるｍＲＮＡセグメントに特異的に結合することができる。

ｍｉＰＭＰ２２をコードするＤＮＡの送達は、ＤＮＡをシュワン細胞に送達する送達ビヒクルを使用して達成することができる。例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを使用して、ｍｉＰＭＰ２２をコードするＤＮＡを送達することができる。他のベクター（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ウマ随伴ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、及びワクシニアウイルスなどの他のウイルスベクター）を使用して、ｍｉＰＭＰ２２をコードするポリヌクレオチドを送達することもできる。したがって、１つ以上のｍｉＰＭＰ２２をコードするウイルスベクターも提供される。ウイルスベクターがｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠く。ｒＡＡＶは、自己相補型（ｓｃ）ＡＡＶであり得る。別の例として、脂質ナノ粒子などの非ウイルスベクターを送達に使用することができる。

ｍｉＰＭＰ２２を各々コードするｒＡＡＶが本明細書に提供される。また、１つ以上のｍｉＰＭＰ２２をコードするｒＡＡＶも提供される。１つ以上のｍｉＰＭＰ２２をコードするｒＡＡＶ（一本鎖ゲノム、ｓｃＡＡＶを有する）は、１、２、３、４、５、６、７、又は８つのｍｉＰＭＰ２２をコードすることができる。１つ以上のｍｉＰＭＰ２２をコードするｓｃＡＡＶは、１、２、３、又は４つのｍｉＰＭＰ２２をコードすることができる。

本明細書に記載の核酸又はウイルスベクターを含む組成物が提供される。
細胞におけるＰＭＰ２２遺伝子の発現の防止又は阻害する方法が更に提供され、細胞を、ｍｉＰＭＰ２２をコードする送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）と接触させることを含み、送達ビヒクルがｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠く。本方法において、重複及び／又は変異型ＰＭＰ２２アレルの発現が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％阻害される。本方法において、野生型ＰＭＰ２２アレルの発現が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％阻害される。

ｍｉＰＭＰ２２をコードするＤＮＡを必要とする対象にそれを送達する方法が更に提供され、ｍｉＰＭＰ２２をコードするＤＮＡを含む送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）を、対象に投与することを含み、送達ビヒクルがｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠く。ｍｉＰＭＰ２２をコードするＤＮＡを必要とする対象にそれを送達する他の方法は、１つ以上のｍｉＰＭＰ２２をコードするＤＮＡを含む送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）を、対象に投与することを含み、送達ビヒクルがｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠く。

ＣＭＴ１Ａの予防又は治療する方法も提供され、ｍｉＰＭＰ２２をコードするＤＮＡを含む送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）を投与することを含む、送達ビヒクルがｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠く。ＣＭＴ１Ａを予防又は治療する他の方法は、１つ以上のｍｉＰＭＰ２２をコードするＤＮＡを含む送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）を投与することを含み、送達ビヒクルがｒＡＡＶである場合、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を欠く。これらの方法は、発現罹患していない対象における正常なＰＭＰ２２発現の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％、又はそれ以上への、ＰＭＰ２２発現の回復をもたらす。

本開示は、本明細書に記載の核酸及び／又はそれらのうちのいずれか１つ以上の組み合わせを含むウイルスベクターである送達ビヒクルを提供する。提供されるウイルスベクターとしては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターは、ＡＡＶであり得る。ＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を欠く。ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補型組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり得る。ＡＡＶは、例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、又はＡＡＶｒｈ．７４である。ＡＡＶは、ＡＡＶ－９であり得る。ＡＡＶは、偽型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２／８又はＡＡＶ２／９であり得る。

本開示は、本明細書に記載の核酸及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に記載の核酸を含むウイルスベクター、及び／又はそれらのうちのいずれか１つ以上と薬学的に許容される担体との組み合わせを含む組成物を提供する。

本開示は、シュワン細胞に薬剤を送達することができる送達ビヒクルと、ｍｉＰＭＰ２２をコードする核酸であってを、ｍｉＰＭＰ２２が、ヒトＰＭＰ２２遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのセグメント（セグメントは、ＣＭＴ１Ａに関連する変異を含む配列をコードするか又はコードしないかのいずれか）に結合し、セグメントが、野生型マウスＰＭＰ２２遺伝子と比較して保存されている、核酸と、任意選択的に、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。ヒトＰＭＰ２２遺伝子は、配列番号２５の配列、又は少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含むそのバリアントを含むことができる。マウスＰＭＰ２２遺伝子は、配列番号２７の配列、又は少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を含むそのバリアントを含むことができる。ｍｉＰＭＰ２２は、例えば、配列番号２５のヌクレオチド１４１２～１４３３（例えば、ｍｉＰＭＰ２２～８６８が結合するヌクレオチド）又は配列番号２５の１４１５～１４３６（例えば、ｍｉＰＭＰ２２～８７１が結合するヌクレオチド）内の配列に相補的であるｍＲＮＡセグメントに特異的に結合する。

本開示は、ウイルスベクターである、組成物中の送達ビヒクルを提供する。組成物中のウイルスベクターは、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスであり得る。ウイルスベクターは、ＡＡＶであり得る。ＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を欠く。ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補型組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり得る。ＡＡＶは、例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択されるカプシド血清型であるか、又はそれを有する。ＡＡＶは、ＡＡＶ－９のカプシド血清型であり得るか、又はカプシド血清型を有することができる。ＡＡＶは、ＡＡＶ２／８又はＡＡＶ２／９などの偽型ＡＡＶであり得る。

本開示は、重複及び／又は変異型ＰＭＰ２２遺伝子を含むシュワン細胞に、（ａ）配列番号１～８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含むｍｉＰＭＰ２２をコードする鋳型核酸を含む核酸、配列番号９～１６のうちのいずれか１つに示される全長ｍｉＰＭＰ２２配列をコードする核酸、又は配列番号９～１６のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を含むそのバリアント、配列番号１７～２４のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含むｍｉＰＭＰ２２のプロセシングされたアンチセンスガイド鎖をコードする核酸、図４８に示される１つ以上のアンチセンスガイド鎖をコードする核酸、又は少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である図４８におけるアンチセンスガイド鎖のバリアント、あるいは図５０に示される１つ以上のアンチセンスガイド鎖をコードする核酸、又は少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である図５０におけるアンチセンスガイド鎖のバリアント、（ｂ）本明細書に記載の核酸のうちのいずれか１つ以上を含むベクター、あるいは（ｃ）本明細書に記載の核酸又はベクターのうちのいずれか１つ以上を含む組成物を送達する方法を提供する。

本開示は、重複及び／又は変異型ＰＭＰ２２遺伝子に罹患している対象を治療する方法を提供し、本方法は、対象に（ａ）配列番号１～８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含むｍｉＰＭＰ２２をコードする鋳型核酸を含む核酸、配列番号９～１６のうちのいずれか１つに示される全長ｍｉＰＭＰ２２配列をコードする核酸、又は配列番号９～１６のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を含むそのバリアント、配列番号１７～２４のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を含むｍｉＰＭＰ２２のプロセシングされたアンチセンスガイド鎖をコードする核酸、図４８に示される１つ以上のアンチセンスガイド鎖をコードする核酸、又は少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である図４８におけるアンチセンスガイド鎖のバリアント、あるいは図５０に示される１つ以上のアンチセンスガイド鎖をコードする核酸、又は少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である図５０におけるアンチセンスガイド鎖のバリアント、（ｂ）本明細書に記載の核酸のうちのいずれか１つ以上を含むベクター、あるいは（ｃ）本明細書に記載の核酸又はベクターのうちのいずれか１つ以上を含む組成物を投与することを含む。

本開示は、ＣＭＴ１Ａに罹患している、本明細書の方法によって治療される対象を企図する。本開示はまた、ＰＭＰ２２遺伝子の重複又は変異によりＣＭＴ１Ａのリスクがある対象の治療を企図する。対象は、哺乳動物であり得る。対象は、ヒト対象であり得る。

本開示はまた、重複及び／又は変異型ＰＭＰ２２遺伝子に罹患している対象を治療するための医薬品の製造又はその対象の治療における、本明細書に記載される少なくとも１つの核酸、本明細書に記載される少なくとも１つのウイルスベクター、又は本明細書に記載される組成物の使用を提供する。

本開示はまた、ＣＭＴ１Ａを治療するための医薬品の製造又はＣＭＴ１Ａの治療を必要とする対象における治療において、本明細書に記載される少なくとも１つの核酸、本明細書に記載される少なくとも１つのウイルスベクター、又は本明細書に記載される組成物の使用を提供する。

本開示の他の特徴及び利点は、以下の図面の説明及び詳細な説明から明らかであろう。しかしながら、図面、詳細な説明、及び実施例は、開示された主題の実施形態を示しているが、本開示の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が、図面、詳細な説明、及び実施例から明らかになるため、単に例示として与えられることを理解されたい。

この特許又は出願ファイルには、少なくとも１つのカラーで作成された図面が含まれている。このカラー図面を含む特許又は特許出願公開のコピーは、請求により、必要な費用の支払いに応じて、米国特許商標庁によって提供される。

フォールディング部位及びプロセシング部位を示す人工ｍｉＲＮＡシャトル配列の例を示す。成熟ガイド鎖には下線が引かれている。灰色の矢印は、Ｄｒｏｓｈａ切断部位を示し、黒色の矢印は、Ｄｉｃｅｒ切断部位を示す。５’及び３’最末端の影付き配列は、Ｕ６プロモーターの前のｍｉＲＮＡシャトルをクローニングするために使用される鋳型ＤＮＡにおける制限部位である。ヒトＰＭＰ２２の全長ｃＤＮＡ配列（配列番号２５）を示し、ここで、交互の陰影は、エキソン境界（５つのエキソン）を示し、下線を引いた配列は、最長のヒトＰＭＰ２２タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）である。翻訳されたＰＭＰ２２タンパク質配列（配列番号２６）を有するヒトＰＭＰ２２の全長ＯＲＦ配列を示す。マウスＰＭＰ２２ｃＤＮＡ配列（配列番号２７）を示す。交互の陰影は、エキソン境界（５つのエキソン）を示す。図５Ａ～Ｂは、ｍｉＰＭＰ２２結合部位を有するヒトＰＭＰ２２ｃＤＮＡを示す。全てのｍｉＰＭＰ２２標的配列は、エキソン５に（３’ＵＴＲ領域に）位置する。下線の配列は、ＰＭＰ２２全長オープンリーディングフレームである。同上。同上。全長ｍｉＰＭＰ２２－８６８配列（配列番号９）を示す。マウスＰＭＰ２２及びヒトＰＭＰ２２とのｍｉＰＭＰ２２－８６８及びｍｉＰＭＰ２２－８７１の結合相互作用を示す。全長ｍｉＰＭＰ２２－８７１配列（配列番号１０）を示す。全長ｍｉＰＭＰ２２－８６９配列（配列番号１１）を示す。全長ｍｉＰＭＰ２２－８７２配列（配列番号１２）を示す。全長ｍｉＰＭＰ２２－１７０６配列（配列番号１３）を示す。全長ｍｉＰＭＰ２２－１７４０配列（配列番号１４）を示す。全長ｍｉＰＭＰ２２－１７４１配列（配列番号１５）を示す。全長ｍｉＰＭＰ２２－１８３４配列（配列番号１６）を示す。図１５Ａ～Ｄは、ｍｉＰＭＰ２２によるＰＭＰ２２ノックダウンのインビトロ試験のｑＰＣＲ結果を示す。同上。図１６Ａ～Ｄは、成体マウスの腰髄神経根におけるＡＡＶ９のインビボ発現を示す。非注射マウス（Ａ）並びにＡＡＶ９－Ｕ６－ｍｉＲＬａｃＺ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰの腰髄髄腔内注射の４週間後及び８週間後のマウス（Ｂ～Ｃ）の腰髄神経根切片の代表的な画像。切片を、ｅＧＦＰ（赤色）に対して免疫染色し、ｍｉＲＬａｃＺとともにレポーター遺伝子を発現する細胞を示す。また、ｅＧＦＰは、自家蛍光（緑色）であった。細胞核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色した。矢じりは、ＳＣにおける核周囲ｅＧＦＰ免疫反応性の例を示す。ｅＧＦＰ陽性細胞の割合の定量化を、Ｄ（平均値、ＳＤ）に示す。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、データを比較した（ｐ＜０．０００１）。平均値：４週目４５．９５、８週目５６．８２。図１７Ａ～Ｄは、成体マウスの坐骨神経におけるＡＡＶ９のインビボ発現を示す。非注射マウス（Ａ、Ｅ）並びにＡＡＶ９－Ｕ６－ｍｉＲＬａｃＺ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰによる腰髄髄腔内注射の４週間後（Ｂ、Ｆ）及び８週間後（Ｃ、Ｇ）のマウス（Ｂ～Ｃ）の坐骨神経切片（Ａ～Ｃ）及びときほぐした線維坐骨神経（Ｅ～Ｇ）の代表的な画像。切片を、ｅＧＦＰ（赤色）に対して免疫染色し、ｍｉＲＬａｃＺとともにレポーター遺伝子を発現する細胞を示す。また、ｅＧＦＰは、自家蛍光（緑色）であった。細胞核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色した。矢じりは、ＳＣにおける核周囲ｅＧＦＰ免疫反応性の例を示す。ｅＧＦＰ陽性細胞の割合の定量化を、Ｄ（平均値、ＳＤ）に示す。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、データを比較した（ｐ＝０．０４６０）。平均値：４週目４２．０７、８週目４５．７４。図１８Ａ～Ｄは、成体マウスの大腿神経におけるＡＡＶ９のインビボ発現を示す。非注射マウス（Ａ）並びにＡＡＶ９－Ｕ６－ｍｉＲＬａｃＺ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（Ｂ～Ｃ）を発現するＡＡＶ９の腰髄髄腔内注射の４週間後及び８週間後のマウスのときほぐした大腿神経線維の代表的な画像。線維を、ｅＧＦＰ（赤色）に対して免疫染色し、ｍｉＲＬａｃＺとともにレポーター遺伝子を発現する細胞を示す。また、ｅＧＦＰは、自家蛍光（緑色）であった。細胞核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色した。矢じりは、ＳＣにおける核周囲ｅＧＦＰ免疫反応性の例を示す。ｅＧＦＰ陽性細胞の割合の定量化を、Ｄ（平均値、ＳＤ）に示す。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、データを比較した（ｐ＝０．０３３６）。平均値：４週目３１．１７、８週目４１．０９。図１９Ａ～Ｆは、ＡＡＶ９－ｍｉＬａｃＺｅＧＦＰレポーター遺伝子の発現の免疫ブロット及びＶＧＣＮ分析を示す。ｅＧＦＰレポーター遺伝子とともにｍｉＲＬａｃＺを発現するＡＡＶ９による腰髄神経根（Ａ）及び坐骨神経（Ｄ）溶解物における髄腔内腰髄注射の４週間及び８週間後のｅＧＦＰ発現レベルの免疫ブロット分析の代表的な画像。Ｃ６１－Ｈｅｔ非注射マウスからの組織試料を陰性対照として使用した。チューブリンブロットを負荷対照として使用した。定量化のために、ｅＧＦＰ対チューブリンの光学密度比を計算した（平均値、ＳＤ）。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、データを比較した（ｐ＝０．０２７２）（Ｂ、Ｅ）。腰髄神経根（Ｃ）及び坐骨神経（Ｆ）におけるＡＡＶ９－ｍｉＬａｃＺＶＧＣＮを、髄腔内腰髄注射の４週間及び８週間後に計算した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、ＶＧＣＮデータを比較し、２つの時点間に統計的有意性は見出されなかった（平均値、ＳＤ）。平均値：神経根のウエスタンブロット：４週目０．９２、８週目０．９９；坐骨神経のウエスタンブロット：４週目０．４８、８週目０．８１、ＶＣＮ神経根：４週目３．２４、８週目１．０９；ＶＣＮ坐骨神経：４週目０．４１、８週目０．３８。図２０Ａ～Ｆは、ＣＭＴ１Ａマウスモデルの腰髄神経根におけるｈｕＰＭＰ２２／ｍｕＰＭＰ２２及び他のミエリン関連遺伝子におけるＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１効果のインビボ試験の結果を示す。ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（非標的化対照）ベクターを注射した同腹仔と比較した（ベースラインとして提示）、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による注射の６週間後の、Ｃ６１ＨｅｔマウスにおけるｈｕＰＭＰ２２／ｍｕＰＭＰ２２及び他のミエリン関連遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析。上記の全ての転写産物の発現分析のために、ｍｕＧＡＰＤＨを、負荷に対して正規化するためのハウスキーピング遺伝子として使用し、相対的な変化を、２－ΔΔＣＴ法（平均値、ＳＤ）を使用して決定した。図２１Ａ～Ｆは、ＣＭＴ１Ａマウスモデルの坐骨神経におけるｈｕＰＭＰ２２／ｍｕＰＭＰ２２及び他のミエリン関連遺伝子におけるＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１効果のインビボ試験の結果を示す。ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（非標的化対照）ベクターを注射した同腹仔と比較した（ベースラインとして提示）、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による注射の６週間後の、Ｃ６１ＨｅｔマウスにおけるｈｕＰＭＰ２２／ｍｕＰＭＰ２２及び他のミエリン関連遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析。上記の全ての転写産物の発現分析のために、ｍｕＧＡＰＤＨを、負荷に対して正規化するためのハウスキーピング遺伝子として使用し、相対的な変化を、２－ΔΔＣＴ法（平均値、ＳＤ）を使用して決定した。図２２Ａ～Ｆは、ＣＭＴ１Ａマウスモデルの大腿神経におけるｈｕＰＭＰ２２／ｍｕＰＭＰ２２及び他のミエリン関連遺伝子におけるＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１効果のインビボ試験の結果を示す。ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（非標的化対照）ベクターを注射した同腹仔と比較した（ベースラインとして提示）、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による注射の６週間後の、Ｃ６１ＨｅｔマウスにおけるｈｕＰＭＰ２２／ｍｕＰＭＰ２２及び他のミエリン関連遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析。上記の全ての転写産物の発現分析のために、ｍｕＧＡＰＤＨを、負荷に対して正規化するためのハウスキーピング遺伝子として使用し、相対的な変化を、２－ΔΔＣＴ法（平均値、ＳＤ）を使用して決定した。図２３Ａ～Ｆは、ＣＭＴ１Ａマウスモデルの腰髄神経根におけるｈｕＰＭＰ２２／ｍｕＰＭＰ２２及び他のミエリン関連遺伝子におけるＡＡＶ９－ｍｉＲ８６８効果のインビボ試験の結果を示す。ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（非標的化対照）ベクターを注射した同腹仔と比較した（ベースラインとして提示）、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による注射の６週間後の、Ｃ６１ＨｅｔマウスにおけるｈｕＰＭＰ２２／ｍｕＰＭＰ２２及び他のミエリン関連遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析。上記の全ての転写産物の発現分析のために、ｍｕＧＡＰＤＨを、負荷に対して正規化するためのハウスキーピング遺伝子として使用し、相対的な変化を、２－ΔΔＣＴ法（平均値、ＳＤ）を使用して決定した。図２４Ａ～Ｆは、ＣＭＴ１Ａマウスモデルの坐骨神経におけるｈｕＰＭＰ２２／ｍｕＰＭＰ２２及び他のミエリン関連遺伝子におけるＡＡＶ９－ｍｉＲ８６８効果のインビボ試験の結果を示す。ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（非標的化対照）ベクターを注射した同腹仔と比較した（ベースラインとして提示）、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による注射の６週間後の、Ｃ６１ＨｅｔマウスにおけるｈｕＰＭＰ２２／ｍｕＰＭＰ２２及び他のミエリン関連遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析。上記の全ての転写産物の発現分析のために、ｍｕＧＡＰＤＨを、負荷に対して正規化するためのハウスキーピング遺伝子として使用し、相対的な変化を、２－ΔΔＣＴ法（平均値、ＳＤ）を使用して決定した。図２５Ａ～Ｆは、ＣＭＴ１Ａマウスモデルの大腿神経におけるｈｕＰＭＰ２２／ｍｕＰＭＰ２２及び他のミエリン関連遺伝子におけるＡＡＶ９－ｍｉＲ８６８効果のインビボ試験の結果を示す。ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（非標的化対照）ベクターを注射した同腹仔と比較した（ベースラインとして提示）、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による注射の６週間後の、Ｃ６１ＨｅｔマウスにおけるｈｕＰＭＰ２２／ｍｕＰＭＰ２２及び他のミエリン関連遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析。上記の全ての転写産物の発現分析のために、ｍｕＧＡＰＤＨを、負荷に対して正規化するためのハウスキーピング遺伝子として使用し、相対的な変化を、２－ΔΔＣＴ法（平均値、ＳＤ）を使用して決定した。図２６Ａ～Ｄは、ＣＭＴ１Ａマウスモデルの腰髄神経根におけるＨｕＰＭＰ２２及びＭＰＺタンパク質に対するＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１効果のインビボ試験の結果を示す。ｍｉＲ８７１又はｍｉＲＬａｃＺを発現するＡＡＶ９による腰髄髄腔内注射の６週間後の腰髄神経根溶解物中のＨｕＰＭＰ２２（Ａ）の発現レベルの免疫ブロット分析。非注射マウスからの組織試料を、陰性対照として使用した。チューブリンブロット及びＭＰＺゲルバンドを負荷対照（Ｂ、Ｃ）として使用した。ＭＰＺの発現が、処置後に変化した（Ｄ）。定量化のために、ＨｕＰＭＰ２２対チューブリン、ＨｕＰＭＰ２２対ＭＰＺゲルバンド、及びＭＰＺゲルバンド対チューブリンの光学密度比を計算した（平均値、ＳＤ）。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、データを比較した。図２７Ａ～Ｄは、ＣＭＴ１Ａマウスモデルの坐骨神経におけるＨｕＰＭＰ２２及びＭＰＺタンパク質に対するＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１効果のインビボ試験の結果を示す。ｍｉＲ８７１又はｍｉＲＬａｃＺを発現するＡＡＶ９による腰髄髄腔内注射の６週間後の坐骨神経溶解物中のＨｕＰＭＰ２２（Ａ）の発現レベルの免疫ブロット分析。非注射マウスからの組織試料を、陰性対照として使用した。チューブリンブロット及びＭＰＺゲルバンドを負荷対照（Ｂ、Ｃ）として使用した。ＭＰＺの発現が、処置後に変化した（Ｄ）。定量化のために、ＨｕＰＭＰ２２対チューブリン、ＨｕＰＭＰ２２対ＭＰＺゲルバンド、及びＭＰＺゲルバンド対チューブリンの光学密度比を計算した（平均値、ＳＤ）。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、データを比較した。図２８Ａ～Ｄは、ＣＭＴ１Ａマウスモデルの大腿神経におけるＨｕＰＭＰ２２及びＭＰＺタンパク質に対するＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１効果のインビボ試験の結果を示す。ｍｉＲ８７１又はｍｉＲＬａｃＺを発現するＡＡＶ９による腰髄髄腔内注射の６週間後の大腿神経溶解物中のＨｕＰＭＰ２２（Ａ）の発現レベルの免疫ブロット分析。非注射マウスからの組織試料を、陰性対照として使用した。チューブリンブロット及びＭＰＺゲルバンドを負荷対照（Ｂ、Ｃ）として使用した。ＭＰＺの発現が、処置後に変化した（Ｄ）。定量化のために、ＨｕＰＭＰ２２対チューブリン、ＨｕＰＭＰ２２対ＭＰＺゲルバンド、及びＭＰＺゲルバンド対チューブリンの光学密度比を計算した（平均値、ＳＤ）。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、データを比較した。ＣＭＴ１ＡのＣ６１Ｈｅｔマウスモデルにおける早期処置及び後期処置の試験設計を示す。正常レベルのマウスＰＭＰ２２のみを発現するＷＴマウスにも早期処置の試験設計が用いられた。図３０Ａ～Ｂは、ベースライン時及び早期処置後の５ｒｐｍでのロータロッド結果を示す。Ａ：示されるように、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスをＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（モック（ｍｏｃｋ））処置対照マウスと比較した。２ヶ月齢の非注射ＷＴマウス及び非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスは有意差を示さなかったが、４ヶ月齢及び６ヶ月齢のＷＴマウスは、それらの年齢適合ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスよりも良好な成績を示した。４ヶ月齢及び６ヶ月齢（注射後２ヶ月及び４ヶ月）の時点で、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、モック群と比較して改善された運動能力（ｍｏｔｏｒｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を示し、同齢のＷＴマウスと有意差はなかった（ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１６、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝１６、２ヶ月齢Ｃ６１Ｈｅｔ：ｎ＝３２、２～６ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝１０）。Ｂ：時間経過分析は、注射後２ヶ月及び４ヶ月（４ヶ月齢及び６ヶ月齢）のロータロッドにおいて、モック処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスと比較して、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスの改善を実証する。値は、平均値±ＳＤを表す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、データを比較した。４ヶ月齢ＷＴ対４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＝０．００１７、４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＝０．０００３、６ヶ月齢ＷＴ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＝０．０００３、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１。平均値：２ヶ月齢ＷＴ：５９４．１２、２ヶ月齢Ｈｅｔ：５４９、４ヶ月齢ＷＴ：５９６．１、４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：５１２．９６、４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：５９７．５９、６ヶ月齢ＷＴ：５８５．４２、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：３９０．４３、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：５８４．９６。図３１Ａ～Ｂは、ベースライン時及び早期処置後の１７．５ｒｐｍでのロータロッド結果を示す。Ａ：処置前の２ヶ月齢のベースラインでは、全てのＣ６１Ｈｅｔマウスは、ＷＴマウスよりも成績が悪かった。同様に、ＷＴマウスは、４ヶ月齢及び６ヶ月齢でモック処置されたＣ６１Ｈｅｔマウスよりも良好な成績を示した。４ヶ月齢及び６ヶ月齢の時点で、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、対照ベクター処置マウスと比較して改善された運動能力を示し、ＷＴマウスの能力に達した（ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１６、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝１６、２ヶ月齢Ｃ６１Ｈｅｔ：ｎ＝３２、２～６ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝１０）。Ｂ：時間経過分析は、注射後２ヶ月及び４ヶ月（４ヶ月齢及び６ヶ月齢）のロータロッドにおいて、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスの改善された運動能力を実証する。値は、平均値±ＳＤを表す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、データを比較した。２ヶ月齢ＷＴ対２ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、４ヶ月齢ＷＴ対４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１、４ヶ月齢ＷＴ対４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１、６ヶ月齢ＷＴ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１、６ヶ月齢ＷＴ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＝０．０１０６。平均値：２ヶ月齢ＷＴ：５８２．２１、２ヶ月齢Ｈｅｔ：２３５．７９、４ヶ月齢ＷＴ：４９７．８、４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１７２．９３、４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：５０４．０９、６ヶ月齢ＷＴ：４１６．１６、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：６９．５４、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：４７０．４８。図３２Ａ～Ｂは、ベースライン時及び早期処置後のフットグリップ（ｆｏｏｔｇｒｉｐ）分析を示す。Ａ：処置前の２ヶ月齢のベースラインでは、全てのＣ６１Ｈｅｔマウスは、非注射ＷＴマウスよりも成績が悪かった。同様に、ＷＴマウスは、４ヶ月齢及び６ヶ月齢でモック処置されたＣ６１Ｈｅｔマウスよりも良好な成績を示した。４ヶ月齢及び６ヶ月齢の時点で、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置対照マウスと比較して、改善されたグリップ強度能力を示した（ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１６、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝１６、２ヶ月齢Ｃ６１Ｈｅｔ：ｎ＝３２、２～６ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝１０）。Ｂ：時間経過分析は、注射後２ヶ月及び４ヶ月（４ヶ月齢及び６ヶ月齢）のフットグリップ分析において、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスの改善された能力を示した。値は、平均値±ＳＤを表す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、データを比較した。２ヶ月齢ＷＴ対２ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、４ヶ月齢ＷＴ対４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１、４ヶ月齢ＷＴ対４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１、６ヶ月齢ＷＴ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１、６ヶ月齢ＷＴ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＝０．０１０６。平均値：２ヶ月齢ＷＴ：５１．２８、２ヶ月齢Ｈｅｔ：２２．６９、４ヶ月齢ＷＴ：４２．７３、４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１７．８０、４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：２９．５３、６ヶ月齢ＷＴ：３６．８１、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１５．９２、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：３１．７０。図３３Ａ～Ｂは、ベースライン及び早期処置後のワイヤーハング（ｗｉｒｅｈａｎｇ）試験分析を示す。Ａ：処置前の２ヶ月齢のベースラインでは、全てのＣ６１Ｈｅｔマウスは、非注射ＷＴマウスよりも成績が悪かった。同様に、ＷＴマウスは、４ヶ月齢及び６ヶ月齢でモック処置されたＣ６１Ｈｅｔマウスよりも良好な成績を示した。４ヶ月齢及び６ヶ月齢の時点で、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置対照マウスと比較して、改善されたハング試験能力を示した（ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１６、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝１６、２ヶ月齢Ｃ６１Ｈｅｔ：ｎ＝３２、２～６ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝１０）。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスは、４ヶ月時点でＷＴの能力に達することができず、これは、６ヶ月齢のＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスとは対照的であり、これらのマウスは、それらの年齢適合ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウスと有意差はなかった。Ｂ：時間経過分析は、注射後２ヶ月及び４ヶ月（４ヶ月齢及び６ヶ月齢）のハング試験分析において、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスの改善された能力を示した。値は、平均値±ＳＤを表す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、データを比較した。２ヶ月齢ＷＴ対２ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、４ヶ月齢ＷＴ対４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１、４ヶ月齢ＷＴ対４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１、６ヶ月齢ＷＴ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１、６ヶ月齢ＷＴ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＝０．０１０６。平均値：２ヶ月齢ＷＴ：５９３．７０、２ヶ月齢Ｈｅｔ：３０６．９６、４ヶ月齢ＷＴ：５２７．２８、４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１５５．６４、４ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：３８１．５３、６ヶ月齢ＷＴ：３５１．３０、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１３０．８１、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：３７１．６５。図３４Ａ～Ｂは、ベースライン時及び後期処置後の５ｒｐｍでのロータロッド結果を示す。Ａ：示されるように、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスをＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（モック）処置対照マウスと比較した。試験した全ての年齢で、ＷＴマウスは、年齢適合Ｃ６１－Ｈｅｔ又はＣ６１－ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウスよりも良好な成績を示した。８ヶ月齢及び１０ヶ月齢（注射後２ヶ月及び４ヶ月）の時点で、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１－処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、モック群と比較して改善された運動能力を示し、同齢のＷＴマウスと有意差はなかった（８ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１６、８ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝１６、１０ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１０、１０ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝８、６ヶ月齢Ｃ６１Ｈｅｔ：ｎ＝３２、６～８ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝１０）。Ｂ：時間経過分析は、モック処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスと比較して、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスの改善を実証する。値は、平均値±ＳＤを表す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、データを比較した。６ヶ月齢ＷＴ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、８ヶ月齢ＷＴ対８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１、１０ヶ月齢ＷＴ対１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１。平均値：６ヶ月齢ＷＴ：５８３．８０、６ヶ月齢Ｈｅｔ：３４５．０４、８ヶ月齢ＷＴ：５７８．４９、８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：２２１．９３、８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：５６６．０１、１０ヶ月齢ＷＴ：５８４．２０、１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１４８．５７，１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：５５８．４０。図３５Ａ～Ｂは、ベースライン時及び後期処置後の１７．５ｒｐｍでのロータロッド結果を示す。Ａ：示されるように、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスをＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（モック）処置対照マウスと比較した。試験した全ての年齢で、ＷＴマウスは、年齢適合Ｃ６１－Ｈｅｔ又はＣ６１－ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウスよりも良好な成績を示した。８ヶ月齢及び１０ヶ月齢（注射後２ヶ月及び４ヶ月）の時点で、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１－処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、８ヶ月齢ＷＴ対８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１を唯一の例外として、モック群と比較して改善された運動能力を示し、同齢のＷＴマウスと有意差はなかった（８ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１６、８ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝１６、１０ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１０、１０ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝８、６ヶ月齢Ｃ６１Ｈｅｔ：ｎ＝３２、６～８ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝１０）。Ｂ：時間経過分析は、モック処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスと比較して、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスの改善を実証する。値は、平均値±ＳＤを表す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、データを比較した。６ヶ月齢ＷＴ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、８ヶ月齢ＷＴ対８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１、８ヶ月齢ＷＴ対８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＝０．００１５、１０ヶ月齢ＷＴ対１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１。平均値：６ヶ月齢ＷＴ：４１７．９６、６ヶ月齢Ｈｅｔ：６６．１２、８ヶ月齢ＷＴ：４５３．３８、８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１９．２４、８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：２９３．９５、１０ヶ月齢ＷＴ：３２８．９６、１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１６．８９，１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：３０４．７６。図３６Ａ～Ｂは、ベースライン時及び後期処置後のグリップ強度結果を示す。Ａ：示されるように、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスをＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（モック）処置対照マウスと比較した。試験した全ての年齢で、ＷＴマウスは、年齢適合Ｃ６１－Ｈｅｔ又はＣ６１－ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウスよりも良好な成績を示した。８ヶ月齢及び１０ヶ月齢（注射後２ヶ月及び４ヶ月）の時点で、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１－処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、モック群と比較して改善された運動能力を示し、同齢のＷＴマウスと有意差はなかった（８ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１６、８ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝１６、１０ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１０、１０ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝８、６ヶ月齢Ｃ６１Ｈｅｔ：ｎ＝３２、６～８ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝１０）。Ｂ：時間経過分析は、モック処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスと比較して、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスの改善を実証する。値は、平均値±ＳＤを表す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、データを比較した。６ヶ月齢ＷＴ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、８ヶ月齢ＷＴ対８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１、１０ヶ月齢ＷＴ対１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１。平均値：６ヶ月齢ＷＴ：３６．８１、６ヶ月齢Ｈｅｔ：１６．５９、８ヶ月齢ＷＴ：２７．２９、８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１６．２０、８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：２６．８２、１０ヶ月齢ＷＴ：２５．６２、１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１４．００，１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：２２．２３。図３７Ａ～Ｂは、ベースライン時及び後期処置後のハング試験結果。Ａ：示されるように、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスをＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（モック）処置対照マウスと比較した。試験した全ての年齢で、ＷＴマウスは、年齢適合Ｃ６１－Ｈｅｔ又はＣ６１－ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウスよりも良好な成績を示した。８ヶ月齢及び１０ヶ月齢（注射後２ヶ月及び４ヶ月）の時点で、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１－処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、モック群と比較して改善された運動能力を示し、同齢のＷＴマウスと有意差はなかった（８ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１６、８ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝１６、１０ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１０、１０ヶ月齢ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝８、６ヶ月齢Ｃ６１Ｈｅｔ：ｎ＝３２、６～８ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝１０）。Ｂ：時間経過分析は、モック処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスと比較して、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスの改善を実証する。値は、平均値±ＳＤを表す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、データを比較した。６ヶ月齢ＷＴ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、８ヶ月齢ＷＴ対８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＜０．０００１、８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＝０．０００４、１０ヶ月齢ＷＴ対１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＝０．００６２、１０ヶ月齢ＷＴ対１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＝０．０３３８。平均値：６ヶ月齢ＷＴ：３５１．３０、６ヶ月齢Ｈｅｔ：５５．２３、８ヶ月齢ＷＴ：２３８．４０、８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：３９．７９、８ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：１６２．９９、１０ヶ月齢ＷＴ：１６５．２０、１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：７０．９０，１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：１２７．５４。図３８Ａ～Ｂは、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１早期処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスにおける生理学的及び表現型の改善を示す。Ａ：運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺベクターを注射した同腹仔（ｎ＝８）と比較して、６ヶ月齢のＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置Ｃ６１Ｈｅｔマウス（ｎ＝８）において改善され、ＷＴマウスの値に近づいた（ｎ＝６）。値は、平均値±ＳＤを表す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙを使用して、データを比較した：６ヶ月齢ＷＴ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＝０．０００３、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＜０．０００１、６ヶ月齢ＷＴ対６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＝０．１４１２。平均値：６ヶ月齢ＷＴ：４１．６１、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：２５．９０、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：３６．８８。Ｂ：ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１又はＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺのいずれかによるＣ６１Ｈｅｔマウス早期処置群の末梢神経障害の表現型評価の代表的な画像。６ヶ月齢のＣ６１ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウスは、尾による懸垂時に、つま先の異常な握り締め及び後肢表現型のクラスピング（ｃｌａｓｐｉｎｇ）を示し、末梢神経系欠陥の存在を示唆した。この表現型は、Ｃ６１ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１において完全に回復し、後肢のクラスピングなしで正常な握り締めを示す。図３９Ａ～Ｂは、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１後期処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスにおける生理学的及び表現型の改善を示す。Ａ：運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺベクターを注射した同腹仔（ｎ＝５）と比較して、６ヶ月齢のＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置Ｃ６１Ｈｅｔマウス（ｎ＝６）において改善されたが、ＷＴマウス（ｎ＝４）の値には達しなかった。値は、平均値±ＳＤを表す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙを使用して、データを比較した：１０ヶ月齢ＷＴ対１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｐ＝０．００７９、１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ対１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＝０．００４０、１０ヶ月齢ＷＴ対１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：ｐ＝０．０３３３。平均値：６ヶ月齢ＷＴ：４３．３８、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：２４．１２、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：３７．６９。Ｂ：ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１又はＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺのいずれかによるＣ６１Ｈｅｔマウス後期処置群の末梢神経障害の表現型評価の代表的な画像。１０ヶ月齢のＣ６１ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウスは、尾による懸垂時に、つま先の異常な握り締め及び後肢表現型のクラスピングを示し、ＰＮＳの欠陥の存在を示唆した。この表現型は、Ｃ６１ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１において完全に回復し、後肢のクラスピングなしで正常な握り締めを示す。図４０Ａ～Ｄは、早期処置ＣＭＴ１Ａマウスモデルの神経根準超薄切片（ｓｅｍｉｔｈｉｎｓｅｃｔｉｏｎ）を示す。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１又はＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺベクターのいずれかによる早期処置後のＣ６１Ｈｅｔマウスの腰髄運動神経根のトルイジンブルー染色した縦断（Ａ、Ｂ）及び横断（Ｃ、Ｄ）準超薄切片。低倍率及び高倍率（Ａ～Ｄ）での、脊髄に付着した前腰髄運動神経根の準超薄切片の代表的な画像。薄くミエリン化した線維、脱ミエリン化した線維（＊）、及びオニオンバルブの形成（ｏ）。図４１Ａ～Ｃは、複数の早期処置された神経根における異常にミエリン化した線維の割合（％）の定量化（ｎ＝１群当たり１６匹のマウス）により、モックベクターで処置された同腹仔と比較して、異常にミエリン化した線維の数の有意な改善（Ａ～Ｂ）、並びにオニオンバルブ形成の数（Ｃ）の有意な減少が確認された。値は、平均値±ＳＤを表す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙを使用して、データを比較した。平均値：Ａ：ｍｉＲＬａｃＺ：１５．３５，ｍｉＲ８７１：１１．７４，Ｂ：ｍｉＲＬａｃＺ：４９．７４、ｍｉＲ８７１：２５．３６，Ｃ：ｍｉＲＬａｃＺ：８．０６、ｍｉＲ８７１：０．６９。図４２Ａ～Ｂは、早期処置ＣＭＴ１Ａマウスモデルの大腿神経準超薄切片を示す。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１又はＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺベクターのいずれかによる早期処置後のＣ６１Ｈｅｔマウスの大腿神経のトルイジンブルー染色準超薄切片。低倍率及び高倍率（Ａ～Ｂ）における大腿神経の準超薄切片の代表的な画像。薄くミエリン化した線維（ｔ）、脱ミエリン化した線維（＊）。図４３Ａ～Ｃは、複数の早期処置された大腿神経における異常にミエリン化した線維の割合（％）の定量化（ｎ＝１群当たり１６匹のマウス）により、モックベクターで処置された同腹仔と比較して、異常にミエリン化した線維の数（Ａ～Ｂ）、オニオンバルブ形成の数の有意な改善が確認された。値は、平均値±ＳＤを表す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙを使用して、データを比較した。平均値：Ａ：ｍｉＲＬａｃＺ：１９．３６，ｍｉＲ８７１：６．８３，Ｂ：ｍｉＲＬａｃＺ：２．３３、ｍｉＲ８７１：１．０９，Ｃ：ｍｉＲＬａｃＺ：０．６９，ｍｉＲ８７１：０．２５。図４４Ａ～Ｂは、後期処置ＣＭＴ１Ａマウスモデルの神経根準超薄切片を示す。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１又はＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺベクターのいずれかの髄腔内送達後のＣ６１Ｈｅｔマウスの腰髄運動脊椎神経根のトルイジンブルー染色準超薄切片。低倍率及び高倍率（Ａ～Ｂ）での、脊髄に付着した前腰髄運動神経根の準超薄切片の代表的な画像。薄くミエリン化した線維、脱ミエリン化した線維（＊）、及びオニオンバルブの形成（ｏ）。図４５Ａ～Ｃは、複数の後期処置された神経根における異常にミエリン化した線維の割合（％）の定量化（ｎ＝１群当たり７匹のマウス）により、モックベクターで処置された同腹仔と比較して、異常にミエリン化した線維の数の有意な改善（Ａ～Ｂ）、並びにオニオンバルブ形成の数（Ｃ）の有意な減少が確認された。値は、平均値±ＳＤを表す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙを使用して、データを比較した。平均値：Ａ：ｍｉＲＬａｃＺ：１９．３９，ｍｉＲ８７１：１４．６２，Ｂ：ｍｉＲＬａｃＺ：５２．２５，ｍｉＲ８７１：３２．６５，Ｃ：ｍｉＲＬａｃＺ：３８．８６，ｍｉＲ８７１：２．７１。図４６Ａ～Ｂは、後期処置ＣＭＴ１Ａマウスモデルの大腿神経準超薄切片を示す。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１又はＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺベクターのいずれかによる後期処置後のＣ６１Ｈｅｔマウスの大腿神経のトルイジンブルー染色準超薄切片。低倍率及び高倍率（Ａ～Ｂ）での、脊髄に付着した前腰髄運動神経根の準超薄切片の代表的な画像。薄くミエリン化した線維（ｔ）、脱ミエリン化した線維（＊）。図４７Ａ～Ｃは、複数の後期処置された大腿神経における異常にミエリン化した線維の割合（％）の定量化（ｍｉＲＬａｃＺｎ＝７、ｍｉＲ８７１ｎ＝１０）により、モックベクターで処置された同腹仔と比較して、異常にミエリン化した線維の数（Ａ～Ｂ）の有意な改善が確認され、オニオンバルブ形成が制限され、有意差がなかったことが確認された。値は、平均値±ＳＤを表す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙを使用して、データを比較した。平均値：Ａ：ｍｉＲＬａｃＺ：２１．９５，ｍｉＲ８７１：１１．３１，Ｂ：ｍｉＲＬａｃＺ：２．０８、ｍｉＲ８７１：１．３７，Ｃ：ｍｉＲＬａｃＺ：０．５７、ｍｉＲ８７１：０．２０。ＰＭＰ２２～２１５全長ｃＤＮＡ配列を標的化することができる１９～２３ヌクレオチドのｍｉＰＭＰ２２アンチセンスガイド鎖を示す。図における各カラムは、５’から３’方向の長さ（例えば、１９ヌクレオチドガイド鎖）のうちの１つのアンチセンスガイド鎖配列を示し、各カラムは、図の次のページまで続く（にわたる）。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。ＰＭＰ２２－２０４ｃＤＮＡ配列を示す。同上。ＰＭＰ２２－２０４ｃＤＮＡ配列を標的化することができる１９～２３ヌクレオチドのｍｉＰＭＰ２２アンチセンスガイド鎖を示す。図における各カラムは、長さ（例えば、１９ヌクレオチドガイド鎖）のうちの１つのアンチセンスガイド鎖配列を示し、各配列は、５’から３’方向に示され、各カラムは、図の次のページまで続く（にわたる）。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。注射の６週間後の、正常レベルのマウスＰＭＰ２２のみを発現する正常レベルのマウスＰＭＰ２２のみを発現する野生型（ＷＴ）マウスの腰髄神経根、坐骨神経、及び大腿神経におけるｍｕＰＭＰ２２におけるＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１効果のインビボ試験の結果を示す。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１（非標的化対照）ベクターを注射した同腹仔と比較した（ベースラインとして提示）、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による注射の６週間後のＷＴマウスにおけるｍｕＰＭＰ２２遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析。上記の転写産物の発現解析では、ｍｕＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用して、負荷に対して正規化し、相対変化を、２－ΔΔＣＴ法（平均値，ＳＤ）を使用して決定した。ｍｉＲ８７１：腰髄神経根ｎ＝４、坐骨神経ｎ＝４、大腿神経ｎ＝２。ｍｉＲＬａｃＺ：腰髄神経根ｎ＝４、坐骨神経ｎ＝４、大腿神経ｎ＝１。平均値：ｍｕＰＭＰ２２：神経根：－０．３５６８５６６７５、坐骨神経：－０．５２１２６９４７５、大腿神経：－０．８７４７２０７。注射の６週間後の、正常レベルのマウスＰＭＰ２２のみを発現する野生型（ＷＴ）マウスの腰髄神経根、坐骨神経、及び大腿神経におけるミエリン関連遺伝子におけるＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１効果のインビボ試験の結果を示す。ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（非標的化対照）ベクターを注射した同腹仔と比較した（ベースラインとして提示）、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による注射の６週間後のＷＴマウスにおけるミエリン関連遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析。上記の転写産物の発現解析では、ｍｕＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用して、負荷に対して正規化し、相対変化を、２－ΔΔＣＴ法（平均値，ＳＤ）を使用して決定した。ｍｉＲ８７１：腰髄神経根ｎ＝４、坐骨神経ｎ＝４、大腿神経ｎ＝２。ｍｉＲＬａｃＺ：腰髄神経根ｎ＝４、坐骨神経ｎ＝４、大腿神経ｎ＝１。平均値：ｍｕＭＰＺ：神経根：１．３０７５６３８２５、坐骨神経：１．４７５２７６５７５、大腿神経：２．２２８４１４４５、ｍｕＣＮＰ：神経根：０．８５６１１４７７５、坐骨神経：０．７９５３４７０５、大腿神経：５．０２５２１３、ｍｕＧｌｄｎ：神経根：１．３１６１４９９５、坐骨神経：１．０１１１０３９３５、大腿神経：２．８５５４８９６５，ｍｕＧＪＢ１：神経根：１．０２２４３０１、坐骨神経：２．０９１１６９、大腿神経：４．０６０４５２８５。図５３Ａ～Ｃは、注射の６週間後の、正常レベルのマウスＰＭＰ２２のみを発現するＷＴマウスの腰髄神経根におけるｍｕＰＭＰ２２及びＭＰＺタンパク質に対するＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１効果のインビボ試験の結果を示す。ｍｉＲ８７１又はｍｉＲＬａｃＺを発現するＡＡＶ９による腰髄髄腔内注射の６週間後の腰髄神経根溶解物中のｍｕＰＭＰ２２（Ａ）の発現レベルの免疫ブロット分析。非注射マウスからの組織試料（腰髄神経根及び脊髄）を対照として使用した。チューブリンのブロットを負荷対照（Ａ～Ｃ）として使用した。処置後、ｍｕＰＭＰ２２の発現は減少したが、ＭＰＺの発現は有意に変化しなかった（Ａ～Ｃ）。注射の成功を確認するために、ｅＧＦＰレポーター遺伝子の免疫ブロットを使用した（Ａ）。定量化のために、ｍｕＰＭＰ２２対チューブリン及びＭＰＺ対チューブリンの光学密度比を計算した（平均値、ＳＤ）。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、データを比較した：ｍｕＰＭＰ２２：ｐ＝０．０００４、ｍｕＭＰＺ：ｐ＝０．４４６５。正規化した平均値：ｍｉＲ８７１－ｍｕＰＭＰ２２：０．３４、ｍｉＲ８７１－ＭＰＺ：０．９８。図５４Ａ～Ｃは、注射の６週間後の、正常レベルのマウスＰＭＰ２２のみを発現するＷＴマウスの坐骨神経におけるｍｕＰＭＰ２２及びＭＰＺタンパク質に対するＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１効果のインビボ試験の結果を示す。ｍｉＲ８７１又はｍｉＲＬａｃＺを発現するＡＡＶ９による腰髄髄腔内注射の６週間後の坐骨神経溶解物中のｍｕＰＭＰ２２（Ａ）の発現レベルの免疫ブロット分析。非注射マウスからの組織試料（坐骨神経及び脊髄）を対照として使用した。チューブリンのブロットを負荷対照（Ａ～Ｃ）として使用した。処置後、ｍｕＰＭＰ２２の発現は減少したが、ＭＰＺの発現は増加した（Ａ～Ｃ）。注射の成功を確認するために、ｅＧＦＰレポーター遺伝子の免疫ブロットを使用した（Ａ）。定量化のために、ｍｕＰＭＰ２２対チューブリン及びＭＰＺ対チューブリンの光学密度比を計算した（平均値、ＳＤ）。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、データを比較した：ｍｕＰＭＰ２２：ｐ＝０．００２４、ｍｕＭＰＺ：ｐ＝０．０２８７。正規化した平均値：ｍｉＲ８７１－ｍｕＰＭＰ２２：０．３１、ｍｉＲ８７１－ＭＰＺ：１．５４。図５５Ａ～Ｃは、注射の６週間後の、正常レベルのマウスＰＭＰ２２のみを発現するＷＴマウスの大腿神経におけるｍｕＰＭＰ２２及びＭＰＺタンパク質に対するＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１効果のインビボ試験の結果を示す。ｍｉＲ８７１又はｍｉＲＬａｃＺを発現するＡＡＶ９による腰髄髄腔内注射の６週間後の坐骨神経溶解物中のｍｕＰＭＰ２２（Ａ）の発現レベルの免疫ブロット分析。非注射マウスからの組織試料（大腿神経及び脊髄）を対照として使用した。チューブリンのブロットを負荷対照（Ａ～Ｃ）として使用した。処置後、ｍｕＰＭＰ２２の発現は減少したが、ＭＰＺの発現は有意に変化しなかった（Ａ～Ｃ）。注射の成功を確認するために、ｅＧＦＰレポーター遺伝子の免疫ブロットを使用した（Ａ）。定量化のために、ｍｕＰＭＰ２２対チューブリン及びＭＰＺ対チューブリンの光学密度比を計算した（平均値、ＳＤ）。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、データを比較した：ｍｕＰＭＰ２２：ｐ＝０．００９９、ｍｕＭＰＺ：ｐ＝０．２５１５。正規化した平均値：ｍｉＲ８７１－ｍｕＰＭＰ２２：０．１５、ｍｉＲ８７１－ＭＰＺ：１．１７。図５６Ａ～Ｂは、ベースライン時及びＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１の注射後２ヶ月齢での、正常レベルのマウスＰＭＰ２２のみを発現するＷＴ注射マウスの５ｒｐｍでのロータロッド結果を示す。Ａ：示されるように、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１注射マウスをＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（モック）注射対照マウスと比較した。注射前、２ヶ月齢のＷＴマウスは、非注射ＷＴマウスと差異が無かった。４カ月齢（注射後２カ月）では、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１注射ＷＴマウスは、ＷＴモック群及び非注射群と比較して、運動能力の障害を示した。６ヶ月齢では、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１注射ＷＴマウスは、年齢適合非注射ＷＴマウス群又はモックマウス群と差異がなかった。調べた全ての年齢において、モック注射マウスは、ＷＴ非注射マウスと差異がなかった（ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１０、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝１０、注射される２ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝２０、２～６ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝１０）。Ｂ：時間経過分析は、モック注射ＷＴマウスと比較して、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１注射マウスの能力を実証する。値は、平均値±ＳＤを表す。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。全ての比較の有意水準、Ｐ＜０．０５。平均値：２ヶ月齢ＷＴ：５９４．１２、注射前の２ヶ月齢ＷＴ：５９９．５１、４ヶ月齢ＷＴ：５９６．１、４ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲＬａｃＺ：５８６．７８、４ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲ８７１：４９６．７２、６ヶ月齢ＷＴ：５８５．４２、６ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲＬａｃＺ：５６５．７８、６ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲ８７１：５７０．７６。図５７Ａ～Ｂは、ベースライン時及びＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１の注射後２ヶ月齢での、正常レベルのマウスＰＭＰ２２のみを発現するＷＴ注射マウスの１７．５ｒｐｍでのロータロッド結果を示す。Ａ：示されるように、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１注射マウスをＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（モック）注射対照マウスと比較した。注射前、２ヶ月齢のＷＴマウスは、非注射ＷＴマウスと差異が無かった。４カ月齢（注射後２カ月）では、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１注射ＷＴマウスは、ＷＴモック群及び非注射群と比較して、運動能力の障害を示した。６ヶ月齢では、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１注射ＷＴマウスは、年齢適合非注射ＷＴマウス群又はモックマウス群と差異がなかった。調べた全ての年齢において、モック注射マウスは、ＷＴ非注射マウスと差異がなかった（ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１０、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝１０、注射される２ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝２０、２～６ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝１０）。Ｂ：時間経過分析は、モック注射ＷＴマウスと比較して、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１注射マウスの能力を実証する。値は、平均値±ＳＤを表す。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。全ての比較の有意水準、Ｐ＜０．０５。平均値：２ヶ月齢ＷＴ：５８２．２２、注射前の２ヶ月齢ＷＴ：５６５．０６、４ヶ月齢ＷＴ：４９７．８、４ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲＬａｃＺ：４６１．４４、４ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲ８７１：２３７、６ヶ月齢ＷＴ：４１６．１６、６ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲＬａｃＺ：４７４．３２、６ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲ８７１：３７７．３８。図５８Ａ～Ｂは、ベースライン時及びＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１の注射後２ヶ月齢での、正常レベルのマウスＰＭＰ２２のみを発現するＷＴ注射マウスのグリップ強度結果を示す。Ａ：示されるように、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１注射マウスをＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（モック）注射対照マウスと比較した。注射前、２ヶ月齢のＷＴマウスは、非注射ＷＴマウスと差異が無かった。調べた全ての年齢で、ＷＴ非注射マウス及びモック注射マウスは、それらの年齢適合ＷＴ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１マウスよりも良好な成績を示した。調べた全ての年齢において、モック注射マウスは、ＷＴ非注射マウスと差異がなかった（ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１０、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝１０、注射される２ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝２０、２～６ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝１０）。Ｂ：時間経過分析は、モック注射ＷＴマウスと比較して、ＷＴＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１注射マウスの能力を実証する。値は、平均値±ＳＤを表す。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。全ての比較の有意水準、Ｐ＜０．０５。平均値：２ヶ月齢ＷＴ：５１．２８、注射前の２ヶ月齢ＷＴ：４６．１１、４ヶ月齢ＷＴ：４２．７３、４ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲＬａｃＺ：４０．０９、４ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲ８７１：２３．３４、６ヶ月齢ＷＴ：３６．８１、６ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲＬａｃＺ：３２．９８、６ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲ８７１：２４．４８。図５９Ａ～Ｂは、ベースライン時及びＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１の注射後２ヶ月齢での、正常レベルのマウスＰＭＰ２２のみを発現するＷＴ注射マウスのハング試験結果を示す。Ａ：示されるように、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１注射マウスをＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（モック）注射対照マウスと比較した。注射前、２ヶ月齢のＷＴマウスは、非注射ＷＴマウスと差異が無かった。４ヶ月齢（注射後２ヶ月）で、非注射ＷＴマウス、モック注射マウス、及びＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１注射マウスも同様な成績を示した。６カ月齢（注射後４カ月）では、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１注射ＷＴマウスは、ＷＴモック群及び非注射群と比較して、能力の障害を示した。調べた全ての年齢において、モック注射マウスは、ＷＴ非注射マウスと差異がなかった（ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：ｎ＝１０、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝１０、注射される２ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝２０、２～６ヶ月齢ＷＴ：ｎ＝１０）。Ｂ：時間経過分析は、モック注射ＷＴマウスと比較して、ＷＴＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１注射マウスの能力を実証する。値は、平均値±ＳＤを表す。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。全ての比較の有意水準、Ｐ＜０．０５。平均値：２ヶ月齢ＷＴ：５９３．７、注射前の２ヶ月齢ＷＴ：５８５．２６、４ヶ月齢ＷＴ：５２７．２８、４ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲＬａｃＺ：５０３．９２、４ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲ８７１：４１０．２、６ヶ月齢ＷＴ：３５１．３、６ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲＬａｃＺ：４４９．０６、６ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲ８７１：１６１．９４。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１早期処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスの生理学的改善を示す。複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の振幅は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺベクターを注射した同腹仔（ｎ＝８）と比較して、６ヶ月齢のＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置Ｃ６１Ｈｅｔマウス（ｎ＝８）において改善されたが、ＷＴマウス（ｎ＝６）の値には達しなかった。値は、平均値±ＳＤを表す。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。平均値（ｍＶ）：６ヶ月齢ＷＴ：６．９０、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１．４４、６ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：３．５１。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１後期処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスの生理学的能力の改善を示す。複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の振幅は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺベクターを注射した同腹仔（ｎ＝８）と比較して、１０ヶ月齢のＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置Ｃ６１Ｈｅｔマウス（ｎ＝８）では改善されず、ＷＴマウスの値には達しなかった（ｎ＝６）。値は、平均値±ＳＤを表す。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。平均値（ｍＶ）：１０ヶ月齢ＷＴ：５．３３、１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：２．４０，１０ヶ月齢Ｈｅｔ－ｍｉＲ８７１：２．９８。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１ＷＴ注入マウスの生理学的能力を示す。複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の振幅は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺベクターを注射した同腹仔（ｎ＝４）と比較して、６ヶ月齢のＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置ＷＴマウス（ｎ＝５）において減少したが（Ｂ）、運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）は、ＷＴ非注射マウス（ｎ＝６）の値と比較して、影響を受けなかった（Ａ）。値は、平均値±ＳＤを表す。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。平均値：６ヶ月齢ＷＴ：６．８９、６ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲＬａｃＺ：７．０３、６ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲ８７１：４．６２。ＭＮＣＶの平均値：６ヶ月齢ＷＴ：４１．６１、６ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲＬａｃＺ：４２．０９、６ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲ８７１：４０．０７。注射の４ヶ月後（６ヶ月齢）の、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ又はＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１ベクターのいずれかを注射したＷＴマウスの後肢クラスピング表現型を示す。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１又はＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺのいずれかを注射したＷＴマウス群の末梢神経障害の表現型評価の後肢クラスピング角度の定量化及び代表的な画像。６ヶ月齢のＷＴマウス、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺを注射したＷＴマウス、又はＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射したＷＴマウスの間に差異はなかった。ＣＭＡＰの平均値（ｍＶ）：６ヶ月齢ＷＴ：７３．１９、６ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲＬａｃＺ：７０．５４、６ヶ月齢ＷＴ－ｍｉＲ８７１：５９．０９。ベースラインのＷＴマウス及びＣ６１－Ｈｅｔマウス、並びにＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺを注射したＣ６１－Ｈｅｔマウスの前腰髄神経根切片の注射後６週間及び４ヶ月の免疫応答分析を示す。総細胞数（平均値、ＳＤ）に対して、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０、白血球マーカーＣＤ４５、マクロファージマーカーＣＤ６８、及びＴ細胞マーカーＣＤ３の割合を計算した。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。全ての比較の有意水準、Ｐ＜０．０５（ＷＴ：ｎ＝４、Ｃ６１Ｈｅｔ：ｎ＝４、Ｃ６１Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝４）。平均値：ＣＤ２０：６週間：ＷＴ：０．０６、Ｈｅｔ：０．５５、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：０．６９、４か月：ＷＴ：０．１８、Ｈｅｔ：１．９４、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１．３７、ＣＤ４５：ＷＴ：０．２３、Ｈｅｔ：７．８２、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：７．４３、４ヶ月：ＷＴ：１．４９、Ｈｅｔ：８．４６、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：８．１３、ＣＤ６８：ＷＴ：２．３８、Ｈｅｔ：３．５９、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：３．３４、４ヶ月：ＷＴ：１．００、Ｈｅｔ：６．８８、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：７．６２、ＣＤ３：ＷＴ：０．０７、Ｈｅｔ：０．７６、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：０．８４、４か月：ＷＴ：０．２３、Ｈｅｔ：１．４３、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１．２０。ベースラインのＷＴマウス及びＣ６１－Ｈｅｔマウス、並びにＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺを注射したＣ６１－Ｈｅｔマウスの坐骨神経切片の注射後６週間及び４ヶ月の免疫応答分析を示す。総細胞数（平均値、ＳＤ）に対して、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０、白血球マーカーＣＤ４５、マクロファージマーカーＣＤ６８、及びＴ細胞マーカーＣＤ３の割合を計算した。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。全ての比較の有意水準、Ｐ＜０．０５（ＷＴ：ｎ＝４、Ｃ６１Ｈｅｔ：ｎ＝４、Ｃ６１Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝４）。平均値：ＣＤ２０：６週間：ＷＴ：２．３８、Ｈｅｔ：３．５９、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：３．３４、４ヶ月：ＷＴ：１．００、Ｈｅｔ：６．８８、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：７．６２、ＣＤ４５：ＷＴ：２．７６、Ｈｅｔ：７．０３、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：６．６４、４ヶ月：ＷＴ：１．９４、Ｈｅｔ：６．３６、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：６．６２、ＣＤ６８：ＷＴ：２．７６、Ｈｅｔ：７．０３、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：６．６４、４ヶ月：ＷＴ：１．９４、Ｈｅｔ：６．３６、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：６．６２、ＣＤ３：ＷＴ：０．８５、Ｈｅｔ：２．２７、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１．８６、４ヶ月：ＷＴ：０．６６、Ｈｅｔ：４．５７、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：４．４６。ベースラインのＷＴ及びＣ６１－Ｈｅｔマウス、並びにＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺを注射したＣ６１－Ｈｅｔマウスの肝臓切片の注射後６週間及び４ヶ月の免疫応答分析を示す。総細胞数（平均値、ＳＤ）に対して、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０、白血球マーカーＣＤ４５、マクロファージマーカーＣＤ６８、及びＴ細胞マーカーＣＤ３の割合を計算した。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。全ての比較の有意水準、Ｐ＜０．０５（ＷＴ：ｎ＝４、Ｃ６１Ｈｅｔ：ｎ＝４、Ｃ６１Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝４）。平均値：ＣＤ２０：６週間：ＷＴ：０．０９、Ｈｅｔ：０．６２、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：０．６４、４ヶ月：ＷＴ：０．１６のＨｅｔ：０．５９、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：０．６２、ＣＤ４５：ＷＴ：０．７７、Ｈｅｔ：０．６６、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：２．５０、４ヶ月：ＷＴ：１．３６、Ｈｅｔ：１．００、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１．２４、ＣＤ６８：ＷＴ：１．２８、Ｈｅｔ：１．１５、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１．１７、４ヶ月：ＷＴ：０．６６、Ｈｅｔ：１．０３、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１．２３、ＣＤ３：ＷＴ：０．７２、Ｈｅｔ：０．７７、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：１．６９、４ヶ月：ＷＴ：１．０１、Ｈｅｔ：１．１０、Ｈｅｔ－ｍｉＲＬａｃＺ：０．９２。６ヶ月齢のベースラインのＷＴマウス（ｎ＝４）、Ｃ６１Ｈｅｔマウス（ｎ＝４）、Ｃ６１ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウス（ｎ＝６）、及びＣ６１ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウス（ｎ＝６）における血漿中ニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。Ｎｆｌ濃度は、軸索損傷の動的尺度であり、ＣＭＴ疾患の重症度のバイオマーカーとして機能する。６ヶ月齢のベースラインのＣ６１Ｈｅｔマウスは、年齢適合したベースラインのＷＴマウスと比較して、その血漿中のＮｆｌの濃度がより高いことを示した。Ｃ６１ＨｅｔマウスへのＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺの注射は、年齢適合非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスと比較した場合、Ｎｆｌレベルに影響を及ぼさなかった。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による早期処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺを注射したＣ６１Ｈｅｔマウスと比較した場合、その血漿中のＮｆｌの濃度が低いことを示した。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１のスコアが、ＷＴレベルに近づいた。平均値：６ヶ月齢ＷＴ：１３１．１０、６ヶ月齢Ｃ６１Ｈｅｔ：４１８．０７、Ｃ６１ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：５４０．６５、Ｃ６１ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：３２１．３７。１０ヶ月齢のベースラインのＷＴマウス（ｎ＝４）、Ｃ６１Ｈｅｔマウス（ｎ＝４）、Ｃ６１ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウス（ｎ＝６）、及びＣ６１ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウス（ｎ＝６）における血漿中ニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。Ｎｆｌ濃度は、軸索損傷の動的尺度であり、ＣＭＴ疾患の重症度のバイオマーカーとして機能する。１０ヶ月齢のベースラインのＣ６１Ｈｅｔマウスは、年齢適合したベースラインのＷＴマウスと比較して、その血漿中のＮｆｌの濃度がより高いことを示した。Ｃ６１ＨｅｔマウスへのＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺの注射は、年齢適合非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスと比較した場合、Ｎｆｌレベルに影響を及ぼさなかった。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による後期処置は、１０ヶ月齢のＣ６１ＨｅｔマウスにおけるＮｆｌレベルを改善するのに十分ではなかった。平均値：１０ヶ月齢ＷＴ：８８．０７、１０ヶ月齢Ｃ６１Ｈｅｔ：５３９．６６、Ｃ６１ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：４７１．９９、Ｃ６１ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：５５９．２８。６ヶ月齢のベースラインのＷＴマウス（ｎ＝４）、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置ＷＴマウス（ｎ＝５）、及びＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置ＷＴマウス（ｎ＝５）における血漿中ニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。Ｎｆｌ濃度は、軸索損傷の動的尺度である。非注射及び注射ＷＴマウス間では、血漿Ｎｆｌ協議に関して差異はなかった。平均値：６ヶ月齢ＷＴ：１３１．１０，ＷＴＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：１２８．９３、ＷＴＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：１０４．９２。ベースラインのＷＴマウス及びＣ６１－Ｈｅｔマウス、並びに注射後４ヶ月でＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射したＣ６１－Ｈｅｔマウス（６ヶ月齢マウス）の早期処置前腰髄神経根切片の免疫組織化学切片の免疫応答分析を示す。総細胞数（平均値、ＳＤ）に対して、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０、白血球マーカーＣＤ４５、マクロファージマーカーＣＤ６８、及びＴ細胞マーカーＣＤ３の割合を計算した。６ヶ月齢の非注射Ｃ６１Ｈｅｔ腰髄神経根は、全ての免疫応答マーカーのスコアの上昇を示し、これらは、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１の注射後、ＷＴレベルまで低下した。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。全ての比較の有意水準、Ｐ＜０．０５。平均値：ＣＤ２０：ＷＴ：０．１８、Ｃ６１Ｈｅｔ：１．９４、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：０．２５、ＣＤ４５：ＷＴ：１．４９、Ｃ６１Ｈｅｔ：８．４６、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：２．３９、ＣＤ６８：ＷＴ：１．００、Ｃ６１Ｈｅｔ：６．８８、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：０．９８、ＣＤ３：ＷＴ：０．２３、Ｃ６１Ｈｅｔ：１．４３、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：０．６０。ベースラインのＷＴマウス及びＣ６１－Ｈｅｔマウス、並びに注射後４ヶ月でＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射したＣ６１－Ｈｅｔマウス（６ヶ月齢マウス）の早期処置坐骨神経の免疫組織化学切片の免疫応答分析を示す。総細胞数（平均値、ＳＤ）に対して、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０、白血球マーカーＣＤ４５、マクロファージマーカーＣＤ６８、及びＴ細胞マーカーＣＤ３の割合を計算した。６ヶ月齢の非注射Ｃ６１Ｈｅｔ坐骨神経は、全ての免疫応答マーカーのスコアの上昇を示し、これらは、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１の注射後、ＷＴレベルまで低下した。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。全ての比較の有意水準、Ｐ＜０．０５。平均値：ＣＤ２０：ＷＴ：０．０５、Ｃ６１Ｈｅｔ：１．２５、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：０．５１、ＣＤ４５：ＷＴ：１．９３、Ｃ６１Ｈｅｔ：６．３６、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：２．６８、ＣＤ６８：ＷＴ：０．６６、Ｃ６１Ｈｅｔ：４．５８、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：１．２２、ＣＤ３：ＷＴ：０．１６、Ｃ６１Ｈｅｔ：０．５９、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：０．２５。ベースラインのＷＴマウス及びＣ６１－Ｈｅｔマウス、並びに注射後４ヶ月でＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射したＣ６１－Ｈｅｔマウス（６ヶ月齢マウス）の早期処置肝臓の免疫組織化学切片の免疫応答分析を示す。総細胞数（平均値、ＳＤ）に対して、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０、白血球マーカーＣＤ４５、マクロファージマーカーＣＤ６８、及びＴ細胞マーカーＣＤ３の割合を計算した。６ヶ月齢の非注射ＷＴマウス、Ｃ６１Ｈｅｔマウス、及びＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射したＣ６１Ｈｅｔマウスの肝臓は、同様のスコアの免疫応答マーカーを示した。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。全ての比較の有意水準、Ｐ＜０．０５。平均値：ＣＤ２０：ＷＴ：１．３６、Ｃ６１Ｈｅｔ：１．００、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：１．１９、ＣＤ４５：ＷＴ：０．６６、Ｃ６１Ｈｅｔ：１．０３、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：０．９１、ＣＤ６８：ＷＴ：１．９９、Ｃ６１Ｈｅｔ：２．４２、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：２．５２、ＣＤ３：ＷＴ：１．０１、Ｃ６１Ｈｅｔ：１．０９、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：１．１１。ベースラインのＷＴマウス及びＣ６１－Ｈｅｔマウス、並びに注射後４ヶ月でＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射したＣ６１－Ｈｅｔマウス（１０ヶ月齢マウス）の後期処置前腰髄神経根切片の免疫応答分析を示す。総細胞数（平均値、ＳＤ）に対して、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０、白血球マーカーＣＤ４５、マクロファージマーカーＣＤ６８、及びＴ細胞マーカーＣＤ３の割合を計算した。１０ヶ月齢の非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスの腰髄神経根は、全ての免疫応答マーカーのスコアの上昇を示し、これらは、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１の注射後、ＷＴレベルまで低下した。唯一の例外は、ＣＤ４５陽性細胞であり、その有意な低下にもかかわらず、ＷＴレベルに達しなかった。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。全ての比較の有意水準、Ｐ＜０．０５。平均値：ＣＤ２０：ＷＴ：０．３９、Ｃ６１Ｈｅｔ：１．８０、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：０．４５、ＣＤ４５：ＷＴ：４．０７、Ｃ６１Ｈｅｔ：１３．４５、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：７．３２、ＣＤ６８：ＷＴ：２．３２、Ｃ６１Ｈｅｔ：７．８１、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：１．２５、ＣＤ３：ＷＴ：０．４５、Ｃ６１Ｈｅｔ：２．１９、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：０．５５。ベースラインのＷＴマウス及びＣ６１－Ｈｅｔマウスの後期処置坐骨神経切片、並びに注射後４ヶ月でＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射したＣ６１－Ｈｅｔマウス（１０ヶ月齢のマウス）の免疫応答分析を示す。総細胞数（平均値、ＳＤ）に対して、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０、白血球マーカーＣＤ４５、マクロファージマーカーＣＤ６８、及びＴ細胞マーカーＣＤ３の割合を計算した。１０ヶ月齢の非注射Ｃ６１Ｈｅｔ坐骨神経は、全ての免疫応答マーカーのスコアの上昇を示し、これらは、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１の注射後、ＷＴレベルまで低下した。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。全ての比較の有意水準、Ｐ＜０．０５。平均値：ＣＤ２０：ＷＴ：０．１４、Ｃ６１Ｈｅｔ：１．２９、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：０．４３、ＣＤ４５：ＷＴ：６．２１、Ｃ６１Ｈｅｔ：１２．３４、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：８．５２、ＣＤ６８：ＷＴ：２．１７、Ｃ６１Ｈｅｔ：５．２５、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：２．５１、ＣＤ３：ＷＴ：０．３７、Ｃ６１Ｈｅｔ：１．６５、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：０．５７。ベースラインのＷＴマウス及びＣ６１－Ｈｅｔマウスの後期処置肝臓切片、並びに注射後４ヶ月でＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射したＣ６１－Ｈｅｔマウス（１０ヶ月齢のマウス）の免疫応答分析を示す。総細胞数（平均値、ＳＤ）に対して、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０、白血球マーカーＣＤ４５、マクロファージマーカーＣＤ６８、及びＴ細胞マーカーＣＤ３の割合を計算した。１０ヶ月齢の非注射ＷＴマウス、Ｃ６１Ｈｅｔマウス、及びＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射したＣ６１Ｈｅｔマウスの肝臓は、同様のスコアの免疫応答マーカーを示した。一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、データを比較した。全ての比較の有意水準、Ｐ＜０．０５。平均値：ＣＤ２０：ＷＴ：４．０４、Ｃ６１Ｈｅｔ：４．６９、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：４．８９、ＣＤ４５：ＷＴ：３．８４、Ｃ６１Ｈｅｔ：３．０３、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：３．９８、ＣＤ６８：ＷＴ：１２．６３、Ｃ６１Ｈｅｔ：１１．８６、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：１０．６８、ＣＤ３：ＷＴ：１．４８、Ｃ６１Ｈｅｔ：２．７４、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：２．８４。注射後４ヶ月（６ヶ月齢のマウス）の早期処置マウスのＰＮＳ及び非ＰＮＳ組織のＶＧＣＮを示す。平均値：神経根：３．５７、坐骨神経：３．５７、大腿神経：０．５５、脳：０．１９、肝臓：２１．２９、腎臓：０．１７、肺：０．１７、四頭筋：０．０９、心臓：０．４８、胃：０．０５、眼：０．４３。注射後４ヶ月（１０ヶ月齢のマウス）の後期処置マウスのＰＮＳ及び非ＰＮＳ組織のＶＧＣＮを示す。平均値：神経根：１．８４、坐骨神経：２．７３、大腿神経：１．４１、脳：０．３４、肝臓：２０．７４、腎臓：０．６３、肺：０．８５、四頭筋：０．３３、心臓：３．８６、胃：０．１７、眼：０．１７。

本明細書に記載の生成物及び方法は、重複及び／又は変異型ＰＭＰ２２遺伝子に関連する疾患の治療に使用される。ＰＭＰ２２に関連する疾患としては、例えば、ＣＭＴ１Ａが挙げられる。

ヒトＰＭＰ２２をコードする核酸は、配列番号２５に示されている。本開示の様々な生成物及び方法は、配列番号２５に示されるヒトＰＭＰ２２ヌクレオチド配列のバリアントを標的化することができる。バリアントは、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％の同一性を示すことができる。

マウスＰＭＰ２２をコードする核酸は、配列番号２７に示されている。本開示の様々な生成物及び方法は、配列番号２７に示されるヌクレオチド配列のバリアントを標的化することができる。バリアントは、配列番号２７に示されるヌクレオチド配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％の同一性を示すことができる。

本開示には、ＰＭＰ２２の過剰発現に起因する疾患又は障害を有する対象を改善及び／又は治療するために、ＰＭＰ２２の発現を阻害又は妨害するためのＲＮＡ干渉の使用が含まれる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、真核細胞における遺伝子調節のメカニズムであり、様々な疾患の治療のために考慮されている。ＲＮＡｉは、阻害性ＲＮＡによって媒介される遺伝子発現の転写後制御を指す。阻害性ＲＮＡは、小さい（長さ２１～２５ヌクレオチド）、同族メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と配列相同性及び塩基対を共有する非コードＲＮＡである。阻害性ＲＮＡとｍＲＮＡとの間の相互作用は、ｍＲＮＡの翻訳を防止するために細胞遺伝子サイレンシング機構を指示する。ＲＮＡｉ経路は、Ｄｕａｎ（Ｅｄ．），Ｓｅｃｔｉｏｎ７．３ｏｆＣｈａｐｔｅｒ７ｉｎＭｕｓｃｌｅＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，ＳｐｒｉｎｇｅｒＳｃｉｅｎｃｅ＋ＢｕｓｉｎｅｓｓＭｅｄｉａ，ＬＬＣ（２０１０）に要約されている。

天然のＲＮＡｉ経路の理解が進むにつれて、研究者は、疾患を治療するために、標的遺伝子の発現の調節に使用するための人工阻害性ＲＮＡを設計した。いくつかのクラスの低分子ＲＮＡは、哺乳類細胞でＲＮＡｉプロセスを誘発することが知られている［Ｄａｖｉｄｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１２：３２９－４０（２０１１）、Ｈａｒｐｅｒ，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６６：９３３－９３８（２００９）］。プラスミド又はウイルスベースのベクターからインビボで発現される人工阻害性ＲＮＡ及びは、ベクターが標的細胞核内に存在し、駆動するプロモーターが活性である限り、単回投与で長期の遺伝子サイレンシングを達成することができる［Ｄａｖｉｄｓｏｎｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，３９２：１４５－７３，（２００５）］。重要なことに、このベクター発現アプローチは、筋肉遺伝子療法の分野で既に数十年にわたって行われてきた進歩を活用しているが、タンパク質をコードする遺伝子を発現させる代わりに、ＲＮＡｉ療法戦略におけるベクターカーゴは、目的の疾患遺伝子を標的化する人工阻害性ＲＮＡである。

ＰＭＰ２２の発現（例えば、発現のノックダウン又は阻害）に影響を与えるｓｈＲＮＡを含む生成物及び方法が本明細書に提供される。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子の発現をサイレンシングするために使用することができるタイトなヘアピンターンを有する人工ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、それが分解及び代謝回転の速度が比較的低いという点でＲＮＡｉの有利なメディエーターであるが、それは発現ベクターの使用を必要とする。ベクターが宿主ゲノムに形質導入されると、ｓｈＲＮＡは、プロモーターの選択に応じて、ポリメラーゼＩＩ又はポリメラーゼＩＩＩによって核内で転写される。この生成物は、プリマイクロＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を模倣し、Ｄｒｏｓｈａによってプロセシングされる。得られたｐｒｅ－ｓｈＲＮＡは、エキスポーチン５によって核から輸送される。次いで、この生成物がＤｉｃｅｒによってプロセシングされ、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に装填される。センス（パッセンジャー）鎖が分解される。アンチセンス（ガイド）鎖は、相補的配列を有するｍＲＮＡにＲＩＳＣを誘導する。完全に相補的である場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡを切断する。不完全に相補的である場合、ＲＩＳＣはｍＲＮＡの翻訳を抑制する。これらの両方の場合において、ｓｈＲＮＡは、標的遺伝子のサイレンシングをもたらす。本開示は、ｓｈＲＮＡを介してＰＭＰ２２アンチセンス配列を発現するウイルスベクターの産生及び投与を含む。ｓｈＲＮＡの発現は、様々なプロモーターを使用することによって調節される。本開示は、Ｕ６及びＨ１プロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩプロモーター、又はポリメラーゼＩＩプロモーターの使用を企図する。Ｕ６ｓｈＲＮＡが例示される。

本明細書に提供される生成物及び方法は、ＰＭＰ２２の発現を修飾する（例えば、発現をノックダウン又は阻害する）ためのｍｉＲＮＡシャトルを含むことができる。ｓｈＲＮＡと同様に、ｍｉＲＮＡシャトルは、ＤＮＡ導入遺伝子から細胞内で発現する。ｍｉＲＮＡシャトルは、典型的には、正しいプロセシングを誘導するために必要な天然のｍｉＲＮＡ配列を含むが、ステム内の天然の成熟したｍｉＲＮＡ二重鎖は、（例えば、図１に示されるように）意図された標的転写産物に特異的な配列によって置き換えられる。発現後、人工ｍｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒによって切断されて、埋め込まれたｓｉＲＮＡ様領域を遊離する。Ｕ６及びＨ１プロモーターなどのポリメラーゼＩＩＩプロモーター、並びにポリメラーゼＩＩプロモーターも、ｍｉＲＮＡシャトルの発現を駆動するために使用される。

本開示は、ＰＭＰ２２遺伝子の発現を阻害するために、ｍｉＰＭＰ２２をコードする核酸を提供する。本開示は、ｍｉＰＭＰ２２をコードする核酸を提供し、核酸は、配列番号１～８のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む。本開示は、ｍｉＰＭＰ２２のプロセシングされたアンチセンスガイド鎖をコードする核酸を提供し、これは、配列番号１７～２４のうちのいずれか１つに示されるｍｉＰＭＰ２２のプロセシングされたアンチセンスガイド鎖と少なくとも約７０％、７５、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む。

例示的なｍｉＰＭＰ２２は、配列番号９～１６のうちのいずれか１つ以上に示されるＲＮＡ配列、又は配列番号９～１６のうちのいずれか１つと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むそのバリアントを含む。配列番号９～１６に対応する最終的にプロセシングされたガイド鎖配列は、それぞれ配列番号１７～２４に示される。本開示は更に、図４８に示されるアンチセンスガイド鎖を提供し、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である、これらのアンチセンスガイド鎖の各々のバリアントを企図する。本開示は更に、図５０に示されるアンチセンスガイド鎖を提供し、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である、これらのアンチセンスガイド鎖の各々のバリアントを企図する。

本開示は、これらの配列のうちの１つ以上のコピーをコードするポリヌクレオチドが、ベクターなどの単一の送達ビヒクルに組み合わされることを企図する。したがって、本開示は、本開示の核酸又は本開示の核酸の組み合わせを含むベクターを含む。本明細書に開示される核酸を送達するためのウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ随伴ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、若しくは合成ウイルス（例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、若しくは偽型ウイルス）、及び／又は外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、若しくは小分子を含有するウイルス）が提供される。ＡＡＶベクターが例示される。非ウイルス送達ビヒクルもまた、企図される。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠陥パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、約４．７ｋｂ長であり、１４５ヌクレオチドの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されている。ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４（１９８３）に提供されている。ＡＡＶ－３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されている。ＡＡＶ－４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されている。ＡＡＶ－５のゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されている。ＡＡＶ－６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されている。ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部分は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供されている。ＡＡＶ－９のゲノムは、Ｇａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されている。ＡＡＶ－１０のゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されている。ＡＡＶ－１１のゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶ－１２のゲノムの部分は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＤＱ８１３６４７に提供されている。ＡＡＶ－１３のゲノムの部分は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＵ２８５５６２に提供されている。ＡＡＶｒｈ．７４のゲノムの配列は、米国特許第９，４３４，９２８号に提供されている（参照により本明細書に援用される）。ＡＡＶ－Ｂ１のゲノムの配列は、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２４（７）：１２４７－１２５７（２０１６）に提供されている。ウイルスのＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体への組込みを誘導するシス作用性配列は、ＡＡＶＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置にちなんでｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられている）は、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部のオープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシング（ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）と共役した、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を保有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。

ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞傷害性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、無症状及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を与える。更に、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞及び非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外エレメント）として本質的にそれらの細胞の生涯にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成、及び組み込みを誘導するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれているため、内部の約４．３ｋｂのゲノム（複製及び構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部又は全てを、外来ＤＮＡで置き換えることができる。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性が低くなる。ＡＡＶは、凍結乾燥することもできる。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性がない。

本明細書に例示されるように、ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を欠く。ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補型組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり得る。ＡＡＶは、例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、又はＡＡＶｒｈ．１０に由来し得るカプシド血清型を有する。

提供されるウイルスベクターとしては、例えば、ＡＡＶ１（すなわち、ＡＡＶ１逆末端反復（ＩＴＲ）及びＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ２（すなわち、ＡＡＶ２ＩＴＲ及びＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ３（すなわち、ＡＡＶ３ＩＴＲ及びＡＡＶ３カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ４（すなわち、ＡＡＶ４ＩＴＲ及びＡＡＶ４カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ５（すなわち、ＡＡＶ５ＩＴＲ及びＡＡＶ５カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ６（すなわち、ＡＡＶ６ＩＴＲ及びＡＡＶ６カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ７（すなわち、ＡＡＶ７ＩＴＲ及びＡＡＶ７カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ８（すなわち、ＡＡＶ８ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ９（すなわち、ＡＡＶ９ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ７４（すなわち、ＡＡＶｒｈ７４ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．８（すなわち、ＡＡＶｒｈ．８ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．８カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．１０（すなわち、ＡＡＶｒｈ．１０ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１１（すなわち、ＡＡＶ１１ＩＴＲ及びＡＡＶ１１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１２（すなわち、ＡＡＶ１２ＩＴＲ及びＡＡＶ１２カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、又はＡＡＶ１３（すなわち、ＡＡＶ１３ＩＴＲ及びＡＡＶ１３カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）が挙げられる。

本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子に組み立てるために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）の感染が許容される細胞に導入される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能を細胞に提供するｒＡＡＶ粒子を生成する技術は、当該技術分野において標準である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶｒｅｐ遺伝子は、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、及びＡＡＶｒｈ．７４が含まれるが、これらに限定されない）に由来してもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよい。ｒＡＡＶゲノム中のＩＡＡＶＤＮＡは、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、及びＡＡＶｒｈ．７４が含まれるが、これらに限定されない）に由来することができる。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも、本開示に含まれる。例えば、Ｍａｒｓｉｃｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上述のとおり、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。同族成分の使用が具体的に企図される。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている（その全体が参照により本明細書に援用される）。

ＡＡＶベクターは、擬ＡＡＶであり得、１つのＡＡＶ血清型からのＩＴＲと、異なるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質と、を含む。偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／９（すなわち、ＡＡＶ２ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）であり得る。擬似型のＡＡＶは、ＡＡＶ２／８（すなわち、ＡＡＶ２ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）であり得る。擬似型のＡＡＶは、ＡＡＶ２／１（すなわち、ＡＡＶ２ＩＴＲ及びＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）であり得る。

ＡＡＶベクターは、組換えカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ．８、若しくはＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ１３からのカプシドタンパク質のうちの１つ以上のキメラを含むカプシドタンパク質）を含むことができる。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶ、も企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上述のとおり、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。

本開示は、ＰＭＰ２２ｍＲＮＡを標的化してＰＭＰ２２発現を阻害するｍｉＰＭＰ２２を送達するためのＡＡＶを提供する。ＡＡＶは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）ベースのプロモーターの制御下でｍｉＰＭＰ２２を送達するために使用することができる。ＡＡＶは、Ｕ６プロモーターの制御下でｍｉＰＭＰ２２を送達するために使用される。ＡＡＶは、Ｈ１プロモーターの制御下でｍｉＰＭＰ２２を送達するために使用される。ＡＡＶは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）ベースのプロモーターの制御下でｍｉＰＭＰ２２を送達するために使用される。ＡＡＶは、Ｕ７プロモーターの制御下でｍｉＰＭＰ２２を送達するために使用される。ＡＡＶは、シュワン細胞特異的プロモーターの制御下でｍｉＰＭＰ２２を送達するために使用される。ＡＡＶは、ＭＰＺプロモーターの制御下でｍｉＰＭＰ２２を送達するために使用される。ＡＡＶは、ＰＭＰ２２プロモーターの制御下でｍｉＰＭＰ２２を送達するために使用される。

本質的に、Ｕ６プロモーターは、Ｕ６ＲＮＡの発現を制御する。Ｕ６ＲＮＡは、スプライシングに関与する核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）であり、これらは十分に特徴付けられている［Ｋｕｎｋｅｌｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２２（６０７４）：７３－７７（１９８６）、Ｋｕｎｋｅｌｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．２（２）：１９６－２０４（１９８８）、Ｐａｕｌｅｅｔａｌ．，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２８（６）：１２８３－１２９８（２０００）］。Ｕ６プロモーターは、哺乳類細胞におけるベクターベースの発現を制御するために使用されている［Ｐａｄｄｉｓｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９（３）：１４４３－１４４８（２００２）、Ｐａｕｌｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（５）：５０５－５１８（２００２）］。それは、（１）プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌｙＩＩＩ）によって認識され、ＲＮＡの高レベルな構成的発現を制御し、（２）プロモーターがほとんどの哺乳類細胞型において活性であるためである。本開示は、マウス及びヒトの両方のＵ６プロモーターの使用を含む。

本明細書におけるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を欠く。ＡＡＶは、組換えＡＡＶ、組換え一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）、又は組換え自己相補型ＡＡＶ（組換えｓｃＡＡＶ）であり得る。

本開示のｒＡＡＶゲノムは、例えば、１つ以上のｍｉＰＭＰ２２をコードするポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＡＡＶＩＴＲを含む。商業プロバイダー、例えば、ＡｍｂｉｏｎＩｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、ＤａｒｍａｃｏｎＩｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＬＬＣ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）は、カスタム阻害性ＲＮＡ分子を生成している。加えて、市販のキットは、ＳＩＬＥＮＣＥＲ（商標）ｓｉＲＮＡ構築キット（ＡｍｂｉｏｎＩｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）又はｐｓｉＲＮＡシステム（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）などのカスタムｓｉＲＮＡ分子を産生するために利用可能である。

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全ての成分を安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びに選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）を含む、プラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング［Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１（１９８２）］、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加［Ｌａｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３（１９８３）］、又は直接平滑末端ライゲーション［Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６（１９８４）］などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム並びに／又はｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを使用する。

ｒＡＡＶの生産の一般原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－１５３９（１９９２）及びＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．ＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。様々なアプローチが以下に記載されている：Ｒａｔｓｃｈｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８（１９８９）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５、及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１３：１２４４－１２５０（１９９５）、Ｐａｕｌｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，４：６０９－６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，３：１１２４－１１３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、米国特許第６，２５８，５９５号、及びＭｃＣａｒｔｙ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６（１０）：１６４８－１６５６（２００８）。前述の文書は、それらの全体が参照により本明細書に援用され、特に、ｒＡＡＶ産生に関する文書のセクションに重点を置く。自己相補型（ｓｃ）ｒＡＡＶの産生及び使用は、具体的に企図され、例示される。

本開示は、ＡＡＶベクターを産生するパッケージング細胞を更に提供する。パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定して形質転換されたがん細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代数の２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。

したがって、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）が本明細書に提供される。ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐのＤＮＡを欠き、すなわち、ｒＡＡＶのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐ又はｃａｐのＤＮＡが存在しない。

ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって（例えば、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配などによって）精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、ＳｃｈｅｎｐｐａｎｄＣｌａｒｋ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｍｅｄ．，６９：４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、及びＷＯ９８／０９６５７に開示されている方法を含む。

本開示の核酸及びウイルスベクターを含む組成物が提供される。本明細書に記載の送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）を含む組成物が提供される。かかる組成物は、薬学的に許容される担体も含む。本組成物は、希釈剤及びアジュバントなどの他の成分も含み得る。許容される担体、希釈剤、及びアジュバントは、レシピエントに対して非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量及び濃度で不活性であり、緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、若しくは他の有機酸）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、低分子量ポリペプチド、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、若しくはリジン）、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、糖アルコール（例えば、マンニトール若しくはソルビトール）、塩形成カウンターイオン（例えば、ナトリウム）、並びに／又は非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が含まれる。

本発明の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、及び標的化される細胞型に応じて異なり、当該技術分野における標準的な方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３、約１×１０^１４、約１×１０^１６、又はそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）［又はウイルスゲノム（ｖｇ）］の範囲であり得る。

インビボ又はインビトロで、標的細胞に送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）を形質導入する方法が企図される。インビボ方法は、有効用量又は有効な複数回用量の送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）を含む組成物を、それを必要とする対象（ヒト患者を含む）に投与するステップを含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。有効用量は、治療される障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除若しくは低減）する用量であり、障害／疾患状態への進行を遅延若しくは予防する用量であり、障害／疾患状態の進行を遅延若しくは予防する用量であり、疾患の程度を軽減する用量であり、疾患の寛解（部分若しくは完全）をもたらす用量であり、並びに／又は生存を延長する用量である。本発明の方法による予防又は治療が企図される疾患の例はＣＭＴ１Ａである。病理学的ＰＭＰ２２遺伝子重複又は変異を保有することが知られている家族において、本方法は、疾患の発症前に実行することができる。他の患者では、本方法は診断後に行われる。

分子的、生化学的、組織学的、及び機能的な転帰の尺度は、本方法の治療有効性を実証する。転帰の尺度は、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ３２，３５ａｎｄ４３ｏｆＤｙｃｋａｎｄＴｈｏｍａｓ，ＰｅｒｉｐｈｅｒａｌＮｅｕｒｏｐａｔｈｙ，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，４ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ１（２００５）及びＢｕｒｇｅｓｓｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６０２：３４７－３９３（２０１０）に記載されている。転帰の尺度としては、罹患した組織における変異型ＰＭＰ２２ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の減少又は除去、ＰＭＰ２２遺伝子のノックダウン、体重増加、及び筋力の改善のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。他には、神経組織学（軸索数、軸索サイズ、及びミエリン形成）、神経筋接合部の分析、並びに筋肉重量及び／又は筋肉組織学が含まれるが、これらに限定されない。他のものとしては、神経伝導速度ｎｃｖ、筋電図ｅｍｇ、及びシナプス生理学が挙げられるが、これらに限定されない。

本開示の方法では、対象におけるＰＭＰ２２の発現は、治療前の対象における発現と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％阻害される。

併用療法も本発明により企図される。本明細書で使用される組み合わせは、同時治療及び逐次治療の両方を含む。本明細書に記載の方法と標準的な医学的治療及び支持療法との組み合わせは特に企図される。

有効用量の本開示の核酸、ウイルスベクター、又は組成物の投与は、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、頬側、経鼻、経肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、眼内、経直腸、又は膣内が含まれるが、これらに限定されない。有効用量は、経路の組み合わせによって送達され得る。例えば、有効用量は、静脈内及び筋肉内、又は静脈内及び脳室内などで送達される。有効用量は、連続して又は逐次送達され得る。有効用量は、同時に送達され得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（具体的には、ＡＡＶＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、治療される感染症及び／又は疾患状態、並びにｍｉＲＮＡを発現させる標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合される。

特に、送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）の実際の投与は、送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）を対象の標的細胞に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。投与としては、筋肉への注射、血流への注入、及び／又は神経系若しくは肝臓への直接注射が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体又は他の成分に対する既知の制限はない（しかし、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いる通常の方法において避ける必要がある）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶがグリア細胞（例えば、シュワン細胞）などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾され得る。例えば、ＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい（その開示は、参照により本明細書に援用される）。薬学的組成物は、注射用製剤として、又は経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤がこれまで開発されてきており、本発明の実施において使用することができる。送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）は、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。

送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）の分散液はまた、グリセロール、ソルビトール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術によって容易に入手可能である。

注射用途に好適な薬学的形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な通針性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。製造及び保管の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、ソルビトールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散液の場合には、必要な粒径を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖類又は塩化ナトリウム）を含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を使用することによってもたらされ得る。

滅菌注射用溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて、上に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、滅菌した活性成分を、基本分散媒及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分に加えて予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。

本明細書に提供されるｒＡＡＶによるシュワン細胞などの細胞の形質導入は、ＰＭＰ２２ｍｉＲＮＡの持続発現をもたらす。したがって、本発明は、ＰＭＰ２２ｍｉＲＮＡを発現するｒＡＡＶを、対象（好ましくは、ヒト）に投与／送達する方法を提供する。これらの方法には、本明細書に記載の１つ以上のｒＡＡＶを細胞及び組織（シュワン細胞などのグリア細胞、末梢運動ニューロン、感覚運動ニューロン、筋肉などの組織、並びに肝臓及び脳などの臓器を含むが、これらに限定されない）に形質導入することが含まれる。形質導入は、細胞特異的制御エレメントを含む遺伝子カセットを用いて行うことができる。

「形質導入」という用語は、一例として、本明細書に記載の複製欠陥ｒＡＡＶを介したインビボ又はインビトロのいずれかでの標的細胞へのｍｉＰＭＰ２２の投与／送達を指すために使用され、標的細胞（例えば、シュワン細胞）によるｍｉＰＭＰ２２の発現をもたらす。

したがって、有効用量の本明細書に記載のｒＡＡＶ（又は本質的に同時に投与される用量若しくは一定間隔で与えられる用量）を、それを必要とする対象に投与する方法が提供される。
その他の用語
単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上特に明記されていない限り、複数形の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「抗体」への言及は、複数の抗体を含む。

本明細書で使用される場合、全ての数値又は数値範囲は、文脈上特に明記されていない限り、かかる範囲内の又はかかる範囲を包含する全ての整数、及び値又はその範囲内の又はその範囲を包含する整数の分数を含む。したがって、例えば、９０～１００％の範囲への言及には、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％など、並びに９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％など、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％などが含まれる。別の例では、１～５，０００倍の範囲への言及には、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍など、並びに１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、又は１．５倍など、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、又は２．５倍などが含まれる。

本明細書で使用される場合、「約」数値は、その数を含む範囲を指し、その数値より１０％低い値から、その数値より１０％高い値までの範囲を指す。「約」範囲とは、範囲の下限より１０％低い値から、範囲の上限より１０％高い値までの範囲を指す。

本明細書で使用される場合、「することができる」又は「であり得る」とは、提供される対象の一部として機能的かつ利用可能である、本発明者らによって企図されるものを示す。

本発明の態様及び例示的な実施形態は、以下の実施例によって示される。
実施例１
ＰＭＰ２２を標的化するｍｉＰＭＰ２２の設計とインビトロ試験
人工ｍｉＲＮＡは、天然のｍｉｒ－３０に基づいており、正常なｍｉＲＮＡの生合成に必要な重要な構造エレメント及び配列エレメントを維持しているが、成熟ｍｉｒ－３０配列が、ＰＭＰ２２遺伝子に相補的な２２ｎｔで置き換えられる。例示的な一般的なｍｉＲＮＡシャトル構造を示す図１を参照されたい。

ＰＭＰ２２人工ｍｉＲＮＡ（ｍｉＰＭＰ２２）は、マウスＰＭＰ２２遺伝子とヒトＰＭＰ２２遺伝子との間の保存領域を標的化するように設計された。ヒトの全長ＰＭＰ２２ｃＤＮＡ配列を図２に示し、翻訳を図３に示す。一方、マウスのＰＭＰ２２ｃＤＮＡを図４に示す。全てのｍｉＰＭＰ２２は、エキソン５の３’ＵＴＲの保存領域に結合する。図５は、ヒトＰＭＰ２２ｃＤＮＡ内の６つのｍｉＲＮＡの結合部位を示し、本明細書においてｍｉＰＭＰ２２－８６８、ｍｉＰＭＰ２２－８７１、ｍｉＰＭＰ２２－１７０６、ｍｉＰＭＰ２２－１７４０、ｍｉＰＭＰ２２－１７４１、及びｍｉＰＭＰ２２－１８３４と称される。

ｍｉＰＭＰ２２－８６８ＤＮＡ鋳型配列は、５’ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＴＧＧＧＧＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＴＴＧＡＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＣＣＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＡＣＴＡＧＴ３’（配列番号１）であり、これは、全長ＲＮＡ配列５’ＣＵＣＧＡＧＵＧＡＧＣＧＡＧＵＧＧＧＧＧＵＵＧＣＵＧＵＵＧＡＵＵＧＡＣＵＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧＧＧＵＣＡＡＵＣＡＡＣＡＧＣＡＡＵＣＣＣＣＡＣＣＵＧＣＣＵＡＣＵＡＧＵ３’（配列番号９）をコードする。図６は、Ｕｎａｆｏｌｄを使用して生成されたフォールディングした全長ＲＮＡ配列を示す。プロセシングされた成熟二本鎖ｍｉＰＭＰ２２－８６８は、以下のとおりである。

一方、プロセシングされたアンチセンスガイド鎖は、

である。
アンチセンスガイド鎖の１５番目のヌクレオチドを「Ｕ」に変えると、二重鎖のその位置での従来のワトソン－クリック塩基対（Ｃ：Ｇ）の代わりに、この塩基対は、２つの主な理由により、ゆらいだ（ｗｏｂｂｌｅ）Ｕ：Ｇ塩基対になる。図７を参照されたい。まず、マウス及びヒトのＰＭＰ２２遺伝子は、この結合部位に配列多型を有する。ヒトでは、ヌクレオチドはＧであるが、マウスではＡである。ＲＮＡ分子は、Ｇ：Ｕ塩基対（２つの水素結合）並びにＧ：Ｃ塩基対（３つの水素結合）を形成することができる。ＤＮＡと同様に、ＲＮＡはＧ：Ａ塩基対を形成することができない。したがって、ヌクレオチドをＵに変えると、この位置でのマウス及びヒトのＰＭＰ２２転写産物の両方と塩基対を形成することができる。第二に、この塩基を変えると、ｍｉＲＮＡ二重鎖のＧ：Ｃ含有量を、約５５％から５０％に減少させた。アンチセンス分子の３’末端に５つの連続したＧ：Ｃ塩基対の長いストレッチは、二重鎖の巻き戻しを阻害し、サイレンシングを低減する可能性がある。Ｇ：Ｕ塩基対は２つの水素結合しか有さないが、ＧＣ塩基対は３つの水素結合を有しているため、この位置にＵを挿入すると、依然として、ｍｉＲＮＡのアンチセンス及びセンス鎖の塩基対形成を可能にするが、相互作用はわずかに弱い。

ｍｉＰＭＰ２２－８７１ＤＮＡ鋳型配列は、５’ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＧＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＴＴＧＡＡＧＡＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＴＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＣＣＣＣＴＧＣＣＴＡＣＴＡＧＴ３’（配列番号２）であり、これは、全長ＲＮＡ配列
５’ＣＵＣＧＡＧＵＧＡＧＣＧＡＧＧＧＧＵＵＧＣＵＧＵＵＧＡＵＵＧＡＡＧＡＣＵＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧＧＧＵＣＵＵＣＡＡＵＣＡＡＣＡＧＣＡＡＵＣＣＣＣＵＧＣＣＵＡＣＵＡＧＵ３’（配列番号１０）をコードする。図８は、Ｕｎａｆｏｌｄを使用して生成されたフォールディングした全長ＲＮＡ配列を示す。プロセシングされた成熟二本鎖ｍｉＰＭＰ２２－８７１は、以下のとおりである。

一方、プロセシングされたアンチセンスガイド鎖は、

である。
ｍｉＰＭＰ２２－８６８と同様の様式で、ｍｉＰＭＰ２２－８７１アンチセンスガイド鎖の１８番目のヌクレオチドを「Ｕ」に変えた。図７を参照されたい。

ｍｉＰＭＰ２２－８６９ＤＮＡ鋳型配列は、
５’ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＴＴＧＡＡＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＴＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＣＣＣＣＡＣＴＧＣＣＴＡＣＴＡＧＴ３’（配列番号３）であり、これは、全長ＲＮＡ配列
５’ＣＵＣＧＡＧＵＧＡＧＣＧＡＵＧＧＧＧＧＵＵＧＣＵＧＵＵＧＡＵＵＧＡＡＣＵＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧＧＧＵＵＣＡＡＵＣＡＡＣＡＧＣＡＡＵＣＣＣＣＡＣＵＧＣＣＵＡＣＵＡＧＵ３’（配列番号１１）をコードする。図９は、Ｕｎａｆｏｌｄを使用して生成されたフォールディングした全長ＲＮＡ配列を示す。プロセシングされた成熟二本鎖ｍｉＰＭＰ２２－８６９は、以下のとおりである。

一方、プロセシングされたアンチセンスガイド鎖は、

である。ｍｉＰＭＰ２２－８６８と同様の様式で、ｍｉＰＭＰ２２－８６９アンチセンスガイド鎖の１６番目のヌクレオチドを「Ｕ」に変えた。
ｍｉＰＭＰ２２－８７２ＤＮＡ鋳型配列は５’ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＴＣＴＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＡＣＴＡＧＴ３’（配列番号４）であり、これは全長ＲＮＡ配列
５’ＣＵＣＧＡＧＵＧＡＧＣＧＡＧＧＧＵＵＧＣＵＧＵＵＧＡＵＵＧＡＡＧＡＵＣＵＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧＧＧＡＵＣＵＵＣＡＡＵＣＡＡＣＡＧＣＡＡＵＣＣＣＵＧＣＣＵＡＣＵＡＧＵ３’（配列番号１２）をコードする。図１０は、Ｕｎａｆｏｌｄを使用して生成されたフォールディングした全長ＲＮＡ配列を示す。プロセシングされた成熟二本鎖ｍｉＰＭＰ２２－８７２は、以下のとおりである。

一方、プロセシングされたアンチセンスガイド鎖は、

である。ｍｉＰＭＰ２２－８６８と同様の様式で、ｍｉＰＭＰ２２－８６９アンチセンスガイド鎖の１９番目のヌクレオチドを「Ｕ」に変えた。
ｍｉＰＭＰ２２－１７０６ＤＮＡ鋳型配列は、５’ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＴＣＴＧＧＣＡＡＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＴＴＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＴＡＣＴＡＧＴ３’（配列番号５）であり、これは、全長ＲＮＡ配列
５’ＣＵＣＧＡＧＵＧＡＧＣＧＡＣＵＣＣＡＡＧＧＡＣＵＧＵＣＵＧＧＣＡＡＵＣＵＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧＧＧＡＵＵＧＣＣＡＧＡＣＡＧＵＣＣＵＵＧＧＡＧＧＵＧＣＣＵＡＣＵＡＧＵ３’（配列番号１３）をコードする。図１１は、Ｕｎａｆｏｌｄを使用して生成されたフォールディングした全長ＲＮＡ配列を示す。プロセシングされた成熟二本鎖ｍｉＰＭＰ２２－１７０６は、以下のとおりである。

一方、プロセシングされたアンチセンスガイド鎖は、５’ＡＵＵＧＣＣＡＧＡＣＡＧＵＣＣＵＵＧＧＡＧＧ３’（配列番号２１）である。ｍｉＰＭＰ２２－１７０６のマウスＰＭＰ２２への結合は、以下に示されるように、Ｇ：Ｕ塩基対（２つの水素結合を有する）を含む。

ｍｉＰＭＰ２２－１７４０ＤＮＡ鋳型配列は、５’ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＴＡＴＡＴＡＣＡＴＣＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＡＣＴＡＧＴ３’（配列番号６）であり、これは、全長ＲＮＡ配列
５’ＣＵＣＧＡＧＵＧＡＧＣＧＡＣＡＣＣＡＡＣＵＧＵＡＧＡＵＧＵＡＵＡＵＡＣＵＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧＧＧＵＡＵＡＵＡＣＡＵＣＵＡＣＡＧＵＵＧＧＵＧＧＵＧＣＣＵＡＣＵＡＧＵ３’（配列番号１４）をコードする。図１２は、Ｕｎａｆｏｌｄを使用して生成されたフォールディングした全長ＲＮＡ配列を示す。プロセシングされた成熟二本鎖ｍｉＰＭＰ２２－１７４０は、以下のとおりである。

一方、プロセシングされたアンチセンスガイド鎖は、５’ＵＡＵＡＵＡＣＡＵＣＵＡＣＡＧＵＵＧＧＵＧＧ３’（配列番号２２）である。ヒト及びマウスのＰＭＰ２２へのｍｉＰＭＰ２２－１７４０の結合を、以下に示す。

ｍｉＰＭＰ２２－１７４１ＤＮＡ鋳型配列は、５’ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＣＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＡＣＴＡＧＴ３’（配列番号７）であり、これは、全長ＲＮＡ配列
５’ＣＵＣＧＡＧＵＧＡＧＣＧＡＡＣＣＡＡＣＵＧＵＡＧＡＵＧＵＡＵＡＵＡＵＣＵＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧＧＧＡＵＡＵＡＵＡＣＡＵＣＵＡＣＡＧＵＵＧＧＵＧＵＧＣＣＵＡＣＵＡＧＵ３’（配列番号１５）をコードする。図１３は、Ｕｎａｆｏｌｄを使用して生成されたフォールディングした全長ＲＮＡ配列を示す。プロセシングされた成熟二本鎖ｍｉＰＭＰ２２－１７４１は、以下のとおりである。

一方、プロセシングされたアンチセンスガイド鎖は５’ＡＵＡＵＡＵＡＣＡＵＣＵＡＣＡＧＵＵＧＧＵＧ３’（配列番号２３）である。ヒト及びマウスのＰＭＰ２２へのｍｉＰＭＰ２２－１７４１の結合を、以下に示す。

ｍｉＰＭＰ２２－１８３４ＤＮＡ鋳型配列は、５’ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＣＧＡＴＧＧＡＣＴＡＡＧＡＴＧＣＡＴＴＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＣＡＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＣＴＧＣＣＴＡＣＴＡＧＴ３’（配列番号８）であり、これは、全長ＲＮＡ配列
５’ＣＵＣＧＡＧＵＧＡＧＣＧＡＵＧＧＡＣＵＡＡＧＡＵＧＣＡＵＵＡＡＡＡＵＣＵＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧＧＧＡＵＵＵＵＧＡＵＧＣＡＵＣＵＵＡＧＵＣＣＡＣＵＧＣＣＵＡＣＵＡＧＵ３’（配列番号１６）をコードする。図１４は、Ｕｎａｆｏｌｄを使用して生成されたフォールディングした全長ＲＮＡ配列を示す。プロセシングされた成熟二本鎖ｍｉＰＭＰ２２－１８３４は、以下のとおりである。

一方、プロセシングされたアンチセンスガイド鎖は、５’ＡＵＵＵＵＧＡＵＧＣＡＵＣＵＵＡＧＵＣＣＡＣ３’（配列番号２４）である。ヒト及びマウスのＰＭＰ２２へのｍｉＰＭＰ２２－１８３４の結合を、以下に示す。

それ以外の場合、ｍｉＰＭＰ２２配列は、概して、Ｂｏｕｄｒｅａｕｅｔａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ２ｏｆＨａｒｐｅｒ（Ｅｄ．），ＲＮＡＩｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｎｅｕｒｏｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．５８，ＳｐｒｉｎｇｅｒＳｃｉｅｎｃｅ＋ＢｕｓｉｎｅｓｓＭｅｄｉａ，ＬＬＣ（２０１１）に従って設計された。

この設計戦略には、以下の２つの大きな利点がある：（１）非アレル特異的ＰＭＰ２２遺伝子サイレンシング、及び（２）ヒトにおいて直接翻訳可能なマウスにおける有効性の試験。

実施例２
ｍｉＰＭＰ２２のインビトロ試験
ｍｉＰＭＰ２２鋳型配列を、Ｕ６Ｔ６発現ベクター［Ｂｏｕｄｒｅａｕｅｔａｌ．，ｐａｇｅｓ１９－３７ｉｎＲＮＡＩｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＭｅｔｈｏｄｓ，Ｈａｒｐｅｒ（Ｅｄ．），ＨｕｍａｎａＳｐｒｉｎｇｅｒＰｒｅｓｓ（２０１１）］にクローニングした。ｍｉＲＮＡ発現カセットのサイズは、約５００ｂｐである。次いで、ｍｉＰＭＰ２２を、４：１のｍｉＲ：標的モル比を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のヒトＰＭＰ２２（ｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターにおいてＧｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成された）と共発現させた。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用してトランスフェクトし、２４時間インキュベートした。全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して回収し、ランダムプライミングされたｃＤＮＡを合成し（高容量ｃＤＮＡＲＴキット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ヒト及びマウスのＰＭＰ２２に対するＴａｑｍａｎプローブを使用してｑＲＴ－ＰＣＲによってＰＭＰ２２のノックダウンを評価した（Ｈｓ００１６５５５６＿ｍ１、Ｍｍ０１３３３３９３＿ｍ１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。

ｑＲＴ－ＰＣＲによるノックダウン試験では、ｍｉＰＭＰ２２－８６８、ｍｉＭＰＭ２２－８７１、及びｍｉＰＭＰ２２－８７２の３つのリード候補が同定された。これらの３つのｍｉＰＭＰ２２は、未処理の（「ｍｉＲなし」）状態と比較して、ヒトＰＭＰ２２転写産物のレベルを有意に低下させることができた（図１５）。結果は、３つの独立した実験の平均値である。

２つの最強のｍｉＰＭＰ２２（８６８及び８７１）をコードする鋳型配列を、以下に記載するように、インビボ送達のためにｓｃＡＡＶ９にクローニングした。
実施例３
ｍｉＰＭＰ２２をコードするｓｃＡＡＶ９の産生
ｍｉＰＭＰ２２－８６８及びｍｉＰＭＰ２２－８７１鋳型配列を、インビボ送達のために、ｓｃＡＡＶ９構築物（一般的に「ｓｃＡＡＶ－ＮＰ．Ｕ６．ｍｉＰＭＰ２２．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ」と名付けられた）にクローニングした。ｓｃＡＡＶ９はまた、ＣＭＶプロモーター駆動型ｅＧＦＰレポーター遺伝子も含んだ。ｓｃＡＡＶ９は、自己相補型ＡＡＶゲノムのパッケージングを可能にする変異型ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）及び野生型ＡＡＶ２ＩＴＲを含む。得られたｓｃＡＡＶ９は、「ＡＡＶ９－ｍｉＲ８６８」（ｓｃＡＡＶ９構築物ｓｃＡＡＶ－ＮＰ．Ｕ６．ｍｉＰＭＰ２２－８６８．ＣＭＶ．ｅＧＦＰの）及び「ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１」（ｓｃＡＡＶ９構築物ｓｃＡＡＶ－ＮＰ．Ｕ６．ｍｉＰＭＰ２２－８７１．ＣＭＶ．ｅＧＦＰの略）と称される。非標的化ｓｃＡＡＶは、「ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ」（ｓｃＡＡＶ構築物ｓｃＡＡＶ－ＮＰ．Ｕ６．ｍｉＲｌａｃＺ．ＣＭＶ．ｅＧＦＰの略）と称される。

ｓｃＡＡＶ９は、以前に記載されているように［Ｇａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）］、アデノウイルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）とともに、Ｒｅｐ２Ｃａｐ９配列をコードするプラスミドを有する二本鎖ＡＡＶ２－ＩＴＲベースのベクターを使用して、一過性トランスフェクション手順によって、２９３細胞において産生された。実験のためにｓｃＡＡＶ９を３つの別々のバッチで産生し、２つの塩化セシウム密度勾配精製ステップによって精製し、ＰＢＳに対して透析し、ウイルス凝集を防止するために０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ－Ｆ６８を用いて製剤化し、４℃で保存した。全てのベクター調製物を、Ｔａｑ－Ｍａｎ技術を使用して、定量的ＰＣＲによって滴定した。ベクターの純度を、４～１２％のドデシル硫酸ナトリウム－アクリルアミドゲル電気泳動及び銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって評価した。ｓｃＡＡＶ９ウイルスを生成し、滴定した（ＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒＣｏｒｅａｔＴｈｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅａｔＮａｔｉｏｎｗｉｄｅＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ）。

実施例４
動物モデル
Ｃ６１－Ｈｅｔマウスのコロニーを、Ｒ．Ｍａｒｔｉｎｉ教授（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＷｕｒｚｂｕｒｇ）によって寄贈された２つの繁殖ペアから始めて確立した。このモデルは、内因性野生型マウスＰＭＰ２２と比較した場合、ヒトＰＭＰ２２導入遺伝子の２倍の過剰発現をもたらす内因性マウス遺伝子に加えて、ヒトＰＭＰ２２遺伝子の４つのコピーを発現することが知られている［Ｈｕｘｌｅｙｅｔａｌ．，（１９９６）上記、Ｈｕｘｌｅｙｅｔａｌ．，（１９９８）上記、及びＳｅｒｅｄａｅｔａｌ．，ＮｅｕｒｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄ．，８（１－２）：２０５－２１６（２００６）］。全ての実験手順は、ＥＵガイドライン（ＥＣＤｉｒｅｃｔｉｖｅ８６／６０９／ＥＥＣ）と調和した国内法に従って、キプロス政府の獣医主任によって承認されたアニマルケアプロトコル（プロジェクトライセンスＣＹ／ＥＸＰ／ＰＲ．Ｌ２／２０１２）に従って実施した。

実施例５
髄腔内ベクター送達
ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１ウイルス（標的化）、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８６８ウイルス（標的化）、及びＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺウイルス（非標的化対照）を、ヒト／マウスＰＭＰ２２及び他のミエリン関連タンパク質に対するそれらの効果を調べるために、２ヶ月又は２ヶ月齢のＣ６１Ｈｅｔマウスに髄腔内注射した。髄腔内送達の場合、２６ゲージの針に接続された５０μＬハミルトンシリンジを使用して、推定量のＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：１．６６×１０^１３ＤＲＰ／ｍｌ、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：３．０×１０^１３ＤＲＰ／ｍｌ、又はＡＡＶ９－ｍｉＲ８６８：２．７×１０^１３ＤＲＰ／ｍｌのベクターを含む２０μｌのＡＡＶ９ストックを、麻酔したマウスのＬ５～Ｌ６髄腔内空間に、５μｌ／分の遅い速度で注射した。以前に記載されているように、尾のフリック（ｆｌｉｃｋ）によって、正しい注射を検証した［Ｋａｇｉａｖａｅｔａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，１１３（１７）：Ｅ２４２１－Ｅ２４２９（２０１６）、Ｋａｇｉａｖａｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２７（８）：１４６０－１４７３（２０１８）、Ｋａｇｉａｖａｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１７９１：２７７－２８５（２０１８）、及びＳｃｈｉｚａｅｔａｌ．，Ｂｒａｉｎ，１４２（５）：１２２７－１２４１（２０１９）］。

実施例６
生体内分布及び発現
ＡＡＶ９ｍｉＲ８７１（標的化）及びｍｉＲＬａｃＺウイルス（非標的化対照）を、上記のように、２ヶ月齢のＣ６１Ｈｅｔマウスに髄腔内に注射して、ヒト／マウスＰＭＰ２２及び他のミエリン関連タンパク質に対するそれらの効果を調べた。注射の４週間及び８週間後、マウスを、ｅＧＦＰレポーター遺伝子の発現について免疫染色で分析した。並びに、注射の６週間後、ＰＭＰ２２発現のリアルタイムＰＣＲ又は免疫ブロットによって分析した。ＰＮＳ組織におけるＡＡＶ９ベクターの生体内分布も、ベクターゲノムコピー数（ＶＧＣＮ）分析によって評価した。

免疫組織化学の場合、マウスを麻酔し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、続いて、新鮮な４％パラホルムアルデヒドを経心灌流した。脊髄神経根を含む腰髄、並びに坐骨神経及び大腿神経を切開し、凍結切片用に凍結させた。坐骨神経及び大腿神経の一部は、立体鏡下で線維にときほぐした。切片及び線維を、冷たいアセトン中で透過させ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含有する５％ＢＳＡのブロッキング溶液で、室温で１時間インキュベートした。スライドを、ブロッキング溶液に希釈されたｅＧＦＰ（１：２，０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対するウサギ抗血清である一次抗体と、４℃で一晩インキュベートした。次いで、スライドを、ＰＢＳ中で洗浄し、ウサギの交差親和性精製二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：５００希釈）と、室温で１時間インキュベートした。細胞核をＤＡＰＩで視覚化した。スライドを、蛍光封入剤で封入し、蛍光顕微鏡下でＮＩＳ－ｅｌｅｍｅｎｔｓｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｉｋｏｎ）を使用して、デジタルカメラで撮影した。ｅＧＦＰはまた、抗ｅＧＦＰ抗体を用いずに、自家蛍光シグナルとして可視化した。腰髄神経根、坐骨神経、及び大腿神経のｅＧＦＰ＋ＳＣの割合（％）は、最近記載されているようにカウントした［Ｋａｇｉａｖａｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２８（２１）：３５２８－３６１６（２０１９）］。

免疫ブロット分析の場合、新鮮な腰髄神経根、坐骨神経、及び大腿神経を、２ヶ月齢でＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１又はＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺベクターを髄腔内注射し、注射後４週間及び８週間（生体内分布実験）又は注射後６週目（サイレンシング実験）のいずれかで犠牲にしたＣ６１Ｈｅｔマウスの群から採取し、プロテアーゼ阻害剤の混合物（Ｒｏｃｈｅ）を含む氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭフッ化ナトリウム、１％ノニデット（登録商標）Ｐ－４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ）中で溶解した。溶解物からのタンパク質（１５０μｇ）を、１２％ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分画し、次いで、セミドライ転写ユニットを使用して、ＰＶＤＦ膜（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）に転写した。膜上の非特異的部位を、室温でＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中の５％脱脂乳で１時間ブロッキングした。免疫ブロットを、抗ｈｕＰＭＰ２２抗体（１：５００Ａｂｃａｍ）、抗ｅＧＦＰ抗体（１：１０００Ａｂｃｏｍ）、及び抗ｍｓＴｕｂｕｌｉｎ抗体（１：３０００；ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｉｅｓＨｙｂｒｉｄｏｍａＢａｎｋ，負荷対照用）と、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、５％ミルクＰＢＳＴ中のＨＲＰコンジュゲート二次抗血清（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：３０００希釈）で１時間、免疫ブロットをインキュベートした。ブロットを、ＰＢＳＴで再び洗浄し、結合した抗体を強化型化学発光システム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）によって可視化した。

リアルタイムＰＣＲ分析の場合、ＲＮＡを、２ヶ月齢でＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８６８又はＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺベクターを髄腔内注射し、注射後６週目で犠牲にしたＣ６１Ｈｅｔマウスの群からのスナップ凍結された腰髄神経根、坐骨神経、及び大腿神経から、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙ（登録商標）脂質組織ミニキットを使用して単離した。ＤＮａｓｅ処理後、ＲＮＡを分光光度測定によって定量化し、０．３μｇのＲＮＡを使用して、ＴａｑＭａｎ（商標）逆転写試薬を用いてｃＤＮＡを合成した。次いで、Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び内因性対照としてｍｕＧＡＰＤＨアッセイを使用して、ｈｕＰＭＰ２２、ｍｕＰＭＰ２２、ｍｕＭＰＺ、ｍｕＣＮＰ、ｍｕＧｌｄｎ、及びｍｕＧＪＢ１のｍＲＮＡのレベルを定量化した。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１及びＡＡＶ９－ｍｉＲ８６８処置マウスにおけるｈｕＰＭＰ２２、ｍｕＰＭＰ２２、ｍｕＭＰＺ、ｍｕＣＮＰ、ｍｕＧｌｄｎ、及びｍｕＧＪＢ１の発現レベルを、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置同腹仔の類似の発現レベルと比較した。

ベクターゲノムコピー数（ＶＧＣＮ）分析の場合、製造業者の説明書に従ってＭｅｓｌｏＭａｇＰｕｒｉｘ組織ＤＮＡ抽出キットを使用して、腰髄神経根及び坐骨神経からＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡにおけるベクターゲノムの検出及び定量化の場合、ｅＧＦＰ（レポーター遺伝子）及びＴＲＦＣ（負荷対照）に対するプローブを使用して、ドロップレットデジタルＰＣＲ分析を実施した。１細胞あたりの平均ＶＧＣＮを、総ＶＧＣＮを総細胞数で割って計算した。

免疫染色（ｅＧＦＰ発現細胞の割合）及び免疫ブロット（正規化した光学密度の比）データを、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアの対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して比較した。全ての比較における有意水準、Ｐ＜０．０５。各統計解析の更なる詳細が、各結果とともに示される。

成体マウスの腰髄神経根では、発現率分析により、総ＰＮＳ細胞の４５．９６％及び５６．８２％が、それぞれ注射後４週間及び８週間でｅＧＦＰ陽性であったことが示された（図１６）。坐骨神経では、発現率分析により、総細胞の４２．０６％及び４５．７４％が、それぞれ注射後４週間及び８週間でｅＧＦＰ陽性であったことが示された（図１７）。大腿神経では、発現率分析により、細胞の３１．０６％及び４１．０９％が、それぞれ注射後４週間及び８週間でｅＧＦＰ陽性であったことが示された（図１８）。ユビキタスプロモーターによって発現が駆動されたという事実から予想されるように、脊髄、並びに腰髄神経根、坐骨神経、及び大腿神経の両方で、軸索に沿ったｅＧＦＰシグナルが検出された。

成体マウスにおけるｅＧＦＰの発現は、ＡＡＶ９－Ｕ６－ｍｉＲＬａｃＺ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰを髄腔内注射した２ヶ月齢マウス群から得られた腰髄神経根及び坐骨神経溶解物における抗ｅＧＦＰ抗体を使用した免疫ブロット分析によっても実証された。この目的のために、新鮮な腰髄神経根及び坐骨神経を、注射後４週間及び８週間で採取し、氷冷ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。予測された３０ｋＤａのｅＧＦＰタンパク質バンドは、陰性対照と比較して、調べたＡＡＶ９－ｍｉＬａｃＺ処置マウスの腰髄神経根（神経根ｅＧＦＰ／チューブリン比の平均：４週間：０．９６、８週間：１．０１）並びに坐骨神経（坐骨神経ｅＧＦＰ／チューブリン比の平均：４週間：０．４６、８週間：１．０３）で検出可能であったが、同じレベルではなかった、（図１９Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）。

更に、注射後４週間及び８週間のマウスの腰髄神経根（平均神経根ＶＧＣＮ：４週間：３．２５、８週間：１．９）及び坐骨神経（平均坐骨神経ＶＧＣＮ：４週間：０．４１、８週間：０．３８）から抽出されたゲノムＤＮＡに対して行ったＶＧＣＮ分析により、動物間に変動があるものの、全体的に十分かつ安定した経時的な生体内分布が示された（図１９Ｃ、Ｆ）。

実施例７
ＰＭＰ２２のインビボＡＡＶ媒介性遺伝子サイレンシング
ＰＮＳ組織における対照ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺベクターの適切な生体内分布及び発現を確認した後、Ｃ６１－Ｈｅｔマウスの選択された転写産物におけるＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１及びＡＡＶ９－ｍｉＲ８６８の効果を評価した。

ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１で処置されたＣ６１－Ｈｅｔマウスの腰髄神経根は、ヒト及びマウスのＰＭＰ２２ｍＲＮＡレベルが、それぞれ０．２９倍及び０．２５倍低下し、一方、ＧＪＢ１、ＭＰＺ、ＣＮＰ、及びＧｌｄｎを含む他のミエリン関連タンパク質のｍＲＮＡレベルが、それぞれ０．７２倍、０．５４倍、０．３６倍、及び０．６１倍増加したことを示した（図２０）。それと一致して、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１で処置されたマウスの坐骨神経は、ヒト及びマウスのＰＭＰ２２ｍＲＮＡレベルが、それぞれ０．４６及び０．４９倍低下し、一方、ＧＪＢ１、ＭＰＺ、ＣＮＰ、及びＧｌｄｎを含む他のミエリン関連タンパク質のｍＲＮＡレベルが、それぞれ０．３２、０．１６、９．１６及び５．０６倍増加したことを示した（図２１）。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスの大腿神経は、ヒト及びマウスのＰＭＰ２２ｍＲＮＡレベルが、それぞれ０．５４及び０．５３倍低下し、一方、ＧＪＢ１、ＭＰＺ、ＣＮＰ、及びＧｌｄｎを含む他のミエリン関連タンパク質のｍＲＮＡレベルが、それぞれ２．４９、２．３、２．１２及び１．９６倍増加したことを示した（図２２）。

ＡＡＶ９－ｍｉＲ８６８で処置されたＣ６１－Ｈｅｔマウスの腰髄神経根は、ヒト及びマウスのＰＭＰ２２ｍＲＮＡレベルが、それぞれ０．２７倍及び０．０１倍低下し、一方、ＧＪＢ１、ＭＰＺ、ＣＮＰ、及びＧｌｄｎを含む他のミエリン関連タンパク質のｍＲＮＡレベルが、それぞれ－０．６倍、０．２１倍、－０．２４倍、及び０．７８倍変化したことを示した（図２３）。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８６８で処置されたマウスの坐骨神経は、ヒト及びマウスのＰＭＰ２２ｍＲＮＡレベルが、それぞれ０．４９及び０．３８倍低下し、一方、ＧＪＢ１、ＭＰＺ、ＣＮＰ、及びＧｌｄｎを含む他のミエリン関連タンパク質のｍＲＮＡレベルが、それぞれ０．５６、０．５５、０．５０及び０．４９倍増加したことを示した（図２４）。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８６８処置マウスの大腿神経は、ヒト及びマウスのＰＭＰ２２ｍＲＮＡレベルが、それぞれ０．３９及び０．４０倍低下し、一方、ＧＪＢ１、ＭＰＺ、ＣＮＰ、及びＧｌｄｎを含む他のミエリン関連タンパク質のｍＲＮＡレベルが、それぞれ１．４４、１．５４、２．２８及び２．３０倍増加したことを示した（図２５）。

ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１で処置されたＷＴマウスの腰髄神経根は、マウスＰＭＰ２２ｍＲＮＡレベルが、０．３６倍低下し、一方、ＧＪＢ１、ＭＰＺ、ＣＮＰ、及びＧｌｄｎを含む他のミエリン関連タンパク質のｍＲＮＡレベルが、それぞれ１．０２、１．３１、０．８５、及び１．３１倍増加したことを示した（図５１及び５２）。それと一致して、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１で処置されたＷＴマウスの坐骨神経は、マウスＰＭＰ２２ｍＲＮＡレベルが、０．５２倍低下し、一方、ＧＪＢ１、ＭＰＺ、ＣＮＰ、及びＧｌｄｎを含む他のミエリン関連タンパク質のｍＲＮＡレベルが、それぞれ２．０９、１．４７、０．７９、及び１．０１倍増加したことを示した（図５１及び５２）。ＷＴＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスの大腿神経は、マウスＰＭＰ２２ｍＲＮＡレベルが、０．８７低下し、一方、ＧＪＢ１、ＭＰＺ、ＣＮＰ、及びＧｌｄｎを含む他のミエリン関連タンパク質のｍＲＮＡレベルが、それぞれ４．０６、２．２９、５．０３、及び２．８６倍増加したことを示した（図５１及び５２）。

これらの結果に基づいて、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１は、他のミエリンタンパク質の増強された転写をもたらしながら、ｈｕ／ｍｓのＰＭＰ２２ｍＲＮＡをサイレンシングするのに最も有望なものとして選択された。したがって、腰髄神経根、坐骨神経、及び大腿神経のヒトＰＭＰ２２タンパク質レベルに対するその効果を、免疫ブロット分析を使用して評価した。

ＰＭＰ２２タンパク質バンドは、チューブリン免疫ブロットのバンド又はミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）ＳＤＳゲルのバンドのいずれかを使用して正規化し（図２６）、両方のシナリオにおいて、ＨｕＰＭＰ２２タンパク質レベルは、ｍｉＲＬａｃＺ処置マウスと比較した場合、ｍｉＲ８７１処理後に６０％超有意に低下することが示された（ＨｕＰＭＰ２２／Ｔｕｂ：６７％サイレンシング、ＨｕＰＭＰ２２／ＭＰＺ：６４％サイレンシング）。チューブリンに対して正規化した場合、ＭＰＺタンパク質の発現は、ｍｉＲＬａｃＺ処置マウスと比較した場合、２４％増加することが示された。同様に、坐骨神経のＨｕＰＭＰ２２タンパク質は、ｍｉＲＬａｃＺ処置マウスと比較した場合、８５％超有意に減少し（ＨｕＰＭＰ２２／Ｔｕｂ：８７％サイレンシング、ＨｕＰＭＰ２２／ＭＰＺ：８５％サイレンシング）、一方、ＭＰＺタンパク質の発現は、不変のままであった（ＭＰＺ／Ｔｕｂ：０．００８％サイレンシング）（図２７）。大腿神経では、ＨｕＰＭＰ２２タンパク質レベルは、ｍｉＲＬａｃＺ処置マウスと比較した場合、６０％超有意に減少し（ＨｕＰＭＰ２２／Ｔｕｂ：６４％サイレンシング、ＨｕＰＭＰ２２／ＭＰＺ：７２％サイレンシング）、一方、ＭＰＺタンパク質の発現は、３４％有意に増加した（図２８）。

同様に、ＷＴマウスにおけるＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１の注射は、ＭＰＺレベルを変化させずに、腰髄神経根におけるマウスＰＭＰ２２のレベルを６６％低下させた（図５３）。ＷＴ坐骨神経では、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１の注射は、マウスＰＭＰ２２を６９％減少させ、ＭＰＺタンパク質レベルを５４％増加させた（図５４）。ＷＴの大腿神経は、ＷＴの腰髄神経根と同様に応答し、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１の注射は、ＭＰＺタンパク質レベルを変化させずに、マウスＰＭＰ２２タンパク質レベルを９９％低下させた（図５５）。統計：ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアのＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、免疫ブロット（光学密度の比）データを比較した。全ての比較における有意水準、Ｐ＜０．０５。

実施例８
ＣＭＴ１Ａのマウスモデルを回復させるためのＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１ベクターを用いた治療試験
既に進行した末梢神経病理を有する成体Ｃ６１ＨｅｔマウスにおいてＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１ベクターの十分なサイレンシング効果を確認した後、図２９に示される試験設計に従って、早期及び後期治療試験を実施した。無作為化非標的化ベクター対照治療試験を、ＣＭＴ１ＡのＣ６１Ｈｅｔマウスモデルにおいて、２ヶ月齢（早期処置）又は６ヶ月齢（後期処置）でＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１又はＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺのいずれかを注射した群を使用して実施した。

Ｃ６１－Ｈｅｔマウスを、それらの年齢及び受けた処置、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１又はＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺに従って、４つの群に無作為化した。転帰分析は、両方の処置時点について、注射の４ヶ月後に実施され、運動行動能力、運動神経伝導試験、並びに形態計測分析を含み、オニオンバルブ形成の総数とともに、薄くミエリン化した軸索及び脱ミエリン化した軸索の割合を測定することによって脱ミエリン化の程度を決定した。転帰分析には、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１初期及び後期処置マウス群のＮｆｌレベルの血漿定量、並びにＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ３、及びＣＤ６８マーカーの免疫応答も含まれた。

各年齢群の同腹仔マウスを、標的化ベクター（ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１；処置群）又は非標的化ベクター（ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ；対照群）のいずれかに無作為化した。無作為化は、テーリング後の動物の付番に基づいた（奇数のマウスが処置に、偶数のマウスが対照処置に無作為化される）。マウスを、早期処置の場合は６ヶ月齢で、及び後期処置の場合は１０ヶ月齢で、臨床試験、続いて、電気生理学的試験、Ｎｆｌ分析のための血漿採取、並びに灌流及び定量的形態計測及び免疫応答分析によって評価した。一次評価項目は、腰髄神経根及び大腿運動神経の病理学的変化の回復（ｒｅｓｃｕｅ）とみなした。二次評価項目は、坐骨神経運動伝導速度の有意な改善、臨床運動行動能力の改善、腰髄神経根、大腿運動神経、及び肝臓、並びに血漿Ｎｆｌレベルにおける免疫反応の改善であった。

統計：ｍｉＲＬａｃＺ早期又は後期処置マウス、ｍｉＲ８７１早期又は後期処置マウスの行動分析、電気生理学的分析、及び形態学的分析のデータを、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアのＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して比較した。全ての比較における有意水準、Ｐ＜０．０５。各統計解析の更なる詳細は、各結果に示されている。

実施例９
行動試験
［Ｋａｇｉａｖａ（２０１６），上記、Ｓｃｈｉｚａ，上記］に記載されているように、処置動物及び対照処置動物における強度及び協調性を比較した。試験官は、動物の処置状況（処置又は対照ベクター処置）に対して盲検化された。運動能力（ｍｏｔｏｒｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）は、２ヶ月齢（早期処置）又は６ヶ月齢（後期処置）での注射前、及び再度、注射の２ヶ月後及び４ヶ月後にロータロッド（５ｒｐｍ及び１７．５ｒｐｍ）、フットグリップ、及びハング試験で評価した。

ロータロッド試験：運動のバランス及び協調は、加速ロータロッド装置（ＵｇｏＢａｓｉｌｅ，Ｉｔａｌｙ）を使用して、記載されたプロトコル［Ｋａｇｉａｖａ，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（２０１８），上記、Ｓａｖｖａｋｉ，上記］に従って決定した。動物の訓練は、連続３日間の１日当たり３回の試験で構成され、試験の間に１５分間の休息を含んだ。マウスをロッド上に配置し、速度を２．５ｒｐｍから２５ｒｐｍに徐々に増加させた。トライアルは、マウスがロッドから落ちた場合、ミスステップした場合、又は６００秒間ロッド上に滞在し場合に終了する。試験は、４日目に、５ｒｐｍ及び１７．５ｒｐｍの２つの異なる速度を使用して実施した。落下するまでの時間が、速度ごとに計算される。

グリップ強度試験：グリップ強度を測定するために、マウスを尾部で保持し、後肢でグリッドをつかむまで装置（ＵｇｏＢａｓｉｌｅ）に向かって下げ、次いで、グリッドを離すまで穏やかに引き戻した。各セッションは、６回の連続した試験からなる。ｇ単位での力の測定値は、装置に示されていた。

ワイヤーハング試験：ワイヤーハング試験は、運動機能及びグリップ強度を評価することを目的としている。試験は、動物を高架のワイヤーに吊るすことで開始する。動物をワイヤーの上に置き、次いで、それを反転させ、動物が落下するまでの時間を記録した。この試験は、連続３日間、１日１回実施し、次いで、平均的な能力を計算した。

早期処置群について、ロータロッド、フットグリップ、ハング試験により、２ヶ月齢での注射前、及び再度、注射後２ヶ月、注射後４ヶ月での運動能力を評価した（図３０～３３）。２ヶ月齢のＷＴマウス及び非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスを上記の試験と比較すると、ＣＭＴ１Ａモデルの運動能力が著しく障害されることが証明される。これら２群間で有意差を示さなかった唯一の試験は、ＣＭＴ１Ａモデルにおける２ヶ月齢時の５ｒｐｍでのロータロッドであったが、時間の経過とともに進行性の悪化を示し、これは、処置によって回復した（図３０）。運動能力を評価するために用いた他の全ての試験は、４ヶ月齢及び６ヶ月齢のＷＴマウスが、それらの年齢適合ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウスと著しく異なることを示した（図３０～３３）。

早期処置試験群について、２ヶ月齢のＣ６１Ｈｅｔマウスを、各処置（ｍｉＲ８７１又はｍｉＲＬａｃＺ）に無作為に割り当てた。予想どおり、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１又はＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺのいずれかで処置された２ヶ月齢のＣ６１Ｈｅｔマウスは、処置を開始する前のベースラインで有意差を示さなかった。重要なことに、４ヶ月齢及び６ヶ月齢、処置後２ヶ月及び４ヶ月での全ての運動能力試験（５ｒｐｍ及び１７．５ｒｐｍのロータロッド、グリップ強度、ワイヤーハング試験）は、ＡＡＶ９－ｍｉＬａｃＺ処置対照同腹仔と比較した場合、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスの有意な改善を示した（図３０～３３）。

後期処置群について、ロータロッド、フットグリップ、ハング試験により、６ヶ月齢での注射前、及び再度、注射後２ヶ月、注射後４ヶ月での運動能力を評価した（図３４～３７）。６ヶ月齢のＷＴマウス及び非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスを上記の試験と比較すると、モデルの運動能力が著しく障害されることが証明される。運動能力を評価するために用いた他の全ての試験は、６ヶ月齢及び８ヶ月齢のＷＴマウスが、それらの年齢適合ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウスと著しく異なることを示した（図３４～３７）。

後期処置試験群について、６ヶ月齢のＣ６１Ｈｅｔマウスを、各処置（ｍｉＲ８７１又はｍｉＲＬａｃＺ）に無作為に割り当てた。予想どおり、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１又はＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺのいずれかで処置された６ヶ月齢のＣ６１Ｈｅｔマウスは、処置を開始する前のベースラインで有意差を示さなかった。重要なことに、６ヶ月齢及び８ヶ月齢、処置後２ヶ月及び４ヶ月での全ての運動能力試験（５ｒｐｍ及び１７．５ｒｐｍのロータロッド、グリップ強度、ワイヤーハング試験）は、ＡＡＶ９－ｍｉＬａｃＺ処置対照同腹仔と比較した場合、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスの有意な改善を示した（図３４～３７）。

ＷＴ注射群について、２ヶ月のＷＴマウスを各処置（ｍｉＲ８７１又はｍｉＲＬａｃＺ）に無作為に割り当てた。予想どおり、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１又はＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺのいずれかで処置された２ヶ月齢のＷＴマウスの全ての運動能力試験について、注射前のベースラインで有意差を示さなかった。ＷＴ注射群について、ロータロッド、フットグリップ、ハング試験により、２ヶ月齢での注射前、及び再度、注射後２ヶ月、注射後４ヶ月での運動能力を評価した（図５６～５９）。

ＷＴ注射群の５ｒｐｍ及び１７．５ｒｐｍでのロータロッド分析は、ＷＴマウスにおけるＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１の注射が、注射後２ヶ月での運動能力に悪影響を及ぼすことを示した（図５６～５７）。この表現型は、注射後４ヶ月では観察されず、注射ＷＴマウス及び非注射ＷＴマウスは同様の能力を示した（図４４～４５）。注射後２ヶ月及び４ヶ月のグリップ強度分析は、年齢適合非注射マウス及びモック注射ＷＴマウスと比較した場合、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射したＷＴマウスの有意な障害を示した（図５８）。ハング試験分析は、ＷＴマウスにおけるＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１の注射が、注射後４ヶ月の時点で、マウスの能力に悪影響を及ぼすことを示した。他の全ての時点で、ベースラインのＷＴマウス及び注射したＷＴマウスのハング試験の成績は、統計的有意差を示さなかった（図５９）。

実施例１０
運動神経伝導速度（ＭＮＣＶ）、複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の坐骨神経振幅、及び後肢クラスプ観察
Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、２ヶ月齢で約２８ｍ／ｓ、６ヶ月齢及び１０ヶ月齢で２２ｍ／ｓの坐骨神経のＭＮＣＶを示す［Ｈｕｘｌｅｙ（１９９８），上記、Ｋｏｈｌｅｔａｌ．，ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，１７６（３）：１３９０－１３９９（２０１０）］。坐骨神経のＭＮＣＶ特性を、上記のように処置群で比較した［Ｈｕｘｌｅｙ（１９９８），上記、Ｋｏｈｌ，上記、Ｚｉｅｌａｓｅｋｅｔａｌ．，Ｍｕｓｃｌｅ＆Ｎｅｒｖｅ，１９（８）：９４６－９５２（１９９６）］。ＭＮＣＶ及びＣＭＡＰの場合、左右の坐骨神経を、麻酔した動物で、０．０５ｍｓの最大上矩形波パルス（５Ｖ）を用いて、双極電極を介して、坐骨切痕及び遠位に足首で刺激した。ＭＮＣＶは、刺激電極と記録電極との間の距離を、遠位潜時を近位潜時から差し引いた結果で割ることによって計算した。ＣＭＡＰの潜時は、後肢の第２指と第３指の間に挿入された双極電極によって記録され、刺激アーチファクトから負のＭ波のふれが開始するまで測定された。各マウスにおける足首から肢までの距離の変動から生じる誤差を回避するために、遠位刺激部位と記録部位との間の固定距離を使用して、遠位潜時を計算した。処置マウス群及び対照マウス群の機能的特性を評価するために、坐骨神経のＭＮＣＶ及びＣＭＡＰを、早期処置群では６ヶ月齢で、後期処置群では１０ヶ月齢で、及びＷＴ注射群では６ヶ月齢で測定した（全ての時点は処置後４ヶ月であった）。

統計：ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアの一元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、ＭＮＣＶ及びＣＭＡＰを比較した。全ての比較における有意水準、Ｐ＜０．０５。

ｍｉＲ８７１処置群及びｍｉＲＬａｃＺ処置群における機能的特性を評価するために、早期処置マウス坐骨神経のＭＮＣＶを、処置後４ヶ月、６ヶ月齢で測定した。ｍｉＲ８７１処置群では、ＭＮＣＶ及びＣＭＡＰ値が有意に改善し、それぞれ平均３６．８８ｍ／ｓ及び３．５１ｍＶ（ｎ＝８）に達し、一方、ｍｉＲＬａｃＺ群（ｎ＝８）では、ＭＮＣＶ及びＣＭＡＰ値が、それぞれ平均２５．９ｍ／ｓ及び１．４４ｍＶであった（図３８Ａ；ｐ＜０．０００１、及び図６０）。ｍｉＲ８７１処置群のＭＮＣＶ値は、ＷＴマウスのＭＮＣＶ値に近く、平均４１．６１ｍ／ｓ（ｎ＝６；ｐ＞０．０５）であった。しかしながら、ｍｉＲ８７１群のＣＭＡＰ値は、ＷＴレベルに達しなかった（ＷＴＣＭＡＰスコア：６．９ｍＶ）。早期処置Ｃ６１－Ｈｅｔマウスにおける運動能力の改善は、電気生理学的特性の改善と相関していた。

早期処置群と同様に、ｍｉＲ８７１群及びｍｉＲＬａｃＺ群の機能的特性を評価するために、処置後４ヶ月、１０ヶ月齢で、後期処置坐骨神経のＭＮＣＶ及びＣＭＡＰを測定した。ｍｉＲ８７１処置群では、ＭＮＣＶ値が有意に改善し、平均が３７．６９ｍ／ｓ（ｎ＝６）に達し、一方、ｍｉＲＬａｃＺ群（ｎ＝５）では、速度が平均２４．１２ｍ／ｓであった（図３９Ａ；ｐ＝０．００４０、及び図６１）。しかしながら、ｍｉＲ８７１後期処置群のＭＮＣＶ値は、平均４３．３８ｍ／ｓを有するＷＴマウスの値に到達することができなかった（ｎ＝４；ｐ＝０．０３３３）。１０ヶ月齢のＷＴマウス及びｍｉＲＬａｃＺマウスのＣＭＡＰ値は有意に異なり、それらの平均は、それぞれ５．３３及び２．４ｍＶである。この表現型は、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による後期処置後に改善されず、ｍｉＲ８７１マウス群の平均ＣＭＡＰスコアは、２．９８ｍＶであった。早期処置群と同様に、早期処置Ｃ６１－Ｈｅｔマウスにおける運動能力の改善は、電気生理学的特性の改善と相関していた。

ｍｉＲ８７１群及びｍｉＲＬａｃＺ群の機能的特性を評価するために、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ又はＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射したＷＴマウスのＭＮＣＶ及びＣＭＡＰを、処置後４ヶ月、６ヶ月齢で測定した。ＷＴ、ｍｉＲＬａｃＺ、及びｍｉＲ８７１処置群のＭＮＣＶ値には差異がなく、平均スコアが、それぞれ４１．６１、４２．０９、及び４０．０７ｍ／ｓであった（図６２Ａ～Ｂ）。６ヶ月齢のＷＴマウス及びｍｉＲＬａｃＺマウスのＣＭＡＰ値には有意差がなく、平均が、それぞれ６．８９及び７．０３ｍ／Ｖであった。ｍｉＲ８７１群は、ＣＭＡＰスコアの低下を示し、平均が、４．６２ｍ／Ｖであった。

後肢クラスピングは、末梢神経障害の多くのマウスモデルにおける疾患進行のマーカーである［Ａｒｎａｕｄｅｔａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，１０６（４１）：１７５２８－１７５３３（２００９）］。後肢クラスピングの表現型がＣ６１Ｈｅｔマウスで観察され、１ヶ月齢から始まり、１０ヶ月齢まで進行した。この観察の間、マウスを、尾で懸垂させ、末梢神経系欠損の徴候としてのつま先の異常な握り締め及びクラスピングを監視した。

統計：ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアの一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、後肢開脚角度のデータを比較した。全ての比較における有意水準、Ｐ＜０．０５。

２ヶ月齢でＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（モック）を注射した６ヶ月齢のＣ６１Ｈｅｔマウスは、尾による懸垂時に、つま先の異常な握り締め及び後肢表現型のクラスピングを示し、末梢神経系欠陥の存在を示唆した。２ヶ月齢でＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射した６ヶ月齢のＣ６１Ｈｅｔマウスでは、この表現型が完全に回復し、後肢のクラスピングがなく、正常な握り締めを示した（図３８Ｂ）。

６ヶ月齢でＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（モック）を注射した１０ヶ月齢のＣ６１Ｈｅｔマウスは、尾による懸垂時に、つま先の異常な握り締め及び後肢表現型のクラスピングを示し、末梢神経系ＰＮＳ欠陥の存在を示唆した。早期処置群と同様に、６ヶ月齢でＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射した１０ヶ月齢のＣ６１Ｈｅｔマウスでは、この表現型が完全に回復し、後肢のクラスピングがなく、正常な握り締めを示した（図３９Ｂ）。

非注射ＷＴ及びＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ又はＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１のいずれかを注射したＷＴは、それらの後肢クラスピング表現型において統計的有意差を示さなかった（図６３）。平均の後肢開脚は、それぞれ７３．１９、７０．５４、５９．０９度であった。

実施例１１
形態計測分析
６ヶ月齢又は１０ヶ月齢のＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１及びＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスの腰髄運動神経根及び大腿運動神経を得て、上記のように、２．５％グルタルアルデヒドによる灌流、オスミウム酸染色（ｏｓｍｉｃａｔｉｏｎ）、脱水、及びアラルダイト樹脂（全て、ＡｇａｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫから購入）への包埋後、ミエリン形成の定量分析を行った［Ｋａｇｉａｖａ（２０１９），上記］。神経根が付着した腰髄脊髄及び大腿運動神経の中央部分の横断準超薄切片（１μｍ）を得、アルカリ性トルイジンブルー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色した。切片を使用して、両群における異常なミエリン形成の程度を調べた。簡潔に、全ての脱ミエリン化した軸索、薄くミエリン化した軸索、及び正常にミエリン化した軸索は、以下の基準を使用してカウントした：ミエリン鞘を含まない１μｍより大きい軸索は、脱ミエリン化した軸索とみなした；ミエリン鞘が軸索径の１０％未満の軸索は、薄くミエリン化した軸索とみなした；円周方向に配置されたシュワン細胞のプロセス及び細胞外マトリックスによって囲まれた軸索は、「オニオンバルブ」とみなした；他の全てのミエリン化した軸索は、脱ミエリン化した軸索とみなした。全ての病理学的分析は、各マウスの処置条件に対して盲検で実施した。形態学的分析は、複数の運動神経根及び両側の大腿運動神経で実施し、結果をマウスごとに平均化した。脱ミエリン化した線維及び薄くミエリン化した線維を含む異常にミエリン化した線維の数をカウントし、各カテゴリにおける線維の割合を計算した。オニオンバルブの形成の場合、マウス当たりのバルブの総数をカウントし、そのように提示した。

形態学的分析により、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による早期処置Ｃ６１－Ｈｅｔマウスの調べた全てのＰＮＳ組織（神経根及び大腿神経）において、異常にミエリン化した線維の減少が示した（図４０～４３）。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスの前腰髄運動神経根において、異常にミエリン化した線維の割合は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ群と比較して減少した（図４０～４１）。詳細には、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウス（ｎ＝１６）における薄くミエリン化した線維の割合は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウス（ｎ＝１６）における１５．３５％と比較して、１１．７４％であった（ｐ＝０．０２６１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。詳細には、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウス（ｎ＝１６）における脱ミエリン化した線維の割合は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウス（ｎ＝１６）における４９．７４％と比較して、２５．３６％であった（ｐ＝０．０００１、Ｍａｎｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。また、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による処置後のオニオンバルブの形成（１切片当たり平均０．６９のオニオンバルブの形成、ｎ＝１６）も、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置（平均８．０６のオニオンバルブの形成／切片、ｎ＝１６）と比較して減少した（ｐ＜０．０００１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。

同様に、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１早期処置マウスの大腿運動神経では、異常にミエリン化した線維の割合は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ群と比較して低下した（図４２～４３）。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウス（ｎ＝１６）では、薄くミエリン化した線維の割合は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウス（ｎ＝１６）における１９．３６％と比較して、６．８３％であり（ｐ＜０．０００１，Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）、一方、脱ミエリン化した線維の割合は、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウス（ｎ＝１６）では、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウス（ｎ＝１６）における２．３３％と比較して、１．０９％であった（ｐ＝０．０００４，Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。早期処置群のｍｉＲＬａｃＺ大腿運動神経において、十分なオニオンバルブの形成が観察されず、ｍｉＲ８７１処置後のこの形成における有意な交代をもたらさなかった（ｍｉＲＬａｃＺ：０．６９％，ｍｉＲ８７１：０．２５％）。

早期処置群と同様に、１０ヶ月齢のＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１又はＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスの腰髄運動神経根及び大腿運動神経を得て、マウス群からのミエリン形成の定量分析を行った。形態学的分析により、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による後期処置Ｃ６１－Ｈｅｔマウスの調べた全てのＰＮＳ組織（神経根及び大腿神経）において、異常にミエリン化した線維の減少が示された（図４４～４７）。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウスの前腰髄運動神経根において、異常にミエリン化した線維の割合は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ群と比較して減少した（図４４～４５）。詳細には、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウス（ｎ＝７）における薄くミエリン化した線維の割合は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウス（ｎ＝７）における１９．３９％と比較して、１４．６２％であった（ｐ＝０．０３６４、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。詳細には、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウス（ｎ＝７）における脱ミエリン化した線維の割合は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウス（ｎ＝７）における５２．２５％と比較して、３２．６５％であった（ｐ＝０．００３５、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。また、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による処置後のオニオンバルブの形成（１切片当たり平均３８．８６のオニオンバルブの形成、ｎ＝７）も、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置（平均２．７１のオニオンバルブの形成／切片、ｎ＝７）と比較して減少した（ｐ＜０．００１０、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。

同様に、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１後期処置マウスの大腿運動神経では、異常にミエリン化された線維の割合は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ群と比較して低下した（図４６～４７）。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置マウス（ｎ＝１０）では、薄くミエリン化した線維の割合は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ処置マウス（ｎ＝７）における２１．９５％と比較して、１１．３１％であった（ｐ＝０．０００４、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。しかしながら、後期処置は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ（ｎ＝７）処置マウスと比較した場合、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１（ｎ＝１０）処置マウスにおける脱ミエリン化した線維の割合を有意に減少させることができなかった（ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：１．３７％，ｍｉＲＬａｃＺ：２．０８％；ｐ＝０．０５４４、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。早期処置群のｍｉＲＬａｃＺ大腿運動神経において、十分なオニオンバルブの形成が観察されず、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１処置後のこの形成における有意な交代をもたらさなかった（ｍｉＲＬａｃＺ：０．５７％，ｍｉＲ８７１：０．２０％）。

統計：ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアのＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、形態計測分析のデータを比較した。全ての比較における有意水準、Ｐ＜０．０５。

実施例１２
ＰＭＰ２２スプライス形態
ＰＭＰ２２は、いくつかのスプライスバリアントを有する。３つの異なる研究において、６つの選択的スプライス形態が経験的に同定された。［Ｖｉｓｉｇａｌｌｉｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｓｕｔｅｒｅｔａｌ．，上記、及びＨｕｅｈｎｅａｎｄＲａｕｔｅｎｓｔｒａｕｓｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７（６）：６６９－６７５（２００１）］。加えて、Ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇは、２６種類の異なるヒトＰＭＰ２２スプライス形態を示し、そのほとんどはシリコで予測される。これらのスプライス形態のうち３つは、ナンセンス媒介性分解（ＮＭＤ）を受け、したがって、タンパク質をコードしていない可能性が高い。加えて、この遺伝子座から生じ得る他の４つの切断型非コードのプロセシングされた転写産物が存在する（Ｅｎｓｅｍｂｌ転写産物２０５、２０６、２２７、２２９）。したがって、Ｅｎｓｅｍｂｌは、ＰＭＰ２２遺伝子座から生じる２３の可能なタンパク質コード転写産物を予測し、８つの可能なタンパク質アイソフォームを産生する。

２つの最も長いＥｎｓｅｍｂｌ転写産物は、ＰＭＰ２２－２１５（２，４２３ｂｐ）及びＰＭＰ２２－２０４（４，１６１ｂｐ）である。ＰＭＰ２２－２１５は、全長１６０アミノ酸のＰＭＰ２２タンパク質をコードし、ＰＭＰ２２－２０４は、より短い１２５アミノ酸アイソフォームを産生する。図４９は、ＰＭＰ２２－２０４ｃＤＮＡ配列を示す。

上に記載したｍｉＰＭＰ２２－８６８及びｍｉＰＭＰ２２－８７１は、２３種類の可能なタンパク質コードＰＭＰ２２転写産物のうちの２２種類における結合部位を標的とする（図５０）。１つの転写産物の例外は、ＰＭＰ２２－２０４であり、これは、エキソン４の末端に保持されたイントロンを含み、それによって、選択的な３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を産生する。

実施例１３
Ｃ６１ＨｅｔマウスにおけるＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ髄腔内注射の６週間後の免疫応答分析
２ヶ月齢のＣ６１ＨｅｔマウスにＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺを髄腔内注射し、次いで、注射後６週間（３．５ヶ月齢）又は注射後４ヶ月（６ヶ月齢）のいずれかで犠牲にした。上記の実施例６に記載のように、免疫組織化学分析用の組織を採取した。腰髄神経根、坐骨神経、及び肝臓の切片を、ＣＤ２０（１：１００ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、ＣＤ４５（１：１００Ａｂｃａｍ）、ＣＤ６８（１：５０Ｂｉｏｒａｄ）、及びＣＤ３（１：１００Ａｂｃａｍ）に対して染色した。細胞核をＤＡＰＩで視覚化した。総細胞数に対するＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ６８、及びＣＤ３陽性細胞の割合を計算した。

注射後６週間又は４ヶ月のいずれかで、２ヶ月齢のＣ６１ＨｅｔマウスへのＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺの髄腔内送達に対する、腰髄神経根（図６４）、坐骨神経（図６５）、及び肝臓（図６６）での免疫学的応答を、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０、白血球マーカーＣＤ４５、マクロファージマーカーＣＤ６８、及びＴ細胞マーカーＣＤ３を定量することによって分析した。ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃｚ注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスを、年齢適合非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウス及びＷＴマウス（正常レベルのマウスＰＭＰ２２のみを発現する）と比較した。

腰髄神経根のＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ３、及びＣＤ６８マーカーの免疫応答分析（図６４）は、６週間の時点で、ＷＴ、Ｃ６１Ｈｅｔ、及びＣ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺのＣＤ２０レベルに有意差がないことを示した。非注射Ｃ６１ＨｅｔのＣＤ２０レベルは、６ヶ月齢の値である３．５と比較した場合、有意に増加した。非注射マウス及びＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、年齢適合ＷＴマウスと比較した場合、注射後４ヶ月（マウスは６ヶ月齢）でＣＤ２０レベルの増加を示した。Ｃ６１ＨｅｔマウスにおけるＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺの注射は、非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスと比較した場合、ＣＤ２０レベルに影響を及ぼさなかった。両方の時点で、腰髄神経根のＣＤ４５、ＣＤ６８、及びＣＤ３レベルは、年齢適合非注射ＷＴマウスと比較した場合、非注射マウス及びＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺＣ６１Ｈｅｔマウスにおいて上昇していることが示された。非注射Ｃ６１ＨｅｔマウスのＣＤ６８及びＣＤ３レベルは、動物が加齢するにつれて増加した。Ｃ６１ＨｅｔマウスにおけるＡＡＶ９－ｍｉＲｌａｃＺの注射は、非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスと比較した場合、ＣＤマーカーのレベルに影響を及ぼさなかった。

坐骨神経のＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ３、及びＣＤ６８マーカーの免疫応答分析（図６５）は、ＷＴ、Ｃ６１Ｈｅｔ、及びＣ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺの６週間の時点におけるＣＤ２０レベルに有意差がなかったことを示した。非注射Ｃ６１ＨｅｔのＣＤ２０レベルは、３．５ヶ月齢及び６ヶ月齢の値を比較した場合、有意に増加した。非注射マウス及びＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、年齢適合ＷＴマウスと比較した場合、注射後４ヶ月（マウスは６ヶ月齢）でＣＤ２０レベルの増加を示した。Ｃ６１ＨｅｔマウスにおけるＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺの注射は、非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスと比較した場合、ＣＤ２０レベルに影響を及ぼさなかった。両方の時点で、坐骨神経のＣＤ４５、ＣＤ６８、及びＣＤ３レベルは、年齢適合非注射ＷＴマウスと比較した場合、非注射マウス及びＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺＣ６１Ｈｅｔマウスにおいて上昇していることが示された。ベースラインのＣ６１ＨｅｔマウスのＣＤ６８レベルは、動物が加齢するにつれて増加した。Ｃ６１ＨｅｔマウスにおけるＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺの注射は、非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスと比較した場合、ＣＤマーカーのレベルに影響を及ぼさなかった。

肝臓のＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ３、及びＣＤ６８マーカー免疫応答分析（図６６）は、非注射ＷＴ及びＣ６１Ｈｅｔが、同様の数の免疫応答マーカーを発現することを示した。６週間の時点でのＣ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺマウスのＣＤ２０及びＣＤ３レベルは、非注射ＷＴ及びＣ６１Ｈｅｔと比較した場合、増加した。この増加は、４ヶ月の時点でベースラインレベルに戻りバランスが取れた。

これらのデータによれば、非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、年齢適合ＷＴ対照と比較した場合、腰髄神経根及び坐骨神経の切片において免疫応答マーカーの上昇を示し、年齢とともに増加した。この表現型は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺの注射の影響を受けなかった。３．５ヶ月齢及び６ヶ月齢の非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、年齢適合対照と比較した場合、それらの肝臓において正常なレベルの免疫応答マーカーを示した。注射時点から４週間後、Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ注射マウスは、肝臓のＣＤ２０及びＣＤ３陽性細胞のレベルの増加を示し、ＡＡＶ９注射に対する全身的な免疫応答を示した。この表現型は、注射後の時間が進行するにつれて改善され、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺを注射したＣ６１Ｈｅｔマウスにおいて、注射の４ヶ月後、炎症反応が検出されなかった。

統計：免疫染色のデータ（ＣＤ陽性細胞の割合）を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアの一元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、免疫染色のデータ（ＣＤ陽性細胞の割合）を比較した。全ての比較における有意水準、Ｐ＜０．０５。

実施例１４
ニューロフィラメント軽鎖（Ｎｆｌ）の血漿中レベル
本発明者らは、処置の有効性を更に評価するために、早期処置及び後期処置終了時点で、ベースラインのＷＴ、Ｃ６１Ｈｅｔ、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺを注射したＣ６１Ｈｅｔ、及びＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射したＣ６１Ｈｅｔに対して血液試料からのＮｆｌバイオマーカーの分析を行った。Ｎｆｌ濃度は、軸索損傷の動的尺度であり、ＣＭＴ疾患の重症度のバイオマーカーとして機能する。動物を犠牲にする前に、標準的な方法を使用して血液を採取した［Ｐａｒａｓｕｒａｍａｎ，ｅｔａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１，（２）：８７－９３（２０１０）］。

以前に記載されているように、血液試料を採取し、１時間以内に処理した［Ｋａｇｉａｖａｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ，Ｏｎｌｉｎｅａｈｅａｄｏｆｐｒｉｎｔ（２０２１）］。血液試料を、ＥＤＴＡ含有チューブに採取し、２０℃で、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。遠心分離により、血液試料を２相に分離し、上層の血漿を回収し、試験するまで－８０℃で保存した。血漿中Ｎｆｌ濃度を、単一分子アレイ（ＳＩＭＯＡ）ＨＤ－１装置（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で、市販のＮＦ－Ｌｉｇｈｔキットを使用して、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｌｅｇｅＬｏｎｄｏｎ（ＵＣＬ）において測定した［Ｒｏｈｒｅｒｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，８７（１３）：１３２９－１３３６（２０１６）、Ｓａｎｄｅｌｉｕｓｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，９０（６）：ｅ５１８－ｅ５２４（２０１８）］。

６ヶ月齢の非注射Ｃ６１ＨｅｔマウスのＮｆｌ濃度（ｎ＝４、４１８．０７ｐｇ／ｍｌ）は、年齢適合非注射ＷＴ対照マウスと比較して（ｎ＝４、１３１．１０ｐｇ／ｍｌ）上昇していた（図６７）。ＡＡＶ９－ｍｉＲ９７１による早期処置Ｃ６１Ｈｅｔマウス（ｎ＝６）は、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ群（ｎ＝６、５４０．６５ｐｇ／ｍｌ）と比較して、より低いＮｆｌ濃度（３２１．３７ｐｇ／ｍｌ）を示し、ＡＡＶ９－ｍｉＲ９７１のスコアが、ＷＴレベル（１３１．１０ｐｇ／ｍｌ）に近かった（図６２）。ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺの注射は、非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスと比較した場合、血漿中Ｎｆｌレベルへのいかなる代替ももたらさなかった（図６７）。

１０ヶ月齢の非注射Ｃ６１ＨｅｔマウスのＮｆｌ濃度（ｎ＝４、５３９．６６ｐｇ／ｍｌ）は、年齢適合非注射ＷＴ対照マウスと比較して（ｎ＝４、８８．０７ｐｇ／ｍｌ）上昇していた（図６８）。ＡＡＶ９－ｍｉＲ９７１による後期処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、ＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺを注射した年齢適合非注射Ｃ６１Ｈｅｔ又はＣ６１Ｈｅｔと比較した場合、血漿中Ｎｆｌレベルの改善を示さなかった（図６８）。非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウス、並びにＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ及びＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスは、同様のレベルのＮｆｌを示した（Ｃ６１ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：４７１．９９ｐｇ／ｍｌ、Ｃ６１ＨｅｔＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：５５９．２８ｐｇ／ｍｌ）（図６８）。

６ヶ月齢の注射（ｍｉＲＬａｃＺ：ｎ＝５、ｍｉＲ８７１：ｎ＝５）及び非注射（ｎ＝４）ＷＴマウスのＮｆｌ濃度は、類似のスコアであり、それらの間に統計的有意差はなかった（６ヶ月齢ＷＴ：１３１．１０ｐｇ／ｍｌ、ＷＴＡＡＶ９－ｍｉＲＬａｃＺ：１２８．９３ｐｇ／ｍｌ、ＷＴＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１：１０４．９２ｐｇ／ｍｌ）（図６９）。

統計：ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェアの一元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、Ｎｆｌ濃度のデータを比較した。全ての比較における有意水準、Ｐ＜０．０５。

実施例１５
Ｃ６１ＨｅｔマウスにおけるＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１髄腔内注射の４ヶ月後の免疫応答分析
Ｃ６１Ｈｅｔマウスに、２ヶ月齢（早期処置）又は６ヶ月齢（後期処置）のいずれかでＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を髄腔内注射し、次いで、注射の４ヶ月後（それぞれ６ヶ月齢又は１０ヶ月齢）に犠牲にした。「実施例６」で前述したように、免疫組織化学分析用の組織を採取した。腰髄神経根、坐骨神経、及び肝臓の切片を、ＣＤ２０（１：１００ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、ＣＤ４５（１：１００Ａｂｃａｍ）、ＣＤ６８（１：５０Ｂｉｏｒａｄ）、及びＣＤ３（１：１００Ａｂｃａｍ）に対して染色した。細胞核をＤＡＰＩで視覚化した。総細胞数に対するＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ６８、及びＣＤ３陽性細胞の割合を計算した。

６ヶ月齢の非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスの腰髄神経根及び坐骨神経の切片は、年齢適合非注射ＷＴマウスと比較して、より高いレベルのＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ６８、及びＣＤ３陽性細胞を示した（図７０～７１）。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射した早期処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスの腰髄神経根及び坐骨神経は、低下したレベルのＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ６８、及びＣＤ３陽性細胞を示し、これらのスコアがＷＴレベルに達した（図７０～７１）。これらのデータによれば、６ヶ月齢のＣ６１Ｈｅｔマウスの腰髄神経根及び坐骨神経は、免疫応答マーカーのスコアの上昇を示し、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による早期処置後、低下してＷＴレベルに戻った。

６ヶ月の非注射ＷＴマウス、及びＣ６１Ｈｅｔマウス、並びにＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射したＣ６１Ｈｅｔマウスの肝臓切片は、類似のスコアのＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ６８、及びＣＤ３陽性細胞を示した（図７２）。これらのデータによれば、６ヶ月齢のＣ６１Ｈｅｔマウスの肝臓は、ベースライン時又はＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１の注射後４ヶ月で過剰な炎症応答を発現しない。

１０ヶ月齢の非注射Ｃ６１Ｈｅｔマウスの腰髄神経根及び坐骨神経の切片は、年齢適合非注射ＷＴマウスと比較して、より高いレベルのＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ６８、及びＣＤ３陽性細胞を示した（図７３～７４）。ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射した後期処置Ｃ６１Ｈｅｔマウスの腰髄神経根及び坐骨神経は、低下したレベルのＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ６８、及びＣＤ３陽性細胞を示した（図７３～７４）。Ｃ６１Ｈｅｔ－ＡＡ９－ｍｉＲ８７１のスコアは、腰髄神経根のＣＤ４５のスコアを唯一の例外として、ＷＴレベルに達した（図７３～７４）。これらのデータによれば、１０ヶ月齢のＣ６１Ｈｅｔマウスの腰髄神経根及び坐骨神経は、免疫応答マーカーのスコアの上昇を示し、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１による早期処置後、腰髄神経根のＣＤ４５マーカーを唯一の例外として、ＷＴレベルに低下した。

１０ヶ月の非注射ＷＴマウス、及びＣ６１Ｈｅｔマウス、並びにＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射したＣ６１Ｈｅｔマウスの肝臓切片は、類似のスコアのＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ６８、及びＣＤ３陽性細胞を示した（図７５）。これらのデータによれば、６ヶ月齢のＣ６１Ｈｅｔマウスの肝臓は、ベースライン時又はＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１の注射後４ヶ月で過剰な炎症応答を発現しない。

実施例１６
注射の４ヶ月後の早期処置群及び後期処置群のＰＮＳ及び非ＰＮＳ組織のＶＧＣＮ分析
Ｃ６１Ｈｅｔマウスに、２ヶ月齢（早期処置）又は６ヶ月齢（後期処置）のいずれかで（マウスがそれぞれ６ヶ月齢又は１０ヶ月齢であるときに）、ＡＡＶ９－ｍｉＲ８７１を注射し、注射の４ヶ月後に犠牲にした。ＰＮＳ（腰髄神経根、坐骨神経、及び大腿神経）並びに非ＰＮＳ（脳、肝臓、腎臓、肺、四頭筋、心臓、胃、及び眼）試料を採取し、”実施例６”に記載されるように、ＶＧＣＮ分析用に処理した。ＡＡＶ９ウイルスベクター粒子は、両方の処置群の注射の４ヶ月後、調べた全ての組織において、有意に多量に検出することができた（図７６～７７）。両方の処置群において、肝臓が最も高いＶＧＣＮスコアを有する組織であり、胃が最も低いＶＣＧＮスコアを有する組織であった（図７６～７７）。

本発明を特定の実施形態に関して説明してきたが、当業者には、その変更及び修正が想起されることが理解される。したがって、特許請求の範囲に見られるようなかかる限定のみが本発明に課されるべきである。

本出願で参照される全ての文書は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。

Claims

核酸であって、
（ａ）配列番号１～８のうちのいずれか１つに示される鋳型核酸、
（ｂ）配列番号９～１６のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一のＰＭＰ２２人工阻害性ＲＮＡをコードする核酸、
（ｃ）配列番号９～１６のうちのいずれか１つに示されるＰＭＰ２２人工阻害性ＲＮＡをコードする核酸、
（ｄ）配列番号１７～２４のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一のＰＭＰ２２アンチセンスガイド鎖をコードする核酸、又は
（ｅ）配列番号１７～２４のうちのいずれか１つに示されるＰＭＰ２２アンチセンスガイド鎖をコードする核酸、を含む、核酸。
請求項１に記載の核酸、又はそれらのうちのいずれか１つ以上の組み合わせを含む、ウイルスベクター。
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスである、請求項２に記載のウイルスベクター。
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶである、請求項３に記載のウイルスベクター。
前記ＡＡＶが、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を欠く、請求項４に記載のウイルスベクター。
前記ＡＡＶが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補型組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項４又は５に記載のウイルスベクター。
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、又はＡＡＶｒｈ．７４のカプシド血清型を有する、請求項４～６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ－９のカプシド血清型を有する、請求項４～７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
前記ＡＡＶが、偽型ＡＡＶである、請求項４～８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２／８又はＡＡＶ２／９である、請求項９に記載のウイルスベクター。
前記ＰＭＰ２２人工阻害性ＲＮＡをコードする前記核酸の発現が、Ｕ６プロモーターの制御下にある、請求項４～１０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
請求項１に記載の核酸と、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
請求項２～１１のいずれか一項に記載のウイルスベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
シュワン細胞に薬剤を送達することができる送達ビヒクルと、人工阻害性ＲＮＡをコードする核酸であって、前記人工阻害性ＲＮＡが、ヒト末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子によってコードされるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のセグメントに結合する、核酸と、任意選択的に、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
前記ヒトＰＭＰ２２遺伝子が、配列番号２５の配列、又は配列番号２５の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一のそのバリアントを含む、請求項１４に記載の組成物。
前記ｍＲＮＡセグメントが、配列番号２５のヌクレオチド１～２４２３内の配列に相補的である、請求項１４又は１５に記載の組成物。
前記ｍＲＮＡセグメントが、配列番号２５のヌクレオチド１４１２～１４３３又は１４１５～１４３６内の配列に相補的である、請求項１６に記載の組成物。
前記送達ビヒクルが、ウイルスベクターである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の組成物。
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスである、請求項１８に記載の組成物。
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶである、請求項１９に記載の組成物。
前記ＡＡＶが、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を欠く、請求項２０に記載の組成物。
前記ＡＡＶが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、組換え一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）、又は自己相補型組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項２０又は２１に記載の組成物。
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、及びＡＡＶｒｈ．７４からなる群から選択されるカプシド血清型を有する、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の組成物。
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ－９のカプシド血清型を有する、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の組成物。
前記ＡＡＶが、偽型ＡＡＶである、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の組成物。
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２／８又はＡＡＶ２／９である、請求項２５に記載の組成物。
前記ＰＭＰ２２人工阻害性ＲＮＡをコードする前記核酸の発現が、Ｕ６プロモーターの制御下にある、請求項１２～２６のいずれか一項に記載の組成物。
重複した末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子を有するシュワン細胞への送達方法であって、前記シュワン細胞を有する対象に、
（ａ）請求項１に記載の核酸、
（ｂ）請求項２～１１のいずれか一項に記載のベクター、又は
（ｃ）請求項１２～２７のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子の過剰発現に罹患している対象を治療する方法であって、前記対象に、
（ａ）請求項１に記載の核酸、
（ｂ）請求項２～１１のいずれか一項に記載のベクター、又は
（ｃ）請求項１２～２７のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
前記対象が、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）に罹患している、請求項２９に記載の方法。
前記対象が、ヒト対象である、請求項２９又は３０に記載の方法。