KR20160002900A - 선택적 유전자 치료 발현 시스템 - Google Patents

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Abstract

선택적 유전자 치료 발현 시스템
본 발명은 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 전신 투여용 발현 시스템에 관한 것으로서, 상기 발현 시스템은
- 골격근 및/또는 말초 신경 조직을 포함하는 표적 조직에서 치료학적으로 허용가능한 수준으로 상기 단백질을 발현시키고;
- 표적 조직 이외의 조직, 특히 심장에서 독성학적으로 허용가능한 수준으로 상기 단백질을 발현시킨다.

Description

선택적 유전자 치료 발현 시스템{SELECTIVE GENE THERAPY EXPRESSION SYSTEM}
본 발명은 유전자 치료, 특히 MTM1 유전자에의 돌연변이로 인해 유발되는, 근세관성 근육병(myotubular myopathy)과 같이 골격근에 영향을 미치는 질환의 치료에 관한 것이다.
이러한 맥락에서, 본 발명은 표적 조직 바람직하게는 골격근에서 치료학적으로 유효한 양의 단백질의 생산, 및 비-표적 조직 특히 심장에서 독성학적으로 허용가능한 양의 단백질의 생산을 보장하는 단백질-암호화하는 이식유전자(transgene)를 포함하는 발현 시스템을 제안한다.
X-연관 근세관성 근육병(또는 XLMTM, OMIN 310400)은 중심핵성 근육병(centronuclear myopathy)이라고 불리는 질환 군 중 가장 심각하고 흔한 형태이다. 환자들은 태아기 동안에 이미 영향을 받았고, 임신 기간 동안 감소된 움직임을 보이며, 출생할 당시에도 비-진행성으로 보이는 근육병을 가진다[1,2,3]. 그것들은 근력 저하 및 근긴장 저하로 일반화되고, 호흡 부전을 야기하여 집중적인 의학적 관리에도 불구하고 생애 초기에 다수가 사망하게 된다. 보다 이례적으로, 남성 또는 여성 개체에서 아동기 동안 가벼운 증상을 나타내고, 그들 생애의 초기 10년 내지 20년 동안 악화되는, 덜 심각한 형태의 근세관성 근육병도 존재한다[4].
영향을 받은 개체의 골격근은 전형적으로 섬유의 중앙에 위치되는 핵과 미토콘드리아 같은 세포 소기관들의 분포가 변형되거나, 또는 덜 심각한 경우에는 근섬유막 하부 영역(subsarcolemmal region )에 줄무늬(collar) 형태로 배열된 작은 섬유들을 포함한다[4,5].
상기 질환은 도처에서 발현된, 미오튜불라린이라고 불리는 포스포이노시티드 포스파타아제(phosphoinositide phosphatase)를 암호화하는 MTM1 유전자를 불활성화시키는 돌연변이로부터 야기된다[6].
현재, 상기 질환의 동물 모델로는 제브라피시, 마우스, 및 개가 있다[7,8,9,10]. 이러한 모델들에서 수행된 연구들은 골격근에서 미오튜불라린이 T-튜블린 및 중간섬유의 구성, 흥분-수축 짝지음, 신경근 접합부의 전달, 및 위성세포의 생존 및 증식을 포함하는 다양한 메커니즘으로 역할을 수행함을 밝혀냈다[11,12,13,14].
벡터를 이용한 유전자 대체 치료법은 근세관성 근육병을 위한 잠재적인 치료학적 접근법을 대표한다. 따라서 근육-특이적인 징후를 나타내는 미오튜불라린의 손상을 지닌 마우스(mKO)에 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector, AAV)를 단독으로 근육 내 주사함으로써 표적 근육의 병리 및 기능을 개선할 수 있다는 사실이 그러한 개념의 증거로서 시사된다[15].
근육 장애의 치료에 중요한 문제가 남아 있다. 유전자 전이법, 특히 근육 형질감염에 특별히 적합한 것으로 밝혀진 아데노-관련 바이러스에서 유래한 벡터를 이용하는 유전자 전이법은 특히 유망한 접근법이다. 이는 환자에서 생성된, 돌연변이되고 불활성인 단백질을 보완하는 기능성 단백질의 생산을 위해, 온전한 본(copy)의 유전자를 상기 환자에게 투여하는 것을 수반한다.
근육 질환의 경우, 상기 투여가 이식유전자를 가진 벡터를 근육으로 국소 주사함으로써 수행될 수 있다. 그러나 임상적으로는 전신 투여가 바람직하고, 이는 상기 이식유전자가 신체의 다양한 조직에서 발견될 수 있음을 의미한다.
전형적으로, 상기 이식유전자는 그것의 발현, 특히 발현 수준 또는 발현의 조직 특이성을 통제하는 제어 서열의 조절 하에 있다. 따라서 근육 질환의 유전자 치료의 경우, 근육에서의 발현을 더욱 특이적으로 통제하는 프로모터를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 당업자에게 근육에서 유전자 발현을 향상시키는 것으로 잘 알려진 합성 프로모터 C5-12가 개발되었다.
그러나, 표적 조직에서 유효한 양의 단백질을 생산하여 돌연변이된 단백질의 활성 결핍을 보완해 줄 수 있으면서, 한편으로는 치료받는 환자들에게 안전한, 신경근 질환을 치료하는 유전자 치료를 위한 새로운 기술들은 분명히 개발될 필요가 있다.
도 1: 벡터 컨스트럭트의 다이어그램:
A/ miRNA-208a에 대한 표적 서열이 없는 Mtm1 발현 카세트;
B/ Mtm1 유전자의 3'에 miRNA-208a에 대한 1, 2 또는 4개의 표적 서열(박스)을 포함하는 발현 카세트.
도 2: AAV-pDES-Mtm1 벡터로 처리된 XLMTM 마우스의 심장의 단면도. 섬유화 부분이 시리우스 레드 염색으로 붉은색으로 확인되었다.
도 3:
- 위: 벡터(vg/이배체 게놈)의 정맥내 투여 1개월 후의 야생형 마우스(WT)의 골격근(전경골근(tibialis anterior) = TA; 사두근(quadriceps) = QUA; 삼두근(triceps) = TRI) 및 심장(heart)에서의 벡터의 분포.
- 아래: 상기 벡터의 투여 1개월 후의 야생형 마우스(WT)의 골격근 및 심장에서의 MTM1 단백질의 수준. 수치는 내재적인 수준에 대한 증가 속도(multiplication rate). 대조군으로서, 마우스는 PBS 또는 빈 AAV8 벡터(AAV-MCS) 중 어느 하나로 주사되었다.
도 4: PBS, AAV8-Des-MCS, AAV8-Des-Mtm1 또는 AAV-Des-Mtm1-miRHT1 중 어느 하나로 주사된 Mtm1 KO("녹아웃") 마우스의 생존 곡선(좌) 및 체중 곡선(우). 대조군으로서, 야생형 마우스(WT)에는 PBS가 투여되었다.
도 5: 인 비보에서 CAPN3 및 miR-206의 프로모터 활성 분석:
A/ PBS, 벡터 AAV2/9-desm-CAPN3(pdes.C3), AAV2/9-pC3-CAPN3(pC3.C3), AAV2/9-pmiR206-CAPN3(p206.C3)의 주사 후의 심장 근육의 조직학 분석, 그리고 시리우스 레드 염색(위, 스케일 = 500㎛) 또는 헤마톡실린 플록신 사프론(Hematoxylin Phloxine Saffron, HPS)(아래, 스케일 = 100㎛).
B/ 주사 후의 WT의 심장에서 qPCR에 의한 벡터 DNA의 평가.
C/ 주사 후의 WT 야생형 마우스의 심장에서 qPCR에 의한 CAPN3 mRNA의 평가. 선 "H"는 야생형 마우스의 심장에서 내재적인 CAPN3의 mRNA 수준에 대응된다.
D/ 혈청 효소의 분석. 알라닌 아미노전이효소(ALT) 시험은 좌측에 pC3.C3를, 우측에 p206.C3를 처리한 WT 야생형 마우스의 혈청 상에서 수행되었다. 각 상태에 대한 표준 편차 및 평균(SEM)은 각각 원과 수직 바로 표시하였다.
도 6: 인 비보에서 miR-208aT의 활성 분석:
A/ PBS 또는 동량의 벡터 AAV2/9-desm-CAPN3(pdes.C3) 또는 AAV2/9-desmin-CAPN3-miR208aT(pdes.C3-T)의 주사 35일 후의 심장 근육의 조직학 분석, 그리고 시리우스 레드 염색(위, 스케일 = 500㎛) 또는 헤마톡실린 플록신 사프론(Hematoxylin Phloxine Saffron, HPS)(아래, 스케일 = 100㎛).
B/ 주사 후의 WT 야생형 마우스의 심장에서 qPCR에 의한 벡터 DNA 수준(위) 및 CAPN3 이식유전자의 mRNA 수준(아래)의 평가. 선 "H"는 야생형 마우스의 심장에서 내재적인 CAPN3의 mRNA 수준에 대응된다.
C/ PBS 또는 AAV2/9-desmin-CAPN3(pdes.C3) 또는 AAV2/9-desm-CAPN3-miR208aT(pdes.C3-T)로 주사된 WT 마우스의 골격근 및 심장에서 웨스턴 블롯을 통한 칼페인 3의 발현의 분석. 전체 단백질은 화살표로, 분해 산물(60, 58 및 55 kDa)은 고리로 표시된다.
D/ AAV2/9-desmin-CAPN3(pdes.C3) 또는 AAV2/9 desmin-CAPN3-miR208aT(pdes.C3-T)로 주시된 WT 마우스의 심장에서 miR-208a(miR208a), HOP(Hop) 및 코넥신 40(connexin 40, Cnx40)의 mRNA 수준의 정량. 상기 pdes.C3-T 상태에서 RNA의 양은 상기 pdes.C3 상태에서 RNA 수준의 비율로 주어진다.
도 7: 칼페인 3가 결핍된 마우스의 골격근에서 칼페인 3의 전이 효율의 조직학 분석:
A/ PBS 또는 벡터(1.2x1013vg/kg) AAV2/9-desmin-CAPN3-miR208aT(pdes.C3-T), AAV2/9-PC3-CAPN3-miR208aT(pC3.C3-T), AAV2/9-pmiR206-CAPN3 -miR208aT(P206.C3-T) 중 어느 하나로 주사한 4개월 후, C3KO 마우스의 TA 근육의 횡단면이 HPS로 염색되었다. 스케일 = 100㎛.
B/ PBS 또는 벡터(1.2x1013 vg/kg) AAV2/9-desmin-CAPN3-miR208aT(pdes.C3-T), AAV2/9-PC3-CAPN3-miR208aT(pC3.C3-T), AAV2/9-pmiR206-CAPN3-miR208aT(p206.C3-T) 중 어느 하나로 주사된 C3KO 마우스의 TA(좌) 및 PSO(우) 근육에서 HPS로 염색된 단면에서 측정한 중심핵성 섬유의 수(CNF/㎟). P값<0.05인 차이는 별표로 표시된다. TA: 전경골근(tibialis anterior); PSO: Psoas 근육.
본 발명은 표적 조직, 바람직하게는 골격근에서 단백질의 생산을 목적으로 하는 발현 시스템이, 전신 투여 후에, 잠재적으로 독성을 나타내는 다른 조직 및 기관들에서도 동시에 발현을 야기할 수 있어서 상기 시스템을 치료학적 용도로 부적합하게 만든다는 본 발명자들의 확인에 기반한 것이다.
본 발명은 이러한 새롭게 확인된 문제점, 특히 이식유전자의 골격근-특이적 발현과 관련된 심장성 누출(cardiac leakage)에 대한 기술적 해결책을 제시한다.
보다 개괄적으로, 본 발명은 당해 발현 시스템을 위해 하기의 단계를 수반한다:
- 상기 시스템이 독성을 나타내는지 확인하는 단계;
- 독성을 타나내는 조직(들)을 확인하는 단계;
- 이러한 독성을 허용가능한 수준까지 감소시키는 수단을 제공하는 단계.
따라서 본 발명에서 일컬어지는 단백질은 당해 발현 시스템으로부터 발현되었을 때, 적어도 하나의 조직, 특히 비-표적 조직에서 독성을 나타내는 것들이다.
유익하게, 상기 발현 시스템은 신체, 특히 동물, 더욱 바람직하게는 인간에 전신 투여된다.
바람직하게는, 독성 분석은 상기 단백질을 암호화하는 서열의 결함이 있는 본(copy)을 가진 신체, 예컨대 치료될 질병을 가진 신체, 예를 들어 "녹아웃"(Knockout, KO) 동물 모델에서 수행된다. 실제로, 만약 본 발명의 맥락에서 미오튜불라린 또는 칼페인 3를 암호화하는 발현 시스템에 대해 심장 독성이 관찰된다면, 미오튜불라린의 경우에 이는 오직 KO 마우스에서만 검출된다. 다시 말해, 통상의 방법에 따라 건강한 동물에서 수행되는 독성 분석은 이러한 독성을 드러내 보이지 않는다.
따라서 일반적으로 본 발명은 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 발현 시스템에 관한 것으로서, 상기 발현 시스템은
-표적 조직(들)에서 상기 단백질을 치료학적으로 허용가능한 수준으로 발현시키고;
-상기 표적 조직 이외의 조직들, 예컨대 비-표적 조직들에서는 상기 단백질을 독성학적으로 허용가능한 수준으로 발현시킨다.
본 발명에 따르면, 상기 표적 조직은 바람직하게는 상기 단백질이 치료학적 역할을 수행하는, 특히 상기 단백질을 암호화하는 천연 유전자(native gene)에 결함이 있는 조직 또는 기관으로 정의된다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 표적 조직은 가로무늬 골격근을 지칭하고, 이하에서는 횡경막을 포함하는 운동 능력에 관련된 모든 근육을 골격근이라고 한다. 이러한 근육들은 특히 근육병이라고 불리는 질환들에 영향을 받는다. 다른 잠재적인 표적 조직은 역시 신경근 질환에 영향을 받는 말초 신경 조직이다. 따라서 상기 표적 조직은 유익하게 골격근 및/또는 말초 신경 조직을 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 비-표적 조직은 바람직하게는 상기 단백질이 수행할 치료학적 역할이 없고, 선택적으로 내재적인 양을 초과하는 상기 단백질의 존재가 해롭거나 심지어는 치명적이어서 독성을 나타내는 것으로 판명될 수 있는 조직 또는 기관으로 정의된다.
본 발명의 맥락에서, 이러한 잠재적인 독성으로부터 보호될 조직은 바람직하게
- 심장 또는 심장 가로무늬 근육;
- 간;
- 뇌;
- 폐;
- 신장; 및/또는
- 민무늬근, 특히 위장관이다.
이들은 상기 유전자 발현 시스템이 축적되는 경향이 있는, 생명 유지에 필수적인 기관 또는 조직이다.
본 발명의 맥락에서, 심장 근육은 적어도 미오튜불라린 및 칼페인 3에 대해 특별한 중요성을 나타내는 조직으로 보인다. 특정 구현예에 따르면, 상기 발현 시스템은 심장에서 상기 단백질을 독성학적으로 허용가능한 수준으로 발현시킨다.
따라서 특정 측면에 따르면, 본 발명은 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 발현 시스템에 관한 것이고, 상기 발현 시스템은
- 골격근 및/또는 말초 신경 조직을 포함하는 표적 조직에서 상기 단백질을 치료학적으로 허용가능한 수준으로 발현시키고;
- 상기 표적 조직 이외의 조직, 특히 심장에서는 상기 단백질을 독성학적으로 허용가능한 수준으로 발현시킨다.
제1 특징부에 따르면, 본 발명의 발현 시스템은 단백질을 암호화하는, 이식유전자에 대응되는 서열을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "이식유전자"는 서열, 바람직하게는 본 발명의 발현 시스템을 이용하여 전이될 수 있도록 제공된 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 의미한다.
특정 구현예에 따르면, 상기 서열은 상기 발현 시스템이 도입되는 신체의 게놈에 존재하는 내재적인 서열과 동일 또는 동등한 본이다. 다른 특정 구현예에 따르면, 상기 내재적인 서열은 상기 단백질이, 특히 표적 조직, 예컨대 골격근에서, 부분적으로 또는 전체적으로 비-기능적이거나 또는 심지어 부존재(상기 내재적인 단백질의 발현 또는 활성이 결핍)하도록 만드는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 가진다. 다시 말해서, 바람직하게 본 발명의 발현 시스템은 상기 단백질을 암호화하는 서열의 결함이 있는 본(copy)을 가진 개체 및 관련 병리를 가진 개체에 투여될 것을 목적으로 한다. 따라서 이러한 맥락에서 본 발명의 발현 시스템에 포함된 상기 서열에 의해 암호화되는 단백질은 그 자체의 돌연변이가 신경근 장애를 초래하는 단백질로 정의될 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 본 발명의 발현 시스템이 투여되는 개체에서 (그것의 발현 또는 활성의 측면에서) 결함이 있는 단백질의 부전(failure)을 "보완"할 수 있는 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다.
따라서 신경근 병리와 관련된 예로는:
- 유트로핀(utrophin)이 돌연변이되고 결함이 있는 디스트로핀(dystrophin) 대신에 이용될 수 있다;
- 디코린(decorin), 피브로모듈린(fibromodulin) 및 루미칸(lumican)이 신경근 질환의 경우에 관찰되는 근소모를 보완할 수 있다;
- 액티빈(activin)이 상기 단백질의 돌연변이가 원인이 아닌 질환에서 근육량을 증가시킬 수 있다.
따라서 보다 일반적으로 본 발명의 발현 시스템에 포함되는 서열은 신경근 질환의 맥락에서 치료학적 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 것으로 정의될 수 있다. 치료학적 활성의 개념은 "치료학적으로 허용가능한 수준"이라는 용어와 관련하여 하위에 있는 것으로 정의된다.
상기 단백질을 암호화하는 서열은 핵산 서열이고, 특히 DNA(deoxyribonucleic acid), RNA(ribonucleic acid) 또는 cDNA(complementary deoxyribonucleic acid)일 수 있다.
유익하게, 상기 서열은 기능성 단백질, 예컨대 특히 골격근에서 그 자체의 본래 또는 필수적인 기능을 할 수 있는 단백질을 암호화한다. 각각의 목적 단백질에 따라 원하는 활성 및 이러한 활성을 얻는데 필요한 서열이 정의될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 서열은 천연 단백질을 암호화하고, 상기 단백질은 바람직하게는 인간 유래이다. 또한 상기 서열은 원하는 활성을 유지한 채 제공되는, 상기 단백질의 유도체(derivative) 또는 단편(fragment)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 용어 "유도체" 또는 "단편"은 목적 단백질의 인간에서의 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 또는 심지어 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 가지는 단백질 서열을 일컫는다. 예를 들어, 다른 기원(비-인간 포유동물 등)에서 유래되거나, 절단(truncated) 또는 심지어 돌연변이되었지만, 활성인 단백질도 선정될 수 있다. 따라서 본 발명의 맥락에서 상기 용어 "단백질"은 그 유도체 및 단편 뿐만 아니라, 그것의 기원에 관계없이 전장의 단백질로 이해된다.
본 발명의 맥락에서, 골격근 및/또는 말초 신경 조직에 영향을 줄 수 있는 신경근 질환을 치료학적으로 치료할 수 있는 단백질이 모두 망라된다. 보다 바람직하게는, 일반적으로 "근육병"이라고, 불리는 골격근에 영향을 주는 질환의 치료학적 치료를 가능하게 하는 단백질을 일컫는다.
특정 측면에서, 상기 질환들은 상기 단백질의 비-생산 또는 비-기능성 단백질의 전체 또는 부분적인 생산을 야기하는 적어도 하나의 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발된다. 본 발명에 따르면, 상기 발현 시스템은 상기 단백질을 활성 형태 및 천연 단백질의 부존재를 적어도 부분적으로 보완할 수 있는 양으로, 또는 상기 천연 단백질의 부존재를 보완할 수 있는 다른 단백질을 생산할 수 있다. 따라서 상기 발현 시스템의 투여는 표적 조직(들), 특히 골격근에서, 운동성 및 호흡의 측면에서 정상적인 표현형을 개선 또는 복구할 수 있도록 한다.
본 발명의 맥락에서 특별히 유용한 단백질은 인간 유래의 미오튜불라린(서열번호 1), 쥐과(murine)의 미오튜불라린(서열번호 2) 또는 개과(canine)의 미오튜불라린(서열번호 3)이다. 상기와 같은 단백질, 이들의 치료학적 기능성 유도체 또는 단편을 암호화하는 모든 서열이 본 발명의 발현 시스템의 일부로 이용될 수 있다. 따라서 그 예로, 대응되는 염기 서열(cDNA)은 각각 서열번호 4, 5(또는 14) 및 6의 서열이다.
알려진 대로, MTM1 유전자에의 돌연변이는 근세관성 근육병이라고 불리는 근육 질환(MTM 또는 XLMTM)을 유발한다. 따라서 상기 유전자를 대체 또는 전이하는 전략에 따라, 치료학적 미오튜불라린, 예를 들어 천연 단백질을 암호화하는 서열을 전이가능한 형태로 제공하는 것은 이러한 병리를 치료하는데 도움을 준다.
다른 구현예에서, 목적 단백질은 그것의 돌연변이가 특히 2A형 지대형 근디스트로피{LGMD 2A 또는 칼페인돌연변이증(calpainopathy), OMIN 253600}로 불리는 상염색체 열성 유전 질환을 야기하는 칼페인 3(CAPN3)이다. 예를 들어, 인간 칼페인 3는 서열번호 7의 서열을 가진다. 따라서 상술한 바와 같이, 치료학적 칼페인 3, 예를 들어 서열번호 7의 서열 또는 그의 유도체 또는 단편을 암호화하는 모든 서열이 본 발명의 발현 시스템에 존재할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 8에 기재된 cDNA 서열, 또는 그의 오픈 리딩 프레임에 대응되는 307번째 내지 2772번째의 염기 서열일 수 있다.
다음은 본 발명에서 일컫는 골격근에 영향을 주는 질병과 관련된 단백질의 비제한적인 목록이다: 사코글리칸(Sarcoglycan)(α, β, γ, δ), 디스트로핀(Dystrophin), 디스페린(Dysferlin)(DYSF), 셀레노프로테인 1(Selenoprotein 1)(SEPN1), 암피피신 2(Amphiphysin 2)(BIN1), 디나민 2(dynamin 2)(DNM2), 코필린 2(cofilin 2)(CFL2), 트로포닌 T(troponin T)(TNNT1), 트로포미오신 3(tropomyosin 3)(TPM3), ACTA1, 콘택틴 1(contactin 1)(CNTN1), TRIM32, 랩신(Rapsyn)(RASPN), DOK7, 아그린(Agrin)(AGRN), COLQ, CHAT, 아세틸콜린 수용체(acetylcholine receptors)(CHRNE, CHRNA1, CHRNB1, CHRND), GFPT1, MUSK.
특정 구현예에 따르면, 본 발명의 발현 시스템에 포함된 서열은 사코글리칸 패밀리의 단백질, 특히 α-사코글리칸, 또는 더욱 특별히 Mendell et al. (Annals of Neurology, Vol. 68, No 5, pp 629-638, 2010) 논문에서 설명된 서열을 암호화하지는 않는다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명의 발현 시스템에 포함된 서열은 미니디스트로핀을 포함하는 디스트로핀-유사 단백질 및 특히 Wang et al. (Gene Therapy, Vol. 15, No 22, pp 1489-1499, 2008) 논문에서 설명된 서열을 암호화하지는 않는다.
더욱 일반적으로, 본 발명은 발현 시스템으로부터 단백질의 생산이 적어도 하나의 조직, 바람직하게는 비-표적 조직, 특히 심장, 보다 구체적으로는 심장, 간, 뇌, 폐, 신장 및 민무늬근의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 조직에서 독성을 나타낸다면, 신경근 질환에 치료학적 활성을 갖는, 예를 들어 그것의 돌연변이가 하나 이상의 표적 조직에서 질환을 유발하는 모든 단백질과 관련이 있다.
본 발명에 따르면, 유익하게, 상기 발현 시스템은 표적 조직, 바람직하게는 골격근 및/또는 말초 신경 조직에서 상기 단백질을 치료학적으로 허용가능한 수준으로 발현시킬 수 있어야 한다.
또한, 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 발현 시스템은 비-표적 조직, 특히 심장에서 상기 단백질을 독성학적으로 허용가능한 수준으로 발현시킬 수 있어야 한다.
본 발명의 맥락에서, "단백질 발현"이라는 용어는 "단백질 생산"으로 이해될 수 있다. 따라서 상기 발현 시스템은 상기 정의된 수준으로 상기 단백질을 전사 및 번역을 모두 할 수 있어야 한다.
본 발명의 맥락에서, "치료학적으로 허용가능한" 및 "독성학적으로 허용가능한" 것으로 정의된 수준은 단백질의 양뿐만 아니라 단백질의 활성에 관한 것이다.
당해 조직에서 생산된 단백질의 양의 평가는 상기 단백질에 대한 항체를 이용하는 면역검출법, 예들 들어 웨스턴 블롯 또는 ELISA에 의해 수행될 수 있다. 또는, 대응되는 메신저 RNA가 예를 들어 PCR 또는 RT-PCR에 의해 정량화될 수 있다. 이러한 정량은 하나 또는 여러 개 조직의 샘플 상에서 수행될 수 있다. 따라서 표적 조직이 골격근인 경우에는 한 종류의 근육 또는 다양한 종류의 근육(예를 들어, 대퇴사두근(quadriceps), 횡경막(diaphragm), 전경골근(tibialis anterior), 삼두근(triceps) 등)에서 수행될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "치료학적으로 허용가능한 수준"이라는 용어는 본 발명의 발현 시스템으로부터 생산된 단백질이 환자의 병리 상태를, 특히 수명 및 삶의 질의 관점에서 개선시키는 것을 의미한다. 따라서 골격근에 영향을 주는 질환과 관련하여, 본 발명은 상기 질환에 의해 영향을 받은 개체의 근육 상태를 개선시키거나 또는 건강한 개체의 근육과 유사한 근육 표현형으로 복구시키는 과정을 수반한다. 상술한 바와 같이, 근육 상태, 바람직하게는 근육의 세기, 크기, 조직학 및 기능에 의해 정의되는 근육 상태는 다음의 방법 중 하나로 평가될 수 있다: 생체 검사(biopsy), 근력, 근긴장, 근부피, 또는 근육의 운동성 측정, 임상 시험, 의료 영상, 바이오마커, 등
따라서 골격근에 관한 치료 효과를 분석하고 치료 후의 다른 시점에서 평가할 수 있는 기준은 특히
- 증가된 기대 수명;
- 증가된 근력;
- 개선된 조직학; 및/또는
- 개선된 횡경막의 기능성이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "독성학적으로 허용가능한 수준"은 본 발명의 발현 시스템으로부터 생산된 상기 단백질이 비-표적 조직에, 특히 조직학적으로, 생리학적으로 및/또는 기능적으로 심각한 변형을 일으키지 않는 것을 일컫는다. 특히, 상기 단백질의 발현은 치명적이지 않을 수 있다. 유익하게, 비-표적 조직에서 생산되는 단백질의 양은, 특히 건강한 개체와 대비하였을 때, 그 조직에서 상기 단백질의 내재적인 수준을 초과하지 않는다. 상술한 바와 같이, 조직에서의 독성은 조직학적으로, 생리학적으로 그리고 기능적으로 평가될 수 있다. 설명을 위해 특별히 심장의 경우를 예로 들면, 단백질의 모든 독성은 심장 기능 및 형태의 연구, 임상 검사, 전기생리학, 영상화, 바이오마커, 기대수명의 모니터링 또는 예를 들어 시리어스 레드 또는 헤마톡실린/에오신으로 염색함으로써 섬유화 및/또는 셀룰로오스 침투의 검출을 포함하는 조직학적 분석에 의해 평가될 수 있다.
유익하게, 본 발명에 따른 발현 시스템의 효능 및/또는 독성의 수준은 동물에서, 더욱 바람직하게는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 결함이 있는 본을 가져서 관련 병리에 의해 영향을 받은 동물에서 인 비보 상태로, 평가된다.
바람직하게는, 상기 발현 시스템은 예를 들어 정맥내 주사로 전신 투여된다.
본 발명에 따르면, 바람직하게 본 발명의 발현 시스템이
- 비-표적 조직에서, 특히 상기 단백질의 발현이 독성을 나타내는 비-표적 조직에서는 상기 단백질의 발현을 방지하거나 발현 수준을 감소시키고/시키거나;
- 표적 조직에서는 상기 단백질의 발현을 유지하거나 발현 수준을 증가시키는 적어도 하나의 서열을 포함한다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명은
- 골격근 및/또는 말초 신경 조직 이외의 조직, 바람직하게는 상기 단백질의 발현이 독성을 나타내는 조직에서 상기 단백질의 발현을 방지하거나 발현 수준을 감소시키고/시키거나;
- 골격근 및/또는 말초 신경 조직에서 상기 단백질의 발현을 유지하거나 발현 수준을 증가시키는 적어도 하나의 서열을 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "발현을 방지한다"는 표현은 바람직하게 상기 서열의 부존재 하에서도 발현이 없는 경우를 일컫고, 용어 "발현 수준을 감소시킨다"는 표현은 상기 서열의 제공에 의해 발현이 감소하는(또는 줄어드는) 경우를 일컫는다.
유사하게, 용어 "발현을 유지한다"는 표현은 바람직하게 상기 서열의 부존재 하에서도 동등한 수준의 발현이 있는 경우를 일컫고, 용어 "발현 수준을 증가시킨다"는 표현은 상기 서열의 제공에 의해 발현이 증가하는 경우를 일컫는다.
본 발명의 맥락에서, 원하는 목적을 달성하기 위하여 조합될 수 있는 적어도 세 가지 방법이 있다:
- 표적 조직(들)에서는 상기 단백질의 발현을 감소시키지 않으면서, 비-표적 조직에서 상기 단백질의 발현을 방지하거나 발현 수준을 감소시킬 수 있는 서열을 이용하는 방법;
- 표적 조직에서는 높은 수준의 발현을, 비-표적 조직, 특히 상기 단백질의 발현이 독성을 나타내는 것으로 보이는 조직에서는 낮은 수준의 발현 또는 전혀 발현되지 않는 것을 보장할 수 있는 프로모터 서열의 이용;
- 비-표적 조직, 특히 상기 단백질의 발현이 독성을 나타내는 것으로 보이는 조직에 대해서 보다, 표적 조직(들)에 대해서 더 높은 적절한 굴성(tropism)을 가지는 벡터, 바람직하게는 바이러스성 벡터의 이용.
적절하게, 본 발명의 발현 시스템은 상기 단백질을 암호화하는 서열의 전사를 통제하는, 바람직하게는 이식유전자의 5'에 위치하여 그것에 기능적으로 연결된 프로모터 서열을 포함한다. 바람직하게, 이것은 표적 조직, 특히 골격근에서 상기 단백질의 치료학적으로 허용가능한 수준으로의 발현을 보장한다.
이것은 유도성(inducible) 또는 항시성(constitutive), 천연 또는 합성(인공)의 프로모터를 포함할 수 있다. 유사하게, 이들은 인간을 포함하여, 이식유전자와 동일한 유래 또는 다른 유래의 임의의 유래의 것일 수 있다.
제1 구현예에 따르면, 프로모터 서열은 도처에 존재하거나(ubiquitous) 또는 비-선택적 프로모터, 다시 말해 조직 특이성이 낮아 광범위하게 다른 조직들, 표적 및 비-표적 조직들 모두에서 비슷한 발현 수준을 나타내는 프로모터에 대응된다. 다음의 것들이 예로서 인용될 수 있다: 시토메갈로바이러스 프로모터(cytomegalovirus promoter)(pCMV), Mtm1 프로모터.
특정 구현예에 따르면, 이는 골격근 및/또는 말초 신경 조직에 적합하지만, 다른 조직, 특히 다른 근육에서 발현될 수 있는 프로모터를 의미한다. 다음의 것들이 예로서 인용될 수 있다: 데스민(desmin) 프로모터, 바람직하게는 서열번호 11의 서열, 골격 알파-액틴(skeletal alpha-actin) 프로모터, 근크레아틴인산화효소(muscle creatine kinase, MCK) 프로모터, C5-12 합성 프로모터, 시냅신 Ⅰ(the synapsin Ⅰ, Syn) 프로모터 또는 CK6 프로모터. 골격근과 관련해서는, 다른 것들도 인용될 수 있다: 트로포닌(troponin), Myf5(myogenic factor 5), MLC1/3f(myosin light chain 1/3 fast), MyoD1(myogenic differentiation 1), Myog(myogenin), Pax7(paired box gene 7), MEF2 프로모터. 말초 신경 조직과 관련해서는, P0 및 MBP(Myelin Basic Protein) 프로모터도 인용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 발현 시스템의 프로모터 서열은 표적 및 비-표적 조직 간을 차별화시키는, 본 발명의 경우에는 표적 조직에서 더욱 우수한 프로모터 활성에 따라 선택된다. 본 발명의 경우에는, 이러한 서열이 표적 조직, 바람직하게는 골격근 및/또는 말초 신경 조직에서 상기 단백질의 발현을 증가시키는 반면, 비-표적 조직, 특히 상기 단백질이 독성을 나타내는 조직에서는 발현을 방지한다.
예를 들어, 상기 표적 조직이 골격근인 경우에 상기 프로모터는 바람직하게 근육-특이적 프로모터이다. 다른 유익한 특징에 따르면, 상기 프로모터는 비-표적 조직, 특히 심장에서는 낮은 프로모터 활성 또는 프로모터 활성을 전혀 나타내지 않아서, 이러한 조직들에서는 상기 단백질의 발현이 독성학적으로 허용가능한 수준으로 된다.
특정 구현예에 따르면, 상기 프로모터 서열은 칼페인 3 유전자의 프로모터, 바람직하게는 인간 유래의, 더욱 바람직하게는 서열번호 12의 서열에 대응될 수 있다. 다른 적절한 프로모터 서열은 miRNA 206(miR206)의 프로모터, 바람직하게는 인간 유래의, 더욱 바람직하게는 서열번호 13의 서열이다.
따라서 본 발명의 범위 내에서는, 적어도 칼페인 3의 경우에, 상기 단백질을 암호화하는 서열이 칼페인 3 또는 miRNA 206 프로모터의 조절 하에 위치하도록 포함하는 발현 시스템은 골격근에서 상기 단백질을 약학적으로 허용가능한 수준으로, 심장 및 간에서 상기 단백질을 독성학적으로 허용가능한 수준으로 발현하도록 보장할 수 있다.
따라서 본 발명은, 다른 측면에서, 단백질을 암호화하는 서열을 서열번호 12 또는 서열번호 13의 서열을 갖는 프로모터의 조절 하에 위치하도록 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다. 상기 서열번호 12 및 서열번호 13의 서열에서 유래한 프로모터 서열, 또는 이들의 단편에 대응되나 유사한 프로모터 활성을 가지는 서열은 조직 특이성 및 선택적으로 효율성 측면에서, 역시 본 발명의 범위 내에 포함된다.
이러한 프로모터 서열이 비-표적 조직에서 상기 단백질을 독성학적으로 허용가능한 수준으로 발현할 수 없는 경우에, 이는 유익하게 상기 비-표적 조직, 바람직하게는 상기 단백질의 발현이 독성을 나타내는 비-표적 조직에서 상기 단백질의 발현 수준을 감소시키는 기능을 갖는 서열과 관련된다.
따라서, 예를 들어, 미오튜불라린 및 칼페인 3 모두의 경우에, 데스민 프로모터의 이용은 심장 독성을 나타내었다. 반면에, 본 발명에 따르면, miRNA-208a의 적어도 하나의 표적 서열과 관련된 데스민 프로모터, 바람직하게는 서열번호 11의 서열, 바람직하게는 서열번호 10의 서열은
- 표적 조직, 바람직하게는 골격근에서 상기 단백질의 발현이 치료학적으로 허용가능한 수준이 되고;
- 비-표적 조직, 바람직하게는 심장 또는 간에서 상기 단백질의 발현이 독성학적으로 허용가능한 수준이 되도록 한다.
상술한 바와 같이, 상기 서열은 비-표적 조직, 바람직하게는 상기 단백질의 발현이 독성을 나타내는 비-표적 조직에서 상기 단백질의 발현을 방지하거나 또는 발현 수준을 감소시킬 수 있다. 이러한 작용은 다양한 기작, 특히
- 상기 단백질을 암호화하는 서열의 전사 수준에 관한;
- 상기 단백질을 암호화하는 서열의 전사에 의해 생성되는 전사체에 관한, 예컨대 그것들의 분해(degradation)를 통해;
- 상기 전사체의 단백질로의 번역에 관한 기작에 따라 일어날 수 있다.
그러한 서열은 바람직하게 하기 군으로부터 선택되는 작은 RNA 분자들에 대한 표적이다:
- 마이크로 RNAs;
- 내재적인 작은 간섭 RNA 또는 siRNAs;
- 운반 RNA(tRNA)의 작은 단편;
- 유전자간 부위(intergenic regions)의 RNA;
- 리보솜 RNA (rRNA);
- 작은 핵 RNA (Small nuclear RNA, snRNA);
- 작은 인 RNAs(Small nucleolar RNAs, snoRNA);
- piwi 단백질과 상호작용하는 RNA(piRNA);
- ...
유익하게, 이러한 서열은 표적 조직(들), 바람직하게는 골격근에서 상기 단백질의 발현을 유지하거나, 또는 심지어는 발현 수준을 증가시킨다.
바람직하게, 그러한 서열은 상기 단백질의 발현이 독성을 나타내는 비-표적 조직에서의 그것의 효율성을 위해 선택된다. 이러한 서열의 효율성이 조직에 따라 변할 수 있기 때문에, 독성이 증명된 모든 표적 조직에서 그것들의 효율성을 위해 선택된 이러한 서열들 몇몇을 조합할 필요가 있을 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 이러한 서열은 마이크로RNA(miRNA)를 위한 표적 서열이다. 알려진 바와 같이, 그와 같이 신중하게 선택된 서열은 선택된 조직에서 유전자의 발현을 특히 억제한다.
따라서 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 발현 시스템이 상기 단백질이 독성을 나타내는 비-표적 조직(들), 예를 들어 심장에서 발현되거나 존재하는 마이크로RNA(miRNA)에 대한 표적 서열을 포함한다. 적절하게, 상기 표적 조직, 바람직하게는 골격근에 존재하는 이러한 miRNA의 양은 비-표적 조직에 존재하는 것보다 적거나, 또는 심지어 이러한 miRNA는 상기 표적 조직에서 발현되지 않을 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 상기 표적 miRNA는 특히 심장과 같은 비-표적 조직에서 발현된다.
당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 당해 조직에서 miRNA의 존재 또는 발현 수준은 PCR, 바람직하게는 RT-PCR 또는 노던 블롯에 의해 평가될 수 있다.
다른 miRNA들뿐만 아니라 그들의 표적 서열 및 그들의 조직 특이성이 확인되어 당업자들에게 알려졌고, 예를 들어 문헌 WO2007/000668에 개시되어 있다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명의 발현 시스템은 miRNA-208a(miR208a이라고도 알려짐, 서열번호 9)의 표적 서열을 포함한다. 바람직하게는, 인간, 개 및 마우스에서 동일한 이러한 서열은 22bp의 서열번호 10의 서열을 갖는다. 물론, miRNA-208a에 의해 인식되는 모든 유도되거나 잘린 서열은 본 발명의 일부로서 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위 내에서, 미오튜불라린 및 칼페인 3 모두와 관련해서, 이러한 표적 서열의 이용은 그것들의 심장 독성의 문제점 또는 심지어 칼페인 3의 경우에는 간 독성의 문제점을 해결할 수 있다.
상술한 바와 같이, 마이크로RNA의 표적 서열은 단일로 또는 다른 서열들, 유익하게는 동일 또는 상이할 수 있는 마이크로RNA에 대한 표적 서열과 조합되어 이용될 수 있다. 이러한 서열들은 나란하거나 또는 반대 방향으로 이용될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 miRNA-208a의 표적 서열의 경우, 한 개 이상, 바람직하게는 두 개 또 네 개의 서열이 실시될 수 있다. 바람직하게는, 그것들이 나란한 방향, 즉 모두가 동일한 방향으로 이용된다. 복수 개의 표적 서열이 실시되는 경우에, 그것들은 당업자들에게 알려진 방법에 따라 무작위 서열의 DNA 스페이서에 의해 분리될 수 있다.
바람직하게는, miRNA, 특히 miR208a의 표적 서열의 경우에, 상기 단백질을 암호화하는, 바람직하게는 상기 단백질을 암호화하는 cDNA 서열의 3'에 위치, 더욱 유리하게는 발현 시스템의 3'UTR("Untlanslated Region")에 삽입된다. 더욱 바람직하게는, 발현 시스템이 상기 단백질을 암호화하는 cDNA의 3'에 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal)를 포함하는 경우, 이러한 서열은 오픈 리딩 프레임의 종결 코돈과 상기 폴리아데닐화 신호 사이에 삽입된다.
본 발명의 맥락에서, 적어도 하나의 miRNA-208a의 표적 서열은 적어도 심장에서 특히 미오튜불라린 및 칼페인 3와 관련된 단백질을 독성학적으로 허용가능한 수준으로 얻기 위해 채용된다.
특정 구현예에 따르면, 발현 시스템은
- 프로모터, 바람직하게는 데스민, 더욱 바람직하게는 인간 데스민의 프로모터(서열번호 11)의 조절 하에 위치된 미오튜불라린을 암호화하는 서열;
- 심장에서 발현된 miRNA, 바람직하게는 miRNA-208a의 적어도 하나의 표적 서열, 바람직하게는 서열번호 10의 서열과 같은 단일 표적 서열을 포함한다.
다른 특정 구현예에서, 발현 시스템은
- 프로모터, 바람직하게는 데스민, 더욱 바람직하게는 인간 데스민의 프로모터(서열번호 11), 또는 칼페인 3의 프로모터, 더욱 바람직하게는 인간 칼페인 3의 프로모터(서열번호 12), 또는 miRNA206의 프로모터, 더욱 바람직하게는 인간 miRNA206의 프로모터(서열번호 13)의 조절 하에 위치된 칼페인 3를 암호화하는 서열;
- 심장에서 발현되는 miRNA, 바람직하게는 miRNA-208a의 적어도 하나의 표적 서열, 더욱 바람직하게는 나란한 두 개의 표적 서열을 포함한다.
따라서 상술된 다른 종류의 서열들이 동일한 발현 시스템 내에서 조합될 수 있다.
본 발명에 따르면, 발현 시스템 또는 발현 카세트가 존재하는 전이 유전자의 발현을 위해 필요한 구성들을 포함한다. 이식유전자 발현을 보장 및 조절하기 위해, 상기 정의된 것과 같은 서열에 더하여, 그러한 시스템은 다음과 같은 다른 서열들을 포함할 수 있다:
- 폴리아데닐화 신호, 예들 들면 바람직하게는 암호화 서열의 3' 또는 miRNA의 표적 서열의 3'에 삽입된 SV40 또는 인간 헤모글로빈의 폴리A;
- 인간 헤모글로빈의 인트론 1과 같이 전사체를 안정화시키는 서열;
- 증폭자(enhancer) 서열;
- ...
본 발명에 따른 발현 시스템은 특히 인간의 세포, 조직, 또는 신체 내로 도입될 수 있다. 당업자에게 알려진 방법으로, 상기 도입은 엑스 비보 또는 인 비보 상태에서, 예를 들어 형질 감염 또는 형질 도입에 의해 수행될 수 있다. 따라서 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 발현 시스템을 포함하는 바람직하게는 인간 유래의 세포 또는 조직을 포괄한다.
본 발명에 따른 발현 시스템이 분리된 핵산인 경우에는 네이키드 DNA(naked DNA)의 형태로 개체에 투여될 수 있다. 이러한 핵산은 세포 내로의 도입을 촉진하기 위해 콜로이드성 분산 시스템(거대분자 복합체, 나노캡슐, 미립구, 비드) 또는 액체-기반 시스템(유-중-수 현택액, 마이셀, 리포좀)과 같은 다양한 화학적 수단과 조합될 수 있다.
대안으로, 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 발현 시스템은 플라스미드 또는 벡터를 포함한다. 유익하게, 그러한 벡터는 바이러스성이다. 인간을 포함한 포유동물에서 유전자 치료에 많이 이용되는 바이러스성 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러한 바이러스성 벡터는 바람직하게는 다음의 목록으로부터 선택될 수 있다: 헤르페스(herpes) 바이러스로부터 유래된 벡터, 바큐로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스성 벡터, 및 아데노-관련 바이러스성 벡터(AAV).
바람직하게는, 천연 혈청형(serptype)(AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 및 AAV9), 그들의 변형체 또는 인공 혈청형에 대응되는 아데노-관련 바이러스성 벡터(AAV)이다. 당업자에게 달려진 방식으로, 키메라 AAV 벡터가 실시될 수도 있다.
바람직하게는, 본 발명의 발현 벡터는 AAV 벡터의 두 개의 ITR("Inverted Terminal Repeat") 서열의 사이에 삽입된다.
본 발명의 발현 시스템이 완전히 적용될 수 있는 곳으로의 전신 투여와 관련하여, 혈청형 8 또는 9의 AAV 벡터가 특히 바람직하다. 예를 들어, 이는 AAV2/8 또는 AAV2/9 벡터를 포함할 수 있다.
당업자에게 알려진 방법으로, 예를 들어 HEK293 세포의 트리-형질감염(tri-transfection) 또는 바큐로바이러스 시스템에 의해 재조합 바이러스 입자들이 얻어질 수 있다. 벡터 역가는 통상적으로 밀리리터당 바이러스 게놈(vg/㎖)으로 표현된다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 발현 시스템은 적절한, 이 경우에는 비-표적 조직에서보다 표적 조직(들), 특히 상기 단백질의 발현이 독성을 나타내는 조직에서 더 높은 굴성을 가지는 벡터를 포함한다. 이것은 심장과 같은 비-표적 조직으로 최소한의 표적화성(targeting)/형질도입성(transducing) 또는 표적화성/형질도입성을 전혀 나타내지 않거나, 또는 특히 골격근과 같은 표적 조직에 특히 표적화성/형질도입성을 나타내는 것으로 선택된 캡시드(capsid)를 포함하는 AAV 벡터일 수 있다.
상술한 바로부터 명확히 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 발현 시스템, 특히 재조합 AAV 벡터 또는 재조합 바이러스 입자의 형태인 발현 시스템은 특히 치료 분야에서 명백한 용도를 가진다.
따라서 다른 측면에 따르면, 본 발명은 약물로서 설명된 발현 시스템의 용도와 관련된 것이다. 다시 말해서, 상기 발현 시스템을 포함하는 약학적 조성물도 포함된다는 것이다. 적절하게, 그것은 약학적으로 허용가능하고 불활성의, 바람직하게는 전신 투여, 예컨대 정맥내 투여에 적용될 수 있는 담체를 더 포함할 수 있다. 다양한 부형제, 안정화제 및 당업자에게 알려진 다른 적절한 화합물들이 상기 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명은 표적 조직에 국소적으로 투여가 되지 않는 대신 일반적으로 몸 전체에서 비-표적 조직으로의 전달을 초래하는 경우에, 설명된 발현 시스템의 유용성이 나타난다.
따라서 바람직하게, 본 발명에 따른 발현 시스템은 다음 경로들 중 하나로 투여된다: 장내, 비경구, 경구, 정맥내, 동맥내 및 흡입.
바람직하게는, 그것은 전신 투여, 더욱 바람직하게는 정맥내 주사이다. 전신 투여가 치료 영역 근처, 예를 들면 골격근 근처에서 수행될 수 있다.
구현예의 특정 형태에 따르면, 그것은 국소 투여가 아니다. 따라서 더욱 특별히, 다음의 것들이 배제될 수 있다: 혈관내, 특히 예를 들어 Petrov 등(Methods Mol Biol 2011; 709: 277-86)에서 설명된 (표적 근육에 가까이에 압박대의 존재 및 가압 하에서 수행되는) 정맥내 주사 또는 예를 들어 Gonin 등(J Gene Med 2005; 7: 782-791)에서 설명된 (확산을 방지하기 위해 동맥 상류 근처에서의 정맥 클램핑하고 동맥에 카테터를 넣은 채 수행되는) 동맥내 주사.
주사되는 것인 경우, 본 발명의 조성물은 액체 형태일 수 있다. 본 발명의 발현 시스템의 경우, 활성 농도, 주사되는 양 및 주사 빈도는 당업자에 의해 결정된다. 단일 투여가 충분할 수 있다. 바람직하게는, 치료 효과가 적어도 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 5년 또는 그 이상의 기간 동안 관찰된다.
상기 약물들은 유전자 치료, 특히 신경근 장애, 더욱 바람직하게는 골격근에 주로 영향을 미치는 질환(근육병)의 치료를 목적으로 한다. 더욱 일반적으로, 본 발명은 개체에서 근육 기능을 개선시킨다.
치료되는 환자들은 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이다.
본 발명의 맥락에서 일컬어지는 질환은 특히 근육병, 더욱 정확하게는 X-연관 근세관성 근육병(XLMTM)이다. 더욱이, 샤리코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease)의 일부 형태와 같이, 미오튜불라린과 연관된 다른 중심핵성 근육병(centronuclear myopathy) 및 신경근 질환이 치료될 수 있다.
2A형 지대형 근디스트로피 또한 본 발명의 발현 시스템으로 치료될 수 있다.
더욱 일반적으로, 본 발명에 포함되는 질환의 비-제한적인 목록은 다음과 같다:
셀레노프로테인 N 결핍성 선천성 근디스트로피, 1차 메로신(primary merosin) 결핍성 선천성 근디스트로피, 울리히(Ullrich) 선천성 근디스트로피, 뒤센형(Duchenne) 또는 베커형 근디스트로피(DMD 또는 BMD), 중심핵 선천성 근육병, 다발심(multi-minicore) 선천성 근육병, 중심핵성 상염색체성 근육병, 섬유 불균형성 근육병, 네말린(nemaline) 근육병, 선천성 근무력 증후군(congenital myasthenic syndromes), 미오튜불라린과 연관된 신경근 질환, 2B형 또는 2D형 지대형 근디스트로피, 미요시 말단 근육병(miyoshi distal myopathy), 디스페린돌연변이증(dysferlinopathy), 사코글리칸병(sarcoglycanopathy).
구현예의 특정 형태에 따르면, 병리는 뒤센형 또는 베커형 근디스트로피(DMD 또는 BMD) 또는 심지어 LGMD2D가 아니다.
따라서 본 발명의 약물에 의해 환자의 상태의 호전 및 삶의 질과 수명의 연장이 모두 예상되는 반면, 그러한 치료에 의해 다른 조직에서의 잠재적인 부작용은 감소된다.
실시예로 설명되는 바와 같이, 본 발명은 근육 질환의 유전자 치료의 잠재적인 심장 독성의 문제점을 해결할 수 있는 기술적 해결책을 제시한다.
[실시예]
본 발명 및 그로부터 발생되는 이점은 하기에서 구현된 실시예들과 첨부된 도면으로 더욱 잘 이해될 것이다. 그러나 이것들이 전부는 아니다.
본 발명은 미오튜불라린(MTM1)과 칼페인 3(CAPN3) 유전자와 관련되어 설명된다. 그러나 설명된 전략은 심장 독성을 나타내는, 골격근에서의 목적 단백질을 암호화하는 모든 이식유전자에 적용될 수 있다.
재료 및 방법
1) 재조합 AAV 벡터의 생성:
벡터 혈청형 2 AAV에, 인간 데스민 프로모터(서열번호 11)의 하류에 쥐과 Mtm1 유전자(서열번호 14)의 오픈 리딩 프레임을 클로닝하여 벡터 rAAV-Des-Mtm1를 제조하였다. 각각이 DNA 스페이서에 의해 분리된, 22bp의 miRNA-208a(서열번호 10)의 표적 서열(1, 2 또는 4개의 서열, miRHT1, miRTH2 및 miRHT4, 각각)을 Mtm1 cDNA의 3' UTR 부분에 추가하였다. 대조군으로서 빈 벡터(rAAV-Des-MCS)도 제조하였다. 혈청형 8(AAV8)의 재조합 바이러스 입자는 이미 설명된 바와 같이 HEK 293 세포의 트리-형질감염 프로토콜을 이용하여 얻었다(15). 벡터 역가는 ㎖당 바이러스 게놈(vs/㎖)으로 표현될 수 있다.
유사하게, 인간 데스민 프로모터(서열번호 11)의 조절 하에 인간 칼페인 3의 cDNA(서열번호 8)를 이용하여, 벡터 rAAV-desm-CAPN3(또는 AAV-desmin-CAPN3 또는 AAV-pDes-CAPN3)를 제조하였다. 상기 프로모터를 인간 칼페인 3의 프로모터 부분(서열번호 12) 또는 miARN206의 프로모터 부분(서열번호 13)으로 각각 교체하여, rAAV-PC3-CAPN3 및 rAAV-pmiR206-CAPN3 벡터를 얻었다. 나란한 miRNA208a(서열번호 9)(miR208aT)에 대한 2개의 표적 서열을 칼페인 3 유전자의 3'에 추가하여, 벡터 AAV-desm-CAPN3-miR208aT, AAV-PC3-CAPN3-miR208aT 및 AAV-pmiR206-CAPN3-miR208aT를 얻었다. 혈청형 1(AAV1), 8(AAV8) 및/또는 9(AAV9)의 재조합 바이러스 입자가 생성되었다.
2) 인 비보 실험:
동물 실험에 대한 프랑스 및 유럽 규정에 따라 마우스를 처리하였다. 본 연구에서, WT C57Bl/6 야생형 마우스(Charles River Laboratories) 및 미오튜불라린이 항시적으로 비활성화된 마우스 주(녹아웃), BS53d4-129pas라고도 불리는 KO-Mtm1를 이용하였다. 칼페인 3와 관련하여, Laure 등(Febs J., 2010, 277: 4322-4337)에 설명된 C3KO 쥐과 모델을 이용하였다.
표시된 투여량에 따라 재조합 벡터를 마우스의 꼬리 정맥으로 주입하였다(2주령 내지 2개월령). 동일 부피의 식염수 완충용액(PBS)을 대조군으로서 투여하였다. 임상적 상태 및 동물 체중을, WT 동물의 경우에는 매주, 돌연변이 마우스의 경우에는 주3회 모니터링 하였다. 마우스를 표시된 시점에 희생하였다.
3) 웨스턴 블롯:
이소펜탄에서 동결된 근육을 30㎛의 단면으로 절단하였고, 얼음 상에서 150mM NaCl, 10mM Tris HCl(pH 7.4), 1mM EGTA, 1mM EDTA, 100mM 불화 나트륨, 4mM 피로인산 나트륨, 2mM 오르토바나듐산 나트륨, 1% Triton X100 및 단백질분해효소 억제제의 완전한 칵테일로 보충된 0.5% IGEPAL(Roche)이 함유된 완충 용액으로 용해하였다. 근육 추출물을 1시간 배양하였고, 4℃에서 12,000ㅧg로 30분 동안 원심분리하였다. 상층액의 단백질 농도를 바이로-라드 사의 "단백질 분석 키트"를 이용하여 측정하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 주입되어 이동시킨 다음, 니트로셀룰로오스 막에 전이하였고, 미오튜불라린(p2348 [15]) 및 GAPDH(#MAB374, Millipore)에 대한 다중클론 항체로 배양하였다. 단백질 밴드는 "오디세이 영상 시스템"(LICOR Biotechnology Inc.)을 이용하여 적외선 형광으로 확인하였고, "오디세이 적외선 영상 시스템 소프트웨어"(software application, version 1.2, 2003)을 이용하여 정량하였다.
칼페인 3의 검출을 위해, 유사한 프로토콜을 이용하였다:
근육을 [20mM Tris (pH 7.5), 150mM NaCl, 2mM EGTA, 0.1% Triton X-100, 2mM E64 (Sigma)]에 따른 용해 완충용액과 단백질분해효소 억제제(완전 미니 단백질분해효소 억제제 칵테일; Roche Applied Science, 조직 ㎎ 당 25 ㎕)를 이용하여 FastPreP으로 균질화하였다. DNA의 분해를 위해 250U/100㎕의 벤조나아제(benzonase)(Calbiochem)로 상기 샘플을 4℃에서 30분 동안 처리하였다. 상기 근육 용해물을 로드 완충용액[NuPage LDS(Invitrogen), TNT 3M(Sigma)]과 혼합하였고, 70℃에서 30분 동안 변성한 후, 간단히 원심분리하였다. 상등액은 4-12%의 구배를 가진 폴리아크릴아미드 겔 NuPAGE Bis-Tris(Invitrogen)로 분리하였다. 전이 후에, 칼페인 3에 대한 항체들(마우스 단일클론 항체, Novocastra NCL-CALP-12A2, 1/200 희석)로 상기 막을 4℃로 밤샘 또는 실온에서 2-3시간 동안 혼성화하였다. 최종적으로, 오디세이 적외선 스캐너(LI-COR Biosciences, Lincoln, Nebraska, USA)에 노출시키기 위해, 상기 막을 IRDyeㄾ로 배양하였다.
4) PCR:
4-1-미오튜불라린:
"Gentra Puregene Tissue Kit"(Qiagen)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 상기 근육으로부터 DNA의 분리를 수행하였다. ND-8000 나노드롭 분광광도계(Nanodrop Technologies, France)를 이용하여 총 DNA 농도를 측정하였고, 실시간 PCR을 위해 각 샘플에 대하여 80ng의 DNA를 매트릭스로 이용하였다. 각 샘플들에서, 바이러스 게놈의 본(copy)을 확인하기 위해 rAAV2/X 벡터에 공통 골격 부분에 대하여, 그리고 각 샘플들에 존재하는 쥐과 게놈의 수를 표준화하기 위해 쥐과 티틴 유전자에 대하여, Taqman 실시간 PCR을 수행하였다. rAAV 벡터의 증폭을 위해 이용된 프라이머는 5'-CTCCATCACTAGGGGTTCCTTG-3'(정방향; 서열번호 15), 5'-GTAGATAAGTAGCATGGC-3'(역방향; 서열번호 16)였다. MGB 탐침(probe)은 이중-표지되었다(FAM-NFQ): 5'-TAGTTAATGATTAACCC-3′ (탐침; 서열번호 17). 티틴을 위한 프라이머 및 탐침은 5'-AAAACGAGCAGTGACGTGAGC-3' (정방향; 서열번호 18), 5'-TTCAGTCATGCTGCTAGCGC-3' (역방향; 서열번호 19), 및 5'-TGCACGGAAGCGTCTCGTCTCAGTC-3'(탐침; 서열번호 20)(Applied Biosystem). "Absolute QPCR ROX Mix"(Thermo Fischer Scientific)로 희석된 80ng의 DNA, 0.1ㅅM의 Taqman 탐침 및 0.2ㅅM의 프라이머(정방향 및 역방향)을 최종 부피 25 ㅅM로 이용하여 티틴의 증폭을 수행하였다. 사이클 조건은 90℃에서 15분 동안 Thermo-Start DNA 중합효소를 위한 활성화 단계 다음, 40회의 2-단계 사이클, 95℃에서의 변성 15초, 60℃에서의 혼성화 및 연장 60초로 구성된다. 0.1ㅅM의 Taqman 탐침, 0.3ㅅM의 역방향 프라이머 및 0.05μM의 정방향 프라이머를 최종 부피 25㎕로 이용하여 rAAV의 증폭을 수행한다. 사이클 조건은 90℃에서 15분 동안 Thermo-Start DNA 중합효소를 위한 활성화 단계 다음, 40회의 2-단계 사이클, 95℃에서의 변성 15초, 54℃에서의 혼성화 및 연장 60초로 구성된다. 상기 PCR은 7900 HT 서모사이클러(Applied Biosystem) 상에서 수행된다. rAAV 골격과 티틴의 서열을 포함하는 플라스미드의 일련의 표준 희석액들을 실시간으로 각 PCR 플레이트에서 본의 수의 대조군으로서 이용하였다. 모든 샘플들과 대조군들은 이중(duplicate)이었다. 데이터는 이배체 게놈 당 바이러스 게놈의 본의 수로 표현된다.
4-2-칼페인 3:
Trizol 방법(Invitrogen)을 이용하여 근육을 추출하였다. 추출 과정에서 정량적 PCR에 의한 정량화를 위한 DNA 추출을 위해 각 샘플 분획을 보존하였다. 잔존 DNA를 제거하기 위해 "DNA-Free" 키트(Ambion)로 처리된 남아 있는 추출물으로부터 총 RNA를 추출하였다.
내재적인 마이크로RNA의 발현의 정량화를 위해 총 20ng의 RNA를 "역전사 TaqMan MicroRNA" 키트(Applied Biosystems)를 이용한 역전사에 적용하였고, miR-208a에 대해서는 마이크로RNA ID511 Taqman assay(Applied Biosystems)로 분석하였다. 시험 ID1232(Applied Biosystems)로 snoRNA202의 발현으로, 샘플의 표준화를 수행하였다.
내재적인 또는 형질전환된 칼페인 3의 mRNA를 증폭하기 위하여, 랜덤 헥사머 및 올리고T 및 cDNA Verso kit(Abgene) 또는 "RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis" kit(Fermentas)를 이용하여 1㎍의 RNA를 역전사하였다. ABI PRISM 7700(Applied Biosystems) 시스템에 적용되는 TaqManㄾ 방법과 "Absolute QPCR Rox Mix" 용액(ABgene)을 다음과 같은 프라이머쌍(.f 및 .r) 및 Taqman 탐침(.p)과 함께 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다: 형질전환된 칼페인의 정량화를 위해: CAPN3sfr.f(서열번호 21) 5'_CGCCTCCAAGGCCCGT_3'; CAPN3sfr.r(서열번호 22) 5'_GGCGGAAGCGCTGGCT_3'; MGBTUCAPN3.p(서열번호 23) 5'_CTACATCAACATGAGAGAGGT_3'; 인간 칼페인의 정량화를 위해: CAPN3.f (서열번호 24) 5'_CGCCTCCAAGGCCAGG_3', CAPN3.r(서열번호 25) 5'_GGCGGAAGCGCTGGGA_3', CAPN3.p(서열번호 26) 5'_TACATCAACATGCGGGAGGT_3'. 각각의 실험에 대조군 RNA의 일련의 희석액을 이용하였고, 다른 실험들과 대비할 수 있도록 하기 위해, 실험 샘플로 처리하여 cDNA 준비 및 PCR의 효율에 가변성을 제거하였다. 이러한 RNA는 모든 프라이머 쌍으로 증폭가능하고 돌연변이된 칼페인 3 cDNA를 포함하는 플라스미드로부터 인 비트로 전사 반응을 통해 준비하였다.
아래와 같은 TaqManㄾ Gene Expression tests(Applied Biosystens)을 이용하여 코넥신 40 및 HOP의 발현의 분석을 수행하였다: Cnx40의 경우 Gja-5[Mus Musculus]: Mm00433619_s1 및 hop의 경우 HOP homeobox [Mus musculus]: Mm00558630_m1. qRT-PCR 결과는 도처에 존재하는 리보솜 인단백질 산 쥐과 유전자(P0 GI: 15029771; MH181PO.F(서열번호 27): 5'_CTCCAAGCAGATGCAGCAGA_3'/ M267PO.R(서열번호 28): 5'_ACCATGATGCGCAAGGCTAT_3'/ M225PO.p(서열번호 29): 5'_CCGTGGTGCTGATGGGCAAGAA_3')의 발현과 관련된 임의의 단위로 표현하였다.
5) 조직학:
심장, 간 및 골격근의 동결절단면(8㎛ 두께)을 헤마톡실린 에오신(HE), 시리우스 레드 또는 헤마톡실린 플록신 사프론(HFS)으로 표준 프로토콜에 따라 염색하였다.
단면을 Eukitt 미디엄(LABONORD)으로 고정(mount)했다. CCD 카메라(Sony)를 이용하여 디지털 영상을 포획하였다. 중심핵성 섬유의 수를 정의하기 위해, Histolab 소프트웨어(Microvision, Evry)를 이용하여 골격근의 형태계측학적 분석을 수행하였다.
6) ALT 활성의 측정
혈액 샘플을 응고 없이 수집하였다. 원심 분리(8000g, 10분, 4℃) 후, 알라닌 아미노전이효소(ALT) 비율을 측정하기 위한 "Vitros ALT DT slides" 카세트를 이용하는 VITROS DT60 장치(Ortho Clinical Diagnostics, UK)를 이용하여 혈청을 분석하였다.
결과
A- 미오튜불라린
1) AAV-pDES-Mtm1 구조체의 심장 독성:
벡터 AAV2/1 내에서 CMV 프로모터의 조절 하에 있는 미오튜불라린(Mtm1) 유전자의 단일 근육내 주사의 유리한 효과는 Buj-Bello 등의 논문으로부터 잘 알려져 있었다[15].
Mtm1 녹아웃 마우스에서 전신 경로에 의한 유전자 치료 접근법이 시도되었고, 인간 데스민 프로모터의 조절 하에 있는 미오튜불라린을 발현하는 AAV8 벡터(rAAV-Des-Mtm1)의 돌연변이 마우스로의 투여는 적어도 6개월의 수명을 연장시키고, 횡경막을 포함하는 신체의 전체에 걸쳐 가로무늬 근육에서 병리를 강력하게 개선시키며, 표준화된 운동 활성을 나타내었다(데이터 미도시).
그러나 Mtm1 KO 마우스에서 벡터 AAV8-DES-Mtm1의 전신 투여 후에, 골격근에 비해 심장에서 미오튜불라린 단백질의 수준이 매우 높게 나타타는 것으로 관찰되었다(데이터 미도시). 더욱이, 바이러스 주사 후의 다른 시점에서 AAV를 처리한 XLMTM 마우스의 심장에서 염증성 침투 및 섬유화의 존재가 관찰되었다(도 2).
2) 심장 독성이 없는 발현 시스템의 개발
특히 인간에 전신 투여한 후 벡터 AAV8로부터의 생체내 분포(biodistribution) 및 이식유전자 발현의 예상이 어려운 점을 고려하여, 심장에 영향을 미칠 수 있는 잠재적인 부작용을 제거하기 위해, 근육 특이성을 향상시킨 통제 서열을 포함하는 새로운 벡터를 개발하였다.
도 1B에 도시된 바와 같이, miRNA-208a에 대한 1, 2 또는 4개의 표적 서열을 각각 포함하는 3개의 바이러스 컨스트럭트(rAAV-Des-Mtm1-miRHT1; rAAV-Des-Mtm1-miRHT2 and rAAV-Des-MTM1-miRHT4)가 개발되었다. 이 서열은 서열번호 10이고, 22개의 염기 쌍으로 구성된다. 특히, 이 서열은 인간, 개 및 마우스에서 보존된다.
3) WT 마우스로 주사 후 근육 및 심장에서의 MTM1의 생산
MTM1에 가장 적합한 발현 벡터를 선택하기 위해, 단일 투여량으로 3x1013 바이러스 게놈(vg)/kg의 벡터를 3주령의 야생형 마우스의 꼬리 정맥에 투여하였다. 빈 벡터(AAV-Des-MCS)와 PBS ("Phosphate Buffered Saline")가 내부 대조군으로 이용되었다.
주사 1개월 후 심장 및 다른 골격근(전경골근= TA; 대퇴사두근 = QUA; 삼두근 = TRI)에서의 벡터 분포 및 미오튜불라린의 단백질 수준을 평가하였다. 웨스턴 블롯 결과는 위 벡터들이 심장에서 특이적으로 벡터로부터 생산되는 미오튜불라린의 수준을 감소시킬 수 있음을 보였다. 게다가, miRNA208a의 단일 표적 서열은 이 조직에서 발현을 감소시키는데 충분하였다(도 3 및 표 1).
Figure pct00001
WT 마우스로 벡터의 전달 1개월 후, 골격근 및 심장에서 MTM1 단백질의 반-정량적 정량화
4) 돌연변이된 마우스로 Mtm1 을 주사한 후 벡터 구조체의 유효성 검토
앞선 결과들을 기초로, 추가적인 실험을 위해 rAAV -Des- Mtm1-miRHT1 컨스트럭트를 선택하였다. 3주령 차의 MTM1 유전자에 돌연변이 된 WT 야생형 마우스(KO, "녹아웃")로 3x1013 vg/kg의 AAV-Des-Mtm1, rAAV-Des-Mtm1-miRHT1 및 rAAV-Des-MCS 각각을, 또는 PBS를 투여하였고, 임상적으로 1개월 동안 모니터링 하였다.
AAV8-Des-Mtm1-miRHT1가 투여된 모든 돌연변이 마우스가 AAV8-Des-Mtm1로 처리된 KO 마우스와 유사한 성장 곡선으로 연구의 끝까지 생존하여, miRHT1 서열을 포함시키는 것이 상기 이식유전자의 치료학적 효능에 전혀 영향을 미치지 않음을 나타내었다(도 4).
처리 1개월 후에, 헤마톡실린-에오신 및 시리우스 레드로 염색한 WT 및 KO 마오스의 심장의 조직학을 분석하였다. 섬유성 조직이 9-AAV8-Des-Mtm1이 처리된 9마리 중 7마리의 KO 마우스의 심장에서 관찰되었으나, AAV8-Des-Mtm1-miRHT1이 처리된 KO 마우스(n=10)에서는 관찰되지 않았다. 벡터 AAV8-Des-Mtm1의 투여가 주사 1개월 후에 WT 동물(n=8)에서 섬유화를 유발하지 않았다.
결론적으로, 이러한 결과들은 miRNA208a의 단일 표적 서열을 포함시키는 것이 AAV8-Des-Mtm1 컨스트럭트의 심장 독성을 감소시키는데 충분함을 암시한다.
유사한 실험들이 칼페인 3(CAPN3)에 관하여 수행되었다:
B - 칼페인 3(CALPAIN 3)
Bartoli 등(Molecular Therapy, 2006, Vol. 13, No. 2, 250-259)의 논문은 근육-특이적 프로모터의 조절 하에 있는 칼페인 3 유전자를 포함하는 AAV 유형의 컨스트럭트의 근육내 또는 국소 투여 후의 유용한 효과 및 비-독성을 암시한다. 그러나 본 발명에서 수행된 실험은 상기 컨스트럭트의 전신 투여 후의 독성을 밝혔다.
1) AAV-desm-CAPN3 컨스트럭트의 심장 독성:
아래 표 2에 제시된 서로 다른 컨스트럭트들의 정맥내 주사 후에, WT 마우스의 상태를 모니터링 하였다:
혈청헝
(Serotype) 		투여량(Dose) (vg/kg) 죽은
개체의 수 		35일 후 심장에서의
조직학적 외관
AAV9 4.0 x 1011 0/3 섬유화
" 1.0 x 1012 0/9 섬유화
" 1.6 x 1013 5/7 섬유화
" 4.3 x 1013 2/6 섬유화
AAV8 7.0 x 1012 2/4 섬유화
AAV1 1.6 x 1013 0/3 섬유화
서로 다른 AAV를 서로 다른 투여량으로 정맥내 주사한 결과
위와 같은 유전자 발현 시스템의 치료 목적을 위해 이용한 경우를 제외하고, 시험된 모든 AAV에 대하여 전신 투여의 경우에서 심장 조직의 파괴가 관찰되었다.
2) 프로모터 교체를 통한 AAV-desm- CAPN3 컨스트럭트의 심장 독성의 감소 :
데스민 프로모터를 CAPN3(AAV2/9-pC3-CAPN3) 또는 miR-206(AAV2/9-pmiR206-CAPN3)의 프로모터로 교체하여 두 벡터를 제조하였다. 바이러스 벡터의 제조 후에, 정맥내 주사(6 x 1012 vg/㎏)에 의해 도입된 2개월령의 C57BL/6 마우스(WT)에서 위와 같은 변화의 인 비보에서의 결과를 분석하였다.
주사 35일 후, AAV2/9-desm-CAPN3를 주입한 마우스와는 달리(도 5A), 유사한 형질도입 수준에도 불구하고 상기 벡터 AAV2/9-pC3-CAPN3 및 AAV2/9-pmiR206-CAPN3로 처리된 마우스에서 심장 섬유화가 관찰되지 않았다(도 5B). AAV2/9-desm-CAPN3로 처리된 마우스의 심장에서 CAPN3 이식유전자의 mRNA 수준은 내재적인 수준보다 약 15배 더 높은 반면(도 5C), AAV2/9-pC3-CAPN3 및 AAV2/9-pmiR206-CAPN3로 처리된 마우스에서는 더 낮게 유지되어(각각 13% 및 30%, 도 5C), 이들 두 벡터의 비-독성 효과와 연관성을 나타내었다.
더욱이, 1013 vg/kg로 주입된 WT 마우스에서 약 5주간 알라닌 아미노전이효소 활성(ALT)의 수준의 측정에 의해 이들 두 프로모터는 간 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다. PBS를 주사한 것들에 비해, 주입된 동물에서는 효소 활성에 전혀 증가가 관찰되지 않았다(도 5D).
결과적으로, 프로모터 CAPN3 및 miR-206은 간 독성을 유발함 없이 상기 이식유전자 CAPN3의 심장 독성을 감소시킨다.
3) miR208a의 두 표적 서열의 추가에 의한 AAV-desm- CAPN3 컨스트럭트의 심장 독성의 감소:
miRNA208a(서열번호 10)의 두 표적 서열을 miR208aT 카세트에 나란히 클로닝하였다. 그런 다음, 컨스트럭트 AAV2/9-desm-CAPN3-miR208aT를 제조하기 위해, 그것들을 컨스트럭트 AAV2/9-desm-CAPN3의 3' UTR 부분에 삽입하였다.
6x1012 vg/kg의 투여량으로 주사한 후, AAV2/9-desm-CAPN3를 주사한 마우스들과는 달리(도 6A), 심장에서 유사한 형질도입 수준 및 칼페인 3의 내재적인 수준에 비해 5배 더 높은 mRNA 수준에도 불구하고, 처리된 마우스에서는 심장 섬유화가 전혀 관찰되지 않았다(도 6B). 단백질 수준과 관련하여, 칼페인 3는 심근(myocardium)에서 정상적으로 발현되지 않았고, 검출되지 않았다(도 6C). AAV2/9-desm-CAPN3로 주사된 WT 마우스에서, 전체 단백질은 검출되지 않았고, 그들의 분해에 의해 생성된 단편들(60, 58 및 55 kDa)이 검출되었다(도 6C). 대조적으로, 전제 단백질 뿐만 아니라 분해 단편들 또한 AAV2/9-desm-CAPN3-miR208aT로 주입된 WT 마우스의 심장에서 관찰되지 않아, 번역 수준에서 통제됨을 암시한다.
결론적으로, 이러한 결과들은 miR208aT가 CAPN3 이식유전자의 심장 독성을 감소시킬 수있음을 나타낸다.
4) 두 전략의 조합:
프로모터 CAPN 3와 miR-206 및 miR-208a의 표적 서열 2본을 조합하여 새로운 벡터를 제조하였다: AAV2/9-pC3-CAPN3-miR208aT 및 AAV2/9-pmiR206-CAPN3-miR208aT. C3KO 마우스(칼페인 3이 녹아웃)에 위 벡터들을 1.2x1013 vg/kg로 주사하였다.
앞서 야생형 마우스에서 관찰된 바와 같이, 주사 3개월 후에, 3개의 벡터(AAV2/9-desm-CAPN3-miR208aT, AAV2/9-pC3-CAPN3-miR208aT 및 AAV2/9-pmiR206-CAPN3-miR208aT) 중 어느 것도 심장에 독성을 나타내지 않았다(데이터 미도시).
대조적으로, 이들 벡터가 주사된 4주령의 C3KO 마우스의 골격근의 조직학적 및 형태학적 검사는 쥐과 모델의 병리 신호 상에 칼페인 3의 발현의 긍정적인 효과를 나타낸다. 이들 벡터가 주사된 전경골근(TA) 근육은 PBS가 주사된 것들에 비해 개선된 조직학적 특성을 나타내었다. HPS로 염색된 TA 근육의 단면의 형태계측학적 분석은 상기 벡터가 주사된 근육에서 중심핵성 섬유(CNF)에 현저한 감소를 나타내었다. 비록 AAV2/9-pC3-CAPN3-miR208aT 및 AAV2/9-pmiR206-CAPN3-miR208aT에서 관찰된 감소가 통계학적으로 유의미하지는 않았지만, PSO 근육(장요근)에서도 유사한 결과가 얻어졌다.
결과적으로, 이러한 결과들은 이러한 재조합 벡터들로 형질도입된 골격근에서 칼페인 3의 발현이 심장 독성을 나타내지 않고 칼페인 3이 결핍된 마우스의 병리학적 신호를 바로잡을 수 있음을 암시한다.
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140 Ala His Asn Leu Pro Leu Phe Ala Phe Val Asn Glu Glu Lys Phe Asn 145 150 155 160 Val Asp Gly Trp Thr Val Tyr Asn Pro Val Glu Glu Tyr Arg Arg Gln 165 170 175 Gly Leu Pro Asn His His Trp Arg Ile Ser Phe Ile Asn Lys Cys Tyr 180 185 190 Glu Leu Cys Glu Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Val Val Pro Tyr Arg Thr 195 200 205 Ser Asp Asp Asp Leu Arg Arg Ile Ala Thr Phe Arg Ser Arg Asn Arg 210 215 220 Leu Pro Val Leu Ser Trp Ile His Pro Glu Asn Lys Met Val Ile Met 225 230 235 240 Arg Cys Ser Gln Pro Leu Val Gly Met Ser Gly Lys Arg Asn Lys Asp 245 250 255 Asp Glu Lys Tyr Leu Asp Val Ile Arg Glu Thr Asn Lys Gln Thr Ser 260 265 270 Lys Leu Met Ile Tyr Asp Ala Arg Pro Ser Val Asn Ala Val Ala Asn 275 280 285 Lys Ala Thr Gly Gly Gly Tyr Glu Ser Asp Asp Ala Tyr Gln Asn Ser 290 295 300 Glu Leu Ser Phe Leu Asp Ile His Asn Ile His Val Met Arg Glu Ser 305 310 315 320 Leu Lys Lys Val Lys Asp Ile Val Tyr Pro Asn Ile Glu Glu Ser His 325 330 335 Trp Leu Ser Ser Leu Glu Ser Thr His Trp Leu Glu His Ile Lys Leu 340 345 350 Val Leu Thr Gly Ala Ile Gln Val Ala Asp Gln Val Ser Ser Gly Lys 355 360 365 Ser Ser Val Leu Val His Cys Ser Asp Gly Trp Asp Arg Thr Ala Gln 370 375 380 Leu Thr Ser Leu Ala Met Leu Met Leu Asp Ser Phe Tyr Arg Thr Ile 385 390 395 400 Glu Gly Phe Glu Ile Leu Val Gln Lys Glu Trp Ile Ser Phe Gly His 405 410 415 Lys Phe Ala Ser Arg Ile Gly His Gly Asp Lys Asn His Ala Asp Ala 420 425 430 Asp Arg Ser Pro Ile Phe Leu Gln Phe Ile Asp Cys Val Trp Gln Met 435 440 445 Ser Lys Gln Phe Pro Thr Ala Phe Glu Phe Asn Glu Gly Phe Leu Ile 450 455 460 Thr Val Leu Asp His Leu Tyr Ser Cys Arg Phe Gly Thr Phe Leu Phe 465 470 475 480 Asn Cys Asp Ser Ala Arg Glu Arg Gln Lys Leu Thr Glu Arg Thr Val 485 490 495 Ser Leu Trp Ser Leu Ile Asn Ser Asn Lys Asp Lys Phe Lys Asn Pro 500 505 510 Phe Tyr Thr Lys Glu Ile Asn Arg Val Leu Tyr Pro Val Ala Ser Met 515 520 525 Arg His Leu Glu Leu Trp Val Asn Tyr Tyr Ile Arg Trp Asn Pro Arg 530 535 540 Val Lys Gln Gln Gln Pro Asn Pro Val Glu Gln Arg Tyr Met Glu Leu 545 550 555 560 Leu Ala Leu Arg Asp Asp Tyr Ile Lys Arg Leu Glu Glu Leu Gln Leu 565 570 575 Ala Asn Ser Ala Lys Leu Ala Asp Ala Pro Ala Ser Thr Ser Ser Ser 580 585 590 Ser Gln Met Val Pro His Val Gln Thr His Phe 595 600 <210> 3 <211> 603 <212> PRT <213> Canis lupus <400> 3 Met Ala Ser Ala Pro Thr Ser Lys Tyr Asn Ser His Ser Leu Glu Asn 1 5 10 15 Glu Ser Ile Lys Arg Thr Ser Arg Asp Gly Val Asn Trp Asp Leu Ser 20 25 30 Glu Ala Val Pro Arg Leu Pro Gly Glu Thr Arg Ile Thr Asp Lys Glu 35 40 45 Val Ile Tyr Ile Cys Pro Phe Asn Gly Pro Ile Lys Gly Arg Val Tyr 50 55 60 Ile Thr Asn Tyr Arg Leu Tyr Leu Arg Ser Leu Glu Thr Asp Ser Ala 65 70 75 80 Leu Ile Leu Asp Val Pro Leu Gly Val Ile Ser Arg Ile Glu Lys Met 85 90 95 Gly Gly Ala Thr Ser Arg Gly Glu Asn Ser Tyr Gly Leu Asp Ile Thr 100 105 110 Cys Lys Asp Met Arg Asn Leu Arg Phe Ala Leu Lys Gln Glu Gly His 115 120 125 Ser Arg Arg Asp Met Phe Glu Ile Leu Thr Arg Tyr Ala Phe Pro Leu 130 135 140 Ala His Ser Leu Pro Ile Phe Ala Phe Leu Asn Glu Glu Lys Phe Asn 145 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360 365 Ser Ser Val Leu Val His Cys Ser Asp Gly Trp Asp Arg Thr Ala Gln 370 375 380 Leu Thr Ser Leu Ala Met Leu Met Leu Asp Ser Phe Tyr Arg Ser Ile 385 390 395 400 Glu Gly Phe Glu Ile Leu Val Gln Lys Glu Trp Ile Ser Phe Gly His 405 410 415 Lys Phe Ala Ser Arg Ile Gly His Gly Asp Lys Asn His Ala Asp Ala 420 425 430 Asp Arg Ser Pro Ile Phe Leu Gln Phe Ile Asp Cys Val Trp Gln Met 435 440 445 Ser Lys Gln Phe Pro Thr Ala Phe Glu Phe Asn Glu Arg Phe Leu Ile 450 455 460 Thr Ile Leu Asp His Leu Tyr Ser Cys Arg Phe Gly Thr Phe Leu Tyr 465 470 475 480 Asn Cys Glu Ser Ala Arg Glu Lys Gln Lys Val Thr Glu Arg Thr Val 485 490 495 Ser Leu Trp Ser Leu Ile Asn Ser Asn Lys Asp Lys Phe Lys Asn Pro 500 505 510 Phe Tyr Thr Lys Glu Ile Asn Arg Val Leu Tyr Pro Val Ala Ser Met 515 520 525 Arg His Leu Glu Leu Trp Val Asn Tyr Tyr Ile Arg Trp Asn Pro Arg 530 535 540 Ile Lys Gln Gln Gln Pro Asn Pro Val Glu Gln Arg Tyr Val Glu Leu 545 550 555 560 Leu Ala Leu Arg Asp Glu Tyr Ile Gln Arg Leu Glu Glu Leu Gln Leu 565 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780 tacgcaggga tcttccactt ccagttctgg cgctatggag agtgggtgga cgtggttata 840 gatgactgcc tgccaacgta caacaatcaa ctggttttca ccaagtccaa ccaccgcaat 900 gagttctgga gtgctctgct ggagaaggct tatgctaagc tccatggttc ctacgaagct 960 ctgaaaggtg ggaacaccac agaggccatg gaggacttca caggaggggt ggcagagttt 1020 tttgagatca gggatgctcc tagtgacatg tacaagatca tgaagaaagc catcgagaga 1080 ggctccctca tgggctgctc cattgatgat ggcacgaaca tgacctatgg aacctctcct 1140 tctggtctga acatggggga gttgattgca cggatggtaa ggaatatgga taactcactg 1200 ctccaggact cagacctcga ccccagaggc tcagatgaaa gaccgacccg gacaatcatt 1260 ccggttcagt atgagacaag aatggcctgc gggctggtca gaggtcacgc ctactctgtc 1320 acggggctgg atgaggtccc gttcaaaggt gagaaagtga agctggtgcg gctgcggaat 1380 ccgtggggcc aggtggagtg gaacggttct tggagtgata gatggaagga ctggagcttt 1440 gtggacaaag atgagaaggc ccgtctgcag caccaggtca ctgaggatgg agagttctgg 1500 atgtcctatg aggatttcat ctaccatttc acaaagttgg agatctgcaa cctcacggcc 1560 gatgctctgc agtctgacaa gcttcagacc tggacagtgt ctgtgaacga gggccgctgg 1620 gtacggggtt gctctgccgg aggctgccgc aacttcccag atactttctg gaccaaccct 1680 cagtaccgtc tgaagctcct ggaggaggac gatgaccctg atgactcgga ggtgatttgc 1740 agcttcctgg tggccctgat gcagaagaac cggcggaagg accggaagct aggggccagt 1800 ctcttcacca ttggcttcgc catctacgag gttcccaaag agatgcacgg gaacaagcag 1860 cacctgcaga aggacttctt cctgtacaac gcctccaagg ccaggagcaa aacctacatc 1920 aacatgcggg aggtgtccca gcgcttccgc ctgcctccca gcgagtacgt catcgtgccc 1980 tccacctacg agccccacca ggagggggaa ttcatcctcc gggtcttctc tgaaaagagg 2040 aacctctctg aggaagttga aaataccatc tccgtggatc ggccagtgaa aaagaaaaaa 2100 accaagccca tcatcttcgt ttcggacaga gcaaacagca acaaggagct gggtgtggac 2160 caggagtcag aggagggcaa aggcaaaaca agccctgata agcaaaagca gtccccacag 2220 ccacagcctg gcagctctga tcaggaaagt gaggaacagc aacaattccg gaacattttc 2280 aagcagatag caggagatga catggagatc tgtgcagatg agctcaagaa ggtccttaac 2340 acagtcgtga acaaacacaa ggacctgaag acacacgggt tcacactgga gtcctgccgt 2400 agcatgattg cgctcatgga tacagatggc tctggaaagc tcaacctgca ggagttccac 2460 cacctctgga acaagattaa ggcctggcag aaaattttca aacactatga cacagaccag 2520 tccggcacca tcaacagcta cgagatgcga aatgcagtca acgacgcagg attccacctc 2580 aacaaccagc tctatgacat cattaccatg cggtacgcag acaaacacat gaacatcgac 2640 tttgacagtt tcatctgctg cttcgttagg ctggagggca tgttcagagc ttttcatgca 2700 tttgacaagg atggagatgg tatcatcaag ctcaacgttc tggagtggct gcagctcacc 2760 atgtatgcct gaaccaggct ggcctcatcc aaagccatgc aggatcactc aggatttcag 2820 tttcaccctc tatttccaaa gccatttacc tcaaaggacc cagcagctac acccctacag 2880 gcttccaggc acctcatcag tcatgctcct cctccatttt accccctacc catccttgat 2940 cggtcatgcc tagcctgacc ctttagtaaa gcaatgaggt aggaagaaca aacccttgtc 3000 cctttgccat gtggaggaaa gtgcctgcct ctggtccgag ccgcctcggt tctgaagcga 3060 gtgctcctgc ttaccttgct ctaggctgtc tgcagaagca cctgccggtg gcactcagca 3120 cctccttgtg ctagagccct ccatcacctt cacgctgtcc caccatgggc caggaaccaa 3180 accagcactg ggttctactg ctgtggggta aactaactca gtggaatagg gctggttact 3240 ttgggctgtc caactcataa gtttggctgc attttgaaaa aagctgatct aaataaaggc 3300 atgtgtatgg ctggtc 3316 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> (1)..(22) <223> /mol_type="other RNA" /note="Accession: MIMT0000241" /organism="Homo sapiens" <400> 9 auaagacgag caaaaagcuu gu 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> (1)..(22) <223> /mol_type="unassigned DNA" /organism="Homo sapiens" <400> 10 acaagctttt tgctcgtctt at 22 <210> 11 <211> 1050 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> (1)..(1050) <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="Promoteur Desmine" /organism="Homo sapiens" <400> 11 cccccacagc tcctctcctg tgccttgttt cccagccatg cgttctcctc tataaatacc 60 cgctctggta tttggggttg gcagctgttg ctgccaggga gatggttggg ttgacatgcg 120 gctcctgaca aaacacaaac ccctggtgtg tgtgggcgtg ggtggtgtga gtagggggat 180 gaatcaggga gggggcgggg gacccagggg gcaggagcca cacaaagtct gtgcgggggt 240 gggagcgcac atagcaattg gaaactgaaa gcttatcaga ccctttctgg aaatcagccc 300 actgtttata aacttgaggc cccaccctcg acagtaccgg ggaggaagag ggcctgcact 360 agtccagagg gaaactgagg ctcagggcca gctcgcccat agacatacat ggcaggcagg 420 ctttggccag gatccctccg cctgccaggc gtctccctgc cctcccttcc tgcctagaga 480 cccccaccct caagcctggc tggtctttgc ctgagaccca aacctcttcg acttcaagag 540 aatatttagg aacaaggtgg tttagggcct ttcctgggaa caggccttga ccctttaaga 600 aatgacccaa agtctctcct tgaccaaaaa ggggaccctc aaactaaagg gaagcctctc 660 ttctgctgtc tcccctgacc ccactccccc ccaccccagg acgaggagat aaccagggct 720 gaaagaggcc cgcctggggg ctgcagacat gcttgctgcc tgccctggcg aaggattggt 780 aggcttgccc gtcacaggac ccccgctggc tgactcaggg gcgcaggcct cttgcggggg 840 agctggcctc cccgccccca cggccacggg ccgccctttc ctggcaggac agcgggatct 900 tgcagctgtc aggggagggg aggcgggggc tgatgtcagg agggatacaa atagtgccga 960 cggctggggg ccctgtctcc cctcgccgca tccactctcc ggccggccgc ctgcccgccg 1020 cctcctccgt gcgcccgcca gcctcgcccg 1050 <210> 12 <211> 1654 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> (1)..(1654) <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="Promoteur calpaine 3" /organism="Homo sapiens" <400> 12 cacatgcctc cactctgcca tacttgaaat gtgctcatct ccttacagcc cagggagcag 60 ctattgtggg tagaagacaa ggtggaggcc aggcaggcac ttcccttccc cagagccact 120 tatgctctca tctaagagcc ctgaaaccag gtgtgacatc ccaggagttg acagacagtc 180 tggttcagta tctaattcca acttctgtct cagatgccta atgtggcatg gctgaatgag 240 tcaacatata acctgtacag taagtcctca cttaacatca ttgataggtg cttgtaaact 300 gtgactttaa cgaaaacata ccgtgtgctg tagggactta actcttgttt atatcagtta 360 gcctggtttc actatacagt acatcatttt gcttaaagtc acagcttacg agaacctatc 420 gatgatgtta agtgaggatt ttctctgctc aggtgcactt tttttttttt tttaagacgg 480 agtctctttc tgtcacctgg gctggagtgc agtggcgcga tctgggttca ctacaacctc 540 tgcctcctgg gttcaagcaa ttcttctgtc tcagcctccc aagtagctgg gattacaggc 600 acccgccgcc acacccggct tatttttgta tttttagtag agacagggtt tcactattgt 660 tggccatgct ggtctcgaac tcctgacctc atgtgatcca cccgcctcgg cctcccaaag 720 tgcagagatt agagacgtga gccacatggc ccagcaggac cactttttag cagattcagt 780 cccagtgttc attttgtgga tggggagaga caagaggtgg caaggtcaag tgtgcaggta 840 gagacaggga ttttctcaaa tgaggactct gctgagtagc attttccatg cagacatttc 900 caatgagcgc tgacccaaga acattctaaa aaagatacca aatctaacat tgaataatgt 960 tctgatatcc taaaatttta ggactaaaaa tcatgttctc taaaattcac agaatatttt 1020 tgtagaattc agtacctccc gttcacccta actagctttt ttgcaatatt gttttccatt 1080 catttgatgg ccagtagttg ggtggtctgt ataactgcct actcaataac atgtcagcag 1140 ttctcagctt ctttccagtg ttcaccttac tcagatactc ccttttcatt ttctggcaac 1200 accagcactt catggcaaca gaaatgtccc tagccaggtt ctctctctac catgcagtct 1260 ctcttgctct catactcaca gtgtttcttc acatctattt ttagttttcc tggctcaagc 1320 atcttcaggc cactgaaaca caaccctcac tctctttctc tctccctctg gcatgcatgc 1380 tgctggtagg agacccccaa gtcaacattg cttcagaaat cctttagcac tcatttctca 1440 ggagaactta tggcttcaga atcacagctc ggtttttaag atggacataa cctgtacgac 1500 cttctgatgg gctttcaact ttgaactgga tgtggacact tttctctcag atgacagaat 1560 tactccaact tcccctttgc agttgcttcc tttccttgaa ggtagctgta tcttattttc 1620 tttaaaaagc tttttcttcc aaagccactt gcca 1654 <210> 13 <211> 805 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> (1)..(805) <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="promoteur miARN206" /organism="Homo sapiens" <400> 13 gggggccaac tcttcctttg gcatatgttt ccccattttc tggcagagaa tcagatacca 60 caaagttcaa aaccccatct ccctccagcc agggtggcca tccagaccct gagtggctca 120 acagctgcca atgtccctca tccttctgag gctcaggcct cacagattgt ggggcaggtg 180 atgggctagg gggagcagaa gcccgacaaa aggatccttc ccacagtgaa caatggtgct 240 tggaatgctg gatgggcagc tgctgcccat caacaagcac ccaaaacaga tagacgtaca 300 gtaggaagta caggagggcc ggtgtgtttc taagcatgag tggctctctg cgtgaatgtg 360 gaaaatttct ctgttggatt ctctcttctt tttaattttc ccttcactgg atcccaaaca 420 ttaaaaaaga atcacattca aaatgcacaa aaacagcagc agtgaattaa ttagtagtaa 480 taacaaagga ctggatagac tgtagctgca caagaataag ccagggaaac gtggtgctgc 540 ttatctgtga acaaacagta ggaaggattt ggtcccaagc agcactgcca ttcctcacaa 600 cagatttatt tcagcatgat ttggtcgggc gggggggatt taggatgagt tgagatccca 660 gtgatcttct cgctaagagt ttcctgcctg ggcaaggagg aaagatgcta caagtggccc 720 acttctgaga tgcgggctgc ttctggatga cactgcttcc cgaggccaca tgcttcttta 780 tatccccata tggattactt tgcta 805 <210> 14 <211> 1812 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> source <222> (1)..(1812) <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="ORF MTM1" /organism="Mus musculus" <400> 14 atggcttctg catcagcatc taagtataat tcacactcct tggagaatga atccattaag 60 aaagtgtctc aagatggagt cagtcaggat gtgagtgaga ctgtccctcg gctcccaggg 120 gagttactaa ttactgaaaa agaagttatt tacatatgtc ctttcaatgg ccccattaag 180 ggaagagttt acatcacaaa ttatcgtctt tatttaagaa gtttggaaac ggattctgct 240 ctaatacttg atgttcctct gggtgtgata tcaagaattg aaaaaatggg aggcgcgaca 300 agtagaggag aaaattccta tggtctagat attacttgta aagatttgag aaacctgagg 360 tttgcattga agcaagaagg ccacagcaga agagatatgt ttgagatcct tgtaaaacat 420 gcctttcctc tggcacacaa tctgccatta tttgcatttg taaatgaaga gaagtttaac 480 gtggatgggt ggactgttta taatccagtt gaagaatata gaaggcaggg cctgcccaat 540 caccattgga ggataagttt tattaacaag tgctatgagc tctgtgagac ataccctgct 600 cttttggtgg ttccctatcg gacctcagat gatgatctta ggaggatcgc aacgtttaga 660 tcccgaaatc ggcttcctgt actgtcgtgg attcacccag aaaacaaaat ggtcattatg 720 cgctgcagtc agcctcttgt cggtatgagt ggtaaaagaa ataaagatga cgagaaatac 780 ctggatgtga tcagggaaac taacaaacaa acttctaagc tcatgattta tgatgcacga 840 cccagtgtaa atgcagtcgc caacaaggca acaggaggag gatatgaaag tgatgacgca 900 tatcaaaact cagaactttc cttcttagac attcataata ttcatgttat gcgagaatct 960 ttaaaaaaag tgaaagatat tgtttatccc aacatagaag aatctcattg gttgtccagt 1020 ttggagtcta ctcattggtt agaacatatc aagcttgttc tgaccggtgc cattcaagtg 1080 gcagaccaag tgtcttcagg aaagagctcg gtacttgtgc actgcagtga cggatgggac 1140 aggaccgctc agctgacatc cttggccatg ctgatgttgg acagcttcta cagaactatt 1200 gaaggctttg agatattggt acagaaagag tggataagtt ttggccataa atttgcatct 1260 agaataggtc atggtgataa aaaccatgct gatgctgatc gatctcctat ttttcttcag 1320 tttattgact gtgtgtggca gatgtcgaaa cagttcccca cagcttttga gttcaatgaa 1380 ggctttttga ttaccgtttt ggatcatctg tatagctgtc gatttggtac tttcttattc 1440 aactgtgact cggctcgaga aagacagaaa cttacagaaa gaacagtttc tctatggtcg 1500 ctaattaaca gcaataaaga caaattcaaa aaccccttct atacaaaaga aatcaatcgg 1560 gttttgtatc cagttgccag catgcgtcac ttggaactgt gggtgaatta ttacatccga 1620 tggaatccca gggtcaagca gcaacagccc aacccagtgg agcagcgtta catggagctt 1680 ttggccttgc gtgacgatta tataaagagg ctcgaggaat tgcagctggc caactccgcc 1740 aagcttgctg atgcccccgc ttcgacttcc agttcgtcac agatggtgcc ccatgtgcag 1800 acgcacttct ga 1812 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV forward <400> 15 ctccatcact aggggttcct tg 22 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV reverse <400> 16 gtagataagt agcatggc 18 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV probe <400> 17 tagttaatga ttaaccc 17 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Titine forward <400> 18 aaaacgagca gtgacgtgag c 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Titine reverse <400> 19 ttcagtcatg ctgctagcgc 20 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Titine probe <400> 20 tgcacggaag cgtctcgtct cagtc 25 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAPN3sfr.f <400> 21 cgcctccaag gcccgt 16 <210> 22 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAPN3sfr.r <400> 22 ggcggaagcg ctggct 16 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MGBTUCAPN3.p <400> 23 ctacatcaac atgagagagg t 21 <210> 24 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAPN3.f <400> 24 cgcctccaag gccagg 16 <210> 25 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAPN3.r <400> 25 ggcggaagcg ctggga 16 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAPN3.p <400> 26 tacatcaaca tgcgggaggt 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MH181PO.F <400> 27 ctccaagcag atgcagcaga 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M267PO.R <400> 28 accatgatgc gcaaggctat 20 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M225PO.p <400> 29 ccgtggtgct gatgggcaag aa 22

Claims (15)

  1. 신경근 장애에 치료학적 효과를 가지는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 전신 투여용 발현 시스템으로서,
    상기 단백질의 발현이 적어도 하나의 조직에서는 독성을 나타내고,
    상기 발현 시스템은
    - 골격근 및/또는 말초 신경 조직을 포함하는 표적 조직에서 치료학적으로 허용가능한 수준으로 상기 단백질을 발현시키고;
    - 표적 조직 이외의 조직, 특히 심장에서 독성학적으로 허용가능한 수준으로 상기 단백질을 발현시키는 전신 투여용 발현 시스템.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 발현 시스템은
    - 상기 표적 조직 이외의 조직, 바람직하게는 상기 단백질의 발현이 독성을 나타내는 조직에서는 상기 단백질의 발현을 방지하거나 발현 수준을 감소시키고/시키거나;
    - 상기 표적 조직에서는 상기 단백질의 발현을 유지하거나 발현 수준을 증가시키는
    적어도 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 단백질은 미오튜불라린(myotubularin), 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 단백질은 칼페인 3(calpain 3), 바람직하게는 서열번호 7의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 발현 시스템은 표적 조직 이외의 조직, 바람직하게는 상기 단백질의 발현이 독성을 나타내는 조직에서 발현된 miRNA의 표적 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 발현 시스템은 miR208a, 바람직하게는 서열번호 10의 서열의 표적 서열을 적어도 하나 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 발현 시스템은 표적 조직 이외의 조직, 바람직하게는 상기 단백질의 발현이 독성을 나타내는 조직에서 프로모터 활성을 적게 나타내거나 또는 전혀 나타내지 않는 프로모터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 발현 시스템은 칼페인 3 유전자의 프로모터 서열, 바람직하게는 서열번호 12의 서열, 또는 miR206의 프로모터 서열, 바람직하게는 서열번호 13의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 발현 시스템은 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 발현 시스템은 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector, AAV), 바람직하게는 AAV8 또는 AAV9 혈청형(serptype)을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템을 포함하는 약학적 조성물.
  12. 청구항 1 내지 청구항 10에 있어서,
    약물로 이용되는 발현 시스템.
  13. 청구항 1 내지 청구항 10에 있어서,
    유전자 치료에 이용되는 발현 시스템.
  14. 청구항 1 내지 청구항 10에 있어서,
    신경근 장애, 바람직하게는 근육병, 더욱 바람직하게는 근세관성 근육병(myotubular myopathy, MLMTM) 또는 LGMD2A의 치료에 이용되는 발현 시스템.
  15. 청구항 13 또는 청구항 14에 있어서,
    상기 발현 시스템은 전신적으로, 바람직하게는 정맥내 주사로 투여되는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
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