KR20190053179A - 유전자 지우개들 - Google Patents

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KR20190053179A
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KR
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cells
cell
engineered
gene construct
nuclease
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KR1020197005575A
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티모시 쿠안-타 루
레무스 웡
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센티 바이오사이언시스, 인코포레이티드
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Abstract

일부 구현예들에서, 본원에서는 조작된 세포들로부터 이종 핵산의 제거를 가능하게 하는 방법들, 조성물들, 시스템들 및 키트들이 제공된다.

Description

유전자 지우개들
관련된 출원
본 출원은 35 U.S.C. §119(e)하에 2016년 7월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/366,755호의 이익을 청구하며, 이의 전체가 본원에 참고문헌으로 통합된다.
개요
일부 구현예들에서, 본원에서 (예로, 세포 치료법들에서 사용되는) 조작된 세포들로부터 이종 핵산(예로, DNA)의 매우 효과적인 제거를 가능하게 하는 방법들, 조성물들, 시스템들 및 키트들이 제공된다. 본 기술은 차세대 인간 세포 치료법들을 수립, 조작, 제조, 및 배포하는 데 광범위하게 적용되는 것이다.
조작된 (합성/인공) 유전 (유전자) 회로들은 일반적으로, 예를 들어, 탈체 분화 및 세포 치료법들을 제조하는 데 유용하다. 세포 기능의 역동적인 조절을 가능하게 하는 조작된 유전자 회로들(이종 유전 회로들)을 보유하는 세포들은 많은 다른 조건들을 치료/예방하기 위한 치료제로서 환자들에게 사용될 수 있다. 그러나, 일단 목적하는 세포 유형들이 만들어지고 환자에게 투여되면, 조작된 회로들은 치료적인 응용에 필요하지 않을 수 있고 심지어 부작용들을 가질 수 있다. 이들이 환자에 투여된 후에 효과적으로 이들 유전 회로들(예로, 이종 DNA 카세트들)을 제거하기 위한 능력은 환자의 안전성에 유용하다. 예를 들어, 줄기세포들의 췌장 베타-섬 세포들로의 분화는 유전 회로들3을 통하여 촉진될 수 있으나, 일단 베타-섬 세포들이 환자들에 도입되면, 유전 회로들의 제거는 조절 및 안전 문제를 감소시킬 것이다. 본원에서 제공되는 바와 같은, 다층의 플랫폼, 이는 일부 구현예들에서 여러 개의 유전적 절단 및/또는 분해 기술들을 결합하는 것으로, 이종 핵산(예로, DNA)의 효과적인 제거("지우는 것")을 위하여 조작된다. 따라서, 본 개시의 조작된 유전자 구조체들은 "유전자 지우개들"로 지칭될 수 있다.
본 개시의 구현예들은, (a) 제1 관심 산물(예로, 재조합효소 또는 뉴클레아제)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 (b) 제2 관심 산물(예로, 치료 분자) 및 역선택가능 마커(예로, 프로드러그)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트(카세트)를 포함하고, 제1 관심 산물의 발현 또는 활성이 활성화 가능하며, 및 제1 관심 산물은 카세트의 절단 또는 분해를 조절하는, 조작된 유전자 구조체들(유전자 지우개들)을 제공한다. 일부 구현예들에서, 구성 (a)는 구성 (b)로부터 업스트림(upstream)에 위치한다.
일부 구현예들에서, 조작된 유전자 구조체들(유전자 지우개들)은 (a) 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (b) 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 (b) 관심 산물(예로, 치료 분자) 및 역선택가능 마커(예로, 프로드러그)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열를 포함하고, 재조합효소 및 뉴클레아제는 카세트의 절단 및/또는 분해를 활성화 가능하고 이를 조절하는 것이다.
일부 구현예들에서, 조작된 유전자 구조체들(유전자 지우개들)은 (a) 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 유도 프로모터 및 (b) 관심 산물 및 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 카세트를 포함하고, 상기 카세트는 동종 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹된다(flanked).
일부 구현예들에서, 조작된 유전자 구조체들(유전자 지우개들)은 (a) 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 유도 프로모터 및 (b) 관심 산물 및 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 카세트를 포함하고, 상기 카세트는 뉴클레아제 인식 부위들에 의해 플랭킹된다.
일부 구현예들에서, 조작된 유전자 구조체들(유전자 지우개들)은 (a) 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 유도 프로모터, (b) 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 유도 프로모터, 및 (c) 관심 산물 및 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 카세트를 포함하고, 상기 카세트는 동종 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되고 동종 뉴클레아제 인식 부위들을 포함한다.
본 개시의 일부 구현예들은 세포로 본원에 기술된 바와 같은 조작된 유전자 구조체들 중 임의의 하나를 도입하는 단계를 포함하고, 관심 산물은 세포의 분화, 팽창 또는 표현형 유지를 돕는 것인 방법을 제공한다.
본 개시의 다른 구현예들은 세포로 본원에 기술된 바와 같은 조작된 유전자 구조체들 중 임의의 하나로 도입하는 단계를 포함하고, 관심 산물은 치료 분자 및/또는 예방 분자인 방법을 제공한다.
또한 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 임의의 조작된 유전자 구조체들을 포함하는 벡터들, 세포들, 조성물들 및 키트들을 제공한다.
도 1은 어떻게 다중으로 중복되고 직교하는 재조합효소 단백질들이 사용되어 표적 세포들로부터 이종 DNA 구조체들을 절단하는 지에 대한 예시를 나타낸다. 이들 재조합효소들은 유도 전사, 스플리트 단백질 활성의 재구성 또는 단백질의 뉴클레아제로의 전좌를 통하여 조절된다.
도 2A-2B는 분해를 위해(도 2A) 및/또는 뉴클레아제 표적 부위들 사이 내에 위치하는 큰 DNA 단편들을 절단하는 재조합을 촉발시키기 위하여(도 2B) DNA를 표적하기 위하여 어떻게 뉴클레아제들이 사용되는 지에 대한 예시를 나타낸다. 이들 뉴클레아제들은 메가뉴클레아제들, CRISPR-Cas 뉴클레아제들, 징크-핑거 뉴클레아제들, 및 TALE 뉴클레아제들을 포함할 수 있다. 뉴클레아제들에 의하여 유도된 이중-가닥 절단들(breaks)은 표적화된 단백질-암호화 서열들을 불활성화하거나 또는 큰 결실들을 촉매하는 재조합을 야기할 수 있고, 이는 공여 DNA의 존재를 통하여 더 촉진될 수 있다.
도 3은 이종 DNA 구조체들 내에 암호화된 역선택가능 마커들(CSMs)의 예시를 나타내고, 이에 따라 재조합-기반 또는 뉴클레아제 기반 접근법들에 따른 효율적인 DNA 절단을 겪지 않은 세포들은 독성 약물로 전환되는 프로드러그의 첨가로 사멸된다. 더욱이, 유도 사멸 스위치들은 독소들을 발현하거나 스플리트 독소들을 이형체화하는 작은-분자 유도제의 첨가로 세포 사멸을 촉진하는 것으로 암호화된다. 이들 CSM들은 유전자 지우개들과의 조합으로 사용되어 이종 DNA 결실의 효율을 강화시킬 것이다.
도 4는 안정한 통합을 위한 재조합-기반 절단 구조체의 예시를 나타낸다. 이들 분자 구조체는 제한 효소들의 다른 조합들과 함께 단순히 벡터를 절단함으로써 유전적인 부분들을 쉽게 교환할 수 있도록 한다.
도 5는 재조합효소 절단 효율 분석을 위한 시스템의 예시를 나타낸다. 리포터 벡터는 역-선택 마커(예로, HSV 티미딘 키나제)를 플랭킹(flanking)하는 재조합 서열들을 암호화한다. DNA 어셈블리는, 예를 들어, 제한 효소 클로닝, 깁슨 어셈블리(Gibson assembly) 및 골든 게이트 어셈블리(Golden Gate assembly)를 포함하는 여러-단계 접근법들로 수행될 수 있다. 재조합효소 벡터는 재조합효소(예로, Bxb1)를 암호화한다.
도 6은 일시적인 293FT 세포 형질주입 분석으로 다양한 티로신 재조합효소들의 재조합 활성을 테스트한 데이터를 나타낸다. 293FT 세포들은 리포터 플라스미드, 재조합효소 플라스미드, 및 형질주입 마커 플라스미드(예로, BFP를 암호화하는 플라스미드)와 동일한 비율로 일시적으로 형질주입된다. 세포들은 형질주입 후 24 후에 GFP 형광을 분석하였고, BFP 발현으로 제어하였다. 위쪽 그래프는 % GFP+ 세포들을 나타내고, 아래쪽 그래프는 GFP+ 세포들의 GFP 평균 형광 세기의 중앙값을 나타낸다.
도 7은 일시적인 293FT 세포 형질주입 분석으로 다양한 티로신 재조합효소들의 재조합 활성을 테스트한 데이터를 나타낸다. 293FT 세포들은 리포터 플라스미드, 재조합효소 플라스미드, 및 형질주입 마커 플라스미드(예로, BFP를 암호화하는 플라스미드)와 동일한 비율로 일시적으로 형질주입된다. 세포들은 형질주입 후 24 후에 GFP 형광으로 분석하였고, BFP 발현으로 제어하였다. 히스토그램은 재조합효소가 있는 및 재조합효소가 없는 형질주입된 세포 집단들을 나타낸다.
도 8은 재조합효소 절단 효율 분석을 위하여 사용된 시스템의 예시를 나타낸다. BpiI(x2)-HSVtk-SV40pA-EGFP-Esp3I(x2) 카세트는 pcDNA3.1(+) 포유동물 발현 벡터(Life Tech)로 삽입된다. 재조합 서열들은 골든 게이트 절단/접합(Golden Gate digestion/ligation)을 통해 BpiI 및 Esp3I 부위들로 삽입된다.
도 9는 일시적인 293FT 세포 형질주입 분석으로 다양한 세린 인테그라제들의 재조합 활성을 테스트하는 데이터를 나타낸다. 293FT 세포들은 리포터 플라스미드, 재조합효소 플라스미드, 및 형질주입 마커 플라스미드(예로, BFP를 암호화하는 플라스미드)와 동일한 비율로 일시적으로 형질주입된다. 세포들은 형질주입 후 24 후에 GFP 형광으로 분석하였고, BFP 발현으로 제어하였다. 위쪽 그래프는 % GFP+ 세포들을 나타내고, 아래쪽 그래프는 GFP+ 세포들의 GFP 평균 형광 세기의 중간값을 나타낸다. 각각의 바들의 그룹은, 왼쪽에서 오른쪽으로, 리포터, 재조합효소, 및 리포터+재조합효소에 대한 데이터를 나타낸다.
도 10은 일시적인 293FT 세포 형질주입 분석으로 다양한 세린 인테그라제들의 재조합 활성을 테스트하는 데이터를 나타낸다. 293FT 세포들은 리포터 플라스미드, 재조합효소 플라스미드, 및 형질주입 마커 플라스미드(예로, BFP를 암호화하는 플라스미드)와 동일한 비율로 일시적으로 형질주입된다. 세포들은 형질주입 후 24 후에 GFP 형광으로 분석하였고, BFP 발현으로 제어하였다. 히스토그램은 재조합효소가 있는 및 재조합효소가 없는 형질주입된 세포 집단들을 나타낸다.
도 11은 부위-특이적 통합을 위한 재조합효소-기반 절단 구조체의 예시를 나타낸다. 재조합효소-기반 절단 구조체를 암호화하는 엔트리 벡터(entry vector)는 YEP 및 히그로마이신을 발현하는 미리 조작된 293FT 랜딩 패드 세포주(landing pad cell line)로 통합된다. 성공적인 통합은 퓨로마이신의 발현을 야기한다.
도 12는 GFP 리포터의 293FT 랜딩 패드 세포주로의 성공적인 통합을 나타낸다. 통합시, 세포들은 GFP를 발현하고 동시에 YFP의 발현을 잃는다. 퓨로마이신의 선택압은 통합되지 않은 세포들을 제거한다.
도 13은 유전체적-통합된 구조체들을 절단하는 방법의 예시를 나타낸다. 재조합-기반 절단 구조체를 암호화하는 엔트리 벡터는 미리 조작된 293FT 랜딩 패드 세포주로 통합된다. 통합된 세포주들은 재조합효소-발현 플라스미드 및 (예로, BFP를 발현하는) 리포터 플라스미드로 일시적으로 형질주입되고 시간에 따른 GFP 발현에 대하여 분석되었다. 역-선택 마커(CSM)는 통합된 구조를 가지는 세포들을 사멸시키기 위해 사용된다.
도 14는 도 13에 기술된 실험적인 방법을 이용하여 수득한 실시예 데이터를 나타낸다. 3개의 다른 재조합효소-기반 절단 구조체들을 발현하는 세포주들은 동종 재조합효소들로 형질주입되고, GFP 발현은 시간에 따라 분석되었다. GFP+ 세포들의 %는 BFP 발현에 대하여 제어되지 않거나 제어된 세포 집단들에 대하여 플로팅되었다. 각 바들의 그룹은, 왼쪽에서 오른쪽으로, 2일차, 4일차 및 7일차에 대한 데이터를 나타낸다.
도 15는 도 13에 기술된 실험적인 방법을 이용하여 수득한 실시예 데이터를 나타낸다. 도 14 내 B3 재조합효소의 일시적인 형질주입 후, 프로드러그를 사용하여 pENTR_B3RT 절단 구조체를 보유하고 있는 세포들을 사멸시켰다. 역선택마커(CSM)은 프로드러그를 독성 약물로 전환시킨다. 이 경우에, CSM은 HSVtk였고 프로드러그는 간사이클로비르(GCV)였다. 세포들은 7일 동안 0.5, 1, 2 및 5 μM GCV로 처리하였고 GFP 발현은 시간에 따라 분석되었다. 히스토그램들은 GFP- 세포들의 % 및 GFP+ 세포들의 %을 나타낸다.
도 16은 도 13에 기술된 실험적인 방법을 이용하여 수득한 실시예 데이터를 나타낸다. 도 14 내 B3 재조합효소의 일시적인 형질주입 후, 프로드러그를 사용하여 pENTR_B3RT 절단 구조체를 보유하고 있는 세포들을 사멸시켰다. 역선택마커(CSM)은 프로드러그를 독성 약물로 전환시킨다. 이 경우에, CSM은 HSVtk였고 프로드러그는 간사이클로비르(GCV)였다. 세포들은 7일 동안 0.5, 1, 2 및 5 μM GCV로 처리하였고 GFP 발현은 시간에 따라 분석되었다. 히스토그램들은 GFP- 세포들의 % 및 GFP+ 세포들의 %을 나타낸다.
도 17은 시스템의 예를 나타내고, 상기 시스템에서 가이드 RNA들(gRNAs)은 유전체적으로-통합된 회로(circuit)를 절단하고 제거한다. 본 도면에서, gRNAs은, 세포들로 안정하게 통합되어 온 YFP 리포터인 경우, 5'-UTR 및 3'-UTR을 표적한다.
도 18은 일시적인 형질주입 분석을 수행하여 CRISPR/Cas9를 이용하여 유전체적으로-통합된 회로의 제거를 테스트한 데이터를 나타낸다. 단일 gRNA 및 Cas9을 암호화하는 벡터들은 (예로, BFP를 발현하는) 리포터 플라스미드와 함께 YGP를 발현하는 세포주로 공-형질주입되었다. 일부 경우들에서, 다른 gRNA들을 암호화하는 두 벡터들은 리포터 플라스미드와 함께 형질주입되었다. 세포 집단들은 BFP 발현으로 제어되었고, YFP+ 세포들의 %는 시간에 따라 플롯되었다. gRNA들의 다른 조합들은 YFP를 제거하기 위하여 사용될 수 있다. 각 바들의 그룹은, 왼쪽에서 오른쪽으로, 2일차, 5일차 및 7일차에 대한 데이터를 나타낸다.
도 19는 도 13에 기술된 실험적인 방법을 이용하여 수득한 실시예 데이터를 나타낸다. pENTR_B3RT_FRT 재조합효소-기반 절단 구조체들을 발현하는 세포주들은 나타낸 타임라인에 따라 연속적으로 B3 또는 Flp으로 형질주입된다. GFP 발현은 시간에 따라 분석되고, 및 히스토그램들은 15일차 GFP+ 세포들의 %를 나타낸다. pENTR_B3RT_FRT 재조합효소-기반 절단 구조체는 구조체 B3RT_FRT_iCasp9_SV40pA_FRT_B3RT_EGFP_BGHpA를 암호화하고, 여기서 B3RT 및 FRT은 각각 B3 및 Flp에 대한 재조합 서열이고; iCasp9는 역 선택 마커(CSM)이다.
도 20은 도 13에 기술된 실험적인 방법을 이용하여 수득한 실시예 데이터를 나타낸다. pENTR_B3RT_FRT 재조합효소-기반 절단 구조체들을 발현하는 세포주들은 나타낸 타임라인에 따라 연속적으로 B3 또는 Flp으로 형질주입된다. GFP 발현은 시간에 따라 분석되고, 및 15일차 GFP+ 세포들의 %를 플로팅하였다. 바들은, 왼쪽에서 오른쪽으로, 기록 없음(no rec); B3; B3, Flp; Flp; 및 Flp, B3에 대한 데이터를 나타낸다.
본원에서는, 부분적으로, 조작된 세포들로부터 이종 핵산을 매우 효율적으로 제거할 수 있게 함으로서, 차세대 세포 치료들을 가능하게 하는 강력한 기술이 기술되어 있다. 본원의 조작된 유전자 구조체들은 "유전자 지우개들(genetic erasers)"로 지칭될 수 있다. 본원에 기술된 유전자 지우개 기술들은 적어도 두 가지 주된 응용들에서 유용하다. 첫째로, 그들은 탈체(ex vivo)에서 세포들의 분화, 팽창 또는 표현형 유지를 돕는 유전적인 회로들을 만들어내기에 유용하고, 이들은 환자들에 도입되기 전에 제거될 수 있는 것이다. 둘째, 이들은 이종 DNA를 조작된 세포들로부터 제거함으로써 세포 치료들이 생체 내(in vivo)에서 전달된 후 그들의 기능을 잃은 후에 촉발될 수 있는 안전한 스위치들로서 사용된다.
따라서, 일부 측면들에서, 이들 유전자 지우개들은 탈체에서 특정 표현형들의 분화, 팽창 또는 유지를 증가시키는 유전 회로들의 구현 및 체내로의 도입 전에 유전자 회로들의 연속적인 제거를 가능하게 한다. 세포 표현형들을 조절하는 존재하는 전략들은 작은 분자들, 성장인자들, RNA 구조들 또는 DNA 회로들의 사용을 포함한다. 작은 분자들은 분화를 증가시키기에 유용할 수 있으나, 이와 같은 화합물들은 내인성 세포 조절의 복잡성들을 고려할 때 수고스럽고 어려울 수 있다. 성장 인자들은 탈체에서 세포들을 프로그래밍하는 데 성공적으로 사용되어 왔으나 많은 잠재적인 조합들을 고려할 때 발견하고, 측정하고, 적용하는 데 비용이 많이 들 수 있다. 전사 인자들 및 기타 세포 내 세포 기능 조절자들을 암호화하는 RNA 구조들은 세포 프로그래밍에 이용되어 왔으나, 프로그램될 수 있는 RNA 조절자들의 부재로 인하여 개선되는 효율(비록, 이것이 최근 발전들과 함께 변화하기 시작하였을 지라도 (25))에 필요한 세포 프로그램에 복잡한 역학을 암호화하는 데 사용되지 못하였다. DNA 회로들은 복합체 전사 프로그램들, 예로 iPS 세포들로부터 유래한 전구 세포들의 췌장 베타-섬 유사 세포들(beta-islet-like cells)로의 분화를, 상기에 기술한 바와 같이, 프로그래밍하기 위하여 사용되어 왔다. 이들 회로들은 세포 내 조절자들, 예로 전사 인자들 및 마이크로RNA들을 발현하기 위하여, 뿐만 아니라 췌장 인자들, 예로 성장 인자들 및 사이토카인들을 분비하기 위하여 사용될 수 있고, 따라서 규모를 증가시키고 탈체 세포 프로그래밍 비용을 감소시킬 수 있는 잠재력을 가진다. 환자들에게로의 도입되기 전 이와 같은 회로들의 제거는 안전성 및 규제 부담에 대한 우려를 줄일 것이다.
본 개시의 유전자 지우개들은, 일부 구현예들에서, 다양한 기작들을 통합시켜 유전자 지우개(결실/분해)를 현저한 수준에 도달하게 하고, 이는 세포들을 이종 활성들 없이 기준 상태로 회복시키고 및 게놈을 외부 DNA(재조합효소들은 최소한의 효과들로 작은 DNA 상흔(scar)을 남길 수 있음)의 흔적 없이 기준 상태로 회복시킬 수 있는 것이다. 유전자 지우개들의 여러 개의 중복된 층들을 이용하는 것은 유전자 결실의 효율성이 현저하게 개선될 수 있도록 하고 본 기술의 임상적인 응용들(임상-등급 활성에 도달하는 것)을 가능하게 하는 데 중요하다.
본원에 기술된 다양한 접근법들로, 이종 DNA를 제거하거나 이종 DNA를 포함하는 세포들을 사멸시키는 것의 효율성들을 측정한다. 전자에서, 형광 또는 qPCR-기반 분석들이 사용된다. 후자에서는, 세포 생존을 생존-사멸 분석들(live-dead assays)을 이용하여 관찰한다. 이는 세포주들에서 프로토타이핑되고 치료적으로 관련있는 세포 유형들(예로, 중간엽 줄기 세포들, T 세포들, NK 세포들)로 확장된다. 이와 같은 기술들은 효율적인 세포 분화를 프로그래밍하고, 그리고 나서 치료 전에 이들 회로들을 제거하는 데 유용하다. 이와 같은 기술들은 또한 유전적으로 조작된 세포 치료들의 생체 내 응용들을 위한 사멸 스위치들 또는 OFF 스위치들로서 유용하다.
유전자 지우개들의 주요 기술적 과제는 유전자를 지우는 과정으로부터 벗어나는 세포들의 수를 최소화하는 것이다. 임상 시험에서 CAR T 세포들의 용량들은 2*105-2*107 CD19 CAR T 세포들/kg이고, 임상에서 사용되는 중간엽 줄기 세포들(MSCs)은 1-3*106 MSCs/kg (27)이다. 따라서, 임상에서 사용되는 세포 치료들의 최대 용량들은 하이엔드에서 109 세포들 미만인 것으로 보인다. 용량 당 1 세포 미만이 이종 유전자 물질을 포함하는 것을 보장하기 위하여, 이는, 일부 구현예에서, 109 이상의 효율성을 달성할 수 있는 유전자 지우개들이 선호된다는 것을 의미한다. 이러한 엄격한 효율성을 달성하기 위하여, 여러 개의 유전자 지우개 기작들은, 본원에서 제공된 바와 같이, 적층될 수 있다. 유전자 지우개 구성들의 조합들은 증가된 효율성들에 도달할 수 있다. 예를들어, 97% 이상 절단 효율이 4개의 다른 재조합효소들로 달성되고 97% 이상 사멸 효율이 2개의 역선택가능 마커들로 달성되면, ~7.310 세포들 중 오직 하나의 세포만이 유전자 지우개 기술의 적용 이후에도 남아있을 것이다. 일부 구현예들에서, 조건부 복제 플라스미드들이 유전자 회로들을 게놈으로 암호화하는 것 대신 사용되어 새로운 역학 조절자들과 함께 이종 DNA 또는 RNA 회로들을 제거하는 효율을 개선시킨다(25).
따라서, 본원에서 (a) 재조합효소를 암호화하는 재조합효소 서열과 작동 가능하게 연결된 유도 프로모터 및 (b) 관심 산물 및 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 카세트를 포함하는 조작된 유전자 구조체들을 제공하고, 상기 카세트는 동종 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되는 것이다. 재조합효소는 카세트를 자가-절단하는 기능을 가지고, 역선택가능 마커는 절단 후에 카세트가 남아있는 임의의 세포들을 사멸시키는 기능을 한다. 일부 구현예들에서, 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 유도 프로모터는 관심 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터(5'로부터)로부터 업스트림에 위치하는 것이다. 도 1 및 3을 참조하라.
또한 본원에서 (a) 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 유도 프로모터 및 (b) 관심 산물 및 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 카세트를 포함하는 조작된 유전자 구조체들을 제공하고, 상기 카세트는 동종 뉴클레아제 인식 부위들에 의해 플랭킹되는 것이다. 뉴클레아제는 카세트를 절단/분해하는 기능을 가지고, 역선택가능 마커는 절단 후에 카세트가 남아있는 임의의 세포들을 사멸시키는 기능을 한다. 일부 구현예들에서, 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 유도 프로모터는 관심 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터(5'로부터)로부터 업스트림에 위치하는 것이다. 도 2 및 3을 참조하라.
상기에서 논의한 바와 같이, 본 개시의 기술은 다중층상 플랫폼을 포함한다. 따라서, 관심 산물을 암호화하는 단일 유전자 구조는 여러 개(예로, 적어도 2, 3, 4, 또는 5)의 다른 재조합효소들, 뉴클레아제들 및/또는 역선택가능 마커들을 암호화할 수 있다. 마찬가지로, 동일 유전자 구조는 재조합효소 인식 부위들의 여러 개의 쌍들 및/또는 여러 개의 뉴클레아제 인식 부위들을 포함하여 다른 재조합효소들 및/또는 뉴클레아제 및 관심 산물을 암호화하는 핵산의 고도로 효율적인 절제 및/또는 분해을 가능하게 할 수 있다.
일부 구현예들에서, 단일 구조는 재조합효소, 뉴클레아제 및 역선택가능 마커를 암호화한다. 일부 구현예들에서, 단일 구조는 적어도 하나(예로, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 재조합효소, 적어도 하나(예로, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 뉴클레아제 및 적어도 하나(예로, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 역선택가능 마커를 암호화한다. 일부 구현예들에서, 단일 구조는 적어도 하나의 재조합효소 및 적어도 하나의 뉴클레아제를 암호화한다. 일부 구현예들에서, 단일 구조는 적어도 하나의 재조합효소 및 적어도 하나의 역선택가능 마커를 암호화한다. 일부 구현예에서, 단일 구조는 적어도 두개의 뉴클레아제들 및 적어도 하나의 재조합효소를 암호화한다. 일부 구현예들에서, 단일 구조는 적어도 두개의 뉴클레아제들 및 적어도 하나의 역선택가능 마커를 암호화한다. 일부 구현예들에서, 단일 구조는 적어도 두개의 재조합효소들, 적어도 두개의 뉴클레아제들 및 적어도 하나의 역선택가능 마커들을 암호화한다. 일부 구현예들에서, 단일 구조는 적어도 두개의 재조합효소들, 적어도 두개의 뉴클레아제들 및 적어도 두개의 역선택가능 마커들을 암호화한다.
따라서, 일부 구현예들에서, 단일 구조의 카세트는 동종 재조합효소 인식 부위의 여러 개 쌍들에 의해 플랭킹될 수 있고 및/또는 여러 개 뉴클레아제 인식 부위들을 포함할 수 있다.
또한, 일부 구현예에서, 조작된 유전자 구조체는 다른 재조합효소 및/또는 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 각각 연결된, 적어도 두 개의 유도 프로모터들을 포함하는 카세트를 포함하고, 카세트는 다른 재조합효소들과 동족인 재조합 효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되고 및/또는 다른 뉴클레아제들과 동족인 뉴클레아제 인식 부위들을 포함한다. 일부 구현예들에서, 유도 프로모터는 다른 재조합효소 및/또는 뉴클레아제를 각각 암호화하는, 적어도 두 개의 뉴클레오티드 서열들에 연결되어 있고, 카세트는 다른 재조합효소들과 동족인 재조합 효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되고 및/또는 다른 뉴클레아제들과 동족인 뉴클레아제 인식 부위들을 포함한다. 일부 구현예들에서, 구조는 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 각각 연결된, 적어도 세 개의 유도 프로모터들을 포함하고, 카세트는 다른 재조합효소들과 동족인 재조합 효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되고 및/또는 다른 뉴클레아제들과 동족인 뉴클레아제 인식 부위들을 포함한다. 일부 구현예들에서, 유도 프로모터는 다른 재조합효소 및/또는 뉴클레아제를 각각 암호화하는, 적어도 세 개의 뉴클레오티드 서열에 연결되어 있고, 카세트는 다른 재조합효소들과 동족인 재조합 효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되고 및/또는 다른 뉴클레아제들과 동족인 뉴클레아제 인식 부위들을 포함한다.
상기에서 논의한 바와 같이, 유전자 지우개 구성들의 다른 조합들은 이종 핵산의 제거에서 증가된 효율성을 야기한다. 일련의 절단, 분해 및/또는 역선택 반응들(세포들을 발현 카세트의 각 구성을 발현시키는 데 필요한 유도제들 및/또는 역선택제들에 노출시키는 것을 포함함) 후에, 일부 구현예들에서, 최초로 조작된 유전자 구조체들을 받아들인 세포들의 20%(예로, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0%) 미만은 일련의 절단, 분해 및/또는 역선택 반응들 후에 발현 카세트를 더 이상 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, 최초로 조작된 유전자 구조체를 받아들인 세포들의 80-100%, 80-95%, 80-90%, 80-85%, 85-100%, 85-95%, 85-90%, 90-100% 또는 95-100%는 일련의 절단, 분해 및/또는 역선택 반응들 후에 발현 카세트를 더 이상 포함하지 않는다.
따라서, 일부 구현예들에서, 본 개시의 방법들은 세포들의 집단을 조작된 유전자 구조체를 본원에서 제공된 바와 같이 도입하는 단계, 집단의 세포들을 배양하여 관심 산물을 제조하는 단계, 적어도 하나(하나 이상)의 유도제의 존재 하에 세포들을 배양하여 재조합효소 및/또는 뉴클레아제를 발현하여 조작된 유전자 구조체로부터 카세트를 절단 및/또는 분해하는 단계, 역선택가능 제제의 존재하여 집단의 세포들을 배양하여 역선택가능 마커를 여전히 보유하고 발현하는 세포들을 사멸하는 단계를 포함한다. 유도제는 동종 유도 프로모터(이들의 활성은 유도제의 존재하에서 활성화됨)를 활성화시키는 임의의 제제이다. 역선택제는 역선택가능 마커(이는 세포에 독성이 있는 것, 예로 역선택가능 제제의 존재 하에 독성 제제로 전환되는 것임)를 발현/포함하는 세포를 사멸시키는 임의의 제제이다.
재조합효소-기반 절단
일부 구현예들에서, (a) 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 유도 프로모터 및 (b) 관심 산물 및 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트(카세트)를 포함하고, 카세트는 동종 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예들에서, 구성 (a)는 구성 (b)로부터 업스트림에 위치한다. 일부 구현예들에서, 종결 서열은 구성 (a) 및 구성 (b) 사이에 위치한다. 도 1을 참조하라.
일부 구현예들에서, 구성 (a)는 다른 재조합효소들에 각각 연결된, 적어도 두 개(또는 적어도 세 개)의 유도 프로모터들을 포함하고, 카세트는 다른 재조합들에 동종인 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예들에서, 구성 (a)의 뉴클레오티드 서열은 적어도 둘(또는 적어도 셋)의 다른 재조합효소들을 암호화하고, 카세트는 다른 재조합효소들에 동종인 재조합 인식 부위들에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예들에서, 구성 (b)의 뉴클레오티드 서열은 적어도 둘(또는 적어도 셋)의 역선택가능 마커들을 암호화한다.
일부 구현예들에서, 재조합효소(들)은 티로신 재조합효소들 및 티로신 인테그라제들로부터 선택된다. 예를 들어, 재조합효소(들)은 Cre, Dre, Flp, KD, B2, B3, λ, HK022 및 HP1 재조합효소들로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예들에서, 재조합효소(들)은 세린 재조합효소들 또는 세린 인테그라제들로부터 선택된다. 예를 들어, 재조합효소(들)은 γδ, ParA, Tn3, Gin, ΦC31, Bxb1 및 R4 재조합효소들로부터 선택될 수 있다.
재조합효소는 일반적으로 약 30 염기쌍(bp) 및 40 bp 사이인 짧은 DNA 서열(들)을 인식하는 부위-특이적 효소이고, 이는 이들 재조합 효소 인식 서열들 간의 재조합을 매개하고, 이는 재조합 인식 서열들 사이 DNA 단편들의 절단, 통합, 역전 또는 교환을 야기한다.
재조합효소들은 두 개의 별개의 군들로 분류될 수 있다: 별개의 생화학적 특성들에 기반하여, 세린 재조합효소(예로, 위치특이적 재조합촉진효소들(resolvases) 및 인베르타아제들(invertases)) 및 티로신 재조합효소(예로, 인테그라제들). 세린 재조합효소 및 티로신 재조합효소는 양방향성 재조합효소들 및 단일방향성 재조합효소들로 추가로 나눌 수 있다. 양방향형 세린 재조합효소들의 예시들은, 비제한적으로, β-six, CinH, ParA 및 γδ을 포함하고, 단일방향성세린 재조합효소들의 예시들은, 비제한적으로, Bxb1, φC31, TP901, TG1, φBT1, R4, φRV1, φFC1, MR11, A118, U153 및 gp29을 포함한다. 양방향성 티로신 재조합효소들은, 비제한적으로, Cre, FLP, 및 R을 포함하고; 및 단일방향성 티로신 재조합효소들은, 비제한적으로, 람다(Lambda), HK101, HK022 및 pSAM2을 포함한다. 세린 및 티로신 재조합효소들 이름은 재조합효소가 DNA를 공격하는 데 사용하는 보존된 친핵성 아미노산 잔기로부터 유래되었고 이는 가닥 교환 중에 DNA에 공유 결합된다. 재조합효소들은 유전자 녹아웃들의 생성 및 분류 문제들의 해결을 포함하는 수많은 표준 생물학적 응용들에 사용되어 왔다.
재조합의 결과는, 부분적으로, 일반적으로 30 bp 미만 길이로 재결합되는, 두 개의 짧은 반복 DNA 서열들의 위치 및 방향에 의존한다. 재조합효소들은 이들 반복 서열들에 결합하고, 이는 각 재조합효소들에 특이적이고, 본원에서 재조합 인식 서열들 또는 재조합 인식 부위들로 지칭된다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같이, 재조합효소들은 재조합효소들이 반복 DNA 서열들 간의 역전 또는 절단을 매개할 수 있는 재조합 인식 부위에 특이적이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 재조합효소는 또한 간섭 유전자 요소(intervening genetic element)(예로, 프로모터, 종결자, 또는 출력 핵산 서열)를 플랭킹하는 이의 동종 재조합효소 인식 부위들을 인식하는 것으로 볼 수 있다. 핵산 또는 핵산의 단편은 상기 요소가 두 반복 DNA 서열들의 사이 및 바로 옆에 인접하여 위치하는 경우 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되는 것이라 할 수 있다. 일부 구현예들에서, 재조합효소 인식 부위들은 서로 겹치지 않는다. 그러나, 다른 구현예들에서, 재조합효소 인식 부위들은 서로 결치고, 이는 결합 복합성을 현저하게 증가시키도록 한다.
역전 재조합은 두 개의 짧고, 역전되고, 반복되는 DNA 서열들 사이에서 발생한다. DNA 벤딩 단백질들(DNA bending proteins)에 보조를 받은, DNA 루프 형성은 DNA 절단 및 결합이 발생하는 위치에서, 두 개의 반복 서열들과 함께 일어난다. 이 반응은 ATP 독립적이고 슈퍼코일된 DNA를 요구한다. 이러한 역전 재조합 이벤트의 끝은 반복되는 부위 사이의 DNA 스트레치가 역전되고(즉, DNA 스트레치가 방향을 반대로 만듬) 이에 코팅 서열은 이제 비코딩 서열이고 그 반대도 마찬가지이다. 이와 같은 반응들에서, DNA는 순 수익이 없거나 또는 DNA 손실이 없는 것으로 보존된다.
대조적으로, 통합(절단) 재조합은 두 개의 짧은 반복 DNA 서열들 사이에서 발생하고, 상기 서열들은 동일한 방향을 향하는 것이다. 이 경우에, 간섭 DNA는 절단/제거된다.
재조합효소들은 또한 비가역적인 또는 가역적인 것으로 분류될 수 있다. 비가역적인 재조합효소는 두 상보적인 재조합 부위들 사이의 재조합을 촉매할 수 있는 재조합효소이나, 추가적인 인자의 도움 없이 본 재조합에 의하여 형성되는 하이브리드 부위들 사이에 재조합을 촉매할 수 없다. 따라서, 비가역적 인식 부위는 재조합효소 인식 부위를 지칭하는 것으로, 이는 비가역적 재조합효소에 대한 두 개의 DNA 인식 서열들 중 하나로 역할을 할 수 있고 해당 부위에서 동종 재조합이 수반된 하이브리드 재조합 부위로 변형되는 것이다. 예를 들어, attB 및 attP은 Bxb1 및 phiC31 재조합효소들에 대한 비가역적 재조합 부위들이고- attB는 attP의 상보적인 비가역적 재조합 부위이고, 이와 반대도 마찬가지이다. AttB/attP 부위들은 서로 반응할 뿐 다른 돌연변이들과는 반응하지 않는 직교 B/P 쌍들(orthogonal B/P pairs)을 생산하기 위하여 돌연변이 된다.
phiC31 (φC31) 인테그라제는, 예를 들어, 진핵 세포들 내에서 발견되지 않는 추가적인 인자가 존재하지 않을 때 attB×attP 반응만을 촉매한다. 재조합효소는 attB 및 attP 간의 재조합으로 형성된 attB 및 attP 하이브리드 재조합 부위들 사이의 재조합을 매개하지 못한다. phiC31 인테그라제와 같은 재조합효소들은 단독으로 역 반응을 촉매하지 못하기 때문에, phiC31 attB×attP 재조합이 안정하다.
비가역적인 재조합효소들, 및 비가역적 재조합효소들을 암호화하는 핵산들은 본 기술에 기술되고 통상적인 방법들을 이용하여 수득될 수 있다. 비가역적 재조합효소들의 예시들은, 비제한적으로, phiC31 (φC31) 재조합효소(서열번호 11), 콜리파지 P4 재조합효소, 콜리파지 람다 인테그라제, 리스테리아 A118 파지 재조합효소, 및 악티노파지 R4 Sre 재조합효소, HK101, HK022, pSAM2, Bxb1, TP901, TG1, φBT1, φRV1, φFC1, MR11, U153 및 gp29를 포함한다.
대조적으로, 가역적 재조합효소는 두 개의 상보적인 재조합효소 인식 부위들 사이의 재조합을 촉매할 수 있고, 및 추가적인 인자의 도움 없이 초기 재조합에 의하여 형성된 부위들 사이의 재조합을 촉매하여, 이를 역전시킬 수 있는 는 재조합효소이다. 재조합에 의하여 생성된 산물-부위들은 그 자체가 연속적인 재조합을 위한 기질들이다. 가역적 재조합효소 시스템들의 예시는, 비제한적으로, Cre-lox 및 Flp-frt 시스템들, R, β-six, CinH, ParA 및 γδ을 포함한다.
일부 구현예들에서, 조작된 유전자 구조체는 티로신 재조합효소들 또는 티로신 인테그라제들로부터 선택된 재조합효소를 암호화한다. 일부 구현예들에서, 재조합효소는 Cre, Dre, Flp, KD, B2, B3, λ, HK022 및 HP1 재조합효소들로부터 선택되는 것이다. 일부 구현예들에서, 조작된 유전자 구조체는 세린 재조합효소들 또는 세린 인테그라제들로부터 선택된 재조합효소를 암호화한다. 일부 구현예들에서, 재조합효소는 γδ, ParA, Tn3, Gin, ΦC31, Bxb1 및 R4 재조합효소들로부터 선택되는 것이다.
본원에서 제공되는 재조합효소들은 본 개시의 구현예들에서 사용될 수 있는 재조합효소들의 배타적인 예시들을 의미하는 것은 아니다. 본 개시의 유전자 지우개들의 복합성은 신규 직교 재조합효소들에 대한 데이터베이스들을 얻거나 또는 정의된 DNA 특이성들을 갖는 합성 재조합효소들을 설계함으로써 확대될 수 있다. 유용한 재조합효소들의 다른 예시들은 이 기술 분야의 숙련자들에게 알려져 있고, 발견되거나 생성된 임의의 신규 재조합효소들 본 개시의 다른 구현예들에서 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
추가로, 재조합효소 발현 및/또는 활성의 조절은 많은 다른 방식들로, 예를 들어, ABA 시스템(Liang, F.S., 외. Sci. Signal., 2011, 4, rs2 LP-rs2), GIB 시스템 (Miyamota, T. 외. Nat Chem Biol, 2012, 8, 465-470), FKBP-FRB 기반 이량체화 시스템 (Komatsu, T. 외. Nat Meth, 2010, 7, 206-208), 타목시펜 시스템 (Matsuda, T. 외. Proc. Natl. Acad. Sci., 2007, 104, 1027-1032), DD(FKBP) 시스템 (Banaszynski, L.A. 외. Cell, 2006, 126, 995-1004), DD(DHFR) 시스템 (Iwamoto, M. 외. Chem. Biol., 2010, 17, 981-988), SMAsh 시스템 (Chung, H.K. 외. Nature Chemical Biology, 11: 713-720, 2015)을 이용하여, 또는 청색광으로 유도된 이량체화(Guntas, G. 외. Proc. Natl. Acad. Sci., 2015, 112, 112-117, 이들 각각은 참고문헌으로 본원에 통합됨)를 통하여 달성될 수 있다.
일부 구현예들에서, (a) 적어도 하나의 리간드-의존적 키메라 재조합효소, 및 (b) 관심 산물 및 연석택가능 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 카세트를 포함하고, 상기 카세트는 동종 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되는, 조작된 유전자 구조체.
일부 구현예들에서, (a) 재조합효소의 제1 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (b) 재조합효소의 제2 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 (c) 관심 산물 및 연선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 카세트를 포함하고, 상기 제1 단편 및 제2 단편은 결합(이량체화)될 때 전장 기능적 재조합효소를 형성하는 것(Miyamoto, T. 외. Nature Chemical Biology 8:465-470, 201 참조, 이는 참고문헌으로 본원에 통합됨)이며, 카세트는 동종 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되는, 조작된 유전자 구조체.
뉴클레아제-기반 절단/분해
일부 구현예들에서, 조작된 유전자 구조체는 (a) 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 유도 프로모터 및 (b) 관심 산물 및 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트(카세트)를 포함하고, 카세트는 동종 뉴클레아제 인식 부위들을 포함한다. 일부 구현예들에서, 카세트는 뉴클레아제 인식 부위들에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예들에서, 구성 (a)는 구성 (b)로부터 업스트림에 위치한다. 일부 구현예들에서, 종결 서열은 구성 (a) 및 구성 (b) 사이에 위치한다. 도 2를 참조하라.
일부 구현예들에서, 구성 (a)는 다른 뉴클레아제에 각각 연결된, 적어도 두 개의 유도 프로모터들을 포함하고, 카세트는 다른 뉴클레아제들과 동족인 뉴클레아제 인식 부위들을 포함한다. 일부 구현예들에서, 구성 (a)의 뉴클레오티드 서열은 적어도 두 개의 다른 뉴클레아제들을 암호화화고, 카세트는 다른 뉴클레아제들과 동족인 뉴클레아제 인식 부위들을 포함한다. 일부 구현예들에서, 구성(b)의 뉴클레오티스 서열은 적어도 두 개의 역선택가능 마커들을 암호화한다.
일부 구현예들에서, 뉴클레아제(들)은 메가뉴클레아제들 및 RNA-가이드 뉴클레아제들로부터 선택되는 것이다. 예를 들어, 뉴클레아제(들)은 인트론 엔도뉴클레아제들 및 인테인 엔도뉴클레아제들로부터 선택된 메가뉴클레아제들일 수 있다. 일부 구현예들에서, 뉴클레아제(들)은 Cas9 뉴클레아제들 및 Cpf1 뉴클레아제들로부터 선택된 RNA-가이드 뉴클레아제이다. 따라서, 카세트는 뉴클레아제 인식 부위들에 상보적인 가이드 RNA들(gRNAs)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들을 더 포함할 수 있다.
뉴클레아제는 핵산들의 단량체들 사이 포스포디에스터 결합들을 절단하는 효소이다. 많은 뉴클레아제들, 예로 제한 엔도뉴클레아제는 분자를 따라 특정 부위들에서 DNA를 절단한다. 뉴클레아제가 절단하는 이들 부위들은 뉴클레아제 인식 부위들로 지칭된다. 본 개시에 따라 사용될 수 있는 많은 다른 유형들의 뉴클레아제들이 있고, 이는 제한 뉴클레아제들, 예로 메카뉴클레아제들, RNA-가이드 뉴클레아제들, 징크-핑거 뉴클레아제들, 및 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제들을 포함한다.
메가뉴클레아제들(예로, I-SceI, I-CreI, I-DmoI, E-Drel 및 DmoCre)은 긴 인식 부위(예로, 12 내지 40 염기쌍들의 이중-가닥 DNA 서열들)을 가지는 엔도데옥시리보뉴클레아제들이다. 따라서, 이 부위는 일반적으로 임의의 주어진 게놈에서 오직 한번만 발생한다. 수백개의 메가뉴클레아제들이 이 기술 분야에서 알려져 있다. 메가뉴클레아제들은 주로 호밍 엔도뉴클레아제들(homing endonucleases)로 집합적으로 알려진 두 가지 주요 효소군들로 주로 나타낸다. 일부 구현예들에서, 메가뉴클레아제는 LAGLIDADG 군 엔도뉴클레아제이다. 이 군의 명칭은 이 군의 모든 단백질들 내에서 발견되고, 일반적으로 보존된 아미노산 서열에 상응하는 것이다.
RNA-가이드 뉴클레아제들은 표적 부위에 상보적인 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA) 가닥과 관련하여 그들의 표적 부위들을 선택적으로 가이드하는 엔도뉴클레아제들이다. 일부 구현예들에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 ㅇ릴정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)(CRISPR)-CRISPR-관련(CRISPR-associated)(Cas) 시스템의 구성이다. 일부 구현예들에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 유형 II CRISPR-Cas 시스템의 구성이다. CRISPR-Cas 시스템들은 다양한 세균 및 고세균들에 의하여 사용되어 바이러스들 및 기타 외부 핵산의 방어를 매개하는 것이다. 스페이서들(spacers)로 불리는, 외부 DNA의 짧은 조각은 CRISPER 반복들 사이의 게놈에 통합되고 과거 노출들의 "기억"으로 역할을 한다. CRISPER 스페이서들은 그리고 나서 진핵 생물체들 내 RNAi와 유사한 방식으로 외부 유전 요소들을 인식하고 침묵시킨다. 유형 II CRISPR-Cas 시스템들은 조작되어 이중-가닥 DNA 절단들(breaks)이 생체 외 특정 서열들을 직접적으로 표적하도록 할 수 있다. RNA-가이드 뉴클레아제들(RGNs)은 일반적으로 두 구성들을 포함한다: 표적 DNA와 염기 쌍을 만드는 데 관여하는 5' 말단에서 20개의 다양한 뉴클레오티드들을 포함하는 짧은 ~100 뉴클레오티드 단일 가이드 RNA(gRNA), 및 표적 DNA를 절단하는 Cas9 뉴클레아제(Jinek, M. 외. Science 337, 816-821 (2012)).
CRISPR-Cas의 특이성은 CRISPER 위치에 암호화된 직접 반복들에 의해 플랭킹된 스페이서 서열들의 동일성에 의하여 결정되고, 이는 전사되고 성숙한 가이드 RNA(gRNA)로 가공된다(Jinek, M. 외. (2012)). 스몰 RNA(tracrRNA)의 전사 촉진(trans-activating)의 도움으로, gRNA는 Cas9 엔도뉴클레아제가 이중-가닥 절단들(breaks)을 표적 DNA 서열들(프로토스페이서들(protospacers)로 도입되도록 한다(Jinek, M. 외. (2012); Bikard, D., 외. (2012)). 따라서, CRISPR 위치 내 스페이서들의 단순한 변형들을 통하여, RNA-가이드 뉴클레아제는 프로토스페이스의 3' 말단에 NGG 모티프를 가지는 디자인적 제한만을 가지는 임의의 DNA 서열의 대부분을 직접적으로 절단시킬 수 있다(Jinek, M. 외. (2012)).
본원에서 사용될 수 있는 RNA-가이드 뉴클레아제들의 비제한적인 예시들은 Cas9 및 Cpf1을 포함한다.
징크-핑거 뉴클레아제들(ZENs) 및 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제들(TALENs)를 포함하는, 다른 프로그래밍 가능한 뉴클레아제들(및 시스템들)은 본원에 사용될 수 있다.
역선택가능 마커들
일부 구현예들에서, 조작된 유전자 구조체들은 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 역선택가능 마커는 이를 가지는 세포의 사멸을 촉진하는 분자이다(Reyrat, J. 외, Infect Immun. 66(9): 4011-4017, 1998). 역선택가능 마커를 포함하는 조작된 유전자 구조체와 동합된 세포들은, 예를 들어, 역-선택되는 화합물의 존재 하에서 제거된다. 따라서, 역선택가능 마커들은, 본원에서 제공되는 바와 같이, 역선택가능 마커의 손실을 야기하는 절단/분해(지우개)를 겪은 세포들의 양성적 선택을 위하여 사용될 수 있다. 일부 구현예들에서, 조작된 유전자 구조체의 카세트는 (적어도 하나의) 역선택가능 마커를 포함하고, 따라서 역선택가능 마커는 재조합효소 인식 부위들 사이에 위치할 수 있고 및/또는 뉴클레아제 인식 부위들을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 역선택가능 마커는 관심 산물을 암호화하는 핵산으로부터 다운스트림에 위치한다. 일부 구현예들에서, 관심 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터는 또한 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예들에서, 역선택가능 마커는 프로드러그이다. 프로드러그는, 투여 후에, 약물학적 활성 드러그로 대사되는 약물 또는 화합물이다. 일부 구현예들에서, 역선택가능 마커는 시토신 데아미나제이다. 시토신 데아미나제는 5-플루오로시토신(5-FC)를 5-플로오로우라실(5-FU)로 전환시키고, 이는 세포 독성을 야기할 수 있는 것이다. 일부 구현예들에서, 역선택가능 마커는 티미딘 키나제들(예로 HSV 티미딘 키나제)이다. HSV 티미딘 키나제(HSV-tk)는 간사이클로비르를 독성 산물로 전환시키고 세포 사멸을 촉진할 수 있다. 기타 역선택가능 마커들(예로, 사멸 스위치들)이 알려져 있고 본원에 제공되는 바와 같이 사용될 수 있다.
기타 역선택가능 마커들은, 예를 들어, 다음에 기술된 것들을 포함하여 본 개시에 포함된다: Deans, T.L. 외. Cell 130, 363-372, 2007; Ramos, C. A 외. Stem Cells, 28(6): 1107-1115, 2010; 및 Chung, H.K. 외. Nature Chemical Biology, 11: 713-720, 이들 각각은 본원에 참고문헌으로 통합된다.
조작된 핵산들
조작된 핵산(예로, 조작된 유전자 구조체)는 자연에서 발생하지 않는 핵산이다. 그러나, 조작된 핵산은 전체로 자연에서 발생하지 않으나, 이는 자연에서 발생하는 뉴클레오티드 서열들을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 조작된 핵산은 다른 생물체들(예로 다른 종들) 유래 뉴클레오티드 서열들을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예들에서, 조작된 핵산은 쥣과(murine) 뉴클레오티드 서열, 세균 뉴클레오티드 서열, 인간 뉴클레오티드 서열, 및/또는 바이러스 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 용어 "조작된 핵산들"은 재조합된 핵산들 및 합성 핵산들을 포함한다. "재조합된 핵산"은 핵산 분자들을 연결하여 구성된 분자를 지칭하고, 및 일부 구현예들에서, 살아있는 세포를 복제할 수 있다. "합성 핵산"은 증폭된 또는 화학 작용으로, 또는 다른 수단들로, 합성된 분자를 지칭한다. 합성 핵산은 화학 작용으로 변형된, 또는 다른 방식으로 변형된 것을 포함하나, 천연 핵산 분자들과 염기 쌍을 이룰 수 있다. 재조합 핵산들 및 합성 핵산들은 또한 전술한 것들 중 임의의 것의 복제에 기인한 분자들을 포함한다. 본 개시의 조작된 핵산은 단일 분자(예로, 동일 플라스미드 또는 기타 벡터에 포함됨) 또는 다수개의 다른 분자들(예로, 다수개의 다른 독립적-복제 분자들)에 의하여 암호화될 수 있다.
본 개시의 조작된 핵산은 표준 분자 생물학적 방법들을 이용하여 생산될 수 있다(예로, Green 및 Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2012, Cold Spring Harbor Press을 참조하라). 일부 구현예들에서, 조작된 핵산 구조들은 GIBSON ASSEMBLY® 클로닝을 이용하여 생산된다(예로, Gibson, D.G. 외. Nature Methods, 343-345, 2009; 및 Gibson, D.G. 외. Nature Methods, 901-903, 2010을 참조하고, 이들의 각각은 본원에 참고문헌으로 통합된다). GIBSON ASSEMBLY®은 일반적으로 단일-튜브 활성에서 세개의 효소적 활성을 사용한다: 5' 엑소뉴클레아제, DNA 폴리머라제의 Y' 연장 활성 및 DNA 리가제 활성. 5' 엑소뉴클레아제 활성은 5' 말단 서열들을 분리시켜(chew back) 어닐링을 위한 상보적인 서열을 노출시킨다. 그리고 나서 폴리머라제 활성은 어닐링된 영역들의 갭들을 채운다. 그리고 나서 DNA 리가제는 틈(nick)을 봉합하고 DNA 단편들을 서로 공유적으로 결합시킨다. 인접하는 단편들의 겹치는 서열은 골든 게이트 어셈블리(Golden Gate Assembly) 내에 사용되는 것들에 비하여 훨씬 길고, 따라서 정확한 어셈블리의 비율이 높아진다. 일부 구현예들에서, 조작된 핵산 구조체들은 IN-FUSION® 클로닝(Clontech)을 이용하여 생산한다.
프로모터는 핵산 서열의 나머지 부분의 전사 개시 및 속도를 조절하는 핵산 서열의 조절 영역을 지칭한다. 프로모터는 또한 조절 단백질들 및 분자들, 예를 들어 RNA 폴리머라제 및 기타 전사 인자들이 결합할 수 있는 하위-영역들을 포함한다. 프로모터들은 구성, 유도, 활성화 가능, 억제성, 조직-특이성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 프로모터는 이를 조절하는 핵산 서열의 발현이나 전사를 구동한다. 여기서, 프로모터는 해당 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절("구동(drive)")하는 핵산 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치 및 배향에 있을 때 작동 가능하게 연결된 것으로 본다.
구성 프로모터들은 계속적으로 전사를 활성화시키는 조절되지 않는 프로모터들이다. 구성 프로모터들의 비제한적인 예시들은 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 연장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 연장 인자(EFS) 프로모터, MND 프로모터(골수증식성 육종 바이러스 인핸서(myeloproliferative sarcoma virus enhancer)와 함께 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 포함하는 합성 프로모터), 포스포글리세린산 키나제(PGK) 프로모터, 비장병소형성 바이러스(spleen focus-forming virus)(SFFV) 프로모터, 시미안 바이러스 40 (SV40) 프로모터, 및 유비퀴틴 C(UbC) 프로모터를 포함한다.
유도 프로모터들은 신호에 영향을 받거나 신호와 접촉하고 있을 때 전사 활성을 조절(예로, 시작하거나 활성화)하는 것을 특징으로 하는 프로모터들이다. 신호는 내인성 또는 일반적으로 외인성 조건(예로, 빛), 화합물(예로, 화학적 또는 비-화학적 화합물) 또는 단백질(예로, 사이토카인)일 수 있고, 이는 유도 프로모터로부터 전사 활성을 조절하는 데 활성을 갖는 방식으로 유도 프로모터와 접촉할 수 있다. 전사의 활성은 직접적으로 프로모터에 작용하여 전사를 야기하거나 또는 프로모터로부터 전사가 진행되는 것을 방지하는 억제자(repressor)를 불활성화하여 간접적으로 프로모터에 작용하는 것을 포함할 수 있다. 반대로, 전사의 불활성화는 직접적으로 프로모터에서 작동하여 전사를 방지하도록 하거나, 또는 간접적으로 프로모터에서 작동하여 프로모터에서 작동하는 억제자를 활성화시키는 것을 포함할 수 있다. 신호의 존재 하에서 프로모터로부터 전사가 활성화되거나, 불활성화되거나, 증가되거나 또는 감소되면, 프로모터는 신호에 반응하는 것으로 보인다.
일부 구현예들에서, 종결 서열은 재조합효소들 및/또는 뉴클레아제들을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들을 다운스트림의 관심 산물들을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로부터 분리시킨다. 종결 서열은 전사가 중단되도록 하는 핵산 서열이다. 종결은 단일방향성 또는 양방향성일 수 있다. 이는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사에 특이적인 종결에 관여하는 DNA 서열을 포함한다. 종결 서열은 업스트림 프로모터들에 의한 다운스트림 핵산 서열들의 전사적 활성을 방지한다. 종결의 일반적으로 사용되는 유형의 대부분은 순방향(forward) 종결이다. 일반적으로 전사되는 핵산 서열의 다움스트림에 놓이면, 순방향 전사 종결은 전사를 중단시킬 것이다. 일부 구현예들에서, 양방향성 전사 종결들은 순방향 및 역방향 가닥 모두에서 전사가 종결되도록 한다.
진핵 시스템들에서, 종결 영역은 새로운 전사의 부위-특이적 절단을 허용하여 아데닐산중합반응 부분을 노출시키는 특이적 DNA 서열들을 포함한다. 이는 전문화된 내인성 폴리머라제가 약 200 A 잔기들(다중A)이 전사체의 3'말단에 추가되도록 신호한다. 이러한 다중 A 꼬리(polyA tail)로 변형된 RNA 분자들은 보다 안정하고 보다 효율적으로 전사하는 것으로 보인다. 따라서, 진핵생물들을 포함하는 일부 구현예들에서, 종결은 RNA 전달을 위한 신호를 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 종결 신호는 메시지(message)의 아데닐산중합반응을 촉진한다. 종결 및/또는 아데닐산중합반응 부위 요소들은 출력 핵산 수준들을 강화하는 역할을 할 수 있고 및/또는 핵산들 사이를 통하여 리드(read)를 최소화할 수 있다.
또한 본원에서 본 개시의 조작된 유전자 구조체들을 포함하는 벡터들이 제공된다. 일부 구현예들에서, 벡터는 에피솜 벡터, 예로 플라스미드 또는 바이러스 벡터(예로, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 단순포진 바이러스 벡터 및/또는 키메라 바이러스 벡터들)이다.
관심 산물들
본 개시의 조작된 유전자 구조체들에 의하여 암호화된 산물들은, 예를 들어, 치료 분자들 및/또는 예방 분자들일 수 있다. 일부 구현예들에서, 관심 산물은 단백질 또는 펩타이드(예로, 치료 단백질 또는 펩타이드)이다. 일부 구현예들에서, 관심 산물은 핵산(예로, 치료 핵산)이다. 핵산들의 예시는 RNA, DNA, RNA 및 DNA의 조합을 포함한다. 일부 구현예들에서, 관심 산물은 DNA(예로, 단일-가닥 DNA 또는 이중-가닥 DNA)이다. 일부 구현예들에서, 관심 산물은 RNA이다. 예를 들어, 관심 산물은 RNA 간섭(RNAi) 분자들, 예로 짧은-헤어핀 RNA들(short-hairpin RNAs), 작은 간섭 RNA들(short interfering RNAs) 및 마이크로 RNA들로부터 선택되는 것일 수 있다.
치료 및/또는 예방 분자들의 예시들은 항체들, 효소들, 호르몬들, 염증제들, 항-염증제들, 면역조절제들 및 항암제들이다.
세포들
일부 구현예들에서, 본 개시는 본원에 기술된 조작된 유전자 구조체들을 포함하는 세포 및/또는 본원에 기술된 조작된 유전자 구초제들을 포함하는 벡터들을 제공한다.
일부 구현예들에서, 세포는 줄기 세포이다. 예를 들어, 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포, 조혈모세포, 배아 줄기세포, 또는 만능 줄기세포(예로, 유도 만능 줄기세포)일 수 있다. "줄기 세포"는 배지에서 무기한으로 분열하는 능력을 가지고 분화된 세포들을 발생시키는 능력을 가지는 세포를 지칭한다. "만능 줄기세포"는 줄기 세포의 일 유형을 지칭하는 것으로, 생물체의 모든 조직들로 분화가능하나, 단독으로는 완전한 유기체 발달을 유지할 수는 없는 것이다. "인간 유도 만능 줄기세포"는 배아 줄기 세포들의 정의된 특성들을 유지하는 데 중요한 유전자들 및 인자들을 강제적으로 발현함으로서 배아 줄기 세포-유사 상태로 재프로그램화된 체세포(예로, 성숙한 세포 또는 성인 세포) 세포이다(Takahashi and Yamanaka, Cell 126 (4): 663-76, 2006 참고, 이는 본원에 참고문헌으로 통합됨). 인간 유도 만능 줄기세포들은 줄기 세포 마커들을 발현하고 모든 세 배엽들(외배엽, 내배엽, 중배엽)의 특징의 세포들을 발생시킬 수 있다.
일부 구현예들에서, 세포는 면역 세포이다. 본원에서 제공되는 바와 같이 사용될 수 있는 면역 세포들의 비제한적인 예들은 자연살해(NK) 세포들, NKT 세포들, 비만세포들, 호산구들, 호염구들, 대식세포들, 호중구들, 수지상 세포들, T 세포들 및 B 세포들을 포함한다. T 세포들의 예시는, 비제한적으로, CD8+ T 세포들, CD4+ T 세포들, 감마-델타 T 세포들, 및 T 조절 세포들(예로, (CD4+, FOXP3+, CD25+ 세포들)을 포함한다. 일부 구현예들에서, T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포들(예로, CD3-제타 막횡단도메인 및 엔도도메인에 융합되는, 단일클론 항체들로부터 유래한 단일-사슬 가변 단편들(scFv)의 융합들)이다.
본 개시에 따라 사용될 수 있는 세포주들의 추가적인 비제한적 예시들은 293-T, 293-T, 3T3, 4T1, 721, 9L, A-549, A172, A20, A253, A2780, A2780ADR, A2780cis, A431, ALC, B16, B35, BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C2C12, C3H-10T1/2, C6, C6/36, Cal-27, CGR8, CHO, CML T1, CMT, COR-L23, COR-L23/5010, COR-L23/CPR, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, E14Tg2a, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, Hepa1c1c7, High Five 세포들, HL-60, HMEC, HT-29, HUVEC, J558L 세포들, 주르카트(Jurkat), JY 세포들, K562 세포들, KCL22, KG1, Ku812, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1, 2, 3....48, MC-38, MCF-10A, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-468, MDCK II, MG63, MONO-MAC 6, MOR/0.2R, MRC5, MTD-1A, MyEnd, NALM-1, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NW-145, OPCN/OPCT Peer, PNT-1A/PNT 2, PTK2, 라지(Raji), RBL 세포들, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, S2, Saos-2 세포들, Sf21, Sf9, SiHa, SKBR3, SKOV-3, T-47D, T2, T84, THP1, U373, U87, U937, VCaP, WM39, WT-49, X63, YAC-1 및 YAR 세포들을 포함한다.
조성물들 및 키트들
또한 본원에서는 본 개시의 조작된 유전자 구조체들 중 적어도 하나를 포함하는 조성물들, 본 개시의 조작된 유전자 구조체들 중 적어도 하나를 포함하는 벡터, 또는 본 개시의 조작된 유전자 구조체들 중 적어도 하나를 포함하는 세포들을 제공한다.
본원에서는 본 개시의 조작된 유전자 구조체들 중 적어도 하나를 포함하는 키트들 또는 본 개시의 조작된 유전자 구조체들 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 벡터를 더 제공한다. 일부 구현예들에서, 키트들은 발현 카세트의 유도 프로모터(들)의 활성을 조절하는 적어도 하나의 유도제를 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 키트들은 역선택제를 더 포함한다.
방법들
본 개시의 구현예들은 세포들 집단을 적어도 하나의 조작된 유전자 구조체(예로, (a) 적어도 하나의 재조합효소들 및/또는 적어도 하나의 뉴클레아제 및 (b) 관심 산물 및 적어도 하나의 역선택가능 마커를 암호화하는 것)으로 도입하는 단계를 포함하고, 관심 산물은 세포들의 분화, 팽창 또는 표현형 유지(지속)를 돕는 것(예로, 전사 인자들, 성장 인자들, 등)인 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 방법은 세포들 집단의 세포들을 배양하는 단계 및 관심 산물을 제조하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 방법은 유도제의 존재 하에서 집단의 세포들을 배양하는 단계, 재조합효소(들)과 작동 가능하게 연결된 유도 프로모터를 활성화시키는 단계, 및 조작된 유전자 구조체로부터 카세트를 절단하는 단계(및/또는 세포 내에서 이종 핵산을 절단하는 단계)를 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 방법은 역선택제의 존재 하에서 집단의 세포들을 배양하는 단계 및 역선택가능 마커를 발현하는 세포들을 사멸시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 방법은 집단의 세포들을 대상(예로, 인간 대상)에 전달하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예들에서, 역선택제의 존재 하에 집단의 세포들을 배양하는 단계 후에 집단의 세포들의 20% 미만이 카세트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 역선택제의 존재 하에 집단의 세포들을 배양하는 단계 후에 집단의 세포들의 15% 미만이 카세트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 역선택제의 존재 하에 집단의 세포들을 배양하는 단계 후에 집단의 세포들의 10% 미만이 카세트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 역선택제의 존재 하에 집단의 세포들을 배양하는 단계 후에 집단의 세포들의 5% 미만이 카세트를 포함한다.
세포들(예로, 줄기세포들 또는 면역세포들)의 집단은 105 - 1011 세포들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포들의 집단은 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 또는 1011 세포들을 포함할 수 있다. 세포들의 집단은, 일부 구현예들에서, 세포들의 동종 집단(모두 동일한 세포 유형)이고, 다른 구현예들에서는, 세포들의 집단은 세포들의 이종 집단(다른 세포 유형들의 혼합)이다.
본 개시의 다른 구현예들은 세포들의 집단에 적어도 하나의 조작된 유전자 구조체들(예로, (a) 적어도 하나의 재조합효소 및/또는 적어도 하나의 뉴클레아제 및 (b) 관심 산물 및 적어도 하나의 역선택가능 마커를 암화하는 것)을 도입하는 단계를 제공하고, 관심 산물은 치료 분자 및/또는 예방 분자이다. 일부 구현예들에서, 방법은 집단의 세포들을 대상으로 전달하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 방법은 대상을 유도제에 노출시켜 유도 프로모터를 활성화시키고 재조합효소(들)을 발현시키는 단계 및 조작된 유전자 구조체로부터 카세트를 절단하는 단계(및/또는 세포 내 이종 핵산을 절단하는 단계)를 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 방법은 대상을 역선택제에 노출시키는 단계 및 역선택가능 마커를 발현하는 세포들을 사멸시키는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예들에서, 대상에 역선택제를 노출시키는 단계 후에 집단의 세포들의 20% 미만이 카세트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 대상에 역선택제를 노출시키는 단계 후에 집단의 세포들의 15% 미만이 카세트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 대상에 역선택제를 노출시키는 단계 후에 집단의 세포들의 10% 미만이 카세트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 대상에 역선택제를 노출시키는 단계 후에 집단의 세포들의 5%(예로, 4%, 3%, 2% 또는 1%) 미만이 카세트를 포함한다.
본 개시의 다양한 구현예들에 따라, 발명은 세포들에 본 개시의 임의의 조작된 구조체들을 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 본원에서 제공되는, 임의의 세포들은 대상, 예로 인간 대상에 전달될 수 있다.
조작된 유전자 구조체들은 바이러스 전달 시스템(예로, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련, 헬퍼-의존성 아데노바이러스 시스템들, 하이브리드 아데노바이러스 시스템들, 단순 포진, 폭스바이러스, 렌티바이러스, 엡스타인-바 바이러스) 또는 비-바이러스 전달 시스템(예로, 물리적, 네이키드 DNA, DNA충격(DNA bombardment), 전기천공, 유체역학, 초음파 또는 마그네토펙션(magnetofection); 또는 화학적: 양이온성 지질, 다른 양이온성 중합체들 또는 지질 중합체)을 이용하여 세포들로 전달될 수 있다(Nayerossadat N 외. Adv Biomed Res. 2012; 1: 27, 이는 본원에 참고문헌으로 통합됨). 일부 구현예들에서, 비-바이러스 기반 전달 시스템은 하이드로겔-기반 전달 시스템(예로, Brandl F, 외. Journal of Controlled Release, 2010, 142(2): 221-228 참고, 이는 본원에 참고문헌으로 통합됨)
조작된 유전자 구조체들 및/또는 세포들은 대상(예로, 인간 대상과 같은 포유동물 대상)로 이 기술 분야에 알려진 임의의 생체 내 전달 방법을 통하여 전달될 수 있다. 예를 들어, 조작된 유전자 구조체들 및/또는 세포들은 정맥 내로 전달될 수 있다. 일부 구현예들에서, 조작된 유전자 구조체들 및/또는 세포들은 전달 비히클(예로, 비-리포솜 나노입자 또는 리포솜)에 전달될 수 있다. 일부 구현예들에서, 조작된 유전자 구조체들 및/또는 세포들은 암 또는 기타 질병을 앓고 있는 대상에게 전신으로 전달될 수 있고 대상의 암 세포들 또는 질병 세포들에서 특이적으로 활성화(전사가 활성화)될 수 있다.
추가적인 구현예들
1. 조작된 유전자 구조체로서, (a) 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 유도 프로모터; 및 (b) 관심 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 카세트를 포함하고, 카세트는 동종 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹된, 조작된 유전자 구조체.
2. 단락 1에 있어서, (a)는 (b)로부터 업스트림에 위치하는, 조작된 유전자 구조체.
3. 단락 2에 있어서, 종결 서열은 (a) 및 (b) 사이에 위치하는, 조작된 유전자 구조체.
4. 단락 1-3 중 임의의 하나에 있어서, 재조합효소는 티로신 재조합효소들 또는 티로신 인테그라제들로부터 선택되는, 조작된 유전자 구조체.
5. 단락 4에 있어서, 재조합효소는 Cre, Dre, Flp, KD, B2, B3, λ, HK022 및 HP1 재조합효소들로부터 선택되는, 조작된 유전자 구조체.
6. 단락 1-3 중 임의의 하나에 있어서, 재조합효소는 세린 재조합효소들 또는 세린 인테그라제들로부터 선택되는, 조작된 유전자 구조체.
7. 단락 6에 있어서, 재조합효소는 γδ, ParA, Tn3, Gin, ΦC31, Bxb1 및 R4 재조합효소들로부터 선택되는, 조작된 유전자 구조체.
8. 단락 1-7 중 임의의 하나에 있어서, 관심 산물은 치료 분자 또는 예방 분자인, 조작된 유전자 구조체.
9. 단락 1-8 중 임의의 하나에 있어서, 관심 산물은 단백질 또는 펩타이드인 조작된 유전자 구조체.
10. 단락 1-9 중 임의의 하나에 있어서, 관심 산물은 핵산인 조작된 유전자 구조체.
11. 단락 10에 있어서, 핵산은 RNA, DNA 또는 RNA 및 DNA의 조합을 포함하는 조작된 유전자 구조체.
12. 단락 10에 있어서, RNA는 짧은-헤어핀 RNA들, 작은 간섭 RNA들 및 마이크로 RNA들인 조작된 유전자 구조체.
13. 단락 1-12 중 임의의 하나에 있어서, 조작된 유전자 구조체는 (c) 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 조작된 유전자 구조체.
14. 단락 13에 있어서, 역선택가능 마커는 동종 재조합효소 인식 부위들 사이에 위치하는 조작된 유전자 구조체.
15. 단락 13 또는 14에 있어서, (c)의 뉴클레오티드 서열은 (b)의 뉴클레오티드 서열로부터 다운스트림에 위치하는 조작된 유전자 구조체.
16. 단락 9 또는 10에 있어서, 역선택가능 마커는 프로드러그인 조작된 유전자 구조체.
17. 단락 13-16 중 임의의 하나에 있어서, 역선택가능 마커는 시토신 데아미나제들 및 티미딘 키나제들로부터 선택되는 조작된 유전자 구조체.
18. 단락 1-17 중 임의의 하나에 있어서, 구조체는 다른 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 각각 연결된, 적어도 두 개의 유도 프로모터들 포함하고, 카세트는 다른 재조합효소들에 동종인 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되는 조작된 유전자 구조체.
19. 단락 1-17 중 임의의 하나에 있어서, 유도 프로모터는 다른 재조합효소를 각각에 연결된, 적어도 두 개의 뉴클레오티드 서열들에 연결되고, 상기 카세트는 다른 재조합효소들에 동종인 재조합 인식 부위들에 의해 플랭킹되는 조작된 유전자 구조체.
20. 단락 1-17 중 임의의 하나에 있어서, 구조체는 다른 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 각각 연결된, 적어도 세 개의 유도 프로모터들 포함하고, 카세트는 다른 재조합효소들에 동종인 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되는 조작된 유전자 구조체.
21. 단락 1-17 중 임의의 하나에 있어서, 유도 프로모터는 다른 재조합효소를 각각에 연결된, 적어도 세 개의 뉴클레오티드 서열들에 연결되고, 상기 카세트는 다른 재조합효소들에 동종인 재조합 인식 부위들에 의해 플랭킹되는 조작된 유전자 구조체.
22. 조작된 유전자 구조체로서, 상기 조작된 유전자 구조체는 (a) 다른 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 각각에 작동 가능하게 연결된, 적어도 두 개의 유도 프로모터들; 및 (b) 관심 산물 및 역선택가능 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 카세트를 포함하고, 카세트는 다른 재조합효소들에 동종인 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되는 조작된 유전자 구조체.
23. 단락 1-22 중 임의의 하나의 조작된 유전자 구조체를 포함하는 벡터.
24. 단락 23에 있어서, 플라스미드 또는 바이러스 벡터인 벡터.
25. 단락 1-22 중 임의의 하나의 조작된 유전자 구조체를 포함하는 세포.
26. 단락 23 또는 24의 벡터를 포함하는 세포.
27. 단락 25 또는 26에 있어서, 세포는 줄기세포인 세포.
28. 단락 27에 있어서, 줄기세포는 중간엽 줄기세포들, 조혈모세포들, 배아 줄기세포들 및 만능 줄기세포들인 세포.
29. 단락 25 또는 26에 있어서, 세포는 면역세포인 세포.
30. 단락 29에 있어서, 면역세포는 자연살해(NK) 세포들, NKT 세포들, 비만세포들, 호산구들, 호염구들, 대식세포들, 호중구들, 수지상 세포들, T 세포들 및 B 세포들인 세포.
31. 단락 30에 있어서, T 세포는 CD8+ T 세포들, CD4+ T 세포들, 감마-델타 T 세포들 및 T 조절 세포들인 세포.
32. 단락 30 또는 31에 있어서, T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 또는 조작된 T 세포 수용체(TCR) 세포인 세포.
33. 단락 1-22 중 임의의 하나의 조작된 유전자 구조체를 포함하는 조성물.
34. 단락 23 또는 24의 벡터를 포함하는 조성물.
35. 단락 25-32 중 임의의 하나의 세포를 포함하는 조성물.
36. 단락 1-22 중 임의의 하나의 조작된 유전자 구조체, 및 (a)의 유도 프로모터(들)의 활성을 조절하는 적어도 하나의 유도제를 포함하는 키트.
37. 단락 23 또는 24의 벡터, 및 (a)의 유도 프로모터(들)의 활성을 조절하는 적어도 하나의 유도제를 포함하는 키트.
38. 세포에 단락 1-24 중 임의의 하나의 조작된 유전자 구조체를 도입하는 단계를 포함하고, 관심 산물은 분화, 팽창 또는 표현형 유지(지속)을 돕는 것인 방법.
39. 단락 38에 있어서, (b)의 프로모터는 구성 프로모터인 방법.
40. 단락 38 또는 39에 있어서, 방법은 세포를 배양하는 단계 및 관심 산물을 생산하는 단계를 더 포함하는 방법.
41. 단락 38-40 중 임의의 하나에 있어서, 방법은 (a)의 프로모터를 활성화시키는 단계, 재조합효소를 발현하는 단계 및 세포 내 이종 핵산을 절단하는 단계를 더 포함하는 방법.
42. 단락 41에 있어서, 방법은 세포를 대상에 전달하는 단계를 더 포함하는 방법.
43. 세포를 단락 1-24 중 임의의 하나의 조작된 유전자 구조체에 도입하는 단계를 포함하고, 관심 산물은 치료 또는 예방 분자인 방법.
44. 단락 43에 있어서, (b)의 프로모터는 구성 프로모터인 방법.
45. 단락 43 또는 44에 있어서, 세포를 대상에 전달하는 단계를 더 포함하는 방법.
46. 단락 45에 있어서, 방법은 (a)의 프로모터를 활성화하는 단계를 더 포함하는 단계, 재조합효소를 발현하는 단계 및 세포 내 이종핵산을 절단하는 단계를 더 포함하는 방법.
47. 단락 25-52 중 임의의 하나의 세포를 대상에 전달하는 단계를 포함하는 방법.
48. (a) 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 유도 프로모터; 및 (b) 관심 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 카세트를 포함하고, 상기 카세트는 선택적으로 카세트를 플랭킹하는 동종 뉴클레아제 인식 부위들을 포함하는, 조작된 유전자 구조체.
49. 단락 48에 있어서, (a)는 (b)로부터 업스트림에 위치하는 조작된 유전자 구조체.
50. 단락 49에 있어서, 종결 서열은 (a) 및 (b) 사이에 위치하는 조작된 유전자 구조체.
51. 단락 48-50 중 임의의 하나에 있어서, 뉴클레아제는 메가뉴클레아제들 및 RNA-가이드 뉴클레아제들로부터 선택된 조작된 유전자 구조체.
52. 단락 51에 있어서, 메가뉴클레아제는 인트론 엔도뉴클레아제들 및 인테인 엔도뉴클레아제들로부터 선택되는 조작된 유전자 구조체.
53. 단락 51에 있어서, RNA-가이드 뉴클레아제들은 Cas9 뉴클레아제들 및 Cpf1 뉴클레아제들로부터 선택된 조작된 유전자 구조체.
54. 단락 D6에 있어서, 조작된 유전자 구조체는 (c) 뉴클레아제 인식 부위들에 상보적이고 뉴클레아제 인식 부위들 사이에 위치하는 가이드 RNA들(gRNAs)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들을 더 포함하는 조작된 유전자 구조체.
55. 단락 48-54 중 임의의 하나에 있어서, 관심 산물은 치료 분자 또는 예방 분자인 조작된 유전자 구조체.
56. 단락 48-55 중 임의의 하나에 있어서, 관심 산물은 단백질 또는 펩타이드인 조작된 유전자 구조체.
57. 단락 48-56 중 임의의 하나에 있어서, 관심 산물은 핵산인 조작된 유전자 구조체.
58. 단락 57에 있어서, 핵산은 RNA, DNA 또는 RNA 및 DNA의 조합을 포함하는 조작된 유전자 구조체.
59. 단락 57에 있어서, RNA는 짧은-헤어핀 RNA들, 작은 간섭 RNA들 및 마이크로 RNA들로부터 선택되는 조작된 유전자 구조체.
60. 단락 48-59 중 임의의 하나에 있어서, 조작된 유전자 구조체는 (c) 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 조작된 유전자 구조체.
61. 단락 60에 있어서, 역선택가능 마커는 인접 뉴클레아제 인식 부위들 사이에 위치하는 조작된 유전자 구조체.
62. 단락 60 또는 61에 있어서, (c)의 뉴클레오티드 서열은 (b)의 뉴클레오티드 서열로부터 다운스트림에 위치하는 조작된 유전자 구조체.
63. 단락 56 또는 57에 있어서, 역선택가능 마커는 프로드러그인 조작된 유전자 구조체.
64. 단락 60-63 중 임의의 하나에 있어서, 역선택가능 마커는 시토신 데아미나제들 및 티미딘 키나제들로부터 선택되는 조작된 유전자 구조체.
65. 단락 48-64 중 임의의 하나에 있어서, 구조체는, 다른 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 각각에 연결된, 적어도 두 개의 유도 프로모터들을 포함하고, 조작된 유전자 구조체는 선택적으로 카세트를 플랭킹하는 동종 뉴클레아제를 포함하는 조작된 유전자 구조체.
66. 단락 48-64 중 임의의 하나에 있어서, 유도 프로모터는, 다른 뉴클레아제를 각각 암호화하는, 적어도 두 개의 뉴클레오티드 서열들과 연결되고, 조작된 유전자 구조체는 선택적으로 카세트를 플랭킹하는 동종 뉴클레아제 인식 부위들을 포함하는 조작된 유전자 구조체.
67. 단락 48-64 중 임의의 하나에 있어서, 구조체는, 다른 뉴클레오티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 각각에 연결된, 적어도 세 개의 유도 프로모터들을 포함하고, 조작된 유전자 구조체는 선택적으로 카세트를 플랭킹하는 동종 뉴클레아제 인식 부위들을 포함하는 조작된 유전자 구조체.
68. 단락 48-64 중 임의의 하나에 있어서, 유도 프로모터는, 다른 뉴클레오티드를 각각 암호화하는, 적어도 세 개의 뉴클레오티드 서열들에 연결되고, 조작된 유전자 구조체는 선택적으로 카세트를 플랭킹하는 동종 뉴클레아제 인식 부위들을 포함하는 조작된 유전자 구조체.
69. (a) 다른 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 각각에 작동 가능하게 연결된, 적어도 두개의 유도 프로모터들; 및
(b) 관심 산물 및 역선택가능 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터;를 포함하는 카세트를 포함하고,
카세트는 다른 뉴클레아제와 동종인 뉴클레아제 인식 부위들에 의해 플랭킹되는, 조작된 유전자 구조체.
70. 단락 48-69 중 임의의 하나의 조작된 유전자 구조체를 포함하는 벡터.
71. 단락 70에 있어서, 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터인 벡터.
72. 단락 48-69 중 임의의 하나의 조작된 유전자 구조체를 포함하는 세포.
73. 단락 70 또는 71의 벡터를 포함하는 세포.
74. 단락 72 또는 73에 있어서, 세포는 줄기세포인 세포.
75. 단락 74에 있어서, 줄기세포는 중간엽 줄기세포들, 배아 줄기세포들 및 만능 줄기세포들로부터 선택되는 줄기세포.
76. 단락 72 또는 73에 있어서, 세포는 면역세포인 세포.
77. 단락 76에 있어서, 면역세포는 자연살해(NK) 세포들, NKT 세포들, 비만세포들, 호산구들, 호염구들, 대식세포들, 호중구들, 수지상 세포들, T 세포들 및 B 세포들로부터 선택된 세포.
78. 단락 77에 있어서, T 세포는 CD8+ T 세포들, CD4+ T 세포들, 감마-델타 T 세포들 및 T 조절 세포들로부터 선택된 세포.
79. 단락 77 또는 78에 있어서, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 또는 조작된 T 세포 수용체(TCR) 세포인 세포.
80. 단락 D1-D22 중 임의의 하나의 조작된 유전자 구조체를 포함하는 조성물.
81. 단락 70 또는 71의 벡터를 포함하는 조성물.
82. 단락 72-79 중 임의의 하나의 세포를 포함하는 조성물.
83. 단락 48-69 중 임의의 하나의 조작된 유전자 구조체 및 (a)의 유도 프로모터(들)의 활성을 조절하는 적어도 하나의 유도제를 포함하는 키트.
84. 단락 70 또는 71의 벡터 및 (a)의 유도 프로모터(들)의 활성을 조절하는 적어도 하나의 유도제를 포함하는 키트.
85. 단락 48-71 중 임의의 하나의 조작된 유전자 구조체를 세포로 도입하는 단계를 포함하고, 관심 산물은 세포의 분화, 팽창 또는 표현형 유지(지속)을 돕는 방법.
86. 단락 85에 있어서, (b)의 프로모터는 구성 프로모터인 방법.
87. 단락 85 또는 86에 있어서, 방법은 세포를 배양하는 단계 및 관심 산물을 생산하는 단계를 더 포함하는 방법.
88. 단락 85-87 중 임의의 하나에 있어서, 방법은 (a)의 프로모터를 활성화시키는 단계, 재조합효소를 발현시키는 단계 및 세포 내 이종 핵산을 절단하는 단계를 더 포함하는 방법.
89. 단락 88에 있어서, 방법은 세포를 대상에 전달하는 단계를 더 포함하는 방법.
90. 세포에 단락 48-71 중 임의의 하나의 조작된 유전자 구조체를 도입하는 단계를 포함하고, 관심 산물은 치료 또는 예방 분자인 방법.
91. 단락 90에 있어서, (b)의 프로모터는 구성 프로모터인 방법.
92. 단락 90 또는 91에 있어서, 방법은 세포를 대상에 전달하는 단계를 더 포함하는 방법.
93. 단락 92에 있어서, 방법은 (a)의 프로모터를 활성화시키는 단계를 더 포함하는 방법.
94. 대상에 단락 72-79 중 임의의 하나의 세포를 전달하는 단계를 포함하는 방법.
95. (a) 리간드-의존적 키메라 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산; 및
(b) 관심 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산;을 포함하고, (b)의 핵산은 동종 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되는, 조작된 세포.
96. 단락 95에 있어서, 재조합효소는 리간드-의존적 키메라 재조합효소인 조작된 세포.
97. 단락 96에 있어서, 리간드-의존적 키메라 재조합효소는 변이된 인간 에스트로겐 수용체(ER) 리간드 결합 도메인에 연결된 조작된 세포.
98. 단락 95-97 중 임의의 하나에 있어서, 관심 산물은 치료 분자 또는 예방 분자인 조작된 세포.
99. 단락 95-98 중 임의의 하나에 있어서, 관심 산물은 단백질 또는 펩타이드인 조작된 세포.
100. 단락 95-98 중 임의의 하나에 있어서, 관심 산물은 핵산인 조작된 세포.
101. 단락 100에 있어서, 핵산은 RNA, DNA 또는 RNA및 DNA의 조합을 포함하는 조작된 세포.
102. 단락 101에 있어서, RNA는 짧은-헤어핀 RNA들, 작은 간섭 RNA들 및 마이크로RNA들로부터 선택된 조작된 세포.
103. 단락 95-102 중 임의의 하나에 있어서, (b)의 핵산은 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 조작된 세포.
104. 단락 103에 있어서, 역선택가능 마커는 동종 뉴클레아제 인식 부위들 사이에 위치하는 조작된 세포.
105. 단락 103 또는 104에 있어서, 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 (b)의 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 위치하는 조작된 세포.
106. 단락 103-105 중 임의의 하나에 있어서, 역선택가능 마커는 프로드러그인 조작된 세포.
107. 단락 103-105 중 임의의 하나에 있어서, 역선택가능 마커는 시토신 데아미나제들 및 티미딘 키나제들로부터 선택되는 조작된 세포.
108. 단락 95-107 중 임의의 하나에 있어서, 세포는 줄기세포인 조작된 세포.
109. 단락 108에 있어서, 줄기세포는 중간엽 줄기세포들, 배아 줄기세포들 및 만능 줄기세포들로부터 선택된 조작된 세포.
110. 단락 95-107 중 임의의 하나에 있어서, 세포는 면역세포인 조작된 세포.
111. 단락 110에 있어서, 면역 세포는 자연살해(NK) 세포들, NKT 세포들, 비만세포들, 호산구들, 호염구들, 대식세포들, 호중구들, 수지상 세포들, T 세포들 및 B 세포들로부터 선택된 조작된 세포.
112. 단락 111에 있어서, T 세포는 CD8+ T 세포들, CD4+ T 세포들, 감마-델타 T 세포들 및 T 조절 세포들로부터 선택된 조작된 세포.
113. 단락 111 또는 112에 있어서, T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 또는 조작된 T 세포 수용체(TCR) 세포인 조작된 세포.
114. 단락 95-113 중 임의의 하나의 조작된 세포를 포함하는 조성물.
115. (a) 리간드-의존적 키메라 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산; 및
(b) 관심 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산;을 포함하고,
(b)의 핵산은 동종 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되는, 키트.
116. 단락 95-113 중 임의의 하나의 조작된 세포를 배양하는 단계 및 관심 산물을 생산하는 단계를 포함하는 방법.
117. 단락 116에 있어서, 리간드-의존적 키메라 재조합효소는 변이된 인간 에스트로겐 수용체(ER) 리간드 결합 도메인에 연결된 방법.
118. 단락 116 또는 117에 있어서, 방법은 조작된 세포를 유도제와 접촉시키는 단계 및 세포 내 이종 핵산을 절단하는 단계를 더 포함하는 방법.
119. 단락 118에 있어서, 유도제는 4-히드록시다목시펜(OHT) 및/또는 ICI 182,780(ICI)인 방법.
120. 단락 119에 있어서, 방법은 조작된 세포를 대상에 전달하는 단계를 더 포함하는 방법.
121. (a) 재조합효소의 제1 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산;
(b) 재조합효소의 제2 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산; 및
(c) 관심 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산;을 포함하고,
상기 제1 단편 및 제2 단편이 결합될 때 전장 기능적 재조합효소를 형성하는 것이며,
(c)의 핵산은 동종 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되는, 조작된 세포.
122. 단락 121에 있어서, 제1 단편은 FKBP 도메인에 연결되고 제2 단편은 FRB 도메인에 연결되는 조작된 세포.
123. 단락 121 또는 122에 있서, 관심 산물은 치료 분자 또는 예방 분자인 조작된 세포.
124. 단락 121-123 중 임의의 하나에 있어서, 관심 산물은 단백질 또는 펩타이드인 조작된 세포.
125. 단락 121-123 중 임의의 하나에 있어서, 관심 산물은 핵산인 조작된 세포.
126. 단락 125에 있어서, 핵산은 RNA, DNA 또는 RNA 및 DNA의 조합인 조작된 세포.
127. 단락 126에 있어서, RNA는 짧은-헤어핀 RNA들, 작은 간섭 RNA들 및 마이크로 RNA들로부터 선택된 조작된 세포.
128. 단락 121-127 중 임의의 하나에 있어서, (c)의 핵산은 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 조작된 세포.
129. 단락 128에 있어서, 역선택가능 마커는 동종 뉴클레아제 인식 부위들 사이에 위치하는 조작된 세포.
130. 단락 128 또는 129에 있어서, 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 (c)의 뉴클레오티드 서열로부터 다운스트림에 위치하는 조작된 세포.
131. 단락 128 또는 130 중 임의의 하나에 있어서, 역선택가능 마커는 프로드러그인 조작된 세포.
132. 단락 128-130 중 임의의 하나에 있어서, 역선택가능 마커는 시토신 데아미나제들 티미딘 키나제들로부터 선택된 조작된 세포.
133. 단락 121-132 중 임의의 하나에 있어서, 세포는 줄기세포인 조작된 세포.
134. 단락 133에 있어서, 줄기세포는 중간엽 줄기세포들, 배아 줄기세포들 및 만능 줄기세포들로부터 선택된 조작된 세포.
135. 단락 121-133 중 임의의 하나에 있어서, 세포는 면역세포인 조작된 세포.
136. 단락 135에 있어서, 면역세포는 자연살해(NK) 세포들, NKT 세포들, 비만세포들, 호산구들, 호염구들, 대식세포들, 호중구들, 수지상 세포들, T 세포들 및 B 세포들로부터 선택된 조작된 세포.
137. 단락 136에 있어서, T 세포는 CD8+ T 세포들, CD4+ T 세포들, 감마-델타 T 세포들 및 T 조절 세포들로부터 선택된 조작된 세포.
138. 단락 136 또는 137에 있어서, T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 또는 조작된 T 세포 수용체(TCR) 세포인 조작된 세포.
139. 단락 121-138 중 임의의 하나의 조작된 세포를 포함하는 조성물.
140. (a) 재조합효소의 제1 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산;
(b) 재조합효소의 제2 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산; 및
(c) 관심 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산;를 포함하고,
상기 제1 단편 및 제2 단편이 결합될 때 전장 기능적 재조합효소를 형성하는 것이며,
(c)의 핵산은 동종 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되는, 키트.
141. 단락 121-138 중 임의의 하나의 조작된 세포를 배양하는 단계 및 관심 산물을 생산하는 단계를 포함하는 방법.
142. 단락 141에 있어서, 제1 단편은 FKBP 도메인에 연결되고 제2 단편은 FRB 도메인에 연결되는 방법.
143. 단락 141 또는 142에 있어서, 방법은 조작된 세포를 유도제에 접촉하는 단계 및 세포 내 이종 핵산을 절단하는 단계를 더 포함하는 방법.
144. 단락 143에 있어서, 유도제는 4-히드록시타목시펜(OHT) 및/또는 ICI 182,780(ICI)인 방법.
145. 단락 144에 있어서, 방법은 조작된 세포를 대상에 전달하는 단계를 더 포함하는 방법.
146. (b) 제2 관심 산물 및 선택적으로 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터로부터 업스트림에 위치하는 (a) 제1 관심 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 카세트를 포함하고,
제1 관심 산물의 발현 또는 활성이 활성화될 수 있고(유도될 수 있고), 및
제1 관심 산물이 카세트의 절단 또는 분해를 조절하는, 조작된 유전자 구조체.
147. 단락 146에 있어서, (a)의 프로모터는 유도 프로모터인 조작된 유전자 구조체.
148. 단락 146 또는 147에 있어서, 카세트는 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되는 조작된 유전자 구조체.
149. 단락 148에 있어서, 제1 관심 산물은 동종 재조합효소인 조작된 유전자 구조체.
150. 단락 146 또는 147에 있어서, 카세트는 뉴클레아제 인식 부위들에 의해 플랭킹되는, 조작된 유전자 구조체.
151. 단락 150에 있어서, 제1 관심 산물은 동종 뉴클레아제인 조작된 유전자 구조체.
152. 단락 146-151에 있어서, 제2 관심 산물은 치료 분자 또는 예방 분자인 조작된 유전자 구조체.
153. 단락 146-152 중 임의의 하나에 있어서 조작된 유전자 구조체를 포함하는 세포.
154. 단락 146-152 중 임의의 하나의 조작된 유전자 구조체 또는 단락 K8의 세포를 포함하는 조성물 또는 키트.
155. 대상에 단락 153의 세포를 전달하는 방법.
156. (a) 재조합효소 유전자들의 유도 전사, 재조합효소들의 핵으로의 유도 전좌 및/또는 스플리트 재조합효소들의 유도 이합체화에 의하여 조절되는 하나 이상의 재조합효소들;
(b) 하나 이상의 메가 뉴클레아제들 또는 CRISPR-Cas 뉴클레아제들; 및/또는
(c) 하나 이상의 역-선택가능 마커들;을 포함하는 조작된 유전 회로.
실시예들
실시예 1
본 실시예에서, 재조합효소 단백질들은 이종 유전자 카세트를 절단하기 위하여 사용된다(도 1). 재조합효소 활성의 조절은 재조합효소 유전자들의 유도성 전사, 재조합효소들의 핵으로의 유도성 전좌(translocation) 및/또는 스플리트 재조합효소들의 유도성 이합체화반응을 통하여 달성된다. 예들 들어, 재조합효소 발현은 독시사이클린, 플로레틴(phloretin)(9), 바닐산(vanillic acid)(13), 매크로라이드들(macrolides)(12) 또는 기타 유도체들의 사용을 통하여 조절된다. 또 다른 예로, 재조합효소는 핵 수용체와 융합되어 재조합효소가 유도제 없이 재조합을 촉매하지 않을 수 있다. 유도제, 예로 4OHT의 첨가로, 재조합효소는 핵으로 전좌되고 재조합을 촉매한다(14, 15). 본 접근법은 Cre, Flp 및 PhiC31로 검증되었으며 추가적인 인테그라제들로 확장 가능하다(15-17). 또 다른 예로, 재조합 단백질은 자체로 불활성화되는 두 개의 단편들로 나뉘어질 수 있으나, 단편들(예로, FKBP 및 FRB) 중 하나에 각각 융합된 두 단백질 도메인들과 상호작용하기 때문에 작은-분자(예로, 라파마이신 유사체들)의 첨가로 이합체화될 수 있다. 본 접근법은 Cre로 입증되어 왔고 다른 재조합효소들로 확장가능하다. 재조합들의 라이브러리들(19)은 이와 같은 방식으로 사용될 수 있다.
실시예2
본 실시예에서, 뉴클레아제 단백질들, 예로 메가뉴클레아제들 또는 CRISPR-Cas 뉴클레아제들은 표적화된 이중가닥 절단을 통하여 이종 유전자 카세트들을 절단 또는 분해하기 위하여 사용된다. 이들 뉴클레아제들은 우리의 이종 DNA 구조체들을 둘러싸는 특정 부위들을 절단하기 위하여 프로그램화되었고, 상기 구조체들은 유전자 결실의 효율을 현저하게 향상시키는 것으로 밝혀진 것(20)이다. 이들 이펙터들은, 일부 구현예들에서, 유도 프로모터들의 조절 하에 위치하는 것이다.
실시예 3
본 실시예에서, 역선택가능 마커들, 예로 시토신 데아미나제들 티미딘 키나제는 절단 또는 분해 반응 후에 이종 DNA를 여전히 포함하는 세포들을 사멸시키기 위하여 사용된다(도 3 참조). 예를 들어, 이스트 또는 세균 시토신 데아미나제는 5-플루오로시토신(5-FC)를 5-플루오로우라실(5-FU)로 전환시키고, 이는 세포 독성을 야기할 수 있다(21, 22). HSV 티미딘 키나제(HSV-사)는 간사이클로비르를 독성 산물로 전환시키고 세포 사멸을 촉진시키는 데 사용될 수 있는데, 물론 독성은 세포 배경에 따라 다양할 수 있다(23). 유도 사멸 스위치(inducible kill switch)가 사용될 수 있고, 이는 디프테리아 독소의 알파 사슬을 IPTG의 조절 하에서 발현하여 세포 사멸을 촉진한다(24). 일부 구현예들에서, 작은 분자들을 통한 독소들의 유도 활성은 세포 사멸을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다.
실시예 4
본 실시예에서, 일시적인 293FT 세포 형질주입(transfection) 분석들을 수행하여 다양한 티로신 재조합효소들의 활성을 재조합 활성을 테스트하였다. 293FT 세포들은 리포터 플라스미드, 재조합 플라스미드 및 형질주입 마커 플라스미드(예로, BFP를 암호화하는 플라스미드)와 균등한 비율로 일시적으로 형질주입되었다. 세포들은 형질주입 후 24시간 동안 GFP 형광체로 분석하였고, BFP 발현으로 제어하였다. 도 6 및 7은 일시적인 293FT 세포 형질주입 분석들의 데이터들을 나타내었다. 위쪽 그래프는 % GFP+ 세포들을 나타내고, 아래쪽 그래프는 GFP+ 세포들의 GFP 평균 형광 세기의 중간값을 나타낸다.
실시예 5
본 실시예에서, 시스템은 재조합효소 절단 효율을 분석하기 위하여 사용된다. BpiI(x2)-HSVtk-SV40pA-EGFP-Esp3I(x2) 카세트는 pcDNA3.1(+) 포유동물 발현 벡터(Life Tech)로 삽입된다. 재조합 서열들은 골든 게이트 절단/접합(Golden Gate digestion/ligation)을 통해 BpiI 및 Esp3I 부위들로 삽입된다. 도 8을 참조하라.
실시예 6
본 실시예에서, 일시적인 293FT 세포 형질주입 분석들을 수행하여 다양한 세린 인테그라제들의 재조합 활성을 테스트하였다. 293FT 세포들은 리포터 플라스미드, 재조합 플라스미드 및 형질주입 마커 플라스미드(예로, BFP를 암호화하는 플라스미드)와 균등한 비율로 일시적으로 형질주입되었다. 세포들은 형질주입 후 24시간 동안 GFP 형광체로 분석하였고, BFP 발현으로 제어되었다. 도 9 및 10은 일시적인 293FT 세포 형질주입 분석들의 데이터들을 나타내었다. 위쪽 그래프는 % GFP+ 세포들을 나타내고, 아래쪽 그래프는 GFP+ 세포들의 GFP 평균 형광 세기의 중간값을 나타낸다.
실시예 7
본 실시예에서, 재조합효소-기반 절단 구조체를 암호화하는 엔트리 벡터(entry vector)는 YEP 및 히그로마이신을 발현하는 미리 조작된 293FT 랜딩 패드 세포주(landing pad cell line)로 통합된다. 도 11을 참조하라. 도 12는 GFP 리포터의 293FT 랜딩 패드 세포주로의 성공적인 통합을 나타낸다. 통합시, 세포들은 GFP를 발현하고 동시에 YFP의 발현은 손실된다. 퓨로마이신의 선택압은 통합되지 않은 세포들을 제거한다.
실시예 8
본 실시예들은 유전체적-통합된 구조체들을 절단하는 방법을 개괄적으로 설명한다. 재조합-기반 절단 구조체를 암호화하는 엔트리 벡터는 미리 조작된 293FT 랜딩 패드 세포주로 통합된다. 통합된 세포주들은 재조합효소-발현 플라스미드 및 (예로, BFP를 발현하는) 리포터 플라스미드로 일시적으로 형질주입되고 시간에 따른 GFP 발현에 대하여 분석되었다. 역-선택 마커(CSM)는 통합된 구조체를 가지는 세포들을 사멸시키기 위해 사용된다. 도 13을 참조하라.
3개의 다른 재조합효소-기반 절단 구조체들을 발현하는 세포주들은 동종 재조합효소들로 형질주입되고, GFP 발현은 시간에 따라 분석되었다. 도 14를 참조하라.
B3 재조합효소의 일시적인 형질주입 후에, 프로드러그를 사용하여 pENTR_B3RT 절단 구조체를 가지는 세포들을 사멸시켰다. 역선택마커(CSM)는 프로드러그를 독성 약물로 전환시킨다. 이 경우에, CSM은 HSVtk였고 프로드러그는 간사이클로비르(GCV)였다. 세포들은 7일 동안 0.5, 1, 2 및 5 μM GCV로 처리하였고 GFP 발현은 시간에 따라 분석되었다. 히스토그램들은 GFP- 세포들의 % 및 GFP+ 세포들의 %을 나타낸다. 도 15를 참조하라. Flp 재조합효소의 일시적인 형질주입 후에 GCV를 사용하였고, 상기에 언급한 바와 같이, pENTR_FRT 절단 구조체를 가지는 세포들을 사멸시켰다. 도 16을 참조하라.
pENTR_B3RT_FRT 재조합효소-기반 절단 구조체를 발현시키는 세포주들은 나타낸 타임라인에 따라 B3 또는 Flp으로 연속적으로 형질주입되었다. GFP 발현은 시간에 따라 분석되었고, 히스토그램들은 15일 경과시 GFP+ 세포들의 %를 나타낸다. pENTR_B3RT_FRT 재조합효소-기반 절단 구조체는 구조체 B3RT_FRT_iCasp9_SV40pA_FRT_B3RT_EGFP_BGHpA를 암호화하고, 여기서 B3RT 및 FRT는 B3 및 Flp 각각에 대한 재조합 서열들이고; 및 iCasp9은 역선택마커(CSM)이다. 도 19를 참조하라.
pENTR_B3RT_FRT 재조합효소-기간 절단 구조체를 발현하는 세포주들은 나타낸 타임라인에 따라 B3 또는 Flp으로 연속적으로 형질주입시켰다. GFP 발현은 시간에 따라 분석되었고, 15일 경과시 GFP+ 세포들의 %은 플롯되었다. 도 20을 참조하라.
실시예 9
도 17은 시스템의 예를 나타내고, 상기 시스템에서 가이드 RNA들(gRNAs)은 유전체적으로-통합된 회로를 절단하고 제거한다. 도 17에서, gRNAs은, 세포들로 안정하게 통합되어 온 YFP 리포터인 경우, 5'-UTR 및 3'-UTR을 표적한다.
일시적인 형질주입 분석을 수행하여 CRISPR/Cas9를 이용하여 유전체적으로-통합된 회로의 제거를 테스트하였다. 단일 gRNA 및 Cas9을 암호화하는 벡터들은 (예로, BFP를 발현하는) 리포터 플라스미드와 함께 YGP를 발현하는 세포주로 공-형질주입되었다. 일부 경우들에서, 다른 gRNA들을 암호화하는 두 벡터들은 리포터 플라스미드와 함께 형질주입되었다. 세포 집단들은 BFP 발현으로 제어되었고, YFP+ 세포들의 %는 시간에 따라 플롯되었다. gRNA들의 다른 조합들은 YFP를 제거하기 위하여 사용될 수 있다. 도 18을 참조하라.
출처들
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
본원에 개시된 모든 출처들, 특허들 및 특허 출원들은 인용된 각각을 위한 주제에 관한 출처로서 통합되고, 일부 경우에 상기 문헌들의 전체를 포함할 수도 있다.
본원 명세서 및 청구항들에서 사용된, 부정관사들 "a" 및 "an"은, 반대로 명확하게 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것임을 이해하여야 할 것이다.
또한, 반대로 명확하게 나타내지 않는 한, 하나 이상의 단계 또는 동작을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법들에서, 방법의 단계들 또는 동작들의 순서는 반드시 열거된 방법의 단계들 또는 동작들의 순서로 제한되는 것은 아니라는 것을 이해하여야 한다.
상기 명세서뿐 아니라, 청구범위들에서, 모든 접속 구절들, 예로 "포함하는(comprising, including, carrying, having, containing, involving, holding, composed of, 등)"은 개방형, 즉, 비제한적으로 포함하는 것을 의미한다. 오직 접속 구절들 "~로 구성된(consisting of 및 consisting essentially of)"만이 각각, 특허 심사 절차들의 미국 특허청 매뉴얼, 섹션 2111.03.에서 명시된 바와 같이, 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 접속 구절들이 된다.

Claims (120)

  1. (a) 제1 관심 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및
    (b) 제2 관심 산물 및 역선택가능 마커(counterselectable marker)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 카세트를 포함하고,
    제1 관심 산물의 발현 또는 활성은 활성화 가능하고, 및
    제1 관심 산물은 카세트의 절단 또는 분해를 조절하는, 조작된 유전자 구조체.
  2. 제1항에 있어서, 제1 관심 산물은 재조합효소인, 조작된 유전자 구조체.
  3. 제2항에 있어서, 재조합효소는 리간드-의존적 키메라 재조합효소(chimeric recombinase)인, 조작된 유전자 구조체.
  4. 제3항에 있어서, 리간드-의존적 키메라 재조합효소는 변이된 인간 에스트로겐 수용체(ER) 리간드 결합 도메인에 연결된, 조작된 유전자 구조체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 재조합효소는 조합되면 재조합효소를 형성하는 제1 단편 및 제2 단편을 포함하는 스플리트-재조합효소(split-recombinase)인, 조작된 유전자 구조체.
  6. 제5항에 있어서, 제1 단편 및 제2 단편의 이합체화 반응이 유도 가능한 것인, 조작된 유전자 구조체.
  7. 제5항에 있어서, 제1 단편은 FKBP 도메인에 연결되고 제2 단편은 FRB 도메인에 연결되는, 조작된 유전자 구조체.
  8. 제2항에 있어서, 재조합효소는 티로신 재조합효소들 및 티로신 인테그라제들로부터 선택되는, 조작된 유전자 구조체.
  9. 제8항에 있어서, 재조합효소는 Cre, Dre, Flp, KD, B2, B3, λ, HK022 및 HP1 재조합효소들로부터 선택되는 티로신 재조합효소인, 조작된 유전자 구조체.
  10. 제2항에 있어서, 재조합효소(들)은 세린 재조합효소들 및 세린 인테그라제들로부터 선택되는, 조작된 유전자 구조체.
  11. 제10항에 있어서, 재조합효소는 γδ, ParA, Tn3, Gin, ΦC31, Bxb1 및 R4 재조합효소들로부터 선택되는, 조작된 유전자 구조체.
  12. 제2항 내지 제11항 중 임의의 한 항에 있어서, 카세트는 동족 재조합효소 인식 부위에 의해 플랭킹되는(flanked), 조작된 유전자 구조체.
  13. 제1항에 있어서, 제1 관심 산물은 뉴클레아제인, 조작된 유전자 구조체.
  14. 제13항에 있어서, 뉴클레아제는 메카뉴클레아제들, RNA-가이드 뉴클레아제들, 징크-핑거 뉴클레아제들, 및 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제들(transcription activator-like effector nucleases)로부터 선택된, 조작된 유전자 구조체.
  15. 제14항에 있어서, 뉴클레아제는 인트론 엔도뉴클레아제들 및 인테인 엔도뉴클레아제들로부터 선택되는 메가뉴클레아제인, 조작된 유전자 구조체.
  16. 제14항에 있어서, 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제들 및 Cpf1 뉴클레아제들로부터 선택된 RNA-가이드 뉴클레아제인, 조작된 유전자 구조체.
  17. 제16항에 있어서, 카세트는 뉴클레아제 인식 부위들과 상보적인 가이드 RNA들(gRNAs)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들을 더 포함하는, 조작된 유전자 구조체.
  18. 제13항 내지 제17항 중 임의의 한 항에 있어서, 카세트는 동족 뉴클레아제 인식 부위들을 포함하는, 조작된 유전자 구조체.
  19. 제1항 내지 제18항에 있어서, (a)의 뉴클레오티드 서열은 유도 프로모터(inducible promoter)와 작동 가능하게 연결된, 조작된 유전자 구조체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 임의의 한 항에 있어서, (b)의 뉴클레오티드 서열은 구성 프로모터(constitutive promoter)에 작동 가능하게 연결된, 조작된 유전자 구조체.
  21. 제1항 내지 제18항 중 임의의 한 항에 있어서, (a) 및 (b)의 뉴클레오티트 서열은 하나의 구성 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 조작된 유전자 구조체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 임의의 한 항에 있어서, 제2 관심 산물은 치료 분자 또는 예방 분자인, 조작된 유전자 구조체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 임의의 한 항에 있어서, 관심 산물은 단백질, 펩타이드 또는 핵산인, 조작된 유전자 구조체.
  24. 제23항에 있어서, 관심 산물은 RNA, DNA, 또는 RNA 및 DNA의 조합으로부터 선택되는 핵산인, 조작된 유전자 구조체.
  25. 제24항에 있어서, 관심 산물은 짧은-헤어핀 RNA들(short-hairpin RNAs), 작은 간섭 RNA들(short interfering RNAs) 및 마이크로 RNA들로부터 선택되는 RNA인, 조작된 유전자 구조체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 임의의 한 항에 있어서, 역선택가능 마커는 프로드러그(prodrug)인, 조작된 유전자 구조체.
  27. 제1항 내지 제25항 중 임의의 한 항에 있어서, 역선택가능 마커는 시토신 데아미나제들 및 티미딘 키나제들로부터 선택되는, 조작된 유전자 구조체.
  28. 벡터로서,
    상기 벡터는 제1항 내지 제27항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체를 포함하고,
    선택적으로 상기 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터인, 벡터.
  29. 제1항 내지 제27항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체 또는 제28항의 벡터를 포함하는, 세포.
  30. 제29항에 있어서, 세포는 줄기 세포 또는 면역 세포인, 세포.
  31. 제30항에 있어서, 세포는 중간엽 줄기세포들, 조혈모세포들, 배아 줄기세포들 및 만능 줄기세포들로부터 선택된 줄기세포인, 세포.
  32. 제30항에 있어서, 세포는 자연살해(NK) 세포들, NKT 세포들, 비만세포들, 호산구들, 호염구들, 대식세포들, 호중구들, 수지상 세포들, T 세포들 및 B 세포들로부터 선택된 면역 세포인, 세포.
  33. 제32항에 있어서, 세포는 CD8+ T 세포들, CD4+ T 세포들, 감마-델타 T 세포들 및 T 조절 세포들로부터 선택된 T 세포인, 세포.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 또는 조작된 T 세포 수용체(TCR) 세포인, 세포.
  35. 제1항 내지 제27항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체, 제28항의 벡터 또는 제29항 내지 제34항 중 임의의 한 항의 세포를 포함하는 조성물.
  36. 제1항 내지 제27항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체 또는 제28항의 벡터, 및 적어도 하나의 유도제 및/또는 역선택제(counterselective agent)를 포함하는 키트.
  37. 세포 집단에 제1항 내지 제27항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체 또는 제28항의 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  38. 대상에 제29항 내지 제34항 중 임의의 한 항의 세포를 전달하는 방법.
  39. (a) 재조합효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 유도 프로모터; 및
    (b) 관심 산물 및 역선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터; 를 포함하는 카세트를 포함하고,
    상기 카세트는 동종 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹된, 조작된 유전자 구조체.
  40. 제39항에 있어서, (a)는 (b)로부터 업스트림(upstream)에 위치하는, 조작된 유전자 구조체.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 종결 서열(terminator sequence)은 (a) 및 (b) 사이에 위치하는, 조작된 유전자 구조체.
  42. 제39항 내지 제41항 중 임의의 한 항에 있어서,
    (a)는, 다른 재조합효소에 각각 연결된, 적어도 두 개의 유도 프로모터들을 포함하고, 및 상기 카세트는 다른 재조합효소들과 동족인 재조합 효소 인식 부위들에 의해 플랭킹된, 조작된 유전자 구조체.
  43. 제39항 내지 제41항 중 임의의 한 항에 있어서, (a)의 뉴클레오티드 서열은 적어도 두 개의 다른 재조합효소들을 암호화하고, 및 상기 카세트는 다른 재조합효소들과 동족인 재조합 효소 인식 부위들에 의해 플랭킹된, 조작된 유전자 구조체.
  44. 제39항 내지 제43항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 (b)의 뉴클레오티드 서열은 적어도 두 개의 역선택가능 마커들을 암호화하는, 조작된 유전자 구조체.
  45. 제39항 내지 제44항 중 임의의 한 항에 있어서, 재조합효소(들)은 티로신 재조합효소들 및 티로신 인테그라제들로부터 선택되는, 조작된 유전자 구조체.
  46. 제45항에 있어서, 재조합효소(들)은 Cre, Dre, Flp, KD, B2, B3, λ, HK022 및 HP1 재조합효소들로부터 선택되는, 조작된 유전자 구조체.
  47. 제39항 내지 제46항 중 임의의 한 항에 있어서, 재조합효소(들)은 세린 재조합효소들 또는 세린 인테그라제들로부터 선택되는, 조작된 유전자 구조체.
  48. 제47항에 있어서, 재조합효소들은 γδ, ParA, Tn3, Gin, ΦC31, Bxb1 및 R4 재조합효소들로부터 선택되는, 조작된 유전자 구조체.
  49. 제39항 내지 제48항 중 임의의 한 항에 있어서, 관심 산물은 치료 분자 또는 예방 분자인, 조작된 유전자 구조체.
  50. 제39항 내지 제49항 중 임의의 한 항에 있어서, 관심 산물은 단백질, 펩타이드 또는 핵산인 조작된, 유전자 구조체.
  51. 제50항에 있어서, 관심 산물은 RNA, DNA, 또는 RNA 및 DNA의 조합으로부터 선택되는 핵산인, 조작된 유전자 구조체.
  52. 제51항에 있어서, 관심 산물은 짧은-헤어핀 RNA들, 작은 간섭 RNA들 및 마이크로 RNA들로부터 선택되는 RNA인, 조작된 유전자 구조체.
  53. 제39항 내지 제52항 중 임의의 한 항에 있어서, 역선택가능 마커는 프로드러그인, 조작된 유전자 구조체.
  54. 제39항 내지 제52항 중 임의의 한 항에 있어서, 역선택가능 마커는 시토신 데아미나제들 및 티미딘 키나제들로부터 선택되는, 조작된 유전자 구조체.
  55. 벡터로서,
    상기 벡터는 제39항 내지 제54항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체를 포함하고, 선택적으로 상기 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터인, 벡터.
  56. 제39항 내지 제54항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체 또는 제55항의 벡터를 포함하는 세포.
  57. 제56항에 있어서, 세포는 줄기세포 또는 면역세포인, 세포.
  58. 제57항에 있어서, 세포는 중간엽 줄기세포들, 조혈모세포들, 배아 줄기세포들 및 만능 줄기세포들로부터 선택된 줄기세포인, 세포.
  59. 제57항에 있어서, 세포는 자연살해(NK) 세포들, NKT 세포들, 비만세포들, 호산구들, 호염구들, 대식세포들, 호중구들, 수지상 세포들, T 세포들 및 B 세포들로부터 선택된 면역 세포인, 세포.
  60. 제59항에 있어서, 세포는 CD8+ T 세포들, CD4+ T 세포들, 감마-델타 T 세포들 및 T 조절 세포들로부터 선택된 T 세포인, 세포.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 또는 조작된 T 세포 수용체(TCR) 세포인, 세포.
  62. 제39항 내지 제54항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체, 제55항의 벡터 또는 제56항 내지 제61항 중 임의의 한 항의 세포를 포함하는 조성물.
  63. 제39항 내지 제54항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체 또는 제55항의 벡터, 및 적어도 하나의 유도제를 포함하고, 상기 유도제는 (a)의 유도 프로모터(들)의 활성을 조절하는 것인, 키트.
  64. 세포 집단에 제39항 내지 제55항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체 또는 제56항의 벡터를 도입하는 단계를 포함하고, 관심 산물은 세포들의 분화, 팽창 또는 표현형 유지(지속)을 돕는 것인, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 방법은 집단의 세포들을 배양하는 단계 및 관심 산물을 생산하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 방법은 유도제의 존재 하에서 집단의 세포들을 배양하는 단계, (a)의 프로모터를 활성화시키는 단계, 재조합효소(들)을 발현시키는 단계 및 조작된 유전자 구조체로부터 카세트를 절단하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 방법은 역선택제의 존재 하에서 집단의 세포들을 배양하는 단계 및 역선택가능 마커를 발현하는 세포들을 사멸시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 역선택제의 존재 하에서 집단의 세포들을 배양하는 단계 후에 집단의 10% 미만의 세포들이 카세트를 포함하는 것인, 방법.
  69. 제67항에 있어서, 방법은 집단의 세포들을 대상에 전달하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  70. 세포 집단에 제36항 내지 제55항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체 또는 제56항의 벡터를 도입하는 단계를 포함하고, 관심 산물은 치료 분자 및/또는 예방 분자인, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 방법은 집단의 세포들을 대상에 전달하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 방법은 대상을 유도제에 노출시키는 단계, (a)의 프로모터를 활성화시키는 단계, 재조합효소(들)을 발현시키는 단계 및 조작된 유전자 구조체로부터 카세트를 절단하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 방법은 대상을 역선택제에 노출시키는 단계 및 역선택가능 마커를 발현시키는 세포를 사멸시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 대상을 역선택제에 노출시키는 단계 후에 집단의 10% 미만의 세포들이 카세트를 포함하는 것인 방법.
  75. 대상에 제56항 내지 제61항 중 임의의 한 항의 세포를 전달하는 단계를 포함하는 방법.
  76. (a) 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 유도 프로모터; 및
    (b) 관심 산물 및 연석택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터;를 포함하는 카세트를 포함하고,
    상기 카세트는, 선택적으로 카세트를 플랭킹하는, 동종 뉴클레아제 인식 부위들을 포함하는, 조작된 유전자 구조체.
  77. 제76항에 있어서, (a)는 (b)로부터 업스트림에 위치하는, 조작된 유전자 구조체.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 종결 서열은 (a) 및 (b) 사이에 위치하는, 조작된 유전자 구조체.
  79. 제76항 내지 제78항 중 임의의 한 항에 있어서, (a)는, 다른 뉴클레아제에 각각 연결된, 적어도 두 개의 유도 프로모터들을 포함하고, 카세트는 다른 뉴클레아제들과 동족인 뉴클레아제 인식 부위들을 포함하는, 조작된 유전자 구조체.
  80. 제76항 내지 제79항 중 임의의 한 항에 있어서, (a)의 뉴클레오티드 서열은 적어도 두 개의 다른 뉴클레아제들을 암호화하고, 카세트는 다른 뉴클레아제들과 동족인 뉴클레아제 인식 부위들을 포함하는, 조작된 유전자 구조체.
  81. 제76항 내지 제80항 중 임의의 한 항에 있어서, (b)의 뉴클레오티드 서열은 적어도 두 개의 역선택가능 마커들을 암호화하는, 조작된 유전자 구조체.
  82. 제76항 내지 제81항 중 임의의 한 항에 있어서, 뉴클레아제(들)은 메가뉴클레아제들, RNA-가이드 뉴클레아제들, 징크-핑거 뉴클레아제들 및 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제들로부터 선택된, 조작된 유전자 구조체.
  83. 제82항에 있어서, 뉴클레아제(들)은 인트론 엔도뉴클레아제들 및 인테인 엔도뉴클레아제들로부터 선택된 메가뉴클레아제인, 조작된 유전자 구조체.
  84. 제82항에 있어서, 뉴클레아제(들)은 Cas9 뉴클레아제들 및 Cpf1 뉴클레아제들로부터 선택된 RNA-가이드 뉴클레아제인, 조작된 유전자 구조체.
  85. 제84항에 있어서, 카세트는 뉴클레아제 인식 부위들에 상보적인 가이드 RNA들(gRNAs)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들을 더 포함하는, 조작된 유전자 구조체.
  86. 제76항 내지 제85항 중 임의의 한 항에 있어서, 관심 산물은 치료 분자 또는 예방 분자인, 조작된 유전자 구조체.
  87. 제76항 내지 제86항 중 임의의 한 항에 있어서, 관심 산물은 단백질, 펩타이드 또는 핵산인, 조작된 유전자 구조체.
  88. 제87항에 있어서, 관심 산물은 RNA, DNA, 또는 RNA 및 DNA의 조합으로부터 선택되는 핵산인, 조작된 유전자 구조체.
  89. 제88항에 있어서, 관심 산물은 짧은-헤어핀 RNA들, 작은 간섭 RNA들 및 마이크로 RNA들로부터 선택되는 RNA인, 조작된 유전자 구조체.
  90. 제76항 내지 제89항 중 임의의 한 항에 있어서, 역선택가능 마커는 프로드러그인, 조작된 유전자 구조체.
  91. 제76항 내지 제89항 중 임의의 한 항에 있어서, 역선택가능 마커는 시토신 데아미나제들 및 티미딘 키나제들로부터 선택되는, 조작된 유전자 구조체.
  92. 벡터로서,
    상기 벡터는 제76항 내지 제91항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체를 포함하고,
    선택적으로 상기 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터인, 벡터.
  93. 제76항 내지 제91항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체 또는 제92항의 벡터를 포함하는 세포.
  94. 제93항에 있어서, 세포는 줄기세포 또는 면역세포인, 세포.
  95. 제94항에 있어서, 세포는 중간엽 줄기세포들, 조혈모세포들, 배아 줄기세포들 및 만능 줄기세포들로부터 선택된 줄기세포인, 세포.
  96. 제94항에 있어서, 세포는 자연살해(NK) 세포들, NKT 세포들, 비만세포들, 호산구들, 호염구들, 대식세포들, 호중구들, 수지상 세포들, T 세포들 및 B 세포들로부터 선택된 면역 세포인, 세포.
  97. 제96항에 있어서, 세포는 CD8+ T 세포들, CD4+ T 세포들, 감마-델타 T 세포들 및 T 조절 세포들로부터 선택된 T 세포인, 세포.
  98. 제96항 또는 제97항에 있어서, T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 또는 조작된 T 세포 수용체(TCR) 세포인, 세포.
  99. 제76항 내지 제91항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체, 제92항의 벡터 또는 제93항 내지 제98항 중 임의의 한 항의 세포를 포함하는 조성물.
  100. 제76항 내지 제91항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체 또는 제92항의 벡터, 및 적어도 하나의 유도제를 포함하고, 상기 유도제는 (a)의 유도 프로모터(들)의 활성을 조절하는 것인, 키트.
  101. 세포 집단에 제76항 내지 제91항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체 또는 제92항의 벡터를 도입하는 단계를 포함하고, 관심 산물은 세포들의 분화, 팽창 또는 표현형 유지(지속)을 돕는, 방법.
  102. 제101항에 있어서, 방법은 집단의 세포들을 배양하는 단계 및 관심 산물을 생산하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  103. 제102항에 있어서, 방법은 유도제의 존재 하에서 집단의 세포들을 배양하는 단계, (a)의 프로모터를 활성화시키는 단계, 재조합효소(들)을 발현시키는 단계 및 조작된 유전자 구조체로부터 카세트를 절단하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  104. 제103항에 있어서, 방법은 역선택제의 존재 하에서 집단의 세포들을 배양하는 단계 및 역선택가능 마커를 발현하는 세포들을 사멸시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 역선택제의 존재 하에서 집단의 세포들을 배양하는 단계 후에 집단의 10% 미만의 세포들이 카세트를 포함하는 것인, 방법.
  106. 제104항에 있어서, 방법은 집단의 세포들을 대상에 전달하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  107. 세포 집단을 제39항 내지 제55항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체 또는 제56항의 벡터에 도입하는 단계를 포함하고, 관심있는 산물은 치료 분자 및/또는 예방 분자인, 방법.
  108. 제107항에 있어서, 방법은 집단의 세포들을 대상에 전달하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  109. 제108항에 있어서, 방법은 대상에 유도제를 노출시키는 단계, (a)의 프로모터를 활성화시키는 단계, 재조합효소(들)을 발현시키는 단계 및 카세트를 조작된 유전자 구조체로부터 절단하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  110. 제109항에 있어서, 방법은 대상을 역선택제에 노출시키는 단계 및 역선택가능 마커를 발현하는 세포를 사멸시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  111. 제110항에 있어서, 역선택제에 대상을 노출시키는 단계 후에 집단의 10% 미만의 세포들이 카세트를 포함하는 것인, 방법.
  112. 대상에 제93항 내지 제98항 중 임의의 한 항의 세포를 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  113. (a) 적어도 하나의 리간드-의존적 키메라 재조합효소를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터; 및
    (b) 관심 산물 및 연석택가능 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터;를 포함하는 카세트를 포함하고,
    상기 카세트는 동종 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹되는, 조작된 유전자 구조체.
  114. 제113항에 있어서, 리간드-의존적 키메라 재조합효소는 변이된 인간 에스트로겐 수용체(ER) 리간드 결합 도메인에 연결된, 조작된 유전자 구조체.
  115. 제113항 및 제114항 중 임의의 한 항의 조작된 유전자 구조체를 포함하는, 세포.
  116. 대상에 제115항의 세포를 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  117. (a) 재조합효소의 제1 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터;
    (b) 재조합효소의 제2 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터; 및
    (c) 관심 산물 및 연선택가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터;를 포함하는 카세트를 포함하고,
    상기 제1 단편 및 제2 단편이 조합되면 전장 기능적 재조합효소를 형성하고,
    카세트는 동종 재조합효소 인식 부위들에 의해 플랭킹된, 조작된 유전자 구조체.
  118. 제117항에 있어서, 제1 단편은 FKBP 도메인에 연결되고 제2 단편은 FRB 도메인에 연결되는, 조작된 세포.
  119. 제117항 또는 제118항의 조작된 유전자 구조체를 포함하는, 세포.
  120. 대상에 제119항의 세포를 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
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