ES2698571T3 - Sistema de expresión para una terapia genética selectiva - Google Patents

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Abstract

Sistema de expresión para administración sistémica que comprende una secuencia que codifica la miotubularina, bajo el control de: - una secuencia promotora que permite la expresión a un nivel terapéuticamente aceptable de miotubularina en los músculos esqueléticos y que presenta una actividad promotora a un nivel tóxicamente aceptable incluso nulo en el corazón; o - una secuencia promotora que permite la expresión a un nivel terapéuticamente aceptable de miotubularina en los músculos esqueléticos, y una secuencia diana de un ARNmi expresado en el corazón.

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema de expresión para una terapia genética selectiva
Campo técnico
La presente invención se refiere a la terapia genética, en particular al tratamiento de enfermedades que afectan a los músculos esqueléticos, como por ejemplo la miopatía miotubular causada por mutaciones en el gen MTM1.
En este contexto, se describe un sistema de expresión que comprende un transgén que codifica la miotubularina, que permitirá asegurar la producción de una cantidad terapéuticamente eficaz de la misma al nivel de los músculos esqueléticos, y de una cantidad tóxicamente aceptable de la misma a nivel del corazón.
Estado anterior de la técnica
La miopatía miotubular relacionada con el cromosoma X (“ X-linked myotubular myopathy ” o XLMTM, OMIN 310400) es la forma más severa y más frecuente de un grupo de enfermedades denominadas miopatías centronucleares. Los sujetos enfermos ya están afectados en el transcurso de su vida fetal, muestran una reducción de la movilidad en el transcurso de la gestación y en el nacimiento presentan una miopatía que parece no progresiva [1,2,3]. Tienen una debilidad muscular y una hipotonía generalizadas, que conducen a una insuficiencia respiratoria y muchos mueren en el transcurso de los primeros años de vida a pesar del tratamiento médico intensivo. De manera más atípica, las formas menos severas de miopatía miotubular también se producen en sujetos masculinos y femeninos con síntomas leves durante la infancia que empeoran en el transcurso de la primera o segunda décadas [4].
Los músculos esqueléticos de los sujetos enfermos contienen pequeñas fibras con una distribución alterada de los orgánulos, tales como los núcleos y las mitocondrias, que de manera característica se encuentran en el centro de las fibras o, en los casos menos graves, se colocan en collar en la región subsarcolemal [4,5].
La enfermedad se debe a mutaciones inactivantes en el gen MTM1 expresado de forma ubicua, que codifica una fosfoinosítido fosfatasa denominada miotubularina [6].
En la actualidad existen modelos animales de la enfermedad en pez cebra, ratón y perro [7,8,9,10]. Los estudios realizados en estos modelos han mostrado que, en el músculo esquelético, la miotubularina desempeña un papel en diversos mecanismos, incluyendo la organización del túbulo T y del filamento intermedio, el acoplamiento de excitación-contracción, la transmisión de la unión neuromuscular, la supervivencia y la proliferación de células satélite [11,12,13,14].
La terapia de reemplazo génico por medio de un vector representa un posible enfoque terapéutico para la miopatía miotubular. Por lo tanto, como prueba de concepto se presentó de que una única inyección intramuscular de un vector viral adeno-asociado (AAV) recombinante en un ratón que presentaba una deficiencia sintomática específica del músculo en miotubularina (mKO) era capaz de mejorar la patología y la función de los músculos diana [15]. La cuestión del tratamiento de las patologías musculares sigue siendo crucial. La transferencia de genes, en particular con la ayuda de vectores obtenidos a partir de virus asociados a los adenovirus que resultan ser herramientas particularmente adecuadas para la transfección muscular, constituye una estrategia particularmente prometedora. Se trata de administrar al sujeto enfermo una copia del gen intacto, destinado a la producción de una proteína funcional que compensa la proteína mutada e inactiva producida por el sujeto.
En el caso de las patologías musculares, la administración se puede realizar mediante inyección local, a nivel muscular, del vector que porta el transgén. Sin embargo, a nivel clínico, una administración sistémica es preferente, lo que implica que el transgén se pueda volver a encontrar a nivel de los diferentes tejidos del organismo.
De una manera convencional, el transgén se coloca bajo el control de secuencias reguladoras que gobiernan su expresión, en particular con respecto al nivel de expresión o la especificidad tisular de la expresión. Por lo tanto y en el caso de la terapia genética de una enfermedad muscular, puede ser preferente un promotor que gobierne una expresión de forma más específica en el músculo. A modo de ejemplo, se ha desarrollado un promotor sintético C5-12, bien conocido por el experto en la materia, que se supone que favorece la expresión de los genes al nivel de los músculos.
Sin embargo, existe una necesidad evidente de desarrollar nuevas herramientas de terapia genética que permitan el tratamiento de las enfermedades neuromusculares, lo que conduce a la producción de cantidades eficaces de proteína al nivel de los tejidos diana lo que permite compensar la falta de actividad de las proteínas mutadas, y que además no sean peligrosos para los pacientes tratados.
Beggs et al., (Neuromuscular Disorders, vol. 22, n.° 9-10, 2012, p. 907) desvelaron la inyección intravenosa, en un ratón KO Mtm1, de un vector AAV9 expresa la miotubularina bajo el control del promotor de la desmina, sin informar de sus efectos a nivel cardiaco.
Objeto de la invención
La presente invención se basa en la puesta de manifiesto, por los inventores, de que después de la administración sistémica, un sistema de expresión destinado a la producción de la proteína de interés al nivel de un tejido diana, de forma ventajosa los músculos esqueléticos, puede comprender de manera simultánea una expresión al nivel de los otros tejidos y órganos potencialmente tóxica, haciendo que el sistema no sea adecuado para un uso terapéutico. Se describen soluciones técnicas para este problema recientemente identificado, que se refieren en particular a las filtraciones cardiacas relacionadas con la expresión de un transgén con enfoque muscular esquelético.
Más ampliamente, se trata, por lo tanto, para un sistema de expresión dado:
- de determinar si éste presenta una toxicidad;
- de determinar en cuál(s) tejido(s) éste presenta una toxicidad;
- proporcionar medios para reducir esta toxicidad a un nivel aceptable.
Por lo tanto, las proteínas a las que se refiere son aquellas que, cuando se expresan a partir de un sistema de expresión, presentan una toxicidad en al menos un tejido, en particular en un tejido en Adriana.
De manera ventajosa, el sistema de expresión se administra de manera sistémica en el organismo, en particular en un animal, incluso de forma más ventajosa en el ser humano.
De manera preferente, el análisis de la toxicidad se realiza en un organismo que presenta una copia defectuosa de la secuencia que codifica la proteína de interés, a saber, en un organismo que presentaba patología a tratar, por ejemplo, un modelo animal de tipo “Desactivación genética” (KO). En efecto, si en el contexto de la presente solicitud, se pudo observar una toxicidad cardiaca para sistemas de expresión que codifican la miotubularina o la calpaína 3, en el caso de la miotubularina, ésta no se detectó más que en los ratones KO. En otros términos, un análisis de toxicidad que, de acuerdo con la práctica habitual, se hubiera realizado en un animal sano, no habría puesto de manifiesto esta toxicidad.
Por lo tanto y de manera general, se describe un sistema de expresión que comprende una secuencia que codifica una proteína, dicho sistema de expresión permitiendo:
la expresión a un nivel terapéuticamente aceptable de la proteína en el o los tejidos diana; y
la expresión a un nivel tóxicamente aceptable de la proteína en otros tejidos distintos a los tejidos diana, es decir, en los tejidos no diana.
De forma más precisa, la presente invención se refiere a un sistema de expresión para administración sistémica que comprende una secuencia que codifica la miotubularina, bajo el control de:
- una secuencia promotora que permite la expresión a un nivel terapéuticamente aceptable de miotubularina en los músculos esqueléticos y que presenta una actividad promotora a un nivel tóxicamente aceptable incluso nulo en el corazón; o
- una secuencia promotora que permite la expresión a un nivel terapéuticamente aceptable de miotubularina en los músculos esqueléticos, y una secuencia diana de un ARNmi expresado en el corazón.
El tejido diana se define de forma ventajosa como el tejido o el órgano en el que la proteína debe desempeñar un papel terapéutico, en particular en el caso en el que el gen nativo que codifica esta proteína es defectuoso. De acuerdo con la invención, el tejido diana tiene como objeto los músculos estriados esqueléticos, denominados en lo sucesivo músculos esqueléticos, es decir, el conjunto de los músculos implicados en la motricidad, incluyendo el diafragma. Estos músculos están afectados en particular en las patologías denominadas miopatías. Otro tejido diana de interés potencial es el tejido nervioso periférico, que también puede estar afectado en las enfermedades neuromusculares. De acuerdo con la invención, los tejidos diana comprenden los músculos esqueléticos.
Los tejidos no diana se definen de forma ventajosa como los tejidos u órganos en los que la proteína no tiene papel terapéutico que desempeñar, y opcionalmente en los que la presencia de la proteína en cantidad superior a la cantidad endógena se puede considerar perjudicial, incluso mortal, y por lo tanto tóxica.
Los tejidos que se deben proteger en particular de esta toxicidad funcional son de forma ventajosa:
- el corazón o músculo estriado cardiaco;
- el hígado;
- el cerebro;
- los pulmones;
- el riñón; y/o
- los músculos lisos, en particular el tracto gastrointestinal.
Por lo tanto, de forma ventajosa se trata de órganos vitales o de tejidos en los que los sistemas de expresión genética tienen tendencia a acumularse.
En el contexto de la invención, el músculo cardiaco aparece como un tejido particularmente de interés, como se demuestra al menos para la miotubularina y la calpaína 3. De acuerdo con la invención, el sistema de expresión Permite por lo tanto una expresión a un nivel tóxicamente aceptable de la proteína en el corazón.
Por lo tanto, se describe un sistema de expresión que comprende una secuencia que codifica una proteína, dicho sistema de expresión permitiendo:
- la expresión a un nivel terapéuticamente aceptable de la proteína en los tejidos diana que comprenden los músculos esqueléticos y/o el tejido nervioso periférico; y
- la expresión a un nivel tóxicamente aceptable de la proteína en otros tejidos que no son los tejidos diana, en particular en el corazón.
De acuerdo con una primera característica, el sistema de expresión comprende una secuencia que codifica una proteína, que corresponde a un transgén. En el contexto de la invención, por “transgén” se hace referencia a una secuencia, de forma ventajosa un marco de lectura abierto, proporcionado en posición trans con la ayuda del sistema de expresión de acuerdo con la invención.
De acuerdo con un modo de realización particular, esta secuencia constituye una copia, idéntica o equivalente, de una secuencia endógena presente al nivel del genoma del organismo en el que se introduce el sistema de expresión. De acuerdo con un modo de realización particular, la secuencia endógena presenta una o varias mutaciones que hacen que la proteína codificada sea poco o nada funcional incluso ausente (defecto de expresión o de actividad de la proteína endógena), en particular a nivel de los tejidos diana, en particular de los músculos esqueléticos. En otros términos y de manera ventajosa, el sistema de expresión de acuerdo con la invención está destinado a su administración a un sujeto que presenta una copia defectuosa de la secuencia que codifica la proteína y que presenta una patología asociada. En este contexto, la proteína codificada por la secuencia portada por el sistema de expresión de acuerdo con la invención por lo tanto se puede definir como una proteína en la que la mutación produce una enfermedad neuromuscular.
De acuerdo con otro modo de realización, se trata de una secuencia que codifica una proteína capaz de “compensar” el defecto de una proteína defectuosa (al nivel de su expresión o de su actividad) en el sujeto al que se le administra el sistema de expresión. Por lo tanto y a modo de ejemplo con respecto a las patologías neuromusculares:
- la utrofina se puede usar para reemplazo de una distrofina mutada y deficiente;
- la decorina, la fibromodulina o el lumicano permiten compensar la fuente muscular observada en el caso de patologías neuromusculares;
- la activina también permite aumentar la masa muscular en patologías cuya causa no es una mutación de esta proteína.
Por lo tanto y de manera más general, la secuencia portada por el sistema de expresión se puede definir como codificante de una proteína que presenta una actividad terapéutica en el contexto de una enfermedad neuromuscular. La noción de actividad terapéutica se define como se menciona a continuación en relación con la expresión “nivel terapéuticamente aceptable”.
La secuencia que codifica la proteína es una secuencia de ácido nucleico y en particular puede ser un ADN (ácido desoxirribonucleico), un ARN (ácido ribonucleico) o un ADNc (ácido desoxirribonucleico complementario).
De manera ventajosa, dicha secuencia codifica una proteína funcional, es decir, capaz de asegurar su función nativa o esencial, en particular al nivel del músculo esquelético. Para cada proteína de interés, se puede definir la actividad buscada y la secuencia necesaria para la obtención de esta actividad.
De acuerdo con un modo de realización preferente, dicha secuencia codifica la proteína nativa, dicha proteína siendo de forma ventajosa de origen humano. También se puede tratar de un derivado o de un fragmento de esta proteína, con la condición de que este derivado o este fragmento conserven la actividad buscada. De manera ventajosa, por “ derivado ” o “ fragmento ” se hace referencia a una secuencia proteica que presenta al menos un 60 %, preferentemente un 70 %, incluso más preferentemente un 80 %, incluso un 90 %, un 95 % o un 99 % de identidad con la secuencia humana de la proteína de interés. Por ejemplo, de ese modo se hace referencia a las proteínas de otro origen (de mamífero no humano...) o proteínas truncadas, incluso mutadas, pero activas. Por lo tanto y en el contexto de la invención, el término “ proteína ” se entiende como la proteína entera sea cual sea su origen, así como los derivados y fragmentos funcionales de la misma.
En el contexto de la presente solicitud se tiene como objeto en particular las proteínas que permiten la gestión de la carga terapéutica de enfermedades denominadas neuromusculares, que pueden afectar a los músculos esqueléticos y/o al tejido nervioso periférico. De forma más particular se tiene como objeto las proteínas que permiten la gestión de la carga terapéutica de enfermedades que afectan a los músculos esqueléticos, denominadas “ miopatías ” de forma genérica.
De acuerdo con un aspecto particular, estas enfermedades están causadas por mutaciones en al menos un gen que comprende la no producción de la proteína o la producción de una proteína total o parcialmente no funcional. Por lo tanto, el sistema de expresión permite producir esta proteína en una forma activa y en una cantidad que permite compensar al menos parcialmente el defecto de la proteína nativa, u otra proteína capaz de compensar el defecto de la proteína nativa. La administración del sistema de expresión permite de ese modo mejorar incluso restaurar un fenotipo normal a nivel del o de los tejidos diana, en particular a nivel de los músculos esqueléticos en términos de movilidad y respiración.
Una proteína que presenta un interés totalmente particular en el contexto de la presente invención es la miotubularina de origen humano (SEQ ID NO: 1), murino (SEQ ID NO: 2) o canino (SeQ ID NO: 3). Cualquier secuencia que codifique estas proteínas, derivados o fragmentos funcionales a nivel terapéutico de las mismas, se puede usar por lo tanto en el contexto del sistema de expresión de acuerdo con la invención. Por lo tanto y a modo de ejemplo, las secuencias de nucleótidos correspondientes (ADNc) sonda secuencias SEQ ID NO: 4, 5 (o 14) y 6, respectivamente.
De manera conocida, las mutaciones en el gen MTM1 conllevan una enfermedad muscular denominada miopatía miotubular (MTM o XLMTM). Por lo tanto y de acuerdo con la estrategia de reemplazo o de transferencia genética, la provisión en trans de una secuencia que codifica una miotubularina terapéutica, por ejemplo, nativa, Permite tratar esta patología.
De acuerdo con otro modo de realización, se describe que la proteína de interés es la calpaína 3 (CAPN3) en la que las mutaciones causan en particular una enfermedad genética autosómica recesiva denominada distrofia periférica de tipo 2A (LGMD 2A o calpainopatía, OMIN 253600). A modo de ejemplo, la calpaína 3 humana presenta la secuencia SEQ ID NO: 7. Por lo tanto y como se ha descrito anteriormente, cualquier secuencia que codifica una calpaína 3 terapéutica, por ejemplo, la de secuencia SEQ ID NO: 7 o un derivado o fragmento de la misma, puede estar presente en un sistema de expresión tal como se ha descrito. Por ejemplo, se puede tratar de la secuencia de ADNc representada por la secuencia SEQ ID NO: 8 o los nucleótidos 307 a 2772 de la misma que corresponden al marco de lectura abierto.
Un listado no exhaustivo de proteínas implicadas en patologías que afectan a los músculos esqueléticos es la siguiente: Sarcoglicanos (a, p, y, 6), Distrofina, Disferlina (DYSF), Selenoproteína 1 (SEPN1), Amfifisina 2 (BIN1), dinamina 2 (DNM2), cofilina 2 (Cfl2), troponina T (TNNT1), tropomiosina 3 (TPM3), ACTA1, contactina 1 (cNTNl), TRIM32, Rapsina (RASPN), DOK7, Agrina (AGRN), COLQ, CHAT, receptores de Acetilcolina (CHRNE, CHRNA1, CHRNB1, CHRND), GFPT1, MUSK.
De acuerdo con un modo de realización particular, la secuencia contenida en el sistema de expresión no codifica una proteína de la familia de los sarcoglicanos, en particular el de a-sarcoglicano, de forma más precisa la secuencia que se describe en el documento Mendell et al., (Annals of Neurology, Vol. 68, N.° 5, pp 629-638, 2010).
De acuerdo con otro modo de realización particular, la secuencia contenida en el sistema de expresión no codifica una proteína de tipo distrofina, en particular una minidistrofina, y en particular la que se describe en el documento Wang et al., (Gene Therapy, Vol. 15, N.° 22, pp 1489-1499, 2008).
De forma más general se hace referencia a cualquier proteína que presente una actividad terapéutica en una enfermedad neuromuscular, por ejemplo en la que la mutación causa una enfermedad a nivel de uno o varios tejidos diana, y en el caso en el que su producción a partir de un sistema de expresión presenta una toxicidad en al menos un tejido, de forma ventajosa un tejido no diana, en particular al nivel del corazón, y de manera más exhaustiva en al menos un tejido elegido entre el siguiente grupo: el corazón, el hígado, el cerebro, los pulmones, el riñón y los músculos lisos.
De acuerdo con la invención, el sistema de expresión debe permitir la expresión a un nivel terapéuticamente aceptable de la miotubularina en los músculos esqueléticos.
Además, debe permitir la expresión a un nivel tóxicamente aceptable de la miotubularina al nivel del corazón.
En el contexto de la presente invención, la expresión “ expresión de la proteína ” se puede entender como “ producción de la proteína ”. Por lo tanto, el sistema de expresión debe permitir a la vez la transcripción y la traducción de la proteína a los niveles que se han definido anteriormente.
Los niveles que se definen en el contexto de la invención, es decir “ terapéuticamente aceptable ” y “ tóxicamente aceptable ” están relacionados efectivamente con la cantidad de proteína y también con su actividad.
La evaluación de la cantidad de proteína producida en un tejido dado se puede realizar por detección inmunológica con la ayuda de un anticuerpo dirigido contra dicha proteína, por ejemplo, por transferencia de Western o ELISA. Como alternativa, se puede realizar la cuantificación de los ARN mensajeros correspondientes, por ejemplo, por PCR o RT-PCR. Esta cuantificación se puede realizar en una muestra del tejido, incluso sobre varias muestras. Por lo tanto y en el caso en el que los tejidos diana son los músculos esqueléticos, se puede realizar a nivel de un tipo muscular o de varios tipos musculares (por ejemplo, cuádriceps, diafragma, tibial anterior, tríceps, ...).
En el contexto de la invención, por “ nivel terapéuticamente aceptable ”, se hace referencia al hecho de que la proteína producida a partir del sistema de expresión de acuerdo con la invención permite mejorar el estado patológico del paciente en cuestión, en particular en términos de duración de vida y calidad de vida. Por lo tanto y con respecto a una patología que afecta a los músculos esqueléticos, se trata de mejorar el estado muscular del sujeto afectado con la enfermedad, incluso restaurar un fenotipo muscular aproximado al de un sujeto sano. Como se ha mencionado anteriormente, el estado muscular, de forma ventajosa definido por la fuerza, tamaño, histología Y funcionalidad de los músculos, se puede valorar con uno de los siguientes métodos: realización de biopsia, medición de la fuerza, de la tonicidad, del volumen, o de la movilidad de los músculos, examen clínico, formación de imágenes médicas, biomarcadores, ...
Por lo tanto, los criterios que permiten evaluar un beneficio terapéutico al nivel de los músculos esqueléticos y que se pueden evaluar en diferentes momentos después del tratamiento son en particular:
- el aumento de la esperanza de vida;
- el aumento de la fuerza muscular
- la mejora del aspecto histológico; y/o
- la mejora de la funcionalidad del diafragma.
En el contexto de la invención, por “ nivel tóxicamente aceptable ”, se hace referencia al hecho de que la proteína producida a partir del sistema de expresión de acuerdo con la invención no comprende alteración mayor del tejido no diana, en particular al nivel histológico, fisiológico y/o funcional. En particular, la expresión de la proteína no debe ser letal. De forma ventajosa, la cantidad de proteína producida en el tejido no diana no debe superar el nivel endógeno de dicha proteína en este tejido, en particular en comparación con un sujeto sano. Como ya se ha mencionado, la toxicidad a nivel de un tejido se puede evaluar a nivel histológico, fisiológico y funcional. En el caso particular del corazón y a modo de ilustración, la toxicidad funcional de una proteína se puede evaluar mediante el estudio de la morfología y la función cardíaca, mediante examen clínico, electrofisiología, formación de imágenes, biomarcadores, la monitorización de la esperanza de vida o mediante análisis histológicos, en particular la detección de fibrosis y/o infiltrados celulares, por ejemplo, mediante correlación con rojo Sirio o hematoxilina/eosina.
De manera ventajosa, el nivel de eficacia y/o de toxicidad del sistema de expresión de acuerdo con la invención se evalúa in vivo en el animal, de forma ventajosa incluso más ventajosa en un animal que presenta una copia defectuosa del gen que codifica la proteína y por lo tanto afectado con la patología asociada.
Preferentemente, el sistema de expresión se administra de manera sistémica, por ejemplo, mediante inyección intravenosa.
Se describe un sistema de expresión que comprende al menos una secuencia que permite:
- evitar la expresión o disminuir el nivel de expresión de la proteína en los tejidos no diana, en particular En aquellos en los que la expresión de la proteína es tóxica; y/o
- mantener la expresión o aumentar el nivel de expresión de la proteína en el o los tejidos diana.
Se describe un sistema de expresión que comprende al menos una secuencia que permite:
- evitar la expresión o disminuir el nivel de expresión de la proteína en los tejidos que no son los músculos esqueléticos y/o el tejido nervioso periférico, de forma ventajosa en aquellos en los que la expresión de la proteína es tóxica; y/o
- mantener la expresión o aumentar el nivel de expresión de la proteína en los músculos esqueléticos y/o el tejido nervioso periférico.
En el contexto de la invención, la expresión “ evitar la expresión ” se refiere de forma ventajosa al caso en el que, incluso en ausencia de dicha secuencia, no hay expresión, mientras que la expresión “ disminuir el nivel de expresión ” se refiere al caso en el que la expresión se disminuye (o se reduce) por la contribución de dicha secuencia.
De manera similar, la expresión “ mantener la expresión ” se refiere de forma ventajosa al caso en el que, incluso en ausencia de dicha secuencia, hay expresión a un nivel comparable, mientras que la expresión “ aumentar el nivel de expresión ” se refiera al caso en el que hay un aumento de la expresión por la contribución de dicha secuencia. En el contexto de la presente solicitud, se destacaron al menos tres medios, combinados opcionalmente, que permiten alcanzar el objetivo buscado:
- el uso de una secuencia capaz evitar la expresión o de reducir el nivel de expresión en la proteína en los tejidos no diana, sin reducir el nivel de expresión en el o los tejidos diana;
- el uso de una secuencia promotora capaz de asegurar un nivel de expresión elevado en el o los tejidos diana y bajo, incluso nulo, en los tejidos no diana, en particular en aquellos en los que se demuestra que la expresión de la proteína es tóxica;
- el uso de un vector, de forma ventajosa viral, que presenta un tropismo adecuado, en ese caso para el o los tejidos diana que para los tejidos no diana, en particular para los cuales se demuestra que la expresión de la proteína es tóxica.
De manera característica, un sistema de expresión de acuerdo con la invención comprende una secuencia promotora que gobierna la transcripción de la secuencia que codifica la miotubularina, de forma ventajosa colocada en la posición 5' de este transgén y que se relaciona funcionalmente con la misma. De manera característica, ésta permite asegurar un nivel de expresión terapéuticamente aceptable de la miotubularina en los músculos esqueléticos.
También se puede tratar de promotores naturales o sintéticos (artificiales), inducibles o constitutivos. De la misma manera, pueden ser de cualquier origen, en particular humano, del mismo origen que el transgén en presencia o de otro origen.
De acuerdo con un primer modo de realización, esta secuencia promotora correspondía un promotor denominado ubicuo o no selectivo, es decir, que presenta una baja especificidad tisular y que asegura un nivel de expresión globalmente similar en los diferentes tejidos, así como en los tejidos diana que no son diana. A modo de ejemplo se pueden mencionar: el promotor del citomegalovirus (pCMV), el promotor de Mtm1.
De acuerdo con un modo de realización particular, il se trata de un promotor adecuado para los músculos esqueléticos y/o para el tejido nervioso periférico pero que se puede expresar en otros tejidos, en particular en otros músculos. A modo de ejemplo se pueden mencionar: el promotor de la desmina, de forma ventajosa de secuencia SEQ ID NO: 11, el promotor de la alfa-actina esquelética, de la creatina quinasa muscular (MCK), el promotor sintético C5-12, el promotor sinapsina I (Syn) o el promotor CK6. En relación a los músculos esqueléticos, también se pueden mencionar los promotores troponina, factor 5 miogénico (Myf5), rápido 1/3 de cadena Ligera de miosina (MLC1/3f), diferenciación miogénica 1 (Myod1), miogenina (Myog), gen 7 de caja emparejada (Pax7), MEF2. En relación al tejido nervioso periférico, también se pueden mencionar los promotores P0 y MBP (Proteína Básica de Mielina).
De acuerdo con un modo de realización ventajoso, la secuencia promotora del sistema de expresión se elige por su actividad promotora diferencial entre los tejidos diana y no diana, en el caso superior en los tejidos diana. En este caso en concreto, esta secuencia permite por lo tanto aumentar la expresión de la proteína en los tejidos diana, de forma ventajosa los músculos esqueléticos y/o el tejido nervioso periférico, siempre evitando la expresión en los tejidos no diana, en particular en los que la expresión de la proteína es tóxica.
A modo de ejemplo y en el caso en el que los tejidos diana son los músculos esqueléticos, el promotor es de forma ventajosa un promotor denominado específico de músculo. De acuerdo con otra característica ventajosa, dicho promotor presenta una actividad promotora baja incluso nula en los tejidos no diana, en particular en el corazón, permitiendo una expresión a un nivel tóxicamente aceptable de la proteína en estos tejidos.
De acuerdo con un modo de realización particular, dicha secuencia promotora puede corresponder al promotor del gen de la calpaína 3, de forma ventajosa de origen humano, incluso de forma más ventajosa de secuencia SEQ ID NO: 12. Otra secuencia promotora adecuada es la del ARNmi 206 (miR206), de forma ventajosa de origen humano, incluso de forma más ventajosa de secuencia SEQ ID NO: 13.
Por lo tanto y en el contexto de la solicitud, se mostró al menos para la calpaína 3, que un sistema de expresión que comprende la secuencia que codifica esta proteína, colocada bajo el control del promotor de la calpaína 3 o del ARNmi 206, era capaz de asegurar la expresión a un nivel terapéuticamente aceptable de la proteína en los músculos esqueléticos, y a un nivel tóxicamente aceptable de la proteína en el corazón y el hígado.
De acuerdo con otro aspecto, por lo tanto se describe un sistema de expresión que comprende una secuencia que codifica una proteína, colocada bajo el control de un promotor que presenta la secuencia SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13. También se hace referencia a secuencias promotoras obtenidas a partir de las secuencias SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 o que corresponden a un fragmento de las mismas pero que presentan una actividad promotora comparable, en particular en términos de especificidad tisular y opcionalmente de eficacia.
En el caso en el que esta secuencia promotora no permite la expresión a un nivel tóxicamente aceptable de la proteína en los tejidos no diana, está asociada de forma ventajosa a una secuencia que tiene como función reducir el nivel de expresión en la proteína en los tejidos no diana, de forma ventajosa en los tejidos no diana en los que se ha demostrado que expresión de la proteína es tóxica.
Por lo tanto y a modo de ejemplo, tanto en el caso de la miotubularina como en el de la calpaína 3, se mostró que el uso de un promotor de la desmina presentaba una toxicidad cardiaca. Por el contrario, y de acuerdo con la invención, el uso de un promotor de la desmina, de forma ventajosa de secuencia SEQ ID NO: 11, asociada al menos una secuencia diana del ARNmi-208a, de forma ventajosa de secuencia SEQ ID NO: 10, permite a la vez: - Un nivel de expresión terapéuticamente aceptable de la proteína a nivel del tejido diana, de forma ventajosa los músculos esqueléticos;
- un nivel de expresión tóxicamente aceptable de la proteína al nivel de los tejidos no diana, de forma ventajosa el corazón, incluso el hígado.
Como ya se ha mencionado, dicha secuencia es capaz de evitar la expresión o de reducir el nivel de expresión en la proteína en los tejidos no diana, de forma ventajosa en el o los tejidos no diana en los que la expresión de la proteína es tóxica. Esta acción se puede ejercer de acuerdo con diferentes mecanismos, en particular:
- al nivel de la transcripción de la secuencia que codifica la proteína;
- a nivel de los transcritos que resultan de la transcripción de la secuencia que codifica la proteína, por ejemplo, mediante su degradación;
- al nivel de la traducción de los transcritos en la proteína.
Una secuencia de ese tipo es de forma ventajosa una diana para una molécula pequeña de ARN elegida entre el siguiente grupo:
- los microARN (“ microARNs);
- pequeños ARN de interferencia endógenos (endogenous small interfering RNA o siRNAs);
- pequeños fragmentos del ARN de transferencia (ARNt);
- ARN de las regiones intergénicas;
- ARN ribosómico (ARNr);
- pequeños ARN nucleares (ARNsn);
- pequeños ARN nucleolares (ARNsno);
- ARN interactúan con las proteínas piwi (ARNpi);
De manera ventajosa, esta secuencia permite mantener la expresión, incluso aumentar el nivel de expresión de la proteína en el o los tejidos diana, de forma ventajosa en los músculos esqueléticos.
Preferentemente, una secuencia de ese tipo se elige por su eficacia en el tejido no diana en el que se considera que la expresión de la proteína es tóxica. La eficacia de esta secuencia puede ser variable en función de los tejidos, por lo tanto, puede ser necesario asociar varias de estas secuencias, elegidas por su eficacia en el conjunto de los tejidos no diana que son objeto en los que se demuestra su toxicidad.
De acuerdo con un modo de realización preferente, esta secuencia es una secuencia diana para un microARN (ARNmi). De manera conocida, una secuencia de ese tipo elegida con criterio permite reprimir la expresión genética de forma específica en tejidos seleccionados.
Por lo tanto y de acuerdo con un modo de realización particular, el sistema de expresión de acuerdo con la invención comprende una secuencia diana para un microARN (ARNmi) expresado un presente en el o los tejidos no diana en los que se demuestra que la expresión de la proteína es tóxica, por ejemplo, en el corazón. De manera adecuada, la cantidad de este ARNmi presente en el tejido diana, de forma ventajosa en los músculos esqueléticos, Es inferior a la presente en el tejido no diana, incluso si este ARNmi no se expresa en el tejido diana. De acuerdo con un modo de realización particular, el ARNmi se expresa de forma específica en el tejido no diana objeto, por ejemplo, el corazón.
De manera conocida por el experto en la materia, la presencia o el nivel de expresión, en particular en un tejido dado, de un ARNmi de interés se puede evaluar por PCR, de forma ventajosa por RT-PCR, o por transferencia Northern.
Los diferentes ARNmi Identificados en la actualidad, así como su secuencia diana y su especificidad tisular, Son conocidos por el experto en la materia y se describen por ejemplo en el documento WO 2007/000668.
De acuerdo con un modo de realización particular, el sistema de expresión de acuerdo con la invención comprende la secuencia diana del ARNmi-208a (también denominado miR208a, SEQ ID NO: 9). De forma ventajosa, esta secuencia, idéntica en el ser humano, el perro y el ratón, presenta la secuencia SEQ ID NO: 10 de 22 pb. De forma muy evidente, cualquier secuencia derivada o truncada, reconocida por el ARNmi-208a se puede usar en el contexto de la invención. Por lo tanto, en el contexto de la solicitud se mostró que el uso de esta secuencia diana, tanto con respecto a la miotubularina como la calpaína 3, permitía resolver el problema de su toxicidad cardiaca incluso hepática en el caso de la calpaína 3.
Como ya se ha mencionado, una secuencia diana para un microARN se puede usar sola o en combinación con otras secuencias, de forma ventajosa secuencias diana para un microARN, idénticas son diferentes. Esta secuencia se puede usar en tándem o en orientación inversa.
De acuerdo con un modo de realización preferente, en particular para la secuencia diana del ARNmi-208a, se puede usar una (1) o varias, en particular dos (2) o cuatro (4) secuencias. De forma ventajosa, éstas se usan en tándem, es decir, todas en la misma orientación. En el caso en el que se usa en varias secuencias diana, éstas se pueden separar mediante un espaciador de ADN de secuencia aleatoria, de manera conocida por el experto en la materia. De manera ventajosa, en el caso de una secuencia diana de un ARNmi, en particular del miR208a, ésta se coloca en la posición 3' de la secuencia que codifica la proteína, e incluso de forma más ventajosa se inserta en la región en la posición 3' UTR (“ Región Sin Traducir ”) del sistema de expresión, de forma ventajosa del ADNc que codifica la proteína. Incluso de forma más ventajosa y en el caso en el que el sistema de expresión comprende una señal de poliadenilación en la posición 3' del ADNc que codifica la proteína, esta secuencia se inserta entre el codón de parada del marco de lectura abierto y la señal de poliadenilación.
En el contexto de la invención, se llevó a la conclusión de que al menos una secuencia diana del ARNmi-208a era adecuada para obtener un nivel tóxicamente aceptable de proteína al menos en el corazón, en particular con respecto a la miotubularina y la calpaína 3.
De acuerdo con un modo de realización particular, el sistema de expresión comprende:
- una secuencia que codifica la miotubularina Colocada bajo el control de un promotor, de forma ventajosa el de la desmina, incluso de forma más ventajosa el de la desmina humana (SEQ ID NO: 11);
- al menos una secuencia diana de un ARNmi expresado en el corazón, de forma ventajosa ARNmi-208a, de forma ventajosa una sola secuencia día natal como la secuencia SEQ ID NO: 10.
De acuerdo con otro modo de realización, se describe un sistema de expresión que comprende:
- una secuencia que codifica la calpaína 3 colocada bajo el control de un promotor, de forma ventajosa el de la desmina, incluso de forma más ventajosa el de la desmina humana (s Eq ID NO: 11), o el de la calpaína 3, incluso de forma más ventajosa el de la calpaína 3 humana (SEQ ID NO: 12), o el del ARNmi206, incluso de forma más ventajosa el del ARNmi206 humano (SEQ ID NO: 13);
- al menos una secuencia diana de un ARNmi expresado en el corazón, de forma ventajosa el ARNmi-208a, incluso de forma más ventajosa dos secuencias diana en tándem.
Por lo tanto, los diferentes tipos de secuencias que se han detallado anteriormente se pueden combinar en un mismo sistema de expresión.
De acuerdo con la invención, un sistema de expresión o casete de expresión comprende los elementos necesarios para la expresión del transgén presente. Además, las secuencias tal como se han definido anteriormente permiten asegurar y modular la expresión del transgén, un sistema de ese tipo puede comprender otras secuencias tales como:
- una señal de poliadenilación, por ejemplo, la poliA del SV40 o de la hemoglobina en particular humana, de forma ventajosa insertada en la posición 3' de la secuencia codificante, incluso en la posición 3' de la secuencia diana del ARNmi;
- secuencias para estabilizar los transcritos, tales como el intrón 1 de la hemoglobina en particular humana; - secuencias de amplificación o “ potenciador ”;
Un sistema de expresión de acuerdo con la invención se puede introducir a tanto en una célula, un tejido o un organismo, en particular en el ser humano. De manera conocida por el experto en la materia, la introducción se puede realizar ex vivo o in vivo, por ejemplo, por transfección o transducción. De acuerdo con otro aspecto, se describe una célula o un tejido, de forma ventajosa de origen humano, que comprende un sistema de expresión de acuerdo con la invención.
El sistema de expresión de acuerdo con la invención, en este caso un ácido nucleico aislado, se puede administrar en el estado en un sujeto, es decir, en forma de un ADN desnudo. Para facilitar la introducción de este ácido nucleico en las células, éste se puede asociar a diferentes medios químicos tales como sistemas de dispersión coloidal (complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, perlas) o sistemas basados en lípidos (emulsiones de aceite en agua, micelas, liposomas).
Como alternativa y de acuerdo con otro modo de realización preferente, el sistema de expresión de acuerdo con la invención comprende un plásmido o un vector. De manera ventajosa, un vector de ese tipo es un vector viral. Los vectores virales usados normalmente en terapia genética en los mamíferos, en particular en el ser humano, son conocidos por el experto en la materia. Los vectores virales de ese tipo se eligen de forma ventajosa entre el siguiente listado: vector obtenido a partir del virus del herpes, vector baculoviral, vector lentiviral, vector retroviral, vector adenoviral y vector viral adeno-asociado o AAV (“ virus adeno-asociado ”).
De manera preferente, se trata de un vector viral adeno-asociado o AAV (“ virus adeno-asociado ”), que corresponde bien a serotipos naturales (AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9), a variantes de los mismos o a serotipos artificiales. De manera conocida por el experto en la materia, también se pueden usar vectores AAV quiméricos.
De forma ventajosa, el sistema de expresión de acuerdo con la invención se inserta entre dos secuencias ITR (“ Inverted Terminal Repeat ”) del vector AAV.
Con respecto a una administración sistémica para la cual el sistema de expresión de acuerdo con la invención adquiere todo su sentido, son particularmente preferentes los vectores AAV de serotipo 8 o 9. Por ejemplo se puede tratar de vectores AAV2/8 o AAV2/9.
De manera conocida por el experto en la materia, las partículas virales recombinantes se pueden obtener, por ejemplo, por tri-transfección de células 293 HEK o mediante el sistema de baculovirus. Las titulaciones de vector Se expresan clásicamente en términos de 100 o más virales por ml (vg/ml).
De acuerdo con un modo de realización preferente, el sistema de expresión de acuerdo con la invención comprende un vector que presenta un tropismo adecuado, en este caso tanto para el o los tejidos diana como para los tejidos no diana, en particular aquellos en los que se ha demostrado que la expresión de la proteína es tóxica. Se puede tratar de un vector AAV que contienen a cápside seleccionada para hacer de diana/transducir poco o nada, los tejidos no diana tales como el corazón, incluso para hacer de diana/transducir de forma específica los tejidos diana, en particular los músculos esqueléticos.
Como se deduce a partir de lo que se ha mencionado anteriormente, los sistemas de expresión de acuerdo con la invención, en particular en forma de vectores AAV recombinantes o de partículas virales recombinantes, tienen aplicaciones evidentes, en particular en el campo terapéutico.
Por lo tanto y de acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere al uso del sistema de expresión que se describe como medicamento. En otros términos, también se hace referencia a una composición farmacéutica que comprende un sistema de expresión de ese tipo. De manera adecuada, ésta puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable e inerte, de forma ventajosa adecuado para una administración sistémica, por ejemplo, intravenosa. A una composición de ese tipo se pueden añadir diversos excipientes, estabilizantes, y otros compuestos adecuados conocidos por el experto en la materia.
La presente invención puso de manifiesto el interés del sistema de expresión que se describe en el caso en el que su administración no se realiza de manera local al nivel de los tejidos diana, sino al contrario de manera general al nivel de todo el cuerpo, llevando su administración a nivel de los tejidos no diana.
Por lo tanto y de manera ventajosa, un sistema de expresión de acuerdo con la invención se administra por una de las siguientes vías: administración enteral, parenteral, oral, intravenosa, intra-arterial y por inhalación.
De manera preferente, se trata de una administración sistémica, de forma ventajosa una inyección intravenosa. Se debe indicar que una administración sistémica se puede realizar en las proximidades de un sitio de tratamiento, por ejemplo, en las proximidades de un músculo esquelético.
De acuerdo con un modo de realización particular, no se trata de una administración loco-regional. De forma más precisa, de ese modo se puede excluir una inyección intravascular en particular intravenosa (realizada bajo presión, y en presencia de un torniquete, en las proximidades de un músculo diana), tal como se lo describe por ejemplo Petrov et al., (Methods Mol Biol 2011; 709: 277-86), o intra-arterial (catéter en una arteria y hinchamiento de las venas en las proximidades así como de la arteria, torrente arriba, para evitar la difusión) tal como lo describe por ejemplo Gonin et al., (J Gene Med 2005; 7: 782-791).
Cuando la composición de acuerdo con la invención se va a inyectar, ésta se presenta preferentemente en forma líquida. La concentración eficaz, en este caso el sistema de expresión de acuerdo con la invención, la cantidad que se va a inyectar y la frecuencia de las inyecciones las determina el experto en la materia. Una administración única se puede considerar suficiente. Un efecto terapéutico se busca de forma ventajosa para un periodo de duración de al menos 1 mes, 3 meses, 6 meses, 1 año, 5 años o más.
Los medicamentos de este tipo están destinados en particular a la terapia genética, en particular para el tratamiento de las enfermedades neuromusculares e incluso de forma más particular las enfermedades que afectan esencialmente a los músculos esqueléticos (miopatías). Más generalmente, la invención permite mejorar en particular la función muscular en un sujeto.
Los pacientes a tratar son de forma ventajosa mamíferos, en particular seres humanos.
Una enfermedad que se tiene como objeto en particular en el contexto de la invención es la miopatía centronuclear, de forma más precisa la miopatía miotubular relacionada con el cromosoma X (XLMTM). Además, que se pueden tratar otras miopatías centronucleares y enfermedades neuromusculares asociadas a la miotubularina, tales como ciertas formas de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth.
La distrofia de las cinturas de tipo 2A (LGMD2A) también se puede tratar con un sistema de expresión tal como se ha descrito.
De forma más general, un listado exhaustivo de las patologías que se tienen como objeto es el siguiente: distrofia muscular congénita con déficit de selenoproteína N, distrofia muscular congénita con déficit primario de merosina, distrofia muscular congénita de tipo Ullrich, distrofia muscular de Duchenne (DMD) o de Becker (BMD), miopatía congénita de núcleo central, miopatía congénita de múltiples mininúcleos, miopatías centronucleares autosómicas, miopatía con desproporción de tipos de fibras, miopatía con bastoncillos, síndromes miasténicos congénitos, otras enfermedades neuromusculares asociadas a las miotubularinas, distrofia de las cinturas de tipo 2B o 2D, miopatía distal de tipo Miyoshi, disferlinopatías, sarcoglicanopatías.
De acuerdo con un modo de realización particular, la patología no es la distrofia muscular de Duchenne (DMD) o de Becker (BMD), incluso la LGMD2D.
Por lo tanto, lo que se espera del medicamento de acuerdo con la invención es a la vez una mejora de la patología, así como de la calidad de vida y de la longevidad del paciente, a la vez que se evitan los efectos secundarios potenciales al nivel de los otros tejidos de un tratamiento de este tipo.
Como se va a demostrar a modo de ejemplo, la presente solicitud puso de manifiesto la posible toxicidad cardiaca de los tratamientos mediante terapia genética de las enfermedades musculares y propone soluciones técnicas que permitan superar este problema.
Ejemplos de realización
La invención y las ventajas que resultan de la misma se destacarán mejor a partir de los ejemplos de realización que siguen a continuación, con el apoyo de las figuras adjuntas. Sin embargo, éstos no tienen ningún alcance limitante. La presente invención se ilustra con respecto al gen de la miotubularina (Mtm1) et de la calpaína 3 (CAPN3). Sin embargo, la estrategia que se describe se puede aplicar a cualquier transgén que codifique una proteína de interés al nivel de los músculos esqueléticos en los que se desvela una toxicidad en particular cardiaca.
Figura 1: Esquema de las construcciones vectoriales:
A/ casete de expresión de Mtm1 desprovisto de secuencias diana para el ARNmi-208a;
B/ casete de expresión que contiene 1, 2 o 4 secuencias diana para el ARNmi-208a (cajas) en la posición 3' del gen Mtm1.
Figura 2: Sección transversal del corazón de un ratón XLMTM tratado con la ayuda de un vector AAV-pDES-Mtm1. Las zonas de fibrosis se desvelan en color rojo gracias a una coloración con rojo Sirio.
Figura 3:
- en la parte superior: distribución del vector en los músculos esqueléticos (músculo tibial anterior = TA;
cuádriceps = QUA; tríceps = TRI) y en el corazón de un ratón de tipo silvestre (WT), 1 mes después de la administración intravenosa de los vectores (vg/genoma diploide).
- en la parte inferior: nivel de proteína MTM1 en los músculos esqueléticos y el corazón de un ratón de tipo silvestre (WT), 1 mes después de la administración de los vectores. Los valores indican la tasa de multiplicación con respecto a los niveles endógenos. Como controles, los ratones se inyectaron con la ayuda o bien de PBS o bien del vector AAV8 vacío (AAV-MCS).
Figura 4: Curva de supervivencia (a la izquierda) y curva de masa corporal (a la derecha) de ratón KO (“ Knock Out ”) Mtm1 inyectado con la ayuda de pBs , AAV8-Des-MCS, AAV8-Des-Mtm1 o AAV8-Des-Mtm1-miRHT1. Los ratones de tipo silvestre (WT) recibieron PBS como control.
Figura 5: Análisis de las actividades promotoras de CAPN3 y miR-206 in vivo:
A/ Análisis histológico del músculo cardiaco después de inyección de PBS o de los vectores AAV2/9-desm-CAPN3 (pdes.C3), AAV2/9-pC3-CAPN3 (pC3.C3), AAV2/9-pmiR206-CAPN3 (p206.C3) y coloración con rojo Sirio (parte superior, escala = 500 pm) o Hematoxilina Floxina Azafrán (HPS) (en la parte inferior, escala = 100 pm).
B/ Evaluación del nivel de ADN vectorial por qPCR en el corazón de razones de tipo silvestre WT después de inyección.
C/ Evaluación del nivel de ARNm CAPN3 por qPCR n el corazón de razones de tipo silvestre WT después de inyección. La línea "H" corresponde al nivel endógeno de ARNm CAPN3 en el corazón de ratones de tipo silvestre WT.
D/ Análisis de enzimas séricas. Los ensayos de alanina aminotransferasa (ALT) se realizaron en suelos de ratones WT tratados con pC3.C3, a la izquierda o p206.C3, a la derecha. La media y el error típico de la media (ETM) para cada condición se indican con un círculo y una barra vertical, respectivamente.
Figura 6: Análisis de la actividad de miR-208aT in vivo:
A/ Análisis histológico del músculo cardiaco, 35 días después de inyección de PBS o de dosis idénticas de los vectores AAV2/9-desm-CAPN3 (pdes.C3) o AAV2/9-desmina-CAPN3-miR208aT (pdes.C3-T) y tinción con rojo Sirio (en la parte superior, escala = 500 pm) o HPS (en la parte inferior, escala = tiene micrómetros). B/ Evaluación del nivel de ADN vectorial por qPCR en el corazón de ratón WT después de inyección (en la parte superior) y del nivel de ARNm del transgén CAPN3 (en la parte inferior). La línea "H" corresponde al nivel endógeno de ARNm CAPN3 en el corazón de ratones de tipo silvestre WT.
C/ Análisis de la expresión de la calpaína 3 mediante transferencia de Western en el músculo esquelético y en el corazón de ratones WT inyectados con PBS o con vectores AAV2/9-desmina-CAPN3 (pdes.C3) o AAV2/9-desm-CAPN3-miR208aT (pdes.C3-T). La proteína completa se indica con una flecha y sus productos de escisión (60, 58 y 55 kDa) con un corchete.
D/ Cuantificación de los niveles de ARNm de miR-208a (miR208a), HOP (Hop) y connexina 40 (Cnx40) en el corazón de ratones WT inyectados con AAV2/9-desmina-CAPN3 (pdes.C3) o AAV2/9-desmina-CAPN3-miR208aT (pdes.C3-T). La cantidad de ARN en la condición pdes.C3-T se proporciona como porcentaje con respecto al nivel de ARN en la condición pdes.C3.
Figura 7: Análisis histológico de la eficacia de la transferencia de la calpaína 3 en los músculos esqueléticos de ratones con déficit de calpaína 3:
A/ Las secciones transversales de los músculos TA de ratones C3KO se tiñeron con HPS, 4 o bien con PBS o con vectores (1,2 x 1013 vg/kg) AAV2/9-desmina-CAPN3-miR208aT (pdes.C3-T), AAV2/9-pC3-CAPN3-miR208aT (pC3.C3-T), AAV2/9-pmiR206-CAPN3-miR208aT (p206.C3-T). Escala = 100 pm.
B/ Número de fibras centronucleadas (CNF/mm2) medido en secciones teñidas con HPS en músculos TA (a la izquierda) o PSO (a la derecha) de ratones C3KO inyectados con la ayuda de PBS o de los vectores (1,2 x 1013 vg/kg) AAV2/9-desmina-CAPN3-miR208aT (pdes.C3-T), AAV2/9-pC3-CAPN3-miR208aT (pC3.C3-T), AAV2/9-pmiR206-CAPN3-miR208aT (p206.C3-T). Una diferencia con un valor P < 0,05 se indica con un asterisco. TA: músculo tibial anterior; PSO: músculo Psoas.
I) MATERIAL Y MÉTODOS
1) Generación de vectores AAV recombinantes:
El vector rAAV-Des-Mtm1 se construyó coronando el marco de lectura abierto del gen murino Mtm1 (SEQ ID NO: 14) cadena abajo del promotor humano de la desmina (SEQ ID NO: 11) en un vector AAV de serotipo 2. Las secuencias diana (1, 2 o 4 secuencias, miRHT1, miRTH2 y miRHT4, respectivamente) del ARNmi-208a de 22 pb (SEQ ID NO: 10), cada una separada por espaciadores de ADN, se añadieron en la región 3'UTR del ADNc de Mtm1. Un vector vacío (rAAV-Des-MCS) también se generó como control. Las partículas virales recombinantes de serotipo 8 (AAV8) se obtuvieron usando un protocolo de tri-transfección de las células 293 HEK como se ha descrito anteriormente (15). Las titulaciones de vector se expresan entre menos deje no más virales por ml (vg/ml).
De manera similar, el vector rAAV-desm-CAPN3 (o AAV-desmina-CAPN3 o AAV-pDes-CAPN3) se construyó usando el ADNc de la calpaína 3 humana (SEQ ID NO: 8) bajo el control del promotor humano de la desmina (SEQ ID NO: 11). Los vectores rAAV-pC3-CAPN3 y rAAV-pmiR206-CAPN3 se obtuvieron sustituyendo este promotor por la región promotora de la calpaína 3 humana (SEQ ID NO: 12) o la del ARNmi206 (SEQ ID NO: 13), respectivamente. Los vectores AAV-desm-CAPN3-miR208aT, AAV-pC3-CAPN3-miR208aT y AAV-pmiR206-CAPN3-miR208aT se obtuvieron añadiendo 2 secuencias diana para el ARNmi208a (SEQ ID NO: 9) en tándem (miR208aT), en la posición 3' del gen de la calpaína 3. Se produjeron partículas virales recombinantes de serotipo 1 (AAV1), 8 (AAV8) y/o 9 (AAV9).
2) Experimentos in vivo:
Los ratones se trataron de acuerdo con las legislaciones Francesa y Europea con respecto a la experimentación animal. En este estudio, se usaron ratones de tipo silvestre WT C57B1/6 (Laboratoires Charles River) y una línea de ratón inactivada de manera constitutiva para la miotubularina (desactivación genética) KO-Mtm1, también denominada BS53d4-129pas. Para la calpaína 3, se usó el modelo murino C3KO, descrito por Laure et al., (Febs J., 2010, 277: 4322-4337).
Los vectores recombinantes, a las dosis indicadas, se inyectaron en la arena de la cola de los ratones tal como se ha indicado (edades de 3 semanas a 2 meses). Como control se administró un volumen equivalente de tampón salino (PBS). La situación clínica y el peso de los animales se siguieron cada semana para los animales WT y tres veces a la semana para los ratones mutantes. Los ratones se sacrificaron en los momentos indicados.
3) Transferencia de Western:
Los músculos congelados en isopentano se cortaron en secciones transversales de 30 |jm y se sometieron a lisis en hielo en un tampón que contenía NaCl 150 mM, Tris HCl 10 mM (pH 7,4), EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, fluoruro de sodio 100 mM, pirofosfato de sodio4 mM, ortovanadato de sodio 2 mM, Triton X100 al 1 %, e IGEPAL al 0,5 % suplementado con un cóctel completo de inhibidores de proteasas (Roche). Los extractos musculares se incubaron 1 h y se centrifugaron a 4 °C a 12.000 x g durante 30 min. Las concentraciones de proteínas en el sobrenadante se determinaron con la ayuda del kit Bio-Rad "kit de ensayo de proteína". Las proteínas se sometieron a una migración en SDS-PAGE y, después de transferencias sobre una membrana de nitrocelulosa, se incubaron con anticuerpos policlonales dirigidos contra la miotubularina (p2348 [15]) y GAPDH (N.° MAB374, Millipore). Las bandas proteicas Se visualizaron mediante fluorescencia de infrarrojos usando el sistema "Odyssey Imaging System" (LICOR Biotechnology Inc.) y se cuantificaron con la ayuda del programa "Odyssey Infrared Imaging System Software" (Application software, versión 1.2, 2003).
Para la detección de la calpaína 3, se usó un protocolo similar: Los músculos se homogeneizaron mediante FastPrep usando el siguiente tampón de lisis [Tris 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EGTA 2 mM, un 0,1 % de Triton X-100, E64 2 uM (Sigma)] e inhibidores de proteasas (cóctel completo de inhibidor de proteasa mini; Roche Applied Sciences; 25 j l por mg de tejido). Les muestras de ensayo se trataron con 250 U/100 j l de Benzonasa (Calbiochem) durante 30 min a 4 °C para digerir el ADN. Los elementos de lisado muscular se mezclaron con el tampón de carga [NuPage LDS (Invitrogen), TNT 3M (Sigma)], seres naturalizaron durante 10 minutos a 70 °C y se centrifugaron brevemente. Los sobrenadantes se separaron mediante gel de poliacrilamida NuPAGE Bis-Tris en gradiente de un 4-12 % (Invitrogen). Después de la transferencia, las membranas se hibridaron con anticuerpos contra la calpaína 3 (anticuerpo monoclonal de ratón, Novocastra NCL-CALP-12A2, dilución a 1/200), a 4 °C durante la noche o a temperatura ambiente durante 2-3 horas. Por último, las membranas se incubaron con IRDye ® para su revelación en el escáner de infrarrojos Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, Nebraska, USA).
4) PCR:
4-1- Miotubularina:
El aislamiento del ADN a partir de músculos se realizó usando el kit "Gentra Puregene Tissu Kit" (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de ADN se determinó usando un espectrofotómetro Nanodrop ND-8000 (Nanodrop Technologies, Francia), y se usaron 80 ng de ADN para cada muestra de ensayo como matriz para la PCR en tiempo real. La PCR en tiempo real Taqman se realizó sobre cada muestra de ensayo para a la vez una parte del esqueleto común para el vector rAAV2/X para determinar las copias del genoma viral, y del gen murino de la titina, para estandarizar el número de gen o masculinos presentes en cada muestra de ensayo. Los cebadores usados para la amplificación de los vectores rAAV fueron: 5'- CTCCATCACTAGGGGTTCCTTG -3' (directo; SEQ ID NO: 15), 5'-GTAGATAAGTAGCATGGC -3' (inverso; SEQ ID NO: 16). Las sondas MGB se marcaron de manera doble (FAM-NFQ): 5'- TAGTTAATGATTAACCC -3' (sonda; SEQ ID NO: 17). Los cebadores y una sonda usados para la titina fueron: 5'-AAAACGAGCAGTGACGTGAGC-3' (directo; SeQ ID NO: 18), 5'-TTCAGTCATGCTGCTAGCGC-3' (inverso; SEQ ID NO: 19), y 5'-TGCACGGAAGCGTCTCGTCTCAGTC-3' (sonda; SEQ ID NO: 20) (Applied Biosystem). La amplificación es de la titina se realizaron usando 80 ng de ADN diluido en una mezcla "Absolute QPCR ROX Mix" (Thermo Fischer scientific), 0,1 jM de sondas Taqman y 0,2 jM de cebadores (directo e inverso), en un volumen final de 25 jl. Las condiciones de los ciclos consistieron en: una etapa de activación de la ADN Polimerasa Thermo-Start a 95 °C durante 15 min, seguido por 40 ciclos de 2 etapas, 15 s de desnaturalización a 95 °C y 60 s de hibridación y de extensión a 60 °C. Las aplicaciones de los rAAV se realizaron usando 0,1 jM de sondas Taqman, 0,3 jM de cebador inverso y 0,5 jM de cebador directo en un volumen final de 25 jl. Las condiciones de los ciclos consistieron en: una etapa de activación de la ADN Polimerasa Thermo-Start a 95 °C durante 15 min, seguido por 40 ciclos de 2 etapas, 15 s de desnaturalización a 95 °C y 60 s de hibridación y de extensión a 54 °C. La PCR se realizó sobre un termociclador 7900 HT (Applied Biosystem). Una gama de dilución estándar de un plásmido que contenía las secuencias de un esqueleto de rAAV y de la titina se usó sobre cada placa de PCR en tiempo real como control de número de copias. Todas las muestras de ensayo y los controles se duplicaron. Los datos se expresan el número de copias del genoma viral por genoma diploide.
4-2- Calpaína 3:
Los músculos se extrajeron con la ayuda del método Trizol (Invitrogen). En el transcurso de la extracción, una fracción de la muestra de ensayos y conservó para extracción de ADN en vista de la cuantificación por PCR cuantitativa. El ARN total se extrajo del extractor residual tratado con el kit “ ADN-free ” (Ambion) para eliminar el ADN residual.
Para la cuantificación de la expresión de los microARN endógenos, 20 ng de ARN total se sometieron a una transcripción inversa usando el kit "microARN TaqMan transcription inverse" (Applied Biosystems) y se analizaron con el ensayo Taqman microARN ID511 para miR-208a (Applied Biosystems). La normalización de las masas de ensayo se realizó con la expresión de snoRNA202 con el ensayo ID1232 (Applied Biosystems).
Para la amplificación de los ARNm de la calpaína 3 endógena o transgénica, un |jg de ARN se transcribió mediante transcripción inversa usando hexámeros aleatorios y oligodT y el kit Verso ADNc (Abgene) o el kit “ RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis" (Fermentas). La PCR en tiempo real se realizó con el método TaqMan ® usando el sistema ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) y la solución “ Absolute QPCR Rox Mix ” (ABgene) con la ayuda de los siguientes pares de cebadores (.f et .r) y la sonda Taqman (.p): para la cuantificación de la calpaína transgénica: CAPN3sfr.f (SEQ ID NO: 21) 5'_CGCCTCCAAGGCCCGT_3 '; CAPN3sfr.r (SEQ ID NO: 22) 5'_GGCGGAAGCGCTGGCT_3'; MGBTUCAPN3.p (SEQ ID NO: 23) 5'_CTACATCAACATGAGAGAGGT_3; para la cuantificación de la calpaína humana: CAPN3.f (SeQ ID NO: 24) 5'_CGCCTCCAAGGCCAGG_3 ', CAPN3.r (SeQ ID NO: 25) 5'_GGCGGAAGCGCTGGGA_3 y CAPN3.p (SEQ ID NO: 26) 5'_T ACAT CAACAT GCGGGAGGT_3. Una dilución en serie de un ARN de control se usó en cada experimento y se trató con las muestras de ensayos experimentales para rodear la variabilidad de la eficacia de la preparación de ADNc y de la PCR con el fin de estar en condiciones de comparar los diferentes experimentos. Este ARN ase preparó mediante una reacción de transcripción in vitro a partir de un plásmido portador de una calpaína 3 ADNc mutada y amplificable con todos los pares de cebadores.
El análisis de la expresión de la connexina 40 y HOP se realizó usando los siguientes ensayos TaqMan ® Gene Expression (Applied Biosystens): para Cnx40; Gja-5 [Mus musculus]: Mm00433619_s1 y hop: HOP homeobox [Mus musculus], Mm00558630_m1. Los resultados de qRT-PCR se expresan en unidades arbitrarias con respecto a la expresión del gen murino ubicuo ácido fosfoproteína ribosómica (P0 GI: 15029771; MH181PO.F (SEQ iD NO: 27): 5'_CTCCAAGCAGATGCAGCAGA_3 '/ M267PO.R (SEQ ID NO: 28): 5'_ACCATGATGCGCAAGGCTAT_3' / M225PO.p (SEQ ID NO: 29): 5 “ _CCGT GGTGCT GAT GGGCAAGAA_3').
5) Histología:
Las criosecciones transversales (8 jm de grosor) de los músculos cardiaco, hepático o esqueléticos se tiñeron con la ayuda de hematoxilina y eosina (HE), rojo Sirio o Hematoxilina Floxina Azafrán (HFS) usando protocolos convencionales.
Las secciones se montaron con el medio Eukitt (LABONORD). Las imágenes digitales se capturaron con la ayuda de una cámara CCD (Sony). Los análisis morfométricos de los músculos esqueléticos para definir los números de fibras centronucleadas (CNF/mm2) se realizaron con la ayuda del software Histolab (Microvision, Evry).
6) Medición de la actividad de ALT:
Se tomaron muestras de sangresin coagulante. Después de centrifugación (8000g, 10 min, 4 °C), los sueros se analizaron con la ayuda del dispositivo VITROS DT60 (Ortho Clinical Diagnostics, Reino Unido) con la ayuda de los casetes “ Vitros ALT DT slides ” para la determinación de la tasa de alanina aminotransferasa (ALT).
II) RESULTADOS
A - MIOTUBULARINA
1) Toxicidad cardiaca de la construcción AAV-pDES-Mtm1:
A partir del documento de Buj-Bello et al., [15] se conocía el efecto beneficioso de una inyección intramuscular única del gen de la miotubularina (Mtm1) colocado bajo el control del promotor de CMV en un vector AAV2/1.
Un enfoque de terapia genética por vía sistémica en ratones KO (“ Desactivación Genética ”) Mtm1 se intentó y mostró que la administración de un vector AAV8 (rAAV-Des-Mtm1) de expresa la miotubularina bajo el control del promotor humano de la desmina (Fig. 1A) en un ratón mutante tenía éxito para un periodo de vida prolongado de al menos 6 meses, una mejora notable de la patología en los músculos estriados en todo el cuerpo incluyendo el diafragma, y una actividad motora normalizada (los resultados no se muestran).
Sin embargo, después de una administración sistémica del vector AAV8-DES-Mtm1 en ratones KO Mtm1, se observó que el nivel de proteína miotubularina era muy elevado en el corazón en comparación con los músculos esqueléticos (los resultados no se muestran). Además, se observó la presencia de infiltrados inflamatorios y de fibrosis en el corazón de los ratones XLMTM tratados con la ayuda de AAV en diferentes momentos después de la inyección viral (Figura 2).
2) Desarrollos de sistemas de expresión sin toxicidad cardiaca
En vista de la dificultad para predecir la biodistribución y la expresión del transgén a partir de un vector AAV8 después de administración sistémica, en particular en el ser humano, se desarrollaron nuevos vectores que portaban secuencias reguladoras que aumentan la especificidad muscular, para evitar los efectos secundarios potenciales a nivel cardiaco.
Se desarrollaron tres construcciones virales (rAAV-Des-Mtm1-miRHT1; rAAV-Des-Mtm1-miRHT2 y rAAV-Des-Mm1-miRHT4), tal como se muestran en la Figura 1B, que comprenden respectivamente 1, 2 o 4 secuencias diana para el ARNmi-208a. Esta secuencia presenta la secuencia SEQ ID NO: 10 y está constituida por 22 pares de bases. De manera notable, esta secuencia está conservada en el ser humano, el perro y el ratón.
3) Producción muscular y cardiaca de MTM1 después de inyección en un ratón WT
Con el objeto de seleccionar el vector de expresión más adecuado para MTM1, una dosis única de 3x1013 genomas virales (vg)/kg de estos vectores se administró en la vena de la cola del ratón de tipo silvestre (WT para “ tipo silvestre ”) con edades de 3 semanas. Un vector vacío (AAV-Des-MCS) y PBS (“ Solución Salina Tamponada con Fosfato ”) se usaron como controles internos.
La distribución vectorial y el nivel proteico de miotubularina en el corazón y en diferentes músculos esqueléticos (Tibial anterior = TA; cuádriceps = QUA; tríceps = TRI) se evaluaron 1 mes después de la inyección. Los resultados mediante transferencia de Western demuestran que todos estos vectores son capaces de disminuir el nivel de miotubularina producida a partir de los vectores de manera específica en el corazón. Además, una sola secuencia diana del ARNmi208a es suficiente para reducir la expresión en este tejido (Figura 3 y Tabla 1).
Tabla 1: Cuantificación semicuantitativa de la proteína MTM1 al nivel de los músculos esqueléticos y al nivel del
Figure imgf000015_0001
4) Validación de la construcción vectorial después de inyección en un ratón mutado Mtm1
Sobre la base de los resultados precedentes, la construcción rAAV-Des-Mtm1-miRHT1 se seleccionó para la continuación de los experimentos. Los ratones de tipo silvestre (WT para “ tipo silvestre ”) y con mutación en el gen Mtm1 (KO para “ Knock Out ”) recibieron 3x1013 vg/kg de AAV-Des-Mtm1, rAAV-Des-Mtm1-miRHT1 y rAAV-Des-MCS, respectivamente, o PBS a la edad de 3 semanas, y se siguieron a nivel clínico durante 1 mes.
Todos los ratones mutantes que recibieron AAV8-Des-Mtm1-miRHT1 sobrevivieron hasta el final del estudio, con una curva de crecimiento similar a la de los ratones KO tratados con la ayuda de AAV8-Des-Mtm1, lo que indica que la inclusión de la secuencia miRHT1 no influyen la eficacia terapéutica del transgén (Fig. 4).
La histología del corazón de los ratones WT y KO se analizó 1 mes después del tratamiento, mediante tinción con hematoxilina-eosina y con rojo Sirio. Se conservaron regiones de fibrosis en el corazón de 7 ratones KO de 9 tratados con AAV8-Des-Mtm1, pero no en los ratones KO tratados con AAV8-Des-Mtm1-miRHT1 (n = 10). La administración del vector AAV8-Des-Mtm1 no comprendió fibrosis en los animales WT 1 mes después de la inyección (n = 8).
En conclusión, estos resultados indican que la inclusión de una sola secuencia diana de ARNmi208a es suficiente para reducir la toxicidad cardiaca de una construcción AAV8-Des-Mtm1.
Se realizaron experimentos similares con respecto a la calpaína 3 (CAPN3):
B - CALPAÍNA 3 (sin tener en cuenta la invención)
A partir del documento Bartoli et al., (Molecular Therapy, 2006, Vol. 13, N.° 2, 250-259) se conocía el efecto beneficioso y la no toxicidad de construcciones de tipo a Av portadoras del gen de la calpaína 3 colocado bajo el control de promotores denominados específicos de músculo, después de administración intramuscular o local. Sin embargo, los experimentos realizados en el contexto de la invención desvelaron la toxicidad de las construcciones de este tipo después de administración sistémica:
1) Toxicidad cardiaca de las construcciones AAV-desm-CAPN3:
La transformación de los ratones WT se siguió, después de la inyección intravenosa de diferentes construcciones, y se presenta en la tabla 2 que sigue a continuación:
^
Figure imgf000016_0001
Para todos los AAV sometidos a ensayo, se observa una destrucción del tejido cardíaco en caso de administración sistémica, excluyendo el uso de objeto terapéutico de estos sistemas de expresión genética.
2) Reducción de la toxicidad cardiaca de las construcciones AAV-desm-CAPN3 o reemplazo del promotor:
Dos vectores se construyeron intercambiando el promotor de la desmina por el de CAPN3 (AAV2/9-pC3-CAPN3) o miR-206 (AAV2/9-pmiR206-CAPN3). Después de la preparación viral de los vectores, las consecuencias in vivo de las modificaciones introducidas por inyección intravenosa (6 x 1012 vg/kg) se analizaron en ratones C57BL/6 (WT) con edades de 2 meses.
35 días después de la inyección, no se observó ninguna fibrosis cardiaca en los ratones tratados con los vectores AAV2/9-pC3-CAPN3 y AAv2/9-pmiR206-CAPN3, a diferencia de los ratones inyectados con AAV2/9-desm-CAPN3 (Fig. 5A), a pesar de un nivel de transducción similar (Fig. 5B). El nivel de la ARNm del transgén CAPN3 en el corazón de ratones tratados con AAV2/9-desm-CAPN3 era aproximadamente 15 veces más elevado que el nivel endógeno (Fig. 5C), mientras que permanece más bajo para los ratones tratados con AAV2/9-pC3-CAPN3 y AAV2/9-pmiR206-CAPN3 (un 13 % y un 30 %, respectivamente, Fig. 5C), lo que correlaciona el efecto perjudicial de estos dos últimos vectores.
Además, se verificó que estos dos promotores no presentaban toxicidad hepática midiendo durante 5 semanas el nivel de actividad de alanina aminotransferasa (ALT) en ratones WT que habían recibido una inyección injection de 1013 vg/kg. No se observó ningún aumento de actividad enzimática en los animales inyectados con respecto a los inyectados con PBS (Fig. 5D).
En conclusión, los promotores CAPN3 y miR-206 reducen la toxicidad cardiaca del transgén CAPN3, sin producir toxicidad hepática.
3) Reducción de la toxicidad cardiaca de las construcciones AAV-desm-CAPN3 por adición de dos secuencias diana de miR208a:
Dos secuencias diana de ARNmi208a (SEQ ID NO: 10) se clonaron en tándem en un casete miR208aT. A continuación, éste se introdujo en la región 3'UTR de la construcción AAV2/9-desm-CAPN3, para proporcionar la construcción AAV2/9-desm-CAPN3-miR208aT.
Después de inyección de una dosis de 6 x 1012 vg/kg, no se observó ninguna fibrosis cardiaca en los ratones tratados, a diferencia de los ratones inyectados con AAV2/9-desm-CAPN3 (Fig. 6A), a pesar de un nivel de transducción similar y un nivel de ARNm 5 veces más elevado con respecto al nivel endógeno de la calpaína 3 en el corazón (Fig. 6B). Al nivel proteico, la calpaína 3 no se expresa normalmente al nivel del miocardio y no se detecta (Fig. 6C). En los ratones WT inyectados con AAV2/9-desm-CAPN3, la proteína completa no se detecta, pero los fragmentos que resultan de su escisión (60, 58 y 55 kDa) si se detectan (Fig. 6C). Por el contrario, no se observa ni la proteína completa, ni fragmentos de escisión en el corazón de ratón WT inyectados con AAV2/9-desm-CAPN3-miR208aT (Fig. 6C), lo que indica una regulación a nivel de traducción (Fig. 6D).
En conclusión, estos resultados muestran que miR208aT es capaz de reducir la toxicidad cardiaca del transgén CAPN3.
4) Combinación de las dos estrategias:
Se construyeron nuevos vectores asociando los promotores CAPN3 y miR-206 y 2 copias de la secuencia diana de miR-208a: AAV2/9-pC3-CAPN3-miR208aT y AAV2/9-pmiR206-CAPN3-miR208aT. Los ratones C3KO (desactivación genética para la calpaína 3) recibieron una inyección de 1,2 x 1013 vg/kg de estos vectores.
Como se observó anteriormente en ratones silvestres, ninguno de los 3 vectores (AAV2/9-desm-CAPN3-miR208aT, AAV2/9-pC3-CAPN3-miR208aT y AAV2/9-pmiR206-CAPN3-miR208aT) resultó ser tóxico para el corazón, 3 meses después de la inyección (los resultados no se muestran).
Por el contrario, un examen histológico y morfológico de los músculos esqueléticos de ratones C3KO con una edad de 4 semanas y a los que se les inyectó con ayuda de estos vectores desveló un efecto positivo de la expresión de la calpaína 3 en los signos patológicos del modelo murino. Los músculos del tibial anterior (TA) inyectados con la ayuda de estos vectores mostraron características histológicas mejoradas con respecto a los inyectados con PBS (Fig. 7A). Un análisis morfométrico de secciones de músculos de TA coloreados con HPS desveló una disminución significativa de las fibras centronucleadas (CNF) en los músculos inyectados con la ayuda del vector (Fig. 9B a la izquierda). Con los músculos PSO (músculo ilio-psoas) se obtuvieron resultados similares e incluso si la disminución observada con AAV2/9-pC3-CAPN3-miR208aT y AAV2/9-pmiR206-CAPN3-miR208aT no era estadísticamente significativa.
En conclusión, estos resultados indican que la expresión de la calpaína 3 en los músculos esqueléticos transducidos con la ayuda de estos vectores recombinantes puede corregir los signos patológicos de un ratón con déficit de calpaína 3, sin presentar toxicidad cardiaca.
BIBLIOGRAFÍA
1. Jungbluth H, Wallgren-Pettersson C, Laporte J (2008) Centronuclear (myotubular) myopathy. Orphanet J Rare Dis 3: 26.
2. Wallgren-Pettersson C, Clarke A, Samson F, Fardeau M, Dubowitz V, et al., (1995) The myotubular myopathies: differential diagnosis of the X linked recessive, autosomal dominant, and autosomal recessive forms and present state of DNA studies. J Med Genet 32: 673-679.
3. Herman G, Finegold M, Zhao W, de Gouyon B, Metzenberg A (1999) Medical complications in longterm survivors with X-linked myotubular myopathy. J Pediatr 134: 206-214.
4. Bevilacqua J, Bitoun M, Biancalana V, Oldfors A, Stoltenburg G, et al., (2009) Necklace" fibers, a new histological marker of late-onset MTM1-related centronuclear myopathy. Acta Neuropathol 117: 283-291.
5. Fardeau M (1992) Congenital myopathies. En: Detchant MFLWo, editor. Skeletal muscle pathology. Edinburgh: Churchill Livingstone. pp. 1488-1531.
6. Laporte J, Hu LJ, Kretz C, Mandel JL, Kioschis P, et al., (1996) A gene mutated in X-linked myotubular myopathy defines a new putative tyrosine phosphatase family conserved in yeast. Nat Genet 13: 175-182.
7. Dowling JJ, Vreede AP, Low SE, Gibbs EM, Kuwada JY, et al., (2009) Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet 5:e1000372.
8. Buj-Bello A, Laugel V, Messaddeq N, Zahreddine H, Laporte J, et al., (2002) The lipid phosphatase myotubularin is essential for skeletal muscle maintenance but not for myogenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 15060-15065.
9. Pierson CR, Dulin-Smith AN, Durban AN, Marshall ML, Marshall JT, et al., (2012) Modeling the human MTM1 p.R69C mutation in murine Mtm1 results in exon 4 skipping and a less severe myotubular myopathy phenotype. Hum Mol Genet 21: 811-825.
10. Beggs AH, Bohm J, Snead E, Kozlowski M, Maurer M, et al., (2010) MTM1 mutation associated with X-linked myotubular myopathy in Labrador Retrievers. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 14697-14702.
11. Al-Qusairi L, Weiss N, Toussaint A, Berbey C, Messaddeq N, et al., (2009) T-tubule disorganization and defective excitation-contraction coupling in muscle fibers lacking myotubularin lipid phosphatase. Proc Natl Acad Sci USA 106: 18763-18768.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Sistema de expresión para administración sistémica que comprende una secuencia que codifica la miotubularina, bajo el control de:
- una secuencia promotora que permite la expresión a un nivel terapéuticamente aceptable de miotubularina en los músculos esqueléticos y que presenta una actividad promotora a un nivel tóxicamente aceptable incluso nulo en el corazón; o
- una secuencia promotora que permite la expresión a un nivel terapéuticamente aceptable de miotubularina en los músculos esqueléticos, y una secuencia diana de un ARNmi expresado en el corazón.
2. Sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado por que la miotubularina presenta la secuencia SEQ ID NO: 1, 2 o 3.
3. Sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 caracterizado por que comprende al menos una secuencia diana del miR208a, de forma ventajosa de secuencia SEQ ID NO: 10.
4. Sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 3 caracterizado por que comprende el promotor de la desmina, de forma ventajosa de secuencia SEQ ID NO: 11.
5. Sistema de expresión de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado por que comprende la secuencia promotora del gen de la calpaína 3, de forma ventajosa de secuencia SEQ ID NO: 12, o la secuencia promotora de miR206, de forma ventajosa de secuencia SEQ ID NO: 13.
6. Sistema de expresión de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes caracterizado por que comprende un vector que presenta un tropismo superior para los músculos esqueléticos que para el corazón.
7. Sistema de expresión de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes caracterizado por que comprende un vector viral, de forma ventajosa un vector viral adeno-asociado (AAV).
8. Sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 7 caracterizado por que comprende un vector AAV de serotipo 8 o 9.
9. Composición farmacéutica que comprende un sistema de expresión de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Sistema de expresión de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso como medicamento.
11. Sistema de expresión de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en terapia genética.
12. Sistema de expresión de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento de una enfermedad neuromuscular, de forma ventajosa una miopatía, de forma incluso más ventajosa miopatía miotubular (XLMTM).
13. Sistema de expresión para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 caracterizado por que el sistema de expresión se administra por vía sistémica, de forma ventajosa por inyección intravenosa.
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015164786A1 (en) * 2014-04-25 2015-10-29 University Of Massachusetts Recombinant aav vectors useful for reducing immunity against transgene products
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
CN107847612A (zh) 2015-04-23 2018-03-27 华盛顿州立大学 递送Smad7基因作为治疗剂
US11230720B2 (en) 2015-10-14 2022-01-25 Audentes Therapeutics, Inc. Nucleic acid molecules containing spacers and methods of use thereof
US11617783B2 (en) 2015-11-16 2023-04-04 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Repairing a mutant human titin gene using CRISPR technology
PL3442600T3 (pl) * 2016-04-15 2024-07-08 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Dostarczanie za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem wektora b- sarkoglikanu i mikroRNA-29 oraz leczenie dystrofii mięśniowej
WO2018022747A1 (en) * 2016-07-26 2018-02-01 Senti Biosciences, Inc. Genetic erasers
US11499154B2 (en) * 2017-04-10 2022-11-15 Genethon Antisense targeting dynamin 2 and use for the treatment of centronuclear myopathies and neuropathies
JP7088521B2 (ja) * 2017-08-30 2022-06-21 国立大学法人 岡山大学 骨格筋特異的ｔｒｐｖ２ノックアウト非ヒト動物
AU2019216257B2 (en) 2018-01-31 2025-11-20 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Gene therapy for limb-girdle muscular dystrophy type 2C
JP7769355B2 (ja) * 2018-04-18 2025-11-13 ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク ミトコンドリアｄｎａ枯渇症候群を含む不均衡ヌクレオチドプールに起因する疾患の遺伝子治療
CN108611355B (zh) * 2018-05-04 2021-08-31 北京锦篮基因科技有限公司 X染色体连锁肌小管肌病的基因药物
US12391928B2 (en) * 2018-06-29 2025-08-19 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus products and methods for treating limb girdle muscular dystrophy 2A
PE20211581A1 (es) * 2018-12-21 2021-08-17 Univ Pennsylvania Composiciones para la reduccion de la expresion transgenica especifica de drg
CN113766935A (zh) 2019-02-26 2021-12-07 全国儿童医院研究所 β-肌聚糖的腺相关病毒载体递送和肌营养不良症的治疗
SI4017871T1 (sl) 2019-08-21 2024-06-28 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Dostava alfa-sarkoglikana z adeno povezanim virusnim vektorjem in zdravljenje mišične distrofije
JP7651562B2 (ja) * 2019-09-19 2025-03-26 ジェネトン Ｆｋｒｐの心毒性を軽減する遺伝子治療発現系
US20220389457A1 (en) * 2019-10-23 2022-12-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for drg-specific reduction of transgene expression
EP4061952A4 (en) * 2019-11-20 2024-01-03 Vita Therapeutics, Inc. METHOD FOR PRODUCING HYPOIMMUNOGENIC MUSCLE PRONECTOR CELLS
US20230173102A1 (en) * 2020-04-28 2023-06-08 Genethon Use of a Synthetic AAV Capsid for Gene Therapy of Muscle and Central Nervous System Disorders
EP4162059A1 (en) * 2020-05-12 2023-04-12 The Trustees of The University of Pennsylvania Compositions for drg-specific reduction of transgene expression
WO2021255245A2 (en) * 2020-06-19 2021-12-23 Genethon Gene therapy expression system allowing an adequate expression in the muscles and in the heart of sgcg
CN116194587A (zh) * 2020-07-10 2023-05-30 吉尼松公司 一种新的肌肉特异性启动子
GB202010894D0 (en) * 2020-07-15 2020-08-26 Univ Oxford Innovation Ltd Gene therapy
EP4192518A4 (en) * 2020-08-05 2024-12-25 Hangzhou Exegenesis Bio Ltd. NUCLEIC ACID CONSTRUCTS AND THEIR USES FOR THE TREATMENT OF SPINAL MUSCULAR ATROPHY
EP4108263A3 (en) * 2021-06-02 2023-03-22 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus products and methods for treating limb girdle muscular dystrophy 2a
EP4219726A1 (en) 2021-10-15 2023-08-02 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Self-complementary adeno-associated virus vector and its use in treatment of muscular dystrophy
WO2024197073A2 (en) * 2023-03-20 2024-09-26 The Regents Of The University Of California Aav-mediated gene therapy

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0717110A1 (en) * 1994-11-22 1996-06-19 Association Francaise Contre Les Myopathies LGMD gene
TW200613554A (en) * 2004-06-17 2006-05-01 Wyeth Corp Plasmid having three complete transcriptional units and immunogenic compositions for inducing an immune response to HIV
CA2578205A1 (en) * 2004-08-25 2006-03-30 The Regents Of The University Of Michigan Partially acetylated dendrimers and related methods of use
AU2010260145B2 (en) * 2009-06-15 2015-08-20 Valerion Therapeutics, Llc Methods and compositions for treatment of Myotubular Myopathy using chimeric polypeptides comprising myotubularin 1 (MTM1) polypeptides
CN102980920A (zh) * 2012-11-14 2013-03-20 华东师范大学 同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片及其检测方法和应用

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