BR112019019857A2 - cassetes de expressão mecp2 - Google Patents

Abstract

a presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico compreendendo um cassete de expressão mecp2, o cassete de expressão compreendendo, em ligação operável de 5' a 3': uma região de controle transcricional 5' compreendendo um promotor capaz de conduzir a transcrição em células neurais; um quadro de leitura aberto (open reading frame) que codifica uma proteína mecp2; sinais de controle de tradução; uma região não traduzida 3' (3'utr) compreendendo um ou mais de: (i) um sítio de ligação para mir-22; (ii) um sítio de ligação para mir-19; (iii) um sítio de ligação para mir-132; (iv) um sítio de ligação para mir124; e (v) um elemento rico em au; e sinais de terminação transcricional; em que o cassete de expressão mecp2 não tem mais do que cerca de 5 kb de comprimento. a invenção fornece ainda vetores virais, especialmente vetores derivados do vírus adeno-associado (aav), para uso na administração terapêutica de tais cassetes de expressão. as moléculas de ácido nucleico e os vetores virais divulgados aqui fornecem novas ferramentas para expressar mecp2 e são de particular valor no tratamento de distúrbios associados à atividade reduzida de mecp2, incluindo a síndrome de rett.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: CASSETES DE EXPRESSÃO MECP2 Campo da invenção [001] A invenção se refere a um cassete de expressão compreendendo um gene que codifica a proteína MeCP2 e a vetores virais, especialmente vetores derivados do vírus adeno-associado (AAV), para uso na entrega terapêutica de tais cassetes de expressão. Antecedentes da invenção [002] A síndrome de Rett (RTT; OMIM 312750) é uma desordem neurológica caracterizada por uma constelação de diagnóstico clínico e características associadas e com início evidente ocorrendo vários meses após o parto ⁴. A RTT típica é causada quase exclusivamente por mutações de novo na linhagem germinativa no gene ligado ao X, MECP2 ²; revisado em ³' ⁴. Vários modelos de camundongos de RTT foram gerados que abrigam deleções ^5-7 de Mecp2 ou mutações nocauteadas ^8-11. Muitos desses modelos recapitulam as principais características que caracterizam a RTT em humanos, embora existam diferenças que refletem a variabilidade fenotípica observada nos pacientes ^12-14. Apesar da gravidade dos fenótipos do tipo RTT, a reativação genética de Mecp2 silenciada em camundongos nocaute condicionais resultou em uma reversão robusta e duradoura dos fenótipos 15-17

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2/88 [003] Essa reversibilidade inerente do fenótipo, adicionada à falta de alvos óbvios para a farmacoterapia, faz da terapia genética uma estratégia terapêutica candidata óbvia na RTT. No entanto, existem desafios significativos para uma abordagem de transferência de genes, incluindo o requisito de transduzir um número suficiente de neurônios no cérebro ¹⁶ e a prevenção de superexpressão deletéria ¹⁸.

[004] Tentativas anteriores de transferência do gene MECP2 usando vetores AAV9 foram confundidas pela eficiência e toxicidade limitadas da transdução cerebral ^{19, 20}, enquanto a eficácia em outros estudos usando o AAV auto-complementar (scAAV) ²¹ pode ter sido comprometida pelo uso de um construto que excede a capacidade de empacotamento do vetor. Sumário da invenção [005] Apesar dos progressos realizados nos últimos anos no estabelecimento da adequação da síndrome de Rett ao tratamento por transferência de genes, os vetores existentes apresentam preocupações de eficácia e segurança. Níveis baixos de transdução ou expressão gênica podem não resgatar com sucesso o fenótipo afetado, enquanto a superexpressão resulta em toxicidade. Consequentemente, permanece a necessidade de vetores para a entrega de MeCP2 que tenham perfis de eficácia e/ou segurança aprimorados em comparação com as opções atualmente disponíveis.

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3/88 [006] Os vetores baseados no virus adeno-associado (AAV) são candidatos promissores à entrega de genes, mas têm capacidade limitada, sendo capazes de transportar um genoma de cerca de 4,7 kb a cerca de 5 kb de DNA de fita simples. Um genoma do vetor AAV possui uma sequência de repetição palindrômica de 145 nucleotideos em cada extremidade (também conhecida como repetição terminal invertida, ou ITR) , reduzindo a capacidade da carga útil do transgene para cerca de 4,4 kb a 4,7 kb.

[007] O gene MECP2 humano é grande, tendo uma região 3' não traduzida muito longa de 8,5 kb, além das sequências promotora e de codificação. Portanto, é impossível incluir o gene inteiro, com todas as suas sequências reguladoras endógenas a montante e a jusante, em um vetor AAV recombinante (rAAV).

[008] Os chamados AAVs auto-complementares (scAAVs) podem fornecer uma expressão de transgene mais eficiente em comparação aos vetores rAAV convencionais. No entanto, um genoma do vetor scAAV contém duas cópias da mesma carga útil de transgene em orientações opostas e, portanto, na prática, possui apenas metade da capacidade de codificação de um vetor rAAV, exacerbando ainda mais a dificuldade.

[009] A presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico compreendendo um cassete de expressão MeCP2, o

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4/88 cassete de expressão compreendendo, em ligação operável de 5’ a 3’ :

- uma região de controle transcricional 5' compreendendo um promotor capaz de conduzir a transcrição em células neurais;

- um quadro de leitura aberto (open reading frame) que codifica uma proteína MeCP2;

- sinais de controle de translação;

- uma região não traduzida 3' (3'UTR) compreendendo um ou mais dentre:

(i) um sítio de ligação para mir-22;

(ii) um sítio de ligação para mir-19;

(iii) um sítio de ligação para miR-132;

(iv) um sítio de ligação para miR124; e (v) um elemento rico em AU; e

- sinais de terminação transcricional;

em que o cassete de expressão MeCP2 não tem mais do que cerca de 5 kb de comprimento.

[010] O ácido nucleico pode ser linear ou circular e de fita simples ou dupla. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser um plasmídeo ou outro vetor de expressão, incluindo um vetor viral. Embora grande parte da discussão a seguir se concentre nos vetores de AAV, será entendido que o cassete de expressão também pode ser empregado no contexto de outros vetores virais, incluindo vetores adenovirais e vetores retrovirais (por exemplo, lentivirais).

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5/88 [Oil] Em algumas modalidades, por exemplo quando o cassete de expressão é para incorporação em um vetor rAAV, o cassete de expressão não pode ter mais do que cerca de 4,9 kb, 4,8 kb, 4,7 kb, 4,6 kb, 4,6 kb, 4,5 kb ou 4,4 kb de comprimento. De preferência, não tem mais do que 4,4 kb de comprimento.

[012] A molécula de ácido nucleico pode ainda compreender sequências ITR. Assim, a molécula de ácido nucleico pode compreender uma ITR 5' e uma ITR 3', em que as ITRs flanqueiam o cassete de expressão.

[013] A molécula de ácido nucleico pode ser um genoma de rAAV. Assim, a invenção fornece ainda um genoma de rAAV compreendendo uma ITR 5', um cassete de expressão MeCP2 da invenção e uma ITR 3'.

[014] Em outras modalidades, por exemplo, quando o cassete de expressão é para incorporação em um vetor scAAV, o cassete de expressão não pode ter mais que 2,4 kb, não mais que 2,3 kb ou não mais que 2,2 kb em comprimento. De preferência, não tem mais que 2,2 kb em comprimento.

[015] Um genoma do vetor scAAV compreende repetições invertidas da sequência de carga útil localizada entre as ITRs. Assim, é possível que a molécula do genoma do vetor adote uma estrutura em forma de gancho na qual as duas sequências complementares de carga útil hibridam entre si por via intramolecular, ou em que duas cópias do genoma

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6/88 completo hibridem entre si através das sequências de carga útil. (As sequências de ITR não necessariamente hibridizam entre si, porque as ITRs em cada extremidade podem não ter sequências precisamente complementares e também porque é provável que cada ITR forme sua própria estrutura secundária interna.) [016] Assim, a invenção fornece ainda uma molécula de ácido nucleico compreendendo, de 5' a 3', um cassete de expressão MeCP2 da invenção e o complemento reverso do referido cassete de expressão.

[017] A molécula de ácido nucleico pode ainda compreender sequências ITR. Assim, a molécula de ácido nucleico pode compreender uma ITR 5', um cassete de expressão MeCP2 da invenção, o complemento reverso do referido cassete de expressão e uma ITR 3'. A molécula de ácido nucleico pode ser um genoma do vetor scAAV.

[018] As sequências de ITR podem ser de qualquer tipo AAV adequado. Por exemplo, elas podem ser de AAV2.

[019] Um vetor AAV pode ter ITRs genômicas a partir de um primeiro sorotipo (A) e proteínas de um segundo sorotipo (B) . Tal vetor pode ser chamado de tipo AAV A/B . No entanto, uma vez que as proteínas virais determinam amplamente as propriedades sorológicas da partícula de virion, esse vetor ainda pode ser referido como sendo do sorotipo B.

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7/88 [020] A região reguladora da transcrição 5' pode compreender um, dois ou todos os três promotores MeCP2 de núcleo, o elemento silenciador de MeCP2 e um elemento regulador de CNS.

[021] O 3'UTR normalmente compreende um sitio de ligação para um ou mais de miR-22, miR-19, miR-132 e miR-124. Por exemplo, pode conter sítios de ligação para pelo menos 2, pelo menos 3 ou todos os 4 de miR-22, miR-19, miR-132 e miR124 .

[022] Por exemplo, o 3'UTR pode conter sítios de ligação para:

miR-22 e miR-19;

miR-22 e mir-132;

miR-22 e miR124;

miR-19 e miR-132;

miR-19 e miR-124;

miR-132 e miR-124;

miR-22, miR-19 e miR-132;

miR-22, miR-19 e miR-124;

miR-22, miR-132 e miR-124;

miR-19, miR-132 e miR-124;

ou miR-22, miR-19, miR-132 e miR-124.

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8/88 [023] Adicionalmente ou alternativamente, o 3'UTR pode compreender um elemento rico em AU. Assim, pode conter um elemento rico em AU sozinho ou em combinação com sítios de ligação para um ou mais dentre um de miR-22, miR-19, miR-132 e miR-124. Por exemplo, o 3'UTR pode conter sítios de ligação para pelo menos 2, pelo menos 3 ou todos os 4 de miR-22, miR-19, miR-132 e miR-124 em combinação com um elemento rico em AU.

[024] Por exemplo, o 3'UTR pode conter um elemento rico em AU em combinação com sítios de ligação para:

miR-22 e miR-19;

miR-22 e mir-132;

miR-22 e miR124;

miR-19 e miR-132;

miR-19 e miR-124;

miR-132 e miR-124;

miR-22, miR-19 e miR-132;

miR-22, miR-19 e miR-124;

miR-22, miR-132 e miR-124;

miR-19, miR-132 e miR-124;

ou miR-22, miR-19, miR-132 e miR-124.

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9/88 [025] O elemento rico em AU e os sítios de ligação ao miRNA regulam a estabilidade e/ou a expressão do mRNA a partir do mRNA. Esses elementos podem estar presentes em qualquer ordem. Contudo, pode ser desejável que esses elementos que estão presentes ocorram na ordem sítio de miR22, sítio de miR-19, sítio de miR-132, elemento rico em AU e sítio de miR-124, de 5' a 3' do sentido vertente.

[026] A invenção fornece ainda uma partícula de virion de AAV compreendendo uma molécula de ácido nucleico ou genoma de AAV como descrito. O genoma de AAV pode ser um genoma de rAAV ou um genoma de scAAV.

[027] A partícula de virion pode ser considerada como um veículo de entrega de genes para entregar o ácido nucleico que codifica a proteína MeCP2 para uma célula alvo, e capaz de induzir a expressão da proteína MeCP2 em uma célula alvo.

[028] O virion do AAV pode ser de qualquer sorotipo adequado. Os sorotipos AAV9 e AAV PHP.B podem ser particularmente preferidos devido à sua capacidade de transdução de células neurais.

[029] A invenção fornece ainda uma célula compreendendo um ácido nucleico como aqui descrito. A célula pode, por exemplo, ser uma célula de empacotamento, capaz de produzir uma partícula de virion como descrito.

[030] A célula será capaz de expressar proteínas AAV (por exemplo, proteínas rep e cap) e de apoiar a montagem e

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10/88 liberação de partículas de virion infecciosas de AAV, como descrito. Pode também possuir funções de vírus auxiliar, por exemplo, de adenovirus, adenovirus com El excluído ou vírus do herpes.

[031] A invenção fornece ainda um ácido nucleico ou partícula de virion de AAV como aqui descrito para utilização no aumento da expressão da proteína MeCP2 em uma célula alvo.

[032] A invenção fornece ainda um ácido nucleico ou partícula de virion de AAV como aqui descrito para utilização no tratamento da síndrome de Rett.

[033] A invenção fornece ainda uma composição farmacêutica compreendendo um ácido nucleico ou um virion de AAV da invenção, opcionalmente em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.

[034] A invenção fornece ainda um método de tratamento da síndrome de Rett em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração de um ácido nucleico ou partícula de virion de AAV como aqui descrito para o indivíduo. A administração pode ser por qualquer via periférica ou central adequada, mas a administração intravenosa e intratecal pode ser particularmente adequada.

[035] A invenção fornece ainda o uso de um ácido nucleico ou partícula de virion de AAV na preparação de um medicamento para o tratamento da síndrome de Rett.

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11/88 [036] Assim, o indivíduo a quem o ácido nucleico ou o virion deve ser administrado já pode ser afetado pela síndrome de Rett ou pode estar em risco de desenvolver a síndrome de Rett. O indivíduo pode ter sido identificado como afetado ou em risco de desenvolver a síndrome de Rett, por exemplo por meio de testes genéticos, por exemplo, para uma ou mais mutações (especialmente mutações na perda de função) no gene MECP2.

[037] Assim, a invenção fornece um método que compreende a etapa de testar um indivíduo quanto à presença de uma ou mais mutações no gene MECP2 indicativo da presença de ou de predisposição para a síndrome de Rett, e selecionar o indivíduo para tratamento com um ácido nucleico ou virion de AAV como aqui descrito se uma ou mais dessas mutações for identificada.

[038] Quando uma molécula de ácido nucleico é referida nesta especificação, ela pode ser RNA ou DNA, e de fita simples ou dupla, a menos que o contexto exija de outra forma.

[039] Uma molécula do genoma do AAV é necessariamente uma molécula de DNA de cadeia simples. Embora um genoma do scAAV tenha a capacidade de adotar uma estrutura secundária em forma de gancho, um único genoma do scAAV será geralmente considerado aqui como uma molécula de cadeia simples, uma vez que ainda consiste apenas em uma única cadeia contínua

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12/88 de DNA. Um complexo de dois genomas de scAAV hibridizados entre si pode ser considerado uma molécula de fita dupla.

[040] É feita referência nesta especificação a ambas as sequências de DNA e RNA. Será evidente para o leitor que sequências contendo T se referem a moléculas de DNA, tais como sequências do genoma de AAV ou construtos de expressão, enquanto sequências contendo U se referem a moléculas de RNA como transcritos de mRNA derivados por transcrição a partir de cassetes de expressão de DNA, por exemplo, nos genomas de AAV.

Descrição dos Desenhos

Figura 1. A entrega sistêmica do vetor de I^a geração a camundongos Mecp2~^/y revelou eficácia terapêutica e uma janela terapêutica estreita.

[041] (a) Gráfico de sobrevivência de Kaplan-Meier para camundongos Mecp²~^/y injetados com doses diferentes [1 x 10¹¹ (n = 10) , 1 x 10¹² (n = 8) e 1 x 10¹³ (n = 5) vg/camundongo] do vetor de I^a geração em comparação aos animais tratados com veículo (WT; n = 9, Mecp²~^/y; n = 16) . O período médio de sobrevivência em camundongos Mecp²~^/y tratados com 1 x 10¹² vg/camundongo foi significativamente maior do que nos controles tratados com veículo (27,14 versus 11,64 semanas, p = 0,001, teste de Mantel-Cox). (b-c) gráficos mostrando peso corporal médio e pontuação de gravidade agregada, respectivamente, para camundongos Mecp²~^/y tratados com 1 x

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ΙΟ¹¹, 1 χ ΙΟ¹² vg/camundongo ou veículo. As setas indicam a idade na injeção; dados apresentados como média ± SEM. (d) Eficiência de transdução dependente da dose (núcleos positivos para Myc como uma proporção de núcleos positivos para DAPI) em diferentes regiões do cérebro. Dados apresentados como média ± SEM (n = 3 camundongos por grupo) . CAI indica a região do hipocampo CAI.

Figura 2. A injeção intravenosa do vetor de I^a geração resultou em alterações patológicas no fígado.

[042] (a-d) Secções representativas do fígado coradas com H&E de camundongos do tipo selvagem injetados com (a) veículo ou (b-d) doses diferentes do vetor, (e) Seção do fígado de um camundongo injetado intravenosamente com um vetor de controle GFP, contrastado com DAPI. (f) Seção representativa do fígado corada com H&E de um camundongo tratado com vetor GFP. As setas indicam infiltração de células mononucleares, vacuolização e/ou perda de hepatócitos. Linha branca tracejada indica inchaço celular. Barra de escala indica 20 pm; CV indica veia central.

Figura 3. Sobrevivência e peso corporal aprimorados de camundongos Mecp2^T158M/Y após a entrega sistêmica do vetor de 1^a geração.

[043] (a) Gráfico de sobrevivência para camundongos tratados com Mecp2^T158M/y. A seta indica a idade na injeção, (b-c) gráficos de peso corporal e pontuação de gravidade

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14/88 agregada, respectivamente, para camundongos Mecp2^T158M/y tratados com 1 x 10¹² vg/camundongo do vetor de primeira geração e grupos de controle (Mecp2^T158M/y e WT) tratados com veiculo. Dados apresentados como média ± SEM. (d) Eficiência de transdução no cérebro de camundongos tratados (núcleos Myc-positivos como uma proporção de núcleos positivos em DAPI; n = 3 camundongos).

Figura 4. Localização nuclear de MeCP2 em camundongos Mecp2^T158M/Y não tratados e tratados.

[044] Imagens confocais representativas da região CAI do hipocampo, (a) MeCP2 endógeno exibe localização enriquecida em heterocromatina em núcleos do tipo selvagem, enquanto MeCP2 marcado com GFP exibe localização reduzida de heterocromatina (isto é, marcação mais difusa) nos núcleos de camundongos Mecp2^T158M/y. (b) Imagens demonstrando localização enriquecida em heterocromatina de MeCP2 derivada exogenamente em núcleos de células transduzidas em camundongos Mecp2^T158M/y tratados com o vetor de I^a geração. As setas brancas indicam células transduzidas (positivas para Myc). A barra de escala indica 20 pm.

Figura 5. Eficácia terapêutica do vetor de 2^a geração após administração sistêmica em camundongos Mecp2~^/y.

[045] (a) Características de projeto do nosso vetor de 2^a geração resumidas (consulte o texto e a Figura 7 para obter detalhes ) . (b) Gráfico de sobrevivência para

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15/88 camundongos Mecp2~^/y tratados por via intravenosa com 1 x 10¹² vg/camundongo do vetor de 2^a geração (sobrevida média = 29,9 semanas) ou uma dose idêntica do vetor de I^a geração (sobrevida média = 27,1 semanas) ou veículo (sobrevida média = 11,6 semanas) . A seta indica a idade na injeção, (c-d) Gráficos mostrando os escores médios de peso corporal e gravidade agregada, respectivamente, de camundongos Mecp2~^/y tratados como em (b).

Figura 6. Expressão reduzida de MeCP2 exógena no fígado de camundongos tratados com vetor de 2^a geração [046] (a) Imagens achatadas confocais em grandes quantidades de fígados de camundongos um mês após serem injetadas por via intravenosa às 5 semanas de idade com o vetor de 2^a geração ou vetor de I^a geração a 1 x 10¹² vg/camundongo; as configurações confocais eram as mesmas em cada caso. Os tecidos foram marcados imunologicamente com coloração nuclear anti-Myc e DAPI. As setas indicam células transduzidas (positivas para Myc) e as pontas das setas indicam células não transduzidas. (b) Eficiências de transdução no fígado para ambos os vetores, (c) Quantificação dos níveis celulares de MeCP2 exógeno medidos como imunofluorescência anti-Myc em células transduzidas no fígado (n = 3 camundongos, 1400 células transduzidas). Dados apresentados como média ± SEM. (d) Distribuição de frequência dos níveis celulares de MeCP2 exógena no fígado, medidos

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16/88 como em (c). (e) Secções hepáticas coradas com H&E mostrando vacuolização de hepatócitos (setas) e locais de infiltração de células mononucleares (círculos tracejados). CV indica veia central. A barra de escala em branco indica 20 pm. (f) Quantificação da densidade de focos inflamatórios no fígado de camundongos tratados (n = 3 por grupo). Dados apresentados como média ± SEM. ★ p < 0,05, ★★ p < 0,01, ★★★ p < 0,001.

Figura 7. A entrega direta no cérebro do vetor de 2^a geração aos camundongos Mecp2~^/y neonatais revelou eficácia terapêutica.

[047] (a) Projeto experimental. (b) Gráfico de sobrevivência mostrando sobrevida estendida de camundongos tratados de forma neonatal com Mecp2~^/y (sobrevida média = 38,6 semanas; p < 0,0001, teste de Mantel-Cox) em comparação com animais tratados com veículo (sobrevida média = 12,4 semanas). (c-d) Gráficos mostrando os escores médios de peso corporal e gravidade agregada, respectivamente, para os camundongos mostrados em (b). (e) Imagens confocais representativas do córtex de camundongos do tipo selvagem injetados. Setas brancas indicam células transduzidas; as pontas das setas indicam células não transduzidas; barra de escala indica 20 pm. (f) Gráfico mostrando a eficiência da transdução em diferentes regiões do cérebro (n = 3 camundongos). (g) Distribuição de frequência dos níveis de MeCP2 em células transduzidas e não transduzidas ('nativas')

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17/88 no cortex do camundongo (n = 3 camundongos; 954 células transduzidas) dados apresentados como média ± SEM.

Figura 8. Expressão de MeCP2 exógena no cérebro após injeção intravenosa do vetor de I^a geração.

[048] Micrografias confocais representativas mostrando a expressão do transgene na região CAI do hipocampo em camundongos Mecp2~^/y tratados por via intravenosa com 1 x 10¹¹, 1 x 10¹² e 1 x 10¹³ vg/camundongo do vetor de I^a geração (como revelado pela marcação imunomarcadora anti-Myc). As setas denotam células transduzidas e o painel inferior mostra a co-localização com DAPI. Barra de escala = 20 pm

Figura 9. A entrega sistêmica do vetor de I^a geração a camundongos do tipo selvagem é tolerada em doses baixas, mas tóxica em doses altas.

[049] (a) Gráfico de sobrevivência mostrando a toxicidade precoce observada após injeção IV de uma dose de 1 x 10¹³ vg/camundongo do vetor de I^a geração (verde) em comparação com outras doses e controle do veículo. A seta indica a idade na injeção, (b-c) Gráficos mostrando o peso corporal médio e a pontuação de gravidade agregada, respectivamente, para essas coortes após a injeção. Dados apresentados como média ± SEM. (d) Imagens confocais achatadas em grande quantidade da região CAI do hipocampo de camundongos do tipo selvagem injetados com 1 x 10¹³ vg/camundongo do vetor de I^a geração. Os tecidos foram

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18/88 marcados imunologicamente com anticorpos anti-Myc e antiMeCP2. As setas brancas indicam células transduzidas. A barra de escala indica 20 pm. (e) Quantificação dos níveis celulares de MeCP2 nativo e MeCP2 exógeno em células transduzidas e não transduzidas na região CAI do hipocampo de camundongos do tipo selvagem (n = 2 camundongos; 131 células transduzidas e 172 células não transduzidas). Dados apresentados como média ± SEM e normalizados para MeCP2 nativo, (f) Distribuição de frequência do nível normalizado de MeCP2 em células transduzidas e não transduzidas. # indica letalidade em altas doses.

Figura 10. A injeção intravenosa do vetor de I^a geração resultou em alto nível de expressão exógena de MeCP2 no fígado.

[050] (a) Imagens confocais representativas do fígado colhidas de camundongos WT injetados intravenosamente com vetor de I^a geração na dose de 1 x 10¹³ vg/camundongo. As secções foram marcadas imunologicamente com coloração nuclear anti-Myc (verde), anti-MeCP2 (vermelho) e DAPI (azul). As setas brancas indicam células transduzidas, enquanto as setas amarelas indicam células não transduzidas. (b) imagens confocais achatadas em grande quantidade tiradas da região CAI do hipocampo (em cima) e do fígado (camundongos foram injetados intravenosamente com 1 x 10¹³ vg/camundongo) usando as mesmas configurações confocais. As setas indicam

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19/88 núcleos com um alto nível de expressão exógena de MeCP2 (com base na intensidade de fluorescência do anticorpo anti-Myc) e as pontas de seta indicam núcleos com baixos níveis de expressão. Barra de escala em (a) e (b) = 20 pm. (c) medida da intensidade integrada de pixels por núcleo no fígado (55 células transduzidas e CAI (131 células transduzidas)) dos mesmos camundongos (n = 3 camundongos), dados apresentados como média ± SEM.

Figura 11. Comparação de camundongos Mecp2^T158M/y e Mecp2~ ^/y.

[051] (a) Gráfico de sobrevivência para camundongos Mecp2^T158M/y (n = 15) e camundongos Mecp2~^/y (n = 29) . (b-c) Gráficos que mostraram nenhuma diferença significativa no peso corporal médio e na pontuação de gravidade agregada, respectivamente, entre os camundongos Mecp2^T158M/y e Mecp2~^/y. Dados apresentados como média ± SEM.

Figura 12. Novos recursos de projetos de vetor, eficácia e fenótipo hepático.

[052] (a) Um resumo das diferenças de projeto para três dos novos vetores descritos no texto, (b) Eficácia desses três novos vetores após injeção intravenosa de 1 x 10¹² vg/camundongo a camundongos Mecp2~^/y com 4-5 semanas de idade, expressada como aumento da sobrevida média em relação aos controles do veículo (esquerda; comparada pelo teste de Mantel-Cox) e peso corporal médio com 11 semanas de idade (à

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20/88 direita) em relação aos controles do veículo (ANOVA unidirecional com comparações post-hoc de Tukey em pares). ★ p < 0,05, ★★ p < 0,01, ★★★ p < 0,001. (c) Secções representativas do fígado coradas com H&E de camundongos injetados com vetores JeT, 9.47 ou spA. As setas indicam vacuolização de hepatócitos; barra de escala indica 20 pm.

Figura 13. Projeto do construto do vetor de 2^a geração.

[053] Elementos reguladores putativos (RE) no promotor mMeP426 estendido e 3'-UTR distai endógeno são indicados. A extensão do promotor mMeP229 (usado no vetor de I^a geração) é mostrada em relação ao mMeP426. O RDHlpA 3'-UTR consiste em vários sítios de ligação a microRNA exógenos (miR) incorporados como um 'painel de ligação' adjacente a uma porção do sinal de poliadenilação de MECP2 endógeno distai e seus elementos reguladores que os acompanham. As referências com um asterisco indicam estudos humanos in vitro, não roedores.

Figura 14. Sequência anotada do cassete de expressão de 2 ^a geração.

Figura 15. Diagrama esquemático do plasmideo que codifica o vetor MeCP2 de segunda geração.

Figura 16. Sequência completa (SEQ ID NO: 32) do plasmideo mostrado na Figura 15.

[054] O cassete de expressão ilustrado na Figura 14 é sublinhada uma vez e as ITRs são sublinhadas duas vezes.

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Figura 17. A entrega cerebral direta do vetor de 2^a geração para camundongos Mecp2~^/y neonatais revelou uma eficácia terapêutica semelhante da proteína MeCP2 e ANIC de comprimento total.

[055] (a) Projeto experimental, (b) Gráfico mostrando os escores agregados médios de gravidade de camundongos Mecp2~^/y tratados neonatais (proteína MeCP2 de comprimento total versus proteína ICNIC (MeCP2 truncada) em comparação com animais tratados com veículo. Os camundongos do tipo selvagem injetados com vetor eram indistinguíveis dos camundongos tratados com veículo.

Descrição detalhada da invenção

Síndrome de Rett [056] A síndrome de Rett (RTT) é um distúrbio neurológico causado quase exclusivamente por mutações da linhagem germinativa de novo no gene ligado ao X, MECPE¹^⁴. É caracterizada por uma constelação de diagnóstico clínico e características associadas, com os sintomas tipicamente se tornando evidentes apenas de 6 a 18 meses após o nascimento. O fenótipo parece ser inerentemente reversível, pois a reativação genética de Mecp2 silenciada em camundongos nocaute condicionais resulta em uma reversão robusta e duradoura dos sintomas. No entanto, existem desafios significativos para uma abordagem de transferência de genes, incluindo o requisito de transduzir um número suficiente de

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22/88 neurônios no cérebro ¹⁶ e a prevenção de superexpressão deletéria ¹⁸.

[057] Os presentes vetores fornecem candidatos viáveis para o tratamento de indivíduos afetados e podem até oferecer a perspectiva de impedir o desenvolvimento de fenótipo detectável, se administrados a um indivíduo portador de uma mutação no gene MECP2 antes que os sintomas se tornem detectáveis. Assim, o tratamento pode ser considerado terapêutico ou profilático. O termo terapia será usado para se referir à inibição ou reversão de sintomas ou fenótipo estabelecidos, enquanto a profilaxia será usada para se referir à inibição ou prevenção do desenvolvimento de sintomas em indivíduos que ainda não apresentam sintomas manifestos. Tais indivíduos serão tipicamente identificados no início da vida como portadores de uma mutação de perda de função no gene MECP2, por exemplo, por testes genéticos apropriados realizados antes de 18 meses após o parto, por exemplo, antes dos 12 meses ou antes dos 6 meses após o parto.

Vetores AAV [058] O vírus adeno-associado (AAV) é um parvovirus deficiente em replicação, cujo genoma de DNA de cadeia simples tem cerca de 4,7 kb de comprimento, incluindo 145 nucleotídeos de repetições terminais invertidas (ITRs). A sequência nucleotídica do genoma do AAV sorotipo 2 (AAV2) é

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23/88 apresentada em Srivastava el al., J Virol, 45: 555-564 (1983), conforme corrigida por Ruffing el al., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994). Sequências de ação Cis direcionando a replicação do DNA viral (rep), encapsidação/empacotamento e integração do cromossomo da célula hospedeira estão contidas nas ITRs. Três promotores de AAV (chamados p5, p!9 e p40 por suas localizações relativas no mapa) dirigem a expressão dos dois quadros de leitura abertos internos do AAV que codificam os genes rep e cap. Os dois promotores rep (p5 e p 19) , acoplados ao splicing diferencial do único intron AAV (nos nucleotídeos 2107 e 2227), resultam na produção de quatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52 e rep 40) a partir do gene rep. As proteínas Rep possuem múltiplas propriedades enzimáticas que são responsáveis pela replicação do genoma viral. O gene cap é expresso a partir do promotor p40 e codifica as três proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3. Locais alternativos de conversão e de tradução sem consenso são responsáveis pela produção das três proteínas capsídicas relacionadas.

[059] Como os sinais que direcionam a replicação do AAV, a encapsidação e a integração do genoma estão contidas nas ITRs do genoma do AAV, alguns ou todos os aproximadamente 4,3 kb internos do genoma (codificação da replicação e proteínas estruturais do capsídeo, rep-cap) podem ser substituídos por DNA estrangeiro como um cassete de

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24/88 expressão, com as proteínas rep e cap fornecidas em trans. A sequência localizada entre as ITRs de um genoma do vetor AAV é aqui referida como carga útil.

[060] A capacidade real de qualquer partícula de AAV específica pode variar dependendo das proteínas virais empregadas. Tipicamente, o genoma do vetor (incluindo ITRs) não é mais do que cerca de 5kb, por exemplo, não mais do que cerca de 4,9 kb, 4,8 kb ou 4,7 kb.

[061] As ITR possuem, cada uma, 145 bases de comprimento. Assim, a carga útil normalmente não tem mais do que 4,7 kb, 4,6 kb, 4,5 kb ou 4,4 kb de comprimento. De preferência, não é superior a 4,4 kb de comprimento. Um AAV recombinante (rAAV) pode, portanto, conter até cerca de 4,7 kb, 4,6 kb, 4,5 kb ou 4,4 kb de sequência de carga útil única.

[062] No entanto, após a infecção de uma célula alvo, a expressão e replicação de proteínas a partir do vetor requer a síntese de uma fita de DNA complementar para formar um genoma de fita dupla. Esta síntese da segunda cadeia representa uma etapa limitadora da taxa na expressão do transgene. O requisito para a síntese da segunda fita pode ser evitado usando os chamados vetores AAV autocomplementares (scAAV) nos quais a carga útil contém duas cópias da mesma carga transgênica em orientações opostas uma à outra, ou seja, uma primeira sequência de carga seguida pela reversão do complemento dessa sequência. Esses genomas

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25/88 scAAV são capazes de adotar uma estrutura em forma de gancho, na qual as sequências complementares de carga útil hibridam intramolecularmente entre si, ou um complexo de cadeia dupla de duas moléculas de genoma hibridadas entre si. A expressão do transgene desses scAAVs é muito mais eficiente do que dos rAAVs convencionais, mas a capacidade de carga útil efetiva do genoma do vetor é reduzida pela metade devido à necessidade do genoma de transportar duas cópias complementares da sequência da carga útil.

[063] Um genoma do vetor scAAV pode conter uma ou mais mutações em uma das sequências de ITR para inibir a resolução em uma repetição terminal e, consequentemente, aumentar o rendimento em uma preparação de scAAV. Assim, um dos ITRs em um scAAV pode ser excluído para o sitio de resolução do terminal ou pode conter uma mutação inativadora no sitio de resolução do terminal. Ver, por exemplo, Wang et al. , Gene Therapy (2003) 10, 2105-2111 e McCarty et al., Gene Therapy (2003) 10, 2112-2118. Portanto, será evidente que as duas sequências de ITR em cada extremidade de um genoma de AAV não precisam ser idênticas.

[064] Os scAAVs são revistos em McCarty, Molecular Therapy, 16 (10), 2008, 1648-1656.

[065] Nesta especificação, o termo vetor rAAV é geralmente usado para se referir a vetores com apenas uma cópia de qualquer sequência de carga útil (ou seja, um vetor

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26/88 rAAV não é um vetor scAAV) e o termo vetor AAV é usado para abranger ambos vetores rAAV e scAAV.

[066] As sequências de AAV nos genomas do vetor de AAV (por exemplo, ITRs) podem ser de qualquer sorotipo de AAV para o qual um vírus recombinante pode ser derivado, incluindo, mas não limitado a, sorotipos de AAV, AAV-1, AAV2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11 e AAV PHP.B. As sequências de nucleotídeos dos genomas dos sorotipos de AAV são conhecidas na técnica. Por exemplo, o genoma completo do AAV-1 é fornecido no número de acesso ao GenBank NC_002077; o genoma completo do AAV-2 é fornecido no número de acesso ao GenBank NC 001401 e Srivastava et al. , J. Virol., 45: 555-564 {1983); o genoma completo do AAV-3 é fornecido no número de acesso ao GenBank NC_1829; o genoma completo do AAV-4 é fornecido no número de acesso do GenBank NC_001829; o genoma do AAV-5 é fornecido no número de acesso do GenBank AF085716; o genoma completo do AAV-6 é fornecido no número de acesso ao GenBank NC_00 1862; pelo menos porções dos genomas de AAV-7 e AAV-8 são fornecidas nos números de acesso do GenBank AX753246 e AX753249, respectivamente; o genoma do AAV-9 é fornecido em Gao et al. , J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); o genoma do AAV-10 é fornecido em Mol. Ther., 13 (1): 67-76 (2006); o genoma do AAV-11 é fornecido em Virology, 330 (2): 375-383 (2004); O AAV PHP.B é descrito por Deverman et al., Nature Biotech. 34

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27/88 (2), 204-209 e sua sequência depositada sob o N° de Acesso ao GenBank KU056473.1.

[067] Pode ser desejável empregar ITRs de AAV-2. Os vetores scAAV descritos nos exemplos abaixo contêm ITRs de AAV-2 tendo as sequências (SEQ ID NO: 1): GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTG GTCGCCCGGCCTCGTGAGCGAGCGAGCGGCGAGCGGCGAGCGGGGGGGGGGGGT E (SEQ ID NO: 2): CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGA CGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC [068] Do mesmo modo, as proteínas presentes nas partículas de virion de AAV da invenção podem ser derivadas a partir de qualquer sorotipo de AAV adequado. Em geral, os vetores são direcionados para células neurais, embora uma capacidade de transduzir células da glia também possa ser desejável. O AAV-9 e o AAV PHP.B podem ser particularmente eficazes na transdução de tais tipos de células e, portanto, as proteínas do virion, especialmente proteínas do capsídeo (cap), do AAV-9 ou AAV PHP.B podem ser particularmente preferidas. As proteínas do capsídeo podem ser pseudotipadas para aumentar a especificidade ou eficiência de transdução do tipo de célula alvo. Esses tipos de AAV também são capazes de atravessar a barreira hematoencefálica, sendo particularmente adequados se for necessária a administração periférica.

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28/88 [069] As partículas de virion compreendendo genomas de vetor da invenção são tipicamente geradas em células de empacotamento capazes de replicar genomas virais, expressando proteínas virais (por exemplo, proteínas rep e cap) e montando partículas de virion. As células de empacotamento também podem exigir funções de vírus auxiliares, por exemplo, adenovirus, adenovirus com El excluído ou vírus do herpes. As técnicas para produzir partículas de vetor de AAV em células de empacotamento são padrão na técnica. A produção de AAV pseudotipado é divulgada em, por exemplo, WO 01/83692. Em várias modalidades, as proteínas do capsídeo do AAV podem ser modificadas para melhorar a entrega do vetor recombinante. As modificações nas proteínas do capsídeo são geralmente conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, US 2005/0053922 e US 2009/0202490.

[070] Um método para gerar uma célula de empacotamento é criar uma linhagem celular que expresse de forma estável todos os componentes necessários para a produção de partículas de AAV. Por exemplo, um plasmídeo (ou vários plasmídeos) que compreende um genoma de AAV sem os genes rep e cap de AAV, os genes rep e cap de AAV separados do genoma de AAV, e um marcador selecionável, como um gene de resistência à neomicina, são integrados ao genoma de uma célula. Os genomas de AAV foram introduzidos em plasmídeos

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29/88 bacterianos por procedimentos tais como o rejeito de GC (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79: 20772081), adição de ligantes sintéticos contendo locais de divagem de endonucleases de restrição (Laughlin et al., 1983, Gene, 23: 65-73) ou por ligação direta na extremidade cega (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259: 46614666) . A linhagem celular de empacotamento é então infectada com um vírus auxiliar, tal como o adenovirus. As vantagens deste método são que as células são selecionáveis e são adequadas para a produção em larga escala de AAV. Outros exemplos de métodos adequados empregam adenovirus ou baculovírus em vez de plasmídeos para introduzir genomas de AAV e/ou genes rep e cap nas células de empacotamento.

[071] Alternativamente, uma célula de empacotamento pode ser gerada simplesmente transformando uma célula adequada com um ou mais plasmídeos que codificam um genoma de AAV, proteínas de AAV e quaisquer funções necessárias de vírus auxiliar. O chamado método de transfecção tripla utiliza três plasmídeos cada um contendo um desses conjuntos de genes. Ver Grieger et al., Nature Protocols 1 (3), 1412-128 (2006) e referências aqui citadas.

[072] Os princípios gerais da produção de AAV são revisados em, por exemplo, Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; e Muzyczka, 1992, Curr. Tópicos em Microbial e Immunol., 158: 97-129) . Várias abordagens são

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descritas em Ratschin	et	al.,	Mol.	Cell.	Biol.	4 :	2072
(1984); Hermonat et al	• /	Proc.	Natl.	Acad.	Sci .	USA,	81:
6466 (1984); Tratschin	et	al.,	Mol.	Cell.	Biol.	5:	3251
(1985); McLaughlin et	al.	, J.	Virol.	, 62:	1963	(1988	) ; e

Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 7: 349 (1988) . Samulski et al. (1989, J. Virol., 63: 3822-3828); Patente U.S. No. 5.173.414; WO 95/13365 e patente correspondente U.S. No. 5.658.776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872) ; WO 97/21825 (PCT/US96/20777) ; WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13: 1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4: 609615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3: 1124-1132; Patente U.S. No. 5.786.211; Patente U.S. No. 5.871.982; e Patente U.S. 6.258.595.

[073] As técnicas para a produção de scAAV são descritas por Grieger et al., Molecular Therapy 24 (2), 287-297, 2016.

[074] A invenção fornece assim células de empacotamento que produzem partículas infecciosas de virion de AAV da invenção. Em uma modalidade, as células de empacotamento podem ser células cancerígenas transformadas de maneira estável, tal como células HeLa, células 293 e células PerC.6 (uma linhagem 293 cognata). Em outra modalidade, as células de empacotamento são células que não são células cancerígenas transformadas, tal como células 293 de passagem baixa

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31/88 (células renais fetais humanas transformadas com El de adenovirus), células MRC-5 (fibroblastos fetais humanos), células WI-38 (fibroblastos fetais humanos), Células Vero (células renais de macaco) e células FRhL-2 (células pulmonares fetais de rhesus).

Proteína MeCP2 [075] Os vetores descritos nesta especificação possuem um cassete de expressão que codifica a proteína de ligação à metil CpG (MeCP2), que é um regulador da transcrição codificado no cromossomo X e altamente expresso em neurônios, especialmente em neurônios no cérebro e no SNC. Os termos MECP2 e Mecp2 são tipicamente usados para se referir aos genes humanos e murinos, respectivamente. Embora os vetores da invenção sejam previstos para uso principalmente em seres humanos, eles podem ser empregados em outras espécies, especialmente em camundongos e outros modelos animais com a sindrome de Rett. Assim, os termos MECP2 e MeCP2 serão usados para se referir a genes e proteínas de qualquer espécie apropriada e não devem ser interpretados como específicos da espécie, a menos que o contexto exija.

[076] Como discutido acima, as mutações de perda de função no gene MECP2 estão implicadas no desenvolvimento da sindrome de Rett, principalmente em fêmeas.

[077] Uma proteína MeCP2 é capaz de induzir um aumento na sobrevida, um aumento no peso corporal e/ou um aumento no

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32/88 escore de gravidade agregada do tipo RTT em camundongos machos jovens MeCP2~^/y. Veja Guy et al., Reversão de sintomas neurológicos em um modelo de camundongo de sindrome de Rett; Science 315 (5815) : 1143-1147 (2007) .

[078] Para fins de avaliação da atividade, a administração pode ser por qualquer via apropriada, por exemplo através de um vetor de AAV como descrito nesta especificação. As melhorias são vistas em comparação com camundongos de controle idênticos, dado um tratamento de controle idêntico sem a proteína MeCP2 funcional.

[079] Sem desejar ser vinculado pela teoria, uma proteína MeCP2 será tipicamente capaz de se ligar ao DNA metilado e de interagir com (por exemplo, se ligar a) componentes do complexo co-repressor NCoR/SMRT. Os componentes do complexo co-repressor incluem NCoR, HDAC3, SIN3A, GPS2, SMRT, TBL1X e TBLR1. Assim, uma proteína MeCP2 pode ser capaz de recrutar componentes do complexo corepressor NCoR/SMRT para o DNA metilado.

[080] Existem duas isoformas da proteína MeCP2 humana que diferem na sua sequência N-terminal.

[081] A isoforma 1 tem a sequência (SEQ ID NO: 3): MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEPVQ P SAHH SAE PAEAGKAEIS E GS GSAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTR KLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSP

SRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKM

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P FQT S PGGKAEGGGAT T S T QWVIKR PGRKRKAEADPQAIPKKRGRKP G S VVAAAAAE A KKKAVKE SSIRSVQE TVL PIKKRKTRE TVSIEVKEVVKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSP GRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTS PPEPQDLSSSVCKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRGEGERKD IVS S SMPRPNREE PVDSRT PVTERVS S [082] A isoforma 2 tem a sequência (SEQ ID NO: 4):

MVAGMLGLREEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEPVQPSAHHSAEPAEA GKAE T S E G S G SAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAG KYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPK SPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGKAEG G GAT T S T QVMVI KRPGRKÍRKÃEL&DPQÃJPKKRG.RKPGSAVAAAAAEAKKKAVKESS IRS VQETVLPIKKRKTRETVSIEVKEVVKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGR SSSASSPPKKEHHHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTSPPEPQDLSSSVC KEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNRE EPVDSRTPVTERVSS [083] Sem desejar ser vinculado pela teoria, acreditase que as regiões funcionais mais significativas da proteína MeCP2 sejam o domínio de ligação a metil-CpG (MBD; sublinhado), o sinal de localização nuclear (NLS; negrito e itálico) e o Domínio de Interação NCoR/SMRT (NID; sublinhado duas vezes). Assim, uma proteína MeCP2 normalmente compreende:

(i) um domínio de ligação metil-CpG (MBD) com a sequência (SEQ ID NO: 5):

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PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGK AFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPND FDFTVTGRGSPS RRE QKP P ou uma variante da mesma com pelo menos 7 0% de identidade, por exemplo, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com ela;

(ii) um Domínio de Interação NCoR/SMRT (NID) com a sequência (SEQ ID NO: 6)

PGSWAAAAAEAKKAVKES SIRSVQE TVL PIKKRKTRE TV ou uma variante da mesma com pelo menos 7 0% de identidade, por exemplo, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com ela; e (iii) um sinal de localização nuclear (NLS).

[084] Normalmente, o MBD é capaz de se ligar ao DNA metilado. Acredita-se possuir um número de sítios de fosforilação que são mostrados em negrito e sublinhados acima. Esses sítios são Ser80, Ser86, Thrl48, Serl49 e Serl64, numerados de acordo com suas posições na sequência da isoforma 2 humana.

[085] O NID normalmente é capaz de interagir ou de se ligar ao complexo co-repressor NCoR/SMRT.

[086] O MBD normalmente está localizado no N-terminal do NID.

[087] O NLS pode estar localizado entre o MBD e o NID.

[088] O NLS pode ser o MeCP2 NLS nativo, tendo a sequência (SEQ ID NO: 7) RKAEADPQAIPKKRGRK. Todavia, são

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35/88 conhecidas muitas sequências NLS diferentes e podem ser utilizadas sequências NLS à parte do NLS MeCP2 nativo, tal como o NLS de antígeno T Grande SV4 0 (SEQ ID NO: 8) (PKKKRKV) .

[089] Assim, a proteína MeCP2 pode compreender ou consistir na sequência (SEQ ID NO: 9) : SEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEPVQPSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSA PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGK AFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRG RPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVI KRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSWAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRK TRE TVSIEVKEWKPLLVS TLGEKSGKGLKTCKS PGRKSKE S S PKGRS S SAS S PPKKEH HHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTSPPEPQDLSSSVCKEEKMPRGGSLE SDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTER VSS;

ou uma variante funcional da mesma possuindo pelo menos 70% de identidade, por exemplo, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com ela; ou um fragmento funcional de qualquer um. As diferenças desta sequência estão preferencialmente fora do MBD e do NID, e um NLS funcional deve ser mantido.

[090] Um fragmento desta sequência, designado ANC, que se acredita ter funcionalmente equivalente, tem a sequência (SEQ ID NO: 10):

PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGK AFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRG

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RPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVI KRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSWAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRK TRETV [091] Assim, a proteína MeCP2 pode compreender ou consistir na sequência ANC ou pode ser uma variante funcional da mesma com pelo menos 70% de identidade, por exemplo, pelo menos 75%, 80% 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com ela. Novamente, as diferenças desta sequência estão preferencialmente fora do MBD e do NID, e um NLS funcional deve ser mantido.

[092] Uma variante adicional, designada ANIC, compreendendo MBD e NID, e tendo uma sequência NLS alternativa (a partir do antígeno T grande SV40), mas com grande parte da sequência de MeCP2 nativa restante excluída, tem a sequência (SEQ ID NO: 11): PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGK AFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPGSSGSSGPKKKRKVPG S WAWAAAPIKKKRR [093] Assim, a proteína MeCP2 pode compreender ou consistir na sequência ANIC ou pode ser uma variante funcional da mesma possuindo pelo menos 70% de identidade, por exemplo, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com ela. Novamente, as diferenças desta sequência estão preferencialmente fora do MBD e do NID, e um NLS funcional deve ser mantido.

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37/88 [094] Onde o MBD ou o NID da proteína MeCP2 contenham uma ou mais diferenças das sequências de referência fornecidas, pode ser desejável que essas diferenças sejam substituições conservativas. Também pode ser desejável que os sítios de fosforilação do MBD sejam mantidos.

[095] A proteína pode ainda compreender uma porção do Nterminal com a sequência:

(SEQ ID NO: 12) MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEK ou

MVAGMLGLREEK (SEQ ID NO: 13) ou pelo menos 70% de identidade para qualquer uma, por exemplo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, para ambas.

[096] Assim, a proteína MeCP2 codificada pelo cassete de expressão pode, por exemplo, compreender ou consistir em uma das sequências: MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEPVQ PSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTR KLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSP SRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKM PFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSWAAAAAEA KKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKTRETVSIEVKEWKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSP GRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTS PPEPQDLSSSVCKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRGEGERKD IVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTERVSS (isoforma 1 humana) (SEQ ID NO: 14)

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38/88

MVAGMLGLREEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEPVQPSAHHSAEPAEA GKAETSEGSGSAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAG KYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPK SPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGKAEG GGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSWAAAAAEAKKKAVKESSIRS VQETVLPIKKRKTRETVSIEVKEWKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGR SSSASSPPKKEHHHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTSPPEPQDLSSSVC

KEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNRE EPVDSRTPVTERVSS (isoforma 2 humana) (SEQ ID NO: 15)

MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTR KLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSP SRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKM PFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSWAAAAAEA KKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKTRETV (isoforma 1 de ANC) (SEQ ID NO : 16)

MVAGMLGLREEKPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAG KYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPK SPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGKAEG GGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSWAAAAAEAKKKAVKESSIRS VQETVLPIKKRKTRETV (isoforma 2 de ANC) (SEQ ID NO: 17)

MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTR KLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSP

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SRREQKPPGSSGSSGPKKKRKVPGSWAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKT

RETV (isoforma 1 de ΔΝΙΟ) (SEQ ID NO: 18)

MVAGMLGLREEKPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAG KYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPGSSG S S GPKKKRKVPGSWAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQE TVL PIKKRKTRE TV (isoforma 2 de ΔΝΙΟ) (SEQ ID NO: 19) ou pode ter pelo menos 70% de identidade, por exemplo, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, para qualquer uma dessas sequências.

[097] Valores de identidade de pelo menos 80% ou de pelo menos 90% para as sequências de referência fornecidas podem ser particularmente preferidos.

[098] Será evidente para o especialista que o cassete de expressão da invenção também pode codificar utilmente proteínas de MeCP2 de outras espécies, especialmente de outras espécies de mamíferos, por exemplo, de um primata não humano ou de um animal doméstico, de laboratório ou de pecuária, tal como um roedor (por exemplo, camundongo, rato, porquinho da índia), lagomorfo (por exemplo, coelho), gato, cachorro, porco, vaca, cavalo, ovelha, cabra, etc.

[099] A proteína MeCP2 pode adicionalmente compreender sequência heteróloga (isto é, não MeCP2), por exemplo, na extremidade C-terminal da molécula, tal como um marcador de epítopo para auxiliar no isolamento ou identificação. Os

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40/88 exemplos incluem uma marcação de poli-histidina (por exemplo, hexa-histidina), marcação FLAG, marcação Myc, proteínas fluorescentes, tais como proteína verde fluorescente (GFP) e proteína verde fluorescente aprimorada (eGFP), etc. Essas porções heterólogas geralmente não passam de 50 aminoácidos de comprimento, por exemplo não mais do que 20 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, a proteína MeCP2 codificada pelo vetor de segunda geração descrita nos exemplos abaixo compreende um marcador de epitopo c-Myc Cterminal tendo a sequência EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 20) . Esta proteína tem a sequência (SEQ ID NO: 21): MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEPVQ PSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTR

KLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSP

SRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAA.TSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKM

PFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSWAAAAAEA

KKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKTRETVSIEVKEWKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSP

GRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTS

PPEPQDLSSSVCKEEKIdPRGGSLESDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRGEGERKD IVS S SMPRPNREE PVDSRT PVTERVS SRGPFEQKLISEEDLVD onde a sequência MeCP2 está sublinhada e a marcação do epitopo c-Myc é sublinhada duas vezes.

[100] Uma versão marcada com c-Myc da proteína ANC descrita acima pode ter a sequência (SEQ ID NO: 22):

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MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTR

KLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSP

SRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKM

PFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSWAAAAAEA

KKKAVKE SSIRSVQE TVL PIKKRKTRE TVGS S G S S GEQKLISEEDLVD onde a sequência de MeCP2 está sublinhada e a marcação do epítopo c-Myc é sublinhada duas vezes.

[101] Uma versão marcada com c-Myc da proteína ANIC descrita acima pode ter a sequência (SEQ ID NO: 23) : MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTR KLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSP SRREQKPPGSSGSSGPKKKRKVPGSVVAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKT RETVGS S GS S GEQKLISEEDLVD onde a sequência de MeCP2 está sublinhada e a marcação do epítopo c-Myc é sublinhada duas vezes.

[102] Será entendido que uma proteína destinada para uso terapêutico geralmente não conterá esses elementos heterólogos, para reduzir a imunogenicidade e o risco de outros efeitos colaterais.

[103] Em algumas modalidades, a proteína MeCP2 codificada pelo cassete de expressão não tem mais que 600 aminoácidos de comprimento, por exemplo, não mais que 550, 540, 530 ou 520 aminoácidos de comprimento. Assim, o quadro de leitura aberto que codifica a proteína MeCP2 não terá mais que 1803 bases de comprimento (incluindo o códon

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42/88 superior), por exemplo, não mais de 1653, 1623, 1593 ou 1563 bases de comprimento.

[104] A porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos entre uma sequência candidata e as sequências de referência apresentadas acima é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácidos na sequência de referência, após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir o alinhamento ideal e não considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade da sequência. Os valores de % de identidade podem ser determinados por WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)). O WU-BLAST-2 usa vários parâmetros de pesquisa, a maioria dos quais é definida com os valores padrão. Os parâmetros ajustáveis são definidos com os seguintes valores: span de sobreposição = 1, fração de sobreposição = 0,125, limiar de palavras (T) = 11. Um valor de identidade de sequência de aminoácidos % é determinado pelo número de resíduos idênticos correspondentes, conforme determinado por WU-BLAST -2, dividido pelo número total de resíduos da sequência de referência (intervalos introduzidos por WU-BLAST-2 na sequência de referência para maximizar a pontuação do alinhamento sendo ignorada), multiplicado por 100.

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43/88 [105] Uma substituição conservadora pode ser definida como uma substituição dentro de uma classe de aminoácidos e/ou uma substituição com pontuação positiva na matriz BLOSUM62.

[106] De acordo com uma classificação, as classes de aminoácidos são ácidas, básicas, polares não carregadas e não polares, em que os aminoácidos ácidos são Asp e Glu; os aminoácidos básicos são Arg, Lys e His; os aminoácidos polares não carregados são Asn, Gin, Ser, Thr e Tyr; e os aminoácidos não polares são Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Pro, Phe, Met, Trp e Cys.

[107] De acordo com outra classificação, as classes de aminoácidos são pequenos hidrofílicos, ácido/amida ácida/ hidrofílicos, básicos, pequenos hidrofóbicos e aromáticos, em que os pequenos aminoácidos hidrofílicos são Ser, Thr, Pro, Ala e Gly; os aminoácidos ácido/amida ácida/ hidrofílicos são Asn, Asp, Glu e Gin; os aminoácidos básicos são His, Arg e Lys; os pequenos aminoácidos hidrofóbicos são Met, lie, Leu e Vai; e aminoácidos aromáticos são Phe, Tyr e Trp.

[108] As substituições com resultado positivo na matriz BLOSUM62 são as seguintes:

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Resíduo Original

C

s

T

P

A

G

N

D

E

Q

H

R

K

M

I

L

V

F

Y

W

Substituição

-

T

S

-

S

-

S

N

D

E

N

Q

E

I

M

M

M

Y

H

F

A

D

E

Q

R

Y

K

Q

L

L

I

I

W

F

Y

N

H

K

K

R

V

V

V

L

W

Região de controle transcricional 5' [109] 0 cassete de expressão MeCP2 compreende uma região de controle de transcrição 5' capaz de direcionar a transcrição em células neurais, por exemplo nos neurônios, especialmente no cérebro e no SNC. Pode ser desejável que a expressão também ocorra nas células da glia, embora geralmente não sejam preferidos altos níveis de expressão nas células da glia.

[110] A região de controle transcricional 5' compreende um promotor e um local de iniciação transcricional. Também pode conter outros elementos de controle, incluindo elementos potenciadores e/ou silenciadores.

[111] Pode ser possível usar um promotor universal, como um promotor viral (por exemplo, o promotor SV40) ou um promotor de serviço doméstico de mamífero. De preferência, porém, o promotor direciona a expressão preferencialmente em células neurais em comparação com outros tipos de células.

[112] O cassete de expressão de segunda geração descrita nos exemplos emprega um trecho contíguo da sequência cromossômica do gene MeCP2 humano, incluindo uma região promotora central, uma região silenciosa a montante da região

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45/88 promotora central (e ligeiramente sobreposta) e um elemento regulador do SNC localizado a jusante da região promotora do núcleo a e a montante do sítio de início da transcrição. Essas sequências são ilustradas na Figura 14.

[113] Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que o promotor do núcleo e o elemento regulador do SNC garantam expressão adequada nas células neurais, enquanto o silenciador pode impedir a superexpressão e, portanto, a toxicidade, nas células neurais e em outros tipos de células, incluindo células da glia e células hepáticas.

[114] Assim, a região de controle transcricional 5' pode compreender um elemento promotor principal tendo a sequência (SEQ ID NO: 24):

AAACCAGCCCCTCTGTGCCCTAGCCGCCTCTTTTTTCCAAGTGACAGTAGAACTCCACC AATCCGCAGCTGAATGGGGTCCGCCTCTTTCCCTGCCTAAACAGACAGGAACTCCTGCC AATTGAGGGCG ou um fragmento funcional da mesma, ou uma variante da mesma com não mais que 20 alterações de nucleotídeos, por exemplo, não mais que 10 ou não mais que 5 alterações de nucleotídeos em comparação com essa sequência, em que a região promotora do núcleo é capaz de iniciar a transcrição nas células neurais, por exemplo, em neurônios no cérebro e/ou no SNC, isoladamente ou em conjunto com um elemento regulador do SNC.

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46/88 [115] A região de controle transcricional 5' pode compreender um elemento silencioso com a sequência (SEQ ID NO: 25): TTAAGCGCCAGAGTCCACAAGGGCCCAGTTAATCCTCAACATTCAAATGCTGCCCACAA AAC ou uma variante da mesma que não tenha mais que 10 ou não mais que 5 alterações de nucleotídeo em comparação com essa sequência.

[116] A região de controle transcricional 5' pode compreender um elemento regulador do CNS com a sequência (SEQ ID NO: 26): CAGCACACAGGCTGGTCGG.

[117] Um elemento de E-box (sequência CAGGTG) se sobrepõe à extremidade 3' da sequência do promotor principal e um sítio SP1 (GGGCGG) está localizado a 3' do elemento regulador do CNS. Esses elementos também podem estar presentes, se desejado.

[118] A região de controle transcricional 5' pode compreender a sequência promotora do núcleo MeCP2 nativo anotada como mMeP426 na Figura 14.

Sítios de ligação ao microRNA [119] O 3'UTR do cassete de expressão MeCP2 pode conter um ou mais sítios de ligação ao microRNA (miRNA) , para facilitar a regulação da expressão do transgene MeCP2.

[120] Os microRNAs são pequenos RNAs não codificantes que têm um impacto substancial na função celular através da

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47/88 repressão da tradução (através da inibição da tradução ou da indução da degradação do mRNA). Os microRNAs derivam de transcritos primários de RNA (pri-miRNA) sintetizados pelo RNA pol II, que podem ter vários milhares de nucleotídeos de comprimento. Um único transcrito de pri-miRNA pode dar origem a mais de um miRNA ativo.

[121] No núcleo, a enzima RNAse do tipo III Drosha processa o transcrito do pri-miRNA em um miRNA precursor (pre-miRNA) que consiste em uma estrutura de loop-haste ou em gancho, normalmente com cerca de 70 a 100 nucleotídeos de comprimento. O pre-miRNA é então transportado para o citoplasma, onde é processado posteriormente pelo RNAse Dicer, removendo a alça e produzindo uma molécula madura de miRNA de fita dupla, possuindo uma fita guia ativa (normalmente com 15 a 25 nucleotídeos de comprimento) hibridizada a uma fita passageira total ou parcialmente complementar.

[122] O miRNA maduro de fita dupla é então incorporado no complexo de silenciamento induzido por RNA, onde a fita guia hibridiza com um sítio de ligação no mRNA alvo.

[123] A fita guia pode não ser completamente complementar ao sítio de ligação alvo. No entanto, uma região da cadeia guia designada como sequência semente é geralmente totalmente complementar à sequência núcleo correspondente do sítio de ligação ao alvo. A sequência

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48/88 semente tem tipicamente de 2 a 8 nucleotideos de comprimento e está localizada na ou próximo da (dentro de 1 ou dois nucleotideos de) extremidade 5' da fita guia.

[124] Sem desejar estar ligado a nenhuma teoria em particular, um sítio de ligação ao miR-22 pode regular a expressão de MeCP2 em células periféricas. Veja ref. 32 [125] Um sítio de ligação ao miR-22 compreende tipicamente pelo menos a sequência central:

GGCAGCT.

[126] Por exemplo, um sítio de ligação ao miR-22 pode compreender a sequência (SEQ ID NO: 27):

ACAAGAATAAAGGCAGCTGTTGTCTCTTC em que a sequência central está sublinhada;

ou podem diferir em uma ou mais posições, por exemplo em até 5 posições, até 10 posições, até 15 posições ou até 20 posições, todas as quais devem estar fora da sequência central.

[127] Um sítio de ligação ao miR-19 pode regular a expressão de MeCP2 nas células da glia. Veja ref. 33.

[128] Um sítio de ligação ao miR-19 normalmente compreende pelo menos a sequência central: TTTGCAC.

[129] Por exemplo, um sítio de ligação ao miR-19 pode compreender a sequência (SEQ ID NO: 28):

AGAAGTAGCTTTGCACTT T T C TAAAC TAGG em que a sequência central está sublinhada;

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49/88 ou podem diferir em uma ou mais posições, por exemplo em até 5 posições, até 10 posições, até 15 posições ou até 20 posições, as quais devem estar fora da sequência central.

[130] Um sítio de ligação ao miR-124 também pode regular a expressão do transgene MeCP2 nas células da glia. Veja refs. 35 e 44.

[131] Um sítio de ligação ao miR-124 compreende tipicamente pelo menos a sequência central:

TGCCTTA.

[132] Um sítio de ligação ao miR-124 pode compreender outras sequências 5' ou 3' da sequência central, se desejado, mas a sequência central normalmente não varia.

[133] Um sítio de ligação ao miR-132 pode regular a expressão de MeCP2 por meio de um loop de feedback com BNDF2 (fator neurotrófico derivado do cérebro 2) . Acredita-se que o MeCP2 aumente os níveis de expressão do BNDF2. O BNDF2, por sua vez, aumenta os níveis de miR132, que é um regulador negativo da expressão de MeCP2. Veja ref. 34) [134] Um sítio de ligação ao miR132 compreende tipicamente pelo menos a sequência central:

GACTGTTA.

[135] Por exemplo, um sítio de ligação ao miR-132 pode compreender a sequência (SEQ ID NO: 29):

AATAT CAC CAGGACTGTTACT CAAT GT GT G em que a sequência central está sublinhada;

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50/88 ou podem diferir em uma ou mais posições, por exemplo em até 5 posições, até 10 posições, até 15 posições ou até 20 posições, as quais devem estar fora da sequência central. Elemento rico em AU [136] O 3'UTR do cassete de expressão pode codificar um elemento rico em AU.

[137] Os elementos ricos em AU (AREs) são reguladores comuns da estabilidade do mRNA, por meio do caminho do exossoma 3'-5', e geralmente estão localizados no 3'UTR.

[138] Um elemento rico em AU pode conter uma ou mais repetições da sequência AUUUA. Pode também conter um ou mais elementos chamados US2B, com a sequência AUAUAU.

[139] O 3'UTR do gene MeCP2 contém um elemento rico em AU com a sequência AUAUAUUUAAAAA (SEQ ID NO: 30) (ref. 38) e contendo uma repetição de AUUUA e um elemento ES2B. Variações nessa sequência podem ser possíveis.

Outros sinais regulatórios [140] O especialista no assunto será capaz de conceber outros elementos do cassete de expressão para conseguir uma expressão apropriada do transgene MeCP2 no tipo de célula alvo desejado.

[141] Por exemplo, os sinais de terminação transcricional e de poliadenilação estarão tipicamente presentes, para direcionar a divagem do transcrito primário e a poliadenilação do mRNA resultante. Estes podem

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51/88 compreender elementos a montante (5' do local de divagem) e elementos a jusante (3' do local de divagem).

[142] Um elemento a montante comum é tipicamente um hexâmero localizado de 10 a 30 nucleotídeos a montante do sítio de divagem, e frequentemente referido simplesmente como um sinal de poliadenilação ou poli (A) . O gene MeCP2 possui dois sinais de poliadenilação, dos quais a sequência do sinal de poliadenilação distal (UAUAAA) pode ser preferida. A sequência AAUAAA também é um sinal de poliadenilação comumente usado.

[143] Um elemento a jusante pode ser um elemento rico em U ou em GU. Estes podem conter sítios de ligação para componentes do mecanismo de poliadenilação, tal como o CstF (fator de estimulação da divagem) . O gene MeCP2 contém uma região rica em GU com a sequência (SEQ ID NO: 31) UGUCCGUUUGUGUCUUUUGUUGU e contendo dois sítios de ligação a CstF, cada um com a sequência UUUGU.

[144] Será entendido que U (uridina) é referido no contexto de sequências de RNA. Sequências de DNA correspondentes, por exemplo, como encontrado em um genoma de vetor AAV, incorporará T em seu lugar.

[145] O cassete de expressão tipicamente também conterá um sinal de iniciação de tradução, por exemplo, uma sequência de Kozak. A sequência de Kozak inclui o códon de iniciação da proteína MeCP2, tipicamente AUG. Um exemplo de uma

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52/88 sequência Kozak adequada, usada nos vetores descritos nos Exemplos abaixo, é AAACCAUGG, onde o códon de iniciação está sublinhado.

[146] A sequência Kozak nativa do gene MECP2 humano tem a sequência AAAAUGG, isto é, carece do dubleto CG presente nos vetores descritos abaixo. 0 dupleto CG foi introduzido para fornecer melhor conformidade com a sequência de consenso geralmente reconhecida de Kozak e, portanto, aumentar a força da sequência de Kozak. No entanto, dado que altos níveis de expressão de MeCP2 podem ser prejudiciais, pelo menos em alguns tecidos, pode ser desejável, em alguns casos, usar a sequência Kozak nativa em vez da sequência modificada.

[147] 0 especialista estará ciente de que uma variação considerável dentro da sequência de Kozak é possível e poderá selecionar outras sequências alternativas, conforme apropriado.

Composições farmacêuticas e vias de administração [148] Os ácidos nucleicos, virions, etc. aqui descritos podem ser formulados em composições farmacêuticas.

[149] A administração pode ser periférica, por exemplo, intravenosa, cutânea ou subcutânea, nasal, intramuscular ou intraperitoneal ou direto para o sistema nervoso central (SNC), por exemplo, por injeção intratecal ou injeção intracraniana .

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53/88 [150] A administração intravenosa e intratecal pode ser preferida .

[151] As composições farmacêuticas podem compreender, além de uma das substâncias acima, um excipiente, veiculo, tampão, estabilizador ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos dos especialistas na técnica. Esses materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir na eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do veiculo ou outro material pode depender da via de administração.

[152] Para injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável, isenta de pirogênio e com pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os especialistas no

assunto	são	bem capazes de preparar soluções	adequadas
usando,	por	exemplo, veículos isotônicos, como	injeção de
cloreto	de	sódio, injeção de Ringer, injeção	de Ringer
lactada.		Conservantes, estabilizantes,	tampões,
antioxidante	s e/ou outros aditivos podem ser	incluídos,

conforme necessário.

[153] As composições para administração direta no SNC são tipicamente composições mínimas sem conservantes e outros excipientes e podem ser especialmente preparadas no momento da administração.

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54/88 [154] A administração é preferencialmente uma quantidade profilaticamente eficaz ou uma quantidade terapeuticamente eficaz (conforme o caso), sendo suficiente

para mostrar	benefícios	ao	indivíduo	A quantidade real
administrada,	a taxa e	o	tempo de	administração podem
depender do	indivíduo e	da	natureza	e gravidade de sua

condição. Prescrição de tratamento, por exemplo, decisões sobre a dosagem etc., é de responsabilidade dos médicos e de outros médicos e normalmente leva em consideração o distúrbio a ser tratado, a condição de cada paciente, o local da entrega, o método de administração e outros fatores conhecidos por praticantes.

[155] Exemplos das técnicas e protocolos mencionados acima podem ser encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 20^a edição, 2000, pub. Lippincott, Williams e Wilkins.

Exemplos

O aumento da dose com A&V/MECP2 revelou uma janela terapêutica estreita após a administração sistêmica.

[156] Para explorar a relação entre a dose do vetor e os benefícios terapêuticos, realizamos um experimento de escalonamento da dose no qual um vetor scAAV2/9 foi usado para fornecer um cDNA MECP2_el humano marcado com Myc sob o controle de uma região curta de 229pb do promotor de núcleo endógeno Mecp2 de murino (MeP229) ^{19, 22}, doravante referido

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55/88 como o 'vetor de I^a geração'. Camundongos machos jovens Mecp2~^/y e do tipo selvagem (WT) foram injetados na idade de 4-5 semanas na veia da cauda com veículo ou com 1 x 10¹¹ (dose baixa) , 1 x 10¹² (dose moderada) ou 1 x 10¹³ (dose alta) de genomas virais (vg) por camundongo (intervalo de doses ~ 1 x 10¹³ - 1 x 10¹⁵ vg/kg) . Como esperado em estudos anteriores desta linha de nocaute ^{6f 7}' ¹⁵, foi observado o início de sinais fenotípicos do tipo RTT em camundongos Mecp2~^/y tratados com controle de veículo a partir das 4-5 semanas de idade e a gravidade aumentou progressivamente até a morte ou censura de todos os camundongos com 2 0 semanas de idade (Figura la-c) . Os camundongos Mecp2~^/y tratados com a dose baixa eram indistinguíveis dos camundongos injetados com veículo em termos de sobrevivência, peso corporal e escore de gravidade (Figura la-c). Por outro lado, os camundongos Mecp²~^/y tratados com a dose moderada (1 x 10¹²) apresentaram sobrevida e peso corporal significativamente aumentados em comparação com os controles do veículo (sobrevida média = 27,3 semanas versus 11,64 semanas, p = 0,001, teste de Mantel-Cox, Figura la; p < 0,05 para o peso corporal médio medido às 11 semanas de idade, a sobrevida média para os camundongos Mecp2~^/y de controle, Figura 1b). No entanto, não houve diferença no escore de gravidade do fenótipo do tipo RTT nesta dose (Figura 1c). Finalmente, a coorte que recebeu

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56/88 a dose mais alta mostrou toxicidade e letalidade agudas 1015 dias após a injeção (Figura la).

[157] Os padrões de transdução em camundongos Mecp2~^/y tratados foram avaliados no SNC por marcação por imunofluorescência de anticorpos anti-Myc (Figura 8), que revelou expressão exógena da proteína MeCP2 distribuída em um padrão pontuado dentro dos núcleos celulares, correspondente ao observado para MeCP2 endógeno em camundongos WT. Amostras da coorte de baixa dose revelaram baixas eficiências de transdução nas regiões do cérebro (0,5 a 1%). A dose moderada resultou em ~ 3-5% da eficiência da transdução, enquanto a eficiência da dose alta foi de 10 a 22% (Figura ld).

[158] Para medir os níveis celulares de MeCP2 exógeno em relação aos níveis nativos, os camundongos WT foram tratados com o vetor como acima. As doses baixas e moderadas foram toleradas e não tiveram efeito observável no peso corporal ou no escore de gravidade fenotípica (Figura 9a-c). No entanto, os camundongos WT tratados com a dose alta exibiram a toxicidade aguda e a letalidade rápida observada nos camundongos nocaute (Figura 9a-c). A quantificação dos níveis celulares de MeCP2 em camundongos, dada a alta dose, revelou que as células piramidais do hipocampo transduzidas expressavam MeCP2 exógena a um nível médio equivalente a 120% do nível endógeno, resultando em níveis celulares totais

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57/88 de MeCP2 um pouco mais que o dobro do normal para essas células (Figura 9d-f).

A administração sistêmica do vetor de I^a geração resultou em toxicidade hepática.

[159] Para investigar ainda mais os efeitos tóxicos encontrados após a injeção sistêmica do vetor de I^a geração em doses elevadas, os níveis de expressão exógena de MeCP2 foram testados em uma variedade de tecidos periféricos. A imuno-histoquímica revelou que a proporção de células Mycpositivas no fígado era alta (Figura 10) . Sabe-se que os níveis endógenos de MeCP2 são muito mais baixos nas células hepáticas do que nos neurônios cerebrais ^{23, 24} e estão tipicamente abaixo do limiar de detecção para imunohistoquímica usando anticorpos disponíveis (Figura 10a). No entanto, os níveis exógenos de MeCP2 em um subconjunto de células hepáticas (usando marcação imunológica anti-Myc) de camundongos WT tratados foram superiores aos níveis de MeCP2 observados nos neurônios (Figura lOb-c) e, portanto, aproximadamente 20 vezes maiores que os níveis encontrados endogenamente nessas células. As células Myc-positivas também foram detectadas no coração, rim e outros tecidos periféricos em camundongos Mecp2~^/y tratados (dados não mostrados).

[160] A investigação histológica das secções hepáticas de camundongos injetados com veículo ou com baixa dose do

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58/88 vetor mostrou estrutura hepática amplamente normal com áreas ocasionais de infiltração mononuclear (Figura 2a-b). Em contraste, camundongos injetados com doses mais altas do vetor mostraram um aumento dependente da dose nas características patológicas, incluindo destruição e vacuolização celular, perda de hepatócitos e infiltração de células mononucleares (Figura 2c-d).

[161] Para abordar se a patologia hepática observada foi devida ao alto número de cópias de partículas virais per se ou foi uma consequência da superexpressão de MeCP2, injetamos em camundongos um vetor dirigindo a expressão de GFP, mas idênticos ao vetor de I^a geração. Apesar da detecção da expressão generalizada de GFP no fígado (Figura 2e), o exame histológico das secções hepáticas não revelou evidência de dano celular ou infiltração de células imunes (Figura 2f) . Além disso, não foram observadas alterações no escore de gravidade agregada da RTT com esse vetor (dados não mostrados).

A administração sistêmica do vetor de I^a geração melhora a sobrevivência nos camundongos nocaute Mecp2[T158M].

[162] Uma questão importante para a transferência de genes na RTT é se a presença do mutante endógeno MeCP2 pode reduzir o efeito terapêutico do MeCP2 exógeno. Camundongos machos expressando MeCP2 nativo marcado com GFP como uma proteína de fusão e abrigando a mutação p.T158M comum

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59/88 causadora de RTT, Mecp2^{T158M/y 9}, exibem um fenótipo muito semelhante ao dos camundongos Mecp2 nulos (Figura 11), mas com sobrevida um pouco melhorada (sobrevida média de 20,3 semanas e 12,4 semanas, respectivamente; p = 0,0016, teste de Mantel-Cox).

[163] A administração intravenosa de uma dose moderada (1 x 10¹² vg/camundongo) do vetor de I^a geração a camundongos Mecp2^T158M/y com 4-5 semanas de idade resultou em aumento significativo da sobrevida (Figura 3a; sobrevida média = 38,3 semanas em camundongos tratados com vetor versus 20,3 semanas em camundongos tratados com veículo; p = 0,0019, teste de Mantel-Cox, n = 8-15 por grupo). Houve um aumento modesto no peso corporal na coorte tratada com vetor (Figura 3b; p < 0,05, ANOVA unidirecional usando dados às 20 semanas de idade). No entanto, não houve diferença no escore de gravidade agregada do tipo RTT entre os grupos (Figura 3c), consistente com uma baixa eficiência de transdução cerebral (~ 2-4%), conforme revelado pela marcação anti-Myc (Figura 3d) .

[164] A mutação p.T158M afeta a capacidade de ligação à cromatina de MeCP2, levando à perda do elemento pontuado da marcação MeCP2 no núcleo (Figura 4a) ⁹. A marcação imunológica dos neurônios do hipocampo dos camundongos Mecp2^T158M/y tratados mostrou padrões WT da expressão do MeCP2, com localização restaurada para pontos brilhantes DAPI,

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60/88 apenas em células transduzidas (positivas para Myc) (Figura 4b). Isto é consistente com a MeCP2 exógena ser capaz de se localizar normalmente na heterocromatina, apesar da presença da proteína MeCP2 endógena mutante dentro do mesmo núcleo.

Desenvolvimento de um vetor de 2^a geração que reduziu a toxicidade hepática após administração sistêmica [165] À luz dos dados descritos acima, era evidente que é necessária uma dose mais alta do vetor de AAV para atingir níveis terapeuticamente relevantes de transdução cerebral após administração sistêmica. No entanto, a toxicidade severa após a administração de altas doses de nosso cassete de I^a geração exigiu um novo projeto. Testamos uma série de modificações no cassete de expressão e no capsídeo que foram previstas para resultar em níveis mais baixos de expressão celular e/ou reduzir o tropismo hepático. Isso incluiu o uso de cassetes de expressão utilizando (1) um promotor JeT alternativo, compacto e presumivelmente mais fraco ²⁵, (2) um sinal curto de poliadenilação sintética (SpA) ²⁶, Figura 12a) e (3) a expressão original do cassete de I^a geração embalado em um capsídeo scAAV9.47, que emergiu de uma triagem ín vivo para sequências de capsídeos não direcionadas ao fígado em relação a AAV9 ^{27, 28} . Injeção sistêmica desses vetores na dose moderada (1 x 10¹² vg/camundongo) em camundongos Mecp2^-/y com 4-5 semanas de idade resultaram em sobrevida significativamente aumentada e melhoram o peso

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61/88 corporal, mas não houve impacto no escore de gravidade agregada do tipo RTT (Figura 12b). Em resumo, nenhuma dessas modificações resultou em melhorias significativas em relação ao vetor de I^a geração (p > 0,05 para todas as medidas; ANOVA e testes de Mantel Cox) . É importante ressaltar que todos esses vetores modificados causaram o desenvolvimento de patologia hepática semelhante à observada com o vetor de primeira geração (como mostrado anteriormente na Figura 2; Figura 12c).

[166] A justificativa para o uso de um fragmento de promotor de núcleo de Mecp2 endógeno (MeP229) no vetor de I^a geração foi que foi demonstrado em grande parte recapitular o padrão de nivel de tecido endógeno da expressão de MeCP2 ²². No entanto, esse fragmento de promotor de núcleo está faltando um número previsto elementos reguladores a montante que podem ser importantes na regulação especifica do tipo celular da expressão de MeCP2 ²⁹~³¹. Portanto, projetamos um vetor de 2^a geração (v2) no qual usamos um fragmento promotor estendido (MeP426) incorporando elementos reguladores adicionais do promotor e um elemento supressor de silenciador (Figura 13) . Previmos que isso podería permitir melhor a regulação dos níveis exógenos de MeCP2 em células transduzidas. Além do promotor estendido, também incorporamos um novo 3'-UTR que consiste em um fragmento do MECP2 3'UTR endógeno, juntamente com um painel selecionado

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62/88 de sítios de ligação para miRNAs conhecidos por estarem envolvidos na regulação do Mecp2 ³²~³⁵ (Figura 13) .

[167] Para testar a eficácia terapêutica do vetor de 2^a geração, uma dose moderada (1 x 10¹² vg/camundongo) foi injetada por via intravenosa em camundongos Mecp2~^/y com 4-5 semanas de idade. Houve uma extensão significativa da sobrevida nos camundongos tratados com vetor em comparação aos camundongos tratados com veículo (sobrevida média = 29,9 semanas e 11,6 semanas, respectivamente; p < 0,0001, MantelCox, Figura 5b). Também houve uma melhora significativa no peso corporal com 11 semanas de idade (p < 0,05, ANOVA unidirecional, com o teste de comparação post-hoc de Tukey, Figura 5c) . Por outro lado, não houve efeito no escore de gravidade agregada do tipo RTT (Figura 5d) . O vetor de 2^a geração, portanto, não mostrou vantagens terapêuticas sobre o vetor de I^a geração após o parto sistêmico (Figura 5b-d).

[168] A fim de comparar este vetor frente a frente com o vetor de I^a geração em termos de segurança do fígado, os camundongos foram injetados por via intravenosa com vetor de I^a ou 2^a geração na dose de 1 x 10¹² vg/camundongo. Esses camundongos foram sacrificados após 30 dias e os tecidos analisados quanto à expressão exógena de MeCP2 (usando anticorpo de marcação anti-Myc) e sinais de patologia hepática (Figura 6) . Não houve diferença significativa na eficiência da transdução entre os construtos de vetores

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63/88 (Figura 6b), mas os níveis celulares de MeCP2 exógeno (antiMyc) em camundongos tratados com vetor de I^a geração foram significativamente maiores do que aqueles em camundongos tratados com vetor de 2^a geração (Figura 6c; p < 0,001, teste t não pareado). A análise da distribuição dos níveis de expressão celular de MeCP2 em células transduzidas mostrou que a expressão de MeCP2 foi mais fortemente regulada em camundongos injetados com o vetor de 2^a geração (Figura 6d) , com menos células exibindo níveis de expressão muito altos. Além disso, não havia nenhuma arquitetura ou vacuolização hepática interrompida anteriormente observada com o vetor de I^a geração (Figura 6e). A densidade dos focos inflamatórios foi significativamente maior nas amostras de fígado de camundongos injetados com vetor de I^a geração do que naqueles injetados com vetor de 2^a geração (Figura 6f).

A injeção cerebroventricular neonatal do vetor de 2^a geração melhorou a pontuação da gravidade agregada do tipo RTT [169] A falta de impacto no fenótipo após administração sistêmica é consistente com as baixas eficiências de transdução cerebral observadas, pois foi estabelecido que a gravidade do fenótipo e o grau de melhora após a restauração gênica se correlacionam com a proporção de células que expressam MeCP2 no cérebro ¹⁶. Portanto, foi decidido testar o vetor de segunda geração por injeção direta

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64/88 cerebroventricular em neonates de camundongos, uma via de distribuição conhecida por proporcionar expressão generalizada de transgene ¹⁹. Quando administrada na dose de 1 x 10¹¹ vg/camundongo (Figura 7a), houve uma extensão pronunciada em a sobrevivência de camundongos Mecp2~^/y tratados com o vetor de segunda geração em comparação com camundongos tratados com veículo (sobrevida média = 38,5 e 12,4 semanas, respectivamente; p < 0,0001, teste de MantelCox, Figura 7b) . Embora tenha havido um efeito insignificante do vetor no peso corporal (Figura 7c), uma observação importante foi a clara melhoria no escore de gravidade agregada do tipo RTT em comparação com os camundongos Mecp2 nulos tratados com veículo (Figura 7d) . O MeCP2 exógeno (revelado por marcação imunológica com marcação anti-Myc) foi detectável em todas as regiões do cérebro, com eficiências de transdução nas regiões do cérebro variando de ~ 10-40% (Figura 7e-f) . A análise de distribuição revelou que o nível de MeCP2 celular modal nas células transduzidas no córtex era de aproximadamente o dobro do MeCP2 endógeno (consistente com um nível de expressão exógena igual ao nível endógeno), com algumas células expressando níveis mais altos de MeCP2 exógeno (Figura 7g). Foi demonstrado que a proteína ANIC descrita acima produz resultados comparáveis à proteína MeCP2 de comprimento total (Figura 17).

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Discussão [170] A reversão de uma ampla gama de fenótipos do tipo RTT em camundongos após atraso no silenciamento do Mecp2 fornece uma forte justificativa para a transferência de genes como estratégia terapêutica no RTT ^{15, 16}. É provável que haja uma variedade de barreiras ao sucesso da tradução que serão necessárias a ser identificado e tratado, a fim de garantir resultados ótimos em ensaios clínicos em humanos. No presente estudo, identificamos desafios específicos associados à administração sistêmica de um vetor de terapia genética portadora de MECP2 em termos de uma janela terapêutica estreita, impulsionada pela baixa eficiência da transdução cerebral e pelo aparecimento de toxicidade por superexpressão periférica após o aumento da dose. No entanto, a superexpressão periférica pode ser reduzida refinando o design do cassete. Mostramos que a entrega direta do vetor cerebral em camundongos neonatais pode atingir níveis terapeuticamente relevantes de transdução que resultam na melhoria do fenótipo. Também mostramos que o vetor tem eficácia semelhante em camundongos que expressam a mutação causadora de RTT mais comum, sugerindo que é improvável que a presença de formas mutantes existentes de MeCP2 seja um obstáculo ao sucesso da tradução. Esses resultados são consistentes com experimentos em camundongos transgênicos que expressam as formas mutante e WT da proteína ³⁶.

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66/88 [171] Tentativas recentes de fornecer MECP2 exogenamente em modelos de RTT de camundongos usaram doses vetoriais muito variadas, mas são difíceis de comparar com base em diferenças adicionais no design de cassetes e outras variáveis, incluindo produção viral, protocolo de dosagem e medidas de fenótipo ¹⁹~²¹. No presente estudo, usamos nosso projeto de cassete publicado anteriormente (MECP2_el humano sob o controle de um fragmento de promotor de núcleo MeP229), ¹⁹ para investigar diretamente o efeito da dose em termos de eficácia e segurança. Uma descoberta notável foi a falta geral de eficácia em toda a faixa de doses testadas em termos de um efeito no escore de gravidade do fenótipo do tipo RTT. Isso não se deve ao fato de tais fenótipos serem inerentemente resistentes à reversão ^{15, 16}, mas é provavelmente explicado pelos baixos níveis de expressão do transgene cerebral proporcionados por essa via de entrega. Em contraste com o escore de gravidade do fenótipo, houve uma clara relação dose-resposta para a sobrevivência, com a dose intermediária causando um aumento modesto no peso corporal médio e uma extensão significativa na sobrevida. Não está claro se os efeitos de sobrevivência e peso corporal são devidos a níveis de transdução suficientes (se baixos) em regiões cerebrais críticas ou à expressão de MeCP2 em tecidos periféricos relevantes para a mortalidade. Evidências recentes sugerem que os níveis de MeCP2 nos

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67/88 tecidos periféricos podem afetar sutilmente o peso corporal ²³ e é possível que isso possa afetar indiretamente as medidas de sobrevivência, pois somos obrigados a usar a perda aguda de peso corporal como critério de avaliação. Outra possível explicação é que estávamos subestimando os níveis de eficiência da transdução relacionados à sobrevivência com base na sensibilidade de nossa detecção imuno-histoquímica. No entanto, a validação da biodistribuição do vetor usando qPCR foi consistente com nossas medidas, confirmando uma transdução muito modesta após a entrega sistêmica. Somente a dose mais alta testada produziu níveis consideráveis de transdução cerebral (> 10-20%) e, infelizmente, a patologia hepática grave e a letalidade associada a isso impedem a avaliação do potencial de efeitos terapêuticos específicos do cérebro nessa situação. As células hepáticas normalmente expressam níveis relativamente baixos de MeCP2 em comparação com os neurônios ²³ e doses idênticas de um vetor que expressa GFP não eram tóxicas, portanto, a patologia hepática dependente da dose provavelmente é atribuída à superexpressão de MeCP2 exógena.

[172] Nossas tentativas iniciais de diminuir a expressão tóxica de MeCP2 e/ou reduzir o tropismo hepático envolveram modificações no cassete de expressão e no capsídeo. No entanto, o uso de promotores sintéticos mais fracos e sinais de poliadenilação não foram suficientes para evitar a

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68/88 toxicidade hepática. Surpreendentemente, o uso de um capsideo AAV9.47, cujo objetivo é desviar o fígado em relação ao AAV9 ²⁷' ²⁸, resultou em patologia hepática semelhante à observada no AAV9. Portanto, concentramos os esforços em um vetor de 2^a geração, cujo design foi baseado na inclusão de elementos reguladores endógenos que podem regular melhor os níveis de MeCP2 exógeno em células transduzidas. Isso incluiu a incorporação de um promotor endógeno estendido e um fragmento endógeno de 3'-UTR. Estudos analisando as regiões promotoras de MECP2 humano e Mecp2 de camundongos bem conservadas indicaram a presença de vários elementos reguladores putativos dentro de uma janela de 1 kb imediatamente a montante do local inicial da transcrição ²⁹~ ³¹. Consequentemente, nosso promotor endógeno estendido (426 pb) no vetor de segunda geração compreendeu um elemento silencioso putativo na posição de -274 a -335, com relação ao local inicial da transcrição RefSeg (Figura 13).

[173] Um 3'-UTR endógeno também foi incorporado, contendo o sinal de poliadenilação MECP2 distai e vários elementos reguladores putativos em cluster ³⁷~³⁹. Além disso, realizamos uma análise dos sítios de ligação ao miRNA no 3'UTR do MECP2 usando várias ferramentas bioinformáticas ^40-42 e incorporamos uma sequência compacta contendo sítios de ligação de três miRNAs altamente conservados, conhecidos por estarem envolvidos na regulação do MeCP2 em o cérebro; miR-

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69/88 ⁴³, miR-19 ⁴⁴ e miR-132 ³⁴ . Combinadas, essas modificações reduziram significativamente a expressão de MeCP2 no fígado com subsequente redução da hepatotoxicidade encontrada no vetor de I^a geração. A importância relativa de diferentes modificações (elementos dentro do promotor estendido e do novo 3'-UTR) não foi investigada. No entanto, a eficácia de ambos os vetores após injeção sistêmica de doses moderadas não foi significativamente diferente. A vantagem importante do vetor de segunda geração é a falta de patologia hepática proeminente em uma dose que fornece algum benefício terapêutico (isto é, 1 x 10¹² vg/camundongo) . A melhora da sobrevida após a injeção sistêmica, apesar da baixa eficiência da transdução cerebral, pode ser devida à restauração dos níveis de MeCP2 em células críticas suficientemente numerosas no cérebro ou à restauração em importantes tecidos periféricos. 0 direcionamento de mais células no cérebro através da injeção direta no cérebro de camundongos recém-nascidos, juntamente com um impacto potencialmente maior através de intervenção anterior, levou a um acentuado aumento da sobrevida em uma dose (1 x 10¹¹ vg/camundongo) aproximadamente equivalente à dose sistêmica de 10¹². A administração por essa via de injeção direta no cérebro foi associada a uma melhoria no peso corporal, mas, principalmente, também a uma melhora no escore do fenótipo do tipo RTT. A melhoria não foi tão profunda quanto a

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70/88 relatada em experimentos de reversão genética ¹⁶ e isso provavelmente se deve aos efeitos combinados de (1) ineficiência relativa da re-expressão de MeCP2 no cérebro (10-40%) em comparação à reversão genética experiências (até 90%) e (2) os possíveis efeitos contrários prejudiciais da superexpressão de MeCP2 em uma proporção de células transduzidas.

[174] A análise dos níveis de MeCP2 indica, de fato, um conjunto significativo de células gue superexpressam o MeCP2, presumivelmente transduzido com várias cópias do vetor que fornece MECP2. Isso também pode ser responsável pelo escore de gravidade ligeiramente elevado em camundongos WT tratados com vetor (Figura 7d) na forma de um leve aperto dos membros posteriores. No geral, as experiências de prova de conceito que envolvem entrega direta do cérebro em camundongos neonatais sugerem que, se a eficiência da transdução através do cérebro atingir níveis suficientemente altos, uma melhoria comportamental é conferida por esse desenho vetorial.

Conclusão [175] Os resultados do presente estudo destacam os desafios associados à entrega cerebral sistêmica e direta do MECP2. As descobertas sugerem que alcançar uma expressão ampla do cérebro, mantendo ao mesmo tempo o controle adequado do tipo celular dos níveis de MeCP2, será um requisito

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71/88 essencial para o desenvolvimento bem-sucedido de uma terapia translacional. 0 desenvolvimento de cassetes de expressão capazes de produzir níveis eficazes e sub-tóxicos de MeCP2 pode superar problemas de superexpressão celular e permitir a entrega direta via compartimento do líquido cefalorraquidiano. Embora o AAV9 pareça ser insuficientemente eficiente em termos de transdução cerebral após a administração sistêmica de MECP2 para alcançar o benefício terapêutico desejado, a combinação do cassete de 2^a geração mais seguro com capsídeos com melhor penetrância cerebral ⁴⁵ pode efetivamente emparelhar efetivamente a transferência gênica do SNC eficaz com níveis seguros de periférico Expressão de transgene MeCP2. Essa combinação manteria uma promessa de translação aprimorada.

Material e métodos

Animais [176] Todas as experiências foram realizadas de acordo com a Diretiva do Conselho das Comunidades Européias (86/609/EEC) e com os termos de uma licença de projeto sob a Lei de Procedimentos Científicos do Reino Unido (1986). Os camundongos Mecp2-null, Mecp2^tml-^1Bird e Mecp2^T158M, originalmente fornecidos como um presente gentil pelo professor Adrian Bird, foram mantidos em um fundo C57BL/6. Os animais foram mantidos em ciclos de 12 horas claro/escuro com acesso livre a comida normal de camundongo. Os

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72/88 camundongos foram genotipados como descrito anteriormente ⁹' 15

Preparação de vetor viral.

[177] Partículas de vetores AAV recombinantes foram geradas na instalação do UNC Gene Therapy Center Vector Core. Partículas auto-complementares de AAV (scAAV) (genomas flanqueados por AAV2 ITR empacotados em capsideos de sorotipo AAV9 ou AAV9.47) foram produzidas a partir de células HEK293 em suspensão transíectadas usando polietilenoimina (Polysciences, Warrington, PA) com plasmídeos auxiliares (pXX6-80, pGSK2/9) e um plasmídeo contendo a construção de transgene flanqueada por ITR apropriada. Todos os construtos que expressam MeCP2 utilizaram a região de codificação MECP2_el humana com uma marcação de epítopo Myc no Cterminal, salvo indicação em contrário. A produção do vírus foi realizada como descrito anteriormente ⁴⁶, e os vetores foram preparados em uma formulação final de solução salina tamponada com fosfato com alto teor de sal (PBS; contendo 350 mmol/1 de NaCl total) suplementada com sorbitol a 5%.

Injeção do vetor scAAV e fenotipagem em camundongos.

[178] Alíquotas congeladas de partículas virais de scAAV9 foram descongeladas e diluídas para 100 pL em PBS/350 mmol/1 NaCl contendo 5% de sorbitol. As injeções de controle foram feitas usando o mesmo vetor ausente de diluente ('controle de veículo'). Para injeção direta no cérebro de

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73/88 recém-nascidos de camundongo, os companheiros de ninhada foram sexuados ao nascimento e injeções bilaterais diretas de vírus (3 μΐ por local) foram administradas no neuropil de machos PO-3 não anestesiados, como descrito anteriormente ¹⁹. Os filhotes injetados foram devolvidos à gaiola doméstica contendo suas ninhadas não injetadas. A genotipagem foi realizada em 3 semanas, altura em que a fenotipagem foi iniciada. Para injeção em camundongos machos jovens, as injeções foram feitas pela veia da cauda com 4-5 semanas de idade. Após a injeção, todos os camundongos foram pesados semanalmente. Foi realizada fenotipagem, cega ao genótipo e tratamento, duas vezes por semana. Os camundongos foram pontuados em uma escala de gravidade agregada usando um protocolo estabelecido (os camundongos foram pontuados para fenótipos do tipo RTT, incluindo mobilidade, marcha, respiração, fechamento dos membros posteriores, tremor e condição geral; ^{15, 16, 19, 21}. Para análise de sobrevivência, camundongos foram censurados após a morte natural ou se as perdas de peso corporal excederem 20% do pico de peso corporal.

Imuno-hi s toquimi ca [179] Os camundongos foram anestesiados com pentobarbitona (50 mg, intraperitonealmente) e perfundidos transcardialmente com paraformaldeído a 4% (0,1 mol/1 de PBS) . Um micrótomo vibratório (Leica VT1200; Leica, Milton

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Keynes, Reino Unido) foi utilizado para obter secções de 80 pm do cérebro, medula espinhal e fígado. As secções foram lavadas três vezes em PBS a 0,3 mol/l e foram depois transferidas para citrato de sódio 10 mM (pH 6, 85 °C, 30 minutos) para recuperação de antígeno. As secções foram então incubadas na solução de bloqueio (soro de cabra normal a 5% em PBS a 0,3 mol/l com Triton X-100 a 0,3%) durante 1 hora à temperatura ambiente. As amostras foram então incubadas por 48 horas em um agitador a 4 °C com os seguintes anticorpos primários: coelho anti-Myc (Abeam, ab9106); anti- MeCP2 monoclonal de camundongo (Sigma, WH0004204M1), anti- GFP de galinha, Abeam abl3970). Os anticorpos primários foram então lavados (3 χ 0,3 mol/l PBST) e os anticorpos secundários aplicados às secções durante a noite a 4 °C: Alexa flúor 488 anti-camundongo/coelho de cabra (Invitrogen, Carlsbad, CA; 1/500), Alexa flúor 546 anti-camundongo /coelho de cabra (Invitrogen; 1/500), Alexa flúor 649, anti-camundongo de cabra (Jackson immunoresearch, 112-495-003JIR). Finalmente, as secções foram incubadas com coloração nuclear de 4 ', 6diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Sigma, Poole, Reino Unido; 1/1000) por 30 minutos em temperatura ambiente antes da montagem com Vectashield (Vector labs, Peterborough, Reino Unido).

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Coloração com Hematoxilina e Eosina (H&E) [180] As amostras de fígado foram lavadas com 0,1 mol/1 de PBS e depois desidratadas através de graus ascendentes de etanol e eliminadas em acetato de amila usando um processador de tecidos automatizado. As amostras foram embebidas em paraplast e as secções (10 pm de espessura) foram coletadas em lâminas revestidas com APES (aminopropiltrietoxissilano) e secas durante a noite no forno a 37 °C. As secções foram então desparafinizadas através de duas alterações de Histoclear (Agar Scientific, Reino Unido) por 15 min e reidratadas através de graus decrescentes de álcool (100%, 90% e 70%). As secções foram coradas com hematoxilina de Mayer por 8 minutos e depois enxaguadas com água da torneira. Os núcleos foram corados em azul, colocando as lâminas na solução de Scott por 1 minuto e depois enxaguados com água da torneira. As secções foram então coradas com 1% de eosina durante 2 min e lavadas com água. Finalmente, as secções foram desidratadas por graus ascendentes de álcool e histoclear antes de serem montadas com DPX. As imagens foram capturadas usando um AxioCam MRc (Zeiss, Alemanha) montado em um microscópio ótico (Zeiss, Alemanha).

Análise de imagem [181] A análise dos padrões de expressão, eficiência de transdução e quantificação dos níveis de MeCP2 derivados exogenamente nos núcleos foi realizada em células de imagens

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76/88 capturadas usando um microscópio confocal a laser Zeiss LSM710 ou Zeiss Axiovert LSM510 (Zeiss, Cambridge, Reino Unido). A série Z foi tirada em intervalos de 1 pm através da seção de interesse usando uma objetiva de 40X. Para estimar a eficiência da transdução, as imagens foram capturadas como acima e a proporção de núcleos imunopositivos para Myc e núcleos corados com DAPI foi calculada para campos aleatórios (n = 12 imagens/região: 4 imagens de cada um dos três camundongos) de secções do hipocampo (CAI região), camada 5 do córtex motor primário, tálamo, hipotálamo, tronco cerebral e estriado. Para quantificar os níveis de MeCP2 derivado exogenamente por núcleo em camundongos WT, células confocais (20 pm de espessura) foram obtidas como acima e o software ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) foi usado para determinar a fluorescência média do canal MeCP2 intensidade nas células transduzidas (Myc + ve) e não transduzidas (Mycve). A fluorescência no canal DAPI foi usada para definir a o limite nuclear.

Análise estatística [182] Os testes para diferenças entre os grupos de tratamento foram realizados no GraphPad PRISM usando ANOVA unidirecional, teste t de Student e teste de Mantel-Cox (curvas de sobrevivência), conforme apropriado, p < 0,05 foi utilizado para definir significância estatística. Nas comparações de vários grupos, a correção de testes múltiplos

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77/88 para testes em pares entre grupos foi aplicada usando a análise post-hoc de Tukey.

[183] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as modalidades exemplares descritas acima, muitas modificações e variações equivalentes serão evidentes para os especialistas na técnica quando recebidas esta divulgação. Por conseguinte, as modalidades exemplares da invenção estabelecidas são consideradas ilustrativas e não limitativas. Várias alterações nas modalidades descritas podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Todos os documentos agui mencionados são expressamente incorporados por referência.

[184] 0 ensino de todas as referências no presente pedido, incluindo pedidos de patente e patentes concedidas, é aqui totalmente incorporado por referência. Qualquer pedido de patente ao qual este pedido reivindica prioridade é incorporado por referência aqui na sua totalidade, da maneira aqui descrita para publicações e referências.

[185] Para evitar dúvidas, os termos 'compreendendo', 'compreende' e 'compreendem' aqui pretendidos pelos inventores são opcionalmente substituíveis pelos termos 'consistindo em', 'consiste em' e 'consiste em', respectivamente, em toda instância. 0 termo cerca de (ou em torno de) em todos os valores numéricos permite uma

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78/88 variação de 5%, ou seja, um valor de cerca de 1,25% significaria entre 1,19% -1,31%.

[186] Será entendido que modalidades particulares descritas aqui são mostradas a título de ilustração e não como limitações da invenção. As principais características desta invenção podem ser empregues em várias modalidades sem se afastar do escopo da invenção. Os especialistas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar, usando não mais que um estudo de rotina, numerosos equivalentes aos procedimentos específicos aqui descritos. Tais equivalentes são considerados como estando dentro do escopo desta invenção e são cobertos pelas reivindicações. Todas as publicações e pedidos de patente mencionados na especificação são indicativos do nível de habilidade daqueles versados na técnica a que esta invenção se refere. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específico e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

[187] 0 uso da palavra o ou um quando usado em conjunto com o termo compreendendo nas reivindicações e/ou na especificação pode significar um, mas também é consistente com o significado de um ou mais, pelo menos um e um ou mais de um. 0 uso do termo ou nas reivindicações é usado para significar e/ou, a menos que

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79/88 explicitamente indicado para se referir apenas a alternativas ou as alternativas sejam mutuamente exclusivas, embora a divulgação apoie uma definição que se refira apenas a alternativas e e/ou. Em todo este pedido, o termo cerca de é usado para indicar que um valor inclui a variação inerente do erro para a medição, o método empregado para determinar o valor ou a variação existente entre os indivíduos do estudo.

[188] Conforme usados nesta especificação e reivindicação(ões), as palavras compreendendo (e qualquer forma de compreender, como compreender e compreende), tendo (e qualquer forma de possuir, como ter e tem), incluindo (e qualquer forma de inclusão, como incluem e inclui) ou contendo (e qualquer forma de conter, como contêm e contém) são inclusivas ou abertas e não exclui elementos adicionais não-indicados ou etapas do método.

[189] 0 termo ou combinações dos mesmos, conforme aqui utilizado, se refere a todas as permutações e combinações dos itens listados que precedem o termo. Por exemplo, A, B, C ou combinações dos mesmos deve incluir pelo menos um de: A, B, C, AB, AC, BC ou ABC e, se a ordem for importante em um contexto específico, também BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC ou CAB. Continuando com este exemplo, estão expressamente incluídas combinações que contêm repetições de um ou mais itens ou termos, como BB, AAA, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB

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80/88 e o técnico habilidoso entenderá que normalmente não há limite para o número de itens ou termos em qualquer combinação, a menos que seja aparente do contexto.

[190] Todas as composições e/ou métodos divulgados e reivindicados neste documento podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente divulgação. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, será evidente para os versados na técnica que variações podem ser aplicadas às composições e/ou métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método aqui descrito sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Todos esses substitutos e modificações semelhantes aparentes para os especialistas na técnica são considerados dentro do espírito, escopo e conceito da invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas. Referências

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Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que compreende um cassete de expressão MeCP2, o cassete de expressão compreendendo, em ligação operável de 5' a 3':

   uma região de controle transcricional 5' compreendendo um promotor capaz de conduzir a transcrição em células neurais;

   - um quadro de leitura aberto (open reading frame) que codifica uma proteína MeCP2;

   - sinais de controle de tradução;

   - uma região não traduzida 3' (3'UTR) compreendendo um ou mais dentre:

   (i) um sítio de ligação para mir-22;

   (ii) um sítio de ligação para mir-19;

   (iii) um sítio de ligação para miR-132;

   (iv) um sítio de ligação para miR124; e (v) um elemento rico em AU; e

   - sinais de terminação transcricional;

   em que o cassete de expressão MeCP2 não tem mais do que cerca de 5 kb de comprimento.
2. 2. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o 3'UTR compreende sítios de ligação para pelo menos um de miR-22, miR-19, miR-132 e miR-124.

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3. 3. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o 3'UTR compreende sítios de ligação para pelo menos 2, pelo menos 3 ou todos os 4 de miR-22, miR-19, miR-132 e miR-124.
4. 4. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o 3'UTR compreende sítios de ligação para:

   miR-22 e miR-19;

   miR-22 e mir-132;

   miR-22 e miR124;

   miR-19 e miR-132;

   miR-19 e miR-124;

   miR-132 e miR-124;

   miR-22, miR-19 e miR-132;

   miR-22, miR-19 e miR-124;

   miR-22, miR-132 e miR-124;

   miR-19, miR-132 e miR-124;

   ou miR-22, miR-19, miR-132 e miR-124.
5. 5. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o 3'UTR compreende um elemento rico em AU.
6. 6. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a proteína MeCP2 codificada compreende:

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   3/Ί (i) um domínio de ligação metil-CpG (MBD) tendo a sequência PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKY DVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPP (SEQ ID NO: 5) ou uma variante da mesma com pelo menos 70% de identidade, por exemplo, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a mesma;

   (ii) um domínio de interação NCoR/SMRT (DIN) tendo a sequência PGSWAAAAAEAKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKTRETV (SEQ ID NO: 6) ou uma variante da mesma tendo pelo menos 70% de identidade, por exemplo, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a mesma; e (iii) um sinal de localização nuclear (SLN).
7. 7. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a proteína MeCP2 codificada compreende ou consiste na sequência: SEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHEPVQPSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSA PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGK AFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRG RPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVI KRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSWAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRK TRE TVSIEVKEWKPLLVS TLGEKSGKGLKTCKS PGRKSKE S S PKGRS S SAS S PPKKEH HHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTSPPEPQDLSSSVCKEEKMPRGGSLE SDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTER VSS (SEQ ID NO: 9); ou é uma variante funcional da mesma com pelo menos 70% de identidade, por exemplo, pelo menos 75%,

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   80%, 85%, 90%, 95% , 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a mesma; ou é um fragmento funcional de qualquer um dos mesmos. 8 . Molécula de ácido nucleico, de acordo com a

   reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a proteína MeCP2 codificada compreende ou consiste na sequência: PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGK AFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRG RPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVI KRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSWAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRK TRETV (SEQ ID NO: 10) ou é uma variante da mesma com pelo menos 70% de identidade, por exemplo, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a mesma.
8. 9. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a proteína MeCP2 codificada compreende ou consiste na sequência: PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGK AFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPGSSGSSGPKKKRKVPG SWAWAAAPIK (SEQ ID NO: 11) ou é uma variante da mesma com pelo menos 70% de identidade, por exemplo, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a mesma.
9. 10. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizada pelo fato de que

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   5/7 a proteína MecP2 compreende ainda uma porção N terminal tendo a sequência MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEK (SEQ ID NO: 12), MVAGMLGLREEK (SEQ ID NO: 13), ou pelo menos 70% de identidade com ambas.
10. 11. Molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a região reguladora da transcrição 5' compreende o promotor principal de MeCP2, o elemento silenciador de MeCP2 e/ou um elemento regulador de CNS.
11. 12. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão não tem mais do que cerca de 4,9 kb, 4,8 kb, 4,7 kb, 4,6 kb, 4,5 kb ou 4,4 kb de comprimento.
12. 13. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ITR 5' e um ITR 3', em que os ITRs flanqueiam o cassete de expressão.
13. 14. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é um genoma de rAAV.
14. 15. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão não tem mais que cerca de 2,4 kb, não mais que 2,3 kb ou não mais que 2,2 kb em comprimento.
15. 16. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de compreender, de 5' a 3', um

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    6/7 cassete de expressão MeCP2 da invenção e o complemento reverso do referido cassete de expressão.
16. 17. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma ITR 5' e uma ITR 3'.
17. 18. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que é um genoma do vetor scAAV.
18. 19. Partícula de vírion de AAV caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico conforme definido na reivindicação 14 ou reivindicação 18.
19. 20. Célula de empacotamento caracterizada pelo fato de que é capaz de produzir uma partícula de vírion de AAV conforme definida na reivindicação 19.
20. 21. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou uma partícula de vírion de AAV conforme definida na reivindicação 19, em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.
21. 22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que é formulada para administração intravenosa ou intratecal.
22. 23. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou uma partícula de vírion de AAV, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado(a) pelo fato de

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    7/7 que é para utilização no aumento da expressão da proteína MeCP2 em uma célula alvo.
23. 24. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou uma partícula de virion de AAV, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado(a) pelo fato de que é para utilização no tratamento da sindrome de Rett.
24. 25. Método de tratamento da sindrome de Rett em um indivíduo em necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou uma partícula de virion de AAV conforme definida na reivindicação 19 ao indivíduo.
25. 26. Uso de um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou de uma partícula de virion de AAV conforme definida na reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento da sindrome de Rett.
26. 27. Método caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de testar um indivíduo quanto à presença de uma ou mais mutações no gene MeCP2 indicativo da presença ou da predisposição para a sindrome de Rett, e selecionar o indivíduo para tratamento com um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou uma partícula de virion de AAV conforme definida na reivindicação 19, se uma ou mais dessas mutações for identificada.