BR112019019833A2

BR112019019833A2 - terapia baseada em mecp2

Info

Publication number: BR112019019833A2
Application number: BR112019019833A
Authority: BR
Inventors: Bird Adrian; David Hector Ralph; Tillotson Rebekah; Robert Cobb Stuart
Original assignee: Univ Court Univ Of Edinburgh; Univ Glasgow Court
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2018-03-23
Publication date: 2020-04-22
Also published as: EP3601324A1; BR112019019857A2; RU2019133002A3; KR20200019846A; US11969479B2; CA3057430A1; AU2018239498B2; WO2018172795A1; US20240165270A1; US20200016279A1; JP2020513830A; JP2020513831A; AU2018239498C1; JP2023011865A; CN110869385A; RU2019133002A; JP7170656B2; WO2018172794A1; CA3057425A1; AU2018239498A1

Abstract

terapia baseada em mecp2. a presente invenção refere-se a polipeptídeos sintéticos que são úteis no tratamento de distúrbios associados à atividade reduzida de mecp2, incluindo a síndrome de rett. a presente invenção fornece polipeptídeos sintéticos compreendendo: i) uma sequência de aminoácidos mbd apresentando pelo menos 70% de similaridade com a sequência de aminoácidos como representada na seq id no: 1; e ii) uma sequência de aminoácidos nid apresentando pelo menos 70% de similaridade com a sequência de aminoácidos como representada na seq id no: 2, em que o polipeptídeo tem uma deleção de pelo menos 50 aminoácidos, quando comparado às sequências mecp2 e1 e e2 de comprimento total. a invenção fornece ainda construtos de ácidos nucleicos, vetores de expressão, virions, composições farmacêuticas e células que fornecem polinucleotídeos da invenção. a invenção fornece ainda métodos de tratamento ou prevenção de doenças em um animal compreendendo a administração ao referido animal de um polipeptídeo sintético de acordo com a invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: TERAPIA BASEADA EM MECP2 CAMPO DE INVENÇÃO [001] A presente invenção se refere a polipeptideos sintéticos que são úteis no tratamento de distúrbios associados à atividade reduzida de MeCP2, incluindo a sindrome de Rett. A invenção também se refere a construtos de ácidos nucleicos, vetores de expressão, virions e células para expressar os polipeptideos sintéticos. Além disso, a invenção se refere a métodos de tratamento de distúrbios, tal como a sindrome de Rett, usando os polipeptideos sintéticos da invenção, o uso de polipeptideos sintéticos, construtos de ácidos nucleicos, vetores de expressão, virions e células na fabricação de medicamentos para o tratamento de distúrbios associado à atividade reduzida de MeCP2, incluindo a sindrome de Rett, e composições farmacêuticas compreendendo os polipeptideos sintéticos, construtos de ácido nucleico, vetores de expressão e virions da invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] A Proteína de ligação ao Metil CpG 2 (MeCP2) é uma proteína nuclear que foi nomeada por sua capacidade de se ligar preferencialmente ao DNA metilado. O interesse em MeCP2 aumentou quando mutações no gene MECP2 foram identificadas na maioria dos pacientes com sindrome de Rett.

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2/125 [003] A sindrome de Rett ocorre em cerca de 1 em 15.000 meninas. Embora seja, em teoria, uma doença rara porque afeta menos de 1 em 2000 indivíduos, é na verdade uma das causas genéticas mais comuns de deficiência intelectual em mulheres. Originalmente, era considerado um distúrbio do neurodesenvolvimento, devido ao desenvolvimento diminuído, interrompido e retardado daqueles com o distúrbio a partir

dos 6 meses	de	idade. No entanto,	o fato de	que	alguns dos
principais	sintomas foram reversíveis em	um	modelo de
camundongo	da	doença significa	que agora	é	geralmente

considerado um distúrbio neurológico.

[004] O gene MECP2 está localizado no cromossomo X. Ele mede 7 6 kb e é composto por quatro éxons. A proteína MeCP2 possui duas isoformas, MeCP2 el e MeCP2 e2, que diferem no N-terminal da proteína. A isoforma el é composta por 498 aminoácidos e a isoforma e2 tem 486 aminoácidos. Os genes MECP2 (humano) e Mecp2 (camundongo) consistem em quatro éxons e sofrem splicing alternativo para produzir as duas espécies de mRNA: el consiste nos éxons 1, 3 e 4; e e2 consiste em 1, 2, 3 e 4. A tradução começa no éxon 1 ou 2 nas isoformas el e e2, respectivamente. Como a grande maioria da sequência de codificação está nos éxons 3 e 4, essas duas isoformas são muito semelhantes e diferem apenas nas extremidades Nterminais. O mRNA da variante MECP2 el tem maior expressão no cérebro do que o MECP2 e2 e a proteína el é mais abundante

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3/125 no cérebro humano e de camundongos. 0 MeCP2 é uma proteína abundante de mamífero que se liga seletivamente aos resíduos de 5-metil citosina em dinucleotídeos mCpG metilados simetricamente e em dinucleotídeos mCpA metilados assimetricamente. Os dinucleotídeos CpG estão preferencialmente localizados nas regiões promotoras dos genes, mas estes são na maior parte não metilados. Em comparação, são os dinucleotídeos CpG no genoma a granel que são altamente metilados e é a esses que o MeCP2 se liga. A presença de mCpA metilada nos neurônios aumenta ainda mais o número de sítios de ligação. Dessa maneira, o MeCP2 regula a transcrição gênica, ligando-se ao corpo principal das sequências gênicas¹.

[005] O MeCP2 é altamente conservado entre os vertebrados e pelo menos seis domínios bioquimicamente distintos foram identificados na proteína², incluindo domínios semelhantes a proteínas do grupo de alta mobilidade, o Domínio de Ligação de Metil (MBD), o domínio de repressão transcricional que compreende o Domínio de Interação NCoR/SMRT (NID) e os domínios C-terminais α e β. Funcionalmente, o MeCP2 foi implicado em vários processos celulares com base em sua interação relatada com > 40 parceiros de ligação³, incluindo co-repressores transcricionais⁴ (por exemplo, NCoR/SMRT⁵), ativadores transcricionais⁶, RNA⁷, remodeladores de cromatina^8,9,

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4/125 proteínas de processamento de microRNA¹⁰ e fatores de splicing¹¹. Nesse sentido, o MeCP2 foi lançado como um hub multifuncional que integra diversas funções essenciais em neurônios maduros¹².

[006] Atualmente, não existem tratamentos disponíveis que sejam específicos para a síndrome de Rett. Em vez disso, o tratamento geralmente envolve o tratamento dos sintomas da doença usando fármacos tradicionais, enquanto as estratégias preventivas envolvem manejo nutricional agressivo, prevenção de complicações gastrointestinais e ortopédicas e terapias de reabilitação. Assim, permanece uma necessidade urgente de um meio de tratar e prevenir especificamente o desenvolvimento da síndrome de Rett.

SUMARIO DA INVENÇÃO [007] Por conseguinte, a presente invenção fornece polipeptídeos sintéticos compreendendo uma sequência de aminoácidos MBD apresentando pelo menos 70% de similaridade com a sequência de aminoácidos como representada na SEQ ID NO: 1 e uma sequência de aminoácidos NID apresentando pelo menos 70% de similaridade com a sequência de aminoácidos como representado na SEQ ID NO: 2.

[008] Os polipeptídeos sintéticos da invenção podem ter uma deleção ou substituição de pelo menos 50 aminoácidos em comparação com as sequências MeCP2 el e e2 de comprimento

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5/125 total (SEQ ID NOs 3 e 4). Adicionalmente, ou alternativamente, os polipeptídeos sintéticos da invenção têm menos de 90% de identidade ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos de MeCP2, como representado na SEQ ID NO: 3 e/ou na SEQ ID NO: 4.

[009] Geralmente, os polipeptídeos sintéticos da invenção compreenderão domínios MBD e NID de acordo com MeCP2, mas carecem de outras partes da sequência natural de MeCP2. Assim, qualquer deleção ou substituição no polipeptídeo sintético pode ser parte da sequência natural de MeCP2, mas não parte do MBD ou NID do MeCP2. Assim, os polipeptídeos sintéticos da invenção podem geralmente ter a estrutura

A-B-C-D-E em que a porção B do polipeptídeo sintético é a sequência de aminoácidos MBD apresentando pelo menos 70% de similaridade com a sequência de aminoácidos como representada na SEQ ID NO: 1, e a porção D do polipeptídeo sintético é a sequência de aminoácidos NID apresentando pelo menos 70 % de similaridade com a sequência de aminoácidos, conforme representado na SEQ ID NO: 2, e ainda em que pelo menos uma das três seguintes é verdadeira: a porção A do polipeptídeo sintético tem menos de 30 aminoácidos e/ou menos de 90% identidade para as sequências de aminoácidos como representadas nas SEQ ID NOs: 5 e 6, calculadas ao longo de

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6/125 todo o comprimento das sequências de aminoácidos como representadas nas SEQ ID NO: 5 e 6; a porção C do polipeptídeo sintético tem menos de 20 aminoácidos e/ou tem menos de 90% de identidade com a sequência de aminoácidos, como representado na SEQ ID NO: 7, calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos, como representado em SEQ ID NO: 7; e a porção E do polipeptídeo sintético está ausente, é uma marcação polipeptídica e/ou tem menos de 90% de identidade com a sequência de aminoácidos, como representada na SEQ ID NO: 8, calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos, como representado em SEQ ID NO: 8. O especialista na matéria apreciará que esta estrutura geral é divulgada da esquerda para a direita na direção aceita N-terminal para C-terminal do polipeptídeo sintético.

[0010] A invenção também fornece construtos de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo sintético da invenção e vetores de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo sintético da invenção. O vetor de expressão pode ser um vetor viral e, portanto, a invenção também fornece um virion compreendendo um vetor de expressão de acordo com a invenção. A invenção também fornece células que compreendem um construto genético sintético adaptado para expressar um polipeptídeo da

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7/125 invenção, células compreendendo um vetor da invenção e células para a produção de um virion da invenção.

[0011] A invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo os polipeptídeos sintéticos, construtos de ácidos nucleicos, vetores de expressão e/ou virions da invenção.

[0012] Os polipeptídeos sintéticos da invenção têm utilidade na medicina, e particularmente no tratamento de distúrbios neurológicos associados à inativação, tal como uma mutação inativadora, de MECP2. Tais distúrbios incluem a síndrome de Rett. Portanto, a invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de doenças em um animal, compreendendo a administração ao referido animal de um polipeptídeo sintético da invenção. A referida administração pode compreender a administração de um polipeptídeo sintético da invenção, um vetor de expressão da invenção, um virion da invenção e/ou uma composição farmacêutica da invenção.

[0013] Além disso, a invenção fornece polipeptídeos sintéticos da invenção, vetores de expressão da invenção e virions da invenção para o tratamento ou prevenção de um distúrbio neurológico associado à mutação inativadora de MECP2, por exemplo, a síndrome de Rett. A invenção também fornece o uso de polipeptídeos sintéticos da invenção, vetores de expressão da invenção e virions da invenção na

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8/125 fabricação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de um distúrbio neurológico associado à mutação inativadora de MECP2, por exemplo, a síndrome de Rett.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0014] Os polipeptídeos sintéticos da invenção fornecem proteínas terapêuticas que podem ser usadas no tratamento de distúrbios causados por inativação ou atividade reduzida de MeCP2. Tais distúrbios incluem, em particular, a síndrome de Rett. Os construtos de ácido nucleico, vetores de expressão, virions e células da invenção podem ser usados para produzir e, opcionalmente, entregar os polipeptídeos sintéticos. A invenção também fornece métodos de tratamento utilizando os produtos da invenção e o uso desses produtos nesses tratamentos.

[0015] A invenção é baseada na descoberta surpreendente e inesperada dos inventores de que é uma deficiência na atividade biológica associada ao MBD e ao NID do MeCP2 que é a chave para o desenvolvimento da síndrome de Rett, de modo que outras partes da proteína não são necessárias, apesar do fato de o MeCP2 ser uma proteína altamente conservada. Eles geraram e testaram a hipótese de que as funções do MeCP2, que são vitais na síndrome de Rett, são aquelas devidas ao MeCP2, formando uma ponte entre a cromatina e o complexo NCoR/SMRT, para que todos os outros domínios do MeCP2 sejam dispensáveis. Além disso, eles

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9/125 levantaram a hipótese de que as mutações da síndrome de Rett que ocorrem nos domínios do MBD ou NID interferem diretamente com essa função e que as mutações da síndrome de Rett que ocorrem fora do MBD e do NID geralmente desestabilizam a proteína ou prejudicam a ponte entre a cromatina e o Complexo NCoR/SMRT. Como resultado de seus estudos e entendimento, eles concluíram que o MBD e o NID são, portanto, suficientes para a função MeCP2 necessária para tratar ou prevenir a síndrome de Rett e distúrbios semelhantes. Isso significa que eles são capazes de fornecer um derivado de proteína mini-MeCP2 descartando uma porção significativa, por exemplo, em algumas modalidades, até 50-65% da proteína MeCP2 nativa.

[0016] Como discutido em outra parte da especificação, a conclusão dos inventores significa que podem ser preparados polipeptídeos sintéticos terapêuticos que são consideravelmente menores que o comprimento total da MeCP2. Obviamente, isso significa que eles podem ser mais fáceis de produzir e de entregar efetivamente aos pacientes. Por exemplo, alguns veículos de entrega, tais como os vetores virais adeno-associados (AAV), são restritos à quantidade de carga útil que podem transportar, de modo que a capacidade de aliviar essa carga codificando um polipeptídeo menor é vantajosa. Além disso, a remoção de partes desnecessárias do polipeptídeo MeCP2 significa que uma sequência de

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10/125 polipeptídeo alternativa, tais como marcações peptídicas, marcações reguladoras e/ou peptídeos sinalizadores, pode ser inserida no polipeptídeo em algumas modalidades, sem tornar o polipeptídeo excessivamente grande. Da mesma forma, a proteína menor significa que uma sequência menor de ácido nucleico pode codificar a proteína, de modo que, quando houver restrições de tamanho na quantidade de sequência de ácido nucleico que pode ser incluída em um construto específico em algumas modalidades da invenção, os construtos desse tipo que codificam os polipeptídeos da invenção podem incluir sequências adicionais, tais como elementos reguladores, que seriam difíceis de incluir se a proteína MeCP2 de comprimento total estivesse sendo codificada em vez do polipeptídeo menor, devido às restrições de tamanho. Além disso, a remoção de outras partes biologicamente ativas, mas desnecessárias, da proteína MeCP2 significa que pode haver menos chance de efeitos colaterais indesejados devido às interações dessas partes da proteína durante o tratamento terapêutico ou preventivo.

[0017] Assim, a invenção fornece métodos aprimorados de tratamento ou prevenção de distúrbios associados à atividade reduzida de MeCP2, tal como a síndrome de Rett, bem como produtos terapêuticos para uso nesses métodos.

[0018] Além disso, os inventores descobriram de maneira surpreendente e inesperada que, embora a deleção da

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11/125 parte do MeCP2 que liga os domínios MBD e NID pareça reduzir a estabilidade do polipeptídeo sintético que possui os domínios MBD e NID, essa estabilidade reduzida pode ter um efeito benéfico, pois reduz a toxicidade que pode ser associada à superdosagem de indivíduos com um polipeptídeo MeCP2 . Assim, a invenção também fornece, em algumas modalidades da invenção, métodos aprimorados que são mais seguros e com menor probabilidade de serem associados a efeitos colaterais tóxicos, bem como os produtos terapêuticos para uso nesses métodos, que fornecem polipeptídeos sintéticos carecendo pelo menos de parte da sequência de aminoácidos que liga o MBD e o NID no MeCP2.

[0019] A fim de auxiliar o entendimento da presente invenção, certos termos aqui utilizados serão agora definidos mais detalhadamente, e mais geralmente serão fornecidos detalhes adicionais da invenção, nos parágrafos a seguir.

Polipeptídeos sintéticos [0020] A invenção fornece polipeptídeos sintéticos compreendendo uma sequência de aminoácidos MBD e uma sequência de aminoácidos NID.

[0021]	Como usado	aqui, o termo	polipeptídeo	pode
ser usado	de forma intercambiável	com peptídeo	ou
proteína	e significa	pelo menos	dois resíduos	de
aminoácidos	alfa ligados	covalentemente, ligados por	uma

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12/125 ligação peptidil. 0 termo polipeptídeo abrange produtos naturais purificados, ou produtos químicos, que podem ser produzidos parcial ou totalmente usando técnicas recombinantes ou sintéticas. 0 termo polipeptídeo pode se referir a um complexo de mais de um polipeptídeo, tal como um dímero ou outro multímero, uma proteína de fusão, uma variante de proteína ou seu derivado. 0 termo também inclui proteínas modificadas, por exemplo, uma proteína modificada por glicosilação, acetilação, fosforilação, peguilação, ubiquitinação e assim por diante. Um polipeptídeo pode compreender aminoácidos não codificados por um códon de ácido nucleico.

[0022] Como usado aqui, o termo polipeptídeo sintético se refere a sequências de polipeptídeos formadas por processos através da agência humana. Os polipeptídeos sintéticos da invenção são baseados no MeCP2, pois possuem sequências MBD e NID biologicamente ativas, tais como aquelas que ocorrem nas proteínas MeCP2 do tipo selvagem, mas são diferenciadas das proteínas MeCP2 que ocorrem naturalmente. Os polipeptídeos da invenção são sintéticos porque incluem mutações, tais como deleções de aminoácidos, substituições e/ou inserções, nas sequências MeCP2 do tipo selvagem, de modo que os polipeptídeos sintéticos resultantes não sejam conhecidos na técnica como polipeptídeos naturais.

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13/125 [0023] Ocorrendo naturalmente, nativo ou do tipo selvagem é usado para descrever um objeto que pode ser encontrado na natureza como distinto de ter sido produzido artificialmente. Por exemplo, uma sequência de proteína ou nucleotídeo presente em um organismo (incluindo um vírus), que pode ser isolada de uma fonte natural e que não foi intencionalmente modificada por uma pessoa no laboratório, é de ocorrência natural.

[0024] O Domínio de Ligação Metil-CpG (MBD) do MeCP2 tem a habilidade de se ligar ao DNA metilado. A sequência MBD de MeCP2 humana é aqui fornecida como SEQ ID NO: 1. Ela consiste nos aminoácidos de 72 a 173, inclusive, da proteína MeCP2 humana (a numeração se refere à isoforma e2, isto é, como na SEQ ID NO: 4). A sequência MeCP2 MBD do camundongo é idêntica à sequência humana. Os polipeptídeos da invenção compreendem um MBD tendo pelo menos 70% de similaridade com esta sequência de MeCP2 MBD (SEQ ID NO: 1). De preferência, os polipeptídeos da invenção compreendem um MBD tendo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de similaridade com a sequência MeCP2 MBD humana (SEQ ID NO: 1). Além disso, de preferência os polipeptídeos da invenção compreendem uma MBD com pelo menos 90% de similaridade. Mais preferencialmente, os polipeptídeos da invenção compreendem a sequência MeCP2 MBD humana (SEQ ID

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NO: 1). As sequências de MBD dos polipeptídeos sintéticos da invenção têm a capacidade de se ligar ao DNA metilado.

[0025] A sequência MBD de interesse particular para os polipeptídeos sintéticos da invenção é a dos aminoácidos nas posições 78 a 162 da isoforma MeCP2 e2 (SEQ ID NO: 4). Assim, nas modalidades preferidas da invenção, os polipeptídeos da invenção compreendem um MBD com pelo menos 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de similaridade com a sequência de aminoácidos das posições 78 a 162 da isoforma MeCP2 e2 (SEQ ID NO: 4) . Mais preferencialmente, as sequências de aminoácidos MBD dos polipeptídeos da invenção compreendem a sequência de aminoácidos das posições 78 a 162 da isoforma MeCP2 e2 (SEQ ID NO: 4).

[0026] A sequência MBD do MeCP2 inclui vários sítios de fosforilação (Ser80, Ser86, Thrl48/9 e Serl64; numeração em relação à isoforma e2). A fosforilação em Ser80 e Serl64, pelo menos, tem sido associada a afetar a atividade do MeCP2. Portanto, é preferido que um, mais ou todos esses aminoácidos sejam retidos nas sequências de MBD dos polipeptídeos sintéticos da invenção.

[0027] A sequência MBD da invenção pode corresponder àquela de uma sequência MBD MeCP2 de ocorrência natural, por exemplo, a sequência de MBD no homólogo de peixe-zebra de MeCP2.

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15/125 [0028] O Domínio de Interação NCoR/SMRT (NID) do MeCP2 é o domínio pelo qual o MeCP2 interage com os complexos co- repressores NCoR/SMRT. A sequência NID de MeCP2 humana é aqui fornecida como SEQ ID NO: 2. Ela consiste nos aminoácidos 272 a 312, inclusive, da proteína MeCP2 humana (a numeração se refere à isoforma e2, isto é, como na SEQ ID NO: 4) . A sequência de MBD MeCP2 de camundongo é idêntica à sequência humana, exceto a posição de aminoácido 297 na SEQ ID NO: 4 (isto é, o aminoácido na posição 26 na SEQ ID NO: 2), que é histidina no camundongo, mas glutamina no ser humano. Os polipeptídeos da invenção compreendem uma sequência de aminoácidos NID possuindo pelo menos 70% de similaridade com esta sequência NID de MeCP2 (SEQ ID NO: 2). Preferencialmente, os polipeptídeos da invenção compreendem um NID com pelo menos 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98% ou 99% de similaridade com a sequência NID de MeCP2 humana (SEQ ID NO: 2). Além disso, de preferência os polipeptídeos da invenção compreendem um NID com pelo menos 90% de similaridade. Mais preferencialmente, os polipeptídeos da invenção compreendem a sequência NID de MeCP2 humana (SEQ ID NO: 2). As sequências NID dos polipeptídeos sintéticos da invenção têm a capacidade de interagir ou se ligar ao complexo co-repressor NCoR/SMRT.

[0029] A sequência NID de interesse particular para os polipeptídeos sintéticos da invenção é a dos aminoácidos

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16/125 nas posições 298 a 309 da isoforma MeCP2 e2 (SEQ ID NO: 4). Assim, em modalidades preferidas da invenção, os polipeptídeos da invenção compreendem um MBD com pelo menos 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de similaridade com a sequência de aminoácidos das posições 298 a 309 da isoforma MeCP2 e2 (SEQ ID NO: 4) . Mais preferencialmente, as sequências de aminoácidos NID dos polipeptídeos da invenção compreendem a sequência de aminoácidos das posições 298 a 309 da isoforma MeCP2 e2 (SEQ ID NO: 4).

[0030] A sequência NID do MeCP2 inclui sítios de fosforilação (Thr308 e Ser274; numeração em relação à isoforma e2), a primeira das quais foi associada a afetar a atividade do NID. Por isso, é preferido que Thr308 seja retido pelo menos nas sequências NID dos polipeptídeos sintéticos da invenção.

[0031] A sequência de NID da invenção pode corresponder à de uma sequência de NID MeCP2 que ocorre naturalmente, por exemplo, a sequência de NID no homólogo de peixe-zebra de MeCP2. As sequências MBD e NID podem ter a mesma quantidade de percentual de similaridade às suas respectivas sequências MeCP2 humana do tipo selvagem, ou elas podem ter diferentes quantidades de percentual de similaridade em relação às suas respectivas sequências MeCP2 humanas do tipo selvagem. As similaridades percentuais para

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17/125 o MBD e o NID podem, portanto, consistir em qualquer combinação dos percentuais de similaridades divulgados acima. Assim, a presente invenção fornece polipeptídeos sintéticos compreendendo uma sequência de aminoácidos MBD apresentando pelo menos 70% de similaridade com a sequência de aminoácidos como representada na SEQ ID NO: 1 e uma sequência de aminoácidos NID apresentando pelo menos 70% de similaridade com a sequência de aminoácidos como representado na SEQ ID NO: 2, mas de preferência as sequências de aminoácidos MBD e NID podem ter pelo menos 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98% ou 99% de similaridade com as sequências do domínio MeCP2 humano. Além disso, de preferência pelo menos 90% de similaridade. Da mesma forma, a sequência MBD pode ter pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 95%, 97%, 97%, 98% ou 99% de similaridade com a sequência MeCP2 MBD humana, enquanto a sequência NID do mesmo polipeptídeo sintético pode ter pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98% ou 99% de similaridade com a sequência NID MeCP2 humana. Preferencialmente, uma ou ambas as sequências MBD e NID consistirão em, ou compreenderão a sequência correspondente no domínio humano ou do camundongo.

[0032] O termo similaridade se refere a um grau de similaridade entre proteínas ou sequências polipeptídicas, levando em consideração diferenças nos aminoácidos em

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18/125 posições alinhadas das sequências, mas nas quais a similaridade funcional dos diferentes resíduos de aminoácidos, em vista de tamanho quase igual, lipofilicidade, acidez etc., também é levada em consideração. Uma porcentagem de similaridade pode ser calculada pelo alinhamento ideal das sequências usando uma matriz de pontuação de similaridade, tal como a matriz Blosum62 descrita em Henikoff S. e Henikoff J.G., P.N.A.S. USA 1992, 89: 10915-10919. O cálculo do percentual de similaridade e do alinhamento ideal de duas sequências usando a matriz de similaridade Blosum62 e o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 1970, 48: 443-453) podem ser realizados usando o programa GAP do Genetics Computer Group (GCG, Madison, WI, EUA) usando os parâmetros padrão do programa.

[0033] Parâmetros exemplificativos para comparações de aminoácidos para similaridade na presente invenção usam a matriz Blosum62 (Henikoff e Henikoff, supra) em associação com as seguintes configurações para o programa GAP:

• Penalidade de intervalo: 8 • Penalidade no comprimento do intervalo: 2 • Não há penalidade para os intervalos finais.

[0034] Formas polimórficas funcionais de MBD e NID de camundongos e humanos, e homólogos desses domínios de MeCP2 de outras espécies, podem ser incluídos nos

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19/125 polipeptideos da presente invenção. Variantes desses domínios nos polipeptideos que também fazem parte da presente invenção são variantes naturais ou sintéticas que podem conter variações na sequência de aminoácidos devido a deleções, substituições, inserções, inversões ou adições de um ou mais aminoácidos na referida sequência ou devido a uma alteração em uma porção quimicamente ligada a uma proteína. Por exemplo, uma variante de proteína pode ser um carboidrato alterado ou uma estrutura de PEG ligada a uma proteína. Os polipeptideos da invenção podem incluir pelo menos uma dessas modificações de proteínas.

[0035] Variantes de um domínio ou proteína de polipeptídeo, conforme usado aqui, se refere a um domínio ou proteína de polipeptídeo resultante quando um polipeptídeo é modificado por um ou mais aminoácidos (por exemplo, inserção, deleção ou substituição), ou que compreende uma modificação de proteína ou que contém aminoácidos modificados ou não naturais. Variantes substitucionais de polipeptideos são aquelas nas quais pelo menos um resíduo na sequência de aminoácidos foi removido e um resíduo diferente foi inserido em seu lugar. Os domínios nos polipeptideos da presente invenção podem conter alterações conservativas, em que um aminoácido substituído tem propriedades estruturais ou químicas semelhantes ou, mais raramente, substituições não conservativas, por exemplo, substituição de uma glicina

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20/125 por um triptofano, desde que os domínios retenham a função. As variantes também podem incluir sequências com deleções ou inserções de aminoácidos, ou ambas. Orientações para determinar quais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou excluídos sem abolir a atividade biológica ou imunológica podem ser encontradas usando programas de computador bem conhecidos na técnica.

[0036] O termo substituição conservativa se refere à substituição de uma ou mais substituições de aminoácidos por resíduos de aminoácidos com propriedades bioquímicas semelhantes. Tipicamente, as substituições conservativas têm pouco ou nenhum impacto na atividade de uma sequência de polipeptídeo resultante. Por exemplo, uma substituição conservativa em um domínio de ligação pode ser uma substituição de aminoácidos que não afeta substancialmente a capacidade do domínio de se ligar ao (s) seu (s) parceiro (s) de ligação ou de outra forma de desempenhar sua função biológica usual. O rastreio de variantes dos domínios polipeptídicos da presente invenção pode ser usado para identificar quais resíduos de aminoácidos podem tolerar uma substituição de aminoácidos. Em um exemplo, a atividade biológica relevante de um polipeptídeo com um domínio modificado não é alterada em mais de 25%, preferencialmente não mais de 20%, especialmente não mais de 10%, quando uma

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21/125 ou mais substituições de aminoácidos conservativas são realizadas.

[0037] Uma ou mais substituições conservativas podem ser incluídas em um MBD ou NID de um polipeptídeo da presente invenção. Em um exemplo, 10 ou menos substituições conservativas são incluídas nos domínios. Um polipeptídeo da invenção pode, portanto, incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições conservativas dos domínios MBD e/ou NID. Um polipeptídeo pode ser produzido para conter uma ou mais substituições conservativas, manipulando a sequência de nucleotídeos que codifica esse polipeptídeo usando, por exemplo, procedimentos padrão, tais como mutagênese dirigida ao sítio ou PCR. Alternativamente, um polipeptídeo pode ser produzido para conter uma ou mais substituições conservativas usando métodos de síntese de peptídeos, por exemplo, como conhecido na técnica.

[0038] Exemplos de aminoácidos que podem ser substituídos por um aminoácido original em uma proteína e que são considerados substituições conservativas incluem: Ser para Ala; Lis para Arg; Gin ou His para Asn; Glu para Asp; Asn para Gin; Asp para Glu; Pro para Gly; Asn ou Gin para His; Leu ou Vai para lie; lie ou Vai para Leu; Arg ou Gin para Lys; Leu ou lie para Met; Met, Leu ou Tyr para Phe; Thr para Ser; Ser para Thr; Tyr para Trp; Trp ou Phe para Tyr; e lie ou Leu para Vai. Em uma modalidade, as

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22/125 substituições estão entre Ala, Vai, Leu e Ile; entre Ser e Thr; entre Asp e Glu; entre Asn e Gin; entre Lys e Arg; e/ou entre Phe e Tyr. No entanto, uma substituição pode não ser considerada conservativa quando resultar na remoção de um sítio de fosforilação dentro da sequência de polipeptídeo. Mais informações sobre substituições conservativas podem ser encontradas em, entre outros locais, Ben-Bassat et al., (J. Bacteriol. 169: 751-7, 1987), 0'Regan et al. , (Gene 77: 23751, 1989), Sahin-Toth et al. , (Protein Sei. 3: 240-7, 1994), Hochuli et al. , (Bio/Technology 6: 1321-5, 1988), WO 00/67796 (Curd et al. ) e em manuais padrão de genética e biologia molecular.

[0039] As substituições que causam perda ou diminuição da função de MBD e NID são conhecidas na técnica, principalmente devido à associação de algumas com a síndrome de Rett e outros distúrbios associados à MeCP2. Exemplos de tais alterações ou mutações prejudiciais incluem aqueles mostrados na Tabela 1 e Figura 2C no MBD e aqueles mostrados na Tabela 2 e Figura 2D no NID. Assim, o especialista compreenderá que essas alterações prejudiciais não devem ser incluídas nos domínios MBD e NID dos polipeptídeos da invenção.

[0040] Tabela 1: Alterações de aminoácidos prejudiciais e benignas no MBD. De acordo com a convenção, todos os números de aminoácidos fornecidos a seguir se

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23/125 referem às isoformas e2 de humanos e camundongos. * aqueles encontrados em homens hemizigotos estão em negrito e os em mulheres heterozigotos estão em itálico; ** aqueles encontrados em vertebrados não mamíferos são fornecidos em itálico. As alterações benignas listadas abaixo não são conhecidas por estarem associadas a um distúrbio associado ao MeCP2, portanto são provavelmente benignas.

Alterações prejudiciais associadas a:	Alterações benignas presentes em:
RTT¹³clássico	RTT atípico ou outra deficiência intelectual¹³	População geral¹⁴ *	Outras espécies [vertebrados] **
L100V	S86C ?	P72L/S	P72L
L100R	P93S ?	P75L	A73S
P101R	D97Y/E ?	K82R	V74A
P101S	P101R ?	R85H	A77S
P101H	G103D ?	R89C	P81A
P101L	W104R ?	R91W	I8 7V
R10 6W	G114A ?	S113F	D96E
R106Q	Y120D ?	R115H	T99S
R106L	D121G ?	Q128E	E102Q
L108H	V122M ?	A140G	Y120F
R111G	N126S ?	K144R	Q128N/E
L124F	G129V ?	D147E/N	113 9M
P127L	R133H/G ?	T160S	E143Q
Q128P	E137G c<s apenas	K171N	S149I
A131D	A140V ?s + rfs	P172L	L150T
R133C	Y141C ?	P173A	QI 70K
R133P	D151G ?		Kl 71R
R133L	P152A ?s + c<s		Pl 72Q

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S134C	F155C ?
S134F	D156G ?
S134P	T160S ?s + <?s
K135E	G161E/W
L138S	P172S <?s apenas
P152R
F155S
D156E
D15 6A
F157L
F157I
T158M
T158A
G161V

[0041] As tabelas 1 e 2 também listam alterações que não têm associação conhecida com um distúrbio relacionado ao

MECP2 e, portanto, que são consideradas benignas. Assim, o especialista compreenderá que tais alterações aparentemente benignas podem opcionalmente ser incluídas nos polipeptídeos sintéticos da invenção.

[0042] Tabela 2: Alterações de aminoácidos prejudiciais e benignas no NID. De acordo com a convenção, todos os números de aminoácidos fornecidos a seguir se referem às isoformas e2 de humanos e camundongos. * aqueles encontrados em homens hemozigotos estão em negrito e os em mulheres heterozigotos estão em itálico; ** aqueles

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25/125 encontrados no camundongo estão em negrito e os encontrados em vertebrados não mamíferos são fornecidos em itálico.

Alterações prejudiciais associadas a:	Alterações benignas presentes em:
RTT¹³clássico	RTT atípico ou outra deficiência intelectual¹³	População geral¹⁴*	Presente em outras espécies [vertebrados]
P302T	K286R ?	P272L	G213S/A
P302S	V300I ?	A278T/V	5214 A
P302H	I303M ?	A279S/P	V275A/L
P302L	K304E/R ?	A291T	1727 6A
P302R	R309W ?s + c<s	A287V/P	A218I
K305R	T311M ?	V288M	A279L
K305T		R294Q/P//G	A280T
R306C		S295T	A281E
R306H		T311A	E282A
			A288I/L
			12 93A
			R294K
			S295P
			V296L
			Q297H (camundongo)/L
			T299R
			V300A
			V312I/L

[0043] A atividade biológica dos domínios MBD e NID que é de particular interesse para a invenção é a capacidade de recrutar membros do complexo co-repressor NCoR/SMRT para o DNA metilado. Portanto, é preferido que os polipeptídeos sintéticos da invenção sejam capazes de recrutar componentes

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26/125 do complexo co-repressor NCoR/SMRT para o DNA metilado. Os componentes do complexo co-repressor NCoR/SMRT incluem NCoR, HDAC3, SIN3A, GPS2, SMRT, TBL1X e TBLR1. Preferencialmente, os polipeptídeos sintéticos são capazes de recrutar TBL1X ou TBLR1 para DNA metilado.

[0044] Os inventores identificaram os domínios MBD e NID como sendo a chave para a atividade necessária da MeCP2 terapêutica, a fim de compensar a atividade reduzida da MeCP2 na síndrome de Rett e distúrbios relacionados. Portanto, embora seja necessário que os domínios MBD e NID sejam biologicamente ativos nos polipeptídeos sintéticos da invenção, as sequências de aminoácidos em outras partes da proteína MeCP2 do tipo selvagem podem ser alteradas, por exemplo, por deleção de aminoácidos. Assim, os polipeptídeos sintéticos da invenção podem ter uma deleção de pelo menos 50 aminoácidos quando comparados com as sequências MeCP2 el e e2 humanas de comprimento total (SEQ ID NOs 3 e 4) . A referida deleção de pelo menos 50 aminoácidos pode ser uma deleção de pelo menos 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 ou 300 aminoácidos quando comparada às sequências MeCP2 el e e2 humana de comprimento total (SEQ ID NOs 3 e 4) . De preferência, a referida deleção é de pelo menos 200 aminoácidos quando comparada com as sequências MeCP2 el e e2 humanas de comprimento total (SEQ ID NOs 3 e 4) . Essa deleção de pelo menos 50 aminoácidos pode ser

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27/125 avaliada através da preparação de um alinhamento (ver acima) da sequência de aminoácidos de interesse com as sequências MeCP2 el e e2 humanas (SEQ ID NOs 3 e 4). Isso identificará quaisquer regiões nas quais os resíduos de aminoácidos nas sequências de MeCP2 foram excluídos porque haverá lacunas na sequência de interesse alinhadas às sequências de MeCP2 el e e2 (SEQ ID NOs 3 e 4) . De preferência, pelo menos alguns dos aminoácidos que foram excluídos serão consecutivos dentro da sequência MeCP2, de modo que a referida deleção de pelo menos 50 aminoácidos inclua a deleção de pelo menos 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ou mais aminoácidos consecutivos nas sequências MeCP2 el e e2 (SEQ ID NOs 3 e 4) . A deleção dos pelo menos 50 aminoácidos será aparente a partir do alinhamento com as sequências el e e2, portanto, qualquer deleção que esteja presente na região N-terminal do MeCP2 e que esteja associada apenas a uma das sequências el e e2, não deve ser considerada uma deleção a ser contada como parte dos pelo menos 50 aminoácidos consecutivos excluídos de acordo com a invenção. No entanto, uma deleção que está presente na região N-terminal do MeCP2 e que está presente nos alinhamentos das sequências el e e2 deve ser considerada uma deleção e contada como parte dos pelo menos 50 aminoácidos deletados de acordo com a invenção.

[0045] Os aminoácidos deletados das sequências MeCP2 el e e2 do tipo selvagem podem ser substituídos por alguma

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28/125 outra sequência de aminoácidos útil. Por exemplo, uma deleção de pelo menos 50 aminoácidos pode ter ocorrido quando comparada às sequências MeCP2 el e e2 humanas de comprimento total (SEQ ID NOs 3 e 4), mas esses aminoácidos excluídos podem ter sido substituídos, pelo menos em parte, com a sequência de aminoácidos fornecendo um ligante, um marcador e/ou um peptídeo sinalizador. Isso pode ser identificado em um alinhamento do polipeptídeo sintético com as sequências MeCP2 el e e2 por um trecho da sequência de aminoácidos no polipeptídeo sintético que não corresponde à sequência MeCP2 e em que esse trecho da sequência de aminoácidos não correspondida corresponde a uma sequência heteróloga útil ou intencional. Assim, a invenção fornece, em pelo menos algumas modalidades, polipeptídeos sintéticos que possuem atividade MeCP2 associada às sequências MBD e NID, mas que também podem incluir sequências heterólogas úteis sem exigir que os polipeptídeos sintéticos sejam maiores que a proteína MeCP2 do tipo selvagem; uma vez que grande parte da sequência de MeCP2 pode ser deixada de fora dos polipeptídeos sintéticos da invenção, a (s) sequência (s) heteróloga (s) pode ser incluída enquanto se mantém um tamanho geral relativamente pequeno para o polipeptídeo sintético.

[0046] Como alternativa à deleção acima mencionada de pelo menos 50 aminoácidos, ou em adição a ela, o polipeptídeo sintético da invenção possuindo as sequências

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29/125 de aminoácidos MBD e NID pode ter alterações nas sequências de aminoácidos polipeptídicas, de modo que tenha menos de 90% de identidade para as sequências de aminoácidos de MeCP2, como representadas nas SEQ ID NOs: 3 e 4, ao longo de todo o comprimento das sequências de aminoácidos de MeCP2, como representadas nas SEQ ID NOs: 3 e 4. Os referidos menos de 90% de identidade serão aparentes a partir da comparação com as sequências el e e2, portanto, tal identidade é apenas devido a alterações na região N-terminal do MeCP2, que estão associadas apenas a uma das sequências el e e2, não será considerada como o polipeptídeo sintético com identidade inferior a 90% de acordo com a invenção. De preferência, a referida identidade será inferior a 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60% ou 55%. É particularmente preferido que a referida identidade seja inferior a 60%.

[0047] Os polipeptídeos sintéticos da invenção geralmente têm a estrutura: A-B-C-D-E [0048] em que a porção B do polipeptídeo sintético é a sequência de aminoácidos MBD, como descrito acima, e a porção D do polipeptídeo sintético é a referida sequência de aminoácidos NID, como descrito acima. Como explicado acima, no entanto, partes do polipeptídeo sintético que não os domínios MBD e NID, isto é, as porções A, C e D, podem ter alterações em comparação com a sequência MeCP2 do tipo

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30/125 selvagem. Assim, o polipeptídeo sintético pode incluir alterações de acordo com um ou mais dos seguintes itens: a porção A do polipeptídeo sintético tem menos de 40 aminoácidos e/ou tem menos de 95% de identidade com as sequências de aminoácidos, conforme representado nas SEQ ID NOs: 5 e 6, calculados ao longo de todo o comprimento das sequências de aminoácidos, como representado nas SEQ ID NOs: 5 e 6; a porção C do polipeptídeo sintético tem menos de 20 aminoácidos e/ou tem menos de 95% de identidade com a sequência de aminoácidos, como representado na SEQ ID NO: 7, calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos, como representado em SEQ ID NO: 7; e a porção E do polipeptídeo sintético está ausente, é um marcador de proteína e/ou tem menos de 95% de identidade com a sequência de aminoácidos, como representado na SEQ ID NO: 8, calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos, como representado em SEQ ID NO: 8.

[0049] A porção A do polipeptídeo sintético, correspondente à porção N-terminal do polipeptídeo e à área adjacente à extremidade amino da sequência de aminoácidos MBD, quando a sequência de aminoácidos MBD é N-terminal da sequência de aminoácidos NID, pode ser menos de 40 aminoácidos, de preferência menos de 35, 30, 25 ou 20 aminoácidos. É particularmente preferido que a porção A seja inferior a 25 aminoácidos. Adicionalmente ou

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31/125 alternativamente, a porção A pode ter menos de 95% de identidade com as sequências de aminoácidos como representadas nas SEQ ID NOs: 5 e 6, calculadas ao longo de todo o comprimento das sequências de aminoácidos como representadas nas SEQ ID NOs: 5 e 6; de preferência, a identidade é inferior a 90%, inferior a 85%, inferior a 80%, inferior a 75%, inferior a 70%, inferior a 65%, inferior a 60% ou inferior a 50%. De preferência, a porção A é truncada em comparação com as sequências naturais de MeCP2 el e e2, de modo que a porção A tenha menos de 72 aminoácidos de comprimento, de preferência menos de 70, 65, 50, 55, 45, 30 ou 25 aminoácidos. Além disso, de preferência, a porção A será truncada de tal maneira que as SEQ ID NOs: 5 e 6 não estejam essencialmente presentes. Por exemplo, as SEQ ID NOs: 5 e 6 podem ter sido excluídas da sequência de aminoácidos do polipeptídeo sintético e opcionalmente substituídas por uma marcação N-terminal.

[0050] Assim, as sequências de aminoácidos específicas para el e e2, que possuem 24 aminoácidos de comprimento no el humano (29 aminoácidos de comprimento no camundongo el) e 9 aminoácidos de comprimento no e2 (humano/camundongo) e codificadas pelos éxons 1 e 2 e os 10 primeiros pares de bases do éxon 3 de MECP2 e Mecp2, podem ser incluídos nos polipeptídeos sintéticos da invenção e, por exemplo, podem fornecer a sequência de aminoácidos mais

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N-terminal do polipeptídeo sintético. A sequência de aminoácidos N- terminal específica de el de camundongo é MAAAAATAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEK (SEQ ID NO: 9) . A sequência de aminoácidos N-terminal específica de e2 de camundongo é MVAGMLGLREEK (SEQ ID NO: 10). A sequência de aminoácidos Nterminal específica de el humana é MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEK (SEQ ID NO: 11) . A sequência de aminoácidos N-terminal específica de e2 humana é MVAGMLGLREEK (SEQ ID NO: 12) . Portanto, um polipeptídeo sintético da invenção pode compreender uma sequência de aminoácidos correspondente a qualquer uma das SEQ ID NOs 9 a 12, e opcionalmente a referida sequência de aminoácidos pode ser a sequência mais N-terminal no polipeptídeo sintético da invenção.

[0051] De preferência, contudo, estas sequências Nterminais extremas específicas para MeCP2 el e e2 do tipo selvagem não serão incluídas nos polipeptídeos sintéticos da invenção. Portanto, preferencialmente, um polipeptídeo sintético da invenção não compreenderá uma sequência de aminoácidos correspondente a qualquer uma das SEQ ID NOs 9 a 12.

[0052] Preferencialmente, a sequência de aminoácidos adjacente à extremidade amino da sequência de aminoácidos MBD tem menos de 75% de identidade com as sequências de aminoácidos, como representado nas SEQ ID NOs: 5 e 6, calculadas ao longo de todo o comprimento das sequências de

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33/125 aminoácidos, como representado nas SEQ ID NOs: 5 e 6, preferencialmente, inferiores a 50%, e ainda preferencialmente, inferiores a 30% de identidade.

[0053] De preferência, a sequência de aminoácidos adjacente à extremidade amino da sequência de aminoácidos MBD tem menos de 50 aminoácidos de comprimento, preferencialmente menos de 30 aminoácidos de comprimento ou menos de 20 aminoácidos de comprimento e, ainda mais preferencialmente, menos de 10 aminoácidos de comprimento. A porção C do polipeptídeo sintético, que corresponde à sequência de aminoácidos entre as sequências de aminoácidos MBD e NID, pode ser menor que 20 aminoácidos, preferencialmente menor que 15, 10 ou 5 aminoácidos. Adicionalmente ou alternativamente, a porção C pode ter menos de 95% de identidade com a sequência de aminoácidos, como representado na SEQ ID NO: 7; de preferência, a identidade é inferior a 90%, inferior a 85%, inferior a 80%, inferior a 75%, inferior a 70%, inferior a 65%, inferior a 60%, inferior a 50% ou inferior a 30%. De preferência, a porção C é truncada em comparação com a sequência natural de MeCP2, de modo que a porção C tenha menos de 98 aminoácidos, de preferência menos de 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 ou 15 aminoácidos de comprimento. Preferencialmente, a sequência de aminoácidos entre as sequências de aminoácidos MBD e NID tem menos de 50

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34/125 aminoácidos de comprimento, preferencialmente menos de 30 aminoácidos de comprimento e ainda mais preferencialmente menos de 20 aminoácidos de comprimento.

[0054] Um benefício adicional às deleções na porção C do polipeptídeo sintético, isto é, a sequência de aminoácidos entre as sequências MBD e NID, é que os inventores descobriram que as deleções nessa porção podem tornar o polipeptídeo sintético menos estável. Surpreendentemente, os inventores descobriram que essa estabilidade reduzida pode ser benéfica para a utilidade do polipeptídeo sintético no cenário clínico, porque pode reduzir a chance de super expressão do polipeptídeo sintético. Portanto, em algumas modalidades, é particularmente preferido que exista uma deleção significativa na sequência de aminoácidos entre as sequências de aminoácidos MBD e NID, por exemplo, a porção C da estrutura genérica acima mencionada, por exemplo, uma deleção de pelo menos 10, 15, 20, 30, 40 ou 50 aminoácidos. De preferência, a substituição ou deleção significativa dos aminoácidos incluirá substituição ou deleção significativa da região da posição 207 para a posição 271 da sequência de polipeptídeo MeCP2 do tipo selvagem humano de comprimento total (isoforma e2) como mostrado na SEQ ID NO: 4.

[0055] A porção E do polipeptídeo sintético, que corresponde à porção C-terminal do polipeptídeo e à área

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35/125 adjacente à extremidade carboxi da sequência de aminoácidos NID, quando a sequência de aminoácidos MBD é N-terminal à sequência de aminoácidos NID, pode ser ausente, de modo que a extremidade carboxi da sequência de aminoácidos do NID corresponda ao C-terminal do polipeptídeo sintético. Alternativamente, a porção E pode compreender uma marcação de proteína, por exemplo, de modo que a porção E possa ser usada para isolar ou monitorar/detectar o polipeptídeo sintético.

[0056] Adicional ou alternativamente, a porção E pode ter menos de 95% de identidade com a sequência de aminoácidos fornecida na SEQ ID NO: 8, calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos, como representado na SEQ ID NO: 8; de preferência, a identidade é inferior a 90%, inferior a 85%, inferior a 80%, inferior a 75%, inferior a 70%, inferior a 65%, inferior a 60% ou inferior a 50%. Assim, a porção E pode compreender uma deleção de todos ou de uma parte significativa dos aminoácidos nas posições 313 a 486 de MeCP2 (SEQ ID NO: 4), opcionalmente com a substituição da sequência excluída por uma marcação, e ainda mais opcionalmente com um ligante anexando a marcação para o polipeptídeo sintético.

[0057] De preferência, a sequência de aminoácidos adjacente à extremidade carboxi da sequência de aminoácidos do NID possui menos de 75% de identidade com a sequência de

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36/125 aminoácidos, como representada na SEQ ID NO: 8, calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos, como representada na SEQ ID NO: 8, preferencialmente inferior a 50%, e ainda preferencialmente inferior a 30% de identidade.

[0058] Preferencialmente, a sequência de aminoácidos adjacente à extremidade carboxi da sequência de aminoácidos NID tem menos de 50 aminoácidos de comprimento, preferencialmente menos de 30 aminoácidos de comprimento ou menos de 20 aminoácidos de comprimento, e ainda preferencialmente não há sequência de aminoácidos adjacente à extremidade carboxi da sequência de aminoácidos NID, de modo que a extremidade carboxi da sequência de aminoácidos NID corresponda ao C-terminal do polipeptídeo sintético.

[0059] O marcador que faz parte da porção E dos polipeptídeos sintéticos da invenção pode ser para monitoramento ou detecção do polipeptídeo sintético ou para permitir a regulação pós-tradução do polipeptídeo sintético, como explicado mais adiante. Exemplos de marcadores adequados para detecção ou monitoramento do polipeptídeo são conhecidos na técnica e incluem um marcador de polihistidina, um marcador FLAG, um marcador Myc e um marcador proteico fluorescente, tal como a proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP).

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37/125 [0060] De preferência, os polipeptídeos sintéticos da invenção têm menos de 90% de identidade em todo o comprimento das sequências de aminoácidos de MeCP2, como representado nas SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, de preferência menos de 80% de identidade, menos de 70% identidade, ou menos de 60% de identidade, e ainda mais preferencialmente, menos de 40% de identidade.

[0061] O termo identidade se refere à extensão em que duas sequências de aminoácidos têm os mesmos resíduos nas mesmas posições em um alinhamento. O percentual de identidade como aqui utilizada é calculada ao longo do comprimento de uma sequência comparativa aqui divulgada, por exemplo, uma das SEQ ID NOs: 3 a 8, como aqui descrito. Assim, todos os resíduos nessa sequência comparativa devem ser alinhados com a sequência de interesse, e quaisquer lacunas criadas durante o alinhamento da sequência de interesse com o comprimento total da sequência comparativa devem ser levadas em consideração ao calcular o percentual de identidade, incluindo quando lacunas ocorrem em cada extremidade da sequência de interesse no alinhamento. No entanto, qualquer sequência final adicional na sequência de interesse que se alinhe após o final da sequência

comparativa, ou seja,	que	não	se	alinhe como	tal com	a
sequência	comparativa,	mas	que	se	sobreponha ao final	da
sequência	comparativa,	não	deve	ser	incluída ao	calcular	o

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38/125 percentual de identidade. Assim, ao calcular o percentual de identidade, a pontuação da identidade será dividida pelo comprimento da sequência comparativa, incluindo quaisquer lacunas que foram inseridas na sequência comparativa como resultado do alinhamento ideal com a sequência de interesse e multiplicadas por 100.

[0062] Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Nat. Acad Sci. USA 85: 2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73: 23744, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls in the Biosciences 8, 155-65, 1992; e Pearson et al., Meth Mol. Bio. 24: 307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990, apresenta uma consideração detalhada dos métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homologia. Existem programas prontamente disponíveis que permitem a preparação de alinhamentos de sequência e o cálculo do percentual de identidade, como o programa GAP, executado sob GGG (Genetics Computer Group Inc., Madison, WI, EUA).

[0063] Outras variantes dos polipeptídeos sintéticos da invenção podem ser, por exemplo, variantes funcionais,

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39/125 tais como sais, amidas, ésteres e, especificamente, ésteres C- terminais e derivados de N-acil. Também estão incluídos peptídeos que são modificados in vivo o u in vitro, por exemplo, por glicosilação, amidação, carboxilação ou fosforilação.

[0064] Um benefício da invenção é que, ao identificar as sequências MBD e NID como sendo essenciais para a atividade de MeCP2 que é deficiente na sindrome de Rett, os inventores identificaram que porções significativas de outras seções da proteína MeCP2 podem ser removidas ao preparar uma proteína sintética para uso no tratamento ou prevenção de um distúrbio tal como a sindrome de Rett. Portanto, a invenção fornece polipeptideos sintéticos que são formas truncadas de MeCP2, compreendendo sequências MBD e NID, mas carecendo de uma ou mais seções das sequências de aminoácidos adjacentes à extremidade amino da sequência de aminoácidos MBD (por exemplo, na porção A), entre o MBD e as sequências de aminoácidos NID (por exemplo, na porção C) e adjacentes à extremidade carboxi da sequência de aminoácidos NID (por exemplo, na porção E), quando comparadas às sequências MeCP2 el e e2 humanas de comprimento total (SEQ ID NOs 3 e 4). De preferência, um polipeptídeo sintético da invenção terá menos aminoácidos que a proteína MeCP2 do tipo selvagem, por exemplo, um polipeptídeo sintético da invenção pode consistir em menos de 430 aminoácidos,

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40/125 preferencialmente menos que 400, 350, 320, 270 ou 200 aminoácidos e ainda mais preferencialmente menos de 180 aminoácidos.

[0065] Os polipeptídeos sintéticos da invenção podem compreender adequadamente um peptídeo de sinal, por exemplo, um sinal de localização nuclear. Um sinal de localização nuclear pode ter como alvo um polipeptídeo para importação para dentro do núcleo celular por transporte nuclear. Os sinais de localização nuclear adequados são conhecidos na técnica e incluem o sinal de localização nuclear SV40 e o NLS da proteína MeCP2 nativa (aminoácidos 253 a 271 da SEQ ID NO: 4) . O NLS pode estar situado em qualquer parte do polipeptídeo, mas preferencialmente estará situado na sequência de aminoácidos que liga o MBD ao NID.

[0066] Os polipeptídeos sintéticos da invenção podem adequadamente compreender um peptídeo de penetração celular (CPP) . Os CPPs, também chamados de domínios de transdução de proteínas, consistem em sequências curtas de 8 a 30 aminoácidos de comprimento que podem facilitar a entrada de moléculas nas células¹⁵. O CPP pode ser sintético, projetado especificamente para o direcionamento de moléculas terapêuticas ou de ocorrência natural. De preferência, o CPP facilitará a entrada nas células neuronals. Um CPP preferido para utilização com os polipeptídeos sintéticos da invenção é o CPP do transativador da proteína de transcrição, Tat.

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41/125 [0067] Os polipeptídeos sintéticos da invenção podem adequadamente compreender um marcador. Tais marcadores são bem conhecidos na técnica e podem ser úteis para purificação de polipeptídeos, detecção/monitoramento e/ou regulação póstradução. Exemplos de marcadores adequados úteis na purificação ou detecção de um polipeptídeo são conhecidos na técnica e incluem um marcador de poli-histidina, um marcador FLAG, um marcador Myc e um marcador de proteína fluorescente, tal como a proteína verde fluorescente aprimorada (EGFP).

[0068] Um marcador pode ser usado para regulação póstradução de um polipeptídeo, por exemplo, fornecendo a capacidade de controlar a degradação pós-tradução do polipeptídeo. Exemplos de marcadores adequados que podem ser utilizados com polipeptídeos sintéticos da invenção para permitir tal controle da degradação pós-tradução incluem um marcador SMASh e um Domínio de Desestabilização (DD) de FKBP12. O marcador SMASh tem aproximadamente 300 aminoácidos de comprimento e compreende um sítio de divagem de protease seguido pela protease, seguida por um marcador degron. O marcador SMASh é fundido na proteína de interesse (BOI) com o sítio de divagem da protease e a protease entre o POI e o marcador degron. Isso pode estar em qualquer um dos terminais do POI. Normalmente, a protease auto-cliva o sítio da protease, removendo o marcador degron para que a proteína não seja degradada. No entanto, o tratamento com um

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42/125 medicamento como o Asunaprevir pode inibir a protease, o que impede a remoção do marcador degron e, portanto, resulta na degradação do POI anexado. Uma vez que a administração de Asunaprevir tem um efeito dependente da dose na degradação do POI, o uso de um marcador SMASh com o Asunaprevir pode permitir a regulação pós-tradução da guantidade do POI.

[0069] Da mesma forma, o DD-FKBP12 tem aproximadamente 110 aminoácidos de comprimento e desestabiliza o POI ao qual está ligado. Ele pode ser fundido a qualquer um dos terminais do POI, mas é preferencialmente ligado ao N-terminal, pois é geralmente mais eficaz. A proteína de fusão produzida será, portanto, geralmente instável, mas pode ser protegida pela administração de uma molécula chamada Shield-1. A administração de Shield-1 tem um efeito dependente da dose na prevenção da degradação do POI.

[0070] A pessoa habilitada compreenderá que pode não ser desejável incluir certos tipos de marcadores, particularmente aqueles usados para purificação ou detecção durante a síntese de polipeptídeos, tal como Myc ou EGFP, no polipeptídeo terapêutico final que é entregue a um indivíduo, pois os marcadores podem ser imunogênicos ou ativos de maneira indesejável. Portanto, os marcadores incluídos nos polipeptídeos sintéticos da invenção podem ser removíveis, por exemplo, por agentes químicos ou meios enzimáticos, tal

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43/125 como proteólise ou splicing de interinas; isso pode permitir o uso do marcador durante a preparação de um polipeptídeo sintético seguido pela remoção do marcador antes que o polipeptídeo seja introduzido em um animal para tratamentos de acordo com usos terapêuticos (por exemplo, terapia de reposição de proteínas) aqui divulgados.

[0071] Os polipeptídeos sintéticos da invenção podem compreender uma sequência ligante, por exemplo, para vincular a sequência MBD à sequência NID, no lugar da sequência natural que vincula essas duas sequências no MeCP2, ou como um meio de anexar ou inserir um marcador, CPP ou NLS para um polipeptídeo sintético da invenção. A concepção e utilização de tais ligantes são bem conhecidas na técnica. Um ligante adequado pode compreender entre 4 e 15 aminoácidos, preferencialmente entre 6 e 10 aminoácidos. De preferência, o ligante consistirá em glicina, serina ou uma combinação de glicina e serina.

[0072] De preferência, as sequências de polipeptídeos sintéticas da invenção mostrarão pelo menos 80% de similaridade com uma ou mais das sequências ΔΝΟ (SEQ ID NO: 13), ΔΝΙΟ (SEQ ID NO: 14), ΔΝ de camundongo (SEQ ID NO: 15), ΔΝΟ de camundongo (SEQ ID NO: 16) e ΔΝΙΟ de camundongo (SEQ ID NO: 17), de preferência pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de similaridade. Opcionalmente, como divulgado acima, as

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44/125 sequências polipeptídicas sintéticas da invenção podem compreender uma sequência específica el ou e2, preferencialmente no N- terminal do polipeptídeo sintético. Assim, preferencialmente, as sequências polipeptídicas sintéticas da invenção mostrarão pelo menos 80% de similaridade com uma sequência que consiste em uma ou mais das sequências: ΔΝΟ (SEQ ID NO: 13); ΔΝΙΟ (SEQ ID NO: 14); ΔΝ de camundongo (SEQ ID NO: 15); ΔΝΟ de camundongo (SEQ ID NO: 16) ; e ΔΝΙΟ de camundongo (SEQ ID NO: 17) e uma das sequências específicas el ou e2 (SEQ ID NOs: 9 a 12) no Nterminal da sequência e, de preferência, pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de similaridade. Além disso, de preferência as sequências polipeptídicas sintéticas da invenção podem compreender ou consistir na sequência ΔΝΟ (SEQ ID NO: 13), ΔΝΙΟ (SEQ ID NO: 14), ΔΝ de camundongo (SEQ ID NO: 15), ΔΝΟ de camundongo (SEQ ID NO: 16), ΔΝΙΟ de camundongo (SEQ ID NO: 17) ou uma das sequências ΔΝΟ (SEQ ID NO: 13), ΔΝΙΟ (SEQ ID NO: 14), ΔΝ de camundongo (SEQ ID NO: 15), ΔΝΟ de camundongo (SEQ ID NO: 16), ΔΝΙΟ de camundongo (SEQ ID NO: 17), com uma das sequências específicas el ou e2 (SEQ ID NOs: 9 a 12) no Nterminal da sequência. ΔΝΟ (SEQ ID NO: 13), ΔΝ de camundongo (SEQ ID NO: 15) e ΔΝΟ de camundongo (SEQ ID NO: 16) incluem a sequência NLS de MeCP2 do tipo selvagem. ΔΝΙΟ (SEQ ID NO:

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14) e ANIC de camundongo (SEQ ID NO: 17) incluem a sequência NLS SV40.

[0073] É particularmente preferido que as sequências polipeptidicas sintéticas da invenção apresentem pelo menos 80% de similaridade com uma sequência que consiste em ANIC (SEQ ID NO: 14) e uma sequência especifica el ou e2 humana (SEQ ID NOs: 11 e 12) imediatamente adjacente ao N-terminal de ANIC (SEQ ID NO: 14), de preferência pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de similaridade. Além disso, de preferência as sequências polipeptidicas sintéticas da invenção podem compreender ou consistir em ANIC (SEQ ID NO: 14), opcionalmente com uma sequência especifica el ou e2 humana (SEQ ID NOs: 11 e 12) imediatamente adjacente ao N-terminal de ANIC (SEQ ID NO: 14) . Os polipeptídeos sintéticos da invenção podem ser utilizados no tratamento ou prevenção de um distúrbio neurológico associado à mutação inativadora de MECP2, por exemplo, sindrome de Rett, como explicado mais adiante.

Construtos de Ácidos Nucléicos, Vetores de Expressão, Virions e Células [0074] A invenção fornece construtos de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo sintético da invenção e vetores de expressão compreendendo uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptídeo sintético da invenção. O vetor de expressão pode ser um vetor viral e,

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46/125 portanto, a invenção também fornece um virion compreendendo um vetor de expressão de acordo com a invenção. A invenção também fornece células que compreendem um construto genético sintético adaptado para expressar um polipeptídeo da invenção, células compreendendo um vetor da invenção e células para a produção de um virion da invenção.

[0075] Os construtos de ácido nucleico e/ou vetores de expressão compreendem adequadamente pelo menos uma sequência de controle de expressão operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo sintético da invenção, para conduzir a expressão do polipeptídeo sintético. Sequências de controle de expressão são sequências nucleotídicas localizadas a montante (sequências 5' não codificantes), dentro ou a jusante (sequências 3' não codificantes) de uma sequência codificante e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade do RNA ou tradução da sequência de codificação associada. As sequências de controle de expressão incluem intensificadores, promotores, sequências líderes de tradução, introns e sequências de sinais de poliadenilação. Eles incluem sequências naturais e sintéticas, bem como sequências que podem ser uma combinação de sequências sintéticas e naturais. Como é observado aqui, o termo sequências de controle de expressão não está limitado a promotores. No entanto, algumas sequências de

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47/125 controle de expressão adequadas úteis na presente invenção incluirão, mas não estão limitadas a promotores constitutivos, promotores específicos de tecidos, promotores específicos de desenvolvimento, promotores reguláveis e promotores virais.

[0076] Tais sequências de controle de expressão geralmente compreendem uma sequência promotora e sequências adicionais que regulam a transcrição e tradução e/ou aumentam os níveis de expressão. As sequências de controle de expressão adequadas são bem conhecidas na técnica e incluem promotor eucariótico, procariótico ou viral ou sinal poliA. O controle da expressão e outras sequências variarão, é claro, dependendo da célula hospedeira selecionada ou podem ser induzidas. Exemplos de promotores úteis são o promotor SV-40 (Science 1983, 222: 524-527), o promotor de metalotioneína (Nature 1982, 296: 39-42), o promotor de choque térmico (Voellmy et al. , PNAS USA 1985, 82: 49494953), o promotor PRV gX (Mettenleiter e Rauh, J. Virol. Methods 1990, 30: 55-66), o promotor humano CMV IE (US 5.168.062), o promotor LTR do vírus Rous Sarcoma (Gorman et al., PNAS USA 1982, 79: 6777-6781), ou promotor de fator 1 de alongamento humano alfa ou ubiquitina. Sequências de controle adequadas para conduzir a expressão em animais, por exemplo, humanos, são bem conhecidos na técnica. As sequências de controle de expressão podem direcionar

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48/125 expressão ubíqua ou expressão específica de tecido ou célula. A sequência de controle de expressão pode compreender, por exemplo, um promotor viral ou humano. Um promotor adequado pode ser ubíquo (por exemplo, o promotor CAG), restrito a tecido ou específico de tecido. Por exemplo, o promotor NESTIN pode direcionar a expressão no CNS e os promotores TAU e SYNAPSIN podem direcionar a expressão nos neurônios. Preferencialmente, o promotor será para expressão da sequência nucleotídica em células neuronals, por exemplo, o promotor MECP2 ou Mecp2. Muitas sequências de controle adequadas são conhecidas na técnica, e seria rotina para o especialista selecionar sequências adequadas para o sistema de expressão que está sendo usado.

[0077] A expressão do MECP2 é fortemente controlada em animais. Portanto, onde construtos de ácido nucleico e vetores de expressão da invenção devem ser utilizados para a expressão dos polipeptídeos sintéticos da invenção em um animal, por exemplo em terapia gênica, é preferível que a referida expressão seja específica para células neurais, particularmente células neurais do cérebro e o SNC. Isso pode ser realizado, por exemplo, através do direcionamento específico dos construtos de ácidos nucleicos e vetores de expressão para o cérebro e/ou células neurais, através do uso de veículos de entrega, tais como virions de AAV, e/ou vias de administração específicas, tal como pela

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49/125 administração diretamente ao CNS. Adicionalmente ou alternativamente, a referida expressão específica de neurônio pode ser realizada pelo uso de sequências de controle de expressão nos construtos de ácido nucleico e/ou vetores de expressão que limitam substancialmente a expressão do polipeptídeo sintético às células neurais. Preferencialmente, essas sequências de controle de expressão serão selecionadas a partir das sequências de controle de expressão usadas para controlar a expressão natural do gene MECP2.

[0078] O gene MECP2 contém um 3'UTR notavelmente grande e altamente conservado, no qual foram identificados melhoradores, silenciadores e muitos sítios de ligação ao miRNA. Da mesma forma, a região promotora do gene MECP2 também é muito grande e inclui silenciador, elemento regulador e sequências promotoras. Portanto, preferencialmente, os vetores de expressão e/ou construtos de ácidos nucleicos da invenção incluirão um ou mais dos elementos da sequência de controle de expressão do MECP2 3'UTR. Por exemplo, a terapia gênica é aqui divulgada que utilizava um cassete de expressão que incluía um elemento promotor do núcleo a montante do gene Mecp2, e sítios de ligação a microRNA a jusante (miR) e um elemento rico em AU. Portanto, um vetor de expressão e/ou construto de ácido nucleico da invenção compreenderá preferencialmente um ou

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50/125 mais elementos selecionados a partir de: uma sequência promotora de núcleo MECP2 ou Mecp2 a montante (ver, por exemplo, nucleotídeos 200 a 329, inclusive, da SEQ ID NO: 65); um ou mais sítios de ligação a miR a jusante do MECP2 ou Mecp2 3'UTR; e um elemento rico em AU do MECP2 ou Mecp2 3'UTR. Além disso, de preferência os um ou mais sítios de ligação a miR a jusante do MECP2 ou Mecp2 3'UTR compreenderão um ou mais, ou todos os seguintes sítios de ligação a miR: um sítio de ligação para mir-22 (nucleotídeos 1166 a 1195, inclusive, de SEQ ID NO: 65), um sítio de ligação para mir19 (nucleotídeos 1196 a 1224, inclusive, da SEQ ID NO: 65), um sítio de ligação para mir-132 (nucleotídeos 1225 a 1252, inclusive, da SEQ ID NO: 65) e um sítio de ligação para mir124 (nucleotídeos 1318 a 1324, inclusive, da SEQ ID NO: 65).

[0079] De preferência, o vetor de expressão e/ou o construto de ácido nucleico da invenção pode compreender um elemento regulador do CNS a montante de Mecp2 ou MECP2 (ver, por exemplo, nucleotídeos 422 a 443, inclusive, da SEQ ID NO: 65) e/ou um silenciador de Mecp2 ou MECP2 a montante (ver, por exemplo, nucleotídeos 142 a 203, inclusive, da SEQ ID NO: 65).

[0080] É particularmente preferido que a região a montante do vetor de expressão e/ou construto de ácido nucleico da invenção compreenda a sequência mMeP426 (nucleotídeos 117 a 542 da SEQ ID NO: 65; veja a Figura 17B,

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C) e/ou que a região do vetor de expressão a jusante e/ou o construto de ácido nucleico da invenção compreenderá a sequência RDHlpA (nucleotideos 1166 a 1370 da SEQ ID NO: 65; ver Figura 17B, C).

[0081] Obviamente, o técnico especialista compreenderá que um ou mais outros elementos de sequência também podem ser desejáveis ou necessários em um vetor de expressão e/ou construto de ácido nucleico da invenção, tal como um sinal de iniciação de tradução, por exemplo, uma sequência de Kozak, um sinal de poliadenilação e sítios de ligação para componentes da maquinaria de poliadenilação, como CstF (fator de estimulação da clivagem).0 técnico especialista será capaz de projetar um vetor de expressão e/ou um construto de ácido nucleico de acordo com a invenção possuindo toda e qualquer uma dessas sequências bem conhecidas necessárias ou desejáveis.

[0082] A sequência de cDNA da isoforma de MECP2 el humano do tipo selvagem é aqui fornecida como SEQ ID NO: 18. A sequência de cDNA da isoforma de MECP2 el humano do tipo selvagem é aqui fornecida como SEQ ID NO: 21.

[0083] Adequadamente, o construto de ácido nucleico da invenção pode compreender uma sequência para codificar a sequência de cDNA de ΔΝΟ (SEQ ID NO: 19), ΔΝΙΟ (SEQ ID NO: 20), ΔΝ de camundongo (SEQ ID NO: 22), ΔΝΟ de camundongo (SEQ ID NO: 23) ou ΔΝΙΟ de camundongo (SEQ ID NO: 24). Como

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52/125 explicado acima, opcionalmente os polipeptídeos sintéticos da invenção podem compreender as sequências N-terminais de el ou de e2 específicas. A sequência de aminoácidos Nterminal específica do el de camundongo é codificada pela sequência de cDNA ATGGCCGCCGCTGCCGCCACCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAGCGGAGGAGGAGGAGG AGGCGAGGAGGAGAGACTGGAGGAAAAG (SEQ ID NO: 25) . A sequência de aminoácidos N-terminal específica de e2 de camundongo é codificada pela sequência de cDNA ATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCAGGGAGGAAAAGGGAGGAAAAG (SEQ ID NO: 26). A sequência de aminoácidos N-terminal específica de el humana é codificada pela sequência de cDNA ATGGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAGCGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG AGGAGGAGAGGGGGGGGAGAGACTGGAAGAAAAG (SEQ ID NO: 27) . A sequência de aminoácidos N-terminal específica de e2 humana é codificada pela sequência de cDNA ATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCAGGGAAGAAAAG (SEQ ID NO: 28). Portanto, o construto de ácido nucleico da invenção pode compreender uma sequência para codificar a sequência de cDNA de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 28.

[0084] Além disso, de preferência, o construto de ácido nucleico da invenção pode compreender uma sequência para codificar a sequência de cDNA da SEQ ID NO: 28 ou 29 imediatamente adjacente à sequência de cDNA de ANIC (SEQ ID NO: 20).

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53/125 [0085] Devido à degeneração do código genético, os polinucleotideos que codificam uma sequência de aminoácidos idêntica ou substancialmente idêntica podem utilizar diferentes códons específicos (por exemplo, substituições de bases sinônimas). Todos os polinucleotideos que codificam os polipeptídeos sintéticos como definido acima são considerados parte da invenção.

[0086] A invenção fornece um vetor de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo sintético da invenção. Tais vetores compreendem adequadamente um construto de ácido nucleico isolado ou sintético, como descrito acima.

[0087] Os vetores de acordo com a invenção são adequados para transformar uma célula hospedeira. Exemplos de vetores de clonagem adequados são vetores de plasmídeo como pBR322, os vários plasmídeos pUC, pEMBL e Bluescript ou vetores virais como HVT (Vírus do Herpes dos Perus), MDV (Vírus da Doença de Marek), ILT (Vírus da Laringotraqueíte Infecciosa), FAV (Adenovirus de Aves), FPV (FowlpoxVirus) ou NDV (Vírus da Doença de Newcastle) . pcDNA3.1 é um vetor particularmente preferido para expressão em células animais.

[0088] Após o polinucleotídeo ter sido clonado em um vetor apropriado, o construto pode ser transferido para a célula, bactéria ou levedura por meio de um método apropriado, tal como eletroporação, transfecção de CaC12 ou

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54/125 lipofectinas. Quando é utilizado um sistema de expressão de baculovírus, o vetor de transferência contendo o polinucleotídeo pode ser transfectado juntamente com um genoma completo do baculo.

[0089] Essas técnicas são bem conhecidas na técnica e os fabricantes de materiais biológicos moleculares (tal como Clontech, Stratagene, Promega e/ou Invitrogen) fornecem reagentes adequados e instruções sobre como usá-los. Além disso, existem vários livros de texto de referência padrão que fornecem mais informações sobre isso, por exemplo Rodríguez, R. L. e D. T. Denhardt, ed., Vetores: Uma pesquisa de vetores de clonagem molecular e seus usos, Butterworths, 1988; Current protocols in Molecular Biology, eds.: F.M. Ausubelet al., Wiley N.Y., 1995; Clonagem Molecular: um manual de laboratório, supra; e DNA Cloning, vol. 1-4, 2a edição 1995, eds.: Glover e Hames, Oxford University Press).

[0090] Detalhes das proteínas preferidas de acordo com a presente invenção para expressão através do vetor são descritos acima.

[0091] O vetor pode ser adaptado para fornecer expressão transitória em uma célula hospedeira ou expressão estável. A expressão estável pode ser alcançada, por exemplo, através da integração da sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo sintético no genoma da célula hospedeira.

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55/125 [0092] Os vetores virais adequados incluem vetores retrovirais (incluindo vetores lentivirais), vetores adenovirais, vetores virais adeno-associados (AAV) e vetores alfavirais. Preferencialmente, o vetor viral será um vetor AAV, tal como AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8 ou AAV9. De

preferência,	o vetor AAV	será um vetor AAV auto-complementar
(sc) .
[0093]	0 vetor	da presente invenção pode estar
presente em	um virion.	Assim, a presente invenção também

fornece um virion compreendendo um vetor de acordo com a presente invenção. De preferência, o virion e/ou o vetor viral serão para expressão em células do sistema nervoso central (SNC), tais como células neuronals. Assim, de preferência, um virion da invenção compreenderá um capsídeo e/ou repetições terminais invertidas (ITRs) de um ou mais de AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8 e AAV9. Preferencialmente, o AAV será um vetor AAV auto-complementar (sc). Mais preferencialmente, as proteínas ITR e capsídeo podem ser de diferentes sorotipos, por exemplo, as ITRs de AAV2 podem ser usadas com proteínas capsídicas de AAV9 para formar virions scAAV.

[0094] Os vetores de acordo com a presente invenção podem ser utilizados na transformação de células para expressão de uma proteína de acordo com a presente invenção. Isto pode ser feito em cultura de células para produzir

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56/125 proteína recombinante para a colheita, ou pode ser feito in vivo para entregar uma proteína de acordo com a presente invenção a um animal.

[0095] Assim, a presente invenção também fornece uma população de células na qual as células compreendem um construto genético sintético adaptado para expressar uma proteína de acordo com a presente invenção. A referida população de células pode estar presente em um sistema de cultura de células em um meio adequado para apoiar o crescimento celular.

[0096] As células podem ser eucarióticas ou procarióticas.

[0097] Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser clonados em qualquer sistema de expressão apropriado. Sistemas de expressão adequados incluem sistema de expressão bacteriana (por exemplo, Escherichia coli DH5a), um sistema de expressão viral (por exemplo, Baculovírus), um sistema de levedura (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae) ou células eucarióticas (por exemplo, COS-7, CHO, BHK, HeLa, HD11, DT40, CEF ou células HEK-293T). Está disponível comercialmente uma vasta gama de sistemas de expressão adequados. Tipicamente, o polinucleotídeo é clonado em um vetor apropriado sob controle de um promotor constitutivo ou induzível adequado e, em seguida, introduzido na célula hospedeira para expressão.

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57/125 [0098] Adequadamente, as células são células animais, mais preferencialmente são células de mamíferos e mais preferencialmente células humanas. Adequadamente, as células compreendem um vetor como estabelecido acima.

[0099] Preferencialmente, as células são adaptadas de modo a que a expressão da proteína de acordo com a presente invenção seja induzível.

[00100] É particularmente preferido que as células compreendam um vetor de expressão para expressar um polipeptídeo sintético da invenção, e a célula seja adequada ou adaptada para produzir um virion compreendendo um vetor de expressão da invenção. Assim, as células podem ser usadas para produzir virions para uso no tratamento de terapia gênica da síndrome de Rett e distúrbios relacionados. Preferencialmente, os virions compreenderão vetores AAV para expressar um polipeptídeo da invenção, e ainda preferencialmente os vetores AAV compreenderão AAV9 e/ou AAV2 .

[00101] As células hospedeiras adequadas para a produção de virions de AAV incluem microrganismos, células de leveduras, células de insetos e células de mamíferos, que podem ser ou foram utilizadas como receptores de uma molécula de DNA heteróloga. O termo inclui a descendência da célula original que foi transfectada. Assim, uma célula hospedeira como aqui utilizada geralmente se refere a uma

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58/125 célula que foi transfectada com uma sequência de DNA exógena. As células da linhagem celular humana estável, 293 (prontamente disponível através, por exemplo, da American Type Culture Collection sob o Número de Acesso ATCC CRL1573) podem ser usadas na prática da presente invenção. Em particular, a linhagem celular humana 293 é uma linhagem celular de rim embrionário humano que foi transformada com fragmentos de DNA do adenovirus tipo 5 e expressa os genes adenovirais Ela e Elb. A linhagem celular 293 é prontamente transfectada e fornece uma plataforma particularmente conveniente para produzir virions de AAV.

[00102] Adequadamente, para entrega in vivo, os virions da invenção, tais como os virions de AAV, podem ser formulados em composições farmacêuticas. Adequadamente, as composições farmacêuticas compreenderão material genético suficiente para produzir uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo sintético da invenção, isto é, uma quantidade suficiente para reduzir, melhorar ou prevenir os sintomas dos distúrbios associados à atividade reduzida de MeCP2, tal como a síndrome de Rett. As composições farmacêuticas também podem conter um excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais excipientes incluem qualquer agente farmacêutico que não induza a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição e que possa ser administrado sem toxicidade indevida.

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Excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a sorbitol, Tween80 e líquidos tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser incluídos nos mesmos, por exemplo, sais de ácidos minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e similares; e os sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e similares. Além disso, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, substâncias tampão de pH e similares, podem estar presentes em tais veículos.

[00103] Como é evidente para os especialistas na técnica, uma quantidade eficaz de vetor viral que deve ser adicionada pode ser determinada empiricamente. A administração pode ser efetuada em uma dose, contínua ou intermitentemente ao longo do curso do tratamento. Os métodos para determinar os meios e dosagens mais eficazes de administração são bem conhecidos dos especialistas na técnica e variarão com o vetor viral, a composição da terapia e o indivíduo a ser tratado. Administrações únicas e múltiplas podem ser realizadas com o nível e o padrão da dose selecionados pelo médico assistente.

Composições farmacêuticas, métodos de prevenção e tratamento e uso na mesma

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60/125 [00104] Os polipeptídeos sintéticos da invenção são úteis para substituir o MeCP2 defeituoso nas células daqueles afetados pela síndrome de Rett ou distúrbios relacionados. Assim, a invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de doenças em um animal compreendendo a administração de um polipeptídeo sintético da invenção. Preferencialmente, a doença é um distúrbio neurológico associado à mutação inativadora de MECP2, por exemplo, síndrome de Rett. De preferência o animal é um paciente humano.

[00105] A administração nos métodos da invenção pode compreender a administração de uma composição compreendendo um polipeptídeo sintético da invenção, a administração de um vetor de expressão da invenção e/ou a administração de um virion da invenção.

[00106] A invenção também fornece, portanto, polipeptídeos sintéticos, vetores de expressão e virions para o tratamento ou prevenção de um distúrbio neurológico associado à mutação inativadora de MECP2, por exemplo, síndrome de Rett e o uso de um polipeptídeo sintético da invenção, um vetor de expressão da invenção, ou um virion da invenção, na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um distúrbio neurológico associado à mutação inativadora de MECP2, por exemplo, síndrome de Rett.

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61/125 [00107] Os distúrbios que podem ser tratados ou prevenidos conforme aqui fornecidos incluem aqueles que envolvem uma redução ou inativação na atividade do MeCP2. Assim, como aqui utilizada, a frase mutação inativadora abrange mutações que resultam em atividade reduzida de MeCP2, bem como mutações que abolem a atividade de MeCP2 e, em particular, a atividade devido à habilidade do MeCP2 de recrutar membros do complexo co-repressor de NCoR/SMRT para DNA metilado. Tais desordens podem ser reconhecidas, por exemplo, pela identificação de mutações no MeCP2 no indivíduo que tem ou corre o risco de ter o distúrbio. Por exemplo, verificou-se que mutações recorrentes (por exemplo, A140V) ou esporádicas em homens são causadoras em alguns casos de deficiência intelectual ligada ao X. Da mesma forma, no sexo feminino, mutações hipomórficas desse tipo estão associadas à dificuldade de aprendizagem, e o sequenciamento do exoma de crianças diagnosticadas com atraso no desenvolvimento também está revelando mutações no MECP2. Tais mutações podem afetar a capacidade do MeCP2 de recrutar componentes do complexo co-repressor de NCoR/SMRT para o DNA metilado e/ou geralmente podem afetar a estabilidade da proteína.

[00108] No contexto dos métodos e usos médicos da presente invenção, o animal a ser tratado pode ser qualquer pessoa que exija o tratamento ou alguém considerado em risco

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62/125 de desenvolver um distúrbio relevante. Adequadamente, o animal pode ser um mamífero, preferencialmente um primata e ainda preferencialmente um indivíduo humano.

[00109] 0 animal a ser tratado pode apresentar sintomas sugestivos de um distúrbio associado ao MeCP2. Alternativamente, o indivíduo pode parecer assintomático, mas considerado em risco de desenvolver um distúrbio relacionado ao MECP2 causado pela perda da função MeCP2, de modo que o tratamento preventivo com polipeptídeos sintéticos da invenção seja desejável. Adequadamente, um indivíduo assintomático pode ser um indivíduo que se acredita estar em risco elevado de ter um distúrbio associado ao MeCP2. Um indivíduo assintomático pode ser um indivíduo com histórico familiar de MeCP2 ou submetido a testes genéticos que indiquem uma mutação no gene MECP2.

[00110] A presente invenção prevê o tratamento ou a prevenção de distúrbios associados à atividade reduzida de MeCP2 pela administração de um agente terapêutico, isto é, uma composição de polipeptídeo sintético, um construto de ácido nucleico, um vetor de expressão e/ou um virion da invenção. A administração dos agentes terapêuticos de acordo com a presente invenção pode ser contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do destinatário, se o objetivo da administração é terapêutico ou profilático, e outros fatores conhecidos pelos

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63/125 especialistas. A administração dos agentes da invenção pode ser essencialmente contínua durante um período de tempo préselecionado ou pode estar em uma série de doses espaçadas. Ambas as administrações local e sistêmica são contempladas.

[00111] Uma ou mais formas de dosagem unitária adequadas com o (s) agente (s) terapêutico (s) da invenção podem ser administradas por uma variedade de vias, incluindo parentérica, incluindo por via intravenosa e intramuscular, bem como por injeção direta no tecido diretamente associado à atividade reduzida de MeCP2. Por exemplo, o agente terapêutico pode ser injetado diretamente no cérebro. Alternativamente, o agente terapêutico pode ser introduzido intratecalmente para condições cerebrais e da medula espinhal. Em outro exemplo, o agente terapêutico pode ser introduzido por via intramuscular para vírus que trafegam de volta aos neurônios afetados pelos músculos, tais como AAV, lentivírus e adenovirus. As formulações podem, quando apropriado, ser convenientemente apresentadas em formas de dosagem unitária discretas e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos pela farmácia. Tais métodos podem incluir a etapa de associar o agente terapêutico a carreadores líquidos, matrizes sólidas, carreadores semissólidos, carreadores sólidos finamente divididos ou combinações dos mesmos e, se necessário,

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64/125 introduzir ou moldar o produto no sistema de entrega desejado.

[00112] Quando os agentes terapêuticos da invenção são preparados para administração, eles são preferencialmente combinados com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável para formar uma formulação farmacêutica ou forma de dosagem unitária. O total de ingredientes ativos nessas formulações inclui de 0,1 a 99,9% em peso da formulação. Um carreador farmaceuticamente aceitável é um diluente, excipiente e/ou sal que é compatível com os outros ingredientes da formulação e não é prejudicial para o seu receptor. O ingrediente ativo para administração pode estar presente como um pó ou como grânulos, como uma solução, uma suspensão ou uma emulsão.

[00113] As formulações farmacêuticas contendo os agentes terapêuticos da invenção podem ser preparadas por procedimentos conhecidos na técnica, utilizando ingredientes bem conhecidos e facilmente disponíveis.1 [00114] Os agentes terapêuticos da invenção também podem ser formulados como soluções apropriadas para administração parentérica, por exemplo por via intramuscular, subcutânea ou intravenosa.

[00115] As formulações farmacêuticas dos agentes terapêuticos da invenção também podem assumir a forma de uma

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65/125 solução ou dispersão aquosa ou anidra ou, alternativamente, a forma de uma emulsão ou suspensão.

[00116] Assim, o agente terapêutico pode ser formulado para administração parenteral (por exemplo, por injeção, por exemplo, injeção em bolus ou infusão contínua) e pode ser apresentado na forma de dose unitária em ampolas, seringas pré-preenchidas, recipientes de infusão de pequeno volume ou em dosear recipientes com um conservante adicionado. Os ingredientes ativos podem assumir formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, os ingredientes ativos podem estar na forma de pó, obtido por isolamento asséptico de sólido estéril ou por liofilização da solução, para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril, livre de pirogênio, antes do uso.

[00117] As formulações farmacêuticas da presente invenção podem incluir, como ingredientes opcionais, carreadores, diluentes, agentes solubilizantes ou emulsificantes farmaceuticamente aceitáveis e sais do tipo que são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos específicos dos carreadores e/ou diluentes que são úteis nas formulações farmacêuticas da presente invenção incluem água e soluções salinas tamponadas fisiologicamente aceitáveis,

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66/125 tal como soluções salinas tamponadas com fosfato pH 7,0-8,0 soluções salinas e água.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [00118] A invenção será agora descrita em detalhes com referência a uma modalidade específica e com referência aos desenhos anexos, nos quais:

[00119] A Figura 1 mostra a deleção gradual da proteína MeCP2, mantendo apenas os dois domínios funcionais principais previstos pela análise mutacional.

[00120] A) Esquema da sequência da proteína MeCP2 humana (isoforma el) com o domínio de ligação metil-CpG (MBD) [resíduos 78 a 162¹²] e o domínio de interação NCoR/SMRT (NID) [resíduos 285 a 309⁴] ; anotado com (acima) : polimorfismos em machos hemizigotos saudáveis, mutações missense causadoras de RTT e (inferior) identidade de sequência com homólogos de chimpanzé (el), camundongo (el), Xenopus e peixe-zebra [sítios de inserções nas sequências de Xenopus e peixe-zebra mostrados como barras mais longas].

[00121] B) Esquema da série de deleções de proteínas MeCP2 (isoformas e2 de camundongo) expressas pelas três novas linhagens de camundongo apresentadas neste estudo (e camundongos WT-EGFP¹⁶) .

[00122] C) As proteínas encurtadas marcadas com EGFP foram superexpressas nas células HeLa e imunoprecipitadas usando esferas de GFP-TRAP. Western blot mostra a expressão

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67/125 e a purificação dessas proteínas (GFP) e a coimunoprecipitação de componentes do complexo co-repressor de NCoR/SMRT (NCoR, HDAC3 e TBL1XR1). WT-EGFP e R306C-EGFP foram usados como controles para mostrar a presença e ausência de ligação a essas proteínas, respectivamente. 'In' = entrada, 'IP' = imunoprecipitado.

[00123] D) As proteínas MeCP2 encurtadas marcadas com EGFP foram superexpressas em células NIH-3T3, que foram fixadas em PFA e coradas com DAPI. WT-EGFP e R111G-EGFP foram usados como controles para mostrar localização focal e difusa, respectivamente.

[00124] E) As proteínas encurtadas marcadas com EGFP foram co-superexpressas com TBLIX-mCherry em células NIH3T3, que foram fixadas em PFA e coradas com DAPI. WT-EGFP e R306C-EGFP foram usados como controles para mostrar a presença e ausência de recrutamento de TBLIX-mCherry para focos heterocromáticos, respectivamente.

[00125] A Figura 2 mostra o design da série de deleção de MeCP2.

[00126] A) Esquema das sequências de DNA genômico do tipo selvagem e ANIC MeCP2, apresentando a retenção dos aminoácidos N-terminais extremos codificados nos éxons 1 e 2 e nos primeiros 10 bp do éxon 3, a deleção do N- e Cterminal, a substituição da região intermediária por um ligante e SV40 NLS, e a adição da marcação EGFP do C

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68/125 terminal. Chave de cor: 5'UTR = branco, MBD = cinza médio, NID = cinza escuro, regiões não caracterizadas = cinza, SV40 NLS = cinza médio ao lado do ligante, ligantes = cinza escuro e EGFP = C-terminal cinza médio.

[00127] B) As extremidades do N-terminal das sequências de todas as três proteínas encurtadas (isoformas el e e2) apresentando a fusão dos aminoácidos N-terminais extremos ao MBD (começando com Pro72).

[00128] C), D) Alinhamento da sequência de proteína da região (C) MBD e (D) NID usando o ClustalWS, sombreado de acordo com o escore BLOSUM62. Ambos os alinhamentos são anotados com: (acima) mutações RTT-missense¹³ e sítios de fosforilação dependentes de atividade^17,18,19; e (inferior) conservação de sequência, domínios de interação e estrutura conhecida²⁰/prevista²¹. Sítios de interação: ligação ao meDNA (resíduos 78 a 162¹²), gancho AT 1 (resíduos 183 a 195²²) , gancho AT 2 (resíduos 257 a 272²³) , ligação NCoR/SMRT (resíduos 285 a 309⁴) . O sinal de localização nuclear bipartido (NLS) também é mostrado (resíduos 253 a 256 e 266 a 271) . Os números de resíduos que correspondem aos das isoformas e2 de mamíferos. As regiões retidas em ΔΝΙΟ são: MBD reside 72 a 173 (destacado pelo retângulo cinza em C) e NID reside 272 a 312 (destacado pelo retângulo cinza em D).

[00129] A Figura 3 mostra os construtos para a geração de camundongos ΔΝ e ΔΝΟ.

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69/125 [00130] Diagrama (superior) da produção de camundongos (A) ΔΝ e (B) ΔΝΟ. O alelo de Mecp2 endógeno foi direcionado para células ES masculinas. O cassete de seleção foi removido ín vivo através do cruzamento de quimeras com camundongos deletores (CMV-Cre).

[00131] A análise Southern Blot (inferior) mostra o direcionamento correto das células ES e a deleção bemsucedida do cassete nos camundongos knock-in.

[00132] A Figura 4 mostra os construtos para a geração de camundongos ΔΝΙΟ e STOP.

[00133] Diagrama (superior) da produção de camundongos ΔΝΙΟ. O alelo de Mecp2 endógeno foi direcionado para células ES masculinas. O cassete de seleção foi removido ín vivo cruzando quimeras com camundongos deletores (CMVCre) para produzir camundongos ANIC expressando constitutivamente ou retidos para produzir camundongos STOP.

[00134] A análise de Southern blot (inferior) mostra o direcionamento correto das células ES e a deleção bemsucedida do cassete nos camundongos knock-in ΔΝΙΟ.

[00135] A Figura 5 mostra que as proteínas ΔΝ e ΔΝΟ são expressas em torno dos níveis do tipo selvagem em camundongos knock-in.

[00136] A, Superior) Análise de Western blot do extrato bruto do cérebro apresentando tamanhos e níveis de proteína em camundongos ΔΝ (n = 3) em comparação com seus

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70/125 companheiros de ninhada do tipo selvagem (n = 3), detectados usando um anticorpo MeCP2 C-terminal.

[00137] A, Inferior) Análise Western blot de camundongos ΔΝ (n = 3) e ANC (n = 3) em comparação com os controles WT-EGFP (n = 3), detectados usando um anticorpo GFP. A histona H3 foi usada como controle de carregamento. * indica uma banda não específica detectada pelo anticorpo GFP.

[00138] B) Análise por citometria de fluxo dos níveis de proteína em núcleos preparados a partir de cérebro inteiro ('Todo') e a subpopulação de NeuN alta ('Neurônios') em camundongos WT-EGFP (n = 3) , ΔΝ (n = 3) e ANC (n = 3) , detectados usando fluorescência EGFP. O gráfico mostra a média ± S.E.M e os genótipos foram comparados aos controles WT-EGFP pelo teste t: 'Todo' AN p = 0,338, ANC ** p = 0,003; e Neurônios ΔΝ p = 0,672, ANC * p = 0,014.

[00139] A Figura 6 mostra que a deleção dos N- e Cterminais tem consequência fenotípica mínima.

[00140] A), B) pontuação fenotípica de camundongos machos hemizigotos (A) camundongos ΔΝ (n = 10) e (B) camundongos ANC (n = 10), cada um comparado aos seus companheiros de ninhada do tipo selvagem (n = 10) durante um ano. Os gráficos mostram pontuações médias ± S.E.M. Dados Mecp2-nulos (n = 12)¹⁶ são usados como um comparador.

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71/125 [00141] C), D) Gráficos de Kaplan-Meier apresentando a sobrevivência das mesmas coortes nas partes A e B. Os dados de Mecp2-nulos (n = 24)¹⁶ são usados como um comparador.

[00142] E) , F), G) Análise comportamental de coortes separadas realizadas às 20 semanas de idade: camundongos ΔΝ (n = 10) e ΔΝΟ (n = 10-11), cada um comparado aos seus companheiros de ninhada do tipo selvagem (n = 10). Todos os gráficos mostram valores e medianas individuais e os resultados da análise estatística comparando genótipos (veja inferior): não significativo ('n.s.') p > 0,05, * p < 0,05.

[00143] E) O tempo gasto nos braços fechados e abertos do Elevated Plus Maze foi medido durante um ensaio de 15 minutos, e os genótipos foram comparados usando testes KS: coorte ΔΝ (esquerda) braços fechados p = 0,988 e braços abertos p = 0,759; A coorte hNC (direita) braços fechados p = 0,956 e braços abertos p = 0,932.

[00144] F) O tempo gasto na região central do teste de campo aberto foi medido durante um ensaio de 20 minutos e os genótipos foram comparados usando os testes t: ΔΝ p = 0, 822; hNC * p = 0, 020.

[00145] G) A latência média para cair do Rotarod de Aceleração em quatro ensaios foi calculada para cada um dos três dias do experimento, e os genótipos foram comparados usando testes KS: coorte ΔΝ dia 1 p = 0,759, dia 2 p = 0,401

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72/125 e dia 3 p = 0,055; coorte ANC dia 1 p = 0,988, dia 2 p = 0,401 e dia 3 p = 0,759.

[00146] A Figura 7 mostra que ANC tem um fenótipo de peso ligeiramente aumentado que depende do fundo.

[00147] A), B) Curvas de crescimento das coortes de pontuação retrocedidas (ver Fig. 6A-D).

[00148] C) Curva de crescimento de uma coorte de consanguínea (75% C57BL/6 J) de camundongos ANC (n = 7) e companheiros de ninhada do tipo selvagem (n = 9).

[00149] A), B) , C) Os gráficos mostram valores médios ± S.E.M. Os genótipos foram comparados usando medidas repetidas ANOVA: AN p = 0,385, ANC **** p < 0, 0001, ANC (consanguíneo) p = 0,739. Dados Mecp2-nulos (n = 20) ¹⁶ são usados como um comparador.

[00150] A Figura 8 mostra que nenhum fenótipo de atividade foi detectado para camundongos AN ou ANC.

[00151] A), B) Análise comportamental de camundongos

AN (n = 10) e ANC (n = 10) , cada um comparado aos seus companheiros de ninhada do tipo selvagem (n = 10) às 20 semanas de idade (ver Fig. 6E-G). A distância total percorrida no teste de campo aberto foi medida durante um teste de 20 minutos. Os gráficos mostram valores e medianas individuais e os genótipos foram comparados pelo teste t: AN p = 0,691; ANC p = 0,791.

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73/125 [00152] A Figura 9 mostra que a deleção adicional da região intervinda leva à instabilidade da proteína e a sintomas leves do tipo RTT.

[00153] A) Análise de Western blot do extrato bruto de cérebro inteiro apresentando tamanhos e níveis de proteína em camundongos ANIC (n = 3) e controles WT-EGFP (n = 3), detectados usando um anticorpo GFP. A histona H3 foi usada como controle de carregamento. * indica uma banda não específica detectada pelo anticorpo GFP.

[00154] B) Análise por citometria de fluxo dos níveis de proteína em núcleos preparados a partir de cérebro inteiro ('Todo') e a subpopulação de NeuN alta ('Neurônios') em camundongos ANIC (n = 3) e controles WT-EGFP (n = 3) detectados usando fluorescência EGFP. O gráfico mostra a média ± S.E.M e os genótipos foram comparados pelo teste t: Todo *** p = 0,0002 e Neurônios *** p = 0,0001.

[00155] C) Análise quantitativa por PCR dos níveis de mRNA preparados a partir do cérebro inteiro de camundongos ANIC (n = 3) e companheiros de ninhada do tipo selvagem (n = 3) . Os níveis de transcrito de Mecp2 foram normalizados para Ciclofilina A. O gráfico mostra a média ± S.E.M (em relação ao tipo selvagem) e os genótipos foram comparados pelo teste t: ** p = 0,005.

[00156] D) Pontuação fenotípica de camundongos ANIC (n = 10) em comparação com seus companheiros de ninhada do

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74/125 tipo selvagem (n = 10) durante um ano. 0 gráfico mostra as pontuações médias ± S.E.M. Dados de lfecp2-nulos (n = 12)¹⁶são usados como um comparador.

[00157] E) Gráfico de Kaplan-Meier apresentando sobrevivência da mesma coorte na parte D. Um animal ΔΝΙΟ morreu às 43 semanas sem exceder uma pontuação de gravidade de 2,5. Dados de Mecp2-nulos (n = 24) ¹⁶ são usados como um comparador.

[00158] F) , G), H) Análise comportamental de coortes separadas realizadas às 20 semanas de idade: ãNIC (n = 10) em comparação com seus companheiros de ninhada do tipo selvagem (n = 10) . Todos os gráficos mostram valores e medianas individuais e os resultados da análise estatística comparando genótipos (veja abaixo): não significantes ('n.s.') p > 0,05, * p < 0,05, ** p < 0,01.

[00159] F) O tempo gasto nos braços fechados e abertos e na região central do Elevated Plus Maze foi medido durante um ensaio de 15 minutos, e os genótipos foram comparados usando testes KS: braços fechados ** p = 0,003, braços abertos p = 0,055 e centro * p = 0,015.

[00160] G) O tempo gasto na região central do teste de Campo Aberto foi medido durante um ensaio de 20 minutos, e os genótipos foram comparados usando um teste t: p = 0,402.

[00161] H) A latência média para cair do Rotarod de Aceleração em quatro ensaios foi calculada para cada um dos

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75/125 três dias do experimento, e os genótipos foram comparados usando testes KS: dia 1 p = 0,164, dia 2 p = 0,055 e dia 3 ** p = 0,003. O desempenho alterado (aprendizado/piora) durante o período de três dias foi determinado usando os testes de Friedman: animais do tipo selvagem p = 0,601, animais ANIC ** p = 0,003.

[00162] A Figura 10 mostra que camundongos ANIC consanguíneos tiveram 100% de sobrevivência ao longo de um ano.

[00163] Gráfico de Kaplan-Meier apresentando a sobrevivência de uma coorte de camundongos ANIC consanguíneos (75% C57BL/6J) (n = 10) e seus companheiros de ninhada do tipo selvagem (n = 1). Dados de Mecp2-nulos (n = 24) ¹⁶ são usados como um comparador.

[00164] A Figura 11 mostra que os camundongos ANIC diminuíram o peso corporal.

[00165] Curva de crescimento da coorte de pontuação retrocedida (ver Fig. 9D-E). O gráfico mostra a média ± S.E.M. Os genótipos foram comparados usando medidas repetidas ANOVA: **** p < 0,0001. Dados de _Mecp2-nulos (n = 20) ¹⁶ são usados como um comparador.

[00166] A Figura 12 mostra que nenhum fenótipo de atividade foi detectado para camundongos ΔΝΙΟ.

[00167] A análise comportamental de ANIC (n = 10) em comparação com seus companheiros de ninhada do tipo selvagem

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76/125 (η = 10) às 20 semanas de idade (ver Fig. 9F-H). A distância total percorrida no teste de campo aberto foi medida durante um teste de 20 minutos. Os gráficos mostram valores e medianas individuais e os genótipos foram comparados pelo teste t p = 0,333.

[00168] A Figura 13 mostra que camundongos ΔΝΙΟ têm um fenótipo menos grave que o modelo mais leve de RTT, R133C.

[00169] A), B) , C) Cópia da análise fenotípica de camundongos ΔΝΙΟ e companheiros de ninhada do tipo selvagem apresentados na Fig. 9D-E e Fig. Sll usando camundongos R133C marcados com EGFP (n = 10)¹⁶ como um comparador.

[00170] A Figura 14 mostra que os camundongos 'STOP' com ΔΝΙΟ silenciados transcricionalmente se assemelham a Mecp2 nulos.

[00171] A) Análise de Western blot do extrato bruto do cérebro apresentando tamanhos e níveis de proteína em camundongos STOP (n = 3) em comparação com os controles WTEGFP (n = 3) e ΔΝΙΟ (n = 3), detectados usando um anticorpo GFP. A histona H3 foi usada como controle de carregamento. * indica uma banda não específica detectada pelo anticorpo GFP.

[00172] B) Análise por citometria de fluxo dos níveis de proteína em núcleos preparados a partir de cérebro inteiro ('Todo') e da subpopulação de NeuN alta ('Neurônios') em camundongos WT-EGFP (n = 3), ΔΝΙΟ (n = 3) e STOP (n = 3),

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77/125 detectados usando fluorescência EGFP. 0 gráfico mostra a média ± S.E.M e os genótipos foram comparados usando testes t: **** denota um valor de p < 0,0001.

[00173] C) Pontuação fenotipica de camundongos STOP (n = 22) em comparação com dados de Mecp2 nulos (n = 12)¹⁶. O gráfico mostra as pontuações médias ± S.E.M.

[00174] D) Gráfico de Kaplan-Meier apresentando sobrevivência de camundongos STOP (n = 14) em comparação com dados de Mecp2 nulos (n = 24) ¹⁶.

[00175] A Figura 15 mostra que a reativação de ΔΝΙΟ reverte com sucesso os sintomas neurológicos em camundongos com deficiência de MeCP2.

[00176] A) Linha do tempo do experimento de reversão (resultados mostrados em B-C e Fig. 16).

[00177] B) Pontuação fenotipica de camundongos injetados com tamoxifeno de 4-28 semanas: WT^T (n = 4), WT CreER^T (n = 4), STOP^T (n = 9) e STOP CreER^T (n = 9). O gráfico mostra as pontuações médias ± S.E.M.

[00178] C) Gráfico de Kaplan-Meier apresentando sobrevivência da mesma coorte. As setas indicam o momento das injeções de tamoxifeno. '^T' denota animais injetados com tamoxifeno.

[00179] D) Linha do tempo do experimento de resgate mediado por AAV (resultados mostrados em E-F e Fig. 17).

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78/125 [00180] E) Pontuação fenotipica de camundongos injetados com AAV9 de 5-20 semanas: WT + veículo (n = 19), Nulo + veículo (n = 21) e Nulo + ΔΝΙΟ (n = 11) . O gráfico mostra as pontuações médias ± S.E.M.

[00181] F) Gráfico de Kaplan-Meier apresentando a sobrevivência dos mesmos animais. Uma seta indica o momento da injeção viral.

[00182] A Figura 16 mostra uma reativação bemsucedida de ΔΝΙΟ em camundongos STOP CreER injetados com tamoxifeno.

[00183] A) Análise de Southern blot do DNA genômico para determinar o nível de recombinação por CreER em animais STOP CreER injetados com tamoxifeno ('+ Tmx') (n = 8). Um animal STOP injetado com tamoxifeno foi incluído como controle negativo, apresentando que a recombinação dependia de CreER. Outras amostras foram incluídas para referência (ver mapa de restrição na Fig. 4).

[00184] B) Os níveis de proteína em animais STOP CreER injetados com Tamoxifeno foram determinados utilizando Western blotting (superior, n = 5) e citometria de fluxo (inferior, n = 3). Camundongos ΔΝΙΟ expressando constitutivamente (n = 3) foram usados como um comparador. Os gráficos mostram valores médios ± S.E.M (a quantificação por Western blotting é mostrada normalizada para ΔΝΙΟ). Os genótipos foram comparados por meio dos testes t: Western

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79/125 blotting p = 0,434; citometria de fluxo núcleos Todo p = 0,128 e núcleos Neuronals * p = 0,016.

[00185] A Figura 17 mostra que a introdução de ANIC em camundongos do tipo selvagem não tem consequências adversas .

[00186] A) Pontuação fenotípica de camundongos injetados com AAV9 de 5-20 semanas: WT + veículo (n = 19) Nulo + veículo (n = 21) e WT + ANIC (n = 9) . O gráfico mostra as pontuações médias ± S.E.M. Uma seta indica o momento da injeção viral.

[00187] B) Projeto do construto usado na entrega do vetor de ANIC. Elementos reguladores putativos (RE) no promotor mMeP426 estendido e 3'-UTR distai endógeno são indicados. A extensão da região curta de 229 bp do promotor de núcleo endógeno de Mecp2 de murino que é divulgada na técnica ^29,38 (niMeP229) é mostrada em relação ao promotor de mMeP426 usado neste construto. O RDHlpA 3'-UTR consiste em vários sítios de ligação a microRNA exógenos (miR) incorporados como um 'painel de ligação' adjacente a uma porção do sinal de poliadenilação MECP2 endógeno distai e seus elementos reguladores que os acompanham. As referências com um asterisco indicam estudos humanos in vitro, não roedores.

[00188] C) Sequência completa, anotada, do cassete de expressão ilustrado na Fig. 17B, com ITRs de AAV2

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80/125 flanqueadoras. Essa sequência também é fornecida como SEQ ID NO: 65.

[00189] A Figura 18 mostra um alinhamento da sequência de cDNA da isoforma el de MECP2 humana de tipo selvagem com sequências de cDNA que codificam sequências polipeptídicas de acordo com a invenção e os resultados experimentais aqui fornecidos. WT humano (SEQ ID NO: 18) é uma sequência de cDNA para a isoforma 1 de MeCP2 do tipo selvagem. dNIC-Myc (SEQ ID NO: 62) é uma sequência de cDNA para um polipeptídeo sintético de acordo com a invenção tendo deleções nas sequências N- e C-terminais do MeCP2 e na sequência que liga o MBD e o NID e com uma marcação Myc no C-terminal. DNCMyc (SEQ ID NO: 63) é uma sequência de cDNA para um polipeptídeo sintético de acordo com a invenção tendo deleções nas sequências N- e C-terminais de MeCP2 e tendo uma marcação Myc no C-terminal. As seções das sequências de cDNA correspondentes ao N-terminal extremo do polipeptídeo, fornecendo as sequências específicas de el, do MBD, do NID, da marcação Myc, de uma NLS SV40 e ligantes para ligar a marcação e NLS, são todos indicados.

[00190] A Figura 19 mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da isoforma el de MeCP2 humana de tipo selvagem com sequências polipeptídicas de acordo com a invenção e os resultados experimentais aqui fornecidos. WT humano (SEQ ID NO: 3) é a sequência de aminoácidos da

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81/125 isoforma 1 de MeCP2 do tipo selvagem. dNIC-Myc (SEQ ID NO: 61) é a sequência de aminoácidos para um polipeptídeo sintético de acordo com a invenção tendo deleções nas sequências N- e C-terminais do MeCP2 e na sequência que liga o MBD e o NID, e tendo uma marcação Myc no C-terminal. DNCMyc (SEQ ID NO: 60) é a sequência de aminoácidos para um polipeptídeo sintético de acordo com a invenção tendo deleções nas sequências N- e C- terminais de MeCP2 e tendo uma marcação Myc no C-terminal. As seções das sequências de aminoácidos correspondentes ao N-terminal extremo do polipeptídeo, com as sequências específicas de el, o MBD, o NID, a marcação Myc, uma SV40 NLS e ligantes para ligar a marcação e NLS, estão todos indicados.

[00191] A Figura 20 mostra um alinhamento da sequência de cDNA da isoforma MECP2 el de camundongo do tipo selvagem, com uma marcação EGFP, com sequências de cDNA que codificam sequências polipeptídicas de acordo com a invenção e os resultados experimentais aqui fornecidos. DNIC-EGFP (SEQ ID NO: 51) é uma sequência de cDNA para um polipeptídeo sintético de acordo com a invenção tendo deleções nas sequências N- e C-terminais de MeCP2 e na sequência que liga o MBD e o NID, e tendo um marcador EGFP no C-terminal. DNCEGFP (SEQ ID NO: 50) é uma sequência de cDNA para um polipeptídeo sintético de acordo com a invenção tendo deleções nas sequências N- e C-terminais de MeCP2 e tendo

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82/125 uma marcação EGFP no C-terminal. WT-EGFP (SEQ ID NO: 48) é uma sequência de cDNA para a isoforma 1 de MeCP2 do tipo selvagem com uma marcação EGFP. DN-EGFP (SEQ ID NO: 49) é uma sequência de cDNA para um polipeptídeo sintético de acordo com a invenção tendo deleções nas sequências Nterminais de MeCP2 e tendo uma marcação EGFP no C-terminal. As seções das sequências de cDNA correspondentes ao Nterminal extremo do polipeptídeo, fornecendo as sequências específicas de el, o MBD, o NID, a marcação EGFP, uma SV40 NLS e ligantes para ligar a marcação e NLS, são todos indicados.

[00192] A Figura 21 mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da isoforma el de MECP2 humana do tipo selvagem, com uma marcação EGFP, com sequências polipeptídicas de acordo com a invenção e os resultados experimentais aqui fornecidos. WT-EGFP/1-748 (SEQ ID NO: 40) é uma sequência de aminoácidos para a isoforma 1 de MeCP2 do tipo selvagem com uma marcação EGFP no C-terminal. ΔΝEGFP/1-689 (SEQ ID NO: 41) é a sequência de aminoácidos para um polipeptídeo sintético de acordo com a invenção tendo deleções nas sequências N terminais do MeCP2 e tendo uma marcação EGFP no C-terminal. ANIC-EGFP/l-432 (SEQ ID NO: 43) é a sequência de aminoácidos para um polipeptídeo sintético de acordo com a invenção tendo deleções nas sequências N- e C-terminais de MeCP2 e na sequência que liga

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83/125 o MBD e NID e com uma marcação EGFP no C-terminal. ANCEGFP/1-516 (SEQ ID NO: 42) é a sequência de aminoácidos para um polipeptídeo sintético de acordo com a invenção tendo deleções nas sequências N- e C- terminais de MeCP2 e tendo uma marcação EGFP no C-terminal. As seções das sequências de aminoácidos correspondentes ao N-terminal extremo do polipeptídeo, tendo as sequências específicas de el, o MBD, o NID, a marcação EGFP, uma SV40 NLS e ligantes para ligar a marcação e NLS, estão todos indicados.

SEQUÊNCIAS [00193] Abaixo estão as sequências de polinucleotideos e de aminoácidos utilizadas de acordo com a invenção.

[00194] [SEQ ID NO: 1] Sequência de polipeptídeo do Domínio de Ligação Metil-CpG (MBD) de MeCP2 [00195] PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGR SAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPP [00196] [SEQ ID NO: 2] Sequência de polipeptídeo do Domínio de Interação NCoR/SMRT de MeCP2 (NID) [00197] PGS WAAAAAEAKKKAVKE S SI RS VQE TVLPIKKRKTRE TV [00198] [SEQ ID NO: 3] Sequência de polipeptídeo de MeCP2 do tipo selvagem humano de comprimento total (isoforma el) [00199] MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVK KDKKEEKEGKHE PVQPSAHHSAE PAEAGKAE T SEGS GSAPAVPEASAS PKQRRS11RDR

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GPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSL

DPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQV KRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKR GRKPGS WAAAAAEAKKKAVKE SSI RS VQE TVLPIKKRKTRE TVS IEVKEWKPLLVS T LGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESPKAPVPLLPPL PPPPPEPESSEDPTSPPEPQDLSSSVCKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPAVATAAT

AAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTERVS [00200] [SEQ ID NO: 4] Sequência de polipeptídeo de MeCP2 do tipo selvagem humano de comprimento total (isoforma e2) [00201] MVAGMLGLREEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHE

PVQPSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEG WTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGR GSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLL VKMPFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSWAAAA AEAKKKAVKE SSIRSVQE TVLPIKKRKTRE TVSIEVKEWKPLLVS TLGEKS GKGLKTC

KSPGRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSED PTSPPEPQDLSSSVCKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRGEGE RKDIVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTERVS [00202] [SEQ ID NO: 5] Sequência de polipeptídeo de MeCP2 (isoforma el) N-terminal para o MBD [00203] MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVK

KDKKEEKEGKHEPVQPSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSA [00204] [SEQ ID NO: 6] Sequência de polipeptídeo de MeCP2 (isoforma e2) N-terminal para o MBD

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85/125 [00205] MVAGMLGLREEKSEDQDLQGLKDKPLKFKKVKKDKKEEKEGKHE

PVQPSAHHSAEPAEAGKAETSEGSGSA [00206] [SEQ ID NO: 7] Sequência de polipeptídeo de MeCP2 que intervém entre o MBD e o NID [00207] KKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSP

GKLLVKMPFQTSPGGKAEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRK [00208] [SEQ ID NO: 8] Sequência de polipeptídeo de MeCP2 C-terminal para o NID [00209] SIEVKEWKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGRSS SASSPPKKEHHHHHHHSESPKAPVPLLPPLPPPPPEPESSEDPTSPPEPQDLSSSVCKE EKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPAVATAATAAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNREEP VDSRTPVTERVS [00210] [SEQ ID NO: 9] Sequência de polipeptídeo Nterminal extremo específico de el de camundongo [00211] MAAAAATAAAAAPSGGGGGGEEERLEEK [00212] [SEQ ID NO: 10] Sequência de polipeptídeo Nterminal extremo específico de e2 de camundongo [00213] MVAGMLGLREEK [00214] [SEQ ID NO: 11] Sequência de polipeptídeo Nterminal extremo específico da el humana [00215] MAAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEK [00216] [SEQ ID NO: 12] Sequência de polipeptídeo Nterminal extremo específico de e2 humano [00217] MVAGMLGLREEK

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86/125 [00218] [SEQ ID NO: 13] ΔΝΟ: uma sequência de polipeptídeo sintética truncada (a partir da MeCP2 humana) [00219] PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGR

SAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPK KPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTTRPKAATSEGVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQTSPGGK AEGGGATTSTQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSWAAAAAEAKKKAVKESS IRSVQE TVL PIKKRKTRE TV [00220] [SEQ ID NO: 14] ΔΝΙ0: Uma sequência de polipeptídeo sintética truncada (a partir da MeCP2 humana) [00221] PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGR

SAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPG S S GS S GPKKKRKVPGSWAAAAAEAKKKAVKE SSIRSVQE TVLPIKKRKTRE TV [0 0222] [SEQ ID NO: 15] ΔΝ de camundongo: Uma sequência de polipeptídeo sintética truncada (a partir do MeCP2 de camundongo) [00223] PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGR

SAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPK KPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTGRPKAAASEGVQVKRVLEKSPGKLWKMPFQASPGGK GEGGGATTSAQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSWAAAAAEAKKKAVKESS IRSVHETVLPIKKRKTRETVSIEVKEWKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSP KGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESTKAPMPLLPSPPPPEPESSEDPISPPEPQDLSSSI CKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPMVATTTTVAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNR EEPVDSRTPVTERVS

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87/125 [00224] [SEQ ID NO: 16] ΔΝΟ de camundongo: uma sequência de polipeptídeo sintética truncada (a partir do MeCP2 de camundongo) [00225] PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGR

SAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPK KPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTGRPKAAASEGVQVKRVLEKSPGKLWKMPFQASPGGK GEGGGATTSAQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSVVAAAAAEAKKKAVKESS IRSVHE TVL PIKKRKTRE TV [00226] [SEQ ID NO: 17] ΔΝΙΟ de camundongo: uma sequência de polipeptídeo sintética truncada (a partir do MeCP2 de camundongo) [00227] PAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGR

SAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPG S S GS S GPKKKRKVPGSVVAAAAAEAKKKAVKE SSIRSVHE TVLPIKKRKTRE TV [00228] [SEQ ID NO: 18] Sequência de cDNA de MeCP2 de tipo selvagem humano de comprimento total (isoforma el) [00229] ATGGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAGCGGAGGAGGAGGAGG

AGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGG ACAAAC C C C T CAAG T T TAAAAAG G T GAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAG G G CAAG CATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGC AGAGACATCAGAAGGGTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCA AACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCT GAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGCCGCTCTGCTGGGAAGTATGA TGTGTATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGT ACTTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACT

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GGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAA AGCTCCAGGAACTGGCAGAGGCCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCA AGGCGGCCACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTGGGAAG CTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTGGGGC CACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGG CCGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGCCGAAAGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCC GCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGA GACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGG AAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAG ACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAG CGCCTCCT GAG C C C C CAAGAAG GAG GAG GAG GAG CAT GAG GAG GAG T CAGAG T C C C CAA

AGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCCCTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCC GAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAGCCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGA GAAGATGCCCAGAGGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGA CTCAGCCCGCGGTTGCCACCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAG GGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGT GGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGC [00230] [SEQ ID NO: 19] ΔΝΟ: sequência de cDNA de uma sequência de polipeptídeo sintética truncada (a partir da MeCP2 humana) [00231] CCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTC

CATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACAC GGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGCCGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATC AATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAAAAGGT AGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCC

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CCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACT GGCAGAGGCCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAGGCGGCCACGTC AGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGA TGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTGGGGCCACCACATCCACC CAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGCCGACCCTCAGGC CATTCCCAAGAAACGGGGCCGAAAGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGG CCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCC ATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTC [00232] [SEQ ID NO: 20] ΔΝΙΟ: sequência de cDNA de uma sequência de polipeptídeo sintética truncada (a partir da MeCP2 humana) [00233] CCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTC CATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACAC GGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGCCGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATC AATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAAAAGGT AGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCC CCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTGGATCCAGTGGCAGCTCTGGGCCCAAGAAAAAG CGGAAGGTGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGT GAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGA CCCGGGAGACGGTC [00234] [SEQ ID NO: 21] Sequência de cDNA de MeCP2 do tipo selvagem de camundongo de comprimento total (isoforma el) [00235] ATGGCCGCCGCTGCCGCCACCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAG CGGAGGAGGAGGAGGAGGCGAGGAGGAGAGACTGGAGGAAAAGTCAGAAGACCAGGATC

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TCCAGGGCCTCAGAGACAAGCCACTGAAGTTTAAGAAGGCGAAGAAAGACAAGAAGGAG

GACAAAGAAGGCAAGCATGAGCCACTACAACCTTCAGCCCACCATTCTGCAGAGCCAGC

AGAGGCAGGCAAAGCAGAAACATCAGAAAGCTCAGGCTCTGCCCCAGCAGTGCCAGAAG

CCTCGGCTTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATTATCCGTGACCGGGGACCTATGTATGAT

GACCCCACCTTGCCTGAAGGTTGGACACGAAAGCTTAAACAAAGGAAGTCTGGCCGATC

TGCTGGAAAGTATGATGTATATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCTTTTCGCTCTAAAG

TAGAATTGATTGCATACTTTGAAAAGGTGGGAGACACCTCCTTGGACCCTAATGATTTT

GACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCAGGAGAGAGCAGAAACCACCTAAGAA

GCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGGGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCG

GCACTGGGAGACCAAAGGCAGCAGCATCAGAAGGTGTTCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAG

AAGAGCCCTGGGAAACTTGTTGTCAAGATGCCTTTCCAAGCATCGCCTGGGGGTAAGGG

TGAGGGAGGTGGGGCTACCACATCTGCCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCTGGCAGAA

AGCGAAAAGCTGAAGCTGACCCCCAGGCCATTCCTAAGAAACGGGGTAGAAAGCCTGGG

AGTGTGGTGGCAGCTGCTGCAGCTGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCCAT

ACGGTCTGTGCATGAGACTGTGCTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCA

GCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTTGGTGAGAAAAGC

GGGAAGGGACTGAAGACCTGCAAGAGCCCTGGGCGTAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAA

GGGGCGCAGCAGCAGTGCCTCCTCCCCACCTAAGAAGGAGCACCATCATCACCACCATC

ACTCAGAGTCCACAAAGGCCCCCATGCCACTGCTCCCATCCCCACCCCCACCTGAGCCT

GAGAGCTCTGAGGACCCCATCAGCCCCCCTGAGCCTCAGGACTTGAGCAGCAGCATCTG

CAAAGAAGAGAAGATGCCCCGAGGAGGCTCACTGGAAAGCGATGGCTGCCCCAAGGAGC

CAGCTAAGACTCAGCCTATGGTCGCCACCACTACCACAGTTGCAGAAAAGTACAAACAC

CGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCTTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGA

GGAGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCTCT

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91/125 [0023 6] [SEQ ID NO: 22] ΔΝ de camundongo: cDNA para uma sequência de polipeptídeo sintética truncada (a partir do MeCP2 de camundongo) [00237] CCAGCAGTGCCAGAAGCCTCGGCTTCCCCCAAACAGCGGCGCTC CATTATCCGTGACCGGGGACCTATGTATGATGACCCCACCTTGCCTGAAGGTTGGACAC GAAAGCTTAAACAAAGGAAGTCTGGCCGATCTGCTGGAAAGTATGATGTATATTTGATC AATCCCCAGGGAAAAGCTTTTCGCTCTAAAGTAGAATTGATTGCATACTTTGAAAAGGT GGGAGACACCTCCTTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCC CCTCCAGGAGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACT GGCAGGGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACTGGGAGACCAAAGGCAGCAGCATC AGAAGGTGTTCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAGAGCCCTGGGAAACTTGTTGTCAAGA TGCCTTTCCAAGCATCGCCTGGGGGTAAGGGTGAGGGAGGTGGGGCTACCACATCTGCC CAGGTCATGGTGATCAAACGCCCTGGCAGAAAGCGAAAAGCTGAAGCTGACCCCCAGGC CATTCCTAAGAAACGGGGTAGAAAGCCTGGGAGTGTGGTGGCAGCTGCTGCAGCTGAGG CCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCCATACGGTCTGTGCATGAGACTGTGCTCCCC ATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCC CCTGCTGGTGTCCACCCTTGGTGAGAAAAGCGGGAAGGGACTGAAGACCTGCAAGAGCC CTGGGCGTAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGTGCCTCCTCCCCA CCTAAGAAGGAGCACCATCATCACCACCATCACTCAGAGTCCACAAAGGCCCCCATGCC ACTGCTCCCATCCCCACCCCCACCTGAGCCTGAGAGCTCTGAGGACCCCATCAGCCCCC CTGAGCCTCAGGACTTGAGCAGCAGCATCTGCAAAGAAGAGAAGATGCCCCGAGGAGGC TCACTGGAAAGCGATGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCTATGGTCGCCAC CACTACCACAGTTGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTG TTTCATCTTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTG AC C GAGAGAG T T AG C T G T

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92/125 [00238] [SEQ ID NO: 23] ΔΝΟ de camundongo: cDNA para uma sequência de polipeptídeo sintética truncada (a partir do MeCP2 de camundongo) [00239] CCAGCAGTGCCAGAAGCCTCGGCTTCCCCCAAACAGCGGCGCTC CATTATCCGTGACCGGGGACCTATGTATGATGACCCCACCTTGCCTGAAGGTTGGACAC GAAAGCTTAAACAAAGGAAGTCTGGCCGATCTGCTGGAAAGTATGATGTATATTTGATC AATCCCCAGGGAAAAGCTTTTCGCTCTAAAGTAGAATTGATTGCATACTTTGAAAAGGT GGGAGACACCTCCTTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCC CCTCCAGGAGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACT GGCAGGGGTCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACTGGGAGACCAAAGGCAGCAGCATC AGAAGGTGTTCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAGAGCCCTGGGAAACTTGTTGTCAAGA TGCCTTTCCAAGCATCGCCTGGGGGTAAGGGTGAGGGAGGTGGGGCTACCACATCTGCC CAGGTCATGGTGATCAAACGCCCTGGCAGAAAGCGAAAAGCTGAAGCTGACCCCCAGGC CATTCCTAAGAAACGGGGTAGAAAGCCTGGGAGTGTGGTGGCAGCTGCTGCAGCTGAGG CCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCCATACGGTCTGTGCATGAGACTGTGCTCCCC ATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTC [00240] [SEQ ID NO: 24] ΔΝΙΟ de camundongo: cDNA para uma sequência de polipeptídeo sintética truncada (a partir do MeCP2 de camundongo) [00241] CCAGCAGTGCCAGAAGCCTCGGCTTCCCCCAAACAGCGGCGCTC CATTATCCGTGACCGGGGACCTATGTATGATGACCCCACCTTGCCTGAAGGTTGGACAC GAAAGCTTAAACAAAGGAAGTCTGGCCGATCTGCTGGAAAGTATGATGTATATTTGATC AATCCCCAGGGAAAAGCTTTTCGCTCTAAAGTAGAATTGATTGCATACTTTGAAAAGGT GGGAGACACCTCCTTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCC CCTCCAGGAGAGAGCAGAAACCACCTGGATCCAGTGGCAGCTCTGGGCCCAAGAAAAAG

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CGGAAGGTGCCTGGGAGTGTGGTGGCAGCTGCTGCAGCTGAGGCCAAAAAGAAAGCCGT GAAGGAGTCTTCCATACGGTCTGTGCATGAGACTGTGCTCCCCATCAAGAAGCGCAAGA CCCGGGAGACGGTC [00242] [SEQ ID NO: 25] Sequência de cDNA N-terminal extremo especifica de el de camundongo [00243] ATGGCCGCCGCTGCCGCCACCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAG

CGGAGGAGGAGGAGGAGGCGAGGAGGAGAGACTGGAGGAAAAG [00244] [SEQ ID NO: 26] Sequência de cDNA N-terminal extremo especifica de e2 de camundongo [00245] ATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCAGGGAGGAAAAGGGAGGAAA

AG [00246] [SEQ ID NO: 27] Sequência de cDNA N-terminal extremo especifica de el humano [00247] ATGGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAGCGGAGGAGGAGGAGG AGGCGAGGAGGAGAGAC T GGAAGAAAAG [00248] [SEQ ID NO: 28] Sequência de cDNA N-terminal extremo especifica de e2 humano [00249] ATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCAGGGAAGAAAAG [00250] [SEQ ID NO: 29] Sequência de polipeptídeo de

MeCP2 do tipo selvagem de camundongo de comprimento total (isoforma el) [ 00251] MAAAAATAAAAAAPSGGGGGGEEERLEEKSEDQDLQGLRDKPLK FKKAKKDKKEDKEGKHE PLQPSAHHSAE PAEAGKAE TSES S GSAPAVPEASAS PKQRRS IIRDRGPMYDDPTLPEGWTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKV GDTSLDPNDFDFTVTGRGSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTGRPKAAAS

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EGVQVKRVLEKSPGKLWKMPFQASPGGKGEGGGATTSAQVMVIKRPGRKRKAEADPQA IPKKRGRKPGSWAAAAAEAKKKAVKESSIRSVHE TVL PIKKRKTRE TVSIEVKEWKP LLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESTKAPMP LLPSPPPPEPESSEDPISPPEPQDLSSSICKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPMVAT TTTVAEKYKHRGEGERKDIVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTERVS [00252] [SEQ ID NO: 30] Sequência de polipeptídeo de MeCP2 do tipo selvagem de camundongo de comprimento total (isoforma e2) [00253] MVAGMLGLREEKSEDQDLQGLRDKPLKFKKAKKDKKEDKEGKHE

PLQPSAHHSAEPAEAGKAETSESSGSAPAVPEASASPKQRRSIIRDRGPMYDDPTLPEG WTRKLKQRKSGRSAGKYDVYLINPQGKAFRSKVELIAYFEKVGDTSLDPNDFDFTVTGR GSPSRREQKPPKKPKSPKAPGTGRGRGRPKGSGTGRPKAAASEGVQVKRVLEKSPGKLV VKMPFQASPGGKGEGGGATTSAQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSWAAAA AEAKKKAVKE SSIRSVHE TVLPIKKRKTRE TVSIEVKEWKPLLVS TLGEKSGKGLKTC KSPGRKSKESSPKGRSSSASSPPKKEHHHHHHHSESTKAPMPLLPSPPPPEPESSEDPI

SPPEPQDLSSSICKEEKMPRGGSLESDGCPKEPAKTQPMVATTTTVAEKYKHRGEGERK DIVSSSMPRPNREEPVDSRTPVTERVS [00254] [SEQ ID NO: 31] Sequência de cDNA de MeCP2 de tipo selvagem de camundongo de comprimento total (isoforma e2) [00255] ATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCAGGGAGGAAAAGTCAGAAGA

CCAGGATCTCCAGGGCCTCAGAGACAAGCCACTGAAGTTTAAGAAGGCGAAGAAAGACA AGAAGGAGGACAAAGAAGGCAAGCATGAGCCACTACAACCTTCAGCCCACCATTCTGCA GAGCCAGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAAACATCAGAAAGCTCAGGCTCTGCCCCAGCAGT GCCAGAAGCCTCGGCTTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATTATCCGTGACCGGGGACCTA

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TGTATGATGACCCCACCTTGCCTGAAGGTTGGACACGAAAGCTTAAACAAAGGAAGTCT GGCCGATCTGCTGGAAAGTATGATGTATATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCTTTTCG CTCTAAAGTAGAATTGATTGCATACTTTGAAAAGGTGGGAGACACCTCCTTGGACCCTA ATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCAGGAGAGAGCAGAAACCA CCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGGGGTCGGGGACGCCCCAA AGGGAGCGGCACTGGGAGACCAAAGGCAGCAGCATCAGAAGGTGTTCAGGTGAAAAGGG TCCTGGAGAAGAGCCCTGGGAAACTTGTTGTCAAGATGCCTTTCCAAGCATCGCCTGGG GGTAAGGGTGAGGGAGGTGGGGCTACCACATCTGCCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCC TGGCAGAAAGCGAAAAGCTGAAGCTGACCCCCAGGCCATTCCTAAGAAACGGGGTAGAA AGCCTGGGAGTGTGGTGGCAGCTGCTGCAGCTGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAG TCTTCCATACGGTCTGTGCATGAGACTGTGCTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGA GACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTTGGTG AGAAAAGCGGGAAGGGACTGAAGACCTGCAAGAGCCCTGGGCGTAAAAGCAAGGAGAGC AGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGTGCCTCCTCCCCACCTAAGAAGGAGCACCATCATCA CCACCATCACTCAGAGTCCACAAAGGCCCCCATGCCACTGCTCCCATCCCCACCCCCAC CTGAGCCTGAGAGCTCTGAGGACCCCATCAGCCCCCCTGAGCCTCAGGACTTGAGCAGC AGCATCTGCAAAGAAGAGAAGATGCCCCGAGGAGGCTCACTGGAAAGCGATGGCTGCCC CAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCTATGGTCGCCACCACTACCACAGTTGCAGAAAAGT ACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCTTCCATGCCAAGGCCA AACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGC

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

1. Materiais e Métodos

Nomenclatura [00256] De acordo com a convenção, todos os números de aminoácidos fornecidos a seguir se referem à isoforma e2.

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Os números se referem a aminoácidos homólogos em humanos (acesso NCBI P51608) e em camundongos (acesso NCBI Q9Z2D6) até o resíduo 385, onde há uma inserção de dois aminoácidos na proteína humana.

Análise de mutação [00257] Os dados mutacionais foram coletados como descrito anteriormente⁴: mutações causais de missense causadoras de RTT foram extraídas a partir do conjunto de dados RettBASE¹³; e os polimorfismos identificados em machos hemizigotos saudáveis foram extraídos do banco de dados do Exome Aggregation Consortium (ExAC)¹⁴.

Projeto de proteínas MeCP2 encurtadas [00258] O MBD e o NID foram definidos como resíduos 72 a 173 e 272 a 312, respectivamente. Todos os três construtos retêm as sequências N-terminais extremas codificadas pelos éxons 1 e 2 - presentes nas isoformas el e e2, respectivamente. Eles também incluem os três primeiros aminoácidos dos éxons 3 (EEK) para preservar o sítio aceitador da emenda. A região de intervenção (I) foi substituída em ΔΝΙΟ pelo NLS do SV40 precedido por um ligante flexível. A sequência do NLS é PKKKRKV (SEQ ID NO: 32) (sequência de DNA: CCCAAGAAAAAGCGGAAGGTG (SEQ ID NO: 33)) e a do ligante é GSSGSSG (SEQ ID NO: 34) (sequência de DNA: GGATCCAGTGGCAGCTCTGGG (SEQ ID NO: 35) ) . Todas as três proteínas foram marcadas no C-terminal com EGFP conectado

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97/125 por um ligante. Para ser consistente com um estudo anterior, marcando MeCP2¹⁶ de comprimento total, a sequência de ligação CKDPPVAT (SEQ ID NO: 36) (sequência de DNA: TGTAAGGATCCACCGGTCGCCACC (SEQ ID NO: 37)) foi usada para conectar o C-terminal de ΔΝ ao EGFP. Para conectar o NID ao marcador EGFP em ΔΝΟ e ANIC, foi utilizado o ligante GSSGSSG (SEQ ID NO: 38) (sequência de DNA: GGGAGCTCCGGCAGTTCTGGA (SEQ ID NO: 39)). As sequências de aminoácidos das isoformas el e e2 para os polipeptideos WT-EGFP, ΔΝ-EGFP, ANC-EGFP e ANIC-EGFP são aqui fornecidas como SEQ ID NOs 40 a 47, respectivamente. As sequências de cDNA das isoformas el e e2 para os polipeptideos WT-EGFP, ΔΝ-EGFP, ANC-EGFP e ANIC-EGFP são aqui fornecidas como SEQ ID NOs 48 a 55, respectivamente.

[00259] Para expressão em células cultivadas, as sequências de cDNA que codificam isoformas e2 da série de deleção de MeCP2 foram sintetizadas (GeneArt, Thermo Fisher Scientific) e clonadas no vetor pEGFPNl (Clontech) usando sítios de restrição Xhol e Notl (NEB). As mutações pontuais (R111G e R306C) foram inseridas no plasmídeo WT-EGFP usando o Kit de Mutagênese Direcionada ao Sítio QuikChange II XL (Agilent Technologies). Sequências de iniciadores para R111G: TGGACACGAAAGCTTAAACAAGGGAAGTCTGGCC Adiante (SEQ ID NO: 56) e GGCCAGACTTCCCTTGTTTAAGCTTTCGTGTCCA Reverso (SEQ ID NO: 57); eR306C: CTCCCGGGTCTTGCACTTCTTGATGGGGA Adiante (SEQ ID NO: 58) e TCCCCATCAAGAAGTGCAAGACCCGGGAG Reverso (SEQ ID

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NO: 59). Para o direcionamento de células ES, as sequências genômicas que codificam os éxons 3 e 4 das proteínas encurtadas marcadas com EGFP foram sintetizadas (GeneArt, Thermo Fisher Scientific) e clonadas em um vetor de direcionamento²⁴ usado anteriormente usando sítios de restrição MfeI (NEB). Este vetor contém um gene de resistência à Neomicina seguido por um cassete 'STOP' transcricional, flanqueado por sítios LoxP ('floxed') no intron 2.

[00260] Para entrega viral de proteínas MeCP2 encurtadas, foram preparadas proteínas marcadas com epítopo Myc. As sequências de aminoácidos dos polipeptídeos ANC-Myc e ΔΝΙΟ- Myc são aqui fornecidas como SEQ ID NOs 60 a 61, respectivamente. As sequências de cDNA dos polipeptídeos ΔΝΟ-Myc e ΔΝΙΟ-Myc são aqui fornecidas como SEQ ID NOs 62 a 63, respectivamente. Cultura de células [00261] As células HeLa e NIH-3T3 foram cultivadas em DMEM (Gibco) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS; Gibco) e Penicilina-Estreptomicina a 1% (Gibco). As células ES foram cultivadas em Glasgow MEM (Gibco) suplementado com soro fetal bovino (FBS; Gibco testado em lote), 1% de aminoácidos não essenciais (Gibco), 1% de piruvato de sódio (Gibco), 0,1% de β-mercaptoetanol (Gibco) e LIE (ESGRO). Imunoprecipi tação

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99/125 [00262] As células HeLa foram transfectadas com plasmideos pEGFPNl-MeCP2 usando JetPEI (PolyPlus Transfection) e colhidas após 24-48 horas. Os extratos nucleares foram preparados usando Benzonase (Sigma E101425KU) e NaCl 150 mM, e os complexos MeCP2-EGFP foram capturados usando esferas de GFP-Trap_A (Chromotek), como descrito anteriormente⁴. As proteínas foram analisadas por western blotting usando anticorpos para GFP (NEB # 2956), NCoR (Bethyl A301-146A), HDAC3 (Sigma 3E11) eTBLIXRl (Bethyl A300-408A), todos em uma diluição de 1:1000; seguido de anticorpos secundários LI-COR: IRDye® 800CW Burro antiCamundongo (926-32212) e IRDye® 800CW Burro anti-Coelho (926-32213) ou IRDye® 680LT Burro anti-Coelho (926-68023) em uma diluição de 1: 10.000.

Ensaio de recrutamento [00263] As células NIH-3T3 foram semeadas em lamínulas em placas de 6 cavidades (25.000 células por cavidade) e transf ectadas com 2 pg de DNA do plasmídeo (pEGFPNl-MeCP2 e pmCherry-TBLIX) usando JetPEI (PolyPlus Transfection). Após 48 horas, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% (p/v), coradas com DAPI (Sigma) e depois montadas usando ProLong Diamond (Life Technologies). As células fixas foram fotografadas usando microscopia confocal (Leica SP5).

Geração de camundongos knock-in

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100/125 [00264] Os vetores de direcionamento foram introduzidos nas células 129/Ola E14 TG2a ES por eletroporação, e os clones resistentes a G418 com direcionamento correto no locus Mecp2 foram identificados por PCR e triagem por Southern blot. A tecnologia CRISPRCas9 foi usada para aumentar a eficiência de direcionamento das linhagens ΔΝ e ΔΝΙΟ: a sequência de RNA guia (GGTTGTGACCCGCCATGGAT) (SEQ ID NO: 64) foi clonada em pX330U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (um presente de Feng Zhang; Plasmídeo de Addgene # 42230²⁵) , que foi introduzido nas células ES com os vetores de direcionamento. Isso introduziu um corte de fita dupla no intron 2 do gene do tipo selvagem (no sítio do cassete NeoSTOP no vetor alvo). Os camundongos foram gerados a partir de células ES, conforme descrito anteriormente²⁶. O cassete 'floxed' NeoSTOP foi removido ín vivo através do cruzamento de quimeras com fêmeas homozigotas da cepa transgênica CMV-Cre deletora (JAX Stock # 006054) sobre um fundo C57BL/6J. O transgene CMV-Cre foi subsequentemente produzido. Todos os camundongos utilizados neste estudo foram criados e mantidos nas instalações de animais da Universidade de Edimburgo, sob condições e procedimentos padrão, realizados por funcionários licenciados pelo UK Home Office e de acordo com a Lei de Procedimentos Animais e Científicos de 1986.

Caracterização bioquímica de camundongos knock-in

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101/125 [00265] Para análise bioquímica, os cérebros foram colhidos por congelamento instantâneo em nitrogênio líquido às 6-13 semanas de idade, a menos que indicado de outra forma. Os cérebros de camundongos machos hemizigotos foram utilizados para todas as análises, a menos que indicado de outra forma. Para análise de Southern blot, meios cérebros foram homogeneizados em Tris Cl 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 5 mM e tratados com Proteinase K 0,4 mg/ml em SDS a 1% a 55 °C durante a noite. As amostras foram tratadas com 0,1 mg/ml de RNAseA por 1-2 horas a 37 °C, antes da extração com fenol: clorofórmio do DNA genômico. O DNA genômico foi purificado a partir de células ES usando o Puregene Core Kit A (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante para células cultivadas. O DNA genômico foi digerido com enzimas de restrição (NEB), separado por eletroforese em gel de agarose e transferido para as membranas ZetaProbe (BioRad). As sondas de DNA homólogas ao éxon 4 ou ao final do braço de homologia da 3' foram marcadas radioativamente com [a32] dCTP (Perkin Elmer) usando o Sistema de Marcação Prime-aGene (Promega). As manchas foram sondadas durante a noite, lavadas e expostas em cassetes de fósforo-imagem antes da digitalização em um Typhoon ELA 7000. As bandas foram quantificadas usando o software ImageQuant.

[00266] Os níveis de proteína em extratos brutos do cérebro inteiro foram quantificados usando Western blotting.

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Os extratos foram preparados como descrito anteriormente¹⁶ e as transferências foram sondadas com anticorpos para GFP (NEB # 2956) ou MeCP2 (Sigma M6818), ambos na diluição de 1: 1.000, seguidos por anticorpos secundários LI-COR (listados acima). A histona H3 (Abeam abl791) foi usada como controle de carregamento (diluição 1: 10.000) . Os níveis foram quantificados usando o software Image Studio Lite Ver 4.0 e comparados usando testes t. Camundongos WT-EGFP¹⁶ foram utilizados como controle.

[00267] Para a análise por citometria de fluxo, cérebros frescos foram colhidos de animais de 12 semanas e homogeneizados por Dounce em 5 ml de tampão de homogeneização (sacarose 320 mM, CaC12 5 mM, Mg (Ac) 2 3 mM, Tris HC1 10 mM pH 7,8, 0,1 EDTA mM, NP40 0, 1%, PMSF 0,1 mM, β-mercaptoetanol 14,3 mM, inibidores de protease (Roche)) e 5 ml de meio de centrifugação com gradiente OptiPrep 50% (Optiprep 50% (Sigma D1556-250ML), CaC12 5 mM, Mg(Ac)2 3 mM, Tris HC1 10 mM, pH 7,8, PMSF 0,1 M, β-mercaptoetanol 14,3 mM) . Esta foi aplicada em camadas sobre 10 ml de solução OptiPrep a 29% (v/v em H2O) em tubos de centrífuga Ultra clear Beckman Coulter, e as amostras foram centrifugadas a 7.500 rpm por 30 minutos, 4 °C. Os núcleos sedimentados foram ressuspensos em tampão de ressuspensão (glicerol a 20% em DPBS com inibidores de protease (Roche)). Para análise por citometria de fluxo, os núcleos foram sedimentados a 600xg (5 minutos,

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103/125 °C), lavados em 1 ml de PBTB (5% (p/v) de BSA, 0,1% de Triton X-100 em DPBS com inibidores de protease (Roche)), e depois ressuspenso em 250 μΐ de PBTB. Para a coloração de NeuN, 10 μΐ de anticorpo NeuN-A60 (Millipore MAB377) foram conjugados com Alexa Fluor 647 (Kit de Marcação de Anticorpo APEX, Invitrogen A10475) , adicionados a uma diluição de 1: 125 e incubados em rotação por 45 minutos a 4 °C. A citometria de fluxo (BD LSRFortessa SORP) foi usada para obter a expressão média de EGFP para o núcleo total (n = 50.000 por amostra) e a subpopulação NeuN alta (neuronal) (n > 8.000 por amostra), e os genótipos foram comparados usando testes t. Camundongos WT-EGFP¹⁶ foram utilizados como controle.

[00268] Para determinar os níveis de mRNA, o RNA foi purificado e transcrito reversamente a partir de meios cérebros; e os transcritos de Mecp2 e Ciclofilina A foram analisados por qPCR como descrito anteriormente¹⁶. Os níveis de mRNA em camundongos ANIC foram comparados com ninhadas do tipo selvagem usando um teste t.

Caracterização fenotípica de camundongos knock-in [00269] Consistente com um estudo anterior¹⁶, os camundongos foram cruzados quatro gerações para atingir ~ 94% C57BL/6J antes de serem submetidos à caracterização fenotípica. Duas coortes separadas, cada uma consistindo em 10 animais mutantes e 10 ninhadas do tipo selvagem, foram produzidas para cada nova linhagem de reprodução. Uma coorte

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104/125 foi pontuada e pesada regularmente a partir de 4-52 semanas de idade, conforme descrito anteriormente^24,27 . A sobrevivência foi representada graficamente usando gráficos de Kaplan Meier. (Também foi avaliada uma coorte preliminar consanguinea [75% C57BL/6J] de 7 camundongos ANC e 9 companheiros de ninhada do tipo selvagem.) A segunda coorte retrocruzada foi submetida a análise comportamental entre as semanas 20 e 21 de idade (consulte os protocolos detalhados ²⁷ e ¹⁶) . Os testes foram realizados em um período de duas semanas: Elevated Plus Maze no dia 1, teste de campo aberto no dia 2 e teste de aceleração do Rotarod nos dias 6 a 9 (um dia de treinamento seguido de três dias de testes). Todas as análises foram realizadas às cegas ao genótipo.

Análise estatística [00270] As curvas de crescimento foram comparadas usando medidas repetidas ANOVA. Para análise comportamental, quando todos os dados se ajustaram a uma distribuição normal (tempo do centro de campo aberto e distância percorrida) , os genótipos foram comparados usando testes t. Caso contrário (tempo de Elevated Plus Maze nos braços e latência do Rotarod de Aceleração a cair), os genótipos foram comparados usando os testes de Kolmogorov-Smirnov. A mudança no desempenho ao longo do tempo no teste Rotarod de Aceleração foi determinada usando os testes de Friedman.

Reativação genética de MeCP2 mínimo (ΔΝΙΟ

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105/125 [00271] O MeCP2 mínimo transcricionalmente silencioso (ANIC) foi reativado em camundongos 'STOP' do tipo nulo sintomáticos seguindo o procedimento usado em ²⁷. Em suma, o alelo Mecp2 de ΔΝΙΟ foi inativado pela retenção do cassete NeoSTOP no intron 2, acasalando quimeras com fêmeas do tipo selvagem em vez de camundongos deletores. As fêmeas STOP/+ resultantes foram cruzadas com machos transgênicos heterozigotos Cre-ER (JAX Stock # 004682) para produzir machos de quatro genótipos (87,5% C57BL/6J). Uma coorte composta pelos quatro genótipos WT (n = 4), WT CreER (n = 4), STOP (n = 9) e STOP CreER (n = 9) foi pontuada e pesada semanalmente a partir das 4 semanas de idade. A partir de 6 semanas (quando os camundongos STOP e STOP CreER exibiram sintomas do tipo RTT), todos os indivíduos receberam uma série de injeções de Tamoxifeno: duas por semana, seguidas por cinco por dia, cada uma na dose de 100 pg/g de peso corporal. O tecido cerebral dos animais STOP CreER (n = 8), WT (n = 1) e WT CreER (n = 1) tratados com Tamoxifeno foi colhido com 28 semanas de idade (após reversão bem-sucedida dos sintomas em camundongos STOP CreER) para análise bioquímica. O tecido cerebral de um camundongo STOP tratado com Tamoxifeno também foi incluído na análise bioquímica (métodos descritos acima).

Entrega do vetor de MeCP2 mínimo (ΔΝΙΟ

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106/125 [00272] O vetor de AAV de MeCP2 mínimo (ΔΝΙΟ) foi testado em camundongos Mecp2-nulo e WT mantidos em um fundo C57BL/6. Partículas de vetores AAV recombinantes foram geradas na instalação do UNC Gene Therapy Center Vector Core. Partículas de AAV auto-complementares (scAAV) (genomas flanqueados por AAV2 ITR empacotados em capsídeos AAV9) foram produzidas a partir de células HEK293 em suspensão transfectadas usando polietilenoimina (Polysciences, Warrington, PA) com plasmídeos auxiliares (pXX6-80, pGSK2/9) e um plasmídeo contendo o construto do transgene de ΔΝΙ3 flanqueada por ITR. O construto usado é ilustrado na Figura 17B, e a sequência anotada (SEQ ID NO: 65) do construto do transgene de hNIC flanqueada por ITR é mostrada na Figura 17C. Para relevância de tradução, o construto que expressa hNIC utilizou a sequência de codificação MECP2_el humana equivalente e com uma pequena marcação do epítopo Myc Cterminal substituindo a marcação EGFP usada em outras experiências. O transgene estava sob o controle de um fragmento de promotor endógeno estendido de Mecp2 (MeP426) incorporando elementos reguladores de promotor adicionais e um elemento silenciador putativo (Figura 17 B, C) . O construto também incorporou um novo 3'-UTR que consiste em um fragmento do MECP2 3'UTR endógeno, juntamente com um painel selecionado de sítios de ligação para miRNAs conhecidos por estarem envolvidos na regulação de _Mecp2³⁹~⁴¹

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107/125 (Figura 17 B, C). A produção do vírus foi realizada conforme descrito anteriormente²⁸ e o vetor preparado em uma formulação final de PBS com alto teor de sal (contendo NaCl total 350 mM) suplementado com sorbitol a 5%. Para injeção cerebral em camundongos, injeções bilaterais diretas de vírus (3 μΐ por sítio; dose = 1 x 10¹¹ de genoma viral por camundongo) foram entregues no neuropilo de machos Pl/2 não anestesiados, como descrito anteriormente²⁹. As injeções de controle foram feitas usando o mesmo diluente carecendo do vetor ('controle de veículo'). Os filhotes injetados foram devolvidos à gaiola doméstica e avaliados semanalmente como descrito acima.

2. Resultados [00273] A sequência de aminoácidos de MeCP2 é altamente conservada em todas as espécies de vertebrados (Fig. IA) , sugerindo que a maior parte da proteína está sujeita a seleção purificadora. Isso apoia a visão amplamente aceita de que suas interações com múltiplos parceiros de ligação são de importância funcional: com a qual o MeCP2 foi implicado em várias vias celulares necessárias para a função neuronal adequada^11,3. Um quadro alternativo surge ao analisar a distribuição de mutações missense causadoras de RTT, destacando apenas o MBD e o NID - uma pequena minoria da proteína - como críticos (Fig. IA). Além disso, os dados de sequenciamento de exoma coletados de indivíduos saudáveis

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108/125 mostram um grande número de polimorfismos nas outras regiões da proteína (Fig. IA), sugerindo que essas sequências são dispensáveis. Para testar se o MBD e o NID podem ser suficientes para a função MeCP2, projetamos uma série passo a passo de deleções do gene endógeno para remover as regiões N-terminais para o MBD (ΔΝ), C-terminais para o NID (AC) e os aminoácidos entre esses domínios (ΔΙ) (Fig. IB). A região de intervenção foi substituída por uma sequência de sinal de localização nuclear (NLS) derivada do virus SV40, conectada por ligantes curtos. O gene Mecp2 possui quatro éxons, com transcritos alternadamente unidos para produzir duas isoformas que diferem apenas no N-terminal³⁰ extremo. Para manter a estrutura do gene Mecp2 nos camundongos knock-in, os construtos mantiveram os éxons 1 e 2, bem como os primeiros 10 bp do éxon 3 (sítio aceitador de emenda), resultando na inclusão de 29 e 12 aminoácidos N-terminais para isoformas el e e2, respectivamente (Fig. 2 A-B, 3, 4). Uma marcação EGFP C-terminal foi adicionada para facilitar a detecção e recuperação, pois a marcação não afeta a função MeCP2 em camundongos¹⁶ (Fig. 1B). Considerando os sítios de ligação mapeados, as informações estruturais e a conservação evolucionária, incluímos o MBD como resíduos 72 a 173 e o NID como resíduos 272 a 312 (Fig. S1C-D) . A proporção de sequência de proteína MeCP2 nativa retida em ΔΝ, ANC e ANIC é de 88%, 52% e 32% do tipo selvagem, respectivamente.

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[00274	] Primeiro,	testamos	se	as	proteínas	MeCP2
encurtadas	mantinham a	capacidade	de	interagir com	o DNA
metilado e	o complexo	co-repressor	de	NCoR/SMRT	usando

ensaios baseados em cultura de células. Todos os três derivados proteicos imunoprecipitaram os componentes do complexo endógeno de NCoR/SMRT quando superexpressos nas células HeLa, enquanto essa interação foi abolida no mutante NID de controle negativo, R306C (Fig. 1C) . Para testar a ligação a mCpG, perguntamos se proteínas expressas localizadas em focos heterocromáticos pericêntricos ricos em mCpG em fibroblastos de camundongos. Trabalhos anteriores estabeleceram que a localização de MeCP2 de tipo selvagem para esses focos depende da metilação do DNA³¹,³² e da funcionalidade do MBD³³. Todas as três versões reduzidas de MeCP2 localizadas em focos heterocromáticos, enquanto um mutante MBD de controle negativo (R111G) mostrou uma distribuição nuclear difusa (Fig. 1D) . Para determinar se as proteínas encurtadas poderíam se ligar à cromatina e ao complexo de NCoR/SMRT simultaneamente, perguntamos se eles eram capazes de recrutar TBL1X, uma subunidade de NCoR/SMRT que se liga diretamente ao MeCP2⁴, à heterocromatina. O TBLIX-mCherry sobre expresso não possui NLS e, portanto, é citoplasmático, mas na presença de MeCP2 sobre expresso é recrutado com eficiência para focos heterocromáticos⁴. Todas as proteínas MeCP2 encurtadas também recrutaram TBL1X para

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110/125 os focos heterocromáticos, demonstrando sua capacidade de conectar o DNA com o co-repressor (Fig. 1E) . O controle mutante do MeCP2 de NID (R306C) se localizou corretamente, mas, como descrito anteriormente⁴, não foi possível realocar o TBL1X do citoplasma (Fig. 1E) . Esses três ensaios confirmam que todas as proteínas encurtadas mantêm a capacidade de se ligar ao DNA metilado e ao complexo de NCoR/SMRT e formam uma ponte entre elas.

[00275] Inicialmente, geramos camundongos knock-in ΔΝ e ΔΝΟ substituindo o alelo Mecp2 endógeno nas células ES, seguido pela injeção de blastocisto e transmissão da linhagem germinativa (Fig. 3). Essas proteínas truncadas foram expressas em níveis aproximadamente do tipo selvagem no cérebro inteiro e nos neurônios, conforme determinado por análises de western blot e citometria de fluxo (Fig. 5A-B). Para avaliar o fenótipo dessas truncações, os camundongos knock-in foram cruzados em um fundo C57BL/6J e as coortes foram submetidas a pontuações fenotípicas semanais²⁴, ²⁷ ou análise comportamental. Ambos os camundongos machos hemizigotos ΔΝ e ΔΝΟ foram viáveis, férteis e apresentaram escores fenotípicos indistinguíveis de seus companheiros de ninhada do tipo selvagem ao longo de um ano (Fig. 6A-D). Os camundongos ΔΝ não tinham fenótipo de peso corporal (Fig. 7A) , enquanto os camundongos ΔΝΟ exibiram um ligeiro aumento de peso em comparação com companheiros de ninhada do tipo

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111/125 selvagem (Fig. 7B, medidas repetidas ANOVA p < 0,0001). A diferença de peso estava ausente em uma coorte mais alta (75% C57BL/6J) de camundongos ANC (Fig. 7C), consistente com observações anteriores de que os fenótipos de peso corporal nos modelos de RTT são afetados pelo antecedente genético²⁶.

[00276] Com 20 semanas de idade, coortes separadas foram testadas para comportamentos comumente relatados em modelos de RTT: hipoatividade, ansiedade reduzida e habilidades motoras reduzidas. Nenhum fenótipo de atividade (analisado pela distância total percorrida no teste de Campo Aberto) foi detectado para os camundongos AN ou ANC (Fig. 8). Nenhum fenótipo de ansiedade (analisado pelo aumento do tempo gasto nos braços abertos do Elevated Plus Maze) foi detectado para qualquer nova linhagem de camundongo (Fig. 6E) . Os camundongos ANC, no entanto, gastam significativamente mais tempo do que seus companheiros de ninhada do tipo selvagem na praça central da arena de Campo Aberto (Fig. 6F), indicativos de ansiedade levemente diminuída. A coordenação motora foi avaliada usando o teste Rotarod de Aceleração por três dias. Enquanto os modelos de camundongos com RTT mostram desempenho prejudicado neste teste que é mais impressionante no terceiro dia^34,16, os camundongos AN e ANC não foram significativamente diferentes dos seus companheiros de ninhada do tipo selvagem em nenhum dos três dias (Fig. 6G). No geral, os resultados sugerem que

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112/125 as contribuições dos domínios N- e C-terminal para a função MeCP2 são, na melhor das hipóteses, sutis. Este resultado é particularmente notável dado os sintomas do tipo RTT em camundongos machos que expressam um truncamento C-terminal ligeiramente mais grave, que carece de resíduos além do T308³⁵ . A diferença no fenótipo pode ser explicada pela retenção da função NID completa em camundongos ANC, pois evidências anteriores indicam que a perda dos quatro aminoácidos C-terminais adicionais (309-312) reduz a afinidade dessa molécula MeCP2 truncada para o complexo compressor⁴ de NCoR/SMRT.

[00277] Em seguida, substituímos o gene endógeno de Mecp2 por ANIC, o alelo mínimo, contendo apenas os domínios MBD e NID e compreendendo 32% da sequência de proteína completa (Fig. 1B, 4) . Os níveis de proteína em todo o cérebro foram quantificados por Western blotting e citometria de fluxo, os quais mostraram abundância reduzida (~ 50% dos controles WT-EGFP; Fig. 9A-B) . Uma redução semelhante na abundância de proteínas também foi observada na subpopulação neuronal (~ 40% dos controles WT-EGFP; Fig. 9B). Níveis baixos de proteína não foram devidos ao silenciamento transcricional, já que o mRNA era de fato mais abundante em camundongos ANIC do que em companheiros de ninhada do tipo selvagem (Fig. 9C), sugerindo que a deleção da região intermediária compromete a estabilidade da

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113/125 proteína. Apesar dos baixos níveis de proteína, os camundongos ANIC machos tiveram uma vida útil normal (Fig. 9E, 10). A pontuação fenotípica ao longo de um ano detectou fenótipos neurológicos leves (Fig. 9D) , predominantemente anormalidades da marcha e fechamento parcial dos membros posteriores. Esses sintomas persistiram durante o período de pontuação, mas não se tornaram mais graves. Os camundongos ΔΝΙΟ também pesavam ~ 40% menos que seus irmãos do tipo selvagem (Fig. 11A; medidas repetidas ANOVA p < 0,0001). Como observado neste estudo, tanto os aumentos quanto as diminuições no peso corporal foram relatados anteriormente em modelos de camundongos mutantes do MeCP2²⁶, ³⁶, ²³, ¹⁶ . A análise comportamental de uma coorte separada em 20 semanas mostrou diminuição da ansiedade em camundongos ΔΝΙΟ machos, como evidenciado pelo tempo significativamente reduzido gasto nos braços fechados do Elevated Plus Maze (Fig. 9F, teste KS p = 0,003). Este resultado não foi suportado pelo teste de campo aberto (Fig. 9G) , que também não detectou fenótipo de atividade (Fig. 12). Consistente com os defeitos da marcha detectados na coorte de pontuação, os camundongos ΔΝΙΟ reduziram a coordenação motora, demonstrando desempenho declinante ao longo de três ensaios diários no Rotarod de Aceleração (Fig. 9H, teste de Friedman p = 0, 003) . Isso resultou em desempenho significativamente prejudicado no terceiro dia de teste em comparação com os companheiros de

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114/125 ninhada do tipo selvagem (teste KS p = 0, 003) . No geral, é digno de nota que os animais ANIC são muito menos afetados do que os camundongos machos com a mais leve mutação comum encontrada em pacientes com RTT, o R133C, que teve uma vida média de 42 semanas, escores sintomáticos mais altos e um fenótipo de peso reduzido mais forte¹⁶ (Fig. 13) Esse resultado apoia fortemente nossa hipótese de que o recrutamento do complexo co-repressor de NCoR/SMRT para a cromatina é a função principal do MeCP2, com o fenótipo leve observado sendo uma provável consequência de níveis reduzidos de proteínas, conforme descrito anteriormente para camundongos hipomórficos que expressam de comprimento médio em 50% dos níveis do tipo selvagem³⁷.

[00278] Para testar ainda mais a funcionalidade do MeCP2 mínimo, perguntamos se o fornecimento tardio de ANIC via reativação genética podería reverter defeitos fenotípicos em camundongos sintomáticos com deficiência de MeCP2, como foi mostrado anteriormente para a proteína completa²⁴. Geramos camundongos deficientes em MeCP2 do tipo nulo, impedindo a expressão de ANIC com um cassete STOP transcricional floxado no intron 2 (Fig. 4, 14) . Estes camundongos foram cruzados com camundongos portadores de um transgene CreER (Cre recombinase fundida com um receptor de estrogênio modificado) para permitir a reativação após o tratamento com Tamoxifeno. Isso foi induzido após o início

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115/125 dos sintomas nos camundongos STOP CreER (Fig. 15A), resultando em altos níveis de recombinação Cre (Fig. 16A) e níveis de proteína semelhantes aos camundongos ΔΝΙΟ (Fig. 16B). A reativação do gene ΔΝΙΟ teve um efeito dramático na progressão fenotípica, melhorando os sintomas neurológicos e restaurando a sobrevida normal (Fig. 15B-C). Por outro lado, os camundongos STOP carecendo do transgene CreER não sobreviveram além de 26 semanas. Assim, apesar do seu comprimento radicalmente reduzido e abundância relativamente baixa, ο ΔΝΙΟ foi capaz de reverter efetivamente o fenótipo do tipo RTT em camundongos com deficiência de MeCP2.

[00279] Essa descoberta nos levou a explorar se ΔΝΙΟ podería ser usado para terapia gênica, o qual testamos em camundongos Mecp2 nulos. O gene ΔΝΙΟ, acionado por um promotor de Mecp2 mínimo, foi marcado com um epítopo Myc (no lugar de EGFP muito maior) e empacotado em um vetor viral adeno-associado (AAV9). Os camundongos neonatais (Pl-2) foram injetados intracranialmente com esse vírus ou apenas com o veículo AAV (Fig. 15D) . Os animais Mecp2 nulos que receberam o gene ΔΝΙΟ mostraram severidade de sintomas muito reduzida e maior sobrevida (Fig. 15E-F). Apesar da falta de controle fino sobre a taxa de infecção por célula cerebral, não observamos efeitos deletérios devido à superexpressão, mesmo em animais do tipo selvagem (Fig. 17) . É concebível que a toxicidade seja mitigada pela instabilidade moderada

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116/125 e/ou atividade reduzida da proteína ANIC. Esta experiência também mostra que a proteína ANIC é funcional sem a grande marcação EGFP. 0 uso de MeCP2 mínimo pode fornecer uma vantagem terapêutica devido à capacidade restrita dos vetores de AAV. Encurtar a sequência de codificação cria espaço para sequências regulatórias adicionais, permitindo um melhor controle dos níveis de expressão.

3. Discussão [00280] No geral, nossos resultados argumentam contra a visão de que o MeCP2 funciona como um hub multifuncional e, em vez disso, suporta um modelo mais simples, pelo qual sua função predominante é recrutar o complexo co-repressor de NCoR/SMRT para sítios metilados na cromatina. Vale ressaltar que a proteína de MeCP2 mínimo (ANIC) está ausente ao todo ou em parte de vários domínios que foram destacados como potencialmente importantes, incluindo os ganchos AT²³, vários sítios de fosforilação dependentes de atividade^17,18, um motivo de ligação a RNA ⁶ e sítios de interação para proteínas envolvidas no processamento de micro-RNA⁹, splicing¹⁰ e remodelação da cromatina⁸. É importante ressaltar que nossa descoberta de que esses dois domínios são suficientes para restaurar a função neuronal em camundongos com deficiência de MeCP2 nos permitiu mostrar o potencial terapêutico da proteína mínima.

4. Experiência Adicional

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117/125 [00281] O aparecimento de toxicidade na forma de disfunção motora, ataxia e perda aparente de propriocepção quando Mecp2/MECP2 de comprimento total é administrado a camundongos foi relatado anteriormente^49,50 . Um relatório independente mostrou recentemente uma ataxia estereotipada idêntica e perda de propriocepção em resposta à entrega da variante AAV9 (AAVhu68) em espécies maiores de mamíferos e demonstrou que os gânglios da raiz dorsal do nervo periférico podem ser especialmente suscetíveis à dosagem da variante AAV9⁵¹.

[00282] Realizamos uma comparação direta do comprimento total do MECP2 e do ANIC MECP2 (Tabela 3) . Observamos uma redução significativa da ataxia e da disfunção de propriocepção nos animais tratados com AAV9 ANIC MECP2 em comparação aos camundongos tratados com MECP2 de comprimento total. Estes dados suportam o fato de que, em condições idênticas, o mini gene ANIC MECP2 confere uma susceptibilidade reduzida à neurotoxicidade periférica conhecida em comparação com a MeCP2 de comprimento total.

[00283] Tabela 3: Comparação de MECP2 de comprimento total e o ANIC MECP2 AAV9-MeP229/MECP2 se refere a um vetor AAV2/9 com o forte fragmento de 229 bp do promotor endógeno de Mecp2 e MECP2 de comprimento total; AAV9- MeP426/MECP2 se refere a um vetor AAV2/9 com o fragmento de 426 bp do promotor endógeno de Mecp2 e MECP2 de comprimento total; AAV9

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MeP426/hNIC MECP2 se refere a um vetor AAV2/9 com o fragmento de 426 bp do promotor endógeno Mecp2 e a inserção de minigene ΔΝΙΟ MECP2.

Vetor	Toxicidade
AAV9-MeP229/MECP2	Ataxia grave/perda de propriocepção em 100% dos camundongos tratados
AAV9-MeP42 6/MECP2	Ataxia leve/perda de propriocepção/estreitamento em 100% dos camundongos tratados
AAV9-MeP42 6/ANIC MECP2	Ataxia leve/perda de propriocepção/estreiamento em < 25% (4 de 17) dos camundongos tratados

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo sintético caracterizado pelo fato de que compreende:

(i) uma sequência de aminoácidos MBD apresentando pelo menos 70% de similaridade com a sequência de aminoácidos, como representada na SEQ ID NO: 1; e ii) uma sequência de aminoácidos NID apresentando pelo menos 70% de similaridade com a sequência de aminoácidos, como representado na SEQ ID NO: 2, em que o polipeptídeo tem uma deleção de pelo menos 50 aminoácidos, quando comparado com as sequências MeCP2 el e e2 de comprimento total (SEQ ID Nos. 3 e 4).
2. Polipeptídeo sintético, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem menos que 90% de identidade em todo o comprimento das sequências de aminoácidos de MeCP2, como representado nas SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.
3. Polipeptídeo sintético, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que tem a estrutura:

A-B-C-D-E onde a porção B do polipeptídeo sintético é a referida sequência de aminoácidos MBD, e

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2/9 a porção D do polipeptídeo sintético é a referida sequência de aminoácidos NID, e ainda em que:

a porção A do polipeptídeo sintético tem menos que 40 aminoácidos de comprimento e/ou tem menos que 8 0% de identidade com as sequências de aminoácidos, como representadas nas SEQ ID NOs: 5 e 6, calculadas ao longo de todo o comprimento das sequências de aminoácidos, como representado nas SEQ ID NOs: 5 e 6;

a porção C do polipeptídeo sintético tem menos que 20 aminoácidos de comprimento e/ou tem menos que 8 0% de identidade com a sequência de aminoácidos, como representada na SEQ ID NO: 7, calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos, como representado em SEQ ID NO: 7; e/ou a porção E do polipeptídeo sintético está ausente, é um marcador de proteína e/ou tem menos que 80% de identidade com a sequência de aminoácidos como representada na SEQ ID NO: 8, calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos como representada na SEQ ID NO: 8.
4. Polipeptídeo sintético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo sintético é capaz de recrutar um componente complexo co-repressor NCoR/SMRT, tal como

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3/9

NCoR/SMRT, HDAC3, GPS2, TBL1X ou TBLR1, preferencialmente TBL1X ou TBLR1, para DNA metilado.
5. Polipeptídeo sintético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo sintético consiste em menos que 430 aminoácidos, preferencialmente menos que 400, 350, 320, 270 ou 200 aminoácidos, e ainda preferencialmente menos que 180 aminoácidos.
6. Polipeptídeo sintético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo compreende um sinal de localização nuclear (NLS), de preferência em que o referido NLS está compreendido dentro da sequência de aminoácidos entre o MBD e o NID.
7. Polipeptídeo sintético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos entre as sequências de aminoácidos MBD e NID tem menos que 75% de identidade com a sequência de aminoácidos, como representada na SEQ ID NO: 7, calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos como representada na SEQ ID NO: 7, de preferência menos que 50%, e ainda preferencialmente menos que 30% de identidade.
8. Polipeptídeo sintético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos entre as sequências de aminoácidos

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4/9

MBD e NID tem menos que 50 aminoácidos de comprimento, preferencialmente menos que 30 aminoácidos de comprimento e ainda mais preferencialmente menos que 20 aminoácidos de comprimento.
9. Polipeptídeo sintético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos entre as sequências de aminoácidos MBD e NID tem uma substituição ou deleção de pelo menos 10 aminoácidos consecutivos em comparação com a sequência de aminoácidos a partir da posição 207 até a posição 271 da sequência de polipeptídeo MeCP2 do tipo selvagem humano de comprimento completo (isoforma e2) como mostrado na SEQ ID NO: 4 .
10. Polipeptídeo sintético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos adjacente à extremidade carboxi da sequência de aminoácidos NID tem menos que 75% de identidade com a sequência de aminoácidos, conforme representada na SEQ ID NO: 8, calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos como representada na SEQ ID NO: 8, de preferência menos que 50%, e ainda preferencialmente menos que 30% de identidade.
11. Polipeptídeo sintético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos adjacente à extremidade carboxi da

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5/9 sequência de aminoácidos NID tem menos que 50 aminoácidos de comprimento, de preferência menos que 30 aminoácidos de comprimento ou menos que 20 aminoácidos de comprimento, e ainda mais preferencialmente em que não existe uma sequência de aminoácidos adjacente à extremidade carboxi da sequência de aminoácidos NID.
12. Polipeptídeo sintético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos adjacente à extremidade amino da sequência de aminoácidos MBD tem menos que 75% de identidade com as sequências de aminoácidos, conforme representado nas SEQ ID NOs: 5 e 6, calculadas ao longo de todo comprimento das sequências de aminoácidos, como representado nas SEQ ID NOs: 5 e 6, de preferência menos que 50%, e ainda preferencialmente, menos que 30% de identidade.
13. Polipeptídeo sintético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos adjacente à extremidade amino da sequência de aminoácidos MBD tem menos que 50 aminoácidos de comprimento, de preferência menos que 30 aminoácidos de comprimento ou menos que 20 aminoácidos de comprimento, e ainda mais preferencialmente menos que 10 aminoácidos de comprimento.
14. Polipeptídeo sintético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o

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6/9 polipeptídeo tem menos que 90% de identidade em todo o comprimento das sequências de aminoácidos de MeCP2, como representado nas SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, de preferência menos que 80% de identidade, menos que 70% de identidade ou menos que 60% de identidade e ainda mais preferencialmente menos que 40% de identidade.
15. Constructo de ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
16. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo sintético como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
17. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ou mais elementos de controle selecionados a partir de: um promotor para expressão da sequência de nucleotídeos em células neuronals, por exemplo, um promotor Mecp2 ou MECP2, um ou mais locais de ligação a miR à jusante de MECP2 ou Mecp2 3'UTR, e um elemento rico em AU.
18. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que é um vetor viral, tal como um vetor retroviral, um vetor adenoviral, um vetor viral adeno-associado ou um vetor alfaviral.

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7/9
19. Virion caracterizado pelo fato de que compreende um vetor como definido na reivindicação 18.
20. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo sintético como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, um construto de ácido nucleico como definido na reivindicação 15, um vetor de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 18 e/ou um virion como definido na reivindicação 19.
21. Célula caracterizada pelo fato de que compreende um construto genético sintético adaptado para expressar um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
22. Célula, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 18.
23. Célula, de acordo com as reivindicações 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que é para a produção de um virion como definido na reivindicação 19.
24. Método para tratar ou prevenir doenças em um animal caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao referido animal um polipeptídeo sintético como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a referida doença é um

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8/9 distúrbio neurológico associado à mutação de inativação de MeCP2, por exemplo, sindrome de Rett.
26. Método, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a referida administração compreende administrar uma composição compreendendo um polipeptídeo sintético como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, um construto de ácido nucleico como definido na reivindicação 15, um vetor de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 18, um virion como definido na reivindicação 19 e/ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 20.
27. Polipeptídeo sintético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, construto de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, virion, de acordo com a reivindicação 19, e/ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado (a) pelo fato de que é para o tratamento ou prevenção de um distúrbio neurológico associado à mutação de inativação de MeCP2, por exemplo, sindrome de Rett.
28. Uso de um polipeptídeo sintético como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, um construto de ácido nucleico como definido na reivindicação 15, um vetor de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 18, um virion como definido na reivindicação 19 e/ou

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9/9 uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um distúrbio neurológico associado à mutação de inativação de MeCP2, por exemplo, síndrome de Rett.