JP2022526823A - リソソーム障害のための遺伝子療法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）などの異常なリソソーム機能に関連する疾患の治療のための組成物及び方法に関する。本開示はまた、プログラニュリンまたはその一部分をコードする導入遺伝子を含む発現構築物を提供する。本開示は、そのような発現構築物をＦＴＤの治療を必要とする対象に投与することによってＦＴＤを治療する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／９８８，６６５号、２０２０年１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９６０，４７１号、２０１９年１２月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／９５４，０８９号、２０１９年１１月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／９３４，４５０号、及び２０１９年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／８３１，８４６号の優先権を主張する。これらの出願の各々の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読フォーマットコピー（ファイル名：ＰＲＶＬ＿０１０＿０５ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０２０年４月１０日、ファイルサイズ約６１２，９０２バイト）。
分野
本開示は、遺伝子療法の分野及びそれを使用する方法に関する。
ゴーシェ病は、リソソーム酸性β－グルコセレブロシダーゼ（Ｇｃａｓｅ、「ＧＢＡ」）の欠乏によるスフィンゴ糖脂質代謝の稀な先天性異常である。患者は、肝脾腫大、汎血球減少症につながる骨髄不全、肺障害及び線維症、ならびに骨欠損を含む非ＣＮＳ症状及び所見に苦しむ。さらに、かなりの数の患者は、衝動性眼球運動及び視線の欠陥、発作、認知障害、発達遅延、及びパーキンソン病を含む運動障害を含む神経学的症状に苦しむ。造血骨髄及び内臓における末梢疾患及び主な臨床症状に対処するいくつかの治療法が存在し、それは、以下に記載する酵素補充療法、欠陥のあるＧｃａｓｅと結合して安定性を向上させるシャペロン様小分子薬剤、ならびにゴーシェ病において蓄積して症状及び所見に至る基質の産生を遮断する基質減少療法を含む。しかしながら、ゴーシェ病の他の側面（特に骨格及び脳に影響を及ぼすもの）は、治療に対して難治性であるようである。
プログラニュリン（ＰＧＲＮ）は、リソソーム機能に関連する付加的なタンパク質である。ＰＧＲＮは、ＧＲＮ遺伝子によってコードされる。ヒトにおけるＧＲＮハプロイ不全は、ＦＴＤ－ＧＲＮ（ＧＲＮ変異を伴う前頭側頭型認知症）、前頭葉及び側頭葉の萎縮を伴う、実行機能の障害、行動における変化、及び言語障害によって特徴付けられる神経変性疾患を発症するリスクが約９０％に至る。ＦＴＤ患者には疾患修飾療法がない。
本明細書では、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法が提供され、方法は、対象に以下を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含む。（ｉ）ＰＧＲＮタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物は配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶベクター、及び（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、約１×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）～約７×１０１４ｖｇの範囲の用量で対象に投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、大槽への注射を介して投与される。
いくつかの実施形態において、ＰＧＲＮタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターは、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーをさらに含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部をさらに含む。いくつかの実施形態において、核酸は、発現構築物に隣接する２つのアデノ随伴ウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。いくつかの実施形態において、各ＩＴＲ配列は、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、５’ＩＴＲ及び発現構築物の間のＴＲＹ領域をさらに含み、ＴＲＹ領域は、配列番号２８を含む。
本明細書では、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法が提供され、方法は、対象に以下を含むｒＡＡＶを投与することを含む。（ｉ）５’から３’の順に、（ａ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ、（ｂ）ＣＭＶエンハンサー、（ｃ）ＣＢＡプロモーター、（ｄ）ＰＧＲＮタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、導入遺伝子挿入物が配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、導入遺伝子挿入物、（ｅ）ＷＰＲＥ、（ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部、及び（ｇ）ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、核酸を含むｒＡＡＶベクター、ならびに
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、約１×１０１３ｖｇ～約７×１０１４ｖｇの範囲の用量で対象に投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、大槽への注射を介して投与される。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、約２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約２００ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．００１％ｗ／ｖのポロキサマー１８８を含む製剤で投与される。
本明細書で提供されるのは、以下を含む医薬組成物が提供される。（ｉ）（ａ）ＰＧＲＮタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶベクター、ならびに（ｂ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ、（ｉｉ）約２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、（ｉｉｉ）約１ｍＭのＭｇＣｌ２、（ｉｖ）約２００ｍＭのＮａＣｌ、及び（ｖ）約０．００１％ｗ／ｖのポロキサマー１８８。
本明細書では、以下を含むｒＡＡＶが提供される。（ａ）ＰＧＲＮタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物は配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶベクター、及び（ｂ）対象におけるＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を治療する方法において使用するためのＡＡＶ９キャプシドタンパク質。
本明細書では、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料におけるＰＧＲＮタンパク質レベルを定量する方法が提供され、方法は、以下を含む。（１）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び試料緩衝液を含むマスター混合物においてＣＳＦ試料を希釈すること、（２）希釈ＣＳＦ試料、抗プログラニュリン抗体、抗プログラニュリン抗体を検出する二次抗体、ルミノール及び過酸化物を、キャピラリーカートリッジのウェルに充填すること、（３）キャピラリーカートリッジを自動ウエスタンブロットイムノアッセイ機器に装填すること、（４）自動ウエスタンブロットイムノアッセイ機器を使用して、シグナル強度、ピーク面積、及びシグナル対ノイズ比を計算すること、ならびに（５）ＣＳＦ試料におけるプログラニュリンタンパク質レベルを、抗プログラニュリン抗体に対する免疫反応性のピーク面積として定量すること。
Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びＬＩＭＰ２（ＳＣＡＲＢ２）またはその一部分をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びＬＩＭＰ２のコード配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びＬＩＭＰ２（ＳＣＡＲＢ２）またはその一部分をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びＬＩＭＰ２のコード配列の発現は、別個のプロモーターによってそれぞれ駆動される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）、ＬＩＭＰ２（ＳＣＡＲＢ２）またはその一部分、及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）、プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰまたはその一部分）、及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びプロサポシン（例えば、ＰＳＡＰまたはその一部分）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びプロサポシンのコード配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。本実施形態において、ベクターは、以下の４つの部分からなるＣＢＡプロモーター要素（ＣＢＡ）を含む。ヒトＧＢＡ１のコドン最適化コード配列を構成的に発現するための、ＣＭＶエンハンサー（ＣＭＶｅ）、ＣＢＡプロモーター（ＣＢＡｐ）、エクソン１、及びイントロン（ｉｎｔ）。３’領域はまた、ＷＰＲＥ調節エレメント、続いてｂＧＨポリＡ尾部を含む。以下の３つの転写調節活性化部位が、プロモーター領域の５’末端に含まれる：ＴＡＴＡ、ＲＢＳ、及びＹＹ１。隣接ＩＴＲは、介在配列の正しいパッケージングを可能にする。５’ＩＴＲ配列の２つのバリアント（挿入ボックス）を評価し、これらは、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲの２０ヌクレオチド「Ｄ」領域内にいくつかのヌクレオチド差を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、上段の並びに示される「Ｄ」ドメインヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、変異体「Ｄ」ドメイン（例えば、下段の並びに示されるヌクレオチド変化を有する「Ｓ」ドメイン）を含む。 図６に記載のベクターの一実施形態を示す概略図である。 パーキンソン病のＣＢＥマウスモデルにおけるＧｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶの送達についての代表的なデータを示す。ＰＢＳビヒクル、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ、３７．５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ、または５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ（左から右）の１日あたりのＩＰ送達をＰ８で開始した。生存率（上段左）を１日２回チェックし、体重（上段右）を毎日チェックした。すべての群は、ｎ＝８で開始した。Ｐ２３でのオープンフィールドにおける移動距離の合計（下段左）、及びＰ２４でのロータロッドでの落下までの潜時（下段中央）によって、行動を評価した。ＣＢＥ離脱を伴う（３日目）及び伴わない（１日目）の両方で、ＰＢＳ及び２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ処置群におけるマウスの皮質において、ＧＣａｓｅ基質のレベルを分析した。凝集体ＧｌｕＳｐｈ及びＧａｌＳｐｈレベル（下段右）を、組織のｍｇ湿潤重量あたりのｐｍｏｌとして示す。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、線形回帰による処置群についての名目上のｐ値。 パーキンソン病のＣＢＥマウスモデルにおけるＧｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶの送達についての代表的なデータを示す。ＰＢＳビヒクル、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ、３７．５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ、または５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ（左から右）の１日あたりのＩＰ送達をＰ８で開始した。生存率（上段左）を１日２回チェックし、体重（上段右）を毎日チェックした。すべての群は、ｎ＝８で開始した。Ｐ２３でのオープンフィールドにおける移動距離の合計（下段左）、及びＰ２４でのロータロッドでの落下までの潜時（下段中央）によって、行動を評価した。ＣＢＥ離脱を伴う（３日目）及び伴わない（１日目）の両方で、ＰＢＳ及び２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ処置群におけるマウスの皮質において、ＧＣａｓｅ基質のレベルを分析した。凝集体ＧｌｕＳｐｈ及びＧａｌＳｐｈレベル（下段右）を、組織のｍｇ湿潤重量あたりのｐｍｏｌとして示す。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、線形回帰による処置群についての名目上のｐ値。 ＣＢＥマウスモデルにおける最大ｒＡＡＶ用量についての試験設計の一実施形態を示す概略図である。簡潔に述べると、ｒＡＡＶは、Ｐ３でのＩＣＶ注射によって送達され、毎日のＣＢＥ処置は、Ｐ８で開始された。挙動をＰ２４～２５でオープンフィールド及びロータロッドアッセイにおいて評価し、基質レベルをＰ３６及びＰ３８で測定した。 ＣＢＥマウスモデルにおける最大ｒＡＡＶ用量の生存中評価についての代表的なデータを示す。Ｐ３で、マウスを、ＩＣＶ送達を介して賦形剤または８．８ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１のいずれかで処置した。ＰＢＳまたは２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥのいずれかの毎日のＩＰ送達を、Ｐ８で開始した。試験の終了時に、半数のマウスを、Ｐ３６（１日目）での最終ＣＢＥ用量の１日後に屠殺し、残りの半数を、３日間のＣＢＥ離脱を経てＰ３８（３日目）で屠殺した。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ、ｎ＝８、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＰＢＳ（ｎ＝７）、賦形剤＋ＣＢＥ（ｎ＝８）、及びバリアント＋ＣＢＥ（ｎ＝９））を毎日計量し（上段左）、Ｐ３６で重量を分析した（上段右）。行動を、Ｐ２３でのオープンフィールドにおける総移動距離（下段左）及びｐ２４でのロータロッドでの落下までの潜時（下段右）によって評価し、３つの試験にわたる中央値として各動物について評価した。致死性により、行動アッセイについての賦形剤＋ＣＢＥ群については、ｎ＝７であり、他のすべての群についてはｎ＝８であった。動物全体の平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置の動物における線形回帰による処置群についての名目上のｐ値。 ＣＢＥマウスモデルにおける最大ｒＡＡＶ用量の生存中評価についての代表的なデータを示す。Ｐ３で、マウスを、ＩＣＶ送達を介して賦形剤または８．８ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１のいずれかで処置した。ＰＢＳまたは２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥのいずれかの毎日のＩＰ送達を、Ｐ８で開始した。試験の終了時に、半数のマウスを、Ｐ３６（１日目）での最終ＣＢＥ用量の１日後に屠殺し、残りの半数を、３日間のＣＢＥ離脱を経てＰ３８（３日目）で屠殺した。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ、ｎ＝８、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＰＢＳ（ｎ＝７）、賦形剤＋ＣＢＥ（ｎ＝８）、及びバリアント＋ＣＢＥ（ｎ＝９））を毎日計量し（上段左）、Ｐ３６で重量を分析した（上段右）。行動を、Ｐ２３でのオープンフィールドにおける総移動距離（下段左）及びｐ２４でのロータロッドでの落下までの潜時（下段右）によって評価し、３つの試験にわたる中央値として各動物について評価した。致死性により、行動アッセイについての賦形剤＋ＣＢＥ群については、ｎ＝７であり、他のすべての群についてはｎ＝８であった。動物全体の平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置の動物における線形回帰による処置群についての名目上のｐ値。 ＣＢＥマウスモデルにおける最大ｒＡＡＶ用量の生存中評価についての代表的なデータを示す。Ｐ３で、マウスを、ＩＣＶ送達を介して賦形剤または８．８ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１のいずれかで処置した。ＰＢＳまたは２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥのいずれかの毎日のＩＰ送達を、Ｐ８で開始した。試験の終了時に、半数のマウスを、Ｐ３６（１日目）での最終ＣＢＥ用量の１日後に屠殺し、残りの半数を、３日間のＣＢＥ離脱を経てＰ３８（３日目）で屠殺した。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ、ｎ＝８、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＰＢＳ（ｎ＝７）、賦形剤＋ＣＢＥ（ｎ＝８）、及びバリアント＋ＣＢＥ（ｎ＝９））を毎日計量し（上段左）、Ｐ３６で重量を分析した（上段右）。行動を、Ｐ２３でのオープンフィールドにおける総移動距離（下段左）及びｐ２４でのロータロッドでの落下までの潜時（下段右）によって評価し、３つの試験にわたる中央値として各動物について評価した。致死性により、行動アッセイについての賦形剤＋ＣＢＥ群については、ｎ＝７であり、他のすべての群についてはｎ＝８であった。動物全体の平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置の動物における線形回帰による処置群についての名目上のｐ値。 ＣＢＥマウスモデルにおける最大ｒＡＡＶ用量の生化学的評価についての代表的なデータを示す。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ（ｎ＝８）、バリアント＋ＰＢＳ（ｎ＝７）、賦形剤＋ＣＢＥ（ｎ＝７）、及びバリアント＋ＣＢＥ（ｎ＝９））の皮質を使用して、ＣＢＥ離脱前（１日目）または離脱後（３日目）の群におけるＧＣａｓｅ活性（上段左）、ＧｌｕＳｐｈレベル（上段右）、ＧｌｕＣｅｒレベル（下段左）、及びベクターゲノム（下段右）を測定した。生体内分布は、１μｇのゲノムＤＮＡあたりのベクターゲノムとして示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。（＊）ｐ＜０．１、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置の動物における線形回帰による処置群の名目上のｐ値、収集日数及び性別は共変量として補正された。 ＣＢＥマウスモデルにおける最大ｒＡＡＶ用量の生化学的評価についての代表的なデータを示す。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ（ｎ＝８）、バリアント＋ＰＢＳ（ｎ＝７）、賦形剤＋ＣＢＥ（ｎ＝７）、及びバリアント＋ＣＢＥ（ｎ＝９））の皮質を使用して、ＣＢＥ離脱前（１日目）または離脱後（３日目）の群におけるＧＣａｓｅ活性（上段左）、ＧｌｕＳｐｈレベル（上段右）、ＧｌｕＣｅｒレベル（下段左）、及びベクターゲノム（下段右）を測定した。生体内分布は、１μｇのゲノムＤＮＡあたりのベクターゲノムとして示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。（＊）ｐ＜０．１、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置の動物における線形回帰による処置群の名目上のｐ値、収集日数及び性別は共変量として補正された。 賦形剤＋ＰＢＳ、賦形剤＋ＣＢＥ、及びバリアント＋ＣＢＥ処置群の投与後のＣＢＥマウスモデルにおける行動及び生化学的相関についての代表的なデータを示す。処置群にわたって、ロータロッドでの性能は、ＧｌｕＣｅｒ蓄積と負の相関があり（Ａ、線形回帰によりｐ＝０．００１２）、ＧｌｕＳｐｈ蓄積は、ＧＣａｓｅ活性の増加と負の相関があった（Ｂ、線形回帰によりｐ＝０．００８６）。 ＣＢＥマウスモデルにおけるバリアントの生体内分布についての代表的なデータを示す。ベクターゲノムの存在を、すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ（ｎ＝８）、バリアント＋ＰＢＳ（ｎ＝７）、賦形剤＋ＣＢＥ（ｎ＝７）、及びバリアント＋ＣＢＥ（ｎ＝９））についての肝臓、脾臓、腎臓、及び生殖腺において評価した。生体内分布は、１μｇのゲノムＤＮＡあたりのベクターゲノムとして示される。ベクターゲノムの存在を、ベクター参照標準曲線を使用した定量的ＰＣＲによって定量し、ゲノムＤＮＡ濃度を、Ａ２６０光学密度測定によって評価した。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置の動物における線形回帰による処置群の名目上のｐ値、収集日数及び性別が共変量として補正された。 ＣＢＥマウスモデルにおけるバリアントの生体内分布についての代表的なデータを示す。ベクターゲノムの存在を、すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ（ｎ＝８）、バリアント＋ＰＢＳ（ｎ＝７）、賦形剤＋ＣＢＥ（ｎ＝７）、及びバリアント＋ＣＢＥ（ｎ＝９））についての肝臓、脾臓、腎臓、及び生殖腺において評価した。生体内分布は、１μｇのゲノムＤＮＡあたりのベクターゲノムとして示される。ベクターゲノムの存在を、ベクター参照標準曲線を使用した定量的ＰＣＲによって定量し、ゲノムＤＮＡ濃度を、Ａ２６０光学密度測定によって評価した。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置の動物における線形回帰による処置群の名目上のｐ値、収集日数及び性別が共変量として補正された。 ＣＢＥマウスモデルにおけるｒＡＡＶ用量範囲の生存中評価についての代表的なデータを示す。マウスは、Ｐ３でのＩＣＶ送達によって、賦形剤、または以下の３つの異なる用量のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１のうちの１つを受けた。３．２ｅ９ｖｇ、１．０ｅ１０ｖｇ、または３．２ｅ１０ｖｇ。Ｐ８で、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥの毎日のＩＰ処置を開始した。賦形剤及びＣＢＥまたは賦形剤及びＰＢＳを受けたマウスを対照とした。すべての処置群は、群あたりｎ＝１０（５頭雄／５頭雌）で開始した。最終ＣＢＥ用量（Ｐ３８～Ｐ４０）の１日後にすべてのマウスを屠殺した。すべての処置群を毎日計量し、それらの体重をＰ３６で分析した。Ｐ２４でロータロッドでの落下まで潜時、及びＰ３０でテーパービームを横断するまでの潜時によって、運動性能を評価した。早期の致死性のため、行動アッセイに参加するマウスの数は、賦形剤＋ＰＢＳのｎ＝１０、賦形剤＋ＣＢＥのｎ＝９、及び３．２ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥのｎ＝６、１．０ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥのｎ＝１０、３．２ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥのｎ＝７であった。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭであり、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１はＣＢＥ処置群における線形回帰による名目上のｐ値についてであり、性別は共変量として補正される。 ＣＢＥマウスモデルにおけるｒＡＡＶ用量範囲の生存中評価についての代表的なデータを示す。マウスは、Ｐ３でのＩＣＶ送達によって、賦形剤、または以下の３つの異なる用量のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１のうちの１つを受けた。３．２ｅ９ｖｇ、１．０ｅ１０ｖｇ、または３．２ｅ１０ｖｇ。Ｐ８で、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥの毎日のＩＰ処置を開始した。賦形剤及びＣＢＥまたは賦形剤及びＰＢＳを受けたマウスを対照とした。すべての処置群は、群あたりｎ＝１０（５頭雄／５頭雌）で開始した。最終ＣＢＥ用量（Ｐ３８～Ｐ４０）の１日後にすべてのマウスを屠殺した。すべての処置群を毎日計量し、それらの体重をＰ３６で分析した。Ｐ２４でロータロッドでの落下まで潜時、及びＰ３０でテーパービームを横断するまでの潜時によって、運動性能を評価した。早期の致死性のため、行動アッセイに参加するマウスの数は、賦形剤＋ＰＢＳのｎ＝１０、賦形剤＋ＣＢＥのｎ＝９、及び３．２ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥのｎ＝６、１．０ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥのｎ＝１０、３．２ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥのｎ＝７であった。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭであり、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１はＣＢＥ処置群における線形回帰による名目上のｐ値についてであり、性別は共変量として補正される。 ＣＢＥマウスモデルにおけるｒＡＡＶ用量範囲の生化学的評価についての代表的なデータを示す。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ（ｎ＝１０）、賦形剤＋ＣＢＥ（ｎ＝９）、及び３．２ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ（ｎ＝６）、１．０ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ（ｎ＝１０）、３．２ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ（ｎ＝７））の皮質を使用して、ＧＣａｓｅ活性、ＧｌｕＳｐｈレベル、ＧｌｕＣｅｒレベル、及びベクターゲノムを測定した。ＧＣａｓｅ活性は、総タンパク質のｍｇあたりのＧＣａｓｅのｎｇとして示される。ＧｌｕＳｐｈ及びＧｌｕＣｅｒレベルは、組織のｍｇ湿潤重量あたりのｐｍｏｌとして示される。生体内分布は、１μｇのゲノムＤＮＡあたりのベクターゲノムとして示される。ベクターゲノムの存在を、ベクター参照標準曲線を使用した定量的ＰＣＲによって定量し、ゲノムＤＮＡ濃度を、Ａ２６０光学密度測定によって評価した。ベクターゲノムの存在を、肝臓においても測定した（Ｅ）。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１はＣＢＥ処置群における線形回帰による名目上のｐ値についてであり、性別は共変量として補正される。 ＣＢＥマウスモデルにおけるｒＡＡＶ用量範囲の生化学的評価についての代表的なデータを示す。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ（ｎ＝１０）、賦形剤＋ＣＢＥ（ｎ＝９）、及び３．２ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ（ｎ＝６）、１．０ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ（ｎ＝１０）、３．２ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ（ｎ＝７））の皮質を使用して、ＧＣａｓｅ活性、ＧｌｕＳｐｈレベル、ＧｌｕＣｅｒレベル、及びベクターゲノムを測定した。ＧＣａｓｅ活性は、総タンパク質のｍｇあたりのＧＣａｓｅのｎｇとして示される。ＧｌｕＳｐｈ及びＧｌｕＣｅｒレベルは、組織のｍｇ湿潤重量あたりのｐｍｏｌとして示される。生体内分布は、１μｇのゲノムＤＮＡあたりのベクターゲノムとして示される。ベクターゲノムの存在を、ベクター参照標準曲線を使用した定量的ＰＣＲによって定量し、ゲノムＤＮＡ濃度を、Ａ２６０光学密度測定によって評価した。ベクターゲノムの存在を、肝臓においても測定した（Ｅ）。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１はＣＢＥ処置群における線形回帰による名目上のｐ値についてであり、性別は共変量として補正される。 遺伝子マウスモデルにおける最大用量ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１におけるテーパービーム分析についての代表的なデータを示す。処置群（ＷＴ＋賦形剤（ｎ＝５）、４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋賦形剤（ｎ＝６）、及び４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１（ｎ＝５））の運動性能を、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１投与の４週間後のビームウォークによってアッセイした。合計スリップ及び活動時間は、異なるビームでの５回にわたる試験の合計として示される。速度ごとの速度及びスリップは、異なるビームでの５回にわたる試験の平均として示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。 遺伝子マウスモデルにおける最大用量ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１におけるテーパービーム分析についての代表的なデータを示す。処置群（ＷＴ＋賦形剤（ｎ＝５）、４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋賦形剤（ｎ＝６）、及び４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１（ｎ＝５））の運動性能を、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１投与の４週間後のビームウォークによってアッセイした。合計スリップ及び活動時間は、異なるビームでの５回にわたる試験の合計として示される。速度ごとの速度及びスリップは、異なるビームでの５回にわたる試験の平均として示される。平均が示されている。エラーバーはＳＥＭである。 プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするｒＡＡＶ構築物のインビトロ発現についての代表的なデータを示す。左パネルは、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）ＥＬＩＳＡアッセイの標準曲線を示す。下段パネルは、ｒＡＡＶで形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解物におけるＥＬＩＳＡアッセイによって測定したＰＧＲＮ発現の用量応答を示す。ＭＯＩ＝感染の多重度（細胞あたりのベクターゲノム）。 プロサポシン（ＰＳＡＰ）、ＳＣＡＲＢ２、及び／または１つ以上の阻害性核酸と組み合わせた、ＧＢＡ１をコードするｒＡＡＶ構築物のインビトロ発現についての代表的なデータを示す。データは、各構築物でのＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、モックトランスフェクション細胞に対して目的の導入遺伝子の過剰発現をもたらしたことを示す。 プロサポシン（ＰＳＡＰ）、ＳＣＡＲＢ２、及び／または１つ以上の阻害性核酸と組み合わせた、ＧＢＡ１をコードするｒＡＡＶ構築物のインビトロ発現についての代表的なデータを示す。データは、各構築物でのＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、モックトランスフェクション細胞に対して目的の導入遺伝子の過剰発現をもたらしたことを示す。 プロサポシン（ＰＳＡＰ）、ＳＣＡＲＢ２、及び／または１つ以上の阻害性核酸と組み合わせた、ＧＢＡ１をコードするｒＡＡＶ構築物のインビトロ発現についての代表的なデータを示す。データは、各構築物でのＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、モックトランスフェクション細胞に対して目的の導入遺伝子の過剰発現をもたらしたことを示す。 ＩＴＲの「外側」に位置する「Ｄ」領域を（例えば、導入遺伝子挿入物または発現構築物に対してＩＴＲの末端に近位に）含むｒＡＡＶベクター（上段）、及びベクターの「内側」にＩＴＲを（例えば、ベクターの導入遺伝子挿入物に近位に）有する野生型ｒＡＡＶベクターを示す概略図である。 ＧＢＡ２またはその一部分、及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びガラクトシルセラミダーゼ（例えば、ＧＡＬＣまたはその一部分）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びガラクトシルセラミダーゼのコード配列の発現は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びガラクトシルセラミダーゼ（例えば、ＧＡＬＣまたはその一部分）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びガラクトシルセラミダーゼのコード配列の発現は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）、カテプシンＢ（例えば、ＣＴＳＢまたはその一部分）、及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びカテプシンＢのコード配列の発現は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１（例えば、ＳＭＰＤ１、その一部分）、及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びガラクトシルセラミダーゼ（例えば、ＧＡＬＣまたはその一部分）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びガラクトシルセラミダーゼのコード配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びカテプシンＢ（例えば、ＣＴＳＢまたはその一部分）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びカテプシンＢのコード配列の発現は、別個のプロモーターによってそれぞれ駆動される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）、ＧＣＨ１（例えば、ＧＣＨ１またはその一部分）、及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びＧＣＨ１のコード配列は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列により分離される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）、ＲＡＢ７Ｌ１（例えば、ＲＡＢ７Ｌ１またはその一部分）、及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びＲＡＢ７Ｌ１のコード配列は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）、ＧＣＨ１（例えば、ＧＣＨ１またはその一部分）、及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びＧＣＨ１のコード配列の発現は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）である。 ＶＰＳ３５（例えば、ＶＰＳ３５またはその一部分）及びα－Ｓｙｎ及びＴＭＥＭ１０６Ｂについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）、ＩＬ－３４（例えば、ＩＬ３４またはその一部分）、及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びＩＬ－３４のコード配列は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びＩＬ－３４（例えば、ＩＬ３４またはその一部分）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びＩＬ－３４のコード配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びＴＲＥＭ２（例えば、ＴＲＥＭ２またはその一部分）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びＴＲＥＭ２のコード配列の発現は、別個のプロモーターによってそれぞれ駆動される。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びＩＬ－３４（例えば、ＩＬ３４またはその一部分）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。Ｇｃａｓｅ及びＩＬ－３４のコード配列の発現は、別個のプロモーターによってそれぞれ駆動される。 Ａ～Ｂは、ｑＰＣＲ及びＥＬＩＳＡによって測定された対照形質導入細胞に対して、ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＲＥＭ２及びＧＢＡ１の過剰発現についての代表的なデータを示す。Ａは、ＴＲＥＭ２の過剰発現についてのデータを示す。Ｂは、同じ構築物からのＧＢＡ１の過剰発現についてのデータを示す。 ＧＦＰレポーターアッセイ（上段）及びα－Ｓｙｎアッセイ（下段）によるインビトロでのＳＮＣＡのサイレンシングに成功したことを示す代表的なデータを示す。 ＧＦＰレポーターアッセイ（上段）及びα－Ｓｙｎアッセイ（下段）によるインビトロでのＴＭＥＭ１０６Ｂのサイレンシングに成功したことを示す代表的なデータを示す。 ＰＧＲＮをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 「Ｄ」配列の野生型（円）または代替的（例えば、「外側」、正方形）配置を有するＩＴＲを有するｒＡＡＶを使用したＨＥＫ２９３細胞の形質導入についてのデータを示す。「外側」に配置されたＩＴＲを有するｒＡＡＶは、野生型ＩＴＲを有するｒＡＡＶと同様に効率的に細胞に形質導入することができた。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 ＰＧＲＮをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 ＰＧＲＮをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 ＰＧＲＮ及び微小管関連タンパク質ｔａｕ（ＭＡＰＴ）についての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 ＰＳＡＰをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）及びガラクトシルセラミダーゼ（例えば、ＧＡＬＣまたはその一部分）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。 Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）、プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰまたはその一部分）、及びα－Ｓｙｎについての干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を示す概略図である。 ＦＴＤ－ＧＲＮ変異を有する患者由来のｉＰＳＣ由来の神経幹細胞（ＮＳＣ）株が、健常な対照対象由来のＮＳＣ株よりも少ないプログラニュリンを分泌したことを示す。統計を、対応のないｔ検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１を使用して決定した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。 ＦＴＤ－ＧＲＮ変異保有ニューロン培養における用量範囲のＰＲ００６Ａ形質導入の結果を示す。ＮＳＣを等密度で播種し、ニューロンに分化させた。７日目に、賦形剤または示された量のＰＲ００６Ａで７２時間ニューロンに形質導入した。分泌されたプログラニュリン発現を、ＥＬＩＳＡによって細胞培地から測定し、体積に対して正規化した（ｎ＝３～４、平均値±ＳＥＭ）。黒い破線は、対照ニューロン（賦形剤処置）から分泌されるプログラニュリンの内因性レベルを表す。分泌されたプログラニュリンは、賦形剤処置のＦＴＤ－ＧＲＮニューロンにおいて検出可能ではなかった。統計を、ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ ＨＳＤを使用して決定し、賦形剤処置の対照ニューロンに対する各状態の統計的比較をグラフ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１で示す。ＬＬＯＱ＝定量の下限、ＭＯＩ＝感染多重度。 ＦＴＤ－ＧＲＮニューロン培養物において、ニューロン培養物のＰＲ００６処理が、主要なリソソームプロテアーゼ、カテプシンＤの欠陥のある成熟を救出したことを示す。ＮＳＣを等濃度で播種し、ニューロンに分化させた。７日目に、５．３×１０５のＭＯＩで７２時間、賦形剤またはＰＲ００６Ａでニューロンに形質導入した。ニューロンを溶解し、溶解物を、抗カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）一次抗体を用いてＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｊｅｓｓシステムで分析した。成熟カテプシンＤ（ｍａｔＣＴＳＤ）及びプロカテプシンＤ（ｐｒｏＣＴＳＤ）の両方に対応するバンドを検出し、曲線下面積を各バンドについて定量し、内部総タンパク質正規化シグナルに対して正規化した。賦形剤またはＰＲ００６Ａ処置のＦＴＤ－ＧＲＮニューロンにおけるｍａｔＣＴＳＤ／ｐｒｏＣＴＳＤ比を決定し、ｙ軸は、賦形剤処置の対照ニューロン（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ）の比のパーセントとして、ｍａｔＣＴＳＤ／ｐｒｏＣＴＳＤ比を示す。統計を、対応のないｔ検定、＊＝ｐ＜０．０５を使用して決定した。 ＰＲ００６ＡがＦＴＤ－ＧＲＮニューロン培養におけるＴＤＰ－４３病理を低減することを示す。ＮＳＣを等濃度で播種し、ニューロンに分化させた。７日目に、５．３×１０５のＭＯＩで賦形剤またはＰＲ００６Ａを用いてニューロンを形質導入し、形質導入の２１日後に収集した。ニューロンを溶解し、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ不溶性タンパク質画分を単離し、抗ＴＤＰ－４３抗体（＃１２８９２－ＡＰ－１）を用いてＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｊｅｓｓシステムで分析した。ＴＤＰ－４３に対応するバンドを検出し、各バンドについて曲線下面積を定量化し、不溶性画分の総タンパク質濃度に対して正規化した。Ｙ軸は、不溶性ＴＤＰ－４３の量を、各ＦＴＤ－ＧＲＮ細胞株について別々に正規化された賦形剤処置レベルのパーセントとして示す（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ）。図５２Ｄは、ＦＴＤ－ＧＲＮ神経細胞培養において、ＰＲ００６処理が、ＦＴＤ－ＧＲＮ病理の特徴である不溶性ＴＤＰ－４３を減少させたことを示す。統計を、対応のないｔ検定、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１を使用して決定した。 ＦＴＤ－ＧＲＮ変異を有する患者由来のｉＰＳＣ由来のＮＳＣ株が、健常な対照対象由来のＮＳＣ株よりも少ないプログラニュリンを発現したことを示す。統計を、対応のないｔ検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１を使用して決定した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。 ＰＲ００６ＡがＦＴＤ－ＧＲＮニューロン培養におけるＴＤＰ－４３病理を低減することを示す。ＮＳＣを等濃度で播種し、ニューロンに分化させた。７日目に、５．３×１０５のＭＯＩで賦形剤またはＰＲ００６Ａを用いてニューロンを形質導入し、形質導入の２１日後に収集した。ＰＲ００６Ａで処理されたｉＰＳＣ由来ニューロンの免疫蛍光画像由来の核ＴＤＰ－４３シグナルの定量化である。賦形剤またはＰＲ００６Ａで処理したＦＴＤ－ＧＲＮニューロンにおける核あたりのＴＤＰ－４３シグナル強度を決定し、ｙ軸は、核あたりのＴＤＰ－４３シグナル強度を、賦形剤処置の対照ニューロンの核あたりのＴＤＰ－４３シグナル強度のパーセントとして示す（ｎ＝１４５～３０６細胞、平均±ＳＥＭ）。抗ＴＤＰ－４３抗体（＃１２８９２－ＡＰ－１）を使用してＴＤＰ－４３を測定し、核領域をＤＡＰＩ染色によって決定した。図５２Ｆは、ＰＲ００６処理が、ＦＴＤ－ＧＲＮニューロン培養における核ＴＤＰ－４３発現レベルを、野生型対照レベルに近いレベルまで増加させたことを示す。統計を、対応のないｔ検定、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１を使用して決定した。 ヒトＦＴＤ－ＧＲＮ由来の神経幹細胞（ＮＳＣ）株及びヒト対照細胞株を神経細胞培養物に分化させることに成功したことを示す一連の画像である。対照及びＦＴＤ－ＧＲＮ ＮＳＣ株（ＦＴＤ－ＧＲＮ＃１及びＦＴＤ－ＧＲＮ＃２）を、細胞形態及びニューロンマーカーについての免疫蛍光染色（ＮｅｕＮ［赤色］、左で標識されるＭＡＰ２またはＴａｕ［緑色］）によって示されるように、７日後にニューロンに分化させた。ＤＡＰＩ（青色）を使用して核を染色した。 Ａ～Ｃは、成体用量範囲のＰＲ００６Ａ ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデル試験におけるＣＮＳにおける生体内分布及びプログラニュリン発現を分析する実験の結果を示す一連の棒グラフである。４か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスに、ＩＣＶ投与によってＰＲ００６Ａまたは賦形剤を投与した。それらを、ＣＮＳにおける生化学的エンドポイントのために、賦形剤（赤色）または、１．１×１０９ｖｇ（２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）、１．１×１０１０ｖｇ（２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、もしくは１．１×１０１１ｖｇ（２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量のＰＲ００６Ａ（青色）での処置の３か月後に屠殺した。Ａ：ベクターゲノムの存在を大脳皮質及び脊髄において評価し、対数スケールでｇＤＮＡのμｇあたりのベクターゲノムとして生体内分布を示す（ｎ＝８～１０／群、平均±ＳＥＭ）。ベクターゲノムの存在を、ベクター参照標準曲線を使用して、ｑＰＣＲによって定量化した。破線（５０ベクターゲノム／μｇ ｇＤＮＡで）は、ベクターの存在の陽性についての閾値を表す。Ｂ：ＰＲ００６ＡがコードされたＧＲＮ ＲＮＡ発現を、大脳皮質における定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって評価した（ｎ＝８～１０／群、平均値±ＳＥＭ）。ＧＲＮコピーの数（発明者らのコドン最適化ＰＲ００６Ａ配列に特異的な）は、全ＲＮＡの１μｇに対して正規化され、対数スケールで示される。Ｃ：プログラニュリンタンパク質レベルを、脳及び脊髄におけるヒト特異的プログラニュリンＥＬＩＳＡを使用して測定した（ｎ＝８～１０／群、平均±ＳＥＭ）。組織プログラニュリンレベルを総タンパク質濃度に対して正規化した。定量の下限（ＬＬＯＱ）は、破線灰色で示される。組織ＥＬＩＳＡアッセイについて、ＬＬＯＱ（ｎｇ／ｍｇ）値は、アッセイＬＬＯＱ（ｎｇ／ｍＬ）を、すべての試料由来の総タンパク質濃度平均で除すことによって決定される。エラーバーのないｘ軸上の処置群の凡例の色に対応する単一の線は、その群におけるすべての動物が０であったことを示す。賦形剤処置のＧｒｎ ＫＯマウス群と比較するために、ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１を使用して、統計分析を実施した。ｖｇ＝ベクターゲノム、ＬＬＯＱ＝定量の下限、ＳＣ＝脊髄。 Ｄ～Ｅは、成体用量範囲のＰＲ００６Ａ ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデル試験における末梢組織生体内分布及びプログラニュリン発現を分析する実験の結果を示す一連の棒グラフである。４か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスに、ＩＣＶ投与によってＰＲ００６Ａまたは賦形剤を投与した。それらを、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、及び生殖腺における生化学的エンドポイントのために、賦形剤（赤色）または１．１×１０９ｖｇ（２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）、１．１×１０１０ｖｇ（２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、もしくは１．１×１０１１ｖｇ（２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量のＰＲ００６Ａ（青色）での処置の３か月後に屠殺した。Ｄ：ベクターゲノムの存在を評価し、対数スケールでｇＤＮＡのμｇあたりのベクターゲノムとして生体内分布を示す（ｎ＝８～１０／群、平均±ＳＥＭ）。ベクターゲノムの存在を、ベクター参照標準曲線を使用して、ｑＰＣＲによって定量化した。破線（５０ベクターゲノム／μｇ ｇＤＮＡで）は、ベクターの存在の陽性についての閾値を表す。Ｅ：プログラニュリンタンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡを使用して測定した（ｎ＝８～１０／群、平均±ＳＥＭ）。組織プログラニュリンレベルを総タンパク質濃度に対して正規化した。エラーバーのないｘ軸上の処置群の凡例の色に対応する単順な線は、その群におけるすべての動物が０であったことを示す。賦形剤処置のＧｒｎ ＫＯマウス群と比較するために、ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１を使用して、統計分析を実施した。ｖｇ＝ベクターゲノム。 Ｆは、成体用量範囲のＰＲ００６Ａ ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデル研究における血漿におけるプログラニュリンレベルを分析する実験の結果を示す棒グラフである。４か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスに、ＩＣＶ投与によってＰＲ００６Ａまたは賦形剤を投与した。それらを、血漿における生化学的エンドポイントのために、賦形剤（赤色）または、１．１×１０９ｖｇ（２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）、１．１×１０１０ｖｇ（２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、もしくは１．１×１０１１ｖｇ（２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量のＰＲ００６Ａ（青色）での処置の３か月後に屠殺した。プログラニュリンタンパク質レベルを、血漿におけるヒト特異的プログラニュリンＥＬＩＳＡ（ｎ＝８～１０／群、平均値±ＳＥＭ）を使用して測定した。血漿レベルは、対数スケールで示される。定量の下限（ＬＬＯＱ）は、破線灰色で示される。賦形剤処置のＧｒｎ ＫＯマウス群と比較するために、ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１を使用して、統計分析を実施した。ＬＬＯＱ＝定量の下限。ｖｇ＝ベクターゲノム。 Ｇ～Ｈは、成体用量範囲のＰＲ００６Ａ ＦＴＤ－ＧＲＮ成体マウスモデル試験におけるリソソームの神経病理学的な欠損の減少を示す実験の結果を示す一連の棒グラフである。４か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスに、ＩＣＶ投与によってＰＲ００６Ａまたは賦形剤を投与した。それらを、分析のために、賦形剤（赤色）または、１．１×１０９ｖｇ（２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）、１．１×１０１０ｖｇ（２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、または１．１×１０１１ｖｇ（２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量のＰＲ００６Ａ（青色）での処置の３か月後に屠殺した。リポフスチン症を、以下の２つの独立した方法によって分析した。（１）病理学者によるＨ＆Ｅ染色脳切片の点数付け、及び（２）ＩＨＣ切片由来のリポフスチン自己蛍光の定量化。Ｇ：リポフスチンの蓄積（自己蛍光リポフスチン顆粒）を、以下の等級付けスキームに従って、盲検化された有資格の病理学者によって異なる脳領域におけるＨ＆Ｅ染色切片において半定量的に採点した。０＝リポフスチンは観察されない。１＝領域全体に散在するリポフスチンの非常に小さな顆粒（＜２μｍ）。２＝小さな顆粒の蓄積の密度の増加、及び／またはより大きな顆粒の発達（＞２～３μｍ）。３＝低い対物レンズパワーから見える高密度のリポフスチンの顆粒を有する多焦点領域。４＝広範囲にわたるリポフスチンの蓄積。大脳皮質、海馬、及び視床／視床下部脳領域におけるリポフスチン重症度点数を示す（ｎ＝８～１０／群）。Ｈ：大脳皮質、海馬、及び視床においてユビキチンのＩＨＣ分析を実施し、定量化した。閾値を超える免疫反応性物体のサイズ（免疫反応性物体のサイズ［μｍ２］は、ユビキチンについて示されている（ｎ＝８～１０／群、平均±ＳＥＭ）。賦形剤処置のＧｒｎ ＫＯマウス群と比較するために、ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１によって統計を決定した。ｖｇ＝ベクターゲノム、ＷＴ＝野生型。 Ｉ～Ｋは、成体用量範囲のＰＲ００６Ａ ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデル試験における神経炎症マーカーの減少を示す実験の結果を示す一連の棒グラフである。４か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスに、ＩＣＶ投与によってＰＲ００６Ａまたは賦形剤を投与した。それらを、分析のために、賦形剤（赤色）または、１．１×１０９ｖｇ（２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）、１．１×１０１０ｖｇ（２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、または１．１×１０１１ｖｇ（２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量のＰＲ００６Ａ（青色）での処置の３か月後に屠殺した。Ｉ：Ｔｎｆ及びＣｄ６８の遺伝子発現（ｍＲＮＡレベル）を、体性感覚皮質におけるｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝８～１０／群）。遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子Ｐｐｉｂに対して正規化した。Ｊ～Ｋ：大脳皮質、海馬、及び視床における固定された脳切片において、Ｉｂａ１（Ｊ）及びＧＦＡＰ（Ｋ）のＩＨＣ分析を実施し、定量化した。閾値を超える物体によって覆われる関心領域の割合（免疫反応面積［％］）を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝８～１０／群）。各群を賦形剤処置のＧｒｎ ＫＯマウス群と比較してＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ調整を伴うＡＮＯＶＡ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１を使用して統計を決定した。ｖｇ＝ベクターゲノム、ＷＴ＝野生型。 Ｌ～Ｎは、成体用量範囲のＰＲ００６Ａ ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデル試験におけるリソソーム及び免疫経路の遺伝子発現の減少を示す実験の結果を示す一連の棒グラフである。４か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスに、ＩＣＶ投与によってＰＲ００６Ａまたは賦形剤を投与した。それらを、分析のために、賦形剤（赤色）または、１．１×１０９ｖｇ（２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）、１．１×１０１０ｖｇ（２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、または１．１×１０１１ｖｇ（２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量のＰＲ００６Ａ（青色）での処置の３か月後に屠殺した。ＲＮＡ配列決定は、ＩＣＶ処置のＧｒｎ ＫＯマウス及び齢適合ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（灰色）由来の大脳皮質試料において実施した。遺伝子セット変異分析（ＧＳＶＡ）法を使用して、ＷＴマウスと比較して賦形剤処置のＧｒｎ ＫＯマウスにおいて調節不全である以前に公開された遺伝子特徴のｍＲＮＡ発現レベルを比較した。示されるデータは、２つの公開された研究及び１つのＨＡＬＬＭＡＲＫ経路からのキュレートされた遺伝子セットについてのＧＳＶＡ活性点数である。Ｌ：細胞成分：液胞（ＧＯ：０００５７７３）、Ｍ：リソソーム、及びＮ：補体系（ＨＡＬＬＭＡＲＫ経路）（中央値±範囲、ｎ＝８～１０／群）。ファミリーワイズＩ型エラー率について制御しながら賦形剤処置のＧｒｎ ＫＯマウス群と比較するために、ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ検定、＊＊＊＝ｐ＜０．００１を使用して統計分析を実施した。ＧＳＶＡ＝遺伝子セット変異分析、ｖｇ＝ベクターゲノム、ＷＴ＝野生型。 ｑＰＣＲによって定量化されたＰＲ００６Ａ導入遺伝子の生体内分布を分析する実験の結果を示す一連の棒グラフである。導入遺伝子レベルは、賦形剤、低用量のＰＲ００６Ａ（６．５×１０９ｖｇ／ｇ脳）、または高用量のＰＲ００６Ａ（６．５×１０１０ｖｇ／ｇ脳）のいずれかのＩＣＭ注射の１８２日後のＮＨＰにおけるｑＰＣＲ法を使用して分析した。各バーは、群あたり３頭の動物の平均±ＳＥＭを表し、黄色の線は、５０ｖｇ／μｇのＤＮＡでの定量の下限を示す。 ヒトプログラニュリンに対する抗薬物抗体のレベルを分析する実験の結果を示す一連の棒グラフである。賦形剤、低用量のＰＲ００６Ａ（６．５×１０９ｖｇ／ｇ脳）、または高用量のＰＲ００６Ａ（６．５×１０１０ｖｇ／ｇ脳）のいずれかでの処置後２９日目及び１８２日目のＮＨＰ血清及びＣＳＦ試料におけるプログラニュリンに対する抗体。データは平均値±ＳＥＭを表す。 ＰＲ００６Ａ導入遺伝子（ＧＲＮ）の発現を分析する実験の結果を示す一連の棒グラフである。ＧＲＮ発現レベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して、１８３日目に収集したＮＨＰ皮質、海馬、及び腹側中脳において決定した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。 Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）（ＪＥＳＳ）プラットフォームによって定量化されたＣＳＦにおけるプログラニュリンレベルを分析する実験の結果を示す棒グラフである。プログラニュリンレベルを、１８３日目に収集したＮＨＰ ＣＳＦ試料において決定し、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）（ＪＥＳＳ）分析によって決定した。賦形剤、低用量のＰＲ００６Ａ（６．５×１０９ｖｇ／ｇ脳重量）または高用量のＰＲ００６Ａ（６．５×１０１０ｖｇ／ｇ脳重量）で処置したＮＨＰ由来のＣＳＦ試料。提示されるデータは平均±ＳＥＭであり、Ｐ値：＊ｐ＜０．０５、ウィリアム傾向検定を使用した一元的用量依存性応答分析による。 自動Ｗｅｓｔｅｒｎ ＪＥＳＳアッセイの選択性及び特異度の結果を示すグラフである。ＦＴＤ患者ＣＳＦ試料におけるプログラニュリンタンパク質レベルは、Ｊｅｓｓによって５８ｋＤａで検出された。群（Ａ）：ヘテロ接合性ＦＴＤ患者、ならびに群（Ｂ）及び（Ｃ）：家族性非保有者または正常個体。データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。ＳＥＭ値は、垂直方向のエラーバーとして表示される。 ＥＬＩＳＡによって検出されたＦＴＤ患者ＣＳＦ試料におけるプログラニュリンレベルを示すグラフである。群（Ａ）：ヘテロ接合性ＦＴＤ患者、ならびに群（Ｂ）及び（Ｃ）：家族性非保有者または正常個体。データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。ＳＥＭ値は、垂直方向のエラーバーとして表示される。 Ｊｅｓｓ自動Ｗｅｓｔｅｒｎプラットフォーム上で二重に実行された各ＣＳＦ試料のゲル画像である。試料を、一次抗体Ａｄｉｐｏｇｅｎ ＰＧ－３５９－７を使用して４倍希釈で分析した。第１のレーンは、分子量基準であり、右側は、実施例１４において報告される免疫反応性を計算するために使用されるバンドの識別である。 Ａ～Ｂは、ヒトＰＧＲＮ発現レベルの測定を示す一連のプロットである。ヒトＰＧＲＮ発現レベルを、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）（Ｊｅｓｓ）分析を使用して、１８０日目に収集した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＣＳＦ試料において決定した。賦形剤（「賦形剤」）、低用量のＰＲ００６Ａ（６．５×１０９ｖｇ／ｇ脳重量、「低」）、または高用量のＰＲ００６（６．５×１０１０ｖｇ／ｇ脳重量、「高」）で処置したＮＨＰ由来のＣＳＦを分析した。データは、平均免疫反応性ピーク面積（Ａ）、または賦形剤処置の動物に対する倍率変化（Ｂ）として表される。各ドットは、１つのＮＨＰ由来の単一のＣＳＦ試料（技術的複製の平均）を表し、ボックスは、３つの個々のＮＨＰの平均値＋／－標準誤差を表す。 Ａ～Ｃは、ＰＲ００６Ａ処置後の老齢ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおけるＣＮＳにおける生体内分布及びプログラニュリン発現を分析する実験の結果を示す一連の棒グラフである。組織試料は、賦形剤（赤色）または９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）のＰＲ００６Ａ（青色）のＩＣＶを受けた２か月後に、１８か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスから収集した。Ａ：大脳皮質及び脊髄におけるベクターゲノムの存在を評価した（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。生体内分布は、対数スケールで１μｇのｇＤＮＡあたりのベクターゲノムとして示す。ベクターゲノムの存在を、ベクター参照標準曲線を使用して、ｑＰＣＲによって定量化した。破線（５０ベクターゲノム／μｇ ｇＤＮＡで）は、ベクターの存在の陽性についての閾値を表す。Ｂ～Ｃ：プログラニュリンタンパク質レベルを、ＣＮＳ組織（脳及び脊髄（Ｂ））及びＣＳＦ（Ｃ）（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）におけるＥＬＩＳＡを使用して測定した。組織プログラニュリンレベルを総タンパク質濃度に対して正規化し、プログラニュリンのＣＳＦレベルを流体体積に対して正規化した。定量の下限（ＬＬＯＱ）は、破線灰色で示される。組織ＥＬＩＳＡアッセイについて、ＬＬＯＱ（ｎｇ／ｍｇ）値は、アッセイＬＬＯＱ（ｎｇ／ｍＬ）を、すべての試料由来の総タンパク質濃度平均で除すことによって決定された。エラーバーのないｘ軸上の単順な赤い線は、その群におけるすべての動物が０であったことを示す。統計分析は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１を使用して実施した。ｖｇ＝ベクターゲノム、ＬＬＯＱ＝定量の下限、ＳＣ＝脊髄。 Ｄ～Ｅは、ＰＲ００６Ａ処置後の老齢ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおけるリソソームの神経病理学的欠損の減少を示す実験の結果を示す一連の棒グラフ及び画像である。組織試料は、賦形剤（赤色）または９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）のＰＲ００６Ａ（青色）のＩＣＶを受けた２か月後に、１８か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスから収集した。リポフスチン症を、病理学者によるＨ＆Ｅ染色脳切片の点数付けによって分析した。Ｄ：脳切片の視床／視床下部領域からの代表的なリポフスチン画像。白い矢印はリポフスチンの蓄積の例を示す。自己蛍光リポフスチン顆粒について評価した脳切片由来のＨ＆Ｅ染色スライドの大脳皮質、海馬、及び視床／視床下部におけるリポフスチン重症度点数の概要を提供する。リポフスチンの蓄積を、以下の等級付けスキームに従って、盲検化された有資格の病理学者によって半定量的に採点した：０＝リポフスチンは観察されなかった。１＝領域全体に散在するリポフスチンの非常に小さな顆粒（＜２μｍ）。２＝小さな顆粒の蓄積の密度の増加、及び／またはより大きな顆粒の発達（＞２～３μｍ）。３＝低い対物レンズパワーから見える高密度のリポフスチンの顆粒を有する多焦点領域。４＝広範囲にわたるリポフスチンの蓄積。Ｅ：大脳皮質、海馬、及び視床においてユビキチンのＩＨＣ分析（ｎ＝４／群）を実施し、定量化した。各領域の陽性細胞密度（細胞／ｍｍ２）を示した（平均±ＳＥＭ）。統計を、ｔ検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１を使用して決定した。ｖｇ＝ベクターゲノム。 Ｄ～Ｅは、ＰＲ００６Ａ処置後の老齢ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおけるリソソームの神経病理学的欠損の減少を示す実験の結果を示す一連の棒グラフ及び画像である。組織試料は、賦形剤（赤色）または９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）のＰＲ００６Ａ（青色）のＩＣＶを受けた２か月後に、１８か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスから収集した。リポフスチン症を、病理学者によるＨ＆Ｅ染色脳切片の点数付けによって分析した。Ｄ：脳切片の視床／視床下部領域からの代表的なリポフスチン画像。白い矢印はリポフスチンの蓄積の例を示す。自己蛍光リポフスチン顆粒について評価した脳切片由来のＨ＆Ｅ染色スライドの大脳皮質、海馬、及び視床／視床下部におけるリポフスチン重症度点数の概要を提供する。リポフスチンの蓄積を、以下の等級付けスキームに従って、盲検化された有資格の病理学者によって半定量的に採点した：０＝リポフスチンは観察されなかった。１＝領域全体に散在するリポフスチンの非常に小さな顆粒（＜２μｍ）。２＝小さな顆粒の蓄積の密度の増加、及び／またはより大きな顆粒の発達（＞２～３μｍ）。３＝低い対物レンズパワーから見える高密度のリポフスチンの顆粒を有する多焦点領域。４＝広範囲にわたるリポフスチンの蓄積。Ｅ：大脳皮質、海馬、及び視床においてユビキチンのＩＨＣ分析（ｎ＝４／群）を実施し、定量化した。各領域の陽性細胞密度（細胞／ｍｍ２）を示した（平均±ＳＥＭ）。統計を、ｔ検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１を使用して決定した。ｖｇ＝ベクターゲノム。Ｆ～Ｉは、ＰＲ００６Ａ処置後の老齢ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおける神経炎症マーカーの減少を示す実験の結果を示す一連の棒グラフである。組織試料は、賦形剤（赤色）または９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）のＰＲ００６Ａ（青色）のＩＣＶを受けた２か月後に、１８か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスから収集した。Ｆ：Ｔｎｆ及びＣｄ６８の遺伝子発現を、体性感覚皮質におけるｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子Ｐｐｉｂに対して正規化した。（Ｇ）炎症促進サイトカインＴＮＦαのタンパク質発現を、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙマウス炎症促進サイトカインアッセイを用いて大脳皮質において測定した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。大脳皮質を均質化し、タンパク質発現レベルを組織溶解物の総タンパク質濃度に対して正規化した。Ｈ～Ｉ：固定脳切片においてＩｂａ１（Ｈ）及びＧＦＡＰ（Ｉ）のＩＨＣ分析を実施し、定量化した。分析された３つの脳領域（大脳皮質、海馬、及び視床）由来の陽性細胞密度（細胞／ｍｍ２）の編集物を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３～４／群）。統計分析は、ｔ検定、＊＝ｐ＜０．０５を使用して実施した。ｖｇ＝ベクターゲノム。 Ｆ～Ｉは、ＰＲ００６Ａ処置後の老齢ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおける神経炎症マーカーの減少を示す実験の結果を示す一連の棒グラフである。組織試料は、賦形剤（赤色）または９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）のＰＲ００６Ａ（青色）のＩＣＶを受けた２か月後に、１８か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスから収集した。Ｆ：Ｔｎｆ及びＣｄ６８の遺伝子発現を、体性感覚皮質におけるｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子Ｐｐｉｂに対して正規化した。（Ｇ）炎症促進サイトカインＴＮＦαのタンパク質発現を、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙマウス炎症促進サイトカインアッセイを用いて大脳皮質において測定した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。大脳皮質を均質化し、タンパク質発現レベルを組織溶解物の総タンパク質濃度に対して正規化した。Ｈ～Ｉ：固定脳切片においてＩｂａ１（Ｈ）及びＧＦＡＰ（Ｉ）のＩＨＣ分析を実施し、定量化した。分析された３つの脳領域（大脳皮質、海馬、及び視床）由来の陽性細胞密度（細胞／ｍｍ２）の編集物を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３～４／群）。統計分析は、ｔ検定、＊＝ｐ＜０．０５を使用して実施した。ｖｇ＝ベクターゲノム。 ＰＲ００６Ａで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の用量反応曲線を示すグラフである（ｎ＝２、平均±ＳＥＭ）。等しい数の細胞に、様々な量のＰＲ００６Ａで形質導入した。７２時間後、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、細胞培地中のプログラニュリンタンパク質レベルを測定した。 老齢ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおける最大用量ＰＲ００６Ａの試験設計の図である。１０μＬの賦形剤（対照）または９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量のＰＲ００６Ａを、ＩＣＶ注射により以下の２つのコホートのＧｒｎ ＫＯマウスに送達した。（１）注射時１６か月齢（ｎ＝４～５／群、ＰＲＶ－２０１８－０２７）及び（２）注射時１４か月齢（ｎ＝１／賦形剤処置群、ｎ＝３／ＰＲ００６Ａ処置群、ＰＲＶ－２０１９－００２）。動物を注射の２か月後に屠殺した。ＣＮＳ及び末梢組織を収集して、ＰＲ００６Ａ生体内分布（ｑＰＣＲ）、プログラニュリンタンパク質発現（ＥＬＩＳＡ）、及び組織病理（Ｈ＆Ｅ）を分析した。炎症促進マーカーの発現、リポフスチンの蓄積、及びユビキチンの蓄積を脳において評価した。 Ａ～Ｂは、ＰＲ００６Ａ処置後の老齢ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおける末梢組織生体内分布及びプログラニュリン発現の結果を示す棒グラフである。組織試料は、賦形剤（赤色）または９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）のＰＲ００６Ａ（青色）のＩＣＶを受けた２か月後に、１８か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスから収集した。Ａ：肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、及び生殖腺におけるベクターゲノムの存在を評価した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。生体内分布を、対数スケールでｇＤＮＡのμｇあたりのベクターゲノムとして示す。ベクターゲノムの存在を、ベクター参照標準を使用して、ｑＰＣＲによって定量化した。Ｂ：プログラニュリンタンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）を使用して測定した。組織プログラニュリンレベルを総タンパク質濃度に対して正規化した。エラーバーのないｘ軸上の単順な赤い線は、その群におけるすべての動物が０であったことを示す。統計分析は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１を用いて実施した。ｖｇ＝ベクターゲノム。 １０μｌ賦形剤（対照）または１．１×１０９ｖｇ（２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）、１．１×１０１０ｖｇ（２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、または１．１×１０１１ｖｇ（２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）ＰＲ００６Ａの用量のＰＲ００６Ａが４か月齢のＧｒｎ ＫＯマウス（ｎ＝１０／群）へＩＣＶ注射によって送達された、成体ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおける用量範囲のＰＲ００６Ａについての試験設計の図である。動物は、マウスが７か月齢であったとき、注射の３か月後に屠殺された。ＣＮＳ及び末梢組織を収集して、ＰＲ００６Ａ生体内分布（ｑＰＣＲ）、プログラニュリンタンパク質発現（ＥＬＩＳＡ）、及び組織病理（Ｈ＆Ｅ）を分析した。炎症促進マーカーの発現、リポフスチンの蓄積、ユビキチンの蓄積、及び全般的な遺伝子発現変化を脳において評価した。 ヒトプログラニュリンをコードする発現構築物を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ＰＲ００６Ａ）の一実施形態を示す概略図である。「ｂｐ」は、「塩基対」を指す。「ｋａｎ」は、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を指す。「ＧＲＮ」は、「プログラニュリン」を指す。「ＩＴＲ」は、アデノ随伴ウイルス逆位末端反復配列を指す。「ＴＲＹ」は、３つの転写制御活性化部位、すなわちＴＡＴＡ、ＲＢＳ、及びＹＹ１を含む配列を指す。「ＣＢＡｐ」は、ニワトリβ－アクチンプロモーターを指す。「ＣＭＶｅ」は、サイトメガロウイルスエンハンサーを指す。「ＷＰＲＥ」は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素を指す。「ｂＧＨ」は、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部を指す。「ｉｎｔ」は、イントロンを指す。ＰＲ００６Ａの２本鎖のヌクレオチド配列は、配列番号９０及び９１に提供される。
本開示は、部分的に、対象におけるある特定の遺伝子産物（例えば、ＣＮＳ疾患に関連する遺伝子産物）の組み合わせの発現のための組成物及び方法に基づく。遺伝子産物は、タンパク質、タンパク質の断片（例えば、部分）、ＣＮＳ疾患関連遺伝子を阻害する干渉核酸などであり得る。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、ＣＮＳ疾患関連遺伝子によってコードされるタンパク質またはタンパク質断片である。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、ＣＮＳ疾患関連遺伝子を阻害する干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）である。
ＣＮＳ疾患関連遺伝子は、ＦＴＤ（前頭側頭型認知症）またはＰＤ（パーキンソン病）などのＣＮＳ疾患に遺伝的、生化学的、または機能的に関連する遺伝子産物をコードする遺伝子を指す。例えば、ＧＲＮ遺伝子（タンパク質ＰＧＲＮをコードする）において病原性変異を有する個体は、ＧＲＮにおいて変異を有さない個体と比較して、ＦＴＤを発症するリスクが増加する。同様に、ＧＢＡ１遺伝子（タンパク質Ｇｃａｓｅをコードする）において変異を有する個体は、ＧＢＡ１において変異を有さない個体と比較して、ＰＤを発症するリスクが増加することが観察されている。別の例では、ＰＤは、α－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）タンパク質を含むタンパク質凝集体の蓄積に関連しており、したがって、ＳＮＣＡ（α－Ｓｙｎをコードする）は、ＰＤ関連遺伝子である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の発現カセットは、野生型または非変異体形態のＣＮＳ疾患関連遺伝子（またはそのコード配列）をコードする。ＣＮＳ疾患関連遺伝子の例を表１に記載する。
表１：ＣＮＳ疾患関連遺伝子の例
Figure 2022526823000002
Figure 2022526823000003
Figure 2022526823000004
ゴーシェ病患者（ＧＢＡ１遺伝子の両方の染色体対立遺伝子に変異を有する）に加えて、ＧＢＡ１の１つの対立遺伝子のみにおいて変異を有する患者は、パーキンソン病（ＰＤ）のリスクが非常に増加する。歩行困難、安静時の振戦、硬直、及び頻繁な抑うつ、睡眠障害、及び認知機能低下を含むＰＤ症状の重症度は、酵素活性の低下の程度と相関する。したがって、ゴーシェ病患者は最も重度の経過を有するが、ＧＢＡ１における単一の軽度の変異を有する患者は、典型的にはより良性の経過を有する。変異保有者はまた、実行機能不全、精神病、及びＰＤ様運動障害を特徴とするレビー小体型認知症、ならびに特徴的な運動障害及び認知機能障害を有する多系統萎縮症を含む、他のＰＤ関連障害のリスクが高い。これらの障害の不可避な経過を変える療法は存在しない。
Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１遺伝子の遺伝子産物）などの酵素の欠損だけでなく、リソソーム機能またはリソソームへの巨大分子の輸送に関与する多くの遺伝子における一般的な変異体（例えば、リソソーム膜タンパク質１（ＬＩＭＰ）、ＳＣＡＲＢ２とも称される）は、ＰＤリスク及び／またはゴーシェ病（例えば、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病などの神経障害性ゴーシェ病）のリスクの増加と関連付けられている。本開示は、部分的に、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、例えば、ゴーシェ病、ＰＤなどに関連する、１つ以上の遺伝子、例えば、Ｇｃａｓｅ、ＧＢＡ２、プロサポシン、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）、ＬＩＭＰ２、ＧＡＬＣ、ＣＴＳＢ、ＳＭＰＤ１、ＧＣＨ１、ＲＡＢ７、ＶＰＳ３５、ＩＬ－３４、ＴＲＥＭ２、ＴＭＥＭ１０６Ｂ、または前述（またはそれらの部分）のうちのいずれかの組み合わせをコードする発現構築物（例えば、ベクター）に基づく。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の遺伝子産物の組み合わせは、対象において発現されるとき、一緒に作用して（例えば、相乗的に）、ＣＮＳ疾患の１つ以上の徴候及び症状を減少させる。
したがって、いくつかの態様において、本開示は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）Ｇｃａｓｅコード配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｇｃａｓｅをコードする核酸配列は、配列番号１４に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１４８．２に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号１５に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）プロサポシンコード配列を含む。いくつかの実施形態において、プロサポシンをコードする核酸配列は、配列番号１６に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００２７６９．１に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号１７に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば、プロサポシンタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、ＬＩＭＰ２／ＳＣＡＲＢ２（例えば、ＳＣＡＲＢ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）ＳＣＡＲＢ２コード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＩＭＰ２／ＳＣＡＲＢ２をコードする核酸配列は、配列番号１８に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００５４９７．１に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号２９に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＳＣＡＲＢ２タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、ＧＢＡ２タンパク質（例えば、ＧＢＡ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）ＧＢＡ２コード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＧＢＡ２をコードする核酸配列は、配列番号３０に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６５９９５．１に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号３１に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＧＢＡ２タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、ＧＡＬＣタンパク質（例えば、ＧＡＬＣ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）ＧＡＬＣコード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＧＡＬＣをコードする核酸配列は、配列番号３３に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１４４．２に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号３４に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えばＧＡＬＣタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、ＣＴＳＢタンパク質（例えば、ＣＴＳＢ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）ＣＴＳＢコード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＴＳＢをコードする核酸配列は、配列番号３５に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１８９９．１に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号３６に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えばＣＴＳＢタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、ＳＭＰＤ１タンパク質（例えば、ＳＭＰＤ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）ＳＭＰＤ１コード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＳＭＰＤ１をコードする核酸配列は、配列番号３７に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００５３４．３に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号３８に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＳＭＰＤ１タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、ＧＣＨ１タンパク質（例えば、ＧＣＨ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）ＧＣＨ１コード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＧＣＨ１をコードする核酸配列は、配列番号４５に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００５３４．３に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号４６に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＧＣＨ１タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、ＲＡＢ７Ｌタンパク質（例えば、ＲＡＢ７Ｌ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）ＲＡＢ７Ｌコード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＡＢ７Ｌをコードする核酸配列は、配列番号４７に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３９２０．１に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号４８に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＲＡＢ７Ｌタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、ＶＰＳ３５タンパク質（例えば、ＶＰＳ３５遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）ＶＰＳ３５コード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＰＳ３５をコードする核酸配列は、配列番号４９に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６０６７６．２に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号５０に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＶＰＳ３５タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、ＩＬ－３４タンパク質（例えば、ＩＬ３４遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）ＩＬ－３４コード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－３４をコードする核酸配列は、配列番号５５に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６８９６６９．２に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号５６に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＩＬ－３４タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、ＴＲＥＭ２タンパク質（例えば、ＴＲＥＭ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）ＴＲＥＭ２コード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＲＥＭ２をコードする核酸配列は、配列番号５７に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６１８３８．１に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号５８に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＴＲＥＭ２タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質（例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）ＴＭＥＭ１０６Ｂコード配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＭＥＭ１０６Ｂをコードする核酸配列は、配列番号６３に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６０８４４．２に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号６４に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、プログラニュリン（例えば、ＰＧＲＮ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）プロサポシンコード配列を含む。いくつかの実施形態において、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードする核酸配列は、配列番号６７に記載（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００２０７８．１に記載）のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号６８に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば、プロサポシンタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
いくつかの態様において、本開示は、第１の遺伝子産物及び第２の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供し、各遺伝子産物は、独立して、表１に記載の遺伝子産物またはその一部から選択される。
いくつかの実施形態において、第１の遺伝子産物または第２の遺伝子産物は、Ｇｃａｓｅタンパク質、またはその一部分である。いくつかの実施形態において、第１の遺伝子産物は、Ｇｃａｓｅタンパク質であり、第２の遺伝子産物は、ＧＢＡ２、プロサポシン、プログラニュリン、ＬＩＭＰ２、ＧＡＬＣ、ＣＴＳＢ、ＳＭＰＤ１、ＧＣＨ１、ＲＡＢ７、ＶＰＳ３５、ＩＬ－３４、ＴＲＥＭ２、及びＴＭＥＭ１０６Ｂから選択される。
いくつかの実施形態において、発現構築物は、（例えば、単独でまたは別の遺伝子産物に加えて）干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）をコードする。いくつかの実施形態において、干渉核酸は、α－シヌクレイン（α－シヌクレイン）の発現を阻害する。いくつかの実施形態において、α－シヌクレインを標的とする干渉核酸は、配列番号２０～２５のうちのいずれか１つに記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、α－シヌクレインを標的とする干渉核酸は、配列番号２０～２５のうちのいずれか１つに記載の配列に結合する（例えば、ハイブリダイゼーションする）。
いくつかの実施形態において、干渉核酸は、ＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を阻害する。いくつかの実施形態において、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする干渉核酸は、配列番号６４または６５に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする干渉核酸は、配列番号６４または６５に記載の配列に結合する（例えば、ハイブリダイゼーションする）。
いくつかの実施形態において、発現構築物は１つ以上のプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、またはＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６など）である。
いくつかの実施形態において、発現構築物は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＩＲＥＳは、第１の遺伝子産物及び第２の遺伝子産物の間に位置する。
いくつかの実施形態において、発現構築物は、自己切断ペプチドコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチドである。
いくつかの実施形態において、発現構築物は、２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列は、第１の遺伝子産物及び第２の遺伝子産物に隣接する（例えば、５’末端から３’末端までに以下のように配置される：ＩＴＲ－第１遺伝子産物－第２遺伝子産物－ＩＴＲ）。いくつかの実施形態において、単離核酸のＩＴＲ配列のうちの１つは、機能的な末端解離部位（ｔｒｓ）を欠く。例えば、いくつかの実施形態において、ＩＴＲのうちの１つは、ΔＩＴＲである。
本開示は、いくつかの態様において、修飾「Ｄ」領域（例えば、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲに対して修飾されたＤ配列、配列番号２９）を有するＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターに関する。いくつかの実施形態において、修飾Ｄ領域を有するＩＴＲは、ｒＡＡＶベクターの５’ＩＴＲである。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」領域は、例えば、配列番号２６に記載の「Ｓ」配列を含む。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」領域を有するＩＴＲは、ｒＡＡＶベクターの３’ＩＴＲである。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」領域は、「Ｄ」領域がＩＴＲの３’末端（例えば、ベクターの導入遺伝子挿入物に対してＩＴＲの外側または末端）に配置される３’ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」領域は、配列番号２６または２７に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態において、単離核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、ＴＲＹ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＴＲＹ領域は、配列番号２８に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示による記載の単離核酸は、配列番号１～９１のうちのいずれか１つに記載の配列を含むか、またはそれからなるか、またはそれを有するペプチドをコードする。
いくつかの態様において、本開示は、本開示による記載の単離核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド、またはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターまたはバキュロウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（例えば、一本鎖ＤＮＡ）である。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示による記載の単離核酸または本開示による記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、キャプシドタンパク質及び本開示による記載の単離核酸またはベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
いくつかの実施形態において、キャプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質またはＡＡＶｒｈ．１０キャプシドタンパク質は、血液脳関門を通過することができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞及び非神経細胞を形質導入する。
いくつかの態様において、本開示は、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法を提供し、方法は、本開示による記載の組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＣＮＳ疾患は、表１２に記載の神経変性疾患などの神経変性疾患である。いくつかの実施形態において、ＣＮＳ疾患は、表１３に記載のシヌクレイン病などのシヌクレイン病である。いくつかの実施形態において、ＣＮＳ疾患は、表１４に記載のタウオパチーなどのタウオパチーである。いくつかの実施形態において、ＣＮＳ疾患は、表１５に記載のリソソーム蓄積症などのリソソーム蓄積症である。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症は、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病などの神経障害性ゴーシェ病である。
いくつかの実施形態において、本開示は、パーキンソン病を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法を提供し、方法は、本開示による記載の組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤ、タウ変異を有するＦＴＤ、Ｃ９Ｏｒｆ７２変異を有するＦＴＤ、セロイドリポフスチン症、パーキンソン病、アルツハイマー病、大脳皮質基底核変性症、運動ニューロン病、またはゴーシェ病を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法を提供し、方法は、対象に、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを投与することを含み、ＰＧＲＮは、配列番号６８の核酸配列によってコードされ、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＧＲＮ変異を有する、ＦＴＤを有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法を提供し、方法は、対象に、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを投与することを含み、ＰＧＲＮは、配列番号６８の核酸配列によってコードされ、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、約３．５×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）、約７．０×１０１３ｖｇ、または約１．４×１０１４ｖｇの用量で対象に投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、大槽への注射を介して投与される。
いくつかの実施形態において、組成物は、２つ以上の遺伝子産物（例えば、ＣＮＳ疾患関連遺伝子産物）、例えば、本出願に記載の２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の遺伝子産物をコードする核酸（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質によって封入される、ｒＡＡＶゲノム）を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）の異なる核酸（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質によって別々に封入される２つ以上のｒＡＡＶゲノム）を含み、それぞれが１つ以上の異なる遺伝子産物をコードする。いくつかの実施形態において、２つ以上の異なる組成物が対象に投与され、それぞれの組成物は、異なる遺伝子産物をコードする１つ以上の核酸を含む。いくつかの実施形態において、異なる遺伝子産物が、同じプロモーター型（例えば、同じプロモーター）に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、異なる遺伝子産物が、異なるプロモーターに作動可能に連結されている。
単離核酸及びベクター
単離核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの態様において、本開示は、１つ以上のＰＤ関連遺伝子、例えば、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１遺伝子の遺伝子産物）またはその一部分をコードする発現構築物を含む単離核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）を提供する。Ｇｃａｓｅは、ベータ－グルコセレブロシダーゼまたはＧＢＡとも称され、化学的グルコセレブロシド、糖脂質代謝における中間体のβ－グルコシド結合を切断するリソソームタンパク質を指す。ヒトにおいて、Ｇｃａｓｅは、１番染色体上に位置するＧＢＡ１遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＧＢＡ１は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１４８．２（配列番号１４）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号１５に記載の配列などの、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）Ｇｃａｓｅコード配列を含む。
いくつかの態様において、本開示は、プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。プロサポシンは、スフィンゴ脂質活性化タンパク質（サポシン）Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの前駆体糖タンパク質であり、短いオリゴ糖基を有するスフィンゴ糖脂質の異化を促進する。ヒトにおいて、ＰＳＡＰ遺伝子は、１０番染色体上に位置する。いくつかの実施形態において、ＰＳＡＰは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００２７６９．１（例えば、配列番号１６）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号１７に記載の配列などの、コドン最適化された（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）プロサポシンをコードする配列を含む。
本開示の態様は、ＬＩＭＰ２／ＳＣＡＲＢ２（例えば、ＳＣＡＲＢ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関する。ＳＣＡＲＢ２は、細胞内のリソソーム及びエンドソーム輸送を調節する膜タンパク質を指す。ヒトにおいて、ＳＣＡＲＢ２遺伝子は、４番染色体上に位置する。いくつかの実施形態において、ＳＣＡＲＢ２遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００５４９７．１（配列番号１８）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号１９に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化されたＳＣＡＲＢ２コード配列を含む。
本開示の態様は、ＧＢＡ２タンパク質（例えば、ＧＢＡ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関する。ＧＢＡ２タンパク質は、非リソソームグルコシルセラミダーゼを指す。ヒトにおいて、ＧＢＡ２遺伝子は、９番染色体上に位置する。いくつかの実施形態において、ＧＢＡ２遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６５９９５．１（配列番号３０）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号３１に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化されたＧＢＡ２コード配列を含む。
本開示の態様は、ＧＡＬＣタンパク質（例えば、ＧＡＬＣ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関する。ＧＡＬＣタンパク質は、ガラクトシルセラミダーゼ（またはガラクトセレブロシダーゼ）を指し、ガラクトセレブロシド、ガラクトシルスフィンゴシン、ラクトシルセラミド、及びモノガラクトシルジグリセリドのガラクトースエステル結合を加水分解する酵素である。ヒトにおいて、ＧＡＬＣ遺伝子は、１４番染色体上に位置する。いくつかの実施形態において、ＧＡＬＣ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１４４．２（配列番号３３）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号３４に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化されたＧＡＬＣコード配列を含む。
本開示の態様は、ＣＴＳＢタンパク質（例えば、ＣＴＳＢ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関する。ＣＴＳＢタンパク質は、細胞内タンパク質分解において重要な役割を果たすリソソームシステインプロテアーゼであるカテプシンＢを指す。ヒトにおいて、ＣＴＳＢ遺伝子は、８番染色体上に位置する。いくつかの実施形態において、ＣＴＳＢ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１８９９．１（配列番号３５）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号３６に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化されたＣＴＳＢコード配列を含む。
本開示の態様は、ＳＭＰＤ１タンパク質（例えば、ＳＭＰＤ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関する。ＳＭＰＤ１タンパク質は、スフィンゴ脂質代謝に関与する加水分解酵素であるスフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１を指す。ヒトにおいて、ＳＭＰＤ１遺伝子は、１１番染色体上に位置する。いくつかの実施形態において、ＳＭＰＤ１遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００５３４．３（配列番号３７）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号３８に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化されたＳＭＰＤ１コード配列を含む。
本開示の態様は、ＧＣＨ１タンパク質（例えば、ＧＣＨ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関する。ＧＣＨ１タンパク質は、葉酸及びビオプテリン生合成経路の一部である加水分解酵素であるＧＴＰシクロヒドロラーゼＩを指す。ヒトにおいて、ＧＣＨ１遺伝子は、１４番染色体上に位置する。いくつかの実施形態において、ＧＣＨ１遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１５２．１（配列番号４５）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号４６に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化されたＧＣＨ１コード配列を含む。
本開示の態様は、ＲＡＢ７Ｌタンパク質（例えば、ＲＡＢ７Ｌ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関する。ＲＡＢ７Ｌタンパク質は、ＧＴＰ結合タンパク質である、ＲＡＢ７、メンバーＲＡＳがん遺伝子ファミリー様１を指す。ヒトにおいて、ＲＡＢ７Ｌ遺伝子は、１番染色体上に位置する。いくつかの実施形態において、ＲＡＢ７Ｌ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３９２０．１（配列番号４７）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号４８に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化されたＲＡＢ７Ｌコード配列を含む。
本開示の態様は、ＶＰＳ３５タンパク質（例えば、ＶＰＳ３５遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関する。ＶＰＳ３５タンパク質は、エンドソームからトランスゴルジネットワークへのタンパク質の逆行輸送に関与するタンパク質複合体の一部である、空胞タンパク質選別関連タンパク質３５を指す。ヒトにおいて、ＶＰＳ３５遺伝子は、１６番染色体上に位置する。いくつかの実施形態において、ＶＰＳ３５遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６０６７６．２（配列番号４９）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号５０に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化されたＶＰＳ３５コード配列を含む。
本開示の態様は、ＩＬ－３４タンパク質（例えば、ＩＬ３４遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関する。ＩＬ－３４タンパク質は、単球の増殖及び生存を増加させるサイトカインであるインターロイキン３４を指す。ヒトにおいて、ＩＬ３４遺伝子は、１６番染色体上に位置する。いくつかの実施形態において、ＩＬ３４遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６８９６６９．２（配列番号５５）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号５６に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化されたＩＬ－３４コード配列を含む。
本開示の態様は、ＴＲＥＭ２タンパク質（例えば、ＴＲＥＭ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関する。ＴＲＥＭ２タンパク質は、骨髄性細胞で見出される免疫グロブリンスーパーファミリー受容体である、骨髄性細胞発現トリガー受容体２を指す。ヒトにおいて、ＴＲＥＭ２遺伝子は、６番染色体上に位置する。いくつかの実施形態において、ＴＲＥＭ２遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６１８３８．１（配列番号５７）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号５８に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化されたＴＲＥＭ２コード配列を含む。
本開示の態様は、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質（例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関する。ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質は、樹状突起の形態形成及びリソソーム輸送の調節に関与するタンパク質である、膜貫通タンパク質１０６Ｂを指す。ヒトにおいて、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子は、７番染色体上に位置する。いくつかの実施形態において、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６０８４４．２（配列番号６２）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号６３に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化されたＴＭＥＭ１０６Ｂコード配列を含む。
本開示の態様は、プログラニュリンタンパク質（例えば、ＰＧＲＮ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関する。ＰＧＲＮタンパク質は、発生、炎症、細胞増殖及びタンパク質恒常性に関与するタンパク質であるプログラニュリンを指す。ヒトにおいて、ＰＧＲＮ遺伝子は、１７番染色体上に位置する。いくつかの実施形態において、ＰＧＲＮ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００２０７８．１（配列番号６７）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、単離核酸は、配列番号６８に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、単離核酸は、コドン最適化されたＰＧＲＮコード配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター及びサイトメガロウイルスエンハンサー（ＣＭＶｅ）をさらに含む。
いくつかの態様において、本開示は、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料におけるＰＧＲＮタンパク質レベルを定量するための自動ウエスタンブロットイムノアッセイを提供する。いくつかの実施形態において、イムノアッセイは、キャピラリーベースの自動ウエスタンブロットイムノアッセイプラットフォームであり、タンパク質分離、免疫プロービング、洗浄、及び化学発光による検出などのすべてのステップがキャピラリーカートリッジにおいて行われる。いくつかの実施形態において、ＣＳＦ試料は、ヒトまたは非ヒト霊長類由来である。いくつかの態様において、イムノアッセイは、循環抗体の存在下でのＰＧＲＮタンパク質レベルの差の検出を可能にする。いくつかの態様において、本開示は、ＣＳＦ試料におけるプログラニュリンタンパク質レベルを定量する方法を提供し、方法は、以下を含む。（１）ＣＳＦ試料を希釈すること（例えば、４倍希釈）、（２）ＣＳＦ試料、抗プログラニュリン抗体、抗プログラニュリン抗体を検出する二次抗体、ルミノール及び過酸化物を、キャピラリーカートリッジのウェルに充填すること、（３）キャピラリーカートリッジを自動ウエスタンブロットイムノアッセイ機器に装填すること、（４）自動ウエスタンブロットイムノアッセイ機器を使用して、シグナル強度、ピーク面積、シグナル対ノイズ比及び総タンパク質正規化パラメータのうちの１つ以上を計算すること、ならびに（５）ＣＳＦ試料におけるプログラニュリンタンパク質レベルを、抗プログラニュリン抗体に対する免疫反応性のピーク面積として定量すること。いくつかの実施形態において、ＣＳＦ試料は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び試料緩衝液を含むマスター混合物において希釈される。マスター混合物は、他の独自の構成要素をさらに含み得る。いくつかの態様において、抗プログラニュリン抗体は、ヒトプログラニュリンを検出する。いくつかの実施形態において、プログラニュリンタンパク質レベルは、自動ウエスタンブロットイムノアッセイ機器を制御するソフトウェアを使用して、計算されたパラメータから定量化される。いくつかの実施形態において、このソフトウェアは、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のためのＣｏｍｐａｓソフトウェアである。
いくつかの実施形態において、本開示は、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料におけるプログラニュリンタンパク質レベルを定量する方法を提供し、方法は、以下を含む。（１）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び試料緩衝液を含むマスター混合物においてＣＳＦ試料を希釈すること（例えば、４倍希釈）、（２）希釈ＣＳＦ試料、抗プログラニュリン抗体、抗プログラニュリン抗体を検出する二次抗体、ルミノール及び過酸化物を、キャピラリーカートリッジのウェルに充填すること、（３）キャピラリーカートリッジを自動ウエスタンブロットイムノアッセイ機器に装填すること、（４）自動ウエスタンブロットイムノアッセイ機器を使用して、シグナル強度、ピーク面積、及びシグナル対ノイズ比を計算すること、ならびに（５）ＣＳＦ試料におけるプログラニュリンタンパク質レベルを、抗プログラニュリン抗体に対する免疫反応性のピーク面積として定量すること。
いくつかの態様において、本開示は、第１の遺伝子産物及び第２の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供し、各遺伝子産物は、独立して、表１に記載の遺伝子産物またはその一部から選択される。
いくつかの実施形態において、本開示による記載の単離核酸またはベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、配列番号１～９１のうちのいずれか１つに記載の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、本開示による記載の単離核酸またはベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、配列番号１～９１のうちのいずれか１つに記載の配列と相補的である（例えば、その相補鎖である）配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、本開示による記載の単離核酸またはベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、配列番号１～９１のうちのいずれか１つに記載の配列の逆相補鎖である配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、本開示による記載の単離核酸またはベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、配列番号１～９１のうちのいずれか１つに記載の配列の一部分を含むか、またはそれからなる。一部分は、配列番号１～９１のうちのいずれか１つに記載の配列の少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示による記載の核酸配列は、核酸センス鎖（例えば、５’から３’鎖）であるか、またはウイルス配列の文脈において、プラス（＋）鎖である。いくつかの実施形態において、本開示による記載の核酸配列は、核酸アンチセンス鎖（例えば、３’から５’鎖）であるか、またはウイルス配列の文脈において、マイナス（－）鎖である。
いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、天然に存在する遺伝子のコード部分（例えば、ｃＤＮＡ）によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１の遺伝子産物は、ＧＢＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質（またはその断片）である。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、表１に記載の別の遺伝子、例えば、ＳＣＡＲＢ２／ＬＩＭＰ２遺伝子またはＰＳＡＰ遺伝子によってコードされるタンパク質（またはその断片）である。しかしながら、当業者は、第１の遺伝子産物（例えば、Ｇｃａｓｅ）及び第２の遺伝子産物（例えば、ＬＩＭＰ２など）の発現順序が概して逆転し得ること（例えば、ＬＩＭＰ２は第１の遺伝子産物であり、Ｇｃａｓｅは第２の遺伝子産物である）を認識する。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、表１に記載の遺伝子の断片（例えば、部分）である。タンパク質断片は、表１に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％を含み得る。いくつかの実施形態において、タンパク質断片は、表１に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質の５０％～９９．９％（例えば、５０％～９９．９％の任意の値）を含む。
いくつかの実施形態において、発現構築物は、モノシストロン性である（例えば、発現構築物は、第１の遺伝子産物及び第２の遺伝子産物を含む単一の融合タンパク質をコードする）。いくつかの実施形態において、発現構築物は、ポリシストロン性である（例えば、発現構築物は、２つの異なる遺伝子産物、例えば、２つの異なるタンパク質またはタンパク質断片をコードする）。
ポリシストロン発現ベクターは、１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）のプロモーターを含み得る。任意の好適なプロモーター、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、内因性プロモーター、組織特異的プロモーター（例えば、ＣＮＳ特異的プロモーター）などを使用し得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＢＡプロモーター）、ＣＡＧプロモーター（例えば、Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２；ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１２１－９－２によって記載される）、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーター（例えば、Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅ ２９７（１－２）：２１－３２によって記載される）である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、または第１の遺伝子産物及び第２の遺伝子産物をコードする核酸配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、発現カセットは、転写因子結合配列、イントロンスプライス部位、ポリ（Ａ）付加部位、エンハンサー配列、リプレッサー結合部位、または前述の任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない１つ以上の追加の調節配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１の遺伝子産物をコードする核酸配列及び第２の遺伝子産物をコードする核酸配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする核酸配列によって分離される。ＩＲＥＳ部位の例は、例えば、Ｍｏｋｒｅｊｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１２５－３０によって記載されている。いくつかの実施形態において、第１の遺伝子産物をコードする核酸配列及び第２の遺伝子産物をコードする核酸配列は、自己切断ペプチドをコードする核酸配列によって分離される。自己切断ペプチドの例として、限定されないが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ ２Ａ、及びＢｍＩＦＶ ２Ａが挙げられ、それらはＬｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ．７：２１９３に記載される。いくつかの実施形態において、自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチドである。
病理学的には、ＰＤ及びゴーシェ病などの障害は、α－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）タンパク質を主に含むタンパク質凝集体の蓄積と関連している。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の単離核酸は、α－Ｓｙｎタンパク質の発現を減少または防止する阻害性核酸を含む。阻害性核酸をコードする配列は、発現ベクターの非翻訳領域（例えば、イントロン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲなど）に配置され得る。
いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、発現構築物のイントロンにおいて、例えば、第１の遺伝子産物をコードする配列の上流のイントロンにおいて配置される。阻害性核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）、またはＲＮＡアプタマーであり得る。一般に、阻害性核酸は、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の約６個～約３０個（例えば、６個及び３０個を含めたその間の任意の整数）の連続したヌクレオチドに結合する（例えば、ハイブリダイゼーションする）。いくつかの実施形態において、阻害性核酸分子は、ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡ、例えば、ＳＮＣＡ（α－Ｓｙｎタンパク質をコードする遺伝子）またはＴＭＥＭ１０６Ｂ（例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質をコードする遺伝子）を標的とするｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、それがハイブリダイゼーションするＳＮＣＡ ｍＲＮＡの領域とのミスマッチを一切含まない（例えば、ｍｉＲＮＡは「完全」である）。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、ｓｈＲＮＡ（例えば、ＳＮＣＡまたはＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とするｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、ｍｉＲ－１５５足場及びＳＮＣＡまたはＴＭＥＭ１０６Ｂ標的配列を含む人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）である。
当業者は、阻害性核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）を含むかまたはコードする核酸配列に言及する場合、本明細書で提供される配列において任意の１つ以上のチミジン（Ｔ）ヌクレオチドまたはウリジン（Ｕ）ヌクレオチドを、アデノシンヌクレオチドとの塩基対形成（例えば、ワトソン－クリック塩基対を介して）に適切な任意の他のヌクレオチドと置き換えてもよいことを認識する。例えば、ＴをＵに置き換え得、ＵをＴに置き換え得る。
本明細書に記載の単離核酸は、それ自体として、またはベクターの一部として存在し得る。一般に、ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなど）であり得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド（例えば、本明細書に記載の単離核酸を含むプラスミド）である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（例えば、一本鎖ＤＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ベクターは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、バキュロウイルスベクター（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病（ＡｃＮＰＶ）ベクター）である。
典型的には、ｒＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶゲノム）は、２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接する導入遺伝子（例えば、以下のプロモーター、イントロン、エンハンサー配列、タンパク質コード配列、阻害性ＲＮＡコード配列、ポリＡ尾部配列などの各々のうちの１つ以上を含む発現構築物）を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子は、本開示による記載の単離核酸を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターの２つのＩＴＲ配列の各々は、全長ＩＴＲ（例えば、長さが約１４５ｂｐであり、機能的なＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）及び末端解離部位（ｔｒｓ）を含む）である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターのＩＴＲのうちの１つは、切断されている（例えば、短縮されるか、または完全長ではない）。いくつかの実施形態において、切断されたＩＴＲは、機能的な末端解離部位（ｔｒｓ）を欠き、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶベクター）の産生のために使用される。いくつかの実施形態において、切断されたＩＴＲは、例えば、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（２６）：２１１２－８によって記載されるΔＩＴＲである。
本開示の態様は、野生型ＡＡＶ ＩＴＲに対して、例えば野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（例えば、配列番号２９）に対して、１つ以上の修飾（例えば、核酸付加、欠失、置換など）を有するＩＴＲを含む単離核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）に関する。野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲの構造を図２０に示す。概して、野生型ＩＴＲは、自己アニールして、２つのクロスアーム（それぞれＢ／Ｂ’及びＣ／Ｃ’と称される配列によって形成される）、より長いステム領域（配列Ａ／Ａ’と称される配列によって形成される）、及び「Ｄ」領域と称される一本鎖末端領域からなる回文二本鎖Ｔ字形ヘアピン構造を形成する１２５ヌクレオチド領域を含む（図２０）。概して、ＩＴＲの「Ｄ」領域は、Ａ／Ａ’配列によって形成されるステム領域と、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子を含む挿入物との間に配置される（例えば、ＩＴＲの末端に対してＩＴＲの「内側」に配置されるか、またはｒＡＡＶベクターの導入遺伝子挿入物もしくは発現構築物の近位に配置される）。いくつかの実施形態において、「Ｄ」領域は、配列番号２７に記載の配列を含む。「Ｄ」領域は、例えば、Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ ９（３）によって開示されるように、キャプシドタンパク質によるｒＡＡＶベクターのキャプシド化において重要な役割を果たすことが観察されている。
本開示は、部分的に、ＩＴＲの「外側」（例えば、導入遺伝子挿入物または発現構築物に対してＩＴＲの末端に近位）に位置する「Ｄ」領域を含むｒＡＡＶベクターが、未修飾（例えば、野生型）ＩＴＲを有するＩＴＲを有するｒＡＡＶベクターよりもＡＡＶキャプシドタンパク質によって効率的にキャプシド化されるという驚くべき発見に基づいている。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」配列（例えば、「外側」位置における「Ｄ」配列）を有するｒＡＡＶベクターは、野生型ＩＴＲ配列を有するｒＡＡＶベクターに対して毒性が低下している。
いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）に対して少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む。修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）に対して、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１０個超のヌクレオチド置換を有し得る。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）に対して、少なくとも１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、または１９個の核酸置換を含む。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）と、約１０％～約９９％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）同一である。いくつかの実施形態において、修飾「Ｄ」配列は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５０（５）：５７３－８０に記載の「Ｓ」配列とも称される、配列番号２６に記載の配列を含む。
本開示による記載の単離核酸またはｒＡＡＶベクターは、例えば、配列番号２８に記載の、またはＦｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１７）：１１０８２－１１０９４によって記載される「ＴＲＹ」配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＴＲＹ配列は、単離核酸またはｒＡＡＶベクターのＩＴＲ（例えば５’ＩＴＲ）と発現構築物（例えば導入遺伝子コード挿入物）との間に位置付けられる。
いくつかの態様において、本開示は、本開示による記載の単離核酸またはｒＡＡＶベクターを含むバキュロウイルスベクターに関する。いくつかの実施形態において、バキュロウイルスベクターは、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３（１６）：１９３５－４３及びＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７（１１）：１８８８－１８９６によって記載される、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病（ＡｃＮＰＶ）ベクターである。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の単離核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、宿主細胞は哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞などであり得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。
ｒＡＡＶ
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の核酸（例えば、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター）をコードする導入遺伝子を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）に関する。「ｒＡＡＶ」という用語は、概して、１つ以上のＡＡＶキャプシドタンパク質によって封入されたｒＡＡＶベクターを含むウイルス粒子を指す。本開示による記載のｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ１０から選択される血清型を有するキャプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、非ヒト宿主由来のキャプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３９などのアカゲザルＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本開示による記載のｒＡＡＶは、それが由来する野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質に対して、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１０個超（例えば、１５個、２０個、２５個、５０個、１００個など）のアミノ酸置換（例えば、変異）を含むキャプシドタンパク質変異体などの野生型キャプシドタンパク質の変異体であるキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶキャプシドタンパク質変異体は、例えば、Ａｌｂｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１８ Ｆｅｂ ７；２６（２）：５１０－５２３によって記載される、ＡＡＶ１ＲＸキャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態において、キャプシドタンパク質変異体は、例えば、Ｒｏｓａｒｉｏ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１６；３：１６０２６によって記載される、ＡＡＶ ＴＭ６キャプシドタンパク質である。
いくつかの実施形態において、本開示による記載のｒＡＡＶは、特にＣＳＦ空間に、または脳実質に直接導入されるときに、ＣＮＳを通して容易に拡散する。したがって、いくつかの実施形態において、本開示による記載のｒＡＡＶは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができるキャプシドタンパク質を含む。例えば、いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ．１０血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。ｒＡＡＶの産生は、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６３（９）：３８２２－８及びＷｒｉｇｈｔ（２００９）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０（７）：６９８－７０６によって記載される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、骨髄性細胞、例えば、小膠細胞を特異的または優先的に標的とするキャプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、「ＰＲ００６Ａ」と称されるｒＡＡＶを提供する。ＰＲ００６Ａは、機能的なヒトＧＲＮ遺伝子を送達し、機能的なヒトＰＧＲＮの発現の増加をもたらすｒＡＡＶである。ＰＲ００６Ａベクター挿入物は、ヒトＧＲＮのコドン最適化コード配列（配列番号６８）を構成的に発現するために、４つの部分、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ＣＢＡプロモーター、エクソン１、及びイントロン（イントロン）を含む、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター要素を含む。３’領域はまた、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）、それに続くウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル尾部を含む。よく説明された３つの転写制御活性化部位が、プロモーター領域の５’末端に含まれる：ＴＡＴＡ、ＲＢＳ、及びＹＹ１（例えば、Ｆｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１７）：１１０８２－１１０９４を参照）。隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）は、介在配列の正しいパッケージングを可能にする。骨格は、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子、及び逆パッケージングを防止するためのスタッファー配列を含む。ＲＡＡＶベクターを示す概略図を図６４に示す。配列番号９０は、図６４に示されるＰＲ００６Ａベクターの第１の鎖のヌクレオチド配列（５’から３’の順に）を提供する。配列番号９１は、図６４に示されるＰＲ００６Ａベクターの第２の鎖のヌクレオチド配列（５’から３’の順に）を提供する。ＰＲ００６Ａは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、本開示による記載のｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶキャプシド粒子を形成するようにＡＡＶキャプシドタンパク質によってキャプシド化された組換えｒＡＡＶゲノムを含む）は、バキュロウイルスベクター発現系（ＢＥＶＳ）において産生される。ＢＥＶＳを使用したｒＡＡＶの産生は、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３（１６）：１９３５－４３、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７（１１）：１８８８－１８９６、米国特許第８，９４５，９１８号、米国特許第９，８７９，２８２号、及び国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１８４８７９号によって記載される。しかしながら、ｒＡＡＶは、任意の適切な方法を用いて（例えば、組換えｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を用いて）産生され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示のｒＡＡＶは、ＨＥＫ２９３（ヒト胚性腎臓）細胞において産生される。
医薬組成物
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の単離核酸またはｒＡＡＶ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、化合物の生物学的活性または特性を無効にせず、比較的無毒である担体または希釈剤などの材料を指し、例えば、材料は、望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、またはそれが含まれている組成物の構成要素のうちのいずれかと有害な様式で相互作用することなく、個体に投与され得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、本発明内で有用な化合物をその意図された機能を実行し得るように患者内で、または患者に運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体充填剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒、または封入材料などの薬学的に許容される材料、組成物、または担体を意味する。本発明の実施において使用される医薬組成物に含まれ得る追加の成分は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９８５，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に記載され、それは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供される組成物（例えば、医薬組成物）は、経腸（例えば、経口）、非経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、皮下、脳室内、経皮、皮膚間、直腸、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、クリーム、及び／または液滴による）、粘膜、鼻腔、口腔、舌下を含む任意の経路によって；気管内注入、気管支注入、及び／または吸入によって；及び／または経口スプレー、鼻腔スプレー、及び／またはエアロゾルとして投与され得る。具体的に企図される経路は、経口投与、静脈内投与（例えば、全身静脈内注射）、血液及び／またはリンパ供給を介した局所投与、及び／または患部への直接投与である。概して、最も適切な投与経路は、薬剤の性質（例えば、胃腸管の環境におけるその安定性）、及び／または対象の状態（例えば、対象が経口投与に耐えることができるかどうか）を含む様々な因子に依存する。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の化合物または医薬組成物は、対象の眼への局所投与に適切である。
いくつかの実施形態において、本開示は、水溶液中に存在する上述のＰＲ００６Ａ ｒＡＡＶを含むＰＲ００６Ａ完成薬品を提供する。いくつかの実施形態において、最終製剤緩衝液は、約２０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ８．０］、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約２００ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．００１％［ｗ／ｖ］のポロキサマー１８８を含む。いくつかの実施形態において、完成した薬剤製品及び最終製剤緩衝液は、大槽内（ＩＣＭ）注射に適切である。
方法
本開示の態様は、ＣＮＳ関連疾患を治療するための対象における１つ以上のＣＮＳ疾患関連遺伝子産物の発現のための組成物に関する。１つ以上のＣＮＳ疾患関連遺伝子産物は、１つ以上の単離核酸またはｒＡＡＶベクターによってコードされ得る。いくつかの実施形態において、対象は、１つ以上（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）の遺伝子産物をコードする単一のベクター（例えば、単離核酸、ｒＡＡＶなど）を投与される。いくつかの実施形態において、対象は、複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の）ベクター（例えば、単離核酸、ｒＡＡＶなど）を投与され、各ベクターは、異なるＣＮＳ疾患関連遺伝子産物をコードする。
ＣＮＳ関連疾患は、神経変性疾患、シヌクレイン病、タウオパチー、またはリソソーム蓄積症であり得る。神経変性疾患及びその関連遺伝子の例を表１２に記載する。
「シヌクレイン病」は、（例えば、健康な対象、例えば、シヌクレイン病を有しない対象に対して）対象におけるアルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡの遺伝子産物）の蓄積によって特徴付けられる疾患または障害を指す。シヌクレイン病及びその関連遺伝子の例を表１３に記載する。
「タウオパチー」は、（例えば、タウオパチーを有しない健康な対象に対して）対象における異常なＴａｕタンパク質の蓄積によって特徴付けられる疾患または障害を指す。タウオパチー及びその関連遺伝子の例を表１４に記載する。
「リソソーム蓄積症」は、対象のリソソームにおける有毒な細胞産物の異常な蓄積によって特徴付けられる疾患を指す。リソソーム蓄積症及びそれらに関連する遺伝子の例を表１５に記載する。
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療すること」は、（ａ）ＣＮＳ疾患の発症の予防または遅延、（ｂ）ＣＮＳ疾患の重症度の減少、（ｃ）ＣＮＳ疾患の特徴的な症状の発症の減少または予防、（ｄ）及び／またはＣＮＳ疾患の特徴的な症状の悪化の予防を指す。ＣＮＳ疾患の症状は、例えば、運動機能障害（例えば、震え、硬直、動きの遅さ、歩行困難、麻痺）、認知機能障害（例えば、認知症、うつ病、不安、精神病）、記憶の障害、感情及び行動機能障害を含み得る。
本開示は、部分的に、パーキンソン病を治療するために一緒に（例えば、相乗的に）作用する対象におけるＰＤ関連遺伝子産物の組み合わせの発現のための組成物に基づく。
したがって、いくつかの態様において、本開示は、パーキンソン病を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法を提供し、方法は、本開示による記載の組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を対象に投与することを含む。
本開示は、部分的に、ゴーシェ病を治療するための対象における１つ以上のＣＮＳ疾患関連遺伝子産物の発現のための組成物に基づく。いくつかの実施形態において、ゴーシェ病は、神経障害性ゴーシェ病、例えば、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病である。いくつかの実施形態において、ゴーシェ病を有する対象は、ＰＤまたはＰＤ症状を有しない。
したがって、いくつかの態様において、本開示は、神経障害性ゴーシェ病を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法を提供し、方法は、本開示による記載の組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を対象に投与することを含む。
本開示は、部分的に、アルツハイマー病または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を治療するための対象における１つ以上のＣＮＳ疾患関連遺伝子産物の発現のための組成物に基づく。いくつかの実施形態において、対象は、アルツハイマー病を有さない。いくつかの実施形態において、対象は、ＦＴＤを有し、アルツハイマー病を有さない。いくつかの実施形態において、対象は、ＧＲＮ（プログラニュリン）変異を有して、ＦＴＤを有する。いくつかの実施形態において、対象は、ＧＲＮ変異を有して、ＦＴＤを有し、対象は、ＧＲＮ変異についてヘテロ接合性である（例えば、病原性ＧＲＮ変異）。いくつかの実施形態において、ＧＲＮ変異は、ヌル（ｎｕｌｌ）変異（例えば、ナンセンス、フレームシフト、またはスプライス部位変異、または完全または部分的（エクソン的）遺伝子欠失）である。いくつかの実施形態において、ＧＲＮ変異は、実証された機能的に有害な効果を有する病原性変異である。いくつかの実施形態において、ＧＲＮ変異は、ミスセンス病原性変異である。いくつかの実施形態において、ＧＲＮ変異は、Ｍｏｌｇｅｎ ＦＴＤデータベース（ｍｏｌｇｅｎ．ｕａ．ａｃ．ｂｅ）に記載される。いくつかの実施形態において、ＧＲＮ変異は、対象において低い血漿ＰＧＲＮレベル（７０ｎｇ／ｍＬ未満）を産生する。
いくつかの実施形態において、対象は、ＦＴＤ、ＧＲＮ変異を伴うＦＴＤ、タウ変異を伴うＦＴＤ、Ｃ９Ｏｒｆ７２変異を伴うＦＴＤ、神経セロイドリポフスチン症、パーキンソン病、アルツハイマー病、大脳皮質基底核変性症、運動ニューロン病、またはゴーシェ病を有する。
いくつかの実施形態において、対象は、症候性ＦＴＤ（例えば、行動変異型ＦＴＤ（ｂｖＦＴＤ）、原発性進行性失語症（ＰＰＡ）－ＦＴＤ、皮質基底核症候群を伴うＦＴＤ、または症候群の組み合わせ）を有する。
したがって、いくつかの態様において、本開示は、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤを有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法を提供し、方法は、本開示による記載の組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、アルツハイマー病またはＦＴＤ（例えば、ＧＲＮ変異を伴うＦＴＤ）を有する対象は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）またはその一部分をコードするｒＡＡＶを投与される。いくつかの実施形態において、アルツハイマー病またはＦＴＤ（例えば、ＧＲＮ変異を伴うＦＴＤ）を有する対象は、ＰＧＲＮまたはその一部分をコードするｒＡＡＶを投与され、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＰＧＲＮタンパク質は、配列番号６７のアミノ酸配列またはその一部分を含む。いくつかの実施形態において、ＰＧＲＮをコードするｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ＦＴＤ（例えば、ＧＲＮ変異を伴うＦＴＤ）を治療するためのＰＧＲＮをコードするｒＡＡＶを含む組成物は、対象に、約１×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）～約１×１０１５ｖｇ、または約１×１０１３ｖｇ～約７×１０１４ｖｇ、または約１×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇ、または約２×１０１３ｖｇ～約２×１０１４ｖｇ、または約３×１０１３ｖｇ～約２×１０１４ｖｇ、または約３．５×１０１３ｖｇ～約１．４×１０１４ｖｇの範囲の用量で投与される。いくつかの実施形態において、ＦＴＤ（例えば、ＧＲＮ変異を伴うＦＴＤ）を治療するためのＰＧＲＮをコードするｒＡＡＶを含む組成物は、対象に、約２×１０１３ｖｇ、約３×１０１３ｖｇ、約４×１０１３ｖｇ、約５×１０１３ｖｇ、約６×１０１３ｖｇ、約７×１０１３ｖｇ、約８×１０１３ｖｇ、約９×１０１３ｖｇ、約１×１０１４ｖｇ、または約２×１０１４ｖｇの用量で投与される。
いくつかの態様において、本開示は、ＦＴＤ（例えば、ＧＲＮ変異を伴うＦＴＤ）を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法を提供し、方法は、対象に、ＰＧＲＮをコードするｒＡＡＶを含む組成物を投与することを含み、組成物は、約３．５×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）、約７．０×１０１３ｖｇ、または約１．４×１０１４ｖｇの用量で投与される。
いくつかの態様において、本開示は、ＦＴＤ（例えば、ＧＲＮ変異を伴うＦＴＤ）を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法を提供し、方法は、対象に、ＰＧＲＮをコードするｒＡＡＶを含む組成物を投与することを含み、組成物は、約１×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）、約２．０×１０１４ｖｇ、または約４．０×１０１４ｖｇの用量で投与される。
いくつかの実施形態において、単回用量として対象にＦＴＤ（例えば、ＧＲＮ変異を伴うＦＴＤ）を治療するためのＰＧＲＮをコードするｒＡＡＶを含む組成物であって、組成物は、その後対象に投与されない。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶを含む組成物は、大槽への単一の後頭下注射を介して送達される。いくつかの実施形態において、大槽への注射は、放射線誘導下で行われる。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＧＲＮ変異を有して、ＦＴＤを有するか、または有する疑いのある対象の症状を治療するための方法を提供し、方法は、機能的なプログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質についての配列をコードするｒＡＡＶを含む組成物を対象に投与することを含み、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＧＲＮ変異を伴うＦＴＤの症状は、人格変化、実行機能の障害、脱抑制、無気力、発話の遅さ、文法の誤用、多様な失認、語義失語、または単語理解の障害であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＧＲＮをコードするｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＧＲＮ変異を有して、ＦＴＤを有するか、または有する疑いのある対象の脳におけるリポフスチンの蓄積を減少させるための方法を提供し、方法は、対象に、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを含む組成物を投与することを含み、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、本開示は、ＧＲＮ変異を有して、ＦＴＤを有するか、または有する疑いのある対象の脳におけるユビキチンの蓄積を減少させるための方法を提供し、方法は、対象に、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを含む組成物を投与することを含み、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、本開示は、ＧＲＮ変異を有して、ＦＴＤを有するか、または有する疑いのある対象の脳におけるＴＮＦα及び／またはＣＤ６８の遺伝子発現及び／またはタンパク質発現を減少させるための方法を提供し、方法は、対象に、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを含む組成物を投与することを含み、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、本開示は、ＧＲＮ変異を有して、ＦＴＤを有するか、または有する疑いのある対象の脳におけるカテプシンＤの成熟を増加させるための方法を提供し、方法は、対象に、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを含む組成物を投与することを含み、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、本開示は、ＧＲＮ変異を有して、ＦＴＤを有するか、または有する疑いのある対象の脳における核ＴＤＰ－４３（トランス活性応答ＤＮＡ結合タンパク質４３ｋＤａ）タンパク質のレベルを増加させるための方法を提供し、方法は、対象に、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを含む組成物を投与することを含み、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、本開示は、ＧＲＮ変異を有して、ＦＴＤを有するか、または有する疑いのある対象の血液またはＣＳＦにおける神経フィラメント軽鎖（ＮＦＬ）のレベルを減少させるための方法を提供し、方法は、対象に、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを含む組成物を投与することを含み、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＰＧＲＮをコードするｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。
対象は、典型的には、哺乳動物、好ましくはヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、１か月齢～１０歳齢（例えば、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、２２か月、２３か月、２４か月、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、またはこれらの間の任意の齢）である。いくつかの実施形態において、対象は、２歳～２０歳である。いくつかの実施形態において、対象は、３０歳～１００歳である。実施形態によっては、対象は、年齢５５歳より高齢である。
いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、対象の脳、及び／または脊髄への直接注射によって、対象のＣＮＳに直接投与される。ＣＮＳ直接投与様式の例としては、脳内注射、脳室内注射、大槽内注射、実質内注射、くも膜下腔内注射、及び前述の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、組成物は、大槽内（ＩＣＭ）注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象のＣＮＳへの直接注射は、対象の中脳、線条体、及び／または大脳皮質における導入遺伝子発現（例えば、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、及び該当する場合、第３の遺伝子産物の発現）をもたらす。いくつかの実施形態において、ＣＮＳへの直接注射は、対象の脊髄、及び／またはＣＳＦにおける導入遺伝子発現（例えば、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、及び該当する場合、第３の遺伝子産物の発現）をもたらす。
いくつかの実施形態において、対象のＣＮＳへの直接注射は、対流増強送達（ＣＥＤ）を含む。対流増強送達は、脳の外科的露出及び脳の標的領域への小径カテーテルの直接的な配置、続いて治療薬（例えば、本明細書に記載の組成物またはｒＡＡＶ）の対象の脳への直接的な注入を含む治療戦略である。ＣＥＤは、例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ．９（１０）：１５１９－２７によって記載されている。
いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、末梢注射によって、対象に末梢投与される。末梢注射の例としては、皮下注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、または前述の任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、末梢注射は、動脈内注射、例えば対象の頸動脈への注射である。
いくつかの実施形態において、本開示による記載の組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）は、対象のＣＮＳに末梢及び直接の両方で投与される。例えば、いくつかの実施形態において、対象は、動脈内注射（例えば、頸動脈への注射）及び実質内注射（例えば、ＣＥＤによる実質内注射）によって組成物を投与される。いくつかの実施形態において、ＣＮＳへの直接注射及び末梢注射は、同時に行われる（例えば、同時に行われる）。いくつかの実施形態において、直接注射は、末梢注射の前（例えば、１分～１週間、またはそれ以上前）に行われる。いくつかの実施形態において、直接注射は、末梢注射の後（例えば、１分～１週間、またはそれ以上後）に行われる。
いくつかの実施形態において、対象は、本明細書に記載の組成物の前（例えば、１か月～１分前）または同時に免疫抑制剤を投与される。いくつかの実施形態において、免疫抑制剤は、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、ブデソニドなど）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス、エベロリムスなど）、抗体（例えば、アダリムマブ、エタネルセプト、ナタリズマブなど）、またはメトトレキサートである。
対象に投与される本開示による記載の組成物（例えば、単離核酸またはベクタ
ーまたはｒＡＡＶを含む組成物）の量は、投与方法に応じて変化するであろう。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶは、約１０９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ～約１０１４ＧＣ／ｋｇ（例えば、約１０９ＧＣ／ｋｇ、約１０１０ＧＣ／ｋｇ、約１０１１ＧＣ／ｋｇ、約１０１２ＧＣ／ｋｇ、約１０１２ＧＣ／ｋｇ、または約１０１４ＧＣ／ｋｇ）の力価で対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象は、ＣＳＦ空間への注射によって、または実質内注射によって、高い力価（例えば、１０１２ゲノムコピーＧＣ／ｋｇ超のｒＡＡＶ）を投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶは、静脈内注射によって約１×１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）～約１×１０１７ｖｇの範囲の用量で対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶは、大槽への注射によって、約１×１０１０ｖｇ～約１×１０１６ｖｇの範囲の用量で対象に投与される。
本開示による記載の組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）は、対象に、１回または複数回（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、２０回、またはそれ以上）投与され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、注入ポンプを介して、対象に連続的に（例えば、慢性的に）投与される。
実施例１：ｒＡＡＶベクター
ＨＥＫ２９３細胞などの細胞を使用して、トリプルプラスミドトランスフェクションのためのＡＡＶベクターを生成する。ＩＴＲ配列は、各目的の導入遺伝子についてのプロモーター／エンハンサー要素、３’ポリＡシグナル、及びＷＰＲＥ要素などの翻訳後シグナルを含む発現構築物に隣接している。ＧＢＡ１及びＬＩＭＰ２、及び／またはプロサポシンなどの複数の遺伝子産物が、タンパク質配列の融合によって、またはペプチド結合の生成の防止によりアミノ酸が付加された２つのペプチド断片を導くＴ２ＡもしくはＰ２Ａなどの２Ａペプチドリンカーを使用して、またはＩＲＥＳ要素を使用して、または２つの別々の発現カセットをでの発現によって、同時に発現され得る。発現された遺伝子の上流で効率的にスプライシングされる短いイントロン配列の存在は、発現レベルを改善し得る。ｓｈＲＮＡ及び他の調節ＲＮＡは、潜在的にこれらの配列内に含まれ得る。本開示による記載の発現構築物の例は、図１～８、２１～３５、３９、４１～５１、及び６４、ならびに下記の表２に示される。
Figure 2022526823000005
Figure 2022526823000006
Figure 2022526823000007
実施例２：ＧＢへのウイルス形質導入の細胞ベースアッセイ
ＧＢＡ１が欠損した細胞は、例えば、ＧＤ患者、単球もしくはｈＥＳ細胞由来の線維芽細胞、または患者由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）として得られる。これらの細胞は、グルコシルセラミド及びグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＣｅｒ及びＧｌｃＳｐｈ）などの基質を蓄積する。野生型または変異体培養細胞株でのＣＢＥなどのＧｃａｓｅ阻害剤での処置もまた、ＧＢＡ欠損細胞を得るために使用される。
そのような細胞モデルを使用して、リソソーム欠損は、このタンパク質またはホスホαＳｙｎについての抗体、続いて蛍光顕微鏡法を使用した画像化でα－シヌクレインなどのタンパク質凝集体の蓄積の観点で定量化される。ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＬＩＭＰ１、ＬＩＭＰ２などのタンパク質マーカーについてのＩＣＣによる、またはライソトラッカーなどの染料を使用した、または蛍光デキストランもしくは他のマーカーのエンドサイトーシス区画を介した取り込みによる、リソソーム異常についての画像化も実施される。ＬＣ３についてなどのリソソームとの欠陥のある融合による自食作用マーカー蓄積についての画像化も実施され得る。ウェスタンブロッティング及び／またはＥＬＩＳＡを使用して、これらのマーカーの異常蓄積を定量する。また、ＧＢＡ１の糖脂質基質及び生成物の蓄積を標準的な手法を用いて測定する。
治療的エンドポイント（例えば、ＰＤ関連病理の減少）を、ＡＡＶベクターの形質導入の発現という観点で測定し、活性及び機能を確認し、定量化する。Ｇｃａｓｅはまた、タンパク質ＥＬＩＳＡ測定を使用して、または標準的なＧｃａｓｅ活性アッセイによって定量化され得る。
実施例３：変異体マウスを用いたインビボアッセイ
本実施例は、変異体マウスを使用したＡＡＶベクターのインビボアッセイを記載する。変異体マウスにおける上述のＡＡＶベクターのインビボ試験は、例えば、Ｌｉｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（７）：４２４２－４２５３、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４６：２１０２－２１１３、及びＦａｒｆｅｌ－Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｄｉｓ．Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ．４（６）：７４６－７５２によって記載されるアッセイを使用して実施される。
ビヒクル対照及びＡＡＶベクターのくも膜下腔内または脳室内送達（例えば、２×１０１１ｖｇ／マウスの用量）は、濃縮ＡＡＶストックを使用して、例えば、５～１０μＬの注射体積で実行される。対流増強送達による実質内送達を実施する。
処置は、症状の発症の前、または発症の後のいずれかで開始される。測定されるエンドポイントは、ＣＮＳ及びＣＳＦにおける基質の蓄積、ＥＬＩＳＡによるＧｃａｓｅ酵素の蓄積及び酵素活性の蓄積、運動及び認知エンドポイント、リソソーム機能障害、ならびにα－シヌクレインモノマー、プロトフィブリルまたは原線維の蓄積である。
実施例４：疾患の化学モデル
本実施例は、ゴーシェ病の化学的誘導マウスモデル（例えば、ＣＢＥマウスモデル）を使用したＡＡＶベクターのインビボアッセイを記載する。これらのＡＡＶベクターのインビボ試験は、例えば、Ｖａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２３９（４）：４９６－５０９によって記載されているように、ゴーシェ病の化学的誘導マウスモデルにおいて実施される。
ビヒクル対照及びＡＡＶベクターのくも膜下腔内または脳室内送達（例えば、２×１０１１ｖｇ／マウスの用量で）は、濃縮されたＡＡＶストックを使用して、例えば、５～１０μＬの注射体積で実施される。対流増強送達による実質内送達を実施する。末梢送達を尾静脈注射によって達成する。
処置は、症状の発症の前、または発症の後のいずれかで開始される。測定されるエンドポイントは、ＣＮＳ及びＣＳＦにおける基質の蓄積、ＥＬＩＳＡによるＧｃａｓｅ酵素の蓄積及び酵素活性の蓄積、運動及び認知エンドポイント、リソソーム機能障害、ならびにα－シヌクレインモノマー、プロトフィブリルまたは原線維の蓄積である。
実施例５：ＰＤ、ＬＢＤ、ゴーシェ病患者における臨床試験
いくつかの実施形態において、ある特定の形態のゴーシェ病（例えば、ＧＤ１）を有する患者は、パーキンソン病（ＰＤ）またはレビー小体型認知症（ＬＢＤ）を発症するリスクが増加する。本実施例は、ゴーシェ病、ＰＤ及び／またはＬＢＤを有する患者における、本開示による記載のｒＡＡＶの安全性及び有効性を評価するための臨床試験を記載する。
ゴーシェ病、ＰＤ及び／またはＬＢＤの治療のためのそのようなベクターの臨床試験は、Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１２２（１）：３３－３９に記載されているものと同様の試験設計を使用して実施される。
実施例６：末梢疾患の治療
いくつかの実施形態において、ある特定の形態のゴーシェ病を有する患者は、例えば、Ｂｉｅｇｓｔｒａａｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒａｉｎ １３３（１０）：２９０９－２９１９に記載されているように、末梢神経障害の症状を呈する。
本実施例は、ゴーシェ病（例えば、１型ゴーシェ病）に関連する末梢神経障害の治療のための本明細書に記載のＡＡＶベクターのインビボアッセイを記載する。簡潔に述べると、末梢神経障害の徴候または症状を有すると特定された１型ゴーシェ病患者は、本開示による記載のｒＡＡＶを投与される。いくつかの実施形態において、対象の末梢神経障害の徴候及び症状は、ｒＡＡＶの投与後に、例えば、Ｂｉｅｇｓｔｒａａｔｅｎ ｅｔ ａｌ．に記載の方法を使用して監視される。
患者の患者において存在する（例えば、患者の血清における、末梢組織（例えば、肝臓組織、脾臓組織など）における）本開示による記載の形質導入遺伝子産物のレベルを、例えば、ウエスタンブロット分析、酵素機能アッセイ、または画像化研究によってアッセイする。
実施例７：ＣＮＳ形態の治療
本実施例は、ゴーシェ病のＣＮＳ形態の治療のための本明細書に記載のｒＡＡＶのインビボアッセイを記載する。簡潔に述べると、ＣＮＳ形態のゴーシェ病（例えば、２型または３型ゴーシェ病）を有すると特定されたゴーシェ病患者は、本開示による記載のｒＡＡＶを投与される。患者のＣＮＳにおいて（例えば、患者のＣＮＳの血清において、患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）において、または患者のＣＮＳ組織において）存在する本開示による記載の形質導入遺伝子産物のレベルを、例えば、ウエスタンブロット分析、酵素機能アッセイ、または画像化研究によってアッセイする。
実施例８：ＧＢＡ１において変異を有する対象におけるパーキンソン病の遺伝子療法
本実施例は、ＧＢＡ１遺伝子における変異によって特徴付けられるパーキンソン病を有する対象への、ＧＢＡ１をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の投与を記載する。
ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクター挿入物は、ヒトＧＢＡ１（栗色）のコドン最適化コード配列（ＣＤＳ）を構成的に発現するために、４つの部分、すなわちＣＭＶエンハンサー（ＣＭＶｅ）、ＣＢＡプロモーター（ＣＢＡｐ）、エクソン１、及びイントロン（ｉｎｔ）からなるＣＢＡプロモーター要素（ＣＢＡ）を含む。３’領域はまた、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）転写後調節要素、それに続くウシ成長ホルモンポリＡシグナル（ｂＧＨポリＡ）尾部を含む。隣接ＩＴＲは、介在配列の正しいパッケージングを可能にする。５’ＩＴＲ配列の２つの変異型（図７、挿入ボックス、下部配列）を評価し、これらの変異型は、ＩＴＲの２０ヌクレオチド「Ｄ」領域内にいくつかのヌクレオチドの差異を有し、これはパッケージング及び発現の効率に影響を与えると考えられる。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクター生成物は、図７（挿入ボックス、上部配列）に示される「Ｄ」ドメインヌクレオチド配列を含む。変異型ベクターは、前臨床研究において同様に実施される変異体「Ｄ」ドメイン（本明細書では「Ｓ」ドメインと呼ばれ、ヌクレオチド変化が陰影によって示される）を有する。骨格は、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子、及び逆パッケージングを防止するためのスタッファー配列を含む。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクターを示す概略図を図８に示す。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクターは、ＡＡＶ９血清型キャプシドタンパク質を使用してｒＡＡＶにパッケージ化される。
ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１は、大槽（大槽内、ＩＣＭ）への蛍光透視誘導後頭下注射を介して単回用量として対象に投与される。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１投与レジメン研究の一実施形態は以下のとおりである。
非臨床薬理学及び毒物学試験の結果に基づいて決定される２つの用量レベル（３ｅ１３ｖｇ（低用量）、１ｅ１４ｖｇ（高用量）など）のうちの１つで患者（Ｎ＝１２）に投与されるｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の単回用量。
初期試験は、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクター及びｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ Ｓ－変異型構築物（以下にさらに記載する）の有効性及び安全性を評価するために、コンズリトール－ｂ－エポキシド（ＣＢＥ）、ＧＣａｓｅの阻害剤の日次送達にて、化学マウスモデルにおいて実施された。さらに、初期試験は、ホモ接合性ＧＢＡ１変異を保有し、サポシンが部分的に欠損している（４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ）遺伝子マウスモデルにおいて行われた。マウス及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における追加の用量範囲試験を実施して、ベクターの安全性及び有効性をさらに評価する。
ＡＡＶ骨格における５’逆位末端反復（ＩＴＲ）の２つのわずかに異なるバージョンを試験して、製造可能性及び導入遺伝子発現を評価した（図７）。１４５ｂｐの５’ＩＴＲ内の２０ｂｐの「Ｄ」ドメインは、最適なウイルスベクター産生に必要であると考えられているが、「Ｄ」ドメイン内の変異が、場合によっては導入遺伝子発現を増加させることも報告されている。したがって、無傷な「Ｄ」ドメインを保有するウイルスベクターｒＡＡＶ－ＧＢＡ１に加えて、変異体Ｄドメイン（本明細書において「Ｓ」ドメインと称される）を有する第２のベクター形態も評価した。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１及び変異型の両方が同じ導入遺伝子を発現する。両方のベクターが、以下に詳述するようにインビボで有効なウイルスを産生したが、野生型「Ｄ」ドメインを含むｒＡＡＶ－ＧＢＡ１をさらなる開発のために選択した。
ＧＣａｓｅ欠損のＣＢＥモデルを確立するために、若齢マウスに、ＣＢＥ、ＧＣａｓｅの特異的阻害剤を投薬した。生後８日目（Ｐ８）で開始して、毎日のＩＰ注射によって、マウスにＣＢＥを与えた。３つの異なるＣＢＥ用量（２５ｍｇ／ｋｇ、３７．５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ）及びＰＢＳを試験し、行動表現型を呈するモデルを確立した（図９）。ＣＢＥの高用量は、用量依存的に致死性をもたらした。５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＥで処置したすべてのマウスは、Ｐ２３までに死亡し、３７．５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥで処置した８頭のマウスのうち５頭は、Ｐ２７までに死亡した。２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥで処置したマウスに致死性はなかった。ＣＢＥ注射のマウスがオープンフィールドアッセイで全般的な運動欠損を示さなかった（ＰＢＳを与えられたマウスと同じ距離を、同じ速度で移動した）のに対し、ＣＢＥ処置のマウスは、ロータロッドアッセイによって測定されるように運動協調性及びバランスの欠損を呈した。
試験終了まで生存したマウスを、最後のＣＢＥ投与の翌日（Ｐ２７、「１日目」）またはＣＢＥ離脱の３日後（Ｐ２９、「３日目」）に屠殺した。２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥを与えたマウスの皮質に対して脂質分析を行い、１日目及び３日目の両方のコホートにおけるＧＣａｓｅ基質の蓄積を評価した。ＧｌｕＳｐｈ及びＧａｌＳｐｈレベル（本実施例において、凝集体で測定した）は、ＧＣａｓｅ不全と一致して、ＰＢＳ処置の対照と比較して、ＣＢＥ処置のマウスにおいて顕著に蓄積された。
上述の試験に基づいて、生存に影響を与えることなく行動欠損を生じさせたため、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ用量を選択した。ＣＢＥ処置中に脳全体にわたる広いＧＢＡ１分布及び導入遺伝子発現を達成するために、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１または賦形剤を、生後３日目（Ｐ３）に脳室内（ＩＣＶ）注射によって送達し、続いてＰ８で毎日のＩＰ ＣＢＥまたはＰＢＳ処置が開始した（図１０）。
ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を受けたＣＢＥ処置のマウスは、賦形剤を受けたマウスよりも、ロータロッド上で統計学的に有意に良好に行動した（図１１）。バリアント処置群のマウスは、試験中に移動した総距離などの他の行動尺度において、賦形剤処置のマウスと差異はなかった（図１１）。
生存中試験の完了時に、生化学分析のために、半数のマウスは、最後のＣＢＥ投与の翌日に（Ｐ３６、「１日目」）、またはＣＢＥ離脱の３日後（Ｐ３８、「３日目」）に屠殺された（図１２）。生物学的三重で実施した蛍光測定酵素アッセイを使用して、皮質におけるＧＣａｓｅ活性を評価した。ＧＣａｓｅ活性は、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１で処置したマウスにおいて増加したが、ＣＢＥ処置はＧＣａｓｅ活性を低下させた。加えて、ＣＢＥ及びｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の両方を受けたマウスは、ＰＢＳ処置群と同様のＧＣａｓｅ活性レベルを有し、これは、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の送達が、ＣＢＥ処置によって誘導されるＧＣａｓｅ活性の阻害を克服することができることを示す。マウスの運動皮質に対して脂質分析を行い、基質ＧｌｕＣｅｒ及びＧｌｕＳｐｈのレベルを調査した。ＣＢＥ及びｒＡＡＶ－ＧＢＡ１処置を与えられたマウスの脳において蓄積した両方の脂質は、基質蓄積を顕著に減少させた。
脂質レベルは、処置群にわたってＧＣａｓｅ活性及びロータロッド上の性能の両方と負の相関があった。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１投与後のＧＣａｓｅ活性の増加は、基質の減少及び運動機能の増強と関連した（図１３）。図１４に示されるように、予備的な生体内分布は、ｑＰＣＲによって測定して、ベクターゲノムの存在によって評価した（１μｇのゲノムＤＮＡあたり１００超のベクターゲノムを陽性として定義した）。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を受けたマウスは、ＣＢＥの有無の両方で、皮質におけるｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクターゲノムについて陽性であり、これは、ＩＣＶ送達が、皮質へのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１送達をもたらすことを示す。さらに、ベクターゲノムは、肝臓で検出され、脾臓ではほとんど検出されず、心臓、腎臓、または生殖腺では検出されなかった。すべての測定値について、１日目群及び３日目群の間に統計学的有意差はなかった。
ＣＢＥモデルにおけるより大規模な試験により、ＣＢＥモデルにおけるｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の有効用量をさらに探索した。２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ用量モデルを用いて、賦形剤またはｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を、Ｐ３でＩＣＶを介して送達し、Ｐ８で毎日のＩＰ ＰＢＳまたはＣＢＥ処置を開始した。以前の試験で観察されたＣＢＥ離脱有無の群間の類似性を考慮して、すべてのマウスを最終ＣＢＥ用量の１日後に屠殺した（Ｐ３８～４０）。３つの異なるｒＡＡＶ－ＧＢＡ１用量の効果を評価し、群あたり１０頭のマウス（５Ｍ／５Ｆ）での以下の５つの群の結果をもたらした。
賦形剤ＩＣＶ＋ＰＢＳ ＩＰ
賦形剤ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ
３．２ｅ９ｖｇ（２．１３ｅ１０ｖｇ／ｇ脳）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ
１．０ｅ１０ｖｇ（６．６７ｅ１０ｖｇ／ｇ脳）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ
３．２ｅ１０ｖｇ（２．１３ｅ１１ｖｇ／ｇ脳）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ。
ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の最高用量は、Ｐ３７でのＣＢＥ処置に関連した体重増加の失敗を救出した。さらに、この用量は、賦形剤＋ＣＢＥ処置群と比較して、ロータロッド及びテーパービームの性能において統計学的に有意な増加をもたらした（図１５）。致死性が、賦形剤処置群及びｒＡＡＶ－ＧＢＡ１処置群の両方を含むいくつかの群において観察された（賦形剤＋ＰＢＳ：０、賦形剤＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ：１、３．２ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ：４、１．０ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ：０、３．２ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ：３）。
生存中試験の完了時に、生化学分析のためにマウスを屠殺した（図１６）。皮質におけるＧＣａｓｅ活性を、蛍光測定アッセイによって、生物学的三重で評価した。ＣＢＥ処置のマウスは、ＧＣａｓｅ活性の低下を示したが、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１高用量を受けたマウスは、ＣＢＥ処置と比較して、ＧＣａｓｅ活性の統計学的に有意な増加を示した。ＣＢＥ処置のマウスはまた、ＧｌｕＣｅｒ及びＧｌｕＳｐｈの蓄積を有し、これらの両方は、高用量のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を投与することによって救出された。
確立された化学ＣＢＥモデルに加えて、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１は、Ｇｂａ１のＶ３９４Ｌ ＧＤ変異に対してホモ接合性であり、また、ＧＣａｓｅの局在化及び活性に影響を及ぼすサポシンも部分的に欠損している４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝モデルにおいても評価された。これらのマウスは、ビームウォーク、ロータロッド、及びワイヤハングアッセイにおけるそれらの性能によって証明されるように、運動強度、協調性、及びバランスの欠損を呈する。典型的には、これらのマウスの寿命は２２週未満である。初期試験において、３μｌの最大力価ウイルスを、Ｐ２３で、２．４ｅ１０ｖｇ（６．０ｅ１０ｖｇ／ｇ脳）の最終用量で、ＩＣＶにより送達した。群あたり６頭のマウスを用いて、処置群は以下であった。
ＷＴ＋賦形剤ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋賦形剤ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋２．４ｅ１０ｖｇ（６．０ｅ１０ｖｇ／ｇ脳）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ
ビームウォーク試験による運動性能を、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の送達の４週間後に評価した。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を受けた変異体マウス群は、賦形剤で処置した変異体マウスと比較して、全スリップが少なく、速度あたりスリップが少ない傾向を示し、運動機能をＷＴレベル近くまで回復させた（図１７）。運動表現型は、これらのマウスの加齢に伴ってより重度になるため、この行動試験及び他の行動試験におけるそれらの性能は、後の時点で評価される。生存中研試験の完了時に、脂質レベル、ＧＣａｓｅ活性、及び生体内分布を、これらのマウスにおいて評価した。
追加の低用量のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１が、現在、ＣＢＥモデルを使用して試験中であり、提案された第１相高臨床用量の０．０３倍、０．１倍、及び１倍に対応する。各群は、群あたり１０頭のマウス（５Ｍ／５Ｆ）を含む。
賦形剤ＩＣＶ
賦形剤ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ
３．２ｅ８ｖｇ（２．１３ｅ９ｖｇ／ｇ脳）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ
１．０ｅ９ｖｇ（６．６７ｅ９ｖｇ／ｇ脳）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ
１．０ｅ１０ｖｇ（６．６７ｅ１０ｖｇ／ｇ脳）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ。
運動表現型に加えて、皮質における脂質レベル及びＧＣａｓｅ活性を評価する。処置及び分析の時間経過も実施される。
有効性及び安全性データを評価するために、より大きな用量範囲の試験が開始された。１０頭の４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウス（群あたり５頭雄／５頭雌）に１０μｌのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を注射した。アロメトリック脳重量計算を使用して、用量は、提案された第１相高臨床用量の０．１５倍、１．５倍、４．４倍、及び１４．５倍と相関する。注射群は以下からなる。
ＷＴ＋賦形剤ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋賦形剤ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋４．３ｅ９ｖｇ（１．１ｅ１０ｖｇ／ｇ脳）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋４．３ｅ１０ｖｇ（１．１ｅ１１ｖｇ／ｇ脳）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋１．３ｅ１１ｖｇ（３．２ｅ１１ｖｇ／ｇ脳）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋４．３ｅ１１ｖｇ（１．１ｅ１２ｖｇ／ｇ脳）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ。
実施例９：ｒＡＡＶベクターのインビトロ分析
ｒＡＡＶ構築物をインビトロ及びインビボで試験した。図１８は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするｒＡＡＶ構築物のインビトロ発現についての代表的なデータを示す。左パネルは、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）ＥＬＩＳＡアッセイの標準曲線を示す。下段パネルは、ｒＡＡＶで形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解物におけるＥＬＩＳＡアッセイによって測定したＰＧＲＮ発現の用量応答を示す。ＭＯＩ＝感染の多重度（細胞あたりのベクターゲノム）。
単独でまたはＧＢＡ１及び／または１つ以上の阻害性ＲＮＡと組み合わせて、プロサポシン（ＰＳＡＰ）及びＳＣＡＲＢ２をコードするｒＡＡＶベクターのインビトロ活性を評価するためにパイロット試験を行った。ＰＳＡＰ及びプログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードする１つの構築物も試験した。試験したベクターは、表３に示されるものを含むる。「Ｏｐｔ」は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）における発現のためにコドン最適化された核酸配列を指す。図１９は、構築物の各々でのＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、モックトランスフェクション細胞と比較して対応する遺伝子産物の過剰発現をもたらしたことを示す代表的なデータを示す。
単独で、または１つ以上の阻害性ＲＮＡと組み合わせて、ＴＲＥＭ２をコードするｒＡＡＶベクターのインビトロ活性を評価するために、パイロット試験を行った。試験したベクターは、表３に示されるものを含むる。「Ｏｐｔ」は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）における発現のためにコドン最適化された核酸配列を指す。図３６Ａ～３６Ｂは、構築物の各々でのＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、モックトランスフェクション細胞と比較して対応する遺伝子産物の過剰発現をもたらしたことを示す代表的なデータを示す。
表３
Figure 2022526823000008
実施例１０：ＳＮＣＡ及びＴＭＥＭ１０６Ｂ ｓｈＲＮＡ構築物の試験
ＨＥＫ２９３細胞
この試験において、ヒト胚性腎臓２９３細胞株（ＨＥＫ２９３）が使用された（＃８５１２０６０２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＨＥＫ２９３細胞を、１００単位／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（＃１５１４０１２２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む培養培地（１０％のウシ胎仔血清［ＦＢＳ］［＃１００８２１４７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を補充したＤ－ＭＥＭ［＃１１９９５０６５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］）中で維持した。
プラスミドトランスフェクション
プラスミドトランスフェクションを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（＃１１６６８０１９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造業者の指示に従って実施した。簡単に述べると、ＨＥＫ２９３細胞（＃１２０２２００１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、抗生物質を含まない培地中で３×１０５細胞／ｍｌの密度で播種した。翌日、プラスミド及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬をＯｐｔｉ－ＭＥＭ溶液（番号３１９８５０６２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で混ぜ合わせた。５分後、混合物をＨＥＫ２９３培養物に添加した。７２時間後、ＲＮＡまたはタンパク質抽出のために細胞を採取したか、または画像化分析に供した。画像化分析のために、プレートを、細胞の播種前に、０．０１％のポリ－Ｌ－リジン溶液（Ｐ８９２０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で予めコーティングした。
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）による遺伝子発現解析
相対遺伝子発現レベルを、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴ Ｋｉｔ（＃４４０２９５５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造業者の指示に従って、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって決定した。候補プラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ溶液中の０．５μｇのプラスミド及び１．５μｌの試薬）を使用して、４８ウェルプレート上に播種したＨＥＫ２９３細胞（７．５×１０４細胞／ウェル）に一過性にトランスフェクションした。製造業者の指示に従って、７２時間後、ＲＮＡを細胞から抽出し、逆転写のために使用してｃＤＮＡを合成した。定量的ＰＣＲ分析について、２～５μＬのｃＤＮＡ生成物を、遺伝子特異的プライマー対（２５０ｎＭの最終濃度）を使用して、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（＃４３６７６５９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で二重に増幅した。ＳＮＣＡ、ＴＭＥＭ１０６Ｂ、及びＧＡＰＤＨ遺伝子についてのプライマー配列は以下のとおりである。ＳＮＣＡについては５’－ＡＡＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＴＣＴ ＡＴＧ ＴＡＧ ＧＣ－３’（配列番号７１）、５’－ＧＣＴ ＣＣＴ ＣＣＡ ＡＣＡ ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＣＴ Ｔ－３’（配列番号７２）、ＴＭＥＭ１０６Ｂについては５’－ＡＣＡ ＣＡＧ ＴＡＣ ＣＴＡ ＣＣＧ ＴＴＡ ＴＡＧ ＣＡ－３’（配列番号７３）、５’－ＴＧＴ ＴＧＴ ＣＡＣ ＡＧＴ ＡＡＣ ＴＴＧ ＣＡＴ ＣＡ－３’（配列番号７４）、及びＧＡＰＤＨについては５’－ＣＴＧ ＧＧＣ ＴＡＣ ＡＣＴ ＧＡＧ ＣＡＣ Ｃ－３’（配列番号７５）、５’－ＡＡＧ ＴＧＧ ＴＣＧ ＴＴＧ ＡＧＧ ＧＣＡ ＡＴＧ－３’（配列番号７６）。定量的ＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において実行された。発現レベルをハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨによって正規化し、比較ＣＴ法を用いて計算した。
蛍光画像化分析
ＥＧＦＰコード領域の下流にヒトＳＮＣＡ遺伝子の３’ＵＴＲを含むＥＧＦＰレポータープラスミドを、ＳＮＣＡ及びＴＭＥＭ１０６Ｂノックダウンプラスミドの検証のために使用した。ＥＧＦＰレポータープラスミド及び候補ノックダウンプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（１０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ溶液中の０．０４μｇのレポータープラスミド、０．０６μｇのノックダウンプラスミド、及び０．３μｌの試薬）を使用して、ポリ－Ｌ－リジンコーティング９６ウェルプレート上に播種したＨＥＫ２９３細胞（３．０ｘ１０４細胞／ウェル）に同時にトランスフェクションした。７２時間後、ＥＧＦＰシグナルの蛍光強度を、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸマルチモードリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、励起４８８ｎｍ／発光５１２ｎｍで測定した。細胞を４％ＰＦＡで室温にて１０分間固定し、４０μｇ／ｍＬの７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）を含むＤ－ＰＢＳで室温で３０分間インキュベーションした。Ｄ－ＰＢＳで洗浄した後、７－ＡＡＤシグナルの蛍光強度を、Ｖａｒｉｏｓｋａｎリーダーを使用して励起５４６ｎｍ／発光６４７ｎｍで測定し、細胞数を定量した。７－ＡＡＤシグナルレベルあたりの正規化されたＥＧＦＰシグナルを、対照ノックダウン試料と比較した。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＳＮＣＡコード領域の下流にヒトＳＮＣＡ遺伝子またはＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子の３’－ＵＴＲを含むα－シヌクレインレポータープラスミドを、タンパク質レベルでのノックダウンプラスミドの検証のために使用した。ＨＥＫ２９３細胞から抽出した溶解物を使用して、α－シヌクレインタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡ（＃ＫＨＢ００６１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定した。候補プラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（２５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ溶液中の０．１μｇのレポータープラスミド、０．１５μｇのノックダウンプラスミド、及び０．７５μｌの試薬）を使用して、４８ウェルプレート上に播種したＨＥＫ２９３細胞（７．５×１０４細胞／ウェル）に一過性にトランスフェクションした。７２時間後、細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（＃Ｐ８３４０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（＃８９９００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で溶解し、数秒間超音波処置した。氷上で３０分間インキュベーションした後、溶解物を２０，０００×ｇで、４℃で１５分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質レベルを定量化した。プレートを４５０ｎｍのＶａｒｉｏｓｋａｎプレートリーダーで読み取り、濃度をＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ５ソフトウェアを使用して計算した。測定されたタンパク質濃度を、ビシンコニン酸アッセイ（＃２３２２５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で決定された総タンパク質濃度に対して正規化した。
図３７及び表４は、ＧＦＰレポーターアッセイ（上段）及びα－Ｓｙｎアッセイ（下段）によるインビトロでのＳＮＣＡの成功裏のサイレンシングを示す代表的なデータを示す。図３８及び表５は、ＧＦＰレポーターアッセイ（上段）及びα－Ｓｙｎアッセイ（下段）によるインビトロでのＴＭＥＭ１０６Ｂの成功裏のサイレンシングを示す代表的なデータを示す。
表４
Figure 2022526823000009
 表５
Figure 2022526823000010
実施例１１：ＩＴＲ「Ｄ」配列の配置及び細胞形質導入
ｒＡＡＶベクターの細胞形質導入に対するＩＴＲ「Ｄ」配列の配置の効果を調査した。図２０に示すように、ＨＥＫ２９３細胞を、１）野生型ＩＴＲ（例えば、導入遺伝子挿入物の近位にあり、ＩＴＲの末端の遠位にある「Ｄ」配列）または２）ベクターの「外側」に位置する「Ｄ」配列を有するＩＴＲ（例えば、ＩＴＲの末端に近位であり、導入遺伝子挿入物の遠位にある「Ｄ」配列）を有するＧｃａｓｅコード化ｒＡＡＶで形質導入した。驚くべきことに、データは、「外側」位置に位置する「Ｄ」配列を有するｒＡＡＶが、パッケージ化され、細胞を効率的に形質導入する能力を保持することを示す（図４０）。
実施例１２：プログラニュリンｒＡＡＶのインビトロ試験
図３９は、ＰＧＲＮをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を示す概略図である。プログラニュリンは、大槽などへの実質内または髄腔内注射のいずれかによるＰＧＲＮ（例えば、コドン最適化されたＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶベクターの注射によって、ＧＲＮ欠失についてヘテロ接合またはホモ接合のいずれかであるＧＲＮが欠損しているげっ歯類のＣＮＳにおいて過剰発現される。
２か月齢または６か月齢でマウスに注射し、６か月齢または１２か月齢まで年をとらせ、以下のうちの１つ以上について分析する。ＲＮＡ及びタンパク質レベルでのＧＲＮの発現レベル、行動アッセイ（例えば、改善された移動）、生存アッセイ（例えば、改善された生存）、小膠細胞及び炎症マーカー、神経膠症、ニューロンの喪失、リポフスチン症、ならびに／またはＬＡＭＰ１などのリソソームマーカー蓄積救済。ＰＧＲＮ欠損マウスに対するアッセイは、例えば、Ａｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｂｒａｉｎ １４０：１４７７－１４６５、Ａｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３８（９）：２３４１－２３５８、及びＡｍａｄｏ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／３０８６９によって記載されており、それらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１３：プログラニュリンｒＡＡＶのインビトロ及びインビボ試験
プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするｒＡＡＶ構築物（ＰＲ００６（ＰＲ００６Ａとも称される）、図６４を参照）の効果を分析するために、インビトロアッセイ及びインビボアッセイを行った。ＰＲ００６は、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドを含む。
インビトロ非臨床試験
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＲ００６Ａに由来するプログラニュリン発現
細胞の環境でＰＲ００６Ａのプログラニュリンタンパク質産生を誘導する能力を調査した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２．１×１０５～３．３×１０６ベクターゲノム（ｖｇ）／細胞の範囲の感染の多重度（ＭＯＩ）の範囲にわたってＰＲ００６Ａで形質導入した。ＰＲ００６Ａ形質導入は、プログラニュリンタンパク質の発現及び細胞培地への分泌において堅牢で用量依存的な増加をもたらした（図６０）。賦形剤（意図する臨床ビヒクル）のみで処置した陰性対照群において、内因性ヒトＧＲＮ遺伝子由来の発現を反映する実質的に低いプログラニュリンタンパク質レベルを検出した。
ＦＴＤ－ＧＲＮ ｉＰＳＣ由来ニューロンにおける有効性
アッセイを実施して、ヒトＦＴＤ－ＧＲＮ（ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症）ニューロン培養におけるインビトロでのｒＡＡＶ構築物の有効性を分析した。細胞株は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ（ＮＩＮＤＳ）Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄａｔａ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＮＨＣＤＲ）から入手した。材料ＮＤ５００１５（ＦＴＤ－ＧＲＮ、Ｍ１Ｌ）、ＮＤ５００６０（ＦＴＤ－ＧＲＮ、Ｒ４９３Ｘ）及びＮＤ３８５５５（対照、野生型）（表６を参照）。
表６：ｉＰＳＣ細胞株の特徴の要約
Figure 2022526823000011
ＦＴＤ－ＧＲＮに病理学的に関連する細胞モデルを確立するために、各株由来のｉＰＳＣを、２ステッププロトコルを使用して神経細胞に分化させた。第１のステップにおいて、ｉＰＳＣを、免疫蛍光標識によって検出されるように、多能性マーカー（すなわち、ＯＣＴ４及びＳＳＥＡ１）の発現を欠き、神経幹細胞マーカー（すなわち、ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、ＳＯＸ１、及びＰＡＸ６）の発現を獲得した増殖ニューロン幹細胞（ＮＳＣ）株に分化させた。
対照及びＦＴＤ－ＧＲＮ ＮＳＣ株を等密度で播種し、４８時間後、細胞溶解物（細胞内プログラニュリン）（図５２Ｅ）及び細胞培地（分泌プログラニュリン）（図５２Ａ）におけるプログラニュリン発現を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。プログラニュリン発現を総タンパク質濃度に対して正規化して、細胞数の差（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ）を考慮した。ヘテロ接合性ＧＲＮ変異を有するＮＳＣ株は、対照ＮＳＣと比較して顕著に低い細胞内及び分泌プログラニュリンレベルを有し、ＦＴＤ－ＧＲＮ ＮＳＣは、内因性プログラニュリンレベルの約２５～５０％を発現した。これは、このＦＴＤ－ＧＲＮ細胞モデルが、血漿中の正常なプログラニュリンレベルの３分の１から２分の１を発現するＦＴＤ－ＧＲＮ患者において観察された臨床プログラニュリン欠乏症を再現することを示唆した（Ｆｉｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ １３２，５８３－５９１（２００９）、Ｇｈｉｄｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７１，１２３５－１２３９，（２００８）、Ｓｌｅｅｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ６５，６０３－６０９（２００９））。
すべての細胞株由来のＮＳＣを神経細胞培養物に分化させた。ｉＰＳＣ由来のＮＳＣがプログラニュリン発現の減少を呈することを確認した後、株をニューロンに分化させ、ＰＲ００６Ａの非臨床有効性試験のための臨床的に代表的な細胞型を生成した。ＮＳＣをニューロン分化培地に播種し、最終的に、７日間有糸分裂後ニューロンに分化させ、次いで免疫蛍光によってニューロンマーカー（すなわち、ＭＡＰ２、ＮｅｕＮ、Ｔａｕ、Ｔｕｊ１、ＮＦ－Ｈ）の発現について評価した（図５２Ｇ）。このプロトコルを使用して、対照及びＦＴＤ－ＧＲＮ ｉＰＳＣ由来ＮＳＣ株の両方がニューロンに効率的に分化した。
ＦＴＤ－ＧＲＮ ｉＰＳＣ由来ニューロン培養物を使用して、インビトロでのＰＲ００６Ａの有効性を評価した。ＦＴＤ－ＧＲＮニューロンを、２．７×１０５、５．３×１０５、または１．１×１０６ｖｇ／細胞のＭＯＩで賦形剤またはＰＲ００６Ａで処理した。ＰＲ００６形質導入は、すべての細胞株において、ＥＬＩＳＡによって測定されたように、分泌プログラニュリンの堅牢で用量依存的な発現をもたらした（図５２Ｂ）。賦形剤処置の対照及びＦＴＤ－ＧＲＮニューロンを、内因性プログラニュリンレベルについて評価した。対照ニューロンは内因性分泌プログラニュリンを発現したが、ＦＴＤ－ＧＲＮニューロンにおいては、分泌プログラニュリンは検出されなかった（図５２Ｂ）。線形回帰分析は、両方のＦＴＤ－ＧＲＮ細胞株にわたって、ＰＲ００６Ａ用量とプログラニュリンレベルとの間の有意な相関を確認した（ｐ＝３．５×１０－１３）。これらの結果は、ＰＲ００６Ａでの処置が、ＦＴＤ－ＧＲＮニューロンモデルにおけるプログラニュリンの分泌の上昇をもたらすことを実証している。
プログラニュリンは、リソソームプロテアーゼカテプシンＤ（ＣＴＳＤ）の成熟を刺激することが知られており、その機能の喪失は、リソソーム貯蔵障害及び神経変性にも関与するものと考えられている。ＣＴＳＤは、酵素活性成熟プロテアーゼ（ｍａｔＣＴＳＤ）へのタンパク質分解処理を受ける不活性全長プロタンパク質（ｐｒｏＣＴＳＤ）として発現される。プログラニュリンは、ｐｒｏＣＴＳＤに結合してｍａｔＣＴＳＤプロテアーゼへのその成熟を増強する分子シャペロンとして作用することが報告されている。ＦＴＤ－ＧＲＮニューロン培養において、ＰＲ００６形質導入は、カテプシンＤの欠陥のある成熟を救出した（図５２Ｃ）。対照、ＦＴＤ－ＧＲＮ＃１、及びＦＴＤ－ＧＲＮ＃２ニューロンを、ＰＲ００６Ａまたは賦形剤で形質導入した。プログラニュリンレベルを対照細胞の少なくとも２倍に回復させたため、５．３×１０５のＭＯＩのＰＲ００６Ａを有効性実験に使用した（図５２Ｂ）。有効性を評価するために、ｐｒｏＣＴＳＤ及びｍａｔＣＴＳＤ発現レベルを、自動Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）（Ｊｅｓｓ）プラットフォームを使用して、細胞溶解物において測定した（図５２Ｃ）。賦形剤処置のＦＴＤ－ＧＲＮニューロンは、賦形剤処置の対照ニューロンと比較して、ｍａｔＣＴＳＤのｐｒｏＣＴＳＤに対する比率が低く、ＰＲ００６Ａ処置は、両方のＦＴＤ－ＧＲＮニューロン株における比率を顕著に増加させた（図５２Ｃ）。対照ニューロンにおいて、ｍａｔＣＴＳＤのｐｒｏＣＴＳＤに対する比率は、ＰＲ００６Ａ処置によって顕著に変化しなかった。これらの所見は、ＰＲ００６ＡがＦＴＤ－ＧＲＮニューロンにおけるリソソーム機能関連表現型を復元することを実証している。
正常なニューロンにおいて、ＴＤＰ－４３（トランス活性応答ＤＮＡ結合タンパク質４３ｋＤａ）タンパク質は核内に局在している。ＦＴＤ－ＧＲＮ患者の死後脳において、ニューロンの細胞質におけるＴＤＰ－４３の凝集が観察され、ＴＤＰ－４３の核蓄積が減少する。ＦＴＤニューロンは核ＴＤＰ－４３を減少させ、ニューロンにおける凝集及び下流毒性につながる。Ｇｒｎ ＫＯマウスは、このＴＤＰ－４３病理を完全に再現しないので、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ニューロンは、ＴＤＰ－４３生物学を研究するための貴重なＦＴＤ－ＧＲＮモデルである。Ｖａｌｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２６，４８６１－４８７２（２０１７））によって記載されているように、核におけるＴＤＰ－４３の蓄積の減少、及び不溶性ＴＤＰ－４３の蓄積の増加は、ＧＲＮ変異を保有しない対照ニューロンに対して、ＦＴＤ－ＧＲＮを有する患者由来のｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて報告されている。両方のＦＴＤ－ＧＲＮ変異保有株由来のニューロン培養物のＰＲ００６Ａ形質導入がＴＤＰ－４３異常を逆転させ、不溶性ＴＤＰ－４３の減少（Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）（Ｊｅｓｓ）プラットフォームを使用して測定（図５２Ｄ））、及びＴＤＰ－４３の核局在の増加（免疫蛍光を使用して測定（図５２Ｆ））をもたらした。
要約すると、ＰＲ００６の形質導入は、リソソーム酵素、カテプシンＤにおける欠陥のある成熟を回復させ、ＦＴＤ－ＧＲＮニューロンにおける異常ＴＤＰ－４３病理を改善した。
インビボ非臨床試験
老齢Ｇｒｎノックアウトマウスにおける有効性及び生体内分布
ＰＲ００６Ａのインビボでの有効性及び最大用量ＰＲ００６Ａを、Ｇｒｎノックアウト（ＫＯ）マウスモデルで評価した。これらの試験において使用したＧｒｎ ＫＯマウスモデル（Ｂ６（Ｃｇ）－Ｇｒｎｔｍ１．１Ａｉｄｉ／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）において、エクソン１～４を標的プログラニュリン（Ｇｒｎ）遺伝子から欠失させる（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０７，１１７－１２８（２０１０））。これらの動物はプログラニュリンを完全に喪失し、リソソームの変化、ニューロンのリポフスチンの蓄積、ユビキチンの蓄積、小膠細胞症、及び神経炎症を含む年齢依存性の表現型を示し、したがってＦＴＤ－ＧＲＮをモデル化するために広く使用される。試験からバイアスを除去するためにすべての試みを行なった。性別及び体重についてバランスの取れた処置群にマウスを割り当て、有資格者によって実験エンドポイントの盲検評価を行った。
初期試験において、ＰＲ００６Ａを９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量で老齢Ｇｒｎ ＫＯマウスに送達し、これは、注射量の制約及び試験に使用されるウイルスロットの物理力価により、試験時点で達成可能な最高用量であった。ＣＮＳ炎症及び小膠細胞症を含む多くのＦＴＤ－ＧＲＮ関連表現型は、年齢依存的な様式で発症し、表現型の最も顕著な症状は、１２～２４か月齢間で発生するため、老齢マウスを使用した。
老齢Ｇｒｎ ＫＯマウスでの試験において、ＰＲ００６Ａを、単回脳室内（ＩＣＶ）注射によって投与した。１０μｌの賦形剤（意図される臨床ビヒクル、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＭｇＣｌ２＋０．００１％のプルロニックＦ６８）または９．７×１０１０ｖｇのＰＲ００６Ａ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇの脳［４００ｍｇの成体マウスの脳重量に基づく］）を、以下の老齢Ｇｒｎ ＫＯマウスの２つのコホートにＩＣＶ注射によって送達した。（１）注射時に１６か月齢（ｎ＝４／群、ＰＲＶ－２０１８－０２７、図６１）及び（２）注射時に１４か月齢（ｎ＝３／群、ＰＲＶ－２０１９－００２、図６１）。動物を注射の２か月後に屠殺した。
ＰＲＶ－２０１８－０２７試験において、ＰＲ００６Ａの単回用量を、以下の処置群で１６か月齢のマウスに送達した。
Figure 2022526823000012
予期しない試験の逸脱（遺伝子型決定の誤り及び動物の早期喪失）により、ＰＲＶ－２０１９－００２試験（１４ヵ月コホート）は、計画されたｎ＝３の代わりに、賦形剤処置群において１頭のマウスのみが登録された。試料数が少ないことで統計解析が不可能であるため、本試験はここでのさらなる考察から除外する。しかしながら、本試験からの所見は、試験ＰＲＶ－２０１８－０２７からの所見に類似していた。
生体内分布及びプログラニュリン発現：現在の米国Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＢＥＲ）／Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ（ＯＴＡＴ）のＰＣＲ感受性についての基準を満たすｑＰＣＲアッセイを使用して、ベクターゲノムの存在を測定することによって、生体内分布を決定した（１μｇのゲノムＤＮＡあたり５０超のベクターゲノムを陽性として定義した）。ＰＲ００６Ａを受けたすべてのマウスは、大脳皮質及び脊髄におけるベクターゲノムについて陽性であり、これは、ＩＣＶ投与が、脳及びＣＮＳにおけるＰＲ００６Ａ形質導入を成功裏にもたらすことを示す（図５９Ａ）。ＩＣＶ ＰＲ００６Ａは、Ｇｒｎ ＫＯマウスのＣＮＳ（脳、脊髄）において顕著なレベルのヒトプログラニュリンタンパク質をもたらしたが、予想されるように、賦形剤を受けたマウスにおいては、ヒトプログラニュリンは検出できなかった（図５９Ｂ）。プログラニュリンは主に分泌タンパク質であるため、ＣＳＦにおける発現は、脳内のタンパク質産生の代理物と見なされ得、ＣＳＦプログラニュリンレベルが減少したＦＴＤ－ＧＲＮ患者の潜在的な翻訳エンドポイントを表す。ＰＲ００６Ａ処置のマウスのＣＳＦにおいてヒトプログラニュリンを検出することができたが、試料量が少なく、マウスにおいて十分な量のＣＳＦを得る技術的限界があるため、ＣＳＦプログラニュリンレベルの測定は、アッセイの定量の下限（ＬＬＯＱ）を下回った（図５９Ｃ）。
ＩＣＶ投与はまた、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、及び生殖腺を含む末梢組織において、広範なベクターゲノムの存在及びプログラニュリンタンパク質レベルをもたらした（図６２Ａ～図６２Ｂ）。さらに、ＰＲ００６Ａ処置のＧｒｎ ＫＯマウスの血漿において顕著なレベルのヒトプログラニュリンが検出可能であった。予想されるように、ヒトプログラニュリンは、賦形剤処置のＧｒｎ ＫＯマウスにおいて検出されなかった。
リポフスチンの蓄積：有糸分裂後の細胞のリソソームにおいて経時的に徐々に蓄積し、リソソーム機能不全の指標である、電子密度の高い自己蛍光材料であるニューロンリポフスチンの蓄積は、Ｇｒｎ ＫＯマウスの特徴的な年齢依存性の表現型である。リポフスチンの蓄積を、隣接する脳切片において、以下の２つの独立した方法を使用して評価した。（１）より臨床的なアプローチにおいて、脳におけるリポフスチンの蓄積を盲検病理学者によって０（リポフスチンは観察されない）～４（広範なリポフスチンの蓄積）の尺度で点数化し、（２）より定量的なアプローチにおいて、リポフスチンの自己蛍光を免疫組織化学（ＩＨＣ）によって検出し、自動的に定量化した。Ｇｒｎ ＫＯマウスは、脳全体にわたって実質的なリポフスチン症を呈し、ＩＣＶ ＰＲ００６Ａ処置は、大脳皮質、海馬、及び視床におけるリポフスチン点数の重症度を減少させた（図５９Ｄ）。ＩＨＣ画像からのリポフスチンの蓄積の定量化は、３つの脳領域すべてにおいてＰＲ００６Ａ処置でリポフスチン症の減少も検出した。ユビキチン陽性の包含は、年齢依存的な様式でＧｒｎ ＫＯマウスモデルにおいても蓄積するＦＴＤ－ＧＲＮ患者の決定的な病理学的特徴であるため、ＩＨＣを実施し、目的の脳領域（大脳皮質、海馬、視床）において定量化して、ユビキチンの蓄積を評価した。ＰＲ００６Ａ処置は、Ｇｒｎ ＫＯマウスにおけるユビキチンの蓄積を顕著に減少させた（図５９Ｅ）。これらの所見は、ＰＲ００６Ａが、ＦＴＤ－ＧＲＮのＧｒｎ ＫＯマウスモデルにおけるリソソーム機能障害を改善することを示唆する。
神経炎症：慢性ＣＮＳ炎症は、年齢依存的な様式でＧｒｎ ＫＯマウスにおいて再現されるＦＴＤ－ＧＲＮを有する患者の脳における病理学的特徴である。プログラニュリンは、ＦＴＤ－ＧＲＮのマウスモデルにおいて抗炎症効果を有し、プログラニュリンの喪失は、ＴＮＦαを含む炎症促進サイトカインの上方制御につながる。この試験において、ＰＲ００６Ａでの処置は、老齢Ｇｒｎ ＫＯマウスにおける炎症マーカーレベルを抑制した。ＩＣＶ ＰＲ００６Ａは、大脳皮質における、小膠細胞のマーカーである、炎症促進サイトカインＴｎｆ（ＴＮＦα）及びＣｄ６８（ＣＤ６８）の遺伝子発現を減少させた（図５９Ｆ）。また、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙマウス炎症促進サイトカインアッセイを使用して、ＰＲ００６Ａ処置のＧｒｎ ＫＯマウス由来の大脳皮質試料におけるＴＮＦαタンパク質レベルも減少した（図５９Ｇ）。神経炎症をさらに評価するために、Ｉｂａ１、小膠細胞症のマーカー、及びＧＦＡＰ、アストロサイトーシスのマーカーについて免疫組織化学検査（ＩＨＣ）を行い、目的の脳領域（大脳皮質、海馬、視床）において定量化した。ＰＲ００６Ａ処置は、Ｇｒｎ ＫＯマウスにおいて小膠細胞症（Ｉｂａ１）の減少の傾向をもたらしたが、アストロサイトーシス（ＧＦＡＰ）には影響を与えなかった（図５９Ｈ、図５９Ｉ）。総合すると、これらの結果は、ＰＲ００６Ａ処置がＦＴＤ－ＧＲＮの老齢Ｇｒｎ ＫＯマウスモデルにおける神経炎症を減少させることを示す。
組織病理：これらの試験から得られたすべてのマウスの脳、胸髄、肝臓、心臓、脾臓、肺、及び腎臓のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色の盲検化された委員会認定病理学者による徹底的な組織病理学的分析により、ＰＲ００６Ａ処置に関連する有害事象が認められなかった。ＰＲ００６ＡのＧｒｎ ＫＯマウスへの投与は、髄質及び脳橋におけるニューロン壊死の頻度及び／または重症度点数の減少を含む、モデルに特徴的である所見の発生率及び／または重症度の減少がもたらされた。さらに、ＰＲ００６Ａ処置で、胸髄における軸索変性の発生率と重症度の両方が減少した。これらの所見は、以下の毒物セクションで詳細に考察されている。
結論：９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量でのＩＣＶ ＰＲ００６Ａは、老齢Ｇｒｎ ＫＯマウスにおいて、脳及び末梢組織全体にわたって広範なベクターゲノムの存在をもたらした。ＰＲ００６Ａ処置は、全体的なプログラニュリン発現を増加させた。さらに、ＰＲ００６Ａは、Ｇｒｎ ＫＯマウスモデル及びＦＴＤ－ＧＲＮを有する患者の両方で発生することが知られている病態である、脳におけるリポフスチン及びユビキチンの蓄積を減少させた。ＰＲ００６Ａはまた、慢性ＣＮＳ炎症を示す表現型である、大脳皮質における炎症促進サイトカイン及び免疫細胞活性化の発現を低下させた。
成体Ｇｒｎノックアウトマウスにおける用量範囲の有効性
ＰＲ００６Ａの有効用量をさらに評価するために、成体Ｇｒｎ ＫＯマウスにおけるより大きな用量範囲の試験を実施した。ＰＲＶ－２０１９－００４において、１０μｌの賦形剤（意図された臨床ビヒクル、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＭｇＣｌ２＋０．００１％のプルロニックＦ６８）またはＰＲ００６Ａを、ＩＣＶを介して４か月齢の動物に送達した。これらの成体マウスを、老齢Ｇｒｎ ＫＯマウスの代わりに使用した。それは、後者は、用量範囲の試験を実施するのに十分な数では利用できなかったからである。成体Ｇｒｎ ＫＯマウスは、老齢マウスよりも穏やかな表現型を有するが、それらは依然としてリソソーム欠損及び神経炎症の変化を呈し、したがって、ＰＲ００６Ａの有効用量範囲を評価するのに適切である。広範囲のウイルス用量にわたるＰＲ００６Ａの有効性を評価するために、ＰＲ００６Ａを、試験に使用されるウイルスロットの注射量制約及び物理力価に起因する、試験時点で達成可能な最高用量である１．１×１０１１ｖｇ（２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）、１．１×１０１０ｖｇ（２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）の中程度用量、または１．１×１０９ｖｇ（２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）の低用量で、各用量にわたる完全対数差で投与した。実験設計の詳細を図６３に示す。
群あたり１０頭のマウス（４頭雄／６頭雌）で、以下のＰＲ００６Ａの３回用量を評価した。
Figure 2022526823000013
この試験において、野生型（ＷＴ）Ｇｒｎ対立遺伝子を有するＧｒｎ ＫＯマウス（７か月齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と同じ背景株の齢適合マウスが、選択された有効性エンドポイントについての対照として機能した。
Figure 2022526823000014
生体内分布及びプログラニュリン発現：現在の米国Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ＣＢＥＲ／ＯＴＡＴのＰＣＲ感受性についての基準を満たすｑＰＣＲアッセイを使用して、ベクターゲノムの存在を測定することによって、生体内分布を決定した（ゲノムＤＮＡのμｇあたり５０超のベクターゲノムを陽性として定義した）。ＰＲ００６Ａを受けたマウスは、用量依存的に大脳皮質及び脊髄におけるベクターゲノムについて陽性であり、ＩＣＶ投与がＣＮＳにおけるＰＲ００６Ａの形質導入を成功裏にもたらすことを示した（図５３Ａ）。ＰＲ００６ＡをコードするＧＲＮのｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＰＲ００６ＡのＩＣＶ投薬が大脳皮質におけるヒトＧＲＮ ｍＲＮＡ発現の用量依存的誘導をもたらしたことを明らかにした（図５３Ｂ）。ＰＲ００６Ａ処置は、脳及び脊髄におけるヒトプログラニュリンタンパク質のレベルを増加させた（図５３Ｃ）。脳組織において、ヒトプログラニュリンレベルを検出し、ＰＲ００６Ａの最高用量で定量化した。低用量では、プログラニュリンレベルは、脳における高いバックグラウンドのためにアッセイの検出の限界を下回った。しかしながら、用量間の対数倍の差に基づいて、より低い用量での予想されるプログラニュリンレベルの比例推定は、脳組織におけるアッセイの定量の下限（ＬＬＯＱ）をはるかに下回るであろう。内因性マウスプログラニュリンのレベルを、野生型（ＷＴ）Ｇｒｎ対立遺伝子を有する齢及び株適合マウスにおいて測定し、大脳皮質及び脊髄の両方において、ＰＲ００６Ａ処置のＧｒｎ ＫＯマウスにおけるヒトプログラニュリンのレベルは、任意の用量でＷＴマウスにおける内因性プログラニュリンのレベルを超えなかった。非種間交差反応性抗プログラニュリン抗体を採用した異なる検出アッセイを使用して、ヒト及びマウスプログラニュリンを測定したため、絶対数を正確に比較することはできない。
ＰＲ００６Ａ投与はまた、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、及び生殖腺を含む末梢組織において、広範なベクターゲノムの存在及びプログラニュリンタンパク質レベルをもたらした（図５３Ｄ、図５３Ｅ）。
血漿において、ＰＲ００６Ａ処置のＧｒｎ ＫＯマウスにおいて、すべての用量レベルで顕著なレベルのヒトプログラニュリンが検出された（図５３Ｆ）。予想通り、ヒトプログラニュリンは、賦形剤処置のＧｒｎ ＫＯマウスにおいて検出されなかった。中程度用量のＰＲ００６Ａで処置した動物におけるヒトプログラニュリンのレベルは、ＷＴ Ｇｒｎ対立遺伝子を有するマウスにおいて測定したマウスプログラニュリンのレベルと同じ範囲であった。非種間交差反応性抗プログラニュリン抗体を採用した異なる検出アッセイを使用して、ヒト及びマウスプログラニュリンを測定したため、絶対数を正確に比較することはできない。
リポフスチンの蓄積：リポフスチンの蓄積を、隣接する脳切片において、以下の２つの独立した方法を使用して評価した。（１）より臨床的なアプローチにおいて、脳におけるリポフスチンの蓄積を盲検病理学者によって０（リポフスチンは観察されない）～４（広範なリポフスチンの蓄積）の尺度で点数化し、（２）より定量的なアプローチにおいて、リポフスチンの自己蛍光をＩＨＣによって検出し、自動的に定量化した。Ｇｒｎ ＫＯマウスは脳全体にわたってリポフスチン症を呈したが、ＷＴマウスは脳において検出可能なリポフスチンを有しなかった（図５３Ｇ）。ＰＲ００６ＡのＩＣＶ投与は、Ｇｒｎ ＫＯマウスの脳における細胞内リポフスチンの蓄積の重症度点数の用量依存的減少をもたらした（図５３Ｇ）。リポフスチン症の減少に対するＰＲ００６Ａの有効性は、海馬及び視床を含むＦＴＤ－ＧＲＮのＧｒｎ ＫＯマウスモデルにおいて最も堅牢なリポフスチン症表現型を示す脳領域において最も容易に定量化することができる。病理学者によるリポフスチン点数化に加えて、リポフスチン症を定量的に評価するために目的の脳領域（すなわち、大脳皮質、海馬、視床）において実施されたＩＨＣは、大脳皮質及び視床脳領域におけるリポフスチンの蓄積の量の用量依存的減少を検出し、ＰＲ００６Ａの中程度及び高用量で顕著な減少が生じた。Ｇｒｎ ＫＯマウスにおいて生じるさらなるＦＴＤ－ＧＲＮ関連病理である、脳におけるユビキチンの蓄積を評価するためにもＩＨＣを実施した。ＷＴマウスと比較して、Ｇｒｎ ＫＯマウスは、脳全体にわたってユビキチンの増加を呈した（図５３Ｈ）。ＰＲ００６Ａは、すべて３回用量において、ユビキチン免疫反応性物体サイズをほぼＷＴレベルまで顕著に減少させた（図５３Ｈ）。
神経炎症：ＰＲ００６Ａでの処置は、成体Ｇｒｎ ＫＯマウスの脳における炎症マーカーレベルを抑制した。ＩＣＶ ＰＲ００６Ａは、２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳～２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳の用量範囲にわたって、小膠細胞のマーカーである、大脳皮質における炎症促進サイトカインＴｎｆ（ＴＮＦα）及びＣｄ６８（ＣＤ６８）の遺伝子発現を減少させた（図５３Ｉ）。公表されているデータに一致して、野生型Ｇｒｎ対立遺伝子を有する齢適合マウスと比較して、賦形剤処置のＧｒｎ ＫＯマウスにおけるこれらの神経炎症マーカーの遺伝子発現の増加を観察した（図５３Ｉ）。ＰＲＶ－２０１８－０２７からの１８か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスにおける観察及び文献におけるＴＮＦα異常の報告とは対照的に、７か月齢の成体の賦形剤処置のＧｒｎ ＫＯマウスにおいて大脳皮質ＴＮＦαタンパク質レベルの堅牢な増加はなく、加えて、Ｇｒｎ ＫＯマウスにおけるＰＲ００６Ａでの顕著な変化は観察されなかった。これらの所見は、堅牢な神経炎症の表現型が、１２～２４か月齢までＧｒｎ ＫＯマウスモデルでは生じないという、以前に発表された所見と一致する。免疫組織化学検査（ＩＨＣ）を実施し、目的の脳領域（大脳皮質、海馬、及び視床）において定量化して、小膠細胞症のマーカーであるＩｂａ１、及びアストロサイトーシスのマーカーであるＧＦＡＰについて染色することによって、ニューロンの炎症をさらに評価した。ＷＴマウスと比較して、Ｇｒｎ ＫＯマウスにおける脳全体にわたって小膠細胞症（Ｉｂａ１）及びアストロサイトーシス（ＧＦＡＰ）の顕著な増加があった（図５３Ｊ～図５３Ｋ）。ＰＲ００６Ａ処置は、すべて３回用量で顕著に小膠細胞症（Ｉｂａ１）を減少させた（図５３Ｊ）。ＰＲ００６Ａの中程度用量では星状細胞症（ＧＦＡＰ）の減少傾向が観察され、視床脳領域においてＰＲ００６Ａの高用量でアストロサイトーシス（ＧＦＡＰ）の顕著な減少が観察された（図５３Ｋ）。
Ｇｒｎ ＫＯモデルの表現型の多くは、晩年に生じるが、研究は、Ｇｒｎ ＫＯマウスは、早ければ４か月齢においても、リソソーム及び免疫関連経路の変化を含む、広範囲にわたる遺伝子発現変化を呈することを報告している。したがって、上記の標的化されたｑＲＴ－ＰＣＲ分析に加えて、ｍＲＮＡレベルの変化を評価するためのトランスクリプトミクスアプローチを用いた。それは高感度のハイスループット技術（ＲＮＡ配列決定）で全般的に評価でき、必要する試料材料を最小限にすることができる。我々は、大脳皮質上でＲＮＡ配列決定を行い、遺伝子セット変異分析（ＧＳＶＡ）を使用して（Ｈａｎｚｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４，７（２０１３））、７か月齢の賦形剤処置のＧｒｎ ＫＯマウスにおいて、どの遺伝子発現経路が同じ株の齢適合ＷＴマウスと比較して変化しているかを決定した。以前に発表された研究において報告されたように、Ｇｒｎを欠くマウスにおけるリソソーム及び免疫関連経路の欠損を確認した。ＧＯ ＴＥＲＭ（ＧＯ：０００５７７３）「液胞」遺伝子のサブセット（Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ（Ｃｅｌｌ １６５，９２１－９３５（２０１６））によって記載されるＧｒｎ ＫＯマウスにおいて調節不全であると報告された４つの遺伝子を含む）、「リソソーム遺伝子」セット（Ｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０，２５６５－２５７４（２０１７））によって記載されるＧｒｎ ＫＯマウスにおいて調節不全であることが示された２５個のリソソーム関連遺伝子のサブセット）、及びＧｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＡＬＬＭＡＲＫデータベースからの「補体」遺伝子セット（自然免疫系の一部である補体系の構成要素をコードする遺伝子を含む）において顕著な変化が報告された。次いで、これらの遺伝子セットの活性レベルを測定し、ＰＲ００６Ａ処置と比較した（図５３Ｌ～図５３Ｎ）。ＰＲ００６Ａでの処置は、Ｇｒｎ ＫＯマウスにおいて観察された遺伝子セット欠損を用量依存的に逆転させた。
組織病理：これらの試験から得られたすべてのマウスの脳、胸髄、肝臓、心臓、脾臓、肺、腎臓、及び生殖腺のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色に対する盲検化された委員会認定病理学者によって徹底的な組織病理学的分析が実施され、ＰＲ００６Ａ処置に関連する毒性の証拠は発見されなかった。毒性分析の詳細は、以下のセクションに記載されている。
結論：２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳～２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳の範囲の用量でのＩＣＶ ＰＲ００６Ａは、用量依存的に、脳及び末梢組織全体にわたって広範なベクターゲノムの存在をもたらした。ＰＲ００６Ａ処置はまた、ＣＮＳにおけるプログラニュリンｍＲＮＡ及びタンパク質の産生ももたらした。ＰＲ００６Ａとリポフスチン症、リソソーム機能不全の読み出しの減少との間の明確な用量応答関係が、複数の脳領域にわたって観察された。ＰＲ００６Ａの中程度及び最高用量レベルでは、リポフスチン症の堅牢で統計学的に有意な減少が観察された。すべてのＰＲ００６Ａの用量は、脳におけるユビキチンの蓄積を減少させた。２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳の最低用量で始まり、ＰＲ００６Ａは、ＲＮＡ及びタンパク質レベルでの脳における炎症促進マーカーの発現を減少させた。
要約：インビボ非臨床試験
ＰＲ００６Ａは、Ｇｒｎ ＫＯマウスを効果的に形質導入し、導入遺伝子の堅牢で用量依存的な生体内分布及びＣＮＳにおけるプログラニュリンｍＲＮＡ及びタンパク質の産生をもたらした。ＰＲ００６Ａは、リソソーム及び神経炎症の経路における遺伝子発現異常を用量依存的に逆転させた。ＰＲ００６Ａは、リポフスチン症、ユビキチンの蓄積、及び小膠細胞症を含む、このＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルの脳において発生する多くの表現型を減少させた。用量範囲の試験において、２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳のＰＲ００６Ａの最低用量は、大脳皮質における炎症マーカーの発現を顕著に抑制した。中程度用量の２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳のＰＲ００６Ａは、堅牢で統計学的に有意な方法で、リソソーム欠損（例えば、リポフスチン症）と神経炎症の両方を改善した。高用量の２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳のＰＲ００６Ａは、毒性の証拠なしに、プログラニュリン発現をさらに増加させた。
表７：生体内分布の要約
Figure 2022526823000015
 陽性の生体内分布は５０ｖｇ／μｇ超のゲノムＤＮＡとして定義される。
安全性薬理学
これらの試験を通じて、試験品に起因する可能性のある有害事象はなかった。ＰＲＶ－２０１８－０２７、ＰＲＶ－２０１９－００２、及びＰＲＶ－２０１９－００４における動物の生存中及び組織病理学的分析からの安全性所見が、以下のセクションで考察される。
単回投与毒性
ＰＲ００６Ａでの一連の非臨床試験は、マウス及びサルにおける安全性エンドポイントを調査して実施した。３つの試験は、Ｇｒｎ ＫＯマウスモデルにおいて実施され、エンドポイントは、神経病理学的評価を含み、脳室内（ＩＣＶ）注射を介したＰＲ００６Ａ投与から結果として生じる保護活性及び潜在的毒性の両方を評価した。ＩＣＭ投与は、マウスにおいてはより技術的に困難である。これらのマウスモデルは、患者がプログラニュリンレベルの低下をもたらすＧＲＮ遺伝子における変異を有するＦＴＤ－ＧＲＮの代表的なものである。カニクイザルにおいて、ＰＲ００６Ａを大槽（ＩＣＭ）に注射したパイロット試験の一部として、神経病理検査も実施した。ＧＬＰ試験は、ＰＲ００６ＡがＩＣＭに送達されたカニクイザルにおいて実施され、サルは７日目、３０日目、または１８３日目に屠殺された。ＧＬＰ試験は、組織の完全なリストに対する解剖学的病理学的評価に加えて、臨床エンドポイントの包括的リストを組み込んだ。診療所における単回投与をサポートするために、以下の単回投与試験が実施された。
老齢ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおける最大用量のＰＲ００６Ａ（ＰＲＶ－２０１８－０２７及びＰＲＶ－２０１９－００２）
Ｇｒｎ ＫＯマウスにおけるこれらの有効性試験の一部として、賦形剤またはＰＲ００６ＡのいずれかでＩＣＶを処置したマウスにおいて神経病理学的評価を行った。Ｇｒｎ ＫＯマウスは、プログラニュリンの完全な喪失を有し、リソソームの変化、ニューロンのリポフスチンの蓄積、小膠細胞症、及び神経炎症を含む年齢依存性の表現型により、ＦＴＤ－ＧＲＮのモデルとして広く使用されている。試験の薬理学部分の側面は、上記のセクションに要約され、本試験において評価された毒物学関連エンドポイントは、以下に要約される。老齢Ｇｒｎ ＫＯマウスモデルにおいて、ＰＲ００６Ａの２つの試験を実施した。第１の試験（ＰＲＶ－２０１８－０２７）において、９頭の１６か月齢の雌雄混合Ｇｒｎ ＫＯマウスが、ＰＲ００６Ａまたは賦形剤のいずれかのＩＣＶ投与を受けた。投与の９週間後に動物を屠殺した。以下の単一のＰＲ００６Ａ用量群をこの試験に含めた。全用量９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）について１０μｌの未希釈ウイルス。対照群を賦形剤１０μｌで処置した。
表８：ＰＲＶ－２０１８－０２７の試験設計
Figure 2022526823000016
 ＲＯＡ：投与経路
生体内分布、リソソーム変化、及び炎症マーカーなどの様々な死後エンドポイントを、この試験プロトコルの一部として評価した（上記セクションを参照）。また、動物の生存を１日２回確認し、体重を１日１回測定した。処置の２か月後に安楽死させた後、標的組織を採取し、冷却された４％パラホルムアルデヒド中に落として固定し、４℃で保管した。試験を完了した８頭の動物由来の組織の不要部分を切り落とし、処理し、パラフィンブロックに包埋した。次いで、これらを、約５μｍに切片化し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、理事会認定の獣医病理学者によって検査した。
この試験の間、１頭のマウスが処置群で早期に死亡し、剖検中、死亡動物について異常は記録されておらず、したがって、死因は分かっていない。他の死亡または異常は観察されなかった。すべての処置群は、体重に関して同様に追跡され、有意差は存在しなかった。
病理組織学的検査では、ＰＲ００６Ａ関連の有害所見はなかった。Ｇｒｎ ＫＯマウスにおける予想される所見と一致して、脳におけるリポフスチンの蓄積が広範に存在した。ＰＲ００６Ａ処置の動物において、脳のすべての領域におけるリポフスチンの蓄積についての点数重症度の減少があった。形態変化もまた、ＰＲ００６Ａ処置で、特に髄質及び脳橋におけるニューロン壊死に関して、頻度及び／または重症度点数においてわずかな減少を示すようであった。しかしながら、形態変化におけるこれらの傾向は、リポフスチン点数の傾向ほど一貫していなかった。
胸髄では軸索変性があり、ごく稀に（各群４頭のうち１匹）最小限のニューロン壊死が認められた。ＰＲ００６Ａで処置した動物において、軸索変性の発生率及び重症度の両方において軽微な減少があった。
Ｇｒｎホモ接合性ノックアウトマウスにおそらく関連する以下の所見は、ＰＲ００６Ａで処置した動物において、発生率及び／または重症度が低下しているようであった：腎臓の髄質における拡張した尿細管、腎臓における糸球体症、及び肺における異物（通常、気道内で、異物巨細胞及び／またはマクロファージに頻繁に関連する、線状、無細胞、暗いピンク色の構造を特徴とする）。より確実な結論を得るためには動物のより大きなコホートが必要であろう。
観察された他のすべての組織病理学的所見は、賦形剤及び試験品処置の動物において偶発的及び／または同様の発生率及び重症度であると見なされ、したがって、ＰＲ００６Ａの投与とは無関係であると見なされた。
第２の試験（ＰＲＶ－２０１９－００２）では、５頭の１４か月齢の雌雄混合Ｇｒｎ ＫＯマウスが、ＰＲ００６Ａまたは賦形剤のいずれかのＩＣＶ投与を受けた。投与の８週間後に動物を屠殺した。単一のＰＲ００６Ａ用量群をこの試験に含めた：全用量９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）について１０μｌの未希釈ウイルス、対照群を賦形剤１０μｌで処置した。
表９：ＰＲＶ－２０１９－００２の試験設計
Figure 2022526823000017
 ＊研究終了時の遺伝子型の結果は、賦形剤群からのｎ＝１の動物が、予想されるＧｒｎホモ接合ＫＯの代わりにＧｒｎヘテロ接合ＫＯであることを確認した。
動物は、ＰＲＶ－２０１８－０２７試験と同一の方法で分析された。動物の生存を１日２回確認し、体重を１日１回測定した。処置の２か月後に安楽死させた後、標的組織を採取し、冷却された４％パラホルムアルデヒド中に落として固定し、評価まで４℃で保管した。
ＣＮＳにおいて、Ｇｒｎ ＫＯマウスにおいて以前に観察されたものと一致する所見が、脳内で観察された（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０７（１）：１１７－１２８（２０１０））。具体的には、脳全体にわたってリポフスチンの蓄積が広く増加していた。稀に最小限のニューロン壊死も観察された（１頭の未処置の早期死亡動物及び１頭の賦形剤動物において）。
試料数が少ないため、処置に関連する所見において一貫した傾向を示すことはできなかった。試験品（ＰＲ００６Ａ）と賦形剤との間に応答において一貫した差はなかった。
非ＣＮＳ組織について、Ｇｒｎ ＫＯマウスの表現型と一致すると考えられる所見が、腎臓（単核炎症性細胞の尿細管拡張及び浸潤）及び肝臓（クッパー細胞／類洞並列細胞、及びクッパー細胞小肉芽腫の空胞化）において観察された（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０７（１）：１１７－１２８（２０１０））。
手術を受け、試験に登録されたすべての動物において、「糸球体症」の所見が観察された。標準的な、負荷されていないＧｒｎノックアウトマウスに関連する変化としてこの所見の発表された報告が見出されなかったが、ある研究は、高ホモシステイン血症を誘導し、糸球体基底膜の肥厚及び有足細胞足突起の消失を発症させる食事で処置されたプログラニュリン欠損マウスを実証した（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ６９（２）：２５９－２６６（２０１７））。
他のすべての所見は、実験室マウスにおいて一般的に観察された所見と一致した。試料数が少ないため、処置に関連する決定的な差異は示されなかった。
成体ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおける用量範囲ＰＲ００６Ａ（ＰＲＶ－２０１９－００４）
ＰＲ００６Ａの安全性をさらに評価するために、成体Ｇｒｎ ＫＯマウスにおけるより大きな用量範囲の試験を実施した。合計４０頭の雌雄混合マウスを４つの群に分け、左脳半球への単回片側ＩＣＶ注射によって、賦形剤または３つの用量のＰＲ００６Ａのうちの１つのいずれかを投与し、すべての動物は、処置群に関係なく、１０μｌの総用量体積を受けた。マウスを４か月齢で処置し、処置後３か月で安楽死させた。約７か月まで齢をとった未処置Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（同じバックグラウンド系統）を含む追加の野生型（ＷＴ）対照群も安楽死させ、同様の剖検に供した。
以下の試験設計に従って試験を実施した：
表１０：ＰＲＶ－２０１９－００４の試験設計
Figure 2022526823000018
試験中、動物は、１日２回生存を確認し、１週間に１回計量した。処置の３か月後にマウスを安楽死させ、種々の死後評価を行い、ＰＲ００６Ａの有効性を評価した（上記セクションを参照）。さらに、脳、胸髄、肝臓、心臓、脾臓、肺、腎臓、及び生殖腺由来のＨ＆Ｅで染色された切片を、理事会認定の病理学者によって評価した。
組織病理学的検査では、処置群にかかわらず、いずれのマウスにも有害なＰＲ００６Ａ関連の所見はなかった。
大脳皮質、大脳核、海馬、視床／視床下部、小脳及び脳幹（特に脳橋および髄質）の脳の様々な領域における細胞内リポフスチンの蓄積など、Ｇｒｎ ＫＯマウスモデルの表現型と一致する所見があった。Ｈ＆Ｅ染色された切片における形態変化の明確な証拠（ニューロンの空胞化及び神経膠症症）は観察されなかった。リポフスチン色素の蓄積が、容易に検出可能な形態変化の前に認められ得、したがって、有効性の適切なバイオマーカーとして機能する。すべてのＧｒｎホモ接合ＫＯ群はリポフスチンの蓄積を示したが、処置群にわたってこの所見の重症度に差異があった。リポフスチンの蓄積についてのより高い点数の頻度は、賦形剤で処置した動物の群（群１）において最大であった。ＰＲ００６Ａで処置した動物のうち、群４（低用量ＰＲ００６Ａ、２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）、続いて群３（中程度用量ＰＲ００６Ａ、２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）においてより高い点数の頻度が観察された。群２（高用量ＰＲ００６Ａ、２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）で最小重症度点数を観察した。これらの所見は、Ｇｒｎホモ接合性ノックアウトマウスの脳における細胞内リポフスチンの蓄積の重症度点数の用量依存的減少を示す。他のすべての組織病理学的所見は、賦形剤及び試験品処置の動物において偶発的及び／または同様の発生率及び重症度であると見なされ、したがって、ＰＲ００６Ａの投与とは無関係であると見なされた。
サルにおけるＧＬＰ単回投与試験（ＰＲＶ－２０１８－０２８）
試験設計
このＧＬＰ試験の目的は、投与の６日後、２９日後、または１８２日後の観察期間で、カニクイザルにＩＣＭ注射を介して１回投与した場合の試験品、ＰＲ００６Ａの毒性及び生体内分布を評価することであり、試験７日目、３０日目、または１８３日目に動物を屠殺した。この研究は、２つの用量レベルを評価するように設計されており、最高用量は、１．２ｍＬ体積（投与の経験があった最高体積）の未希釈のＰＲ００６Ａで達成可能な最大実行可能用量であり、低用量は、高用量よりも１ログ単位低い用量に相当する。用量は、４．８×１０１１ｖｇの低用量、及び４．８×１０１２ｖｇの高用量に等しく、本試験で使用されるカニクイザル、ＮＨＰ種の脳重量推定値７４ｇであり、これは、約６．５×１０９ｖｇ／ｇ脳及び６．５×１０１０ｖｇ／ｇ脳となる。この試験は、動物が１．２ｍＬの賦形剤のみ（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＭｇＣｌ２＋０．００１％［ｗ／ｖ］のプルロニックＦ６８）を受ける対照群も含む。この試験は、雄及び雌のカニクイザルマカクの両方を利用した。７日目の群は、最高用量での１頭の雌を含み、早期毒性のためのセンチネルとして設計され、残りの２つの時点（３０日目及び１８３日目）には、各用量での２頭の雄と１頭の雌を含んだ。複数の脳領域由来の試料に加えて、ｑＰＣＲ分析のために末梢組織試料を収集した。ｑＰＣＲで陽性であったすべての試料を、導入遺伝子発現について分析した。この試験の設計の表形式の要約を表１１に示す。
表１１：ＧＬＰ ＮＨＰ試験ＰＲＶ－２０１８－０２８の概要
Figure 2022526823000019
Figure 2022526823000020
Figure 2022526823000021
 略語：Ｆ、雌；ＩＣＭ；大槽内；Ｍ、雄；ＭｇＣｌ２；塩化マグネシウム；ＮａＣｌ、塩化ナトリウム；ｖｇ、ベクターゲノム（複数可）；ＤＲＧ、後根神経節；ＧＡＬＴ、腸関連リンパ組織。
カニクイザルＮＨＰを、死亡率／罹患率（毎日）、臨床観察（毎日）、体重（ベースライン及びその後毎週）、食物消費の目視検査（毎日）、神経学的観察（ベースライン及び２週目及び２６週目の間）、間接眼底検査（ベースライン及び２週目及び２６週目の間）、及び心電図（ＥＣＧ）測定（ベースライン及び２週目及び２６週目の間）を含む複数の生存中観察及び測定によって評価した。
ＡＡＶ９キャプシドに対する中和抗体（ｎＡｂ）の分析を、ベースライン時及び７日目、３０日目、または１８３日目の屠殺時に実施した。血液学、凝固、臨床化学、及び尿検査からなる臨床病理検査を、ベースライン時に２回（血液検査、尿検査について１回）、及び投与段階の１週目及び１３週目の間に１回行った。
動物を安楽死させ、７日目、３０日目、または１８３日目に組織を回収した。表１１に概説した組織は、存在する場合、すべての動物から収集し、重量を測定し（該当する場合）、複製に分割した。組織病理学的評価のために、１０％中性緩衝ホルマリン（最適な固定のために特別な固定剤が必要な場合を除く）中に１個の複製物を保存した（すべての動物）。ｑＰＣＲ及び導入遺伝子発現分析のために更なる複製物を収集した。
安全性及び毒物学
予定外の死亡はなく、すべての動物は予定された剖検まで生存した。有害なＰＲ００６Ａ関連の臨床観察、体重変化、眼科的観察、または身体的もしくは神経学的検査所見は存在しなかった。剖検時の肉眼的検査では、いずれのコホートにも薬物関連の異常は見られなかった。さらに、６．５×１０９または６．５×１０１０ｖｇ／ｇ脳を投与された雄または雌雄の組み合わせにおいて観測されたＰＲ間隔、ＱＲＳ期間、ＱＴ間隔、補正ＱＴ（ＱＴｃ）間隔、または心拍数においてＰＲ００６Ａ関連の変化はなかった。ＥＣＧの定性評価中に異常なＥＣＧ波形または不整脈は観察されなかった。
生体内分布
ＰＲ００６Ａ導入遺伝子の生体内分布分析を、ｑＰＣＲベースのアッセイを使用して実施した。高用量群（６．５×１０１０ｖｇ／ｇ脳）における１８３日目に、ＣＮＳ及び末梢にわたって広範囲の形質導入があり、ｑＰＣＲアッセイの定量の下限である５０ｖｇ／μｇのＤＮＡのカットオフで、すべての組織がベクターの存在について陽性であった。１８３日目からの選択された代表的な領域からのデータを図５４Ａに示す。３０日目のデータは示されない。高用量群（６．５×１０１０ｖｇ／ｇ脳）における３０日目に、調べられたＣＮＳ組織は、被殻を除いてすべて形質導入において陽性であった。低用量（６．５×１０９ｖｇ／ｇ脳）で処置した動物由来の組織は、１８３日目のＣＮＳでは陽性であったが、末梢組織からは脾臓及び肝臓のみが陽性であった。さらに、高用量のＰＲ００６Ａで処置した１頭の雌のＮＨＰは、７日目の卵巣において陽性であり、高用量で処置した雄は３０日目及び１８３日目の精巣において陽性であった。ＰＲ００６Ａ形質導入は、肝臓及び神経系の組織において最も堅牢であり、検査した他の末梢臓器においては一貫して低かった。脳において、ベクター形質導入は、３０日目と比較したときに１８３日目に安定し、導入遺伝子の堅牢で持久性のある形質導入を実証した。
ＰＲ００６ＡのＩＣＭ投与を受けたＮＨＰにおいて、導入遺伝子産物、プログラニュリンに対する顕著な同種免疫応答があり、処置後３０日目及び１８３日目に採取された血清及びＣＳＦ試料において抗プログラニュリン抗体が検出され、免疫応答は、ヒトプログラニュリンタンパク質がＮＨＰにおいて発現されたことを示す。抗薬物抗体（ＡＤＡ）レベルを、確立された免疫アッセイ技術を使用して決定した。データを図５４Ｂに示す。
ＰＲ００６Ａ（ＧＲＮ）の発現を、ＲＴ－ｑＰＣＲベースのアッセイを使用してｍＲＮＡレベルで測定し、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）（Ｊｅｓｓ）分析を使用してタンパク質レベルで測定した。ＰＲ００６Ａ形質導入レベルと同時に、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用したｍＲＮＡ測定によって、１８３日目に収集された選択された脳領域（図５４Ｃ）、肝臓、生殖腺、脊髄及びＤＲＧにおける導入遺伝子の発現が観察された。
導入遺伝子の発現は、ＰＲ００６Ａの両方の用量で脳及び肝臓において測定可能であり、発現レベルは用量依存性及び持続性の両方であった。生殖腺において、発現は、高用量でのみ雄において測定可能であり、雌における両方の用量において、発現は、７日目及び３０日目において測定可能であったが、１８３日目においては測定可能ではなかった。
処置されたＮＨＰにおいてヒトプログラニュリンが産生されたことを確認するために、ＣＳＦにおけるタンパク質レベルを、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）（Ｊｅｓｓ）プラットフォームで評価した。方法の詳細は、実施例１４に提供される。方法は、ＦＴＤ－ＧＲＮ患者由来のＣＳＦ試料におけるプログラニュリンレベルを測定し、それらが、健常なヒト対照由来の、及びＧＲＮ変異を有さないＦＴＤ患者由来のＣＳＦ試料において測定されたレベルの約半分であることを確立することによって限定された。ＣＳＦからの結果は、低用量及び高用量のＰＲ００６Ａの両方で処置された動物において、プログラニュリンのレベルが、用量依存的に上昇することを示す（図５４Ｄ）。これらの結果は、ＩＣＭ投与後のＮＨＰにおけるＰＲ００６Ａの効果的で広範な形質導入が、プログラニュリンのレベルの増加につながることを示す。
Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）（Ｊｅｓｓ）アッセイは、高いレベルの非特異的バックグラウンドバンドにより、脳組織中のプログラニュリンレベルを測定するのに適していないため、プログラニュリンタンパク質測定は、ＣＳＦに焦点を当てた。現在利用可能なアッセイは、高レベルの非特異的バックグラウンドのために、ＮＨＰ組織における導入遺伝子由来ヒトプログラニュリンのレベルの測定は確実ではない。ＣＳＦレベルは、概して、関連する脳濃度を反映すると考えられており、それらは、臨床研究への翻訳バイオマーカーとして特に価値がある。
要約
ＮＨＰにおける小規模なパイロット非ＧＬＰ試験及び１８３日目までのＮＨＰにおけるＧＬＰ試験を含む、非臨床試験のうちのいずれにおいても、臨床試験の開始を妨げる有害な安全性所見または毒性の懸念は存在しない。ＧＬＰ試験における病理学的知見は、両方の用量群にわたって影響を受ける細胞の数が少なく、重症度が一貫して最小限であった。他の生存中または死後のＰＲ００６Ａ関連の有害な所見はなかった。
ＦＴＤ－ＧＲＮを有するヒト対象における第１／２相試験
ヒト被験者（ｎ＝１５）が、ＰＲ００６組換えＡＡＶの非盲検試験に登録される。対象の包含基準は、以下を含む：３０～８０歳（上限、下限を含める）、病原性ＧＲＮ変異を有し、症候性の病期にあり、治験薬の投薬前にバックグラウンド薬を安定して使用している。各被験者は、単回ＩＣＭ（大槽内）注射として治験薬を受ける。試験は、３か月間のバイオマーカー読み出し、１２か月間の臨床読み出し、５年間の安全性及び臨床フォローアップを含む。試験では、以下を分析する。（１）安全性及び忍容性：（２）プログラニュリン、ＮｆＬ（ニューロフィラメント軽鎖）、及び体積ＭＲＩ（磁気共鳴画像）を含む主要なバイオマーカー、ならびに（３）有効性：ＣＤＲ ｐｌｕｓ ＮＡＣＣ ＦＴＬＤ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ ｐｌｕｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｒｏｎｔａｌ Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｌｏｂａｒ Ｄｅｍｅｎｔｉａ）、行動、認知、言語、機能、及びＱｏＬ（生活の質）の尺度。
表１２：神経変性疾患の例
Figure 2022526823000022
 表１３：シヌクレイン病の例
Figure 2022526823000023
 表１４：タウオパチーの例
Figure 2022526823000024
 表１５：リソソーム貯蔵疾患の例
Figure 2022526823000025
実施例１４：脳脊髄液におけるプログラニュリンの検出のための自動ウエスタンアッセイ
この実験の目的は、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＷｅｓｔｅｒｎプラットフォームＪｅｓｓを使用して、脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるプログラニュリン（ＰＧＲＮ）のタンパク質レベルを定量化することであった。この試験方法を使用して、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＣＳＦ試料を分析し得る。ヒトプログラニュリンタンパク質、ＰＲ００６Ａの導入遺伝子産物の発現レベルを決定するために、ヒトプログラニュリンタンパク質を特異的に検出する抗体を使用して、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）（Ｊｅｓｓ）プラットフォームで非ヒト霊長類対象由来のＣＳＦ試料を分析した。Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）プラットフォームは、キャピラリーベースの自動ウエスタンブロットイムノアッセイプラットフォームであり、タンパク質分離、免疫プロービング、洗浄、及び化学発光による検出を含むすべてのステップがキャピラリーカートリッジにおいて行われる。試料（４倍希釈）及びヒトプログラニュリンに対する一次抗体（Ａｄｉｐｏｇｅｎ ＰＧ－３５９－７、１０倍希釈）、加えて二次抗体及びＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅによって製造されたすべての緩衝液を、カスタマイズされたカートリッジに充填し、Ｊｅｓｓプラットフォームで実行した。半定量的データ分析が、各実行が完了した後に自動的に行われ、信号強度、ピーク面積、及び信号対ノイズ比などのパラメータがＪｅｓｓ機器を使用して計算された。各個々の試料について、プログラニュリンのレベルを、抗体に対する免疫反応性のピーク面積として測定した。すべての分析は、盲検化試料を用いて実施された。
ここで記載されるアッセイを、非ヒト霊長類動物研究由来のＣＳＦ試料に対して実施した。プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするｒＡＡＶ構築物（ＰＲ００６；図６４を参照）を使用して、遺伝子療法の有効性を試験するために、プログラニュリンタンパク質の存在及びレベルについてＣＳＦ試料を試験した。この試験において、賦形剤またはＰＲ００６のいずれかが、ＮＨＰ動物への大槽内（ＩＣＭ）注入によって、ＰＲ００６の低用量（１．８×１０１０ｖｇ／ｇ脳重量）またはＰＲ００６の高用量（１．８×１０１１ｖｇ／ｇ脳重量）で送達された。各群は３頭の動物からなった。９頭のＮＨＰ動物を感染後１８０日目に屠殺し（表１６）、Ｊｅｓｓベースのアッセイを使用してＣＳＦ試料を分析した。
表１６：群分け及び投薬を示すＮＨＰ動物の要約
Figure 2022526823000026
 表１７：自動ウエスタンアッセイのための材料
Figure 2022526823000027
 注：すべての試薬は、バイアルを開く前に室温に温める必要がある。
この方法を実施する際に、以下の手順に従った：
ストック溶液の調製：
１．分離モジュールＥＺ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐａｃｋにおけるクリアチューブに４０μＬの水を添加して、４００ｍＭのＤＴＴ溶液を調製する。優しく混ぜる。
２．マスター混合物を調製するために、ＥＺピンクマスター混合物チューブに２０μＬの１０×試料緩衝液及び２０μＬの４００ｍＭのＤＴＴを添加する。優しく混ぜる。
３．ビオチン化ラダーを調製するために、２０μＬの水を、ピンク色のペレットを有するＥＺクリアビオチン化ラダーチューブにピペットで入れる。優しく混ぜる。
４．それぞれ等量を添加して、ルミノー及び過酸化物の混合物を調製する。１回の実行では、２００μＬのルミノールを２００μＬの過酸化水素に添加する。
５．２５μＬの一次抗体及び２２５μＬの抗体希釈剤２を混合することにより一次抗体希釈液（１０倍希釈）を調製する。
試料の調製：
１．試料を０．１×試料緩衝液中に希釈する。１０μＬの１０×試料緩衝液を９９０μＬの水に添加することによって、０．１×試料緩衝液を調製する。
２．必要に応じて試料を希釈する。例えば、ＮＨＰ ＣＳＦ試料を、マスター混合物を添加する前に４倍希釈した。５μＬのＮＨＰ ＣＳＦを１５μＬの０．１Ｘ試料緩衝液に添加する。
３．１Ｘのマスター混合物を４Ｘの試料に添加することにより試料を調製する。技術的な複製を実行するために、合計１５μＬの試料及び試料ごとのマスター混合物を準備する。例えば、１２μＬの希釈した試料に３μＬのマスター混合物を加える。優しく混ぜる。
４．試料を９５℃で５分間煮沸する。
５．卓上ミニ遠心分離機を使用して試料を短時間遠沈させる。試料を装填する前にボルテックスする。
試薬及び試料をカートリッジに充填する：
１．すべての試料をカートリッジマップに従ってピペットで入れる。
ａ．レーンＥにおける各ウェルに１５μＬのルミノール＋過酸化物混合物をピペットで入れる。
ｂ．レーンＤにおける第１のウェルに１０μＬのストレプトアビジンをピペットで入れる。
ｃ．レーンＤにおける残りの２４ウェルに１０μＬの二次抗体をピペットで入れる。
ｄ．レーンＣの第１のウェルに１０μＬの抗体希釈液をピペットで入れる。
ｅ．レーンＣにおける残りの２４ウェルに１０μＬの一次抗体希釈液をピペットで入れる。
ｆ．レーンＢにおけるすべてのウェルに１０μＬの抗体希釈剤をピペットで入れる。
ｇ．レーンＡにおける第１のウェルに１０μＬの調整されたＥＺラダーをピペットで入れる。
ｈ．レーンＡにおける複製レーンに５μＬの試料及びマスター混合物溶液をピペットで入れる。
２．カートリッジを室温で５分間、２５００ＲＰＭで回転させる。
キャピラリー及びカートリッジを機器に装填する：
１．スロットにキャピラリーを装填する。ライトが青色になっていることを確認する。
２．スピンカートリッジを装置に装填する。
３．機器の青色のライトの点滅が止まった後、スタートボタンを押す。
複製物についてのＣＶ（変動係数）のパーセンテージが３０％以下であれば、アッセイシステムの適合性が許容できるとみなした。
アッセイを使用してＮＨＰ ＣＳＦ試料におけるプログラニュリンを検出する前に、アッセイを以下のように試験した。Ｊｅｓｓアッセイの適格性試験は、希釈線形性、選択性、及び特異度の評価を含んだ。ＢｉｏＩＶＴ由来の通常のＣＳＦ試料を使用して、Ｊｅｓｓアッセイの希釈線形性を決定した。ＰＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）患者由来のＣＳＦ試料（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｅｍｅｎｔｉａｓ（ＮＣＲＡＤ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）から入手）を使用して、Ｊｅｓｓアッセイの選択性及び特異度を決定した。
表１８：結果の要約
Figure 2022526823000028
結果及び考察
希釈線形性
Ｊｅｓｓによって検出されたＰＧＲＮタンパク質の希釈線形性を、市販（ＢｉｏＩＶＴ）されている正常な個体由来のＣＳＦ試料において試験した。ＣＳＦ試料におけるＰＧＲＮの内因性レベルを測定して、希釈線形性を決定した。２個体を、２倍～６４倍の範囲の２倍連続希釈で試験した。
表１９は、Ｊｅｓｓによって検出された５８ｋＤａでのＰＧＲＮタンパク質のピーク面積、及び１６倍希釈からの各希釈の％差を報告した。線形範囲内の結果は太字（１００±３０％差以内）である。希釈線形性は４～１６倍以内であることが確立された。
Figure 2022526823000029
要約すると、試験したすべてのマトリックスは、マトリックス間で範囲のサイズ及び希釈量が異なったが、０±３０％の差の許容基準に合格した許容可能な線形範囲を有した。試料線形性ＭＲＤは４倍希釈であることが確立された。希釈線形性は、４～１６倍の希釈範囲内であることが確立された。ＣＳＦについての許容基準を合格するＭＲＤ及び線形希釈範囲の概要を表２０に示す。
表２０：ＣＳＦのＭＲＤ及び線形希釈範囲
Figure 2022526823000030
選択性及び特異度
Ｊｅｓｓによって検出されたＰＧＲＮタンパク質の選択性及び特異度を、ＮＣＲＡＤ由来のＰＲ００６ ＦＴＤ患者試料由来のＣＳＦ試料において試験した。ＣＳＦ試料の３つの群（群Ａ、Ｂ、及びＣ）を、ヘテロ接合性ＦＴＤ患者（群Ａ）、家族性非保有者（群ＢまたはＣ）、及び正常個体（群ＢまたはＣ）から収集した。各群について６つの試料を分析した。試料の群を表１６のＦＴＤ患者ＣＳＦ試料情報に記載する。
ＣＳＦ試料は、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅによって提供される０．１Ｘ試料緩衝液中で４倍希釈され、技術的な複製物において試験された。結果の％ＣＶが２０％超の試料の複製物を再分析した。％ＣＶが２０％未満の結果を表２２に報告した。表２２は、Ｊｅｓｓによって検出された５８ｋＤａでのＰＧＲＮタンパク質のピーク面積、及び複製物間の％ＣＶを報告した。結果は、群Ｂ及びＣにおけるＰＧＲＮレベルが、Ａ群と比較して約２倍高いことを示し、これは、ＣＳＦ試料についてのＰＧＲＮレベルの決定においてのＪｅｓｓアッセイの選択性及び特異度を示す（図５５）。
表２１：ＦＴＤ患者のＣＳＦ試料情報
Figure 2022526823000031
Figure 2022526823000032
 表２２：選択性及び特異度の結果
Figure 2022526823000033
ＦＴＤ患者由来のＣＳＦ試料試験（表２１）も、ヒトＰＧＲＮのＥＬＩＳＡキット（Ａｄｉｐｏｇｅｎ，ＡＧ－４５Ａ－００１８ＹＥＫ－ＫＩ０１）で分析した。ＥＬＩＳＡからの結果（図５６）は、Ｊｅｓｓと同様の群間のＰＧＲＮレベルの傾向を示し、ＪｅｓｓアッセイがＣＳＦ試料におけるＰＧＲＮレベルの評価に使用するのに最適であることを実証した。
結論として、このＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｊｅｓｓアッセイは、ＮＨＰ ＣＳＦ試料におけるＰＧＲＮレベルの評価に使用するのに最適であると判定された。
ＮＨＰ ＣＳＦ試料についてのＪｅｓｓデータを表２３に示す。各試料は、２つの技術的複製にわたる平均を表す。試料レーンにおける５８ｋＤバンドについてのピーク面積を報告する。データは、技術的複製の平均ピーク面積及び調整された希釈倍率として提示される。
表２３：ＮＨＰ ＣＳＦ試料についてのＪｅｓｓデータ
Figure 2022526823000034
このアッセイの目的は、ＮＨＰ試験のための目的の組織領域におけるＰＲ００６の形質導入後のプログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質発現レベルのレベルを確認することであった。これは、モノクローナル抗体を使用してプログラニュリンタンパク質を検出する自動ウエスタンプラットフォームを使用して実施された。プログラニュリン発現は、対照及びＰＲ００６処置のＮＨＰの両方におけるＣＳＦにおいて測定可能であり、このアッセイは、内因性プログラニュリンタンパク質とＰＲ００６Ａ誘導プログラニュリンタンパク質を区別しない。
本出願は、参照により、以下の文書の内容全体を組み込む。国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１９／０７０８９３号、国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１９／０７０８９１号、２０１７年１０月３日に出願され、「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題された米国仮特許出願第６２／５６７，２９６号、２０１７年１０月３日に出願され、「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題された同第６２／５６７，３１１号、２０１７年１０月３日に出願され、「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題された同第６２／５６７，３１９号、２０１８年１０月３日に出願され、「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題された同第６２／５６７，３０１号、２０１７年１０月３日に出願され、「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題された同第６２／５６７，３１０号、２０１７年１０月３日に出願され、「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題された同第６２／５６７，３０３号、及び２０１７年１０月３日に出願され、「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題された同第６２／５６７，３０５号。
このように本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様を説明したが、当業者は、様々な変更、修正、及び改善を容易に考えつくことが理解されるであろう。そのような変更、修正、及び改善は、本開示の一部であることが意図され、本発明の趣旨及び範囲内であることが意図されている。したがって、前述の説明及び図面は単なる例にすぎない。
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を記載及び例示説明したが、当業者は、本明細書に記載の機能を実行するために、及び／または、結果及び／または利点のうちの１つ以上を得るるために様々な他の手段及び／または構造を容易に想起するであろうし、そのような変形及び／または修正の各々は本発明の範囲内であると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示であることを意図しており、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／または構成は、本発明の教示が使用される特定の用途または複数の用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、通常の実験のみを使用して本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識するか、または確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は、単なる例として提示され、添付の特許請求の範囲及びその同等の範囲内で、本発明は、具体的に記載され特許請求される以外の方法で実施され得ることを理解されたい。本発明は、本明細書に記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、及び／または方法を対象とする。さらに、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、及び／または方法の任意の組み合わせが、そのような特徴、システム、物品、材料、及び／または方法が相互に矛盾しない場合、本発明の範囲内に含まれる。
本明細書及び特許請求の範囲において本願で使用される場合、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解される必要がある。
本明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、「及び／または」という表現は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には結合して存在し、他の場合には分離して存在する要素を意味すると理解される必要がある。「及び／または」節によって具体的に特定される要素以外の他の要素は、反対に明確に示されない限り、具体的に特定される要素に関連するかどうかにかかわらず、任意に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「含む」などの制限のない言語と組み合わせて使用される場合、「Ａ及び／またはＢ」への言及は、一実施形態において、ＢのないＡ（任意にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態において、ＡのないＢ（任意にＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態において、Ａ及びＢの両方（任意に他の要素を含む）などを指し得る。
本明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、「または」は、上記で定義された「及び／または」と同じ意味を有すると理解される必要がある。例えば、リストにおいて項目を区切る場合、「または」または「及び／または」は包括的である、すなわち、多数の、またはリストの要素のうちの少なくとも１つを含むが、それのうちの１つより多く、及び任意に、追加のリストされていない項目を含むと解釈されるものとする。「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」などの反対に明確に示される用語のみ、または特許請求の範囲で使用される場合の「からなる」は、多数の、またはリストの要素のうちの正確に１つの要素を含むことを指す。概して、本明細書で使用されるとき、「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、または「のうちの正確に１つ」などの排他性の用語が先行する場合にのみ、排他的代替（すなわち、「１つまたは他の、しかし両方ではない」）を示すものとして解釈されるべきである。
本明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも１つ」という表現は、要素のリストの要素の任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも要素のリスト内に具体的に記載される各及びすべての要素のうちの少なくとも１つを含む必要はなく、要素のリストにおける要素の任意の組み合わせを除外しないことが理解される必要がある。この定義はまた、「少なくとも１つ」という表現が指す要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定される要素に関連するかどうかにかかわらず、任意に存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（または同等に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または同等に、「Ａ及び／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態において、少なくとも１つ、任意に１つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（及び任意にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態において、少なくとも１つ、任意に１つより多いＢを含み、Ａが存在しない（及び任意選択的にＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態において、少なくとも１つ、任意に１つより多いＡ、及び少なくとも１つ、任意に１つ以上のＢを含むこと（及び任意に他の要素を含む）を指し得る。
特許請求の範囲の要素を修飾するための特許請求の範囲における「第１の」、「第２の」、「第３の」などの順序用語の使用は、それ自体が、ある特許請求の範囲の要素の他の要素に対する重要度、優先度、もしくは順序、または方法の行為が実行される時間的順序を意味するものではなく、特許請求の範囲の要素を区別するために、特定の名前を有する１つの特許請求の範囲の要素を（順序用語の使用について以外で）同じ名前を有する別の要素から区別するためのラベルとしてのみ使用される。
また、反対に明確に示されない限り、１つより多いステップまたは行為を含む本明細書で請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも、方法のステップまたは行為が列挙される順序に限定されないことも理解される必要がある。
本出願において参照されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許刊行物の各々は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
配列
いくつかの実施形態において、１つ以上の遺伝子産物（例えば、第１、第２及び／または第３の遺伝子産物）をコードする発現カセットは、配列番号１～９１のうちのいずれか１つに記載の配列を含むか、またはそれからなる（またはそれを有するペプチドをコードする）。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、配列番号１～９１のうちのいずれか１つの部分（例えば、断片）によってコードされる。
番号付けされた実施形態
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の番号付けされた本開示の実施形態を記載する。
１．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するＧｃａｓｅタンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記Ｇｃａｓｅタンパク質が、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
２．前記Ｇｃａｓｅタンパク質が、配列番号１４に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態１に記載の単離核酸。
３．前記Ｇｃａｓｅタンパク質が、コドン最適化核酸配列、任意に配列番号１５に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態１または２に記載の単離核酸。
４．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の単離核酸。
５．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態１～４のいずれか１つに記載の単離核酸。
６．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態１～５のいずれか１つに記載の単離核酸。
７．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するプロサポシンタンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記プロサポシンタンパク質が、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
８．前記プロサポシンタンパク質が、配列番号１６に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態７に記載の単離核酸。
９．前記プロサポシンタンパク質が、コドン最適化核酸配列、任意に配列番号１７に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態７または８に記載の単離核酸。
１０．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態７～９のいずれか１つに記載の単離核酸。
１１．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態７～１０のいずれか１つに記載の単離核酸。
１２．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態７～１１のいずれか１つに記載の単離核酸。
１３．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するＳＣＡＲＢ２タンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記ＳＣＡＲＢ２タンパク質が、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
１４．前記ＳＣＡＲＢ２タンパク質が、配列番号１８に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態１３に記載の単離核酸。
１５．前記ＳＣＡＲＢ２タンパク質が、コドン最適化核酸配列、または配列番号１９に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態１３または１４に記載の単離核酸。
１６．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態１３～１５のいずれか１つに記載の単離核酸。
１７．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態１３～１６のいずれか１つに記載の単離核酸。
１８．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態１３～１７のいずれか１つに記載の単離核酸。
１９．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するＧＢＡ２タンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記ＧＢＡ２タンパク質が、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
２０．前記ＧＢＡ２タンパク質が、配列番号３０に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態１９に記載の単離核酸。
２１．前記ＧＢＡ２タンパク質が、コドン最適化核酸配列、または配列番号３１に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態１９または２０に記載の単離核酸。
２２．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態１９～２１のいずれか１つに記載の単離核酸。
２３．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態１９～２２のいずれか１つに記載の単離核酸。
２４．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態１９～２３のいずれか１つに記載の単離核酸。
２５．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するＧＡＬＣタンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記ＧＡＬＣタンパク質が、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
２６．前記ＧＡＬＣタンパク質が、配列番号３３に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態２５に記載の単離核酸。
２７．前記ＧＡＬＣタンパク質が、コドン最適化核酸配列、または配列番号３４に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態２５または２６に記載の単離核酸。
２８．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載の単離核酸。
２９．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態２５～２８のいずれか１つに記載の単離核酸。
３０．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態２５～２９のいずれか１つに記載の単離核酸。
３１．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するＣＴＳＢタンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記ＣＴＳＢタンパク質が、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
３２．前記ＣＴＳＢタンパク質が、配列番号３０に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態３１に記載の単離核酸。
３３．前記ＣＴＳＢタンパク質が、コドン最適化核酸配列、または配列番号３６に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態３１または３２に記載の単離核酸。
３４．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態３１～３３のいずれか１つに記載の単離核酸。
３５．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態３１～３４のいずれか１つに記載の単離核酸。
３６．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態３１～３５のいずれか１つに記載の単離核酸。
３７．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するＳＭＰＤ１タンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記ＳＭＰＤ１タンパク質が、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
３８．前記ＳＭＰＤ１タンパク質が、配列番号３７に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態３７に記載の単離核酸。
３９．前記ＳＭＰＤ１タンパク質が、コドン最適化核酸配列、または配列番号３８に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態３７または３８に記載の単離核酸。
４０．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態３７～３９のいずれか１つに記載の単離核酸。
４１．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態３７～４０のいずれか１つに記載の単離核酸。
４２．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態３７～４１のいずれか１つに記載の単離核酸。
４３．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するＧＣＨ１タンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記ＧＣＨ１タンパク質が、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
４４．前記ＧＣＨ１タンパク質が、配列番号４５に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態４３に記載の単離核酸。
４５．前記ＧＣＨ１タンパク質が、コドン最適化核酸配列、または配列番号４６に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態４３または４４に記載の単離核酸。
４６．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態４３～４５のいずれか１つに記載の単離核酸。
４７．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態４３～４６のいずれか１つに記載の単離核酸。
４８．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態４３～４７のいずれか１つに記載の単離核酸。
４９．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するＲＡＢ７Ｌタンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記ＲＡＢ７Ｌタンパク質が、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
５０．前記ＲＡＢ７Ｌタンパク質が、配列番号４７に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態４９に記載の単離核酸。
５１．前記ＲＡＢ７Ｌタンパク質が、コドン最適化核酸配列、または配列番号４８に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態４９または５０に記載の単離核酸。
５２．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態４９～５１のいずれか１つに記載の単離核酸。
５３．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態４９～５２のいずれか１つに記載の単離核酸。
５４．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態４９～５３のいずれか１つに記載の単離核酸。
５５．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するＶＰＳ３５タンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記ＶＰＳ３５タンパク質が、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
５６．前記ＶＰＳ３５タンパク質が、配列番号４９に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態５５に記載の単離核酸。
５７．前記ＶＰＳ３５タンパク質が、コドン最適化核酸配列、または配列番号５０に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態５５または５６に記載の単離核酸。
５８．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態５５～５７のいずれか１つに記載の単離核酸。
５９．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態５５～５８のいずれか１つに記載の単離核酸。
６０．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態５５～５９のいずれか１つに記載の単離核酸。
６１．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するＩＬ－３４タンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記ＩＬ－３４タンパク質が、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
６２．前記ＩＬ－３４タンパク質が、配列番号５５に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態６１に記載の単離核酸。
６３．前記ＩＬ－３４タンパク質が、コドン最適化核酸配列、または配列番号５６に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態６１または６２に記載の単離核酸。
６４．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態６１～６３のいずれか１つに記載の単離核酸。
６５．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態６１～６４のいずれか１つに記載の単離核酸。
６６．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態６１～６５のいずれか１つに記載の単離核酸。
６７．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するＴＲＥＭ２タンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記ＴＲＥＭ２タンパク質が、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
６８．前記ＴＲＥＭ２タンパク質が、配列番号５７に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態６７に記載の単離核酸。
６９．前記ＴＲＥＭ２タンパク質が、コドン最適化核酸配列、または配列番号５８に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態６７または６８に記載の単離核酸。
７０．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態６７～６９のいずれか１つに記載の単離核酸。
７１．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態６７～７０のいずれか１つに記載の単離核酸。
７２．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態６７～７１のいずれか１つに記載の単離核酸。
７３．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質が、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
７４．前記ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質が、配列番号６３に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態７３に記載の単離核酸。
７５．前記ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質が、コドン最適化核酸配列、または配列番号６４に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態７３または７４に記載の単離核酸。
７６．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態７３～７５のいずれか１つに記載の単離核酸。
７７．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態７３～７６のいずれか１つに記載の単離核酸。
７８．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態７３～７７のいずれか１つに記載の単離核酸。
７９．２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接するプログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、
（ｉ）前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含み、及び／または
（ｉｉ）前記ＰＧＲＮタンパク質が、コドン最適化核酸配列によってコードされる、前記単離核酸。
８０．前記ＰＧＲＮタンパク質が、配列番号６７に記載のアミノ酸配列またはその一部分を含む、実施形態７９に記載の単離核酸。
８１．前記ＰＧＲＮタンパク質が、コドン最適化核酸配列、または配列番号６８に記載の核酸配列によってコードされる、実施形態７９または８０に記載の単離核酸。
８２．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態７９～８１のいずれか１つに記載の単離核酸。
８３．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態７９～８２のいずれか１つに記載の単離核酸。
８４．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態７９～８３のいずれか１つに記載の単離核酸。
８５．第１の遺伝子産物及び第２の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む単離核酸であって、各遺伝子産物が、独立して、表１に記載の遺伝子産物またはその一部から選択される、前記単離核酸。
８６．前記第１の遺伝子産物が、Ｇｃａｓｅタンパク質またはその一部分である、実施形態８５に記載の単離核酸。
８７．前記第２の遺伝子産物が、ＬＩＭＰ２もしくはその一部分、またはプロサポシンもしくはその一部分である、実施形態８５または８６に記載の単離核酸。
８８．干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）をさらにコードし、任意に、前記干渉核酸が、α－ＳｙｎまたはＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を阻害する、実施形態８５～８７のいずれか１つに記載の単離核酸。
８９．１つ以上のプロモーターをさらに含み、任意に、前記１つ以上のプロモーターの各々が、独立して、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーターである、実施形態８５～８８のいずれか１つに記載の単離核酸。
９０．内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含み、任意に、前記ＩＲＥＳが、第１の遺伝子産物及び第２の遺伝子産物の間に位置する、実施形態８５～８９のいずれか１つに記載の単離核酸。
９１．自己切断ペプチドコーディング配列をさらに含み、任意に、前記自己切断ペプチドがＴ２Ａである、実施形態８５～９０のいずれか１つに記載の単離核酸。
９２．前記発現構築物が、前記第１の遺伝子産物及び前記第２の遺伝子産物に隣接する２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含み、任意に、前記ＩＴＲ配列のうちの１つが、機能的な末端解離部位を欠く、実施形態８５～９１のいずれか１つに記載の単離核酸。
９３．前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）に対して修飾「Ｄ」領域を含む、実施形態９２に記載の単離核酸。
９４．前記修飾「Ｄ」領域が、前記発現構築物に対して前記ＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、実施形態９３に記載の単離核酸。
９５．前記修飾「Ｄ」配列を含む前記ＩＴＲが、３’ＩＴＲである、実施形態９３または９４に記載の単離核酸。
９６．ＴＲＹ配列をさらに含み、任意に、前記ＴＲＹ配列が、配列番号２８に記載されている、実施形態８５～９５のいずれか１つに記載の単離核酸。
９７．配列番号１～９１のうちのいずれか１つに記載の配列を有する、単離核酸。
９８．実施形態１～９７のいずれか１つに記載の単離核酸を含む、ベクター。
９９．前記ベクターがプラスミドである、実施形態９８に記載のベクター。
１００．前記ベクターが、ウイルスベクターであり、任意に、前記ウイルスベクターが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターまたはバキュロウイルスベクターである、実施形態９８に記載のベクター。
１０１．実施形態１～９７のいずれか１つに記載の単離核酸、または実施形態９８～１００のいずれか１つに記載のベクターを含む、組成物。
１０２．実施形態１～９７のいずれか１つに記載の単離核酸または実施形態９８～１００のいずれか１つに記載のベクターを含む、宿主細胞。
１０３．
（ｉ）キャプシドタンパク質、及び
（ｉｉ）実施形態１～９７のいずれか１つに記載の単離核酸、または実施形態９８～１００のいずれか１つに記載のベクターを含む、
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
１０４．前記キャプシドタンパク質が、血液脳関門を通過することができ、任意に、前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質またはＡＡＶｒｈ．１０キャプシドタンパク質である、実施形態１０３に記載のｒＡＡＶ。
１０５．前記ｒＡＡＶが、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞及び非神経細胞を形質導入する、実施形態１０３または１０４に記載のｒＡＡＶ。
１０６．パーキンソン病を有するか，または有する疑いのある対象を治療するための方法であって、前記対象に、実施形態１～９７のいずれか１つに記載の単離核酸、実施形態９８～１００のいずれか１つに記載のベクター、実施形態１０１に記載の組成物、または実施形態１０３～１０５のいずれか１つに記載のｒＡＡＶを投与することを含む、前記方法。
１０７．前記投与が、前記対象の前記ＣＮＳへの直接注射を含み、任意に、前記直接注射が、脳内注射、実質内注射、くも膜下腔内注射、大槽内注射、またはそれらの任意の組み合わせである、実施形態１０６に記載の方法。
１０８．前記対象の前記ＣＮＳへの前記直接注射が、対流増強送達（ＣＥＤ）を含む、実施形態１０７に記載の方法。
１０９．前記投与が、末梢注射を含み、任意に、前記末梢注射が、静脈内注射である、実施形態１０６～１０８のいずれか１つに記載の方法。
１１０．ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法であって、
（ｉ）ＰＧＲＮタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、前記導入遺伝子挿入物が配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、前記ｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、
を含むｒＡＡＶを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
１１１．前記ｒＡＡＶが、約１×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）～約７×１０１４ｖｇの範囲の用量で前記対象に投与される、実施形態１１０に記載の方法。
１１２．前記ｒＡＡＶが、大槽への注射を介して投与される、実施形態１１０または１１１に記載の方法。
１１３．前記プロモーターが、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、実施形態１１０～１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１４．前記ｒＡＡＶベクターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーをさらに含む、実施形態１１０～１１３のいずれか１つに記載の方法。
１１５．前記ｒＡＡＶベクターが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）をさらに含む、実施形態１１０～１１４のいずれか１つに記載の方法。
１１６．前記ｒＡＡＶベクターが、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部をさらに含む、実施形態１１０～１１５のいずれか１つに記載の方法。
１１７．前記核酸が、前記発現構築物に隣接する２つのアデノ随伴ウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、実施形態１１０～１１６のいずれか１つに記載の方法。
１１８．各ＩＴＲ配列が、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である、実施形態１１７に記載の方法。
１１９．前記ｒＡＡＶベクターが、５’ＩＴＲ及び前記発現構築物の間にＴＲＹ領域をさらに含み、前記ＴＲＹ領域が、配列番号２８を含む、実施形態１１０～１１８のいずれか１つに記載の方法。
１２０．ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法であって、
（ｉ）５’から３’の順に、
（ａ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ、
（ｂ）ＣＭＶエンハンサー、
（ｃ）ＣＢＡプロモーター、
（ｄ）ＰＧＲＮタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、前記導入遺伝子挿入物が配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、前記導入遺伝子挿入物、
（ｅ）ＷＰＲＥ、
（ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部、及び
（ｇ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ含む核酸を含む、ｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、
を含むｒＡＡＶを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
１２１．前記ｒＡＡＶが、約１×１０１３ｖｇ～約７×１０１４ｖｇの範囲の用量で前記対象に投与される、実施形態１２０に記載の方法。
１２２．前記ｒＡＡＶが、大槽への注射を介して投与される、実施形態１２０または１２１に記載の方法。
１２３．前記ｒＡＡＶが、約２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約２００ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．００１％ｗ／ｖのポロキサマー１８８を含む製剤で投与される、実施形態１１０～１２２のいずれか１つに記載の方法。
１２４．
（ｉ）
（ａ）ＰＧＲＮタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、前記導入遺伝子挿入物が配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、前記ｒＡＡＶベクター、及び
（ｂ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む
ｒＡＡＶと、
（ｉｉ）約２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）と、
（ｉｉｉ）約１ｍＭのＭｇＣｌ２と、
（ｉｖ）約２００ｍＭのＮａＣｌと、
（ｖ）約０．００１％ｗ／ｖのポロキサマー１８８と、を含む、医薬組成物。
１２５．
（ａ）ＰＧＲＮタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、前記導入遺伝子挿入物が配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、前記ｒＡＡＶベクターと、
（ｂ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む、
対象においてＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を治療する方法において使用するための、ｒＡＡＶ。
１２６．脳脊髄液（ＣＳＦ）試料におけるＰＧＲＮタンパク質レベルを定量する方法であって、
（１）前記ＣＳＦ試料を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び試料緩衝液を含有するマスター混合物において希釈することと、
（２）前記希釈ＣＳＦ試料、抗プログラニュリン抗体、前記抗プログラニュリン抗体を検出する二次抗体、ルミノール及び過酸化物を、キャピラリーカートリッジのウェルに充填することと、
（３）前記キャピラリーカートリッジを自動ウエスタンブロットイムノアッセイ機器に装填することと、
（４）前記自動ウエスタンブロットイムノアッセイ機器を使用して、シグナル強度、ピーク面積、及びシグナル対ノイズ比を計算することと、
（５）前記ＣＳＦ試料におけるプログラニュリンタンパク質レベルを、免疫反応性の前記抗プログラニュリン抗体に対する前記ピーク面積として定量することと、を含む、前記方法。

Claims (17)

  1. ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法であって、
    （ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、前記導入遺伝子挿入物が配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、前記ｒＡＡＶベクターと、
    （ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、
    を含むｒＡＡＶを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
  2. 前記ｒＡＡＶが、約１×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）～約７×１０１４ｖｇの範囲の用量で前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｒＡＡＶが、大槽への注射を介して投与される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記プロモーターが、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記ｒＡＡＶベクターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーをさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記ｒＡＡＶベクターが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記ｒＡＡＶベクターが、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記核酸が、前記発現構築物に隣接する２つのアデノ随伴ウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 各ＩＴＲ配列が、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ｒＡＡＶベクターが、５’ＩＴＲ及び前記発現構築物の間にＴＲＹ領域をさらに含み、前記ＴＲＹ領域が、配列番号２８を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するか、または有する疑いのある対象を治療するための方法であって、
    （ｉ）５’から３’の順に、
    （ａ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ、
    （ｂ）ＣＭＶエンハンサー、
    （ｃ）ＣＢＡプロモーター、
    （ｄ）ＰＧＲＮタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、前記導入遺伝子挿入物が配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、前記導入遺伝子挿入物、
    （ｅ）ＷＰＲＥ、
    （ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナル尾部、及び
    （ｇ）ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む核酸を含む、ｒＡＡＶベクターと、
    （ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、
    を含むｒＡＡＶを、前記対象に投与することを含む、前記方法。
  12. 前記ｒＡＡＶが、約１×１０１３ｖｇ～約７×１０１４ｖｇの範囲の用量で前記対象に投与される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ｒＡＡＶが、大槽への注射を介して投与される、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記ｒＡＡＶが、約２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約２００ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．００１％ｗ／ｖのポロキサマー１８８を含む製剤で投与される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. （ｉ）
    （ａ）ＰＧＲＮタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、前記導入遺伝子挿入物が配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、前記ｒＡＡＶベクター、及び
    （ｂ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む
    ｒＡＡＶと、
    （ｉｉ）約２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）と、
    （ｉｉｉ）約１ｍＭのＭｇＣｌ２と、
    （ｉｖ）約２００ｍＭのＮａＣｌと、
    （ｖ）約０．００１％ｗ／ｖのポロキサマー１８８と、を含む、医薬組成物。
  16. （ａ）ＰＧＲＮタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に作動可能に連結したプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、前記導入遺伝子挿入物が配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、前記ｒＡＡＶベクターと、
    （ｂ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、
    を含む、
    対象においてＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を治療する方法において使用するための、ｒＡＡＶ。
  17. 脳脊髄液（ＣＳＦ）試料におけるＰＧＲＮタンパク質レベルを定量する方法であって、
    （１）前記ＣＳＦ試料を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び試料緩衝液を含有するマスター混合物において希釈することと、
    （２）前記希釈ＣＳＦ試料、抗プログラニュリン抗体、前記抗プログラニュリン抗体を検出する二次抗体、ルミノール及び過酸化物を、キャピラリーカートリッジのウェルに充填することと、
    （３）前記キャピラリーカートリッジを自動ウエスタンブロットイムノアッセイ機器に装填することと、
    （４）前記自動ウエスタンブロットイムノアッセイ機器を使用して、シグナル強度、ピーク面積、及びシグナル対ノイズ比を計算することと、
    （５）前記ＣＳＦ試料におけるプログラニュリンタンパク質レベルを、免疫反応性の前記抗プログラニュリン抗体に対する前記ピーク面積として定量することと、を含む、前記方法。
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