JP7336730B2 - ライソゾーム病の遺伝子治療 - Google Patents

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Description

関連出願
本出願は、35 U.S.C. 119(e)の下で、２０１７年１０月３日に提出された米国仮出願第62/567,296号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」、２０１７年１０月３日に提出された第62/567,311号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」、２０１７年１０月３日に提出された第62/567,319号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」、２０１８年１０月３日に提出された第62/567,301号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」、および２０１７年１０月３日に提出された第62/567,310号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」の出願日の利益を主張する；これら各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
背景
ゴーシェ病は、リソソーム酸β－グルコセレブロシダーゼ（Ｇｃａｓｅ、「ＧＢＡ」）の欠損による、スフィンゴ糖脂質代謝の稀な先天性異常である。患者は、非ＣＮＳ症状ならびに、肝脾腫および、汎血球減少症、肺障害／線維症および骨欠損につながる骨髄不全を含む所見に苦しむ。さらに、かなりの数の患者が神経症状にも苦しみ、これには、断続性眼球運動と注視の異常、発作、認知障害、発達遅延、およびパーキンソン病を含む運動障害が含まれる。
末梢疾患および造血骨髄と内臓の主な臨床症状に対処するいくつかの治療法が存在し、これには、以下に記載の酵素補充療法、欠陥Ｇｃａｓｅに結合して安定性を改善するシャペロン様小分子薬、およびゴーシェ病において蓄積して症状や所見をもたらす基質の生成をブロックする基質抑制療法などが含まれる。しかし、ゴーシェ病の他の側面（特に、骨格および脳に影響を与えるもの）は、処置に不応性のようである。
概要
ゴーシェ病患者（ＧＢＡ１遺伝子の両方の染色体アレルに変異がある患者）に加えて、ＧＢＡ１の一方のアレルのみに変異がある患者は、パーキンソン病（ＰＤ）のリスクが非常に高くなる。ＰＤ症状－歩行困難、安静時の振戦、硬直、および多くの場合うつ病、睡眠困難、認知機能低下など－の重症度は、酵素活性の低下の程度と相関する。したがって、ゴーシェ病患者は最も重篤な経過をたどり、一方ＧＢＡ１に単一の軽度の変異を有する患者は、典型的にはより良性の経過をたどる。突然変異保有者は他のＰＤ関連疾患のリスクも高く、これには、実行機能障害、精神病、およびＰＤ様の運動障害を特徴とするレビー小体型認知症、および特徴的な運動および認知障害を伴う多系統萎縮症が含まれる。これらの疾患の容赦のない経過を変える治療法は存在しない。
Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１遺伝子の遺伝子産物）などの酵素、およびリソソーム機能またはリソソームへの高分子の輸送に関連する多くの遺伝子の一般的なバリアント（例：リソソーム膜タンパク質１（ＬＩＭＰ）、これはＳＣＡＲＢ２とも呼ばれる）の欠損は、ＰＤリスクの増加と関連付けられている。本開示は部分的に、１つ以上のＰＤ関連遺伝子、例えば、Ｇｃａｓｅ、ＧＢＡ２、プロサポシン、プログラニュリン、ＬＩＭＰ２、ＧＡＬＣ、ＣＴＳＢ、ＳＭＰＤ１、ＧＣＨ１、ＲＡＢ７、ＶＰＳ３５、ＩＬ－３４、ＴＲＥＭ２、ＴＭＥＭ１０６Ｂ、または前述のいずれかの組み合わせ（またはその一部）をコードする発現構築物（例えば、ベクター）に基づく。いくつかの態様において、本明細書に記載の遺伝子産物の組み合わせは、対象において発現された場合に、一緒に（例えば相乗的に）作用してＰＤの１つ以上の兆候および症状を軽減する。
したがって、いくつかの側面において、本開示は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）Ｇｃａｓｅコード配列を含む。いくつかの態様において、Ｇｃａｓｅをコードする核酸配列は、配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列NP_0014148.2に示されるもの）を含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号１５に示される配列を含む。いくつかの態様において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、例えば、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ
ＩＴＲを含む。
いくつかの側面において、本開示は、プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、単離発された核酸は、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）プロサポシンコード配列を含む。いくつかの態様において、プロサポシンをコードする核酸配列は、配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列NP_002769.1に示されるもの）を含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号１７に示される配列を含む。いくつかの態様において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、例えば、プロサポシンタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ
ＩＴＲを含む。
いくつかの側面において、本開示は、ＬＩＭＰ２／ＳＣＡＲＢ２（例えば、ＳＣＡＲＢ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）ＳＣＡＲＢ２コード配列を含む。いくつかの態様において、ＬＩＭＰ２／ＳＣＡＲＢ２をコードする核酸配列は、配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列NP_005497.1に示されるもの）を含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号２９に示される配列を含む。いくつかの態様において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＳＣＡＲＢ２タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ
ＩＴＲを含む。
いくつかの側面において、本開示は、ＧＢＡ２タンパク質（例えば、ＧＢＡ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）ＧＢＡ２コード配列を含む。いくつかの態様において、ＧＢＡ２をコードする核酸配列は、配列番号３０に示されるようなアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列NP_065995.1に示されるもの）を含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号３１に示される配列を含む。いくつかの態様において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＧＢＡ２タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ
ＩＴＲを含む。
いくつかの側面において、本開示は、ＧＡＬＣタンパク質（例えば、ＧＡＬＣ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）ＧＡＬＣコード配列を含む。いくつかの態様において、ＧＡＬＣをコードする核酸配列は、配列番号３３に示されるようなアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列NP_0014144.2に示されるもの）を含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号３４に示される配列を含む。いくつかの態様において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＧＡＬＣタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ
ＩＴＲを含む。
いくつかの側面において、本開示は、ＣＴＳＢタンパク質（例えば、ＣＴＳＢ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）ＣＴＳＢコード配列を含む。いくつかの態様において、ＣＴＳＢをコードする核酸配列は、配列番号３５に示されるようなアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列NP_001899.1に示されるもの）を含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号３６に示される配列を含む。いくつかの態様において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＣＴＳＢタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ
ＩＴＲを含む。
いくつかの側面において、本開示は、ＳＭＰＤ１タンパク質（例えば、ＳＭＰＤ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）ＳＭＰＤ１コード配列を含む。いくつかの態様において、ＳＭＰＤ１をコードする核酸配列は、配列番号３７に示されるようなアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列NP_000534.3に示されるもの）を含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号３８に示される配列を含む。いくつかの態様において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＣＴＳＢタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ
ＩＴＲを含む。
いくつかの側面において、本開示は、ＧＣＨ１タンパク質（例えば、ＧＣＨ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）ＧＣＨ１コード配列を含む。いくつかの態様において、ＧＣＨ１をコードする核酸配列は、配列番号４５に示されるようなアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列NP_000534.3に示されるもの）を含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号４６に示される配列を含む。いくつかの態様において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＧＣＨ１タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ
ＩＴＲを含む。
いくつかの側面において、本開示は、ＲＡＢ７Ｌタンパク質（例えば、ＲＡＢ７Ｌ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）ＲＡＢ７Ｌコード配列を含む。いくつかの態様において、ＲＡＢ７Ｌをコードする核酸配列は、配列番号４７に示されるようなアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列NP_003920.1に示されるもの）を含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号４８に示される配列を含む。いくつかの態様において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＲＡＢ７Ｌタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ
ＩＴＲを含む。
いくつかの側面において、本開示は、ＶＰＳ３５タンパク質（例えば、ＶＰＳ３５遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）ＶＰＳ３５コード配列を含む。いくつかの態様において、ＶＰＳ３５をコードする核酸配列は、配列番号４９に示されるようなアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列NP_060676.2に示されるもの）を含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号５０に示される配列を含む。いくつかの態様において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＶＰＳ３５タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ
ＩＴＲを含む。
いくつかの側面において、本開示は、ＩＬ－３４タンパク質（例えば、ＩＬ３４遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）ＩＬ－３４コード配列を含む。いくつかの態様において、ＩＬ－３４をコードする核酸配列は、配列番号５５に示されるようなアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列NP_689669.2に示されるもの）を含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号５６に示される配列を含む。いくつかの態様において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＩＬ＿３４タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ
ＩＴＲを含む。
いくつかの側面において、本開示は、ＴＲＥＭ２タンパク質（例えば、ＴＲＥＭ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）ＴＲＥＭ２コード配列を含む。いくつかの態様において、ＴＲＥＭ２をコードする核酸配列は、配列番号５７に示されるようなアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列NP_061838.1に示されるもの）を含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号５８に示される配列を含む。いくつかの態様において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＴＲＥＭ２タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ
ＩＴＲを含む。
いくつかの側面において、本開示は、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質（例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）ＴＭＥＭ１０６Ｂコード配列を含む。いくつかの態様において、ＴＭＥＭ１０６Ｂをコードする核酸配列は、配列番号６３に示されるようなアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列NP_060844.2に示されるもの）を含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号６４に示される配列を含む。いくつかの態様において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ
ＩＴＲを含む。
いくつかの側面において、本開示は、プログラニュリン（例えば、ＰＧＲＮ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）プロサポシンコード配列を含む。いくつかの態様において、プログラニュリン（ＰＲＧＮ）をコードする核酸配列は、配列番号６７に示されるようなアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列NP_002078.1に示されるもの）を含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号６８に示される配列を含む。いくつかの態様において、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）、例えば、プロサポシンタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ
ＩＴＲを含む。
いくつかの側面において、本開示は、第１の遺伝子産物および第２の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供し、ここで各遺伝子産物は独立して、表１に示される遺伝子産物またはその一部から選択される。
いくつかの態様において、第１の遺伝子産物または第２の遺伝子産物は、Ｇｃａｓｅタンパク質またはその一部である。いくつかの態様において、第１の遺伝子産物はＧｃａｓｅタンパク質であり、第２の遺伝子産物は、ＧＢＡ２、プロサポシン、プログラニュリン、ＬＩＭＰ２、ＧＡＬＣ、ＣＴＳＢ、ＳＭＰＤ１、ＧＣＨ１、ＲＡＢ７、ＶＰＳ３５、ＩＬ－３４、ＴＲＥＭ２、およびＴＭＥＭ１０６Ｂから選択される。
いくつかの態様において、発現構築物はさらに、干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）をコードする。いくつかの態様において、干渉核酸は、α－シヌクレイン（α－シヌクレイン）の発現を阻害する。いくつかの態様において、α－シヌクレインを標的とする干渉核酸は、配列番号２０～２５のいずれか１つに示される配列を含む。いくつかの態様において、α－シヌクレインを標的とする干渉核酸は、配列番号２０～２５のいずれか１つに示される配列に結合する（例えば、ハイブリダイズする）。
いくつかの態様において、干渉核酸は、ＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を阻害する。いくつかの態様において、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする干渉核酸は、配列番号６４または６５に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする干渉核酸は、配列番号６４または６５に示される配列に結合する（例えば、ハイブリダイズする）。
いくつかの態様において、発現構築物はさらに、１つ以上のプロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターは、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、ＲＮＡ
ｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、またはＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６など））である。
いくつかの態様において、発現構築物はさらに、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。いくつかの態様において、ＩＲＥＳは、第１の遺伝子産物と第２の遺伝子産物の間に位置する。
いくつかの態様において、発現構築物はさらに、自己切断型ペプチドコード配列を含む。いくつかの態様において、自己切断型ペプチドは、Ｔ２Ａペプチドである。
いくつかの態様において、発現構築物は、２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。いくつかの態様において、ＩＴＲ配列は、第１の遺伝子産物および第２の遺伝子産物に隣接する（例えば、５’末端から３’末端へと次のように配置される：ＩＴＲ－第１遺伝子産物－第２遺伝子産物－ＩＴＲ）。いくつかの態様において、単離された核酸のＩＴＲ配列の１つは、機能的な末端分解部位（ｔｒｓ）を欠いている。例えば、いくつかの態様において、ＩＴＲの１つはΔＩＴＲである。
本開示は、いくつかの側面において、修飾された「Ｄ」領域（例えば、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ、配列番号２９と比べて修飾されたＤ配列）を有するＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターに関する。いくつかの態様において、修飾Ｄ領域を有するＩＴＲは、ｒＡＡＶベクターの５’ＩＴＲである。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」領域は、例えば配列番号２６に示されるような「Ｓ」配列を含む。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」領域を有するＩＴＲは、ｒＡＡＶベクターの３’ＩＴＲである。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」領域は３’ＩＴＲを含み、ここで「Ｄ」領域は、ＩＴＲの３’末端（例えば、ベクターの導入遺伝子インサートに対してＩＴＲの外側または末端）に位置する。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」領域は、配列番号２６または２７に示されるような配列を含む。
いくつかの態様において、単離された核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、ＴＲＹ領域を含む。いくつかの態様において、ＴＲＹ領域は、配列番号２８に示される配列を含む。
いくつかの態様において、本開示に記載の単離された核酸は、配列番号１～７８のいずれか１つに示される配列を有するペプチドを含むか、またはそれからなるか、またはそれをコードする。
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターまたはバキュロウイルスベクターである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは一本鎖（例えば、一本鎖ＤＮＡ）である。
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の単離された核酸または本開示に記載のベクターを含む、宿主細胞を提供する。
いくつかの側面において、本開示は、カプシドタンパク質および本開示に記載の単離された核酸またはベクターを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は血液脳関門を通過することができ、例えば、ＡＡＶ９カプシドタンパク質またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞および非神経細胞を形質導入する。
いくつかの側面において、本開示は、パーキンソン病を有するかまたは有すると疑われる対象を処置する方法を提供し、該方法は、対象に、本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を投与することを含む。
いくつかの態様において、投与は、対象のＣＮＳへの直接注射を含む。いくつかの態様において、直接注射は、脳内注射、実質内注射、髄腔内注射、大槽内注射、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様において、対象のＣＮＳへの直接注射は、対流強化送達（ＣＥＤ）を含む。
いくつかの態様において、投与は末梢注射を含む。いくつかの態様において、末梢注射は静脈内注射である。
図１は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。 図２は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびＬＩＭＰ２（ＳＣＡＲＢ２）またはその一部をコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。ＧｃａｓｅおよびＬＩＭＰ２のコード配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている。 図３は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびＬＩＭＰ２（ＳＣＡＲＢ２）またはその一部をコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。ＧｃａｓｅおよびＬＩＭＰ２のコード配列の発現は、それぞれ別のプロモーターによって駆動される。
図４は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、ＬＩＭＰ２（ＳＣＡＲＢ２）またはその一部、およびα－Ｓｙｎの干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。 図５は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰまたはその一部）、およびα－Ｓｙｎの干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。 図６は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびプロサポシン（例えば、ＰＳＡＰまたはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。Ｇｃａｓｅおよびプロサポシンのコード配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている。
図７は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。この態様においてベクターは、４つの部分：ＣＭＶエンハンサー（ＣＭＶｅ）、ＣＢＡプロモーター（ＣＢＡｐ）、エクソン１、およびイントロン（ｉｎｔ）からなるＣＢＡプロモーター要素（ＣＢＡ）を含み、ヒトＧＢＡ１のコドン最適化コード配列を構成的に発現する。３’領域には、ＷＰＲＥ調節要素とそれに続くｂＧＨポリＡテールも含まれている。プロモーター領域の５’末端には、ＴＡＴＡ、ＲＢＳ、ＹＹ１の３つの転写調節活性化部位が含まれている。隣接するＩＴＲは、介在する配列の正しいパッケージングを可能にする。５’ＩＴＲ配列の２つのバリアント（挿入ボックス）を評価した；これらは、野生型ＡＡＶ２ＩＴＲの２０ヌクレオチドの「Ｄ」領域内にいくつかのヌクレオチドの違いを有する。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、最上行に示される「Ｄ」ドメインヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、変異体「Ｄ」ドメイン（例えば、「Ｓ」ドメインであり、ヌクレオチドの変化が最下行に示されている）を含む。
図８は、図６に記載されたベクターの一態様を示す概略図である。 図９は、パーキンソン病のＣＢＥマウスモデルにおける、Ｇｃａｓｅ（例えばＧＢＡ１またはその一部）をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶの送達に関する、代表的なデータを示す。ＰＢＳビヒクル、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ、３７．５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ、または５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ（左から右）の毎日のＩＰ送達は、Ｐ８で開始した。生存率（左上）は１日２回チェックし、体重（右上）を毎日チェックした。すべての群はｎ＝８で開始した。行動は、オープンフィールド（左下）を移動した総距離をＰ２３で、ロータロッド（中央下）での落下までの時間をＰ２４で評価した。ＧＣａｓｅ基質のレベルを、ＰＢＳおよび２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ処置群において、ＣＢＥ中止あり（３日目）となし（１日目）の両方のマウスの皮質で分析した。総ＧｌｕＳｐｈ＆ＧａｌＳｐｈレベル（右下）は、組織の湿重量１ｍｇあたりのｐｍｏｌとして表示する。平均値を提示する。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、線形回帰による処置群の公称ｐ値。 図９は、パーキンソン病のＣＢＥマウスモデルにおける、Ｇｃａｓｅ（例えばＧＢＡ１またはその一部）をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶの送達に関する、代表的なデータを示す。ＰＢＳビヒクル、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ、３７．５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ、または５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ（左から右）の毎日のＩＰ送達は、Ｐ８で開始した。生存率（左上）は１日２回チェックし、体重（右上）を毎日チェックした。すべての群はｎ＝８で開始した。行動は、オープンフィールド（左下）を移動した総距離をＰ２３で、ロータロッド（中央下）での落下までの時間をＰ２４で評価した。ＧＣａｓｅ基質のレベルを、ＰＢＳおよび２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ処置群において、ＣＢＥ中止あり（３日目）となし（１日目）の両方のマウスの皮質で分析した。総ＧｌｕＳｐｈ＆ＧａｌＳｐｈレベル（右下）は、組織の湿重量１ｍｇあたりのｐｍｏｌとして表示する。平均値を提示する。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、線形回帰による処置群の公称ｐ値。
図１０は、ＣＢＥマウスモデルにおける、最大ｒＡＡＶ用量のための研究デザインの一態様を示す概略図である。簡潔に述べると、ｒＡＡＶはＩＣＶ注射によりＰ３で送達し、毎日のＣＢＥ処置はＰ８で開始した。行動はオープンフィールドおよびロータロッドアッセイによりＰ２４～２５で評価し、基質レベルはＰ３６およびＰ３８で測定した。 図１１は、ＣＢＥマウスモデルにおける、最大ｒＡＡＶ用量の生存評価のための代表的なデータを示す。Ｐ３において、マウスを、賦形剤または８．８ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１のいずれかで、ＩＣＶ送達を介して処置した。ＰＢＳまたは２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥの毎日のＩＰ送達を、Ｐ８で開始した。研究の最後に、マウスの半分を最後のＣＢＥ投与の１日後にＰ３６（１日目）で犠牲にし、一方残りの半分は、Ｐ３８（３日目）で犠牲にする前に、３日間のＣＢＥの中止を経た。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ：ｎ＝８、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＰＢＳ：ｎ＝７、賦形剤＋ＣＢＥ：ｎ＝８、およびバリアント＋ＣＢＥ：ｎ＝９）を、毎日計量し（左上）、Ｐ３６での体重を分析した（右上）。行動は、オープンフィールドを移動した総距離をＰ２３で（左下）、ロータロッドでの落下までの時間をＰ２４で（右下）評価し、各動物について３回の試験の中央値として評価した。致死性のため、行動アッセイの賦形剤＋ＣＢＥ群においてｎ＝７であり、その他すべての群においてｎ＝８である。動物にわたる平均値を表示する。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置動物での線形回帰による処置群の公称ｐ値。 図１１は、ＣＢＥマウスモデルにおける、最大ｒＡＡＶ用量の生存評価のための代表的なデータを示す。Ｐ３において、マウスを、賦形剤または８．８ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１のいずれかで、ＩＣＶ送達を介して処置した。ＰＢＳまたは２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥの毎日のＩＰ送達を、Ｐ８で開始した。研究の最後に、マウスの半分を最後のＣＢＥ投与の１日後にＰ３６（１日目）で犠牲にし、一方残りの半分は、Ｐ３８（３日目）で犠牲にする前に、３日間のＣＢＥの中止を経た。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ：ｎ＝８、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＰＢＳ：ｎ＝７、賦形剤＋ＣＢＥ：ｎ＝８、およびバリアント＋ＣＢＥ：ｎ＝９）を、毎日計量し（左上）、Ｐ３６での体重を分析した（右上）。行動は、オープンフィールドを移動した総距離をＰ２３で（左下）、ロータロッドでの落下までの時間をＰ２４で（右下）評価し、各動物について３回の試験の中央値として評価した。致死性のため、行動アッセイの賦形剤＋ＣＢＥ群においてｎ＝７であり、その他すべての群においてｎ＝８である。動物にわたる平均値を表示する。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置動物での線形回帰による処置群の公称ｐ値。 図１１は、ＣＢＥマウスモデルにおける、最大ｒＡＡＶ用量の生存評価のための代表的なデータを示す。Ｐ３において、マウスを、賦形剤または８．８ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１のいずれかで、ＩＣＶ送達を介して処置した。ＰＢＳまたは２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥの毎日のＩＰ送達を、Ｐ８で開始した。研究の最後に、マウスの半分を最後のＣＢＥ投与の１日後にＰ３６（１日目）で犠牲にし、一方残りの半分は、Ｐ３８（３日目）で犠牲にする前に、３日間のＣＢＥの中止を経た。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ：ｎ＝８、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＰＢＳ：ｎ＝７、賦形剤＋ＣＢＥ：ｎ＝８、およびバリアント＋ＣＢＥ：ｎ＝９）を、毎日計量し（左上）、Ｐ３６での体重を分析した（右上）。行動は、オープンフィールドを移動した総距離をＰ２３で（左下）、ロータロッドでの落下までの時間をＰ２４で（右下）評価し、各動物について３回の試験の中央値として評価した。致死性のため、行動アッセイの賦形剤＋ＣＢＥ群においてｎ＝７であり、その他すべての群においてｎ＝８である。動物にわたる平均値を表示する。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置動物での線形回帰による処置群の公称ｐ値。
図１２は、ＣＢＥマウスモデルにおける、最大ｒＡＡＶ用量の生化学的評価のための代表的なデータを示す。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ：ｎ＝８、バリアント＋ＰＢＳ：ｎ＝７、賦形剤＋ＣＢＥ：ｎ＝７、バリアント＋ＣＢＥ：ｎ＝９）の皮質を使用して、ＣＢＥ中止の前（１日目）または後（３日目）の群における、ＧＣａｓｅ活性（左上）、ＧｌｕＳｐｈレベル（右上）、ＧｌｕＣｅｒレベル（左下）、およびベクターゲノム（右下）を測定した。生体内分布は、ゲノムＤＮＡ１μｇあたりのベクターゲノムとして表示する。平均値を表示する。エラーバーはＳＥＭである。（＊）ｐ＜０．１；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置動物での線形回帰による処置群の公称ｐ値、収集日と性差を共変量とした補正あり。 図１２は、ＣＢＥマウスモデルにおける、最大ｒＡＡＶ用量の生化学的評価のための代表的なデータを示す。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ：ｎ＝８、バリアント＋ＰＢＳ：ｎ＝７、賦形剤＋ＣＢＥ：ｎ＝７、バリアント＋ＣＢＥ：ｎ＝９）の皮質を使用して、ＣＢＥ中止の前（１日目）または後（３日目）の群における、ＧＣａｓｅ活性（左上）、ＧｌｕＳｐｈレベル（右上）、ＧｌｕＣｅｒレベル（左下）、およびベクターゲノム（右下）を測定した。生体内分布は、ゲノムＤＮＡ１μｇあたりのベクターゲノムとして表示する。平均値を表示する。エラーバーはＳＥＭである。（＊）ｐ＜０．１；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置動物での線形回帰による処置群の公称ｐ値、収集日と性差を共変量とした補正あり。 図１３は、ＣＢＥマウスモデルにおける行動的および生化学的相関の、賦形剤＋ＰＢＳ、賦形剤＋ＣＢＥ、およびバリアント＋ＣＢＥ処置群の投与後の代表的なデータを示す。処置群全体で、ロータロッドのパフォーマンスはＧｌｕＣｅｒの蓄積と負の相関があり（Ａ、線形回帰によるｐ＝０．００１２）、ＧｌｕＳｐｈの蓄積はＧＣａｓｅ活性の増加と負の相関があった（Ｂ、線形回帰によるｐ＝０．００８６）。
図１４は、ＣＢＥマウスモデルにおけるバリアントの生体内分布の代表的なデータを示す。ベクターゲノムの存在を、すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ：ｎ＝８、バリアント＋ＰＢＳ：ｎ＝７、賦形剤＋ＣＢＥ：ｎ＝７、およびバリアント＋ＣＢＥ：ｎ＝９）の肝臓、脾臓、腎臓、および生殖腺で評価した。生体内分布は、ゲノムＤＮＡ１μｇあたりのベクターゲノムとして表示する。ベクターゲノムの存在は、定量ＰＣＲによりベクター参照標準曲線を使用して定量化した；ゲノムＤＮＡ濃度は、Ａ２６０光学密度測定によって評価した。平均値を表示する。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置動物での線形回帰による処置群の公称ｐ値、収集日と性差を共変量とした補正あり。 図１４は、ＣＢＥマウスモデルにおけるバリアントの生体内分布の代表的なデータを示す。ベクターゲノムの存在を、すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ：ｎ＝８、バリアント＋ＰＢＳ：ｎ＝７、賦形剤＋ＣＢＥ：ｎ＝７、およびバリアント＋ＣＢＥ：ｎ＝９）の肝臓、脾臓、腎臓、および生殖腺で評価した。生体内分布は、ゲノムＤＮＡ１μｇあたりのベクターゲノムとして表示する。ベクターゲノムの存在は、定量ＰＣＲによりベクター参照標準曲線を使用して定量化した；ゲノムＤＮＡ濃度は、Ａ２６０光学密度測定によって評価した。平均値を表示する。エラーバーはＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置動物での線形回帰による処置群の公称ｐ値、収集日と性差を共変量とした補正あり。
図１５は、ＣＢＥマウスモデルにおける、ｒＡＡＶ用量範囲の生存評価のための代表的なデータを示す。マウスに、賦形剤またはｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の３つの異なる用量：３．２ｅ９ｖｇ、１．０ｅ１０ｖｇ、または３．２ｅ１０ｖｇの１つを、ＩＣＶ送達によりＰ３で投与した。Ｐ８で、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥの毎日のＩＰ処置を開始した。賦形剤とＣＢＥまたは賦形剤とＰＢＳを投与したマウスを対照とした。すべての処置群は、群あたりｎ＝１０（５Ｍ／５Ｆ）で開始した。すべてのマウスを、ＣＢＥの最終投与（Ｐ３８～Ｐ４０）の１日後に犠牲にした。すべての処置群の体重を毎日測定し、その体重をＰ３６で分析した。運動パフォーマンスは、Ｐ２４でのロータロッドで落下するまでの時間、およびＰ３０でのテーパ梁の横断時間により、評価した。初期の致死性のため、行動アッセイに参加したマウスの数は以下である：賦形剤＋ＰＢＳ：ｎ＝１０、賦形剤＋ＣＢＥ：ｎ＝９、および３．２ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ：ｎ＝６、１．０ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ：ｎ＝１０、３．２ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ：ｎ＝７。平均値を表示する。エラーバーはＳＥＭである；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、ＣＢＥ処置動物での線形回帰による公称ｐ値、性差を共変量とした補正あり。 図１５は、ＣＢＥマウスモデルにおける、ｒＡＡＶ用量範囲の生存評価のための代表的なデータを示す。マウスに、賦形剤またはｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の３つの異なる用量：３．２ｅ９ｖｇ、１．０ｅ１０ｖｇ、または３．２ｅ１０ｖｇの１つを、ＩＣＶ送達によりＰ３で投与した。Ｐ８で、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥの毎日のＩＰ処置を開始した。賦形剤とＣＢＥまたは賦形剤とＰＢＳを投与したマウスを対照とした。すべての処置群は、群あたりｎ＝１０（５Ｍ／５Ｆ）で開始した。すべてのマウスを、ＣＢＥの最終投与（Ｐ３８～Ｐ４０）の１日後に犠牲にした。すべての処置群の体重を毎日測定し、その体重をＰ３６で分析した。運動パフォーマンスは、Ｐ２４でのロータロッドで落下するまでの時間、およびＰ３０でのテーパ梁の横断時間により、評価した。初期の致死性のため、行動アッセイに参加したマウスの数は以下である：賦形剤＋ＰＢＳ：ｎ＝１０、賦形剤＋ＣＢＥ：ｎ＝９、および３．２ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ：ｎ＝６、１．０ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ：ｎ＝１０、３．２ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ：ｎ＝７。平均値を表示する。エラーバーはＳＥＭである；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、ＣＢＥ処置動物での線形回帰による公称ｐ値、性差を共変量とした補正あり。
図１６は、ＣＢＥマウスモデルにおける、ｒＡＡＶ用量範囲の生化学的評価のための代表的なデータを示す。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ：ｎ＝１０、賦形剤＋ＣＢＥ：ｎ＝９、および３．２ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ：ｎ＝６、１．０ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ：ｎ＝１０、３．２ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ：ｎ＝７）の皮質を使用して、ＧＣａｓｅ活性、ＧｌｕＳｐｈレベル、ＧｌｕＣｅｒレベル、およびベクターゲノムを測定した。ＧＣａｓｅ活性は、総タンパク質１ｍｇあたりのＧＣａｓｅのｎｇとして示す。ＧｌｕＳｐｈおよびＧｌｕＣｅｒレベルは、組織の湿重量１ｍｇあたりのｐｍｏｌとして示す。生体内分布は、ゲノムＤＮＡ１μｇあたりのベクターゲノムとして示す。ベクターゲノムの存在は、定量ＰＣＲによりベクター参照標準曲線を使用して定量化した；ゲノムＤＮＡ濃度は、Ａ２６０光学密度測定によって評価した。ベクターゲノムの存在は肝臓でも測定した（Ｅ）。平均値を表示する。エラーバーはＳＥＭである。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置動物での線形回帰による公称ｐ値、性差を共変量とした補正あり。 図１６は、ＣＢＥマウスモデルにおける、ｒＡＡＶ用量範囲の生化学的評価のための代表的なデータを示す。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ：ｎ＝１０、賦形剤＋ＣＢＥ：ｎ＝９、および３．２ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ：ｎ＝６、１．０ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ：ｎ＝１０、３．２ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ：ｎ＝７）の皮質を使用して、ＧＣａｓｅ活性、ＧｌｕＳｐｈレベル、ＧｌｕＣｅｒレベル、およびベクターゲノムを測定した。ＧＣａｓｅ活性は、総タンパク質１ｍｇあたりのＧＣａｓｅのｎｇとして示す。ＧｌｕＳｐｈおよびＧｌｕＣｅｒレベルは、組織の湿重量１ｍｇあたりのｐｍｏｌとして示す。生体内分布は、ゲノムＤＮＡ１μｇあたりのベクターゲノムとして示す。ベクターゲノムの存在は、定量ＰＣＲによりベクター参照標準曲線を使用して定量化した；ゲノムＤＮＡ濃度は、Ａ２６０光学密度測定によって評価した。ベクターゲノムの存在は肝臓でも測定した（Ｅ）。平均値を表示する。エラーバーはＳＥＭである。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、ＣＢＥ処置動物での線形回帰による公称ｐ値、性差を共変量とした補正あり。
図１７は、遺伝子マウスモデルにおける、最大用量ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１でのテーパ梁分析の代表的なデータを示す。処置群（ＷＴ＋賦形剤、（ｎ＝５）、４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋賦形剤（ｎ＝６）、および４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１（ｎ＝５））の運動パフォーマンスを、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１投与後４週間での梁歩行によって分析した。合計スリップおよび活性時間は、異なる梁での５回の試行の平均として示す。速度および速度当たりのスリップは、異なる梁での５回の試行の平均として示す。平均値を表示する。エラーバーはＳＥＭである。 図１７は、遺伝子マウスモデルにおける、最大用量ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１でのテーパ梁分析の代表的なデータを示す。処置群（ＷＴ＋賦形剤、（ｎ＝５）、４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋賦形剤（ｎ＝６）、および４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１（ｎ＝５））の運動パフォーマンスを、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１投与後４週間での梁歩行によって分析した。合計スリップおよび活性時間は、異なる梁での５回の試行の平均として示す。速度および速度当たりのスリップは、異なる梁での５回の試行の平均として示す。平均値を表示する。エラーバーはＳＥＭである。 図１８は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするｒＡＡＶ構築物のin vitro発現についての代表的なデータを示す。左のパネルは、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）ＥＬＩＳＡアッセイの標準曲線を示す。下のパネルは、ｒＡＡＶで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解物においてＥＬＩＳＡアッセイにより測定された、ＰＧＲＮ発現の用量反応を示す。ＭＯＩ＝感染の多重度（細胞あたりのベクターゲノム）。
図１９は、プロサポシン（ＰＳＡＰ）、ＳＣＡＲＢ２、および／または１つ以上の阻害性核酸と組み合わせてＧＢＡ１をコードするｒＡＡＶ構築物のin vitro発現についての、代表的なデータを示す。データは、各構築物によるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、モックトランスフェクトされた細胞と比べて、目的の導入遺伝子の過剰発現をもたらしたことを示す。 図１９は、プロサポシン（ＰＳＡＰ）、ＳＣＡＲＢ２、および／または１つ以上の阻害性核酸と組み合わせてＧＢＡ１をコードするｒＡＡＶ構築物のin vitro発現についての、代表的なデータを示す。データは、各構築物によるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、モックトランスフェクトされた細胞と比べて、目的の導入遺伝子の過剰発現をもたらしたことを示す。 図１９は、プロサポシン（ＰＳＡＰ）、ＳＣＡＲＢ２、および／または１つ以上の阻害性核酸と組み合わせてＧＢＡ１をコードするｒＡＡＶ構築物のin vitro発現についての、代表的なデータを示す。データは、各構築物によるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、モックトランスフェクトされた細胞と比べて、目的の導入遺伝子の過剰発現をもたらしたことを示す。 図２０は、ＩＴＲの「外側」（例えば、導入遺伝子インサートまたは発現構築物と比べてＩＴＲの末端の近位）に位置する「Ｄ」領域を含むｒＡＡＶベクター（上）、およびＩＴＲをベクターの「内側」（例えば、ベクターの導入遺伝子インサートの近位）に有する野生型ｒＡＡＶベクターを示す概略図である。
図２１は、ＧＢＡ２またはその一部、およびα－Ｓｙｎの干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。 図２２は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびガラクトシルセラミダーゼ（例えば、ＧＡＬＣまたはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。Ｇｃａｓｅおよびガラクトシルセラミダーゼのコード配列の発現は、Ｔ２Ａ自己切断型ペプチド配列によって分離されている。 図２３は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびガラクトシルセラミダーゼ（例えば、ＧＡＬＣまたはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。Ｇｃａｓｅおよびガラクトシルセラミダーゼのコード配列の発現は、Ｔ２Ａ自己切断型ペプチド配列によって分離されている。
図２４は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、カテプシンＢ（例えば、ＣＴＳＢまたはその一部）、およびα－Ｓｙｎの干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。ＧｃａｓｅおよびカテプシンＢのコード配列の発現は、Ｔ２Ａ自己切断型ペプチド配列によって分離されている。 図２５は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１（例えば、ＳＭＰＤ１、その一部）、およびα－Ｓｙｎの干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。 図２６は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびガラクトシルセラミダーゼ（例えば、ＧＡＬＣまたはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。Ｇｃａｓｅおよびガラクトシルセラミダーゼのコード配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている。
図２７は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびカテプシンＢ（例えば、ＣＴＳＢまたはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。ＧｃａｓｅおよびカテプシンＢのコード配列の発現は、それぞれ別のプロモーターによって駆動される。 図２８は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、ＧＣＨ１（例えば、ＧＣＨ１またはその一部）、およびα－Ｓｙｎの干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。ＧｃａｓｅおよびＧＣＨ１のコード配列は、Ｔ２Ａ自己切断型ペプチド配列によって分離されている。 図２９は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、ＲＡＢ７Ｌ１（例えば、ＲＡＢ７Ｌ１またはその一部）、およびα－Ｓｙｎの干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。ＧｃａｓｅおよびＲＡＢ７Ｌ１のコード配列は、Ｔ２Ａ自己切断型ペプチド配列によって分離されている。
図３０は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、ＧＣＨ１（例えば、ＧＣＨ１またはその一部）、およびα－Ｓｙｎの干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。ＧｃａｓｅおよびＧＣＨ１のコード配列の発現は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。 図３１は、ＶＰＳ３５（例えば、ＶＰＳ３５またはその一部）およびα－ＳｙｎとＴＭＥＭ１０６Ｂの干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。 図３２は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、ＩＬ－３４（例えば、ＩＬ３４またはその一部）、およびα－Ｓｙｎの干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。ＧｃａｓｅおよびＩＬ－３４のコード配列は、Ｔ２Ａ自己切断型ペプチド配列によって分離されている。
図３３は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびＩＬ－３４（例えば、ＩＬ３４またはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。ＧｃａｓｅおよびＩＬ－３４のコード配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている。 図３４は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびＴＲＥＭ２（例えば、ＴＲＥＭ２またはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。ＧｃａｓｅおよびＴＲＥＭ２のコード配列の発現は、それぞれ別のプロモーターによって駆動される。
図３５は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびＩＬ－３４（例えば、ＩＬ３４またはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。ＧｃａｓｅおよびＩＬ－３４のコード配列の発現は、それぞれ別のプロモーターによって駆動される。 図３６Ａ～３６Ｂは、ｑＰＣＲおよびＥＬＩＳＡで測定され、対照の形質導入細胞と比較した、ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＲＥＭ２およびＧＢＡ１の過剰発現についての代表的なデータを示す。図３６Ａは、ＴＲＥＭ２の過剰発現についてのデータを示す。図３６Ｂは、同じ構築物からのＧＢＡ１の過剰発現についてのデータを示す。
図３７は、ＧＦＰレポーターアッセイ（上）およびα－Ｓｙｎアッセイ（下）による、in vitroでのＳＣＮＡの成功したサイレンシングを示す代表的なデータを示す。 図３８は、ＧＦＰレポーターアッセイ（上）およびα－Ｓｙｎアッセイ（下）による、in vitroでのＴＭＥＭ１０６Ｂの成功したサイレンシングを示す代表的なデータを示す。 図３９は、ＰＧＲＮをコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。 図４０は、野生型（丸）のＩＴＲ、または「Ｄ」配列の代替（例えば、「外側」；四角）配置のＩＴＲを有するｒＡＡＶを使用した、ＨＥＫ２９３細胞の形質導入のデータを示す。「外側」に配置されたＩＴＲを有するｒＡＡＶは、野生型ＩＴＲを有するｒＡＡＶと同程度に効率的に、細胞を形質導入することができた。
詳細な説明
本開示は部分的に、対象におけるＰＤ関連遺伝子産物の組み合わせの発現のための、組成物および方法に基づく。遺伝子産物は、タンパク質、タンパク質の断片（例えば、一部）、ＰＤ関連遺伝子を阻害する干渉核酸などであり得る。いくつかの態様において、遺伝子産物は、ＰＤ関連遺伝子によってコードされるタンパク質またはタンパク質断片である。いくつかの態様において、遺伝子産物は、ＰＤ関連遺伝子を阻害する干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）である。
ＰＤ関連遺伝子とは、遺伝的、生化学的または機能的にＰＤに関連する遺伝子産物をコードする遺伝子を指す。例えば、ＧＢＡ１遺伝子（これはタンパク質Ｇｃａｓｅをコードする）に変異のある個体は、ＧＢＡ１に変異がない個体と比べて、ＰＤ発症のリスクが高いことが観察されている。別の例において、ＰＤは、α－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）タンパク質を含むタンパク質凝集体の蓄積に関連する；したがって、ＳＣＮＡ（これはα－Ｓｙｎをコードする）は、ＰＤ関連遺伝子である。いくつかの態様において、本明細書に記載の発現カセットは、ＰＤ関連遺伝子（またはそのコード配列）の野生型または非変異型形態をコードする。ＰＤ関連遺伝子の例を、表１に列挙する。
単離された核酸およびベクター
単離された核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。本開示は、いくつかの側面において、１つ以上のＰＤ関連遺伝子、例えばＧｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１遺伝子の遺伝子産物）またはその一部をコードする発現構築物を含む、単離された核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）を提供する。β－グルコセレブロシダーゼまたはＧＢＡとも呼ばれるＧｃａｓｅは、糖脂質代謝の中間体である化学物質グルコセレブロシドのβ－グルコシド結合を切断する、リソソームタンパク質を指す。ヒトにおいて、Ｇｃａｓｅは、１番染色体にあるＧＢＡ１遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、ＧＢＡ１は、ＮＣＢＩ参照配列NP_000148.2（配列番号１４）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号１５に示される配列などの、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）Ｇｃａｓｅコード配列を含む。
いくつかの側面において、本開示は、プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供する。プロサポシンは、スフィンゴ脂質活性化タンパク質（サポシン）Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの前駆体糖タンパク質であり、短いオリゴ糖グループを持つスフィンゴ糖脂質の異化を促進する。ヒトにおいて、ＰＳＡＰ遺伝子は１０番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＰＳＡＰは、ＮＣＢＩ参照配列NP_002769.1（例えば、配列番号１６）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号１７に示される配列などの、コドン最適化された（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された）プロサポシンコード配列を含む。
本開示の側面は、ＬＩＭＰ２／ＳＣＡＲＢ２（例えば、ＳＣＡＲＢ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＳＣＡＲＢ２は、細胞内のリソソームおよびエンドソーム輸送を調節する膜タンパク質を指す。ヒトにおいて、ＳＣＡＲＢ２遺伝子は４番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＳＣＡＲＢ２遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_005497.1（配列番号１８）で表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号１９に示される配列を含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化されたＳＣＡＲＢ２コード配列を含む。
本開示の側面は、ＧＢＡ２タンパク質（例えば、ＧＢＡ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＧＢＡ２タンパク質は、非リソソームグルコシルセラミダーゼを指す。ヒトにおいて、ＧＢＡ２遺伝子は９番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＧＢＡ２遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_065995.1（配列番号３０）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号３１に示される配列を含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化されたＧＢＡ２コード配列を含む。
本開示の側面は、ＧＡＬＣタンパク質（例えば、ＧＡＬＣ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＧＡＬＣタンパク質は、ガラクトセレブロシド、ガラクトシルスフィンゴシン、ラクトシルセラミド、およびモノガラクトシルジグリセリドのガラクトースエステル結合を加水分解する酵素である、ガラクトシルセラミダーゼ（またはガラクトセレブロシダーゼ）を指す。ヒトにおいて、ＧＡＬＣ遺伝子は１４番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＧＡＬＣ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_000144.2（配列番号３３）で表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号３４に示される配列を含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化されたＧＡＬＣコード配列を含む。
本開示の側面は、ＣＴＳＢタンパク質（例えば、ＣＴＳＢ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＣＴＳＢタンパク質は、細胞内タンパク質分解に重要な役割を果たす、リソソームのシステインプロテアーゼであるカテプシンＢを指す。ヒトにおいて、ＣＴＳＢ遺伝子は８番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＣＴＳＢ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_001899.1（配列番号３５）で表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号３６に示される配列を含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化されたＣＴＳＢコード配列を含む。
本開示の側面は、ＳＭＰＤ１タンパク質（例えば、ＳＭＰＤ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＳＭＰＤ１タンパク質は、スフィンゴ脂質代謝に関与する加水分解酵素である、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１を指す。ヒトにおいて、ＳＭＰＤ１遺伝子は１１番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＳＭＰＤ１遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_000534.3（配列番号３７）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号３８に示される配列を含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化されたＳＭＰＤ１コード配列を含む。
本開示の側面は、ＧＣＨ１タンパク質（例えば、ＧＣＨ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＧＣＨ１タンパク質は、葉酸およびビオプテリンの生合成経路の一部である加水分解酵素である、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩを指す。ヒトにおいて、ＧＣＨ１遺伝子は１４番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＧＣＨ１遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_000152.1（配列番号４５）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号４６に示される配列を含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化されたＧＣＨ１コード配列を含む。
本開示の側面は、ＲＡＢ７Ｌタンパク質（例えば、ＲＡＢ７Ｌ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＲＡＢ７Ｌタンパク質は、ＧＴＰ結合タンパク質である、ＲＡＳ発がん遺伝子ファミリー様１のメンバーであるＲＡＢ７を指す。ヒトにおいて、ＲＡＢ７Ｌ遺伝子は１番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＲＡＢ７Ｌ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_003920.1（配列番号４７）で表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号４８に示される配列を含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化されたＲＡＢ７Ｌコード配列を含む。
本開示の側面は、ＶＰＳ３５タンパク質（例えば、ＶＰＳ３５遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＶＰＳ３５タンパク質は、液胞タンパク質分類関連タンパク質３５を指し、これはエンドソームからトランスゴルジネットワークへのタンパク質の逆行性輸送に関与するタンパク質複合体の一部である。ヒトにおいて、ＶＰＳ３５遺伝子は１６番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＶＰＳ３５遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_060676.2（配列番号４９）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号５０に示される配列を含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化されたＶＰＳ３５コード配列を含む。
本開示の側面は、ＩＬ－３４タンパク質（例えば、ＩＬ３４遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＩＬ－３４タンパク質は、単球の成長および生存を増加させるサイトカインである、インターロイキン３４を指す。ヒトにおいて、ＩＬ３４遺伝子は１６番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＩＬ３４遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_689669.2（配列番号５５）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号５６に示される配列を含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化されたＩＬ－３４コード配列を含む。
本開示の側面は、ＴＲＥＭ２タンパク質（例えば、ＴＲＥＭ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＴＲＥＭ２タンパク質は、骨髄細胞に見られる免疫グロブリンスーパーファミリー受容体である、骨髄細胞２に発現するトリガー受容体を指す。ヒトにおいて、ＴＲＥＭ２遺伝子は第６染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＴＲＥＭ２遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_061838.1（配列番号５７）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号５８に示される配列を含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化されたＴＲＥＭ２コード配列を含む。
本開示の側面は、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質（例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質は、樹状突起の形態形成とリソソーム輸送の調節に関与するタンパク質である、膜貫通タンパク質１０６Ｂを指す。ヒトにおいて、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子は７番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_060844.2（配列番号６２）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号６３に示される配列を含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化されたＴＭＥＭ１０６Ｂコード配列を含む。
本開示の側面は、プログラニュリンタンパク質（例えば、ＰＲＧＮ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＰＧＲＮタンパク質は、発生、炎症、細胞増殖、およびタンパク質の恒常性に関与するタンパク質である、プログラニュリンを指す。ヒトにおいて、ＰＧＲＮ遺伝子は１７番染色体に位置する。いくつかの態様において、ＰＧＲＮ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_002078.1（配列番号６６）によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号６７に示される配列を含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、コドン最適化されたＰＧＲＮコード配列を含む。
いくつかの側面において、本開示は、第１の遺伝子産物および第２の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供し、ここで各遺伝子産物は独立して、表１に示される遺伝子産物またはその一部から選択される。
いくつかの態様において、遺伝子産物は、天然に存在する遺伝子のコード部分（例えば、ｃＤＮＡ）によってコードされる。いくつかの態様において、第１の遺伝子産物は、ＧＢＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質（またはその断片）である。いくつかの態様において、遺伝子産物は、表１に列挙される別の遺伝子、例えば、ＳＣＡＲＢ２／ＬＩＭＰ２遺伝子またはＰＳＡＰ遺伝子によってコードされるタンパク質（またはその断片）である。しかしながら当業者は、第１の遺伝子産物（例えば、Ｇｃａｓｅ）および第２の遺伝子産物（例えば、ＬＩＭＰ２など）の発現の順序は、一般的に逆転され得ることを認識する（例えば、ＬＩＭＰ２が第１の遺伝子産物であり、Ｇｃａｓｅが第２の遺伝子産物である）。いくつかの態様において、遺伝子産物は、表１に列挙された遺伝子の断片（例えば、一部）である。タンパク質断片は、表１に列挙された遺伝子によってコードされるタンパク質の、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％を含み得る。いくつかの態様において、タンパク質断片は、表１に列挙された遺伝子によってコードされるタンパク質の５０％～９９．９％（例えば、５０％～９９．９％の間の任意の値）を含む。
いくつかの態様において、発現構築物はモノシストロニックである（例えば、発現構築物は、第１の遺伝子産物および第２の遺伝子産物を含む単一の融合タンパク質をコードする）。いくつかの態様において、発現構築物はポリシストロニックである（例えば、発現構築物は、２つの異なる遺伝子産物、例えば２つの異なるタンパク質またはタンパク質断片をコードする）。
ポリシストロニックな発現ベクターは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）のプロモーターを含み得る。任意の適切なプロモーター、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、内因性プロモーター、組織特異的プロモーター（例えば、ＣＮＳ特異的プロモーター）などを使用することができる。いくつかの態様において、プロモーターは、ニワトリベータ－アクチンプロモーター（ＣＢＡプロモーター）、ＣＡＧプロモーター（例えば、Alexopoulou et al. (2008) BMC Cell Biol. 9:2; doi:
10.1186/1471-2121-9-2に記載のもの）、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーター（例えばTornoe et al. (2002) Gene 297(1-2):21-32に記載のもの）である。いくつかの態様において、プロモーターは、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、または第１の遺伝子産物と第２の遺伝子産物をコードする核酸配列に、作動可能に連結されている。いくつかの態様において、発現カセットは１つ以上の追加の調節配列を含み、これには、限定することなく、転写因子結合配列、イントロンスプライス部位、ポリ（Ａ）付加部位、エンハンサー配列、リプレッサー結合部位、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。
いくつかの態様において、第１の遺伝子産物をコードする核酸配列と第２の遺伝子産物をコードする核酸配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする核酸配列によって分離されている。ＩＲＥＳ部位の例は、例えば、Mokrejs et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34(Database issue):D125-30に記載されている。いくつかの態様において、第１の遺伝子産物をコードする核酸配列と第２の遺伝子産物をコードする核酸配列は、自己切断型ペプチドをコードする核酸配列によって分離されている。自己切断型ペプチドの例には、限定はされないが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ
２Ａ、およびＢｍＩＦＶ ２Ａ、およびLiu et al. (2017) Sci Rep. 7: 2193に記載されたものが含まれる。いくつかの態様において、自己切断型ペプチドはＴ２Ａペプチドである。
病理学的には、ＰＤおよびゴーシェ病などの疾患は、α－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）タンパク質で主に構成されるタンパク質凝集体の蓄積に関連する。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載の単離された核酸は、α－Ｓｙｎタンパク質の発現を低減または防止する阻害性核酸を含む。阻害性核酸をコードする配列は、発現ベクターの非翻訳領域（例えば、イントロン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲなど）に配置され得る。
いくつかの態様において、阻害性核酸は、発現構築物のイントロン、例えば、第１の遺伝子産物をコードする配列の上流のイントロンに配置される。阻害性核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）、またはＲＮＡアプタマーであることができる。一般に阻害性核酸は、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に隣接する約６～約３０（例えば、両端を含む６～３０の間の任意の整数）のヌクレオチドに結合する（例えば、ハイブリダイズする）。いくつかの態様において、阻害性核酸分子は、ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡ、例えば、ＳＮＣＡ（α－Ｓｙｎタンパク質をコードする遺伝子）またはＴＭＥＭ１０６Ｂ（例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質をコードする遺伝子）を標的とするｍｉＲＮＡである。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、それがハイブリダイズするＳＮＣＡのｍＲＮＡの領域とのいかなるミスマッチも含まない（例えば、ｍｉＲＮＡは「完全」である）。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ｓｈＲＮＡ（例えば、ＳＮＣＡまたはＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とするｓｈＲＮＡ）である。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ｍｉＲ－１５５足場およびＳＣＮＡまたはＴＭＥＭ１０６Ｂ標的化配列を含む、人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）である。
本明細書に記載の単離された核酸は、それ自体で、またはベクターの一部として存在し得る。一般にベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなど）である。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミド（例えば、本明細書に記載の単離された核酸を含むプラスミド）である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（例えば、一本鎖ＤＮＡ）である。いくつかの態様において、ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、バキュロウイルスベクター（例えば、Autographa californica核多角体病（ＡｃＮＰＶ）ベクター）である。
典型的には、ｒＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶゲノム）は、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接した、導入遺伝子（例えば、以下の各々の１つ以上を含む発現構築物：プロモーター、イントロン、エンハンサー配列、タンパク質コード配列、阻害性ＲＮＡコード配列、ポリＡテール配列など）を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子は、本開示に記載の単離された核酸を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターの２つのＩＴＲ配列のそれぞれは、完全長ＩＴＲ（例えば、長さが約１４５ｂｐであり、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を含む）である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターのＩＴＲの１つは、切断されている（例えば、短縮されているかまたは完全長ではない）。いくつかの態様において、切断型ＩＴＲは、機能的末端分解部位（ｔｒｓ）を欠き、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶベクター）の生成のために使用される。いくつかの態様において、切断型ＩＴＲは、例えば、McCarty et al. (2003) Gene Ther. 10(26):2112-8に記載のΔＩＴＲである。
本開示の側面は、野生型ＡＡＶ ＩＴＲと比べて、例えば野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（例えば、配列番号２９）と比べて、１つ以上の修飾（例えば、核酸の追加、欠失、置換など）を有するＩＴＲを含む、単離された核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）に関する。野生型ＡＡＶ２
ＩＴＲの構造を、図２０に示す。一般に野生型ＩＴＲは、自己アニーリングして回文構造の二本鎖Ｔ型ヘアピン構造（これは、２つのクロスアーム（それぞれＢ／Ｂ’およびＣ／Ｃ’と呼ばれる配列によって形成される）、より長いステム領域（配列Ａ／Ａ’によって形成される）、および「Ｄ」領域と呼ばれる一本鎖末端領域からなる）を形成する、１２５ヌクレオチドの領域を含む（図２０）。一般に、ＩＴＲの「Ｄ」領域は、Ａ／Ａ’配列によって形成されるステム領域と、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子を含むインサートの間に配置される（例えば、ＩＴＲの末端に対してＩＴＲの「内側」に配置されるか、またはｒＡＡＶベクターの導入遺伝子インサートもしくは発現構築物の近位に配置される）。いくつかの態様において、「Ｄ」領域は、配列番号２７に示される配列を含む。「Ｄ」領域は、例えば、Ling et al. (2015) J Mol Genet Med 9(3)に開示されるように、カプシドタンパク質によるｒＡＡＶベクターのカプシド形成において重要な役割を果たすことが観察されている。
本開示は、部分的に、ＩＴＲの「外側」に位置する「Ｄ」領域（例えば、導入遺伝子インサートまたは発現構築物に対してＩＴＲの末端に近い）を含むｒＡＡＶベクターが、修飾されていない（例えば、野生型の）ＩＴＲを有するｒＡＡＶベクターよりも、ＡＡＶカプシドタンパク質によって効率的にカプシド化されるという、驚くべき発見に基づいている。いくつかの態様において、修飾された「Ｄ」領域を有するｒＡＡＶベクターは、野生型ＩＴＲ配列を有するｒＡＡＶベクターと比べて、毒性が減少している。
いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）と比べて、少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む。修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）と比べて、少なくも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチド置換を有し得る。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）と比べて、少なくも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９のヌクレオチド置換を含む。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）と、約１０％～約９９％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）同一である。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、Wang et al. (1995) J Mol Biol 250(5):573-80に記載のように、「Ｓ」配列とも呼ばれる配列番号２６に示される配列を含む。
本開示に記載の単離された核酸またはｒＡＡＶベクターはさらに、例えば、配列番号２８に示されるような、またはFrancois,
et al. 2005. The Cellular TATA Binding Protein Is Required for Rep-Dependent
Replication of a Minimal Adeno-Associated Virus Type 2 p5 Element. J Virolに記載のような「ＴＲＹ」配列を含み得る。いくつかの態様において、ＴＲＹ配列は、単離された核酸またはｒＡＡＶベクターのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）と発現構築物（例えば、導入遺伝子をコードするインサート）との間に配置される。
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の単離された核酸またはｒＡＡＶベクターを含む、バキュロウイルスベクターに関する。いくつかの態様において、バキュロウイルスベクターは、例えばUrabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43およびSmith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896に記載されるような、Autographa californica核多角体病（ＡｃＮＰＶ）ベクターである。
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の単離された核酸またはベクターを含む、宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。例えば宿主細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞などであり得る。いくつかの態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は細菌細胞、例えば大腸菌細胞である。
ｒＡＡＶ
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の核酸をコードする導入遺伝子を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）に関する（例えば、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター）。「ｒＡＡＶ」という用語は一般に、１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質によってカプシド化されたｒＡＡＶベクターを含む、ウイルス粒子を指す。本開示に記載のｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０から選択される血清型を有するカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、非ヒト宿主由来のカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３９などのアカゲザルＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶは、野生型カプシドタンパク質のバリアントであるカプシドタンパク質を含み、これは例えば、それが由来する野生型ＡＡＶカプシドタンパク質に対して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０より多く（例えば、１５、２０、２５、５０、１００など）のアミノ酸置換（例えば、変異）を含む、カプシドタンパク質バリアントである。
いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶは、特にＣＳＦ空間にまたは直接脳実質に導入された場合に、ＣＮＳを通して容易に広がる。したがって、いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができるカプシドタンパク質を含む。例えば、いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ．１０血清型を有するカプシドタンパク質を含む。ｒＡＡＶの生成は、例えば、Samulski et al. (1989) J Virol. 63(9):3822-8 and Wright (2009) Hum
Gene Ther. 20(7): 698-706に記載されている。
いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質によってカプシド化されてｒＡＡＶカプシド粒子を形成する、組換えｒＡＡＶゲノムを含むもの）は、バキュロウイルスベクター発現系（ＢＥＶＳ）で生成される。ＢＥＶＳを使用したｒＡＡＶの生成は、例えば以下に記載されている：Urabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43、Smith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896、米国特許第8,945,918号、米国特許第9,879,282号、および国際ＰＣＴ公開WO 2017/184879。しかしながらｒＡＡＶは、任意の適切な方法を使用して（例えば、組換えｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を使用して）生成され得る。
医薬組成物
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の単離された核酸またはｒＡＡＶおよび薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容し得る」という用語は、化合物の生物活性または特性を無効にせず、比較的非毒性である担体または希釈剤などの材料を指し、例えば材料は、望ましくない生物学的影響を引き起こしたり、またはそれが含まれている組成物の任意の成分と有害な様式で相互作用したりすることなく、個体に投与し得る。
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容し得る担体」とは、薬学的に許容し得る材料、組成物または担体、例えば、液体または固体の充填剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒または封入材料などであって、本発明内で有用な化合物をそれが意図する機能を果たすことができるように患者内にまたは患者に運ぶかまたは輸送することに関連するものを、意味する。本発明の実施において使用される医薬組成物に含まれ得るさらなる成分は、当該分野で知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing
Co., 1985, Easton, PA)に記載されている；これは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供される組成物（例えば、医薬組成物）は、以下を含む任意の経路で投与することができる：経腸（例えば、経口）、非経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、脳室内、経皮、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所的（粉末、軟膏、クリーム、および／または滴剤による）、粘膜、鼻腔、頬側、舌下；気管内注入、気管支注入、および／または吸入；および／または経口スプレー、鼻スプレー、および／またはエアロゾルとして。具体的に企図される経路は、経口投与、静脈内投与（例えば、全身静脈内注射）、血液および／またはリンパ供給による局所投与、および／または罹患部位への直接投与である。一般に、最も適切な投与経路は、様々な因子、例えば薬剤の性質（例えば、胃腸管の環境におけるその安定性）、および／または対象の状態（例えば、対象が経口投与に耐えることができるかどうか）などに依存するであろう。特定の態様において、本明細書に記載の化合物または医薬組成物は、対象の眼への局所投与に適している。
方法
本開示は、部分的に、パーキンソン病を処置するために一緒に（例えば、相乗的に）作用する、対象におけるＰＤ関連遺伝子産物の組み合わせの発現のための組成物に基づく。本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置すること」とは、（ａ）パーキンソン病の発症を予防または遅延させること；（ｂ）パーキンソン病の重症度を軽減すること；（ｃ）パーキンソン病に特徴的な症状の発症を軽減または防止すること；（ｄ）パーキンソン病に特徴的な症状の悪化を防ぐこと、を指す。パーキンソン病の症状には、例えば、運動機能障害（例えば、震え、硬直、動きの鈍さ、歩行困難）、認知機能障害（例えば、認知症、うつ病、不安症）、感情的および行動的機能障害が含まれる。
したがって、いくつかの側面において、本開示は、パーキンソン病を有するかまたは有すると疑われる対象を処置する方法を提供し、該方法は、対象に、本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を投与することを含む。
いくつかの態様において、組成物は、対象のＣＮＳに直接、例えば対象の脳および／または脊髄への直接注射によって、投与される。ＣＮＳ直接投与法の例には、限定はされないが、脳内注射、脳室内注射、大槽内注射、実質内注射、髄腔内注射、および前述の任意の組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、対象のＣＮＳへの直接注射は、対象の中脳、線条体および／または大脳皮質における、導入遺伝子発現（例えば、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、および該当する場合は第３の遺伝子産物の発現）をもたらす。いくつかの態様において、ＣＮＳへの直接注射は、対象の脊髄および／またはＣＳＦにおける、導入遺伝子発現（例えば、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、および該当する場合は第３の遺伝子産物の発現）をもたらす。
いくつかの態様において、対象のＣＮＳへの直接注射は、対流強化送達（ＣＥＤ）を含む。対流強化送達は、脳の外科的露出および小径カテーテルを脳の標的領域に直接配置し、続いて治療剤（例えば、本明細書に記載の組成物またはｒＡＡＶ）を対象の脳に直接注入することを含む、治療戦略である。ＣＥＤは、例えば、Debinski et al. (2009) Expert Rev Neurother. 9(10):1519-27に記載されている。
いくつかの態様において、組成物は、例えば末梢注射により、対象の末梢に投与される。末梢注射の例には、皮下注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、末梢注射は、動脈内注射、例えば対象の頸動脈への注射である。
いくつかの態様において、本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）は、対象のＣＮＳに末梢および直接の両方で投与される。例えば、いくつかの態様において、対象は、動脈内注射（例えば、頸動脈への注射）および実質内注射（例えば、ＣＥＤによる実質内注射）によって、組成物を投与される。いくつかの態様において、ＣＮＳへの直接注射および末梢注射は同時である（例えば、同時に起こる）。いくつかの態様において、直接注射は、末梢注射の前（例えば、１分から１週間の間、またはそれより前）に行われる。いくつかの態様において、直接注射は、末梢注射の後（例えば、１分から１週間の間、またはその後）に行われる。
対象に投与される本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）の量は、投与方法に応じて変化するであろう。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載のｒＡＡＶは、対象に、約１０９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇと約１０１４ＧＣ／ｋｇの間（例えば、約１０９ＧＣ／ｋｇ、約１０１０ＧＣ／ｋｇ、約１０１１ＧＣ／ｋｇ、約１０１２ＧＣ／ｋｇ、約１０１２ＧＣ／ｋｇ、または約１０１４ＧＣ／ｋｇ）の力価で投与される。いくつかの態様において、対象は、高力価（例えば、＞１０１２ゲノムコピーＧＣ／ｋｇのｒＡＡＶ）を、ＣＳＦ空間への注射により、または実質内注射により投与される。
本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）は、対象に１回または複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、またはそれ以上）投与され得る。いくつかの態様において、組成物は対象に継続的に（例えば、慢性的に）、例えば注入ポンプを介して、投与される。
例１：ｒＡＡＶベクター
ＡＡＶベクターは、トリプルプラスミドトランスフェクション用のＨＥＫ２９３細胞などの細胞を使用して生成される。ＩＴＲ配列は、目的の各導入遺伝子のプロモーター／エンハンサー要素、３’ポリＡシグナル、およびＷＰＲＥ要素等の翻訳後シグナルを含む発現構築物に隣接している。ＧＢＡ１、ＬＩＭＰ２、プロサポシンなどの複数の遺伝子産物を、以下によって同時に発現させることができる：タンパク質配列の融合により；または、Ｔ２ＡやＰ２Ａなどの２Ａペプチドリンカーの使用により（ペプチド結合の作成が妨げられるため、アミノ酸が付加された２ペプチド断片がもたらされる）；またはＩＲＥＳ要素の使用により；または２つの別々の発現カセットでの発現により。発現された遺伝子の上流で効率的にスプライシングされる短いイントロン配列の存在は、発現レベルを改善することができる。ｓｈＲＮＡおよび他の調節ＲＮＡは、これらの配列内に含まれる可能性がある。本開示に記載の発現構築物の例を、図１～８および２１～３５、ならびに下の表２に示す。
例２：ＧＢＡ欠損細胞へのウイルス形質導入の、細胞ベースのアッセイ
ＧＢＡ１が欠損した細胞は、例えばＧＤ患者からの線維芽細胞、単球、またはｈＥＳ細胞、または患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）として取得される。これらの細胞は、グルコシルセラミドおよびグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｕＣｅｒおよびＧｌｕＳｐｈ）などの基質を蓄積する。野生型または変異培養細胞株のＣＢＥなどのＧｃａｓｅ阻害剤による処理も、ＧＢＡ欠損細胞を得るために使用される。
かかる細胞モデルを使用して、リソソームの欠陥（lysosomal defects）を、α－シヌクレインなどのタンパク質凝集体の蓄積の観点からこのタンパク質に対する抗体またはホスホ－αＳｙｎを用いて定量化し、続いて蛍光顕微鏡を使用して画像化する。ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＬＩＭＰ１、ＬＩＭＰ２などのタンパク質マーカーのＩＣＣによる、またはLysotrackerなどの色素を使用した、または蛍光デキストランもしくは他のマーカーのエンドサイトーシスコンパートメントを介した取り込みによる、リソソーム異常の画像化も実施する。ＬＣ３などのリソソームとの融合の欠陥によるオートファジーマーカーの蓄積の画像化も、実施可能である。ウエスタンブロッティングおよび／またはＥＬＩＳＡを使用して、これらのマーカーの異常な蓄積を定量化する。また、糖脂質基質およびＧＢＡ１の産物の蓄積は、標準的なアプローチを使用して測定する。
治療のエンドポイント（ＰＤ関連の病状の軽減など）は、ＡＡＶベクターの形質導入の発現の文脈において測定し、活性および機能を確認および定量化する。Ｇｃａｓｅは、タンパク質ＥＬＩＳＡ測度を使用して、または標準のＧｃａｓｅ活性アッセイによっても定量化することができる。
例３：変異マウスを使用したin vivoアッセイ
この例では、変異マウスを使用したＡＡＶベクターのin vivoアッセイについて記載する。変異マウスにおける上記のようなＡＡＶベクターのin vivo研究は、例えば、Liou et al. (2006) J. Biol.
Chem. 281(7): 4242-4253、Sun et al. (2005) J. Lipid Res.
46:2102-2113、およびFarfel-Becker et al. (2011) Dis. Model
Mech. 4(6):746-752に記載されたアッセイを使用して実施する。
ビヒクル対照およびＡＡＶベクターの髄腔内または脳室内送達（例えば、２×１０１１ｖｇ／マウスの用量）は、濃縮ＡＡＶストックを使用して、例えば５～１０μＬの注入量で行う。対流強化送達による実質内送達を行う。
処置は、症状の発症前、または発症後に開始する。測定するエンドポイントは、ＣＮＳおよびＣＳＦにおける基質の蓄積、ＥＬＩＳＡによるＧｃａｓｅ酵素の蓄積、および酵素活性の蓄積、運動および認知エンドポイント、リソソーム機能障害、およびα－シヌクレインモノマー、プロトフィブリルまたはフィブリルの蓄積である。
例４：疾患の化学的モデル
この例では、ゴーシェ病の化学的誘発マウスモデル（ＣＢＥマウスモデルなど）を使用した、ＡＡＶベクターのin
vivoアッセイについて記載する。これらのＡＡＶベクターのin vivo研究は、例えばVardi et al. (2016) J Pathol. 239(4):496-509に記載のように、ゴーシェ病の化学的誘発マウスモデルで実施される。
ビヒクル対照とＡＡＶベクターの髄腔内または脳室内送達（例えば、２×１０１１ｖｇ／マウスの用量）は、濃縮されたＡＡＶストックを使用して、例えば５～１０μＬの注入量で行う。対流強化送達による実質内送達を行う。末梢送達は、尾静脈注射によって達成する。
処置は、症状の発症前、または発症後に開始する。測定するエンドポイントは、ＣＮＳおよびＣＳＦにおける基質の蓄積、ＥＬＩＳＡによるＧｃａｓｅ酵素の蓄積、および酵素活性の蓄積、運動および認知エンドポイント、リソソーム機能障害、およびα－シヌクレインモノマー、プロトフィブリルまたはフィブリルの蓄積である。
例５：ＰＤ、ＬＢＤ、ゴーシェ病の患者の臨床試験
いくつかの態様において、特定の形態のゴーシェ病（例えば、ＧＤ１）を有する患者は、パーキンソン病（ＰＤ）またはレビー小体型認知症（ＬＢＤ）を発症するリスクが高い。この例では、ゴーシェ病、ＰＤおよび／またはＬＢＤを有する患者における、本開示に記載のｒＡＡＶの安全性および有効性を評価するための臨床試験を記載する。
ゴーシェ病、ＰＤおよび／またはＬＢＤの処置のためのかかるベクターの臨床試験は、Grabowski et
al. (1995) Ann. Intern. Med. 122(1):33-39に記載されているものと同様の研究デザインを使用して実施する。
例６：末梢疾患の処置
いくつかの態様において、特定の形態のゴーシェ病を有する患者は、例えば、Biegstraaten et al.
(2010) Brain 133(10):2909-2919に記載のように、末梢神経障害の症状を示す。
この例は、ゴーシェ病（例えば、１型ゴーシェ病）に関連する末梢神経障害の処置のための、本明細書に記載のＡＡＶベクターのin vivoアッセイを記載する。簡潔に述べると、末梢神経障害の兆候または症状を有すると同定された１型ゴーシェ病患者に、本開示に記載のようにｒＡＡＶを投与する。いくつかの態様において、対象の末梢神経障害の兆候および症状を、例えば、Biegstraatenらに記載されている方法を使用して、ｒＡＡＶの投与後に監視する。
患者（例えば、患者の血清、末梢組織（例えば、肝臓組織、脾臓組織など））に存在する本開示に記載の形質導入された遺伝子産物のレベルを、例えばウエスタンブロット分析、酵素機能アッセイ、または画像検査によりアッセイする。
例７：ＣＮＳ型の処置
この例では、ＣＮＳ型ゴーシェ病の処置のための、本明細書に記載のｒＡＡＶのin vivoアッセイを記載する。簡潔に述べると、ＣＮＳ型のゴーシェ病（例えば、２型または３型ゴーシェ病）を有すると同定されたゴーシェ病患者に、本開示に記載のようにｒＡＡＶを投与する。患者のＣＮＳ（例えば、患者のＣＮＳの血清中、患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中、または患者のＣＮＳ組織中）に存在する本開示に記載の形質導入された遺伝子産物のレベルを、例えばウエスタンブロット分析、酵素機能アッセイ、または画像検査によりアッセイする。
例８：ＧＢＡ１に変異を有する対象におけるパーキンソン病の遺伝子治療
この例では、ＧＢＡ１遺伝子の変異を特徴とするパーキンソン病の患者への、ＧＢＡ１をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の投与について記載する。
ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクターインサートは、４つの部分：ＣＭＶエンハンサー（ＣＭＶｅ）、ＣＢＡプロモーター（ＣＢＡｐ）、エクソン１、およびイントロン（ｉｎｔ）から構成されており、ヒトＧＢＡ１（maroon）のコドン最適化コード配列（ＣＤＳ）を構成的に発現するＣＢＡプロモーター要素（ＣＢＡ）を含む。３’領域はまた、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節要素（ＷＰＲＥ）の転写後調節要素と、それに続くウシ成長ホルモンポリＡシグナル（ｂＧＨポリＡ）テールも含む。隣接するＩＴＲは、介在する配列の正しいパッケージングを可能にする。５’ＩＴＲ配列の２つのバリアント（図７、挿入ボックス、下の配列）を評価した；これらのバリアントは、ＩＴＲの２０ヌクレオチド「Ｄ」領域内にいくつかのヌクレオチドの違いがあり、これはパッケージングおよび発現の効率に影響を与えると考えられている。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクター産物は、図７に示される「Ｄ」ドメインヌクレオチド配列を含む（挿入ボックス、上部配列）。バリアントベクターは、前臨床試験で同様に作用する変異「Ｄ」ドメイン（本明細書では「Ｓ」ドメインと呼ばれ、ヌクレオチドの変化は網掛けで示される）を備えている。骨格には、カナマイシン耐性を付与する遺伝子と、逆パッケージングを防ぐためのスタッファー配列が含まれる。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクターを示す概略図を図８に示す。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクターは、ＡＡＶ９血清型カプシドタンパク質を使用してｒＡＡＶにパッケージングされている。
ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を、対象に単回用量として大槽（大槽内；ＩＣＭ）へのＸ線透視法ガイドによる後頭下注射を介して投与する。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１投与計画研究の一態様は、以下の通りである：
ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の単回用量を患者（Ｎ＝１２）に、非臨床薬理学および毒物学研究の結果に基づいて決定される２つの用量レベル（３ｅ１３ｖｇ（低用量）；１ｅ１４ｖｇ（高用量）など）の１つで投与する。
初期の研究は、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクターとｒＡＡＶ－ＧＢＡ１のＳバリアント構築物の有効性および安全性を評価するためのＧＣａｓｅの阻害剤であるコンズリトール－ｂ－エポキシド（ＣＢＥ）の毎日の送達を含む、化学的マウスモデルで実施した（以下にさらに説明するとおり）。また、初期の研究は、ホモ接合ＧＢＡ１変異を保有し、サポシン（４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ）が部分的に欠損している遺伝子マウスモデルにおいて実施した。マウスおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）での追加の用量範囲研究を実施して、ベクターの安全性および有効性をさらに評価する。
ＡＡＶ骨格の５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）のわずかに異なる２つのバージョンを試験して、製造性および導入遺伝子発現を評価した（図７）。１４５ｂｐの５’ＩＴＲ内の２０ｂｐの「Ｄ」ドメインは、最適なウイルスベクターの生成に必要であると考えられているが、しかし「Ｄ」ドメイン内の変異もまた、いくつかの場合において導入遺伝子の発現を増加させることが報告されている。したがって、無傷の「Ｄ」ドメインを保有するウイルスベクターｒＡＡＶ－ＧＢＡ１に加えて、変異型Ｄドメイン（本明細書では「Ｓ」ドメインと呼ばれる）を有する第２のベクター形態も評価した。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１とバリアントの両方が、同じ導入遺伝子を発現する。両方のベクターが以下に詳述するようにin vivoで有効なウイルスを生成したが、野生型「Ｄ」ドメインを含むｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を、さらなる開発用に選択した。
ＧＣａｓｅ欠損のＣＢＥモデルを確立するために、若年マウスに、ＧＣａｓｅの特異的阻害剤であるＣＢＥを投与した。マウスには、ＣＢＥを毎日ＩＰ注射により生後８日（Ｐ８）から開始して与えた。３つの異なるＣＢＥ用量（２５ｍｇ／ｋｇ、３７．５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ）およびＰＢＳを試験して、行動表現型を示すモデルを確立した（図９）。ＣＢＥの高用量は、用量依存的に致死をもたらした。５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＥで処置したすべてのマウスはＰ２３までに死亡し、３７．５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥで処置した８匹のマウスのうち５匹はＰ２７までに死亡した。２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥで処置したマウスには致死性はなかった。ＣＢＥを注射したマウスは、オープンフィールドアッセイで一般的な運動障害を示さなかったが（ＰＢＳを投与したマウスと同じ距離および同じ速度で移動する）、ＣＢＥで処置したマウスは、ロータロッドアッセイの測定により、運動協調性とバランスの障害を示した。
研究の終わりまで生存したマウスは、最後のＣＢＥ投与の翌日（Ｐ２７、「１日目」）またはＣＢＥ中止の３日後（Ｐ２９、「３日目」）に犠牲にした。２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥを投与したマウスの皮質で脂質分析を行い、１日目と３日目のコホートの両方でＧＣａｓｅ基質の蓄積を評価した。ＧｌｕＳｐｈおよびＧａｌＳｐｈレベル（この例では合計で測定）は、ＰＢＳ処置対照と比べてＣＢＥ処置マウスで有意に蓄積され、ＧＣａｓｅ不全と整合した。
上記の研究に基づき、生存に影響を与えることなく行動障害を引き起こしたことにより、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ用量を選択した。脳全体にわたるＧＢＡ１分布とＣＢＥ処置中の導入遺伝子発現を達成するために、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１または賦形剤を、脳室内（ＩＣＶ）注射によって出生後３日目（Ｐ３）に送達し、続いて毎日のＩＰでのＣＢＥまたはＰＢＳ処置を、Ｐ８で開始した（図１０）。
ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を投与したＣＢＥ処置マウスは、賦形剤を投与したマウスよりも、ロータロッドにおいて統計的に有意に良好に機能した（図１１）。バリアント処置群のマウスは、試験中の総移動距離などの他の行動指標の点で、賦形剤で処置したマウスと差はなかった（図１１）。
生存試験の完了時に、ＣＢＥの最終投与の翌日（Ｐ３６、「１日目」）またはＣＢＥ中止の３日後（Ｐ３８、「３日目」）に、マウスの半分を生化学分析のために犠牲にした（図１２）。生物学的トリプリケートで行われた蛍光酵素アッセイを使用して、ＧＣａｓｅ活性を皮質で評価した。ＧＣａｓｅ活性は、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１で処置したマウスで増加したが、一方ＣＢＥ処置は、ＧＣａｓｅ活性を低下させた。さらに、ＣＢＥとｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の両方を投与したマウスは、ＰＢＳ処置群と同様のＧＣａｓｅ活性レベルを示し、これは、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の送達が、ＣＢＥ処置により誘導されるＧＣａｓｅ活性の阻害を克服できることを示す。脂質分析をマウスの運動皮質で実施して、基質ＧｌｕＣｅｒおよびＧｌｕＳｐｈのレベルを調べた。両方の脂質がＣＢＥを投与したマウスの脳に蓄積し、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１処置は基質の蓄積を大幅に減少させた。
脂質レベルは、処置群全体にわたり、ＧＣａｓｅ活性およびロータロッドでのパフォーマンスの両方に負の相関があった。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１投与後のＧＣａｓｅ活性の増加は、基質の減少および運動機能の増強と関連していた（図１３）。図１４に示すように、予備的な生体内分布は、ｑＰＣＲの測定を用いてベクターゲノムの存在により評価した（ゲノムＤＮＡ１μｇあたり１００を超えるベクターゲノムを陽性と定義）。ＣＢＥありとなしの両方でｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を投与したマウスは、皮質でのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクターゲノムが陽性であり、ＩＣＶ送達が皮質へのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１送達をもたらすことを示す。さらに、ベクターゲノムは肝臓で検出され、脾臓ではほとんど検出されず、心臓、腎臓または生殖腺では全く検出されなかった。すべての測定値について、１日目群と３日目群の間に統計的に有意な差はなかった。
ＣＢＥモデルでの大規模な研究により、ＣＢＥモデルでのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の有効用量をさらに調べた。２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ用量モデルを使用して、賦形剤またはｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を、ＩＣＶを介してＰ３で送達し、毎日のＩＰでのＰＢＳまたはＣＢＥ処置をＰ８で開始した。以前の研究で観察されたＣＢＥ中止ありとなしの群間の類似性を考慮して、すべてのマウスを最終ＣＢＥ投与の１日後に犠牲にした（Ｐ３８～４０）。３つの異なるｒＡＡＶ－ＧＢＡ１用量の効果を評価した結果、次の５つの群を、１群あたり１０匹のマウス（５Ｍ／５Ｆ）で得た。
賦形剤 ＩＣＶ＋ＰＢＳ ＩＰ
賦形剤 ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ
３．２ｅ９ｖｇ（２．１３ｅ１０ｖｇ／脳１ｇ）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ
１．０ｅ１０ｖｇ（６．６７ｅ１０ｖｇ／脳１ｇ）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ
３．２ｅ１０ｖｇ（２．１３ｅ１１ｖｇ／脳１ｇ）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ。
最高用量のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１は、ＣＢＥ処置に関連したＰ３７での体重増加の失敗を救済した。さらに、この用量により、ロータロッドおよびテーパ梁でのパフォーマンスが賦形剤＋ＣＢＥ処置群と比べて統計的に有意に増加した（図１５）。致死性は、賦形剤処置群とｒＡＡＶ－ＧＢＡ１処置群の両方を含むいくつかの群で観察された（賦形剤＋ＰＢＳ：０；賦形剤＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ：１；３．２ｅ９ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ：４；１．０ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ：０；３．２ｅ１０ｖｇのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ：３）。
生存試験の完了時に、マウスを生化学的分析のために犠牲にした（図１６）。皮質のＧＣａｓｅ活性を、生物学的トリプリケートで蛍光アッセイにより評価した。ＣＢＥ処置マウスはＧＣａｓｅ活性の低下を示したのに対し、高用量ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を投与したマウスは、ＣＢＥ処置と比べて統計的に有意なＧＣａｓｅ活性の増加を示した。ＣＢＥ処置マウスもまた、ＧｌｕＣｅｒとＧｌｕＳｐｈの蓄積があり、どちらも高用量のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を投与することで救済された。
確立された化学的ＣＢＥモデルに加えて、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝モデルでも評価する；これは、Ｇｂａ１のＶ３９４Ｌ ＧＤ変異についてホモ接合であり、かつＧＣａｓｅの局在と活性に影響を与えるサポシンが部分的に欠損している。これらのマウスは、梁歩行、ロータロッド、およびワイヤハングアッセイでのパフォーマンスから明らかなように、運動強度、協調性、バランスの障害を示す。通常、これらのマウスの寿命は２２週間未満である。初期の研究では、３μｌの最大力価ウイルスをＩＣＶによりＰ２３で送達し、最終投与量は２．４ｅ１０ｖｇ（６．０ｅ１０ｖｇ／脳１ｇ）であった。１群あたり６匹のマウスを用いた処置群は以下である：
ＷＴ＋賦形剤 ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋賦形剤 ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋２．４ｅ１０ｖｇ（６．０ｅ１０ｖｇ／脳１ｇ）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ
梁歩行試験による運動パフォーマンスは、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１送達の４週間後に評価した。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を投与した変異マウスの群は、賦形剤で処置した変異マウスと比べて合計スリップが少なく、速度あたりのスリップが少ない傾向を示し、運動機能をＷＴレベル近くまで回復させた（図１７）。これらのマウスが加齢するにつれて運動表現型はより重症になるので、これと他の行動試験におけるそのパフォーマンスは、後の時点で評価する。生存試験の完了時に、脂質レベル、ＧＣａｓｅ活性、および生体内分布をこれらのマウスにおいて評価する。
追加の低用量のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１は現在、ＣＢＥモデルを使用して試験されており、提案されているフェーズ１の高臨床用量の０．０３倍、０．１倍、および１倍に相当する。各群には、群ごとに１０匹のマウス（５Ｍ／５Ｆ）が含まれる：
賦形剤 ＩＣＶ
賦形剤 ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ
３．２ｅ８ｖｇ（２．１３ｅ９ｖｇ／脳１ｇ）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ
１．０ｅ９ｖｇ（６．６７ｅ９ｖｇ／脳１ｇ）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ
１．０ｅ１０ｖｇ（６．６７ｅ１０ｖｇ／脳１ｇ）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ ＩＰ。
運動表現型に加えて、脂質レベルおよびＧＣａｓｅ活性を皮質で評価する。処置の時間経過および分析も実施する。
より大きな用量範囲の研究を開始して、有効性と安全性のデータを評価した。１０匹の４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウス（群当たり５Ｍ／５Ｆ）に、１０μｌのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を注射した。アロメトリック脳重量計算を使用して、用量は提案されたフェーズ１の高臨床用量の０．１５倍、１．５倍、４．４倍、１４．５倍に相関する。注射群は以下から構成される：
ＷＴ＋賦形剤 ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋賦形剤 ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋４．３ｅ９ｖｇ（１．１ｅ１０ｖｇ／脳１ｇ）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋４．３ｅ１０ｖｇ（１．１ｅ１１ｖｇ／ｇ／脳）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋１．３ｅ１１ｖｇ（３．２ｅ１１ｖｇ／脳１ｇ）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋４．３ｅ１１ｖｇ（１．１ｅ１２ｖｇ／脳１ｇ）のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ。
ＣＢＥモデルの非臨床試験の概要を、以下の表３に示す。
正の生体内分布は、１００ｖｇ／１μｇゲノムＤＮＡより大として定義されることに注意。
略語：ＢＤ＝生体内分布；ＮＳ＝有意性なし；Ｔ＝傾向；Ｓ＝有意；Ｎ／Ａ＝適用されず；＋＝正；－＝負。
例９：ｒＡＡＶベクターのin vitro分析
ｒＡＡＶ構築物を、in vitroおよびin vivoで試験した。図１８は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするｒＡＡＶ構築物のin vitro発現についての代表的なデータを示す。左のパネルは、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）ＥＬＩＳＡアッセイの標準曲線を示す。下のパネルは、ｒＡＡＶで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解物においてＥＬＩＳＡアッセイにより測定された、ＰＧＲＮ発現の用量反応を示す。ＭＯＩ＝感染の多重度（細胞あたりのベクターゲノム）。
パイロット研究を実施して、プロサポシン（ＰＳＡＰ）およびＳＣＡＲＢ２を、単独で、またはＧＢＡ１および／または１つ以上の阻害性ＲＮＡと組み合わせてコードするｒＡＡＶベクターのin vitro活性を評価した。ＰＳＡＰおよびプログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードする１つの構築物も試験した。試験したベクターは、表４に示すものを含む。「Ｏｐｔ」は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）での発現用に最適化された核酸配列コドンを指す。図１９は、各構築物によるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、モックトランスフェクトされた細胞と比べて、対応する遺伝子産物の過剰発現をもたらしたことを示す代表的なデータを示す。
パイロット研究を実施して、ＴＲＥＭ２を、単独で、または１つ以上の阻害性ＲＮＡと組み合わせてコードするｒＡＡＶベクターのin vitro活性を評価した。試験したベクターは、表４に示すものを含む。「Ｏｐｔ」は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）での発現用に最適化された核酸配列コドンを指す。図３６Ａ～３６Ｂは、各構築物によるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、モックトランスフェクトされた細胞と比べて、対応する遺伝子産物の過剰発現をもたらしたことを示す代表的なデータを示す。
例１０：ＳＣＮＡおよびＴＭＥＭ１０６Ｂ ｓｈＲＮＡ構築物の試験
ＨＥＫ２９３細胞
ヒト胚性腎臓２９３細胞株（ＨＥＫ２９３）をこの研究で使用した（#85120602,
Sigma-Aldrich）。ＨＥＫ２９３細胞は、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（#15140122, Thermo Fisher Scientific）を含有する培地（Ｄ－ＭＥＭ［#11995065, Thermo Fisher Scientific］に１０％ウシ胎児血清［ＦＢＳ］［#10082147, Thermo Fisher Scientific］を補充）で維持した。
プラスミドトランスフェクション
プラスミドのトランスフェクションを、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬（#11668019, Thermo Fisher Scientific）を使用し、製造元の指示に従って実施した。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞（#12022001, Sigma-Aldrich）を、３×１０５細胞／ｍｌの密度で抗生物質を含まない培地にプレーティングした。翌日、プラスミドおよびLipofectamine 2000試薬をOpti-MEM溶液（#31985062, Thermo Fisher Scientific）に混合した。５分後、混合物をＨＥＫ２９３培養物に加えた。７２時間後、細胞を、ＲＮＡまたはタンパク質の抽出のために回収するか、または画像解析を行った。画像分析のために、プレートを０．０１％のポリ－Ｌ－リジン溶液（P8920, Sigma-Aldrich）で、細胞をプレーティングする前にプレコートした。
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）による遺伝子発現解析
相対遺伝子発現レベルは、Power SYBR Green Cells-to-CTキット（#4402955, Thermo Fisher Scientific）を使用した定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）により、製造元の指示に従って決定した。候補プラスミドを、４８ウェルプレート（７．５×１０４細胞／ウェル）にプレーティングしたＨＥＫ２９３細胞に、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬（５０μｌのOpti-MEM溶液中、０．５μｇのプラスミドおよび１．５μｌの試薬）を使用して、一時的にトランスフェクションした。７２時間後、ＲＮＡを細胞から抽出し、製造元の指示に従って逆転写に使用してｃＤＮＡを合成した。定量的ＰＣＲ分析では、２～５μｌのｃＤＮＡ産物を、遺伝子特異的プライマーペア（最終濃度２５０ｎＭ）を使用して、Power SYBR Green PCR Master Mix（#4367659,
Thermo Fisher Scientific）でデュプリケートに増幅した。ＳＮＣＡ、ＴＭＥＭ１０６Ｂ、およびＧＡＰＤＨ遺伝子のプライマー配列は以下である：ＳＮＣＡについて、５’－ＡＡＧ
ＡＧＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＴＣＴ ＡＴＧ ＴＡＧ ＧＣ－３’（配列番号７１）、５’－ＧＣＴ ＣＣＴ ＣＣＡ ＡＣＡ ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＣＴ Ｔ－３’（配列番号７２）；ＴＭＥＭ１０６Ｂについて、５’－ＡＣＡ
ＣＡＧ ＴＡＣ ＣＴＡ ＣＣＧ ＴＴＡ ＴＡＧ ＣＡ－３’（配列番号７３）、５’－ＴＧＴ ＴＧＴ ＣＡＣ ＡＧＴ ＡＡ ＴＴＧ ＣＡＴ ＣＡ－３’（配列番号７４）；およびＧＡＰＤＨについて、５’－ＣＴＧ
ＧＧＣ ＴＡＣ ＡＣＴ ＧＡＧ ＣＡＣ Ｃ－３’（配列番号７５）、５’－ＡＡＧ ＴＧＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＡＧＧ ＧＣＡ ＡＴＧ－３’（配列番号７６）。定量的ＰＣＲは、QuantStudio 3リアルタイムＰＣＲシステム（Thermo Fisher
Scientific）で実施した。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨによって正規化し、比較ＣＴ法を使用して算出した。
蛍光画像分析
ヒトＳＮＣＡ遺伝子の３’－ＵＴＲをＥＧＦＰコード領域の下流に含むＥＧＦＰレポータープラスミドを使用して、ＳＮＣＡおよびＴＭＥＭ１０６Ｂノックダウンプラスミドを検証した。ＥＧＦＰレポータープラスミドおよび候補ノックダウンプラスミドを、ポリ－Ｌ－リジンを被覆した９６ウェルプレート（３．０×１０４細胞／ウェル）上にプレーティングしたＨＥＫ２９３細胞に、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬（１０μｌのOpti-MEM溶液中、０．０４μｇのレポータープラスミド、０．０６μｇのノックダウンプラスミドおよび０．３μｌの試薬）を使用して、同時にトランスフェクトした。７２時間後、ＥＧＦＰシグナルの蛍光強度を、励起４８８ｎｍ／発光５１２ｎｍで、Varioskan LUXマルチモードリーダー（Thermo Fisher
Scientific）を使用して測定した。細胞を、４％ＰＦＡで室温で１０分間固定し、４０μｇ／ｍｌの７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）を含むＤ－ＰＢＳで、室温で３０分間インキュベートした。Ｄ－ＰＢＳで洗浄した後、７－ＡＡＤシグナルの蛍光強度を、励起５４６ｎｍ／発光６４７ｎｍでVarioskanリーダーを使用して測定し、細胞数を定量化した。７－ＡＡＤシグナルレベルあたりの正規化ＥＧＦＰシグナルを、対照のノックダウン試料と比較した。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ヒトＳＮＣＡ遺伝子またはＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子の３’－ＵＴＲをＳＮＣＡコード領域の下流に含む、α－シヌクレインレポータープラスミドを使用して、タンパク質レベルでのノックダウンプラスミドを検証した。α－シヌクレインタンパク質のレベルを、ＨＥＫ２９３細胞から抽出した細胞溶解物を使用して、ＥＬＩＳＡ（#KHB0061, Thermo Fisher Scientific）で測定した。候補プラスミドを、４８ウェルプレート（７．５×１０４細胞／ウェル）にプレーティングしたＨＥＫ２９３細胞に、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬（２５μｌのOpti-MEM溶液中、０．１μｇのレポータープラスミド、０．１５μｇのノックダウンプラスミド、および０．７５μｌの試薬）を使用して、一時的にトランスフェクトした。７２時間後、細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（#P8340, Sigma-Aldrich）を補充したラジオイムノ沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）バッファー（#89900, Thermo Fisher Scientific）に溶解し、数秒間超音波処理した。氷上で３０分間インキュベートした後、細胞溶解物を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質レベルを定量化した。プレートを、Varioskanプレートリーダーで４５０ｎｍで読み取り、SoftMax Pro 5ソフトウェアを使用して濃度を算出した。測定されたタンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイ（#23225, Thermo Fisher Scientific）で決定した総タンパク質濃度に対して正規化した。
図３７および表５は、ＧＦＰレポーターアッセイ（上）およびα－Ｓｙｎアッセイ（下）による、in vitroでのＳＣＮＡの成功したサイレンシングを示す代表的なデータを示す。図３８および表６は、ＧＦＰレポーターアッセイ（上）およびα－Ｓｙｎアッセイ（下）による、in vitroでのＴＭＥＭ１０６Ｂの成功したサイレンシングを示す代表的なデータを示す。
例１１：ＩＴＲ「Ｄ」配列の配置および細胞の形質導入
ＩＴＲ「Ｄ」配列の配置の、ｒＡＡＶベクターの細胞の形質導入に対する効果を調べた。ＨＥＫ２９３細胞は、ＧｃａｓｅをコードするｒＡＡＶであって、図２０に示すように１）野生型ＩＴＲ（例えば、導入遺伝子インサートの近位でＩＴＲの末端から遠位の「Ｄ」配列）、または２）ベクターの「外側」に位置する「Ｄ」配列（例えば、ＩＴＲの末端の近位で、導入遺伝子インサートの遠位に位置する「Ｄ」配列）を有するＩＴＲ、を有するものを用いて形質導入した。驚くべきことにデータは、「外側」の位置にある「Ｄ」配列を有するｒＡＡＶが、パッケージングされる能力を保持し、細胞を効率的に形質導入することを示している（図４０）。
例１２：プログラニュリンｒＡＡＶのin vitro試験
図３９は、ＰＧＲＮをコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。プログラニュリンは、ＧＲＮ欠損についてヘテロ接合性またはホモ接合性であるＧＲＮ欠損齧歯類のＣＮＳにおいて、ＰＧＮをコードするｒＡＡＶベクター（コドン最適化ＰＧＲＮなど）を実質内注射または大槽等への髄腔内注射のいずれかによって注入することにより、過剰発現される。
マウスは２か月齢または６か月齢で注射され、６か月または１２か月まで育成され、以下の１つ以上について分析される：ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルでのＧＲＮの発現レベル、行動アッセイ（例：運動の改善）、生存アッセイ（例：生存期間の改善）、ミクログリアおよび炎症マーカー、神経膠症、神経細胞の喪失、リポフスチン症、および／またはＬＡＭＰ１などのリソソームマーカー蓄積の救済。ＰＧＲＮ欠損マウスに対するアッセイは、例えば、Arrant et al. (2017) Brain 140: 1477-1465；Arrant
et al. (2018) J. Neuroscience 38(9):2341-2358；およびAmado
et al. (2018) doi:https://doi.org/10.1101/30869に記載されている；その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
均等物
本出願には、以下の文献の内容全体が参照により組み込まれる：２０１８年１０月３日に提出された代理人整理番号P1094.70002WO00により参照される国際ＰＣＴ出願；２０１８年１０月３日に提出された代理人整理番号P1094.70004WO00により参照される国際ＰＣＴ出願；２０１７年１０月３日に提出された米国仮出願第62/567,296号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」；２０１７年１０月３日に提出された第62/567,311号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」；２０１７年１０月３日に提出された第62/567,319号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」；２０１８年１０月３日に提出された第62/567,301号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」；２０１７年１０月３日に提出された第62/567,310号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」；２０１７年１０月３日に提出された第62/567,303号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」；および２０１７年１０月３日に提出された第62/567,305号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」。
本発明の少なくとも１つの態様のいくつかの側面をこのように説明してきたが、様々な変更、修正、および改善が当業者には容易に思い浮かぶであろうことを理解されたい。かかる変更、修正、および改善は、この開示の一部であることが意図されており、本発明の精神および範囲の内にあることが意図されている。したがって、前述の説明および図面は、例示としてのみのものである。
本明細書では本発明のいくつかの態様を説明および図示してきたが、当業者は、本明細書に記載の機能を実行し、および／または結果および／または1つ以上の利点を取得するための、さまざまな他の手段および／または構造を容易に思い浮かべるであろうし、かかる変更および／または修正のそれぞれは、本発明の範囲内であると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、本発明の教示が使用される特定の用途（単数または複数）に依存することを、容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。したがって、前述の態様は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、本発明は、具体的に記載されおよび特許請求された以外の方法で実施できることを理解されたい。本発明は、本明細書に記載の個々の特徴、システム、物品、材料、および／または方法を対象とする。さらに、２つ以上のかかる特徴、システム、物品、材料、および／または方法の任意の組み合わせは、かかる特徴、システム、物品、材料、および／または方法が相互に矛盾しない場合、本発明の範囲内に含まれる。
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「a」および「an」は、明確に逆が示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲で使用される「および／または」という語句は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素を意味すると理解すべきである。明確に逆が示されない限り、任意に他の要素も、「および／または」節で具体的に識別された要素以外に、具体的に識別された要素に関連するかどうかに関係なく存在し得る。したがって非限定的な例として、「含む」などのオープンエンドの言語と組み合わせて使用される場合の「Ａおよび／またはＢ」への言及は、一態様では、ＢなしでＡを指す（任意にＢ以外の要素を含む）ことができ；別の態様では、ＡなしでＢを指す（任意にＡ以外の要素を含む）ことができ；さらに別の態様では、ＡおよびＢの両方を指す（任意に他の要素を含む）ことができる；など。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包括的、すなわち要素の数またはリストの少なくとも１つを含み、さらにまた複数も含み、および任意にリストされていない追加の項目を含むものとして解釈される。明確に逆の用語が示されている場合、例えば「１つのみ」または「正確に１つ」など、または特許請求の範囲で使用されている場合の「からなる」は、要素の数またはリストの正確に１つを含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、排他性の用語、例えば「いずれか」、「１つ」または「１つのみ」、または「正確に１つ」が先行する場合には、排他的選択肢（すなわち、一方または他方だが、両方ではない）を指すとして解釈されるべきである。特許請求の範囲で使用される場合の「から本質的になる」は、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関して「少なくとも１つ」という語句は、要素のリストの任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されたい；ただし、要素のリスト内に具体的にリストされているすべてのそれぞれの要素の少なくとも１つを必ずしも含む必要はなく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外することもない。この定義により、「少なくとも１つ」という句が参照する要素のリスト内で具体的に識別された要素以外の要素が、具体的に識別された要素に関連するかどうかに関係なく、任意に存在可能とされる。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一態様では、少なくとも１つ、任意に複数のＡを含み、Ｂが存在しない（および任意にＢ以外の要素を含む）；別の態様では、少なくとも１つ、任意に複数のＢを含み、Ａが存在しない（任意にＡ以外の要素を含む）；さらに別の態様では、少なくとも１つ、任意に複数のＡを含み、および少なくとも１つ、任意に複数のＢを含む（および任意に他の要素を含む）；など。
特許請求の範囲、および上記の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「保持する（carrying）」、「有する」、「含有する」、「含む（involving）」、「保有する（holding）」などのすべての移行句は、オープンエンドとして、すなわち、限定することなく含むことを意味すると理解されたい。「からなる」および「本質的にからなる」という移行句のみが、米国特許庁の特許審査手続きマニュアルのSection 2111.03に記載されているように、それぞれクローズまたはセミクローズの移行句とする。
「第１」、「第２」、「第３」などの順序を示す用語の、クレーム要素を修飾するためのクレームにおける使用は、それ自体では、あるクレーム要素の他に対する優先権、先行、もしくは順序、または方法の行為が実行される時間的な順序を示すものではなく、しかし、特定の名前を有する一定のクレーム要素を、同じ名前（ただし順序用語のみが異なる）の別の要素から区別するためのラベルとしてのみ使用されて、クレーム要素を区別する。
明確に逆が示されない限り、１つ以上のステップまたは行為を含む本明細書で特許請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は必ずしも、方法のステップまたは行為が示されている順序に限定されないことも、理解されるべきである。
配列
いくつかの態様において、１つ以上の遺伝子産物（例えば、第１、第２および／または第３の遺伝子産物）をコードする発現カセットは、配列番号１～７８のいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれからなる（または該配列を有するペプチドをコードする）。いくつかの態様において、遺伝子産物は、配列番号１～７８のいずれか１つの一部（例えば、断片）によってコードされる。

Claims (45)

  1. （ｉ）配列番号５８に示される核酸配列によってコードされるＴＲＥＭ２タンパク質、および配列番号１５に示される核酸配列によってコードされるＧｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子を含む発現構築物；および
    （ｉｉ）発現構築物に隣接する２つのアデノ随伴ウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、
    を含む、単離された核酸。
  2. 導入遺伝子が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の単離された核酸。
  3. プロモーターが、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項２に記載の単離された核酸。
  4. ＣＭＶエンハンサーをさらに含む、請求項２に記載の単離された核酸。
  5. ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  6. ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールをさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  7. 各ＩＴＲ配列が、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である、請求項１に記載の単離された核酸。
  8. 各ＩＴＲ配列が、導入遺伝子に近位である「Ｄ」領域（配列番号２７）を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  9. 少なくとも１つのＩＴＲ配列が、導入遺伝子に対してＩＴＲ配列の外側に配置された「Ｄ」領域（配列番号２７）を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  10. 導入遺伝子に対して５’に配置されたＩＴＲ配列が、導入遺伝子に近位である「Ｄ」領域（配列番号２７）を含み、導入遺伝子に対して３’に配置されたＩＴＲ配列が、導入遺伝子に対してＩＴＲ配列の外側に配置された「Ｄ」領域（配列番号２７）を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  11. ５’ＩＴＲの核酸配列が、配列番号１のヌクレオチド１～１４５であり、３’ＩＴＲの核酸配列が、配列番号１のヌクレオチド３８６７～４０１１である、請求項１０に記載の単離された核酸。
  12. ５’ＩＴＲと導入遺伝子との間のＴＲＹ領域をさらに含み、ここで、ＴＲＹ領域が、配列番号２８に示される配列を有する、請求項１１に記載の単離された核酸。
  13. ２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接されるＴＲＥＭ２タンパク質およびＧｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子を含む発現構築物を含む核酸を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ＴＲＥＭ２タンパク質は、配列番号５８に示される核酸配列によってコードされ、およびＧｃａｓｅタンパク質は、配列番号１５に示される核酸配列によってコードされる、前記ｒＡＡＶベクター。
  14. 導入遺伝子が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１３に記載のｒＡＡＶベクター。
  15. プロモーターが、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項１４に記載のｒＡＡＶベクター。
  16. ＣＭＶエンハンサーをさらに含む、請求項１４に記載のｒＡＡＶベクター。
  17. ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む、請求項１３に記載のｒＡＡＶベクター。
  18. ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールをさらに含む、請求項１３に記載のｒＡＡＶベクター。
  19. 各ＩＴＲ配列が、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である、請求項１３に記載のｒＡＡＶベクター。
  20. 各ＩＴＲ配列が、導入遺伝子に近位である「Ｄ」領域（配列番号２７）を含む、請求項１３に記載のｒＡＡＶベクター。
  21. 少なくとも１つのＩＴＲ配列が、導入遺伝子に対してＩＴＲ配列の外側に配置された「Ｄ」領域（配列番号２７）を含む、請求項１３に記載のｒＡＡＶベクター。
  22. 導入遺伝子に対して５’に配置されたＩＴＲ配列が、導入遺伝子に近位である「Ｄ」領域（配列番号２７）を含み、導入遺伝子に対して３’に配置されたＩＴＲ配列が、導入遺伝子に対してＩＴＲ配列の外側に配置された「Ｄ」領域（配列番号２７）を含む、請求項１３に記載のｒＡＡＶベクター。
  23. ５’ＩＴＲの核酸配列が、配列番号１のヌクレオチド１～１４５であり、３’ＩＴＲの核酸配列が、配列番号１のヌクレオチド３８６７～４０１１である、請求項２２に記載のｒＡＡＶベクター。
  24. ５’ＩＴＲと導入遺伝子との間のＴＲＹ領域をさらに含み、ここで、ＴＲＹ領域が、配列番号２８に示される配列を有する、請求項２３に記載のｒＡＡＶベクター。
  25. （ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質；および
    （ｉｉ）請求項１３に記載のｒＡＡＶベクター
    を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
  26. ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ９カプシドタンパク質である、請求項２５に記載のｒＡＡＶ。
  27. ５’から３’の順で以下を含む核酸：
    （ａ）５’ＡＡＶ ＩＴＲ；
    （ｂ）ＣＭＶエンハンサー；
    （ｃ）ＣＢＡプロモーター；
    （ｄ）配列番号５８に示される核酸配列によってコードされるＴＲＥＭ２タンパク質、および配列番号１５に示される核酸配列によってコードされるＧｃａｓｅタンパク質をコードする導入遺伝子；
    （ｅ）ＷＰＲＥ；
    （ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテール；および
    （ｇ）３’ＡＡＶ ＩＴＲ
    を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
  28. （ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質；および
    （ｉｉ）請求項２７に記載のｒＡＡＶベクター
    を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
  29. ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ９カプシドタンパク質である、請求項２８に記載のｒＡＡＶ。
  30. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された核酸を含む、プラスミド。
  31. 配列番号５８に示される核酸配列および配列番号１５に示される核酸配列を含む、バキュロウイルスベクター。
  32. （ｉ）１以上のアデノ随伴ウイルスｒｅｐタンパク質および／または１以上のアデノ随伴ウイルスｃａｐタンパク質をコードする第１のベクター；および
    （ｉｉ）配列番号５８に示される核酸配列および配列番号１５に示される核酸配列を含む第２のベクター
    を含む、細胞。
  33. 第１のベクターがプラスミドであり、第２のベクターがプラスミドである、請求項３２に記載の細胞。
  34. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項３３に記載の細胞。
  35. 哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項３４に記載の細胞。
  36. 第１のベクターがバキュロウイルスベクターであり、第２のベクターがバキュロウイルスベクターである、請求項３２に記載の細胞。
  37. 細胞が昆虫細胞である、請求項３６に記載の細胞。
  38. 昆虫細胞がＳＦ９細胞である、請求項３７に記載の細胞。
  39. 請求項２５、２６、２８および２９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを生成する方法であって、
    （ｉ）１以上のアデノ随伴ウイルスｒｅｐタンパク質および／または１以上のアデノ随伴ウイルスｃａｐタンパク質をコードする第１のベクター、ならびに、配列番号５８の核酸配列および配列番号１５の核酸配列を含む発現カセットを含む組換えＡＡＶベクターを、細胞へ送達すること；
    （ｉｉ）ｒＡＡＶのパッケージングを許容する条件下で細胞を培養すること；および
    （ｉｉｉ）ｒＡＡＶの収集のために、培養した宿主細胞または培養培地を回収すること
    を含む、前記方法。
  40. アルツハイマー病を有するか、またはこれを有することが疑われる対象を処置するための医薬組成物であって、請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、請求項１３～２４および２７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター、または請求項２５、２６、２８および２９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを含む、前記組成物。
  41. 組成物が対象に投与され、および、投与が対象のＣＮＳへの直接注射を含む、請求項４０に記載の組成物。
  42. 直接注射が、脳内注射、実質内注射、髄腔内注射、大槽内（ＩＣＭ）注射、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項４１に記載の組成物。
  43. 対象のＣＮＳへの直接注射が、対流強化送達（ＣＥＤ）を含む、請求項４１に記載の組成物。
  44. 組成物が対象に投与され、および、投与が末梢注射を含む、請求項４０に記載の組成物。
  45. 末梢注射が静脈内注射である、請求項４４に記載の組成物。
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