BR112020015967A2 - Promotor e vetor específicos de oligodendrócitos, mirna específico a um gene plp1, vetor, composição farmacêutica, e, métodos para tratar uma doença associada à anormalidade de um gene plp1 e para suprimir a expressão de um gene plp1. - Google Patents

Promotor e vetor específicos de oligodendrócitos, mirna específico a um gene plp1, vetor, composição farmacêutica, e, métodos para tratar uma doença associada à anormalidade de um gene plp1 e para suprimir a expressão de um gene plp1. Download PDF

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Yu Ohki
Makoto Koizumi
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Abstract

o objetivo da presente invenção é prover um vetor, um promotor e mirna para o mesmo, e uma composição farmacêutica incluindo o vetor, através dos quais a expressão do gene plp1 pode ser suprimida especificamente em oligodendrócitos a fim de tratar pmd causada por anormalidade no gene plp1.. este promotor específico de oligodendrócitos inclui um ácido nucleico tendo uma identidade de sequência de pelo menos 90% com a sequência de base representada por seq id no: 1. este mirna específico para o gene plp1 tem um par de sequências de base que compreende uma sequência antissentido e uma sequência de sentido predeterminadas.

Description

1 / 39 PROMOTOR E VETOR ESPECÍFICOS DE OLIGODENDRÓCITOS, MIRNA ESPECÍFICO A UM GENE PLP1, VETOR, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODOS PARA TRATAR UMA DOENÇA ASSOCIADA À ANORMALIDADE DE UM GENE PLP1 E PARA SUPRIMIR A EXPRESSÃO DE UM GENE PLP1 Campo técnico
[001] A presente invenção refere-se a um promotor específico de oligodendrócitos, em particular, a um promotor específico de oligodendrócitos compreendendo um ácido nucleico tendo uma identidade de sequência de pelo menos 90% a uma sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 1. A presente invenção também se refere a um miRNA específico a um gene PLP1. Além disso, a presente invenção refere-se a um vetor compreendendo o promotor e/ou o miRNA e uma composição farmacêutica compreendendo o vetor. Fundamentos da Técnica
[002] Leucodistrofias hipomielinizantes é um termo coletivo para doenças cerebrais em crianças causadas pelo mau desenvolvimento da substância branca do cérebro, e atualmente são conhecidas 11 doenças. Uma doença representativa entre eles é a doença de Pelizaeus-Merzbacher (PMD). A PMD é uma doença intratável rara, distinguida pelo fato de que a mielinização do sistema nervoso central é desordenada e causa falha no desenvolvimento das funções motoras e sintomas neurológicos imediatamente após o nascimento. A incidência estimada no Japão é de 1,45 indivíduos por 100.000 recém-nascidos do sexo masculino. Atualmente, não há cura fundamental.
[003] A mielina é gerada por oligodendrócitos (oligodendróglia), uma das células da glia, no cérebro, e possui uma estrutura de multicamadas de fosfolipídeos isolante presente em torno do axônio de um neurônio. Uma proteína primária que constitui a mielina é a proteína proteolipídica (PLP), a
2 / 39 proteína básica de mielina (MBP), a nucleotídeo fosfodiesterase 2’,3’-cíclica humana (CNP) e assim por diante, também são conhecidas como outros constituintes. A PMD é causada por anormalidades de um gene da proteína proteolipídica (gene PLP1). A mutação mais frequente entre essas anormalidades é a duplicação de PLP1 (cerca de 60%). A duplicação de PLP1 leva à superexpressão do gene PLP1, pelo qual se espera que a normalização do seu nível de expressão proveja efeito terapêutico.
[004] A literatura não patente 1 descreveu a expressão de proteína fluorescente verde (GFP) mediada por vírus adenoassociado (AAV), acionada pelo promotor de proteína básica de mielina (MBP) ou pelo promotor de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) no cérebro de camundongos em desenvolvimento, e relatou que a expressão de GFP acionada pelo promotor de GFAP era altamente específica para astrócitos após a injeção de um vetor no cérebro de camundongos neonatais e camundongos adultos. A literatura não patente 1 também relatou que a seletividade do promotor de MBP para oligodendrócitos era baixa após a entrega do AAV logo após o nascimento, mas era superior após a injeção de um vetor 10 dias após o nascimento. Este documento sugeriu que a injeção direta de AAV acionada por um promotor específico do tipo de célula no cérebro desenvolvido após o nascimento gera expressão de transgene de longo prazo alvejada nas células gliais.
[005] A Literatura Não Patente 2 descreveu o desenvolvimento da terapia genética alvo para oligodendrócitos na doença de Pelizaeus-Merzbacher símile, e relatou que um gene GJC2/Cx47 foi inserido a jusante de um promotor de proteína básica de mielina e administrado em camundongos de 10 dias de idade através de injeção intracerebral única na cápsula interna com um vetor de vírus adenoassociado (AAV.MBP.Cx47myc).
[006] Cada uma das Literaturas Não Patentes 1 e 2 descreve terapia
3 / 39 genética e um promotor para ela com o uso de um vetor AAV, mas não descreveu nenhuma terapia genética para anormalidade do gene PLP1 e um promotor ou miRNA para a mesma. Lista de citações Literatura Não Patente
[007] Literatura Não Patente 1: von Jonquieres G et al., Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 2013 Jun 14; 8(6) : e65646.
[008] Literatura Não Patente 2: Georgiou E et al., Gene therapy targeting oligodendrocytes provides therapeutic benefit in a leukodystrophy model. Brain. 2017 Mar 1; 140(3): 599-616. Sumário da invenção Problema técnico
[009] Um objeto da presente invenção é prover um vetor capaz de suprimir especificamente para oligodendrócitos a expressão do gene PLP1 para tratar PMD causada por anormalidade do gene PLP1 e um promotor e miRNA para o mesmo, e uma composição farmacêutica compreendendo o vetor. Solução para o Problema
[0010] Os presentes inventores verificaram que um promotor de nucleotídeo fosfodiesterase 2’,3’-cíclica humana (CNP) tendo uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 pode acionar a expressão genética de uma maneira específica de oligodendrócitos e altamente eficiente, e essa expressão do gene PLP1 é suprimida com sucesso com um vetor AAV compreendendo o promotor e um miRNA específico do gene PLP1 operacionalmente ligado à jusante do promotor, completando assim a presente invenção.
[0011] Especificamente, a presente invenção refere-se aos seguintes.
[0012] [1] Um promotor específico de oligodendrócitos
4 / 39 compreendendo um ácido nucleico tendo uma identidade de sequência de pelo menos 90% a uma sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO:
1.
[0013] [2] O promotor de acordo com [1], compreendendo um ácido nucleico tendo a sequência nucleotídica apresenta na SEQ ID NO: 1.
[0014] [3] Um vetor específico de oligodendrócitos compreendendo o promotor de acordo com [1] ou [2].
[0015] [4] O vetor de acordo com [3], compreendendo adicionalmente uma sequência de miRNA específica a um gene PLP1 humano operacionalmente ligado ao promotor.
[0016] [5] Um miRNA compreendendo um par de sequências nucleotídicas consistindo em uma sequência antissentido e uma sequência de sentido e sendo específico a um gene PLP1, em que o par de sequências nucleotídicas é selecionado a partir do grupo que consiste em pares de uma sequência antissentido apresentada em um coluna esquerda da Tabela 1 e uma sequência de sentido apresentada à direita da sequência antissentido em uma coluna direita da tabela.
[0017] [6] O miRNA de acordo com [5], compreendendo uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2 a 7 e 24 a 51.
[0018] [7] O miRNA de acordo com [5], compreendendo uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2 a 5, 7, 24, 26, 29 a 32, 35, 36, 42, e 51.
[0019] [8] O miRNA de acordo com [5], compreendendo uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 29, 31, e 32.
[0020] [9] Um vetor compreendendo uma sequência do miRNA de acordo com qualquer um de [5] a [8].
[0021] [10] O vetor de acordo com [9], em que a sequência do
5 / 39 miRNA está operacionalmente ligada a um promotor específico de oligodendrócitos.
[0022] [11] O vetor de acordo com [10], em que o promotor específico de oligodendrócitos é o promotor de acordo com [1] ou [2].
[0023] [12] O vetor de acordo com qualquer um de [3], [4] e [9] a
[11], em que o vetor é um vetor de vírus adenoassociado (AAV).
[0024] [13] Uma composição farmacêutica compreendendo o vetor de acordo com qualquer um de [3], [4] e [9] a [12].
[0025] [14] A composição farmacêutica de acordo com [13], em que a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença associada à anormalidade em um gene PLP1.
[0026] [15] A composição farmacêutica de acordo com [14], em que a doença é a doença de Pelizaeus-Merzbacher, paraplegia espástica tipo 2 ou esclerose múltipla.
[0027] [16] A composição farmacêutica de acordo com [14], em que a doença é a doença de Pelizaeus-Merzbacher.
[0028] [17] A composição farmacêutica de acordo com [13], em que a composição farmacêutica é um supressor de expressão do gene PLP1 que suprime a expressão do gene PLP1.
[0029] [18] Um método para tratar uma doença associada à anormalidade de um gene PLP1, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do vetor de acordo com qualquer um de [3], [4] e
[9] a [12] a um paciente com necessidade de tratamento.
[0030] [19] O método de acordo com [18], em que a doença é a doença de Pelizaeus-Merzbacher, paraplegia espástica tipo 2 ou esclerose múltipla.
[0031] [20] O método de acordo com [18], em que a doença é a doença de Pelizaeus-Merzbacher.
[0032] [21] Um método para suprimir a expressão de um gene PLP1,
6 / 39 compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do vetor de acordo com qualquer um de [3], [4] e [9] a [12] a um paciente com necessidade de tratamento.
[0033] [22] O vetor de acordo com qualquer um de [3], [4] e [9] a
[12] para uso no tratamento de uma doença associada à anormalidade de um gene PLP1.
[0034] [23] O vetor de acordo com [22], em que a doença é a doença de Pelizaeus-Merzbacher, paraplegia espástica tipo 2 ou esclerose múltipla.
[0035] [24] O vetor de acordo com [22], em que a doença é a doença de Pelizaeus-Merzbacher. Efeitos Vantajosos da Invenção
[0036] O vetor AAV compreendendo o promotor da presente invenção é capaz de expressar um gene de maneira específica de oligodendrócitos e altamente eficiente, e além disso, suprime com sucesso a expressão do gene PLP1 através da inclusão de uma sequência de miRNA específica para o gene PLP1 humano operacionalmente ligado ao promotor e, portanto, pode servir como um fármaco terapêutico para PMD causado pela duplicação de PLP1, etc. Breve Descrição dos Desenhos
[0037] [Figura 1] A Figura 1 mostra um diagrama esquemático de um vetor AAV do Exemplo 1.
[0038] [Figura 2] A Figura 2 mostra fotografias representando resultados de coloração por imunofluorescência na especificidade de células que expressam AAV no Exemplo 2.
[0039] [Figura 3] A Figura 3 mostra um gráfico representando os resultados da medição sítio a sítio da supressão da expressão (knockdown) em termos dos níveis de expressão do gene PLP1 com base na intensidade da fluorescência gerada pela coloração por imunofluorescência de PLP1 no Exemplo 3.
7 / 39
[0040] [Figura 4] A Figura 4 mostra gráficos que representam os resultados da medição da supressão da expressão (knockdown) em termos de níveis de expressão do gene PLP1 por meio de PCR quantitativo no Exemplo
4. (A) e (B) mostram níveis de expressão relativa do gene PLP1 e níveis de expressão relativa do gene Olig2, respectivamente.
[0041] [Figura 5] A Figura 5 mostra fotografias representando os resultados da análise histológica por imunocoloração após administração a camundongos PLP1-Tg no Exemplo 5.
[0042] [Figura 6] A Figura 6 mostra fotografias representando os resultados da análise micromorfológica com um microscópio eletrônico após administração a camundongos PLP1-Tg no Exemplo 5.
[0043] [Figura 7] A Figura 7 mostra um gráfico representando o efeito de prolongamento da vida provido pela administração a camundongos PLP1-Tg no Exemplo 5.
[0044] [Figura 8] A Figura 8 mostra um gráfico representando o efeito de ganho de peso corporal provido pela administração a camundongos PLP1-Tg no Exemplo 5.
[0045] [Figura 9] A Figura 9 mostra um gráfico que representa os resultados da medição da supressão da expressão (knockdown) em termos de níveis de expressão do gene PLP1 por meio de PCR quantitativo no Exemplo
6.
[0046] [Figura 10] A Figura 10 mostra um gráfico que representa os resultados da medição da supressão da expressão (knockdown) em termos de níveis de expressão do gene PLP1 por meio de PCR quantitativo no Exemplo
7.
[0047] [Figura 11] A Figura 11 mostra um gráfico que representa os resultados da medição da supressão da expressão (knockdown) em termos de níveis de expressão do gene PLP1 por meio de PCR quantitativo no Exemplo
8.
8 / 39
[0048] [Figura 12] A Figura 12 mostra um gráfico que representa os resultados da medição da supressão da expressão (knockdown) em termos de níveis de expressão do gene PLP1 por meio de PCR quantitativo no Exemplo
9.
[0049] [Figura 13] A Figura 13 mostra um gráfico representando os resultados da medição sítio a sítio da supressão da expressão (knockdown) em termos dos níveis de expressão do gene PLP1 com base na intensidade da fluorescência gerada pela coloração por imunofluorescência de PLP1 no Exemplo 10. Descrição das Modalidades [Promotor]
[0050] O promotor da presente modalidade é um promotor específico de oligodendrócitos compreendendo um ácido nucleico tendo uma identidade de sequência de pelo menos 90%, preferencialmente tendo uma identidade de sequência de pelo menos 95%, mais preferencialmente tendo uma identidade de sequência de pelo menos 98%, a uma sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 1, um modo particularmente preferido compreendendo um ácido nucleico tendo a sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 1. Além do ácido nucleico tendo uma identidade de sequência de pelo menos 90% à sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 1, o promotor pode incluir em uma extremidade das sequências nucleotídicas do promotor de sítios para clonagem em vetores, como os sítios das enzimas de restrição e uma sequência att para a clonagem Gateway.
[0051] O ácido nucleico tendo a sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 1 é um promotor de CNP humano e derivado de chr17:40,118,309-40,120,101 da sequência de referência do genoma humano (GRCh37/hg19). O gene CNP humano é um gene expresso especificamente em oligodendrócitos no cérebro, e a especificidade é inferida como sendo determinada pela sequência do promotor. Os presentes inventores
9 / 39 verificaram que a sequência do promotor de CNP humano apresentada na SEQ ID NO: 1 é capaz de expressar genes de expressão específica de oligodendrócitos, exceto o gene CNP, que são dispostos à jusante do promotor.
[0052] O promotor da presente modalidade é um promotor que opera especificamente em oligodendrócitos, em que os genes operacionalmente ligados à jusante do promotor são expressos especificamente em oligodendrócitos. O promotor da presente modalidade pode ser obtido através de uma abordagem de engenharia genética. Por exemplo, um gene para o promotor CNP humano é obtido a partir de um genoma humano, e alguns nucleotídeos são excluídos, inseridos ou substituídos para obter um promotor tendo a sequência nucleotídica desejada. Alternativamente, um promotor tendo uma sequência nucleotídica desejada pode ser obtido através de síntese parcial ou completa. [miRNA]
[0053] Um miRNA normalmente inclui uma sequência antissentido e uma sequência de sentido e pode formar uma estrutura em forma de grampo, processada desse modo em um miRNA maduro. A fita antissentido no miRNA maduro se liga a um mRNA alvo para decompor o mRNA ou causar repressão translacional, suprimindo assim a expressão do gene alvo. O miRNA da presente modalidade é um miRNA específico ao gene PLP1, em particular ao gene PLP1 humano, inclui uma sequência antissentido e uma sequência de sentido, e é capaz de suprimir a expressão do gene PLP1.
[0054] É preferível que uma sequência flanqueadora 5’, uma sequência antissentido, uma sequência de haste-alça, uma sequência de sentido e uma sequência flanqueadora 3’ sejam dispostas na ordem a partir do lado 5’ no miRNA da presente modalidade. É necessário que a configuração seja tal que a sequência flanqueadora 5’ tenha um comprimento de 25 a 100 nucleotídeos, a sequência de haste-alça tenha um comprimento
10 / 39 de 4 a 30 nucleotídeos e a sequência flaqueadora 3’ tenha um comprimento de 25 a 100 nucleotídeos.
[0055] Cada sequência flanqueadora precisa ser uma sequência flanqueadora conhecida por ser geralmente expressa em oligodendrócitos e, por exemplo, uma sequência flanqueadora 5’ e uma sequência flanqueadora 3’ que são conhecidas por serem sequências derivadas de miR155 podem ser usadas. Além da sequência flanqueadora 5’ e da sequência flanqueadora 3’ derivada de miR155, uma sequência flanqueadora 5’ e sequência flanqueadora 3’ de qualquer um dos miR-138, miR-219, miR-9, miR-23a, miR-388, e o miR-297c, que se sabe ser expresso em oligodendrócitos, podem ser usadas.
[0056] A sequência de miRNA específica para o gene PLP1 humano pode ser projetada, por exemplo, usando software como o BLOCK-iT (TM) RNAi Designer (Thermo Fisher Scientific, EUA) e, por exemplo, as seguintes sequências nucleotídicas candidatas PLP1-miRNA humanas podem ser utilizadas.
[0057] Sequência nucleotídica candidata PLP1-miRNA humanas 1 (SEQ ID NO: 2): 5’-
AAAGGAAGAAGAAAGAGGCAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTGC CTCTCTTCTTCCTTT -3’ Sequência nucleotídica candidata PLP1-miRNA humana 2 (SEQ ID NO: 3): 5’-
AACACCAGGAGCCACACAACGGTTTTGGCCACTGACTGACCGTTG TGTCTCCTGGTGTT -3’ Sequência nucleotídica candidata PLP1-miRNA humana 3 (SEQ ID NO: 4): 5’-
11 / 39
TTCCATGGGAGAACACCATACGTTTTGGCCACTGACTGACGTATG GTGCTCCCATGGAA -3’ Sequência nucleotídica candidata PLP1-miRNA humana 4 (SEQ ID NO: 5): 5’-
TGAGCAGGGAAACCAGTGTAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTACA CTGTTCCCTGCTCA-3’ Sequência nucleotídica candidata PLP1-miRNA humana 5 (SEQ ID NO: 6): 5’-
AGGGCTTTCTGATTGACAGCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGCTG TCACAGAAAGCCCT -3’ Sequência nucleotídica candidata PLP1-miRNA humana 6 (SEQ ID NO: 7): 5’- ACCCCAAAGAAACACAATCCAGTTTTGGCCACTGACTGACtggattgtt tctttggggt -3’ Sequência nucleotídica candidata PLP1-miRNA humana 7 (SEQ ID NO: 24): 5’-
ACAAATGCAGCAATAAACAGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCTGT TTAGCTGCATTTGT -3’ Sequência nucleotídica candidata PLP1-miRNA humana 8 (SEQ ID NO: 25): 5’-
AATAGACTGGCAGGTGGTCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGAC CACGCCAGTCTATT -3’ Sequência nucleotídica candidata PLP1-miRNA humana 9 (SEQ ID NO: 26):
12 / 39 5’-
AAAGAATGAGCTTGATGTTGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCAAC ATCGCTCATTCTTT -3’ Sequência nucleotídica candidata PLP1-miRNA humana 10 (SEQ ID NO: 27): 5’-
AGATACTCATAGTCTTGGTAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTACC AAGTATGAGTATCT -3’ Sequência nucleotídica candidata PLP1-miRNA humana 11 (SEQ ID NO: 28): 5’-
AAGCCCATGTCTTTGGGACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTC CCAGACATGGGCTT -3’
[0058] Alternativamente, a sequência de miRNA específica para o gene PLP1 humano pode ser projetada de tal maneira que os siRNAs artificiais sejam projetados como descrito nos Exemplos, e uma sequência ideal é selecionada a partir dos siRNAs para projetar o miRNA.
[0059] O miRNA da presente modalidade compreende um par de sequências nucleotídicas que consistem em uma sequência antissentido e uma sequência de sentido, e o par de sequências nucleotídicas pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em pares de uma sequência antissentido apresentada em uma coluna esquerda da Tabela 1 e uma sequência de sentido apresentada à direita da sequência antissentido em uma coluna direita da tabela. [Tabela 1] Tabela 1. Sequências antissentido e de sentido para miRNA projetadas para o gene PLP1 humano Sequência antissentido Sequência de sentido （ （ AAAGGAAGAAGAAAGAGGCAG SEQ ID NO: CTGCCTCTCTTCTTCCTTT SEQ ID NO: 53 ） 52 ）
13 / 39 AACACCAGGAGCCACACAACG （SEQ ID NO: CGTTGTGTCTCCTGGTGTT（SEQ ID NO: 55） 54 ） TTCCATGGGAGAACACCATAC （SEQ ID NO: GTATGGTGCTCCCATGGAA（SEQ ID NO: 57） 56 ） TGAGCAGGGAAACCAGTGTAG （SEQ ID NO: CTACACTGTTCCCTGCTCA（SEQ ID NO: 59） 58 ） AGGGCTTTCTGATTGACAGCC （SEQ ID NO: GGCTGTCACAGAAAGCCCT（SEQ ID NO: 61） 60 ） ACCCCAAAGAAACACAATCCA （SEQ ID NO: TGGATTGTTTCTTTGGGGT（SEQ ID NO: 63） 62 ） ACAAATGCAGCAATAAACAGG （SEQ ID NO: CCTGTTTAGCTGCATTTGT（SEQ ID NO: 65） 64 ） AATAGACTGGCAGGTGGTCCA （SEQ ID NO: TGGACCACGCCAGTCTATT（SEQ ID NO: 67） 66 ） AAAGAATGAGCTTGATGTTGG （SEQ ID NO: CCAACATCGCTCATTCTTT（SEQ ID NO: 69） 68 ） AGATACTCATAGTCTTGGTAG （SEQ ID NO: CTACCAAGTATGAGTATCT（SEQ ID NO: 71） 70 ） AGAAACACAATCCAGTGGCCA （SEQ ID NO: TGGCCACTATTGTGTTTCT（SEQ ID NO: 73） 72 ） AAATAGGTCTCAATTAGCTTT （SEQ ID NO: AAAGCTAAGAGACCTATTT（SEQ ID NO: 75） 74 ） AAGAAACACAATCCAGTGGCC （SEQ ID NO: GGCCACTGTTGTGTTTCTT（SEQ ID NO: 77） 76 ） TAAACAGGTGGAAGGTCATTT （SEQ ID NO: AAATGACCCCACCTGTTTA（SEQ ID NO: 79） 78 ） TTGTAGTCGCCAAAGATCTGC （SEQ ID NO: GCAGATCTGGCGACTACAA（SEQ ID NO: 81） 80 ） AATTAGAGCCTCCATTCCTTT （SEQ ID NO: AAAGGAATAGGCTCTAATT（SEQ ID NO: 83） 82 ） TTAAGGACGGCAAAGTTGTAA （SEQ ID NO: TTACAACTGCCGTCCTTAA（SEQ ID NO: 85） 84 ） TTTAAGGACGGCAAAGTTGTA （SEQ ID NO: TACAACTTCCGTCCTTAAA（SEQ ID NO: 87） 86 ） ATGTCTTTGGGACTCTGACTC （SEQ ID NO: GAGTCAGACCCAAAGACAT（SEQ ID NO: 89） 88 ） TATCTATCCTGTGTCTACCAG （SEQ ID NO: CTGGTAGACAGGATAGATA（SEQ ID NO: 91） 90 ） AAATTACTTTCTGATCCTCAG （SEQ ID NO: CTGAGGATGAAAGTAATTT（SEQ ID NO: 93） 92 ） TCTAACAAGCCCATGTCTTTG （SEQ ID NO: CAAAGACAGGCTTGTTAGA（SEQ ID NO: 95） 94 ） AATTACTTTCTGATCCTCAGG （SEQ ID NO: CCTGAGGAAGAAAGTAATT（SEQ ID NO: 97） 96 ） AGTAAATGTACACAGGCACAG （SEQ ID NO: CTGTGCCTGTACATTTACT（SEQ ID NO: 99） 98 ） TAAGTAAGGTTGGCTGAGTTA （SEQ ID NO: TAACTCAGAACCTTACTTA（SEQ ID NO: 101） 100 ） TTCTGTGGGTGAAAGATCCTT （SEQ ID NO: AAGGATCTCACCCACAGAA（SEQ ID NO: 102 ） 103） AGAAGATGCTGACAACACCCT （SEQ ID NO: AGGGTGTTCAGCATCTTCT（SEQ ID NO: 105） 104 ）
14 / 39 AATTGTAGCCGGCTGGCTAGT （SEQ ID NO: ACTAGCCACGGCTACAATT（SEQ ID NO: 107） 106 ） AGATTTGGGCAAACGCTCTTA （SEQ ID NO: TAAGAGCGTGCCCAAATCT（SEQ ID NO: 109） 108 ） ATTCTACGCTCCCTTATGCTG （SEQ ID NO: CAGCATAAGAGCGTAGAAT（SEQ ID NO: 110 ） 111） TGGTAATAGAGAGACCAGAAT （SEQ ID NO: ATTCTGGTCTCTATTACCA（SEQ ID NO: 113） 112 ） TATAGATGGCAAGAGGACCAA （SEQ ID NO: TTGGTCCTTGCCATCTATA（SEQ ID NO: 115） 114 ） AAACCAGTGTAGCTGCAGCCC （SEQ ID NO: GGGCTGCATACACTGGTTT（SEQ ID NO: 117） 116 ）
[0060] O miRNA da presente modalidade inclui preferencialmente qualquer um dos seguintes pares de sequências nucleotídicas.
[0061] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 52 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 53 como uma sequência de sentido
[0062] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 54 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 55 como uma sequência de sentido
[0063] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 56 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 57 como uma sequência de sentido
[0064] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 58 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 59 como uma sequência de sentido
[0065] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 62 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 63 como uma sequência de sentido
[0066] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 64 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 65 como uma sequência de sentido
[0067] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 68 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 69 como uma
15 / 39 sequência de sentido
[0068] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 72 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 73 como uma sequência de sentido
[0069] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 76 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 77 como uma sequência de sentido
[0070] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 78 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 79 como uma sequência de sentido
[0071] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 84 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 85 como uma sequência de sentido
[0072] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 86 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 87 como uma sequência de sentido
[0073] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 98 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 99 como uma sequência de sentido
[0074] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 116 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 117 como uma sequência de sentido
[0075] O miRNA da presente modalidade inclui mais preferencialmente qualquer um dos seguintes pares de sequências nucleotídicas.
[0076] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 52 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 53 como uma sequência de sentido
[0077] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID
16 / 39 NO: 72 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 73 como uma sequência de sentido
[0078] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 76 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 77 como uma sequência de sentido
[0079] - Um par de sequências nucleotídicas consistindo em SEQ ID NO: 78 como uma sequência antissentido e SEQ ID NO: 79 como uma sequência de sentido
[0080] Além disso, o miRNA da sequência da modalidade presente pode ter uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 29 a 51 apresentadas na Tabela 2. [Tabela 2] Tabela 2. Sequências de miRNA projetadas para o gene PLP1 humano SEQ ID NO: Sequência pré-miRNA 29 AGAAACACAATCCAGTGGCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGCCACTATTG
TGTTTCT 30 AAATAGGTCTCAATTAGCTTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAAGCTAAGAGA
CCTATTT 31 AAGAAACACAATCCAGTGGCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGCCACTGTTGT
GTTTCTT 32 TAAACAGGTGGAAGGTCATTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAATGACCCCAC
CTGTTTA 33 TTGTAGTCGCCAAAGATCTGCGTTTTGGCCACTGACTGACGCAGATCTGGCG
ACTACAA 34 AATTAGAGCCTCCATTCCTTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAAGGAATAGGC
TCTAATT 35 TTAAGGACGGCAAAGTTGTAAGTTTTGGCCACTGACTGACTTACAACTGCCG
TCCTTAA 36 TTTAAGGACGGCAAAGTTGTAGTTTTGGCCACTGACTGACTACAACTTCCGT
CCTTAAA 37 ATGTCTTTGGGACTCTGACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTCAGACCCA
AAGACAT 38 TATCTATCCTGTGTCTACCAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTGGTAGACAGG
ATAGATA 39 AAATTACTTTCTGATCCTCAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTGAGGATGAAA
GTAATTT 40 TCTAACAAGCCCATGTCTTTGGTTTTGGCCACTGACTGACCAAAGACAGGCT
TGTTAGA 41 AATTACTTTCTGATCCTCAGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCTGAGGAAGAA
AGTAATT 42 AGTAAATGTACACAGGCACAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTGTGCCTGTAC
ATTTACT 43 TAAGTAAGGTTGGCTGAGTTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAACTCAGAACC
TTACTTA 44 TTCTGTGGGTGAAAGATCCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGGATCTCACC
CACAGAA
17 / 39 45 AGAAGATGCTGACAACACCCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGGGTGTTCAGC
ATCTTCT 46 AATTGTAGCCGGCTGGCTAGTGTTTTGGCCACTGACTGACACTAGCCACGGC
TACAATT 47 AGATTTGGGCAAACGCTCTTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAAGAGCGTGCC
CAAATCT 48 ATTCTACGCTCCCTTATGCTGGTTTTGGCCACTGACTGACCAGCATAAGAGC
GTAGAAT 49 TGGTAATAGAGAGACCAGAATGTTTTGGCCACTGACTGACATTCTGGTCTCT
ATTACCA 50 TATAGATGGCAAGAGGACCAAGTTTTGGCCACTGACTGACTTGGTCCTTGCC
ATCTATA 51 AAACCAGTGTAGCTGCAGCCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGGCTGCATACA
CTGGTTT
[0081] O miRNA da presente modalidade pode ter uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2 a 7 e 24 a 51, preferencialmente tem uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2 a 5, 7, 24, 26, 29 a 32, 35, 36, 42 e 51 e, mais preferencialmente, tem uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 29, 31 e 32. [Vetor]
[0082] O vetor específico de oligodendrócitos da presente modalidade compreende um promotor específico de oligodendrócitos e/ou um miRNA específico para o gene PLP1. O vetor da presente modalidade é um vetor para uso no tratamento de uma doença associada à anormalidade no gene PLP1, ou com a finalidade de supressão da expressão do gene PLP1.
[0083] O vetor precisa ser um plasmídeo ou vetor capaz de infectar células humanas e expressar um gene, e exemplos do vetor incluem vírus adenoassociado (AAV), lentivírus, retrovírus, adenovírus, vírus Sendai e plasmídeos (incluindo complexos com um lipossoma ou um polímero), e o vetor é preferencialmente AAV. O AAV é um vírus pequeno, sem envelope, dependente de vírus auxiliar, que é classificado no gênero Dependovirus da família Parvoviridae e infecta animais, incluindo humanos, primatas e roedores. A indução da imunorreação pelo AAV é muito fraca e não foi verificada patogenicidade para o AAV. O AAV é capaz de infectar células que se dividem e células que não se dividem e, uma vez infectando células
18 / 39 hospedeiras, o AAV pode sobreviver fora dos cromossomos nucleares e expressar um gene com baixa frequência de inserção do gene no genoma cromossômico do hospedeiro.
[0084] Para o AAV, por exemplo, qualquer um dos serótipos AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 e AAV9 é preferencialmente usado, e um vetor AAV de mosaico híbrido e um vetor AAV quimérico também são preferencialmente usados. Para o vetor AAV de mosaico híbrido, por exemplo, estão disponíveis quaisquer combinações de AAV1 a AAV9, incluindo um híbrido AAV1/2. Exemplos do vetor AAV quimérico incluem Olig001 (Powell SK et al., Gene Ther. 2016 Nov; 23 (11): 807-814), que possui alto tropismo para oligodendrócitos.
[0085] O promotor específico de oligodendrócitos no vetor da presente modalidade não está limitado a um promotor específico e pode ser qualquer promotor que opere especificamente em oligodendrócitos e é preferencialmente o promotor da presente modalidade, ou seja, o promotor é específico de oligodendrócitos, por exemplo, um promotor específico de oligodendrócitos compreendendo um ácido nucleico, preferencialmente tendo uma identidade de sequência de pelo menos 90% à sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 1. O miRNA específico para o gene PLP1 no vetor da presente modalidade não está limitado a um miRNA específico e pode ser qualquer miRNA capaz de suprimir a expressão do gene PLP1 e, preferencialmente, é o miRNA da presente modalidade, ou seja, o miRNA é um miRNA que compreende um par de sequências nucleotídicas consistindo em uma sequência antissentido e uma sequência de sentido, em que o par de sequências nucleotídicas é selecionado a partir do grupo que consiste em pares de uma sequência antissentido apresentada na coluna esquerda da Tabela 1 e uma sequência de sentido apresentada na direita da sequência antissentido, na coluna direita da tabela.
[0086] O vetor da presente modalidade pode compreender o
19 / 39 promotor específico para oligodendrócitos da presente modalidade e um transgene operacionalmente ligado ao promotor. O transgene não está limitado a um transgene particular e, por exemplo, uma sequência de miRNA específica para o gene PLP1, em particular, uma sequência de miRNA específica para o gene PLP1 humano é preferencialmente usada. A sequência de miRNA específica para o gene PLP1 humano pode ser projetada, por exemplo, usando software como o BLOCK-iT (TM) RNAi Designer (Thermo Fisher Scientific, EUA). Alternativamente, a sequência de miRNA específica para o gene PLP1 humano pode ser projetada de tal maneira que os siRNAs artificiais sejam projetados como descrito nos Exemplos, e uma sequência ideal é selecionada a partir dos siRNAs para projetar o miRNA. Para um tal miRNA específico para o gene PLP1 humano, por exemplo, o miRNA acima descrito da presente modalidade é preferencialmente usado.
[0087] O vetor da presente modalidade pode compreender um promotor específico de oligodendrócitos e o miRNA da presente modalidade que está operacionalmente ligado ao promotor. O promotor específico de oligodendrócitos não está limitado a um promotor específico, e exemplos do promotor específico de oligodendrócitos incluem um promotor do gene da proteína básica de mielina e um promotor do gene PLP1. Para o promotor específico de oligodendrócitos, o promotor específico de oligodendrócitos acima descrito da presente modalidade é preferencialmente usado. Preferencialmente, o vetor da presente modalidade pode compreender o promotor específico de oligodendrócitos da presente modalidade e um ou mais miRNAs da presente modalidade que estão operacionalmente ligados ao promotor.
[0088] O vetor da presente modalidade pode compreender um gene repórter para confirmar a expressão do gene. Exemplos do gene repórter incluem, entre outros, GFP, Venus e tdTomato.
[0089] O vetor da presente modalidade pode ser construído com
20 / 39 facilidade através da engenharia genética. Por exemplo, um vetor híbrido AAV1/2 incluindo o promotor hCNP apresentado na SEQ ID NO: 1 e um gene repórter podem ser produzidos com um método como descrito a seguir. O promotor hCNP, uma região de codificação para um gene repórter como Venus, uma região não traduzida 3’ e um sinal poli A de SV40 são dispostos na ordem apresentada entre dois sítios NotI de um vetor AAV autocomplementar e a sequência nucleotídica de uma cassete de expressão de miRNA é então inserida na região não traduzida 3’. O vetor pode ser crioconservado a -20°C até o uso e, quando o vetor é usado, as células AAV293 (Takara Bio Inc., Japão) são transfectadas com o vetor juntamente com um plasmídeo auxiliar específico para um serótipo e o plasmídeo auxiliar adenovírus pHelper, e depois cultivadas por 72 horas para obter amplificação nas células ou na solução de cultura. Dependendo da escala, a purificação pode ser realizada por meio de purificação de coluna, ultrafiltração, ultracentrifugação ou similares. O título do genoma de vetor do vetor AAV obtido pode ser determinado por PCR quantitativo usando um Kit de Titulação AAVpro (Takara Bio Inc., Japão). [Composição farmacêutica]
[0090] A composição farmacêutica da presente modalidade compreende o vetor acima descrito da presente modalidade. A composição farmacêutica da presente modalidade é preferencialmente uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença associada à anormalidade no gene PLP1. Exemplos da doença associada à anormalidade envolvendo o gene PLP1 incluem a doença de Pelizaeus-Merzbacher (PMD) e paraplegia espástica tipo 2, cada qual causada pela duplicação do gene PLP1, mutação pontual no gene PLP1 ou mutação por exclusão ou inserção envolvendo o gene PLP1, ou esclerose múltipla. Além disso, a composição farmacêutica da presente modalidade pode ser um supressor de expressão do gene PLP1 capaz de suprimir a expressão do gene PLP1.
21 / 39
[0091] A composição farmacêutica da presente modalidade é preferencialmente uma solução aquosa contendo um vetor AAV e pode ter um título de 5 × 1010 a 5 × 1014 vg/mL, preferencialmente de 5 × 1011 a 5 × 1013 vg/mL.
[0092] A composição farmacêutica da presente modalidade pode conter um componente aditivo farmaceuticamente aceitável, como solução salina tamponada com fosfato (PBS), e pode conter adicionalmente um agente terapêutico adicional. A composição farmacêutica da presente modalidade pode ser produzida dissolvendo-se em uma solução aquosa como água e adicionando outros componentes, conforme necessário.
[0093] A composição farmacêutica da presente modalidade pode ser administrada diretamente ao cérebro no tratamento da doença de Pelizaeus-Merzbacher, e exemplos dessa administração incluem administração em um sítio ou em vários sítios do parênquima cerebral (por exemplo, a substância branca no hemisfério cerebral, a cápsula interna, o cerebelo) ou medula espinhal e administração intracerebroventricular/intratecal ou intravascular/intraperitoneal também é aceitável. A administração pode ser realizada a qualquer momento após o nascimento. A quantidade de injeção pode variar entre os sítios de administração e as idades, e uma quantidade de 0,1 a 2 mL/sítio é apropriada no caso de administração ao parênquima cerebral, e é preferível administrar cerca de 0,5 mL/sítio. No caso de administração intracerebroventricular/intratecal, é adequada uma quantidade de 0,5 a 2 mL/kg de peso corporal, e é preferível administrar até cerca de 1 mL/kg de peso corporal. No caso de administração intravascular ou intraperitoneal, é adequada uma quantidade de 1 a 10 mL/kg de peso corporal, e é preferível administrar até 5 mL/kg de peso corporal. [Método terapêutico]
[0094] O método terapêutico da presente modalidade é um método
22 / 39 para o tratamento de uma doença associada à anormalidade do gene PLP1, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do vetor acima descrito da presente modalidade a um paciente que necessita de tratamento. Alternativamente, o método terapêutico da presente modalidade é um método para suprimir a expressão do gene PLP1, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do vetor acima descrito da presente modalidade a um paciente que necessita de tratamento. Exemplos
[0095] A seguir, a presente invenção será descrita mais especificamente com referência aos Exemplos. No entanto, a presente invenção não está limitada aos Exemplos a seguir. <Exemplo 1 Construção do cassete de expressão de AAV específico de oligodendrócitos e vetor de AAV incluindo o mesmo>
[0096] Uma sequência pré-miRNA (PLP1 miRNA, SEQ ID NO: 9) alvejando o mRNA de um gene PLP1 de camundongo (NM_011123.3, SEQ ID NO: 8) e uma sequência pré-miRNA como controle negativo (miR-neg, SEQ ID NO: 10) foram projetadas usando o BLOCK-iT (TM) RNAi Designer (Thermo Fisher Scientific, EUA). O miR-neg é uma sequência de miRNA que pode formar uma estrutura em forma de grampo, processada em um miRNA maduro, mas é previsto que não alveje genes de vertebrados conhecidos.
[0097] PLP1-miRNA (SEQ ID NO: 9): 5’-ACTCCAAAGAAACACAATCCAGTTTTGGCCACTG ACTGACTGGATTGTTTCTTTGGAGT -3’ miR-neg (SEQ ID NO: 10): 5’-GTATGCATCGAATGAGATTCCGTTTTGGCCACTG ACTGACGGAATCTCTCGATGCATAC -3’
[0098] Cada uma das sequências de miRNA PLP1 e miR-neg foi sintetizada como projetada e clonada em um sítio de clonagem de um vetor
23 / 39 pcDNA (TM) 6,2-GW/miR (Thermo Fisher Scientific, EUA) incluído em um kit de vetor de expressão BLOCK-iT (TM) Pol II miR RNAi. Uma sequência flanqueadora 5’ (SEQ ID NO: 11) e a sequência flanqueadora 3’ (SEQ ID NO: 12) derivadas de miR-155 de camundongo foram dispostas respectivamente em um lado e no outro lado da sequência de miRNA de PLP1 ou sequência de miR-neg. A sequência flanqueadora 5’ e a sequência flanqueadora 3’ derivadas do miR-155 de camundongo são, respectivamente, a região 5’ e a região 3’ do miR-155 de camundongo com uma porção da estrutura em forma de grampo excluída, e a sequência pré-miRNA ou a sequência miR-neg foi disposta entre a sequência flanqueadora 5’ e a sequência flanqueadora 3’, para que essas sequências de miRNA pudessem ser expressas.
[0099] Sequência flanqueadora 5’ (SEQ ID NO: 11): 5’- CTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCT -3’ Sequência flanqueadora 3’ (SEQ ID NO: 12): 5’-
CAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGC C -3’
[00100] A partir do vetor pcDNA (TM) 6.2-GW/miR resultante, a porção da sequência flanqueadora 5’- sequência de miRNA de PLP1 (ou sequência de miR-neg) - sequência flanqueadora de 3’ foi amplificada por PCR, o produto amplificado foi clivado com XhoI/BamHI, e o resultante foi inserido em um fragmento de DNA obtido pela clivagem de um vetor pW-CAG-Venus-WPRE (SEQ ID NO: 13) com XhoI/BamHI e clivados nas duas extremidades do WPRE posicionados no lado 3’ e uma sequência venus (SEQ ID NO: 14) para remover a sequência WPRE. Posteriormente, o vetor resultante foi clivado com SpeI/EcoRI para remover o promotor CAG, e um fragmento de DNA foi inserido neste sítio no lado 5’ da sequência Venus, o fragmento de DNA sendo obtido por amplificação por PCR de um promotor
24 / 39 CNP humano (SEQ ID NO: 1) de 1,8 kb e clivado nas duas extremidades com SpeI/EcoRI, para permitir a expressão genética específica de oligodendrócitos. O vetor resultante foi clivado adicionalmente com NotI para remover o esqueleto do AAV de fita única derivado de pW-CAG-Venus-WPRE e ligado ao esqueleto do vírus adenoassociado autocomplementar (scAAV) obtido pela clivagem de pscW-PABPN1 (SEQ 15) com NotI para fornecer os construtos finais miRNA de Pscw-hCNP-Venus-PLP1 (SEQ ID NO: 16) e Pscw-hCNP-Venus-miR-neg (SEQ ID NO: 17) (Figura 1).
[00101] A preparação de um vetor híbrido AAV1/2 (vetor scAAV-AAV1/2) foi realizada de acordo com um método descrito na Literatura Não Patente 1. Especificamente, as células AAV293 foram cotransfectadas usando PEI com o miRNA de Pscw-hCNP-Venus-PLP1 ou Pscw-hCNP-Venus-miR-neg, que era um construto de scAAV obtida acima, os plasmídeos auxiliares de AAV específicos de serótipo p5E18RXC1 (Xiao W et al., J. Virol (1999) 73: 3994-4003) e pAAV-RC (Agilent Technologies) que codificam os genes rep e cap de AAV1 e AAV2, respectivamente, e o plasmídeo auxiliar de adenovírus pHelper (Agilent Technologies). As células foram coletadas 72 horas após a transfecção, e cada vetor scAAV-AAV1/2 foi purificado usando um Kit de Purificação AAVpro (Takara Bio Inc., Japão). Os títulos do genoma de vetor foram determinados por PCR quantitativo usando um Kit de Titulação AAVpro (Takara Bio Inc., Japão).
[00102] Os vetores scAAV-AAV1/2 obtidos foram designados como o vetor de miRNA AAV-hCNP-Venus-PLP1 (ou vetor de miRNA de PLP1) e o vetor AAV-hCNP-Venus-miR-negativo (ou vetor miR-negativo). <Exemplo 2 Administração de vetores AAV em camundongos de tipo selvagem e expressão dos mesmos>
[00103] Um microlitro de uma solução do vetor de miRNA de PLP1 ou vetor miR-neg obtido no Exemplo 1 (título: 1,2 × 1012 vg/mL) foi injetado
25 / 39 em um corpo estriado e a cápsula interna de cada camundongo de tipo selvagem de 10 dias de idade Jcl:B6C3F1 (n = 5 por grupo). Antes da injeção, os camundongos foram anestesiados com solução de pentobarbital. A injeção do vetor foi realizada com uma seringa 33G a uma taxa de 150 nL/min. Após a injeção, cada camundongo permaneceu intocado por 1 minuto e a agulha foi lentamente retirada do cérebro. Depois disso, os camundongos foram devolvidos em grupo à mãe e cresceram até o dia 17 após o nascimento.
[00104] A expressão genética de cada vetor foi avaliada através da detecção da proteína verde fluorescente Venus no dia 17 após o nascimento. Os tipos de células que expressam Venus foram identificados por dupla imunocoloração com marcadores celulares, incluindo Gst-π (para oligodendrócitos maduros), NeuN (para neurônios), Iba1 (para micróglia) e GFAP (astrócitos).
[00105] Para imunocoloração, cada camundongo Jcl:B6C3F1 foi anestesiado com solução de inalação Forane e subsequentemente submetido à perfusão transcardial com PBS e depois com paraformaldeído fresco a 4%. O cérebro foi removido e posteriormente fixado a 4°C durante a noite e, em seguida, foi submetido à substituição com sacarose/PBS 30% e crioconservado no meio de fixação OCT Compound (TissueTech, Inc.). Uma seção coronal (20 µm) foi obtida e imunocorada para verificar a especificidade das células infectadas que expressam Venus. A seção foi incubada juntamente com a solução de bloqueio (PBS contendo 0,05% de Triton (TM) X-100 e 5% de soro de cabra) à temperatura ambiente por 3 horas e incubada a 4°C durante a noite com Gst-π (Cell Signaling Technology, Inc., 1:300), GFAP (Millipore Corporation, 1:400), NeuN (Chemicon, 1:400) ou Iba1 (Biocare Medical, LLC., 1:500), como anticorpos primários. A seção foi então lavada e incubada junto com um anticorpo secundário apropriado (Thermo Fisher Scientific, EUA) à temperatura
26 / 39 ambiente por 1 hora. Os núcleos celulares foram visualizados com 40,60-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Sigma-Aldrich Co. LLC). A lâmina foi montada com ProLong (R) Diamond Mountant (Thermo Fisher Scientific, EUA) e fotografada com um microscópio de fluorescência KEYENCE (KEYENCE CORPORATION, Japão).
[00106] A Figura 2 mostra os resultados. Entende-se a partir da Figura 2 que as células positivas para Venus correspondiam a oligodendrócitos positivos para Gst-π, mas não correspondiam a neurônios celulares positivos para NeuN, astrócitos positivos para GFAP ou microglia positiva para Iba1. Assim, a Figura 2 demonstra que o vetor miR-neg foi expresso de maneira específica de oligodendrócitos e altamente eficiente. <Exemplo 3 Avaliação da eficiência de supressão da expressão (Knockdown) em termos dos níveis de expressão do gene PLP1 - Parte 1>
[00107] Um microlitro de uma solução de cada um dos dois vetores scAAV-AAV1/2 (título: 1,2 × 1012 vg/mL) obtidos no Exemplo 1 foi injetado em um corpo estriado, a cápsula interna, e o cerebelo de cada camundongo do tipo selvagem de 10 dias de idade Jcl:B6C3F1 (n = 3 por grupo). O método de injeção foi o mesmo que o Exemplo 2. Posteriormente, a expressão da proteína PLP1 em células positivas para Venus foi examinada através de imunocoloração para avaliar as eficiências de knockdown de miRNA de PLP1. A imunocoloração foi realizada com o mesmo método do Exemplo 2, exceto que um anticorpo policlonal de coelho anti-PLP1 (Numata Y et al., J. Biol Chem. 2013 Mar 15; 288 (11): 7451-66) foi usado como anticorpo primário e um anticorpo fluorescente anti-coelho (Thermo Fisher Scientific, EUA) foi usado como anticorpo secundário. Cada sítio do corpo caloso, corpo estriado e cápsula interna foi fotografado com um microscópio de fluorescência KEYENCE (KEYENCE CORPORATION, Japão).
[00108] As intensidades de fluorescência médias de PLP1
27 / 39 imunocorado foram quantificadas usando a Imagem J 1,45s (Wayne Rasband, National Institutes of Health, EUA), e a Figura 3 mostra a análise quantitativa da intensidade da fluorescência através da coloração por imunofluorescência de PLP1. Pode ser visto na Figura 3 que quase não houve diferença na expressão da proteína PLP1 entre o lado sem injeção do vetor miR-neg (lado não infectado) e o lado com injeção de vetor (lado infectado), enquanto que no vetor de miRNA de PLP1, houve 40% de efeito supressor de expressão na proteína de PLP1 no lado infectado em comparação com o lado não infectado. O resultado de que não houve diferença no número de astrócitos e na micróglia entre o lado não infectado e o lado infectado indica a ausência de resposta inflamatória reativa devido à administração do AAV. <Exemplo 4 Avaliação da eficiência de supressão da expressão (Knockdown) em termos dos níveis de expressão do gene PLP1 - Parte 2>
[00109] Um microlitro de uma solução de cada um dos dois vetores scAAV-AAV1/2 (título: 1,2 × 1012 vg/mL) obtido no Exemplo 1 foi injetado nos corpos estriados e na cápsula interna de cada camundongo do tipo selvagem de 10 dias de idade Jcl:B6C3F1 (n = 4 por grupo). O método de injeção foi o mesmo que o Exemplo 2. Posteriormente, a expressão do mRNA de PLP1 em células positivas para Venus foi examinada através de PCR quantitativa para avaliar a eficiência do knockdown de miPRA de PLP1.
[00110] Para classificar as células positivas para Venus, cada camundongo Jcl:B6C3F1 foi anestesiado com solução de inalação Forane e submetido à perfusão transcardial com 20 mL de PBS. O cérebro foi removido e fragmentado grosseiramente com uma tesoura “micro dice”. Em cada cérebro, 1 mL de Accutase (Millipore Corporation) foi adicionado e o resultante foi incubado a 37°C por 30 minutos. Em cada amostra, foram adicionados 2 mL da Solução Salina Balanceada de Hank (HBSS) contendo
28 / 39 10% de FBS e o tecido foi homogeneizado com uma micropipeta. Cada amostra foi filtrada com um filtro celular de 100 µm e a suspensão de células coletada foi centrifugada. Para purificar células de detritos de mielina, as células foram ressuspensas em HBSS contendo Percoll a 40% (Amersham plc) e centrifugadas a 700 ×g à temperatura ambiente por 25 minutos. A camada superior de mielina foi sugada e os monócitos foram ressuspensos em 1 mL de um meio DMEM/F12. Essas células foram separadas por um citômetro de fluxo FACS Canto (BD Biosciences) e o resultado foi analisado usando o software FlowJo (Tree Star Inc., OR, RRID: NIF-0000 a 30575). O resultado é plotado como porcentagem para todas as células.
[00111] Para PCR quantitativa, o RNA total foi isolado das células positivas para Venus selecionadas usando um Mini Kit RNeasy (Qiagen), e um cDNA foi sintetizado usando um Kit SuperScript (R) Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific, EUA) . A expressão genética foi analisada através de RT-PCR quantitativa usando o LightCycler (R) 480 SYBR Green I Master e um LightCycler (R) 480 Instrument com iniciadores específicos abaixo (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Suíça). Os resultados foram normalizados para β-actina do gene de manutenção, e os níveis de expressão relativa de PLP1 e Olig2 foram calculados. Os valores de CP (valores de ponto de cruzamento) obtidos para cada amostra foram convertidos em valores de log para plotar os níveis de expressão relativa ± SD, e os resultados plotados são mostrados na Figura 4.
[00112] Iniciador forward de PLP1 (SEQ ID NO: 18): 5’- GTTCCAGAGGCCAACATCAAGCTC -3’ Iniciador reverse de PLP1 (SEQ ID NO: 19): 5’- AGCCATACAACAGTCAGGGCATAG -3’ Iniciador forward do Olig2 (SEQ ID NO: 20): 5’- GGGAGGTCATGCCTTACGC -3’ Iniciador reverse do Olig2 (SEQ ID NO: 21): 5’-
29 / 39 CTCCAGCGAGTTGGTGAGC -3’ Iniciador forward de β-actina (SEQ ID NO: 22): 5’- CACAGCTTCTTTGCAGCTCCTT -3’ Iniciador reverse de β-actina (SEQ ID NO: 23): 5’- GACGACCAGCGCAGCGATA -3’
[00113] Pode ser visto a partir da Figura 4 que, para o nível de expressão do mRNA de Olig2, um marcador de oligodendrócitos, não houve diferença significativa entre o vetor miR-neg e o vetor de miRNA de PLP1 (B), enquanto que para o nível de expressão do mRNA de PLP1, a injeção do vetor de miRNA de PLP1 proveu aproximadamente 60% do efeito supressor de expressão no gene PLP1 (A). <Exemplo 5 Efeito da administração em camundongos transgênicos PLP1 (PLP1-Tg)>
[00114] Ao corpo estriado e à cápsula interna de cada ninhada de camundongos PLP1-Tg/B6C3 de 10 dias de idade (peso corporal: 5 a 6 g que superexpressam o PLP1 de camundongo, o vetor de miRNA de PLP1 (grupo com tratamento, n = 16) ou o vetor miR-neg (grupo com tratamento simulado, n = 16) foi injetado para realizar o teste de tratamento. O PLP1-Tg/B6C3 foi preparado por retrocruzamento de PLP1-Tg/BDF1, que foi oferecido pelo Dr. Tetsushi Kagawa no Instituto Nacional de Ciências Fisiológicas, com uma cepa B6C3 (Kagawa T et al., Neuron. 1994 Aug; 13 (2): 427-42). Para indivíduos homozigotos PLP1-Tg, 1 µL de uma solução de cada um dos dois vetores scAAV-AAV1/2 (título: 1,2 × 1012 vg/mL) obtidos no Exemplo 1 foram injetados no corpo estriado e na cápsula interna de cada camundongo com 10 dias de idade da mesma maneira que no Exemplo 2. Para um controle positivo, foram utilizados camundongos do tipo selvagem companheiros da mesma ninhada injetados com o vetor miR-neg (n = 16). Alguns desses ratos foram removidos do tecido cerebral no dia 25 após o nascimento (15 dias após a injeção) e a análise histológica (imunocoloração,
30 / 39 análise morfométrica) foi realizada para o tecido cerebral, e os camundongos restantes foram observados quanto ao peso corporal e taxas de sobrevivência.
[00115] A análise histológica por imunocoloração foi realizada como se segue. Para o grupo de camundongos do tipo selvagem, e o grupo de camundongos PLP1-Tg com tratamento e com tratamento simulado, em que n = 5 por grupo, cada um do corpo caloso, corpo estriado e cápsula interna foram imunocorados da mesma maneira que em Exemplo 3 no dia 25 após o nascimento (15 dias após a injeção). Para os camundongos do tipo selvagem, como grupo de controle positivo, o PLP1 proveu imagens fibrosas, fortemente coradas, correspondentes a bainhas de mielina no corpo caloso, corpo estriado e cápsula interna. Na análise dos camundongos PLP1-Tg, quase nenhuma imagem manchada correspondente às bainhas de mielina foi verificada para os camundongos com tratamento simulado, enquanto uma imagem manchada indicando acúmulo anormal de PLP1 no citoplasma de oligodendrócitos foi obtida. Para os camundongos com tratamento, pelo contrário, quase nenhuma imagem manchada indicando o acúmulo de PLP1 no citoplasma foi verificada, e uma imagem fibrosa, inferida para corresponder às bainhas de mielina, descreveu que a administração do vetor de miRNA de PLP1 provê imagens manchadas aprimoradas de PLP1 em comparação com os anormais. A Figura 5 mostra micrografias do corpo caloso.
[00116] A análise micromorfológica com um microscópio eletrônico foi realizada da seguinte maneira. Para os camundongos do tipo selvagem e o grupo de camundongos PLP1-Tg com tratamento e com tratamento simulado, em que n = 2 por grupo, a fixação por refluxo foi realizada com tampão fosfato 0,1 M contendo glutaraldeído a 2% e paraformaldeído a 2% no dia 25 após o nascimento (15 dias após a injeção) e, em seguida, o cérebro foi removido e posteriormente fixado por imersão no mesmo tampão. Cada um do corpo caloso, corpo estriado e cápsula interna foram analisados quanto
31 / 39 a sítios infectados com AAV sob um microscópio de fluorescência estereoscópico, foi cortada uma seção de tecido de 600 µm quadrados e foi pós-fixada com tampão fosfato 0,1 M contendo 1% de ósmio. Após a desidratação, a seção de tecido foi embebida em resina epóxi, uma seção ultrafina de 70 nm foi preparada, e isso foi observado através de um microscópio eletrônico (Tecnai Spirit, Thermo Fisher Scientific, EUA), com uma ampliação de 7300×.
[00117] A Figura 6 mostra micrografias eletrônicas. Ficou claro que para os camundongos do tipo selvagem quase todos os axônios estavam mielinizados em cada um do corpo caloso, corpo estriado e cápsula interna. Na análise dos camundongos PLP1-Tg, a fração de axônios mielinizados foi claramente baixa nos camundongos com tratamento simulado e, além disso, os axônios foram estreitados. Nos camundongos com tratamento, por outro lado, a fração dos axônios mielinizados era maior e, além disso, os diâmetros dos axônios eram geralmente maiores do que aqueles nos camundongos com tratamento simulado. A partir desses resultados, foi descrito do ponto de vista da morfologia ultrafina que a administração do vetor de miRNA de PLP1 provê efeito terapêutico devido ao enriquecimento de fibras mielinizadas.
[00118] O grupo de camundongos com tratamento e o grupo de camundongos com tratamento simulado, em que n = 9 por grupo, foram observados mesmo após 25 dias de idade até sua morte para avaliar o peso corporal e as taxas de sobrevivência dos grupos. Verificou-se que a administração aos camundongos PLP1-Tg provê efeito significativo de melhora da taxa de sobrevivência (prolongamento da vida) (Figura 7) e efeito de ganho de peso corporal (Figura 8), e, portanto, a eficácia da presente terapia foi confirmada.
[00119] Os resultados apresentados descreveram que o promotor específico de oligodendrócitos e o vetor AAV, incluindo o promotor, podem ser aplicáveis como uma técnica fundamental para desenvolver terapia para
32 / 39 PMD, e que o vetor AAV de expressão genética com um miRNA específico de PLP1 usando o promotor pode ser uma abordagem eficaz para o tratamento de PMD. <Exemplo 6 Avaliação da eficiência de supressão da expressão (Knockdown) em termos dos níveis de expressão do gene PLP1 - Parte 3>
[00120] Para avaliar a eficiência de knockdown de PLP1-miRNA humano projetado com BLOCK-iT (TM) RNAi Designer (Thermo Fisher Scientific, EUA), pcDNA (TM) 6.2-hPLP1, que é um plasmídeo capaz de superexpressar uma sequência que codifica o gene PLP1 humano e pscw.CAG.Venus.PLP1-miRNA, que é um plasmídeo obtido pela clonagem de uma sequência em uma região não traduzida 3’ à jusante de um cDNA que codifica Venus, uma proteína fluorescente que é expressa sob o controle de um promotor CAG foram introduzidos concomitantemente nas células HeLa através de um método de transfecção. Para a transfecção, foi utilizado o TransIt-LT1 (Takara Bio Inc.). Após 24 horas, as células foram coletadas e o RNA total foi extraído usando um Mini Kit RNeasy (Qiagen). Para PCR quantitativo, um cDNA foi sintetizado usando um Kit SuperScript (R) Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific, EUA). A expressão genética foi analisada através de PCR quantitativa usando o LightCycler (R) 480 SYBR Green I Master e um LightCycler (R) 480 Instrument com iniciadores específicos abaixo (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Suíça). Os iniciadores utilizados na PCR quantitativa para a expressão do gene PLP1 estão listados a seguir.
[00121] Iniciador forward de PLP1 humano (SEQ ID NO: 280): 5’- GCTCCAACCTTCTGTCCATCT -3’ Iniciador reverse de PLP1 humano (SEQ ID NO: 281): 5’- ACGGCAAAGTTGTAAGTGGC -3’ Iniciador forward de β-actina humano (SEQ ID NO: 282): 5’- GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT -3’
33 / 39 Iniciador reverse de β-actina humano (SEQ ID NO: 283): 5’- TGATCCACATCTGCTGGAAGGT -3’
[00122] A Figura 9 mostra os resultados do knockdown. As eficiências de knockdown foram calculadas assumindo o nível de expressão de PLP1 de células com expressão de miR-neg como 1. Os resultados foram normalizados para β-actina do gene de manutenção e calculados como níveis de expressão relativos ± SD. Sete sequências que reduzem os níveis de expressão do gene PLP1 foram identificadas (SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 7, 24, e 26). <Exemplo 7 Avaliação da eficiência de supressão da expressão (Knockdown) em termos dos níveis de expressão do gene PLP1 - Parte 4>
[00123] Um par de siRNAs consistindo em uma cadeia de sentido e a cadeia antissentido correspondente mostrada na Tabela 3 e a solução de transfecção (RNAi MAX, Invitrogen) foram misturados, e a solução preparada foi adicionada às células U-251MG, e as células foram cultivadas por 48 horas. [Tabela 3] Tabela 3. Sequências de siRNA projetadas para o gene PLP1 humano No SEQ ID NO: Fita de sentido/antissentido Sequência de siRNA 118 hPLP1-001 UGACCUUCCACCUGUUUAUdTdT 1 119 hPLP1-001anti AUAAACAGGUGGAAGGUCAdTdT 120 hPLP1-002 GUGCCUGUGUACAUUUACUdTdT 2 121 hPLP1-002anti AGUAAAUGUACACAGGCACdTdT 122 hPLP1-003 UUGCCCAAAUCUGCCUAUUdTdT 3 123 hPLP1-003anti AAUAGGCAGAUUUGGGCAAdTdT 124 hPLP1-004 AGGAAUGGAGGCUCUAAUUdTdT 4 125 hPLP1-004anti AAUUAGAGCCUCCAUUCCUdTdT 126 hPLP1-005 UGGCCACUGGAUUGUGUUUdTdT 5 127 hPLP1-005anti AAACACAAUCCAGUGGCCAdTdT 128 hPLP1-006 GCGGGUGUGUCAUUGUUUGdTdT 6 129 hPLP1-006anti CAAACAAUGACACACCCGCdTdT 130 hPLP1-007 GACCUUCCACCUGUUUAUUdTdT 7 131 hPLP1-007anti AAUAAACAGGUGGAAGGUCdTdT 132 hPLP1-008 ACUCCCUUCUCCUUGAUAAdTdT 8 133 hPLP1-008anti UUAUCAAGGAGAAGGGAGUdTdT 134 hPLP1-009 CUGCAAGUCACAAAGGAAUdTdT 9 135 hPLP1-009anti AUUCCUUUGUGACUUGCAGdTdT 136 hPLP1-010 GGUCCUCUUGCCAUCUAUAdTdT 10 137 hPLP1-010anti UAUAGAUGGCAAGAGGACCdTdT 11 138 hPLP1-011 CCUCGUUAGGGAAGAGAAAdTdT
34 / 39 139 hPLP1-011anti UUUCUCUUCCCUAACGAGGdTdT 140 hPLP1-012 GGAGAAGAGGACAAAGAUAdTdT 12 141 hPLP1-012anti UAUCUUUGUCCUCUUCUCCdTdT 142 hPLP1-013 GGCCAACAUCAAGCUCAUUdTdT 13 143 hPLP1-013anti AAUGAGCUUGAUGUUGGCCdTdT 144 hPLP1-014 AGGCCAACAUCAAGCUCAUdTdT 14 145 hPLP1-014anti AUGAGCUUGAUGUUGGCCUdTdT 146 hPLP1-015 CUCCCUUCUCCUUGAUAACdTdT 15 147 hPLP1-015anti GUUAUCAAGGAGAAGGGAGdTdT 148 hPLP1-016 GCCUCUUUCUUCUUCCUUUdTdT 16 149 hPLP1-016anti AAAGGAAGAAGAAAGAGGCdTdT 150 hPLP1-017 CUGUGCCUGUGUACAUUUAdTdT 17 151 hPLP1-017anti UAAAUGUACACAGGCACAGdTdT 152 hPLP1-018 AAGGAAUGGAGGCUCUAAUdTdT 18 153 hPLP1-018anti AUUAGAGCCUCCAUUCCUUdTdT 154 hPLP1-019 AGGGUGUUGUCAGCAUCUUdTdT 19 155 hPLP1-019anti AAGAUGCUGACAACACCCUdTdT 156 hPLP1-020 ACAGCUGAGUUCCAAAUGAdTdT 20 157 hPLP1-020anti UCAUUUGGAACUCAGCUGUdTdT
No SEQ ID NO: Fita de sentido/antissentido Sequência de siRNA 158 hPLP1-021 GCCACUGGAUUGUGUUUCUdTdT 21 159 hPLP1-021anti AGAAACACAAUCCAGUGGCdTdT 160 hPLP1-022 ACAACUUUGCCGUCCUUAAdTdT 22 161 hPLP1-022anti UUAAGGACGGCAAAGUUGUdTdT 162 hPLP1-023 GCUGAUGCCAGAAUGUAUGdTdT 23 163 hPLP1-023anti CAUACAUUCUGGCAUCAGCdTdT 164 hPLP1-024 UUGCCGUCCUUAAACUCAUdTdT 24 165 hPLP1-024anti AUGAGUUUAAGGACGGCAAdTdT 166 hPLP1-025 CUGCCUCUUUCUUCUUCCUdTdT 25 167 hPLP1-025anti AGGAAGAAGAAAGAGGCAGdTdT 168 hPLP1-026 CCACUGGAUUGUGUUUCUUdTdT 26 169 hPLP1-026anti AAGAAACACAAUCCAGUGGdTdT 170 hPLP1-027 GGAUCAGAAAGUAAUUUCUdTdT 27 171 hPLP1-027anti AGAAAUUACUUUCUGAUCCdTdT 172 hPLP1-028 UAGCCAGCCGGCUACAAUUdTdT 28 173 hPLP1-028anti AAUUGUAGCCGGCUGGCUAdTdT 174 hPLP1-029 AGCGUAGAAUCUGUGUAGAdTdT 29 175 hPLP1-029anti UCUACACAGAUUCUACGCUdTdT 176 hPLP1-030 UCCCUUCUCCUUGAUAACAdTdT 30 177 hPLP1-030anti UGUUAUCAAGGAGAAGGGAdTdT 178 hPLP1-031 UUCCAAGGAGCUGAGAAUAdTdT 31 179 hPLP1-031anti UAUUCUCAGCUCCUUGGAAdTdT 180 hPLP1-032 UGCCAGAAUGUAUGGUGUUdTdT 32 181 hPLP1-032anti AACACCAUACAUUCUGGCAdTdT 182 hPLP1-033 AUGCCUUCCAGUAUGUCAUdTdT 33 183 hPLP1-033anti AUGACAUACUGGAAGGCAUdTdT 184 hPLP1-034 CAACUUUGCCGUCCUUAAAdTdT 34 185 hPLP1-034anti UUUAAGGACGGCAAAGUUGdTdT 186 hPLP1-035 CCAACAUCAAGCUCAUUCUdTdT 35 187 hPLP1-035anti AGAAUGAGCUUGAUGUUGGdTdT 188 hPLP1-036 UGGCCUUACACCUCGUUAGdTdT 36 189 hPLP1-036anti CUAACGAGGUGUAAGGCCAdTdT 190 hPLP1-037 AGGACAUCCCGACAAGUUUdTdT 37 191 hPLP1-037anti AAACUUGUCGGGAUGUCCUdTdT 192 hPLP1-038 GUCAGAGUCCCAAAGACAUdTdT 38 193 hPLP1-038anti AUGUCUUUGGGACUCUGACdTdT 194 hPLP1-039 UUGCAGGAGAAGAGGACAAdTdT 39 195 hPLP1-039anti UUGUCCUCUUCUCCUGCAAdTdT
35 / 39 196 hPLP1-040 GGUAGACACAGGAUAGAUAdTdT 40 197 hPLP1-040anti UAUCUAUCCUGUGUCUACCdTdT
No SEQ ID NO: Fita de sentido/antissentido Sequência de siRNA 198 hPLP1-041 UCAGCCAACCUUACUUACAdTdT 41 199 hPLP1-041anti UGUAAGUAAGGUUGGCUGAdTdT 200 hPLP1-042 AUGGAACUGCCUCUUUCUUdTdT 42 201 hPLP1-042anti AAGAAAGAGGCAGUUCCAUdTdT 202 hPLP1-043 ACUCAGCCAACCUUACUUAdTdT 43 203 hPLP1-043anti UAAGUAAGGUUGGCUGAGUdTdT 204 hPLP1-044 CUUCCACUGAUGGAAACAAdTdT 44 205 hPLP1-044anti UUGUUUCCAUCAGUGGAAGdTdT 206 hPLP1-045 AUGACCUUCCACCUGUUUAdTdT 45 207 hPLP1-045anti UAAACAGGUGGAAGGUCAUdTdT 208 hPLP1-046 UCUCCUGAGGAUCAGAAAGdTdT 46 209 hPLP1-046anti CUUUCUGAUCCUCAGGAGAdTdT 210 hPLP1-047 GAGGAUCAGAAAGUAAUUUdTdT 47 211 hPLP1-047anti AAAUUACUUUCUGAUCCUCdTdT 212 hPLP1-048 GGAUCUUUCACCCACAGAAdTdT 48 213 hPLP1-048anti UUCUGUGGGUGAAAGAUCCdTdT 214 hPLP1-049 CUGAGGAUCAGAAAGUAAUdTdT 49 215 hPLP1-049anti AUUACUUUCUGAUCCUCAGdTdT 216 hPLP1-050 CUGGUAGACACAGGAUAGAdTdT 50 217 hPLP1-050anti UCUAUCCUGUGUCUACCAGdTdT 218 hPLP1-051 GCAGUUGCUGGUGGCUAAUdTdT 51 219 hPLP1-051anti AUUAGCCACCAGCAACUGCdTdT 220 hPLP1-052 AAGACAUGGGCUUGUUAGAdTdT 52 221 hPLP1-052anti UCUAACAAGCCCAUGUCUUdTdT 222 hPLP1-053 UUGCUGCCACUUACAACUUdTdT 53 223 hPLP1-053anti AAGUUGUAAGUGGCAGCAAdTdT 224 hPLP1-054 UCGUUAGGGAAGAGAAACAdTdT 54 225 hPLP1-054anti UGUUUCUCUUCCCUAACGAdTdT 226 hPLP1-055 UCCACUGAUGGAAACAAAGdTdT 55 227 hPLP1-055anti CUUUGUUUCCAUCAGUGGAdTdT 228 hPLP1-056 AGAGCGUUUGCCCAAAUCUdTdT 56 229 hPLP1-056anti AGAUUUGGGCAAACGCUCUdTdT 230 hPLP1-057 UGAUUGCUGCCACUUACAAdTdT 57 231 hPLP1-057anti UUGUAAGUGGCAGCAAUCAdTdT 232 hPLP1-058 GGAGCGUAGAAUCUGUGUAdTdT 58 233 hPLP1-058anti UACACAGAUUCUACGCUCCdTdT 234 hPLP1-059 UGAGGAUCAGAAAGUAAUUdTdT 59 235 hPLP1-059anti AAUUACUUUCUGAUCCUCAdTdT 236 hPLP1-060 GGUGUUGUCAGCAUCUUCUdTdT 60 237 hPLP1-060anti AGAAGAUGCUGACAACACCdTdT
No SEQ ID NO: Fita de sentido/antissentido Sequência de siRNA 238 hPLP1-061 GUCAAAGCAAGGAUCUUUCdTdT 61 239 hPLP1-061anti GAAAGAUCCUUGCUUUGACdTdT 240 hPLP1-062 AGAUCUUUGGCGACUACAAdTdT 62 241 hPLP1-062anti UUGUAGUCGCCAAAGAUCUdTdT 242 hPLP1-063 UGCAGGAGAAGAGGACAAAdTdT 63 243 hPLP1-063anti UUUGUCCUCUUCUCCUGCAdTdT 244 hPLP1-064 UGGUGGCUAAUGGUGUAACdTdT 64 245 hPLP1-064anti GUUACACCAUUAGCCACCAdTdT 246 hPLP1-065 AGCUAAUUGAGACCUAUUUdTdT 65 247 hPLP1-065anti AAAUAGGUCUCAAUUAGCUdTdT 248 hPLP1-066 GUGCUGAUGCCAGAAUGUAdTdT 66 249 hPLP1-066anti UACAUUCUGGCAUCAGCACdTdT 67 250 hPLP1-067 UUUCCAAGGAGCUGAGAAUdTdT
36 / 39 251 hPLP1-067anti AUUCUCAGCUCCUUGGAAAdTdT 252 hPLP1-068 UGUGCCUGUGUACAUUUACdTdT 68 253 hPLP1-068anti GUAAAUGUACACAGGCACAdTdT 254 hPLP1-069 CAGGUACAGAGAAGGAAUGdTdT 69 255 hPLP1-069anti CAUUCCUUCUCUGUACCUGdTdT 256 hPLP1-070 GCAUAAGGGAGCGUAGAAUdTdT 70 257 hPLP1-070anti AUUCUACGCUCCCUUAUGCdTdT 258 hPLP1-071 UCAGGUACAGAGAAGGAAUdTdT 71 259 hPLP1-071anti AUUCCUUCUCUGUACCUGAdTdT 260 hPLP1-072 GCUGCAGCUACACUGGUUUdTdT 72 261 hPLP1-072anti AAACCAGUGUAGCUGCAGCdTdT 262 hPLP1-073 UCUCCCAUGGAAUGCUUUCdTdT 73 263 hPLP1-073anti GAAAGCAUUCCAUGGGAGAdTdT 264 hPLP1-074 UGCCUUCCAGUAUGUCAUCdTdT 74 265 hPLP1-074anti GAUGACAUACUGGAAGGCAdTdT 266 hPLP1-075 GCUGCCACUUACAACUUUGdTdT 75 267 hPLP1-075anti CAAAGUUGUAAGUGGCAGCdTdT 268 hPLP1-076 ACUUUGCCGUCCUUAAACUdTdT 76 269 hPLP1-076anti AGUUUAAGGACGGCAAAGUdTdT 270 hPLP1-077 ACCUUACUUACAGCAUAAGdTdT 77 271 hPLP1-077anti CUUAUGCUGUAAGUAAGGUdTdT 272 hPLP1-078 UGGACUACUGAAGCCCUAAdTdT 78 273 hPLP1-078anti UUAGGGCUUCAGUAGUCCAdTdT 274 hPLP1-079 CUUCCAGUAUGUCAUCUAUdTdT 79 275 hPLP1-079anti AUAGAUGACAUACUGGAAGdTdT 276 hPLP1-080 UCUGGUCUCUCUAUUACCAdTdT 80 277 hPLP1-080anti UGGUAAUAGAGAGACCAGAdTdT 278 hPLP1-081 GUCCCAAAGACAUGGGCUUdTdT 81 279 hPLP1-081anti AAGCCCAUGUCUUUGGGACdTdT
[00124] Posteriormente, um RNA foi extraído a partir das células e a expressão do gene PLP1 foi avaliada através de um método quantitativo de PCR (n = 3). Um kit SuperPrep Cell Lysis RT para qPCR (TOYOBO CO., LTD.) foi usado para preparação de RNA e síntese de cDNA. Para o método quantitativo de PCR, foi utilizada uma sonda Taqman para o gene PLP1 (Hs00166914_m1, Applied Biosystems) e para o gene S18 (Hs99999901_s1, Applied Biosystems). Os resultados da expressão do gene foram normalizados para o gene de manutenção S18.
[00125] A Figura 10 mostra os resultados. O eixo vertical na Figura 10 representa eficiências de knockdown com referência às células U-251MG com adição apenas de solução de transfecção. As eficiências de knockdown para o gene PLP1 foram calculadas como níveis de expressão relativa, assumindo o nível de expressão em células U-251MG com adição apenas de solução de transfecção como 1. Foram selecionados 24 pares de sequências
37 / 39 de siRNA que reduzem os níveis de expressão do gene PLP1 para 50% ou menos como valor médio, tanto no primeiro quanto no segundo experimento (Nºs 2, 4, 10, 16, 21, 22, 26, 28, 34, 38, 40, 43, 45, 47, 48, 52, 56, 59, 60, 62, 65, 70, 72, e 80). <Exemplo 8 Avaliação da eficiência de supressão da expressão (Knockdown) em termos dos níveis de expressão do gene PLP1 - Parte 5>
[00126] Com base nos 24 pares de sequências de siRNA obtidos no Exemplo 7, as sequências de miRNA foram projetadas (Tabela 2). Entre elas, foram selecionadas sequências de miRNA alvejando à sequência que codifica o gene PLP1 humano (SEQ ID NOs: 2, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 42 e 51). Entre elas, SEQ ID NOs: 2, 29, 31, 32 e 33 são, cada uma, uma sequência direcionada a uma sequência comum a camundongos e primatas, como os saguis comuns.
[00127] Para avaliar as 10 sequências de miRNA, cada plasmídeo obtido por clonagem de qualquer uma das sequências à jusante de um promotor CAG foi introduzido por meio de um método de transfecção em células HeLa, superexpressando as sequências codificadoras do gene PLP1 humano. Os detalhes experimentais dos iniciadores utilizados na PCR quantitativa para a expressão do gene PLP1 são os mesmos do Exemplo 6. A Figura 11 mostra os resultados do knockdown. O eixo vertical na Figura 11 representa os níveis de expressão de PLP1± SD em relação à expressão quando um vetor incluindo o miR-neg foi adicionado, que foi definido como
1. A Figura 11 indica que os miRNAs tendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 29, 30, 31, 32, 35, 36, 42 e 51 realizaram o knockdown do gene PLP1 humano. <Exemplo 9 Avaliação da eficiência de supressão da expressão (Knockdown) em termos dos níveis de expressão do gene PLP1 - Parte 6>
[00128] Cada um dos vetores usados nos Exemplos 6 e 8, incluindo um miRNA tendo uma sequência nucleotídica apresentada em qualquer uma
38 / 39 das SEQ ID NOs: 2, 29, 31, 32 e 35, foram transfectados em células U-251MG que expressam endogenamente o gene PLP1 humano para avaliar a eficiência de knockdown para a expressão do gene PLP1. Um plasmídeo obtido por clonagem à jusante de um promotor CAG foi introduzido nas células através de um método de transfecção, e as células que expressam GFP foram então selecionadas exclusivamente por um método FACS. Posteriormente, a expressão do gene PLP1 foi analisada através de um método de PCR quantitativo. Para os iniciadores, iniciadores tendo sequências nucleotídicas apresentadas nas SEQ ID NOs: 280 a 283 foram usadas.
[00129] A Figura 12 mostra os resultados. O eixo vertical na Figura 12 representa os níveis de expressão relativa, assumindo o nível de expressão de PLP1 quando um vetor incluindo o miR-neg foi adicionado como 1. A partir da Figura 12, verificou-se que os vetores incluindo um miRNA tendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 29, 31, 32 e 35 também exercem efeito supressor na expressão do gene PLP1 endógeno. <Exemplo 10 Avaliação da eficiência de supressão da expressão (Knockdown) em termos dos níveis de expressão do gene PLP1 - Parte 7>
[00130] Um microlitro de uma solução de um vetor scAAV-AAV1/2 incluindo o miRNA tendo a SEQ ID NO: 2 do Exemplo 9 (título: 1,2 × 1012 vg/mL) foi injetado em um corpo estriado, a cápsula interna, e o cerebelo de cada camundongo do tipo selvagem de 10 dias de idade Jcl:B6C3F1 (n = 3 por grupo). O método de injeção foi o mesmo que o Exemplo 2. Posteriormente, a expressão da proteína PLP1 em células positivas para Venus foi examinada através de imunocoloração para avaliar as eficiências de knockdown de miRNA de PLP1. A imunocoloração foi realizada com o mesmo método do Exemplo 2, exceto que um anticorpo policlonal de coelho anti-PLP1 (Numata Y et al., J. Biol Chem. 2013 Mar 15; 288 (11): 7451-66) foi usado como anticorpo primário e um anticorpo fluorescente anti-coelho
39 / 39 (Thermo Fisher Scientific, EUA) foi usado como anticorpo secundário. Cada sítio do corpo caloso, corpo estriado e cápsula interna foi fotografado com um microscópio de fluorescência KEYENCE (KEYENCE CORPORATION, Japão).
[00131] As intensidades de fluorescência médias de PLP1 imunocorado foram quantificadas usando a Imagem J 1,45s (Wayne Rasband, , National Institutes of Health, EUA), e a Figura 13 mostra a análise quantitativa da intensidade da fluorescência através da coloração por imunofluorescência de PLP1. O eixo vertical na Figura 13 representa os níveis de expressão relativos de PLP1 no lado infectado com referência ao lado não infectado. Pode ser visto na Figura 13 que quase não houve diferença na expressão da proteína PLP1 entre o lado sem injeção do vetor miR-neg (lado não infectado) e o lado com injeção de vetor (lado infectado), enquanto que no vetor de miRNA de PLP1, houve 40% de efeito supressor de expressão na proteína de PLP1 no lado infectado em comparação com o lado não infectado. Aplicabilidade Industrial
[00132] O promotor da presente invenção e o vetor AAV da presente invenção podem servir como um fármaco terapêutico para PMD causada pela duplicação de PLP1. Além disso, eles podem servir como um fármaco terapêutico para PMD causada pela mutação pontual de PLP1. Além disso, como o PLP1 é um dos antígenos alvo da esclerose múltipla, espera-se que eles possam servir como um fármaco terapêutico para a esclerose múltipla.

Claims (24)

1 /5 REIVINDICAÇÕES
1. Promotor específico de oligodendrócitos, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico tendo uma identidade de sequência de pelo menos 90% a uma sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 1.
2. Promotor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico tendo a sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 1.
3. Vetor específico de oligodendrócitos, caracterizado pelo fato de que compreende o promotor como definido na reivindicação 1 ou 2.
4. Vetor de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma sequência de miRNA específica a um gene PLP1 humano operacionalmente ligado ao promotor.
5. miRNA específico a um gene PLP1, caracterizado pelo fato de que compreende um par de sequências nucleotídicas que consistem em uma sequência antissentido e uma sequência de sentido, em que o par de sequências nucleotídicas é selecionado a partir do grupo que consiste em pares de uma sequência antissentido apresentada em uma coluna esquerda de uma tabela abaixo e uma sequência de sentido apresentada exatamente à direita da sequência antissentido em uma coluna direita da tabela. [Tabela 1] Tabela 1. Sequências antissentido e de sentido para miRNA projetadas para o gene PLP1 humano Sequência antissentido Sequência de sentido AAAGGAAGAAGAAAGAGGCAG （SEQ ID NO: CTGCCTCTCTTCTTCCTTT（SEQ ID NO: 53） 52 ） AACACCAGGAGCCACACAACG （SEQ ID NO: CGTTGTGTCTCCTGGTGTT（SEQ ID NO: 55） 54 ） TTCCATGGGAGAACACCATAC （SEQ ID NO: GTATGGTGCTCCCATGGAA（SEQ ID NO: 57） 56 ） TGAGCAGGGAAACCAGTGTAG （SEQ ID NO: CTACACTGTTCCCTGCTCA（SEQ ID NO: 59） 58 ） AGGGCTTTCTGATTGACAGCC （SEQ ID NO: GGCTGTCACAGAAAGCCCT（SEQ ID NO: 61） 60 ）
2 /5 ACCCCAAAGAAACACAATCCA （SEQ ID NO: TGGATTGTTTCTTTGGGGT（SEQ ID NO: 63） 62 ） ACAAATGCAGCAATAAACAGG （SEQ ID NO: CCTGTTTAGCTGCATTTGT（SEQ ID NO: 65） 64 ） AATAGACTGGCAGGTGGTCCA （SEQ ID NO: TGGACCACGCCAGTCTATT（SEQ ID NO: 67） 66 ） AAAGAATGAGCTTGATGTTGG （SEQ ID NO: CCAACATCGCTCATTCTTT（SEQ ID NO: 69） 68 ） AGATACTCATAGTCTTGGTAG （SEQ ID NO: CTACCAAGTATGAGTATCT（SEQ ID NO: 71） 70 ） AGAAACACAATCCAGTGGCCA （SEQ ID NO: TGGCCACTATTGTGTTTCT（SEQ ID NO: 73） 72 ） AAATAGGTCTCAATTAGCTTT （SEQ ID NO: AAAGCTAAGAGACCTATTT（SEQ ID NO: 75） 74 ） AAGAAACACAATCCAGTGGCC （SEQ ID NO: GGCCACTGTTGTGTTTCTT（SEQ ID NO: 77） 76 ） TAAACAGGTGGAAGGTCATTT （SEQ ID NO: AAATGACCCCACCTGTTTA（SEQ ID NO: 79） 78 ） TTGTAGTCGCCAAAGATCTGC （SEQ ID NO: GCAGATCTGGCGACTACAA（SEQ ID NO: 81） 80 ） AATTAGAGCCTCCATTCCTTT （SEQ ID NO: AAAGGAATAGGCTCTAATT（SEQ ID NO: 83） 82 ） TTAAGGACGGCAAAGTTGTAA （SEQ ID NO: TTACAACTGCCGTCCTTAA（SEQ ID NO: 85） 84 ） TTTAAGGACGGCAAAGTTGTA （SEQ ID NO: TACAACTTCCGTCCTTAAA（SEQ ID NO: 87） 86 ） ATGTCTTTGGGACTCTGACTC （SEQ ID NO: GAGTCAGACCCAAAGACAT（SEQ ID NO: 89） 88 ） TATCTATCCTGTGTCTACCAG （SEQ ID NO: CTGGTAGACAGGATAGATA（SEQ ID NO: 91） 90 ） AAATTACTTTCTGATCCTCAG （SEQ ID NO: CTGAGGATGAAAGTAATTT（SEQ ID NO: 93） 92 ） TCTAACAAGCCCATGTCTTTG （SEQ ID NO: CAAAGACAGGCTTGTTAGA（SEQ ID NO: 95） 94 ） AATTACTTTCTGATCCTCAGG （SEQ ID NO: CCTGAGGAAGAAAGTAATT（SEQ ID NO: 97） 96 ） AGTAAATGTACACAGGCACAG （SEQ ID NO: CTGTGCCTGTACATTTACT（SEQ ID NO: 99） 98 ） TAAGTAAGGTTGGCTGAGTTA （SEQ ID NO: TAACTCAGAACCTTACTTA（SEQ ID NO: 101） 100 ） TTCTGTGGGTGAAAGATCCTT （SEQ ID NO: AAGGATCTCACCCACAGAA（SEQ ID NO: 102 ） 103） AGAAGATGCTGACAACACCCT （SEQ ID NO: AGGGTGTTCAGCATCTTCT（SEQ ID NO: 105） 104 ） AATTGTAGCCGGCTGGCTAGT （SEQ ID NO: ACTAGCCACGGCTACAATT（SEQ ID NO: 107） 106 ） AGATTTGGGCAAACGCTCTTA （SEQ ID NO: TAAGAGCGTGCCCAAATCT（SEQ ID NO: 109） 108 ） ATTCTACGCTCCCTTATGCTG （SEQ ID NO: CAGCATAAGAGCGTAGAAT（SEQ ID NO: 110 ） 111） TGGTAATAGAGAGACCAGAAT （SEQ ID NO: ATTCTGGTCTCTATTACCA（SEQ ID NO: 113） 112 ）
3 /5 （ （ TATAGATGGCAAGAGGACCAA SEQ ID NO: TTGGTCCTTGCCATCTATA SEQ ID NO: 115 ） 114 ） （ （ AAACCAGTGTAGCTGCAGCCC SEQ ID NO: GGGCTGCATACACTGGTTT SEQ ID NO: 117 ） 116 ）
6. miRNA de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2 a 7 e 24 a 51.
7. miRNA de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2 a 5, 7, 24, 26, 29 a 32, 35, 36, 42, e 51.
8. miRNA de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 29, 31, e 32.
9. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência do miRNA como definido em qualquer umas das reivindicações 5 a 8.
10. Vetor de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a sequência do miRNA está operacionalmente ligada a um promotor específico de oligodendrócitos.
11. Vetor de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o promotor específico de oligodendrócitos é o promotor como definido na reivindicação 1 ou 2.
12. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 4 ou 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de vírus adenoassociado (AAV).
13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 3, 4 ou 9 a 12.
14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação
4 /5 13, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica para tratar uma doença associada à anormalidade em um gene PLP1.
15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a doença é a doença de Pelizaeus-Merzbacher, paraplegia espástica tipo 2 ou esclerose múltipla.
16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a doença é a doença de Pelizaeus-Merzbacher.
17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é um supressor de expressão do gene PLP1 que suprime a expressão do gene PLP1.
18. Método para tratar uma doença associada à anormalidade de um gene PLP1, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz do vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 3, 4 ou 9 a 12 a um paciente com necessidade de tratamento.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a doença é a doença de Pelizaeus-Merzbacher, paraplegia espástica tipo 2 ou esclerose múltipla.
20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a doença é a doença de Pelizaeus-Merzbacher.
21. Método para suprimir a expressão de um gene PLP1, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz do vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 3, 4 ou 9 a 12 a um paciente com necessidade de tratamento.
22. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 4 ou 9 a 12, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de uma doença associada à anormalidade de um gene PLP1.
5 /5
23. Vetor de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a doença é a doença de Pelizaeus-Merzbacher, paraplegia espástica tipo 2 ou esclerose múltipla.
24. Vetor de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a doença é a doença de Pelizaeus-Merzbacher.
BR112020015967-0A 2018-02-07 2019-02-06 Promotor e vetor específicos de oligodendrócitos, mirna específico a um gene plp1, vetor, composição farmacêutica, e, métodos para tratar uma doença associada à anormalidade de um gene plp1 e para suprimir a expressão de um gene plp1. BR112020015967A2 (pt)

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