KR20200118122A - 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터, PLP1 유전자에 특이적인 miRNA, 해당 프로모터 및/또는 해당 miRNA를 포함하는 벡터 및 해당 벡터를 포함하는 의약 조성물 - Google Patents

올리고덴드로사이트 특이적 프로모터, PLP1 유전자에 특이적인 miRNA, 해당 프로모터 및/또는 해당 miRNA를 포함하는 벡터 및 해당 벡터를 포함하는 의약 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은, PLP1 유전자 이상에 기인하는 PMD를 치료하기 위해서, 올리고덴드로사이트 특이적으로 PLP1 유전자의 발현을 억제할 수 있는 벡터 및 그를 위한 프로모터 및 miRNA, 및 해당 벡터를 포함하는 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터는 서열번호 1에 기재된 염기 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함한다. 본 발명의 PLP1 유전자에 특이적인 miRNA는, 소정의 안티센스 서열과 센스 서열로 이루어지는 1쌍의 염기 서열을 갖는다.

Description

올리고덴드로사이트 특이적 프로모터, PLP1 유전자에 특이적인 miRNA, 해당 프로모터 및/또는 해당 miRNA를 포함하는 벡터 및 해당 벡터를 포함하는 의약 조성물
본 발명은, 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터, 특히, 서열번호 1에 기재된 염기 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터에 관한 것이다. 본 발명은 또한, PLP1 유전자에 특이적인 miRNA에 관한 것이다. 본 발명은 더욱이, 상기 프로모터 및/또는 상기 miRNA를 포함하는 벡터, 및 해당 벡터를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
선천성 대뇌 백질 형성 부전증은 뇌의 백질의 발달이 잘 되지 않는 것이 원인으로 일어나는 아이의 뇌의 병기(病氣)의 총칭이고, 현재 11종류의 병기가 있는 것이 알려져 있다. 이 중의 대표적 질환은, 펠리제우스 메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease: PMD)이다. PMD는, 중추 신경계의 수초화(미엘리네이션)가 장애되는 것이 특징이고, 출생 직후부터 중도(重度)의 운동 발달 장애와 신경학적 증상을 초래하는 희소성 난치성 질환으로, 일본에서의 추정 발생률은 남아 10만 출생에 1.45명이다. 현재까지 근본적인 치료법은 없다.
수초(미엘린)는, 뇌에 있어서는 글리아 세포의 일종인 올리고덴드로사이트(핍돌기교세포, 희(稀)돌기교세포 또는 희(希)돌기교세포)로 이루어져 있고, 신경세포(뉴런)의 축삭의 주위에 존재하는 절연성의 인지질의 다중층 구조를 갖는다. 수초를 구성하는 주된 단백질은 프로테올리피드 프로테인(PLP)이고, 그 밖에는 미엘린 염기성 단백질(MBP) 및 인간 2',3'-환상 뉴클레오타이드 포스포다이에스테라아제(CNP) 등도 알려져 있다. PMD는, 프로테올리피드 프로테인의 유전자(PLP1 유전자)의 이상이 원인인 것이 알려져 있다. 이 중 가장 빈도가 높은 변이가 PLP1 중복 변이(60% 정도)이다. PLP1 중복에 의해, PLP1 유전자가 과잉 발현이 되지만, 발현량을 정상화하는 것에 의해 치료 효과가 기대된다.
비특허문헌 1에는, 발생 중의 마우스의 뇌에 있어서의 미엘린 염기성 단백질(MBP) 또는 글리아 섬유성 산성 단백질(GFAP) 프로모터에 의해 구동되는 아데노 수반 바이러스(AAV) 매개성 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 개시하고 있고, GFAP 프로모터 구동형 GFP 발현은, 신생자 마우스 및 성체 마우스의 뇌로의 벡터 주입 후의 성상 세포에 대해서 고도로 특이적이었던 것에 비해서, 올리고덴드로사이트에 대한 MBP 프로모터의 선택성은, 신생자 마우스 AAV 송달 후에 빈약했지만, 출생 후 10일째의 벡터 주사 후에 우수했던 것이 보고되어 있다. 이 문헌은, 세포 프로모터에 의해 구동되는 AAV를, 발달한 출생 후 뇌에 직접 주입하는 것에 의해, 글리아 세포에 있어서 표적으로 여겨진 장기 트랜스진 발현이 생기는 것을 시사했다.
비특허문헌 2에는, 펠리제우스 메르츠바하양 질환(Pelizaeus-Merzbacher-like disease)에 있어서, 올리고덴드로사이트의 표적 유전자 치료의 개발이 개시되어 있고, GJC2/Cx47 유전자를 미엘린 염기성 단백질 프로모터 아래에 삽입하고, 아데노 수반 바이러스(AAV.MBP.Cx47myc) 벡터를 이용하여, 내강 내의 단회의 뇌 내 주입을 통해서 생후 10일째의 마우스에 투여했다고 보고되어 있다.
비특허문헌 1 및 2에는, AAV 벡터를 이용한 유전자 치료 및 그를 위한 프로모터에 대하여 개시되어 있지만, PLP1 유전자 이상 때문의 유전자 치료 및 그를 위한 프로모터 또는 miRNA에 대하여 전혀 기재되어 있지 않다.
von Jonquieres G 등, Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 2013 Jun 14; 8(6):e65646. Georgiou E 등, Gene therapy targeting oligodendrocytes provides therapeutic benefit in a leukodystrophy model. Brain. 2017 Mar 1; 140(3):599-616.
본 발명은, PLP1 유전자 이상에 기인하는 PMD를 치료하기 위해서, 올리고덴드로사이트 특이적으로 PLP1 유전자의 발현을 억제할 수 있는 벡터 및 그를 위한 프로모터 및 miRNA, 및 해당 벡터를 포함하는 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 서열번호 1에 기재된 서열을 갖는 인간 2',3'-환상 뉴클레오타이드 포스포다이에스테라아제(CNP) 프로모터가, 올리고덴드로사이트 특이적이고 또한 고효율로 유전자 발현을 구동할 수 있고, 또한 해당 프로모터와, 해당 프로모터의 하류에 조작 가능하게 연결되어 있는 PLP1 유전자에 특이적인 miRNA를 포함하는 AAV 벡터에 의해 PLP1 유전자의 발현을 억제할 수 있는 것을 발견하여, 본원 발명의 완성에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 이하의 각 발명에 관한 것이다.
[1] 서열번호 1에 기재된 염기 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함하는, 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터.
[2] 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 갖는 핵산을 포함하는, [1]의 프로모터.
[3] [1] 또는 [2]의 프로모터를 포함하는, 올리고덴드로사이트 특이적 벡터.
[4] 추가로, 상기 프로모터와 조작 가능하게 연결되어 있는 인간 PLP1 유전자에 특이적인 miRNA 서열을 포함하는, [3]의 벡터.
[5] 안티센스 서열과 센스 서열로 이루어지는 1쌍의 염기 서열을 갖는, PLP1 유전자에 특이적인 miRNA로서, 상기 1쌍의 염기 서열은, 표 1의 좌란에 기재된 각각의 안티센스 서열과, 그 옆에 있는 우란에 기재된 각각의 센스 서열로 이루어지는 1쌍의 염기 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는, miRNA.
[6] 서열번호 2∼7 및 24∼51로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열을 갖는, [5]의 miRNA.
[7] 서열번호 2∼5, 7, 24, 26, 29∼32, 35, 36, 42 및 51로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열을 갖는, [5]의 miRNA.
[8] 서열번호 2, 29, 31 및 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열을 갖는, [5]의 miRNA.
[9] [5]∼[8] 중 어느 하나의 miRNA의 서열을 포함하는 벡터.
[10] 상기 miRNA의 서열이 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터와 조작 가능하게 연결되어 있는, [9]의 벡터.
[11] 상기 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터가 [1] 또는 [2]의 프로모터인, [10]의 벡터.
[12] 상기 벡터가 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터인, [3], [4] 및 [9]∼[11] 중 어느 하나의 벡터.
[13] [3], [4] 및 [9]∼[12] 중 어느 하나의 벡터를 포함하는, 의약 조성물.
[14] PLP1 유전자 이상에 수반하는 질환을 치료하기 위한 의약 조성물인, [13]의 의약 조성물.
[15] 상기 질환이 펠리제우스 메르츠바하병, 경성(痙性) 대마비 2형 또는 다발성 경화증인, [14]의 의약 조성물.
[16] 상기 질환이 펠리제우스 메르츠바하병인, [14]의 의약 조성물.
[17] PLP1 유전자의 발현을 억제하는 PLP1 유전자 발현 억제제인, [13]의 의약 조성물.
[18] [3], [4] 및 [9]∼[12] 중 어느 하나의 벡터의 유효량을, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, PLP1 유전자 이상에 수반하는 질환을 치료하기 위한 방법.
[19] 상기 질환이 펠리제우스 메르츠바하병, 경성 대마비 2형 또는 다발성 경화증인, [18]의 방법.
[20] 상기 질환이 펠리제우스 메르츠바하병인, [18]의 방법.
[21] [3], [4] 및 [9]∼[12] 중 어느 하나의 벡터의 유효량을, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, PLP1 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법.
[22] PLP1 유전자 이상에 수반하는 질환의 치료에 있어서의 사용을 위한, [3], [4] 및 [9]∼[12] 중 어느 하나의 벡터.
[23] 상기 질환이 펠리제우스 메르츠바하병, 경성 대마비 2형 또는 다발성 경화증인, [22]의 벡터.
[24] 상기 질환이 펠리제우스 메르츠바하병인, [22]의 벡터.
본 발명의 프로모터를 포함하는 AAV 벡터에 의하면, 올리고덴드로사이트 특이적이고 또한 고효율로 유전자 발현시킬 수 있고, 추가로, 프로모터와 조작 가능하게 연결되어 있는 인간 PLP1 유전자에 특이적인 miRNA 서열을 포함하는 것에 의해, PLP1 유전자의 발현을 억제할 수 있어, PLP1 중복 등에 의한 PMD의 치료약이 될 수 있다.
[도 1] 실시예 1의 AAV 벡터의 개요도이다.
[도 2] 실시예 2의 형광 면역 염색에 의한 AAV 발현 세포의 특이성의 결과를 나타내는 도면이다.
[도 3] 실시예 3의 PLP1 형광 면역 염색의 형광 강도에 의한 PLP1 유전자 발현량의 발현 억제(녹다운)의 부위별 측정 결과를 나타내는 도면이다.
[도 4] 실시예 4의 정량 PCR에 의한 PLP1 유전자 발현량의 발현 억제(녹다운)의 측정 결과를 나타내는 도면이다. (A) 및 (B)는 각각 PLP1 유전자의 상대적 발현량, 및 Olig2 유전자의 상대적 발현량을 나타낸다.
[도 5] 실시예 5의 PLP1-Tg 마우스에의 투여 후에 있어서의 면역 염색에 의한 조직학적 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 6] 실시예 5의 PLP1-Tg 마우스에의 투여 후에 있어서의 전자 현미경에 의한 미소 형태적 해석 결과를 나타내는 도면이다.
[도 7] 실시예 5의 PLP1-Tg 마우스에의 투여에 의한 수명 연장 효과를 나타내는 도면이다.
[도 8] 실시예 5의 PLP1-Tg 마우스에의 투여에 의한 체중 증가 효과를 나타내는 도면이다.
[도 9] 실시예 6의 정량 PCR에 의한 PLP1 유전자 발현량의 발현 억제(녹다운)의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
[도 10] 실시예 7의 정량 PCR에 의한 PLP1 유전자 발현량의 발현 억제(녹다운)의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
[도 11] 실시예 8의 정량 PCR에 의한 PLP1 유전자 발현량의 발현 억제(녹다운)의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
[도 12] 실시예 9의 정량 PCR에 의한 PLP1 유전자 발현량의 발현 억제(녹다운)의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
[도 13] 실시예 10의 PLP1 형광 면역 염색의 형광 강도에 의한 PLP1 유전자 발현량의 발현 억제(녹다운)의 부위별 측정 결과를 나타내는 도면이다.
〔프로모터〕
본 실시형태의 프로모터는, 서열번호 1에 기재된 염기 서열과 적어도 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 핵산, 특히 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 갖는 핵산을 포함하는, 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터이다. 프로모터는, 서열번호 1에 기재된 염기 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 외에, 그 말단에 제한 효소 사이트, Gateway 클로닝용 att 서열 등의 벡터에의 클로닝을 위한 사이트 등의 염기 서열을 포함해도 된다.
서열번호 1에 기재된 염기 서열을 갖는 핵산은, 인간 CNP 프로모터이며, 인간 게놈(GRCh37/hg19)에 있어서의 chr17:40, 118, 309-40, 120, 101에서 유래한다. 인간 CNP 유전자는 뇌 내에 있어서, 올리고덴드로사이트에 특이적으로 발현하는 유전자이며, 그 특이성은 이 프로모터 서열에 의해 규정된다고 생각된다. 본 발명자들이, 서열번호 1에 기재된 인간 CNP 프로모터 서열은, 이 프로모터의 하류에 배치되는 CNP 유전자 이외의 유전자를 올리고덴드로사이트 특이적으로 발현시킬 수 있는 것을 발견했다.
본 실시형태의 프로모터는, 올리고덴드로사이트에 있어서 특이적으로 작동하는 프로모터이며, 그에 의해, 해당 프로모터의 하류에 조작 가능하게 연결되어 있는 유전자가 올리고덴드로사이트에 있어서 특이적으로 발현된다. 본 실시형태의 프로모터는, 유전자 공학적 수법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 인간 게놈으로부터 인간 CNP 프로모터의 유전자를 취득하고, 일부의 염기를 결실, 삽입 또는 치환하는 것에 의해 원하는 염기 서열을 갖는 프로모터를 얻는다. 또한, 일부 또는 완전 합성에 의해 원하는 염기 서열을 갖는 프로모터를 얻을 수도 있다.
〔miRNA〕
miRNA는 통상 안티센스 서열과 센스 서열을 가져, 헤어핀 구조를 형성할 수 있고, 그에 의해 성숙 miRNA로 가공된다. 성숙 miRNA 중 안티센스쇄가 표적 mRNA에 결합하고, 그 mRNA를 분해, 혹은 번역 억제하는 것에 의해, 표적 유전자의 발현이 억제된다. 본 실시형태의 miRNA는, PLP1 유전자, 특히 인간 PLP1 유전자에 특이적인 miRNA이고, 안티센스 서열과 센스 서열을 가져, PLP1 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
본 실시형태의 miRNA에 있어서, 5'측으로부터 5' 플랭킹 서열, 안티센스 서열, 스템 루프 서열, 센스 서열, 3' 플랭킹 서열의 순서로 배치되는 것이 바람직하다. 또한, 5' 플랭킹 서열은 25∼100염기, 스템 루프 서열은 4∼30염기, 3' 플랭킹 서열은 25∼100염기의 길이를 갖는 것으로부터 구성되는 것이면 된다.
플랭킹 서열로서는, 일반적으로 올리고덴드로사이트에서의 발현이 알려져 있는 것이면 되고, 예를 들어, miR155 유래의 서열로서 알려져 있는 5' 플랭킹 서열 및 3' 플랭킹 서열을 이용할 수 있다. miR155 이외에 올리고덴드로사이트에서의 발현이 알려져 있는 miR-138, miR-219, miR-9, miR-23a, miR-388, miR-297c의 5' 플랭킹 서열 및 3' 플랭킹 서열을 이용할 수도 있다.
인간 PLP1 유전자에 특이적인 miRNA 서열은, 예를 들어, BLOCK-iT TM RNAi Designer(ThermoFisher Scientific, USA) 등의 소프트웨어를 이용하여 설계할 수 있고, 예를 들면, 하기에 기재된 인간 PLP1-miRNA 후보 염기 서열을 이용할 수 있다.
인간 PLP1-miRNA 후보 염기 서열 1(서열번호 2):
5'-AAAGGAAGAAGAAAGAGGCAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTGCCTCTCTTCTTCCTTT-3'
인간 PLP1-miRNA 후보 염기 서열 2(서열번호 3):
5'-AACACCAGGAGCCACACAACGGTTTTGGCCACTGACTGACCGTTGTGTCTCCTGGTGTT-3'
인간 PLP1-miRNA 후보 염기 서열 3(서열번호 4):
5'-TTCCATGGGAGAACACCATACGTTTTGGCCACTGACTGACGTATGGTGCTCCCATGGAA-3'
인간 PLP1-miRNA 후보 염기 서열 4(서열번호 5):
5'-TGAGCAGGGAAACCAGTGTAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTACACTGTTCCCTGCTCA-3'
인간 PLP1-miRNA 후보 염기 서열 5(서열번호 6):
5'-AGGGCTTTCTGATTGACAGCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGCTGTCACAGAAAGCCCT-3'
인간 PLP1-miRNA 후보 염기 서열 6(서열번호 7):
5'-ACCCCAAAGAAACACAATCCAGTTTTGGCCACTGACTGACtggattgtttctttggggt-3'
인간 PLP1-miRNA 후보 염기 서열 7(서열번호 24):
5'-ACAAATGCAGCAATAAACAGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCTGTTTAGCTGCATTTGT-3'
인간 PLP1-miRNA 후보 염기 서열 8(서열번호 25):
5'-AATAGACTGGCAGGTGGTCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGACCACGCCAGTCTATT-3'
인간 PLP1-miRNA 후보 염기 서열 9(서열번호 26):
5'-AAAGAATGAGCTTGATGTTGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCAACATCGCTCATTCTTT-3'
인간 PLP1-miRNA 후보 염기 서열 10(서열번호 27):
5'-AGATACTCATAGTCTTGGTAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTACCAAGTATGAGTATCT-3'
인간 PLP1-miRNA 후보 염기 서열 11(서열번호 28):
5'-AAGCCCATGTCTTTGGGACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTCCCAGACATGGGCTT-3'
인간 PLP1 유전자에 특이적인 miRNA 서열은 또한, 실시예에 기재된 바와 같이 인공적으로 siRNA를 설계하고, 그 중에서 최적인 서열을 선정하고 나서, miRNA를 설계하는 것도 가능하다.
본 실시형태의 miRNA가, 안티센스 서열과 센스 서열로 이루어지는 1쌍의 염기 서열을 갖고, 해당 1쌍의 염기 서열은, 표 1의 좌란에 기재된 각각의 안티센스 서열과, 그 옆에 있는 우란에 기재된 각각의 센스 서열로 이루어지는 1쌍의 염기 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되어도 된다.
Figure pct00001
본 실시형태의 miRNA는, 바람직하게는 이하의 1쌍의 염기 서열을 갖는다.
·안티센스 서열인 서열번호 52와 센스 서열인 서열번호 53으로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 54와 센스 서열인 서열번호 55로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 56과 센스 서열인 서열번호 57로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 58과 센스 서열인 서열번호 59로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 62와 센스 서열인 서열번호 63으로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 64와 센스 서열인 서열번호 65로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 68과 센스 서열인 서열번호 69로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 72와 센스 서열인 서열번호 73으로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 76과 센스 서열인 서열번호 77로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 78과 센스 서열인 서열번호 79로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 84와 센스 서열인 서열번호 85로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 86과 센스 서열인 서열번호 87로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 98과 센스 서열인 서열번호 99로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 116과 센스 서열인 서열번호 117로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
본 실시형태의 miRNA는, 더 바람직하게는 이하의 1쌍의 염기 서열을 갖는다.
·안티센스 서열인 서열번호 52와 센스 서열인 서열번호 53으로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 72와 센스 서열인 서열번호 73으로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 76과 센스 서열인 서열번호 77로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
·안티센스 서열인 서열번호 78과 센스 서열인 서열번호 79로 이루어지는 1쌍의 염기 서열
본 실시형태의 miRNA 서열은 또한, 표 2에 기재된 서열번호 29∼51로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열을 가져도 된다.
Figure pct00002
본 실시형태의 miRNA가, 서열번호 2∼7 및 24∼51로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열을 가져도 되고, 서열번호 2∼5, 7, 24, 26, 29∼32, 35, 36, 42 및 51로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열을 갖는 것이 바람직하며, 서열번호 2, 29, 31 및 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열을 갖는 것이 보다 바람직하다.
〔벡터〕
본 실시형태의 올리고덴드로사이트 특이적 벡터는, 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터 및/또는 PLP1 유전자에 특이적인 miRNA를 포함한다. 본 실시형태의 벡터는, PLP1 유전자 이상에 수반하는 질환의 치료, 또는 PLP1 유전자의 발현 억제에 있어서의 사용을 위한 벡터이다.
벡터로서는, 인간 세포에 감염할 수 있고, 유전자 발현할 수 있는 플라스미드 또는 벡터이면 되고, 예를 들면, 아데노 수반 바이러스(AAV), 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 센다이 바이러스, 및 플라스미드(리포솜이나 폴리머와의 복합체를 포함한다) 등을 들 수 있고, AAV인 것이 바람직하다. AAV는, 인간이나 영장목, 설치류 등의 동물에 감염하는 소형의, 파보바이러스과 데펜도바이러스속으로 분류되는 헬퍼 의존형의 엔벨로프를 가지지 않는 바이러스이다. 면역 반응의 유발은 매우 약하여, 병원성이 확인되어 있지 않다. 분열 세포, 비분열 세포의 양방에 감염할 수 있고, 숙주 세포에 감염하면, 유전자를 숙주의 염색체 게놈에 삽입하는 빈도는 낮고, 핵 내 염색체 외에서 생존하여, 유전자를 발현할 수 있다.
AAV로서는, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 등의 혈청형의 AAV가 바람직하게 이용되고, 또한 하이브리드 모자이크 AAV 벡터, 키메라 AAV 벡터도 바람직하게 사용할 수 있다. 예를 들어, 하이브리드 모자이크 AAV 벡터에서는, AAV1/2 하이브리드를 비롯한 AAV1로부터 AAV9까지의 임의의 조합이 가능하다. 키메라 AAV 벡터에서는, 올리고덴드로사이트로의 지향성이 높은 Olig001(Powell SK 등, Gene Ther. 2016 Nov; 23(11):807-814) 등을 들 수 있다.
본 실시형태의 벡터에 있어서의 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터로서는, 올리고덴드로사이트에 있어서 특이적으로 작동하는 프로모터이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 본 실시형태의 프로모터, 즉, 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터로서는, 바람직하게 서열번호 1에 기재된 염기 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함하는, 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터를 들 수 있다. 또한, 본 실시형태의 벡터에 있어서의 PLP1 유전자에 특이적인 miRNA로서는 PLP1 유전자의 발현을 억제할 수 있는 miRNA이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 본 실시형태의 miRNA, 즉, 안티센스 서열과 센스 서열로 이루어지는 1쌍의 염기 서열을 갖는 miRNA로서, 해당 1쌍의 염기 서열은, 표 1의 좌란에 기재된 각각의 안티센스 서열과, 그 옆에 있는 우란에 기재된 각각의 센스 서열로 이루어지는 1쌍의 염기 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는, miRNA를 들 수 있다.
본 실시형태의 벡터는, 본 실시형태의 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터와, 해당 프로모터에 조작 가능하게 연결되어 있는 도입 유전자를 포함해도 된다. 도입 유전자로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, PLP1 유전자에 특이적인 miRNA 서열, 특히 인간 PLP1 유전자에 특이적인 miRNA 서열이 바람직하게 이용된다. 인간 PLP1 유전자에 특이적인 miRNA 서열은, 예를 들어, BLOCK-iT TM RNAi Designer(ThermoFisher Scientific, USA) 등의 소프트웨어를 이용하여 설계할 수 있다. 인간 PLP1 유전자에 특이적인 miRNA 서열은 또한, 실시예에 기재된 바와 같이 인공적으로 siRNA를 설계하고, 그 중에서 최적인 서열을 선정하고 나서, miRNA를 설계하는 것도 가능하다. 이와 같은 인간 PLP1 유전자에 특이적인 miRNA로서는, 예를 들면, 전술한 본 실시형태의 miRNA가 바람직하게 이용된다.
본 실시형태의 벡터는, 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터와, 해당 프로모터에 조작 가능하게 연결되어 있는 본 실시형태의 miRNA를 포함해도 된다. 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, myelin basic protein 유전자 프로모터, PLP1 유전자 프로모터 등을 들 수 있다. 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터로서, 전술한 본 실시형태의 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터가 바람직하게 이용된다. 본 실시형태의 벡터는, 바람직하게는 본 실시형태의 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터와, 해당 프로모터에 조작 가능하게 연결되어 있는 본 실시형태의 miRNA를 1개 이상 포함해도 된다.
본 실시형태의 벡터는 또한, 유전자 발현을 확인하기 위한 리포터 유전자를 포함해도 된다. 리포터 유전자로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, GFP, Venus 또는 TdTomato 등을 들 수 있다.
본 실시형태의 벡터는, 유전자 공학에 의해 용이하게 구축할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1에 기재된 hCNP 프로모터, 및 리포터 유전자를 포함하는 AAV1/2 하이브리드 벡터는, 이하와 같은 방법으로 제작할 수 있다. 자기 상보적 AAV 벡터의 2개의 NotI 사이트 사이에 hCNP 프로모터, Venus 등의 리포터 유전자 코드 영역, 추가로 3' 비번역 영역, SV40 폴리 A 시그널을 순서대로 배치한 후, miRNA 발현 카세트의 염기 서열을 3' 비번역 영역 내에 삽입한다. 벡터는, 사용하기까지 -20℃에서 동결 보존할 수 있고, 사용에 있어서, AAV293 세포(TaKaRa, 일본)에 혈청형 특이적 헬퍼 플라스미드, 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 pHelper와 함께 트랜스펙션한 후, 72시간 배양하고, 세포 내 혹은 배양액 중에 증가시킬 수 있다. 정제는, 스케일에 따라서 컬럼 정제, 한외 여과, 초원심법 등을 이용하여 행할 수 있다. 얻어진 AAV 벡터의 벡터 게놈 역가는, AAVpro Titration Kit(TaKaRa, 일본)를 이용한 정량 PCR에 의해 결정할 수 있다.
〔의약 조성물〕
본 실시형태의 의약 조성물은, 전술한 본 실시형태의 벡터를 포함한다. 본 실시형태의 의약 조성물은, 바람직하게는 PLP1 유전자 이상에 수반하는 질환을 치료하기 위한 의약 조성물이다. PLP1 유전자 이상에 수반하는 질환으로서는, PLP1 유전자 중복, PLP1 유전자 점변이, PLP1 유전자로의 결실 또는 삽입 변이에 기인하는 펠리제우스 메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease: PMD), 경성 대마비 2형 또는 다발성 경화증을 들 수 있다. 본 실시형태의 의약 조성물은 또한, PLP1 유전자의 발현을 억제하는 PLP1 유전자 발현 억제제여도 된다.
본 실시형태의 의약 조성물은, 바람직하게는 AAV 벡터를 포함하는 수성 용액이며, 5×1010∼5×1014vg/ml, 바람직하게는 5×1011∼5×1013vg/ml의 역가를 가져도 된다.
본 실시형태의 의약 조성물은, 예를 들어, 인산 완충 생리 식염수(PBS) 등의 약학적으로 허용되는 첨가 성분, 추가로 다른 치료제를 함유해도 된다. 본 실시형태의 의약 조성물은, 물 등의 수성 용액에 녹이고, 필요에 따라서 다른 성분을 넣음으로써 제조할 수 있다.
본 실시형태의 의약 조성물은, 펠리제우스 메르츠바하병의 치료에 있어서, 직접 뇌에 투여해도 되고, 예를 들면 뇌실질(대뇌 반구 내의 백질, 내포, 소뇌 등) 혹은 척수에 1개소 또는 복수 개소 투여하는 것을 들 수 있고, 혹은, 뇌실 내 또는 혈관 내·복강 내에의 투여도 가능하다. 투여는 생후 언제라도 행하는 것이 가능하다. 주입량은 투여 부위 및 연령에 따라 상이할 수 있지만, 뇌실질 투여의 경우는 0.1∼2ml/부위가 적당하고, 0.5ml/부위 정도 투여하는 것이 바람직하다. 뇌실 내 투여의 경우는 0.5∼2ml/Kg 체중이 적당하고, 1ml/Kg 체중 정도까지 투여하는 것이 바람직하다. 혈관 내 또는 복강 내 투여의 경우는 1∼10ml/Kg 체중이 적당하고, 5ml/Kg 체중까지 투여하는 것이 바람직하다.
〔치료 방법〕
본 실시형태의 치료 방법은, 전술한 본 실시형태의 벡터의 유효량을, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, PLP1 유전자 이상에 수반하는 질환을 치료하기 위한 방법이다. 본 실시형태의 치료 방법은 또한, 전술한 본 실시형태의 벡터의 유효량을, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, PLP1 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법이다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1 올리고덴드로사이트 특이적 AAV 발현 카세트 및 이것을 포함하는 AAV 벡터의 구축>
마우스 PLP1 유전자(NM＿011123.3, 서열번호 8)의 mRNA를 표적으로 하는 프리 miRNA 서열(PLP1 miRNA, 서열번호 9), 및 네거티브 컨트롤로서의 프리 miRNA 서열(miR-neg, 서열번호 10)은, BLOCK-iT TM RNAi Designer(ThermoFisher Scientific, USA)에 의해 설계되었다. 한편, miR-neg는, 헤어핀 구조를 형성할 수 있고, 그에 의해 성숙 miRNA로 가공되지만, 기지의 척추동물 유전자를 표적으로 하지 않는다고 예측되고 있는 miRNA 서열이다.
PLP1-miRNA(서열번호 9):
5'-ACTCCAAAGAAACACAATCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGATTGTTTCTTTGGAGT-3'
miR-neg(서열번호 10):
5'-GTATGCATCGAATGAGATTCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGAATCTCTCGATGCATAC-3'
PLP1 miRNA 서열 및 miR-neg 서열을 설계대로 합성하고, BLOCK-iT(상표) Pol II miR RNAi 발현 벡터 키트에 포함되는 pcDNA(상표) 6.2-GW/miR 벡터(ThermoFisher Scientific, USA)의 클로닝 사이트에 클로닝했다. PLP1 miRNA 서열 또는 miR-neg 서열의 양측에 마우스 miR-155 유래의 5' 플랭킹 서열(서열번호 11) 및 3' 플랭킹 서열(서열번호 12)이 각각 배치되었다. 마우스 miR-155 유래의 5' 플랭킹 서열 및 3' 플랭킹 서열은, 마우스 miR-155의 헤어핀 구조의 부분을 제외한 5' 영역 및 3' 영역이고, 5' 플랭킹 서열 및 3' 플랭킹 서열 사이에 pre-miRNA 서열 또는 miR-neg 서열을 배치하고, 그에 의해 이들 miRNA 서열을 발현할 수 있도록 했다.
5' 플랭킹 서열(서열번호 11):
5'-CTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCT-3'
3' 플랭킹 서열(서열번호 12):
5'-CAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCC-3'
얻어진 pcDNA(상표) 6.2-GW/miR 벡터로부터, 5' 플랭킹 서열-PLP1 miRNA 서열(또는 miR-neg 서열)-3' 플랭킹 서열의 부분을 PCR 증폭하고, 증폭 산물을 XhoI/BamHI로 절단하고, 이것을, pW-CAG-Venus-WPRE 벡터(서열번호 13)를 XhoI/BamHI로 절단하고, venus(서열번호 14) 서열의 3'측에 위치하는 WPRE 양단에서 절단하여 WPRE 서열을 제거한 DNA 단편에 삽입했다. 이어서, 얻어진 벡터를 SpeI/EcoRI로 절단하여 CAG 프로모터를 제거하고, 동일 부위에, 올리고덴드로사이트 특이적인 유전자 발현을 가능하게 하는 1.8kb의 인간 CNP 프로모터(서열번호 1)를 PCR 증폭하고, 양단을 SpeI/EcoRI로 절단한 DNA 단편을, venus 서열의 5'측에 삽입했다. 얻어진 벡터를 추가로 NotI로 절단하고, pW-CAG-Venus-WPRE 유래의 1본쇄 AAV의 백본(backbone)을 제거하고, pscW-PABPN1(서열번호 15)을 NotI로 절단하여 얻어진 자기 상보적 아데노 수반 바이러스(scAAV)의 백본에 결합하여, 최종 구축물 Pscw-hCNP-Venus-PLP1 miRNA(서열번호 16) 및 Pscw-hCNP-Venus-miR-neg(서열번호 17)를 얻었다(도 1).
AAV1/2 하이브리드 벡터(scAAV-AAV1/2 벡터)의 제작은, 비특허문헌 1에 개시된 방법에 따라서 실시했다. 구체적으로는, AAV293 세포를, 상기 얻어진 scAAV 구축물인, Pscw-hCNP-Venus-PLP1 miRNA 또는 Pscw-hCNP-Venus-miR-neg, 각각 AAV1 및 AAV2의 rep 및 cap 유전자를 코드하는 혈청형 특이적 AAV 헬퍼 플라스미드 p5E18RXC1(Xiao W 등, J Virol(1999)73:3994-4003) 및 pAAV-RC(애질런트 테크놀로지사), 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 pHelper(애질런트 테크놀로지사)를, PEI 트랜스펙션에 의해 공(共)트랜스펙션했다. 트랜스펙션의 72시간 후에 세포를 회수하고, scAAV-AAV1/2 벡터를 AAVpro Purification Kit(TaKaRa, 일본)를 이용하여 정제했다. 벡터 게놈 역가는, AAVpro Titration Kit(TaKaRa, 일본)를 이용한 정량 PCR에 의해 결정했다.
얻어진 scAAV-AAV1/2는, 각각 AAV-hCNP-Venus-PLP1 miRNA 벡터(또는 PLP1 miRNA 벡터)와, AAV-hCNP-Venus-miR-neg 벡터(또는 miR-neg 벡터)로 명명했다.
<실시예 2 AAV 벡터의 야생형 마우스에의 투여 및 발현>
실시예 1에서 얻어진 PLP1 miRNA 벡터 또는 miR-neg 벡터의 용액(역가: 1.2×1012vg/ml)은, 생후 10일째의 야생형 마우스 Jcl:B6C3F1의 편측의 선조체 및 내포에 각 1μl 주입했다(각 군 n=5). 주입 전에 펜토바비탈 용액으로 마우스를 마취했다. 벡터의 주입은, 33G 시린지를 이용하여 150nl/분의 속도로 행했다. 주입 후 1분간 그 자리에 방치하고, 침을 천천히 뇌로부터 뽑아냈다. 그 후, 군으로 해서 어미에게 되돌리고, 생후 17일째까지 사육했다.
벡터로부터의 유전자 발현은 생후 17일의 녹색 형광 단백질 Venus를 검출해서 평가했다. Gst-π(성숙 올리고덴드로사이트), NeuN(뉴런) Iba1(마이크로글리아) 및 GFAP(아스트로사이트)를 포함하는 세포 마커에 의한 이중 면역 염색에 의해, Venus 발현 세포의 종류를 특정했다.
면역 염색은, Jcl:B6C3F1 마우스를, Forane 흡입액으로 마취하고, 이어서 PBS, 다음으로 신선한 4% 파라폼알데하이드로 경심강적 관류했다. 뇌를 채취하고, 추가로 4℃에서 하룻밤 고정하고, 이어서 30% 수크로스/PBS로 치환하고, 포매제 OCT 콤파운드(티슈·텍) 중에서 동결 보존했다. 관(冠)상 절편을 얻어(20μm), Venus가 발현하고 있는 감염 세포의 특이성을 확인하기 위해, 면역 염색을 했다. 절편을 블로킹 용액(0.05% Triton TM X-100 및 5% 염소 혈청을 포함하는 PBS)과 함께 3시간 실온에서 인큐베이팅하고, 1차 항체로서, gst-π(Cell Singnaling Technology, 1:300), GFAP(Millipore, 1:400), NeuN(Chemicon, 1:400) 및 Iba1(Biocare, 1:500)을 이용하여, 4℃에서 하룻밤 인큐베이팅했다. 이어서 절편을 세정하고, 적절한 2차 항체(ThermoFisher Scientific, USA)와 함께 실온에서 1시간 인큐베이팅했다. 세포핵을 40,60-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI, Sigma-Aldrich)로 가시화했다. 슬라이드를 ProLong(등록상표) Diamond 마운트제(ThermoFisher Scientific, USA)로 마운트하고, KEYENCE 형광 현미경(KEYENCE, Japan)으로 촬영했다.
결과는 도 2에 나타냈다. 도 2로부터는, Venus 양성 세포는, Gst-π 양성 올리고덴드로사이트와 일치하고 있지만, NeuN 양성 세포의 뉴런, GFAP 양성 아스트로사이트 및 IbaI 양성 마이크로글리아와는 일치하고 있지 않았다. 즉, 도 2에 의해, miR-neg 벡터는, 올리고덴드로사이트 특이적으로, 또한 고효율로 발현하고 있는 것이 증명되었다.
<실시예 3 PLP1 유전자 발현량의 발현 억제(녹다운) 효율의 평가 1>
실시예 1에서 얻어진 2종류의 scAAV-AAV1/2 벡터의 용액(역가: 1.2×1012vg/ml)을, 생후 10일째의 야생형 마우스 Jcl:B6C3F1의 편측의 선조체, 내포 및 소뇌에 1μl씩 주입했다(각 군 n=3). 주입 방법은 실시예 2와 동일했다. 그 후, PLP1 miRNA 녹다운 효율을 평가하기 위해서, Venus 양성 세포에 있어서의 PLP1 단백질의 발현을 면역 염색에 의해 조사했다. 면역 염색의 방법은, 1차 항체로서 항PLP1 토끼 폴리클로날 항체(Numata Y 등, J Biol Chem. 2013 Mar 15;288(11):7451-66), 및 2차 항체로서 항토끼 형광 항체(ThermoFisher Scientific, USA)를 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 행했다. KEYENCE 형광 현미경(KEYENCE, Japan)을 이용하여 뇌량, 선조체, 및 내포의 핵 부위를 촬영했다.
면역 염색한 PLP1의 평균 형광 강도를, Image J 1.45s(Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA)를 이용하여 정량하고, PLP1 형광 면역 염색에 의한 형광 강도의 정량적 해석은 도 3에 나타냈다. 도 3에 의하면, miR-neg 벡터 주입되어 있지 않은 측(비감염측)과, 벡터 주입한 측(감염측)과 PLP1 단백질의 발현의 차는 거의 없는 데 비하여, PLP1 miRNA 벡터의 경우는, 비감염측에 비해 감염측쪽이 40%의 PLP1 단백질의 발현 억제 효과가 확인되었다. 또한, 비감염측과 감염측 사이에 아스트로사이트 및 마이크로글리아의 수에 차이는 없기 때문에, AAV 투여에 의한 반응성 염증 반응은 확인되지 않았다.
<실시예 4 PLP1 유전자 발현량의 발현 억제(녹다운) 효율의 평가 2>
실시예 1에서 얻어진 2종류의 scAAV-AAV1/2 벡터의 용액(역가: 1.2×1012vg/mlvg/ml)을, 생후 10일째의 야생형 마우스 Jcl:B6C3F1의 양측의 선조체, 및 내포에 1μl씩 주입했다(각 군 n=4). 주입 방법은 실시예 2와 동일했다. 그 후, PLP1 miRNA 녹다운 효율을 평가하기 위해서, Venus 양성 세포에 있어서의 PLP1 mRNA의 발현을 정량 PCR에 의해 조사했다.
Venus 양성 세포를 소팅하기 위해서, Jcl:B6C3F1 마우스는 Forane 흡입액으로 마취하고, 20ml의 PBS로 경심강적 관류했다. 뇌를 취출하고, 마이크로다이스 가위로 굵게 세단했다. Accutase(Millipore) 1ml를 각각의 뇌에 가하고, 37℃에서 30분간 인큐베이팅했다. 10% FBS를 포함하는 행크스 평형 염류 용액(HBSS) 2ml를 각 시료에 첨가하고, 조직을 마이크로피펫으로 호모지나이즈했다. 100μm 세포 스트레이너를 이용하여 시료를 여과하고, 회수한 세포 현탁액을 원심분리했다. 미엘린 잔해로부터의 세포를 정제하기 위해서, 세포를 40% 퍼콜(Amersham사)을 포함하는 HBSS 중에 재현탁시키고, 실온에서 25분간, 700×g으로 원심분리했다. 상부의 미엘린층을 흡인하고, 단핵 세포를 1ml DMEM/F12 배지에 재현탁시켰다. 이들 세포는 FACSCanto 플로 사이토미터(BD Biosciences사)에 의해 분리되고, 그 결과는 FlowJo 소프트웨어(Tree Star Inc, OR, RRID:NIF-0000 내지 30575)를 이용하여 분석되었다. 결과는 전체 세포의 퍼센트로서 플롯된다.
정량 PCR을 위해서, RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 이용하여 선별한 Venus 양성 세포의 전체 RNA를 단리하고, SuperScript(등록상표) Reverse Transcriptase Kit(ThermoFisher Scientific, USA)를 이용하여 cDNA를 합성했다. 유전자 발현은, 이하의 특이적 프라이머를 이용하고, LightCycler(등록상표) 480 SYBR Green I Master 및 LightCycler(등록상표) 480 Instrument를 사용하여 정량 RT-PCR에 의해 분석했다(Roche, 스위스). 결과는 하우스키핑 유전자 β 액틴(β-actin)으로 표준화되고, PLP1 및 Olig2의 상대적인 발현량을 산출했다. 각 검체에 대하여 얻어진 CP치(crossing point)를 log 변환하는 것에 의해 상대적 발현량±SD로서 플롯된 결과를 도 4에 나타낸다.
PLP1 포워드 프라이머(서열번호 18): 5'-GTTCCAGAGGCCAACATCAAGCTC-3'
PLP1 리버스 프라이머(서열번호 19): 5'-AGCCATACAACAGTCAGGGCATAG-3'
Olig2 포워드 프라이머(서열번호 20): 5'-GGGAGGTCATGCCTTACGC-3'
Olig2 리버스 프라이머(서열번호 21): 5'-CTCCAGCGAGTTGGTGAGC-3'
β-actin 포워드 프라이머(서열번호 22): 5'-CACAGCTTCTTTGCAGCTCCTT-3'
β-actin 리버스 프라이머(서열번호 23): 5'-GACGACCAGCGCAGCGATA-3'
도 4로부터, 올리고덴드로사이트 마커인 Olig2의 mRNA의 발현량에 관해서는, miR-neg 벡터와 PLP1 miRNA 벡터는 유의차는 없기는 했지만(B), PLP1 mRNA의 발현량에 관해서는, PLP1 miRNA 벡터의 주입에 의해 약 60%의 PLP1 유전자의 발현 억제 효과가 확인되었다(A).
<실시예 5 PLP1 트랜스제닉(PLP1-Tg) 마우스에의 투여 효과>
생후 10일째(체중 5∼6g)의, 마우스 PLP1을 과잉 발현하는 PLP1-Tg/B6C3 한배새끼 마우스의 양측의 선조체 및 내포에, PLP1 miRNA 벡터(처치군, n=16) 또는 miR-neg 벡터(모의 처치군, n=16)를 주입하고, 치료 시험을 행했다. PLP1-Tg/B6C3은, 생리학 연구소 가가와 데쓰시 박사로부터 증여된 PLP1-Tg/BDF1을 계대하고, B6C3 백그라운드에 바꿔 올려 제작했다(Kagawa T 등, Neuron. 1994 Aug;13(2):427-42). PLP1-Tg 호모접합체의 개체에 대해서, 실시예 1에서 얻어진 2종류의 scAAV-AAV1/2 벡터의 용액(역가: 1.2×1012vg/ml)을, 실시예 2와 마찬가지로 생후 10일째의 마우스의 양측의 선조체 및 내포에 각각 1μl씩 주입했다. 양성 대조군으로서, miR-neg 벡터를 주사한 한배새끼 야생형 마우스(n=16)를 사용했다. 이들 마우스의 일부는 생후 25일(주입 후 15일)에 뇌조직을 채취하여, 조직학적 분석(면역 염색, 형태 계측 분석)을 실시하고, 나머지 마우스는 체중 및 생존율의 관찰을 행했다.
면역 염색에 의한 조직학적 해석은, 이하와 같이 행했다. 각 군 n=5의 야생형 및 PLP1-Tg 마우스의 처치군 및 모의 처치군은, 생후 25일(주입 후 15일)에 뇌량, 선조체 및 내포의 각 부위에 대하여, 실시예 3과 마찬가지로 면역 염색을 행했다. 양성 대조군인 야생형 마우스에서는, PLP1은 뇌량, 선조체 및 내포에 있어서 수초에 일치한 섬유상의 강한 염색상을 나타냈다. PLP1-Tg 마우스의 해석에서는, 모의 처치 마우스에서는 수초에 일치하는 염색상은 거의 보이지 않는 한편으로, 올리고덴드로사이트의 세포질에 PLP1이 이상 축적되는 염색상이 얻어졌다. 한편, 처치 마우스에서는 PLP1의 세포질에의 축적성을 나타내는 염색상은 거의 보이지 않고, 수초에 일치하고 있다고 생각되는 섬유상의 염색상이 보였기 때문에, PLP1 miRNA 벡터의 투여에 의해, PLP1의 이상 있는 염색상이 개선되는 것이 분명해졌다. 뇌량의 현미경 사진을 도 5에 나타냈다.
전자 현미경에 의한 미소 형태적 해석은, 이하와 같이 행했다. 각 군 n=2의 야생형, 및 PLP1-Tg 마우스의 처치군 및 모의 처치군은 생후 25일(주입 후 15일)에 2% 글루탈알데하이드 2% 파라폼알데하이드를 포함하는 0.1M 인산 완충액을 이용하여 환류 고정한 후 뇌를 채취하고, 추가로 동일 액에 침윤시켜 고정했다. 뇌량, 선조체 및 내포의 각 부위를 실체 형광 현미경하에 AAV 감염 부위를 확인하고 600μm 사방의 조직편을 잘라내고, 이것을 1% 오스뮴을 포함하는 0.1M 인산 완충액으로 후고정했다. 탈수 처리 후, 조직편은 에폰 수지로 포매하여, 70nm의 초박 절편을 제작하고, 이것을 전자 현미경(TecnaiSpirit, ThermoFisher Scientific, USA)으로 7300배의 배율로 관찰했다.
전자 현미경의 사진은 도 6에 나타냈다. 야생형 마우스에서는, 뇌량, 선조체 및 내포의 각 부위에서, 대부분의 축삭이 수초화되어 있는 것이 명백했다. PLP1-Tg 마우스의 해석에서는, 모의 처치 마우스에서는 수초화되어 있는 축삭의 비율은, 명백하게 낮고, 축삭도 협소화되어 있었다. 한편, 처치 마우스에서는 수초화되어 있는 축삭의 비율이 증가하고, 축삭의 직경도 모의 처치 마우스에 비해 두꺼워지는 경향이 보였다. 이상으로부터, PLP1 miRNA 벡터의 투여에 의해, 초미형태학적으로도 수초화 섬유의 증가에 의한 치료 효과가 명백해졌다.
각 군 n=9의 처치 마우스 및 모의 처치 마우스는, 각 처치군의 체중 및 생존율을 평가하기 위해서, 25일령을 넘어 사망까지 관찰되었다. PLP1-Tg 마우스에의 투여에 의해, 유의한 생존율의 향상(수명 연장) 효과(도 7)와 체중 증가 효과(도 8)가 확인되어, 본 치료법의 유효성이 확인되었다.
이상으로부터, 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터 및 이것을 포함하는 AAV 벡터는, PMD 치료법의 개발을 위한 기반 기술이 될 수 있고, 이것을 이용한 PLP1 특이적 miRNA에 의한 유전자 발현 AAV 벡터는 PMD 치료의 유용한 수단이 될 수 있는 것이 명백해졌다.
<실시예 6 PLP1 유전자 발현량의 발현 억제(녹다운) 효율의 평가 3>
BLOCK-iT(상표) RNAi Designer(ThermoFisher Scientific, USA)로 설계한 인간 PLP1-miRNA의 녹다운 효율을 평가하기 위해서, 인간 PLP1 유전자의 코드 서열을 과잉 발현할 수 있는 플라스미드 pcDNA(상표) 6.2-hPLP1과 CAG promoter 제어하에 발현하는 형광 단백 Venus를 코드하는 cDNA의 하류의 3' 비번역 영역에 서열을 클로닝한 플라스미드인 pscw.CAG.Venus.Plp1miRNA를 동시에 HeLa 세포에 트랜스펙션법에 의해 도입했다. 트랜스펙션에는 TransIt-LT1(다카라 바이오)을 이용했다. 24시간 후에 세포를 회수하고, RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 이용하여 전체 RNA를 추출했다. 정량 PCR이기 때문에, SuperScript(등록상표) Reverse Transcriptase Kit(ThermoFisher Scientific, USA)를 이용하여 cDNA를 합성했다. 유전자 발현은, 이하의 특이적 프라이머를 이용하여, LightCycler(등록상표) 480 SYBR Green I Master 및 LightCycler(등록상표) 480 Instrument를 사용하여 정량 PCR에 의해 분석했다(Roche, 스위스). PLP1 유전자 발현의 정량 PCR에 사용한 프라이머를 하기에 기재한다.
인간 PLP1 포워드 프라이머(서열번호 280): 5'- GCTCCAACCTTCTGTCCATCT -3'
인간 PLP1 리버스 프라이머(서열번호 281): 5'- ACGGCAAAGTTGTAAGTGGC -3'
인간 β-actin 포워드 프라이머(서열번호 282): 5'- GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT -3'
인간 β-actin 리버스 프라이머(서열번호 283): 5'- TGATCCACATCTGCTGGAAGGT -3'
녹다운의 결과를 도 9에 나타낸다. miR-neg를 발현시킨 세포의 PLP1 발현량을 1로 해서 녹다운 효율을 계산했다. 결과는 하우스키핑 유전자 β 액틴(β-actin)으로 표준화되고, 상대적 발현량±SD로 계산되었다. PLP1 유전자 발현량을 저하시키는 7서열을 동정했다(서열번호 2, 3, 4, 5, 7, 24 및 26).
<실시예 7 PLP1 유전자 발현량의 발현 억제(녹다운) 효율의 평가 4>
표 3에 나타낸 센스쇄 및 그의 대응하는 안티센스쇄로 이루어지는 1쌍의 siRNA를 트랜스펙션 용액(RNAi MAX, invitrogen)과 섞어, 조제된 용액을 U-251MG 세포에 가하고, 48시간 배양했다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
그 후, 세포로부터 RNA를 추출하고, PLP1 유전자 발현을 정량 PCR법에 의해 평가했다(n=3). RNA 조제, 및 cDNA 합성에는 SuperPrep Cell Lysis RT Kit for qPCR(TOYOBO)을 이용했다. 정량 PCR법에는 PLP1 유전자(Hs00166914＿m1, Appiled Biosystems) 및 S18 유전자(Hs99999901＿s1, Applied Biosystems)의 Taqman probe를 이용했다. 유전자 발현의 결과는, 하우스키핑 유전자 S18에 의해 표준화되었다.
결과를 도 10에 나타낸다. 도 10의 세로축은, 트랜스펙션 용액만을 첨가한 U-251MG 세포에 대한 녹다운 효율을 나타낸다. PLP1 유전자의 녹다운 효율은, 트랜스펙션 용액만을 첨가한 U-251MG 세포를 1로 한 상대적 발현량으로 계산되었다. 2번의 시행에서 함께 평균치로 50% 이하까지 PLP1 유전자 발현량을 저하시키는 24쌍의 siRNA 서열을 선택했다(No. 2, 4, 10, 16, 21, 22, 26, 28, 34, 38, 40, 43, 45, 47, 48, 52, 56, 59, 60, 62, 65, 70, 72 및 80).
<실시예 8 PLP1 유전자 발현량의 발현 억제(녹다운) 효율의 평가 5>
실시예 7에서 얻어진 24쌍의 siRNA 서열을 기초로 miRNA 서열을 설계했다(표 2). 이들 중, 인간 PLP1 유전자의 코딩 서열을 표적으로 하는 miRNA 서열을 선정했다(서열번호 2, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 42 및 51). 이들 중, 서열번호 2, 29, 31, 32 및 33은 마우스 및 커먼 마모셋 등의 영장류에게 공통인 서열을 대상으로 하고 있는 서열이다.
상기 10서열의 miRNA를 평가하기 위해서, 트랜스펙션법에 의해 인간 PLP1 유전자의 코드 서열을 과잉 발현시킨 HeLa 세포에, CAG promoter의 하류에 상기 서열을 클로닝한 플라스미드를 도입했다. PLP1 유전자 발현의 정량 PCR에 사용한 프라이머의 실험 상세는 실시예 6과 마찬가지이다. 녹다운의 결과를 도 11에 나타낸다. 도 11의 세로축은, miR-neg를 포함하는 벡터를 첨가했을 때의 PLP1 발현량을 1로 한 상대적 발현량±SD를 나타낸다. 도 11에 의하면, 서열번호 2, 29, 30, 31, 32, 35, 36, 42 및 51을 갖는 miRNA는 인간 PLP1 유전자를 녹다운했다.
<실시예 9 PLP1 유전자 발현량의 발현 억제(녹다운) 효율의 평가 6>
실시예 6 및 실시예 8에 사용된 서열번호 2, 29, 31, 32 및 35의 염기 서열을 갖는 miRNA를 포함하는 벡터를 내인성으로 인간 PLP1 유전자를 발현하고 있는 U-251MG 세포에 트랜스펙션하고 PLP1 유전 발현의 녹다운 효율을 평가했다. CAG promoter의 하류에 클로닝한 플라스미드를 트랜스펙션법에 의해 세포에 도입 후, FACS법에 의해 GFP 발현 세포만을 선별했다. 그 후, PLP1 유전자 발현을 정량 PCR법에 의해 해석했다. 서열번호 280∼283에 기재된 염기 서열을 갖는 프라이머를 프라이머로서 사용했다.
결과는 도 12에 나타낸다. 도 12의 세로축은, miR-neg를 포함하는 벡터를 첨가했을 때의 PLP1 발현량을 1로 한 상대적 발현량을 나타낸다. 도 12에 의하면, 서열번호 2, 29, 31, 32 및 35를 갖는 miRNA를 포함하는 벡터에는 내인성으로 발현하고 있는 PLP1 유전자의 발현도 억제하는 효과가 확인되었다.
<실시예 10 PLP1 유전자 발현량의 발현 억제(녹다운) 효율의 평가 7>
실시예 9에서 얻어진 서열번호 2를 갖는 miRNA를 포함하는 scAAV-AAV1/2 벡터의 용액(역가: 1.2×1012vg/ml)을, 생후 10일째의 야생형 마우스 Jcl:B6C3F1의 편측의 선조체, 내포 및 소뇌에 1μl씩 주입했다(각 군 n=3). 주입 방법은 실시예 2와 동일했다. 그 후, PLP1 miRNA 녹다운 효율을 평가하기 위해서, Venus 양성 세포에 있어서의 PLP1 단백질의 발현을 면역 염색에 의해 조사했다. 면역 염색의 방법은, 1차 항체로서 항PLP1 토끼 폴리클로날 항체(Numata Y 등, J Biol Chem. 2013 Mar 15; 288(11):7451-66), 및 2차 항체로서 항토끼 형광 항체(ThermoFisher Scientific, USA)를 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 행했다. KEYENCE 형광 현미경(KEYENCE, Japan)을 이용하여 뇌량, 선조체, 및 내포의 핵 부위를 촬영했다.
면역 염색한 PLP1의 평균 형광 강도를, Image J 1.45s(Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA)를 이용하여 정량하고, PLP1 형광 면역 염색에 의한 형광 강도의 정량적 해석은 도 13에 나타냈다. 도 13의 세로축은, 비감염 측에 대한 감염측의 PLP1의 상대적 발현량을 나타낸다. 도 13에 의하면, miR-neg 벡터 주입하고 있지 않은 측(비감염측)과, 벡터 주입한 측(감염측)과 PLP1 단백질의 발현의 차는 거의 없는 데 비하여, PLP1 miRNA 벡터의 경우는, 비감염측에 비해 감염측쪽이 40%의 PLP1 단백질의 발현 억제 효과가 확인되었다.
본 발명의 프로모터 및 본 발명의 AAV 벡터는, PLP1 중복에 의한 PMD의 치료약이 될 수 있다. 또한, PLP1 점변이에 의한 PMD의 치료약도 될 수 있다. 더욱이, PLP1은 다발성 경화증의 표적 항원의 하나이기 때문에, 다발성 경화증의 치료약도 될 수 있다고 생각된다.
SEQUENCE LISTING <110> National Center of Neurology and Psychiatry Nippon Medical School DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> An oligodendrocyte-specific promoter, a miRNA specific for the PLP1 gene, a vector containing the promotor and / or the miRNA, and a pharmaceutical composition containing the vector <130> FP18-0144-00 <160> 283 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1793 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggaaaggtcg gggctgagac tgactttcgg ctggcacagg gcctggacga atgaggccag 60 tgaggcattt cagatgcaga gtttaccgga atgccagcaa attgcatgat aatattttaa 120 tccaatgtgg taaaaaaaaa agtttttaat taatgcaaaa gtccatgatg aataaaatat 180 caaaaattaa agacaggatc cgactttgca cgaccctgcc tcactcactt cctgctaatc 240 cacgggaccg gggagggtga ctgagttacc cctcaacacg cagaaaaagc tagtggccgc 300 tcagctcgca ggcgcagtgg gtgggtgcgc gtggggagca ggcgcgcgca gggggcggga 360 ccgggccgag gttcccgcgc gcggcgagag tttcgggttt tggttcgcag cgcctgcgcg 420 cagaggagac ggcccgcccc cagcccgccc gggtgcccgc tccgcccccc gggctatgta 480 aagcggccgg 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gggggaaggg aggcagtctt ggggtaaccc ttctccactc 1380 ccccccttct ctgtgcactc agccgtggca gctgtggctt ggcccagaca cagagacccc 1440 cacctccaaa gaggacgtcc ttagtaggtg ccaagcatat aagagtgagg ccagtcccag 1500 aaccgcaggc tcctggcgcg ccccgcatgc ctccagcacg tttacctttc cgaagtggca 1560 ggaatgggga aagcgcacgc ttaggagagc ttcagacaag cttccctctt cctcctccac 1620 gaccagaagc ggaaaggtgc tcccggaccg aaagggaaag aaggtccagc actgccccgc 1680 ttgggaaggc acccacaacc agtctaggga ctaggggtaa ggccggcggg gagcccgcga 1740 atgacctggg ctgacatctc ttcccctcct tacacagaac agaggcttct ccc 1793 <210> 2 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human PLP1-miRNA 1 <400> 2 aaaggaagaa gaaagaggca ggttttggcc actgactgac ctgcctctct tcttccttt 59 <210> 3 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human PLP1 miRNA 2 <400> 3 aacaccagga gccacacaac ggttttggcc actgactgac cgttgtgtct cctggtgtt 59 <210> 4 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human PLP1 miRNA 3 <400> 4 ttccatggga gaacaccata cgttttggcc actgactgac 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uuguccucuu cuccugcaad tdt 23 <210> 196 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-040 <400> 196 gguagacaca ggauagauad tdt 23 <210> 197 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-040anti <400> 197 uaucuauccu gugucuaccd tdt 23 <210> 198 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-041 <400> 198 ucagccaacc uuacuuacad tdt 23 <210> 199 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-041anti <400> 199 uguaaguaag guuggcugad tdt 23 <210> 200 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-042 <400> 200 auggaacugc cucuuucuud tdt 23 <210> 201 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-042anti <400> 201 aagaaagagg caguuccaud tdt 23 <210> 202 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-043 <400> 202 acucagccaa ccuuacuuad tdt 23 <210> 203 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-043anti <400> 203 uaaguaaggu uggcugagud tdt 23 <210> 204 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-044 <400> 204 cuuccacuga uggaaacaad tdt 23 <210> 205 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-044anti <400> 205 uuguuuccau caguggaagd tdt 23 <210> 206 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-045 <400> 206 augaccuucc accuguuuad tdt 23 <210> 207 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-045anti <400> 207 uaaacaggug gaaggucaud tdt 23 <210> 208 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-046 <400> 208 ucuccugagg aucagaaagd tdt 23 <210> 209 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-046anti <400> 209 cuuucugauc cucaggagad tdt 23 <210> 210 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-047 <400> 210 gaggaucaga aaguaauuud tdt 23 <210> 211 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-047anti <400> 211 aaauuacuuu cugauccucd tdt 23 <210> 212 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-048 <400> 212 ggaucuuuca cccacagaad tdt 23 <210> 213 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-048anti <400> 213 uucugugggu gaaagauccd tdt 23 <210> 214 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-049 <400> 214 cugaggauca gaaaguaaud tdt 23 <210> 215 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-049anti <400> 215 auuacuuucu gauccucagd tdt 23 <210> 216 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-050 <400> 216 cugguagaca caggauagad tdt 23 <210> 217 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-050anti <400> 217 ucuauccugu gucuaccagd tdt 23 <210> 218 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-051 <400> 218 gcaguugcug guggcuaaud tdt 23 <210> 219 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-051anti <400> 219 auuagccacc agcaacugcd tdt 23 <210> 220 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-052 <400> 220 aagacauggg cuuguuagad tdt 23 <210> 221 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-052anti <400> 221 ucuaacaagc ccaugucuud tdt 23 <210> 222 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-053 <400> 222 uugcugccac uuacaacuud tdt 23 <210> 223 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-053anti <400> 223 aaguuguaag uggcagcaad tdt 23 <210> 224 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-054 <400> 224 ucguuaggga agagaaacad tdt 23 <210> 225 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-054anti <400> 225 uguuucucuu cccuaacgad tdt 23 <210> 226 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-055 <400> 226 uccacugaug gaaacaaagd tdt 23 <210> 227 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-055anti <400> 227 cuuuguuucc aucaguggad tdt 23 <210> 228 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-056 <400> 228 agagcguuug cccaaaucud tdt 23 <210> 229 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-056anti <400> 229 agauuugggc aaacgcucud tdt 23 <210> 230 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-057 <400> 230 ugauugcugc cacuuacaad tdt 23 <210> 231 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-057anti <400> 231 uuguaagugg cagcaaucad tdt 23 <210> 232 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-058 <400> 232 ggagcguaga aucuguguad tdt 23 <210> 233 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-058anti <400> 233 uacacagauu cuacgcuccd tdt 23 <210> 234 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-059 <400> 234 ugaggaucag aaaguaauud td 22 <210> 235 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-059anti <400> 235 aauuacuuuc ugauccucad tdt 23 <210> 236 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-060 <400> 236 gguguuguca gcaucuucud tdt 23 <210> 237 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-060anti <400> 237 agaagaugcu gacaacaccd tdt 23 <210> 238 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-061 <400> 238 gucaaagcaa ggaucuuucd tdt 23 <210> 239 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-061anti <400> 239 gaaagauccu ugcuuugacd tdt 23 <210> 240 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-062 <400> 240 agaucuuugg cgacuacaad tdt 23 <210> 241 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-062anti <400> 241 uuguagucgc caaagaucud tdt 23 <210> 242 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-063 <400> 242 ugcaggagaa gaggacaaad tdt 23 <210> 243 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-063anti <400> 243 uuuguccucu ucuccugcad tdt 23 <210> 244 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-064 <400> 244 ugguggcuaa ugguguaacd tdt 23 <210> 245 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-064anti <400> 245 guuacaccau uagccaccad tdt 23 <210> 246 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-065 <400> 246 agcuaauuga gaccuauuud tdt 23 <210> 247 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-065anti <400> 247 aaauaggucu caauuagcud tdt 23 <210> 248 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-066 <400> 248 gugcugaugc cagaauguad tdt 23 <210> 249 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-066anti <400> 249 uacauucugg caucagcacd tdt 23 <210> 250 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-067 <400> 250 uuuccaagga gcugagaaud tdt 23 <210> 251 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-067anti <400> 251 auucucagcu ccuuggaaad tdt 23 <210> 252 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-068 <400> 252 ugugccugug uacauuuacd tdt 23 <210> 253 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-068anti <400> 253 guaaauguac acaggcacad tdt 23 <210> 254 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-069 <400> 254 cagguacaga gaaggaaugd tdt 23 <210> 255 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-069anti <400> 255 cauuccuucu cuguaccugd tdt 23 <210> 256 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-070 <400> 256 gcauaaggga gcguagaaud tdt 23 <210> 257 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-070anti <400> 257 auucuacgcu cccuuaugcd tdt 23 <210> 258 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-071 <400> 258 ucagguacag agaaggaaud tdt 23 <210> 259 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-071anti <400> 259 auuccuucuc uguaccugad tdt 23 <210> 260 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-072 <400> 260 gcugcagcua cacugguuud tdt 23 <210> 261 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-072anti <400> 261 aaaccagugu agcugcagcd tdt 23 <210> 262 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-073 <400> 262 ucucccaugg aaugcuuucd tdt 23 <210> 263 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-073anti <400> 263 gaaagcauuc caugggagad tdt 23 <210> 264 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-074 <400> 264 ugccuuccag uaugucaucd tdt 23 <210> 265 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-074anti <400> 265 gaugacauac uggaaggcad tdt 23 <210> 266 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-075 <400> 266 gcugccacuu acaacuuugd tdt 23 <210> 267 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-075anti <400> 267 caaaguugua aguggcagcd tdt 23 <210> 268 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-076 <400> 268 acuuugccgu ccuuaaacud tdt 23 <210> 269 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-076anti <400> 269 aguuuaagga cggcaaagud tdt 23 <210> 270 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-077 <400> 270 accuuacuua cagcauaagd tdt 23 <210> 271 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-077anti <400> 271 cuuaugcugu aaguaaggud tdt 23 <210> 272 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-078 <400> 272 uggacuacug aagcccuaad tdt 23 <210> 273 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-078anti <400> 273 uuagggcuuc aguaguccad tdt 23 <210> 274 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-079 <400> 274 cuuccaguau gucaucuaud tdt 23 <210> 275 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-079anti <400> 275 auagaugaca uacuggaagd tdt 23 <210> 276 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-080 <400> 276 ucuggucucu cuauuaccad tdt 23 <210> 277 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-080anti <400> 277 ugguaauaga gagaccagad tdt 23 <210> 278 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-081 <400> 278 gucccaaaga caugggcuud tdt 23 <210> 279 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPLP1-081anti <400> 279 aagcccaugu cuuugggacd tdt 23 <210> 280 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human PLP1 forward primer <400> 280 gctccaacct tctgtccatc t 21 <210> 281 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human PLP1 reverse primer <400> 281 acggcaaagt tgtaagtggc 20 <210> 282 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human beta-action forward primer <400> 282 gacaggatgc agaaggagat tact 24 <210> 283 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human beta-actin reverse primer <400> 283 tgatccacat ctgctggaag gt 22

Claims (24)

  1. 서열번호 1에 기재된 염기 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함하는, 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터.
  2. 제 1 항에 있어서,
    서열번호 1에 기재된 염기 서열을 갖는 핵산을 포함하는, 프로모터.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 프로모터를 포함하는, 올리고덴드로사이트 특이적 벡터.
  4. 제 3 항에 있어서,
    추가로, 상기 프로모터와 조작 가능하게 연결되어 있는 인간 PLP1 유전자에 특이적인 miRNA 서열을 포함하는, 벡터.
  5. 안티센스 서열과 센스 서열로 이루어지는 1쌍의 염기 서열을 갖는, PLP1 유전자에 특이적인 miRNA로서, 상기 1쌍의 염기 서열은, 하기 표의 좌란에 기재된 각각의 안티센스 서열과, 그 옆에 있는 우란에 기재된 각각의 센스 서열로 이루어지는 1쌍의 염기 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는, miRNA.
    [표 1]
    Figure pct00007
  6. 제 5 항에 있어서,
    서열번호 2∼7 및 24∼51로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열을 갖는, miRNA.
  7. 제 5 항에 있어서,
    서열번호 2∼5, 7, 24, 26, 29∼32, 35, 36, 42 및 51로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열을 갖는, miRNA.
  8. 제 5 항에 있어서,
    서열번호 2, 29, 31 및 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열을 갖는, miRNA.
  9. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 miRNA의 서열을 포함하는 벡터.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 miRNA의 서열이 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터와 조작 가능하게 연결되어 있는, 벡터.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 올리고덴드로사이트 특이적 프로모터가 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 프로모터인, 벡터.
  12. 제 3 항, 제 4 항 및 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터가 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터인, 벡터.
  13. 제 3 항, 제 4 항 및 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 벡터를 포함하는, 의약 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    PLP1 유전자 이상에 수반하는 질환을 치료하기 위한 의약 조성물인, 의약 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 질환이 펠리제우스 메르츠바하병, 경성(痙性) 대마비 2형 또는 다발성 경화증인, 의약 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 질환이 펠리제우스 메르츠바하병인, 의약 조성물.
  17. 제 13 항에 있어서,
    PLP1 유전자의 발현을 억제하는 PLP1 유전자 발현 억제제인, 의약 조성물.
  18. 제 3 항, 제 4 항 및 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 벡터의 유효량을, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, PLP1 유전자 이상에 수반하는 질환을 치료하기 위한 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 질환이 펠리제우스 메르츠바하병, 경성 대마비 2형 또는 다발성 경화증인, 방법.
  20. 제 18 항에 있어서,
    상기 질환이 펠리제우스 메르츠바하병인, 방법.
  21. 제 3 항, 제 4 항 및 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 벡터의 유효량을, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, PLP1 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법.
  22. 제 3 항, 제 4 항 및 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    PLP1 유전자 이상에 수반하는 질환의 치료에 있어서의 사용을 위한, 벡터.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 질환이 펠리제우스 메르츠바하병, 경성 대마비 2형 또는 다발성 경화증인, 벡터.
  24. 제 22 항에 있어서,
    상기 질환이 펠리제우스 메르츠바하병인, 벡터.
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