JPWO2019156115A1 - オリゴデンドロサイト特異的プロモータ、ＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡ、該プロモータ及び／又は該ｍｉＲＮＡを含むベクター並びに該ベクターを含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＰＬＰ１遺伝子異常に起因するＰＭＤを治療するために、オリゴデンドロサイト特異的にＰＬＰ１遺伝子の発現を抑制することができるベクター及びそのためのプロモータ及びｍｉＲＮＡ、並びに該ベクターを含む医薬組成物を提供することを目的とする。本発明のオリゴデンドロサイト特異的プロモータは配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含む。本発明のＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡは、所定のアンチセンス配列とセンス配列とからなる１対の塩基配列を有する。

Description

本発明は、オリゴデンドロサイト特異的プロモータ、特に、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含むオリゴデンドロサイト特異的プロモータに関する。本発明はまた、ＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡに関する。本発明はさらに、上記プロモータ及び／又は上記ｍｉＲＮＡを含むベクター、並びに、該ベクターを含む医薬組成物に関する。

先天性大脳白質形成不全症は脳の白質の発達がうまくいかないことが原因で起こる子供の脳の病気の総称であり、現在１１種類の病気があることが分かっている。このうちの代表的疾患は、ペリツェウス・メルツバッハ病（Pelizaeus-Merzbacher disease：ＰＭＤ）である。ＰＭＤは、中枢神経系の髄鞘化（ミエリネーション）が障害されることが特徴であり、出生直後より重度の運動発達障害と神経学的症状を来す稀少性難治性疾患で、日本での推定発生率は男児１０万出生に１．４５人である。現在までに根本的な治療法はない。

髄鞘（ミエリン）は、脳においてはグリア細胞の一種であるオリゴデンドロサイト(乏突起膠細胞、稀突起膠細胞又は希突起膠細胞)からなっており、神経細胞（ニューロン）の軸索の周りに存在する絶縁性のリン脂質の多重層構造を有する。髄鞘を構成する主なタンパク質はプロテオリピドプロテイン（ＰＬＰ）であり、他にはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）及びヒト２’，３’−環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）なども知られている。ＰＭＤは、プロテオリピドプロテインの遺伝子（ＰＬＰ１遺伝子）の異常が原因であることが分かっている。このうち最も頻度の高い変異がＰＬＰ１重複変異（６０％程度）である。ＰＬＰ１重複によって、ＰＬＰ１遺伝子が過剰発現となるが、発現量を正常化することによって治療効果が期待される。

非特許文献１には、発生中のマウスの脳におけるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）又はグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモータによって駆動されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を開示しており、ＧＦＡＰプロモータ駆動型ＧＦＰ発現は、新生仔マウス及び成体マウスの脳へのベクター注入後の星状細胞に対して高度に特異的であったのに対して、オリゴデンドロサイトに対するＭＢＰプロモータの選択性は、新生仔マウスＡＡＶ送達後に貧弱であったが、出生後１０日目のベクター注射後に優れていたことが報告されている。この文献は、細胞プロモータによって駆動されるＡＡＶを、発達した出生後脳に直接注入することにより、グリア細胞において標的とされた長期トランスジーン発現が生じることを示唆した。

非特許文献２には、ペリツェウス・メルツバッハ様疾患（Pelizaeus-Merzbacher-like disease）において、オリゴデンドロサイトの標的遺伝子治療の開発が開示されており、ＧＪＣ２／Ｃｘ４７遺伝子をミエリン塩基性タンパク質プロモータの下に挿入し、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ．ＭＢＰ．Ｃｘ４７ｍｙｃ）ベクターを用いて、内腔内の単回の脳内注入を介して生後１０日目のマウスに投与したと報告されている。

非特許文献１及び２には、ＡＡＶベクターを用いた遺伝子治療及びそのためのプロモータについて開示されているものの、ＰＬＰ１遺伝子異常のための遺伝子治療及びそのためのプロモータ若しくはｍｉＲＮＡについて何ら記載されていない。

ｖｏｎ Ｊｏｎｑｕｉｅｒｅｓ Ｇら、Ｇｌｉａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ＡＡＶ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｂｒａｉｎ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１３ Ｊｕｎ １４；８（６）：ｅ６５６４６． Ｇｅｏｒｇｉｏｕ Ｅら、Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｂｅｎｅｆｉｔ ｉｎ ａ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｏｄｅｌ． Ｂｒａｉｎ． ２０１７ Ｍａｒ １； １４０（３）：５９９−６１６．

本発明は、ＰＬＰ１遺伝子異常に起因するＰＭＤを治療するために、オリゴデンドロサイト特異的にＰＬＰ１遺伝子の発現を抑制することができるベクター及びそのためのプロモータ及びｍｉＲＮＡ、並びに該ベクターを含む医薬組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、配列番号１に記載の配列を有するヒト２’，３’−環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）プロモータが、オリゴデンドロサイト特異的かつ高効率に遺伝子発現を駆動でき、また、該プロモータと、該プロモータの下流に操作可能に連結されているＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡとを含むＡＡＶベクターによってＰＬＰ１遺伝子の発現を抑制することができることを見出し、本願発明の完成に至った。

すなわち、本発明は、以下の各発明に関する。
［１］配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含む、オリゴデンドロサイト特異的プロモータ。
［２］配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸を含む、［１］のプロモータ。
［３］［１］又は［２］のプロモータを含む、オリゴデンドロサイト特異的ベクター。
［４］さらに、上記プロモータと操作可能に連結されているヒトＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡ配列を含む、［３］のベクター。
［５］アンチセンス配列とセンス配列とからなる１対の塩基配列を有する、ＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡであって、上記１対の塩基配列は、表１の左欄に記載のそれぞれのアンチセンス配列と、その横にある右欄に記載のそれぞれのセンス配列とからなる１対の塩基配列からなる群から選ばれる、ｍｉＲＮＡ。
［６］配列番号２〜７及び２４〜５１からなる群から選ばれる塩基配列を有する、［５］のｍｉＲＮＡ。
［７］配列番号２〜５、７、２４、２６、２９〜３２、３５、３６、４２及び５１からなる群から選ばれる塩基配列を有する、［５］のｍｉＲＮＡ。
［８］配列番号２、２９、３１及び３２からなる群から選ばれる塩基配列を有する、［５］のｍｉＲＮＡ。
［９］［５］〜［８］のいずれかのｍｉＲＮＡの配列を含むベクター。
［１０］上記ｍｉＲＮＡの配列が、オリゴデンドロサイト特異的プロモータと操作可能に連結されている、［９］のベクター。
［１１］上記オリゴデンドロサイト特異的プロモータが［１］又は［２］のプロモータである、［１０］のベクター。
［１２］上記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、［３］、［４］及び［９］〜［１１］のいずれかのベクター。
［１３］［３］、［４］及び［９］〜［１２］のいずれかのベクターを含む、医薬組成物。
［１４］ＰＬＰ１遺伝子異常に伴う疾患を治療するための医薬組成物である、［１３］の医薬組成物。
［１５］上記疾患が、ペリツェウス・メルツバッハ病、痙性対麻痺２型又は多発性硬化症である、［１４］の医薬組成物。
［１６］上記疾患がペリツェウス・メルツバッハ病である、［１４］の医薬組成物。
［１７］ＰＬＰ１遺伝子の発現を抑制するＰＬＰ１遺伝子発現抑制剤である、［１３］の医薬組成物。
［１８］［３］、［４］及び［９］〜［１２］のいずれかのベクターの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、ＰＬＰ１遺伝子異常に伴う疾患を治療するための方法。
［１９］上記疾患が、ペリツェウス・メルツバッハ病、痙性対麻痺２型又は多発性硬化症である、［１８］の方法。
［２０］上記疾患がペリツェウス・メルツバッハ病である、［１８］の方法。
［２１］［３］、［４］及び［９］〜［１２］のいずれかのベクターの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、ＰＬＰ１遺伝子の発現を抑制するための方法。
［２２］ＰＬＰ１遺伝子異常に伴う疾患の治療における使用のための、［３］、［４］及び［９］〜［１２］のいずれかのベクター。
［２３］上記疾患が、ペリツェウス・メルツバッハ病、痙性対麻痺２型又は多発性硬化症である、［２２］のベクター。
［２４］上記疾患がペリツェウス・メルツバッハ病である、［２２］のベクター。

本発明のプロモータを含むＡＡＶベクターによれば、オリゴデンドロサイト特異的かつ高効率に遺伝子発現させることができ、さらに、プロモータと操作可能に連結されているヒトＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡ配列を含むことにより、ＰＬＰ１遺伝子の発現を抑制することができ、ＰＬＰ１重複などによるＰＭＤの治療薬になり得る。

実施例１のＡＡＶベクターの概要図である。 実施例２の蛍光免疫染色によるＡＡＶ発現細胞の特異性の結果を示す図である。 実施例３のＰＬＰ１蛍光免疫染色の蛍光強度によるＰＬＰ１遺伝子発現量の発現抑制（ノックダウン）の部位別測定結果を示す図である。 実施例４の定量ＰＣＲによるＰＬＰ１遺伝子発現量の発現抑制（ノックダウン）の測定結果を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）はそれぞれＰＬＰ１遺伝子の相対的発現量、及びＯｌｉｇ２遺伝子の相対的発現量を示す。 実施例５のＰＬＰ１−Ｔｇマウスへの投与後における免疫染色による組織学的解析結果を示す図である。 実施例５のＰＬＰ１−Ｔｇマウスへの投与後における電子顕微鏡による微小形態的解析結果を示す図である。 実施例５のＰＬＰ１−Ｔｇマウスへの投与による寿命延長効果を示す図である。 実施例５のＰＬＰ１−Ｔｇマウスへの投与による体重増加効果を示す図である。 実施例６の定量ＰＣＲによるＰＬＰ１遺伝子発現量の発現抑制（ノックダウン）の測定結果を示す図である。 実施例７の定量ＰＣＲによるＰＬＰ１遺伝子発現量の発現抑制（ノックダウン）の測定結果を示す図である。 実施例８の定量ＰＣＲによるＰＬＰ１遺伝子発現量の発現抑制（ノックダウン）の測定結果を示す図である。 実施例９の定量ＰＣＲによるＰＬＰ１遺伝子発現量の発現抑制（ノックダウン）の測定結果を示す図である。 実施例１０のＰＬＰ１蛍光免疫染色の蛍光強度によるＰＬＰ１遺伝子発現量の発現抑制（ノックダウン）の部位別測定結果を示す図である。

〔プロモータ〕
本実施形態のプロモータは、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸、特に好ましくは配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸を含む、オリゴデンドロサイト特異的プロモータである。プロモータは、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸のほかに、その末端に制限酵素サイト、Ｇａｔｅｗａｙクローニング用ａｔｔ配列などのベクターへのクローニングのためのサイトなどの塩基配列を含んでもよい。

配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸は、ヒトＣＮＰプロモータであり、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）におけるｃｈｒ１７：４０，１１８，３０９−４０，１２０，１０１に由来する。ヒトＣＮＰ遺伝子は脳内において、オリゴデンドロサイトに特異的に発現する遺伝子であり、その特異性はこのプロモータ配列によって規定されると考えられる。本発明者らが、配列番号１に記載のヒトＣＮＰプロモータ配列は、このプロモータの下流に配置されるＣＮＰ遺伝子以外の遺伝子をオリゴデンドロサイト特異的に発現させることができることを見出した。

本実施形態のプロモータは、オリゴデンドロサイトにおいて特異的に作動するプロモータであり、それによって、該プロモータの下流に操作可能に連結されている遺伝子がオリゴデンドロサイトにおいて特異的に発現される。本実施形態のプロモータは、遺伝子工学的手法によって得ることができる。例えば、ヒトゲノムからヒトＣＮＰプロモータの遺伝子を取得し、一部の塩基を欠失、挿入又は置き換えることによって所望の塩基配列を有するプロモータを得る。また、一部又は完全合成によって所望の塩基配列を有するプロモータを得ることもできる。

〔ｍｉＲＮＡ〕
ｍｉＲＮＡは通常アンチセンス配列とセンス配列を有し、ヘアピン構造を形成でき、それによって成熟ｍｉＲＮＡに加工される。成熟ｍｉＲＮＡのうちアンチセンス鎖が標的ｍＲＮＡに結合し、そのｍＲＮＡを分解、或いは翻訳抑制することによって、標的遺伝子の発現が抑制される。本実施形態のｍｉＲＮＡは、ＰＬＰ１遺伝子、特にヒトＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡであり、アンチセンス配列とセンス配列とを有し、ＰＬＰ１遺伝子の発現を抑制し得る。

本実施形態のｍｉＲＮＡにおいて、５’側から５’フランキング配列、アンチセンス配列、ステムループ配列、センス配列、３’フランキング配列の順に配置されることが好ましい。また、５’フランキング配列は２５〜１００塩基、ステムループ配列は４〜３０塩基、３’フランキング配列は２５〜１００塩基の長さを有するものから構成されるものであればよい。

フランキング配列としては、一般的にオリゴデンドロサイトでの発現が知られているものであればよく、たとえば、ｍｉＲ１５５由来の配列として知られている５’フランキング配列及び３’フランキング配列を用いることができる。ｍｉＲ１５５以外にオリゴデンドロサイトでの発現が知られているｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−３８８、ｍｉＲ−２９７ｃの５’フランキング配列及び３’フランキング配列を用いることもできる。

ヒトＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡ配列は、たとえば、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ ＴＭ ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）などのソフトを用いて設計することができ、例えば、下記に記載のヒトＰＬＰ１−ｍｉＲＮＡ候補塩基配列を用いることができる。
ヒトＰＬＰ１−ｍｉＲＮＡ候補塩基配列１（配列番号２）：
5’-AAAGGAAGAAGAAAGAGGCAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTGCCTCTCTTCTTCCTTT-3’
ヒトＰＬＰ１−ｍｉＲＮＡ候補塩基配列２（配列番号３）：
5’-AACACCAGGAGCCACACAACGGTTTTGGCCACTGACTGACCGTTGTGTCTCCTGGTGTT-3’
ヒトＰＬＰ１−ｍｉＲＮＡ候補塩基配列３（配列番号４）：
5’-TTCCATGGGAGAACACCATACGTTTTGGCCACTGACTGACGTATGGTGCTCCCATGGAA-3’
ヒトＰＬＰ１−ｍｉＲＮＡ候補塩基配列４（配列番号５）：
5’-TGAGCAGGGAAACCAGTGTAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTACACTGTTCCCTGCTCA-3’
ヒトＰＬＰ１−ｍｉＲＮＡ候補塩基配列５（配列番号６）：
5’-AGGGCTTTCTGATTGACAGCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGCTGTCACAGAAAGCCCT-3’
ヒトＰＬＰ１−ｍｉＲＮＡ候補塩基配列６（配列番号７）：
5’-ACCCCAAAGAAACACAATCCAGTTTTGGCCACTGACTGACtggattgtttctttggggt-3’
ヒトＰＬＰ１−ｍｉＲＮＡ候補塩基配列７（配列番号２４）：
5’-ACAAATGCAGCAATAAACAGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCTGTTTAGCTGCATTTGT-3’
ヒトＰＬＰ１−ｍｉＲＮＡ候補塩基配列８（配列番号２５）：
5’-AATAGACTGGCAGGTGGTCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGACCACGCCAGTCTATT-3’
ヒトＰＬＰ１−ｍｉＲＮＡ候補塩基配列９（配列番号２６）：
5’-AAAGAATGAGCTTGATGTTGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCAACATCGCTCATTCTTT-3’
ヒトＰＬＰ１−ｍｉＲＮＡ候補塩基配列１０（配列番号２７）：
5’-AGATACTCATAGTCTTGGTAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTACCAAGTATGAGTATCT-3’
ヒトＰＬＰ１−ｍｉＲＮＡ候補塩基配列１１（配列番号２８）：
5’-AAGCCCATGTCTTTGGGACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTCCCAGACATGGGCTT-3’

ヒトＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡ配列はまた、実施例に記載のように人工的にｓｉＲＮＡを設計し、その中から最適な配列を選定してから、ｍｉＲＮＡを設計することも可能である。

本実施形態のｍｉＲＮＡが、アンチセンス配列とセンス配列とからなる１対の塩基配列を有し、該１対の塩基配列は、表１の左欄に記載のそれぞれのアンチセンス配列と、その横にある右欄に記載のそれぞれのセンス配列とからなる１対の塩基配列からなる群より選択されてもよい。

本実施形態のｍｉＲＮＡは、好ましくは以下の１対の塩基配列を有する。
・アンチセンス配列である配列番号５２と、センス配列である配列番号５３とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号５４と、センス配列である配列番号５５とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号５６と、センス配列である配列番号５７とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号５８と、センス配列である配列番号５９とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号６２と、センス配列である配列番号６３とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号６４と、センス配列である配列番号６５とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号６８と、センス配列である配列番号６９とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号７２と、センス配列である配列番号７３とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号７６と、センス配列である配列番号７７とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号７８と、センス配列である配列番号７９とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号８４と、センス配列である配列番号８５とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号８６と、センス配列である配列番号８７とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号９８と、センス配列である配列番号９９とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号１１６と、センス配列である配列番号１１７とからなる１対の塩基配列

本実施形態のｍｉＲＮＡは、さらに好ましくは以下の１対の塩基配列を有する。
・アンチセンス配列である配列番号５２と、センス配列である配列番号５３とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号７２と、センス配列である配列番号７３とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号７６と、センス配列である配列番号７７とからなる１対の塩基配列
・アンチセンス配列である配列番号７８と、センス配列である配列番号７９とからなる１対の塩基配列

本実施形態のｍｉＲＮＡ配列はまた、表２に記載の配列番号２９〜５１からなる群から選ばれる塩基配列を有してもよい。

本実施形態のｍｉＲＮＡが、配列番号２〜７及び２４〜５１からなる群から選ばれる塩基配列を有してよく、配列番号２〜５、７、２４、２６、２９〜３２、３５、３６、４２及び５１からなる群から選ばれる塩基配列を有することが好ましく、配列番号２、２９、３１及び３２からなる群から選ばれる塩基配列を有することがより好ましい。

〔ベクター〕
本実施形態のオリゴデンドロサイト特異的ベクターは、オリゴデンドロサイト特異的プロモータ及び／又はＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡを含む。本実施形態のベクターは、ＰＬＰ１遺伝子異常に伴う疾患の治療、又は、ＰＬＰ１遺伝子の発現抑制における使用のためのベクターである。

ベクターとしては、ヒト細胞へ感染でき、遺伝子発現できるプラスミド又はベクターであればよく、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、センダイウィルス、及びプラスミド（リポソームやポリマーとの複合体を含む）などがあげられ、ＡＡＶであることが好ましい。ＡＡＶは、ヒトや霊長目、げっ歯類などの動物に感染する小型の、パルボウイルス科ディペンドウイルス属に分類されるヘルパー依存型のエンベロープを持たないウイルスである。免疫反応の誘発は非常に弱く、病原性が確認されていない。分裂細胞、非分裂細胞の両方に感染することができ、宿主細胞に感染すると、遺伝子を宿主の染色体ゲノムに挿入する頻度は低く、核内染色体外で生存し、遺伝子を発現することができる。

ＡＡＶとしては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９などの血清型のＡＡＶが好ましく用いられ、また、ハイブリッドモザイクＡＡＶベクター、キメラＡＡＶベクターも好ましく使用できる。たとえば、ハイブリッドモザイクＡＡＶベクターでは、ＡＡＶ１／２ハイブリッドをはじめとするＡＡＶ１からＡＡＶ９までの任意の組み合わせが可能である。キメラＡＡＶベクターでは、オリゴデンドロサイトへの指向性が高いＯｌｉｇ００１（Ｐｏｗｅｌｌ ＳＫら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１６ Ｎｏｖ；２３（１１）：８０７−８１４）などがあげられる。

本実施形態のベクターにおけるオリゴデンドロサイト特異的プロモータとしては、オリゴデンドロサイトにおいて特異的に作動するプロモータであれば特に限定されないが、好ましくは本実施形態のプロモータ、すなわち、オリゴデンドロサイト特異的プロモータとしては、好ましく配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含む、オリゴデンドロサイト特異的プロモータが挙げられる。また、本実施形態のベクターにおけるＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡとしてはＰＬＰ１遺伝子の発現を抑制できるｍｉＲＮＡであれば特に限定されないが、好ましくは本実施形態のｍｉＲＮＡ、すなわち、アンチセンス配列とセンス配列とからなる１対の塩基配列を有するｍｉＲＮＡであって、該１対の塩基配列は、表１の左欄に記載のそれぞれのアンチセンス配列と、その横にある右欄に記載のそれぞれのセンス配列とからなる１対の塩基配列からなる群より選択される、ｍｉＲＮＡが挙げられる。

本実施形態のベクターは、本実施形態のオリゴデンドロサイト特異的プロモータと、該プロモータに操作可能に連結されている導入遺伝子を含んでもよい。導入遺伝子としては、特に限定されないが、たとえば、ＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡ配列、特にヒトＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡ配列が好ましく用いられる。ヒトＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡ配列は、たとえば、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ ＴＭ ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）などのソフトを用いて設計することができる。ヒトＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡ配列はまた、実施例に記載のように人工的にｓｉＲＮＡを設計し、その中から最適な配列を選定してから、ｍｉＲＮＡを設計することも可能である。このようなヒトＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡとしては、例えば、上述した本実施形態のｍｉＲＮＡが好ましく用いられる。

本実施形態のベクターは、オリゴデンドロサイト特異的プロモータと、該プロモータに操作可能に連結されている本実施形態のｍｉＲＮＡとを含んでもよい。オリゴデンドロサイト特異的プロモータとしては、特に限定されないが、例えば、ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子プロモータ、ＰＬＰ１遺伝子プロモータなどが挙げられる。オリゴデンドロサイト特異的プロモータとして、上述した本実施形態のオリゴデンドロサイト特異的プロモータが好ましく用いられる。本実施形態のベクターは、好ましくは本実施形態のオリゴデンドロサイト特異的プロモータと、該プロモータに操作可能に連結されている本実施形態のｍｉＲＮＡを１つ以上含んでもよい。

本実施形態のベクターはまた、遺伝子発現を確認するためのリポータ遺伝子を含んでもよい。リポータ遺伝子としては特に限定されないが、たとえば、ＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、又はＴｄＴｏｍａｔｏなどがあげられる。

本実施形態のベクターは、遺伝子工学によって容易に構築することができる。たとえば、配列番号１に記載のｈＣＮＰプロモータ、及びリポータ遺伝子を含むＡＡＶ１／２ハイブリッドベクターは、以下のような方法で作製することができる。自己相補的ＡＡＶベクターの２つのＮｏｔＩサイトの間にｈＣＮＰプロモータ、Ｖｅｎｕｓなどのリポータ遺伝子コード領域、さらに３’非翻訳領域、ＳＶ４０ポリＡシグナルを順に配置した後、ｍｉＲＮＡ発現カセットの塩基配列を３’非翻訳領域内に挿入する。ベクターは、使用するまでに−２０℃で凍結保存でき、使用に際して、ＡＡＶ２９３細胞（ＴａＫａＲａ、日本）に血清型特異的ヘルパープラスミド、アデノウィルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒとともにトンランスフェクションした後、７２時間培養し、細胞内あるいは培養液中に増やすことができる。精製は、スケールに応じてカラム精製、限外濾過、超遠心法などを用いて行なうことができる。得られたＡＡＶベクターのベクターゲノム力価は、ＡＡＶｐｒｏ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ、日本）を用いた定量ＰＣＲによって決定することができる。

〔医薬組成物〕
本実施形態の医薬組成物は、上述した本実施形態のベクターを含む。本実施形態の医薬組成物は、好ましくはＰＬＰ１遺伝子異常に伴う疾患を治療するための医薬組成物である。ＰＬＰ１遺伝子異常に伴う疾患としては、ＰＬＰ１遺伝子重複、ＰＬＰ１遺伝子点変異、ＰＬＰ１遺伝子への欠失又は挿入変異に起因するペリツェウス・メルツバッハ病（Pelizaeus-Merzbacher disease：ＰＭＤ）、痙性対麻痺２型、又は多発性硬化症があげられる。本実施形態の医薬組成物はまた、ＰＬＰ１遺伝子の発現を抑制するＰＬＰ１遺伝子発現抑制剤であってもよい。

本実施形態の医薬組成物は、好ましくはＡＡＶベクターを含む水性溶液であり、５×１０^１０〜５×１０^１４ｖｇ／ｍｌ、好ましくは５×１０^１１〜５×１０^１３ｖｇ／ｍｌの力価を有してもよい。

本実施形態の医薬組成物は、たとえば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの薬学的に許容される添加成分、さらに他の治療剤を含有してもよい。本実施形態の医薬組成物は、水などの水性溶液に溶かして、必要に応じて他の成分を入れることで製造することができる。

本実施形態の医薬組成物は、ペリツェウス・メルツバッハ病の治療に際して、直接に脳に投与してよく、例えば脳実質（大脳半球内の白質、内包、小脳など）あるいは脊髄に１箇所又は複数箇所投与することがあげられ、あるいは、脳室内又は血管内・腹腔内への投与も可能である。投与は生後いつでも行うことが可能である。注入量は投与部位及び年齢によって異なり得るが、脳実質投与の場合は０．１〜２ｍｌ／部位が適当であり、０．５ｍｌ／部位程度投与することが好ましい。脳室内投与の場合は０．５〜２ｍｌ／Ｋｇ体重が適当であり、１ｍｌ／Ｋｇ体重程度まで投与することが好ましい。血管内又は腹腔内投与の場合は１〜１０ｍｌ／Ｋｇ体重が適当であり、５ｍｌ／Ｋｇ体重まで投与することが好ましい。

〔治療方法〕
本実施形態の治療方法は、上述した本実施形態のベクターの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、ＰＬＰ１遺伝子異常に伴う疾患を治療するための方法である。本実施形態の治療方法はまた、上述した本実施形態のベクターの有効量を、有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、ＰＬＰ１遺伝子の発現を抑制するための方法である。

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

＜実施例１ オリゴデンドロサイト特異的ＡＡＶ発現カセット及びこれを含むＡＡＶベクターの構築＞
マウスＰＬＰ１遺伝子（ＮＭ＿０１１１２３．３、配列番号８）のｍＲＮＡを標的とするプレｍｉＲＮＡ配列（ＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡ、配列番号９）、及び、ネガティブコントロールとしてのプレｍｉＲＮＡ配列（ｍｉＲ−ｎｅｇ、配列番号１０）は、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ ＴＭ ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）によって設計された。なお、ｍｉＲ−ｎｅｇは、ヘアピン構造を形成でき、それによって成熟ｍｉＲＮＡに加工されるものの、既知の脊椎動物遺伝子を標的としないと予測されているｍｉＲＮＡ配列である。
ＰＬＰ１−ｍｉＲＮＡ（配列番号９）：
5’-ACTCCAAAGAAACACAATCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGATTGTTTCTTTGGAGT-3’
ｍｉＲ−ｎｅｇ（配列番号１０）：
5’-GTATGCATCGAATGAGATTCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGAATCTCTCGATGCATAC-3’

ＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡ配列及びｍｉＲ−ｎｅｇ配列を設計とおりに合成し、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標） Ｐｏｌ ＩＩ ｍｉＲ ＲＮＡｉ発現ベクターキットに含まれるｐｃＤＮＡ（商標）６．２−ＧＷ／ｍｉＲベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）のクローニングサイトにクローニングした。ＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡ配列又はｍｉＲ−ｎｅｇ配列の両側にマウスｍｉＲ−１５５由来の５’フランキング配列（配列番号１１）及び３’フランキング配列（配列番号１２）がそれぞれ配置された。マウスｍｉＲ−１５５由来の５’フランキング配列及び３’フランキング配列は、マウスｍｉＲ−１５５のヘアピン構造の部分を除いた５’領域及び３’領域であり、５’フランキング配列及び３’フランキング配列の間にｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列又はｍｉＲ−ｎｅｇ配列を配置し、それによってこれらのｍｉＲＮＡ配列が発現できるようにした。
５’フランキング配列（配列番号１１）：
5’-CTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCT-3’
３’フランキング配列（配列番号１２）：
5’-CAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCC-3’

得られたｐｃＤＮＡ（商標）６．２−ＧＷ／ｍｉＲベクターから、５’フランキング配列−ＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡ配列（又はｍｉＲ−ｎｅｇ配列）−３’フランキング配列の部分をＰＣＲ増幅し、増幅産物をＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩで切断し、これを、ｐＷ−ＣＡＧ−Ｖｅｎｕｓ−ＷＰＲＥベクター（配列番号１３）をＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩで切断し、ｖｅｎｕｓ（配列番号１４）配列の３’側に位置するＷＰＲＥ両端で切断しＷＰＲＥ配列を除去したＤＮＡ断片に挿入した。次いで、得られたベクターをＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＩで切断してＣＡＧプロモータを除去し、同部位に、オリゴデンドロサイト特異的な遺伝子発現を可能にする１．８ｋｂのヒトＣＮＰプロモータ（配列番号１）をＰＣＲ増幅し、両端をＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＩで切断したＤＮＡ断片を、ｖｅｎｕｓ配列の５’側に挿入した。得られたベクターをさらにＮｏｔＩで切断し、ｐＷ−ＣＡＧ−Ｖｅｎｕｓ−ＷＰＲＥ由来の一本鎖ＡＡＶのバックボーンを除去し、ｐｓｃＷ−ＰＡＢＰＮ１（配列番号１５）をＮｏｔＩで切断して得られた自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）のバックボーンに結合し、最終構築物Ｐｓｃｗ−ｈＣＮＰ−Ｖｅｎｕｓ−ＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡ（配列番号１６）及びＰｓｃｗ−ｈＣＮＰ−Ｖｅｎｕｓ−ｍｉＲ−ｎｅｇ（配列番号１７）を得た（図１）。

ＡＡＶ１／２ハイブリッドベクター（ｓｃＡＡＶ−ＡＡＶ１／２ベクター）の作製は、非特許文献１に開示の方法従って実施した。具体的には、ＡＡＶ２９３細胞を、上記得られたｓｃＡＡＶ構築物である、Ｐｓｃｗ−ｈＣＮＰ−Ｖｅｎｕｓ−ＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡ若しくはＰｓｃｗ−ｈＣＮＰ−Ｖｅｎｕｓ−ｍｉＲ−ｎｅｇ、それぞれＡＡＶ１及びＡＡＶ２のｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする血清型特異的ＡＡＶヘルパープラスミドｐ５Ｅ１８ＲＸＣ１（Ｘｉａｏ Ｗら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ （１９９９）７３：３９９４−４００３）及びｐＡＡＶ−ＲＣ（アジレントテクノロジー社）、並びにアデノウィルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（アジレントテクノロジー社）を、ＰＥＩトランスフェクションによって共トランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後に細胞を回収し、ｓｃＡＡＶ−ＡＡＶ１／２ベクターをＡＡＶｐｒｏ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ、日本）を用いて精製した。ベクターゲノム力価は、ＡＡＶｐｒｏ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ、日本）を用いた定量ＰＣＲによって決定した。

得られたｓｃＡＡＶ−ＡＡＶ１／２は、それぞれＡＡＶ−ｈＣＮＰ−Ｖｅｎｕｓ−ＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡベクター（又はＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡベクター）と、ＡＡＶ−ｈＣＮＰ−Ｖｅｎｕｓ−ｍｉＲ−ｎｅｇベクター（又はｍｉＲ−ｎｅｇベクター）と命名した。

＜実施例２ ＡＡＶベクターの野生型マウスへの投与及び発現＞
実施例１で得られたＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡベクター又はｍｉＲ−ｎｅｇベクターの溶液（力価：１．２×１０^１２ｖｇ／ｍｌ）は、生後１０日目の野生型マウスＪｃｌ：Ｂ６Ｃ３Ｆ１の片側の線条体及び内包に各１μｌ注入した（各群ｎ＝５）。注入の前にペントバルビタール溶液でマウスを麻酔した。ベクターの注入は、３３Ｇシリンジを用いて１５０ｎｌ／分の速度で行った。注入後１分間その場に放置し、針をゆっくりと脳から引き抜いた。その後、群として母親に戻し、生後１７日目まで飼育した。

ベクターからの遺伝子発現は生後１７日の緑色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓを検出し評価した。Ｇｓｔ−π（成熟オリゴデンドロサイト）、ＮｅｕＮ（ニューロン）Ｉｂａ１（ミクログリア）及びＧＦＡＰ（アストロサイト）を含む細胞マーカーによる二重免疫染色により、Ｖｅｎｕｓ発現細胞の種類を特定した。

免疫染色は、Ｊｃｌ：Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウスを、Ｆｏｒａｎｅ吸入液で麻酔し、次いでＰＢＳ、次に新鮮な４％パラホルムアルデヒドで経心腔的灌流した。脳を採取し、さらに４℃で一晩固定し、次いで３０％スクロース／ＰＢＳで置換し、包埋剤ＯＣＴコンパウンド（ティシュー・テック）中で凍結保存した。冠状切片を得（２０μｍ）、Ｖｅｎｕｓが発現している感染細胞の特異性を確認するため、免疫染色をした。切片をブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ ＴＭ Ｘ−１００及び５％ヤギ血清を含むＰＢＳ）と共に３時間室温でインキュベートし、一次抗体として、ｇｓｔ−π（ＣｅｌｌＳｉｎｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：３００）、ＧＦＡＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：４００）、ＮｅｕＮ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１：４００）、及びＩｂａ１（Ｂｉｏｃａｒｅ， １：５００）を用いて、４℃で一晩インキュベートした。次いで切片を洗浄し、適切な二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）と共に室温で１時間インキュベートした。細胞核を４０，６０−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で可視化した。スライドをＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｄｉａｍｏｎｄマウント剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）でマウントし、ＫＥＹＥＮＣＥ蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ、Ｊａｐａｎ）で撮影した。

結果は図２に示した。図２からは、Ｖｅｎｕｓ陽性細胞は、Ｇｓｔ−π陽性オリゴデンドロサイトと一致しているが、ＮｅｕＮ陽性細胞のニューロン、ＧＦＡＰ陽性アストロサイト及びＩｂａＩ陽性ミクログリアとは一致していかなった。すなわち、図２によって、ｍｉＲ−ｎｅｇベクターは、オリゴデンドロサイト特異的に、かつ、高効率に発現していることが証明された。

＜実施例３ ＰＬＰ１遺伝子発現量の発現抑制（ノックダウン）効率の評価１＞
実施例１で得られた２種類のｓｃＡＡＶ−ＡＡＶ１／２ベクターの溶液（力価：１．２×１０^１２ｖｇ／ｍｌ）を、生後１０日目の野生型マウスＪｃｌ：Ｂ６Ｃ３Ｆ１の片側の線条体、内包及び小脳に１μｌずつ注入した（各群ｎ＝３）。注入方法は実施例２と同じであった。その後、ＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡノックダウン効率を評価するために、Ｖｅｎｕｓ陽性細胞におけるＰＬＰ１タンパク質の発現を免疫染色によって調べた。免疫染色の方法は、一次抗体として抗ＰＬＰ１ウサギポリクローナル抗体（Ｎｕｍａｔａ Ｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１３ Ｍａｒ １５；２８８（１１）：７４５１−６６）、及び二次抗体として抗ウサギ蛍光抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いた以外、実施例１と同様に行った。ＫＥＹＥＮＣＥ蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ、Ｊａｐａｎ）を用いて脳梁、線条体、及び内包の核部位を撮影した。

免疫染色したＰＬＰ１の平均蛍光強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊ １．４５ｓ（Ｗａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡ）を用いて定量し、ＰＬＰ１蛍光免疫染色による蛍光強度の定量的解析は図３に示した。図３によれば、ｍｉＲ−ｎｅｇベクター注入していない側（非感染側）と、ベクター注入した側（感染側）とＰＬＰ１タンパク質の発現の差は殆どないのに対して、ＰＬＰ１ｍｉＲＮＡベクターの場合は、非感染側に比べ感染側のほうが４０％のＰＬＰ１タンパク質の発現抑制効果が認められた。また、非感染側と感染側の間にアストロサイト及びミクログリアの数に差異はないことから、ＡＡＶ投与による反応性炎症反応は認めなかった。

＜実施例４ ＰＬＰ１遺伝子発現量の発現抑制（ノックダウン）効率の評価２＞
実施例１で得られた２種類のｓｃＡＡＶ−ＡＡＶ１／２ベクターの溶液（力価：１．２×１０^１２ｖｇ／ｍｌｖｇ／ｍｌ）を、生後１０日目の野生型マウスＪｃｌ：Ｂ６Ｃ３Ｆ１の両側の線条体、及び内包に１μｌずつ注入した（各群ｎ＝４）。注入方法は実施例２と同じであった。その後、ＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡノックダウン効率を評価するために、Ｖｅｎｕｓ陽性細胞におけるＰＬＰ１ｍＲＮＡの発現を定量ＰＣＲによって調べた。

Ｖｅｎｕｓ陽性細胞をソートするために、Ｊｃｌ：Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウスはＦｏｒａｎｅ吸入液で麻酔し、２０ｍｌのＰＢＳで経心腔的灌流した。脳を取り出して、マイクロダイスハサミで粗く細断した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）１ｍｌをそれぞれの脳に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。１０％ＦＢＳを含むハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）２ｍｌを各試料に添加し、組織をマイクロピペットでホモジナイズした。１００μｍ細胞ストレーナーを用いて試料を濾過し、回収した細胞懸濁液を遠心分離した。ミエリン残骸からの細胞を精製するために、細胞を４０％パーコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を含むＨＢＳＳ中に再懸濁し、室温で２５分間、７００×ｇで遠心分離した。上部のミエリン層を吸引し、単核細胞を１ｍｌ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に再懸濁した。これらの細胞はＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により分離され、その結果はＦｌｏｗＪｏソフトソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ、ＯＲ、ＲＲＩＤ：ＮＩＦ−００００から３０５７５）を用いて分析された。結果は全細胞のパーセントとしてプロットされる。

定量ＰＣＲのために、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて選別したＶｅｎｕｓ陽性細胞の全ＲＮＡを単離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡを合成した。遺伝子発現は、以下の特異的プライマーを用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して定量ＲＴ−ＰＣＲによって分析した（Ｒｏｃｈｅ、スイス）。結果はハウスキーピング遺伝子βアクチン（β−ａｃｔｉｎ）に標準化され、ＰＬＰ１及びＯｌｉｇ２の相対的な発現量を算出した。各検体について得られたＣＰ値（ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）をｌｏｇ変換することにより相対的発現量±ＳＤとしてプロットされた結果を図４に示す。
ＰＬＰ１フォワードプライマー（配列番号１８）：5’-GTTCCAGAGGCCAACATCAAGCTC-3’
ＰＬＰ１リバースプライマー（配列番号１９）：5’-AGCCATACAACAGTCAGGGCATAG-3’
Ｏｌｉｇ２フォワードプライマー（配列番号２０）：5’-GGGAGGTCATGCCTTACGC-3’
Ｏｌｉｇ２リバースプライマー（配列番号２１）：5’-CTCCAGCGAGTTGGTGAGC-3’
β−ａｃｔｉｎフォワードプライマー（配列番号２２）：5’-CACAGCTTCTTTGCAGCTCCTT-3’
β−ａｃｔｉｎリバースプライマー（配列番号２３）：5’-GACGACCAGCGCAGCGATA-3’

図４から、オリゴデンドロサイトマーカーであるＯｌｉｇ２のｍＲＮＡの発現量に関しては、ｍｉＲ−ｎｅｇベクターとＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡベクターとは有意差はなかったものの（Ｂ）、ＰＬＰ１ ｍＲＮＡの発現量に関しては、ＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡベクターの注入によって約６０％のＰＬＰ１遺伝子の発現抑制効果が認められた（Ａ）。

＜実施例５ ＰＬＰ１トランスジェニック（ＰＬＰ１−Ｔｇ）マウスへの投与効果＞
生後１０日目（体重５〜６ｇ）の、マウスＰＬＰ１を過剰発現するＰＬＰ１−Ｔｇ／Ｂ６Ｃ３同腹仔マウスの両側の線条体及び内包に、ＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡベクター（処置群、ｎ＝１６）又はｍｉＲ−ｎｅｇベクター（模擬処置群、ｎ＝１６）を注入し、治療試験を行った。ＰＬＰ１−Ｔｇ／Ｂ６Ｃ３は、生理学研究所鹿川哲史博士より贈与されたＰＬＰ１−Ｔｇ／ＢＤＦ１を継代し、Ｂ６Ｃ３バックグラウンドに乗せかえて作製した（Ｋａｇａｗａ Ｔら、Ｎｅｕｒｏｎ． １９９４ Ａｕｇ；１３（２）：４２７−４２）。ＰＬＰ１−Ｔｇホモ接合体の個体に対して、実施例１で得られた２種類のｓｃＡＡＶ−ＡＡＶ１／２ベクターの溶液（力価：１．２×１０^１２ｖｇ／ｍｌ）を、実施例２と同様に生後１０日目のマウスの両側の線条体及び内包にそれぞれ１μｌずつ注入した。陽性対照群として、ｍｉＲ−ｎｅｇベクターを注射した同腹仔野生型マウス（ｎ＝１６）を使用した。これらのマウスの一部は生後２５日（注入後１５日）に脳組織を採取し、組織学的分析（免疫染色、形態計測分析）を実施し、残りのマウスは体重及び生存率の観察を行った。

免疫染色による組織学的解析は、以下のように行った。各群ｎ＝５の野生型及びＰＬＰ１−Ｔｇマウスの処置群及び模擬処置群は、生後２５日（注入後１５日）に脳梁、線条体及び内包の各部位について、実施例３と同様に免疫染色を行なった。陽性対照群である野生型マウスでは、ＰＬＰ１は脳梁、線条体及び内包において髄鞘に一致した線維状の強い染色像を示した。ＰＬＰ１−Ｔｇマウスの解析では、模擬処置マウスでは髄鞘に一致する染色像はほとんど見られない一方で、オリゴデンドロサイトの細胞質にＰＬＰ１が異常蓄積する染色像が得られた。一方、処置マウスではＰＬＰ１の細胞質への蓄積性を示す染色像はほとんど見られず、髄鞘に一致していると思われる繊維状の染色像が見られたことから、ＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡベクターの投与により、ＰＬＰ１の異常な染色像が改善することが明らかになった。脳梁の顕微鏡写真を図５に示した。

電子顕微鏡による微小形態的解析は、以下のように行った。各群ｎ＝２の野生型、及びＰＬＰ１−Ｔｇマウスの処置群及び模擬処置群は生後２５日（注入後１５日）に２％グルタールアルデヒド２％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液を用いて還流固定したのち脳を採取し、さらに同液に浸潤して固定した。脳梁、線条体及び内包の各部位を実体蛍光顕微鏡下にＡＡＶ感染部位を確認して６００μｍ四方の組織片を切り出し、これを１％オスミウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液にて後固定した。脱水処理後、組織片はエポン樹脂に包埋し、７０ｎｍの超薄切片を作製し、これを電子顕微鏡（Ｔｅｃｎａｉ Ｓｐｉｒｉｔ， ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）にて７３００倍の倍率にて観察した。

電子顕微鏡の写真は図６に示した。野生型マウスでは、脳梁、線条体及び内包の各部位で、ほとんどの軸索が髄鞘化されていることが明らかであった。ＰＬＰ１−Ｔｇマウスの解析では、模擬処置マウスでは髄鞘化されている軸索の割合は、明らかに低く、軸索も狭小化していた。一方、処置マウスでは髄鞘化している軸索の割合が増加し、軸索の直径も模擬処置マウスに比べ太くなる傾向が見られた。以上より、ＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡベクターの投与により、超微形態学的にも髄鞘化線維の増加による治療効果が明らかとなった。

各群ｎ＝９の処置マウス及び模擬処置マウスは、各処置群の体重及び生存率を評価するために、２５日齢を超えて死亡まで観察された。ＰＬＰ１−Ｔｇマウスへの投与によって、有意な生存率の向上（寿命延長）効果（図７）と体重増加効果（図８）が認められ、本治療法の有効性が確認された。

以上より、オリゴデンドロサイト特異的プロモータ及びこれを含むＡＡＶベクターは、ＰＭＤ治療法の開発のための基盤技術となり得、これを用いたＰＬＰ１特異的ｍｉＲＮＡによる遺伝子発現ＡＡＶベクターはＰＭＤ治療の有用な手段となり得ることが明らかとなった。

＜実施例６ ＰＬＰ１遺伝子発現量の発現抑制（ノックダウン）効率の評価３＞
ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標） ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で設計したヒトＰＬＰ１−ｍｉＲＮＡのノックダウン効率を評価するために、ヒトＰＬＰ１遺伝子のコード配列を過剰発現できるプラスミドｐｃＤＮＡ（商標）６．２-ｈＰＬＰ１とＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ制御下に発現する蛍光タンパクＶｅｎｕｓをコードするｃＤＮＡの下流の３’非翻訳領域に配列をクローニングしたプラスミドであるｐｓｃｗ．ＣＡＧ．Ｖｅｎｕｓ．Ｐｌｐ１ｍｉＲＮＡを同時にＨｅＬａ細胞にトランスフェクション法により導入した。トランスフェクションにはＴｒａｎｓＩｔ−ＬＴ１（タカラバイオ）を用いた。２４時間後に細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。定量ＰＣＲのため、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡを合成した。遺伝子発現は、以下の特異的プライマーを用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して定量ＰＣＲによって分析した（Ｒｏｃｈｅ、スイス）。ＰＬＰ１遺伝子発現の定量ＰＣＲに使用したプライマーを下記に記載する。
ヒトＰＬＰ１フォワードプライマー（配列番号２８０）：5’- GCTCCAACCTTCTGTCCATCT -3’
ヒトＰＬＰ１リバースプライマー（配列番号２８１）：5’- ACGGCAAAGTTGTAAGTGGC -3’
ヒトβ−ａｃｔｉｎフォワードプライマー（配列番号２８２）：5’- GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT -3’
ヒトβ−ａｃｔｉｎリバースプライマー（配列番号２８３）：5’- TGATCCACATCTGCTGGAAGGT -3’

ノックダウンの結果を図９に示す。ｍｉＲ−ｎｅｇを発現させた細胞のＰＬＰ１発現量を１としてノックダウン効率を計算した。結果はハウスキーピング遺伝子βアクチン（β−ａｃｔｉｎ）に標準化され、相対的発現量±ＳＤで計算された。ＰＬＰ１遺伝子発現量を低下させる７配列を同定した（配列番号２、３、４、５、７、２４及び２６）。

＜実施例７ ＰＬＰ１遺伝子発現量の発現抑制（ノックダウン）効率の評価４＞
表３に示したセンス鎖及びその対応のアンチセンス鎖からなる１対のｓｉＲＮＡをトランスフェクション溶液（ＲＮＡｉ ＭＡＸ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混ぜ、調製した溶液をＵ−２５１ＭＧ細胞に加え、４８時間培養した。

その後、細胞からＲＮＡを抽出し、ＰＬＰ１遺伝子発現を定量ＰＣＲ法により評価した（ｎ＝３）。ＲＮＡ調製、及びｃＤＮＡ合成にはＳｕｐｅｒＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。定量ＰＣＲ法にはＰＬＰ１遺伝子（Ｈｓ００１６６９１４＿ｍ１、Ａｐｐｉｌｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳ１８遺伝子（Ｈｓ９９９９９９０１＿ｓ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを用いた。遺伝子発現の結果は、ハウスキーピング遺伝子Ｓ１８によって標準化された。

結果を図１０に示す。図１０の縦軸は、トランスフェクション溶液のみを添加したＵ−２５１ＭＧ細胞に対してのノックダウン効率を示す。ＰＬＰ１遺伝子のノックダウン効率は、トランスフェクション溶液のみを添加したＵ−２５１ＭＧ細胞を１とした相対的発現量で計算された。２度の試行でともに平均値で５０％以下までＰＬＰ１遺伝子発現量を低下させる２４対のｓｉＲＮＡ配列を選択した（Ｎｏ．２、４、１０、１６、２１、２２、２６、２８、３４、３８、４０、４３、４５、４７、４８、５２、５６、５９、６０、６２、６５、７０、７２及び８０）。

＜実施例８ ＰＬＰ１遺伝子発現量の発現抑制（ノックダウン）効率の評価５＞
実施例７で得られた２４対のｓｉＲＮＡ配列を基にｍｉＲＮＡ配列を設計した（表２）。これらのうち、ヒトＰＬＰ１遺伝子のコーディング配列を標的とするｍｉＲＮＡ配列を選定した（配列番号２、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、４２及び５１）。これらのうち、配列番号２、２９、３１、３２及び３３はマウス及びコモンマーモセットなどの霊長類に共通の配列を対象としている配列である。

上記１０配列のｍｉＲＮＡを評価するために、トランスフェクション法によりヒトＰＬＰ１遺伝子のコード配列を過剰発現させたＨｅＬａ細胞に、ＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒの下流に上記配列をクローニングしたプラスミドを導入した。ＰＬＰ１遺伝子発現の定量ＰＣＲに使用したプライマーの実験詳細は実施例６と同様である。ノックダウンの結果を図１１に示す。図１１の縦軸は、ｍｉＲ−ｎｅｇを含むベクターを添加したときのＰＬＰ１発現量を１とした相対的発現量±ＳＤを示す。図１１によれば、配列番号２、２９、３０、３１、３２、３５、３６、４２及び５１を有するｍｉＲＮＡはヒトＰＬＰ１遺伝子をノックダウンした。

＜実施例９ ＰＬＰ１遺伝子発現量の発現抑制（ノックダウン）効率の評価６＞
実施例６、及び実施例８に使用された配列番号２、２９、３１、３２及び３５の塩基配列を有するｍｉＲＮＡを含むベクターを内因性にヒトＰＬＰ１遺伝子を発現しているＵ−２５１ＭＧ細胞へトランスフェクションしてＰＬＰ１遺伝発現のノックダウン効率を評価した。ＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒの下流にクローニングしたプラスミドをトランスフェクション法により細胞に導入後、ＦＡＣＳ法によりＧＦＰ発現細胞のみを選別した。その後、ＰＬＰ１遺伝子発現を定量ＰＣＲ法により解析した。配列番号２８０〜２８３に記載の塩基配列を有するプライマーをプライマーとして使用した。

結果は図１２に示す。図１２の縦軸は、ｍｉＲ−ｎｅｇを含むベクターを添加したときのＰＬＰ１発現量を１とした相対的発現量を示す。図１２によれば、配列番号２、２９、３１、３２及び３５を有するｍｉＲＮＡを含むベクターには内因性に発現しているＰＬＰ１遺伝子の発現も抑制する効果が認められた。

＜実施例１０ ＰＬＰ１遺伝子発現量の発現抑制（ノックダウン）効率の評価７＞
実施例９で得られた配列番号２を有するｍｉＲＮＡを含むｓｃＡＡＶ−ＡＡＶ１／２ベクターの溶液（力価：１．２×１０^１２ｖｇ／ｍｌ）を、生後１０日目の野生型マウスＪｃｌ：Ｂ６Ｃ３Ｆ１の片側の線条体、内包及び小脳に１μｌずつ注入した（各群ｎ＝３）。注入方法は実施例２と同じであった。その後、ＰＬＰ１ ｍｉＲＮＡノックダウン効率を評価するために、Ｖｅｎｕｓ陽性細胞におけるＰＬＰ１タンパク質の発現を免疫染色によって調べた。免疫染色の方法は、一次抗体として抗ＰＬＰ１ウサギポリクローナル抗体（Ｎｕｍａｔａ Ｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１３ Ｍａｒ １５；２８８（１１）：７４５１−６６）、及び二次抗体として抗ウサギ蛍光抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いた以外は、実施例１と同様に行った。ＫＥＹＥＮＣＥ蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ、Ｊａｐａｎ）を用いて脳梁、線条体、及び内包の核部位を撮影した。

免疫染色したＰＬＰ１の平均蛍光強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊ １．４５ｓ（Ｗａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡ）を用いて定量し、ＰＬＰ１蛍光免疫染色による蛍光強度の定量的解析は図１３に示した。図１３の縦軸は、非感染側に対する感染側のＰＬＰ１の相対的発現量を示す。図１３によれば、ｍｉＲ−ｎｅｇベクター注入していない側（非感染側）と、ベクター注入した側（感染側）とＰＬＰ１タンパク質の発現の差は殆どないのに対して、ＰＬＰ１ｍｉＲＮＡベクターの場合は、非感染側に比べ感染側のほうが４０％のＰＬＰ１タンパク質の発現抑制効果が認められた。

本発明のプロモータ及び本発明のＡＡＶベクターは、ＰＬＰ１重複によるＰＭＤの治療薬になり得る。また、ＰＬＰ１点変異によるＰＭＤの治療薬にもなり得る。さらに、ＰＬＰ１は多発性硬化症の標的抗原の１つであることから、多発性硬化症の治療薬にもなりうると考えられる。

Claims (24)

1. 配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含む、オリゴデンドロサイト特異的プロモータ。
2. 配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸を含む、請求項１に記載のプロモータ。
3. 請求項１又は２に記載のプロモータを含む、オリゴデンドロサイト特異的ベクター。
4. さらに、前記プロモータと操作可能に連結されているヒトＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項３に記載のベクター。
5. アンチセンス配列とセンス配列とからなる１対の塩基配列を有する、ＰＬＰ１遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡであって、前記１対の塩基配列は、下記表の左欄に記載のそれぞれのアンチセンス配列と、その横にある右欄に記載のそれぞれのセンス配列とからなる１対の塩基配列からなる群から選ばれる、ｍｉＲＮＡ。
   

   
6. 配列番号２〜７及び２４〜５１からなる群から選ばれる塩基配列を有する、請求項５に記載のｍｉＲＮＡ。
7. 配列番号２〜５、７、２４、２６、２９〜３２、３５、３６、４２及び５１からなる群から選ばれる塩基配列を有する、請求項５に記載のｍｉＲＮＡ。
8. 配列番号２、２９、３１及び３２からなる群から選ばれる塩基配列を有する、請求項５に記載のｍｉＲＮＡ。
9. 請求項５〜８のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡの配列を含むベクター。
10. 前記ｍｉＲＮＡの配列が、オリゴデンドロサイト特異的プロモータと操作可能に連結されている、請求項９に記載のベクター。
11. 前記オリゴデンドロサイト特異的プロモータが請求項１又は２に記載のプロモータである、請求項１０に記載のベクター。
12. 前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項３、４及び９〜１１のいずれか１項に記載のベクター。
13. 請求項３、４及び９〜１２のいずれか１項に記載のベクターを含む医薬組成物。
14. ＰＬＰ１遺伝子異常に伴う疾患を治療するための医薬組成物である、請求項１３に記載の医薬組成物。
15. 前記疾患が、ペリツェウス・メルツバッハ病、痙性対麻痺２型又は多発性硬化症である、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 前記疾患がペリツェウス・メルツバッハ病である、請求項１４に記載の医薬組成物。
17. ＰＬＰ１遺伝子の発現を抑制するＰＬＰ１遺伝子発現抑制剤である、請求項１３に記載の医薬組成物。
18. 請求項３、４及び９〜１２のいずれか１項に記載のベクターの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、ＰＬＰ１遺伝子異常に伴う疾患を治療するための方法。
19. 前記疾患が、ペリツェウス・メルツバッハ病、痙性対麻痺２型又は多発性硬化症である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記疾患がペリツェウス・メルツバッハ病である、請求項１８に記載の方法。
21. 請求項３、４及び９〜１２のいずれか１項に記載のベクターの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、ＰＬＰ１遺伝子の発現を抑制するための方法。
22. ＰＬＰ１遺伝子異常に伴う疾患の治療における使用のための、請求項３、４及び９〜１２のいずれか１項に記載のベクター。
23. 前記疾患が、ペリツェウス・メルツバッハ病、痙性対麻痺２型又は多発性硬化症である、請求項２２に記載のベクター。
24. 前記疾患がペリツェウス・メルツバッハ病である、請求項２２に記載のベクター。

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