CN114014924B - 一种通过brca1和bard1蛋白提高基因编辑过程中同源重组效率的方法 - Google Patents

一种通过brca1和bard1蛋白提高基因编辑过程中同源重组效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种通过BRCA1和BARD1蛋白提高基因编辑过程中同源重组效率的方法，包括如下步骤：(1)将BRCA1蛋白和BARD1蛋白组合，得到BRCA1/BARD1蛋白复合体；(2)将BRCA1/BARD1蛋白复合体与基因编辑表达载体共转染即可。本发明的方法能将基因编辑中同源重组的DNA修复效率大幅提高至9％左右，有效提高基因治疗的成功率。

Description

一种通过BRCA1和BARD1蛋白提高基因编辑过程中同源重组效 率的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种通过BRCA1和BARD1蛋白提高基因编辑过程中同源重组效率的方法。
背景技术
BRCA1最初被认为是早发性乳腺癌的易感基因。作为一种抑癌基因，BRCA1的缺失可导致细胞周期停滞和细胞凋亡，说明BRCA1并不直接抑制细胞增殖，而是充当细胞周期稳态的维护者和调停者。BRCA1同时在HDR等多种DNA修复途径中起关键作用，以参与HDR为主，BRCA1缺失会导致DNA损伤修复功能丧失、基因组不稳定。
BARD1(BRCA1 AssociatedRING Domain)是BRCA1蛋白的必需伴侣。BRCA1/BARD1形成的异源二聚体在DNA损伤的HDR修复和正常复制过程中起到关键的监控保护作用，对于细胞周期稳态和基因组稳定性至关重要。BARD1和BRCA1在结构上具有相同的特点：N端都有1个由42个氨基酸组成的高度保守的RING(Really Interesting New Gene)motif，富含半胱氨酸，能够螯合锌离子以介导蛋白相互作用，包含众多与辐射敏感性相关的突变；C端都有2个串联重复的BRCT(BRCA1 C-Terminus)结构域，含有磷酸结合口袋以结合DNA或磷酸化的蛋白质。BARD1/BRCA1通过RING motif所处的N端结构域相互结合，形成稳定的异源二聚体，结合区域具体为BRCA1的1-109位氨基酸和BARD1的26-119位氨基酸。研究表明，将BARD1的互作区域删除会严重降低细胞的HDR效率，提示了BARD1/BRCA1互作的必要性。BRCA1/BARD1异源二聚体在对DNA损伤的响应过程中充当了枢纽的关键角色，至少参与了3种大复合体的招募和组成，分别负责控制G2/M检查点(BRCA1-BARD1-CtIP)、复制起始(BRCA1-BARD1-BACH1)和将Rad51重组酶定位在DSB位点(BRCA1-BARD1-BRCA2)的过程。BRCA1/BARD1互作能够强化Rad51的重组酶活性，且与二聚体的结合对于Rad51的激活是必需的。在DNA复制的过程中，未完成复制而中途停滞的复制叉如果缺乏保护会有基因组紊乱的风险，而BRCA1/BARD1对于停滞复制叉的保护(Stalled Fork Protection,SFP)是必要的，BARD1的BRCT结构域直接进行磷酸识别，发生异构并与复制叉结合，进一步介导Rad51等在停滞复制叉处富集。可见BRCA1/BARD1蛋白的复合体可以修复DNA损伤。但是现有技术仍未发现一种通过BRCA1和BARD1蛋白在提高基因编辑过程中同源重组效率的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的为提供一种通过BRCA1和BARD1蛋白提高基因编辑过程中同源重组效率的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种通过BRCA1和BARD1蛋白提高基因编辑过程中同源重组效率的方法，包括如下步骤：
(1)将BRCA1蛋白和BARD1蛋白组合，得到BRCA1/BARD1蛋白复合体；
(2)将BRCA1/BARD1蛋白复合体与基因编辑表达载体共转染即可。
作为优选，编码BRCA1蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示；编码BARD1蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
作为优选，BRCA1蛋白和BARD1蛋白的质量比为1:1～14。
作为优选，BRCA1/BARD1蛋白复合体为MS2-BRCA1-T2A-BARD1质粒载体编码的蛋白；
或者为pcDNA-NLS-BRCA1质粒载体编码的蛋白和pcDNA-NLS-BARD1质粒载体编码的蛋白。
作为优选，MS2-BRCA1-T2A-BARD1质粒载体的构建方法为：
(1)以psPAX2-D64V-NC-MS2质粒为模板，MS2-for1(Xho1)/MS2-BRCA1-rev1为引物组合，PCR扩增，回收得到MS2片段；
(2)以pcDNA-NLS-BRCA1质粒为模板，MS2-BRCA1-for2/BRCA1-T2A-rev2为引物组合，PCR扩增，回收BRCA1片段；
(3)以pcDNA-NLS-BARD1质粒为模板，T2A-BARD1-for3/BARD1-rev3(Mlu1)为引物组合，PCR扩增，回收得到BARD1片段；
(4)以步骤(1)得到的MS2片段和步骤(2)得到的BRCA1片段混合为模板，MS2-for1(Xho1)/BRCA1-T2A-rev2为引物组合，PCR扩增，回收得到MS2-BRCA1片段；
(5)以步骤(3)得到的BARD1片段和步骤(4)得到的MS2-BRCA1片段混合为模板，MS2-for1(Xho1)/BARD1-rev3(Mlu1)为引物组合，PCR扩增，回收得到MS2-BRCA1-BARD1片段；
(6)利用Xho1-Mlu1酶将步骤(5)得到的片段进行双酶切后，克隆到pLenti6.2-Flag载体上，得到pLenti6.2-MS2-BRCA1-P2A-BARD1质粒载体。
作为优选，MS2-for1(Xho1)的序列如SEQ ID NO.3所示；
MS2-BRCA1-rev1的序列如SEQ ID NO.4所示；
MS2片段的序列如SEQ ID NO.5所示；
MS2-BRCA1-for2的序列如SEQ ID NO.6所示；
BRCA1-T2A-rev2的序列如SEQ ID NO.7所示；
T2A-BARD1-for3的序列如SEQ ID NO.8所示；
BARD1-rev3(Mlu1)的序列如SEQ ID NO.9所示；
pLenti6.2-Flag的序列如SEQ ID NO.10所示。
作为优选，pcDNA-NLS-BRCA1质粒载体的构建方法为：将BRCA1基因片段克隆至pcDNA3.1载体上后，N端通过引物插入核定位信号序列，得到；
pcDNA-NLS-BARD1质粒载体的构建方法为：将BARD1基因片段克隆至pcDNA载体上后，N端通过引物插入核定位信号序列，得到。
作为优选，基因编辑表达载体为pLenti-U6-sgRNA-MS2-CRISPR或Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR。
作为优选，pLenti-U6-sgRNA-MS2-CRISPR表达载体的构建方法为：将Lenti-sgRNA(MS2)-puro backbone质粒的PCR产物与pLH-sgRNA-CRISPRv2载体进行Kpn1-EcoR1双酶切后，将酶切片段进行连接、转化、克隆得到pLenti-U6-sgRNA-MS2-CRISPR；
Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR表达载体的构建方法为：将针对I-Sce1酶切位点设计的sgRNA序列，克隆入pLenti-CRISPR-v2载体上得到。
作为优选，sgRNA序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明提供了一种通过BRCA1和BARD1蛋白提高基因编辑过程中同源重组效率的方法，本发明的方法较现有技术具有如下优点：
(1)本发明的方法将CRISPR/Cas9基因编辑中同源重组的DNA修复效率大幅提高至9％，显著提高了基因治疗的成功率；
(2)本发明的方法相比于RAD51系统，可以以长链双链DNA为模板，通过同源重组来进行对多碱基与大片段DNA变异进行修复。
(3)本发明的方法相比于Prime editing系统，可能修复多碱基与大片段DNA变异，修复功能更强。
附图说明
图1为pcDNA-NLS-BRCA1质粒载体图。
图2为pcDNA-NLS-BARD1质粒载体图。
图3为pLenti6.2-Flag质粒载体图。
图4为sgRNA在pLenti-U6-sgRNA-MS2-CRISPR表达载体中的插入位点图。
图5为Lenti-sgRNA(MS2)-puro backbone载体图。
图6为sgRNA在Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR表达载体中的插入位点图。
图7为pLenti-CRISPR-v2载体图。
图8为293T细胞转染不同载体组合后GFP+细胞的数量(从左到有依次为第1种转染方式得到的GFP+细胞的数量，第2种转染方式得到的GFP+细胞的数量，第3种转染方式得到的GFP+细胞的数量，第4种转染方式得到的GFP+细胞的数量)。
图9为293T细胞转染不同量的载体组合后GFP+细胞的数量(上左图为第1种转染方式得到的GFP+细胞的数量，上中图为第2种转染方式得到的GFP+细胞的数量，上右图为第3种转染方式得到的GFP+细胞的数量，下左图为第4种转染方式得到的GFP+细胞的数量，下中图为第5种转染方式得到的GFP+细胞的数量，下右图为第6种转染方式得到的GFP+细胞的数量)。
具体实施方式
本发明提供了一种通过BRCA1和BARD1蛋白提高基因编辑过程中同源重组效率的方法，包括如下步骤：
(1)将BRCA1蛋白和BARD1蛋白组合，得到BRCA1/BARD1蛋白复合体；
(2)将BRCA1/BARD1蛋白复合体与基因编辑表达载体共转染即可。
在本发明中，编码BRCA1蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示；编码BARD1蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明中，BRCA1蛋白和BARD1蛋白的质量比为1:1～14，优选为1:4～11，进一步优选为1:7.5。
在本发明中，BRCA1/BARD1蛋白复合体为MS2-BRCA1-T2A-BARD1质粒载体编码的蛋白；
或者为pcDNA-NLS-BRCA1质粒载体编码的蛋白和pcDNA-NLS-BARD1质粒载体编码的蛋白。
在本发明中，MS2-BRCA1-T2A-BARD1质粒载体的构建方法为：
(1)以psPAX2-D64V-NC-MS2质粒为模板，MS2-for1(Xho1)/MS2-BRCA1-rev1为引物组合，PCR扩增，回收得到MS2片段；
(2)以pcDNA-NLS-BRCA1质粒为模板，MS2-BRCA1-for2/BRCA1-T2A-rev2为引物组合，PCR扩增，回收BRCA1片段；
(3)以pcDNA-NLS-BARD1质粒为模板，T2A-BARD1-for3/BARD1-rev3(Mlu1)为引物组合，PCR扩增，回收得到BARD1片段；
(4)以步骤(1)得到的MS2片段和步骤(2)得到的BRCA1片段混合为模板，MS2-for1(Xho1)/BRCA1-T2A-rev2为引物组合，PCR扩增，回收得到MS2-BRCA1片段；
(5)以步骤(3)得到的BARD1片段和步骤(4)得到的MS2-BRCA1片段混合为模板，MS2-for1(Xho1)/BARD1-rev3(Mlu1)为引物组合，PCR扩增，回收得到MS2-BRCA1-BARD1片段；
(6)利用Xho1-Mlu1酶将步骤(5)得到的片段进行双酶切后，克隆到pLenti6.2-Flag载体上，得到pLenti6.2-MS2-BRCA1-P2A-BARD1质粒载体。
在本发明中pcDNA-NLS-BRCA1如图1所示；pcDNA-NLS-BARD1如图2所示。
在本发明中，MS2-for1(Xho1)的序列如SEQ ID NO.3所示；
MS2-BRCA1-rev1的序列如SEQ ID NO.4所示；
MS2片段的序列如SEQ ID NO.5所示；
MS2-BRCA1-for2的序列如SEQ ID NO.6所示；
BRCA1-T2A-rev2的序列如SEQ ID NO.7所示；
T2A-BARD1-for3的序列如SEQ ID NO.8所示；
BARD1-rev3(Mlu1)的序列如SEQ ID NO.9所示；
pLenti6.2-Flag的序列如SEQ ID NO.10所示；
在本发明中，所述T2A的序列如SEQ ID NO.14所示。
在本发明中pLenti6.2-Flag如图3所示。
在本发明中所述psPAX2-D64V-NC-MS2质粒购自于Addgene编号为#122944；
pLenti6.2-Flag为自己构建，所得序列如SEQ ID NO.10所示。
在本发明中，pcDNA-NLS-BRCA1质粒载体的构建方法为：将BRCA1基因片段克隆至pcDNA3.1载体上后，N端通过引物插入核定位信号序列，得到；
pcDNA-NLS-BARD1质粒载体的构建方法为：将BARD1基因片段克隆至pcDNA载体上后，N端通过引物插入核定位信号序列，得到。
在本发明中，所述NLS的序列如SEQ ID NO.13所示。
在本发明中，基因编辑表达载体为pLenti-U6-sgRNA-MS2-CRISPR或Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR。
在本发明中pLenti-U6-sgRNA-MS2-CRISPR表达载体中sgRNA的插入位点如图4所示。
在本发明中，pLenti-U6-sgRNA-MS2-CRISPR表达载体的构建方法为：将Lenti-sgRNA(MS2)-puro backbone质粒的PCR产物与pLH-sgRNA-CRISPRv2载体进行Kpn1-EcoR1双酶切后，将酶切片段进行连接、转化、克隆得到pLenti-U6-sgRNA-MS2-CRISPR；
Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR表达载体的构建方法为：将针对I-Sce1酶切位点设计的sgRNA序列，克隆入pLenti-CRISPR-v2载体上得到。
在本发明中Lenti-sgRNA(MS2)-puro backbone质粒如图5所示。
在本发明中Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR表达载体插入sgRNA序列的位点如图6所示。
在本发明中，sgRNA序列如SEQ ID NO.11所示。
在本发明实施例中以利用SEQ ID NO.12所示的pDR-GFP载体做I-Sce1-HR/NHEJ系统同源重组效率评估的荧光报告质粒来检测BRCA1和BARD1蛋白复合体在同源重组修复中的效率。
在本发明中Lenti-sgRNA(MS2)-purobackbone质粒为自建，构建的质粒如图5所示。
pLH-sgRNA-CRISPRv2载体购自于Addgene编号为#52961的载体。
在本发明实施例中设计的I-Sce1-HR/NHEJ系统只有在Cas9酶介导的DNA同源重组修复后才会发出正常的GFP荧光。如果NHEJ介导的DNA连接修复，GFP荧光会比较弱或者没有荧光。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明实施例中所述的pcDNA3.1载体购自于武汉淼灵生物。
实施例1
将pDR-GFP载体的GFP编码框中插入一个I-Sce1的酶切位点，针对I-Sce1的酶切位点设计sgRNA，设计得到的sgRNA如SEQ ID NO.11所示。将sgRNA序列克隆入如图7所示pLenti-CRISPR-v2载体中得到Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR表达载体。
sgRNA序列在Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR表达载体中的插入位置如图6所示。
将SEQ ID NO.1所示的编码BRCA1蛋白的基因序列克隆至pcDNA3.1载体上后，N端通过引物插入核定位信号序列，得到pcDNA-NLS-BRCA1载体。
将SEQ ID NO.2所示的编码BARD1蛋白的基因序列克隆至pcDNA载体上后，N端通过引物插入核定位信号序列，得到pcDNA-NLS-BARD1载体。
将293T细胞培养于24孔平板，分别转染pDR-GFP载体、Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR表达载体、pcDNA-NLS-BRCA1载体和pcDNA-NLS-BARD1载体，MS2-BRCA1-T2A-BARD1载体，按下表1进行转染，每种载体转染500ng。转染36h后在荧光显微镜下观察GFP+细胞的相对数量。结果见图8。
表1转染方式
载体 1 2 3 4
pDR-GFP √ √ √ √
Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR √ √ √
pcDNA-NLS-BRCA1 √
pcDNA-NLS-BARD1 √
MS2-BRCA1-T2A-BARD1 √
实施例2
将pcDNA-NLS-BRCA1质粒载体、pcDNA-NLS-BARD1质粒载体、pLenti-MS2-BRCA1-T2A-BARD1质粒载体、pDR-GFP载体与基因表达载体pLenti-U6-sgRNA-MS2-CRISPR按下表2的方式在293T细胞中共转染，每种载体转染500ng。36h后通过FACS检测GFP+细胞，结果如图9。
表2转染方式
载体 1 2 3 4 5 6
pDR-GFP √ √ √ √ √ √
Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR √ √ √ √ √
pcDNA-NLS-BRCA1 √ √
pcDNA-NLS-BARD1 √ √
MS2-BRCA1-T2A-BARD1 √
由图8～9可以看出，本发明的载体组合可以显著提高基因编辑过程中基因同源重组修复效率，能将其修复效率提高至9％左右。
由以上实施例可以看出，本发明提供了一种通过BRCA1和BARD1蛋白提高基因编辑过程中同源重组效率的方法，本发明的方法较现有技术具有如下优点：
(1)本发明的方法将CRISPR/Cas9基因编辑中同源重组的DNA修复效率大幅提高至9％，显著提高了基因治疗的成功率；
(2)本发明的方法相比于RAD51系统，可以以长链双链DNA为模板，通过同源重组来进行对多碱基与大片段DNA变异进行修复；
(3)本发明的方法相比于Prime editing系统，可能修复多碱基与大片段DNA变异，修复功能更强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 安可来（重庆）生物医药科技有限公司
<120> 一种通过BRCA1和BARD1蛋白提高基因编辑过程中同源重组效率的方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5589
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atggatttat ctgctcttcg cgttgaagaa gtacaaaatg tcattaatgc tatgcagaaa 60
atcttagagt gtcccatctg tctggagttg atcaaggaac ctgtctccac aaagtgtgac 120
cacatatttt gcaaattttg catgctgaaa cttctcaacc agaagaaagg gccttcacag 180
tgtcctttat gtaagaatga tataaccaaa aggagcctac aagaaagtac gagatttagt 240
caacttgttg aagagctatt gaaaatcatt tgtgcttttc agcttgacac aggtttggag 300
tatgcaaaca gctataattt tgcaaaaaag gaaaataact ctcctgaaca tctaaaagat 360
gaagtttcta tcatccaaag tatgggctac agaaaccgtg ccaaaagact tctacagagt 420
gaacccgaaa atccttcctt gcaggaaacc agtctcagtg tccaactctc taaccttgga 480
actgtgagaa ctctgaggac aaagcagcgg atacaacctc aaaagacgtc tgtctacatt 540
gaattgggat ctgattcttc tgaagatacc gttaataagg caacttattg cagtgtggga 600
gatcaagaat tgttacaaat cacccctcaa ggaaccaggg atgaaatcag tttggattct 660
gcaaaaaagg ctgcttgtga attttctgag acggatgtaa caaatactga acatcatcaa 720
cccagtaata atgatttgaa caccactgag aagcgtgcag ctgagaggca tccagaaaag 780
tatcagggta gttctgtttc aaacttgcat gtggagccat gtggcacaaa tactcatgcc 840
agctcattac agcatgagaa cagcagttta ttactcacta aagacagaat gaatgtagaa 900
aaggctgaat tctgtaataa aagcaaacag cctggcttag caaggagcca acataacaga 960
tgggctggaa gtaaggaaac atgtaatgat aggcggactc ccagcacaga aaaaaaggta 1020
gatctgaatg ctgatcccct gtgtgagaga aaagaatgga ataagcagaa actgccatgc 1080
tcagagaatc ctagagatac tgaagatgtt ccttggataa cactaaatag cagcattcag 1140
aaagttaatg agtggttttc cagaagtgat gaactgttag gttctgatga ctcacatgat 1200
ggggagtctg aatcaaatgc caaagtagct gatgtattgg acgttctaaa tgaggtagat 1260
gaatattctg gttcttcaga gaaaatagac ttactggcca gtgatcctca tgaggcttta 1320
atatgtaaaa gtgaaagagt tcactccaaa tcagtagaga gtaatattga agacaaaata 1380
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ctaattatag gagcatttgt tactgagcca cagataatac aagagcgtcc cctcacaaat 1500
aaattaaagc gtaaaaggag acctacatca ggccttcatc ctgaggattt tatcaagaaa 1560
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tctaataatg ctgaagaccc caaagatctc atgttaagtg gagaaagggt tttgcaaact 2280
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aacgaaactg gactcattac tccaaataaa catggacttt tacaaaaccc atatcgtata 2940
ccaccacttt ttcccatcaa gtcatttgtt aaaactaaat gtaagaaaaa tctgctagag 3000
gaaaactttg aggaacattc aatgtcacct gaaagagaaa tgggaaatga gaacattcca 3060
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tcaagcaata ttaatgaagt aggttccagt actaatgaag tgggctccag tattaatgaa 3180
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caacataacc tgataaagct ccagcaggaa atggctgaac tagaagctgt gttagaacag 4260
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tgcccatcat tagatgatag gtggtacatg cacagttgct ctgggagtct tcagaataga 4560
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<210> 2
<211> 2334
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgccggata atcggcagcc gaggaaccgg cagccgagga tccgctccgg gaacgagcct 60
cgttccgcgc ccgccatgga accggatggt cgcggtgcct gggcccacag tcgcgccgcg 120
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ctagcaagtg gctccttgac agaatctgaa tgttttggaa gtttaactga agtctcttta 840
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ctgagcacca gtggagattt tgttaagcaa acggtgccct cagaaaatat accattgcct 1080
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caacagaaaa tgctcagtga gcttgcagta attcttaagg ctaaaaaata tactgagttt 1800
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
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<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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atggcgtcca atttcacgca gttcgtcctg gttgacaacg gggggactgg ggacgttacg 60
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<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gcagccaact ccggtatata atggatttat ctgctcttcg cgttg 45
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 9
gtacgcgttc agctgtcaag aggaagcaac 30
<210> 10
<211> 4399
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
cccggcggca ttaaccctca ctaaagggaa caaaagctgg agctgcaagc ttaatgtagt 60
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tgggcacttg gcgctacaca agtggcctct ggcctcgcac acattccaca tccaccggta 2820
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cacgtctcac tagtctcgtg cagatggaca gcaccgctga gcaatggaag cggtaggcct 3000
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ttatgtgtgg gagggctaag cacaattcga gctcggtacc tttaagacca atgacttaca 3720
aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc 3780
actcccaacg aagacaagat ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg ttagaccaga 3840
tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct 3900
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ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tagtagttca tgtcatctta 4020
ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg aacttgttta 4080
ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 4140
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cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
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tagcgggcgc gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt 1500
cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc catctccagc ctcggggctg ccgcaggggg 1560
acggctgcct tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg 1620
gctctagagc ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca 1680
acgtgctggt tattgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga attcagatcc gccgccacta 1740
tgggatcaag atcgccaaaa aagaagagaa aggtgccgaa gaagcatgca gcaccaccaa 1800
aaaaaaaacg aaaagtagaa gacccacgag gcaacaccag cggcgtgctg agcaccccca 1860
aggccaagag ggccaagcac ccccccggca ccgagaagcc caggagcagg agccagagcg 1920
agcagcccgc cacctgcccc atctgctacg ccgtgatcag gcagagcagg aacctgagga 1980
ggcacctgga gctgaggcac ttcgccaagc ccggcgtgga tccaccggtc gccaccatgg 2040
tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg 2100
acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gctagggata acagggtaat acctacggca 2160
agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg 2220
tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc 2280
acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca 2340
aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga 2400
accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc 2460
tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca 2520
tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc 2580
actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc 2640
tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc 2700
tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaaagcg 2760
gccgcgactc tagatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa 2820
aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa 2880
cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa 2940
taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 3000
aggcgtaaat tgtaagcgtt aatctgaagc ttctgatgga attagaactt ggcaaaacaa 3060
tactgagaat gaagtgtatg tggaacagag gctgctgatc tcgttcttca ggctatgaaa 3120
ctgacacatt tggaaaccac agtacttaga accacaaagt gggaatcaag agaaaaacaa 3180
tgatcccacg agagatctat agatctatag atcatgagtg ggaggaatga gctggccctt 3240
aatttggttt tgcttgttta aattatgata tccaactatg aaacattatc ataaagcaat 3300
agtaaagagc cttcagtaaa gagcaggcat ttatctaatc ccaccccacc cccacccccg 3360
tagctccaat ccttccattc aaaatgtagg tactctgttc tcacccttct taacaaagta 3420
tgacaggaaa aacttccatt ttagtggaca tctttattgt ttaatagatc atcaatttcg 3480
atccgctcct gggcaccgaa ctgcgccgcg tgttcagcag ggtcggcgtg ttcggtgtgt 3540
cccccgcggt gggcctcggg ggcgggtgcg gggtcggcgg ggccgccccg ggtggcttcg 3600
gtcggagcca tggggtcgtg cgctcctttc ggtcgggcgc tgcgggtcgt ggggcgggcg 3660
tcaggcaccg ggcttgcggg tcatgcacca ggtgcgcggt ccttcgggca cctcgacgtc 3720
ggcggtgacg gtgaagccga gccgctcgta gaaggggagg ttgcggggcg cggaggtctc 3780
caggaaggcg ggcaccccgg cgcgctcggc cgcctccact ccggggagca cgacggcgct 3840
gcccagaccc ttgccctggt ggtcgggcga gacgccgacg gtggccagga accacgcggg 3900
ctccttgggc cggtgcggcg ccaggaggcc ttccatctgt tgctgcgcgg ccagccggga 3960
accgctcaac tcggccatgc gcgggccgat ctcggcgaac accgcccccg cttcgacgct 4020
ctccggcgtg gtccagaccg ccaccgcggc gccgtcgtcc gcgacccaca ccttgccgat 4080
gtcgagcccg acgcgcgtga ggaagagttc ttgcagctcg gtgacccgct cgatgtggcg 4140
gtccgggtcg acggtgtggc gcgtggcggg gtagtcggcg aacgcggcgg cgagggtgcg 4200
tacggcccgg gggacgtcgt cgcgggtggc gaggcgcacc gtgggcttgt actcggtcat 4260
ggtggcggct ggatcggtcg aaaggcccgg agatgaggaa gaggagaaca gcgcggcaga 4320
cgtgcgcttt tgaagcgtgc agaatgccgg gcctccggag gaccttcggg cgcccgcccc 4380
gcccctgagc ccgcccctga gcccgccccc ggacccaccc cttcccagcc tctgagccca 4440
gaaagcgaag gagcaaagct gctattggcc gctgccccaa aggcctaccc gcttccattg 4500
ctcagcggtg ctgtccatct gcacgagact agtgagacgt gctacttcca tttgtcacgt 4560
cctgcacgac gcgagctgcg gggcgggggg gaacttcctg actaggggag gagtagaagg 4620
tggcgcgaag gggccaccaa agaacggagc cggttggcgc ctaccggtgg atgtggaatg 4680
tgtgaggcca gaggccactt gtgtagcgcc aagtgcccag cggggctgct aaagcgcatg 4740
ctccagactg ccttgggaaa agcgcctccc ctacccggta gaattcactc ctcaggtgca 4800
ggctgcctat cagaaggtgg tggctggtgt ggccaatgcc ctggctcaca aataccactg 4860
agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac 4920
ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct 4980
ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt 5040
ttagagtttg gcaacatatg ccatatgctg gctgccatga acaaaggtgg ctataaagag 5100
gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga 5160
cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa 5220
aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca 5280
tagctgtccc tcttctctta tgaagatccc tcgacctgca gcccaagctt tagggatcaa 5340
gatcgccaaa aaagaagaga aaggtgccga agaagcatgc agcaccacca aaaaaaaaac 5400
gaaaagtaga agacccacga ggcaacacca gcggcgtgct gagcaccccc aaggccaaga 5460
gggccaagca cccccccggc accgagaagc ccaggagcag gagccagagc gagcagcccg 5520
ccacctgccc catctgctac gccgtgatca ggcagagcag gaacctgagg aggcacctgg 5580
agctgaggca cttcgccaag cccggcgtgg atccaccggt cgccaccatg gtgagcaagg 5640
gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg 5700
gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc 5760
tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc 5820
tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct 5880
tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg 5940
gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg 6000
agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca 6060
actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga 6120
acttcaataa aagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 6180
cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 6240
aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 6300
acctgtcgtg ccagcggatc cgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac 6360
tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact 6420
aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta 6480
gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctaacttgtt tattgcagct 6540
tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca 6600
ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggatccgc 6660
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 6720
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 6780
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 6840
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 6900
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 6960
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 7020
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 7080
cgctttctca aagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 7140
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 7200
gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 7260
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 7320
acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 7380
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 7440
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 7500
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 7560
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 7620
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 7680
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 7740
taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 7800
cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 7860
gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 7920
gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 7980
tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 8040
gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 8100
ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 8160
ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 8220
cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 8280
ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 8340
gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 8400
ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 8460
ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 8520
tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 8580
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 8640
cacctg 8646
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ccaaagaaga agcggaaggt c 21
<210> 14
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54

Claims (2)

1.一种通过BRCA1和BARD1蛋白提高基因编辑过程中同源重组效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将BRCA1蛋白和BARD1蛋白组合，得到BRCA1/BARD1蛋白复合体；
(2)将包含编码BRCA1/BARD1蛋白复合体基因的载体与基因编辑表达载体共转染即可；
编码BRCA1蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示；编码BARD1蛋白的基因序列如SEQ IDNO.2所示；
BRCA1蛋白和BARD1蛋白的质量比为1:1～14；
BRCA1/BARD1蛋白复合体为MS2-BRCA1-T2A-BARD1质粒载体编码的蛋白；
MS2-BRCA1-T2A-BARD1质粒载体的构建方法为：
(1)以psPAX2-D64V-NC-MS2质粒为模板，MS2-for1(Xho1)/MS2-BRCA1-rev1为引物组合，PCR扩增，回收得到MS2片段；
(2)以pcDNA-NLS-BRCA1质粒为模板，MS2-BRCA1-for2/BRCA1-T2A-rev2为引物组合，PCR扩增，回收BRCA1片段；
(3)以pcDNA-NLS-BARD1质粒为模板，T2A-BARD1-for3/BARD1-rev3(Mlu1)为引物组合，PCR扩增，回收得到BARD1片段；
(4)以步骤(1)得到的MS2片段和步骤(2)得到的BRCA1片段混合为模板，MS2-for1(Xho1)/BRCA1-T2A-rev2为引物组合，PCR扩增，回收得到MS2-BRCA1片段；
(5)以步骤(3)得到的BARD1片段和步骤(4)得到的MS2-BRCA1片段混合为模板，MS2-for1(Xho1)/BARD1-rev3(Mlu1)为引物组合，PCR扩增，回收得到MS2-BRCA1-BARD1片段；
(6)利用Xho1-Mlu1酶将步骤(5)得到的片段进行双酶切后，克隆到pLenti6.2-Flag载体上，得到pLenti6.2-MS2-BRCA1-T2A-BARD1质粒载体；
MS2-for1(Xho1)的序列如SEQ ID NO.3所示；
MS2-BRCA1-rev1的序列如SEQ ID NO.4所示；
MS2片段的序列如SEQ ID NO.5所示；
MS2-BRCA1-for2的序列如SEQ ID NO.6所示；
BRCA1-T2A-rev2的序列如SEQ ID NO.7所示；
T2A-BARD1-for3的序列如SEQ ID NO.8所示；
BARD1-rev3(Mlu1)的序列如SEQ ID NO.9所示；
pLenti6.2-Flag的序列如SEQ ID NO.10所示；
基因编辑表达载体为pLenti-U6-sgRNA-MS2-CRISPR或Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR；
pLenti-U6-sgRNA-MS2-CRISPR表达载体的构建方法为：将Lenti-sgRNA(MS2)-purobackbone质粒的PCR产物与pLH-sgRNA-CRISPRv2载体进行Kpn1-EcoR1双酶切后，将酶切片段进行连接、转化、克隆得到pLenti-U6-sgRNA-MS2-CRISPR；
Lenti-SceGFPgRNA1-CRISPR表达载体的构建方法为：将针对I-Sce1酶切位点设计的sgRNA序列，克隆入pLenti-CRISPR-v2载体上得到。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，sgRNA序列如SEQ ID NO.11所示。
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