CN113969287B - 重组单纯疱疹病毒的亲和筛选细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组单纯疱疹病毒的亲和筛选细胞系及其构建方法，包括：构建表达HER2的跨膜区及胞外区HER2CT9基因的慢病毒Ls18；使用慢病毒表达载体pLs18包装所述慢病毒Ls18后感染小鼠黑色素瘤细胞系B16，获得所述亲和筛选细胞系B16‑HER2CT9；所述慢病毒表达载体pLs18如序列表中SEQ ID NO.10所示，所述HER2CT9基因如序列表中SEQ ID NO.7所示。基于如上所述的亲和筛选细胞系B16‑HER2CT9的应用，本发明还提供了一种单纯疱疹病毒的重组改造方法，通过亲和筛选细胞系B16‑HER2CT9选择性地从同源重组后的病毒细胞中筛选出重组单纯疱疹病毒，其工艺更加高效且获得纯度更高的重组单纯疱疹病毒。

Description

重组单纯疱疹病毒的亲和筛选细胞系及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种重组单纯疱疹病毒的亲和筛选细胞系及其构建方法和应用。
背景技术
1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1，HSV1)是一种嗜神经性病毒，在人群中感染非常普遍，临床表现为黏膜或皮肤局部集聚疱疹等轻微症状，偶尔伴有发热。HSV-1为双链DNA病毒，基因组152kb，由独特长片段(UL)和短片段(US)组成，两端为末端反向重复序列TRL和TRS，两片段连接处为内部反向重复序列(IR区)。HSV-1编码约90种蛋白，功能大多已明确，其中约一半为病毒复制所必需，另一些为复制非必需，这些非必需基因删除并代之以外源基因不影响病毒复制，故HSV-1可改造为病毒载体。
目前，HSV1的基因组改造方法主要有：1)同源重组法；2)大肠杆菌人工染色体(BAC)法；3)CRISPR/Cas9法，这三种方法在实际操作过程中都需要通过多轮噬斑挑选过程以纯化重组病毒，噬斑挑选纯化的过程较为繁琐且得到病毒的纯度也有待考证。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种重组单纯疱疹病毒的亲和筛选细胞系及其构建方法和应用，以解决现有的HSV1基因组改造过程中需要进行多轮噬斑挑选纯化而导致工艺复杂其纯不高的问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种重组单纯疱疹病毒的亲和筛选细胞系，所述亲和筛选细胞系命名为B16-HER2CT9，是采用慢病毒表达载体pLs18包装能够表达HER2CT9基因的慢病毒Ls18后感染小鼠黑色素瘤细胞系B16获得；
其中，所述慢病毒表达载体pLs18如序列表中SEQ ID NO.10所示，所述HER2CT9基因如序列表中SEQ ID NO.7所示。
本发明还提供了一种如上所述的亲和筛选细胞系的构建方法，其包括：
合成HER2的跨膜区及胞外区的HER2CT9基因，并在所述HER2CT9基因前连接核定位绿色荧光表达框H2B-EGFP，构建形成所述慢病毒Ls18；
构建所述慢病毒表达载体pLs18，使用所述慢病毒表达载体pLs18包装所述慢病毒Ls18后感染小鼠黑色素瘤细胞系B16，获得所述亲和筛选细胞系B16-HER2CT9；
其中，所述核定位绿色荧光表达框H2B-EGFP如序列表中SEQ ID NO.9所示。
优选地，通过编码连接肽T2A将所述核定位绿色荧光表达框H2B-EGFP连接到所述HER2CT9基因；其中，所述编码连接肽T2A如序列表中SEQ ID NO.8所示。
本发明的另一方面是提供一wei种单纯疱疹病毒的重组改造方法，包括：
构建用于重组改造单纯疱疹病毒的靶向载体；
将所述靶向载体与野生型单纯疱疹病毒进行同源重组，获得混合有重组单纯疱疹病毒和野生型单纯疱疹病毒的细胞液；
使用如权利要求1所述的亲和筛选细胞系B16-HER2CT9从所述细胞液中筛选出重组单纯疱疹病毒，获得纯化的重组单纯疱疹病毒。
具体地，所述野生型单纯疱疹病毒为HSV1-EGFP，具体是在野生型单纯疱疹病毒HSV1中插入了绿色荧光表达框EGFP；所述重组单纯疱疹病毒为Hs34，具体是通过在敲除HSV1-EGFP病毒基因组中的gD基因之后，在被敲除的所述gD基因的位置上插入靶向HER2的单链抗体scHER2得到；
其中，所述单链抗体scHER2如序列表中SEQ ID NO.1所示。
具体地，所述构建用于重组改造单纯疱疹病毒的靶向载体包括：
合成HER2的单链抗体scHER2，所述单链抗体scHER2如序列表中SEQ ID NO.1所示；
将所述单链抗体scHER2替换gD基因的第6至38位氨基酸，构建形成融合基因scHER2::gD；其中，所述gD基因的第6至38位氨基酸如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述融合基因scHER2::gD如序列表中SEQ ID NO.3所示；
将所述融合基因scHER2::gD、所述gD基因的上游同源臂UHA和下游同源臂DHA共同连接入pcDNA3.1+载体，构建获得所述靶向载体pHSV1-ΔgD-scHER2::gD；其中，所述上游同源臂UHA如序列表中SEQ ID NO.4所示，所述下游同源臂构DHA如序列表中SEQ ID NO.5所示，所述靶向载体pHSV1-ΔgD-scHER2::gD如序列表中SEQ ID NO.6所示。
具体地，所述将所述靶向载体与野生型单纯疱疹病毒进行同源重组包括：将所述靶向载体转染BHK细胞，4h～8h后加入所述野生型单纯疱疹病毒进行同源重组。
具体地，所述使用如权利要求1所述的亲和筛选细胞系B16-HER2CT9从所述细胞液中筛选出重组单纯疱疹病毒包括：
S1、收集同源重组细胞液中的细胞，对所述细胞冻融裂解并离心去除细胞碎片，形成第一细胞裂解液；
S2、使用所述第一细胞裂解液感染所述亲和筛选细胞系B16-HER2CT9，
S3、在预定时间后收集所述亲和筛选细胞系中的细胞，对所述细胞冻融裂解并离心去除细胞碎片形成第二细胞裂解液，使用所述第二细胞裂解液感染另一份所述亲和筛选细胞系B16-HER2CT9；
S4、重复以上所述步骤S3多次，最终获得纯化的重组单纯疱疹病毒。
具体地，重复所述步骤S3多次后，将细胞裂解液分别感染BHK细胞和B16-HER2CT9细胞，当细胞裂解液在BHK细胞无感染而B16-HER2CT9大量感染时，判定野生型单纯疱疹病毒被完全去除而获得纯化的重组单纯疱疹病毒。
具体地，所述对所述细胞冻融裂解并离心去除细胞碎片包括：将所述细胞于-80℃～-100℃的温度下冻融裂解后，在转速为4000rpm～6000rpm的条件下离心5min～10min去除细胞碎片。
本发明实施例提供的重组单纯疱疹病毒的亲和筛选细胞系及其构建方法和应用，通过构建亲和筛选细胞系B16-HER2CT9，选择性地从同源重组后的病毒细胞中筛选出重组单纯疱疹病毒，相比于现有技术中的噬斑挑选纯化方法，其工艺更加简单且可以提高重组单纯疱疹病毒的纯度。
附图说明
图1是本发明实施例中HSV1病毒感染细胞系B16的结果图示；
图2是本发明实施例中野生型单纯疱疹病毒HSV1-EGFP的基因结构图示；
图3是本发明实施例中重组单纯疱疹病毒为Hs34的基因结构图示；
图4是本发明实施例中单纯疱疹病毒的重组改造方法的工艺过程图示；
图5是本发明实施例中细胞裂解液中病毒感染BHK细胞和B16-HER2CT9细胞的结果图示。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
本发明实施例首先提供了一种重组单纯疱疹病毒的亲和筛选细胞系，所述亲和筛选细胞系命名为B16-HER2CT9，所述亲和筛选细胞系是采用慢病毒表达载体pLs18能够表达HER2CT9基因的包装慢病毒Ls18后感染小鼠黑色素瘤细胞系B16获得。
其中，所述慢病毒表达载体pLs18如序列表中SEQ ID NO.10所示，所述HER2CT9基因如序列表中SEQ ID NO.7所示。
小鼠黑色素瘤细胞系B16缺失绝大部分单纯疱疹病毒HSV1的受体，HSV1病毒感染B16的效率极低，参阅图1，在较高滴度(MOI＝10)时也仅能感染少量细胞且无法扩增。基于小鼠黑色素瘤细胞系B16特性，本申请的方案在此基础上，采用慢病毒表达载体pLs18包装能够表达HER2CT9基因的慢病毒Ls18后感染小鼠黑色素瘤细胞系B16，构建亲和筛选细胞系B16-HER2CT9，所述亲和筛选细胞系B16-HER2CT9能够被重组后的重组单纯疱疹病毒感染而野生型单纯疱疹病毒则无法感染，由此可以选择性地从同源重组后的病毒细胞中筛选出重组单纯疱疹病毒，避免现有技术中繁琐的噬斑挑选纯化过程。
本发明实施例进一步提供了一种如上所述的亲和筛选细胞系的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)、合成HER2的跨膜区及胞外区的HER2CT9基因，并在所述HER2CT9基因前连接核定位绿色荧光表达框H2B-EGFP，构建形成所述慢病毒Ls18。
具体地，如前所述，所述HER2CT9基因如序列表中SEQ ID NO.7所示。
具体地，通过编码连接肽T2A将所述核定位绿色荧光表达框H2B-EGFP连接到所述HER2CT9基因；其中，所述编码连接肽T2A如序列表中SEQ ID NO.8所示，所述核定位绿色荧光表达框H2B-EGFP如序列表中SEQ ID NO.9所示。
(2)、构建所述慢病毒表达载体pLs18，使用所述慢病毒表达载体pLs18包装所述慢病毒Ls18后感染小鼠黑色素瘤细胞系B16，获得所述亲和筛选细胞系B16-HER2CT9。
具体地，如前所述，所述慢病毒表达载体pLs18如序列表中SEQ ID NO.10所示。
基于本发明实施例如上所述的亲和筛选细胞系B16-HER2CT9的应用，本发明实施例还提供了一种单纯疱疹病毒的重组改造方法，该方法包括以下步骤：
(1)、构建用于重组改造单纯疱疹病毒的靶向载体。
(2)、将所述靶向载体与野生型单纯疱疹病毒进行同源重组，获得混合有重组单纯疱疹病毒和野生型单纯疱疹病毒的细胞液；
(3)、使用如权利要求1所述的亲和筛选细胞系B16-HER2CT9从所述细胞液中筛选出重组单纯疱疹病毒，获得纯化的重组单纯疱疹病毒。
在本发明实施例中，所述野生型单纯疱疹病毒为HSV1-EGFP，如图2所示的基因结构图，具体是在野生型单纯疱疹病毒HSV1中插入了绿色荧光表达框EGFP。更具体的，EGFP表达框插入到HSV1的UL37与UL38基因之间，其不影响病毒的正常功能。
在本发明实施例中，所述重组单纯疱疹病毒为Hs34，如图3所示的基因结构图，具体是通过在敲除HSV1-EGFP病毒基因组中的gD基因之后，在被敲除的所述gD基因的位置上插入靶向HER2的单链抗体scHER2得到。
其中，所述单链抗体scHER2如序列表中SEQ ID NO.1所示。
在具体地方案中，所述构建用于重组改造单纯疱疹病毒的靶向载体包括以下步骤：
(1)、合成HER2的单链抗体scHER2，如前所述，所述单链抗体scHER2如序列表中SEQID NO.1所示。
(2)、将所述单链抗体scHER2替换gD基因的第6至38为位氨基酸，构建形成融合基因scHER2::gD。
其中，所述gD基因的第6至38为位氨基酸如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述融合基因scHER2::gD如序列表中SEQ ID NO.3所示。
(3)、将所述融合基因scHER2::gD、所述gD基因的上游同源臂UHA和下游同源臂DHA共同连接入pcDNA3.1+载体，构建获得所述靶向载体pHSV1-ΔgD-scHER2::gD。
其中，所述上游同源臂UHA如序列表中SEQ ID NO.4所示，所述下游同源臂DHA如序列表中SEQ ID NO.5所示，所述靶向载体pHSV1-ΔgD-scHER2::gD如序列表中SEQ ID NO.6所示。
在具体地方案中，所述将所述靶向载体与野生型单纯疱疹病毒进行同源重组包括：将所述靶向载体转染BHK细胞，4h～8h(优选为6h)后加入所述野生型单纯疱疹病毒进行同源重组。即，如图4中所示，所述靶向载体与野生型单纯疱疹病毒是在BHK细胞上进行同源重组。
在具体地方案中，所述使用所述亲和筛选细胞系B16-HER2CT9从所述细胞液中筛选出重组单纯疱疹病毒包括：
S1、收集同源重组细胞液中的细胞，对所述细胞冻融裂解并离心去除细胞碎片，形成第一细胞裂解液。
其中，将所述细胞于-80℃～-100℃的温度下冻融裂解后，在转速为4000rpm～6000rpm的条件下离心5min～10min去除细胞碎片。
具体地，本实施例中，同源重组48小时后收集细胞及上清，于-80℃冻融裂解2次后，在转速为5000rpm的条件下离心5min去除细胞碎片，形成所述第一细胞裂解液。
S2、使用所述第一细胞裂解液感染所述亲和筛选细胞系B16-HER2CT9。
具体地，取800ul所述第一细胞裂解液的上清感染B16-HER2CT9细胞(传代筛选轮次：P0)。重组单纯疱疹病毒为Hs34因具有识别HER2受体的能力而在B16-HER2CT9细胞上扩增，而野生型单纯疱疹病毒因感染效率极低而无法扩增。
S3、在预定时间后收集所述亲和筛选细胞系中的细胞，对所述细胞冻融裂解并离心去除细胞碎片形成第二细胞裂解液，使用所述第二细胞裂解液感染另一份所述亲和筛选细胞系B16-HER2CT9的细胞(传代筛选轮次：P1)。
具体地，48小时后收集B16-HER2CT9细胞及上清，于-80℃冻融裂解2次后，在转速为5000rpm的条件下离心5min去除细胞碎片，形成第二细胞裂解液，使用所述第二细胞裂解液的上清感染另一份所述亲和筛选细胞系B16-HER2CT9。
S4、重复以上所述步骤S3多次(即，使用亲和筛选细胞系B16-HER2CT9对重组病毒进行多轮传代筛选)，最终获得纯化的重组单纯疱疹病毒。
参阅图4，经过以上步骤，重组单纯疱疹病毒Hs34在B16-HER2CT9细胞上经过多轮传代筛选，最终获得纯化的重组单纯疱疹病毒Hs34。
具体地，重复所述步骤S3多次后，将细胞裂解液分别感染BHK细胞和B16-HER2CT9细胞，当细胞裂解液在BHK细胞无感染而B16-HER2CT9大量感染时，判定野生型单纯疱疹病毒被完全去除而获得纯化的重组单纯疱疹病毒。
图5是重复所述步骤S3后获得的细胞裂解液的上清对BHK细胞和B16-HER2CT9细胞的感染情况：
其中，P2是对应为重复步步骤S3两次的感染图示，如图5中的P2，BHK细胞大量感染而B16-HER2CT9细胞感染较少，由此说明此时还包含有较多的野生型单纯疱疹病毒。
其中，P6是对应为重复步步骤S3六次的感染图示，如图5中的P6，BHK细胞少量感染而B16-HER2CT9细胞感染量提高，由此说明此时野生型单纯疱疹病毒已经得到大量去除，重组单纯疱疹病毒的纯度得到提升。
其中，P9是对应为重复步步骤S3九次的感染图示，如图5中的P9，BHK细胞几乎无感染而B16-HER2CT9细胞大量感染，由此说明此时野生型单纯疱疹病毒已经几乎完全去除，重组单纯疱疹病毒的纯度极高。
综上所述，本发明实施例中，通过构建亲和筛选细胞系B16-HER2CT9，选择性地从同源重组后的病毒细胞中筛选出重组单纯疱疹病毒，相比于现有技术中的噬斑挑选纯化方法，其工艺更加简单高效，且可以提高重组单纯疱疹病毒的纯度。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 重组单纯疱疹病毒的亲和筛选细胞系及其构建方法和应用
<130> 0
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca gggccagcca ggacgtgaac accgccgtgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagcttcc tgtactcggg cgtgcccagc 180
aggttctcgg gcagcaggag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gagcgacatg cccatggccg accccaacag gttcaggggc 360
aagaacctgg tgttccacag cgagatcagc cccctggaga agagggaggc cgaggccgag 420
gtgcagctcg tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gaggctgagc 480
tgcgccgcct cgggcttcaa catcaaggac acctacatcc actgggtgag gcaggccccc 540
ggcaagggcc tggagtgggt ggccaggatc taccccacca acggctacac caggtacgcc 600
gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc gccgacacca gcaagaacac cgcctacctg 660
cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcagcag gtggggcggc 720
gacggcttct acgccatgga ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagctcgagc 780
agcggaggtg gaagtggtag tggaggtagt 810
<210> 2
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gatgcctctc tcaagatggc cgaccccaat cgctttcgcg gcaaagacct tccggtcctg 60
gaccagctga ccgaccctcc gggggtccgg cgcgtgtac 99
<210> 3
<211> 1896
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc 60
catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gacatccaga tgacccagag ccccagcagc 120
ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc atcacctgca gggccagcca ggacgtgaac 180
accgccgtgg cctggtacca gcagaagccc ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc 240
gccagcttcc tgtactcggg cgtgcccagc aggttctcgg gcagcaggag cggcaccgac 300
ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag 360
cactacacca ccccccccac cttcggccag ggcaccaagg tggagatcaa gagcgacatg 420
cccatggccg accccaacag gttcaggggc aagaacctgg tgttccacag cgagatcagc 480
cccctggaga agagggaggc cgaggccgag gtgcagctcg tggagagcgg cggcggcctg 540
gtgcagcccg gcggcagcct gaggctgagc tgcgccgcct cgggcttcaa catcaaggac 600
acctacatcc actgggtgag gcaggccccc ggcaagggcc tggagtgggt ggccaggatc 660
taccccacca acggctacac caggtacgcc gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc 720
gccgacacca gcaagaacac cgcctacctg cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc 780
gccgtgtact actgcagcag gtggggcggc gacggcttct acgccatgga ctactggggc 840
cagggcaccc tggtgaccgt gagctcgagc agcggaggtg gaagtggtag tggaggtagt 900
cacatccagg cgggcctacc ggacccgttc cagcccccca gcctcccgat cacggtttac 960
tacgccgtgt tggagcgcgc ctgccgcagc gtgctcctaa acgcaccgtc ggaggccccc 1020
cagattgtcc gcggggcctc cgaagacgtc cggaaacaac cctacaacct gaccatcgct 1080
tggtttcgga tgggaggcaa ctgtgctatc cccatcacgg tcatggagta caccgaatgc 1140
tcctacaaca agtctctggg ggcctgtccc atccgaacgc agccccgctg gaactactat 1200
gacagcttca gcgccgtcag cgaggataac ctggggttcc tgatgcacgc ccccgcgttt 1260
gagaccgccg gcacgtacct gcggctcgtg aagataaacg actggacgga gattacacag 1320
tttatcctgg agcaccgagc caagggctcc tgtaagtacg ccctcccgct gcgcatcccc 1380
ccgtcagcct gcctgtcccc ccaggcctac cagcaggggg tgacggtgga cagcatcggg 1440
atgctgcccc gcttcatccc cgagaaccag cgcaccgtcg ccgtatacag cttgaagatc 1500
gccgggtggc acgggcccaa ggccccatac acgagcaccc tgctgccccc ggagctgtcc 1560
gagaccccca acgccacgca gccagaactc gccccggaag accccgagga ttcggccctc 1620
ttggaggacc ccgtggggac ggtggcgccg caaatcccac caaactggca cataccgtcg 1680
atccaggacg ccgcgacgcc ttaccatccc ccggccaccc cgaacaacat gggcctgatc 1740
gccggcgcgg tgggcggcag tctcctggca gccctggtca tttgcggaat tgtgtactgg 1800
atgcgccgcc gcactcaaaa agccccaaag cgcatacgcc tcccccacat ccgggaagac 1860
gaccagccgt cctcgcacca gcccttgttt tactaa 1896
<210> 4
<211> 1200
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gccccacgac ccgactcacc tcaaagggac gacccttggt tccgacgcct caacataccc 60
cgctgttctc gttcctcact gcctcccccg ccctggacac cctcttcgtc gtcagcaccg 120
tcatccacac cttatcgttt ttgtgtattg gtgcgatggc gacacacctg tgtggcggtt 180
ggtccagacg cgggcgacgc acacacccta gcgtgcgtta cgtgtgcctg ccgtccgaac 240
gcgggtaggg tatggggcgg gggatgggga gagcccacac gcggaaagca agaacaataa 300
aggcggtggt atctagttga tatgcatctc tgggtgtttt tggggtgtgg cggacgcggg 360
gcggtcattg gacggggtgc agttaaatac atgcccggga cccatgaagc atgcgcgact 420
tccgggcctc ggaacccacc cgaaacggcc aacggacgtc tgagccaggc ctggctatcc 480
ggagaaacag cacacgactt ggcgttctgt gtgtcgcgat gtctctgcgc gcagtctggc 540
atctggggct tttgggaagc ctcgtggggg ctgttcttgc cgccacccat cggggacctg 600
cggccaacac aacggacccc ttaacgcacg ccccagtgtc ccctcacccc agccccctgg 660
ggggctttgc cgtccccctc gtagtcggtg ggctgtgcgc cgtagtcctg ggggcggcgt 720
gtctgcttga gctcctgcgt cgtacgtgcc gcgggtgggg gcgttaccat ccctacatgg 780
acccagttgt cgtataattc cccccccctt ctccgcatgg gtgatgtcgg gtccaaactc 840
ccgacaccac cagctggcat ggtataaatc accggtgcgc cccccaaacc atgtccggca 900
gggggatggg ggggcgaatg cggagggcac ccaacaacac cgggctaacc aggaaatccg 960
tggccccggc ccccaataaa gatcgcggta gcccggccgt gtgacactat cgtccatacc 1020
gaccacaccg acgaatcccc taagggggag gggccatttt acgaggagga ggggtataac 1080
aaagtctgtc tttaaaaagc aggggttagg gagttgttcg gtcataagct tcagcgcgaa 1140
cgaccaacta ccccgatcat cagttatcct taaggtctct tttgtgtggt gcgttccggt 1200
<210> 5
<211> 1200
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ataccccccc ttaatgggtg cgggggggtc aggtctgcgg ggttgggatg ggaccttaac 60
tccatataaa gcgagtctgg aaggggggaa aggcggacag tcgataagtc ggtagcgggg 120
gacgcgcacc tgttccgcct gtcgcaccca cagctttttt tgcgaaccgt cccgttccgg 180
gatgccgtgc cgcccgttgc agggcctggt gctcgtgggc ctctgggtct gtgccaccag 240
cctggttgtc cgtggcccca cggtcagtct ggtatcaaac tcatttgtgg acgccggggc 300
cttggggccc gacggcgtag tggaggaaga cctgcttatt ctcggggagc ttcgctttgt 360
gggggaccag gtcccccaca ccacctacta cgatggggtc gtagagctgt ggcactaccc 420
catgggacac aaatgcccac gggtcgtgca tgtcgtcacg gtgaccgcgt gcccacgtcg 480
ccccgccgtg gcattcgccc tgtgtcgcgc gaccgacagc actcacagcc ccgcatatcc 540
caccctggag ctgaatctgg cccaacagcc gcttttgcgg gtccggaggg cgacgcgtga 600
ctatgccggg gtgtacgtgt tacgcgtatg ggtcggggac gcaccaaacg ccagcctgtt 660
tgtcctgggg atggccatag ccgccaaagg gactctggcg tacaacggct cggcccatgg 720
ctcctgcgac ccgaaactgc ttccgtattc ggccccgcgt ctggccccgg cgagcgtata 780
ccaacccgcc cctaacccgg cctccacccc ctcgaccacc acctccaccc cctcgaccac 840
catccccgct ccccaagcat cgaccacacc cttccccacg ggagacccaa aaccccaacc 900
tcacggggtc aaccacgaac ccccatcgaa tgccacgcga gcgacccgcg actcgcgata 960
cgcgctaacg gtgacccaga taatccagat agccatcccc gcgtccatta tagccctggt 1020
gtttctgggg agctgtattt gctttataca cagatgtcaa cgccgctacc gacgctcccg 1080
ccgcccgatt tacagccccc agatacccac gggcatctca tgcgcggtga acgaagcggc 1140
catggcccgc ctcggagccg agctcaaatc gcatccgagc acccccccca aatcccggcg 1200
<210> 6
<211> 8981
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgtgccccac 240
gacccgactc acctcaaagg gacgaccctt ggttccgacg cctcaacata ccccgctgtt 300
ctcgttcctc actgcctccc ccgccctgga caccctcttc gtcgtcagca ccgtcatcca 360
caccttatcg tttttgtgta ttggtgcgat ggcgacacac ctgtgtggcg gttggtccag 420
acgcgggcga cgcacacacc ctagcgtgcg ttacgtgtgc ctgccgtccg aacgcgggta 480
gggtatgggg cgggggatgg ggagagccca cacgcggaaa gcaagaacaa taaaggcggt 540
ggtatctagt tgatatgcat ctctgggtgt ttttggggtg tggcggacgc ggggcggtca 600
ttggacgggg tgcagttaaa tacatgcccg ggacccatga agcatgcgcg acttccgggc 660
ctcggaaccc acccgaaacg gccaacggac gtctgagcca ggcctggcta tccggagaaa 720
cagcacacga cttggcgttc tgtgtgtcgc gatgtctctg cgcgcagtct ggcatctggg 780
gcttttggga agcctcgtgg gggctgttct tgccgccacc catcggggac ctgcggccaa 840
cacaacggac cccttaacgc acgccccagt gtcccctcac cccagccccc tggggggctt 900
tgccgtcccc ctcgtagtcg gtgggctgtg cgccgtagtc ctgggggcgg cgtgtctgct 960
tgagctcctg cgtcgtacgt gccgcgggtg ggggcgttac catccctaca tggacccagt 1020
tgtcgtataa ttcccccccc cttctccgca tgggtgatgt cgggtccaaa ctcccgacac 1080
caccagctgg catggtataa atcaccggtg cgccccccaa accatgtccg gcagggggat 1140
gggggggcga atgcggaggg cacccaacaa caccgggcta accaggaaat ccgtggcccc 1200
ggcccccaat aaagatcgcg gtagcccggc cgtgtgacac tatcgtccat accgaccaca 1260
ccgacgaatc ccctaagggg gaggggccat tttacgagga ggaggggtat aacaaagtct 1320
gtctttaaaa agcaggggtt agggagttgt tcggtcataa gcttcagcgc gaacgaccaa 1380
ctaccccgat catcagttat ccttaaggtc tcttttgtgt ggtgcgttcc ggtgctagca 1440
tggggggggc tgccgccagg ttgggggccg tgattttgtt tgtcgtcata gtgggcctcc 1500
atggggtccg cggcaaatat gccttggcgg acatccagat gacccagagc cccagcagcc 1560
tgagcgccag cgtgggcgac agggtgacca tcacctgcag ggccagccag gacgtgaaca 1620
ccgccgtggc ctggtaccag cagaagcccg gcaaggcccc caagctgctg atctacagcg 1680
ccagcttcct gtactcgggc gtgcccagca ggttctcggg cagcaggagc ggcaccgact 1740
tcaccctgac catcagcagc ctgcagcccg aggacttcgc cacctactac tgccagcagc 1800
actacaccac cccccccacc ttcggccagg gcaccaaggt ggagatcaag agcgacatgc 1860
ccatggccga ccccaacagg ttcaggggca agaacctggt gttccacagc gagatcagcc 1920
ccctggagaa gagggaggcc gaggccgagg tgcagctcgt ggagagcggc ggcggcctgg 1980
tgcagcccgg cggcagcctg aggctgagct gcgccgcctc gggcttcaac atcaaggaca 2040
cctacatcca ctgggtgagg caggcccccg gcaagggcct ggagtgggtg gccaggatct 2100
accccaccaa cggctacacc aggtacgccg acagcgtgaa gggcaggttc accatcagcg 2160
ccgacaccag caagaacacc gcctacctgc agatgaacag cctgagggcc gaggacaccg 2220
ccgtgtacta ctgcagcagg tggggcggcg acggcttcta cgccatggac tactggggcc 2280
agggcaccct ggtgaccgtg agctcgagca gcggaggtgg aagtggtagt ggaggtagtc 2340
acatccaggc gggcctaccg gacccgttcc agccccccag cctcccgatc acggtttact 2400
acgccgtgtt ggagcgcgcc tgccgcagcg tgctcctaaa cgcaccgtcg gaggcccccc 2460
agattgtccg cggggcctcc gaagacgtcc ggaaacaacc ctacaacctg accatcgctt 2520
ggtttcggat gggaggcaac tgtgctatcc ccatcacggt catggagtac accgaatgct 2580
cctacaacaa gtctctgggg gcctgtccca tccgaacgca gccccgctgg aactactatg 2640
acagcttcag cgccgtcagc gaggataacc tggggttcct gatgcacgcc cccgcgtttg 2700
agaccgccgg cacgtacctg cggctcgtga agataaacga ctggacggag attacacagt 2760
ttatcctgga gcaccgagcc aagggctcct gtaagtacgc cctcccgctg cgcatccccc 2820
cgtcagcctg cctgtccccc caggcctacc agcagggggt gacggtggac agcatcggga 2880
tgctgccccg cttcatcccc gagaaccagc gcaccgtcgc cgtatacagc ttgaagatcg 2940
ccgggtggca cgggcccaag gccccataca cgagcaccct gctgcccccg gagctgtccg 3000
agacccccaa cgccacgcag ccagaactcg ccccggaaga ccccgaggat tcggccctct 3060
tggaggaccc cgtggggacg gtggcgccgc aaatcccacc aaactggcac ataccgtcga 3120
tccaggacgc cgcgacgcct taccatcccc cggccacccc gaacaacatg ggcctgatcg 3180
ccggcgcggt gggcggcagt ctcctggcag ccctggtcat ttgcggaatt gtgtactgga 3240
tgcgccgccg cactcaaaaa gccccaaagc gcatacgcct cccccacatc cgggaagacg 3300
accagccgtc ctcgcaccag cccttgtttt actaagcggc cgcatacccc cccttaatgg 3360
gtgcgggggg gtcaggtctg cggggttggg atgggacctt aactccatat aaagcgagtc 3420
tggaaggggg gaaaggcgga cagtcgataa gtcggtagcg ggggacgcgc acctgttccg 3480
cctgtcgcac ccacagcttt ttttgcgaac cgtcccgttc cgggatgccg tgccgcccgt 3540
tgcagggcct ggtgctcgtg ggcctctggg tctgtgccac cagcctggtt gtccgtggcc 3600
ccacggtcag tctggtatca aactcatttg tggacgccgg ggccttgggg cccgacggcg 3660
tagtggagga agacctgctt attctcgggg agcttcgctt tgtgggggac caggtccccc 3720
acaccaccta ctacgatggg gtcgtagagc tgtggcacta ccccatggga cacaaatgcc 3780
cacgggtcgt gcatgtcgtc acggtgaccg cgtgcccacg tcgccccgcc gtggcattcg 3840
ccctgtgtcg cgcgaccgac agcactcaca gccccgcata tcccaccctg gagctgaatc 3900
tggcccaaca gccgcttttg cgggtccgga gggcgacgcg tgactatgcc ggggtgtacg 3960
tgttacgcgt atgggtcggg gacgcaccaa acgccagcct gtttgtcctg gggatggcca 4020
tagccgccaa agggactctg gcgtacaacg gctcggccca tggctcctgc gacccgaaac 4080
tgcttccgta ttcggccccg cgtctggccc cggcgagcgt ataccaaccc gcccctaacc 4140
cggcctccac cccctcgacc accacctcca ccccctcgac caccatcccc gctccccaag 4200
catcgaccac acccttcccc acgggagacc caaaacccca acctcacggg gtcaaccacg 4260
aacccccatc gaatgccacg cgagcgaccc gcgactcgcg atacgcgcta acggtgaccc 4320
agataatcca gatagccatc cccgcgtcca ttatagccct ggtgtttctg gggagctgta 4380
tttgctttat acacagatgt caacgccgct accgacgctc ccgccgcccg atttacagcc 4440
cccagatacc cacgggcatc tcatgcgcgg tgaacgaagc ggccatggcc cgcctcggag 4500
ccgagctcaa atcgcatccg agcacccccc ccaaatcccg gcgtctagag ggcccgttta 4560
aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 4620
ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 4680
ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 4740
ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 4800
tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggctctagg gggtatcccc acgcgccctg 4860
tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc 4920
cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg 4980
ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg 5040
gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg 5100
atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt 5160
ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt 5220
gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaatta 5280
attctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga 5340
agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc 5400
ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc 5460
ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc 5520
tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct ctgcctctga gctattccag 5580
aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagctccc gggagcttgt 5640
atatccattt tcggatctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa 5700
gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg 5760
gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc 5820
ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca 5880
gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc 5940
actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 6000
tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 6060
acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 6120
cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 6180
ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc 6240
gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct 6300
ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct 6360
acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac 6420
ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc 6480
tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag 6540
atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg 6600
ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccccaact 6660
tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 6720
aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 6780
atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 6840
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 6900
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 6960
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 7020
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 7080
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 7140
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 7200
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 7260
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 7320
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 7380
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 7440
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 7500
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 7560
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 7620
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 7680
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 7740
gcaaacaaac caccgctggt agcggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 7800
aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 7860
aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 7920
ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 7980
acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 8040
ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 8100
gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 8160
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tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 8280
gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 8340
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cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 8520
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<212> DNA
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gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag 120
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tttgatgggg acccagcctc caacactgcc ccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt 1200
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<212> DNA
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tcaccgcgcg cgacgtcgcc ggagcggtcg agttctggac cgaccggctc gggttctccc 9720
gggacttcgt ggaggacgac ttcgccggtg tggtccggga cgacgtgacc ctgttcatca 9780
gcgcggtcca ggaccaggtg gtgccggaca acaccctggc ctgggtgtgg gtgcgcggcc 9840
tggacgagct gtacgccgag tggtcggagg tcgtgtccac gaacttccgg gacgcctccg 9900
ggccggccat gaccgagatc ggcgagcagc cgtgggggcg ggagttcgcc ctgcgcgacc 9960
cggccggcaa ctgcgtgcac ttcgtggccg aggagcagga ctgacacgtg ctacgagatt 10020
tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg 10080
gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac cccaacttgt 10140
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 10200
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 10260
tctgtatacc gtcgacctct agctagagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 10320
tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 10380
aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 10440
ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 10500
gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 10560
tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 10620
aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 10680
gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 10740
aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 10800
ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 10860
tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 10920
tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 10980
ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 11040
tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 11100
ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta 11160
tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 11220
aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 11280
aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 11340
aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 11400
ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 11460
acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 11520
ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 11580
gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 11640
taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 11700
tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 11760
gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 11820
cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 11880
aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 11940
cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 12000
tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 12060
gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 12120
tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 12180
gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 12240
ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 12300
cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 12360
agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 12420
gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgac 12458

Claims (10)

1.一种重组单纯疱疹病毒的亲和筛选细胞系，其特征在于，所述亲和筛选细胞系命名为B16-HER2CT9，是采用慢病毒表达载体pLs18包装能够表达HER2CT9基因的慢病毒Ls18后感染小鼠黑色素瘤细胞系B16获得；
其中，所述慢病毒表达载体pLs18如序列表中SEQ ID NO.10所示，所述HER2CT9基因如序列表中SEQ ID NO.7所示。
2.一种如权利要求1所述的亲和筛选细胞系的构建方法，其特征在于，包括：
合成HER2的跨膜区及胞外区的HER2CT9基因，并在所述HER2CT9基因前连接核定位绿色荧光表达框H2B-EGFP，构建形成所述慢病毒Ls18；
构建所述慢病毒表达载体pLs18，使用所述慢病毒表达载体pLs18包装所述慢病毒Ls18后感染小鼠黑色素瘤细胞系B16，获得所述亲和筛选细胞系B16-HER2CT9；
其中，所述核定位绿色荧光表达框H2B-EGFP如序列表中SEQ ID NO.9所示。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，通过编码连接肽T2A将所述核定位绿色荧光表达框H2B-EGFP连接到所述HER2CT9基因；其中，所述编码连接肽T2A如序列表中SEQID NO.8所示。
4.一种单纯疱疹病毒的重组改造方法，其特征在于，包括：
构建用于重组改造单纯疱疹病毒的靶向载体；
将所述靶向载体与野生型单纯疱疹病毒进行同源重组，获得混合有重组单纯疱疹病毒和野生型单纯疱疹病毒的细胞液；
使用如权利要求1所述的亲和筛选细胞系B16-HER2CT9从所述细胞液中筛选出重组单纯疱疹病毒，获得纯化的重组单纯疱疹病毒。
5.根据权利要求4所述的单纯疱疹病毒的重组改造方法，其特征在于，所述野生型单纯疱疹病毒为HSV1-EGFP，具体是在野生型单纯疱疹病毒HSV1中插入了绿色荧光表达框EGFP；所述重组单纯疱疹病毒为Hs34，具体是通过在敲除HSV1-EGFP病毒基因组中的gD基因之后，在被敲除的所述gD基因的位置上插入靶向HER2的单链抗体scHER2得到；
其中，所述单链抗体scHER2如序列表中SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的单纯疱疹病毒的重组改造方法，其特征在于，所述构建用于重组改造单纯疱疹病毒的靶向载体包括：
合成HER2的单链抗体scHER2，所述单链抗体scHER2如序列表中SEQ ID NO.1所示；
将所述单链抗体scHER2替换gD基因的第6至38位氨基酸，构建形成融合基因scHER2::gD；其中，所述gD基因的第6至38位氨基酸如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述融合基因scHER2::gD如序列表中SEQ ID NO.3所示；
将所述融合基因scHER2::gD、所述gD基因的上游同源臂UHA和下游同源臂DHA共同连接入pcDNA3.1+载体，构建获得所述靶向载体pHSV1-ΔgD-scHER2::gD；
其中，所述上游同源臂UHA如序列表中SEQ ID NO.4所示，所述下游同源臂构DHA如序列表中SEQ ID NO.5所示，所述靶向载体pHSV1-ΔgD-scHER2::gD如序列表中SEQ ID NO.6所示。
7.根据权利要求4-6任一所述的单纯疱疹病毒的重组改造方法，其特征在于，所述将所述靶向载体与野生型单纯疱疹病毒进行同源重组包括：将所述靶向载体转染BHK细胞，4h～8h后加入所述野生型单纯疱疹病毒进行同源重组。
8.根据权利要求7所述的单纯疱疹病毒的重组改造方法，其特征在于，所述使用如权利要求1所述的亲和筛选细胞系B16-HER2CT9从所述细胞液中筛选出重组单纯疱疹病毒包括：
S1、收集同源重组细胞液中的细胞，对所述细胞冻融裂解并离心去除细胞碎片，形成第一细胞裂解液；
S2、使用所述第一细胞裂解液感染所述亲和筛选细胞系B16-HER2CT9，
S3、在预定时间后收集所述亲和筛选细胞系中的细胞，对所述细胞冻融裂解并离心去除细胞碎片形成第二细胞裂解液，使用所述第二细胞裂解液感染另一份所述亲和筛选细胞系B16-HER2CT9；
S4、重复以上所述步骤S3多次，最终获得纯化的重组单纯疱疹病毒。
9.根据权利要求8所述的单纯疱疹病毒的重组改造方法，其特征在于，重复所述步骤S3多次后，将细胞裂解液分别感染BHK细胞和B16-HER2CT9细胞，当细胞裂解液在BHK细胞无感染而B16-HER2CT9大量感染时，判定野生型单纯疱疹病毒被完全去除而获得纯化的重组单纯疱疹病毒。
10.根据权利要求8所述的单纯疱疹病毒的重组改造方法，其特征在于，所述对所述细胞冻融裂解并离心去除细胞碎片包括：将所述细胞于-80℃～-100℃的温度下冻融裂解后，在转速为4000rpm～6000rpm的条件下离心5min～10min去除细胞碎片。
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