CN113584084A - 一种人肝纤维化诱导模型的工具细胞株构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人肝纤维化诱导模型的工具细胞株构建方法，属于生物技术领域。本发明提供一种重组慢病毒载体，包括插入有绿色荧光基因EGFP及人TGF‑β1基因的慢病毒载体，所述慢病毒载体选用Tet‑On诱导表达慢病毒系统，基于该重组慢病毒载体可构建一种人肝纤维化诱导模型的工具细胞株。该重组慢病毒载体能通过诱导剂Dox持续诱导TGF‑β1的过表达，弥补了传统肝纤维化诱导方法过程中需要持续添加重组的TGF‑β1因子操作繁琐、费时、成本高、批次差异大等缺陷；且对细胞的毒性小，且制备方法简单，易于工业化生产。

Description

一种人肝纤维化诱导模型的工具细胞株构建方法
技术领域
本发明涉及一种人肝纤维化诱导模型的工具细胞株构建方法，属于生物技术领域。
背景技术
肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是一个病理生理过程，是由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生。肝损伤时，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)大量产生，同时，肝内的金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)活性下降，金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloprotenase，TIMP)产生过多，使得ECM的降解减少，导致ECM在肝脏中的大量沉积。任何肝脏损伤在肝脏修复愈合的过程中都有肝纤维化的过程，如果损伤因素长期不能去除，纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化。
肝纤维化是由慢性肝损伤引起的细胞外基质蛋白的过度积累。一般来说，是细胞外基质合成和降解之间的不平衡。在慢性肝损伤的情况下，肝星状细胞被激活并转化为增殖性肌成纤维细胞样细胞，这是细胞外基质表达的主要来源。肝星状细胞的激活，被定义为静止的血管周细胞样细胞向肌纤维母细胞的转化，在HF的发展中起着关键作用。肝星状细胞的激活以增强的细胞增殖、运动和沉积细胞外基质的能力为特征。
肝星形细胞(helatic stellate cells，HSC)是肝纤维化时过量的ECM的主要来源，是肝纤维化的主要效应细胞。HSC的活化是肝纤维化的中心环节。正常状态下，HSC位于窦周间隙，其形态不规则，胞体呈卯圆形或不规则形，常有数个星状突起并嵌入相邻肝细胞的凹陷内，其突起包绕肝窦边界的内皮细胞，胞质内富含维生素A和甘油三脂，在正常肝中，与肝细胞之比为1∶20，其总体积占肝体积1.4％。
肝脏在受到各种损伤因素影响后，原处于静止期的HSC受同类细胞或其他细胞分泌的细胞因子的影响，在旁分泌和自分泌的作用下被激活，发生表型改变。其转化规律是HSC细胞转化成肌成纤维细胞。激活后的HSC丢失VitA脂滴，粗面内质网或核糖体扩张增生，细胞增殖、游动、收缩能力增强同时大量合成细胞因子和ECM。
转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)是促肝纤维化的关键因子。活化的TGFβ与受体TβR结合，形成复合体。活化的TβR通过Smads锚着蛋白等招募smads或直接结合丝裂原激活的蛋白激酶等信号分子，并使之磷酸化，使信号在胞内逐级传递至细胞核内，调控目的基因的表达。TGF-β1能刺激ECM合成(增加I、III、IV型胶原)，诱导HSC合成胶原，调节细胞增生，抑制HSC增生，但刺激其转化。同时能抑制基质降解，减少MMPS合成，增加TIMPS的合成并调节自身活性型改变。另外，TGF-β能刺激其他生长因子受体(如PDGF、TGFa)表达及整合素家族受体。
Tet-On诱导表达是以大肠杆菌Tn10转座子上Tet抗性操纵子为基础而建立的，Tet阻遏蛋白(Tet repressor protein，TetR)与Tet操纵基因(Tetoperator，TetO)DNA序列有特异的亲和能力，当细胞内无Tet存在时，TetR会与TetO结合，从而阻断下游的抗性基因表达；当有Tet存在时，药物使TetR的构象发生改变，导致TetR与TetO分离，从而引起抗性基因的抑制解除，抗性蛋白表达使细菌产生耐药性。
Tet系统具有低本底与高诱导倍数的特点，无诱导时目的基因表达水平低，诱导时其表达水平增高，最高诱导倍数可达10000倍。目的基因的诱导倍数与诱导剂的量及诱导时间存在一定的关系，所以人们可以采用Tet诱导调控表达系统对基因表达进行精确的调节。原核来源的TetR与TetO的结合特异性高，哺乳动物细胞中无类似的DNA靶序列，因此该系统调控特异性高，宿主基因不受影响，适合于体内外的各种基因表达的调控。
在肝星状细胞培养基中加入人工合成的人重组蛋白TGF-β1是目前实验室常用的肝纤维化诱导方法。但是商业的TGF-β1重组蛋白价格高，需要持续添加以维持诱导效果，并且不同批次间人重组蛋白TGF-β1的稳定性待考证，因此实验成本很高。通过本发明提供的可调控的肝纤维化诱导方法，可以通过加入价格便宜的诱导剂Dox，替代TGF-β1重组蛋白实现肝纤维化模型诱导。细胞模型构建完成后，不需要反复进行病毒感染，只需要加入Dox就可以持续使用。另外，通过撤掉诱导剂Dox，可以模拟肝纤维化缓解治愈的过程。因此，本发明提供了一种高效可重复且成本低廉的肝纤维化诱导方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种重组慢病毒载体，能够检测钙离子浓度变化。
本发明还提出了一种重组慢病毒载体。
本发明还提出一种上述重组慢病毒载体的制备方法。
本发明还提出一种基于上述重组慢病毒载体构建的工具细胞株。
本发明还提出一种上述重组慢病毒载体的应用。
本发明还提出一种检测人肝星状细胞LX-2纤维化的方法。
根据本发明的第一方面实施方式的重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体包括插入有绿色荧光基因EGFP及人TGF-β1基因的慢病毒载体，所述慢病毒载体选用Tet-On诱导表达慢病毒系统。
根据本发明的一些实施方式，所述重组慢病毒载体在原始载体pLVX-Tetone-puro的基础上进行改造。
根据本发明的第二方面实施方式的重组慢病毒，所述重组慢病毒采用上述重组慢病毒载体与包装质粒共转染哺乳细胞制备得到。
根据本发明的一些实施方式，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。
根据本发明的一些实施方式，所述哺乳细胞为293T细胞。
根据本发明的一些实施方式，所述包装质粒包括psPAX2、pMD2.G载体。
根据本发明的第三方面实施方式的含有上述重组慢病毒载体的重组细胞，所述重组细胞包含上述重组慢病毒载体和/或上述重组慢病毒的宿主细胞。
根据本发明的一些实施方式，所述宿主细胞为人肝星形细胞LX-2。
根据本发明的第四方面实施方式的重组慢病毒载体的制备方法，所述方法如下步骤：将EGFP基因和TGF-β1基因分别克隆至慢病毒载体中得到重组慢病毒载体。
根据本发明的一些实施方式，所述重组载体的构建方法如下步骤：
S1、使用含T2A-EGFP片段的模板，设计上游引物序列T2A-EGFP-F和下游引物序列T2A-EGFP-R，扩增得到T2A-EGFP片段(序列如SEQ ID NO.3所示)
S2、使用含人TGF-β1基因的模板，设计上游引物序列TGF-β1-F和下游引物序列TGF-β1-R，扩增得到人TGF-β1(序列如SEQ ID NO.6所示)；
S3、取pLVX-Tetone-puro慢病毒载体，将步骤S1扩增得到的T2A-EGFP基因和步骤S2扩增得到的TGF-β1基因克隆到所述pLVX-Tetone-puro慢病毒载体中，得到所述重组慢病毒载体。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S1中的T2A-EGFP基因上游引物F和下游引物R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S2中的TGF-β1基因上游引物F和下游引物R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S1中，T2A-EGFP基因的模板为含有EGFP和T2A基因序列的质粒。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S1中，TGF-β1基因的模板为含有人TGF-β1基因序列的cDNA。
根据本发明的一些实施方式，SEQ ID NO.5的序列与SEQ ID NO.1序列完全反向互补。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤S2中，TGF-β1基因和EGFP基因采用同源重组的方法，亚克隆至慢病毒载体TRE3GS promoter下游的MCS区，使TRE3GS promoter控制其表达。
根据本发明的一些实施方式，所述TGF-β1基因插到TRE3启动子后面，由Dox来调控其表达。
根据本发明的一些实施方式，所述TGF-β1基因和EGFP基因由T2A进行连接，EGFP的表达能指示TGF-β1的表达。
根据本发明的第四方面实施方式的上述重组慢病毒载体的应用，所述应用为将上述重组慢病毒载体用于细胞功能相关基因的荧光检测。
根据本发明的一些实施方式，所述荧光检测由多西环素(Doxycyclinehydrochloride，Dox)进行调控，当细胞内无Dox存在时，TetR会与TetO结合，从而阻断下游的TGF-β1和EGFP荧光基因表达；当有Dox存在时，TetR与TetO分离，从而引起TGF-β1和EGFP荧光基因的抑制解除，进而能够表达绿色荧光。
根据本发明的一些实施方式，所述应用为将重组慢病毒载体用于钙调蛋白相关基因的检测。
根据本发明的一些实施方式，所述应用为将重组慢病毒载体用于细胞内钙离子浓度的检测。
根据本发明的第五方面实施方式的一种检测人肝星状细胞LX-2纤维化的方法，包括以下步骤：将上述重组慢病毒载体感染目的细胞，加入及去掉诱导剂Dox，根据EGFP荧光确定人TGF-β1基因表达。
根据本发明的一些实施方式，所述肝纤维化检测采用QPCR方法，用于检测纤维化相关指标a-SMA、CollageI、TGF-β1、TGFβR、P75NTR、TIMP-1的基因水平变化。
根据本发明的一些实施方式，所述肝纤维化检测采用WB方法，用于检测纤维化相关指标a-SMA、CollageI、TGF-β1、TGFβR、P75NTR、TIMP-1的蛋白表达变化。
根据本发明实施方式的重组慢病毒载体，至少具有如下有益效果：本发明方案通过将绿色荧光基因EGFP及TGF-β1亚克隆至慢病毒载体pLVX-Tetone-puro，得到所述慢病毒载体，能通过诱导剂Dox持续诱导TGF-β1的过表达，弥补了传统肝纤维化诱导方法过程中需要持续添加重组的TGF-β1因子操作繁琐、费时、成本高、批次差异大等缺陷；本发明提供的重组慢病毒载体对细胞的毒性小，且制备方法简单，易于工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1中的pLVX-Tetone-puro线性化的凝胶电泳图。
图2为本发明实施例1中的T2A-EGFP质粒片段和TGF-β1基因片段扩增电泳图。
图3为本发明实施例1中的载体pLVX-TetOne-人TGFβ1-T2A-EGFP菌落PCR电泳图。
图4为本发明实施例1中的载体pLVX-TetOne-人TGFβ1-T2A-EGFP测序比对示意图。
图5为本发明实施例1中的载体pLVX-TetOne-人TGFβ1-T2A-EGFP图谱。
图6为本发明实施例3中的慢病毒感染目的细胞LX-2的不同分组效果图。
图7为本发明实施例3中的QPCR检测TGF-β1基因相对表达量柱状图。
图8为QPCR技术检测本发明实施例4中的肝纤维化相关指标基因表达变化。
图9为WB技术检测本发明实施例4中的肝纤维化相关指标基因表达变化。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1重组慢病毒载体的构建
1、引物设计
根据载体pLVX-Tetone-puro(如SEQ ID NO.7所示)、T2A-EGFP和人TGF-β1的序列设计同源重组序列，使得重组载体连接方式为TRE3GS promoter-TGF-β1-T2A-EGFP-SV40poly(A)signal。其中，T2A-EGFP-F引物序列与TGF-β1-R引物序列完全反向互补。
引物序列，具体如表1所示。
表1重组载体构建相关引物序列表
Figure BDA0003136726070000071
2、获得重组片段
2.1 获得pLVX-Tetone-puro酶切片段
2.1.1 使用质粒中提试剂盒(购买自Magen，货号P1155-03)，提取慢病毒载体pLVX-Tetone-puro原始质粒(购买自NTCC，货号pLVX-TetOne-Puro)；
2.1.2 使用EcoRI和BamHI进行双酶切(购买自Neb，货号#R0136S和#R0101S，酶切产物约9.2K，见图1)；
2.1.3 使用胶回收试剂盒(购买自天根，货号DP209)，进行酶切产物胶回收。
2.2 获得T2A-EGFP扩增片段
2.2.1 使用质粒中提试剂盒(购买自Magen，货号P1155-03)，提取含T2A-EGFP的原始质粒(产品编号BR540，来源于丰晖生物)；
2.2.2设计上游引物序列T2A-EGFP-F和下游引物序列T2A-EGFP-R，通过PCR，扩增得到T2A-EGFP片段(序列如SEQ ID NO.3所示)。其中，T2A-EGFP-F含有部分TGF-β1序列，而T2A-EGFP-R含有部分pLVX-Tetone-puro空载序列，以便于后续重组；
2.2.3使用胶回收试剂盒(购买自天根，货号DP209)，进行PCR产物胶回收(见图2)。
2.3 获得TGF-β1扩增片段
2.3.1使用人HEL细胞，提取RNA，并反转录为cDNA，作为TGF-β1的扩增模板；
2.3.2设计上游引物序列TGF-β1-F和下游引物序列TGF-β1-R，通过PCR，扩增得到TGF-β1片段(序列如SEQ ID NO.6所示)。其中，TGF-β1-F含有部分pLVX-Tetone-puro序列，而TGF-β1-R含有部分T2A-EGFP片段序列，且与T2A-EGFP-F完全互补，以便于后续重组；
2.3.3使用胶回收试剂盒(购买自天根，货号DP209)，进行PCR产物胶回收(见图2)。
3、构建重组载体pLVX-TetOne-人TGFβ1-T2A-EGFP-Puro
3.1 将上述获得的空载酶切片段、T2A-EGFP扩增片段和TGF-β1扩增片段进行同源重组，得到重组质粒，随后转化进入感受态细胞，经菌落PCR鉴定(见图3)，菌落PCR采用的正向引物核苷酸序列为：TGATGCCGTTCTTCTGCTTGTC(如SEQ ID NO.8所示)；反向引物核苷酸序列为：GTGAAGAATGTGCGAGACCC(如SEQ ID NO.9所示)。将菌落PCR鉴定正确的菌株送出测序验证，测序核验比对示意图如图4所示。从图中可以看出，终载体pLVX-TetOne-人TGFβ1-T2A-EGFP成功被构建。将序列正确的感受态细胞进行扩大培养，采用质粒去内毒素中提试剂盒提取得到终载体pLVX-TetOne-人TGFβ1-T2A-EGFP，其图谱如图5所示。
实施例2慢病毒包装及滴度检测
慢病毒包装采用三质粒系统：包装质粒(psPAX2、pMD2.G)及目的质粒(pLVX-TetOne-人TGFβ1-T2A-EGFP-Puro)。
(1)293T细胞准备。转染时细胞密度在70-80％，按8×106个/10cm培养皿接种。
(2)质粒共转染。转染前将培养基换成10mL DMEM基础培养基，将目的质粒和包装质粒用1mL DMEM基础培养基孵育5min，同时用1mL DMEM基础培养基孵育Lipofiter 5min，然后将质粒和Lipofiter轻柔混合继续孵育20min。随后将2mL液体全部均匀滴加到培养皿中。6h后将培养基更换成10mL完全培养基(不含双抗，含Dox，1μg/mL)。
(3)观察荧光。转染后24h通过荧光显微镜观察荧光，确认转染是否成功。
(4)收毒。转染后48h收病毒上清，保存于4℃。
(5)浓缩。使用离心柱进行病毒离心浓缩。浓缩完成后根据需要将过滤后的样品进行小体积(100μL或200μL)分装，保留10μL用于滴度检测，并做好标记，存于-80℃或液氮。
(6)滴度测定。采用梯度稀释法检测滴度，最终确保病毒滴度不低于2×108TU/mL。
实施例3目的细胞感染及验证
1、目的细胞感染
1.1 LX-2细胞用含10％胎牛血清和1％pen/strep的DMEM培养基，在37℃饱和湿度、含5％CO2的孵箱中培养。取对数生长期，生长状态良好的LX-2细胞用0.25％胰酶消化后，细胞计数；
1.2 将LX-2细胞种到6孔板中，密度为3.0x105/孔，铺板后24h，按如下分组处理：control组(不感染慢病毒，加入1U/mL的Dox)；NC组(感染慢病毒空载，加入1μg/mL的Dox诱导)；慢病毒组1(感染pLVX-TetOne-人TGFβ1-T2A-EGFP-Puro，加入1μg/mL的Dox诱导)；慢病毒组2(感染pLVX-TetOne-人TGFβ1-T2A-EGFP-Puro，不加入Dox诱导)；慢病毒组3(感染pLVX-TetOne-人TGFβ1-T2A-EGFP-Puro，先加入1μg/mL的Dox诱导，后撤掉Dox诱导)，48h后荧光显微镜下100x拍照。
慢病毒感染后目的细胞LX-2效果如图6所示，从图中可以看出，Control组和NC组不带荧光，细胞状态无显著性差异，说明病毒的感染对细胞形态及状态影响不大。而慢病毒组中，加入1μg/mL的Dox的组1有荧光表达，不加入Dox的组2无荧光表达，说明Tet-on系统运转正常。而病毒组3加入Dox后能见荧光表达，48h后撤掉Dox，传代后72h观察，几乎无荧光表达，且撤掉Dox前后细胞状态差别不大，进一步说明Tet-on系统运转正常且Dox药物的加入对细胞状态影响不大。
2、过表达效果表达验证
2.1 将上述病毒感染后的5组样本，进行RNA提取，逆转录，获得cDNA。
2.2 设计TGF-β1的QPCR检测引物，TGF-β1的QPCR引物为TGF-β1-F：CCGCAACAACGCCATCTATG；TGF-β1-R：TCTCTGCAAGCGCAGCTCTG。通过QPCR检测5个组细胞的TGF-β1基因表达。
2.2.1 反应体系的配置(如表2所示)
表2反应体系的配置
成分 体积
SYBR Green I mix(2×) 5μL
Primer-F(10μM) 0.3μL
Primer-R(10μM) 0.3μL
cDNA 0.2μL
灭菌蒸馏水 up to 10μL
2.2.2 反应条件设置
扩增程序见表3。
表3扩增程序
Figure BDA0003136726070000101
Figure BDA0003136726070000111
熔解程序见表4。
表4熔解程序
Figure BDA0003136726070000112
结果如图7和表5所示，可以看出，慢病毒组1的TGF-β1基因表达水平显著高于其余四组(control组表达值归1后，NC组基因表达为control的2.28倍，慢病毒组2基因表达为control的3.60倍，慢病毒组3基因表达为control的6.71倍，而慢病毒组1中TGF-β1基因表达为control组TGF-β1基因表达的约214倍)，说明TGF-β1过表达细胞株构建成功，且可受Tet-on系统调控。当去掉Dox后，TGF-β1过表达效果消失。
表5不同分组中TGF-β1基因表达相对值
分组 control NC Lenti-1 Lenti-2 Lenti-3
比值 1.00 2.28 213.99 3.60 6.71
实施例4获得的工具细胞株的肝纤维化诱导效果验证
在许多参与肝纤维化的炎性细胞因子中，TGF-β1是参与肝纤维化起始和维持的最有效的促纤维化因子，能加速静止期肝星状细胞(HSCs)的活化，上调胶原表达，减少胶原降解。实验证据表明，TGF-β1有效激活肝星状细胞的机制在于：TGF-β1通过调节细胞外基质成分的表达促进细胞外基质的沉积，包括原纤维胶原和纤维连接蛋白等。因此，上调肝星状细胞的TGF-β1含量能诱导肝纤维化。目前实验室常用的肝纤维化诱导方法是在肝星状细胞培养基中加入人工合成的人重组蛋白TGF-β1。本实施例对比了常规肝星状细胞纤维化诱导方法和本发明介绍的肝星状细胞纤维化诱导方法的差异，以此证明本发明获得的工具细胞株具有良好的肝星状细胞纤维化诱导效果。
1.TGF-β1重组蛋白诱导人肝星状细胞LX-2成纤维化
1.1 LX-2细胞用含10％胎牛血清和1％pen/strep的DMEM培养基，在37℃饱和湿度、含5％CO2的孵箱中培养。取对数生长期，生长状态良好的LX-2细胞用0.25％胰酶消化后，细胞计数；
1.2 培养基中加入5ng/mL的TGF-β1重组蛋白(购于peprotech，货号100-21)，诱导48小时后收样用于后续检测。同时，作为对照组，加入同等体积的PBS，同样48小时后收样用于后续检测。
2.QPCR方法验证获得的工具细胞株实现肝纤维化诱导
2.1 分别取无处理对照组(Control组)、TGF-β1重组蛋白诱导组(TGF-β+)、重组蛋白对照组(TGF-β-)、慢病毒诱导TGF-β1过表达组(Dox+)和撤掉Dox后失去过表达效果组(Dox-)细胞样本，提取RNA，反转录成cDNA；
2.2 QPCR检测相关因子基因表达变化
2.2.1 反应体系的配置(同表2)
2.2.2 反应条件设置：
扩增程序同表3。
熔解程序同表4。
通过QPCR，分别检测了TGF-β1及受体TGFβR、纤维化相关因子a-SMA、collage I、活化因子P75NTR和细胞外基质维持相关因子TIMP-1。相关引物序列见表6。QPCR结果如图8所示。从图8和表7可知：本发明获得的人肝纤维化诱导模型细胞株在诱导物Dox加入后，肝纤维化相关基因表达显著提高(对比contro组，在Dox+组和TGF-β1组中a-SMA基因表达分别增加10.34倍和8.98倍、collage基因表达分别增加8.92倍和9.90倍，P75NTR基因表达分别增加6.48倍和5.78倍，TIMP-1基因表达分别增加7.10倍和6.10倍。另外，TGF-β1的受体TGFβR基因表达分别增加12.41倍和9.02倍，而TGF-β1基因表达在Dox+组中增加50.99倍，直接加入TGF-β1重组蛋白时，基因表达仅仅上升1.57倍)，趋势与直接在细胞培养基中加人重组TGF-β1的效果类似，而TGF-β1-组和Dox-组各基因表达值与control组相似。说明TGF-β1能诱导人肝星状细胞纤维化，且本发明的模型工具株直接进行肝纤维化诱导的效果与传统的TGF-β1诱导效果接近。
表6 QCR验证纤维化相关引物序列表
引物名称 引物序列(5’→3’)
a-SMA-F CTTCGTGACTACTGCCGAGC
a-SMA-R AGGTGGTTTCGTGGATGCC
Collagen I-F CCCTGGTCCCTCTGGAAATG
Collagen I-R GGACCTTTGCCCCCTTCTTT
TGFB1-F CCGCAACAACGCCATCTATG
TGFB1-R TCTCTGCAAGCGCAGCTCTG
Tgfbr1-F CGGGGGCGAAGGCATTAC
Tgfbr1-R GCCTGTCTCGAGGAATTAGGT
P75NTR-F CAACCAGACCGTGTGTGAACCC
P75NTR-R CCTGGTAGTAGCCATAGGAGCATC
Timp1-F AGGCTGTGGGAAATGCCGC
Timp1-R CTTAGGCGGCCCGTGATGAG
表7 肝星状细胞进行纤维化诱导中不同分组各基因表达相对值
Figure BDA0003136726070000131
Figure BDA0003136726070000141
3.WB方法验证获得的工具细胞株实验肝纤维化诱导
分别取无处理对照组(Control组)、TGF-β1重组蛋白诱导组(TGF-β+)、重组蛋白对照组(TGF-β-)、慢病毒诱导TGF-β1过表达组(Dox+)和撤掉Dox后失去过表达效果组(Dox-)细胞样本，提取总蛋白，并通过BCA法测量各组蛋白浓度；WB检测各组样本中不同指标的蛋白表达水平。结果如图9和表8所示，由此可知：本发明获得的人肝纤维化诱导模型细胞株在诱导物Dox加入后，肝纤维化相关基因的蛋白表达都有相应提高(对比contro组，在Dox+组和TGF-β1组中a-SMA蛋白表达分别增加4.17倍和2.98倍、collage蛋白表达分别增加3.50倍和4.48倍，P75NTR蛋白表达分别增加3.40倍和2.44倍，TIMP-1蛋白表达分别增加2.35倍和3.14倍。另外，TGF-β1的受体TGFβRTGFβR蛋白表达分别增加4.46倍和3.13倍，而TGF-β1蛋白表达在Dox+组中增加6.08倍，直接加入TGF-β1重组蛋白时，蛋白表达仅仅上升1.76倍)，趋势与直接在细胞培养基中加人重组TGF-β1的效果类似，而TGF-β1-组和Dox-组各基因表达值与control组相似。说明TGF-β1能诱导人肝星状细胞纤维化，且本发明的模型工具株直接进行肝纤维化诱导的效果与传统的TGF-β1诱导效果接近。。因此，可以认为本发明获得的人肝纤维化诱导模型工具细胞株能有效诱导人肝星状细胞纤维化，其效果与在培养基中直接加人重组蛋白TGF-β1所产生的效果一致。
表8 肝星状细胞进行纤维化诱导中不同分组各蛋白表达相对值
Figure BDA0003136726070000142
Figure BDA0003136726070000151
Tet系统的诱导药物为Tet或其衍生物(如Dox/4-ED等)。Dox(多西霉素)作为一种抗生素已被人们应用了很长时间，是对人体较为安全的一种药物。并且在Tet系统中低剂量的Dox就可调节基因的表达，所以不会对动物或细胞产生强毒性，该系统诱导所需的时间短，在加入诱导剂30分钟内即可检测到目的基因的表达；当去除诱导剂一定时间后可使该系统关闭，之后仍可通过加入诱导剂重新开启，因此该诱导系统是一种可逆系统。
基于Tet系统进行构建的本发明所述的慢病毒重组载体，其意义在于，当细胞内无Dox存在时，TetR会与TetO结合，从而阻断下游的TGF-β1和EGFP荧光基因表达；当有诱导剂Dox存在时，诱导剂使TetR的构象发生改变，导致TetR与TetO分离，从而引起TGF-β1和EGFP荧光基因的抑制解除，EGFP荧光基因表达使实验人员便于判断过表达质粒的转染效率。由于TGF-β1与EGFP是通过T2A连接，因此，EGFP的荧光可以直接指示TGF-β1的过表达。
目前实验室常用的肝纤维化诱导方法是在肝星状细胞培养基中加入人工合成的人重组蛋白TGF-β1。由于商业的TGF-β1重组蛋白价格高，需要持续添加以维持诱导效果，并且不同批次间人重组蛋白TGF-β1的稳定性待考证，因此实验成本极大。通过本发明提供的可调控的肝纤维化诱导方法，可以通过加入价格便宜的诱导剂Dox，替代TGF-β1重组蛋白实现肝纤维化模型诱导。细胞模型构建完成后，不需要反复进行病毒感染，只需要加入Dox就可以持续使用。另外，通过撤掉诱导剂Dox，可以模拟肝纤维化缓解治愈的过程。因此，本发明提供了一种高效可重复且成本低廉的肝纤维化诱导方法。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 湖南亚大丰晖新材料有限公司
<120> 一种人肝纤维化诱导模型的工具细胞株构建方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ctcctgcaag tgcagcgaat tctgcagata tccagcac 38
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tcgcagggga ggtggtctgg atccttactt gtacagctcg tcca 44
<210> 3
<211> 853
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tcgcagggga ggtggtctgg atccttactt gtacagctcg tccatgccga gagtgatccc 60
ggcggcggtc acgaactcca gcaggaccat gtgatcgcgc ttctcgttgg ggtctttgct 120
cagggcggac tgggtgctca ggtagtggtt gtcgggcagc agcacggggc cgtcgccgat 180
gggggtgttc tgctggtagt ggtcggcgag ctgcacgctg ccgtcctcga tgttgtggcg 240
gatcttgaag ttcaccttga tgccgttctt ctgcttgtcg gccatgatat agacgttgtg 300
gctgttgtag ttgtactcca gcttgtgccc caggatgttg ccgtcctcct tgaagtcgat 360
gcccttcagc tcgatgcggt tcaccagggt gtcgccctcg aacttcacct cggcgcgggt 420
cttgtagttg ccgtcgtcct tgaagaagat ggtgcgctcc tggacgtagc cttcgggcat 480
ggcggacttg aagaagtcgt gctgcttcat gtggtcgggg tagcggctga agcactgcac 540
gccgtaggtc agggtggtca cgagggtggg ccagggcacg ggcagcttgc cggtggtgca 600
gatgaacttc agggtcagct tgccgtaggt ggcatcgccc tcgccctcgc cggacacgct 660
gaacttgtgg ccgtttacgt cgccgtccag ctcgaccagg atgggcacca ccccggtgaa 720
cagctcctcg cccttgctca ccatagggcc gggattctcc tccacgtcac cgcatgttag 780
aagacttcct ctgccctcct cgagcggccg ccactgtgct ggatatctgc agaattcgct 840
gcacttgcag gag 853
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ttcctaccct cgtaaagaat tcatgccgcc ctccgggc 38
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
gtgctggata tctgcagaat tcgctgcact tgcaggag 38
<210> 6
<211> 1214
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
gtgctggata tctgcagaat tcgctgcact tgcaggagcg cacgatcatg ttggacagct 60
gctccacctt gggcttgcgg cccacgtagt acacgatggg cagcggctcc agcgcctgcg 120
gcacgcagca cggcgccgcc gaggcgcccg ggttatgctg gttgtacagg gccaggacct 180
tgctgtactg cgtgtccagg ctccaaatgt aggggcaggg cccgaggcag aagttggcat 240
ggtagccctt gggctcgtgg atccacttcc agccgaggtc cttgcggaag tcaatgtaca 300
gctgccgcac gcagcagttc ttctccgtgg agctgaagca atagttggtg tccagggctc 360
ggcggtgccg ggagctttgc agatgctggg ccctctccag cggggtggcc atgagaagca 420
ggaaaggccg gttcatgcca tgaatggtgg ccaggtcacc tcggcggccg gtagtgaacc 480
cgttgatgtc cacttgcagt gtgttatccc tgctgtcaca ggagcagtgg gcgctaaggc 540
gaaagccctc aatttcccct ccacggctca accactgccg cacaactccg gtgacatcaa 600
aagataacca ctctggcgag tcgctgggtg ccagcagccg gttgctgagg tatcgccagg 660
aattgttgct gtatttctgg tacagctcca cgtgctgctc cacttttaac ttgagcctca 720
gcagacgcag ctctgcccgg gagagcaaca cgggttcagg taccgcttct cggagctctg 780
atgtgttgaa gaacatatat atgctgtgtg tactctgctt gaacttgtca tagatttcgt 840
tgtgggtttc caccattagc acgcgggtga cctccttggc gtagtagtcg gcctcaggct 900
cgggctccgg ttctgcactc tccccggcca cccggtcgcg ggtgctgttg tacagggcga 960
gcacggcctc gggcagcggg ccgggcggca cctccccctg gctcgggggg ctggcgagcc 1020
gcagcttgga caggatctgg ccgcggatgg cctcgatgcg cttccgcttc accagctcca 1080
tgtcgatagt cttgcaggtg gatagtcccg cggccggccg gccaggcgtc agcaccagta 1140
gccacagcag cggtagcagc agcggcagca gccgcagccc ggagggcggc atgaattctt 1200
tacgagggta ggaa 1214
<210> 7
<211> 9227
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180
ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360
ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420
cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660
cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720
caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840
aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900
caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960
gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140
aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200
tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260
aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320
gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380
cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440
gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500
ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560
actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620
gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680
aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740
ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800
tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860
actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920
cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980
cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040
gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100
aaactaaaga actacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160
acagcagaga tccagtttat cgacttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 2220
aaggcaatag catcacaaat ttcacaaata aggcattttt ttcactgcat tctagttttg 2280
gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat ctcaaatccc tcggaagctg 2340
cgcctgtctt aggttggagt gatacatttt tatcactttt acccgtcttt ggattaggca 2400
gtagctctga cggccctcct gtcttaggtt agtgaaaaat gtcactctct tacccgtcat 2460
tggctgtcca gcttagctcg caggggaggt ggtctggatc cgccggcacc ggtgtatacg 2520
ggaattcttt acgagggtag gaagtggtac ggaaagttgg tataagacaa aagtgttgtg 2580
gaattgaagt ttactcaaaa aatcagcact cttttatagg cgccctggtt tacataagca 2640
aagcttatac gttctctatc actgataggg agtaaactgg atatacgttc tctatcactg 2700
atagggagta aactgtagat acgttctcta tcactgatag ggagtaaact ggtcatacgt 2760
tctctatcac tgatagggag taaactcctt atacgttctc tatcactgat agggagtaaa 2820
gtctgcatac gttctctatc actgataggg agtaaactct tcatacgttc tctatcactg 2880
atagggagta aactcgaggt gataattcca cggggttggg gttgcgcctt ttccaaggca 2940
gccctgggtt tgcgcaggga cgcggctgct ctgggcgtgg ttccgggaaa cgcagcggcg 3000
ccgaccctgg gtctcgcaca ttcttcacgt ccgttcgcag cgtcacccgg atcttcgccg 3060
ctacccttgt gggccccccg gcgacgcttc ctgctccgcc cctaagtcgg gaaggttcct 3120
tgcggttcgc ggcgtgccgg acgtgacaaa cggaagccgc acgtctcact agtaccctcg 3180
cagacggaca gcgccaggga gcaatggcag cgcgccgacc gcgatgggct gtggccaata 3240
gcggctgctc agcagggcgc gccgagagca gcggccggga aggggcggtg cgggaggcgg 3300
ggtgtggggc ggtagtgtgg gccctgttcc tgcccgcgcg gtgttccgca ttctgcaagc 3360
ctccggagcg cacgtcggca gtcggctccc tcgttgaccg aatcaccgac ctctctcccc 3420
agggggatca tcgaattacc atgtctagac tggacaagag caaagtcata aactctgctc 3480
tggaattact caatggagtc ggtatcgaag gcctgacgac aaggaaactc gctcaaaagc 3540
tgggagttga gcagcctacc ctgtactggc acgtgaagaa caagcgggcc ctgctcgatg 3600
ccctgccaat cgagatgctg gacaggcatc atacccactc ctgccccctg gaaggcgagt 3660
catggcaaga ctttctgcgg aacaacgcca agtcataccg ctgtgctctc ctctcacatc 3720
gcgacggggc taaagtgcat ctcggcaccc gcccaacaga gaaacagtac gaaaccctgg 3780
aaaatcagct cgcgttcctg tgtcagcaag gcttctccct ggagaacgca ctgtacgctc 3840
tgtccgccgt gggccacttt acactgggct gcgtattgga ggaacaggag catcaagtag 3900
caaaagagga aagagagaca cctaccaccg attctatgcc cccacttctg aaacaagcaa 3960
ttgagctgtt cgaccggcag ggagccgaac ctgccttcct tttcggcctg gaactaatca 4020
tatgtggcct ggagaaacag ctaaagtgcg aaagcggcgg gccgaccgac gcccttgacg 4080
attttgactt agacatgctc ccagccgatg cccttgacga ctttgacctt gatatgctgc 4140
ctgctgacgc tcttgacgat tttgaccttg acatgctccc cgggtaaacg cgcgaatgtg 4200
tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg 4260
catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt 4320
atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc 4380
ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt 4440
atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc 4500
ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaacg cgaccatgac cgagtacaag cccacggtgc 4560
gcctcgccac ccgcgacgac gtcccccggg ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg 4620
actaccccgc cacgcgccac accgtcgacc cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc 4680
tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg 4740
acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg 4800
ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga 4860
tggaaggcct cctggcgccg caccggccca aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg 4920
gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg 4980
aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc 5040
ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca ccgccgacgt cgaggtgccc gaaggaccgc 5100
gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg cctgaacgcg tctggaacaa tcaacctctg 5160
gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta 5220
tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt 5280
ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc 5340
aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt 5400
gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg 5460
gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac 5520
aattccgtgg tgttgtcggg gaagctgacg tcctttccat ggctgctcgc ctgtgttgcc 5580
acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac 5640
cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct 5700
cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcctg gaattaattc tgcagtcgag 5760
acctagaaaa acatggagca atcacaagta gcaatacagc agctaccaat gctgattgtg 5820
cctggctaga agcacaagag gaggaggagg tgggtttttc cagtcacacc tcaggtacct 5880
ttaagaccaa tgacttacaa ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagagg 5940
ggactggaag ggctaattca ctcccaacga agacaagata tccttgatct gtggatctac 6000
cacacacaag gctacttccc tgattagcag aactacacac cagggccagg ggtcagatat 6060
ccactgacct ttggatggtg ctacaagcta gtaccagttg agccagataa ggtagaagag 6120
gccaataaag gagagaacac cagcttgtta caccctgtga gcctgcatgg gatggatgac 6180
ccggagagag aagtgttaga gtggaggttt gacagccgcc tagcatttca tcacgtggcc 6240
cgagagctgc atccggagta cttcaagaac tgctgatatc gagcttgcta caagggactt 6300
tccgctgggg actttccagg gaggcgtggc ctgggcggga ctggggagtg gcgagccctc 6360
agatcctgca tataagcagc tgctttttgc ctgtactggg tctctctggt tagaccagat 6420
ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt 6480
gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc 6540
cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt agtagttcat gtcatcttat 6600
tattcagtat ttataacttg caaagaaatg aatatcagag agtgagaggc cttgacattg 6660
ctagcgtttt accgtcgacc tctagctaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 6720
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 6780
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 6840
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 6900
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 6960
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 7020
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 7080
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 7140
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 7200
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 7260
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 7320
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 7380
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 7440
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 7500
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 7560
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 7620
gcaaacaaac caccgctggt agcggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 7680
aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 7740
aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 7800
ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 7860
acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 7920
ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 7980
gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 8040
taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 8100
tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 8160
gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 8220
cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 8280
aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 8340
cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 8400
tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 8460
gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 8520
tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 8580
gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 8640
ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 8700
cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 8760
agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 8820
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ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat 8940
aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat 9000
catgtctgga tcaactggat aactcaagct aaccaaaatc atcccaaact tcccacccca 9060
taccctatta ccactgccaa ttacctagtg gtttcattta ctctaaacct gtgattcctc 9120
tgaattattt tcattttaaa gaaattgtat ttgttaaata tgtactacaa acttagtagt 9180
ttttaaagaa attgtatttg ttaaatatgt actacaaact tagtagt 9227
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
tgatgccgtt cttctgcttg tc 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
gtgaagaatg tgcgagaccc 20

Claims (10)

1.一种重组慢病毒载体，其特征在于：所述重组慢病毒载体包括插入有绿色荧光基因EGFP、TGF-β1、嘌呤霉素抗性基因和Tet-on调控系统的钙调素依赖性蛋白激酶II基因的慢病毒载体，所述慢病毒载体选用Tet-On诱导表达慢病毒系统。
2.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于：所述重组慢病毒载体在原始载体pLVX-Tetone-puro的基础上进行改造。
3.一种重组慢病毒，其特征在于：所述重组慢病毒采用权利要求1或2所述的重组慢病毒载体与包装质粒共转染哺乳细胞制备得到。
4.根据权利要求3所述的重组慢病毒，其特征在于：所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种细胞。
5.权利要求1所述的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：将EGFP基因和TGF-β1基因分别克隆至慢病毒载体中，并通过2A进行串联，并由TRE3GS promoter启动子进行启动。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：
Figure FDA0003136726060000011
3G由强启动子hPGK promoter进行启动；嘌呤霉素抗性基因由强启动子SV40 promoter进行启动。
7.含权利要求1或2所述重组慢病毒载体或权利要求3所述的重组慢病毒的重组细胞。
8.根据权利要求7所述的重组细胞，其特征在于：所述重组细胞以人肝星形细胞LX-2为宿主。
9.一种应用，其特征在于：所述应用为权利要求1或2所述的重组慢病毒载体，或权利要求3或4所述的重组慢病毒，或权利要求7或8所述的重组细胞用于调控TGF-β1的表达或用于细胞功能相关基因的荧光检测。
10.一种应用，其特征在于：所述应用为权利要求1或2所述的重组慢病毒载体，或权利要求3或4所述的重组慢病毒，或权利要求7或8所述的重组细胞用于钙调蛋白相关基因或细胞内钙离子浓度的检测。
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