KR20220099944A - 유전자 요법으로 파킨슨병과 같은 시누클레인병증을 치료하는 데 사용하기 위한 바이러스 입자 - Google Patents

유전자 요법으로 파킨슨병과 같은 시누클레인병증을 치료하는 데 사용하기 위한 바이러스 입자 Download PDF

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페레즈 호세 루이스 란시에고
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푼다시온 파라 라 인베스티가시온 메디카 아플리카다
콘소르시오 센트로 데 인베스티카시온 비오메디카 엔 레드
유씨비 바이오파마 에스알엘
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Abstract

본 개시내용은 유전자 요법으로 시누클레인병증, 특히 산발성 파킨슨병을 치료하는 데 사용하기 위한 바이러스 입자에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 유전자 요법으로 시누클레인병증을 치료하는 데 사용하기 위한 바이러스 입자로서, 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase)를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 바이러스 입자에 관한 것이다.

Description

유전자 요법으로 파킨슨병과 같은 시누클레인병증을 치료하는 데 사용하기 위한 바이러스 입자
본 개시내용은 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase)를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 바이러스 입자, 및 유전자 요법으로 시누클레인병증, 특히 산발성 파킨슨병을 치료하는 데 있어서 이의 용도에 관한 것이다.
파킨슨병(PD)은 흑질 치밀부(SNc)로서 알려진 뇌 영역에서의 도파민 생성 뉴런의 손실을 특징으로 하는 끊임없는 신경퇴행성 장애이다. 이 신경 손실의 결과로서, 뇌 도파민 수준의 점진적인 감소가 있다. 감소된 도파민 수준은 기저회 회로의 기능장애를 유도하여, PD의 전형적인 주요 증상(떨림, 강직, 운동완서 및 자세 불안정)의 출현을 유발한다. 현재, 약리학적 치료(레보도파(levodopa) 및 도파민 아고니스트) 및 수술적 치료(뇌심부 자극) 둘 다가 이용될 수 있고, 이 치료들은 운동 증상 완화에 있어서 높은 효능을 보인다. 그러나, 파킨슨병은 SNc가 가장 먼저 영향을 받는 일반적인 신경퇴행성 장애이나, 이것으로 제한되지 않는다. 기존 치료적 접근법은 질환 진행을 늦추는 데 있어서 어떠한 효과도 없는 도파민 대증적 치료일 뿐이다.
PD 및 관련 시누클레인병증은 주로 산발성 뇌 장애(특발성 장애로서도 알려져 있음; 진단된 환자의 90% 내지 95% 이상을 차지함)이다. 소수의 환자에서만 유전적 배경이 밝혀졌다(가족 사례). 이 시누클레인병증의 출현과 관련된 유전자 돌연변이들(LRRK2, SNCA, PARKIN, DJ-1 등) 중에서 GBA1 유전자(1번 염색체에 위치하고 글루코세레브로시다제로서 알려진 라이소좀 효소를 코딩함)의 돌연변이가 단연코 가장 많은 돌연변이이고, 실제로 동형접합성 및 이형접합성 GBA1 돌연변이와, PD 및 루이체를 가진 치매(DLB)의 증가된 발병률 사이의 직접적인 유전적 연관성은 시드란스키(Sidransky)와 그의 동료들에 의해 명확하게 입증되었고(Sidransky E, et al. N Engl J Med 2009;361:1651-1661), 이때 PD에 대한 승산비는 5.43이다. GBA1 돌연변이와 DLB의 연관성은 PD보다 훨씬 더 강하다(8.28의 승산비). GBA1 돌연변이는 PD 및 DLB 발병 위험을 20배 내지 30배 증가시키는 반면, GBA1 돌연변이와 다계통 위축증(MSA) 사이의 연관성은 여전히 논란의 여지가 더 많다. GBA1 돌연변이와 시누클레인병증 사이의 이러한 직접적인 연관성의 존재는 글루코세레브로시다제(GCase) 결핍을 PD 및 DLB의 출현과 연관시키는 가장 강력한 주장이다. 그러나, GCase-알파-시누클레인 경로에 관여하는 기작의 관점에서, 알파-시누클레인 및 GCase 활성의 분해, 응집 및 세포내 처리가 얼마나 정확히 함께 커플링되는지는 실험적 증거가 제한된 이 분야에서 여전히 미해결된 문제이다.
현재까지, GCase 결핍을 알파-시누클레인과 연관시키는 세 가지 주요 가설이 제안되었다: 1) 잘못 폴딩된(예를 들면, GBA1 돌연변이 때문에 잘못 폴딩된) GCase에 의한 기능 획득은 알파-시누클레인과의 직접적인 상호작용을 야기하여, 궁극적으로 알파-시누클레인 응집 및 축적을 이끌어냄; 2) GCase의 기능 상실(잘못 폴딩된 효소의 분해 때문에 GCase 결핍)은 지질 항상성을 교란시킨 후 알파-시누클레인 수송, 처리 및 제거에 영향을 미치는 기질의 축적을 유발한다. 이것은 결과적으로 알파-시누클레인 응집을 촉진하고 올리고머 형성을 용이하게 함; 3) GCase 결핍이 알파-시누클레인 올리고머의 형성을 용이하게 하는 양방향 피드백 루프, 이때 이 올리고머는 정상 GCase 활성의 추가 감소를 유발하고, 이어서 이 추가 감소는 알파-시누클레인 올리고머의 형성을 촉진한다.
PD 환자의 5% 내지 10%가 GBA1 돌연변이를 보유하는 것으로 추정되었다. PD 환자의 이 하위군의 경우, GBA1 돌연변이의 존재는 심각한 GCase 기능 상실을 유도한다(정상 수준의 15% 이하의 잔류 GCase 활성을 남김). 이 GCase 기능 상실은 (일부 알려지지 않은 기작을 통해) 알파-시누클레인 응집을 유발하여, 궁극적으로 뉴런 사멸을 이끌어낸다. 산발성 PD 및 DLB를 가진 환자의 경우, (예를 들면, GBA1 돌연변이의 부재 하에서) 알파-시누클레인의 응집 그 자체도 GCase 기능 상실을 유도할 수 있다고 추정된다는 것도 주목할 만하지만(Gegg ME, et al., Ann Neurol 2012;72:455-463; Murphy KE, et al., Brain 2014;137:834-848; Alcalay RN et al., Brain 2015;138:2648-2658; Parnetti L, et al., Mov Disord 2014;29:1019-1027), 이 연관성에 대한 궁극적인 근거는 현재까지 실험적 증거가 거의 없기 때문에 밝혀지지 않은 상태로 남아 있다.
다시 말해, 산발성 시누클레인병증에 있어서 GCase 활성 향상의 잠재적 유용성은 재조합 효소의 전신 전달을 위해 임상전 연구에서 여전히 입증되어야 하는 상태로 남아 있다.
적어도 GBA1 돌연변이와 관련된 환자에서 알파-시누클레인 존재량을 감소시키기 위한 시도에서 GCase 활성의 향상은 어느 정도 조사되었다. 재조합 GCase 효소의 직접적인 보충(GCase 대체 요법)은 고셔병(Gaucher disease)의 성공적인 치료이었다(Weinreb NJ, et al., Am J Med 2002;113-112-119; Connock M, et al., Health Technol Assess 2006; 10:iii-iv,ix-136). 전신 전달된 재조합 GCase는 라이소좀에 국한되고 효소 활성을 상향조절하는 것으로 확인되었다. 그러나, 신경퇴행성 장애와 관련하여 이 접근법의 한계는 GCase가 GCase 뇌 활성을 변형시킬 정도의 유의미한 농도로 혈액 뇌 장벽을 횡단할 수 없다는 점이다. 대안적인 접근법은 재조합 GCase의 직접적인 척수강내 투여이다(Brady RO, Yang C, Zhuang Z. J Inherit Metab Dis 2013;36:451-454; LeBowitz J. A Proc Natl Acad Sci USA 2015;102:14485-14486). 그러나, 뉴런 조직에 깊이 침투하기에 충분한 농도 구배를 제공하는 척수강내 투여된 GCase의 능력에 대해서는 의문의 여지가 있다.
다른 접근법은 GBA1 돌연변이 보인자에서 PD의 병원성 기작으로서 글루코실세라마이드 축적에 초점을 맞추었다(Sardi SP, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2013;110:3537-3542). GCase 기질 억제는 시누클레인 과다발현 세포주에서 알파-시누클레인 수준을 감소시키는 것으로 보인다(Sardi SP, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2013;110:3537-3542). 게다가, 글루코실세라마이드 합성효소의 가역적 억제제인 미글루스타트(miglustat)는 그 효능 및 부작용 프로파일에 대한 우려가 존재하지만 고셔병 III형과 관련하여 사용되었다. 다른 두 가지 글루코실세라마이드 합성효소 억제제인 엘리글루스타트(eliglustat)와 벤글루스타트(venglustat)는 고셔병(ClinicalTrials.gov 식별번호 NCT00891202) 및 PD(ClinicalTrials.gov 식별번호 NCT02906020)의 임상 시험에서 평가를 받고 있다.
GCase 샤페론도 ER로부터 라이소좀으로의 GCase 수송을 촉진하는 데 사용되었다. 이소파고민(Isofagomine)이 가장 먼저 시험된 샤페론이었지만, 아마도 이 샤페론이 GCase의 활성 부위에 너무 높은 친화성으로 결합함으로써, 라이소좀 내부의 효소 활성을 억제한다는 사실로 인해 고셔병과 관련하여 이 화합물의 임상 시험은 성공하지 못하였다. 이 문제를 피하기 위해, PD에서 잠재적인 신경보호제로서 GCase의 다수의 신규 비억제성 소분자 샤페론들이 현재 개발 중이다(Mazzuli JR, et al. J Neurosci 2016;36:7693-7706). 현재, PD에서 가장 가능성이 높은 GCase 소분자 샤페론 후보물질은 암브록솔(ambroxol)이다. 마우스에서, GCase 활성은 암브록솔로 치료하였을 때 증가하였고(Migdalska-Richards A, Daly L, Bezard E, Schapira AH. Ann Neurol 2016;80:766-775), 이것은 비인간 영장류에서도 마찬가지이지만, 더 높은 용량에서만 마찬가지였다(Migdalska-Richards A, Ko WKD, Li Q et al. Synapse 2017;256:e21967). PD에서 암브록솔의 두 가지 II 상 임상 시험이 진행 중이다(ClinicalTrials.gov 식별번호 NCT02941822 및 NCT02914366).
GBA1을 사용한 유전자 요법은 마우스에서만 보고되었다. 래트에서 GBA1 및 돌연변이된 알파-시누클레인을 코딩하는 아데노 관련 바이러스 벡터의 공-주사는 도파민작용성 뉴런이 신경퇴행되는 것을 예방하였다(Rocha EM, et al., Neurobiol Dis 2015;82:495-503). 그러나, 일단 시누클레인병증이 이미 자리를 잡으면, AAV-GBA1의 유용성은 이 연구에서 확인되지 않았다. 더욱이, 알파-시누클레인 트랜스제닉 마우스에서 GBA1 유전자를 코딩하는 AAV9-PHP.B로서 알려진 혈액-뇌 장벽(BBB) 침투성 AAV 변이체의 사용은 마우스 뇌 전체에 걸쳐 알파-시누클레인 응집체의 거의 완전한 제거를 야기하였다고 보고되었다(Morabito G, et al., Mol Ther 2017;25:2727-2742). 그러나, 저자들은 적절한 PD 유사 표현형을 결여하는 트랜스제닉 알파-시누클레인 마우스를 이 연구에 사용하였다. 더욱이, AAV9-PHP.B는 특정 마우스 품종에서만 작동하는 것으로 확인되었고 AAV9-PHP-B는 마모셋에서 혈액-뇌 장벽을 횡단하지 못한다.
인간 대상체에서 산발성 파킨슨병을 치료하기에 적합한 GBA1을 사용한 유전자 요법의 필요성은 여전히 남아 있다.
특히, 산발성 PD에 대한 질환 변형 요법은 GCase에 의해 유도된 응집된 알파-시누클레인의 제거가 도파민작용성 뉴런에 대한 신경보호성을 나타내고 알파-시누클레인의 뉴런 횡단 통과(프리온 유사 확산)를 방해한다는 입증과 함께, GCase 활성의 바이러스 매개 향상이 질환의 초기 및 후기 둘 다에서 흑질 치밀부(SNc)의 도파민작용성 뉴런에서 알파-시누클레인 응집체의 제거를 유도한다는 원리 증명에 의해 뒷받침되어야 한다. 추가로, 산발성 PD에 대한 질환 변형 요법은 알파-시누클레인 응집에 의해 유발된 미세아교 유도 전구염증 현상의 약화에 의해서도 뒷받침되어야 한다.
본 발명은 널리 퍼진 시누클레인병증이 뇌 전체에 걸쳐 존재하는, 특히 대뇌 피질에 영향을 미치는 질환의 진행된 병기에서 환자의 파킨슨병을 치료하기 위한 유전자 요법에 사용할 바이러스 매개 GCase 활성 향상을 위한 바이러스 입자를 제공한다.
본 발명자들은 산발성 파킨슨병의 비인간 영장류 모델에서 입증된 바와 같이 상기 요건을 충족시키는 치료 전략을 디자인하였다.
따라서, 본 발명은 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 바이러스 입자, 및 시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 유전자 요법으로 시누클레인병증을 치료하는 데 있어서 이의 용도에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 상기 트랜스진은 a) 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 b) 서열번호 5, 6, 8, 17 또는 18을 포함하는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 핵산 구축물은 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하고, 이때 상기 프로모터는 상기 트랜스진이 적어도 흑질 치밀부(SNc)의 뉴런 세포 및 미세아교 세포; 및 바람직하게는 또한 적어도 흑질 치밀부, 대뇌 피질, 편도체, 및 시상의 미측 수질판내 핵을 포함하는 다른 뇌 영역의 뉴런 세포에서 발현될 수 있게 한다. 전형적으로, 상기 핵산 구축물은 편재성 프로모터, 예를 들면, GusB 프로모터, 특히 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 프로모터, 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터, 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터, 또는 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 인간 시냅신 1 프로모터(hSyn)의 조절 하에서 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 바이러스 입자는 적어도 뉴런 및 미세아교 세포를 동시에 표적화하는 바이러스 입자들 중에서 선택된 캡시드 단백질을 포함한다. 보다 구체적으로, 상기 바이러스 입자는 흑질 치밀부에서 적어도 도파민작용성 뉴런 및 미세아교 세포를 동시에 표적화하는 바이러스 입자들 중에서 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV2, AAV5, AAV9, AAV-MNM004, AAV-MNM008 및 AAV TT 혈청형으로 구성된 군으로부터 선택된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자들 중에서 선택된다.
보다 구체적인 실시양태에서, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 서열번호 14의 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하는 AAV TT 캡시드 단백질을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 바이러스 입자는
a) 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진으로서, 서열번호 19, 또는 서열번호 5 또는 8을 포함하는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스진;
b) 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결되어 있고 상기 트랜스진이 적어도 흑질 치밀부(SNc)의 뉴런 및 미세아교 세포에서 발현될 수 있게 하는 프로모터로서, 바람직하게는 서열번호 9 또는 21을 포함하는 CAG 프로모터, 서열번호 2 또는 20을 포함하는 GusB 프로모터, 서열번호 27을 포함하는 JeT 프로모터, 또는 서열번호 13을 포함하는 hSyn 프로모터인 프로모터;
c) 폴리아데닐화 신호 서열, 바람직하게는 서열번호 28 또는 3, 바람직하게는 서열번호 28을 포함하는 폴리아데닐화 신호 서열
을 포함하는 핵산 구축물을 포함하고;
이때, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV TT의 캡시드 단백질을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열번호 14, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자이고; 상기 핵산 구축물은 5' ITR 및 3' ITR 서열, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스의 5' ITR 및 3' ITR 서열, 보다 바람직하게는 AAV2 혈청형으로부터의 5' ITR 및 3' ITR 서열을 추가로 포함하는 바이러스 벡터에 포함되고, 5' ITR 및 3' ITR 서열은 각각 독립적으로 서열번호 15 또는 16의 서열, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되고, 바람직하게는 5' ITR은 서열번호 15를 포함하고, 3' ITR은 서열번호 16을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스 입자는 후향성 수송을 가진 바이러스 변이체 혈청형(AAVretro) 중에서 선택된 바이러스 캡시드 단백질을 포함한다.
전형적으로, 상기 AAVretro는 생체내 전파(dissemination) 어세이에서 확인될 때 비인간 영장류의 미상 또는 피각 핵에의 실질 주사 후 대뇌 피질, 바람직하게는 적어도 흑질 치밀부 및 대뇌 피질로 후향적으로 전파될 수 있다. 유리하게는, 비인간 영장류의 미상 피각 핵에 주사된 AAVretro는 적어도 흑질 치밀부, 대뇌 피질, 편도체, 및 시상의 미측 수질판내 핵을 포함하는, 미상 피각 핵을 신경지배하는 다른 뇌 영역으로도 후향적으로 전파될 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 하기 단계들을 포함하는 생체내 전파 어세이에 관한 것이다:
a) 상기 rAAV-GFP를 비인간 영장류의 후교련 피각 내로 실질내 주사함으로써 GFP(녹색 형광 단백질) 코딩 트랜스진을 포함하는 시험 rAAV(rAAV-GFP)를 주사하는 단계, 및
b) 주사한 지 1개월 후, 대뇌 피질, 바람직하게는 미상 피각 핵을 신경지배하는 뇌 영역, 보다 구체적으로 적어도 흑질 치밀부, 대뇌 피질, 편도체, 및 시상의 미측 수질판내 핵에서 GFP 발현 뉴런의 수를 카운팅하는 단계.
다른 실시양태에서, 상기 생체내 전파 어세이는 대뇌 피질, 바람직하게는 미상 피각 핵을 신경지배하는 뇌 영역의 표지부착된 뉴런의 퍼센트를, AAV-TT-GFP를 사용함으로써 수행된 대조군 실험과 비교하는 단계 c)를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스 입자는 유리하게는 적어도 전술된 생체내 전파 어세이에서 확인되었을 때 적어도 AAV-TT와 동일한 수준으로 대뇌 피질, 바람직하게는 적어도 흑질 치밀부 및 대뇌 피질로 전파될 수 있는 AAVretro 입자들 중에서 선택된다.
특정 실시양태에서, 상기 AAVretro 캡시드 단백질은 하기 변이체 혈청형들 중에서 선택된다: AAV-MNM004, AAV-MNM008 및 AAV-TT.
보다 구체적인 실시양태에서, 상기 AAVretro 입자는 바람직하게는 서열번호 14의 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하는 AAV TT 혈청형 캡시드 단백질을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 핵산 구축물은 폴리아데닐화 신호 서열, 특히 서열번호 3의 폴리아데닐화 신호 서열도 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 핵산 구축물은 5' ITR 및 3' ITR 서열, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스의 5' ITR 및 3' ITR 서열, 보다 바람직하게는 서열번호 15 및/또는 16의 서열, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성된, AAV2 혈청형으로부터의 5' ITR 및 3' ITR 서열을 추가로 포함하는 바이러스 벡터에 포함된다.
특정 실시양태에서, 상기 핵산 구축물은 서열번호 4의 핵산 서열, 또는 서열번호 4와 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 상기 핵산 구축물은 상기 인간 글루코세레브로시다제가 적어도 도파민작용성 뉴런 및 미세아교 세포 둘 다에서 발현될 수 있게 하는 프로모터의 조절 하에서 인간 글루코세레브로시다제의 코딩 서열을 포함하고, 상기 바이러스 입자는 적어도 흑질 치밀부의 도파민작용성 뉴런 및 미세아교 세포를 표적화하는 바이러스 입자, 전형적으로 AAV2, AAV5, AAV9, AAV-MNM004, AAV-MNM008 및 AAV TT 혈청형으로 구성된 군으로부터 선택된 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자 중에서 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 치료에 있어서, 바람직하게는 시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 유전자 요법으로 시누클레인병증을 치료하는 데 있어서 전술된 바이러스 입자의 용도에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 상기 시누클레인병증은 인간 산발성 시누클레인병증이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 시누클레인병증은 적어도 LRRK2, SNCA, VPS35, GCH1, ATXN2, DNAJC13, TMEM230, GIGYF2, HTRA2, RIC3, EIF4G1, UCHL1, CHCHD2, GBA1, PRKN, PINK1, DJ1, ATP13A2, PLA2G6, FBXO7, DNAJC6, SYNJ1, SPG11, VPS13C, PODXL, PTRHD1, RAB39B, DNAJC13, TMEM230, GIGYF2, HTRA2, RIC3, EIF4G1, UCHL1 및 CHCHD2로 구성된 군으로부터 선택된 유전자의 돌연변이와 관련되어 있지 않다. 바람직하게는, 상기 시누클레인병증은 파킨슨병, 전형적으로 산발성 파킨슨병이다.
특정 실시양태에서, 본 치료 방법에 따라 AAVretro 바이러스 입자를 사용할 때, 치료받는 상기 대상체는 진행된 병기의 시누클레인병증, 전형적으로 적어도 H-Y 3기의 파킨슨병을 가진 환자들 중에서 선택된다.
상기 바이러스 벡터는 바람직하게는 실질내 투여에 의해 상기 대상체에게, 보다 바람직하게는 흑질 치밀부 및/또는 미상 피각 핵의 뇌 영역에 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 신경병증성 고셔병을 치료하는 데 있어서 전술된 바이러스 입자의 용도에 관한 것이기도 하다.
도 1은 AAV-TT 캡시드 단백질 서열과 AAV-2의 아미노산 서열 정렬이다.
도 2는 AAV-TT 캡시드 단백질 서열과 AAV-9의 아미노산 서열 정렬이다.
도 3은 마우스에서 수행된 실험 접근법을 요약하는 밑그림이다.
도 4는 각각 rAAV9-null(트랜스진 없음) 및 rAAV9-GBA1 입자를 받은 좌측 및 우측 SNc에서 GCase(좌측 패널) 및 알파-시누클레인(우측 패널)에 대한 단백질 수준을 보여주는 웨스턴 블롯의 사진이다. 수득된 결과는 GCase 발현이 알파-시누클레인 감소를 야기하였음을 보여주었다.
도 5는 SNc에서 TH+ 뉴런의 뉴런 밀도의 비편향된 입체논리적 추정을 보여주는 히스토그램이다. 수득된 결과는 GCase 효소 활성의 AAV-GBA1 매개 향상 시 알파-시누클레인 제거가 도파민작용성 뉴런에 대한 현저한 신경보호 효과를 유도하였음을 보여주었다.
도 6은 rAAV2/9-GBA1(첫 번째 예에서 rAAV9로서도 지칭됨)(좌측 SNc에 주사됨)을 사용하여 비인간 영장류(NHP)에서 수행한 실험적 접근법을 요약하는 밑그림이다.
도 7은 rAAV9-GBA1이 좌측 SNc에 주사된 NHP에 대한 수득된 microPET 스캔의 대표적인 영상으로서 후교련 피각 및 미상 핵의 수준에서 촬영된 관상 뇌 박편을 보여준다.
도 8은 rAAV9-GBA1이 좌측 SNc에 주사된 4마리의 NHP의 SNc에서 TH+ 뉴런 밀도의 비편향된 입체논리적 추정 후 수득된 결과를 보여주는 히스토그램이다. 한 마리 동물에서 정량을 수행하였다. 38.1%의 SNc 뉴런은 rAAV9-SynA53T 전달로부터 3개월 후 사멸하였는데, 이것은 좌측 SNc(즉, rAAV9-GBA1로 치료받은 SNc)에서 관찰된 14.9%의 뉴런 사멸과 대조된다.
도 9: 수행된 실험 계획을 요약하는 밑그림.
도 10은 인산화된 알파-시누클레인의 면역조직화학적 검출을 보여주는, 선조체 및 대뇌 피질을 통해 마우스 뇌의 관상 박편으로부터 촬영된 현미경사진이다. 대뇌 피질의 수준에서 알파-시누클레인 존재량의 분명한 감소는 AAV2-retro-GBA1(GusB 프로모터)이 주사된 선조체에 동측으로 위치된 대뇌 피질에서 보인다. 우측 대뇌 피질, 즉 먼저 AAV2-retro-SynA53T로 치료받은 후 AAV2-retro-null(GusB 프로모터)로 치료받은 뇌 쪽과 비교될 때 분명한 차이가 관찰되었다. 수득된 데이터는 파종성 시누클레인병증의 치료를 위한, GBA1 유전자를 코딩하는 후향적 확산 바이러스 벡터의 용도를 뒷받침한다.
도 11은 (좌측 후교련 피각에 주사된) rAAV-TT-GBA1을 사용하여 비인간 영장류(NHP)에서 수행한 실험 접근법을 요약하는 밑그림이다.
도 12는 rAAV-TT-GBA1이 후교련 피각에 주사된 NHP에 대해 수득된 microPET 스캔의 대표적인 영상으로서 후교련 피각 및 미상 핵의 수준에서 촬영된 관상 뇌 박편을 보여준다(상부 패널). 평균적으로, 11C-DTBZ 결합력의 24.44% 증가가 좌측 후교련 피각(예를 들면, rAAV-TT-GBA1이 주사된 피각)에서 관찰되었다(하부 패널).
도 13은 rAAV-TT-GBA1이 좌측 후교련 피각에 주사된 4 마리의 NHP의 SNc에서 TH+ 뉴런의 수를 자동 카운팅한 후 수득된 결과를 보여주는 히스토그램이다. 정량을 4 마리의 NHP에서 수행함으로써, 좌측 SNc의 총 TH+ 뉴런 수가 우측 SNc(예를 들면, rAAV-TT-GBA1의 피각내 전달로 치료받지 않은 SNc)에서 관찰된 TH+ 뉴런 수보다 22.3% 더 높았음을 보여주었다. *는 통계적 유의성 p < 0.05를 표시한다.
도 14는 rAAV-TT-GBA1이 좌측 후교련 피각에 주사된 4 마리의 NHP의 좌측 및 우측 후교련 피각 내로의 TH 염색에 대한 광학 밀도(OD)를 자동 측정한 후 수득된 결과를 보여주는 히스토그램이다. 정량은 평균 OD가 좌측 후교련 피각(rAAV-TT-GBA1의 피각내 전달로 치료받은 후교련 피각)에 비해 우측 후교련 피각에서 27.42% 더 낮았음을 보여주었다. ***는 통계적 유의성 p < 0.001을 표시한다.
도 15는 rAAV-TT-GBA1이 좌측 후교련 피각에 주사된 4 마리의 NHP의 SNc에서 알파-시누클레인 발현 뉴런 수를 자동 카운팅한 후 수득된 결과를 보여주는 히스토그램이다. 정량을 4마리의 NHP에서 수행함으로써, 좌측 SNc의 알파-시누클레인 발현 뉴런의 총수가 우측 SNc(rAAV-TT-GBA1의 피각내 전달로 치료받지 않은 SNc)에서 관찰된 알파-시누클레인 양성 뉴런의 수보다 38.3% 더 낮았음을 보여주었다. *는 통계적 유의성 p < 0.05를 표시하고, **는 통계적 유의성 p < 0.001을 표시하고, ***는 통계적 유의성 p < 0.001을 표시한다. ns: 통계적 유의성 없음.
도 16은 시험된 동물의 좌측 대 우측 SNc에서 TH+ 뉴런(흑색 막대)와 a-Syn+ 뉴런(백색 막대) 사이의 비교 시 차이를 보여주는 히스토그램이다. 퍼센트는 TH+ 뉴런 중 a-Syn+ 뉴런의 퍼센트를 표시한다. 알파-시누클레인 발현 뉴런의 퍼센트는 우측 SNc(치료받지 않은 쪽)보다 좌측 SNc(예를 들면, AAV-TT-GBA1이 주사된 후교련 피각에 동측으로 위치된 SNc)에서 일관되게 더 낮다. 이것은 좌측 SNc에서의 뉴런 생존이 더 높다는 것뿐만 아니라, 생존 TH+ 뉴런 중 a-Syn+이 더 적다는 것도 보여준다.
도 17: 뇌실조영술 보조 입체정위 수술 동안 모든 AAV들에 대한 주사 부위를 보여주는 시상봉합 Rx 플레이트.
도 18: 모든 AAV들에 대한 주사 부위를 보여주는 대표적인 현미경사진.
도 19: GFP+ 뉴런의 정확한 위치와 함께, 모든 동물들에 대한 주사 부위를 보여주는 밑그림(A: M295 및 296, B: 297 및 298).
도 20: 동물 M295(A) 및 M296(B)(AAV-TT-GFP가 주사됨)에서 GFP+ 뉴런의 생체분포 및 추정된 강도. 작은 크기의 점("낮음"으로서 표지부착됨)은 1개 내지 200개의 GFP+ 세포를 표시하고; 중간 크기의 점("중간"으로서 표지부착됨)은 201개 내지 400개의 GFP+ 세포를 표시하고; 큰 크기의 점("높음"으로서 표지부착됨)은 401개 이상의 GFP+ 세포를 표시한다.
도 21: 동물 M297(A) 및 M298(B)(AAV-9-GFP가 주사됨)에서 GFP+ 뉴런의 생체분포 및 추정된 강도. 작은 크기의 점("낮음"으로서 표지부착됨)은 1개 내지 200개의 GFP+ 세포를 표시하고; 중간 크기의 점("중간"으로서 표지부착됨)은 201개 내지 400개의 GFP+ 세포를 표시하고; 큰 크기의 점("높음"으로서 표지부착됨)은 401개 이상의 GFP+ 세포를 표시한다.
도 22: 정량. 모든 동물들에 대한 GFP+ 뉴런의 총수를 보여주는 히스토그램.
도 23: 정량. 다수의 관심 있는 영역들에 걸쳐 모든 동물들에 대한 GFP+ 뉴런의 수를 보여주는 히스토그램. 약어: 전방 대상회(AcGg), 상전두회(SFG), 전중심(PrG), 중심후회(PoG), 도회(Ing), 중심정중앙-다발곁 복합체(CM-Pf), 흑질 치밀부(SNc).
도 24: 정량. 좌측 반구의 다수의 관심 있는 영역들에 걸쳐 모든 동물들에 대한 GFP+ 뉴런의 문미(rostrocaudal) 분포를 보여주는 그래프. 약어: 전방 대상회(AcGg), 상전두회(SFG), 전중심(PrG), 중심후회(PoG), 도회(Ing), 중심정중앙-다발곁 복합체(CM-Pf), 흑질 치밀부(SNc).
도 25: 정량. 우측 반구의 다수의 관심 있는 영역들에 걸쳐 모든 동물들에 대한 GFP+ 뉴런의 문미 분포를 보여주는 그래프. 약어: 전방 대상회(AcGg), 상전두회(SFG), 전중심(PrG), 중심후회(PoG), 흑질 치밀부(SNc).
도 26: 수행된 실험의 작업계획.
도 27: 기준 시점, 및 AAV9-SynA53T의 주사 후 4주, 8주 및 12주에서 수행된, 11C-DTBZ를 사용한 MicroPET 스캔. (전형적으로 5개 내지 9개의 상이한 박편을 사용하여) 후교련 피각의 전체 문미 범위를 포함하는 관심 있는 영역을 통해 방사성추적자 결합력에 대한 값을 계산하였다.
도 28: 동물 군에 대한 평균 OD 값뿐만 아니라 개별적으로 고려될 때 각각의 동물에 대한 평균 OD 값도 보여주는 히스토그램. 후교련 피각의 수준에서 촬영된 대표적인 현미경사진도 포함되었다.
도 29: 후교련 피각의 문미 범위(0 더 문측에서 12 더 미측으로)를 통해 OD의 관찰된 변화를 보여주는 그래프. 좌측 피각과 우측 피각(예를 들면, 각각 GBA1 코딩 벡터로 치료받은 쪽과 치료받지 않은 쪽)의 비교에 의한 OD 차이는 음영으로 처리된 영역(AV-tt-GBA1 또는 AAV9-GBA1이 주사된 동물에 상응함)으로 도시되었다.
도 30: 두 동물 군에 대한 TH+ 세포 수뿐만 아니라, 개별적으로 고려될 때 각각의 동물에 대한 TH+ 세포 수도 보여주는 히스토그램. 각각의 동물 군을 전체로서 고려할 때 좌측 흑질 대 우측 흑질에 대한 평균 값은 통계적으로 유의미하다. Aiforia®에 의해 수행된 분석을 더 시각적인 방식으로 예시하기 위해 좌측 흑질 및 우측 흑질의 수준에서 촬영된 대표적인 현미경사진도 포함되었다.
도 31: 흑질의 문미 범위(0 더 문측에서 12 더 미측으로)를 통해 TH+ 세포 수의 관찰된 변화를 보여주는 그래프. 좌측 흑질과 우측 흑질(예를 들면, 각각 GBA1 코딩 벡터를 사용한 주사에 동측으로 위치된 쪽과 주사되지 않은 쪽)을 비교할 때 관찰된 차이는 음영으로 처리된 영역(AAV-TT-GBA1 또는 AAV9-GBA1이 주사된 동물에 상응함)으로 도시되었다.
도 32: 두 동물 군에 대한 α-syn+ 세포 수뿐만 아니라, 개별적으로 고려될 때 각각의 동물에 대한 α-syn+ 세포 수도 보여주는 히스토그램. 각각의 동물 군을 전체로서 고려할 때 좌측 흑질 대 우측 흑질에 대한 평균 값은 통계적으로 유의미하다. 개별 수준에서 동물 M280, M282 및 M287(모두 AAV-TT-GBA1로 치료받음)도 통계적 유의성에 도달하였지만, 동물 M283은 도달하지 못하였다. AAV9-GBA1이 주사된 동물의 경우, 동물 M286에서만 통계적 유의성이 관찰되었다. Aiforia®에 의해 수행된 분석을 더 시각적인 방식으로 예시하기 위해 좌측 흑질 및 우측 흑질의 수준에서 촬영된 대표적인 현미경사진도 포함되었다.
도 33: 흑질의 문미 범위(0 더 문측에서 12 더 미측으로)를 통해 α-syn+ 세포 수의 관찰된 변화를 보여주는 그래프. 좌측 흑질과 우측 흑질(예를 들면, 각각 GBA1 코딩 벡터를 사용한 주사에 동측으로 위치된 쪽과 주사되지 않은 쪽)을 비교할 때 관찰된 차이는 음영으로 처리된 영역(AAV-TT-GBA1 또는 AAV9-GBA1이 주사된 동물에 상응함)으로 도시되었다.
도 34: TH+ 세포와 α-syn+ 세포(각각 TH 및 SYN) 사이의 관찰된 비를 보여주는 히스토그램.
본 발명자들은 유전자 요법으로 시누클레인병증, 보다 구체적으로 파킨슨병, 특히 산발성 파킨슨병을 치료하는 새로운 치료 전략을 확인하였다.
따라서, 본 개시내용은 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 바이러스 벡터 또는 핵산 구축물을 포함하는 바이러스 입자, 및 시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 유전자 요법으로 시누클레인병증, 예컨대, 파킨슨병 또는 신경병증성 고셔병을 치료하는 데 있어서 이의 용도에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스 입자"는 (i) (ii) 캡시드 내에 팩키징된 바이러스 벡터 및 임의적으로 (iii) 상기 캡시드를 둘러싸는 지질성 외피를 포함하는 감염성 및 전형적으로 복제 결함 바이러스 입자에 관한 것이다.
용어 "바이러스 벡터"는 전형적으로 캡시드 내에 팩키징되어 있는, 본원에 개시된 바이러스 입자의 핵산 부분을 지칭한다.
따라서, 상기 바이러스 벡터는 전형적으로 적어도 (i) 트랜스진, 및 유전자 요법에 의해 치료된 숙주에서의 이의 발현에 적합한 핵산 요소를 포함하는 핵산 구축물, 및 (ii) 바이러스 게놈의 전부 또는 일부, 예를 들면, 바이러스 게놈의 역위 말단 반복부를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 구축물"은 재조합 DNA 기술의 이용으로부터 생성된 비천연 생성 핵산을 지칭한다. 특히, 핵산 구축물은 자연계에 존재하지 않을 방식으로 조합되어 있거나 병치되어 있는, 핵산 서열의 분절들을 함유하도록 변형된 핵산 분자이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "트랜스진"은 유전자 요법에서 활성 주성분으로서 사용될 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 분자(또는 간단히 핵산), DNA 또는 cDNA를 지칭한다. 상기 유전자 생성물은 RNA, 펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드 서열"은 단량체성 뉴클레오타이드로 구성되거나 이를 포함하는 임의의 분자를 지칭하기 위해 교환 가능하게 사용될 수 있다. 핵산은 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 화학적으로 변형된 또는 인공 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 펩타이드 핵산(PNA), 모르폴리노 및 잠긴 핵산(LNA)뿐만 아니라, 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스 핵산(TNA)도 포함한다. 이 서열들 각각은 분자의 골격의 변화에 의해 천연 생성 DNA 또는 RNA와 구별된다. 또한, 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드가 사용될 수 있다. 다른 데옥시뉴클레오타이드 유사체는 본 발명의 뉴클레오타이드에서 사용될 수 있는 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트, 포스포로디티오에이트, N3'P5'-포스포라미데이트 및 올리고리보뉴클레오타이드 포스포로티오에이트, 및 이들의 2'-0-알릴 유사체 및 2'-0-메틸리보뉴클레오타이드 메틸포스포네이트를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "역위 말단 반복부(ITR)"는 DNA 복제의 시작 동안 프라이머로서 작용하는 T 모양 헤어핀 구조를 형성하도록 접혀질 수 있는 팔린드로믹(palindromic) 서열을 함유하는, 바이러스의 5'-말단에 위치된 뉴클레오타이드 서열(5' ITR) 및 3'-말단에 위치된 뉴클레오타이드 서열(3' ITR)을 지칭한다. 이들은 숙주 게놈 내로의 바이러스 게놈 통합; 숙주 게놈으로부터의 레스큐(rescue); 및 성숙 비리온으로의 바이러스 핵산의 캡시드화(encapsidation)를 위해서도 필요하다. ITR은 바이러스 게놈 복제 및 바이러스 입자 내로의 그의 팩키징을 위해 시스로(in cis) 요구된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 다른 요소를 배제하지 않는다. 본 개시내용의 목적상, 용어 "로 구성된"은 용어 "포함하는"의 바람직한 실시양태인 것으로 간주된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "주목할 만한", "전형적으로" 또는 "특히"는 여러 실시양태들 중에서 한 대안을 지칭하기 위해 교환 가능하게 사용되고, 용어 "바람직하게는"은 바람직한 실시양태를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, SNc는 흑질 치밀부(SNc)의 두문자어이다.
본 개시내용의 핵산 구축물
본 개시내용에 따른 핵산 구축물은 트랜스진, 및 적어도 본 개시내용의 바이러스 벡터를 사용한 유전자 요법에 의해 치료된 상기 숙주에서의 이의 발현에 적합한 핵산 요소를 포함한다.
예를 들면, 상기 핵산 구축물은 글루코세레브로시다제의 코딩 서열로 구성된 트랜스진, 및 관련 세포 유형 또는 조직에서 상기 코딩 서열을 발현시키기 위해 요구된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다. 일반적으로, 핵산 구축물은 코딩 서열, 및 선택된 유전자 생성물의 발현을 위해 요구되는, 상기 코딩 서열 앞의 조절 서열(5' 비-코딩 서열) 및 상기 코딩 서열 뒤의 조절 서열(3' 비-코딩 서열)을 포함한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 상기 핵산 구축물은 적어도 (i) (ii) 프로모터의 조절 하에서 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진, 및 (iii) 통상적으로 폴리아데닐화 부위 및/또는 전사 터미네이터(terminator)를 함유하는 3' 비번역 영역을 포함한다. 핵산 구축물은 추가 조절 요소, 예를 들면, 인핸서 서열, 인트론, microRNA 표적화 서열, 벡터 내로의 DNA 단편의 삽입을 용이하게 하는 폴리링커 서열, 및/또는 스플라이싱 신호 서열도 포함할 수 있다.
특정 핵산 구축물은 이하에 개시된 바와 같이 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열의 일부를 포함하는 트랜스진을 포함하고, 이러한 특정 핵산 구축물을 포함하는 벡터 또는 입자도 본 개시내용의 일부이다.
글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진
특히, 본 개시내용에 따른 핵산 구축물은 글루코세레브로시다제를 코딩하는, 바람직하게는 서열번호 5, 6, 8, 17 또는 18을 포함하는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는, 바람직하게는 (이소폼 1로서도 알려져 있는) 서열번호 5, 6 또는 8을 포함하는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "글루코세레브로시다제"는 세포막(특히, 피부 세포)에 풍부한 당지질 대사의 중간체인 화학물질 글루코세레브로사이드의 베타-글루코시드 결합을 가수분해로 절단하는 데 필요한 글루코실세라미다제 활성을 가진 효소(EC 3.2.1.45)인 β-글루코세레브로시다제(산 β-글루코시다제, D-글루코실-N-아실스핑고신 글루코하이드롤라제 또는 GCase로서도 지칭됨)를 지칭한다. 용어 "글루코세레브로시다제"는 상기 효소 및 임의의 추가 공-번역 또는 번역 후 변형물을 지칭한다.
인간 글루코세레브로시다제는 글루코세레브로시다제의 3개의 상이한 이소폼(이소폼 1(서열번호 5), 이소폼 2(서열번호 17) 및 이소폼 3(서열번호 18))을 코딩하는 5개의 대안적으로 스플라이싱된 mRNA들을 생성하는 인간의 GBA1 유전자에 의해 천연적으로 코딩된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "글루코세레브로시다제"는 글루코세레브로시다제의 3개의 이소폼을 지칭한다. 인간 GBA1 mRNA 이소폼 1의 코딩 서열 부분 CDS(진뱅크 기준 M19285.1:123-1733)에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7로 표시된다.
특정 실시양태에서, 상기 핵산 구축물은 천연 생성 또는 재조합 글루코세레브로시다제의 코딩 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 코딩 핵산 서열의 전부 또는 일부(적어도 1000개, 1100개, 1500개, 2000개, 2500개 또는 적어도 1500개의 뉴클레오타이드)를 포함한다. 천연 생성 글루코세레브로시다제는 공지되어 있는 인간, 영장류, 뮤린 또는 다른 포유동물 글루코세레브로시다제, 전형적으로 서열번호 5, 17 또는 18의 인간 글루코세레브로시다제를 포함한다.
재조합 글루코세레브로시다제의 예는 이미글루세라제(imiglucerase)(Cerezyme), 벨라글루세라제(velaglucerase)(Vpriv) 및 탈리글루세라제(taliglucerase)(Elelyso)를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 핵산 구축물은 서열번호 5, 6, 8, 17 또는 18을 포함하는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진, 예를 들면, 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 서열로 표시된 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 적어도 75%, 적어도 80% 또는 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열로 구성된 변이체 트랜스진을 포함한다. 바람직하게는, 상기 트랜스진은 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 일부, 예를 들면, 최적화된 서열번호 1의 서열, 서열번호 7 또는 19의 영역 58 내지 1551, 서열번호 7 또는 19의 영역 58 내지 1611, 서열번호 7 또는 19의 영역 118 내지 1611을 포함한다. 한 실시양태에서, 서열번호 5, 6, 8, 17 또는 18의 일부를 코딩하거나, 인간 글루코세레브로시다제와 실질적으로 동일한 글루코세레브로시다제 활성을 가진, 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 적어도 75%, 적어도 80% 또는 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열로 구성된 상기 변이체 트랜스진. 특히, 변이체 핵산 구축물은 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 절두된 글루코세레브로시다제를 코딩한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열들의 정렬로부터 위치에서 일치(동일한 핵산 또는 아미노산 잔기)의 수를 지칭한다. 서열 동일성은 서열 갭을 최소화하면서 중첩 및 동일성을 최대화하도록 정렬될 때 서열들을 비교함으로써 측정된다. 구체적으로, 서열 동일성은 2개의 서열들의 길이에 따라 다수의 수학적인 전반적 또는 국소적 정렬 알고리즘들 중 임의의 정렬 알고리즘을 이용함으로써 측정될 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게는 전체 길이에 걸쳐 서열들을 최적으로 정렬하는 전반적 정렬 알고리즘(예를 들면, 니들만(Needleman)과 분슈(Wunsch) 알고리즘; Needleman and Wunsch, 1970, J Mol Biol.;48(3):443-53)을 이용함으로써 정렬되는 반면, 실질적으로 상이한 길이의 서열들은 바람직하게는 국소적 정렬 알고리즘(예를 들면, 스미스(Smith)와 워터만(Waterman) 알고리즘(Smith and Waterman, 1981, J Theor Biol.; 91(2):379-80) 또는 알츠슐(Altschul) 알고리즘(Altschul SF et al., 1997, Nucleic Acids Res.; 25(17):3389-402.; Altschul SF et al., 2005, Bioinformatics.; 21(8):1451-6)을 이용함으로써 정렬된다. 퍼센트 핵산 또는 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬은 당분야의 기술 내에 있는 다양한 방식들, 예를 들면, 웹 사이트(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)와 같은 인터넷 웹 사이트 상에서 입수될 수 있는 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용함으로써 달성될 수 있다. 당분야에서 숙련된 자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯한, 정렬을 측정하는 데 적당한 파라미터를 결정할 수 있다. 본원의 목적상, % 핵산 또는 아미노산 서열 동일성 값은 니들만-분슈 알고리즘을 이용하여 2개의 서열들의 최적 전반적 정렬을 생성하는 쌍별 서열 정렬 프로그램 EMBOSS Needle을 이용함으로써 생성된 값을 지칭하고, 이때 모든 검색 파라미터들은 디폴트 값, 즉 점수화 매트릭스 = BLOSUM62, 갭 개방 = 10, 갭 연장 = 0.5, 말단 갭 페널티 = 거짓, 말단 갭 개방 = 10 및 말단 갭 연장 = 0.5로 설정된다.
본 개시내용의 핵산 구축물과 함께 사용될 프로모터
한 실시양태에서, 핵산 구축물은 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 숙주 세포 내로 도입될 때 트랜스진 발현을 시작한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 작동 가능하게 연결된 핵산의 전사를 유도하는 조절 요소를 지칭한다. 프로모터는 작동 가능하게 연결된 핵산의 전사의 속도 및 효율 둘 다를 조절할 수 있다. 프로모터는 핵산의 프로모터 의존적 전사를 향상시키거나("인핸서") 억제하는("리프레서") 다른 조절 요소에도 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이 조절 요소는 전사 인자 결합 부위, 리프레서 및 활성화제 단백질 결합 부위, 및 프로모터로부터의 전사의 양을 조절하기 위해 직접 또는 간접적으로 작용하는 것으로 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는, 예를 들면, 어테뉴에이터(attenuator), 인핸서(enhancer) 및 사일런서(silencer)를 비롯한 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 프로모터는 동일한 가닥 상에서 DNA 서열의 업스트림(센스 가닥의 5' 영역 쪽)에 작동 가능하게 연결된 유전자 또는 코딩 서열의 전사 시작 부위 근처에 위치된다. 프로모터는 길이가 약 100개 내지 1000개 염기쌍일 수 있다. 프로모터의 위치는 특정 유전자에 대한 전사 시작 부위를 기준으로 표기된다(즉, 업스트림에서 위치는 -1부터 역으로 카운팅되는 음수임, 예를 들면, -100은 업스트림에서 100번째 염기쌍이 있는 위치임).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 폴리뉴클레오타이드(또는 폴리펩타이드) 요소들이 기능적 관계로 연결되어 있음을 지칭한다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여 있을 때 "작동 가능하게 연결된"다. 예를 들면, 프로모터 또는 전사 조절 서열은 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. "작동 가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열들이 전형적으로 인접해 있음을 의미하고; 2개의 단백질 코딩 영역들을 연결할 필요가 있는 경우, 이들은 인접하고 리딩 프레임 내에 존재한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 구축물은 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하고, 이때 상기 프로모터는 적어도 흑질 치밀부(SNc)의 도파민작용성 뉴런 및 미세아교 세포, 및 바람직하게는 또한 적어도 흑질 치밀부, 대뇌 피질, 편도체, 및 시상의 미측 수질판내 핵을 포함하는 다른 뇌 영역의 뉴런 세포에서 상기 트랜스진의 발현을 유도한다.
전형적으로, 이러한 프로모터는 조직 또는 세포 유형 특이적 프로모터, 또는 장기 특이적 프로모터, 또는 다수의 장기에 특이적인 프로모터, 또는 전신성 또는 편재성 프로모터일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "편재성 프로모터"는 보다 구체적으로 뇌의 다양한 상이한 세포들 또는 조직들, 예를 들면, 뉴런 및 아교 세포 둘 다, 보다 구체적으로 적어도 흑질 치밀부의 도파민작용성 뉴런 및 미세아교 세포, 및 바람직하게는 또한 적어도 흑질 치밀부, 대뇌 피질, 편도체, 및 시상의 미측 수질판내 핵을 포함하는 다른 뇌 영역의 뉴런 세포에서 활성을 띠는 프로모터를 의미한다.
적어도 흑질 치밀부의 뉴런 및 미세아교 세포에서 트랜스진을 발현시키는 데 적합한 프로모터의 예는 CMV 프로모터(Kaplitt 1994, Nat. Genet. 8:148-154), SV40 프로모터(Hamer 1979, Cell 17:725-735), 닭 베타 액틴(CBA) 프로모터(Miyazaki 1989, Gene 79:269-277), CAG 프로모터(Niwa 1991, Gene 108:193-199), b-글루쿠로니다제(glucuronidase) 프로모터(GusB)(Shipley 1991, Genetics 10:1009-1018), 연장 인자 1 알파 프로모터(EF1α)(Nakai 1998, Blood 91:4600-4607), 인간 시냅신 1 유전자 프로모터(hSyn)(Kugler S. et al. Gene Ther. 2003. 10(4):337-47) 또는 포스포글리세레이트 키나제 1 프로모터(PGK1) (Hannan 1993, Gene 130:233-239)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 상기 편재성 프로모터는 바람직하게는 서열번호 22 또는 23의 인간 유비퀴틴(ubiquitin) C(UbC) 프로모터, 바람직하게는 서열번호 24의 인간 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK) 프로모터, 및 서열번호 25 또는 26의 인간 CBA/CBh 프로모터로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 프로모터는 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 GusB 유전자 프로모터이다. 또 다른 실시양태에서, 프로모터는 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터이다. 또 다른 실시양태에서, 프로모터는 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터이다. 또 다른 실시양태에서, 프로모터는 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 hSyn 1 프로모터이다.
모든 이 프로모터 서열들은 상기 트랜스진이 적어도 흑질 치밀부의 뉴런 및 미세아교 세포에서 발현될 수 있게 하는 성질을 가진다.
바람직한 실시양태에서, 상기 핵산 구축물은 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진, 전형적으로 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 GusB 프로모터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 핵산 구축물은 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진, 전형적으로 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 핵산 구축물은 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진, 전형적으로 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 핵산 구축물은 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진, 전형적으로 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 hSyn 프로모터를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에 사용될 프로모터는 화학적 유도성 프로모터일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 화학적 유도성 프로모터는 화학적 유도제를, 프로모터의 조절을 필요로 하는 상기 대상체에게 생체내 투여함으로써 조절되는 프로모터이다. 적합한 화학적 유도성 프로모터의 예는 테트라사이클린(Tetracycline)/미노사이클린(Minocycline) 유도성 프로모터(Chtarto 2003, Neurosci Lett. 352:155-158) 또는 라파마이신(rapamycin) 유도성 시스템(Sanftner 2006, Mol Ther.13:167-174)을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시내용의 핵산 구축물과 함께 사용될 폴리아데닐화 서열
이 핵산 구축물 실시양태들 각각은 다른 임의적 뉴클레오타이드 요소와 함께 또는 이러한 요소 없이 폴리아데닐화 신호 서열도 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리아데닐화 신호" 또는 "폴리(A) 신호"는 전구체 mRNA 분자로 전사되고 유전자 전사의 종결을 안내하는, 유전자의 3' 비번역 영역(3' UTR) 내의 특정 인식 서열을 지칭한다. 폴리(A) 신호는 새로 형성된 전구체 mRNA를 그의 3'-말단에서 핵산내부분해로 절단하고 아데닌 염기만으로 구성된 RNA 스트레치를 이 3'-말단에 추가하기 위한 신호로서 작용한다(폴리아데닐화 과정; 폴리(A) 꼬리). 폴리(A) 꼬리는 mRNA의 핵 이출(export), 번역 및 안정성에 중요하다. 본 발명과 관련하여, 폴리아데닐화 신호는 포유동물 세포에서 포유동물 유전자 및/또는 바이러스 유전자의 폴리아데닐화를 유도할 수 있는 인식 서열이다.
폴리(A) 신호는 전형적으로 a) 전구메신저 RNA(전구-mRNA)의 3'-말단 절단 및 폴리아데닐화 둘 다를 위해 요구될 뿐만 아니라 다운스트림 전사 종결을 촉진하기 위해서도 요구되는 것으로 밝혀진 컨센서스 서열 AAUAAA, 및 b) 폴리(A) 신호로서의 AAUAAA의 이용 효율을 조절하는, AAUAAA의 업스트림 및 다운스트림에 있는 추가 요소로 구성된다. 포유동물 유전자에서 이 모티프들의 상당한 가변성이 있다.
한 실시양태에서, 임의적으로 앞서 또는 뒤에 기재된 다양한 실시양태들의 하나 이상의 특징을 겸비하는 본 발명의 핵산 구축물의 폴리아데닐화 신호 서열은 포유동물 유전자 또는 바이러스 유전자의 폴리아데닐화 신호 서열이다. 적합한 폴리아데닐화 신호는 특히 SV40 초기 폴리아데닐화 신호, SV40 후기 폴리아데닐화 신호, HSV 타이미딘 키나제 폴리아데닐화 신호, 프로타민 유전자 폴리아데닐화 신호, 아데노바이러스 5 EIb 폴리아데닐화 신호, 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, PBGD 폴리아데닐화 신호, 인 실리코(in silico) 디자인된 폴리아데닐화 신호(합성) 등을 포함한다.
특정 실시양태에서, 핵산 구축물의 폴리아데닐화 신호 서열은 인간 또는 소 성장 호르몬 유전자에 기반한 폴리아데닐화 신호 서열이다. 한 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호 서열은 소 성장 호르몬 유전자에 기반하고 서열번호 3을 포함하거나 이것으로 구성된다. 바람직한 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호 서열은 인간 성장 호르몬 유전자에 기반하고 서열번호 28을 포함하거나 이것으로 구성된다.
특정 실시양태에서, 바람직하게는 본 개시내용에 따라 사용될 핵산 구축물은 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 GBA1 유전자의 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 GusB 프로모터, 및 서열번호 28 또는 서열번호 3, 바람직하게는 서열번호 28을 포함하거나 이것으로 구성된 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 바람직하게는 본 개시내용에 따라 사용될 핵산 구축물은 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 GBA1 유전자의 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터, 및 서열번호 28 또는 서열번호 3, 바람직하게는 서열번호 28을 포함하거나 이것으로 구성된 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 바람직하게는 본 개시내용에 따라 사용될 핵산 구축물은 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 GBA1 유전자의 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 hSyn 1 프로모터, 및 서열번호 28 또는 서열번호 3, 바람직하게는 서열번호 28을 포함하거나 이것으로 구성된 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다.
다른 특정 실시양태에서, 바람직하게는 본 개시내용에 따라 사용될 핵산 구축물은 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 GBA1 유전자의 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터, 및 서열번호 28 또는 서열번호 3, 바람직하게는 서열번호 28을 포함하거나 이것으로 구성된 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 핵산 구축물은 a) 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 트랜스진으로서, 바람직하게는 상기 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 19를 포함하고, 인간 글루코세레브로시다제가 서열번호 5 또는 8을 포함하는 것인 트랜스진; b) 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터로서, 바람직하게는 i. 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터, 또는 ii. 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 hSyn 프로모터, 또는 iii. 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 GusB 프로모터, 또는 iv. 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터인 프로모터; 및 c) 폴리아데닐화 신호 서열, 바람직하게는 서열번호 28 또는 서열번호 3, 바람직하게는 서열번호 28을 포함하거나 이것으로 구성된 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다.
바이러스 벡터
본 개시내용의 바이러스 벡터는 전형적으로 적어도 (i) 트랜스진, 및 유전자 요법으로 치료받은 상기 숙주에서의 이의 발현에 적합한 핵산 요소를 포함하는 핵산 구축물, 및 (ii) 바이러스 게놈의 전부 또는 일부, 예를 들면, 적어도 바이러스 게놈의 역위 말단 반복부를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스 벡터는 바이러스의 5' ITR 및 3' ITR을 포함한다.
한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 파보바이러스(parvovirus)(특히 아데노 관련 바이러스), 아데노바이러스(adenovirus), 알파바이러스(alphavirus), 레트로바이러스(retrovirus)(특히 감마 레트로바이러스 및 렌티바이러스(lentivirus)), 헤르페스바이러스(herpesvirus) 및 SV40으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 바이러스의 5' ITR 및 3' ITR을 포함하고; 바람직한 실시양태에서, 바이러스는 아데노 관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스(Ad) 또는 렌티바이러스이다.
한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV의 5' ITR 및 3' ITR을 포함한다.
AAV는 인간 유전자 요법을 위한 잠재적 벡터로서 상당한 관심을 불러 일으켰다. 이 바이러스의 유리한 성질들 중에는 이 바이러스와 임의의 인간 질환의 연관성 결여, 분열 세포와 비분열 세포 둘 다를 감염시키는 그의 능력, 및 감염될 수 있는 상이한 조직들로부터 유래한 광범위한 세포주가 있다. AAV 게놈은 4681개의 염기를 함유하는 선형 단일 가닥 DNA 분자로 구성된다(Berns and Bohenzky, 1987, Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32:243-307). 게놈은 각각의 말단에서 역위 말단 반복부(ITR)를 포함하고, 이 반복부는 바이러스를 위한 DNA 복제 기점 및 팩키징 신호로서 시스로 작용한다. ITR은 길이가 대략 145 bp이다.
본 발명의 바이러스 벡터의 AAV ITR은 야생형 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있거나, 공지되어 있는 AAV ITR에 비해 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환, 전형적으로 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 뉴클레오타이드 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. AAV 벡터의 역위 말단 반복부(ITR)의 혈청형은 임의의 공지되어 있는 인간 또는 비인간 AAV 혈청형으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 임의의 AAV 혈청형의 ITR을 사용함으로써 수행될 수 있다. 공지되어 있는 AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3(3A형 및 3B형을 포함함), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 조류 AAV, 소과 동물 AAV, 갯과 동물 AAV, 말과 동물 AAV, 양과 동물 AAV를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 전술된 핵산 구축물은 혈청형 AAV2의 AAV의 5' ITR 및 3' ITR을 추가로 포함하는 상기 바이러스 벡터에 포함된다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 혈청형 AAV2의 AAV, 바람직하게는 서열번호 15 및/또는 16, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열의 5' ITR 및 3' ITR을 포함한다.
따라서, 보다 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 글루코세레브로시다제의 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 2 또는 20의 GusB 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하고, 상기 바이러스 벡터는 상기 핵산 구축물을 플랭킹하는 AAV ITR, 예컨대, AAV2, 바람직하게는 서열번호 15 및/또는 16, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열의 5' ITR 및 3' ITR을 추가로 포함한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 글루코세레브로시다제의 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하고, 상기 바이러스 벡터는 상기 핵산 구축물을 플랭킹하는 AAV ITR, 예컨대, AAV2, 바람직하게는 서열번호 15 및/또는 16, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열의 5' ITR 및 3' ITR을 추가로 포함한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 글루코세레브로시다제의 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 13의 hSyn 1 유전자 프로모터를 포함하거나 이것으로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하고, 상기 핵산 구축물을 플랭킹하는 AAV ITR, 예컨대, AAV2, 바람직하게는 서열번호 15 및/또는 16, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열의 5' ITR 및 3' ITR을 추가로 포함한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 글루코세레브로시다제의 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터를 포함하거나 이것으로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하고, 상기 핵산 구축물을 플랭킹하는 AAV ITR, 예컨대, AAV2, 바람직하게는 서열번호 15 및/또는 16, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열의 5' ITR 및 3' ITR을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 서열번호 4, 또는 서열번호 4와 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성된다.
바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 글루코세레브로시다제의 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, i. 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 GusB 프로모터; 또는 ii. 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터; 또는 iii. 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 hSyn 1 유전자 프로모터; 또는 iv. 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터를 포함하거나 이들로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하고, 상기 핵산 구축물을 플랭킹하는 AAV ITR, 예컨대, AAV2, 바람직하게는 서열번호 15 및/또는 16, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열의 5' ITR 및 3' ITR을 추가로 포함하고, 이때 보다 바람직하게는 5' ITR은 서열번호 15를 포함하거나 이것으로 구성되고, 3' ITR은 서열번호 16을 포함하거나 이것으로 구성되고; 본 개시내용의 바이러스 벡터는 서열번호 4, 또는 서열번호 4와 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성된다.
다른 한편으로, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 합성 5' ITR 및/또는 3' ITR을 사용함으로써 수행될 수 있고; 상이한 혈청형의 바이러스로부터 유래한 5' ITR 및 3' ITR을 사용함으로써 수행될 수도 있다. 바이러스 벡터 복제를 위해 요구되는 모든 다른 바이러스 유전자들은 이하에 기재된 바와 같이 바이러스 생성 세포(팩키징 세포) 내에 트랜스로(in trans) 제공될 수 있다. 따라서, 바이러스 벡터 내로의 이들의 포함은 임의적이다.
한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 바이러스의 5' ITR 및 3' ITR을 포함한다.
바이러스 입자
앞서 개시된 바이러스 벡터는 캡시드 단백질에 의해 형성된 캡시드 내로 팩키징됨으로써, 다음 단락에 기재된 바와 같이 바이러스 입자를 구성할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 캡시드는 이하 AAV 벡터 입자로서 지칭되는, 아데노 관련 바이러스의 캡시드 단백질로 형성된다.
본원에서 사용된 바와 같이, AAV는 적어도 AAV 게놈의 5' ITR 및 3' ITR, 및 아데노 관련 바이러스의 캡시드 단백질을 포함한다. 용어 AAV 벡터 입자는 임의의 재조합 AAV 벡터 입자(rAAV), 또는 공지되어 있는 rAAV의 유전자 조작에 의해 수득된 돌연변이체 AAV 벡터 입자를 포괄한다.
아데노 관련 바이러스의 바이러스 캡시드의 단백질은 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 포함한다. 다양한 AAV 혈청형들의 캡시드 단백질 서열들 사이의 차이는 세포 진입을 위한 상이한 세포 표면 수용체의 사용을 야기한다. 이것은 대안적 세포내 처리 경로와 함께 각각의 AAV 혈청형에 대한 상이한 조직 향성(tropism)을 발생시킨다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 AAV 바이러스 입자는 동일한 특정 혈청형의 AAV에 상응하는 천연 Cap 단백질에 의해 형성된 바이러스 입자 상의 특정 AAV 혈청형으로부터 유래한 AAV 벡터/게놈의 바이러스 벡터를 캡슐화함으로써 제조될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 천연 생성 AAV 바이러스 입자의 구조적 및 기능적 성질을 변형시키고 개선하기 위해 여러 기법들이 개발되었다(Bㆌnning H et al. J Gene Med 2008; 10: 717-733). 따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 AAV 바이러스 입자는 예를 들면, a) 동일하거나 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래한 캡시드 단백질로 구성된 바이러스 입자[예를 들면, AAV2 ITR 및 AAV9 캡시드 단백질; AAV2 ITR 및 AAV TT 캡시드 단백질, 또는 AAV2-retro, AAVMNM004 또는 AAVMNM008과 같은 AAVretro 혈청형으로부터의 다른 캡시드 단백질 등]; b) 상이한 AAV 혈청형들 또는 돌연변이체들로부터의 캡시드 단백질들의 혼합물로 구성된 모자이크 바이러스 입자[예를 들면, 2개 또는 다수의 AAV 혈청형들의 단백질에 의해 형성된 캡시드를 가진 AAV2 ITR]; c) 상이한 AAV 혈청형들 또는 변이체들 사이의 도메인 교환에 의해 절두된 캡시드 단백질로 구성된 키메라 바이러스 입자[예를 들면, AAV3 도메인을 가진 AAV5 캡시드 단백질을 가진 AAV2 ITR; 또는 d) 선택적 결합 도메인을 표시하여, 표적 세포 특이적 수용체와 엄격히 상호작용할 수 있게 하도록 조작된 표적화된 바이러스 입자로 팩키징된 소정의 AAV 혈청형의 ITR(들)에 의해 플랭킹된 글루코세레브로시다제를 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 구축물을 포함한다.
CNS를 표적화하는 AAV 기반 유전자 요법은 문헌[Pignataro D, Sucunza D, Rico AJ et al., J Neural Transm 2018;125:575-589]에서 이미 검토되었다. 보다 구체적으로, AAV 입자는 적어도 뉴런 및 미세아교 세포, 특히 적어도 뇌의 흑질 치밀부 영역(SNc) 내의 도파민작용성 뉴런 및 미세아교 세포를 표적화하도록 선택될 수 있고/있거나 조작될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 AAV 바이러스 입자의 사용을 위한 캡시드 단백질의 AAV 혈청형의 예는 AAV2, AAV5, AAV9, AAV2-retro, AAV MNM004, AAV MNM008 및 AAV TT를 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 캡시드 단백질의 상기 AAV 혈청형은 AAV9 및 AAV TT 혈청형으로부터 선택된다.
구체적인 실시양태에서, 임의적으로 앞서 또는 뒤에 기재된 다양한 실시양태들의 하나 이상의 특징을 겸비하는 바이러스 입자는, 바람직하게는 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 전술된 AAV 바이러스 벡터를 포함하고 AAV9 혈청형 또는 AAV TT 혈청형의 캡시드 단백질, 바람직하게는 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV TT 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV 바이러스 입자이다.
또 다른 특정 실시양태에서, 바이러스 입자는 적어도 도파민작용성 뉴런 및 미세아교 세포 둘 다에서 상기 인간 글루코세레브로시다제가 발현될 수 있게 하는 프로모터의 조절 하에서 인간 글루코세레브로시다제의 코딩 서열을 포함하는 핵산 구축물을 포함하고, 상기 바이러스 입자는 적어도 흑질 치밀부의 도파민작용성 뉴런 및 미세아교 세포를 표적화하는 바이러스 입자들, 전형적으로 AAV2, AAV5, AAV9, AAV2-retro, AAV MNM004, AAV MNM008 또는 AAV TT 혈청형으로 구성된 군으로부터 선택된 캡시드 단백질, 바람직하게는 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV TT 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자들 중에서 선택된다.
보다 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 이러한 재조합 AAV 바이러스 입자는 AAV9, AAV2-retro, AAV MNM004, AAV MNM008 또는 AAV TT 혈청형의 캡시드 단백질, 및 (i) 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 글루코세레브로시다제의 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 GusB 프로모터, 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터, 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 Jet 프로모터 및 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 hSyn 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는 핵산 구축물 및 (ii) 상기 핵산 구축물을 플랭킹하는 AAV ITR, 예컨대, AAV2의 5' ITR 및 3' ITR, 바람직하게는 서열번호 15 및/또는 16, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열의 5' ITR 및 3' ITR을 포함하는 AAV 바이러스 벡터를 포함한다.
보다 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 이러한 재조합 AAV 바이러스 입자는 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV TT 혈청형의 캡시드 단백질, 및 (i) 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 글루코세레브로시다제의 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 GusB 프로모터를 포함하는 핵산 구축물 및 (ii) 상기 핵산 구축물을 플랭킹하는 AAV ITR, 예컨대, AAV2의 5' ITR 및 3' ITR, 바람직하게는 서열번호 15 및/또는 16, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열의 5' ITR 및 3' ITR을 포함하는 AAV 바이러스 벡터를 포함한다.
보다 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 이러한 재조합 AAV 바이러스 입자는 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV TT 혈청형의 캡시드 단백질, 및 (i) 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 글루코세레브로시다제의 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터를 포함하는 핵산 구축물 및 (ii) 상기 핵산 구축물을 플랭킹하는 AAV ITR, 예컨대, AAV2의 5' ITR 및 3' ITR, 바람직하게는 서열번호 15 및/또는 16, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열의 5' ITR 및 3' ITR을 포함하는 AAV 바이러스 벡터를 포함한다.
보다 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 이러한 재조합 AAV 바이러스 입자는 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV TT 혈청형의 캡시드 단백질, 및 (i) 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 글루코세레브로시다제의 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 hSyn 프로모터를 포함하는 핵산 구축물 및 (ii) 상기 핵산 구축물을 플랭킹하는 AAV ITR, 예컨대, AAV2의 5' ITR 및 3' ITR, 바람직하게는 서열번호 15 및/또는 16, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열의 5' ITR 및 3' ITR을 포함하는 AAV 바이러스 벡터를 포함한다.
보다 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 이러한 재조합 AAV 바이러스 입자는 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV TT 혈청형의 캡시드 단백질, 및 (i) 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 글루코세레브로시다제의 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터를 포함하는 핵산 구축물 및 (ii) 상기 핵산 구축물을 플랭킹하는 AAV ITR, 예컨대, AAV2의 5' ITR 및 3' ITR, 바람직하게는 서열번호 15 및/또는 16, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열의 5' ITR 및 3' ITR을 포함하는 AAV 바이러스 벡터를 포함한다.
한 바람직한 실시양태에서, 바이러스 입자는
a) 서열번호 19 또는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 서열을 포함하는, 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진으로서, 인간 글루코세레브로시다제가 서열번호 5 또는 8을 포함하는 것인 트랜스진;
b) 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터로서, 바람직하게는 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터, 또는 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 GusB 프로모터, 또는 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터, 또는 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 hSyn 프로모터인 프로모터;
c) 폴리아데닐화 신호 서열, 바람직하게는 서열번호 28 또는 서열번호 3, 바람직하게는 서열번호 28을 포함하거나 이것으로 구성된 폴리아데닐화 신호 서열
을 포함하는 핵산 구축물을 포함하고,
상기 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV TT의 캡시드 단백질을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열번호 14, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자이고; 상기 핵산 구축물은 5' ITR 및 3' ITR 서열, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스의 5' ITR 및 3' ITR 서열, 보다 바람직하게는 AAV2 혈청형으로부터의 5' ITR 및 3' ITR 서열을 추가로 포함하는 바이러스 벡터에 포함되고, 5' ITR 및 3' ITR 서열은 각각 독립적으로 서열번호 15 또는 16의 서열, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되고, 이때 바람직하게는 5' ITR은 서열번호 15를 포함하고, 3' ITR은 서열번호 16을 포함한다.
재조합 AAV 바이러스 입자의 구축은 일반적으로 당분야에서 공지되어 있고, 예를 들면, 미국 특허 제5,173,414호 및 제5,139,941호; 국제 특허출원 공개 제WO 92/01070호 및 제WO 93/03769호; 문헌[Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996]; 문헌[Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; 문헌[Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539]; 문헌[Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129]; 및 문헌[Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801]에 기재되어 있다. 혈청형 AAV TT의 캡시드 단백질을 가진 바이러스 입자도 문헌[Tordo J, et al., Brain 2018;141:2014-2031]에 기재되어 있다.
후향성 수송을 가진 바이러스 입자
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 상기 바이러스 입자는 후향성 수송을 가진 바이러스 변이체 혈청형(AAVretro) 중에서 선택된다.
축삭 수송(종종 축삭원형질 수송 또는 축삭원형질 유동으로서도 지칭됨)은 세포 소기간 및 단백질이 소정의 뉴런의 세포체로부터 축삭 말단 종결부를 향해 이동하는 것(전향성 수송으로서도 알려져 있음)을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "후향성 수송"은 입자가 반대 방향, 즉 축삭 말단으로부터 모 세포체로 거꾸로 수송되는 것을 의미한다. 이와 관련하여, 향신경성(neurotropic) 바이러스(광견병 바이러스가 가장 좋은 예임)는 전형적으로 축삭 말단에 의해 흡수되고 후향성 수송을 이용함으로써 신경의 세포체로 수송된다.
AAVretro 입자의 예는 캡시드 단백질, 바람직하게는 AAV2-retro, AAV-TT, AAV-MNM004 및 AAV-MNM008의 캡시드 단백질, 보다 바람직하게는 AAV2-retro, AAV-TT, AAV-MNM004 및 AAV-MNM008의 VP1 캡시드 단백질을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
AAV2-retro 캡시드 단백질은 국제 특허출원 공개 제WO2017/218842A1호에 기재되어 있다.
바이러스 벡터가 바이러스 벡터의 후향성 확산을 통해 전달되는 영역을 신경지배하는 뉴런을 형질도입하기 위해 AAV-TT, AAV-MNM004 및 AAV-MNM008과 같은 다른 다양한 상이한 유형의 변형된 바이러스 캡시드도 디자인하였다.
AAV-MNM004 및 AAV-MNM008은 예를 들면, 문헌[Davidsson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Dec 9 2019 doi: 10.1073/pnas.1910061116] 및 국제 특허출원 공개 제WO2019/158619호에 기재되어 있다.
AAV2 진성 유형 캡시드로서도 명명된 AAV-TT 캡시드는 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO2015/121501호에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, AAV-TT VP1 캡시드 단백질은 AAV2 단백질 서열(NCBI 기준 서열: YP_680426.1)에서 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 상응하는 위치에서 야생형 AAV VP1 캡시드 단백질에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고: 125, 151, 162, 312, 457, 492, 499, 533, 546, 548, 585, 588 및/또는 593, 보다 구체적으로 AAV-TT는 야생형 AAV2 VP1 캡시드 단백질(NCBI 기준 서열: YP_680426.1)에 비해 하기 아미노산 치환들 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다: V125I, V151A, A162S, T205S, N312S, Q457M, S492A, E499D, F533Y, G546D, E548G, R585S, R588T 및/또는 A593S. 한 구체적인 실시양태에서, AAV-TT는 위치 457, 492, 499 및 533에서 야생형 AAV2 VP1 캡시드 단백질에 비해 4개 이상의 돌연변이를 포함한다.
추가 실시양태에서, AAV-TT 캡시드는 AAV2 이외의 AAV 혈청형으로부터 유래할 수 있고, 예를 들면, AAV1, AAV3B, AAV-LK03, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 또는 AAV10 캡시드 단백질로부터 유래할 수 있다. 구체적으로, AAV2에 대해 전술된 위치들에 상응하는 위치는 예를 들면, 도 1 및 2에서 제공된 바와 같이 서열 정렬에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 AAV-TT VP1 캡시드 단백질은 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 상기 AAVretro 바이러스 입자는 생체내 전파 어세이에서 확인될 때 비인간 영장류의 미상 또는 피각 핵에의 실질내 주사 후 대뇌 피질, 바람직하게는 적어도 흑질 치밀부 및 대뇌 피질로 후향적으로 전파될 수 있는 AAVretro 바이러스 입자들 중에서 선택된다.
보다 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 상기 AAVretro 바이러스 입자는 생체내 전파 어세이에서 확인될 때 비인간 영장류의 미상 또는 피각 핵에의 실질내 주사 후 적어도 AAV-TT와 동일한 수준으로 대뇌 피질, 바람직하게는 적어도 흑질 치밀부 및 대뇌 피질로 후향적으로 전파될 수 있는 AAVretro 바이러스 입자들 중에서 선택된다.
본 발명자들은 본원에 개시된 시누클레인병증, 예컨대, 파킨슨병을 치료하기 위한 유전자 요법에 사용하기 위해 진정한 후향성 수송을 가진 rAAV를 확인할 수 있고, 예를 들면, AAV-TT rAAV-GFP와 같은 양성 대조군과 비교할 수 있게 하는 생체내 전파 어세이를 실제로 디자인하였다.
상기 전파 어세이의 한 중요한 특징은 이것이 rAAV를 통과 섬유가 존재하지 않는 영역에 주사하는 비인간 영장류의 생체내 어세이라는 점이다. 따라서, 통과 섬유, 즉 더 먼 목적지를 향해 주사된 영역을 통과하는 섬유에 의해 거짓 양성 흡수가 수득될 수 없다. 비인간 영장류에서, 미상 및 피각 핵은 100% 실질 구조이므로, 통과 섬유를 함유하지 않는다. 따라서, 유리하게는, 후향성 수송을 가진 적합한 rAAV는 제안된 전파 어세이에 의해 본 개시내용에 따라 비교되고 선택될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 AAVretro 바이러스 입자는 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV TT 혈청형 캡시드 단백질을 포함하고, 생체내 전파 어세이에서 측정될 때 비인간 영장류의 미상 또는 피각 핵에의 실질내 주사 후 대뇌 피질, 바람직하게는 적어도 흑질 치밀부 및 대뇌 피질로 후향적으로 전파될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 생체내 전파 어세이는 하기 단계들을 포함한다:
a. 상기 rAAV-GFP를 비인간 영장류의 후교련 피각에 실질내 주사함으로써 GFP 코딩 트랜스진을 포함하는 시험 rAAV(rAAV-GFP)를 주사하는 단계;
b. 주사한 지 1개월 후 대뇌 피질, 바람직하게는 미상 피각 핵을 신경지배하는 뇌 영역에서 GFP 발현 뉴런의 수를 카운팅하는 단계.
GFP 코딩 트랜스진은 서열번호 10의 GFP 코딩 핵산, 또는 최적화된 서열 또는 절두된 형태를 가진 이의 기능적 변이체로부터 제조될 수 있다.
GFP를 발현하는 뉴런은 항-GFP 항체를 사용함으로써 면역퍼록시다제 염색에 의해 가시화될 수 있다. GFP 발현 뉴런은 유리하게는 주사된 비인간 영장류의 대뇌 피질 전체에 걸쳐 자동적으로 카운팅될 수 있다. GFP 양성 뉴런의 우선적인 국소화는 대뇌 피질의 심층에서 일어날 것으로 예상된다. GFP 발현 뉴런은 피질 영역 이외에, 주사된 후교련 피각 또는 미상 피각 핵을 신경지배하는 모든 뇌 영역들, 특히 적어도 흑질 치밀부, 편도체 및 미측 수질판내 핵에서 정량될 수도 있다.
한 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 AAVretro 바이러스 입자는 주사된 부위를 신경지배하는 대뇌 피질의 심층 V 및 VI의 뉴런의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 적어도 90%가 상기 생체내 전파 어세이에서 확인될 때 GFP를 발현하고 있는 AAVretro 바이러스 입자들 중에서 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 AAVretro 바이러스 입자는 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV TT 혈청형 캡시드 단백질을 포함하고, 주사된 부위를 신경지배하는 대뇌 피질의 심층 V 및 VI의 뉴런의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 적어도 90%는 상기 생체내 전파 어세이에서 확인될 때 GFP를 발현하고 있다.
보다 구체적인 실시양태에서, 전파 어세이는 실시예에 기재된 바와 같이 수행된다.
보다 구체적인 실시양태에서, 상기 생체내 전파 어세이는 하기 단계를 포함한다:
a. 상기 rAAV-GFP를 비인간 영장류의 후교련 피각에 실질내 주사함으로써 GFP 트랜스진을 포함하는 시험 rAAV를 주사하는 단계,
b. 주사한 지 1개월 후 대뇌 피질, 바람직하게는 미상 피각 핵을 신경지배하는 뇌 영역, 보다 바람직하게는 적어도 대뇌 피질, 흑질, 편도체 및 미측 수질판내 핵에서 GFP 발현 뉴런의 수를 카운팅하는 단계,
c. 대뇌 피질 내의 표지부착된 뉴런의 퍼센트를, AAV-TT-GFP를 사용함으로써 수행된 대조군 실험과 비교하는 단계.
다른 실시양태에서, 상기 AAVretro는 하기 변이체 혈청형들 중에서 선택된 캡시드 단백질을 포함한다: AAV2-retro, AAV-MNM004, AAV-MNM008 및 AAV-TT.
바람직한 실시양태에서, 상기 AAVretro 바이러스 입자는 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV TT 혈청형 캡시드 단백질을 포함한다.
파킨슨병의 최대 5개의 병기가 신경전문의에 의해 고전적으로 정의되었다(https://www.parkinson.org/Understanding-Parkinsons/What-is-Parkinsons/Stages-of-Parkinsons 참조). 가장 널리 이용되는 임상 평가 척도는 PD의 진행을 5개의 병기로 평가하는 소위 호엔야(Hoehn and Yahr)(H-Y) 병기이다: 1 및 2는 초기 병기를 표시하고, 2 및 3은 경미한 병기를 표시하고, 4 및 5는 진행된 병기를 표시한다.
유리하게는, 후향성 수송을 가진 바이러스 입자는 바이러스 입자가 진행된 질환 병기의 환자에서 전파된 알파-시누클레인 응집체를 가진 뇌 영역 전체에 걸쳐 글루코세레브로시다제를 발현할 수 있게 한다.
따라서, AAVretro 바이러스 입자, 바람직하게는 AAV TT 혈청형 캡시드 단백질, 보다 바람직하게는 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV TT 혈청형 캡시드 단백질을 포함하는 AAVretro 바이러스 입자는 바람직하게는 진행된 병기의 시누클레인병증, 전형적으로 적어도 H-Y 3기의 파킨슨병을 가진 환자를 치료하는 데 있어서 본 개시내용에 따라 사용되도록 선택될 것이다.
바이러스 입자를 제조하는 방법
상기 개시된 발현 바이러스 벡터를 보유하는 바이러스 입자의 생성은 생성되는 바이러스 입자의 실제 실시양태를 위해 선택된 구조적 특징을 고려함으로써 선택된 통상의 방법 및 프로토콜에 의해 수행될 수 있다.
요약하건대, 바이러스 입자는 헬퍼 벡터 또는 바이러스 또는 다른 DNA 구축물(들)의 존재 하에서 팩키징될 핵산 구축물 또는 바이러스 벡터에 의해 형질감염된 숙주 세포, 보다 구체적으로 특정 바이러스 생성 세포(팩키징 세포)에서 생성될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "팩키징 세포"는 본 개시내용의 핵산 구축물 또는 바이러스 벡터에 의해 형질감염될 수 있는 세포 또는 세포주를 지칭하고, 바이러스 벡터의 완전한 복제 및 팩키징을 위해 요구된 모든 누락 기능을 트랜스로 제공한다. 전형적으로, 팩키징 세포는 하나 이상의 상기 누락 바이러스 기능을 항시적 또는 유도적 방식으로 발현한다. 상기 팩키징 세포는 부착 또는 현탁 세포일 수 있다.
전형적으로, 바이러스 입자를 제조하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 전술된 핵산 구축물 또는 바이러스 벡터를 포함하는 팩키징 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
b) 세포 배양물 상청액 및/또는 세포 내부로부터 바이러스 입자를 수거하는 단계.
글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진을 보유하는 핵산 구축물 또는 발현 벡터(예를 들면, 플라스미드); rep 및 cap 유전자를 코딩하나 ITR 서열을 보유하지 않는 핵산 구축물(예를 들면, AAV 헬퍼 플라스미드); 및 AAV 복제에 필요한 아데노바이러스 기능을 제공하는 세 번째 핵산 구축물(예를 들면, 플라스미드)을 사용한 일시적인 세포 공-형질감염으로 구성된 통상의 방법을 이용하여 바이러스 입자인 AAV 바이러스 입자를 생성할 수 있다. AAV 복제에 필요한 바이러스 유전자는 본원에서 바이러스 헬퍼 유전자로서 지칭된다. 전형적으로, AAV 복제에 필요한 상기 유전자는 아데노바이러스 헬퍼 유전자, 예컨대, E1A, E1B, E2a, E4 또는 VA RNA이다. 바람직하게는, 아데노바이러스 헬퍼 유전자는 Ad5 또는 Ad2 혈청형의 아데노바이러스 헬퍼 유전자이다.
본 개시내용에 따른 AAV 입자의 대규모 제조도 예를 들면, 재조합 바큘로바이러스의 조합물을 사용한 곤충 세포의 감염에 의해 수행될 수 있다(Urabe et al. Hum. Gene Ther. 2002; 13: 1935-1943). SF9 세포는 포장될 각각 AAV rep, AAV cap 및 AAV 벡터를 발현하는 2개 또는 3개의 바큘로바이러스 벡터에 의해 공-감염된다. 재조합 바큘로바이러스 벡터는 바이러스 복제 및/또는 팩키징을 위해 요구된 바이러스 헬퍼 유전자 기능을 제공할 것이다. 곤충 세포에서 AAV 입자를 대규모로 제조하는 이중 바큘로바이러스 발현 시스템도 문헌[Smith et al 2009 (Molecular Therapy, vol.17, no.11, pp 1888-1896)]에 기재되어 있다.
적합한 배양 배지는 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있을 것이다. 이러한 배지를 구성하는 성분은 배양될 세포의 유형에 따라 달라질 수 있다. 영양분 조성 이외에, 오스몰농도 및 pH가 배양 배지의 중요한 파라미터인 것으로 간주된다. 세포 생장 배지는 아미노산, 비타민, 유기 염과 무기 염, 탄수화물의 공급원, 지질, 미량 원소(CuS04, FeS04, Fe(N03)3, ZnS04...)를 포함하는, 당분야에서 숙련된 자에 의해 잘 알려진 다수의 성분들을 포함하고, 이때 성분 각각은 시험관내에서의 세포의 배양(즉, 세포의 생존 및 생장)을 뒷받침하는 양으로 존재한다. 성분은 상이한 보조 물질, 예컨대, 완충제 물질(예컨대, 중탄산나트륨, Hepes, Tris 또는 유사하게 수행하는 완충제), 산화 안정화제, 기계적 응력에 대응하기 위한 안정화제, 프로테아제 억제제, 동물 성장 인자, 식물 가수분해물, 항응집제, 소포제도 포함할 수 있다. 세포 생장 배지의 특성 및 조성은 구체적인 세포 요건에 따라 달라진다. 상업적으로 입수될 수 있는 세포 생장 배지의 예는 MEM(최소 필수 배지), BME(기본 배지 Eagle), DMEM(Dulbecco의 변형된 Eagle 배지), Iscoves DMEM(Dulbecco 배지의 Iscove 변형), GMEM, RPMI 1640, Leibovitz L-15, McCoy's, 배지 199, Ham(Ham 배지) F10 및 유도체, Ham F12, DMEM/F12 등이다.
본 개시에 따라 사용될 바이러스 벡터의 구축 및 제조를 위한 추가 지침은 문헌[Viral Vectors for Gene Therapy, Methods and Protocols. Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 737. Merten and Al-Rubeai (Eds.); 2011 Humana Press (Springer); Gene Therapy. M. Giacca. 2010 Springer-Verlag; Heilbronn R. and Weger S. Viral Vectors for Gene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics. In: Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology 197; M. Schafer-Korting (Ed.). 2010 Springer-Verlag; pp. 143-170; Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols. R.O. Snyder and P. Moulllier (Eds). 2011 Humana Press (Springer); Bunning H. et al. Recent developments in adeno-associated virus technology. J. Gene Med. 2008; 10:717-733; Adenovirus: Methods and Protocols. M. Chillon and A. Bosch (Eds.); Third Edition. 2014 Humana Press (Springer)]에서 발견될 수 있다.
또한, 본 개시내용은 전술된 바와 같이 글루코세레브로시다제를 코딩하는 핵산 구축물 또는 바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용에 따른 숙주 세포는 헬퍼 벡터 또는 바이러스 또는 다른 DNA 구축물의 존재 하에서 전술된 핵산 구축물 또는 바이러스 벡터에 의해 형질감염되고 바이러스 입자의 완전한 복제 및 팩키징을 위해 요구되는 모든 누락 기능들을 트랜스로 제공하는, 팩키징 세포로서도 명명된 특정 바이러스 생성 세포이다. 상기 팩키징 세포는 부착 또는 현탁 세포일 수 있다.
예를 들면, 상기 팩키징 세포는 원숭이, 인간, 개 및 설치류 세포를 비롯한 포유동물 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 인간 세포의 예는 PER.C6 세포(WO01/38362), MRC-5(ATCC CCL-171), WI-38(ATCC CCL-75), HEK-293 세포(ATCC CRL-1573), HeLa 세포(ATCC CCL2) 및 태아 레서스(rhesus) 폐 세포(ATCC CL-160)이다. 비인간 영장류 세포의 예는 Vero 세포(ATCC CCL81), COS-1 세포(ATCC CRL-1650) 또는 COS-7 세포(ATCC CRL-1651)이다. 개 세포의 예는 MDCK 세포(ATCC CCL-34)이다. 설치류 세포의 예는 BHK21-F, HKCC 세포 또는 CHO 세포와 같은 햄스터 세포이다.
포유동물 공급원에 대한 대안으로서, 바이러스 입자를 생성하는 팩키징 세포는 닭, 오리, 거위, 메추라기 또는 꿩과 같은 조류 공급원으로부터 유래할 수 있다. 조류 세포주의 예는 조류 배아 줄기 세포(WO01/8593 및 WO03/076601), 불멸화된 오리 망막 세포(WO2005/042728), 및 닭 세포(WO2006/108846) 또는 오리 세포, 예컨대, EB66 세포주(WO2008/129058 & WO2008/142124)를 비롯한 조류 배아 줄기 세포 유래의 세포를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 세포는 바큘로바이러스 감염 및 복제를 허용하는 임의의 팩키징 세포일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 곤충 세포, 예컨대, SF9 세포(ATCC CRL-1711), Sf21 세포(IPLB-Sf21), MG1 세포(BTI-TN-MG1) 또는 High Five™ 세포(BTI-TN-5B1-4)이다.
따라서, 특정 실시양태에서, 임의적으로 앞서 또는 뒤에 기재된 다양한 실시양태들의 하나 이상의 특징을 겸비하는 숙주 세포는
- 전술된 바와 같이 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 핵산 구축물 또는 바이러스 벡터(예를 들면, AAV 벡터);
- ITR 서열을 갖지 않는, AAV rep 및/또는 cap 유전자를 코딩하는 핵산 구축물, 예를 들면, 플라스미드; 및 임의적으로,
- 바이러스 헬퍼 유전자를 포함하는 핵산 구축물, 예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스
를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 바이러스 입자가 형질도입되어 있는 숙주 세포에 관한 것이고, 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 관심 있는 바이러스에 의한 감염에 민감하고 시험관내에서 배양될 수 있는 임의의 세포주를 지칭한다.
약학 조성물
본 개시내용의 또 다른 양태는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 개시내용의 핵산 구축물, 바이러스 벡터, 바이러스 입자 또는 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 규제 관청 또는 인정된 약전, 예컨대, 유럽 약전에 의해 동물 및/또는 인간에서 사용되도록 승인되었음을 의미한다. 용어 "부형제"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 담체 또는 비히클을 지칭한다.
임의의 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제가 약학 조성물의 제조에 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, April 1997] 참조). 약학 조성물은 전형적으로 멸균되어 있고 제조 및 저장의 조건 하에서 안정하다. 약학 조성물은 용액(예를 들면, 식염수, 덱스트로스 용액, 또는 완충된 용액, 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 멸균 유체), 미세유화액, 리포좀, 또는 높은 생성물 농도를 수용하기에 적합한 다른 정돈된 구조물(예를 들면, 미세입자 또는 나노입자)로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 요구된 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다.
바람직하게는, 상기 약학 조성물은 용액, 보다 바람직하게는 임의적으로 완충된 식염수 용액으로서 제제화된다. 보충 활성 화합물도 본 발명의 약학 조성물 내로 혼입될 수 있다. 추가 치료제의 공-투여에 대한 지침은 예를 들면, 캐나다 약사 협회의 의약품집(Compendium of Pharmaceutical and Specialties(CPS))에서 발견될 수 있다.
한 실시양태에서, 약학 조성물은 실질내, 뇌내, 정맥내 또는 척수강내 투여에 적합한 조성물이다. 이 약학 조성물은 예시하기 위한 것일 뿐이고 다른 비경구 투여 경로 및 비-비경구 투여 경로에 적합한 약학 조성물을 제한하지 않는다. 본원에 기재된 약학 조성물은 단회 유닛 용량 또는 다회 용량 형태로 팩키징될 수 있다.
치료 용도
본 발명은 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바이러스 입자도 제공한다.
한 실시양태에서, 치료에 사용하기 위한 바이러스 입자는
a) 서열번호 1, 7, 11, 12 또는 19(바람직하게는 서열번호 19) 또는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 서열을 포함하는, 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진으로서, 인간 글루코세레브로시다제가 서열번호 5, 6, 8, 17 또는 18(바람직하게는 서열번호 5 또는 8)을 포함하는 것인 트랜스진;
b) 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결되어 있고 바람직하게는 상기 트랜스진이 적어도 흑질 치밀부(SNc)의 뉴런 및 미세아교 세포에서 발현될 수 있게 하는 프로모터로서, 바람직하게는 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터, 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 GusB 프로모터, 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터, 또는 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 hSyn 프로모터인 프로모터;
c) 폴리아데닐화 신호 서열, 바람직하게는 서열번호 28 또는 서열번호 3, 바람직하게는 서열번호 28을 포함하거나 이것으로 구성된 폴리아데닐화 신호 서열
을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 바이러스 입자이고,
이때 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV TT의 캡시드 단백질을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열번호 14, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자이고; 상기 핵산 구축물은 5' ITR 및 3' ITR 서열, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스의 5' ITR 및 3' ITR 서열, 보다 바람직하게는 AAV2 혈청형으로부터의 5' ITR 및 3' ITR 서열을 추가로 포함하는 바이러스 벡터에 포함되고, 5' ITR 및 3' ITR 서열은 각각 독립적으로 서열번호 15 또는 16의 서열, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되고, 이때 바람직하게는 5' ITR은 서열번호 15를 포함하고, 3' ITR은 서열번호 16을 포함한다.
본 발명자들은 놀랍게도 마우스 및 비인간 영장류의 산발성 파킨슨병 동물 모델을 사용하여, 글루코세레브로시다제 활성의 AAV 매개 향상이
- 흑질 치밀부의 도파민작용성 뉴런에서 알파-시누클레인 응집체 제거를 유도하고;
- 도파민작용성 뉴런의 신경보호를 유도하고,
- 알파-시누클레인 응집에 의해 유발된 미세아교 유도 전구염증 현상을 약화시키고
- 알파-시누클레인의 뉴런 횡단 통과(프리온 유사 확산)을 방해한다는 것을 발견하였다.
이 결과들은 인간 대상체에서 시누클레인병증, 구체적으로 산발성 시누클레인병증, 보다 구체적으로 파킨슨병을 치료하는 가능한 치료 전략의 강력한 증거를 제공한다.
따라서, 추가 양태에서, 시누클레인병증, 바람직하게는 파킨슨병, 보다 구체적으로 산발성 파킨슨병의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바이러스 입자 또는 바이러스 벡터를 제공한다.
한 실시양태에서, 시누클레인병증, 바람직하게는 파킨슨병, 보다 구체적으로 산발성 파킨슨병의 치료에 사용하기 위한 바이러스 입자는
a) 서열번호 1, 7, 11, 12 또는 19(바람직하게는 서열번호 19) 또는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 서열을 포함하는, 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진으로서, 인간 글루코세레브로시다제가 서열번호 5, 6, 8, 17 또는 18(바람직하게는 서열번호 5 또는 8)을 포함하는 것인 트랜스진;
b) 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결되어 있고 바람직하게는 상기 트랜스진이 적어도 흑질 치밀부(SNc)의 뉴런 및 미세아교 세포에서 발현될 수 있게 하는 프로모터로서, 바람직하게는 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터, 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 GusB 프로모터, 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터, 또는 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 hSyn 프로모터인 프로모터;
c) 폴리아데닐화 신호 서열, 바람직하게는 서열번호 28 또는 서열번호 3, 바람직하게는 서열번호 28을 포함하거나 이것으로 구성된 폴리아데닐화 신호 서열
을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 바이러스 입자이고,
이때, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV TT의 캡시드 단백질을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열번호 14, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자이고; 상기 핵산 구축물은 5' ITR 및 3' ITR 서열, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스의 5' ITR 및 3' ITR 서열, 보다 바람직하게는 AAV2 혈청형으로부터의 5' ITR 및 3' ITR 서열을 추가로 포함하는 바이러스 벡터에 포함되고, 5' ITR 및 3' ITR 서열은 각각 독립적으로 서열번호 15 또는 16의 서열, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되고, 이때 바람직하게는 5' ITR은 서열번호 15를 포함하고, 3' ITR은 서열번호 16을 포함한다.
추가로, 본 개시내용은 시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 시누클레인병증, 바람직하게는 파킨슨병, 보다 구체적으로 산발성 파킨슨병을 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 전술된 바이러스 입자 또는 바이러스 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 시누클레인병증, 바람직하게는 파킨슨병, 보다 구체적으로 산발성 파킨슨병을 치료하는 방법은
a) 서열번호 1, 7, 11, 12 또는 19(바람직하게는 서열번호 19) 또는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 서열을 포함하는, 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진으로서, 인간 글루코세레브로시다제가 서열번호 5, 6, 8, 17 또는 18(바람직하게는 서열번호 5 또는 8)을 포함하는 것인 트랜스진;
b) 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결되어 있고 바람직하게는 상기 트랜스진이 적어도 흑질 치밀부(SNc)의 뉴런 및 미세아교 세포에서 발현될 수 있게 하는 프로모터로서, 바람직하게는 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터, 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 GusB 프로모터, 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터, 또는 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 hSyn 프로모터인 프로모터;
c) 폴리아데닐화 신호 서열, 바람직하게는 서열번호 28 또는 서열번호 3, 바람직하게는 서열번호 28을 포함하거나 이것으로 구성된 폴리아데닐화 신호 서열
을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 바이러스 입자를 치료 유효량으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고;
이때, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV TT의 캡시드 단백질을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열번호 14, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자이고; 상기 핵산 구축물은 5' ITR 및 3' ITR 서열, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스의 5' ITR 및 3' ITR 서열, 보다 바람직하게는 AAV2 혈청형으로부터의 5' ITR 및 3' ITR 서열을 추가로 포함하는 바이러스 벡터에 포함되고, 5' ITR 및 3' ITR 서열은 각각 독립적으로 서열번호 15 또는 16의 서열, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되고, 이때 바람직하게는 5' ITR은 서열번호 15를 포함하고, 3' ITR은 서열번호 16을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 대뇌 피질의 뉴런, 바람직하게는 대뇌 피질의 심층 V 및 VI의 뉴런, 바람직하게는 투여된 부위를 신경지배하는 대뇌 피질의 심층 V 및 VI의 뉴런의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 적어도 90%에게 전달되도록 치료 유효량의 전술된 바이러스 입자 또는 바이러스 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법은 주사 부위를 신경지배하는 뇌 영역의 뉴런에게 전달되도록, 바람직하게는 적어도 미상 피각 핵을 신경지배하는 뇌 영역, 즉 적어도 흑질 치밀부, 대뇌 피질, 편도체 및 시상의 미측 수질판내 핵의 뉴런, 바람직하게는 이 뉴런의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 적어도 90%에게 전달되도록 치료 유효량의 전술된 바이러스 입자 또는 바이러스 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 의약을 필요로 하는 대상체에서 의약으로서 사용하기 위한, 보다 구체적으로 시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 시누클레인병증, 바람직하게는 파킨슨병, 보다 구체적으로 산발성 파킨슨병을 치료하는 데 사용하기 위한 전술된 핵산 구축물, 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
또 다른 추가 양태에서, 본 개시내용은 바람직하게는 시누클레인병증, 바람직하게는 파킨슨병, 보다 구체적으로 산발성 파킨슨병을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 전술된 핵산 구축물, 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
본원에서 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 포유동물을 지칭한다. 개시된 치료 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 포유동물 종은 인간, 비인간 영장류, 예컨대, 유인원, 침팬지, 원숭이 및 오랑우탄, 개와 고양이를 비롯한 사육 동물, 및 말, 소, 돼지, 양 및 염소와 같은 가축, 또는 마우스, 래트, 기니 피그, 토끼, 햄스터 등을 제한 없이 포함하는 다른 포유동물 종을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 구체적인 실시양태에서, 상기 대상체는 신생아, 유아 또는 소아이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료한다" 또는 "치료하는"은 환자의 건강 상태를 호전시키기 위한 임의의 행위, 예컨대, 질환의 치료, 방지, 예방 및 지연을 의미한다. 특정 실시양태에서, 이러한 용어는 질환 또는 질환과 관련된 증상의 호전 또는 박멸을 지칭한다. 다른 실시양태에서, 이 용어는 하나 이상의 치료제를, 이러한 질환을 가진 대상체에게 투여함으로써 질환의 퍼짐 또는 악화를 최소화하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 시누클레인병증은 신경병리학적 특징이 알파-시누클레인의 세포질내 응집으로 나타나는 질환을 지칭한다. 구체적으로, 시누클레인병증은 파킨슨병, 루이체를 가진 치매 및 다계통 위축증과 같은 신경퇴행성 장애를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 파킨슨병(PD)은 기원이 알려지지 않은 중추신경계의 진행성 신경퇴행성 장애를 지칭한다. PD의 환경 내에서, 도파민 생성 뉴런은 점진적으로 사멸하여, 도파민으로서 알려진 신경전달물질의 뇌 결핍을 유발한다. 도파민 뇌 수준의 점진적인 감소의 결과로서, 자발적인 움직임의 시작과 실행을 조절하는 뇌 회로는 기능장애를 갖게 됨으로써, PD를 전형적으로 특징짓는 주요 운동 증상의 출현을 유발한다. 초기 진단은 일반적으로 수명의 60년(평균 65세)에 이루어지고, 특징적인 증상발현은 일측성 및 원위성을 띤다. 질환이 진행됨에 따라, 질환은 신체의 양쪽에 영향을 미치고(예를 들면, 양측성) 증상은 시간에 따라 악화되고 더 분명해진다. 초기 진단 시, 대다수의 환자들은 레보도파(도파민 전구체) 및/또는 매우 다양한 도파민작용성 아고니스트들의 상이한 제제와 같은 의약을 복용함으로써 질환을 약리학적으로 관리할 수 있는 가변적 기간(대략 5세 내지 7세)에 직면한다. 질환이 진행됨에 따라, 의약 용량은 의약의 장기간 복용과 관련된 온-오프(on-off) 현상 및 부작용(레보도파에 의해 유도된 운동이상증)의 출현 때문에 PD가 도파민 대체 요법에 의해 더 이상 관리될 수 없는 시점까지 도파민작용성 뉴런의 끊임없는 손실에 대응하기 위해 증가된다. 이 단계에서, 전극을 기저핵 회로 내에 양쪽으로 배치하는 것으로 구성된 기능적 신경수술적 접근법(심부 뇌 자극으로 알려진 절차)으로 환자를 치료할 수 있다. 치료 옵션과 관계없이, 이용 가능한 접근법은 대증적일 뿐이다. 즉, 질환 진행 속도에 어떠한 영향도 미치지 않으면서 운동 관련 증상을 완화시킬 수 있다. 전형적인 증상적 3요소는 떨림(흔들림), 운동완서(움직임의 느림) 및 강직(근육 경직 때문)으로 구성된다. 전형적인 3요소 이외에, 보행 장애, 구음장애(언어 장애), 통증뿐만 아니라, 많은 비-운동 증상들(특히 변비, 요실금, REM 수면 장애, 후각 기능장애 및 기립성 저혈압)도 포함하는 몇 가지 더 많은 증상들이 종종 인지된다. 정신과적 증상도 질환 진행과 동시에 종종 나타나고, 인지, 사고, 기분 및 행동의 장애를 포함할 수 있다. 실제로, 질환의 후기에서 종종 치매가 나타난다.
PD의 주요 신경병리학적 특징은 알파-시누클레인으로서 알려진 잘못 폴딩된 단백질의 세포질내 응집으로 표시된다. 알파-시누클레인 응집체는 종종 루이체로서 지칭되는 회전타원체 유사 구조물 및 비정상적인 뉴런 구조물(루이체 신경돌기)로서 나타난다. 루이체가 흑질 치밀부로서 알려진 뇌 영역 내의 도파민작용성 뉴런 내부에 존재하는 것은 PD의 신경병리학적 확인을 위한 선택 기준이다. PD의 진단은 임상 표현형을 함께 균형 맞춤으로써 신경전문의에 의해 수행된 임상 평가 후에 이루어진다. 이와 병행하여, 방사성추적자 플루오로-도파(도파민 유사체)를 사용한 양전자 방출 단층촬영(PET 스캔)을 이용한 신경영상 연구도 PD의 초기 진단을 뒷받침하고 실제로 시간에 따른 질환 진행의 신경영상 상관관계로서 매우 유용하다.
상기 방법은 산발성 시누클레인병증, 특히 산발성 파킨슨병을 치료하는 데 특히 적합하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 산발성 시누클레인병증(특발성 장애로서도 지칭됨)은 공지되어 있는 특정 유전자 돌연변이(가족력 사례)와 관련되어 있지 않은 시누클레인병증을 지칭한다. 가족력 시누클레인병증과 관련된 이러한 공지된 유전자 돌연변이는 LRRK2, SNCA, VPS35, GCH1, ATXN2, DNAJC13, TMEM230, GIGYF2, HTRA2, RIC3, EIF4G1, UCHL1, CHCHD2, GBA1, PRKN, PINK1, DJ1, ATP13A2, PLA2G6, FBXO7, DNAJC6, SYNJ1, SPG11, VPS13C, PODXL, PTRHD1, RAB39B, DNAJC13, TMEM230, GIGYF2, HTRA2, RIC3, EIF4G1, UCHL1 및 CHCHD2로 구성된 군으로부터 선택된 유전자의 돌연변이를 포함한다. 이 돌연변이들은 문헌[Lunati et al, The genetic landscape of Parkinson's disease, Rev Neurol 2018;174:628-643]에 더 상세히 더 기재되어 있다.
상기 시누클레인병증은 라이소자임 저장의 결함, 구체적으로 고셔병과 관련될 수 있다. 따라서, 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 방법은 신경병증성 고셔병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경병증성 고셔병, 보다 구체적으로 II형 또는 III형 고셔병을 치료하는 데에도 적합하고, 상기 방법은 치료 유효량의 전술된 바이러스 입자, 바이러스 벡터, 숙주 세포 또는 약학 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
고셔병(GD)은 라이소자임 저장 질환, 보다 구체적으로 대식세포-단핵구 시스템의 세포에서의 글루코세레브로사이드 침착을 특징으로 하는 스핑고지질증을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "라이소자임 저장 질환"은 라이소자임 기능의 결함으로부터 비롯된 유전적 질환 및 대사 장애를 지칭한다. 라이소자임 저장 장애는 통상적으로 라이소자임 내부에서의 비정상적인 물질 축적을 유도하는 지질, 당단백질 또는 소위 뮤코폴리사카라이드의 대사를 위해 요구된 단일 효소의 결핍의 결과로서 라이소자임 기능장애에 의해 야기된다.
고셔병은 효소 글루코세레브로시다제를 코딩하는 유전자의 열성 돌연변이(들)에 의해 야기된다. 베타-글루코시다제의 상이한 돌연변이는 상기 효소의 남은 활성 및 주로 표현형을 결정한다. 고셔병은 3가지 흔한 임상 하위형, 즉 이 질환의 가장 흔한 형태인 비-신경병증성 I형, 본원에서 II형으로서도 지칭되는 급성 신경병증성 II형, 및 본원에서 III형으로서도 지칭되는 만성 신경병증성 III형을 가진다. II형(급성 신경병증성) 또는 III형(아급성 신경병증성)의 고셔병은 중추신경계에 영향을 미치는 원발성 신경학적 질환의 존재를 특징으로 한다. II형의 고셔병은 출생 후 6개월만큼 빠른, 아동기 중 임의의 시간에 시작할 수 있고 대략 100,000명의 생존 출생아들 중 1명의 빈도로 발병한다. 이것은 장기비대증과 관련되어 있고 일반적으로 2세 전에 사망에 이르게 하는 뇌간의 심각한 신경학적 침습을 특징으로 한다. 주요 증상은 확장된 비장 및/또는 간, 발작, 협응 불량, 골격 불규칙, 눈 운동 장애, 빈혈을 비롯한 혈액 장애 및 호흡기 문제를 포함한다. III형의 고셔병은 아동기 및 청소년기 후반에 발병하고 대략 100,000명의 생존 출생아들 중 1명의 발병률을 가진다. 증상은 II형에 비해 더 느리게 진행되며, 확장된 간 및 비장, 광범위한 진행성 뇌 손상, 눈 운동 장애, 경련, 발작, 사지 강직, 및 빨고 삼키는 능력 부족을 포함한다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 의약을 필요로 하는 대상체에서 의약으로서 사용하기 위한, 보다 구체적으로 신경병증성 고셔병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경병증성 고셔병, 보다 구체적으로 II형 또는 III형의 고셔병을 치료하는 데 사용하기 위한 전술된 바이러스 입자, 바이러스 벡터, 숙주 세포 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
또 다른 추가 양태에서, 본 개시내용은 바람직하게는 신경병증성 고셔병, 보다 구체적으로 II형 또는 III형의 고셔병을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 전술된 핵산 구축물, 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 신경병증성 고셔병, 보다 구체적으로 II형 또는 III형의 고셔병의 치료에 사용하기 위한 바이러스 입자는
d) 서열번호 1, 7, 11, 12 또는 19(바람직하게는 서열번호 19) 또는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 서열을 포함하는, 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진으로서, 인간 글루코세레브로시다제가 서열번호 5, 6, 8, 17 또는 18(바람직하게는 서열번호 5 또는 8)을 포함하는 것인 트랜스진;
e) 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결되어 있고 바람직하게는 상기 트랜스진이 적어도 흑질 치밀부(SNc)의 뉴런 및 미세아교 세포에서 발현될 수 있게 하는 프로모터로서, 바람직하게는 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터, 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 GusB 프로모터, 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터, 또는 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 hSyn 프로모터인 프로모터;
f) 폴리아데닐화 신호 서열, 바람직하게는 서열번호 28 또는 서열번호 3, 바람직하게는 서열번호 28을 포함하거나 이것으로 구성된 폴리아데닐화 신호 서열
을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 바이러스 입자이고;
이때, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV TT의 캡시드 단백질을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열번호 14, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자이고; 상기 핵산 구축물은 5' ITR 및 3' ITR 서열, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스의 5' ITR 및 3' ITR 서열, 보다 바람직하게는 AAV2 혈청형으로부터의 5' ITR 및 3' ITR 서열을 추가로 포함하는 바이러스 벡터에 포함되고, 5' ITR 및 3' ITR 서열은 각각 독립적으로 서열번호 15 또는 16의 서열, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되고, 이때 바람직하게는 5' ITR은 서열번호 15를 포함하고, 3' ITR은 서열번호 16을 포함한다.
추가로, 본 개시내용은 신경병증성 고셔병의 치료를 필요하는 대상체에서 신경병증성 고셔병, 보다 구체적으로 II형 또는 III형의 고셔병을 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 전술된 바이러스 입자 또는 바이러스 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 신경병증성 고셔병의 치료를 필요하는 대상체에서 신경병증성 고셔병, 보다 구체적으로 II형 또는 III형의 고셔병을 치료하는 방법은
a) 서열번호 1, 7, 11, 12 또는 19(바람직하게는 서열번호 19) 또는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 서열을 포함하는, 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진으로서, 인간 글루코세레브로시다제가 서열번호 5, 6, 8, 17 또는 18(바람직하게는 서열번호 5 또는 8)을 포함하는 것인 트랜스진;
b) 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결되어 있고 바람직하게는 상기 트랜스진이 적어도 흑질 치밀부(SNc)의 뉴런 및 미세아교 세포에서 발현될 수 있게 하는 프로모터로서, 바람직하게는 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터, 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 GusB 프로모터, 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터, 또는 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 hSyn 프로모터인 프로모터;
c) 폴리아데닐화 신호 서열, 바람직하게는 서열번호 28 또는 서열번호 3, 바람직하게는 서열번호 28을 포함하거나 이것으로 구성된 폴리아데닐화 신호 서열
을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 바이러스 입자를 치료 유효량으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고;
이때, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV TT의 캡시드 단백질을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열번호 14, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자이고; 상기 핵산 구축물은 5' ITR 및 3' ITR 서열, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스의 5' ITR 및 3' ITR 서열, 보다 바람직하게는 AAV2 혈청형으로부터의 5' ITR 및 3' ITR 서열을 추가로 포함하는 바이러스 벡터에 포함되고, 5' ITR 및 3' ITR 서열은 각각 독립적으로 서열번호 15 또는 16의 서열, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되고, 이때 바람직하게는 5' ITR은 서열번호 15를 포함하고, 3' ITR은 서열번호 16을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료 유효량"은 원하는 치료 결과, 예컨대, 하기 치료 결과들 중 하나 이상의 치료 결과를 달성하는 데 필요한 용량 및 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다:
- 상기 대상체에서 흑질 치밀부의 도파민작용성 뉴런, 및 바람직하게는 또한 알파-시누클레인 응집체를 보이는 임의의 다른 뇌 영역의 뉴런에서의 알파-시누클레인 존재량의 유의미한 감소,
- 티로신 양성 뉴런에서의 유의미한 사멸 감소에 의해 확인되는, 흑질 치밀부에서의 도파민작용성 뉴런의 유의미한 신경보호 효과,
- 알파-시누클레인 응집체를 보이는 임의의 다른 뇌 영역의 뉴런에서의 유의미한 신경보호 효과,
- 알파-시누클레인 응집에 의해 유발된 미세아교 유도 전구염증 현상의 유의미한 감소,
- 알파-시누클레인의 프리온 유사 뉴런 횡단 통과의 유의미한 차단.
본원에서 사용된 바와 같이, "알파-시누클레인의 프리온 유사 뉴런 횡단 통과"는 알파-시누클레인이 뉴런 축삭 말단으로부터 알파-시누클레인 발현 축삭 말단에 의해 신경지배되는 다음 뉴런까지 전파되는 능력을 지칭한다.
(예를 들면, 흑질 치밀부의 도파민작용성 뉴런에서) 알파-시누클레인 존재량의 유의미한 감소는 최소 4주의 치료 기간 후 상응하는 뇌 영역(예를 들면, 흑질 치밀부)에서의 알파-시누클레인 응집체의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 적어도 90%의 감소에 상응할 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료받은 환자에서 도파민작용성 뉴런의 유의미한 신경보호 효과는 최소 52주(1년)의 치료 기간 후 치료받지 않은 환자에 비해 적어도 10%, 적어도 20% 또는 적어도 30%의 개선된 뉴런 생존으로서 평가될 수 있다.
다른 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 생성물을 사용한 치료는 시누클레인병증 또는 신경병증성 고셔병의 하나 이상의 증상의 진행을 억제할 수 있거나, 발병을 지연시킬 수 있거나, 중증도를 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 치료는 하기 증상들 중 하나 이상의 증상의 진행을 억제할 수 있거나, 발병을 지연시킬 수 있거나, 중증도를 감소시킬 수 있다:
- (예를 들면, 흑질 치밀부에서의) 도파민작용성 뉴런의 퇴행,
- 운동완서,
- 근육 강직,
- 떨림, 휴식 떨림,
- 손상된 균형 및 보행 장애,
- 신경정신과적 증상,
- 알파-시누클레인의 축적,
- 루이체의 축적,
- 질환 진행 속도,
- 임상 운동 관련 척도로 수득된 점수,
- 인지 상태를 측정하는 검사에서 수득된 점수,
- (결합력으로서 측정된) 신경영상 PET 스캔에서의 방사성추적자 흡수의 수준,
- 후각 검사,
- REM 수면 장애,
- 비-운동 증상(특히 변비, 요실금, REM 수면 장애, 후각 기능장애 및 기립성 저혈압),
- 구음장애 및 언어 유창성,
- 인지(치매로의 진행을 포함함), 사고, 기분 및 행동의 장애.
한 실시양태에서, 유효량의 전술된 바이러스 입자(또는 바이러스 벡터)는 실질내, 뇌내, 뇌실내(icv), 척수강내 또는 정맥내 경로에 의해 대상체 또는 환자에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 파킨슨병, 특히 산발성 파킨슨병의 경우, 표적화된 영역은 알파-시누클레인의 축적을 보이는 임의의 뇌 영역, 특히 흑질 치밀부 및 대뇌 피질로 표시된다. 그러므로, 치료 유효량의 상기 바이러스 입자 또는 바이러스 벡터는 바람직하게는 실질내 경로에 의해 보다 바람직하게는 흑질 치밀부 및/또는 미상 피각 핵의 뇌 영역에 투여된다. 한 실시양태에서, 실질내 경로는 다른 뇌 영역에 비해 SNc에의 바람직한 국소 투여를 용이하게 할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "SNc에의 바람직한 국소 투여"는 모든 바이러스 입자들 또는 바이러스 벡터들이 SNc에 투여됨을 의미하는 것이 아니라, 바이러스 입자의 대부분, 예를 들면, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 80%(vg)가 SNc 영역, 또는 SNc 뉴런에 의해 신경지배되는 임의의 다른 뇌 영역에 투여됨을 의미한다.
뇌척수 공간 내로 투여 시, 뉴런 형질도입은 뇌척수액 순환 동력학에 의존하므로, (1) 뇌실주위 영역, 즉 뇌실에 가까이 인접한 영역 및 (2) 피각과 연결되어 있지 않은 소뇌 및 해마와 같은 뇌 영역에서 (3) 비특이적 방식을 통해 일어날 것으로 예상된다. 즉, 뉴런은 뇌실 또는 지주막하 공간으로부터의 확산에 의해 형질도입되고, 이때 강한 표지부착은 (예를 들면, 지주막하 공간으로부터의 확산에 의해) 상부 피질 층 I 내지 IV에서 관찰될 것으로 예상된다. 흑질과 같은 심뇌 영역의 뉴런의 뇌실계로부터의 형질도입은 흑질이 뇌실로부터 멀리 떨어져 위치되어 있으므로 수동 확산에 의해 형질감염되기 매우 어렵다는 점을 유념할 가능성의 거의 없을 것이다.
뇌척수 공간 내로의 투여와 대조적으로, 미상 피각 핵 내로의 바이러스 벡터의 투여는 몇몇 장점, 예컨대, 대뇌 피질, 시상, 편도체, 흑질 치밀부, 및 주사 부위를 신경지배하는 등측 솔기 핵에 위치된 뉴런의 특이적 형질도입; 및 예를 들면, 예상되지 않은 영역으로의 후향성 확산 없이(예를 들면, 피각을 신경지배하지 않는 것으로 알려진 영역으로의 후향성 수송의 결여) 피각으로 돌출하는 피질 영역의 층 V에서 피각을 신경지배하는 것으로 알려진 뇌 영역에서의 회로 특이적 후향성 확산을 제공한다.
따라서, 실질내 경로는 미상 피각 핵으로의 바이러스 입자의 국소 투여를 용이하게 함으로써, 주사 부위를 신경지배하는 임의의 뇌 영역으로의 트랜스진의 후향성 전파를 용이하게 할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 바이러스 입자는 바람직하게는 1013 내지 1014 vg/㎖(vg: 바이러스 게놈)의 범위 내에 포함된 농도에서 피각당 50 내지 1000 ㎕, 바람직하게는 200 내지 700 ㎕의 범위 내에 포함된 부피로 미상 피각 핵으로의 실질내 경로를 통해 인간 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 2시간 내지 6시간 동안 0.5 내지 5 ㎕/분의 범위 내에 포함된 주사 데빗(debit)으로 투여된다. 바이러스 입자의 이러한 높은 주사 데빗은 바이러스 안정성을 증가시키고 환자의 더 우수한 관리를 가능하게 한다.
특정 실시양태에서, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV2, AAV5, AAV9, AAV-MNM004, AAV-MNM008 및 AAV TT 혈청형으로 구성된 군으로부터 선택된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자들 중에서 선택된다.
특정 실시양태에서, 상기 바이러스 입자는 하기 변이체 혈청형들 중에서 선택된 캡시드 단백질을 포함하는 AAVretro이다: AAV2-retro, AAV-MNM004, AAV-MNM008 및 AAV-TT.
한 실시양태에서, AAV-TT 입자는 바람직하게는 1013 내지 1014 vg/㎖(vg: 바이러스 게놈)의 범위 내에 포함된 농도에서 피각당 50 내지 1000 ㎕, 바람직하게는 200 내지 700 ㎕의 범위 내에 포함된 부피로 미상 피각 핵으로의 실질내 경로를 통해 인간 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 2시간 내지 6시간 동안 0.5 내지 5 ㎕/분의 범위 내에 포함된 주사 데빗으로 투여된다.
또 다른 실시양태에서, AAV-9 입자는 바람직하게는 1013 내지 1014 vg/㎖(vg: 바이러스 게놈)의 범위 내에 포함된 농도에서 피각당 50 내지 1000 ㎕, 바람직하게는 200 내지 700 ㎕의 범위 내에 포함된 부피로 미상 피각 핵으로의 실질내 경로를 통해 인간 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 2시간 내지 6시간 동안 0.5 내지 5 ㎕/분의 범위 내에 포함된 주사 데빗으로 투여된다.
한 실시양태에서, 실질내 경로는 미상 피각 핵으로의 AAV의 바람직한 국소 투여를 용이하게 함으로써, 주사 부위를 신경지배하는 임의의 뇌 영역으로의 GBA1 트랜스진의 후향성 전파를 용이하게 할 수 있다.
본 개시내용은 신경퇴행성 질환, 예컨대, 시누클레인병증의 치료에 사용하기 위한 바이러스 입자, 바람직하게는 본 개시내용에 따른 GBA1 트랜스진을 포함하는 AAV 입자에 관한 것으로서, 이때 상기 바이러스 입자는 미상 피각 핵으로의 실질내 경로를 통해 투여된다.
바람직한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 AAV 바이러스 입자는 바람직하게는 1013 내지 1014 vg/㎖(vg: 바이러스 게놈)의 범위 내에 포함된 농도에서 피각당 50 내지 1000 ㎕, 바람직하게는 200 내지 700 ㎕의 범위 내에 포함된 부피로 미상 피각 핵으로의 실질내 경로를 통해 파킨슨병 또는 신경병증성 고셔병과 같은 시누클레인병증의 치료를 위해 인간 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 2시간 내지 6시간 동안 0.5 내지 5 ㎕/분의 범위 내에 포함된 주사 데빗으로 투여된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 AAV-TT는 미상 피각 핵으로의 실질내 경로를 통해 파킨슨병 또는 신경병증성 고셔병과 같은 시누클레인병증의 치료를 위해 인간 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다.
본 개시내용에 따른 상기 AAV-TT 입자는 바람직하게는 1013 내지 1014 vg/㎖(vg: 바이러스 게놈)의 범위 내에 포함된 농도에서 피각당 50 내지 1000 ㎕, 바람직하게는 200 내지 700 ㎕의 범위 내에 포함된 부피로 미상 피각 핵으로의 실질내 경로를 통해 파킨슨병 또는 신경병증성 고셔병과 같은 시누클레인병증의 치료를 위해 인간 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 2시간 내지 6시간 동안 0.5 내지 5 ㎕/분의 범위 내에 포함된 주사 데빗으로 투여된다.
바람직한 실시양태에서, 시누클레인병증, 바람직하게는 고셔병(예컨대, 신경병증성 고셔병) 또는 PD(예컨대, 산발성 PD)와 같은 신경퇴행성 질환의 치료에 사용하기 위한, 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 5, 6, 8, 17 또는 18을 포함하는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 트랜스진을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자를 제공하고, 이때 상기 핵산 구축물은 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하고, 상기 rAAV 입자는 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하는 AAV-TT 캡시드 단백질을 포함하고, 상기 rAAV 입자는 바람직하게는 1013 내지 1014 vg/㎖(vg: 바이러스 게놈)의 범위 내에 포함된 농도에서 바람직하게는 피각당 50 내지 1000 ㎕, 바람직하게는 200 내지 700 ㎕의 범위 내에 포함된 부피로 미상 피각 핵으로의 실질내 경로를 통해 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 2시간 내지 6시간 동안 0.5 내지 5 ㎕/분의 범위 내에 포함된 주사 데빗으로 투여된다.
추가 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용은
a) 서열번호 1, 7, 11, 12 또는 19(바람직하게는 서열번호 19) 또는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 서열을 포함하는, 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진으로서, 인간 글루코세레브로시다제가 서열번호 5, 6, 8, 17 또는 18(바람직하게는 서열번호 5 또는 8)을 포함하는 것인 트랜스진;
b) 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결되어 있고 바람직하게는 상기 트랜스진이 적어도 흑질 치밀부(SNc)의 뉴런 및 미세아교 세포에서 발현될 수 있게 하는 프로모터로서, 바람직하게는 서열번호 9 또는 21을 포함하는 CAG 프로모터, 서열번호 2 또는 20을 포함하는 GusB 프로모터, 서열번호 27을 포함하는 JeT 프로모터, 또는 서열번호 13을 포함하는 hSyn 프로모터인 프로모터;
c) 폴리아데닐화 신호 서열, 바람직하게는 서열번호 28 또는 서열번호 3, 바람직하게는 서열번호 28을 포함하거나 이것으로 구성된 폴리아데닐화 신호 서열
을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 바이러스 입자에 관한 것으로서,
이때, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV TT의 캡시드 단백질을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열번호 14, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자이고; 상기 핵산 구축물은 5' ITR 및 3' ITR 서열, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스의 5' ITR 및 3' ITR 서열, 보다 바람직하게는 AAV2 혈청형으로부터의 5' ITR 및 3' ITR 서열을 추가로 포함하는 바이러스 벡터에 포함되고, 5' ITR 및 3' ITR 서열은 각각 독립적으로 서열번호 15 또는 16의 서열, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되고, 이때 바람직하게는 5' ITR은 서열번호 15를 포함하고, 3' ITR은 서열번호 16을 포함하고; 상기 바이러스 입자는 시누클레인병증, 바람직하게는 고셔병(예컨대, 신경병증성 고셔병) 또는 PD(예컨대, 산발성 PD)와 같은 신경퇴행성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이고, 상기 rAAV 입자는 바람직하게는 1013 내지 1014 vg/㎖(vg: 바이러스 게놈)의 범위 내에 포함된 농도에서 바람직하게는 피각당 50 내지 1000 ㎕, 바람직하게는 200 내지 700 ㎕의 범위 내에 포함된 부피로 미상 피각 핵으로의 실질내 경로를 통해 투여된다.
특정 실시양태에서, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 2시간 내지 6시간 동안 0.5 내지 5 ㎕/분의 범위 내에 포함된 주사 데빗으로 투여된다.
나아가, 추가 바람직한 실시양태에서, 시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 시누클레인병증, 바람직하게는 고셔병(예컨대, 신경병증성 고셔병) 또는 PD(예컨대, 산발성 PD)를 치료하는 방법으로서,
a) 서열번호 1, 7, 11, 12 또는 19(바람직하게는 서열번호 19) 또는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 서열을 포함하는, 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진으로서, 인간 글루코세레브로시다제가 서열번호 5, 6, 8, 17 또는 18(바람직하게는 서열번호 5 또는 8)을 포함하는 것인 트랜스진;
b) 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결되어 있고 바람직하게는 상기 트랜스진이 적어도 흑질 치밀부(SNc)의 뉴런 및 미세아교 세포에서 발현될 수 있게 하는 프로모터로서, 바람직하게는 서열번호 9 또는 21을 포함하는 CAG 프로모터, 서열번호 2 또는 20을 포함하는 GusB 프로모터, 서열번호 27을 포함하는 JeT 프로모터, 또는 서열번호 13을 포함하는 hSyn 프로모터인 프로모터;
c) 폴리아데닐화 신호 서열, 바람직하게는 서열번호 28 또는 서열번호 3, 바람직하게는 서열번호 28을 포함하거나 이것으로 구성된 폴리아데닐화 신호 서열
을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 바이러스 입자를 치료 유효량으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
이때, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV TT의 캡시드 단백질을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열번호 14, 또는 서열번호 14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 바람직하게는 98.5%, 보다 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자이고; 상기 핵산 구축물은 5' ITR 및 3' ITR 서열, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스의 5' ITR 및 3' ITR 서열, 보다 바람직하게는 AAV2 혈청형으로부터의 5' ITR 및 3' ITR 서열을 추가로 포함하는 바이러스 벡터에 포함되고, 5' ITR 및 3' ITR 서열은 각각 독립적으로 서열번호 15 또는 16의 서열, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되고, 이때 바람직하게는 5' ITR은 서열번호 15를 포함하고, 3' ITR은 서열번호 16을 포함하고; 상기 rAAV 입자는 바람직하게는 1013 내지 1014 vg/㎖(vg: 바이러스 게놈)의 범위 내에 포함된 농도에서 바람직하게는 피각당 50 내지 1000 ㎕, 바람직하게는 200 내지 700 ㎕의 범위 내에 포함된 부피로 미상 피각 핵으로의 실질내 경로를 통해 투여된다.
특정 실시양태에서, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 2시간 내지 6시간 동안 0.5 내지 5 ㎕/분의 범위 내에 포함된 주사 데빗으로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 AAV-9는 시누클레인병증, 예컨대, 파킨슨병 또는 신경병증성 고셔병의 치료를 위해 미상 피각 핵으로의 실질내 경로를 통해 인간 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다.
본 개시내용에 따른 상기 AAV-9 입자는 시누클레인병증, 예컨대, 파킨슨병 또는 신경병증성 고셔병의 치료를 위해 바람직하게는 1013 내지 1014 vg/㎖(vg: 바이러스 게놈)의 범위 내에 포함된 농도에서 피각당 50 내지 1000 ㎕, 바람직하게는 200 내지 700 ㎕의 범위 내에 포함된 부피로 미상 피각 핵으로의 실질내 경로를 통해 인간 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스 입자는 바람직하게는 2시간 내지 6시간 동안 0.5 내지 5 ㎕/분의 범위 내에 포함된 주사 데빗으로 투여된다.
본 개시내용의 생성물 또는 이를 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 이끌어내는 상기 생성물 또는 약학 조성물의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 투약 용법은 최적 치료 반응을 제공하도록 조절될 수 있다.
치료 유효량은 또한 전형적으로 치료적으로 유익한 효과가 상기 생성물 또는 약학 조성물의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 양이다.
임의의 특정 대상체의 경우, 특정 투약 용법은 개별 요구, 및 조성물을 투여하거나 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간에 따라 조절될 수 있다. 본원에 기재된 용량 범위는 예시하기 위한 것일 뿐이고 의료 종사자에 의해 선택될 수 있는 용량 범위를 제한하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 AAV 바이러스 입자는 시누클레인병증, 예컨대, 산발성 파킨슨병 또는 신경병증성 고셔병의 치료를 위해 108 내지 1014 vg/kg(vg: 바이러스 게놈; kg: 대상체 또는 환자의 체중)의 범위 내에 포함된 양 또는 용량으로 인간 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, AAV 바이러스 입자는 109 내지 1013 vg/kg의 범위 내에 포함된 양으로 투여된다. 보다 구체적인 실시양태에서, AAV 바이러스 입자는 인간 대상체에서 적어도 1010 내지 1012 vg/kg의 용량으로 투여된다.
나아가, 이러한 바이러스 입자의 다회 용량은 특히 전달 영역, 예를 들면, 흑질 치밀부 및/또는 미상 피각 핵을 통한 벡터의 균질한 분포를 보장하기 위해 동시적으로 또는 순차적으로 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 전형적으로, 예를 들면, 실질내 경로를 이용하여 바이러스 입자 용량의 3회, 4회, 5회 이상의 주사를 전달 영역, 예를 들면, 인간 대상체의 흑질 치밀부 및/또는 미상 피각 핵으로 동일한 시점에 투여할 수 있다.
키트
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 추가로 하나 이상의 용기 내에 전술된 핵산 구축물, 바이러스 벡터, 숙주 세포, 바이러스 입자 또는 약학 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 키트 내에 함유된 핵산 구축물, 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포 또는 약학 조성물을 환자에게 투여하는 방법이 기재되어 있는 설명서 또는 포장재를 포함할 수 있다. 키트의 용기는 임의의 적합한 재료, 예를 들면, 유리, 플라스틱, 금속 등, 및 임의의 적합한 크기, 모양 또는 입체구조를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 키트는 적합한 액체 또는 용액 형태로 본 발명의 생성물을 함유하는 하나 이상의 앰플 또는 주사기를 포함할 수 있다.
하기 실시예는 예증하기 위해 제공되고, 본 개시내용을 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예
후향성 수송을 가진 AAV를 시험하고 비교하기 위한 생체내 전파 어세이
rAAV를 제조하는 표준 방법을 이용하여 시험 rAAV-GFP를 제조하였다. 시험 rAAV-GFP는 CAG 프로모터의 조절 하에 있는 트랜스진으로서 GFP 코딩 서열 및 AAV2의 ITR을 가진 핵산 구축물을 사용하였고, 상기 핵산 구축물은 그의 후향성 수송 성질에 대해 시험될 AAV 혈청형의 캡시드 단백질로 팩키징되어 있다.
생체내 전파 어세이는 비인간 영장류의 후교련 피각 내로의 상기 rAAV-GFP의 실질내 주사로 상기 시험 rAAV-GFP를 주사하는 첫 번째 단계를 포함하였다.
그 다음, 상기 어세이는 주사한 지 1개월 후 대뇌 피질, 흑질, 편도체 및 미측 수질판내 핵에서 GFP 발현 뉴런의 수를 카운팅하는 단계를 포함하였다. 뇌 조직 표본에서 면역퍼록시다제에 의해 염색된 세포의 자동 비편향된 카운팅을 위해 디자인된 전체 슬라이드 디지털 영상화 및 깊은 콘볼루션 뉴런 네트워크(CNN) 알고리즘인 AiforiaTM를 이용하여 세포 카운팅을 수행하였다(Penttinen et al., European Journal of Neuroscience 2018; 48:2354-2361).
항-GFP 항체를 사용하여 GFP를 발현하는 뉴런을 면역퍼록시다제 염색으로 가시화하였다. 주사된 비인간 영장류의 뇌 전체에서 GFP 발현 뉴런을 자동으로 카운팅하였다. 도 20 및 23에 나타낸 바와 같이, GFP 양성 뉴런의 우선적인 국소화가 대뇌 피질의 심층(예를 들면, 층 V 및 VI)에서 일어났다. 피질 영역 이외에, 주사된 후교련 피각을 신경지배하는 모든 뇌 영역들, 특히 흑질 치밀부, 편도체 및 미측 수질판내 핵에서 GFP 발현 뉴런을 정량하였다(도 20 및 23).
1. 마우스에서의 연구:
시냅신 뉴런 특이적 프로모터의 조절 하에서 돌연변이된 형태의 인간 알파-시누클레인을 코딩하는 재조합 AAV 혈청형 9(rAAV2/9-SynA53T)를, 입체정위 수술을 통해 야생형 마우스(n = 11)의 SNc에 양측으로 주사하였다. 각각의 SNc는 1.0 마이크로리터의 1.36 x 10E13의 바이러스 현탁액을 제공받았다. 일단 신경퇴행 과정이 이미 진행되고 있으나 비-복귀 시점(예를 들면, rAAV2/9-SynA53T의 전달 후 4주)에 도달하기 전이면, 항시성 프로모터 GusB의 조절 하에서 GBA1 유전자를 코딩하는 재조합 AAV9(실시예 및 도면에서 교환 가능하게 rAAV9-GBA1 또는 rAAV2/9-GBA1로서 명명됨)를 우측 SNc 내로 전달하였고(1.0 마이크로리터의 1.25 x 10E13의 바이러스 현탁액), 이와 동시에 트랜스진을 코딩하지 않는 빈 대조군 rAAV9(실시예 및 도면에서 교환 가능하게 rAAV9-null 또는 r-AAV2/9-null로서 명명됨)를 좌측 SNc에 주사하였다. 4주 후(예를 들면, rAAV2/9-SynA53T의 처음 전달 후 8주), 동물을 희생시켰고 신경병리학적 분석을 위해 처리하였다. 수행된 실험 계획은 이하에 요약되어 있다(도 3).
5마리 마우스의 추가 코호트에서 수행된 웨스턴 블롯 분석(도 4 참조)은 (i) 우측 SNc(rAAV2/9-GBA1이 주사된 SNc)에서 향상된 GCase 단백질 수준 발현을 보여주었고, (ii) 우측 SNc에서 알파-시누클레인 단백질 수준의 명확한 감소를 보여주었다.
신경병리학적 데이터:
수행된 상세한 신경병리학적 분석은 (1) GCase의 rAAV2/9-GBA1 매개 향상이 알파-시누클레인의 거의 완전한 제거를 야기하였음을 보여주었다(데이터는 제시되어 있지 않음). (2) GCase의 증가된 발현 수준과 일치하는, 도파민작용성 뉴런에 발휘된 분명한 신경보호 효과와 더불어, 알파-시누클레인 제거는 인산화된(예를 들면, 응집된) 형태의 알파-시누클레인도 포함한다(데이터는 제시되어 있지 않음). (3) SNc에서의 티로신 양성 뉴런 밀도의 비편향된 입체논리적 추정은 좌측 SNc와 우측 SNc를 비교할 때 통계적으로 매우 유의미한 차이를 보여주었다. rAAV2/9-SynA53T를 좌측 SNc 내로 전달한 후 8주의 추적검사 시, 우측 SNc, 즉 rAAV2/9-GBA1로 치료받은 SNc에서 인지된 24%의 뉴런 사멸과 대조적으로 대략 55%의 뉴런 사멸이 관찰되었다(도 5). (4) 미세아교 유도 전구염증 현상은 rAAV2/9-GBA1의 전달 시 우측 SNc에서 약화되었다. 도파민작용성 뉴런이 알파-시누클레인을 발현하기 시작하자마자, 미세아교 세포는 아마도 알파-시누클레인 발현 뉴런을 주변으로부터 격리시키려는 시도로 표현형을 바꾸고 알파-시누클레인 발현 뉴런을 둘러쌌다. 미세아교 세포의 이 형태학적 표현형 전환은 AAV 매개 GCase 향상 시 정상 형태로 다시 복귀된다(데이터는 제시되어 있지 않음). 활성화된 미세아교에서 막 파동운동(ruffling) 및 식세포작용과 관련된 미세아교 및 대식세포 특이적 칼슘 결합 단백질인 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1(Iba1)에 대한 항체를 사용하여 SNc의 치료받은 쪽과 치료받지 않은 쪽을 비교함으로써 미세아교 표현형의 분석을 수행하였다.
종합하건대, 수득된 데이터는 이 치료 벡터가 질환 모델링 목적으로 사용된 혈청형과 동일한 혈청형의 벡터라는 점을 고려하더라도 AAV2/9-GBA1의 긍정적인 치료 효과를 암시한다. 다시 말해, 수득된 치료 효과는 동일한 혈청형을 가진 벡터 바이러스의 이전 주사에 의해 영향을 받지 않는다.
2. 비인간 영장류(NHP)에서 rAAV2/9-GBA1을 사용한 연구:
시냅신 뉴런 특이적 프로모터의 조절 하에서 돌연변이된 형태의 인간 알파-시누클레인을 코딩하는 재조합 AAV 혈청형 9(rAAV2/9-SynA53T)를, 입체정위 수술을 통해 야생형 비인간 영장류(마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis), n = 4)의 미측 절반 SNc에 양측으로 주사하였다. 미측 SNc의 전체 범위를 커버하기 위한 시도로 문미 방향으로 2 mm의 간격을 두고 5.0 마이크로리터의 1.36 x 10E13의 바이러스 현탁액의 두 침착물을 각각의 SNc에게 제공하였다. 일단 신경퇴행 과정이 이미 진행되고 있으나 비-복귀 시점(예를 들면, rAAV2/9-SynA53T의 전달 후 4주)에 도달하기 전이면, 항시성 프로모터 GusB의 조절 하에서 GBA1 유전자를 코딩하는 재조합 AAV9(rAAV2/9-GBA1)를 좌측 SNc 내로 전달하였고(1.0 마이크로리터의 1.25 x 10E13의 바이러스 현탁액), 이와 동시에 트랜스진을 코딩하지 않는 빈 대조군 rAAV9(r-AAV2/9-null)를 우측 SNc에 주사하였다. 8주 후(예를 들면, rAAV2/9-SynA53T의 처음 전달 후 12주), 동물을 희생시켰고 신경병리학적 분석을 위해 처리하였다. 수행된 실험 계획은 이하에 요약되어 있다(도 6).
신경영상 microPET 연구:
기준 시점에서 1회 스캔을 수행한 다음, rAAV2/9-SynA53T를 SNc 내로 양측으로 전달한 지 1개월, 2개월 및 3개월 후(예를 들면, rAAV2/9-GBA1 및 rAAv2/9-null 바이러스 벡터를 주사한 지 1개월 및 2개월 후) 연속 스캔을 수행하는 단계를 포함하는 MicroPET 연구를 규칙적인 간격으로 모든 동물들에서 수행하였다. 이 실험을 위해 선택된 방사성추적자는 높은 재현성으로 선명한 영상을 획득할 수 있게 하는 선택적 VMAT2 리간드인 11c-디하이드로테트라베나진이었다. 수득된 결과는 (도 7에 나타낸 바와 같이) 좌측 후교련 피각에서 측정된 방사성추적자 결합력이 우측 후교련 피각에서 관찰된 방사성추적자 결합력보다 더 높음을 보여주었다.
신경병리학적 데이터:
수행된 신경병리학적 분석은 (1) 티로신 하이드록실라제에 대한 면역조직화학적 염색의 이용 시, 후교련 피각 및 미상 핵과 중뇌의 수준에서 촬영된 NHP 뇌의 관상 박편으로부터 확인된 바와 같이, rAAV2/9-GBA1이 주사된 좌측 SNc에 동측으로 위치된 미측 후교련 피각의 보존된 신경지배와 함께, GCase의 rAAV2/9-GBA1 매개 향상이 알파-시누클레인 존재량을 감소시켰고 SNc에서 도파민작용성(TH+) 뉴런의 유의미한 신경보호를 발휘함을 보여주었다(데이터는 제시되어 있지 않음). (2) SNc에서의 티로신 양성 뉴런 밀도의 비편향된 입체논리적 추정은 좌측 SNc와 우측 SNc를 비교할 때 통계적으로 매우 유의미한 차이를 보여주었다. rAAV2/9-SynA53T를 우측 SNc 내로 전달한 후 12주의 추적검사 시, 좌측 SNc, 즉 rAAV2/9-GBA1로 치료받은 SNc에서 인지된 15%의 뉴런 사멸과 대조적으로 대략 39%의 뉴런 사멸이 관찰되었다(도 8). (3) 돌연변이된 알파-시누클레인의 프리온 유사 뉴런 횡단 확산이 우측 전두엽 피질의 여러 뇌 영역들에서 관찰되었고, 여기서 알파-시누클레인을 발현하는 적당한 양의 피라미드형 뉴런이 rAAV2/9-SynA53T를 전달한 지 3개월 후에 인지되었다. 가장 중요하게는, 좌측 SNc에서 GCase 활성의 AAV 매개 향상은 알파-시누클레인 존재량을 감소시킴으로써, 알파-시누클레인의 뉴런 횡단 확산을 방해하였다. 구체적으로, 알파-시누클레인의 면역조직화학적 검출은 3개월의 AAV 매개 돌연변이된 알파-시누클레인 과다발현이 알파-시누클레인 응집체의 뉴런 횡단 확산을 야기하였음을 보여준다. rAAV2/9-SynA53T를 우측 SNc 내로 전달하였을 때, 내측 전뇌 다발을 통과함으로써, 전두엽 피질의 여러 뇌 영역들 전체에 걸쳐 알파-시누클레인 면역반응성을 보이는 적당한 수의 피라미드형 뉴런의 출현을 유발하는 고밀도의 시누클레인 양성 섬유가 관찰되었다. 대조적으로, 좌측 SNc에서 2개월의 AAV 매개 GCase 활성 향상 후, 내측 전뇌 다발을 통과하는 것으로 관찰된 시누클레인 양성 섬유의 밀도는 분명히 감소되었고, 실제로 전두엽 피질에서 2차 표지부착된 뉴런은 인지되지 않았다(데이터는 제시되어 있지 않음). (4) 미세아교 유도 전구염증 현상은 좌측 SNc, 즉 rAAV2/9-GBA1로 치료받은 SNc에서 약화되었다(데이터는 제시되어 있지 않음). 활성화된 미세아교 표현형에 대한 특이적 마커인 주조직적합성 복합체 클래스 II(MHC-II)(예를 들면, 휴면 미세아교 세포는 MHC-II의 발현을 결여함)에 대한 항체를 사용하여 SNc의 치료받은 쪽과 치료받지 않은 쪽을 비교함으로써 미세아교 표현형의 분석을 수행하였다.
마우스 연구에 대해 언급된 바와 같이, 비인간 영장류 데이터는 이 치료 벡터가 질환 모델링 목적으로 사용된 벡터와 동일한 혈청형의 벡터임을 고려하더라도 AAV2/9-GBA1의 긍정적인 치료 효과를 암시한다. 다시 말해, 수득된 치료 효과는 동일한 혈청형을 가진 바이러스 벡터의 이전 주사에 의해 영향을 받지 않는다.
3. GCase의 후향성 전파는 마우스에서 대뇌 피질 전체에 걸쳐 인산화된 알파-시누클레인의 제거를 야기하였다.
알파-시누클레인은 프리온과 유사한 방식으로 뇌 회로를 통과할 수 있다고 추정되었다. 이 현상은 나중에 SNc 이외의 뇌 영역, 특히 대뇌 피질에도 영향을 미치는 진행성 시누클레인병증의 존재로 인해 비-운동 증상(치매 및 신경정신과적 증상)까지 진행하는, SNc에 위치된 알파-시누클레인 응집체로 인한 운동 증상을 초기 특징으로 하는 질환의 임상 경과를 설명한다. 이와 관련하여, 이 진행성 시누클레인병증이 대뇌 피질에 영향을 미칠 때 PD의 진행된 병기에서 치매 및 신경정신과적 증상의 출현을 지속시키는 주요 원동력이므로, 질환 변형 치료 대안을 디자인하게 될 때 이러한 널리 퍼진 시누클레인병증을 정확히 표적화하는 방법을 찾는 것이 핵심이라는 것은 주목할 가치가 있다. 다시 말해, 진행된 질환 병기의 PD 환자가 다수의 뇌 영역들, 특히 대뇌 피질 전체에 걸쳐 일반화된 시누클레인병증을 나타낼 것임을 고려할 때, 치료받을 뇌 영역 전체에 걸쳐 넓게 전파되는 생성물에 대한 신규 치료 방법이 여전히 필요하다.
PD 이외의 시누클레인병증, 예컨대, 주요 신경병리학적 특징이 대뇌 피질에 걸친 루이체 및 루이 신경돌기의 존재로 표시되는 DLB를 고려할 때에도 마찬가지이다.
종합하건대, 현재 주요 충족되지 않은 의학적 요구는 이 무자비한 뇌 장애의 끊임없는 진행 과정을 늦추거나 심지어 이상적으로 정지시킬 의도로 PD 및 관련 시누클레인병증에 대한 질환 변형 전략을 개발하는 것이다. 따라서, 임의의 성공적인 치료 접근법은 바람직하게는 특히 진행된 질환 병기의 PD 환자들, 즉 질환 진행 속도를 최소화기 위한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 가장 높은 환자들을 대면할 때 뇌 전체에 걸쳐 알파-시누클레인 제거를 수행함에 있어서 효율적이어야 한다.
그러므로, 본 발명자들은 후향성 수송을 가진 AAV 변이체 입자가 주사된 영역으로부터 특히 피질 영역을 포함하는 먼 영역까지 효율적으로 전파될 수 있을지를 먼저 시험하였다.
시냅신 뉴런 특이적 프로모터의 조절 하에서 돌연변이된 형태의 인간 알파-시누클레인을 코딩하는 재조합 AAV2-retro(rAAV2retro-SynA53T)를, 입체정위 수술을 통해 야생형 마우스의 선조체에 양측으로 주사하였다. 주사된 선조체를 신경지배하는 대뇌 피질 영역 전체에 걸쳐 널리 퍼진 시누클레인병증을 더 발생시키기 위해 2.0 마이크로리터의 3.71 x 10E12 vp/㎖의 바이러스 현탁액을 각각의 선조체에게 제공하였다. 4주 후, 항시성 프로모터 GusB의 조절 하에서 GBA1 유전자를 코딩하는 재조합 AAV2-retro(rAAV2retro-GBA1)를 좌측 선조체 내로 전달하였고(2.0 마이크로리터; 3.71 x 10E12 vp/㎖의 바이러스 현탁액), 이와 동시에 트랜스진을 코딩하지 않는 빈 대조군 rAAV2-retro(rAAV2retro-null)를 우측 선조체에 주사하였다. 4주 후(예를 들면, rAAV2retro-SynA53T의 처음 전달 후 8주), 동물을 희생시켰고 신경병리학적 분석을 위해 처리하였다. 수행된 실험 계획은 이하에 요약되어 있다(도 9).
신경병리학적 데이터:
수행된 분석은 GCase의 AAV2retro-GBA1 매개 향상이 좌측 뇌 반구(예를 들면, 먼저 rAAV2retro-SynA53T가 주사되고 나중에 rAAV2retro-GBA1이 주사된 선조체에 동측으로 위치된 뇌 반구)의 수준에서 대뇌 피질 전체에 걸쳐 인산화된 알파-시누클레인의 거의 완전한 제거를 야기하였음을 보여주었다. 대조적으로, 명확한 시누클레인병증이 우측 뇌 반구(먼저 rAAV2retro-SynA53T가 주사되고 나중에 대조군 벡터 rAAV2retro-null이 주사된 선조체에 동측으로 위치된 뇌 반구)의 많은 피질 영역들 내에 여전히 존속한다(도 10).
4. 비인간 영장류(NHP)에서 rAAV-TT-GBA1을 사용한 연구:
시냅신 뉴런 특이적 프로모터의 조절 하에서 돌연변이된 형태의 인간 알파-시누클레인을 코딩하는 재조합 AAV 혈청형 9(rAAV2/9-SynA53T)를, 입체정위 수술을 통해 야생형 비인간 영장류(마카카 파스시쿨라리스, n = 4)의 미측 절반 SNc에 양측으로 주사하였다. 미측 SNc의 전체 범위를 커버하기 위한 시도로 문미 방향으로 2 mm의 간격을 두고 5.0 마이크로리터의 1.36 x 10E13의 바이러스 현탁액의 두 침착물을 각각의 SNc에게 제공하였다. 일단 신경퇴행 과정이 이미 진행되고 있으나 비-복귀 시점(예를 들면, rAAV2/9-SynA53T의 전달 후 4주)에 도달하기 전이면, 항시성 프로모터 CAG의 조절 하에서 GBA1 유전자를 코딩하는 재조합 AAV-TT(rAAV-TT-GBA1)를 좌측 후교련 피각 내로 전달하였다(2 x 10 마이크로리터의 1 x 10E13의 바이러스 현탁액). 압력-주사를 0.5 ㎕/분의 펄스로 달성하였다. 비인간 영장류에서, 데빗은 보다 낮은 범위로 조절된다. 그러나, 인간 시험에서 높은 주사 속도는 바이러스 안정성 및 더 우수한 환자 관리를 가능하게 하고, 데빗은 0.5 ㎕/분 내지 5 ㎕/분일 수 있다. 8주 후(예를 들면, rAAV2/9-SynA53T의 처음 전달 후 12주), 동물을 희생시켰고 신경병리학적 분석을 위해 처리하였다. 수행된 실험 계획은 이하에 요약되어 있다(도 11).
신경영상 microPET 연구:
기준 시점에서 1회 스캔을 수행한 다음, rAAV2/9-SynA53T를 전달한 지 1개월, 2개월 및 3개월 후(예를 들면, rAAV-TT-GBA1 바이러스 벡터를 주사한 지 1개월 및 2개월 후) 연속 스캔을 수행하는 단계를 포함하는 MicroPET 연구를 규칙적인 간격으로 모든 동물들에서 수행하였다. 이 실험을 위해 선택된 방사성추적자는 높은 재현성으로 선명한 영상을 획득할 수 있게 하는 선택적 VMAT2 리간드인 11c-디하이드로테트라베나진(11C-DTBZ)이었다. 수득된 결과는 좌측 후교련 피각에서 측정된 방사성추적자 결합력이 rAAV-TT-GBA1을 전달하기 1.5개월 전에 관찰된 방사성추적자 결합력보다 24.44% 더 높았음을 보여주었다. 수득된 결과는 도 12에 표시되어 있다.
신경병리학적 데이터:
수행된 신경병리학적 분석은 (1) 티로신 하이드록실라제에 대한 면역조직화학적 염색의 이용 시, 후교련 피각 및 미상 핵과 중뇌의 수준에서 촬영된 NHP 뇌의 관상 박편으로부터 확인된 바와 같이, rAAV2/9-GBA1이 주사된 좌측 SNc에 동측으로 위치된 미측 후교련 피각의 보존된 신경지배와 함께, GCase의 rAAV-TT-GBA1 매개 향상이 알파-시누클레인 존재량을 감소시켰고 SNc에서 도파민작용성(TH+) 뉴런의 유의미한 신경보호를 발휘함을 보여주었다(데이터는 제시되어 있지 않음). (2) SNc에서의 티로신 양성 뉴런 수의 자동 카운팅은 좌측 SNc와 우측 SNc를 비교할 때 통계적으로 매우 유의미한 차이를 보여주었다. rAAV2/9-SynA53T를 좌측 및 우측 SNc 내로 전달한 후 12주(rAAV-TT-GBA1을 좌측 후교련 피각 내로 전달한 후 2개월)의 추적검사 시, 좌측 SNc에서의 티로신 양성 뉴런의 총수는 우측 SNc(rAAV-TT-GBA1의 피각내 전달로 치료받지 않은 SNc)에서의 티로신 양성 뉴런 수보다 22.3% 더 높은 것으로 발견되었다(도 13). 좌측 후교련 피각 내로 rAAV-TT-GBA1 주사를 받은 4마리의 NHP의 좌측 및 우측 후교련 피각에서 TH 염색에 대한 광학 밀도(OD)의 자동 측정은 평균 OD가 좌측 후교련 피각에 비해 우측 후교련 피각에서 27.42% 더 낮았음을 보여주었다(좌측 후교련 피각은 rAAV-TT-GBA1의 피각내 전달로 치료받은 후교련 피각임)(도 14). (3) 나아가, SNc에서의 알파-시누클레인 양성 뉴런 수의 자동 카운팅은 좌측 SNc와 우측 SNc를 비교할 때 통계적으로 유의미한 차이를 보여주었다. 좌측 및 우측 SNc 내로의 rAAV2/9-SynA53T의 전달 후 9주의 추적검사 시(예를 들면, 좌측 후교련 피각 내로의 rAAV-TT-GBA1의 전달 후 1.5개월), 좌측 SNc에서의 알파-시누클레인 발현 뉴런의 총수는 우측 SNc(rAAV-TT-GBA1의 피각내 전달로 치료받지 않은 SNc)에서의 알파-시누클레인 양성 뉴런의 수보다 48.33% 더 낮은 것으로 확인되었다(도 15).
알파-시누클레인 발현 뉴런의 퍼센트는 우측 SNc(치료받지 않은 쪽)보다 좌측 SNc(예를 들면, AAV-TT-GBA1이 주사된 후교련 피각에 동측으로 위치된 SNc)에서 일관되게 더 낮다(도 16).
마우스 연구에 대해 언급된 바와 같이, 비인간 영장류 데이터는 rAAV-TT-GBA1의 긍정적인 치료 효과를 암시한다.
5. 비인간 영장류 뇌에서 AAV-TT-GFP 및 AAV9-GFP의 생체분포 및 비교 성능
5.1 수행된 실험
5 ㎕의 AAV-TT-GFP(1 x 1013 vg/㎖, 2마리 동물) 또는 5 ㎕의 AAV9-GFP(1 x 1013 vg/㎖, 2마리 동물)를 최대 4마리의 성체 어린 수컷 마카카 파스시쿨라리스 영장류(체중 3.0 내지 3.4 Kg)에게 주사하였다. 상기 AAV 둘 다가 CAG 프로모터의 조절 하에서 GFP를 코딩하고 있었다.
해밀톤 주사기를 이용하여 뇌실조영술 보조 입체정위 수술을 통해 AAV를 투여하였다. 압력-주사를 0.5 ㎕/분의 펄스로 달성하였다. 비인간 영장류에서, 데빗은 보다 낮은 범위로 조절된다. 그러나, 인간 시험에서 높은 주사 속도는 바이러스 안정성 및 더 우수한 환자 관리를 가능하게 하고, 데빗은 0.5 ㎕/분 내지 5 ㎕/분일 수 있다. 일단 AAV 전달이 완료되면, 주사관을 통한 AAV 역류를 최소화하기 위해 추가 10분 동안 주사 바늘을 제자리에 남겨두었다(도 17). 수술 직전, 체액 샘플(혈액 및 CSF)을 채취하고 -80℃에서 저장하였다.
심장내 관류를 통해 AAV를 전달한 지 1개월 후 동물을 희생시켰다. 희생 전, 체액 샘플(혈액 및 CSF)을 채취하고 -80℃에서 저장하였다. 관류액은 식염수 링거 용액에 이어, 파라포름알데하이드의 완충된 용액(3,000 ㎖/동물) 및 pH 7.3의 인산염 완충제 0.1 M 중의 10% 글리세린 및 1% DMSO로 만들어진 1,000 ㎖의 냉동보호 용액으로 구성되었다.
링거 용액으로 관류하는 동안, 심장, 폐, 간, 비장, 췌장, 신장, 고환 및 선조체 근육을 비롯한 다수의 말초 장기로부터 신선한(예를 들면, 고정되지 않은) 조직 샘플을 채취하였다. 샘플을 드라이 아이스 상에서 냉동시키고 -80℃에서 저장하였다.
일단 관류가 완료되면, 두개골로부터 뇌를 제거하였고 폭이 대략 1cm인 뇌 블록을 만들었고 pH 7.3의 인산염 완충액 0.1 M 중의 20% 글리세린 및 2% DMSO로 만들어진 냉동보호 용액에서 저장하였다(모든 뇌 블록들로부터 제거된 피아(pia) 물질). 고정된 말초 장기(심장, 폐, 간, 비장, 췌장, 신장, 고환, 후복막 신경절, 송과선 및 선조체 근육)로부터 샘플을 수득하고 파라핀에 추가로 포매하였다.
냉동보호 용액에서 최소 48시간 후, 슬라이딩 마이크로톰(sliding microtome)에서 10개의 일련의 냉동된 관상 뇌 박편(40 ㎛ 두께)을 만들어 냉동보호 용액에 수집하였다. 토끼에서 생성된 일차 다중클론 항체를 사용하여 GFP를 면역퍼록시다제 검출하기 위해 하나의 전체 일련의 박편들(예를 들면, 원숭이 뇌의 10번째 박편마다 포함함)을 처리하였다. 박편을 바이오티닐화된 염소 항-토끼 IgG와 함께 인큐베이션한 후, ABC 키트와 함께 인큐베이션하였고, 마지막으로 H2O2-DAB 용액을 사용하여 염색하였다. 일단 염색이 완료되면, 자유 부유 박편을 현미경관찰 슬라이드 상에 장착하고 하룻밤 동안 공기 건조하고 엔텔란(entellan)으로 커버 슬립핑하였다. Aperio CS2 슬라이드 스캐너(Leica)를 이용하여 염색된 박편을 스캐닝하였고 전용 소프트웨어를 이용하여 처리하였다.
5.2 결과
AAV-TT-GFP 또는 AAV9-GFP를 사용한 표지부착은 후교련 피각을 신경지배하는 것으로 알려진 뇌 영역 전체에서만 발견된 반면, 주사 부위를 신경지배하지 않는 뇌 영역(예를 들면, 해마, 소뇌 등)에서는 단일 표지부착된 뉴런조차도 관찰되지 않았다. 더욱이, 수득된 후향성 표지부착은 "골지 유사" 형태를 가졌다. 즉, 뉴런 표지부착은 체세포로 제한되지 않았고, 실제로 원위 수상돌기 전체, 특히 대뇌 피질 전체에 걸친 위치에서 확장된다. 작은 수상돌기 과정, 예컨대, 수상돌기 가시가 종종 보이기도 한다는 것도 주목할 가치가 있다.
주사 부위에서의 사건
AAV-TT-GFP의 두 주사는 정확하였고 후교련 피각의 경계 내에 적절히 위치되었다. (AAV-TT-GFP가 주사된) 동물 M295 및 M296에서 각각 28.01% 및 21.83%를 커버하는, 주사 부위에 대한 수득된 크기는 AAV9-GFP보다 AAV-TT-GFP의 경우 일관되게 더 작은 반면, AAV9-GFP가 주사된 동물(M297 및 M298)에서 각각 32.46% 및 55.86%의 후교련 피각이 주사 부위 내에 포함되었다(도 18). AAV-TT-GFP를 사용한 두 주사는 주사관을 통한 AAV 흡수의 완전한 결여를 보였다(예를 들면, 이들은 둘 다 매우 깨끗한 주사임). 대조적으로, AAV9-GFP를 사용함으로써 수행된 주사는 주사관을 통한 중간 내지 높은 흡수를 나타내었는데, 이것은 수득된 결과가 후교련 피각 위에 위치된 백색 물질 관에 의한 AAV9-GFP 흡수로 인해 거짓 양성 표지부착(아마도 특히 피질 영역 내에서 두드러짐)에 의해 오염되어 있을 가능성이 매우 높음을 의미한다. 거짓 양성 결과와 관련된 문제는 도 19에 표시되어 있다. 나아가, 동물 M297에서 AAV9-GFP의 전달은 후교련 피각의 경계를 넘어 확산되었고 외부 담창구(GPe)의 실질적인 부분도 포함한다.
후향성 확산의 효능
후향적으로 표지부착된 뉴런의 총수 및 관찰된 강도 둘 다가 주사 부위의 범위와 직접적으로 관련되어 있다. 다시 말해, 후교련 피각의 더 큰 영역을 커버하는 주사 부위로부터 더 높은 수의 GFP+ 뉴런이 예상된다. 이와 관련하여, 관심 있는 각각의 영역에서 관찰된 뉴런 수의 정확한 정량을 제공하는 것 이외에, 이 최종 수는 주사 부위에 의해 커버되는 후교련 피각 영역의 범위에 의해 보정될 필요가 있다. Aiforia®를 사용함으로써 수행된 정량에 근거한 뉴런의 수가 제공된다("원" 데이터 및 "보정된" 데이터로서 표지부착됨). AAV-TT의 성능을 AAV9의 성능과 적절히 비교하기 위해, 수득된 원 데이터는 주사 부위의 범위를 고려함으로써 표준화될 필요가 있다. 따라서, 각각의 AAV의 예상된 후향성 확산을 적절히 추정하기 위해 주사 부위의 크기에 근거한 보정 계수를 계산하였다. 보정 계수는 M295의 경우 x3.57, M296의 경우 x4.58, M297의 경우 x3.08, 그리고 M298의 경우 x1.79이었다. 도 20 내지 25에 나타낸 데이터를 생성하기 위해 보정 계수를 사용하였다.
가장 강한 표지부착을 보이는 뇌 영역
모든 동물들(AAV-TT-GFP 및 AAV9-GFP)에서, 가장 강한 표지부착은 상전두회 및 전중심회에서 관찰되었다(도 20 및 21). (비록 더 낮은 정도이지만) GFP+ 뉴런을 일관되게 보이는 다른 피질 영역은 전방 대상 피질, 중심후회 및 도회이다. 중전두회, 하전두회, 안와 전두엽 피질(전두엽 안와, 외측 안와 및 내측 안와 영역), 상측두회, 중측두회, 하측두회뿐만 아니라, 상두정소엽 및 연상회에서도 희박한 뉴런 표지부착이 관찰되었다. 나아가, GFP+ 뉴런은 (분명히 훨씬 더 낮은 수의 GFP+ 뉴런을 함유하는) 동측 피질의 거울 유사 표시로서 반대측 피질에서 일관되게 발견되었다. 후교련 피각(운동 관련 피각 영역) 내로의 AAV 전달 시, 전중심회 및 상전두회(각각 일차 운동 피질 및 보충 운동 영역을 함유하는 피질회) 둘 다에서 가장 강한 표지부착이 관찰되었음을 유념하였을 때, 결과는 예상된 것과 완전히 일치하고 실제로 매우 관련성이 있다. 피질하 표지부착의 경우, 2개의 구조물, 즉 흑질 치밀부(SNc)와 중심정중앙-다발곁(centromedian-parafascicularis) 복합체(CM-Pf)는 특히 관련되어 있다. 더욱이, CM-Pf 시상 복합체가 시상선조체 돌출부의 주공급원이라는 점을 고려하였을 때, CM-Pf에서 관찰된 GFP+ 뉴런의 양은 예상되었지만 매우 인상적이다. 희박한 표지부착은 CM-Pf 이외에 배측 전방, 배측 외측 및 배측 후내측 시상 핵, 중심 외측 및 중심주변 수질판내 핵 및 등측 솔기 핵(피각으로의 세로토닌작용성 돌출부의 주공급원인 것으로 알려진 작은 뇌간 핵)에서도 발견되었다. 뿐만 아니라, 편도 복합체의 수준에서 관찰된 표지부착은 두 AAV 유형들에 대해 처음 예상된 것보다 더 낮다. 편도 복합체가 (피질, 시상 및 흑질과 함께) 피각에 대한 구심성의 또 다른 공급원으로서 종종 간주되어 왔지만, AAV-TT 및 AAV9를 사용하여 수득한 데이터는 이 해부학적 경로의 중요성이 이전 해부학적 연구에서 과대평가되었을 가능성이 있음을 분명히 암시하였다.
선조체 구심성 시스템
본 연구가 이 목적을 위해 디자인되지는 않았지만, 수행된 정량은 각각의 상이한 선조체 구심성 시스템, 즉 피질선조체 경로(동측 및 반대측), 시상선조체 및 흑질선조체 돌출부의 "중량"을 수치적으로 평가할 수 있게 한다. 수득된 데이터는 동측 피질선조체 돌출부가 단연코 가장 풍부한 돌출부이고(평균적으로 총 선조체 구심성의 69.37%), 반대측 피질선조체 돌출 뉴런(총 선조체 구심성의 15.99%), 그 다음 흑질선조체 돌출부(평균 7.99%) 및 마지막으로 중심정중앙-다발곁 시상 복합체로부터 발생된 시상선조체 돌출부(6.67%)가 그 뒤를 잇는다는 것을 보여주었다. 이와 관련하여, 반대측 피질선조체 경로가 기저핵 기능 및 기능장애를 다루는 대다수의 연구들에서 종종 무시되어 왔지만, 이 돌출부가 총 선조체 구심성의 대략 최대 16%를 차지하고, 이 퍼센트는 시상선조체 및 흑질선조체 돌출부와 관련된 선조체 구심성보다 분명히 더 높다.
수득된 결과는 AAV9-GFP와 비교되었을 때 AAV-TT-GFP의 더 우수한 성능을 뒷받침하였다. 결과의 심층 비교는 AAV-TT가 AAV9보다 더 우수한 후보물질임을 보여주었다. AAV-TT는 특히 후향성 확산의 관점에서 더 높은 "효능"을 다룰 때 주사관을 통한 흡수의 결여와 함께 일부 중요한 장점을 가진다. AAV-TT의 사용은 거짓 양성의 완전한 결여를 제공한다.
6. AAV-TT-GBA1 대 AAV9-GBA1의 성능 비교
6.1 수행된 실험
AAV2/9-SynA53T를, 입체정위 수술을 통해 야생형 비인간 영장류(마카카 파스시쿨라리스, n = 8)(체중 4.3 내지 10.4 kg)의 좌측 및 우측 흑질 치밀부에 주사하였다. 미측 SNc의 전체 범위를 커버하기 위한 시도로 문미 방향으로 1 mm의 간격을 두고 각각 5.0 마이크로리터의 1.26 x 10E12 vg/㎖의 바이러스 현탁액의 두 침착물을 각각의 SNc에게 제공하였다(예를 들면, 총 4회 주사/동물).
AAV2/9-SynA53T를 전달한 지 6주 후, 항시성 프로모터 CAG의 조절 하에서 GBA1 유전자를 코딩하는 재조합 AAV-TT(AAV-TT-GBA1)를 좌측 후교련 피각 내로 전달하였다(2 x 10 마이크로리터의 1 x 10E13 vg/㎖의 바이러스 현탁액; 4마리 동물, 문미 방향으로 서로 1 mm 간격을 두고 주사). 8주 후(예를 들면, AAV2/9-SynA53T의 처음 전달 후 12주), 동물을 희생시켰고 신경병리학적 분석을 위해 처리하였다. 수행된 실험 계획은 도 26에 요약되어 있다. 해밀톤 주사기를 이용하여 뇌실조영술 보조 입체정위 수술을 통해 AAV를 투여하였다. 압력-주사를 0.5 ㎕/분의 펄스로 달성하였다. 비인간 영장류에서, 데빗은 보다 낮은 범위로 조절된다. 그러나, 인간 시험에서 높은 주사 속도는 바이러스 안정성 및 더 우수한 환자 관리를 가능하게 하고, 데빗은 0.5 ㎕/분 내지 5 ㎕/분일 수 있다. 일단 AAV 전달이 완료되면, 주사관을 통한 AAV 역류를 최소화하기 위해 추가 10분 동안 주사 바늘을 제자리에 남겨 두었다.
체액 샘플(혈액 및 CSF)을 기준 시점(예를 들면, AAV9-SynA53T를 사용한 수술 전), GBA1 코딩 벡터의 전달 전 및 희생 시 채취하였다.
기준 시점, 및 AAV9-SynA53T의 주사 후 4주, 8주 및 12주에서 방사성추적자 11C-디하이드로테트라베나진(11C-DTBZ)을 사용하여 MicroPET 스캔을 수행하였다.
심장내 관류를 통해 AAV9-SynA53T를 전달한 지 12주 후(예를 들면, AAV-tt-GBA1 또는 AAV9-GBA1을 주사한 지 6주 후) 동물을 희생시켰다. 희생 전, 체액 샘플(혈액 및 CSF)을 채취하고 -80℃에서 저장하였다. 관류액은 식염수 링거 용액에 이어, 파라포름알데하이드의 완충된 용액(3,000 ㎖/동물) 및 pH 7.3의 인산염 완충제 0.1 M 중의 10% 글리세린 및 1% DMSO로 만들어진 1,000 ㎖의 냉동보호 용액으로 구성되었다.
링거 용액으로 관류하는 동안, 심장, 폐, 간, 비장, 췌장, 신장, 고환 및 선조체 근육을 비롯한 다수의 말초 장기로부터 신선한(예를 들면, 고정되지 않은) 조직 샘플을 채취하였다. 샘플을 드라이 아이스 상에서 냉동시키고 -80℃에서 저장하였다.
일단 관류가 완료되면, 두개골로부터 뇌를 제거하였고 폭이 대략 1cm인 뇌 블록을 만들었고 pH 7.3의 인산염 완충액 0.1 M 중의 20% 글리세린 및 2% DMSO로 만들어진 냉동보호 용액에서 저장하였다(모든 뇌 블록들로부터 제거된 피아 물질). 고정된 말초 장기(심장, 폐, 간, 비장, 췌장, 신장, 고환, 후복막 신경절, 송과선 및 선조체 근육)로부터 샘플을 수득하고 파라핀에 추가로 포매하였다(MOTAC로 보내짐).
냉동보호 용액에서 최소 48시간 후, 슬라이딩 마이크로톰에서 10개의 일련의 냉동된 관상 뇌 박편(40 ㎛ 두께)을 만들어 냉동보호 용액에 수집하였다. 염소에서 생성된 일차 다중클론 항체를 사용함으로써 티로신 하이드록실라제(TH)를 면역퍼록시다제 검출하기 위해 하나의 전체 일련의 박편들(예를 들면, 원숭이 뇌의 10번째 박편마다 포함함)을 처리하였다. 박편을 바이오티닐화된 당나귀 항-염소 IgG와 함께 인큐베이션한 후, ABC 키트와 함께 인큐베이션하였고, 마지막으로 H2O2-DAB 용액을 사용하여 염색하였다. 나아가, 마우스에서 생성된 일차 단일클론 항체를 사용함으로써 알파-시누클레인(α-syn)을 면역퍼록시다제 검출하기 위해 또 다른 전체 일련의 박편들을 처리하였다. 박편을 바이오티닐화된 당나귀 항-마우스 IgG와 함께 인큐베이션한 후, ABC 키트와 함께 인큐베이션하였고, 마지막으로 H2O2-DAB 용액을 사용하여 염색하였다. 일단 염색이 완료되면, 자유 부유 박편을 현미경관찰 슬라이드 상에 장착하고 하룻밤 동안 공기 건조하고 엔텔란으로 커버 슬립핑하였다. Aperio CS2 슬라이드 스캐너(Leica)를 이용하여 염색된 박편을 스캐닝하였고 전용 소프트웨어를 이용하여 처리하였다.
6.2 결과
알파-시누클레인 제거에 대한 AAV-TT-GBA1 대 AAV9-GBA1의 성능뿐만 아니라, 흑질선조체 돌출 도파민작용성 뉴런에서의 GCase 향상 및 알파-시누클레인 제거의 잠재적 신경보호 효과도 비교하였다.
신경영상 microPET 연구
기준 시점, 및 AAV9-SynA53T의 주사 후 4주, 8주 및 12주에서 11C-DTBZ를 사용한 MicroPET 스캔을 수행하였다. (전형적으로 5개 내지 9개의 상이한 박편을 사용하여) 후교련 피각의 전체 문미 범위를 포함하는 관심 있는 영역을 통해 방사성추적자 결합력에 대한 값을 계산하였다(도 27).
AAV-TT-GBA1이 주사된 동물에서, AAV-TT-GBA1을 전달한 지 2주 후(예를 들면, AAV9-SynA53T를 주사한 지 단지 6주 후) 결합 값에 비해 AAV-TT-GBA1을 전달한지 6주 후(예를 들면, AAV9-SynA53T를 주사한 지 12주 후) 방사성추적자 결합의 경미한 개선이 있다. 관찰된 증가는 1%(M282), 15%(M280), 22%(M287) 및 53%(M283)이다. 기준 시점(예를 들면, 시누클레인병증의 유도 전)에서의 결합 값과 비교되었을 때, 모든 동물들에 대한 수득된 값은 기준 수준 미만으로 유지되었다(M280에서 -22%, M287에서 -24%, M282에서 -25%, 그리고 M283에서 -32%). 우측 후교련 피각(주사 받지 않은 쪽)에 대한 수득된 값은 동물 M280 및 M282에 대한 기준 수준과 대략 유사한 수준으로 유지된 반면, 동물 M283 및 M287에서는 적당한 감소가 관찰되었다.
AAV9-GBA1이 주사된 동물의 경우, 동물 M286에 대한 임의의 분명한 효과 없이 동물 M281, M284 및 M285에서 가장 높은 수준의 방사성추적자 흡수가 인지되었다. AAV9-SynA53T가 이 동물에 적절히 주사되지 않았음(잘못 표적화된 좌측 및 우측 흑질)을 유념하였을 때, M281에 대한 값은 놀랍지 않다. M281, M284 및 M285이 기준 수준에 비해 추적검사 기간의 말기에 최종적으로 거의 유사한 수준에 도달하였지만, 동일한 동물에 대해 우측 피각에서도 유사한 증가가 관찰되었다는 것도 주목할 가치가 있다.
흑질선조체 신경지배(광학 밀도)
흑질 치밀부의 도파민작용성 뉴런이 파킨슨병의 환경 하에서 사멸에 왜 그렇게 취약한 지를 설명할 때, 흑질선조체 돌출부의 크고 복잡한 축삭 수지상부(arborization)의 독특한 구조(Matsuda et al., J Neurosci. 2009 Jan 14; 29(2): 444-453)가 도파민작용성 뉴런을 세포 사멸에 기여하는 요인에 특히 민감하게 만들 정도로 이 뉴런을 높은 에너지 수지(energy budget) 하에 둔다는 가설을 세웠다(Bolam and Pissadaki, Mov Disord. 2012 Oct;27(12):1478-83). 실제로, 선조체의 부피가 래트(19.9 mm3)에서 인간(6,280 mm3)으로 대략 300배 증가하였지만, 도파민작용성 뉴런의 수는 단지 32배 증가되었다는 것은 주목할 만하다. 요약하건대, 신경보호 연구를 다룰 때, 흑질선조체 경로가 보존되는 정도는 강한 주목을 끌만하다.
이 목적을 위해, 후교련 피각의 전체 범위를 커버하는 10개 내지 12개의 동등하게 이격된 문미 관상 박편들을 TH에 대해 염색하였고 광학 밀도(OD)에 대해 더 분석하였다. 좌측 및 우측 후교련 피각 수준에 대한 OD 값을 비교하는 수득된 데이터는 도 28 및 29에 표시되어 있다.
치료 이익을 반영하는 좌측 OD와 우측 OD의 차이는 AAV9-GBA1이 주사된 동물보다 AAV-TT-GBA1이 주사된 동물에서 후교련 피각의 전체 문미 범위 전체에 걸쳐 일관되게 더 높은 것으로 확인되었다.
도파민작용성 뉴런에 대한 GBA1 코딩 AAV의 신경보호 효과
수행된 연구의 주요 목적들 중 하나는 AAV에 의해 유도된 GCase 향상이 흑질선조체 돌출 도파민작용성 뉴런의 신경보호 효과를 어느 정도 발휘하는지를 평가하는 것이었다. 이 목적을 위해, TH에 대해 염색되고 흑질의 전체 문미 범위를 커버하는 최대 14개의 관상 박편들을 도파민작용성 세포 카운팅에 대해 분석하였다. 심층 학습 알고리즘 Aiforia®를 이용하여 분석을 수행하였다. 수득된 데이터는 도 30 및 31에 표시되어 있다.
치료 이익을 반영하는 좌측과 우측의 차이는 AAV9-GBA1이 주사된 동물보다 AAV-TT-GBA1이 주사된 동물에서 일관되게 더 높은 것으로 발견되었다. 실제로, AAV-TT-GBA1의 치료 이익은 흑질의 문미 범위의 대부분을 통해 유지된다.
알파-시누클레인 제거에 대한 GBA1 코딩 AAV의 효과
GCase 활성의 AAV 매개 향상이 알파-시누클레인의 현저한 제거를 수행하는 데 있어서 어느 정도 효율적인지를 평가하기 위해, α-syn에 대해 염색되었고 좌측 및 우측 흑질의 전체 문미 범위를 포함하는 14개의 관상 박편들을 사용하였다. Aiforia®를 이용하여 분석을 수행하였다. 수득된 데이터는 도 32 및 33에 표시되어 있다.
치료 이익을 반영하는 좌측과 우측의 차이는 AAV9-GBA1이 주사된 동물보다 AAV-TT-GBA1이 주사된 동물에서 일관되게 훨씬 더 높은 것으로 확인되었다. 실제로, AAV-TT-GBA1의 치료 이익은 흑질의 문미 범위의 대부분을 통해 유지된다. 실제로, 알파-시누클레인 제거에 있어서 AAV9-GBA1의 효과가 존재한다 하더라도 모든 동물들에 대해 최소한으로 존재하는 것으로 발견되었다는 것도 언급할 가치가 있다(동물 M281은 AAV9-SynA53T를 사용한 수술적 표적화 오류로 인해 분석에 있어서 고려되지 않았다).
비 TH+/α-syn+
AAV9-SynA53T를 사용하여 유도된 시누클레인병증의 전체 정도를 평가하기 위해, 도 34는 TH+ 세포와 -syn+ 세포 사이의 관찰된 비를 보여준다. 수득된 데이터로부터, 유도된 시누클레인병증이 중등도의 시누클레인병증이라는 결론을 내릴 수 있다.
이 데이터는 (1) 흑질선조체 신경지배의 더 우수한 보존, (2) 도파민작용성 뉴런에 대한 더 우수한 신경보호 효과 및 (3) 알파-시누클레인 제거에 대한 더 우수한 효능의 관점에서 AAV9-GBA1에 비해 AAV-TT-GBA1의 더 우수한 성능을 명확히 뒷받침한다.
7. 본 발명을 실시하는 데 사용하기 위한 서열
본 발명을 실시하는 데 사용될 서열은 이하에 기재되어 있다(비제한적인 목록):
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
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Figure pct00031
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SEQUENCE LISTING <110> FUNDACION PARA LA INVESTIGACION MEDICA APLICADA <120> VIRAL PARTICLES FOR USE IN TREATING SYNUCLEINOPATHIES SUCH AS PARKINSON'S DISEASES BY GENE THERAPY <130> BCT200202QT <150> EP19382706 <151> 2019-08-12 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1551 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggctggca gtcttacagg tctcctgctc ctgcaagctg tctcttgggc ttctggggcc 60 aggccctgta tccccaaatc ctttggatac tcatctgtgg tgtgtgtttg taatgccact 120 tattgtgata gctttgaccc ccccaccttt cctgcactgg gcaccttttc aaggtatgaa 180 tctaccaggt ctgggaggag gatggagctg agtatggggc ccatccaagc aaaccatact 240 ggcactggct tgctgctgac actgcaacct gaacagaagt tccagaaagt gaagggcttt 300 ggaggagcca tgactgatgc tgctgccctc aatattttgg ccctgagccc ccctgctcag 360 aatctccttt tgaaatcata cttctctgag gagggaattg gatacaatat catcagggtg 420 ccaatggcct catgtgactt tagtattagg acttacacct atgctgatac ccctgatgat 480 ttccagctgc ataacttctc attgcctgag gaggatacca aattgaagat cccactcatt 540 cacagggccc tgcaactggc tcagagacca gtgtcattgc 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cgccgtgcac tggtatctgg atttcctggc accagcaaag 1080 gccaccctgg gagagacaca ccggctgttc cctaacacca tgctgtttgc cagcgaggcc 1140 tgcgtgggct ccaagttttg ggagcagtcc gtgaggctgg gatcttggga caggggcatg 1200 cagtactccc actctatcat caccaatctg ctgtatcacg tggtgggctg gacagactgg 1260 aacctggccc tgaatccaga gggcggcccc aactgggtga gaaatttcgt ggatagcccc 1320 atcatcgtgg acatcaccaa ggatacattc tacaagcagc caatgtttta tcacctgggc 1380 cacttctcta agtttatccc agagggcagc cagagggtgg gcctggtggc cagccagaag 1440 aacgacctgg atgccgtggc cctgatgcac cctgatggct ccgccgtggt ggtggtgctg 1500 aatcgctcta gcaaggacgt gcctctgacc atcaaggatc cagccgtggg cttcctggag 1560 actatttccc ccggctattc aattcatacc tatctgtgga gaaggcagtg a 1611 <210> 13 <211> 448 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 13 agtgcaagtg ggttttagga ccaggatgag gcggggtggg ggtgcctacc tgacgaccga 60 ccccgaccca ctggacaagc acccaacccc cattccccaa attgcgcatc ccctatcaga 120 gagggggagg ggaaacagga tgcggcgagg cgcgtgcgca ctgccagctt cagcaccgcg 180 gacagtgcct tcgcccccgc ctggcggcgc gcgccaccgc cgcctcagca 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ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcct 145 <210> 16 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Flop ITR of AAV2 <400> 16 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145 <210> 17 <211> 449 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 17 Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly 1 5 10 15 Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly 20 25 30 Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu 35 40 45 Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu 50 55 60 Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe 65 70 75 80 Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu 85 90 95 His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu 100 105 110 Ile His Arg Ala Leu Gln 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actcatgctg 960 gatgaccaac gcttgctgct gccccactgg gcaaaggtgg tactgacaga cccagaagca 1020 gctaaatatg ttcatggcat tgctgtacat tggtacctgg actttctggc tccagccaaa 1080 gccaccctag gggagacaca ccgcctgttc cccaacacca tgctctttgc ctcagaggcc 1140 tgtgtgggct ccaagttctg ggagcagagt gtgcggctag gctcctggga tcgagggatg 1200 cagtacagcc acagcatcat cacgaacctc ctgtaccatg tggtcggctg gaccgactgg 1260 aaccttgccc tgaaccccga aggaggaccc aattgggtgc gtaactttgt cgacagtccc 1320 atcattgtag acatcaccaa ggacacgttt tacaaacagc ccatgttcta ccaccttggc 1380 cacttcagca agttcattcc tgagggctcc cagagagtgg ggctggttgc cagtcagaag 1440 aacgacctgg acgcagtggc actgatgcat cccgatggct ctgctgttgt ggtcgtgcta 1500 aaccgctcct ctaaggatgt gcctcttacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560 acaatctcac ctggctactc cattcacacc tacctgtggc gtcgccagtg a 1611 <210> 20 <211> 376 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nGUSB promoter #2 <400> 20 attcctgctg ggaaaagcaa gtggaggtgc tccttgaaga aacaggggga tcccaccgat 60 ctcaggggtt ctgttctggc ctgcggccct ggatcgtcca 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gttccttgga agggctgaat ccccgcctcg tccttcgcag cggccccccg ggtgttccca 360 tcgccgcttc taggcccact gcgacgcttg cctgcacttc ttacacgctc tgggtcccag 420 ccgcggcgac gcaaagggcc ttggtgcggg tctcgtcggc gcagggacgc gtttgggtcc 480 cgacggaacc ttttccgcgt tggggttggg g 511 <210> 25 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> CBA/CBh promoter <400> 25 agatgtactg ccaagtagga aagtcccgta aggtcatgta ctgggcataa tgccaggcgg 60 gccatttacc gtcattgacg tcaatagggg gcgtacttgg catatgatac acttgatgta 120 ctgccaagtg ggcagtttac cgtaaatact ccacccattg acgtcaatgg aaagtcccta 180 ttggcgttac tatgggaaca tacgtcatta ttgacgtcaa tgggcggggg tcgttgggcg 240 gtcagccagg cgggccattt accgtaagtt atgtaacgcg gaactccata tatgggctat 300 gaactaatga ccccgtaatt gattactatt aaccacgttc tgcttcactc tccccatctc 360 ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 420 gggggcgggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg 480 gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt 540 ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cggaactgaa 600 aaaccagaaa gttaactggt aagtttagtc tttttgtctt ttatttcagg tcctggtggt 660 gcaaatcaaa gaactgctcc tcagtggatg ttgcctttac ttctaggcct gtacggaagt 720 gttacttctg ctctaaaagc t 741 <210> 26 <211> 818 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> CBA/CBh promoter <400> 26 agatgtactg ccaagtagga aagtcccgta aggtcatgta ctgggcataa tgccaggcgg 60 gccatttacc gtcattgacg tcaatagggg gcgtacttgg catatgatac acttgatgta 120 ctgccaagtg ggcagtttac cgtaaatact ccacccattg acgtcaatgg aaagtcccta 180 ttggcgttac tatgggaaca tacgtcatta ttgacgtcaa tgggcggggg tcgttgggcg 240 gtcagccagg cgggccattt accgtaagtt atgtaacgcg gaactccata tatgggctat 300 gaactaatga ccccgtaatt gattactatt aaccacgttc tgcttcactc tccccatctc 360 ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 420 gggggcgggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg 480 gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt 540 ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg 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Claims (34)

  1. 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase)를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 바이러스 입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 트랜스진은
    a) 서열번호 1, 7, 11, 12 및 19로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는
    b) 서열번호 5, 6, 8, 17 또는 18을 포함하는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열
    을 포함하는 것인 바이러스 입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산 구축물은 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하고, 상기 프로모터는 바람직하게는 상기 트랜스진이 적어도 흑질 치밀부(SNc)의 뉴런 및 미세아교 세포에서 발현될 수 있게 하는 것인 바이러스 입자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 프로모터는 편재성 프로모터, 특히 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 GusB 프로모터, 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터, 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터, 및 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 hSyn 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터인 바이러스 입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 뉴런 및 미세아교 세포를 동시에 표적화하는 바이러스 입자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 흑질 치밀부의 도파민작용성 뉴런 및 미세아교 세포를 동시에 표적화하는 바이러스 입자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 AAV2, AAV5, AAV9, AAV-MNM004, AAV-MNM008 및 AAV TT로 구성된 군으로부터 선택된 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자인 바이러스 입자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 98.5%, 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하는 AAV TT 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 구축물은 폴리아데닐화 신호 서열, 바람직하게는 서열번호 28 또는 3, 보다 바람직하게는 서열번호 28을 포함하는 폴리아데닐화 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 바이러스 입자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 구축물은 5' ITR 및 3' ITR 서열, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스의 5' ITR 및 3' ITR 서열, 보다 바람직하게는 서열번호 15 및/또는 16의 서열, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성된, AAV2 혈청형으로부터의 5' ITR 및 3' ITR 서열을 추가로 포함하는 바이러스 벡터 내에 포함된 것인 바이러스 입자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 서열번호 4, 또는 서열번호 4와 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 바이러스 입자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 구축물은 인간 글루코세레브로시다제가 적어도 도파민작용성 뉴런 및 미세아교 세포 둘 다에서 발현될 수 있게 하는 프로모터의 조절 하에서 상기 인간 글루코세레브로시다제의 코딩 서열을 포함하는 것인 바이러스 입자로서, 적어도 흑질 치밀부의 도파민작용성 뉴런 및 미세아교 세포를 표적화하는 바이러스 입자, 전형적으로 AAV2, AAV5, AAV9로 구성된 군으로부터 선택된 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자 중에서 선택된 바이러스 입자.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 구축물은 인간 글루코세레브로시다제가 적어도 도파민작용성 뉴런 및 미세아교 세포 둘 다에서, 바람직하게는 적어도 흑질 치밀부 및 대뇌 피질의 뉴런에서 발현될 수 있게 하는 프로모터의 조절 하에서 상기 인간 글루코세레브로시다제의 코딩 서열을 포함하는 것인 바이러스 입자로서, 후향성 수송을 가진 바이러스 입자, 전형적으로 AAV-MNM004, AAV-MNM008 및 AAV-TT로 구성된 군으로부터 선택된 AAVretro 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자 중에서 선택된 바이러스 입자.
  14. 제1항 내지 제11항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열번호 19 또는 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 서열을 포함하는, 인간 글루코세레브로시다제를 코딩하는 트랜스진으로서, 인간 글루코세레브로시다제가 서열번호 5 또는 8을 포함하는 것인 트랜스진;
    b) 상기 트랜스진에 작동 가능하게 연결되어 있고, 바람직하게는 상기 트랜스진이 적어도 흑질 치밀부(SNc)의 뉴런 및 미세아교 세포에서 발현될 수 있게 하는 프로모터로서, 바람직하게는 서열번호 9 또는 21을 포함하거나 이것으로 구성된 CAG 프로모터, 서열번호 2 또는 20을 포함하거나 이것으로 구성된 GusB 프로모터, 서열번호 27을 포함하거나 이것으로 구성된 JeT 프로모터, 또는 서열번호 13을 포함하거나 이것으로 구성된 hSyn 프로모터인 프로모터;
    c) 폴리아데닐화 신호 서열, 바람직하게는 서열번호 28 또는 3, 바람직하게는 서열번호 28을 포함하는 폴리아데닐화 신호 서열
    을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 바이러스 입자로서,
    상기 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV TT의 캡시드 단백질을 포함하는, 보다 바람직하게는 서열번호 14, 또는 서열번호 14와 적어도 98.5%, 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자이고; 상기 핵산 구축물은 5' ITR 및 3' ITR 서열, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스의 5' ITR 및 3' ITR 서열, 보다 바람직하게는 AAV2 혈청형으로부터의 5' ITR 및 3' ITR 서열을 추가로 포함하는 바이러스 벡터 내에 포함되고, 5' ITR 및 3' ITR 서열은 각각 독립적으로 서열번호 15 또는 16의 서열, 또는 서열번호 15 및/또는 16과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되고, 바람직하게는 5' ITR은 서열번호 15를 포함하고, 3' ITR은 서열번호 16을 포함하는 것인 바이러스 입자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 후향성 수송을 할 수 있는 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자(AAVretro).
  16. 제15항에 있어서, 생체내 전파(dissemination) 어세이에서 확인될 때 비인간 영장류의 미상 또는 피각 핵 내로의 실질 주사 후 대뇌 피질, 바람직하게는 적어도 흑질 치밀부 및 대뇌 피질로 전파될 수 있는 바이러스 입자.
  17. a) 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 rAAV를 실질내 주사로 비인간 영장류의 후교련 피각에 주사하는 단계, 및
    b) 주사한 지 약 1개월 후 대뇌 피질, 바람직하게는 GFP를 발현하는 미상 피각 핵을 신경지배하는 뇌 영역에서 뉴런의 수를 카운팅하는 단계
    를 포함하는 생체내 전파 어세이.
  18. 제17항에 있어서, c) 대뇌 피질, 바람직하게는 미상 피각 핵을 신경지배하는 뇌 영역에서 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 뉴런의 수를, GFP를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 AAV-TT를 실질내 주사로 비인간 영장류의 후교련 피각에 주사함으로써 수행된 대조군 실험과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 생체내 전파 어세이.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제17항 또는 제18항에 따른 생체내 전파 어세이에서 확인될 때 적어도 AAV-TT와 동일한 수준으로 대뇌 피질에서, 바람직하게는 흑질 치밀부 및 대뇌 피질로 전파할 수 있는 AAVretro 중에서 선택된 바이러스 입자.
  20. 제1항 내지 제16항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAVretro는 AAV-MNM004, AAV-MNM008 및 AAV-TT로 구성된 군으로부터 선택된 것인 바이러스 입자.
  21. 제1항 내지 제16항, 제19항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14와 적어도 98.5%, 바람직하게는 99% 또는 99.5% 동일한 서열을 포함하는 AAV TT 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자.
  22. 제1항 내지 제16항 및 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 치료에 사용하기 위한 바이러스 입자.
  23. 제1항 내지 제16항 및 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 유전자 요법으로 시누클레인병증을 치료하는 데 사용하기 위한 바이러스 입자.
  24. 제23항에 있어서, 상기 시누클레인병증은 인간 산발성 시누클레인병증인 바이러스 입자.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 시누클레인병증은 파킨슨병, 전형적으로 산발성 파킨슨병인 바이러스 입자.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 치료받는 상기 대상체는 진행된 병기의 시누클레인병증, 전형적으로 적어도 H-Y 3기의 파킨슨병을 가진 환자들 중에서 선택된 것인 바이러스 입자.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시누클레인병증은 적어도 LRRK2, SNCA, VPS35, GCH1, ATXN2, DNAJC13, TMEM230, GIGYF2, HTRA2, RIC3, EIF4G1, UCHL1, CHCHD2, GBA1, PRKN, PINK1, DJ1, ATP13A2, PLA2G6, FBXO7, DNAJC6, SYNJ1, SPG11, VPS13C, PODXL, PTRHD1, RAB39B, DNAJC13, TMEM230, GIGYF2, HTRA2, RIC3, EIF4G1, UCHL1 및 CHCHD2로 구성된 군으로부터 선택된 유전자의 돌연변이와 관련되지 않은 것인 바이러스 입자.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 실질내 투여에 의해 상기 대상체에, 바람직하게는 흑질 치밀부 및/또는 미상 피각 핵의 뇌 영역에 투여되는 바이러스 입자.
  29. 제1항 내지 제16항 및 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 신경병증성 고셔병을 치료하는 데 사용하기 위한 바이러스 입자.
  30. 시누클레인병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 시누클레인병증, 바람직하게는 파킨슨병, 보다 구체적으로 산발성 파킨슨병을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제16항 및 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 입자를 치료 유효량으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 치료받는 상기 대상체는 진행된 병기의 시누클레인병증, 전형적으로 적어도 H-Y 3기의 파킨슨병을 가진 환자들 중에서 선택된 것인 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 시누클레인병증은 적어도 LRRK2, SNCA, VPS35, GCH1, ATXN2, DNAJC13, TMEM230, GIGYF2, HTRA2, RIC3, EIF4G1, UCHL1, CHCHD2, GBA1, PRKN, PINK1, DJ1, ATP13A2, PLA2G6, FBXO7, DNAJC6, SYNJ1, SPG11, VPS13C, PODXL, PTRHD1, RAB39B, DNAJC13, TMEM230, GIGYF2, HTRA2, RIC3, EIF4G1, UCHL1 및 CHCHD2로 구성된 군으로부터 선택된 유전자의 돌연변이와 관련되지 않은 것인 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 입자를 실질내 투여로 상기 대상체에, 바람직하게는 흑질 치밀부 및/또는 미상 피각 핵의 뇌 영역에 투여하는 것인 방법.
  34. 신경병증성 고셔병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 신경병증성 고셔병을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제16항 및 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 입자를 치료 유효량으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
KR1020227003990A 2019-08-12 2020-08-06 유전자 요법으로 파킨슨병과 같은 시누클레인병증을 치료하는 데 사용하기 위한 바이러스 입자 KR20220099944A (ko)

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