JP2023500011A - 遺伝子療法によるパーキンソン病などのシヌクレイノパチーの治療に使用するためのウイルス粒子 - Google Patents

遺伝子療法によるパーキンソン病などのシヌクレイノパチーの治療に使用するためのウイルス粒子 Download PDF

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Abstract

本開示は、シヌクレイノパチー、特に孤発性パーキンソン病を遺伝子療法によって治療するのに使用するためのウイルス粒子に関する。より具体的には、本発明は、シヌクレイノパチーを、その治療を必要とする対象において遺伝子療法によって治療するのに使用するためのウイルス粒子であって、グルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物を含むウイルス粒子に関する。

Description

本開示は、グルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物を含むウイルス粒子、およびシヌクレイノパチー、特に孤発性パーキンソン病を遺伝子療法によって治療する際のその使用に関する。
パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質緻密部（ＳＮｃ）として公知の脳領域におけるドーパミン産生ニューロンの喪失を特徴とする持続性の神経変性障害である。このニューロン喪失の結果として、ドーパミンの脳レベルが漸進的に低下する。ドーパミンレベルの低下は、基底核神経回路の機能障害を誘発し、ＰＤの典型的な主症状（振戦、硬直、運動緩徐および姿勢不安定性）の出現をもたらす。現在、薬理学的治療（レボドパおよびドーパミンアゴニスト）および外科的治療（脳深部刺激）の両方が利用可能であり、これらの治療は運動症状の緩和において高い有効性を示す。しかしながら、パーキンソン病は、ＳＮｃが最初に影響を受けるがこれに限定されない一般的な神経変性障害である。既存の治療アプローチは単にドーパミンの対症療法であり、疾患進行の抑制には効果がない。
ＰＤおよび関連するシヌクレイノパチーは、大きな孤発性脳障害（特発性障害としても公知；診断された患者の９０％超～９５％超を占める）によるものである。ごく一部の患者においてのみ、遺伝的背景が解明されている（家族性症例）。これらのシヌクレイノパチーの出現に関与している遺伝子突然変異（とりわけ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＰＡＲＫＩＮ、ＤＪ－１）の中で、ＧＢＡ１遺伝子（１番染色体に位置し、グルコセレブロシダーゼとして公知のリソソーム酵素をコードする）の突然変異が群を抜いて最多であり、実際にホモ接合型およびヘテロ接合型ＧＢＡ１変異とＰＤおよびレビー小体型認知症（ＤＬＢ）の発生率増加との間の直接的な遺伝的関連性がＳｉｄｒａｎｓｋｙと共同研究者によって明らかに実証されており（Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００９；３６１：１６５１－１６６１）、ＰＤのオッズ比は５．４３である。ＧＢＡ１突然変異とＤＬＢとの関連性は、ＰＤよりもさらに強い（オッズ比８．２８）。ＧＢＡ１変異は、ＰＤおよびＤＬＢの発症のリスクを２０～３０倍増加させるが、ＧＢＡ１変異と多系統萎縮症（ＭＳＡ）との関連性は依然としてより議論の余地がある。ＧＢＡ１変異とシヌクレイノパチーとの間のそのような直接的な関連性の存在は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）欠損とＰＤおよびＤＬＢの出現とを結び付ける最も強力な論拠である。しかしながら、ＧＣａｓｅ－α－シヌクレイン経路に関与する機構に関して、α－シヌクレインの分解、凝集および細胞内プロセシングとＧＣａｓｅ活性がどのように正確に結び付けられるかは、実験的証拠が限られている当技術分野で依然として未解決の問題である。
これまでに、α－シヌクレインとＧＣａｓｅ欠損を結びつける３つの主要な仮説が示唆されている：１／ミスフォールドされた（例えば、ＧＢＡ１変異のためにミスフォールドされた）ＧＣａｓｅによる機能獲得は、α－シヌクレインとのその直接相互作用をもたらし、最終的にα－シヌクレインの凝集および蓄積につながる；２／ＧＣａｓｅの機能喪失（ミスフォールドされた酵素の分解によるＧＣａｓｅ欠損）は、基質（グルコセレブロシド）の蓄積をもたらし、これが次に脂質ホメオスタシスを乱し、続いてα－シヌクレインの輸送、プロセシングおよびクリアランスに影響を及ぼす。これは、最終的にα－シヌクレイン凝集を促進し、オリゴマー形成を促進する；３／ＧＣａｓｅ欠損がα－シヌクレインオリゴマーの形成を促進し、これらのオリゴマーが正常なＧＣａｓｅ活性のさらなる低下をもたらし、それが次にさらなるα－シヌクレインオリゴマーの形成を促進する、双方向フィードバックループ。
ＰＤ患者の５～１０％がＧＢＡ１変異を保持すると仮定されている。ＰＤ患者のこのサブグループについて、ＧＢＡ１変異の存在は、重度のＧＣａｓｅ機能喪失（正常レベルの１５％以下の残存ＧＣａｓｅ活性を残す）を誘導する。このＧＣａｓｅ機能喪失は、（いくつかの未知の機構を介して）α－シヌクレイン凝集を誘発し、最終的にはニューロン死をもたらす。孤発性ＰＤおよびＤＬＢを有する患者については、α－シヌクレインの凝集自体（例えば、ＧＢＡ１変異の非存在下での）もＧＣａｓｅ機能喪失を誘発し得ると仮定されているが（Ｇｅｇｇ ＭＥ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１２；７２：４５５－４６３；Ｍｕｒｐｈｙ ＫＥ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ ２０１４；１３７：８３４－８４８；Ａｌｃａｌａｙ ＲＮ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ ２０１５；１３８：２６４８－２６５８；Ｐａｒｎｅｔｔｉ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ ２０１４；２９：１０１９－１０２７）、この関連性の最終的な根拠は解明されないままであり、これまでの実験的証拠がほとんどないことも注目に値する。
言い換えれば、孤発性シヌクレイノパチーにおいてＧＣａｓｅ活性を増強することの潜在的な有用性は、組換え酵素の全身送達のための前臨床研究では依然として実証されないままである。
少なくともＧＢＡ１変異関連患者でα－シヌクレイン負荷量を減少させる試みにおけるＧＣａｓｅ活性の増強は、ある程度まで調査されている。組換えＧＣａｓｅ酵素の直接補充（ＧＣａｓｅ補充療法）は、ゴーシェ病の治療において成功を収めている（Ｗｅｉｎｒｅｂ ＮＪ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ ２００２；１１３－１１２－１１９；Ｃｏｎｎｏｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ａｓｓｅｓｓ ２００６；１０：ｉｉｉ－ｉｖ，ｉｘ－１３６）。全身送達された組換えＧＣａｓｅは、リソソームに局在し、酵素活性を上方制御することが示されている。しかしながら、神経変性障害の状況におけるこのアプローチの限界は、ＧＣａｓｅが、ＧＣａｓｅ脳活性を改変するために有意な濃度で血液脳関門を通過し得ないことである。代替的なアプローチは、組換えＧＣａｓｅの直接髄腔内投与である（Ｂｒａｄｙ ＲＯ，Ｙａｎｇ Ｃ，Ｚｈｕａｎｇ Ｚ．Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２０１３；３６：４５１－４５４；ＬｅＢｏｗｉｔｚ Ｊ．Ａ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１５；１０２：１４４８５－１４４８６）。しかし、髄腔内投与されたＧＣａｓｅが神経組織に深く浸透するのに十分な濃度勾配を提供する能力には疑問が残る。
他のアプローチは、ＧＢＡ１変異キャリアにおけるＰＤの病因機構としてのグルコシルセラミド蓄積に焦点を合わせている（Ｓａｒｄｉ ＳＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１３；１１０：３５３７－３５４２）。ＧＣａｓｅ基質阻害は、シヌクレイン過剰発現細胞株においてα－シヌクレインレベルを低下させるようである（Ｓａｒｄｉ ＳＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１３；１１０：３５３７－３５４２）。さらに、グルコシルセラミドシンターゼの可逆的阻害剤であるミグルスタットは、その有効性および副作用プロファイルに関して懸念が存在するが、ゴーシェ病ＩＩＩ型の状況で使用されている。他の２つのグルコシルセラミドシンターゼ阻害剤、エリグルスタットおよびベングルスタットは、ゴーシェ病（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ００８９１２０２）およびＰＤ（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ０２９０６０２０）の臨床試験において評価中である。
ＧＣａｓｅシャペロンは、ＥＲからリソソームへのＧＣａｓｅの輸送を促進するためにも使用されている。イソファゴミンは最初に試験されたシャペロンであるが、ゴーシェ病に関連したこの化合物の臨床試験は、おそらくこのシャペロンがＧＣａｓｅの活性部位に高すぎる親和性で結合し、したがってリソソーム内の酵素活性を阻害するという事実のために失敗に終わった。この問題を回避するために、ＰＤにおける潜在的な神経保護剤としてのＧＣａｓｅの多数の新規非阻害性低分子シャペロンが現在開発中である（Ｍａｚｚｕｌｉ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１６；３６：７６９３－７７０６）。現在、ＰＤにおける最も可能性の高いＧＣａｓｅ低分子シャペロン候補はアンブロキソールである。マウスでは、ＧＣａｓｅ活性はアンブロキソールによる処置で増加し（Ｍｉｇｄａｌｓｋａ－Ｒｉｃｈａｒｄｓ Ａ，Ｄａｌｙ Ｌ，Ｂｅｚａｒｄ Ｅ，Ｓｃｈａｐｉｒａ ＡＨ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１６；８０：７６６－７７５）、同じことが非ヒト霊長動物にも当てはまるが、より高い用量においてのみである（Ｍｉｇｄａｌｓｋａ－Ｒｉｃｈａｒｄｓ Ａ、Ｋｏ ＷＫＤ，Ｌｉ Ｑ ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎａｐｓｅ ２０１７；２５６：ｅ２１９６７）。ＰＤにおけるアンブロキソールの２つの第ＩＩ相臨床試験が進行中である（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ０２９４１８２２およびＮＣＴ０２９１４３６６）。
マウスにおいてのみではあるが、ＧＢＡ１による遺伝子治療が報告されている。ラットにおけるＧＢＡ１および変異α－シヌクレインをコードするアデノ随伴ウイルスベクターの同時注射は、ドーパミン作動性ニューロンの神経変性を予防した（Ｒｏｃｈａ ＥＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ ２０１５；８２：４９５－５０３）。しかしながら、一旦シヌクレイノパチーが既に発症した後のＡＡＶ－ＧＢＡ１の有用性は、この試験では示されていない。さらに、α－シヌクレイントランスジェニックマウスにおいて、ＧＢＡ１遺伝子をコードするＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂとして公知の血液脳関門（ＢＢＢ）透過性ＡＡＶバリアントを使用すると、マウスの脳全体にわたってα－シヌクレイン凝集体のほぼ完全なクリアランスをもたらしたことが報告されている（Ｍｏｒａｂｉｔｏ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１７；２５：２７２７－２７４２）。しかしながら、著者らは、この試験において、適切なＰＤ様表現型を欠くトランスジェニックα－ｓｙｎマウスを使用した。さらに、ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂは、特定のマウス系統においてのみ作用することが示されており、ＡＡＶ９－ＰＨＰ－Ｂは、マーモセットでは血液脳関門を通過しない。
ヒト対象における孤発性パーキンソン病を治療するのに適したＧＢＡ１を用いた遺伝子治療が依然として必要である。
特に、孤発性ＰＤのための疾患修飾療法は、凝集したα－シヌクレインのＧＣａｓｅによって駆動されるクリアランスがドーパミン作動性ニューロンに対して神経保護的であり、α－シヌクレインの経ニューロン通過（プリオン様拡散）を妨げることの実証と共に、ウイルスが媒介するＧＣａｓｅ活性の増強が、疾患の初期および後期の両方で黒質緻密部（ＳＮｃ）のドーパミン作動性ニューロンにおけるα－シヌクレイン凝集体のクリアランスを誘導するという原理証明によって裏付けられるべきである。さらに、孤発性ＰＤのための疾患修飾療法はまた、α－シヌクレイン凝集によって引き起こされるミクログリア駆動性炎症促進現象の減弱によっても支持されるべきである。
本発明は、広範囲のシヌクレイノパチーが脳全体に存在し、特に大脳皮質に関与する、疾患の進行期にある患者のパーキンソン病を治療するための遺伝子療法で使用するＧＣａｓｅ活性のウイルス媒介増強のためのウイルス粒子を提供する。
本発明者らは、孤発性パーキンソン病の非ヒト霊長動物モデルで実証されたように、上記の要件を満たす治療戦略を設計した。
したがって、本発明は、グルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物を含むウイルス粒子、およびそれを必要とする対象において遺伝子療法によってシヌクレイノパチーを治療する際のその使用に関する。
一実施形態では、前記導入遺伝子は、ａ）配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはｂ）ヒトグルコセレブロシダーゼをコードするヌクレオチド配列であって、ヒトグルコセレブロシダーゼが配列番号５、６、８、１７もしくは１８を含む、ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、前記核酸構築物は、グルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータをさらに含み、前記プロモータは、少なくとも黒質緻密部（ＳＮｃ）の神経細胞およびミクログリア細胞において、好ましくは少なくとも黒質緻密部、大脳皮質、扁桃体および視床尾側髄板内核（ｃａｕｄａｌ ｉｎｔｒａｌａｍｉｎａｒ ｎｕｃｌｅｉ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈａｌａｍｕｓ）を含む他の脳領域の神経細胞においても、前記導入遺伝子の発現を可能にする。典型的には、前記核酸構築物は、遍在性プロモータ、例えばＧｕｓＢプロモータ、特に配列番号２もしくは２０を含むもしくはそれからなるプロモータ、配列番号２７を含むもしくはそれからなるＪｅＴプロモータ、配列番号９もしくは２１を含むもしくはそれからなるＣＡＧプロモータ、または配列番号１３を含むもしくはそれからなるヒトシナプシン１プロモータ（ｈＳｙｎ）の制御下でグルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子を含み得る。
特定の実施形態では、前記ウイルス粒子は、少なくともニューロンおよびミクログリア細胞を同時に標的とするウイルス粒子の中から選択されるキャプシドタンパク質を含む。より具体的には、前記ウイルス粒子は、少なくとも黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンおよびミクログリア細胞を同時に標的とするウイルス粒子の中から選択され得る。
特定の実施形態では、前記ウイルス粒子は、好ましくはＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＭＮＭ００４、ＡＡＶ－ＭＮＭ００８、およびＡＡＶ ＴＴ血清型からなる群より選択されるキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子の中から選択される。
より特定の実施形態では、前記ウイルス粒子は、好ましくは配列番号１４の配列または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９もしくは９９．５％の同一性を有する配列を含むＡＡＶ ＴＴキャプシドタンパク質を含む。好ましい一実施形態では、ウイルス粒子は、
ａ）ヒトグルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子であって、配列番号１９またはヒトグルコセレブロシダーゼをコードする配列を含み、ヒトグルコセレブロシダーゼが配列番号５または８を含む、導入遺伝子；
ｂ）前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータであって、好ましくは少なくとも黒質緻密部（ＳＮｃ）の神経細胞およびミクログリア細胞における前記導入遺伝子の発現を可能にし、好ましくは配列番号９もしくは２１を含むＣＡＧプロモータ、または配列番号２もしくは２０を含むＧｕｓＢプロモータ、または配列番号２７を含むＪｅＴプロモータ、または配列番号１３を含むｈＳｙｎプロモータであるプロモータ；
ｃ）ポリアデニル化シグナル配列であって、好ましくは配列番号２８または３、好ましくは配列番号２８を含むポリアデニル化シグナル配列；
を含む核酸構築物を含み、前記ウイルス粒子は、好ましくはＡＡＶ ＴＴのキャプシドタンパク質を含み、より好ましくは配列番号１４または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有する配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であり、前記核酸構築物は、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、より好ましくはＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含むウイルスベクターに含まれ、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列の各々は、独立して、配列番号１５もしくは１６の配列または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなり、好ましくは５’ＩＴＲは配列番号１５を含み、３’ＩＴＲは配列番号１６を含む。特定の実施形態では、前記ウイルス粒子は、逆行性輸送を伴うウイルスバリアント血清型（ＡＡＶｒｅｔｒｏ）の中から選択されるウイルスキャプシドタンパク質を含む。
典型的には、前記ＡＡＶｒｅｔｒｏは、インビボ播種アッセイで決定される、非ヒト霊長動物の尾状核または被殻核への実質注入後に大脳皮質、好ましくは少なくとも黒質緻密部および大脳皮質における逆行性の播種が可能である場合がある。有利には、非ヒト霊長動物の尾状核－被殻核に注入されたＡＡＶｒｅｔｒｏは、少なくとも黒質緻密部、大脳皮質、扁桃体、および視床尾側髄板内核を含む、尾状－被殻核を神経支配する他の脳領域にも逆行性に播種することができる場合がある。別の態様では、本開示は、以下の工程：
ａ）ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をコードする導入遺伝子を含む試験ｒＡＡＶ（ｒＡＡＶ－ＧＦＰ）を、前記ｒＡＡＶ－ＧＦＰの非ヒト霊長動物の交連後被殻への実質内注入によって注入する工程、および
ｂ）注入の１ヶ月後に、大脳皮質、好ましくは尾状被殻核を神経支配する脳領域、特に少なくとも黒質緻密部、大脳皮質、扁桃体および視床尾側髄板内核におけるＧＦＰ発現ニューロンの数を計測する工程
を含むインビボ播種アッセイに関する。
他の実施形態では、前記インビボ播種アッセイは、大脳皮質、好ましくは尾状被殻核を神経支配する脳領域の標識ニューロンの割合を、ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＦＰを用いて実施した対照実験と比較する工程ｃ）をさらに含む。
特定の実施形態では、本開示によるウイルス粒子は、有利には、大脳皮質、好ましくは少なくとも黒質緻密部および大脳皮質に、上記のインビボ播種アッセイで決定されるＡＡＶ－ＴＴと少なくとも同じレベルまで播種することができるＡＡＶｒｅｔｒｏ粒子の中から選択される。
特定の実施形態では、前記ＡＡＶｒｅｔｒｏキャプシドタンパク質は、以下のバリアント血清型：ＡＡＶ－ＭＮＭ００４、ＡＡＶ－ＭＮＭ００８およびＡＡＶ－ＴＴの中から選択される。
より特定の実施形態では、前記ＡＡＶｒｅｔｒｏ粒子は、好ましくは配列番号１４の配列または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９もしくは９９．５％の同一性を有する配列を含むＡＡＶ ＴＴ血清型キャプシドタンパク質を含む。
特定の実施形態では、前記核酸構築物は、ポリアデニル化シグナル配列、特に配列番号３の配列のポリアデニル化シグナル配列をさらに含む。
特定の実施形態では、前記核酸構築物は、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、より好ましくは配列番号１５および／もしくは１６の配列または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含むウイルスベクターに含まれる。
特定の実施形態では、前記核酸構築物は、配列番号４の核酸配列または配列番号４と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。
特定の実施形態では、前記核酸構築物は、プロモータの制御下でヒトグルコセレブロシダーゼのコード配列を含み、少なくともドーパミン作動性ニューロンおよびミクログリア細胞の両方における前記ヒトグルコセレブロシダーゼの発現を可能にし、前記ウイルス粒子は、少なくとも黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンおよびミクログリア細胞を標的とするウイルス粒子、典型的にはＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＭＮＭ００４、ＡＡＶ－ＭＮＭ００８、およびＡＡＶ ＴＴ血清型からなる群より選択されるキャプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子の中から選択される。
別の態様では、本開示は、治療における、好ましくはシヌクレイノパチーの治療を必要とする対象における遺伝子療法によるシヌクレイノパチーの治療における、上記のウイルス粒子の使用に関する。
特定の実施形態では、前記シヌクレイノパチーはヒト孤発性シヌクレイノパチーである。特定の実施形態では、前記シヌクレイノパチーは、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＶＰＳ３５、ＧＣＨ１、ＡＴＸＮ２、ＤＮＡＪＣ１３、ＴＭＥＭ２３０、ＧＩＧＹＦ２、ＨＴＲＡ２、ＲＩＣ３、ＥＩＦ４Ｇ１、ＵＣＨＬ１、ＣＨＣＨＤ２、ＧＢＡ１、ＰＲＫＮ、ＰＩＮＫ１、ＤＪ１、ＡＴＰ１３Ａ２、ＰＬＡ２Ｇ６、ＦＢＸＯ７、ＤＮＡＪＣ６、ＳＹＮＪ１、ＳＰＧ１１、ＶＰＳ１３Ｃ、ＰＯＤＸＬ、ＰＴＲＨＤ１、ＲＡＢ３９Ｂ、ＤＮＡＪＣ１３、ＴＭＥＭ２３０、ＧＩＧＹＦ２、ＨＴＲＡ２、ＲＩＣ３、ＥＩＦ４Ｇ１、ＵＣＨＬ１、およびＣＨＣＨＤ２からなる群より選択される遺伝子における少なくとも１つの突然変異に関連しない。
好ましくは、前記シヌクレイノパチーは、パーキンソン病、典型的には孤発性パーキンソン病である。
特定の実施形態では、本治療方法に従ってＡＡＶｒｅｔｒｏウイルス粒子を使用する場合、治療される前記対象は、進行期のシヌクレイノパチー、典型的には少なくともパーキンソン病のＨ－Ｙステージ３を有する患者の中から選択される。
前記ウイルスベクターは、好ましくは、実質内投与によって前記対象に、より好ましくは黒質緻密部および／または尾状被殻核の脳領域に投与され得る。
別の態様では、本開示はまた、神経型ゴーシェ病の治療における上記のウイルス粒子の使用に関する。
ＡＡＶ－ＴＴキャプシドタンパク質配列とＡＡＶ－２とのアミノ酸配列アラインメントである。 ＡＡＶ－ＴＴキャプシドタンパク質配列とＡＡＶ－９とのアミノ酸配列アラインメントである。 マウスにおいて実施された実験的アプローチを要約した図解である。 ｒＡＡＶ９－ヌル（導入遺伝子なし）およびｒＡＡＶ９－ＧＢＡ１粒子をそれぞれ与えられた左右のＳＮｃにおけるＧＣａｓｅ（左パネル）およびα－シヌクレイン（右パネル）のタンパク質レベルを示すウェスタンブロットの写真である。得られた結果は、ＧＣａｓｅ発現がα－シヌクレインの減少をもたらしたことを示した。 ＳＮｃにおけるＴＨ＋ニューロンのニューロン密度の不偏立体推定を示すヒストグラムである。得られた結果は、ＧＣａｓｅ酵素活性のＡＡＶ－ＧＢＡ１媒介増強時のα－シヌクレインクリアランスが、ドーパミン作動性ニューロンに対する著明な神経保護効果を誘導することを示した。 ｒＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１（第１の例ではｒＡＡＶ９とも呼ばれる）（左ＳＮｃに注入）を用いて非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）で実施された実験的アプローチを要約した図解である。 左ＳＮｃにｒＡＡＶ９－ＧＢＡ１を注入されたＮＨＰに関して取得されたマイクロＰＥＴスキャンの代表的な画像として、交連後被殻および尾状核のレベルで撮影された冠状脳切片を示す。 左ＳＮｃにｒＡＡＶ９－ＧＢＡ１を注入された４例のＮＨＰのＳＮｃにおけるＴＨ＋ニューロンの密度の不偏立体推定後に得られた結果を示すヒストグラムである。１匹の動物で定量化を実施した。ＳＮｃニューロンの３８．１％がｒＡＡＶ９－ＳｙｎＡ５３Ｔ送達から３ヶ月後に死滅し、これとは対照的に、左ＳＮｃ（すなわちｒＡＡＶ９－ＧＢＡ１で処置したもの）では１４．９％のニューロン死が観察された。 実施された実験計画を要約した図解である。 リン酸化α－シヌクレインの免疫組織化学的検出を示す、マウス脳の線条体および大脳皮質にわたる冠状切片から撮影した顕微鏡写真である。大脳皮質のレベルでのα－シヌクレイン負荷量の明らかな減少が、ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ－ＧＢＡ１（ＧｕｓＢプロモータ）を注入された線条体と同側に位置する大脳皮質で見られる。右大脳皮質と比較した場合、すなわち最初にＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ－ＳｙｎＡ５３Ｔで処置し、その後ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ－ヌル（ＧｕｓＢプロモータ）で処置した脳側と比較した場合、明確な差が観察された。得られたデータは、播種性シヌクレイノパチーの治療のためのＧＢＡ１遺伝子をコードする逆行性伝播ウイルスベクターの使用を支持する。 ｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１（左交連後被殻に注入）を用いて非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）で実施された実験的アプローチを要約した図解である。 交連後被殻内にｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１を注入されたＮＨＰに関して取得されたマイクロＰＥＴスキャンの代表的な画像として、交連後被殻および尾状核のレベルで撮影された冠状脳切片を示す（上のパネル）。平均して、１１Ｃ－ＤＴＢＺ結合電位の２４．４４％の増加が左交連後被殻（例えば、ｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１を注入されたもの）において観察された（下のパネル）。 左交連後被殻にｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１を注入された４例のＮＨＰのＳＮｃにおけるＴＨ＋ニューロンの数の自動計数後に得られた結果を示すヒストグラムである。４例のＮＨＰで定量化を実施し、左ＳＮｃのＴＨ＋ニューロンの総数は、右ＳＮｃ（例えば、ｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１の被殻内送達で処置されなかったもの）で観察されたＴＨ＋ニューロンの数よりも２２．３％多かったことを示した。＊は統計学的有意性ｐ＜０．０５を表す。 左交連後被殻にｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１を注入された４例のＮＨＰの左右の交連後被殻へのＴＨ染色の光学密度（ＯＤ）の自動測定後に得られた結果を示すヒストグラムである。定量化は、平均ＯＤが右交連後被殻では左交連後被殻よりも２７．４２％低いことを示した（後者はｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１の被殻内送達で処置されたものである）。＊＊＊は統計学的有意性ｐ＜０．００１を表す。 左交連後被殻にｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１を注入された４例のＮＨＰのＳＮｃにおけるα－シヌクレイン発現ニューロン数の自動計数後に得られた結果を示すヒストグラムである。４例のＮＨＰで定量化を実施し、左ＳＮｃのα－シヌクレイン発現ニューロンの総数が、右ＳＮｃ（例えば、ｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１の被殻内送達で処置されなかったもの）で観察されたα－シヌクレイン陽性ニューロンの数よりも３８．３％少なかったことを示した。＊は統計学的有意性ｐ＜０．０５を表し、＊＊は統計学的有意性ｐ＜０．００１を表し、＊＊＊は統計学的有意性ｐ＜０．００１を表す。ｎｓ：統計学的有意性なし。 試験した動物の左ＳＮｃ対右ＳＮｃにおけるＴＨ＋（黒い棒）とａ－Ｓｙｎ＋ニューロン（白い棒）との比較の差を示すヒストグラムである。パーセンテージは、ＴＨ＋ニューロン中のａ－Ｓｙｎ＋ニューロンのパーセンテージを示す。α－シヌクレイン発現ニューロンの割合は、右ＳＮｃ（未処置側）よりも左ＳＮｃ（例えば、ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１を注入された交連後被殻と同側に位置するＳＮｃ）において一貫して低い。これは、左ＳＮｃのニューロン生存率がより高いだけでなく、生存しているＴＨ＋ニューロンのうちでａ－Ｓｙｎ＋がより少ないことを示す。 脳室造影法支援定位手術中のすべてのＡＡＶの注入部位を示す矢状Ｒｘ面である。 すべてのＡＡＶの注入部位を示す代表的な顕微鏡写真である。 すべての動物の注入部位を、ＧＦＰ＋ニューロンの正確な位置と共に示す図解（Ａ：Ｍ２９５と２９６、Ｂ：２９７と２９８）である。 動物Ｍ２９５（Ａ）およびＭ２９６（Ｂ）（ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＦＰを注入）におけるＧＦＰ＋ニューロンの生体内分布および推定強度である。小さいドット（「低」と表示）は、１～２００個のＧＦＰ＋細胞を表す；中サイズのドット（「中」と表示）は２０１～４００個のＧＦＰ＋細胞を表し、大きなドット（「高」と表示）は４０１個超のＧＦＰ＋細胞を表す。 動物Ｍ２９７（Ａ）およびＭ２９８（Ｂ）（ＡＡＶ－９－ＧＦＰを注入）におけるＧＦＰ＋ニューロンの生体内分布および推定強度である。小さいドット（「低」と表示）は、１～２００個のＧＦＰ＋細胞を表す；中サイズのドット（「中」と表示）は２０１～４００個のＧＦＰ＋細胞を表し、大きなドット（「高」と表示）は４０１個超のＧＦＰ＋細胞を表す。 定量化。全動物のＧＦＰ＋ニューロンの総数を示すヒストグラムである。 定量化。いくつかの関心対象領域にわたるすべての動物のＧＦＰ＋ニューロンの数を示すヒストグラムである。略語：前帯状回（ＡｃＧｇ）、上前頭回（ＳＦＧ）、中心前回（ＰｒＧ）、中心後回（ＰｏＧ）、島回（Ｉｎｇ）、正中中心核－束傍核複合体（ＣＭ－Ｐｆ）、黒質緻密部（ＳＮｃ）。 定量化。左半球のいくつかの関心対象の領域にわたる全動物のＧＦＰ＋ニューロンの吻側尾側分布を示すグラフである。略語：前帯状回（ＡｃＧｇ）、上前頭回（ＳＦＧ）、中心前回（ＰｒＧ）、中心後回（ＰｏＧ）、島回（Ｉｎｇ）、正中中心核－束傍核複合体（ＣＭ－Ｐｆ）、黒質緻密部（ＳＮｃ）。 定量化。右半球のいくつかの関心対象の領域にわたる全動物のＧＦＰ＋ニューロンの吻側尾側分布を示すグラフである。略語：前帯状回（ＡｃＧｇ）、上前頭回（ＳＦＧ）、中心前回（ＰｒＧ）、中心後回（ＰｏＧ）、黒質緻密部（ＳＮｃ）。 実施した実験の作業計画である。 ベースライン、ならびにＡＡＶ９－ＳｙｎＡ５３Ｔの注入後４、８および１２週間に実施された１１Ｃ－ＤＴＢＺによるマイクロＰＥＴスキャンである。交連後被殻の吻側尾側範囲全体を含む関心対象の領域（典型的には５～９の異なる部分に関わる）にわたって、放射性トレーサ結合能の値を計算した。 個別に考慮した場合の両動物群および各動物の平均ＯＤ値を示すヒストグラムである。交連後被殻のレベルで撮影された代表的な顕微鏡写真も含まれた。 グラフは、交連後被殻の吻側尾側範囲にわたるＯＤの観察された変化を示す（より吻側の０からより尾側の１２まで）。左被殻対右被殻（例えば、それぞれＧＢＡ１コードベクターで処置された側対未処置側）を比較することによるＯＤ差を、影を付けた領域によって描画した（ＡＡＶ－ｔｔ－ＧＢＡ１またはＡＡＶ９－ＧＢＡ１のいずれかを注入した動物に対応する）。 個別に考慮した場合の両動物群および各動物のＴＨ＋細胞数を示すヒストグラムである。左黒質対右黒質の平均値は、各動物群を全体として考慮した場合、統計学的に有意である。左黒質と右黒質のレベルで撮影された代表的な顕微鏡写真も含まれ、Ａｉｆｏｒｉａ（登録商標）が行った分析をより視覚的に例示した。 グラフは、黒質の吻側尾側範囲にわたるＴＨ＋細胞数の観察された変化を示す（より吻側の０からより尾側の１４まで）。左黒質対右黒質（例えば、それぞれＧＢＡ１コードベクターを注入した側と同側対注入していない側）を比較した場合に観察された差を、影を付けた領域によって描画した（ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１またはＡＡＶ９－ＧＢＡ１のいずれかを注入した動物に対応する）。 個別に考慮した場合の両動物群および各動物のα－ｓｙｎ＋細胞数を示すヒストグラムである。左黒質対右黒質の平均値は、各動物群を全体として考慮した場合、統計学的に有意である。個々のレベルでは、動物Ｍ２８０、Ｍ２８２およびＭ２８７（すべてＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１で処置）も統計学的有意性に達し、動物Ｍ２８３は統計学的有意性に達しなかった。ＡＡＶ９－ＧＢＡ１を注入した動物に関して、動物Ｍ２８６においてのみ統計学的有意性が観察された。左黒質と右黒質のレベルで撮影された代表的な顕微鏡写真も含まれ、Ａｉｆｏｒｉａ（登録商標）が行った分析をより視覚的に例示した。 グラフは、黒質の吻側尾側範囲にわたるα－ｓｙｎ＋細胞数の観察された変化を示す（より吻側の０からより尾側の１２まで）。左黒質対右黒質（例えば、それぞれＧＢＡ１コードベクターを注入した側と同側対注入していない側）を比較した場合に観察された差を、影を付けた領域によって描画した（ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１またはＡＡＶ９－ＧＢＡ１のいずれかを注入した動物に対応する）。 ヒストグラムは、ＴＨ＋細胞とα－ｓｙｎ＋細胞（それぞれＴＨおよびＳＹＮ）との間で観察された比率を示す。
本発明者らは、遺伝子療法によってシヌクレイノパチー、より具体的にはパーキンソン病、特に孤発性パーキンソン病を治療するための新しい治療戦略を同定した。
したがって、本開示は、グルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子を含むウイルスベクターまたは核酸構築物を含むウイルス粒子、およびそれを必要とする対象において遺伝子療法によってパーキンソン病または神経障害性ゴーシェ病などのシヌクレイノパチーを治療する際のその使用に関する。
本明細書で使用される場合、「ウイルス粒子」という用語は、（ｉ）キャプシド内にパッケージングされたウイルスベクター、（ｉｉ）キャプシド、および任意で、（ｉｉｉ）キャプシドを取り囲む脂質エンベロープを含む、感染性ウイルス粒子、典型的には複製欠損ウイルス粒子に関する。
「ウイルスベクター」という用語は、典型的には、キャプシドにパッケージングされた、本明細書に開示されるウイルス粒子の核酸部分を指す。
したがって、前記ウイルスベクターは、典型的には、少なくとも（ｉ）導入遺伝子および遺伝子療法によって治療される宿主におけるその発現に適した核酸エレメントを含む核酸構築物、ならびに（ｉｉ）ウイルスゲノムの全部または一部、例えばウイルスゲノムの逆方向末端反復配列を含む。
本明細書で使用される場合、「核酸構築物」という用語は、組換えＤＮＡ技術の使用から生じる天然には存在しない核酸を指す。特に、核酸構築物は、自然界には存在しない様式で組み合わされるかまたは並置される核酸配列のセグメントを含有するように修飾された核酸分子である。
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、遺伝子治療の活性成分として使用するための遺伝子産物をコードする核酸分子（または略して核酸）、ＤＮＡまたはｃＤＮＡを指す。遺伝子産物は、ＲＮＡ、ペプチドまたはタンパク質であり得る。
「核酸」および「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」という用語は、モノマーヌクレオチドで構成されるかまたはそれを含む任意の分子を指すために交換可能に使用され得る。核酸は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ヌクレオチド配列は、化学的に修飾されていてもよく、または人工的であってもよい。ヌクレオチド配列には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が含まれる。これらの配列の各々は、分子の骨格の変化によって天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡと区別される。また、ホスホロチオアートヌクレオチドを使用してもよい。他のデオキシヌクレオチド類似体には、メチルホスホナート、ホスホルアミダート、ホスホロジチオアート、Ｎ３’Ｐ５’－ホスホルアミダートおよびオリゴリボヌクレオチドホスホロチオアートならびに本発明のヌクレオチドにおいて使用され得るそれらの２’－Ｏ－アリル類似体および２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドメチルホスホナートが含まれる。
本明細書で使用される場合、「逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）」という用語は、パリンドローム配列を含み、ＤＮＡ複製の開始中にプライマーとして機能するＴ字型ヘアピン構造を形成するように折りたたむことができる、ウイルスの５’末端に位置するヌクレオチド配列（５’ＩＴＲ）および３’末端に位置するヌクレオチド配列（３’ＩＴＲ）を指す。それらはまた、宿主ゲノムへのウイルスゲノム組込みのため、宿主ゲノムからの救済のため、および成熟ビリオンへのウイルス核酸のキャプシド化のためにも必要である。ＩＴＲは、ベクターゲノム複製およびウイルス粒子へのそのパッケージングのためにシスで必要とされる。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、他の要素を除外しない。本開示の目的のために、「からなる」という用語は、「を含む」という用語の好ましい実施形態であると見なされる。
本明細書で使用される場合、「とりわけ」、「典型的には」または「特に」という用語は、いくつかの実施形態のうちの１つの選択肢を指すために交換可能に使用され、「好ましくは」という用語は好ましい実施形態を指す。
本明細書で使用される場合、ＳＮｃは黒質緻密部（ＳＮｃ）の頭字語である。
本開示の核酸構築物
本開示による核酸構築物は、導入遺伝子、および少なくとも本開示のウイルスベクターを用いた遺伝子療法によって治療される前記宿主におけるその発現のための適切な核酸エレメントを含む。
例えば、前記核酸構築物は、グルコセレブロシダーゼのコード配列および関連する細胞型または組織における前記コード配列の発現に必要な１つ以上の制御配列からなる導入遺伝子を含む。一般に、核酸構築物は、選択された遺伝子産物の発現に必要なコード配列と、コード配列に先行する（５’非コード配列）および後続する（３’非コード配列）調節配列とを含む。したがって、特定の実施形態では、前記核酸構築物は、少なくとも（ｉ）プロモータの制御下でグルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子、（ｉｉ）プロモータならびに（ｉｉｉ）通常ポリアデニル化部位および／または転写ターミネータを含む３’非翻訳領域を含む。核酸構築物はまた、例えば、エンハンサ配列、イントロン、マイクロＲＮＡ標的化配列、ベクター内へのＤＮＡ断片の挿入を促進するポリリンカー配列および／またはスプライシングシグナル配列などのさらなる調節エレメントを含み得る。
特定の核酸構築物は、以下に開示される配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択される核酸配列の一部を含む導入遺伝子を含み、そのような特定の核酸構築物を含むベクターまたは粒子も本開示の一部である。
グルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子
特に、本開示による核酸構築物は、グルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子、好ましくは配列番号５、６、８、１７または１８を含むヒトグルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子、好ましくは配列番号５、６または８を含むヒトグルコセレブロシダーゼ（アイソフォーム１としても公知）をコードする導入遺伝子を含む。
本明細書で使用される場合、「グルコセレブロシダーゼ」という用語は、細胞膜（特に皮膚細胞）に豊富に存在する糖脂質代謝の中間体である化学物質グルコセレブロシドのβ－グルコシド結合を加水分解によって切断するために必要なグルコシルセラミダーゼ活性を有する酵素（ＥＣ ３．２．１．４５）であるβ－グルコセレブロシダーゼ（酸性β－グルコシダーゼ、Ｄ－グルコシル－Ｎ－アシルスフィンゴシングルコヒドロラーゼ、またはＧＣａｓｅとも呼ばれる。）を指す。「グルコセレブロシダーゼ」という用語は、酵素および任意のさらなる同時翻訳修飾または翻訳後修飾を指す。
ヒトグルコセレブロシダーゼは、グルコセレブロシダーゼの３つの異なるアイソフォーム（アイソフォーム１（配列番号５）、アイソフォーム２（配列番号１７）およびアイソフォーム３（配列番号１８））をコードする５つの選択的にスプライシングされたｍＲＮＡを生成するヒトのＧＢＡ１遺伝子によって天然にコードされる。本明細書で使用される場合、「グルコセレブロシダーゼ」という用語は、グルコセレブロシダーゼの３つのアイソフォームを指す。ヒトＧＢＡ１ ｍＲＮＡアイソフォーム１（ＧｅｎｅＢａｎｋ参照番号Ｍ１９２８５．１：１２３－１７３３）のコード配列部分ＣＤＳに対応するヌクレオチド配列は、配列番号７で表される。
特定の実施形態では、前記核酸構築物は、天然に存在するまたは組換えグルコセレブロシダーゼのコード配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有するコード核酸配列の全部または一部（少なくとも１０００、１１００、１５００、２０００、２５００または少なくとも１５００ヌクレオチド）を含む。天然に存在するグルコセレブロシダーゼには、ヒト、霊長動物、マウスまたは他の哺乳動物の公知のグルコセレブロシダーゼ、典型的には配列番号５、１７または１８のヒトグルコセレブロシダーゼが含まれる。
組換えグルコセレブロシダーゼの例には、イミグルセラーゼ（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ）、ベラグルセラーゼ（Ｖｐｒｉｖ）およびタリグルセラーゼ（Ｅｌｅｌｙｓｏ）が含まれる。
好ましい実施形態では、前記核酸構築物は、ヒトグルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子を含み、前記ヒトグルコセレブロシダーゼは、配列番号５、６、８、１７もしくは１８、例えば、配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択される配列によって表されるヌクレオチド配列、または配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択される配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるバリアント導入遺伝子を含む。好ましくは、前記導入遺伝子は、配列番号１、７、１１、１２および１９、例えば最適化された配列である配列番号１、配列番号７または１９の領域５８～１５５１、配列番号７または１９の領域５８から１６１１、配列番号７または１９の領域１１８～１６１１からなる群より選択されるヌクレオチド配列の一部を含む。一実施形態では、配列番号５、６、８、１７もしくは１８の一部をコードするか、またはヒトグルコセレブロシダーゼと実質的に同じグルコセレブロシダーゼ活性を有する配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択される配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる前記バリアント導入遺伝子。特に、バリアント核酸構築物は、アミノ酸残基の１つ以上が欠失している切断型グルコセレブロシダーゼをコードする。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」または「同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のアラインメントからの位置における一致（同一の核酸またはアミノ酸残基）の数を指す。配列同一性は、配列ギャップを最小化しながら重複および同一性を最大化するように整列した場合の配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、いくつかの数学的グローバルまたはローカルアラインメントアルゴリズムのいずれかを使用して決定され得る。類似の長さの配列は、好ましくは、配列を全長にわたって最適にアラインメントするグローバルアラインメントアルゴリズム（例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．；４８（３）：４４３－５３）を用いてアラインメントされ、一方、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えばＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ｊ Ｔｈｅｏｒ Ｂｉｏｌ．；９１（２）：３７９－８０）またはＡｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．；２５（１７）：３３８９－４０２．；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．；２１（８）：１４５１－６）を用いてアラインメントされる。核酸またはアミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／などのインターネットウェブサイトで入手可能な公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の技術の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本明細書の目的のために、核酸またはアミノ酸配列同一性％値は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して２つの配列の最適なグローバルアラインメントを作成するペアワイズ配列アラインメントプログラムＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して生成された値を指し、すべての検索パラメータはデフォルト値、すなわちスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップ伸長＝０．５、エンドギャップペナルティ＝偽、エンドギャップオープン＝１０およびエンドギャップ伸長＝０．５に設定される。
本開示の核酸構築物と共に使用するためのプロモータ
一実施形態では、核酸構築物はプロモータを含む。前記プロモータは、宿主細胞への導入時に導入遺伝子発現を開始する。
本明細書で使用される場合、「プロモータ」という用語は、それが作動可能に連結されている核酸の転写を指示する調節エレメントを指す。プロモータは、作動可能に連結された核酸の転写の速度および効率の両方を調節することができる。プロモータはまた、核酸のプロモータ依存性転写を増強する（「エンハンサ」）または抑制する（「リプレッサ」）他の調節エレメントに作動可能に連結され得る。これらの調節エレメントには、転写因子結合部位、リプレッサおよびアクチベータタンパク質結合部位、ならびに、例えばアテニュエータ、エンハンサおよびサイレンサを含む、プロモータからの転写の量を調節するように直接的または間接的に作用することが当業者に公知の任意の他のヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定されない。プロモータは、同じ鎖上およびＤＮＡ配列の上流（センス鎖の５’領域側）で、作動可能に連結された遺伝子またはコード配列の転写開始部位の近くに位置する。プロモータは、約１００～１０００塩基対の長さであり得る。プロモータ内の位置は、特定の遺伝子の転写開始部位に対して指定される（すなわち、上流の位置は－１から逆算した負の数であり、例えば－１００は１００塩基対上流の位置である）。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、機能的関係にあるポリヌクレオチド（またはポリペプチド）エレメントの連結を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、「作動可能に連結されて」いる。例えば、プロモータまたは転写調節配列は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が、典型的には隣接していることを意味し、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、それらは連続しており、リーディングフレーム内にある。
特定の実施形態では、本開示の核酸構築物は、グルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータをさらに含み、前記プロモータは、少なくとも黒質緻密部（ＳＮｃ）のドーパミン作動性ニューロンおよびミクログリア細胞において、好ましくは少なくとも黒質緻密部、大脳皮質、扁桃体、および視床尾側髄板内核を含む他の脳領域の神経細胞においても、前記導入遺伝子の発現を指示する。
典型的には、そのようなプロモータは、組織もしくは細胞型特異的プロモータ、または器官特異的プロモータ、または複数の器官に特異的なプロモータ、または全身性もしくは遍在性プロモータであり得る。
本明細書で使用される場合、「遍在性プロモータ」という用語は、より具体的には、脳の様々な異なる細胞または組織、例えばニューロンおよびグリア細胞の両方、より具体的には少なくとも黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンおよびミクログリア細胞において、好ましくは少なくとも黒質緻密部、大脳皮質、扁桃体、および視床尾側髄板内核を含む他の脳領域の神経細胞においても活性であるプロモータに関する。
少なくとも黒質緻密部の神経細胞およびミクログリア細胞における導入遺伝子の発現に適したプロモータの例には、ＣＭＶプロモータ（Ｋａｐｌｉｔｔ １９９４，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８－１５４）、ＳＶ４０プロモータ（Ｈａｍｅｒ １９７９，Ｃｅｌｌ １７：７２５－７３５）、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモータ（Ｍｉｙａｚａｋｉ １９８９，Ｇｅｎｅ ７９：２６９－２７７）、ＣＡＧプロモータ（Ｎｉｗａ １９９１，Ｇｅｎｅ １０８：１９３－１９９）、ｂ－グルクロニダーゼプロモータ（ＧｕｓＢ）（Ｓｈｉｐｌｅｙ １９９１，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０：１００９－１０１８）、伸長因子１αプロモータ（ＥＦ１α）（Ｎａｋａｉ １９９８，Ｂｌｏｏｄ ９１：４６００－４６０７）、ヒトシナプシン１遺伝子プロモータ（ｈＳｙｎ）（Ｋｕｇｌｅｒ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３．１０（４）：３３７－４７）またはホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモータ（ＰＧＫ１）（Ｈａｎｎａｎ １９９３，Ｇｅｎｅ １３０：２３３－２３９）が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、前記遍在性プロモータは、好ましくは配列番号２２または２３のヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモータ、好ましくは配列番号２４のヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモータ、および配列番号２５または２６のヒトＣＢＡ／ＣＢｈプロモータからなる群より選択することができる。
一実施形態では、プロモータは、配列番号２または２０を含むかまたはそれからなるＧｕｓＢ遺伝子プロモータである。別の実施形態では、プロモータは、配列番号９または２１を含むかまたはそれからなるＣＡＧプロモータである。別の実施形態では、プロモータは、配列番号２７を含むかまたはそれからなるＪｅＴプロモータである。別の実施形態では、プロモータは、配列番号１３を含むかまたはそれからなるｈＳｙｎ １プロモータである。
これらのプロモータ配列はすべて、少なくとも黒質緻密部の神経細胞およびミクログリア細胞における前記導入遺伝子の発現を可能にする特性を有する。
好ましい実施形態では、前記核酸構築物は、グルコセレブロシダーゼ、典型的には配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列をコードする導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号２または２０を含むかまたはそれからなるＧｕｓＢプロモータを含む。別の実施形態では、前記核酸構築物は、グルコセレブロシダーゼ、典型的には配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列をコードする導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号２７を含むかまたはそれからなるＪｅＴプロモータを含む。別の実施形態では、前記核酸構築物は、グルコセレブロシダーゼ、典型的には配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列をコードする導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号９または２１を含むかまたはそれからなるＣＡＧプロモータを含む。別の実施形態では、前記核酸構築物は、グルコセレブロシダーゼ、典型的には配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列をコードする導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号１３を含むかまたはそれからなるｈＳｙｎプロモータを含む。
特定の実施形態では、本開示で使用するためのプロモータは、化学物質誘導性プロモータであり得る。本明細書で使用される場合、化学物質誘導性プロモータは、それを必要とする前記対象への化学誘導物質のインビボ投与によって調節されるプロモータである。適切な化学物質誘導性プロモータの例には、テトラサイクリン／ミノサイクリン誘導性プロモータ（Ｃｈｔａｒｔｏ ２００３，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．３５２：１５５－１５８）またはラパマイシン誘導性系（Ｓａｎｆｔｎｅｒ ２００６，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１３：１６７－１７４）が含まれるが、これらに限定されない。
本開示の核酸構築物と共に使用するためのポリアデニル化配列
これらの核酸構築物の実施形態の各々はまた、他の任意選択のヌクレオチドエレメントと一緒に、またはヌクレオチドエレメントなしで、ポリアデニル化シグナル配列を含み得る。本明細書で使用される場合、「ポリアデニル化シグナル」または「ポリ（Ａ）シグナル」という用語は、前駆体ｍＲＮＡ分子に転写され、遺伝子転写の終結をガイドする、遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内の特異的認識配列を指す。ポリ（Ａ）シグナルは、新たに形成された前駆体ｍＲＮＡのその３’末端でのエンドヌクレアーゼ切断のため、およびアデニン塩基のみからなるＲＮＡストレッチのこの３’末端への付加（ポリアデニル化プロセス；ポリ（Ａ）尾部）のためのシグナルとして作用する。ポリ（Ａ）尾部は、ｍＲＮＡの核外輸送、翻訳および安定性にとって重要である。本発明の文脈において、ポリアデニル化シグナルは、哺乳動物細胞における哺乳動物遺伝子および／またはウイルス遺伝子のポリアデニル化を指示することができる認識配列である。
ポリ（Ａ）シグナルは、典型的には、ａ）プレメッセンジャＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）の３’末端切断およびポリアデニル化の両方に必要であり、下流の転写終結を促進することが示されているコンセンサス配列ＡＡＵＡＡＡ、ならびにｂ）ポリ（Ａ）シグナルとしてのＡＡＵＡＡＡの利用効率を制御するＡＡＵＡＡＡの上流および下流のさらなるエレメントからなる。哺乳動物遺伝子におけるこれらのモチーフにはかなりの多様性がある。
一実施形態では、任意で上記または下記の様々な実施形態の１つ以上の特徴と組み合わせて、本発明の核酸構築物のポリアデニル化シグナル配列は、哺乳動物遺伝子またはウイルス遺伝子のポリアデニル化シグナル配列である。適切なポリアデニル化シグナルには、とりわけ、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５ ＥＩｂポリアデニル化シグナル、成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＰＢＧＤポリアデニル化シグナル、インシリコで設計されたポリアデニル化シグナル（合成）などが含まれる。
特定の実施形態では、核酸構築物のポリアデニル化シグナル配列は、ヒトまたはウシ成長ホルモン遺伝子に基づくポリアデニル化シグナル配列である。一実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列はウシ成長ホルモン遺伝子に基づき、配列番号３を含むかまたはそれからなる。好ましい実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列はヒト成長ホルモン遺伝子に基づき、配列番号２８を含むかまたはそれからなる。
特定の実施形態では、好ましくは本開示に従って使用するための核酸構築物は、配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるＧＢＡ１遺伝子のコード配列に作動可能に連結された配列番号２または２０を含むかまたはそれからなるＧｕｓＢプロモータ、ならびに配列番号２８または配列番号３、好ましくは配列番号２８を含むかまたはそれからなるポリアデニル化シグナル配列を含む。
特定の実施形態では、好ましくは本開示に従って使用するための核酸構築物は、配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるＧＢＡ１遺伝子のコード配列に作動可能に連結された配列番号９または２１を含むかまたはそれからなるＣＡＧプロモータ、ならびに配列番号２８または配列番号３、好ましくは配列番号２８を含むかまたはそれからなるポリアデニル化シグナル配列を含む。
特定の実施形態では、好ましくは本開示に従って使用するための核酸構築物は、配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるＧＢＡ１遺伝子のコード配列に作動可能に連結された配列番号１３を含むかまたはそれからなるｈＳｙｎ １プロモータ、ならびに配列番号２８または配列番号３、好ましくは配列番号２８を含むかまたはそれからなるポリアデニル化シグナル配列を含む。
他の特定の実施形態では、好ましくは本開示に従って使用するための核酸構築物は、配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるＧＢＡ１遺伝子のコード配列に作動可能に連結された配列番号２７を含むかまたはそれからなるＪｅＴプロモータ、ならびに配列番号２８または配列番号３、好ましくは配列番号２８を含むかまたはそれからなるポリアデニル化シグナル配列を含む。
別の好ましい実施形態では、核酸構築物は、ａ）ヒトグルコセレブロシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝であって、好ましくは前記ヌクレオチド配列が配列番号１９を含み、ヒトグルコセレブロシダーゼが配列番号５または８を含む、導入遺伝子；ｂ）前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータであって、好ましくは、ｉ．配列番号９もしくは２１を含むかもしくはそれからなるＣＡＧプロモータ、またはｉｉ．配列番号１３を含むかもしくはそれからなるｈＳｙｎプロモータ、またはｉｉｉ．配列番号２もしくは２０を含むかもしくはそれからなるＧｕｓＢプロモータ、またはｉｖ．配列番号２７を含むかもしくはそれからなるＪｅＴプロモータである、プロモータ；ならびにｃ）ポリアデニル化シグナル配列であって、好ましくは配列番号２８または配列番号３、好ましくは配列番号２８を含むかまたはそれからなるポリアデニル化シグナル配列を含む。
ウイルスベクター
本開示のウイルスベクターは、典型的には、少なくとも（ｉ）導入遺伝子および遺伝子療法によって治療される前記宿主におけるその発現に適した核酸エレメントを含む核酸構築物、ならびに（ｉｉ）ウイルスゲノムの全部または一部、例えばウイルスゲノムの少なくとも逆方向末端反復配列を含む。
一実施形態では、本開示によるウイルスベクターは、ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含む。
一実施形態では、ウイルスベクターは、パルボウイルス（特にアデノ随伴ウイルス）、アデノウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス（特にガンマレトロウイルスおよびレンチウイルス）、ヘルペスウイルス、ならびにＳＶ４０からなる群より独立して選択されるウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含み、好ましい実施形態では、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス（Ａｄ）、またはレンチウイルスである。
一実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含む。
ＡＡＶは、ヒト遺伝子治療のための潜在的なベクターとしてかなりの関心を集めている。ウイルスの好ましい特性の中には、ヒト疾患との関連性の欠如、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する能力、ならびに感染することができる様々な組織に由来する広範囲の細胞株がある。ＡＡＶゲノムは、４６８１塩基を含む線状一本鎖ＤＮＡ分子で構成される（Ｂｅｒｎｓ ａｎｄ Ｂｏｈｅｎｚｋｙ，１９８７，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）３２：２４３－３０７）。ゲノムは、各末端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含み、これは、ＤＮＡ複製の起点として、およびウイルスのパッケージングシグナルとしてシスで機能する。ＩＴＲは約１４５ｂｐの長さである。
本発明のウイルスベクター中のＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有していてよく、または公知のＡＡＶ ＩＴＲと比較して、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換、典型的には５、４、３、２または１ヌクレオチド以下の挿入、欠失または置換によって改変されていてもよい。ＡＡＶベクターの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）の血清型は、任意の公知のヒトまたは非ヒトＡＡＶ血清型から選択され得る。
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、任意のＡＡＶ血清型のＩＴＲを使用することによって実施され得る。公知のＡＡＶ ＩＴＲには、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、上記の核酸構築物は、血清型ＡＡＶ２のＡＡＶの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲをさらに含む前記ウイルスベクターに含まれる。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、好ましくは配列番号１５および／もしくは１６、または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列の血清型ＡＡＶ２のＡＡＶの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含む。
したがって、より特定の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるグルコセレブロシダーゼのコード配列に作動可能に連結された配列番号２または２０のＧｕｓＢプロモータを含む核酸構築物を含み、前記ウイルスベクターは、好ましくは配列番号１５および／もしくは１６、または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列のＡＡＶ２の５’および３’ＩＴＲなどの、前記核酸構築物に隣接するＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。
別の特定の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるグルコセレブロシダーゼのヌクレオチド配列に作動可能に連結された、配列番号９または２１を含むかまたはそれからなるＣＡＧプロモータからなる群より選択されるプロモータを含む核酸構築物を含み、前記ウイルスベクターは、好ましくは配列番号１５および／もしくは１６、または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列のＡＡＶ２の５’および３’ＩＴＲなどの、前記核酸構築物に隣接するＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。
別の特定の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるグルコセレブロシダーゼのヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号１３のｈＳｙｎ １遺伝子プロモータを含むかまたはそれからなる群より選択されるプロモータを含む核酸構築物を含み、ならびに好ましくは配列番号１５および／もしくは１６、または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列のＡＡＶ２の５’および３’ＩＴＲなどの、前記核酸構築物に隣接するＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。
別の特定の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるグルコセレブロシダーゼのヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号２７を含むかまたはそれからなるＪｅＴプロモータを含むかまたはそれからなる群より選択されるプロモータを含む核酸構築物を含み、ならびに好ましくは配列番号１５および／もしくは１６、または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列のＡＡＶ２の５’および３’ＩＴＲなどの、前記核酸構築物に隣接するＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。
特定の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、配列番号４、または配列番号４と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。
好ましい実施形態では、本開示のウイルスベクターは、配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるグルコセレブロシダーゼのヌクレオチド配列に作動可能に連結された、ｉ．配列番号２もしくは２０を含むかもしくはそれからなるＧｕｓＢプロモータ；またはｉｉ．配列番号９もしくは２１を含むかもしくはそれからなるＣＡＧプロモータ；またはｉｉｉ．配列番号１３を含むかもしくはそれからなるｈＳｙｎ １遺伝子プロモータ；またはｉｖ．配列番号２７を含むかもしくはそれからなるＪｅＴプロモータを含むかもしくはそれからなる群より選択されるプロモータを含む核酸構築物を含み、ならびに好ましくは配列番号１５および／もしくは１６、または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列のＡＡＶ２の５’および３’ＩＴＲなどの、前記核酸構築物に隣接するＡＡＶ ＩＴＲをさらに含み、より好ましくは５’ＩＴＲは配列番号１５を含むかまたはそれからなり、３’ＩＴＲは配列番号１６を含むかまたはそれからなり、ならびに本開示のウイルスベクターは、配列番号４、または配列番号４と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる。
他方で、本開示のウイルスベクターは、合成５’ＩＴＲおよび／もしくは３’ＩＴＲを使用することによって、ならびにまた、異なる血清型のウイルスに由来する５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを使用することによっても実施され得る。ウイルスベクターの複製に必要な他のすべてのウイルス遺伝子は、以下に記載されるように、ウイルス産生細胞（パッケージング細胞）内にトランスで提供することができる。したがって、ウイルスベクターへのそれらの包含は任意である。
一実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含む。
ウイルス粒子
上記に開示されたウイルスベクターは、キャプシドタンパク質によって形成されたキャプシド内にパッケージングされ、それによって、次のセクションに記載されるようにウイルス粒子を構成し得る。
好ましい実施形態では、キャプシドは、以下でＡＡＶベクター粒子と呼ばれるアデノ随伴ウイルスのキャプシドタンパク質から形成される。
本明細書で使用される場合、ＡＡＶベクター粒子は、ＡＡＶゲノムの少なくとも５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲならびにアデノ随伴ウイルスのキャプシドタンパク質を含む。ＡＡＶベクター粒子という用語は、公知の組換えＡＡＶベクター粒子（ｒＡＡＶ）の遺伝子操作によって得られる任意のｒＡＡＶまたは変異ＡＡＶベクター粒子を包含する。
アデノ随伴ウイルスのウイルスキャプシドのタンパク質には、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３が含まれる。様々なＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質配列間の相違は、細胞侵入のための異なる細胞表面受容体の使用をもたらす。代替的な細胞内プロセシング経路と組み合わせて、これは、各ＡＡＶ血清型に対して異なる組織向性を生じさせる。
特定の実施形態では、本開示によるＡＡＶウイルス粒子は、特定のＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶベクター／ゲノムのウイルスベクターを、同じ特定の血清型のＡＡＶに対応する天然Ｃａｐタンパク質によって形成されたウイルス粒子上にカプセル化することによって調製され得る。それにもかかわらず、天然に存在するＡＡＶウイルス粒子の構造的および機能的特性を改変および改善するためのいくつかの技術が開発されている（Ｂｕｎｎｉｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００８；１０：７１７－７３３）。したがって、別の実施形態では、本開示によるＡＡＶウイルス粒子は、例えば、ａ）同じまたは異なるＡＡＶ血清型に由来するキャプシドタンパク質［例えばＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ９キャプシドタンパク質；ＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ ＴＴキャプシドタンパク質またはＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶＭＮＭ００４もしくはＡＡＶＭＮＭ００８などのＡＡＶｒｅｔｒｏ血清型由来の他のキャプシドタンパク質など］で構成されるウイルス粒子；ｂ）異なるＡＡＶ血清型または突然変異体由来のキャプシドタンパク質の混合物［例えば２つ以上のＡＡＶ血清型のタンパク質によって形成されたキャプシドとＡＡＶ２ ＩＴＲ］で構成されるモザイクウイルス粒子；ｃ）異なるＡＡＶ血清型またはバリアント間のドメイン交換によって切断されたキャプシドタンパク質［例えばＡＡＶ３ドメインを有するＡＡＶ５キャプシドタンパク質とＡＡＶ２ ＩＴＲ］で構成されるキメラウイルス粒子；またはｄ）選択的結合ドメインを提示し、標的細胞特異的受容体とのストリンジェントな相互作用を可能にするように操作された標的ウイルス粒子にパッケージングされた所与のＡＡＶ血清型のＩＴＲ（１つまたは複数）に隣接するグルコセレブロシダーゼをコードする遺伝子を含む核酸構築物を含む。
ＣＮＳを標的とするＡＡＶベースの遺伝子治療は、Ｐｉｇｎａｔａｒｏ Ｄ，Ｓｕｃｕｎｚａ Ｄ，Ｒｉｃｏ ＡＪ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ ２０１８，１２５：５７５－５８９において既に総説されている。より具体的には、ＡＡＶ粒子は、少なくとも神経細胞およびミクログリア細胞、特に少なくとも脳の黒質緻密部領域（ＳＮｃ）内のドーパミン作動性ニューロンおよびミクログリア細胞を標的とするように選択および／または操作され得る。
特定の実施形態では、本開示によるＡＡＶウイルス粒子に使用するためのキャプシドタンパク質のＡＡＶ血清型の例には、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ ＭＮＭ００４、ＡＡＶ ＭＮＭ００８、およびＡＡＶ ＴＴが含まれる。より好ましい実施形態では、キャプシドタンパク質の前記ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ９およびＡＡＶ ＴＴ血清型から選択される。
特定の実施形態では、任意で上記または下記の様々な実施形態の１つ以上の特徴と組み合わせて、ウイルス粒子は、好ましくは配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、ならびにＡＡＶ９血清型またはＡＡＶ ＴＴ血清型のキャプシドタンパク質、好ましくは配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＡＶ ＴＴ血清型のキャプシドタンパク質を含む、上記のようなＡＡＶウイルスベクターを含む組換えＡＡＶウイルス粒子である。
別の特定の実施形態では、ウイルス粒子は、プロモータの制御下でヒトグルコセレブロシダーゼのコード配列を含む核酸構築物を含み、前記プロモータは、少なくともドーパミン作動性ニューロンおよびミクログリア細胞の両方における前記ヒトグルコセレブロシダーゼの発現を可能にし、前記ウイルス粒子は、少なくとも黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンおよびミクログリア細胞を標的とするウイルス粒子、典型的にはＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ ＭＮＭ００４、ＡＡＶ ＭＮＭ００８、またはＡＡＶ ＴＴ血清型からなる群より選択されるキャプシドタンパク質、好ましくは配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＡＶ ＴＴ血清型のキャプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子の中から選択される。
より特定の実施形態では、本開示によるそのような組換えＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ ＭＮＭ００４、ＡＡＶ ＭＮＭ００８またはＡＡＶ ＴＴ血清型のキャプシドタンパク質、ならびに（ｉ）配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群から選択されるグルコセレブロシダーゼのヌクレオチド配列に作動可能に連結された、配列番号２または２０を含むかまたはそれからなるＧｕｓＢプロモータ、配列番号９または２１を含むかまたはそれからなるＣＡＧプロモータ、配列番号２７を含むかまたはそれからなるＪｅＴプロモータ、および配列番号１３を含むかまたはそれからなるｈＳｙｎプロモータからなる群より選択されるプロモータを含む核酸構築物と、（ｉｉ）前記核酸構築物に隣接するＡＡＶ２の５’および３’ＩＴＲ、好ましくは配列番号１５および／もしくは１６または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列の５’および３’ＩＴＲなどのＡＡＶ ＩＴＲとを含むＡＡＶウイルスベクターを含む。
より具体的な実施形態では、本開示によるそのような組換えＡＡＶウイルス粒子は、配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＡＶ ＴＴ血清型のキャプシドタンパク質、ならびに（ｉ）配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるグルコセレブロシダーゼのヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号２または２０を含むかまたはそれからなるＧｕｓＢプロモータを含む核酸構築物と、（ｉｉ）前記核酸構築物に隣接するＡＡＶ２の５’および３’ＩＴＲ、好ましくは配列番号１５および／もしくは１６または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列の５’および３’ＩＴＲなどのＡＡＶ ＩＴＲとを含むＡＡＶウイルスベクターを含む。
より具体的な実施形態では、本開示によるそのような組換えＡＡＶウイルス粒子は、配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＡＶ ＴＴ血清型のキャプシドタンパク質、ならびに（ｉ）配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるグルコセレブロシダーゼのヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号９または２１を含むかまたはそれからなるＣＡＧプロモータを含む核酸構築物と、（ｉｉ）前記核酸構築物に隣接するＡＡＶ２の５’および３’ＩＴＲ、好ましくは配列番号１５および／もしくは１６または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列の５’および３’ＩＴＲなどのＡＡＶ ＩＴＲとを含むＡＡＶウイルスベクターを含む。
より具体的な実施形態では、本開示によるそのような組換えＡＡＶウイルス粒子は、配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＡＶ ＴＴ血清型のキャプシドタンパク質、ならびに（ｉ）配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるグルコセレブロシダーゼのヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号１３を含むかまたはそれからなるｈＳｙｎプロモータを含む核酸構築物と、（ｉｉ）前記核酸構築物に隣接するＡＡＶ２の５’および３’ＩＴＲ、好ましくは配列番号１５および／もしくは１６または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列の５’および３’ＩＴＲなどのＡＡＶ ＩＴＲとを含むＡＡＶウイルスベクターを含む。
より具体的な実施形態では、本開示によるそのような組換えＡＡＶウイルス粒子は、配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＡＶ ＴＴ血清型のキャプシドタンパク質、ならびに（ｉ）配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるグルコセレブロシダーゼのヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号２７を含むかまたはそれからなるＪｅＴプロモータを含む核酸構築物と、（ｉｉ）前記核酸構築物に隣接するＡＡＶ２の５’および３’ＩＴＲ、好ましくは配列番号１５および／もしくは１６または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列の５’および３’ＩＴＲなどのＡＡＶ ＩＴＲとを含むＡＡＶウイルスベクターを含む。
好ましい一実施形態では、ウイルス粒子は、
ａ）ヒトグルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子であって、配列番号１９またはヒトグルコセレブロシダーゼをコードする配列を含み、ヒトグルコセレブロシダーゼが配列番号５または８を含む、導入遺伝子；
ｂ）前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータであって、好ましくは、配列番号９もしくは２１を含むかもしくはそれからなるＣＡＧプロモータ、または配列番号２もしくは２０を含むかもしくはそれからなるＧｕｓＢプロモータ、または配列番号２７を含むかもしくはそれからなるＪｅＴプロモータ、または配列番号１３を含むかもしくはそれからなるｈＳｙｎプロモータであるプロモータ；
ｃ）ポリアデニル化シグナル配列であって、好ましくは配列番号２８または配列番号３、好ましくは配列番号２８を含むかまたはそれからなるポリアデニル化シグナル配列；
を含む核酸構築物を含み、前記ウイルス粒子は、好ましくはＡＡＶ ＴＴのキャプシドタンパク質を含み、より好ましくは配列番号１４または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有する配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であり、前記核酸構築物は、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、より好ましくはＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含むウイルスベクターに含まれ、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列の各々は、独立して、配列番号１５もしくは１６の配列または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなり、好ましくは５’ＩＴＲは配列番号１５を含み、３’ＩＴＲは配列番号１６を含む。
組換えＡＡＶウイルス粒子の構築は当技術分野で一般的に公知であり、例えば米国特許第５，１７３，４１４号および米国特許第５，１３９，９４１号；国際公開第９２／０１０７０号、国際公開第９３／０３７６９号、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８－３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３－５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９；およびＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１に記載されている。血清型ＡＡＶ ＴＴのキャプシドタンパク質を有するウイルス粒子は、Ｔｏｒｄｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ ２０１８；１４１：２０１４－２０３１にも記載されている。
逆行性輸送を伴うウイルス粒子
いくつかの実施形態では、本開示による前記ウイルス粒子は、逆行性輸送を伴うウイルスバリアント血清型（ＡＡＶｒｅｔｒｏ）の中から選択される。
軸索輸送（時に軸索原形質輸送または軸索原形質流動とも呼ばれる）とは、所与のニューロンの細胞体から軸索終末に向かう細胞小器官およびタンパク質の移動（順行性輸送として公知）を指す。本明細書で使用される場合、「逆行性輸送」という用語は、反対方向、すなわち軸索終末から親細胞体に戻る粒子の輸送を指す。これに関して、神経向性ウイルス（狂犬病ウイルスが最良の例である）は、典型的には軸索終末によって取り込まれ、逆行性輸送を利用することによってニューロンの細胞体に輸送される。
ＡＡＶｒｅｔｒｏ粒子の例には、キャプシドタンパク質、好ましくはＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＭＮＭ００４およびＡＡＶ－ＭＮＭ００８のキャプシドタンパク質、より好ましくはＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＭＮＭ００４およびＡＡＶ－ＭＮＭ００８のＶＰ１キャプシドタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏキャプシドタンパク質は、国際公開第２０１７／２１８８４２Ａ１号に記載されている。
ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＭＮＭ００４およびＡＡＶ－ＭＮＭ００８などの他の様々な異なる種類の改変ウイルスキャプシドもまた、ウイルスベクターの逆行性拡散によってウイルスベクターが送達される領域を神経支配するニューロンを形質導入するように設計されている。
ＡＡＶ－ＭＮＭ００４およびＡＡＶ－ＭＮＭ００８は、例えばＤａｖｉｄｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｄｅｃ ９ ２０１９ ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１９１００６１１１６および国際公開第２０１９／１５８６１９号に記載されている。
ＡＡＶ２真型キャプシド（ＡＡＶ２ ｔｒｕｅ－ｔｙｐｅ ｃａｐｓｉｄ）とも呼ばれるＡＡＶ－ＴＴキャプシドは、例えば国際公開第２０１５／１２１５０１号に記載されている。一実施形態では、ＡＡＶ－ＴＴ ＶＰ１キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿６８０４２６．１）中の以下の位置：１２５、１５１、１６２、３１２、４５７、４９２、４９９、５３３、５４６、５４８、５８５、５８８および／または５９３のうちの１つ以上に対応する位置に野生型ＡＡＶ ＶＰ１キャプシドタンパク質に対する少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、より詳細には、ＡＡＶ－ＴＴは、野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿６８０４２６．１）に対する以下のアミノ酸置換：Ｖ１２５Ｉ、Ｖ１５１Ａ、Ａ１６２Ｓ、Ｔ２０５Ｓ、Ｎ３１２Ｓ、Ｑ４５７Ｍ、Ｓ４９２Ａ、Ｅ４９９Ｄ、Ｆ５３３Ｙ、Ｇ５４６Ｄ、Ｅ５４８Ｇ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔおよび／またはＡ５９３Ｓのうちの１つ以上を含む。特定の一実施形態では、ＡＡＶ－ＴＴは、４５７、４９２、４９９および５３３の位置に野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質に対する４つ以上の突然変異を含む。
さらなる実施形態では、ＡＡＶ－ＴＴキャプシドは、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型に由来し得、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０キャプシドタンパク質に由来することができる。特に、ＡＡＶ２に関して上述した位置に対応する位置は、例えば図１および２に提供されるように、配列アラインメントによって容易に同定することができる。一実施形態では、本開示のＡＡＶ－ＴＴ ＶＰ１キャプシドタンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
特定の実施形態では、前記ＡＡＶｒｅｔｒｏウイルス粒子は、インビボ播種アッセイで決定される、非ヒト霊長動物の尾状核または被殻核への実質内注入後に大脳皮質、好ましくは少なくとも黒質緻密部および大脳皮質における逆行性播種が可能であるものの中から本開示に従って選択される。
より特定の実施形態では、本開示による前記ＡＡＶｒｅｔｒｏウイルス粒子は、インビボ播種アッセイで決定される、ＡＡＶ－ＴＴと少なくとも同じレベルまで、非ヒト霊長動物の尾状核または被殻核への実質内注入後に大脳皮質、好ましくは少なくとも黒質緻密部および大脳皮質における逆行性播種が可能であるものの中から選択される。
本発明者らは実際に、パーキンソン病などの本明細書に開示されるシヌクレイノパチーを治療するための遺伝子療法で使用するための真の逆行性輸送を伴うｒＡＡＶを決定し、例えばＡＡＶ－ＴＴ ｒＡＡＶ－ＧＦＰなどの陽性対照と比較することを可能にするインビボ播種アッセイを設計した。
播種アッセイの１つの重要な特徴は、ｒＡＡＶが通過線維の存在しない領域に注入される、非ヒト霊長動物におけるインビボアッセイであることである。したがって、通過線維、すなわち注入領域を通ってより遠くの目的地へと進む線維によって偽陽性取り込みを得ることはできない。非ヒト霊長動物では、尾状核および被殻核は１００％の実質構造体であり、したがって通過線維を含まない。したがって、有利には、提案される播種アッセイによって、逆行性輸送を伴う適切なｒＡＡＶを本開示に従って比較および選択することができる。
好ましい実施形態では、前記ＡＡＶｒｅｔｒｏウイルス粒子は、配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、インビボ播種アッセイで決定される、非ヒト霊長動物の尾状核または被殻核への実質内注入後に大脳皮質、好ましくは少なくとも黒質緻密部および大脳皮質における逆行性播種が可能である、ＡＡＶ ＴＴ血清型キャプシドタンパク質を含む。
好ましい実施形態では、前記インビボ播種アッセイは、以下の工程：
ａ．ＧＦＰをコードする導入遺伝子を含む試験ｒＡＡＶ（ｒＡＡＶ－ＧＦＰ）を、非ヒト霊長動物の交連後被殻への前記ｒＡＡＶ－ＧＦＰの実質内注入によって注入する工程、
ｂ．注入の１ヶ月後に、大脳皮質、好ましくは尾状被殻核を神経支配する脳領域におけるＧＦＰ発現ニューロンの数を計測する工程
を含む。
ＧＦＰをコードする導入遺伝子は、配列番号１０のＧＦＰをコードする核酸または最適化された配列もしくは切断型を有するその機能的バリアントから調製され得る。
ＧＦＰを発現するニューロンは、抗ＧＦＰ抗体を使用して免疫ペルオキシダーゼ染色によって可視化され得る。ＧＦＰ発現ニューロンは、有利には、注入された非ヒト霊長動物の大脳皮質全体にわたって自動的に計数され得る。ＧＦＰ陽性ニューロンの選択的な位置は、大脳皮質の深層に生じると予想される。皮質領域に加えて、ＧＦＰ発現ニューロンはまた、注入された交連後被殻または尾状被殻核、特に少なくとも黒質緻密部、扁桃体および尾側髄板内核を神経支配するすべての脳領域において定量化され得る。
１つの特定の実施形態では、本開示によるＡＡＶｒｅｔｒｏウイルス粒子は、前記インビボ播種アッセイで決定される、注入部位を神経支配する大脳皮質の深層Ｖ～ＶＩのニューロンの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または少なくとも９０％がＧＦＰを発現しているものの中から選択される。好ましい実施形態では、前記ＡＡＶｒｅｔｒｏウイルス粒子は、配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記インビボ播種アッセイで決定される、注入部位を神経支配する大脳皮質の深層Ｖ～ＶＩのニューロンの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または少なくとも９０％がＧＦＰを発現している、ＡＡＶ ＴＴ血清型キャプシドタンパク質を含む。
より特定の実施形態では、播種アッセイは、例に記載されているように実施される。
より特定の実施形態では、前記インビボ播種アッセイは、以下の工程：
ａ．ＧＦＰ導入遺伝子を含む試験ｒＡＡＶを、非ヒト霊長動物の交連後被殻への前記ｒＡＡＶ－ＧＦＰの実質内注入によって注入する工程、
ｂ．注入の１ヶ月後に、大脳皮質、好ましくは尾状被殻核を神経支配する脳領域、より好ましくは少なくとも大脳皮質、黒質、扁桃体および尾側髄板内核におけるＧＦＰ発現ニューロンの数を計測する工程、
ｃ．大脳皮質における標識ニューロンの割合を、ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＦＰを用いて実施した対照実験と比較する工程
を含む。
他の実施形態では、前記ＡＡＶｒｅｔｒｏは、以下のバリアント血清型：ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ－ＭＮＭ００４、ＡＡＶ－ＭＮＭ００８およびＡＡＶ－ＴＴの中から選択されるキャプシドタンパク質を含む。
好ましい実施形態では、前記ＡＡＶｒｅｔｒｏウイルス粒子は、配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＡＶ ＴＴ血清型キャプシドタンパク質を含む。
パーキンソン病の最大５つの病期が古典的に神経科医によって定義されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐａｒｋｉｎｓｏｎ．ｏｒｇ／Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ－Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｓ／Ｗｈａｔ－ｉｓ－Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｓ／Ｓｔａｇｅｓ－ｏｆ－Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｓを参照）。最も広く使用されている臨床評価尺度は、ＰＤの進行を５段階で評価するいわゆるＨｏｅｈｎ ａｎｄ Ｙａｈｒ（Ｈ－Ｙ）病期である：１および２は初期段階を表し、２および３は軽症段階を表し、４および５は進行段階を表す。
有利には、逆行性輸送を伴うウイルス粒子は、進行した疾患段階の患者において播種性α－シヌクレイン凝集体を有する脳領域全体にわたってウイルス粒子がグルコセレブロシダーゼを発現することを可能にする。
したがって、ＡＡＶｒｅｔｒｏウイルス粒子、好ましくはＡＡＶ ＴＴ血清型キャプシドタンパク質を含むＡＡＶｒｅｔｒｏウイルス粒子、より好ましくは配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｅｔｒｏウイルス粒子が、好ましくは、進行期のシヌクレイノパチー、典型的には少なくともパーキンソン病のＨ－Ｙステージ３を有する患者の治療において本開示に従って使用するために選択される。
ウイルス粒子を生成する方法
上記に開示される発現ウイルスベクターを担持するウイルス粒子の生成は、従来の方法およびプロトコルによって実施することができ、これらは、生成されるウイルス粒子の実際の実施形態のために選択される構造的特徴を考慮して選択される。
簡詳細には潔には、ウイルス粒子は、宿主細胞、より詳細には、ヘルパーベクターもしくはウイルスまたは他のＤＮＡ構築物（１つまたは複数）の存在下で、パッケージングされる核酸構築物またはウイルスベクターでトランスフェクトされた特定のウイルス産生細胞（パッケージング細胞）において生成することができる。
本明細書で使用される「パッケージング細胞」という用語は、本開示の核酸構築物またはウイルスベクターでトランスフェクトされ得る細胞または細胞株を指し、ウイルスベクターの完全な複製およびパッケージングに必要なすべての欠損機能をトランスで提供する。典型的には、パッケージング細胞は、前記欠損ウイルス機能の１つ以上を構成的または誘導性に発現する。前記パッケージング細胞は、接着細胞または懸濁細胞であり得る。
典型的には、ウイルス粒子を生成する方法は、以下の工程：
ａ）上記の核酸構築物またはウイルスベクターを含むパッケージング細胞を培地中で培養する工程；ならびに
ｂ）細胞培養上清および／または細胞内からウイルス粒子を採取する工程
を含む。
従来の方法を使用して、ＡＡＶウイルス粒子のウイルス粒子を生成することができ、この方法は、グルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子を担持する核酸構築物または発現ベクター（例えばプラスミド）；ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードするが、ＩＴＲ配列を担持しない核酸構築物（例えばＡＡＶヘルパープラスミド）；ならびにＡＡＶ複製に必要なアデノウイルス機能を提供する第３の核酸構築物（例えばプラスミド）による一過性細胞同時トランスフェクションからなる。ＡＡＶ複製に必要なウイルス遺伝子は、本明細書ではウイルスヘルパー遺伝子と呼ばれる。典型的には、ＡＡＶ複製に必要な前記遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、またはＶＡ ＲＮＡなどのアデノウイルスヘルパー遺伝子である。好ましくは、アデノウイルスヘルパー遺伝子はＡｄ５またはＡｄ２血清型のものである。
本開示によるＡＡＶ粒子の大規模生産はまた、例えば、組換えバキュロウイルスの組合せによる昆虫細胞の感染によって実施することもできる（Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００２；１３：１９３５－１９４３）。ＳＦ９細胞に、パッケージングされるＡＡＶｒｅｐ、ＡＡＶｃａｐおよびＡＡＶベクターをそれぞれ発現する２つまたは３つのバキュロウイルスベクターを同時感染させる。組換えバキュロウイルスベクターは、ウイルス複製および／またはパッケージングに必要なウイルスヘルパー遺伝子機能を提供する。Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．２００９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１７，ｎｏ．１１，ｐｐ １８８８－１８９６）はさらに、昆虫細胞におけるＡＡＶ粒子の大規模生産のための二重バキュロウイルス発現系を記載する。
適切な培養培地は当業者に公知である。そのような培地を構成する成分は、培養される細胞の種類に応じて異なり得る。栄養組成に加えて、浸透圧およびｐＨは培養培地の重要なパラメータと考えられる。細胞増殖培地は、アミノ酸、ビタミン、有機塩および無機塩、炭水化物源、脂質、微量元素（ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＺｎＳＯ４・・・）を含む当業者に周知の多数の成分を含み、各成分は、インビトロでの細胞の培養（すなわち細胞の生存および増殖）を支持する量で存在する。成分はまた、緩衝物質（重炭酸ナトリウム、Ｈｅｐｅｓ、Ｔｒｉｓまたは同様に機能する緩衝剤のような）、酸化安定剤、機械的ストレスに対抗する安定剤、プロテアーゼ阻害剤、動物成長因子、植物加水分解物、凝集防止剤、消泡剤などの様々な補助物質を含み得る。細胞増殖培地の特性および組成は、特定の細胞要件に応じて異なる。市販の細胞増殖培地の例は、ＭＥＭ（最小必須培地）、ＢＭＥ（イーグル基礎培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、イスコフＤＭＥＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、ライボビッツＬ－１５、マッコイ培地、１９９培地、ハム（ハム培地）Ｆ１０および誘導体、ハムＦ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２などである。
本開示に従って使用するためのウイルスベクターの構築および生成のためのさらなる指針は、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｓｅｒｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７３７．Ｍｅｒｔｅｎ ａｎｄ Ａｌ－Ｒｕｂｅａｉ（Ｅｄｓ．）；２０１１ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍ．Ｇｉａｃｃａ．２０１０ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ；Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ Ｒ．ａｎｄ Ｗｅｇｅｒ Ｓ．Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｉｎ：Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９７；Ｍ．Ｓｃｈａｆｅｒ－Ｋｏｒｔｉｎｇ（Ｅｄ．）．２０１０ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ；ｐｐ．１４３－１７０；Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｒ．Ｏ．Ｓｎｙｄｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｍｏｕｌｌｌｉｅｒ（Ｅｄｓ）．２０１１ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）；Ｂｕｎｎｉｎｇ Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２００８；１０：７１７－７３３；Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｍ．Ｃｈｉｌｌｏｎ ａｎｄ Ａ．Ｂｏｓｃｈ（Ｅｄｓ．）；Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．２０１４ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）に見出すことができる。
本開示はまた、上記のグルコセレブロシダーゼをコードする核酸構築物またはウイルスベクターを含む宿主細胞に関する。より詳細には、本開示による宿主細胞は、ヘルパーベクターもしくはウイルスまたは他のＤＮＡ構築物の存在下で、上記の核酸構築物またはウイルスベクターでトランスフェクトされ、ウイルス粒子の完全な複製およびパッケージングに必要なすべての欠損機能をトランスで提供する、パッケージング細胞とも呼ばれる特定のウイルス産生細胞である。前記パッケージング細胞は、接着細胞または懸濁細胞であり得る。
例えば、前記パッケージング細胞は、サル、ヒト、イヌおよびげっ歯動物細胞を含む哺乳動物細胞などの真核細胞であり得る。ヒト細胞の例は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（国際公開第０１／３８３６２号）、ＭＲＣ－５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７１）、ＷＩ－３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７５）、ＨＥＫ－２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）および胎児アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＬ－１６０）である。非ヒト霊長動物細胞の例は、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）、ＣＯＳ－１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）またはＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）である。イヌ細胞の例は、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４）である。げっ歯類細胞の例は、ＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはＣＨＯ細胞などのハムスター細胞である。
哺乳動物供給源の代替物として、ウイルス粒子を産生するためのパッケージング細胞は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラまたはキジなどの鳥類供給源に由来し得る。鳥類細胞株の例には、鳥類胚性幹細胞（国際公開第０１／８５９３８号および国際公開第０３／０７６６０１号）、不死化アヒル網膜細胞（国際公開第２００５／０４２７２８号）、ならびにニワトリ細胞（国際公開第２００６／１０８８４６号）またはＥＢ６６細胞株（国際公開第２００８／１２９０５８号および国際公開第２００８／１４２１２４号）などのアヒル細胞を含む鳥類胚性幹細胞由来細胞が含まれる。
別の実施形態では、細胞は、バキュロウイルスの感染および複製を許容する任意のパッケージング細胞であり得る。特定の実施形態では、前記細胞は、ＳＦ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１）、Ｓｆ２１細胞（ＩＰＬＢ－Ｓｆ２１）、ＭＧ１細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－ＭＧ１）またはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）などの昆虫細胞である。
したがって、特定の実施形態では、任意で上記または下記の様々な実施形態の１つ以上の特徴と組み合わせて、宿主細胞は、
－上記のグルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物またはウイルスベクター（例えばＡＡＶベクター）、
－ＩＴＲ配列を有さないＡＡＶｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子をコードする核酸構築物、例えばプラスミド；ならびに、任意で、
－ウイルスヘルパー遺伝子を含む核酸構築物、例えばプラスミドまたはウイルス
を含む。
別の態様では、本開示は、本開示のウイルス粒子で形質導入された宿主細胞に関し、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、関心対象のウイルスによる感染を受けやすく、インビトロでの培養に適した任意の細胞株を指す。
医薬組成物
本開示の別の態様は、本開示の核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子または宿主細胞を、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて含む医薬組成物に関する。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、動物および／またはヒトでの使用について、規制機関または欧州薬局方などの広く認められている薬局方によって承認されていることを意味する。「賦形剤」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、担体、またはビヒクルを指す。
任意の適切な薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を医薬組成物の調製に使用することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄｉｔｏｒ）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｐｒｉｌ １９９７を参照）。医薬組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定である。医薬組成物は、溶液（例えば生理食塩水、デキストロース溶液、もしくは緩衝溶液、もしくは他の薬学的に許容される滅菌流体）、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い製品濃度を収容するのに適した他の秩序構造体（例えばマイクロ粒子またはナノ粒子）として製剤化され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。
好ましくは、前記医薬組成物は、溶液として、より好ましくは任意で緩衝された生理食塩水として製剤化される。補足的な活性化合物を本発明の医薬組成物に組み込むこともできる。さらなる治療薬の同時投与に関する指針は、例えばカナダ薬剤師会（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）のＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ（ＣＰＳ）に見出すことができる。
一実施形態では、医薬組成物は、実質内、大脳内、静脈内、または髄腔内投与に適した組成物である。これらの医薬組成物は単なる例示であり、他の非経口および非非経口投与経路に適した医薬組成物を限定するものではない。本明細書に記載される医薬組成物は、単一単位投与形態または複数回投与形態で包装され得る。
治療用途
本発明はまた、治療に使用するための本明細書に記載のウイルス粒子を提供する。
一実施形態では、治療に使用するためのウイルス粒子は、
ａ）ヒトグルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子であって、配列番号１、７、１１、１２もしくは１９（好ましくは配列番号１９）またはヒトグルコセレブロシダーゼをコードする配列を含み、ヒトグルコセレブロシダーゼが配列番号５、６、８、１７または１８（好ましくは配列番号５または８）を含む、導入遺伝子；
ｂ）前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータであって、好ましくは、少なくとも黒質緻密部（ＳＮｃ）の神経細胞およびミクログリア細胞における前記導入遺伝子の発現を可能にし、好ましくは配列番号９もしくは２１を含むかもしくはそれからなるＣＡＧプロモータ、または配列番号２もしくは２０を含むかもしくはそれからなるＧｕｓＢプロモータ、または配列番号２７を含むかもしくはそれからなるＪｅＴプロモータ、または配列番号１３を含むかもしくはそれからなるｈＳｙｎプロモータである、プロモータ；
ｃ）ポリアデニル化シグナル配列、好ましくは配列番号２８または配列番号３、好ましくは配列番号２８を含むかまたはそれからなるポリアデニル化シグナル配列；
を含む核酸構築物を含むウイルス粒子であり、前記ウイルス粒子は、好ましくはＡＡＶ ＴＴのキャプシドタンパク質を含み、より好ましくは配列番号１４または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有する配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であり、前記核酸構築物は、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、より好ましくはＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含むウイルスベクターに含まれ、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列の各々は、独立して、配列番号１５もしくは１６の配列または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなり、好ましくは５’ＩＴＲは配列番号１５を含み、３’ＩＴＲは配列番号１６を含む。
マウスおよび非ヒト霊長動物における孤発性パーキンソン病の動物モデルを使用して、本発明者らは、驚くべきことに、グルコセレブロシダーゼ活性のＡＡＶ媒介増強が、
－黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンにおけるα－シヌクレイン凝集体のクリアランスを誘導する；
－ドーパミン作動性ニューロンの神経保護を誘導する、
－α－シヌクレイン凝集によって引き起こされるミクログリア駆動性の炎症促進現象を減弱させる、および
－α－シヌクレインの経ニューロン通過（プリオン様拡散）を妨げる
ことを見出した。
これらの結果は、ヒト対象におけるシヌクレイノパチー、特に孤発性シヌクレイノパチー、より具体的にはパーキンソン病を治療するための可能性のある治療戦略の強力な証拠を提供する。
したがって、さらなる態様では、シヌクレイノパチー、好ましくはパーキンソン病、より具体的には孤発性パーキンソン病の治療に使用するための本明細書に記載のウイルス粒子またはウイルスベクターが提供される。
一実施形態では、シヌクレイノパチー、好ましくはパーキンソン病、より具体的には孤発性パーキンソン病の治療に使用するためのウイルス粒子は、
ａ）ヒトグルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子であって、配列番号１、７、１１、１２もしくは１９（好ましくは配列番号１９）またはヒトグルコセレブロシダーゼをコードする配列を含み、ヒトグルコセレブロシダーゼが配列番号５、６、８、１７または１８（好ましくは配列番号５または８）を含む、導入遺伝子；
ｂ）前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータであって、好ましくは、少なくとも黒質緻密部（ＳＮｃ）の神経細胞およびミクログリア細胞における前記導入遺伝子の発現を可能にし、好ましくは配列番号９もしくは２１を含むかもしくはそれからなるＣＡＧプロモータ、または配列番号２もしくは２０を含むかもしくはそれからなるＧｕｓＢプロモータ、または配列番号２７を含むかもしくはそれからなるＪｅＴプロモータ、または配列番号１３を含むかもしくはそれからなるｈＳｙｎプロモータである、プロモータ；
ｃ）ポリアデニル化シグナル配列、好ましくは配列番号２８または配列番号３、好ましくは配列番号２８を含むかまたはそれからなるポリアデニル化シグナル配列
を含む核酸構築物を含むウイルス粒子であり、前記ウイルス粒子は、好ましくはＡＡＶ ＴＴのキャプシドタンパク質を含み、より好ましくは配列番号１４または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有する配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であり、前記核酸構築物は、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、より好ましくはＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含むウイルスベクターに含まれ、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列の各々は、独立して、配列番号１５もしくは１６の配列または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなり、好ましくは５’ＩＴＲは配列番号１５を含み、３’ＩＴＲは配列番号１６を含む。
さらに、本開示は、シヌクレイノパチー、好ましくはパーキンソン病、より具体的には孤発性パーキンソン病を、その治療を必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量の上記のウイルス粒子またはウイルスベクターを前記対象に投与することを含む方法に関する。
一実施形態では、シヌクレイノパチー、好ましくはパーキンソン病、より具体的には孤発性パーキンソン病を、その治療を必要とする対象において治療する方法は、
ａ）ヒトグルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子であって、配列番号１、７、１１、１２もしくは１９（好ましくは配列番号１９）またはヒトグルコセレブロシダーゼをコードする配列を含み、ヒトグルコセレブロシダーゼが配列番号５、６、８、１７または１８（好ましくは配列番号５または８）を含む、導入遺伝子；
ｂ）前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータであって、好ましくは、少なくとも黒質緻密部（ＳＮｃ）の神経細胞およびミクログリア細胞における前記導入遺伝子の発現を可能にし、好ましくは配列番号９もしくは２１を含むかもしくはそれからなるＣＡＧプロモータ、または配列番号２もしくは２０を含むかもしくはそれからなるＧｕｓＢプロモータ、または配列番号２７を含むかもしくはそれからなるＪｅＴプロモータ、または配列番号１３を含むかもしくはそれからなるｈＳｙｎプロモータである、プロモータ；
ｃ）ポリアデニル化シグナル配列、好ましくは配列番号２８または配列番号３、好ましくは配列番号２８を含むかまたはそれからなるポリアデニル化シグナル配列
を含む核酸構築物を含む、治療有効量のウイルス粒子を前記対象に投与することを含み、前記ウイルス粒子は、好ましくはＡＡＶ ＴＴのキャプシドタンパク質を含み、より好ましくは配列番号１４または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有する配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であり、前記核酸構築物は、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、より好ましくはＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含むウイルスベクターに含まれ、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列の各々は、独立して、配列番号１５もしくは１６の配列または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなり、好ましくは５’ＩＴＲは配列番号１５を含み、３’ＩＴＲは配列番号１６を含む。
特定の実施形態では、前記方法は、大脳皮質のニューロン、好ましくは大脳皮質の深層Ｖ～ＶＩのニューロン、好ましくは投与部位を神経支配する大脳皮質の深層Ｖ～ＶＩのニューロンの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または少なくとも９０％に送達される、治療有効量の上記のウイルス粒子またはウイルスベクターを対象に投与することを含む。
別の特定の実施形態では、前記方法は、注入部位を神経支配する脳領域のニューロンに送達される、好ましくは少なくとも尾状被殻核を神経支配する脳領域、すなわち少なくとも黒質緻密部、大脳皮質、扁桃体および視床尾側髄板内核のニューロンに送達される、好ましくはこれらのニューロンの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または少なくとも９０％に送達される、治療有効量の上記のウイルス粒子またはウイルスベクターを対象に投与することを含む。
さらなる態様では、本開示は、上記の核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または医薬組成物であって、それを必要とする対象において薬剤として使用するための、より具体的にはシヌクレイノパチー、特に孤発性シヌクレイノパチー、好ましくはパーキンソン病、より好ましくは孤発性パーキンソン病の治療を必要とする対象において治療に使用するための、核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または医薬組成物に関する。
別のさらなる態様では、本開示は、好ましくはシヌクレインパチー、好ましくはパーキンソン病、より具体的には孤発性パーキンソン病を治療するための薬剤の製造における上記の核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または医薬組成物の使用に関する。
本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、哺乳動物を指す。開示される治療方法から利益を得ることができる哺乳動物種には、ヒト、類人猿、チンパンジー、サルおよびオランウータンなどの非ヒト霊長動物、イヌおよびネコを含む飼いならされた動物、ならびにウマ、ウシ、ブタ、ヒツジおよびヤギなどの家畜、またはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターなどを含むがこれらに限定されない他の哺乳動物種が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、前記対象は、新生児、乳児または小児である。
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」または「治療すること」という用語は、疾患の治療、防止、予防および遅延などの患者の健康状態を改善することを意図した任意の行為を指す。特定の実施形態では、そのような用語は、疾患または疾患に関連する症状の改善または根絶を指す。他の実施形態では、この用語は、そのような疾患を有する対象への１つ以上の治療薬の投与から生じる、疾患の拡散または悪化を最小限に抑えることを指す。
本明細書で使用される場合、シヌクレイノパチーは、神経病理学的特徴がα－シヌクレインの細胞質内凝集によって代表される疾患を指す。特に、シヌクレイノパチーには、パーキンソン病、レビー小体型認知症、および多系統萎縮症などの神経変性障害が含まれる。
本明細書で使用される場合、パーキンソン病（ＰＤ）は、原因不明の中枢神経系の進行性神経変性障害を指す。ＰＤの状況の中では、ドーパミン産生ニューロンが徐々に死滅し、ドーパミンとして公知の神経伝達物質の脳欠損をもたらす。ドーパミン脳レベルの漸進的低下の結果として、随意運動の開始および実行を制御する脳回路が機能不全になり、したがって、典型的にＰＤを特徴付ける基本的な運動症状の出現につながる。最初の診断は通常、寿命の６０代（平均６５歳）で行われ、特徴的な表示は片側性および遠位性である。疾患が進行するにつれて、疾患は身体の両側に影響を及ぼし（例えば両側性）、症状は経時的に悪化し、より明らかになった。最初の診断時に、ほとんどの患者は、レボドパ（ドーパミン前駆体）の様々な製剤および／または多種多様なドーパミン作動薬などの薬剤を服用することによって疾患を薬理学的に管理することができる可変期間（約５～７年間）に直面している。疾患が進行するにつれて、オン－オフ現象および薬剤の慢性摂取に関連する副作用（レボドパ誘発性ジスキネジア）の出現のためにドーパミン補充療法ではＰＤがもはや管理できない時点まで、ドーパミン作動性ニューロンの弱まることのない喪失に対抗するために薬剤投与量が増加する。この段階で、患者は、基底核神経回路内に電極を両側に配置すること（脳深部刺激として公知の手技）からなる機能的な神経外科的アプローチで治療され得る。治療選択肢にかかわらず、利用可能なアプローチは単に症候性であり、すなわち疾患進行速度に何ら影響を及ぼすことなく運動関連症状を緩和することができる。典型的な症候性の三つ組は、振戦（震え）、運動緩徐（動きの緩慢さ）、および固縮（筋硬直のため）で構成される。典型的な三つ組の他に、少数のさらなる症状がしばしば認められ、これらには、歩行障害、構音障害（発話障害）、疼痛、ならびに多数の非運動症状（とりわけ、便秘、尿失禁、レム睡眠障害、嗅覚機能障害および起立性低血圧）が含まれる。精神症状も、しばしば疾患の進行と並行して現れ、認知、思考、気分および行動の障害を含み得る。実際に、認知症は、疾患の後期段階で見られることが多い。
ＰＤの主な神経病理学的特徴は、α－シヌクレインとして公知のミスフォールドタンパク質の細胞質内凝集によって代表される。α－シヌクレイン凝集体は、しばしば、レビー小体と呼ばれる球状構造体および異常なニューロン構造体（レビー小体神経突起）として見られる。黒質緻密部として公知の脳領域のドーパミン作動性ニューロン内のレビー小体の存在は、ＰＤの神経病理学的確認のための選択基準である。ＰＤの診断は、神経科医によって行われる臨床評価の後に、臨床表現型とバランスをとることによって行われる。並行して、放射性トレーサのフルオロドーパ（ドーパミン類似体）を使用した陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴスキャン）による神経画像検査もまた、ＰＤの初期診断を支援し、実際に、経時的な疾患進行の神経画像相関として非常に有用である。
上記の方法は、孤発性シヌクレイノパチー、特に孤発性パーキンソン病を治療するのに特に適している。本明細書で使用される場合、孤発性シヌクレイノパチー（特発性障害とも呼ばれる）は、公知の特定の遺伝子突然変異（家族性症例）に関連しないシヌクレイノパチーを指す。家族性シヌクレイノパチーに関連するそのような公知の遺伝子突然変異には、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＶＰＳ３５、ＧＣＨ１、ＡＴＸＮ２、ＤＮＡＪＣ１３、ＴＭＥＭ２３０、ＧＩＧＹＦ２、ＨＴＲＡ２、ＲＩＣ３、ＥＩＦ４Ｇ１、ＵＣＨＬ１、ＣＨＣＨＤ２、ＧＢＡ１、ＰＲＫＮ、ＰＩＮＫ１、ＤＪ１、ＡＴＰ１３Ａ２、ＰＬＡ２Ｇ６、ＦＢＸＯ７、ＤＮＡＪＣ６、ＳＹＮＪ１、ＳＰＧ１１、ＶＰＳ１３Ｃ、ＰＯＤＸＬ、ＰＴＲＨＤ１、ＲＡＢ３９Ｂ、ＤＮＡＪＣ１３、ＴＭＥＭ２３０、ＧＩＧＹＦ２、ＨＴＲＡ２、ＲＩＣ３、ＥＩＦ４Ｇ１、ＵＣＨＬ１、およびＣＨＣＨＤ２からなる群より選択される遺伝子の突然変異が含まれる。これらの突然変異はさらに、Ｌｕｎａｔｉ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１８；１７４：６２８－６４３により詳細に記載されている。
上記のようなシヌクレイノパチーは、リソソーム蓄積の欠陥、特にゴーシェ病に関連し得る。したがって、別の特定の実施形態では、上記方法はまた、神経障害性ゴーシェ病、より詳細にはＩＩ型またはＩＩＩ型のゴーシェ病を、その治療を必要とする対象において治療するのにも適しており、前記方法は、上記の治療有効量のウイルス粒子、ウイルスベクター、宿主細胞または医薬組成物を前記対象に投与することを含む。
ゴーシェ病（ＧＤ）は、リソソーム蓄積症、より具体的にはマクロファージ－単球系の細胞におけるグルコセレブロシドの沈着を特徴とするスフィンゴ脂質症を指す。
本明細書で使用される「リソソーム蓄積症」という用語は、リソソーム機能の欠陥から生じる遺伝性疾患および代謝障害を指す。リソソーム蓄積障害は、通常、リソソーム内の物質の異常な蓄積を誘導する脂質、糖タンパク質またはいわゆるムコ多糖の代謝に必要な単一の酵素の欠乏の結果としての、リソソーム機能不全によって引き起こされる。
ゴーシェ病は、酵素グルコセレブロシダーゼをコードする遺伝子の劣性突然変異（１つまたは複数）によって引き起こされる。β－グルコシダーゼの異なる突然変異は、酵素の残存活性および、かなりの程度まで、表現型を決定する。ゴーシェ病は、３つの一般的な臨床サブタイプ、すなわち疾患の最も一般的な形態である非神経障害性Ｉ型、本明細書ではＩＩ型とも呼ばれる急性神経障害性ＩＩ型、および本明細書ではＩＩＩ型とも呼ばれる慢性神経障害性ＩＩＩ型を有する。ＩＩ型（急性神経障害性）またはＩＩＩ型（亜急性神経障害性）のゴーシェ病は、中枢神経系に影響を及ぼす原発性神経疾患の存在を特徴とする。ＩＩ型のゴーシェ病は、小児期のいつでも、生後６ヶ月という早い時期に発症する可能性があり、生児出生１００，０００人に約１人で発症する。これは、脳幹の重度の神経学的病変を特徴とし、器官肥大に関連し、一般に２歳前に死亡に至る。主な症状には、脾臓および／または肝臓の腫大、発作、協調不全、骨格不整、眼球運動障害、貧血および呼吸障害を含む血液障害が含まれる。ＩＩＩ型のゴーシェ病は、小児期の後期および青年期に発症し、生児出生１００，０００人に約１人の発生率を有する。症状は、ＩＩ型と比較してよりゆっくりと進行し、肝臓および脾臓の腫大、広範で進行性の脳損傷、眼球運動障害、痙縮、発作、四肢硬直、ならびに吸引および嚥下能力の低下を含む。
さらなる態様では、本開示は、上記のウイルス粒子、ウイルスベクター、宿主細胞または医薬組成物であって、それを必要とする対象において薬剤として使用するための、より具体的には神経障害性ゴーシェ病、より詳細にはＩＩ型またはＩＩＩ型のゴーシェ病を、その治療を必要とする対象において治療するのに使用するための、上記のウイルス粒子、ウイルスベクター、宿主細胞または医薬組成物に関する。
別のさらなる態様では、本開示は、好ましくは神経障害性ゴーシェ病、より詳細にはＩＩ型またはＩＩＩ型のゴーシェ病を治療するための薬剤の製造における上記の核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または医薬組成物の使用に関する。
一実施形態では、神経障害性ゴーシェ病、より詳細にはＩＩ型またはＩＩＩ型のゴーシェ病の治療に使用するためのウイルス粒子は、
ｄ）ヒトグルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子であって、配列番号１、７、１１、１２もしくは１９（好ましくは配列番号１９）またはヒトグルコセレブロシダーゼをコードする配列を含み、ヒトグルコセレブロシダーゼが配列番号５、６、８、１７または１８（好ましくは配列番号５または８）を含む、導入遺伝子；
ｅ）前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータであって、好ましくは、少なくとも黒質緻密部（ＳＮｃ）の神経細胞およびミクログリア細胞における前記導入遺伝子の発現を可能にし、好ましくは配列番号９もしくは２１を含むかもしくはそれからなるＣＡＧプロモータ、または配列番号２もしくは２０を含むかもしくはそれからなるＧｕｓＢプロモータ、または配列番号２７を含むかもしくはそれからなるＪｅＴプロモータ、または配列番号１３を含むかもしくはそれからなるｈＳｙｎプロモータである、プロモータ；
ｆ）ポリアデニル化シグナル配列、好ましくは配列番号２８または配列番号３、好ましくは配列番号２８を含むかまたはそれからなるポリアデニル化シグナル配列
を含む核酸構築物を含むウイルス粒子であり、前記ウイルス粒子は、好ましくはＡＡＶ ＴＴのキャプシドタンパク質を含み、より好ましくは配列番号１４または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有する配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であり、前記核酸構築物は、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、より好ましくはＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含むウイルスベクターに含まれ、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列の各々は、独立して、配列番号１５もしくは１６の配列または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなり、好ましくは５’ＩＴＲは配列番号１５を含み、３’ＩＴＲは配列番号１６を含む。
さらに、本開示は、神経障害性ゴーシェ病、より詳細にはＩＩ型またはＩＩＩ型のゴーシェ病を、その治療を必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量の上記のウイルス粒子またはウイルスベクターを前記対象に投与することを含む方法に関する。
一実施形態では、神経障害性ゴーシェ病、より詳細にはＩＩ型またはＩＩＩ型のゴーシェ病を、その治療を必要とする対象において治療する方法は、
ａ）ヒトグルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子であって、配列番号１、７、１１、１２もしくは１９（好ましくは配列番号１９）またはヒトグルコセレブロシダーゼをコードする配列を含み、ヒトグルコセレブロシダーゼが配列番号５、６、８、１７または１８（好ましくは配列番号５または８）を含む、導入遺伝子；
ｂ）前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータであって、好ましくは、少なくとも黒質緻密部（ＳＮｃ）の神経細胞およびミクログリア細胞における前記導入遺伝子の発現を可能にし、好ましくは配列番号９もしくは２１を含むかもしくはそれからなるＣＡＧプロモータ、または配列番号２もしくは２０を含むかもしくはそれからなるＧｕｓＢプロモータ、または配列番号２７を含むかもしくはそれからなるＪｅＴプロモータ、または配列番号１３を含むかもしくはそれからなるｈＳｙｎプロモータである、プロモータ；
ｃ）ポリアデニル化シグナル配列、好ましくは配列番号２８または配列番号３、好ましくは配列番号２８を含むかまたはそれからなるポリアデニル化シグナル配列
を含む核酸構築物を含む、治療有効量のウイルス粒子を前記対象に投与することを含み、前記ウイルス粒子は、好ましくはＡＡＶ ＴＴのキャプシドタンパク質を含み、より好ましくは配列番号１４または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有する配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であり、前記核酸構築物は、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、より好ましくはＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含むウイルスベクターに含まれ、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列の各々は、独立して、配列番号１５もしくは１６の配列または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなり、好ましくは５’ＩＴＲは配列番号１５を含み、３’ＩＴＲは配列番号１６を含む。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、所望の治療結果、例えば以下の治療結果：
－前記対象における黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンにおける、好ましくはさらにα－シヌクレイン凝集体を示す任意の他の脳領域のニューロンにおける、α－シヌクレイン負荷量の有意な減少、
－チロシン陽性ニューロンの死滅の有意な減少によって示される、黒質緻密部におけるドーパミン作動性ニューロンの有意な神経保護効果、
－α－シヌクレイン凝集体を示す任意の他の脳領域のニューロンにおける有意な神経保護効果、
－α－シヌクレイン凝集によって引き起こされるミクログリア駆動性炎症促進現象の有意な減少、
－α－シヌクレインのプリオン様経ニューロン通過の有意な遮断
の１つ以上を達成するのに必要な投与量および期間で有効な量を指す。
使用される場合、「α－シヌクレインのプリオン様経ニューロン通過」は、α－シヌクレインを発現する軸索終末によって神経支配されているニューロン軸索終末から次のニューロンに伝播するためのα－シヌクレインの能力を指す。
α－シヌクレイン負荷量の有意な減少（例えば黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンにおいて）は、最低４週間の治療期間後の対応する脳領域（例えば黒質緻密部）におけるα－シヌクレイン凝集体の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％の減少に対応し得る。
いくつかの実施形態では、治療された患者におけるドーパミン作動性ニューロンの有意な神経保護効果は、最低５２週間（１年）の治療期間後に、未治療患者と比較してニューロンの生存を少なくとも１０％、少なくとも２０％または少なくとも３０％改善したものとして推定され得る。
他の特定の実施形態では、本開示の生成物による治療は、シヌクレイノパチーまたは神経障害性ゴーシェ病の進行を阻害し得る、または発症を遅延させ得る、または１つ以上の症状の重症度を低下させ得る。例えば、治療は、以下の症状：
－ドーパミン作動性ニューロンの変性（例えば黒質緻密部において）、
－運動緩徐
－筋硬直
－振戦、安静時振戦、
－バランス障害および歩行障害
－神経精神症状、
－α－シヌクレインの蓄積
－レビー小体の蓄積
－疾患進行速度
－臨床運動関連尺度で得られるスコア
－認知状態を測定する試験で得られるスコア
－神経画像ＰＥＴスキャンにおける放射性トレーサ取り込みのレベル（結合能として測定）
－嗅覚試験
－レム睡眠障害
－非運動症状（とりわけ、便秘、尿失禁、レム睡眠障害、嗅覚機能障害、および起立性低血圧）
－構音障害および発話流暢性
－認知（認知症への進行を含む）、思考、気分および行動の障害
の１つ以上の進行を阻害し得る、または発症を遅延させ得る、または重症度を低下させ得る。
一実施形態では、有効量の上記のウイルス粒子（またはウイルスベクター）は、実質内、大脳内、脳室内（ｉｃｖ）、髄腔内、または静脈内経路によって対象または患者に投与される。
いくつかの実施形態では、パーキンソン病、特に孤発性パーキンソン病の場合、標的領域は、α－シヌクレインの蓄積を示す任意の脳領域、特に黒質緻密部および大脳皮質によって代表される。したがって、治療有効量の前記ウイルス粒子またはウイルスベクターは、好ましくは実質内経路によって、より好ましくは黒質緻密部および／または尾状被殻核の脳領域に投与される。一実施形態では、実質内経路は、脳の他の領域と比較してＳＮｃへの好ましい局所投与を促進し得る。
本明細書で使用される場合、「ＳＮｃへの好ましい局所投与」は、すべてのウイルス粒子またはウイルスベクターがＳＮｃに投与されるのではなく、ウイルス粒子の大部分、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％（ｖｇ）がＳＮｃの領域またはＳＮｃニューロンによって神経支配される任意の他の脳領域のいずれかに投与されることを意味する。
脳脊髄腔への投与では、ニューロン形質導入は、脳脊髄液循環動態に依存し、したがって（１）脳室周囲領域、すなわち脳室に近接する領域で、（２）非特異的に、すなわちニューロンは脳室またはくも膜下腔のいずれかからの拡散によって形質導入され、皮質上層Ｉ～ＩＶで強い標識が観察されると予想され（例えばくも膜下腔からの拡散によって）、ならびに（３）被殻に接続されていない小脳および海馬などの脳領域で発生すると予想される。黒質などの脳深部領域のニューロンの脳室系からの形質導入は、黒質が脳室から遠く離れて位置し、したがって受動拡散によってトランスフェクトされることが非常に困難であることを念頭に置くと、まずありそうにない。
脳脊髄腔における投与とは対照的に、尾状被殻核でのウイルスベクターの投与は、大脳皮質、視床、扁桃体、黒質緻密部および注入部位を神経支配する背側縫線核に位置するニューロンの特異的形質導入、ならびに被殻を神経支配することが公知の脳領域、例えば予想外の領域への逆行性拡大を伴わない（例えば被殻を神経支配しないことが公知の領域への逆行性輸送の欠如）被殻に突出する皮質領域のＶ層における回路特異的逆行性拡大などのいくつかの利点を提示する。
したがって、実質内経路は、尾状被殻核へのウイルス粒子の局所投与を促進し、したがって注入部位を神経支配する任意の脳領域への導入遺伝子の逆行性播種を促進し得る。
好ましい実施形態では、ウイルス粒子は、尾状被殻核への実質内経路を介して、好ましくは１０１３～１０１４ｖｇ／ｍＬ（ｖｇ：ウイルスゲノム）の範囲内に含まれる濃度で、被殻当たり５０～１０００μＬ、好ましくは２００～７００μＬの範囲内に含まれる体積で、ヒト対象または患者に投与することができる。特定の実施形態では、前記ウイルス粒子は、０．５～５μＬ／分の範囲内に含まれる注入デビット（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｄｅｂｉｔ）で、好ましくは２～６時間投与される。ウイルス粒子のそのような高い注入デビットは、ウイルスの安定性を高め、患者のより良い管理を可能にする。
特定の実施形態では、前記ウイルス粒子は、好ましくはＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＭＮＭ００４、ＡＡＶ－ＭＮＭ００８、およびＡＡＶ ＴＴ血清型からなる群より選択されるキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子の中から選択される。
特定の実施形態では、前記ウイルス粒子は、以下のバリアント血清型：ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ－ＭＮＭ００４、ＡＡＶ－ＭＮＭ００８およびＡＡＶ－ＴＴの中から選択されるキャプシドタンパク質を含むＡＡＶｒｅｔｒｏである。
一実施形態では、ＡＡＶ－ＴＴ粒子は、尾状被殻核への実質内経路を介して、好ましくは１０１３～１０１４ｖｇ／ｍＬ（ｖｇ：ウイルスゲノム）の範囲内に含まれる濃度で、被殻当たり５０～１０００μＬ、好ましくは２００～７００μＬの範囲内に含まれる体積で、ヒト対象または患者に投与することができる。特定の実施形態では、前記ウイルス粒子は、０．５～５μＬ／分の範囲内に含まれる注入デビットで、好ましくは２～６時間投与される。
別の実施形態では、ＡＡＶ－９粒子は、尾状被殻核への実質内経路を介して、好ましくは１０１３～１０１４ｖｇ／ｍＬ（ｖｇ：ウイルスゲノム）の範囲内に含まれる濃度で、被殻当たり５０～１０００μＬ、好ましくは２００～７００μＬの範囲内に含まれる体積で、ヒト対象または患者に投与することができる。特定の実施形態では、前記ウイルス粒子は、０．５～５μＬ／分の範囲内に含まれる注入デビットで、好ましくは２～６時間投与される。
一実施形態では、実質内経路は、尾状被殻核へのＡＡＶの好ましい局所投与を促進し、したがって注入部位を神経支配する任意の脳領域へのＧＢＡ１導入遺伝子の逆行性播種を促進し得る。
本開示は、シヌクレイノパチーなどの神経変性疾患の治療に使用するための本開示によるＧＢＡ１導入遺伝子を含むウイルス粒子、好ましくはＡＡＶ粒子に関し、前記ウイルス粒子は、実質内経路を介して尾状被殻核に投与される。
好ましい実施形態では、本開示によるＡＡＶウイルス粒子は、尾状被殻核への実質内経路を介して、好ましくは１０１３～１０１４ｖｇ／ｍＬ（ｖｇ：ウイルスゲノム）の範囲内に含まれる濃度で、被殻当たり５０～１０００μＬ、好ましくは２００～７００μＬの範囲内に含まれる体積で、パーキンソン病または神経障害性ゴーシェ病などのシヌクレイノパチーの治療のためにヒト対象または患者に投与することができる。特定の実施形態では、前記ウイルス粒子は、０．５～５μＬ／分の範囲内に含まれる注入デビットで、好ましくは２～６時間投与される。
特定の実施形態では、本開示によるＡＡＶ－ＴＴは、尾状被殻核への実質内経路を介して、パーキンソン病または神経障害性ゴーシェ病などのシヌクレイノパチーの治療のためにヒト対象または患者に投与することができる。
本開示による前記ＡＡＶ－ＴＴ粒子は、尾状被殻核への実質内経路を介して、好ましくは１０１３～１０１４ｖｇ／ｍＬ（ｖｇ：ウイルスゲノム）の範囲内に含まれる濃度で、被殻当たり５０～１０００μＬ、好ましくは２００～７００μＬの範囲内に含まれる体積で、パーキンソン病または神経障害性ゴーシェ病などのシヌクレイノパチーの治療のためにヒト対象または患者に投与することができる。特定の実施形態では、前記ウイルス粒子は、０．５～５μＬ／分の範囲内に含まれる注入デビットで、好ましくは２～６時間投与される。
好ましい実施形態では、配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列または配列番号５、６、８、１７もしくは１８を含むヒトグルコセレブロシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む核酸構築物を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、前記核酸構築物が前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータをさらに含み、前記ｒＡＡＶ粒子が、配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有する配列を含むＡＡＶ－ＴＴキャプシドタンパク質を含み、シヌクレインパチーなどの神経変性疾患、好ましくはゴーシェ病（神経障害性ゴーシェ病など）またはＰＤ（孤発性ＰＤなど）の治療に使用するための、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子が提供され、前記ｒＡＡＶ粒子は、尾状被殻核への実質内経路を介して、好ましくは１０１３～１０１４ｖｇ／ｍＬ（ｖｇ：ウイルスゲノム）の範囲内に含まれる濃度で、被殻当たり５０～１０００μＬ、好ましくは２００～７００μＬの範囲内に含まれる体積で投与される。特定の実施形態では、前記ウイルス粒子は、０．５～５μＬ／分の範囲内に含まれる注入デビットで、好ましくは２～６時間投与される。
さらなる好ましい実施形態では、本開示は、
ａ）ヒトグルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子であって、配列番号１、７、１１、１２もしくは１９（好ましくは配列番号１９）またはヒトグルコセレブロシダーゼをコードする配列を含み、ヒトグルコセレブロシダーゼが配列番号５、６、８、１７または１８（好ましくは配列番号５または８）を含む、導入遺伝子；
ｂ）前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータであって、好ましくは、少なくとも黒質緻密部（ＳＮｃ）の神経細胞およびミクログリア細胞における前記導入遺伝子の発現を可能にし、好ましくは配列番号９もしくは２１を含むＣＡＧプロモータ、または配列番号２もしくは２０を含むＧｕｓＢプロモータ、または配列番号２７を含むかもしくはそれからなるＪｅＴプロモータ、または配列番号１３を含むｈＳｙｎプロモータである、プロモータ；
ｃ）ポリアデニル化シグナル配列、好ましくは配列番号２８または配列番号３、好ましくは配列番号２８を含むかまたはそれからなるポリアデニル化シグナル配列
を含む核酸構築物を含むウイルス粒子に関し、前記ウイルス粒子は、好ましくはＡＡＶ ＴＴのキャプシドタンパク質を含み、より好ましくは配列番号１４または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有する配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であり、前記核酸構築物は、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、より好ましくはＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含むウイルスベクターに含まれ、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列の各々は、独立して、配列番号１５もしくは１６の配列または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなり、好ましくは５’ＩＴＲは配列番号１５を含み、３’ＩＴＲは配列番号１６を含み、前記ウイルス粒子は、シヌクレイノパチー、好ましくはゴーシェ病（例えば神経障害性ゴーシェ病）またはＰＤ（例えば孤発性ＰＤ）などの神経変性疾患の治療に使用するためのものであり、前記ｒＡＡＶ粒子は、実質内経路を介して尾状被殻核に、好ましくは１０１３～１０１４ｖｇ／ｍＬ（ｖｇ：ウイルスゲノム）の範囲内に含まれる濃度で、被殻当たり５０～１０００μＬ、好ましくは２００～７００μＬの範囲内に含まれる体積で投与される。
特定の実施形態では、前記ウイルス粒子は、０．５～５μＬ／分の範囲内に含まれる注入デビットで、好ましくは２～６時間投与される。
さらに、さらなる好ましい実施形態では、シヌクレイノパチー、好ましくはゴーシェ病（神経障害性ゴーシェ病など）またはＰＤ（孤発性ＰＤなど）を、その治療を必要とする対象において治療する方法が提供され、前記方法は、
ａ）ヒトグルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子であって、配列番号１、７、１１、１２もしくは１９（好ましくは配列番号１９）またはヒトグルコセレブロシダーゼをコードする配列を含み、ヒトグルコセレブロシダーゼが配列番号５、６、８、１７または１８（好ましくは配列番号５または８）を含む、導入遺伝子；
ｂ）前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータであって、好ましくは、少なくとも黒質緻密部（ＳＮｃ）の神経細胞およびミクログリア細胞における前記導入遺伝子の発現を可能にし、好ましくは配列番号９もしくは２１を含むＣＡＧプロモータ、または配列番号２もしくは２０を含むＧｕｓＢプロモータ、または配列番号２７を含むもしくはそれからなるＪｅＴプロモータ、または配列番号１３を含むｈＳｙｎプロモータである、プロモータ；
ｃ）ポリアデニル化シグナル配列、好ましくは配列番号２８または配列番号３、好ましくは配列番号２８を含むかまたはそれからなるポリアデニル化シグナル配列
を含む核酸構築物を含む、治療有効量のウイルス粒子を前記対象に投与することを含み、前記ウイルス粒子は、好ましくはＡＡＶ ＴＴのキャプシドタンパク質を含み、より好ましくは配列番号１４または配列番号１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、より好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有する配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であり、前記核酸構築物は、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、より好ましくはＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含むウイルスベクターに含まれ、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列の各々は、独立して、配列番号１５もしくは１６の配列または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなり、好ましくは５’ＩＴＲは配列番号１５を含み、３’ＩＴＲは配列番号１６を含み、前記ｒＡＡＶ粒子は、実質内経路を介して尾状被殻核に、好ましくは１０１３～１０１４ｖｇ／ｍＬ（ｖｇ：ウイルスゲノム）の範囲内に含まれる濃度で、被殻当たり５０～１０００μＬ、好ましくは２００～７００μＬの範囲内に含まれる体積で投与される。
特定の実施形態では、前記ウイルス粒子は、０．５～５μＬ／分の範囲内に含まれる注入デビットで、好ましくは２～６時間投与される。別の実施形態では、本開示によるＡＡＶ－９は、尾状被殻核への実質内経路を介して、パーキンソン病または神経障害性ゴーシェ病などのシヌクレイノパチーの治療のためにヒト対象または患者に投与することができる。
本開示による前記ＡＡＶ－９粒子は、尾状被殻核への実質内経路を介して、好ましくは１０１３～１０１４ｖｇ／ｍＬ（ｖｇ：ウイルスゲノム）の範囲内に含まれる濃度で、被殻当たり５０～１０００μＬ、好ましくは２００～７００μＬの範囲内に含まれる体積で、パーキンソン病または神経障害性ゴーシェ病などのシヌクレイノパチーの治療のためにヒト対象または患者に投与することができる。特定の実施形態では、前記ウイルス粒子は、０．５～５μＬ／分の範囲内に含まれる注入デビットで、好ましくは２～６時間投与される。
本開示の生成物またはそれを含む医薬組成物の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する生成物または医薬組成物の能力などの因子に従って異なり得る。投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整され得る。
治療有効量はまた、典型的には、生成物または医薬組成物の治療上有益な効果が毒性または有害作用を上回る量である。
任意の特定の対象について、具体的な投与レジメンは、個々の必要性および組成物の投与を管理または監督する人の専門的判断に従って経時的に調整され得る。本明細書に記載の投与量範囲は単なる例示であり、医師によって選択され得る投与量範囲を限定するものではない。
一実施形態では、本開示によるＡＡＶウイルス粒子は、孤発性パーキンソン病または神経障害性ゴーシェ病などのシヌクレイノパチーの治療のために、１０８～１０１４ｖｇ／ｋｇ（ｖｇ：ウイルスゲノム；ｋｇ：対象または患者の体重）の範囲内に含まれる量または用量でヒト対象または患者に投与することができる。より特定の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、１０９～１０１３ｖｇ／ｋｇの範囲内に含まれる量で投与される。より特定の実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、ヒト対象において少なくとも１０１０～１０１２ｖｇ／ｋｇの投与量で投与される。
さらに、特に送達領域、例えば黒質緻密部および／または尾状被殻核にわたるベクターの均一な分布を確実にするために、そのようなウイルス粒子の複数回用量をヒト対象に同時にまたは連続的に投与し得る。典型的には、ある用量のウイルス粒子の３回、４回、５回またはそれ以上の注入を、例えば実質内経路を使用して、送達領域、例えばヒト対象の黒質緻密部および／または尾状被殻核に同じ時点で投与し得る。
キット
別の態様では、本開示はさらに、１つ以上の容器中に上記の核酸構築物、ウイルスベクター、宿主細胞、ウイルス粒子または医薬組成物を含むキットに関する。キットは、キット内に含まれる核酸構築物、ウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞または医薬組成物を患者に投与する方法を記載する説明書または包装材料を含み得る。キットの容器は、例えばガラス、プラスチック、金属などの任意の適切な材料のもの、および任意の適切なサイズ、形状、または構造のものであり得る。特定の実施形態では、キットは、適切な液体または溶液形態の本発明の生成物を含有する１つ以上のアンプルまたはシリンジを含み得る。
以下の例は例示として提供されるものであり、本開示を限定することを意図しない。
例
逆行性輸送を伴うＡＡＶを試験し、比較するためのインビボ播種アッセイ
ｒＡＡＶを生成するための標準的な方法を使用して、試験ｒＡＡＶ－ＧＦＰを調製した。試験ｒＡＡＶ－ＧＦＰは、ＣＡＧプロモータの制御下で、導入遺伝子としてＧＦＰコード配列、およびＡＡＶ２のＩＴＲを有する核酸構築物を使用し、前記核酸構築物は、その逆行性輸送特性について試験されるＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質と共にパッケージングされた。
インビボ播種アッセイは、非ヒト霊長動物の交連後被殻内への前記ｒＡＡＶ－ＧＦＰの実質内注入によって前記試験ｒＡＡＶ－ＧＦＰを注入する第１の工程を含んだ。
次に、このアッセイは、注入の１ヶ月後に大脳皮質、黒質、扁桃体および尾側髄板内核におけるＧＦＰ発現ニューロンの数を計測する工程を含んだ。細胞の計数は、脳組織標本における免疫ペルオキシダーゼ染色細胞の自動不偏計数のために設計された全スライドデジタルイメージングおよび深層畳み込みニューロンネットワーク（ＣＮＮ）アルゴリズムであるＡｉｆｏｒｉａ（商標）を利用することによって行った（Ｐｅｎｔｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０１８；４８：２３５４－２３６１）。
ＧＦＰを発現するニューロンを、抗ＧＦＰ抗体を使用して免疫ペルオキシダーゼ染色によって可視化した。ＧＦＰ発現ニューロンを、注入された非ヒト霊長動物の脳全体にわたって自動的に計数した。図２０および２３に示すように、ＧＦＰ陽性ニューロンの選択的な位置は、大脳皮質の深層（例えば第ＶおよびＶＩ層）に生じた。皮質領域に加えて、ＧＦＰ発現ニューロンを、注入された交連後被殻、特に黒質緻密部、扁桃体および尾側髄板内核を神経支配するすべての脳領域で定量化した（図２０および２３）。
１．マウスにおける試験：
野生型マウス（ｎ＝１１）に、シナプシンニューロン特異的プロモータ（ｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔ）の制御下で、ヒトα－シヌクレインの変異型をコードする組換えＡＡＶ血清型９を定位手術によってＳＮｃに両側注入した。各ＳＮｃに、１．０マイクロリットルの１．３６×１０Ｅ１３のウイルス懸濁液を注入した。神経変性過程が既に進行中であるが、非復帰点に達する前に（例えばｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔの送達の４週間後）、構成的プロモータＧｕｓＢの制御下でＧＢＡ１遺伝子をコードする組換えＡＡＶ９（例および図ではｒＡＡＶ９－ＧＢＡ１またはｒＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１と交換可能に呼ばれる）を右ＳＮｃに送達し（１．０マイクロリットルの１．２５×１０Ｅ１３のウイルス懸濁液）、これと共に導入遺伝子をコードしない空の対照ｒＡＡＶ９（例および図ではｒＡＡＶ９－ヌルまたはｒ－ＡＡＶ２／９－ヌルと交換可能に呼ばれる）を左ＳＮｃに注入した。４週間後（例えばｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔの最初の送達の８週間後）、動物を犠死させ、神経病理学的分析のために処理した。実施した実験計画を以下に要約する（図３）。
５匹のマウスのさらなるコホートで実施されたウェスタンブロット分析（図４を参照）は、（ｉ）右ＳＮｃにおけるＧＣａｓｅタンパク質発現レベルの増強（例えばｒＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１を注入したもの）および（ｉｉ）右ＳＮｃにおけるα－シヌクレインタンパク質レベルの明らかな低下を示した。
神経病理学的データ：
実施された詳細な神経病理学的分析は、以下のことを明らかにした：（１）ＧＣａｓｅのｒＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１媒介増強は、α－シヌクレインのほぼ完全なクリアランスをもたらした（データは示していない）。（２）α－シヌクレインクリアランスはまた、ＧＣａｓｅの発現レベル増加に合わせてドーパミン作動性ニューロンに及ぼされる明らかな神経保護効果と共に、リン酸化（例えば凝集）形態のα－シヌクレインも含む（データは示していない）。（３）ＳＮｃにおけるチロシン陽性ニューロンの密度の不偏立体推定は、左ＳＮｃと右ＳＮｃを比較した場合、統計学的に非常に有意な差を示した。左ＳＮｃへのｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔの送達後８週間のフォローアップで、およそ５５％のニューロン死が観察され、これとは対照的に、右ＳＮｃ、すなわちｒＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１で処置したものでは２４％のニューロン死が認められた（図５）。（４）ミクログリア駆動性炎症促進現象は、ｒＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１の送達時に右ＳＮｃで減弱した。ドーパミン作動性ニューロンがα－シヌクレインを発現し始めるとすぐに、ミクログリア細胞は表現型を変化させ、α－シヌクレインを発現するニューロンを、おそらくこれらのニューロンを周囲から単離するために、包み込んだ。ミクログリア細胞の形態学的表現型のこの転換は、ＡＡＶ媒介のＧＣａｓｅ増強時に正常な形態に戻る（データは示していない）。ＳＮｃの処置側と未処置側とを比較することによるミクログリア表現型の分析は、活性化ミクログリアにおける膜ラッフリングおよび食作用に関与するミクログリアおよびマクロファージ特異的カルシウム結合タンパク質であるイオン化カルシウム結合アダプタ分子１（Ｉｂａ１）に対する抗体を使用して実施された。
総合すると、得られたデータは、この治療ベクターが疾患モデリング目的に使用されるものと同じ血清型であることを考慮しても、ＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１のプラスの治療効果を示唆する。言い換えると、得られた治療効果は、同じ血清型を有するベクターウイルスの以前の注入によって影響されない。
２．ｒＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１を用いた非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）における試験：
野生型非ヒト霊長動物（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、ｎ＝４）に、シナプシンニューロン特異的プロモータ（ｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔ）の制御下でヒトα－シヌクレインの変異型をコードする組換えＡＡＶ血清型９を定位手術によってＳＮｃの尾側半分に両側注入した。各ＳＮｃに、尾側ＳＮｃの全体をカバーするために吻側尾側方向に２ｍｍ間隔で配置した、それぞれ１．３６×１０Ｅ１３のウイルス懸濁液５．０マイクロリットルの２つの沈着物を投与した。神経変性過程が既に進行中であるが、非復帰点に達する前に（例えばｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔの送達の４週間後）、構成的プロモータＧｕｓＢの制御下でＧＢＡ１遺伝子をコードする組換えＡＡＶ９（ｒＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１）を左ＳＮｃに送達し（１．０マイクロリットルの１．２５×１０Ｅ１３のウイルス懸濁液）、これと共に導入遺伝子をコードしない空の対照ｒＡＡＶ９（ｒＡＡＶ２／９－ヌル）を右ＳＮｃに注入した。８週間後（例えばｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔの最初の送達の１２週間後）、動物を犠死させ、神経病理学的分析のために処理した。実施した実験計画を以下に要約する（図６）。
神経画像マイクロＰＥＴ試験：
ベースラインでの１回のスキャン、続いてｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３ＴのＳＮｃへの両側送達の１、２および３ヶ月後（例えばｒＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１およびｒＡＡＡＶ２／９－ヌルウイルスベクターの注入の１ヶ月後および２ヶ月後）に実施された連続スキャンを含む、マイクロＰＥＴ試験を、一定の間隔ですべての動物において実施した。これらの実験のために選択された放射性トレーサは、高い再現性で鮮明な画像の取得を可能にする選択的ＶＭＡＴ２リガンドである１１ｃ－ジヒドロテトラベナジンであった。得られた結果は、左交連後被殻内で測定された放射性トレーサ結合電位が、右交連後被殻内で観察されたものよりも高いことを示した（図７に示す）。
神経病理学的データ：
実施された神経病理学的分析は、以下のことを明らかにした：（１）チロシンヒドロキシラーゼの免疫組織化学染色を用いて、交連後被殻核および尾状核ならびに中脳のレベルで採取したＮＨＰ脳の冠状切片から示されるように、ＧＣａｓｅのｒＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１媒介増強は、α－シヌクレイン負荷量を減少させ、ｒＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１を注入した左ＳＮｃと同側に位置する尾側交連後被殻の保存された神経支配と共に、ＳＮｃ中のドーパミン作動性（ＴＨ＋）ニューロンの有意な神経保護を及ぼす（データは示していない）。（２）ＳＮｃにおけるチロシン陽性ニューロンの密度の不偏立体推定は、左ＳＮｃと右ＳＮｃを比較した場合、統計学的に非常に有意な差を示した。右ＳＮｃへのｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔの送達後１２週間のフォローアップで、およそ３９％のニューロン死が観察され、これとは対照的に、左ＳＮｃ、すなわちｒＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１で処置したものでは１５％のニューロン死が認められた（図８）。（３）変異α－シヌクレインのプリオン様経ニューロン拡散が右前頭皮質のいくつかの脳領域で観察され、そこでは、ｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔの送達の３ヶ月後に、α－シヌクレインを発現する中程度の量の錐体ニューロンが認められた。最も重要なことには、左ＳＮｃへのＧＣａｓｅ活性のＡＡＶ媒介増強は、α－シヌクレイン負荷量を減少させ、したがってα－シヌクレインの経ニューロン拡散を妨げた。特に、α－シヌクレインの免疫組織化学的検出は、変異α－シヌクレインの３ヶ月のＡＡＶ媒介過剰発現が、α－シヌクレイン凝集体の経ニューロン拡散をもたらしたことを示す。ｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔの右ＳＮｃへの送達時に、内側前脳束を通って進む高密度のシヌクレイン陽性線維が観察され、前頭皮質のいくつかの脳領域全体にわたってα－シヌクレイン免疫反応性を示す中程度の数の錐体ニューロンの出現をもたらした。対照的に、左ＳＮｃへのＧＣａｓｅ活性のＡＡＶ媒介増強の２ヶ月後、内側前脳束を通って移動する観察されたシヌクレイン陽性線維の密度は明らかに減少し、実際に前頭皮質の二次標識ニューロンは全く認められなかった（データは示していない）。（４）ミクログリア駆動性炎症促進現象は、左ＳＮｃ、すなわちｒＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１で処置したものでは減弱した（データは示していない）。ＳＮｃの処置側と未処置側を比較することによるミクログリア表現型の分析は、活性化ミクログリア表現型の特異的マーカである主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）に対する抗体を使用して実施された（例えば静止ミクログリア細胞はＭＨＣ－ＩＩの発現を欠く）。
マウス試験について述べたように、非ヒト霊長動物データは、この治療ベクターが疾患モデリング目的に使用されるものと同じ血清型であることを考慮しても、ＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１のプラスの治療効果を示唆する。言い換えると、得られた治療効果は、同じ血清型を有するベクターウイルスの以前の注入によって影響されない。
３．ＧＣａｓｅの逆行性播種は、マウスの大脳皮質全体にわたってリン酸化α－シヌクレインのクリアランスをもたらした
α－シヌクレインは、プリオン様様式で脳回路を介して進行し得ると仮定されている。この現象は、最初はＳＮｃ内に位置するα－シヌクレイン凝集体の結果としての運動症状を特徴とし、その後、ＳＮｃ以外の脳領域、特に大脳皮質に関与する進行性シヌクレインオパチーの存在の結果としての非運動症状（認知症および神経精神症状）へと進行する疾患の臨床経過を説明する。これに関して、この進行性シヌクレイノパチーは、大脳皮質に影響を及ぼす場合、ＰＤの進行期における認知症および神経精神症状の出現を持続させる主な推進力であることに注目すべきであり、したがって、疾患修飾治療代替物を設計することになった場合、そのような広範なシヌクレイノパチーを正確に標的とする方法を見出すことが重要である。言い換えると、進行した疾患段階のＰＤ患者は多数の脳領域、なかでも特に大脳皮質全体にわたる広汎性シヌクレイノパチーを示すことに留意すると、治療される脳領域全体に広範に播種する生成物のための新しい治療手段が依然として必要である。
主な神経病理学的特徴が大脳皮質にわたるレビー小体およびレビー神経突起の存在によって代表されるＤＬＢなどのＰＤ以外のシヌクレイノパチーを考慮する場合にも、全く同じことが当てはまる。
全体として、現時点で主な満たされていない医学的必要性は、これらの破壊的な脳障害の弱まることのない進行過程を減速させること、またはさらに理想的には停止させることを意図した、ＰＤおよび関連するシヌクレイノパチーのための疾患修飾戦略を開発することである。したがって、成功する治療アプローチは、好ましくは、特に進行した疾患段階のＰＤ患者に直面した場合、脳全体にわたってα－シヌクレインクリアランスを実施するのに効率的であるべきであり、これらの患者は、疾患進行速度を最小限に抑えることを意図した治療から利益を得る可能性が最も高い。
したがって、本発明者らは、逆行性輸送を伴うＡＡＶバリアント粒子を注入領域から特に皮質領域を含む遠位領域に効率的に播種することができるかどうかを最初に試験した。
野生型マウスに、シナプシン神経特異的プロモータ（ｒＡＡＶ２ｒｅｔｒｏ－ＳｙｎＡ５３Ｔ）の制御下でヒトα－シヌクレインの変異型をコードする組換えＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏを定位手術によって線条体に両側注入した。各線条体に２．０マイクロリットルの３．７１×１０Ｅ１２ｖｐ／ｍｌのウイルス懸濁液を注入して、注入された線条体を神経支配する大脳皮質領域全体に広範なシヌクレイノパチーをさらに生じさせた。４週間後、構成的プロモータＧｕｓＢ（ｒＡＡＶ２ｒｅｔｒｏ－ＧＢＡ１）の制御下でＧＢＡ１遺伝子をコードする組換えＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏを左線条体に送達し（２．０マイクロリットル；３．７１×１０Ｅ１２ｖｐ／ｍｌのウイルス懸濁液）、これと共に、導入遺伝子をコードしない空の対照ｒＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ（ｒＡＡＶ２ｒｅｔｒｏ－ヌル）を右線条体に注入した。４週間後（例えばｒＡＡＶ２ｒｅｔｒｏ－ＳｙｎＡ５３Ｔの最初の送達の８週間後）、動物を犠死させ、神経病理学的分析のために処理した。実施した実験計画を以下に要約する（図９）。
神経病理学的データ：
実施された分析は、ＧＣａｓｅのＡＡＶ２ｒｅｔｒｏ－ＧＢＡ１媒介増強が、左脳半球のレベル（例えば最初にｒＡＡＶ２ｒｅｔｒｏ－ＳｙｎＡ５３Ｔを注入し、その後ｒＡＡＶ２ｒｅｔｒｏ－ＧＢＡ１を注入した線条体と同側に位置するもの）で大脳皮質全体にわたってリン酸化α－シヌクレインのほぼ完全なクリアランスをもたらしたことを明らかにした。対照的に、右半球のいくつかの皮質領域（例えば最初にｒＡＡＶ２ｒｅｔｒｏ－ＳｙｎＡ５３Ｔを注入し、その後対照ベクターｒＡＡＶ２ｒｅｔｒｏ－ヌルを注入した線条体と同側に位置するもの）内には明らかなシヌクレイノパチーが依然として存続する（図１０）。
４．ｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１を用いた非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）における試験：
野生型非ヒト霊長動物（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、ｎ＝４）に、シナプシンニューロン特異的プロモータ（ｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔ）の制御下でヒトα－シヌクレインの変異型をコードする組換えＡＡＶ血清型９を定位手術によってＳＮｃの尾側半分に両側注入した。各ＳＮｃに、尾側ＳＮｃの全体をカバーするために吻側尾側方向に２ｍｍ間隔で配置した、それぞれ１．３６×１０Ｅ１３のウイルス懸濁液５．０マイクロリットルの２つの沈着物を投与した。神経変性過程が既に進行中であるが、非復帰点に達する前に（例えばｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔの送達の４週間後）、構成的プロモータＣＡＧの制御下でＧＢＡ１遺伝子をコードする組換えＡＡＶ－ＴＴ（ｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１）を左交連後被殻に送達した（２×１０マイクロリットルの１×１０Ｅ１３のウイルス懸濁液）。圧力注入は０．５μＬ／分のパルスで達成した。非ヒト霊長動物では、デビットはより低い範囲に調整される。しかしながら、ヒト試験では、高い注入速度はウイルスの安定性およびより良好な患者管理を可能にし、デビットは０．５μＬ～５μＬ／分の範囲であり得る。８週間後（例えばｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔの最初の送達の１２週間後）、動物を犠死させ、神経病理学的分析のために処理した。実施した実験計画を以下に要約する（図１１）。
神経画像マイクロＰＥＴ試験：
ベースラインでの１回のスキャン、続いてｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔの送達の１、２および３ヶ月後（例えばｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１ウイルスベクターの注入の１ヶ月後および２ヶ月後）に実施された連続スキャンを含む、マイクロＰＥＴ試験を、一定の間隔ですべての動物において実施した。これらの実験のために選択された放射性トレーサは、高い再現性で鮮明な画像の取得を可能にする選択的ＶＭＡＴ２リガンドである１１ｃ－ジヒドロテトラベナジン（１１Ｃ－ＤＴＢＺ）であった。得られた結果は、左交連後被殻内で測定された放射性トレーサ結合電位が、ｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１の送達の１．５ヶ月前に観察されたものよりも２４．４４％高いことを示した。得られた結果を以下の図１２に示す。
神経病理学的データ：
実施された神経病理学的分析は、以下のことを明らかにした：（１）チロシンヒドロキシラーゼの免疫組織化学染色を用いて、交連後被殻核および尾状核ならびに中脳のレベルで採取したＮＨＰ脳の冠状切片から示されるように、ＧＣａｓｅのｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１媒介増強は、α－シヌクレイン負荷量を減少させ、ｒＡＡＶ２／９－ＧＢＡ１を注入した左ＳＮｃと同側に位置する尾側交連後被殻の保存された神経支配と共に、ＳＮｃ中のドーパミン作動性（ＴＨ＋）ニューロンの有意な神経保護を及ぼす（データは示していない）。（２）ＳＮｃにおけるチロシン陽性ニューロンの数の自動計数は、左ＳＮｃと右ＳＮｃを比較した場合、統計学的に非常に有意な差を示した。ｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔの左右のＳＮｃへの送達後１２週間のフォローアップで（例えば左交連後被殻内へのｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１の送達の２ヶ月後）、左ＳＮｃのチロシン陽性ニューロンの総数は、右ＳＮｃ（例えばｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１の被殻内送達で処置されなかったもの）のチロシン陽性ニューロンの数よりも２２．３％多いことが認められた（図１３）。左交連後被殻にｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１を注入した４例のＮＨＰの左右交連後被殻のＴＨ染色の光学密度（ＯＤ）の自動測定は、平均ＯＤが右交連後被殻対左交連後被殻（後者はｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１の被殻内送達で処置されたものである）で２７．４２％低いことを示した（図１４）。（３）さらに、ＳＮｃにおけるα－シヌクレイン陽性ニューロンの数の自動計数は、左ＳＮｃと右ＳＮｃを比較した場合、統計学的に有意な差を示した。ｒＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔの左右のＳＮｃへの送達後９週間のフォローアップで（例えば左交連後被殻へのｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１の送達の１．５ヶ月後）、左ＳＮｃのαシヌクレイン発現ニューロンの総数は、右ＳＮｃ（例えばｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１の被殻内送達で処置されなかったもの）のαシヌクレイン陽性ニューロンの数よりも４８．３３％少ないことが認められた（図１５）。
α－シヌクレイン発現ニューロンの割合は、右ＳＮｃ（未処置側）よりも左ＳＮｃ（例えばＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１を注入された交連後被殻と同側に位置するもの）において一貫して低い（図１６）。
マウス試験について述べたように、非ヒト霊長動物データは、ｒＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１のプラスの治療効果を示唆する。
５．非ヒト霊長動物の脳におけるＡＡＶ－ＴＴ－ＧＦＰおよびＡＡＶ９－ＧＦＰの生体内分布および性能比較
５．１ 実施した実験
最大４匹の成体若齢雄性カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（体重３．０～３．４Ｋｇ）に、５μＬのＡＡＶ－ＴＴ－ＧＦＰ（１×１０１３ｖｇ／ｍＬ；２匹の動物）または５μＬのＡＡＶ９－ＧＦＰ（１×１０１３ｖｇ／ｍＬ；２匹の動物）のいずれかを注入した。両方のＡＡＶは、ＣＡＧプロモータの制御下でＧＦＰをコードしていた。
ハミルトンシリンジを利用することによって、脳室造影支援定位手術を介してＡＡＶを投与した。圧力注入は０．５μＬ／分のパルスで達成した。非ヒト霊長動物では、デビットはより低い範囲に調整される。しかしながら、ヒト試験では、高い注入速度はウイルスの安定性およびより良好な患者管理を可能にし、デビットは０．５μＬ～５μＬ／分の範囲であり得る。ＡＡＶ送達が完了したら、注入路を通るＡＡＶ逆流を最小限に抑えるために、注入針をさらに１０分間留置した（図１７）。手術の直前に、体液試料（血液およびＣＳＦ）を採取し、－８０℃で保存した。
心臓内灌流によるＡＡＶ送達の１ヶ月後に動物を犠死させた。犠死の前に、体液試料（血液およびＣＳＦ）を採取し、－８０℃で保存した。灌流液は、生理食塩水リンゲル液（ｓａｌｉｎｅ Ｒｉｎｇｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、続いてパラホルムアルデヒドの緩衝液（３，０００ｍｌ／動物）、およびリン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ７．３中１０％グリセリンおよび１％ＤＭＳＯからなる１，０００ｍｌの凍結保護液からなった。
リンゲル液による灌流中、新鮮な組織試料（例えば未固定）を、心臓、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、精巣および線条体筋を含むいくつかの末梢器官から採取した。試料をドライアイス上で凍結し、－８０℃で保存した。
灌流が完了したら、脳を頭蓋から取り出し、幅約１ｃｍの脳ブロックを作製し、リン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ７．３中２０％グリセリンおよび２％ＤＭＳＯからなる凍結保護液中に保存した（すべての脳ブロックから軟膜を除去した）。固定された末梢器官からの試料を得て（心臓、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、精巣、後腹膜神経節、松果体および線条体筋）、さらにパラフィンに包埋した。
凍結保護液中で最低４８時間後に、１０シリーズの凍結冠状脳切片（４０μｍ厚）をスライド式ミクロトームで作製し、凍結保護液中に回収した。一連の切片全体（例えばサルの脳の１０番目ごとの切片を含む）を、ウサギで惹起された一次ポリクローナル抗体を利用することによってＧＦＰの免疫ペルオキシダーゼ検出のために処理した。ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧとのインキュベーション後、切片をＡＢＣキットと共にインキュベートし、最後にＨ２Ｏ２－ＤＡＢ溶液を用いて染色した。染色が完了したら、浮遊切片を顕微鏡用スライドに載せ、一晩風乾し、エンテランを用いてカバースリップした。染色された切片を、Ａｐｅｒｉｏ ＣＳ２スライドスキャナ（Ｌｅｉｃａ）を使用してスキャンし、専用のソフトウェアを用いて処理した。
５．２ 結果
ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＦＰまたはＡＡＶ９－ＧＦＰのいずれかによる標識は、交連後被殻を神経支配することが公知の脳領域全体でのみ見出されたが、注入部位を神経支配していない脳領域（例えば海馬、小脳など）では、単一の標識ニューロンさえも観察されなかった。さらに、得られた逆行性標識は「ゴルジ様」形態であった、すなわちニューロン標識は細胞体に限定されず、実際に遠位樹状突起、特に大脳皮質全体の位置に及ぶ。樹状突起棘などの小さな樹状突起が時には可視でさえあることにも注目すべきである。
注入部位での事象
ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＦＰの両方の注入は正確であり、交連後被殻の境界内に適切に配置された。注入部位について得られたサイズは、ＡＡＶ９－ＧＦＰよりもＡＡＶ－ＴＴ－ＧＦＰの方が一貫して小さく、動物Ｍ２９５およびＭ２９６（ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＦＰを注入）では２８．０１％および２１．８３％をカバーしたが、ＡＡＶ９－ＧＦＰを注入した動物（Ｍ２９７およびＭ２９８）では、交連後被殻の３２．４６％および５５．８６％がそれぞれ注入部位内に含まれた（図１８）。ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＦＰを用いた両方の注入は、注入路を介したＡＡＶ取り込みの完全な欠如を示した（例えばこれらは両方とも非常にクリーンな注入（ｃｌｅａｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）である）。対照的に、ＡＡＶ９－ＧＦＰを用いて行われた注入は、注入路を介した中程度から高い取り込みを示し、交連後被殻の上に位置する白質路によるＡＡＶ９－ＧＦＰ取り込みに起因して、得られた結果に偽陽性標識（おそらく皮質領域内で特に顕著）が混入する可能性が非常に高いことを意味する。偽陽性結果に関連する問題を図１９に示す。さらに、動物Ｍ２９７におけるＡＡＶ９－ＧＦＰの送達は、交連後被殻の境界を越えて広がっており、外淡蒼球（ＧＰｅ）のかなりの部分も含まれる。
逆行性伝播の効力
逆行性標識されたニューロンの総数および観察された強度の両方が、注入部位の範囲に直接関係している。言い換えると、交連後被殻のより大きな領域をカバーする注入部位から、より多数のＧＦＰ＋ニューロンが予想される。これに関して、および各関心対象の領域において観察されるニューロンの数の正確な定量化を提供することに加えて、この最終的な数は、注入部位によってカバーされている交連後被殻領域の範囲によって補正される必要がある。ニューロンの数は、Ａｉｆｏｒｉａ（登録商標）（「生」および「補正」データとラベル付けされている）で行われた定量化に基づいて提供される。ＡＡＶ－ＴＴ対ＡＡＶ９の性能を適切に比較するために、得られた生データを、注入部位の範囲を考慮して標準化する必要がある。したがって、各ＡＡＶの予想される逆行性拡散を適切に推定するために、注入部位のサイズに基づく補正係数を計算した。補正係数は、Ｍ２９５についてはｘ３．５７、Ｍ２９６についてはｘ４．５８、Ｍ２９７についてはｘ３．０８、Ｍ２９８についてはｘ１．７９であった。図２０～２５に示すデータを生成するために補正係数を使用した。
最も強い標識を示す脳領域
すべての動物（ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＦＰおよびＡＡＶ９－ＧＦＰ）において、上前頭回および中心前回で最も強い標識が観察された（図２０～２１）。（より低い程度ではあるが）ＧＦＰ＋ニューロンを一貫して示す他の皮質領域は、前帯状皮質、中心後回および島回である。まばらなニューロン標識が、中前頭回、下前頭回、眼窩前頭皮質（前頭眼窩野、外側眼窩野および内側眼窩野）、上、中および下側頭回、ならびに上頭頂小葉および上縁回において観察された。さらに、ＧＦＰ＋ニューロンは、同側皮質のミラー様表現として対側皮質において一貫して認められた（明らかにはるかに少ない数のＧＦＰ＋ニューロンを含んだ）。交連後被殻（運動関連被殻領域）におけるＡＡＶ送達時に、最も強い標識が前脳回および上前頭回（それぞれ一次運動皮質および補足運動野を含む皮質脳回）の両方で観察されたことを念頭に置くと、結果は予想されたものと完全に一致し、実際に非常に関連している。皮質下標識に関しては、２つの構造、すなわち黒質緻密部（ＳＮｃ）および正中中心核－束傍核複合体（ＣＭ－Ｐｆ）が特に関連する。さらに、ＣＭ－Ｐｆ視床複合体が視床線条体投射の主な供給源であることを念頭に置くと、ＣＭ－Ｐｆで観察されるＧＦＰ＋ニューロンの量は、予想されるが、非常に印象的である。ＣＭ－Ｐｆの他に、腹側前部、腹側外側および腹側後内側視床核、中心外側および傍中心髄板内核ならびに背側縫線核（被殻へのセロトニン作動性投射の主な供給源であることが公知の小さな脳幹核）においてもまばらな標識が認められた。さらに、扁桃体複合体のレベルで観察された標識は、両方のＡＡＶタ型について最初に予想されたよりも少ない。扁桃体複合体は被殻に対する別の求心性神経源と見なされることが多いが（皮質、視床および黒質と共に）、ＡＡＶ－ＴＴおよびＡＡＶ９で得られたデータは、この解剖学的経路の重要性が以前の解剖学的試験では過大評価されている可能性が高いことを明らかに示唆した。
線条体求心系
本試験はこの目的のために設計されたわけではなかったが、実施された定量化は、それぞれ異なる線条体求心系、すなわち皮質線条体経路（同側および対側）、視床線条体および黒質線条体の投射の「重量」を数値的に推定することを可能にする。得られたデータは、同側の皮質線条体投射が圧倒的に最も豊富な投射であり（平均で全線条体求心性神経の６９．３７％）、次いで対側の皮質線条体投射ニューロン（全線条体求心性神経の１５．９９％）、次いで黒質線条体投射（平均で７．９９％）、最後に視床正中中心核－束傍核複合体から生じる視床線条体投射（６．６７％）が続くことを示した。この点に関して、対側皮質線条体経路は、基底核の機能および機能不全を扱うほとんどの試験で無視されていることが多いが、この投射は、おおよそ全線条体求心性神経の最大１６％に相当し、視床線条体および黒質線条体の投射に関連するものを明らかに上回る割合であることにも注目すべきである。
得られた結果は、ＡＡＶ９－ＧＦＰと比較した場合、ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＦＰの優れた性能を支持した。結果の詳細な比較は、ＡＡＶ－ＴＴがＡＡＶ９よりも良好な候補であることを示した。ＡＡＶ－ＴＴは、特に、注入路を介した取り込みの欠如と共に、逆行性拡散に関するより高い「効力」を扱う場合に、いくつかの重要な利点を有する。ＡＡＶ－ＴＴの使用は偽陽性の完全な欠如を示す。
６．ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１対ＡＡＶ９－ＧＢＡ１の性能の比較
６．１ 実施した実験
野生型非ヒト霊長動物（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、ｎ＝８）（体重４．３～１０．４ｋｇ）を、ＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔによる定位手術を介して左右の黒質緻密部に注入した。各ＳＮｃに、尾側ＳＮｃの全体をカバーするために吻側尾側方向に１ｍｍ間隔で配置した、それぞれ１．２６×１０Ｅ１２ｖｇ／ｍＬのウイルス懸濁液５．０マイクロリットルの２つの沈着物を投与した（例えば合計４回の注入／動物）。
ＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔの送達の６週間後に、構成的プロモータＣＡＧの制御下でＧＢＡ１遺伝子をコードする組換えＡＡＶ－ＴＴ（ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１）を左交連後被殻に送達した（（２×１０マイクロリットルの１×１０Ｅ１３ｖｇ／ｍＬのウイルス懸濁液；４匹の動物、吻側尾側方向に相互に１ｍｍ間隔で注入）。８週間後（例えばＡＡＶ２／９－ＳｙｎＡ５３Ｔの最初の送達の１２週間後）、動物を犠死させ、神経病理学的分析のために処理した。実施した実験計画を図２６に要約する。ハミルトンシリンジを利用することによって、脳室造影支援定位手術を介してＡＡＶを投与した。圧力注入は０．５μＬ／分のパルスで達成した。非ヒト霊長動物では、デビットはより低い範囲に調整される。しかしながら、ヒト試験では、高い注入速度はウイルスの安定性およびより良好な患者管理を可能にし、デビットは０．５μＬ～５μＬ／分の範囲であり得る。ＡＡＶ送達が完了したら、注入路を通るＡＡＶ逆流を最小限に抑えるために、注入針をさらに１０分間留置した。
体液試料（血液およびＣＳＦ）を、ベースライン（例えばＡＡＶ９－ＳｙｎＡ５３Ｔを用いた手術の前）、ＧＢＡ１をコードするベクターの送達前および犠死時に採取した。
放射性トレーサ１１Ｃ－ジヒドロテトラベナジン（１１Ｃ－ＤＴＢＺ）を用いたマイクロＰＥＴスキャンを、ベースラインならびにＡＡＶ９－ＳｙｎＡ５３Ｔの注入の４、８および１２週間後に実施した。
心臓内灌流によるＡＡＶ９－ＳｙｎＡ５３Ｔの送達の１２週間後（例えばＡＡＶ－ｔｔ－ＧＢＡ１またはＡＡＶ９－ＧＢＡ１のいずれかの注入の６週間後）に動物を犠死させた。犠死の前に、体液試料（血液およびＣＳＦ）を採取し、－８０℃で保存した。灌流液は、生理食塩水リンゲル液、続いてパラホルムアルデヒドの緩衝液（３，０００ｍｌ／動物）、およびリン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ７．３中１０％グリセリンおよび１％ＤＭＳＯからなる１，０００ｍｌの凍結保護液からなった。
リンゲル液による灌流中、新鮮な組織試料（例えば未固定）を、心臓、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、精巣および線条体筋を含むいくつかの末梢器官から採取した。試料をドライアイス上で凍結し、－８０℃で保存した。
灌流が完了したら、脳を頭蓋から取り出し、幅約１ｃｍの脳ブロックを作製し、リン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ７．３中２０％グリセリンおよび２％ＤＭＳＯからなる凍結保護液中に保存した（すべての脳ブロックから軟膜を除去した）。固定された末梢器官からの試料を得て（心臓、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、精巣、後腹膜神経節、松果体および線条体筋）、さらにパラフィンに包埋した（ＭＯＴＡＣに送付した）。
凍結保護液中で最低４８時間後に、１０シリーズの凍結冠状脳切片（４０ｍ厚）をスライド式ミクロトームで作製し、凍結保護液中に回収した。一連の切片全体（例えばサルの脳の１０番目ごとの切片を含む）を、ヤギで惹起された一次ポリクローナル抗体を利用することによってチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の免疫ペルオキシダーゼ検出のために処理した。ビオチン化ロバ抗ヤギＩｇＧとのインキュベーション後、切片をＡＢＣキットと共にインキュベートし、最後にＨ２Ｏ２－ＤＡＢ溶液を用いて染色した。さらに、別の一連の切片全体を、マウスで惹起された一次モノクローナル抗体を利用することによってα－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）の免疫ペルオキシダーゼ検出のために処理した。ビオチン化ロバ抗マウスＩｇＧとのインキュベーション後、切片をＡＢＣキットと共にインキュベートし、最後にＨ２Ｏ２－ＤＡＢ溶液を用いて染色した。染色が完了したら、浮遊切片を顕微鏡用スライドに載せ、一晩風乾し、エンテランを用いてカバースリップした。染色された切片を、Ａｐｅｒｉｏ ＣＳ２スライドスキャナ（Ｌｅｉｃａ）を使用してスキャンし、専用のソフトウェアを用いて処理した。
６．２ 結果
α－シヌクレインクリアランスについてのＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１対ＡＡＶ９－ＧＢＡ１の性能、ならびに黒質線条体投射ドーパミン作動性ニューロンにおけるＧＣａｓｅ増強およびα－シヌクレイン除去の潜在的な神経保護効果を比較した。
神経画像マイクロＰＥＴ試験
１１Ｃ－ＤＴＢＺを用いたマイクロＰＥＴスキャンを、ベースライン、ならびにＡＡＶ９－ＳｙｎＡ５３Ｔの注入の４、８および１２週間後に実施した。交連後被殻の吻側尾側範囲全体を含む関心対象の領域（典型的には５～９の異なる部分に関わる）にわたって、放射性トレーサ結合能の値を計算した（図２７）。
ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１を注入した動物では、ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１の２週間目（例えばＡＡＶ９－ＳｙｎＡ５３Ｔの注入のちょうど６週間後）での結合値と比較して、ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１の送達の６週間後（例えばＡＡＶ９－ＳｙｎＡ５３Ｔの注入の１２週間後）に放射性トレーサ結合の軽度の改善が存在する。観察された増加は、１％（Ｍ２８２）、１５％（Ｍ２８０）、２２％（Ｍ２８７）および５３％（Ｍ２８３）である。ベースライン（例えばシヌクレイノパチーの誘発の前）での結合値と比較した場合、すべての動物について得られた値は、ベースラインレベル未満のままであった（Ｍ２８０では－２２％、Ｍ２８７では－２４％、Ｍ２８２では－２５％およびＭ２８３では－３２％）。右交連後被殻（非注入側）について得られた値は、動物Ｍ２８０およびＭ２８２ではベースラインとほぼ同様のままであったが、動物Ｍ２８３およびＭ２８７では中程度の低下が観察された。
ＡＡＶ９－ＧＢＡ１を注入した動物に関して、動物Ｍ２８６には明らかな効果がなく、動物Ｍ２８１、Ｍ２８４およびＭ２８５では最も高いレベルの放射性トレーサ取り込みが認められた。この動物にはＡＡＶ９－ＳｙｎＡ５３Ｔが適切に注入されなかった（誤って左右の黒質を標的化した）ことを考慮すると、Ｍ２８１の値は驚くにはあたらない。Ｍ２８１、Ｍ２８４およびＭ２８５は、最終的に、ベースラインと比較してフォローアップ期間の終わりにほぼ同様のレベルに達したが、同じ動物の右被殻でも同様の増加が観察されたことも注目に値する。
黒質線条体神経支配（光学密度）
黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンがパーキンソン病の状況で非常に死滅しやすい理由を説明する場合、黒質線条体投射の大きく複雑な軸索分枝の独特の構造（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００９ Ｊａｎ １４；２９（２）：４４４－４５３）が、ドーパミン作動性ニューロンを細胞死に寄与する因子に対して特に感受性にするような高いエネルギー収支の下に置くと仮定されている（Ｂｏｌａｍ ａｎｄ Ｐｉｓｓａｄａｋｉ，Ｍｏｖ Ｄｉｓｏｒｄ．２０１２ Ｏｃｔ；２７（１２）：１４７８－８３）。実際に、線条体の体積はラット（１９．９ｍｍ３）からヒト（６，２８０ｍｍ３）まで約３００倍増加したが、ドーパミン作動性ニューロンの数は３２倍しか増加していないことは注目に値する。要約すると、神経保護試験を扱う場合、黒質線条体経路がどの程度まで保存されたかに強い注意を払う必要がある。
これらの目的のために、交連後被殻の全範囲をカバーする１０～１２の等間隔の吻側尾側冠状切片をＴＨについて染色し、光学密度（ＯＤ）についてさらに分析した。左右の交連後被殻レベルのＯＤ値を比較する得られたデータを図２８および２９に示す。
治療上の利益を反映する左対右のＯＤの差は、ＡＡＶ９－ＧＢＡ１を注入した動物よりもＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１を注入した動物において交連後被殻の吻側尾側範囲全体にわたってより高いことが一貫して認められた。
ＧＢＡ１をコードするＡＡＶのドーパミン作動性ニューロンに対する神経保護効果
実施した試験の主な目的の１つは、ＡＡＶによって駆動されるＧＣａｓｅ増強が、黒質線条体投射ドーパミン作動性ニューロンの神経保護効果をどの程度まで発揮し得るかを評価することであった。この目的のために、ＴＨについて染色し、黒質の吻側尾側範囲全体をカバーする最大１４の冠状切片を、ドーパミン作動性細胞数について分析した。深層学習アルゴリズムＡｉｆｏｒｉａ（登録商標）を使用して分析を行った。得られたデータを図３０および３１に示す。
治療上の利益を反映する左対右の差は、ＡＡＶ９－ＧＢＡ１を注入した動物よりもＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１を注入した動物においてより高いことが一貫して認められた。実際に、ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１の治療上の利益は、黒質の吻側尾側範囲の大部分にわたって維持される。
ＧＢＡ１をコードするＡＡＶのα－シヌクレインクリアランスに対する効果
ＧＣａｓｅ活性のＡＡＶ媒介増強がα－シヌクレインの顕著なクリアランスを行うのにどの程度まで有効であるかを評価するために、α－ｓｙｎについて染色し、左右の黒質の吻側尾側範囲全体を含む１４の冠状切片を使用した。Ａｉｆｏｒｉａ（登録商標）を使用して分析を行った。得られたデータを図３２および３３に示す。
治療上の利益を反映する左対右の差は、ＡＡＶ９－ＧＢＡ１を注入した動物よりもＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１を注入した動物においてはるかに高いことが一貫して認められた。実際に、ＡＡＶ－ＴＴ－ＧＢＡ１の治療上の利益は、黒質の吻側尾側範囲の大部分にわたって維持される。実際に、α－シヌクレインクリアランスにおけるＡＡＶ９－ＧＢＡ１の効果が、すべての動物（動物Ｍ２８１はＡＡＶ９－ＳｙｎＡ５３Ｔに関する外科的な誤標的化のために分析には考慮されていない）について、あるとしても最小限であることが見出されたことにも注目すべきである。
ＴＨ＋／α－ｓｙｎ＋比
ＡＡＶ９－ＳｙｎＡ５３Ｔで誘発されたシヌクレイノパチーの全体的な程度を評価する試みとして、図３４は、ＴＨ＋細胞と－ｓｙｎ＋細胞との観察された比率を示す。得られたデータから、誘発されたシヌクレイノパチーの程度は中程度であったと結論付けることができる。
これらのデータは、（１）黒質線条体神経支配のより良好な保存、（２）ドーパミン作動性ニューロンに対するより良好な神経保護効果、および（３）α－シヌクレインクリアランスに対するより良好な有効性に関して、ＡＡＶ－ＧＢＡ１に比べてＡＡＶ９－ＴＴ－ＧＢＡ１の優れた性能を明確に支持する。
７．本発明の実施に使用するための配列
本発明を実施する際に使用するための配列を以下に記載する（非限定的なリスト）：
配列番号１：ヒトＧＢＡ１コードするヌクレオチド配列：
ＡＴＧＧＣＴＧＧＣＡＧＴＣＴＴＡＣＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＴＡＴＣＣＣＣＡＡＡＴＣＣＴＴＴＧＧＡＴＡＣＴＣＡＴＣＴＧＴＧＧＴＧＴＧＴＧＴＴＴＧＴＡＡＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＴＧＡＴＡＧＣＴＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＴＴＴＣＡＡＧＧＴＡＴＧＡＡＴＣＴＡＣＣＡＧＧＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＡＡＧＣＡＡＡＣＣＡＴＡＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣＡＴＧＡＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＡＴＡＴＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＴＣＴＣＣＴＴＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＡＣＴＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＴＡＣＡＡＴＡＴＣＡＴＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＡＴＧＧＣＣＴＣＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＡＧＴＡＴＴＡＧＧＡＣＴＴＡＣＡＣＣＴＡＴＧＣＴＧＡＴＡＣＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＡＡＣＴＴＣＴＣＡＴＴＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＴＡＣＣＡＡＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣＣＣＡＣＴＣＡＴＴＣＡＣＡＧＧＧＣＣＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＡＧＡＧＡＣＣＡＧＴＧＴＣＡＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＣＣＡＡＣＴＴＧＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＴＧＧＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴＧＧＴＡＡＧＧＧＣＴＣＴＣＴＴＡＡＧＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＴＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＴＡＴＴＴＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＡＡＡＴＴＧＣＡＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＴＴＡＣＡＧＣＴＧＡＧＡＡＴＧＡＡＣＣＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＴＡＣＣＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＡＧＧＧＡＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＡＴＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＡＴＡＡＴＧＴＧＡＧＧＣＴＴＣＴＧＡＴＧＣＴＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＧＴＴＧＴＣＣＴＧＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧＴＴＣＡＴＧＧＧＡＴＴＧＣＴＧＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＧＣＴＣＣＡＧＣＴＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＣＡＧＧＴＴＧＴＴＴＣＣＣＡＡＴＡＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＴＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＴＧＴＧＧＧＣＡＧＴＡＡＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＣＡＧＴＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧＧＡＡＴＧＣＡＡＴＡＣＴＣＣＣＡＴＴＣＴＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＴＡＣＣＡＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＡＣＴＧＡＣＴＧＧＡＡＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＡＡＣＣＣＴＧＡＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＡＡＴＴＧＧＧＴＣＡＧＧＡＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴＡＧＴＣＣＣＡＴＣＡＴＴＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＡＴＡＡＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧＴＴＣＴＡＴＣＡＣＣＴＧＧＧＴＣＡＣＴＴＴＡＧＴＡＡＧＴＴＴＡＴＣＣＣＴＧＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＣＴＧＧＴＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＴＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧＴＴＣＴＣＡＡＴＡＧＡＡＧＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＧＴＧＣＣＣＴＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＡＴＴＴＣＣＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＧＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＴＡＣＣＴＴＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＧＴＧＡ
配列番号２：ｎＧＵＳＢプロモータのヌクレオチド配列
ＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＣＣＴＴＧＡＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＣＣＧＡＴＣＴＣＡＧＧＧＧＴＴＣＴＧＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＡＴＣＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＣＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＧＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＧＧＣＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＴＣＣＡＧＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＡＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＧＴＣＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＡＴＧＧＣＧＣＧＧＡＴＧＧＣＴＴＣＡＧＧＣＧＣＡＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＧＴＣＡＣＧＣＧＡＣＣＣＧＣＣＣＴＡＣＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＧＣＧＣＴＴＴＴＣＴＴＡＧＣＧＣＣＧＣＡＧＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＣＧＧＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＡＧＣＡＴＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴ
配列番号３：ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル
ＧＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴ
配列番号４：ｐＡＡＶ．ｎＧＵＳＢ．ＧＢＡ１のヌクレオチド配列
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配列番号５ シグナルペプチド配列を有さないヒトグルコセレブロシダーゼのアミノ酸配列（配列番号１によってコードされる）
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配列番号６ 短いシグナルペプチドを含むヒトグルコセレブロシダーゼの完全なアミノ酸配列（配列番号１によってコードされる）
ＭＡＧＳＬＴＧＬＬＬＬＱＡＶＳＷＡＳＧＡＲＰＣＩＰＫＳＦＧＹＳＳＶＶＣＶＣＮＡＴＹＣＤＳＦＤＰＰＴＦＰＡＬＧＴＦＳＲＹＥＳＴＲＳＧＲＲＭＥＬＳＭＧＰＩＱＡＮＨＴＧＴＧＬＬＬＴＬＱＰＥＱＫＦＱＫＶＫＧＦＧＧＡＭＴＤＡＡＡＬＮＩＬＡＬＳＰＰＡＱＮＬＬＬＫＳＹＦＳＥＥＧＩＧＹＮＩＩＲＶＰＭＡＳＣＤＦＳＩＲＴＹＴＹＡＤＴＰＤＤＦＱＬＨＮＦＳＬＰＥＥＤＴＫＬＫＩＰＬＩＨＲＡＬＱＬＡＱＲＰＶＳＬＬＡＳＰＷＴＳＰＴＷＬＫＴＮＧＡＶＮＧＫＧＳＬＫＧＱＰＧＤＩＹＨＱＴＷＡＲＹＦＶＫＦＬＤＡＹＡＥＨＫＬＱＦＷＡＶＴＡＥＮＥＰＳＡＧＬＬＳＧＹＰＦＱＣＬＧＦＴＰＥＨＱＲＤＦＩＡＲＤＬＧＰＴＬＡＮＳＴＨＨＮＶＲＬＬＭＬＤＤＱＲＬＬＬＰＨＷＡＫＶＶＬＴＤＰＥＡＡＫＹＶＨＧＩＡＶＨＷＹＬＤＦＬＡＰＡＫＡＴＬＧＥＴＨＲＬＦＰＮＴＭＬＦＡＳＥＡＣＶＧＳＫＦＷＥＱＳＶＲＬＧＳＷＤＲＧＭＱＹＳＨＳＩＩＴＮＬＬＹＨＶＶＧＷＴＤＷＮＬＡＬＮＰＥＧＧＰＮＷＶＲＮＦＶＤＳＰＩＩＶＤＩＴＫＤＴＦＹＫＱＰＭＦＹＨＬＧＨＦＳＫＦＩＰＥＧＳＱＲＶＧＬＶＡＳＱＫＮＤＬＤＡＶＡＬＭＨＰＤＧＳＡＶＶＶＶＬＮＲＳＳＫＤＶＰＬＴＩＫＤＰＡＶＧＦＬＥＴＩＳＰＧＹＳＩＨＴＹＬＷＲＲＱ
配列番号７ ヒトＧＢＡ１遺伝子（野生型）のコード配列の完全なヌクレオチド配列
ヒトグルコセレブロシダーゼｍＲＮＡ、完全なｃｄｓ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ１９２８５．１
＞Ｍ１９２８５．１：１２３－１７３３ ヒトグルコセレブロシダーゼｍＲＮＡ、完全なｃｄｓ
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配列番号８ 長いシグナルペプチドを含むヒトグルコセレブロシダーゼの完全なアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿００１００５７４２．１、リソソーム酸性グルコシルセラミダーゼアイソフォーム１前駆体）
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配列番号９ ＣＡＧプロモータのヌクレオチド配列
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配列番号１０ ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列
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配列番号１１ ヒトＧＢＡ１をコードするヌクレオチド配列（ＩＤＴ最適化配列）
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配列番号１２ ヒトＧＢＡ１をコードするヌクレオチド配列（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ最適化配列）
ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＣＡＡＧＣＣＣＣＴＣＡＣＧＧＧＡＡＧＡＧＴＧＣＣＣＴＡＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＧＧＧＴＣＴＣＡＡＴＴＡＴＧＧＣＣＧＧＧＡＧＣＣＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＧＡＧＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＣＡＴＣＣＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＴＴＧＴＧＡＣＴＣＣＴＴＣＧＡＴＣＣＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＡＣＧＡＧＴＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＧＡＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＧＣＣＣＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＣＣＧＧＡＡＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＴＧＡＣＡＧＡＣＧＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＡＣＣＣＧＣＣＣＡＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＴＡＣＴＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＣＧＧＣＴＡＴＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＴＧＣＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＡＧＡＡＣＣＴＡＣＡＣＡＴＡＴＧＣＣＧＡＴＡＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＡＴＴＴＴＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＴＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＣＣＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＣＣＴＡＣＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＡＡＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＧＡＣＡＴＧＧＧＣＣＡＧＡＴＡＴＴＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＡＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＡＧＡＡＣＧＡＧＣＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＴＡＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＧＡＣＴＴＴＡＴＣＧＣＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＣＡＣＡＡＴＧＴＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＴＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＡＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＴＧＣＡＣＧＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＧＡＧＡＧＡＣＡＣＡＣＣＧＧＣＴＧＴＴＣＣＣＴＡＡＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＴＴＴＧＣＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＴＧＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＴＴＴＧＧＧＡＧＣＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＴＣＴＴＧＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＡＴＧＣＡＧＴＡＣＴＣＣＣＡＣＴＣＴＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＧＴＡＴＣＡＣＧＴＧＧＴＧＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＡＡＴＴＴＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＡＴＧＴＴＴＴＡＴＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＴＣＴＣＴＡＡＧＴＴＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＣＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＣＧＣＴＣＴＡＧＣＡＡＧＧＡＣＧＴＧＣＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＣＣＣＣＧＧＣＴＡＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＡＣＣＴＡＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＧＴＧＡ
配列番号１３ ｈＳｙｎプロモータのヌクレオチド配列（ＮＣＢＩ参照 ＮＧ＿００８４３７．１）
ＡＧＴＧＣＡＡＧＴＧＧＧＴＴＴＴＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＣＣＴＧＡＣＧＡＣＣＧＡＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＣＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡＡＡＴＴＧＣＧＣＡＴＣＣＣＣＴＡＴＣＡＧＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＧＣＧＧＣＧＡＧＧＣＧＣＧＴＧＣＧＣＡＣＴＧＣＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＧＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＣＧＴＣＡＣＴＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＣＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＧＣＧＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＧＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＧＧＣＧＣＧＡＧＡＴＡＧＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＣＧＣＧＡＣＣＡＴＣＴＧＣＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＧＣＡＧ
配列番号１４ ＡＡＶ ＴＴキャプシドタンパク質のアミノ酸配列
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＩＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＡＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＳＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＳＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＳＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＭＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＡＡＤＮＮＮＳＤＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＹＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＤＳＧＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＳＧＮＴＱＡＡＴＳＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ
配列番号１５ ＡＡＶ２のＦｌｉｐ ＩＴＲのヌクレオチド配列
ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ
配列番号１６ ＡＡＶ２のＦｌｏｐ ＩＴＲのヌクレオチド配列
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡ
配列番号１７：ヒトＧＢＡ１アイソフォーム２のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照 ＮＰ＿００１１６５２８２．１）
ＭＥＬＳＭＧＰＩＱＡＮＨＴＧＴＧＬＬＬＴＬＱＰＥＱＫＦＱＫＶＫＧＦＧＧＡＭＴＤＡＡＡＬＮＩＬＡＬＳＰＰＡＱＮＬＬＬＫＳＹＦＳＥＥＧＩＧＹＮＩＩＲＶＰＭＡＳＣＤＦＳＩＲＴＹＴＹＡＤＴＰＤＤＦＱＬＨＮＦＳＬＰＥＥＤＴＫＬＫＩＰＬＩＨＲＡＬＱＬＡＱＲＰＶＳＬＬＡＳＰＷＴＳＰＴＷＬＫＴＮＧＡＶＮＧＫＧＳＬＫＧＱＰＧＤＩＹＨＱＴＷＡＲＹＦＶＫＦＬＤＡＹＡＥＨＫＬＱＦＷＡＶＴＡＥＮＥＰＳＡＧＬＬＳＧＹＰＦＱＣＬＧＦＴＰＥＨＱＲＤＦＩＡＲＤＬＧＰＴＬＡＮＳＴＨＨＮＶＲＬＬＭＬＤＤＱＲＬＬＬＰＨＷＡＫＶＶＬＴＤＰＥＡＡＫＹＶＨＧＩＡＶＨＷＹＬＤＦＬＡＰＡＫＡＴＬＧＥＴＨＲＬＦＰＮＴＭＬＦＡＳＥＡＣＶＧＳＫＦＷＥＱＳＶＲＬＧＳＷＤＲＧＭＱＹＳＨＳＩＩＴＮＬＬＹＨＶＶＧＷＴＤＷＮＬＡＬＮＰＥＧＧＰＮＷＶＲＮＦＶＤＳＰＩＩＶＤＩＴＫＤＴＦＹＫＱＰＭＦＹＨＬＧＨＦＳＫＦＩＰＥＧＳＱＲＶＧＬＶＡＳＱＫＮＤＬＤＡＶＡＬＭＨＰＤＧＳＡＶＶＶＶＬＮＲＳＳＫＤＶＰＬＴＩＫＤＰＡＶＧＦＬＥＴＩＳＰＧＹＳＩＨＴＹＬＷＲＲＱ
配列番号１８：ヒトＧＢＡ１アイソフォーム３のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照 ＮＰ＿００１１６５２８３．１）
ＭＥＦＳＳＰＳＲＥＥＣＰＫＰＬＳＲＶＳＩＭＡＧＳＬＴＧＬＬＬＬＱＡＶＳＷＡＳＧＡＲＰＣＩＰＫＳＦＧＹＳＳＶＶＣＶＣＮＡＴＹＣＤＳＦＤＰＰＴＦＰＡＬＧＴＦＳＲＹＥＳＴＲＳＧＲＲＭＥＬＳＭＧＰＩＱＡＮＨＴＧＴＧＩＧＹＮＩＩＲＶＰＭＡＳＣＤＦＳＩＲＴＹＴＹＡＤＴＰＤＤＦＱＬＨＮＦＳＬＰＥＥＤＴＫＬＫＩＰＬＩＨＲＡＬＱＬＡＱＲＰＶＳＬＬＡＳＰＷＴＳＰＴＷＬＫＴＮＧＡＶＮＧＫＧＳＬＫＧＱＰＧＤＩＹＨＱＴＷＡＲＹＦＶＫＦＬＤＡＹＡＥＨＫＬＱＦＷＡＶＴＡＥＮＥＰＳＡＧＬＬＳＧＹＰＦＱＣＬＧＦＴＰＥＨＱＲＤＦＩＡＲＤＬＧＰＴＬＡＮＳＴＨＨＮＶＲＬＬＭＬＤＤＱＲＬＬＬＰＨＷＡＫＶＶＬＴＤＰＥＡＡＫＹＶＨＧＩＡＶＨＷＹＬＤＦＬＡＰＡＫＡＴＬＧＥＴＨＲＬＦＰＮＴＭＬＦＡＳＥＡＣＶＧＳＫＦＷＥＱＳＶＲＬＧＳＷＤＲＧＭＱＹＳＨＳＩＩＴＮＬＬＹＨＶＶＧＷＴＤＷＮＬＡＬＮＰＥＧＧＰＮＷＶＲＮＦＶＤＳＰＩＩＶＤＩＴＫＤＴＦＹＫＱＰＭＦＹＨＬＧＨＦＳＫＦＩＰＥＧＳＱＲＶＧＬＶＡＳＱＫＮＤＬＤＡＶＡＬＭＨＰＤＧＳＡＶＶＶＶＬＮＲＳＳＫＤＶＰＬＴＩＫＤＰＡＶＧＦＬＥＴＩＳＰＧＹＳＩＨＴＹＬＷＲＲＱ
配列番号１９：ヒトＧＢＡ１遺伝子のコード配列の完全なヌクレオチド配列
ａｔｇｇａｇｔｔｔｔｃａａｇｔｃｃｔｔｃｃａｇａｇａｇｇａａｔｇｔｃｃｃａａｇｃｃｔｔｔｇａｇｔａｇｇｇｔａａｇｃａｔｃａｔｇｇｃｔｇｇｃａｇｃｃｔｃａｃａｇｇａｔｔｇｃｔｔｃｔａｃｔｔｃａｇｇｃａｇｔｇｔｃｇｔｇｇｇｃａｔｃａｇｇｔｇｃｃｃｇｃｃｃｃｔｇｃａｔｃｃｃｔａａａａｇｃｔｔｃｇｇｃｔａｃａｇｃｔｃｇｇｔｇｇｔｇｔｇｔｇｔｃｔｇｃａａｔｇｃｃａｃａｔａｃｔｇｔｇａｃｔｃｃｔｔｔｇａｃｃｃｃｃｃｇａｃｃｔｔｔｃｃｔｇｃｃｃｔｔｇｇｔａｃｃｔｔｃａｇｃｃｇｃｔａｔｇａｇａｇｔａｃａｃｇｃａｇｔｇｇｇｃｇａｃｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａｇｔａｔｇｇｇｇｃｃｃａｔｃｃａｇｇｃｔａａｔｃａｃａｃｇｇｇｃａｃａｇｇｃｃｔｇｃｔａｃｔｇａｃｃｃｔｇｃａｇｃｃａｇａａｃａｇａａｇｔｔｃｃａｇａａａｇｔｇａａｇｇｇａｔｔｔｇｇａｇｇｇｇｃｃａｔｇａｃａｇａｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｃｔｃａａｃａｔｃｃｔｔｇｃｃｃｔｇｔｃａｃｃｃｃｃｔｇｃｃｃａａａａｔｔｔｇｃｔａｃｔｔａａａｔｃｇｔａｃｔｔｃｔｃｔｇａａｇａａｇｇａａｔｃｇｇａｔａｔａａｃａｔｃａｔｃｃｇｇｇｔａｃｃｃａｔｇｇｃｃａｇｃｔｇｔｇａｃｔｔｃｔｃｃａｔｃｃｇｃａｃｃｔａｃａｃｃｔａｔｇｃａｇａｃａｃｃｃｃｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃａｇｔｔｇｃａｃａａｃｔｔｃａｇｃｃｔｃｃｃａｇａｇｇａａｇａｔａｃｃａａｇｃｔｃａａｇａｔａｃｃｃｃｔｇａｔｔｃａｃｃｇａｇｃｃｃｔｇｃａｇｔｔｇｇｃｃｃａｇｃｇｔｃｃｃｇｔｔｔｃａｃｔｃｃｔｔｇｃｃａｇｃｃｃｃｔｇｇａｃａｔｃａｃｃｃａｃｔｔｇｇｃｔｃａａｇａｃｃａａｔｇｇａｇｃｇｇｔｇａａｔｇｇｇａａｇｇｇｇｔｃａｃｔｃａａｇｇｇａｃａｇｃｃｃｇｇａｇａｃａｔｃｔａｃｃａｃｃａｇａｃｃｔｇｇｇｃｃａｇａｔａｃｔｔｔｇｔｇａａｇｔｔｃｃｔｇｇａｔｇｃｃｔａｔｇｃｔｇａｇｃａｃａａｇｔｔａｃａｇｔｔｃｔｇｇｇｃａｇｔｇａｃａｇｃｔｇａａａａｔｇａｇｃｃｔｔｃｔｇｃｔｇｇｇｃｔｇｔｔｇａｇｔｇｇａｔａｃｃｃｃｔｔｃｃａｇｔｇｃｃｔｇｇｇｃｔｔｃａｃｃｃｃｔｇａａｃａｔｃａｇｃｇａｇａｃｔｔｃａｔｔｇｃｃｃｇｔｇａｃｃｔａｇｇｔｃｃｔａｃｃｃｔｃｇｃｃａａｃａｇｔａｃｔｃａｃｃａｃａａｔｇｔｃｃｇｃｃｔａｃｔｃａｔｇｃｔｇｇａｔｇａｃｃａａｃｇｃｔｔｇｃｔｇｃｔｇｃｃｃｃａｃｔｇｇｇｃａａａｇｇｔｇｇｔａｃｔｇａｃａｇａｃｃｃａｇａａｇｃａｇｃｔａａａｔａｔｇｔｔｃａｔｇｇｃａｔｔｇｃｔｇｔａｃａｔｔｇｇｔａｃｃｔｇｇａｃｔｔｔｃｔｇｇｃｔｃｃａｇｃｃａａａｇｃｃａｃｃｃｔａｇｇｇｇａｇａｃａｃａｃｃｇｃｃｔｇｔｔｃｃｃｃａａｃａｃｃａｔｇｃｔｃｔｔｔｇｃｃｔｃａｇａｇｇｃｃｔｇｔｇｔｇｇｇｃｔｃｃａａｇｔｔｃｔｇｇｇａｇｃａｇａｇｔｇｔｇｃｇｇｃｔａｇｇｃｔｃｃｔｇｇｇａｔｃｇａｇｇｇａｔｇｃａｇｔａｃａｇｃｃａｃａｇｃａｔｃａｔｃａｃｇａａｃｃｔｃｃｔｇｔａｃｃａｔｇｔｇｇｔｃｇｇｃｔｇｇａｃｃｇａｃｔｇｇａａｃｃｔｔｇｃｃｃｔｇａａｃｃｃｃｇａａｇｇａｇｇａｃｃｃａａｔｔｇｇｇｔｇｃｇｔａａｃｔｔｔｇｔｃｇａｃａｇｔｃｃｃａｔｃａｔｔｇｔａｇａｃａｔｃａｃｃａａｇｇａｃａｃｇｔｔｔｔａｃａａａｃａｇｃｃｃａｔｇｔｔｃｔａｃｃａｃｃｔｔｇｇｃｃａｃｔｔｃａｇｃａａｇｔｔｃａｔｔｃｃｔｇａｇｇｇｃｔｃｃｃａｇａｇａｇｔｇｇｇｇｃｔｇｇｔｔｇｃｃａｇｔｃａｇａａｇａａｃｇａｃｃｔｇｇａｃｇｃａｇｔｇｇｃａｃｔｇａｔｇｃａｔｃｃｃｇａｔｇｇｃｔｃｔｇｃｔｇｔｔｇｔｇｇｔｃｇｔｇｃｔａａａｃｃｇｃｔｃｃｔｃｔａａｇｇａｔｇｔｇｃｃｔｃｔｔａｃｃａｔｃａａｇｇａｔｃｃｔｇｃｔｇｔｇｇｇｃｔｔｃｃｔｇｇａｇａｃａａｔｃｔｃａｃｃｔｇｇｃｔａｃｔｃｃａｔｔｃａｃａｃｃｔａｃｃｔｇｔｇｇｃｇｔｃｇｃｃａｇｔｇａ
配列番号２０：ｎＧＵＳＢプロモータのヌクレオチド配列Ｎｏ．２
ＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＣＣＴＴＧＡＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＣＣＧＡＴＣＴＣＡＧＧＧＧＴＴＣＴＧＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＡＴＣＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＣＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＧＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＧＧＣＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＴＣＣＡＧＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＡＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＧＴＣＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＡＴＧＧＣＧＣＧＧＡＴＧＧＣＴＴＣＡＧＧＣＧＣＡＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＧＴＣＡＣＧＣＧＡＣＣＣＧＣＣＣＴＡＣＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＧＣＧＣＴＴＴＴＣＴＴＡＧＣＧＣＣＧＣＡＧＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＣＧＧＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＡＧＣ
配列番号２１ ＣＡＧプロモータのヌクレオチド配列Ｎｏ．２
ｃｔａｇｔｔａｔｔａａｔａｇｔａａｔｃａａｔｔａｃｇｇｇｇｔｃａｔｔａｇｔｔｃａｔａｇｃｃｃａｔａｔａｔｇｇａｇｔｔｃｃｇｃｇｔｔａｃａｔａａｃｔｔａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｃｃａａｃｇａｃｃｃｃｃｇｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔａａｔｇａｃｇｔａｔｇｔｔｃｃｃａｔａｇｔａａｃｇｃｃａａｔａｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇｔｇｇａｇｔａｔｔｔａｃｇｇｔａａａｃｔｇｃｃｃａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｇｔｇｔａｔｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔａｃｇｃｃｃｃｃｔａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃａｔｔａｔｇｃｃｃａｇｔａｃａｔｇａｃｃｔｔａｔｇｇｇａｃｔｔｔｃｃｔａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃｔａｃｇｔａｔｔａｇｔｃａｔｃｇｃｔａｔｔａｃｃａｔｇｇｔｃｇａｇｇｔｇａｇｃｃｃｃａｃｇｔｔｃｔｇｃｔｔｃａｃｔｃｔｃｃｃｃａｔｃｔｃｃｃｃｃｃｃｃｔｃｃｃｃａｃｃｃｃｃａａｔｔｔｔｇｔａｔｔｔａｔｔｔａｔｔｔｔｔｔａａｔｔａｔｔｔｔｇｔｇｃａｇｃｇａｔｇｇｇｇｇｃｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｃｇｃｇｃｇｃｃａｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇａｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇａｇｇｃｇｇａｇａｇｇｔｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃｃａａｔｃａｇａｇｃｇｇｃｇｃｇｃｔｃｃｇａａａｇｔｔｔｃｃｔｔｔｔａｔｇｇｃｇａｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｃｃｔａｔａａａａａｇｃｇａａｇｃｇｃｇｃｇｇｃｇｇｇｃｇｇｇａｇｔｃｇｃｔｇｃｇａｃｇｃｔｇｃｃｔｔｃｇｃｃｃｃｇｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃｔｃｇｃｇｃｃｇｃｃｃｇｃｃｃｃｇｇｃｔｃｔｇａｃｔｇａｃｃｇｃｇｔｔａｃｔｃｃｃａｃａｇｇｔｇａｇｃｇｇｇｃｇｇｇａｃｇｇｃｃｃｔｔｃｔｃｃｔｃｃｇｇｇｃｔｇｔａａｔｔａｇｃｇｃｔｔｇｇｔｔｔａａｔｇａｃｇｇｃｔｔｇｔｔｔｃｔｔｔｔｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃｇｔｇａａａｇｃｃｔｔｇａｇｇｇｇｃｔｃｃｇｇｇａｇｇｇｃｃｃｔｔｔｇｔｇｃｇｇｇｇｇｇｇａｇｃｇｇｃｔｃｇｇｇｇｇｇｔｇｃｇｔｇｃｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｃｇｔｇｇｇｇａｇｃｇｃｃｇｃｇｔｇｃｇｇｃｃｃｇｃｇｃｔｇｃｃｃｇｇｃｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｇｃｔｇｃｇｇｇｃｇｃｇｇｃｇｃｇｇｇｇｃｔｔｔｇｔｇｃｇｃｔｃｃｇｃａｇｔｇｔｇｃｇｃｇａｇｇｇｇａｇｃｇｃｇｇｃｃｇｇｇｇｇｃｇｇｔｇｃｃｃｃｇｃｇｇｔｇｃｇｇｇｇｇｇｇｇｃｔｇｃｇａｇｇｇｇａａｃａａａｇｇｃｔｇｃｇｔｇｃｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｃｇｔｇｇｇｇｇｇｇｔｇａｇｃａｇｇｇｇｇｔｇｔｇｇｇｃｇｃｇｇｃｇｇｔｃｇｇｇｃｔｇｔａａｃｃｃｃｃｃｃｃｔｇｃａｃｃｃｃｃｃｔｃｃｃｃｇａｇｔｔｇｃｔｇａｇｃａｃｇｇｃｃｃｇｇｃｔｔｃｇｇｇｔｇｃｇｇｇｇｃｔｃｃｇｔａｃｇｇｇｇｃｇｔｇｇｃｇｃｇｇｇｇｃｔｃｇｃｃｇｔｇｃｃｇｇｇｃｇｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇｃａｇｇｔｇｇｇｇｇｔｇｃｃｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｃｇｃｃｔｃｇｇｇｃｃｇｇｇｇａｇｇｇｃｔｃｇｇｇｇｇａｇｇｇｇｃｇｃｇｇｃｇｇｃｃｃｃｃｇｇａｇｃｇｃｃｇｇｃｇｇｃｔｇｔｃｇａｇｇｃｇｃｇｇｃｇａｇｃｃｇｃａｇｃｃａｔｔｇｃｃｔｔｔｔａｔｇｇｔａａｔｃｇｔｇｃｇａｇａｇｇｇｃｇｃａｇｇｇａｃｔｔｃｃｔｔｔｇｔｃｃｃａａａｔｃｔｇｔｇｃｇｇａｇｃｃｇａａａｔｃｔｇｇｇａｇｇｃｇｃｃｇｃｃｇｃａｃｃｃｃｃｔｃｔａｇｃｇｇｇｃｇｃｇｇｇｇｃｇａａｇｃｇｇｔｇｃｇｇｃｇｃｃｇｇｃａｇｇａａｇｇａａａｔｇｇｇｃｇｇｇｇａｇｇｇｃｃｔｔｃｇｔｇｃｇｔｃｇｃｃｇｃｇｃｃｇｃｃｇｔｃｃｃｃｔｔｃｔｃｃｃｔｃｔｃｃａｇｃｃｔｃｇｇｇｇｃｔｇｔｃｃｇｃｇｇｇｇｇｇａｃｇｇｃｔｇｃｃｔｔｃｇｇｇｇｇｇｇａｃｇｇｇｇｃａｇｇｇｃｇｇｇｇｔｔｃｇｇｃｔｔｃｔｇｇｃｇｔｇｔｇａｃｃｇｇｃｇｇｃｔｃｔａｇａｇｃｃｔｃｔｇｃｔａａｃｃａｔｇｔｔｃａｔｇｃｃｔｔｃｔｔｃｔｔｔｔｔｃｃｔａｃａｇ
配列番号２２ ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモータの短いバージョンのヌクレオチド配列
Ｇｇｃｃｔｃｃｇｃｇｃｃｇｇｇｔｔｔｔｇｇｃｇｃｃｔｃｃｃｇｃｇｇｇｃｇｃｃｃｃｃｃｔｃｃｔｃａｃｇｇｃｇａｇｃｇｃｔｇｃｃａｃｇｔｃａｇａｃｇａａｇｇｇｃｇｃａｇｃｇａｇｃｇｔｃｃｔｇａｔｃｃｔｔｃｃｇｃｃｃｇｇａｃｇｃｔｃａｇｇａｃａｇｃｇｇｃｃｃｇｃｔｇｃｔｃａｔａａｇａｃｔｃｇｇｃｃｔｔａｇａａｃｃｃｃａｇｔａｔｃａｇｃａｇａａｇｇａｃａｔｔｔｔａｇｇａｃｇｇｇａｃｔｔｇｇｇｔｇａｃｔｃｔａｇｇｇｃａｃｔｇｇｔｔｔｔｃｔｔｔｃｃａｇａｇａｇｃｇｇａａｃａｇｇｃｇａｇｇａａａａｇｔａｇｔｃｃｃｔｔｃｔｃｇｇｃｇａｔｔｃｔｇｃｇｇａｇｇｇａｔｃｔｃｃｇｔｇｇｇｇｃｇｇｔｇａａｃｇｃｃｇａｔｇａｔｔａｔａｔａａｇｇａｃｇｃｇｃｃｇｇｇｔｇｔｇｇｃａｃａｇｃｔａｇｔｔｃｃｇｔｃｇｃａｇｃｃｇｇｇａｔｔｔｇｇｇｔｃｇｃｇｇｔｔｃｔｔｇｔｔｔｇｔｇｇａｔｃｇｃｔｇｔｇａｔｃｇｔｃａｃｔｔｇｇｔ
配列番号２３ ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモータの長いバージョンのヌクレオチド配列
ｃｃｇｇａｇｇｃｇｃｇｇｃｃｃａａａａｃｃｇｃｇｇａｇｇｇｃｇｃｃｃｇｃｇｇｇｇｇｇａｇｇａｇｔｇｃｃｇｃｔｃｇｃｇａｃｇｇｔｇｃａｇｔｃｔｇｃｔｔｃｃｃｇｃｇｔｃｇｃｔｃｇｃａｇｇａｃｔａｇｇａａｇｇｃｇｇｇｃｃｔｇｃｇａｇｔｃｃｔｇｔｃｇｃｃｇｇｇｃｇａｃｇａｇｔａｔｔｃｔｇａｇｃｃｇｇａａｔｃｔｔｇｇｇｇｔｃａｔａｇｔｃｇｔｃｔｔｃｃｔｇｔａａａａｔｃｃｔｇｃｃｃｔｇａａｃｃｃａｃｔｇａｇａｔｃｃｃｇｔｇａｃｃａａａａｇａａａｇｇｔｃｔｃｔｃｇｃｃｔｔｇｔｃｃｇｃｔｃｃｔｔｔｔｃａｔｃａｇｇｇａａｇａｇｃｃｇｃｔａａｇａｃｇｃｃｔｃｃｃｔａｇａｇｇｃａｃｃｃｃｇｃｃａｃｔｔｇｃｇｇｃｔａｃｔａａｔａｔａｔｔｃｃｔｇｃｇｃｇｇｃｃｃａｃａｃｃｇｔｇｔｃｇａｔｃａａｇｇｃａｇｃｇｔｃｇｇｃｃｃｔａａａｃｃｃａｇｃｇｃｃａａｇａａｃａａａｃａｃｃｔａｇｃｇａｃａｃｔａｇｃａｇｔｇａａｃｃａｃｔｃａｔｃｇｃｃｃｇａｃｇａｃｃｃｇａｃｃｇｇｃｃｃｃｇａａａｇｃａｃｃｇｇｃｇｇｃｃｃｇｇｃｇａｇｃｃａｃｃｃｔｇｃｃｔｔｃｇｃａｃａｃｃｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｔｃｃｃｇａｃａｔｃａｇａｃｃｃａｇｇｃｇｃｔｃｇｔｔｃｃａａｃｇｇｇａｃｔｔｇａｃｃｃｃｃａａｃｃｃｃｃｃｔｃｇｃｇｔｃｇｔｔｔｔａｃｃｇｃｃｇａｃａａｇｇｇｃｔｃａｇａａｃｔｔａｃｃｔｔｃｔｇｃｇａａｃａｃｔｃｃｇｃｃｃｇａｃａｃｔｃｃａｇｃａａｃｔｔｔｇｔｔｃｃａｃｃｃｃｃｃｇｔａｃｃａｃｃｃｇｃｃｇｔｔｃｔｔｇｇｇｔｔｃｃａｇａａｃｔｃｃｇｇａａｇｃｇａｔｔａｃｇｃｃｃｔｔｔｃｇａｇａａｔａａｇｃｃｃａｃｔｃｔａｃｃｃｇａｃｃｃｃｇｔｇｇｔａｇａｃｃｃｃｔｇｇｇａｃｔｇｃａｃｔｔｃａａａｃａｇｔｇａｃｔｇａｃｃｔｃｔｔｇａｇｃｃａａａｃａｇｃａｇａｃａａｃｇｃｃｃｃｃｇｃｃｇｔｃａａｔａｃｃｇｃｃａｃｇｇｃａａｃｃｃｇｔｃａｃｇｔｇｇｇｃａｔｇｇａａａｃｃｃｔｃｇｃｇｃｇｃｇｇｇａｇｃａｇｃａｃａｇｃａｃｔｇｃａｇｔｇｇｇｃａａｇａｃａａｃｃｇａａｔａｔｔａｃｇｔｃｃｃａｃｃｃｃｇｇｔｇｇａｃｇｇｃｃａｔｃｃａｃａｃｇｃｃａｔｃｃｇａａａａｇａｇｇｃａｇｃｇｔｃｃｔｇｃｇｔｃｃｃａａｇｃｃｃｇｇａｔｃｃｃａｔｃｃｇａｇａｇｇａｃｔｔａｇｃｔｇｔｃｃｇｃｇｇｃｃｔｇｇａｇａｃｃａｃｔｃｃｃｃｔｃｃｃｔａｔｔｃａｃｔｃｃｇｃａｇｔｃａａａｇａａａｃｃａｇｃｃａａａａｔａｃａｔｇｇａｔａｇａａｇａａｔｔｃａｔｃｇａｃｔｔｃｇａｇｇｃｃａａａａｃｔｔｇａｔａｃｇｃｇａｇｃｃｃｃａａｃｃｇｃｔｃａｃａｃａａａａｃａｃｔｔｃａａａａａａｔｃｃｇｔｇｇａａａａｃｔｔｔａｃａｔｔａｇｔａａａｃｃｃａｇｔｔａｔａｃａｔｔａａａａｇｔｃａｃａａｔｃｔｇａｔｃａｔｔｔａａｃａｇｇｃｇａｔｔｔａａｇａｃｃｇｇｃａａａａａｃｃｇａａａａａａｃａａｔｃｔｇ
配列番号２４ ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモータのヌクレオチド配列
Ｇａｃｃｃｃｔｃｔｃｔｃｃａｇｃｃａｃｔａａｇｃｃａｇｔｔｇｃｔｃｃｃｔｃｇｇｃｔｇａｃｇｇｃｔｇｃａｃｇｃｇａｇｇｃｃｔｃｃｇａａｃｇｔｃｔｔａｃｇｃｃｔｔｇｔｇｇｃｇｃｇｃｃｃｇｔｃｃｔｔｇｔｃｃｃｇｇｇｔｇｔｇａｔｇｇｃｇｇｇｇｔｇｔｇｇｇｇｃｇｇａｇｇｇｃｇｔｇｇｃｇｇｇｇａａｇｇｇｃｃｇｇｃｇａｃｇａｇａｇｃｃｇｃｇｃｇｇｇａｃｇａｃｔｃｇｔｃｇｇｃｇａｔａａｃｃｇｇｔｇｔｃｇｇｇｔａｇｃｇｃｃａｇｃｃｇｃｇｃｇａｃｇｇｔａａｃｇａｇｇｇａｃｃｇｃｇａｃａｇｇｃａｇａｃｇｃｔｃｃｃａｔｇａｔｃａｃｔｃｔｇｃａｃｇｃｃｇａａｇｇｃａａａｃａｇｔｇｃａｇｇｃｃｇｔｇｃｇｇｃｇｃｔｔｇｇｃｇｔｔｃｃｔｔｇｇａａｇｇｇｃｔｇａａｔｃｃｃｃｇｃｃｔｃｇｔｃｃｔｔｃｇｃａｇｃｇｇｃｃｃｃｃｃｇｇｇｔｇｔｔｃｃｃａｔｃｇｃｃｇｃｔｔｃｔａｇｇｃｃｃａｃｔｇｃｇａｃｇｃｔｔｇｃｃｔｇｃａｃｔｔｃｔｔａｃａｃｇｃｔｃｔｇｇｇｔｃｃｃａｇｃｃｇｃｇｇｃｇａｃｇｃａａａｇｇｇｃｃｔｔｇｇｔｇｃｇｇｇｔｃｔｃｇｔｃｇｇｃｇｃａｇｇｇａｃｇｃｇｔｔｔｇｇｇｔｃｃｃｇａｃｇｇａａｃｃｔｔｔｔｃｃｇｃｇｔｔｇｇｇｇｔｔｇｇｇｇ
配列番号２５ ＣＢＡ／ＣＢｈプロモータのヌクレオチド配列Ｎｏ．１
ＡＧＡＴＧＴＡＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＧＴＡＡＧＧＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＣＣＡＴＴＴＡＣＣＧＴＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＧＧＧＧＧＣＧＴＡＣＴＴＧＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＡＣＴＧＣＣＡＡＧＴＧＧＧＣＡＧＴＴＴＡＣＣＧＴＡＡＡＴＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＴＡＴＧＧＧＡＡＣＡＴＡＣＧＴＣＡＴＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＧＴＣＧＴＴＧＧＧＣＧＧＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＣＣＡＴＴＴＡＣＣＧＴＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＴＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＧＣＴＡＴＧＡＡＣＴＡＡＴＧＡＣＣＣＣＧＴＡＡＴＴＧＡＴＴＡＣＴＡＴＴＡＡＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＣＴＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＧＣＣＴＴＴＡＣＴＴＣＴＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＧＧＡＡＧＴＧＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＡＡＡＡＧＣＴ
配列番号２６ ＣＢＡ／ＣＢｈプロモータのヌクレオチド配列Ｎｏ．２
ＡＧＡＴＧＴＡＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＧＴＡＡＧＧＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＣＣＡＴＴＴＡＣＣＧＴＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＧＧＧＧＧＣＧＴＡＣＴＴＧＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＡＣＴＧＣＣＡＡＧＴＧＧＧＣＡＧＴＴＴＡＣＣＧＴＡＡＡＴＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＴＡＴＧＧＧＡＡＣＡＴＡＣＧＴＣＡＴＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＧＴＣＧＴＴＧＧＧＣＧＧＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＣＣＡＴＴＴＡＣＣＧＴＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＴＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＧＣＴＡＴＧＡＡＣＴＡＡＴＧＡＣＣＣＣＧＴＡＡＴＴＧＡＴＴＡＣＴＡＴＴＡＡＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＡＡＧＡＧＧＴＡＡＧＧＧＴＴＴＡＡＧＧＧＡＴＧＧＴＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＧＴＴＴＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＴＴＴＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＡＡＴＣＡＣＴＴＧＧＴＴＴＴＡＧＧＴＴＧＧ
配列番号２７ ＪｅＴプロモータのヌクレオチド配列
ＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＧＧＡＧＴＴＡＧＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＧＴＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＧＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＧＡＡＣＧＣＣＧＡＴＧＡＴＴＡＴＡＴＡＡＧＧＡＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴＡＧＴＴＣＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＧＧＧＡＴＴＴＧＧＧＴＣＧＣＧＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴＣＧＴＣＡＣＴＴＧＡＣＡ
配列番号２８ ヒト成長ホルモンポリＡのヌクレオチド配列
ＡＣＧＧＧＴＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＴＧＣＣＡＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＴＴＧＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＴＡＡＧＴＴＧＣＡＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＴＧＡＣＴＡＧＧＴＧＴＣＣＴＴＣＴＡＴＡＡＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＧＴＧＧＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＡＧＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧＴＡＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＧＴＣＴＡＴＴＧＧＧＡＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＡＡＴＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＧＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＡＴＴＣＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＡＧＡＧＡＣＧＧＧＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＡＡＴＣＴＣＡＧＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＣＡＣＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＴＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＴＧＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＴＡＧＧＴＡＡＣＣＡＣＧＴＧＣＧＧＡＣＣＧＡ
配列表４、９ ＜２２３＞組換え構築物
配列表１１ ＜２２３＞ヒトＧＢＡ１をコードするヌクレオチド配列（ＩＤＴ最適化配列）
配列表１２ ＜２２３＞ヒトＧＢＡ１をコードするヌクレオチド配列（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ最適化配列）
配列表１４ ＜２２３＞ＡＡＶ ＴＴキャプシドタンパク質
配列表１５ ＜２２３＞ＡＡＶ２のフリップＩＴＲ
配列表１６ ＜２２３＞ＡＡＶ２のフロップＩＴＲ
配列表１９ ＜２２３＞ヒトＧＢＡ１遺伝子バリアント
配列表２０ ＜２２３＞ｎＧＵＳＢプロモータＮｏ．２
配列表２１ ＜２２３＞ＣＡＧプロモータＮｏ．２
配列表２２ ＜２２３＞ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモータの短いバージョン
配列表２３ ＜２２３＞ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモータの長いバージョン
配列表２４ ＜２２３＞ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモータ
配列表２５、２６ ＜２２３＞ＣＢＡ／ＣＢｈプロモータ
配列表２７ ＜２２３＞ＪｅＴプロモータのヌクレオチド配列
配列表２８ ＜２２３＞ヒト成長ホルモンポリＡのヌクレオチド配列

Claims (34)

  1. グルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子を含む核酸構築物を含むウイルス粒子。
  2. 前記導入遺伝子が、
    ａ）配列番号１、７、１１、１２および１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または
    ｂ）ヒトグルコセレブロシダーゼをコードするヌクレオチド配列であって、ヒトグルコセレブロシダーゼが配列番号５、６、８、１７または１８を含む、ヌクレオチド配列
    を含む、請求項１に記載のウイルス粒子。
  3. 前記核酸構築物が、前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータをさらに含み、前記プロモータが、好ましくは、少なくとも黒質緻密部（ＳＮｃ）の神経細胞およびミクログリア細胞における前記導入遺伝子の発現を可能にする、請求項１または２に記載のウイルス粒子。
  4. 前記プロモータが遍在性プロモータ、特に配列番号２または２０を含むかまたはそれからなるＧｕｓＢプロモータ、配列番号９または２１を含むかまたはそれからなるＣＡＧプロモータ、配列番号２７を含むかまたはそれからなるＪｅＴプロモータ、および配列番号１３を含むかまたはそれからなるｈＳｙｎプロモータからなる群より選択されるプロモータである、請求項３に記載のウイルス粒子。
  5. 少なくともニューロンおよびミクログリア細胞を同時に標的とする、請求項１～４のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  6. 少なくとも黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンおよびミクログリア細胞を同時に標的とする、請求項１～５のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  7. 好ましくはＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＭＮＭ００４、ＡＡＶ－ＭＮＭ００８およびＡＡＶ ＴＴからなる群より選択されるキャプシドタンパク質を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である、請求項１～６のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  8. 好ましくは配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と少なくとも９８．５％、好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有する配列を含むＡＡＶ ＴＴキャプシドタンパク質を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  9. 前記核酸構築物が、ポリアデニル化シグナル配列、好ましくは配列番号２８または３、より好ましくは配列番号２８を含むポリアデニル化シグナル配列をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  10. 前記核酸構築物が、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、より好ましくは配列番号１５および／もしくは１６の配列または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含むウイルスベクターに含まれる、請求項１～９のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  11. 前記ウイルスベクターが、配列番号４または配列番号４と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  12. 前記核酸構築物が、プロモータの制御下でヒトグルコセレブロシダーゼのコード配列を含み、少なくともドーパミン作動性ニューロンおよびミクログリア細胞の両方における前記ヒトグルコセレブロシダーゼの発現を可能にする核酸構築物であり、前記ウイルス粒子は、少なくとも黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンおよびミクログリア細胞を標的とするウイルス粒子、典型的にはＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９からなる群より選択されるキャプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子の中から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  13. 前記核酸構築物が、プロモータの制御下でヒトグルコセレブロシダーゼのコード配列を含み、少なくともドーパミン作動性ニューロンおよびミクログリア細胞の両方、好ましくは少なくとも黒質緻密部および大脳皮質のニューロンにおける前記ヒトグルコセレブロシダーゼの発現を可能にする核酸構築物であり、前記ウイルス粒子は、逆行性輸送を伴うウイルス粒子、典型的にはＡＡＶ－ＭＮＭ００４、ＡＡＶ－ＭＮＭ００８およびＡＡＶ－ＴＴからなる群より選択されるＡＡＶｒｅｔｒｏキャプシドタンパク質を含むウイルス粒子の中から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  14. 前記ウイルス粒子が、
    ａ）ヒトグルコセレブロシダーゼをコードする導入遺伝子であって、配列番号１９またはヒトグルコセレブロシダーゼをコードする配列を含み、ヒトグルコセレブロシダーゼが配列番号５または８を含む、導入遺伝子；
    ｂ）前記導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモータであって、好ましくは少なくとも黒質緻密部（ＳＮｃ）の神経細胞およびミクログリア細胞における前記導入遺伝子の発現を可能にし、好ましくは配列番号９もしくは２１を含むかもしくはそれからなるＣＡＧプロモータ、または配列番号２もしくは２０を含むかもしくはそれからなるＧｕｓＢプロモータ、または配列番号２７を含むかもしくはそれからなるＪｅＴプロモータ、または配列番号１３を含むかもしくはそれからなるｈＳｙｎプロモータである、プロモータ；
    ｃ）ポリアデニル化シグナル配列であって、好ましくは配列番号２８または３、好ましくは配列番号２８を含むポリアデニル化シグナル配列；
    を含む核酸構築物を含み、前記ウイルス粒子は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子、好ましくはＡＡＶ ＴＴのキャプシドタンパク質を含み、より好ましくは配列番号１４または配列番号１４と少なくとも９８．５％、好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有する配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であり、前記核酸構築物が、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、好ましくはアデノ随伴ウイルスの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、より好ましくはＡＡＶ２血清型由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列をさらに含むウイルスベクターに含まれ、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列の各々が、独立して、配列番号１５もしくは１６の配列または配列番号１５および／もしくは１６と少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなり、好ましくは５’ＩＴＲが配列番号１５を含み、３’ＩＴＲが配列番号１６を含む、請求項１～１１または１３のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  15. 逆行性輸送が可能なキャプシドタンパク質（ＡＡＶｒｅｔｒｏ）を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  16. インビボ播種アッセイで決定される、非ヒト霊長動物の尾状核または被殻核への実質注入後に大脳皮質、好ましくは少なくとも黒質緻密部および大脳皮質における播種が可能である、請求項１５に記載のウイルス粒子。
  17. ａ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶを、実質内注入によって非ヒト霊長動物の交連後被殻に注入する工程、および
    ｂ）注入の約１ヶ月後に、大脳皮質、好ましくは尾状被殻核を神経支配する脳領域においてＧＦＰを発現するニューロンの数を計測する工程
    を含む、インビボ播種アッセイ。
  18. 大脳皮質、好ましくは尾状被殻核を神経支配する脳領域においてＧＦＰを発現するニューロンの数を、非ヒト霊長動物の交連後被殻に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする導入遺伝子を含むＡＡＶ－ＴＴを実質内注入によって注入することによって実施される対照実験と比較する工程ｃ）をさらに含む、請求項１７に記載のインビボ播種アッセイ。
  19. 大脳皮質、好ましくは少なくとも黒質緻密部および大脳皮質に、請求項１７～１８のいずれか一項に記載のインビボ播種アッセイで決定されるＡＡＶ－ＴＴと少なくとも同じレベルまで播種することができるＡＡＶｒｅｔｒｏの中から選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  20. 前記ＡＡＶｒｅｔｒｏが、ＡＡＶ－ＭＮＭ００４、ＡＡＶ－ＭＮＭ００８およびＡＡＶ－ＴＴからなる群より選択される、請求項１～１６および１９のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  21. 好ましくは配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と少なくとも９８．５％、好ましくは９９％もしくは９９．５％の同一性を有する配列を含むＡＡＶ ＴＴキャプシドタンパク質を含む、請求項１～１６または１９～２０のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  22. 治療に使用するための、請求項１～１６または１９～２１のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  23. シヌクレイノパチーの治療を必要とする対象において遺伝子療法によってシヌクレイノパチーを治療するのに使用するための、請求項１～１６または１９～２１のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  24. 前記シヌクレイノパチーがヒト孤発性シヌクレイノパチーである、請求項２３に記載の使用のためのウイルス粒子。
  25. 前記シヌクレイノパチーがパーキンソン病、典型的には孤発性パーキンソン病である、請求項２３または２４に記載の使用のためのウイルス粒子。
  26. 治療される前記対象が、進行期のシヌクレイノパチー、典型的には少なくともＨ－Ｙステージ３のパーキンソン病を有する患者の中から選択される、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の使用のためのウイルス粒子。
  27. 前記シヌクレイノパチーが、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＶＰＳ３５、ＧＣＨ１、ＡＴＸＮ２、ＤＮＡＪＣ１３、ＴＭＥＭ２３０、ＧＩＧＹＦ２、ＨＴＲＡ２、ＲＩＣ３、ＥＩＦ４Ｇ１、ＵＣＨＬ１、ＣＨＣＨＤ２、ＧＢＡ１、ＰＲＫＮ、ＰＩＮＫ１、ＤＪ１、ＡＴＰ１３Ａ２、ＰＬＡ２Ｇ６、ＦＢＸＯ７、ＤＮＡＪＣ６、ＳＹＮＪ１、ＳＰＧ１１、ＶＰＳ１３Ｃ、ＰＯＤＸＬ、ＰＴＲＨＤ１、ＲＡＢ３９Ｂ、ＤＮＡＪＣ１３、ＴＭＥＭ２３０、ＧＩＧＹＦ２、ＨＴＲＡ２、ＲＩＣ３、ＥＩＦ４Ｇ１、ＵＣＨＬ１、およびＣＨＣＨＤ２からなる群より選択される遺伝子における少なくとも１つの突然変異に関連しない、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の使用のためのウイルス粒子。
  28. 好ましくは黒質緻密部および／または尾状被殻核の脳領域に、実質内投与によって前記対象に投与される、請求項２３～２７のいずれか一項に記載の使用のためのウイルス粒子。
  29. 神経障害性ゴーシェ病の治療に使用するための、請求項１～１６または１９～２１のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
  30. シヌクレイノパチー、好ましくはパーキンソン病、より具体的には孤発性パーキンソン病を、その治療を必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量の請求項１～１６または１９～２１のいずれか一項に記載のウイルス粒子を前記対象に投与することを含む方法。
  31. 治療される前記対象が、進行期のシヌクレイノパチー、典型的には少なくともＨ－Ｙステージ３のパーキンソン病を有する患者の中から選択される、請求項３０に記載のシヌクレイノパチーを治療する方法。
  32. 前記シヌクレイノパチーが、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＶＰＳ３５、ＧＣＨ１、ＡＴＸＮ２、ＤＮＡＪＣ１３、ＴＭＥＭ２３０、ＧＩＧＹＦ２、ＨＴＲＡ２、ＲＩＣ３、ＥＩＦ４Ｇ１、ＵＣＨＬ１、ＣＨＣＨＤ２、ＧＢＡ１、ＰＲＫＮ、ＰＩＮＫ１、ＤＪ１、ＡＴＰ１３Ａ２、ＰＬＡ２Ｇ６、ＦＢＸＯ７、ＤＮＡＪＣ６、ＳＹＮＪ１、ＳＰＧ１１、ＶＰＳ１３Ｃ、ＰＯＤＸＬ、ＰＴＲＨＤ１、ＲＡＢ３９Ｂ、ＤＮＡＪＣ１３、ＴＭＥＭ２３０、ＧＩＧＹＦ２、ＨＴＲＡ２、ＲＩＣ３、ＥＩＦ４Ｇ１、ＵＣＨＬ１、およびＣＨＣＨＤ２からなる群より選択される遺伝子における少なくとも１つの突然変異に関連しない、請求項３０または３１に記載のシヌクレイノパチーを治療する方法。
  33. 前記ウイルス粒子が、好ましくは黒質緻密部および／または尾状被殻核の脳領域に、実質内投与によって前記対象に投与される、請求項３０～３２に記載のシヌクレイノパチーを治療する方法。
  34. 神経障害性ゴーシェ病を、その治療を必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量の請求項１～１６または１９～２１のいずれか一項に記載のウイルス粒子を前記対象に投与することを含む方法。
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