CN114786694A - 用于通过基因疗法治疗诸如帕金森病的突触核蛋白病变的病毒颗粒 - Google Patents

用于通过基因疗法治疗诸如帕金森病的突触核蛋白病变的病毒颗粒 Download PDF

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Abstract

本公开内容涉及用于通过基因疗法治疗突触核蛋白病变、特别是偶发性帕金森病的病毒颗粒。更具体而言，本公开内容涉及用于在有需要的受试者中通过基因疗法治疗突触核蛋白病变的病毒颗粒，所述病毒颗粒包含核酸构建体，其包括编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因。

Description

用于通过基因疗法治疗诸如帕金森病的突触核蛋白病变的病 毒颗粒
技术领域
本公开内容涉及包含含有编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因的核酸构建体的病毒颗粒及其通过基因疗法在治疗突触核蛋白病变、特别是治疗偶发性帕金森病中的用途。
背景技术
帕金森病(PD)是一种无情的神经退化性疾病，其特征为在称为黑质致密部(substantia nigra pars compacta，SNc)的脑部区域中丧失产生多巴胺的神经元。由于此种神经元丧失，脑中的多巴胺水平逐渐下降。降低的多巴胺水平诱发基底神经节回路的功能异常，导致PD的典型主症(颤抖、僵硬、运动迟缓和姿势不稳定)出现。目前，可使用药物治疗(左旋多巴和多巴胺激动剂)和外科治疗(深度脑部刺激)，这些治疗在减轻动作型症状上展现出高的功效。然而，帕金森病是一种一般性神经退化性疾病，其中SNc先受影响，但不限于此。现有的疗法仅为多巴胺对症治疗，对于减缓疾病进展没有任何影响。
PD和相关的突触核蛋白病变大多为偶发性脑部疾病(也称为特发性疾病；占经诊断患者的超过90-95％)。仅在少部分患者中遗传背景得到阐明(家族病例)。在涉及这些突触核蛋白病变的出现的基因突变(LRRK2、SNCA、PARKIN、DJ-1等)之中，在GBA1基因(位于染色体1并编码称为葡萄糖脑苷脂酶的溶酶体酶)中的突变是至今最多的，而实际上Sidransky和其同事已清楚证明纯和和杂合GBA1突变与PD和路易体失智症(DLB)的发生增加之间的直接基因关联(Sidransky E等人,N Engl J Med 2009；361:1651-1661)，其中PD的优势比为5.43。GBA1突变与路易体失智症的关联甚至更强于PD(优势比(odds ratio)为8.28)。GBA1突变使发展PD和DLB的风险增加20至30倍，而GBA1突变与多发性系统退化症(MSA)之间的关联仍更具争议。GBA1突变与突触核蛋白病变之间这种直接关联的存在是联系葡萄糖脑苷脂酶(GCase)缺乏与PD和DLB的出现的强力的论据。然而，就涉及GCase-α-突触核蛋白途径的机制而言，如何精确地将α-突触核蛋白的降解、聚集以及亚细胞加工和GCase活性结合在一起在有限的实验证据的领域中仍为未决问题。
至今，已提出联系GCase缺乏与α-突触核蛋白的三种主要的假说：一、因错误折叠的GCase(例如因GBA1突变而错误折叠)而引起的功能获得造成其与α-突触核蛋白的直接相互作用，最终导致α-突触核蛋白聚集和累积；二、GCase的功能丧失(因错误折叠的酶的降解而引起的GCase缺乏)导致底物(葡萄糖脑苷脂)累积，其进而干扰脂质稳态并随后影响α-突触核蛋白运输、加工和清除。这最终促进α-突触核蛋白聚集并促使寡聚物形成；三、双向反馈回路，其中GCase缺乏促使α-突触核蛋白寡聚物形成，这些寡聚物导致正常的GCase活性进一步降低，其进而促进额外α-突触核蛋白寡聚物的形成。
推测5-10％的PD患者具有GBA1突变。对于PD患者的该亚组，GBA1突变的存在诱发严重的GCase功能丧失(残留的GCase活性剩下不超过正常水平的15％)。此GCase功能丧失引发α-突触核蛋白聚集(通过一些未知的机制)，最终导致神经元死亡。值得注意的是，对于患有偶发性PD和DLB的患者而言，尽管至今只有极少的实验证据并且此关联的最终基础仍为难以捉摸，但已推测α-突触核蛋白本身的聚集(例如在不存在GBA1突变的情况下)可能也诱发GCase功能丧失(Gegg ME等人,Ann Neurol 2012；72:455-463；Murphy KE等人,Brain2014；137:834-848；Alcalay RN等人,Brain 2015；138:2648-2658；Parnetti L等人,MovDisord 2014；29:1019-1027)。
换言之，对于重组酶的全身性递送而言，在临床前研究中，在偶发性突触核蛋白病变中提升GCase活性的潜在可用性仍待证实。
尝试至少在GBA1突变相关患者中降低α-突触核蛋白负荷中增强GCase活性已在某种程度上进行了研究。直接补充重组GCase酶(GCase置换疗法)是在戈谢病中成功的治疗方法(Weinreb NJ等人,Am J Med 2002；113-112-119；Connock M等人,Health TechnolAssess 2006；10:iii-iv,ix-136)。已证明全身性递送的重组GCase定位至溶酶体并上调酶活性。然而，此方法在神经退化性疾病方面的限制在于GCase可能无法以显著浓度跨越血脑屏障而改变GCase的脑中活性。替代方法为直接椎内施用重组GCase(Brady RO,Yang C,Zhuang Z.J Inherit Metab Dis 2013；36:451-454；LeBowitz J.A Proc Natl Acad SciUSA 2015；102:14485-14486)。然而，对于椎内施用的GCase提供足够的浓度梯度以渗透深入神经元组织中的能力仍存有疑问。
其他方法则侧重于在GBA1突变携带者中作为PD的致病机制的葡萄糖神经酰胺累积(Sardi SP等人,Proc Natl Acad Sci USA 2013；110:3537-3542)。在突触核蛋白过表达细胞系中GCase底物抑制似乎使α-突触核蛋白水平降低(Sardi SP等人,Proc Natl AcadSci USA 2013；110:3537-3542)。此外，尽管在其功效和副作用谱方面存有担忧，但美格鲁特(葡萄糖神经酰胺合成酶的可逆抑制剂)已用于III型戈谢病方面。其他两种葡萄糖神经酰胺合成酶抑制剂(eliglustat和venglustat)则正在戈谢病(ClinicalTrials.gov识别码NCT00891202)和PD(ClinicalTrials.gov识别码NCT02906020)的临床试验中进行评估。
GCase伴侣蛋白也用于促进GCase从ER运输到溶酶体。Isofagomine为首先被测试的伴侣蛋白，但此化合物的临床试验在戈谢病方面并不成功，可能因为以下事实：此伴侣蛋白以太高的亲和力结合GCase的活性位点，因此抑制在溶酶体中的酶活性。为了规避此问题，目前正在开发许多新的非抑制性GCase小分子伴侣蛋白作为在PD中可能的神经保护剂(Mazzuli JR等人,J Neurosci 2016；36:7693-7706)。目前，在PD中最有可能的GCase小分子伴侣蛋白候选物为ambroxol。在小鼠中，当以ambroxol治疗时，GCase活性增加(Migdalska-Richards A,Daly L,Bezard E,Schapira AH.Ann Neurol 2016；80:766-775)，并且在非人灵长类动物也有相同的结果，但只是在更高的剂量下(Migdalska-Richards A,Ko WKD,Li Q等人Synapse 2017；256:e21967)。PD中ambroxol的两个II期临床试验正在进行中(ClinicalTrials.gov识别码NCT02941822和NCT02914366)。
已报道使用GBA1的基因疗法，但仅在小鼠中。在大鼠中共同注射编码GBA1的腺相关病毒载体与突变的α-突触核蛋白可防止多巴胺能神经元神经退化(Rocha EM等人,Neurobiol Dis 2015；82:495-503)。然而，在此研究中未显示一旦已经发生突触核蛋白病变时AAV-GBA1的有用性。此外，已报道在α-突触核蛋白转基因小鼠中，使用编码GBA1基因的被称为AAV9-PHP.B的血脑屏障(BBB)穿透AAV变体造成小鼠整个脑中的α-突触核蛋白聚集体的几乎完全清除(Morabito G等人,Mol Ther 2017；25:2727-2742)。然而，作者在此研究中使用的转基因α-syn小鼠缺乏足够的PD样表型。此外，已证明AAV9-PHP.B仅在特定小鼠品系中有作用，并且AAV9-PHP-B并不跨越狨猴的血脑屏障。
仍需要适用于治疗人受试者的偶发性帕金森病的采用GBA1的基因疗法。
具体而言，对于偶发性PD的改善疾病的疗法应受到GCase活性的病毒介导的增强在疾病初期和晚期均诱发黑质致密部(SNc)的多巴胺能神经元中α-突触核蛋白聚集体的清除的原理验证支持，以及证实聚集的α-突触核蛋白的GCase驱动的清除对于多巴胺能神经元为具有神经保护作用并且阻碍α-突触核蛋白的跨神经元通道(朊病毒样扩散)。此外，对于偶发性PD的改善疾病的疗法也应受到由α-突触核蛋白聚集触发的促发炎现象的减轻的支持。
本发明提供用于GCase活性的病毒介导的增强的病毒颗粒，其用于在处于疾病晚期的患者中治疗帕金森病的基因疗法，其中在整个脑中、尤其是涉及大脑皮质处存在广泛的突触核蛋白病变。
概述
如在偶发性帕金森病的非人灵长类动物模型中所证实的，本发明人已设计出满足上述需要的治疗策略。
因此，本发明涉及包含包括编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因的核酸构建体的病毒颗粒及其在有需要的受试者中通过基因疗法治疗突触核蛋白病变的用途。
在一个实施方案中，所述转基因包含：a)选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19的核苷酸序列，或者b)编码人葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列，其中人葡萄糖脑苷脂酶包含SEQ IDNO：5、6、8、17或18。在具体实施方案中，所述核酸构建体还包含可操作地连接至编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因的启动子，并且其中所述启动子使所述转基因至少在黑质致密部(SNc)的神经细胞和小神经胶质细胞中表达；并且优选也在其他脑区域的神经细胞中表达，其他脑区域至少包括黑质致密部、大脑皮质、杏仁核和丘脑的尾椎板内核。通常，所述核酸构建体可包含编码在普遍存在的启动子的控制下的转基因，所述普遍存在的启动子例如为GusB启动子，尤其是包含或由SEQ ID NO：2或20组成的启动子、包含或由SEQ ID NO：27组成的JeT启动子、包含或由SEQ ID NO：9或21组成的CAG启动子或包含或由SEQ ID NO：13组成的人突触蛋白1(hSyn)启动子。
在具体实施方案中，所述病毒颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白选自至少同时靶向神经细胞和小神经胶质细胞的病毒颗粒。更具体而言，病毒颗粒选自至少同时靶向黑质致密部中的多巴胺能神经元和小神经胶质细胞的病毒颗粒。
在某些实施方案中，所述病毒颗粒选自rAAV颗粒，优选rAAV颗粒包括选自AAV2、AAV5、AAV9、AAV-MNM004、AAV-MNM008和AAV TT血清型的衣壳蛋白。
在更具体的实施方案中，所述病毒颗粒包括AAV TT衣壳蛋白，优选其包含SEQ IDNO：14的序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99或99.5％同一性的序列。在优选实施方案中，病毒颗粒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含：
a)编码人葡萄糖脑苷脂酶的转基因；其中所述转基因包含SEQ ID NO：19的序列或编码人葡萄糖脑苷脂酶的序列，其中人葡萄糖脑苷脂酶包含SEQ ID NO：5或8；
b)可操作地连接至所述转基因的启动子，并且其中所述启动子优选使转基因至少在黑质致密部(SNc)的神经细胞和小神经胶质细胞中表达；其中所述启动子优选为包含SEQID NO：9或21的CAG启动子、包含SEQ ID NO：2或20的GusB启动子、包含SEQ ID NO：27的JeT启动子或包含SEQ ID NO：13的hSyn启动子；
c)多腺苷酸化信号序列，优选为包含SEQ ID NO：28或3、优选SEQ ID NO：28的多腺苷酸化信号序列；
其中所述病毒颗粒是重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，优选包含AAV TT的衣壳蛋白，并且更优选包含SEQ ID NO：14的序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的序列；其中所述核酸构建体包含在病毒载体中，所述病毒载体还包含5'ITR和3'ITR序列，优选为腺相关病毒的5'ITR和3'ITR序列，更优选来自AAV2血清型的5'ITR和3'ITR序列，其中5'ITR和3'ITR序列各自独立地包含或由SEQ IDNO：15或16的序列或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列组成，其中优选5'ITR包含SEQ ID NO：15的序列并且3'ITR包含SEQ ID NO：16的序列。在某些实施方案中，病毒颗粒包含选自具有逆向运输的病毒变异血清型的病毒衣壳蛋白(AAVretro)。
通常，如体内散布测定所确定的，在非人灵长类动物的尾状核或壳核进行实质内注射后，所述AAVretro可逆行地散布于大脑皮质，优选至少散布至黑质致密部和大脑皮质。有利地，注射于非人灵长类动物的尾状-壳核的AAVretro也可逆行地散布至神经支配尾状-壳核的其他脑区域，至少包括黑质致密部、大脑皮质、杏仁核和丘脑的尾椎板内核。在另一方面，本公开内容涉及一种体内散布测定，其包括以下步骤：
a)通过rAAV-GFP的实质内注射，将包含编码绿色荧光蛋白(GFP)的转基因的测试rAAV(rAAV-GFP)注射至非人灵长类动物的连合后壳核(post-commissural putamen)，以及
b)在注射后约一个月，计数在大脑皮质中(优选在神经支配尾状壳核的脑区域中，更具体而言，至少在黑质致密部、大脑皮质、杏仁核和丘脑的尾椎板内核中)表达GFP的神经元的数量。
在其他实施方案中，所述体内散布测定还包括步骤c)：与使用AAV-TT-GFP进行的实验组比较在大脑皮质中、优选在神经支配尾状壳核的脑区域中被标记的神经元的百分比。
在某些实施方案中，根据本公开内容的病毒颗粒有利地选自能够散布于大脑皮质，优选至少散布至黑质致密部和大脑皮质，并且至少达到与在如上述体内散布测定所确定的AAV-TT相同的水平的AAVretro颗粒。
在具体实施方案中，AAVretro衣壳蛋白选自以下变异血清型：AAV-MNM004、AAV-MNM008和AAV-TT。
在更具体的实施方案中，所述AAVretro颗粒包括AAV TT血清型衣壳蛋白，优选其包含SEQ ID NO：14的序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的序列。
在具体实施方案中，所述核酸构建体还包含多腺苷酸化信号序列，特别是序列SEQID NO：3的多腺苷酸化信号序列。
在具体实施方案中，所述核酸构建体包含在病毒载体中，所述病毒载体还包含5'ITR和3'ITR序列，优选是腺相关病毒的5'ITR和3'ITR序列，更优选是来自AAV2血清型的5'ITR和3'ITR序列，其包含或由SEQ ID NO：15和/或16的序列或具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列组成。
在具体实施方案中，所述核酸构建体包含SEQ ID NO：4的核酸序列或具有与SEQID NO：4至少80％或至少90％同一性的核酸序列。
在具体的实施方案中，所述核酸构建体包含在启动子的控制下的人葡萄糖脑苷脂酶的编码序列，使所述人葡萄糖脑苷脂酶至少在多巴胺能神经元和小神经胶质细胞两者中表达，并且所述病毒颗粒选自至少靶向黑质致密部中的多巴胺能神经元和小神经胶质细胞的病毒颗粒，通常包括选自AAV2、AAV5、AAV9、AAV-MNM004、AAV-MNM008和AAV TT血清型的衣壳蛋白的AAV颗粒。
在另一方面，本公开内容涉及如上所述的病毒颗粒在治疗、优选在有需要的受试者中通过基因疗法治疗突触核蛋白病变中的用途。
在具体实施方案中，所述突触核蛋白病变是人偶发性突触核蛋白病变。在具体的实施方案中，所述突触核蛋白病变不与选自LRRK2、SNCA、VPS35、GCH1、ATXN2、DNAJC13、TMEM230、GIGYF2、HTRA2、RIC3、EIF4G1、UCHL1、CHCHD2、GBA1、PRKN、PINK1、DJ1、ATP13A2、PLA2G6、FBXO7、DNAJC6、SYNJ1、SPG11、VPS13C、PODXL、PTRHD1、RAB39B、DNAJC13、TMEM230、GIGYF2、HTRA2、RIC3、EIF4G1、UCHL1和CHCHD2的基因中的至少一个突变相关。优选地，所述突触核蛋白病变是帕金森病，通常是偶发性帕金森病。
在具体实施方案中，当使用根据本公开内容的治疗方法的AAVretro病毒颗粒时，待治疗的所述受试者选自患有晚期突触核蛋白病变、通常是至少H-Y 3期帕金森病的患者。
所述病毒载体可优选通过实质内施用、更优选施用至黑质致密部和/或尾状壳核的脑区域施用至所述受试者。
在另一方面，本公开内容还涉及如上所述的病毒颗粒在治疗神经性戈谢病中的用途。
附图简要说明
图1为AAV-TT衣壳蛋白序列与AAV-2的氨基酸序列比对。
图2为AAV-TT衣壳蛋白序列与AAV-9的氨基酸序列比对。
图3为概述在小鼠中进行的实验方法的示意图。
图4为蛋白印迹的照片，显示在分别具有接受rAAV9-null(没有转基因)和rAAV9-GBA1颗粒的左和右SNc中的GCase(左图)和α-突触核蛋白(右图)的蛋白质水平。所获得的结果显示GCase表达造成α-突触核蛋白减少。
图5为显示在SNc中TH+神经元的神经密度的无偏倚立体估计的直方图。所获得的结果显示在AAV-GBA1介导的GCase酶活性的增强下α-突触核蛋白的清除对多巴胺能神经元诱发明显的神经保护作用。
图6为概述在非人灵长类动物(NHP)中用rAAV2/9-GBA1(在第一实施例中也称为rAAV9)(注射至左SNc)进行的实验方法的示意图。
图7显示在连合后壳核和尾状核的水平拍摄的脑部冠状切片，作为所获得的关于被注射rAAV9-GBA1至左SNc的NHP的microPET扫描的代表影像。
图8为在被注射rAAV9-GBA1至左SNc的4个NHP的SNc中进行TH+神经元的密度的无偏倚立体估计之后所获得的结果的直方图。在一个动物中进行定量。在rAAV9-SynA53T递送的3个月后有38.1％的SNc神经元死亡，对比在左SNc(即，以rAAV9-GBA1治疗的)中观察到有14.9％的神经元死亡。
图9为概述所进行的实验计划的示意图。
图10为通过显示磷酸化的α-突触核蛋白的免疫组织化学检测的纹状体和大脑皮质，从小鼠脑部的冠状切片拍摄的显微照片。在位于注射有AAV2-retro-GBA1(GusB启动子)的纹状体同侧的大脑皮质中，看到在大脑皮质的水平中的α-突触核蛋白负荷明显降低。相较于右大脑皮质，即首先以AAV2-retro-SynA53T处理再以AAV2-retro-null(GusB启动子)处理的大脑侧，观察到明显差异。所获得的数据支持编码GBA1基因的逆向散布的病毒载体在治疗散布性突触核蛋白病变中的用途。
图11为概述在非人灵长类动物(NHP)中用rAAV-TT-GBA1(注射至左连合后壳核)进行的实验方法的示意图。
图12显示在连合后壳核和尾状核的水平拍摄的脑部冠状切片，作为所获得的关于被注射rAAV-TT-GBA1至连合后壳核的NHP的microPET扫描的代表影像(上图)。平均地，在左连合后壳核(例如注射有rAAV-TT-GBA1的)观察到11C-DTBZ的结合潜力增加24.44％(下图)。
图13为显示在被注射rAAV-TT-GBA1至左连合后壳核的4个NHP的SNc中进行TH+神经元的自动计数之后所获得的结果的直方图。在4个NHP中进行定量，显示在左SNc的TH+神经元的总数相较于在右黑质致密部(例如没有以rAAV-TT-GBA1的壳核内递送处理的)所观察到的TH+神经元的数量高22.3％。*表示统计显著性p<0.05。
图14为显示在被注射rAAV-TT-GBA1至左连合后壳核的4个NHP的左和右连合后壳核中TH染色的光密度(OD)的自动计数之后所获得的结果的直方图。定量分析显示右连合后壳核的平均OD比左连合后壳核低27.42％(后者为以rAAV-TT-GBA1的壳核内递送处理的)。***表示统计显著性p<0.001。
图15为显示在被注射rAAV-TT-GBA1至左连合后壳核的4个NHP的SNc中表达α-突触核蛋白的神经元的数量的自动计数之后所获得的结果的直方图。在4个非人灵长类动物中进行定量，显示在左黑质致密部中表达α-突触核蛋白的神经元的总数比在右黑质致密部(例如没有以rAAV-TT-GBA1的壳核内递送处理的)中观察到的α-突触核蛋白阳性神经元的数量低38.3％。*表示统计显著性p<0.05，**表示统计显著性p<0.001，***表示统计显著性p<0.001。ns：无统计显著性。
图16为显示在受试动物的左相对右SNc中TH+(黑条)和a-Syn+神经元(白条)之间的比较中的差异的直方图。百分比表示a-Syn+神经元在TH+神经元中的百分比。在左SNc(例如位于被注射AAV-TT-GBA1的连合后壳核同侧的)中表达α-突触核蛋白的神经元的百分比始终低于在右SNc中(未处理侧)。这不仅显示在左SNc中的神经元存活较高，并且显示存活的TH+神经元中较少的为a-Syn+。
图17为显示在心室造影辅助的立体定位手术中所有AAV的注射位置的矢状Rx切面。
图18为显示所有AAV的注射位置的代表显微照片。
图19为示出所有动物的注射位置以及GFP+神经元的准确位置的示意图(A：M295和296，B：297和298)。
图20为在动物M295(A)和M296(B)(注射有AAV-TT-GFP)中GFP+神经元的估计强度和生物分布。小号点(标记为“低”)表示1至200个GFP+细胞，中号点(标记为“中”)表示201至400个GFP+细胞，大号点(标记为“高”)表示超过401个GFP+细胞。
图21为在动物M297(A)和M298(B)(注射有AAV-9-GFP)中GFP+神经元的估计强度和生物分布。小号点(标记为“低”)表示1至200个GFP+细胞，中号点(标记为“中”)表示201至400个GFP+细胞，大号点(标记为“高”)表示超过401个GFP+细胞。
图22为显示所有动物的GFP+神经元的总数的定量直方图。
图23为显示多个感兴趣的区域中所有动物的GFP+神经元的数量的定量直方图。缩写：前扣带回(AcGg)、额上回(SFG)、中枢前回(PrG)、中枢后回(PoG)、岛回(Ing)、中央-束旁复合体(CM-Pf)、黑质致密部(SNc)。
图24为显示左半球的多个感兴趣的区域中所有动物的GFP+神经元的头尾间分布的定量图。缩写：前扣带回(AcGg)、额上回(SFG)、中枢前回(PrG)、中枢后回(PoG)、岛回(Ing)、中央-束旁复合体(CM-Pf)、黑质致密部(SNc)。
图25为显示右半球的多个感兴趣的区域中所有动物的GFP+神经元的头尾间分布的定量图。缩写：前扣带回(AcGg)、额上回(SFG)、中枢前回(PrG)、中枢后回(PoG)、黑质致密部(SNc)。
图26为所进行的实验的工作计划。
图27为在基线和在注射AAV9-SynA53T后4、8和12周使用11C-DTBZ进行的MicroPET扫描。通过包含连合后壳核的整个头尾间范围的感兴趣的区域(其通常包含在5至9个不同切片之间所涵盖的范围)计算放射性示踪剂结合潜力的值。
图28为显示当单独考虑时两个动物组以及每个动物的平均OD值的直方图。还包含在连合后壳核的水平所拍摄的代表显微照片。
图29为示出通过连合后壳核的头尾间范围(从更靠近前端的0至更靠近尾端的12)所观察到的OD的改变的图。比较左相对右壳核(例如分别以编码GBA1的载体处理的侧相对未处理的侧)的OD差异以阴影区域(对应注射AAV-tt-GBA1或AAV9-GBA1的动物)示出。
图30为显示当单独考虑时两个动物组以及每个动物的TH+细胞数的直方图。当以每个动物组为整体考虑时，左相对右黑质的平均值具有统计显著性。还包含在左和右黑质的水平所拍摄的代表显微照片，以便以更视觉的方式说明进行
Figure BDA0003546518920000121
的分析。
图31为示出通过黑质的头尾间范围(从更靠近前端的0至更靠近尾端的14)所观察到的TH+细胞数的改变的图。在比较左相对右黑质(例如分别为与注射编码GBA1的载体同侧的侧相对未注射的侧)时所观察到的差异以阴影区域(对应注射AAV-TT-GBA1或AAV9-GBA1的动物)示出。
图32为显示当单独考虑时两个动物组以及每个动物的α-syn+细胞数的直方图。当以每个动物组为整体考虑时，左相对右黑质的平均值具有统计显著性。在个体水平上，动物M280、M282和M287(全都以AAV-TT-GBA1处理)也达到统计显著性，而动物M283则没有。对于以AAV9-GBA1注射的动物，仅在动物M286中观察到统计显著性。还包含在左和右黑质的水平所拍摄的代表显微照片，以便以更视觉的方式说明进行
Figure BDA0003546518920000122
的分析。
图33为示出通过黑质的头尾间范围(从更靠近前端的0至更靠近尾端的12)所观察到的α-syn+细胞数量的变化的图。在比较左相对右黑质(例如分别为与注射编码GBA1的载体同侧的侧相对未注射的侧)时所观察到的差异以阴影区域示出(对应注射有AAV-TT-GBA1或AAV9-GBA1的动物)。
图34为示出TH+细胞和α-syn+细胞(分别为TH和SYN)之间所观察到的比例的直方图。
详述
本发明人已确定新的治疗策略以通过基因疗法治疗突触核蛋白病变，更具体为帕金森病，特别是偶发性帕金森病。
因此，本公开内容涉及一种病毒颗粒，以及其在有需要的受试者中通过基因疗法治疗诸如帕金森病或神经性戈谢病的突触核蛋白病变的用途，所述病毒颗粒包含包括编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因的病毒载体或核酸构建体。
如本文所使用的术语“病毒颗粒”涉及有传染性并且通常有复制缺陷的病毒颗粒，其包含包装于衣壳(ii)和任选地(iii)围绕衣壳的脂质包膜中的(i)病毒载体。
术语“病毒载体”通常是指如本文所述的病毒颗粒的核酸部分，其包装于衣壳中。
因此，所述病毒载体通常至少包含(i)核酸构建体，其包括转基因和其在以基因疗法治疗的宿主中表达所需的合适的核酸元件，以及(ii)全部或部分的病毒基因组，例如病毒基因组的反向重复序列。
本文所使用的术语“核酸构建体”是指利用重组DNA技术产生的非自然存在的核酸。特别地，核酸构建体是经修饰而含有核酸序列片段的核酸分子，其以自然界中不存在的方式组合或并置。
本文所使用的术语“转基因”是指编码在基因疗法中作为活性成分的基因产物的核酸分子(或简称核酸)、DNA或cDNA。基因产物可以是RNA、肽或蛋白质。
术语“核酸”和“多核苷酸”或“核苷酸序列”可互换地使用并且是指包含或由单体核甘酸组成的任何分子。核酸可以是寡核苷酸或多核苷酸。核苷酸序列可以是DNA或RNA。核苷酸序列可经化学修饰或为人工的。核苷酸序列包括肽核酸(PNA)、吗啉和锁核酸(LNA)，以及二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些序列因分子主链的变化而各自不同于自然存在的DNA或RNA。并且，也可使用硫代磷酸化核苷酸。其它去氧核苷酸类似物包括甲基膦酸脂、氨基磷酸脂、二硫代磷酸脂、N3'P5'-氨基磷酸脂和寡核糖核苷酸硫代磷酸脂和其2'-0-烯丙基类似物和2'-0-甲基核糖核苷酸甲基膦酸脂，其可用于本公开内容的核苷酸。
本文所使用的术语“反向重复序列(ITR)”是指病毒的位于5'端的核苷酸序列(5'ITR)和位于3'端的核苷酸序列(3'ITR)，其含有回文序列并能够折叠而形成T型发夹结构，其在DNA复制的起始阶段作为引物。它们对于病毒基因组整合至宿主基因组；对于从宿主基因组挽救；以及对于将病毒核酸衣壳化为成熟的病毒粒子也是需要的。在对于载体基因组复制和其包装至病毒颗粒内顺式需要ITR。
本文所使用的术语“包含”不排除其他元件。为了本公开内容的目的，术语“由……组成”被认为是术语“包含”的优选的实施方案。
本文所使用的术语“特别”、“通常”或“具体”可互换地使用并且是指在几个实施方案之中的一个替代者，术语“优选”是指优选的实施方案。
本文所使用的SNc是黑质致密部(SNc)的首字母缩写词。
本公开内容的核酸构建体
根据本公开内容的核酸构建体包括转基因，以及此转基因在通过使用本公开内容的病毒载体的基因疗法来治疗的宿主中表达所需的至少合适的核酸元件。
举例而言，所述核酸构建体包含转基因，转基因由葡萄糖脑苷脂酶的编码序列以及在相关细胞类型或组织中表达所述编码序列所需的一个或多个控制序列组成。一般来说，核酸构建体包含编码序列，以及在编码序列之前的调节序列(5'非编码序列)和在编码序列之后的调节序列(3'非编码序列)，其对于所选的基因产物的表达为必需的。因此，在具体实施方案中，所述核酸构建体至少包含(i)转基因、(ii)启动子和(iii)3’非翻译区，其中转基因编码在启动子的控制下的葡萄糖脑苷脂酶，非翻译区通常含有多腺苷酸化位点和/或转录终止子。核酸构建体也可包含其他调节元件，例如增强子序列、内含子、微RNA靶向序列、有助于在载体中插入DNA片段的多接头序列和/或剪接信号序列。
具体的核酸构建体包含转基因，所述转基因包含选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19的核苷酸序列或者如以下所公开的选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19的核酸序列的一部分，包含这样的具体核酸构建体的载体或颗粒也为本公开内容的一部分。
编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因
具体而言，根据本公开内容的核酸构建体包含编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因，优选编码包含SEQ ID NO：5、6、8、17或18的人葡萄糖脑苷脂酶，优选编码包含SEQ ID NO：5、6或8的人葡萄糖脑苷脂酶(也称为同工型1)。
如本文所使用的术语“葡萄糖脑苷脂酶”是指β-葡萄糖脑苷脂酶(也称为酸性β-葡萄糖苷酶、D-葡糖基-N-酰基鞘氨醇葡糖水解酶或GCase)，其为具有葡萄糖脑苷酰胺酶活性的酶(EC3.2.1.45)，其在通过水解切割化学葡萄糖脑苷脂的β-糖苷键中为必需的，葡萄糖脑苷脂是在细胞膜(特别是皮肤细胞)中含量丰富的糖脂代谢的中间体。术语“葡萄糖脑苷脂酶”是指此酶和任何额外的共翻译或翻译后修饰。
人葡萄糖脑苷脂酶是由人中的GBA1基因自然编码的，其产生五个可变剪接的mRNA，其编码葡萄糖脑苷脂酶的三种不同的同工型(同工型1(SEQ ID NO：5)、同工型2(SEQID NO：17)和同工型3(SEQ ID NO：18))。本文所使用的术语“葡萄糖脑苷脂酶”是指葡萄糖脑苷脂酶的三种同工型。对应人GBA1 mRNA同工型I(GeneBank ref.M19285.1:123-1733)的编码序列部分CDS的核苷酸序列由SEQ ID NO：7表示。
在具体实施方案中，所述核酸构建体包含具有与自然存在的或重组的葡萄糖脑苷脂酶的编码序列至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同一性的编码核酸序列的全部或一部分(至少1000、1100、1500、2000、2500或至少1500个核苷酸)。自然存在的葡萄糖脑苷脂酶包含人、灵长类动物、鼠或其他哺乳类已知的葡萄糖脑苷脂酶，通常为SEQ ID NO：5、17或18的人葡萄糖脑苷脂酶。
重组的葡萄糖脑苷脂酶的实例包含伊米苷酶(Cerezyme)、velaglucerase(Vpriv)和taliglucerase(Elelyso)。
在优选的实施方案中，所述核酸构建体包含编码人葡萄糖脑苷脂酶的转基因，其中所述人葡萄糖脑苷脂酶包含SEQ ID NO：5、6、8、17或18，例如以选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19的序列表示的核苷酸序列，或者由具有与选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19的序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列的核苷酸序列组成的变体转基因。优选地，所述转基因包括选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19的核苷酸序列的部分，例如优化序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7或19的区域58至1551、SEQ ID NO：7或19的区域58至1611、SEQ ID NO：7或19的区域118至1611。在一个实施方案中，编码SEQ ID NO：5、6、8、17或18的一部分或由具有与选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19的序列至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的核苷酸序列组成的所述变体转基因，与人葡萄糖脑苷脂酶实质上具有相同的葡萄糖脑苷脂酶活性。特别地，变体核酸构建体编码截短的葡萄糖脑苷脂酶，其中一个或多个氨基酸残基缺失。
本文所使用的术语“序列同一性”或“同一性”是指来自两个多核苷酸或多肽序列的比对的位置的匹配(相同核酸或氨基酸残基)的数量。通过在比对时比较序列以使重叠和相同的部分最大化同时使序列间隙最小化来确定序列同一性。特别地，取决于两个序列的长度，可使用多种数学上整体或区域比对算法的任一种来确定序列同一性。长度相似的序列优选使用在整个长度上优选比对序列的整体比对算法(例如Needleman和Wunsch算法；Needleman and Wunsch,1970,J Mol Biol.；48(3):443-53)来比对，而长度实质上不同的序列优选使用区域比对算法(例如Smith和Waterman算法(Smith and Waterman,1981,JTheor Biol.；91(2):379-80)或Altschul算法(Altschul SF等人,1997,Nucleic AcidsRes.；25(17):3389-402.；Altschul SF等人,2005,Bioinformatics.；21(8):1451-6))来比对。用以确定核酸或氨基酸序列同一性的百分比的比对可以以本领域中已知的多种方式来实现，例如使用可从网站例如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/获得的公共可用的计算软件。本领域技术人员能够决定用于测量比对的合适的参数，包含在比较的序列的全长实现最大比对所需的任何算法。为了本文的目的，核酸或氨基酸序列同一性值的百分比是指使用成对序列比对程序EMBOSSNeedle所产生的值，EMBOSS Needle使用Needleman-Wunsch算法产生两个序列的最佳整体比对，其中所有搜索参数设定为默认值，即Scoring matrix＝BLOSUM62,Gap open＝10,Gapextend＝0.5,End gap penalty＝false,End gap open＝10和End gap extend＝0.5。
用于本公开内容的核酸构建体的启动子
在一个实施方案中，核酸构建体包含启动子。所述启动子在引入宿主细胞后启动转基因的表达。
本文所使用的术语“启动子”是指调节元件，其引导可操作地连接至其的核酸的转录。启动子可调节可操作地连接的核酸的转录的速率和效率。启动子也可以可操作地连接至其他调节元件，其他调节元件可增强(“增强子”)或抑制(“阻遏蛋白”)核酸的启动子依赖性的转录。这些调节元件包括但不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白或活化蛋白结合位点以及对于本领域技术人员而言已知直接或间接作用以调节来自启动子的转录的量的任何其他核苷酸序列，包括例如弱化子、增强子和沉默子。启动子在相同的链上和DNA序列的上游(朝向正义链的5’区域)位于靠近基因或与其可操作地连接的编码序列的转录起始位点。启动子的长度可以是约100至1000个碱基对。启动子的位置可相对具体基因的转录起始位点设计(即，上游位置是从-1往回计数的负数，例如-100为上游100个碱基对的位置)。
本文所使用的术语“可操作地连接”是指多核苷酸(或多肽)元件在功能关系上的连接。当核酸与另一核酸序列有功能关系时，所述核酸为“可操作地连接的”。例如，若启动子或转录调节序列影响编码序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。可操作地连接是指被连接的DNA序列通常是邻近的(contiguous)；当需要连接两个蛋白质编码区域时，它们为邻近的并且位于读框中。
在具体的实施方案中，本公开内容的核酸构建体还包含可操作地连接至转基因的启动子，转基因编码葡萄糖脑苷脂酶，并且其中所述启动子引导所述转基因至少在黑质致密部(SNc)的多巴胺能神经元和小神经胶质细胞中表达，优选也在其他脑区域的神经细胞中表达，其他脑区域至少包括黑质致密部、大脑皮质、杏仁核和丘脑的尾椎板内核。
通常，这种启动子可以是组织或细胞类型特异性的启动子、器官特异性的启动子、对多种器官具特异性的启动子或者系统性或普遍存在的启动子。
本文所使用的术语“普遍存在的启动子”更具体地涉及在脑部的多种不同细胞或组织中具有活性的启动子，例如在神经元和小神经胶质细胞两者中，更具体地至少在黑质致密部的多巴胺能神经元和小神经胶质细胞中，更优选也在其他脑区域的神经细胞，其他脑区域至少包括黑质致密部、大脑皮质、杏仁核和丘脑的尾椎板内核。
适用于使转基因至少在黑质致密部的神经细胞和小神经胶质细胞中表达的启动子的实例包括但不限于CMV启动子(Kaplitt 1994,Nat.Genet.8:148-154),SV40启动子(Hamer 1979,Cell 17:725-735),鸡β肌动蛋白(CBA)启动子(Miyazaki 1989,Gene 79:269-277),CAG启动子(Niwa 1991,Gene 108:193-199),b-葡萄糖醛酸酶启动子(GusB)(Shipley 1991,Genetics 10:1009-1018),延长因子1α启动子(EF1α)(Nakai 1998,Blood91:4600-4607),人突触蛋白1基因启动子(hSyn)(Kugler S.等人,Gene Ther.2003.10(4):337-47)或磷酸甘油酸激酶1启动子(PGK1)(Hannan 1993,Gene 130:233-239)。
在具体的实施方案中，普遍存在的启动子可选自人泛素C(UbC)启动子(优选为SEQID NO：22或23)、人磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子(优选为SEQ ID NO：24)和SEQ ID NO：25或26的人CBA/CBh启动子。
在一个实施方案中，启动子为GusB基因启动子，其包含或由SEQ ID NO：2或20组成。在另一个实施方案中，启动子为CAG启动子，其包含或由SEQ ID NO：9或21组成。在另一个实施方案中，启动子为JeT启动子，其包含或由SEQ ID NO：27组成。在另一个实施方案中，启动子为hSyn 1启动子，其包含或由SEQ ID：13组成。
这些启动子序列全部都具有使转基因至少在黑质致密部的神经细胞和小神经胶质细胞中表达的性质。
在优选的实施方案中，所述核酸构建体包括可操作地连接至转基因的GusB启动子，其中GusB启动子包含或由SEQ ID NO：2或20组成，转基因编码葡萄糖脑苷脂酶、通常选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述核酸构建体包括可操作地连接至转基因的JeT启动子，其中JeT启动子包含或由SEQ ID NO：27组成，转基因编码葡萄糖脑苷脂酶、通常选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述核酸构建体包括可操作地连接至转基因的CAG启动子，其中CAG启动子包含或由SEQID NO：9或21组成，转基因编码葡萄糖脑苷脂酶、通常选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述核酸构建体包括可操作地连接至转基因的hSyn启动子，其中hSyn启动子包含或由SEQ ID NO：13组成，转基因编码葡萄糖脑苷脂酶、通常选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19的核苷酸序列。
在具体实施方案中，用于本公开内容的启动子可以是化学诱导的启动子。本文所使用的化学诱导的启动子是通过将化学诱导物体内施用至有需要的所述受试者来调节的启动子。适合的化学诱导启动子的实例包括但不限于四环素/二甲胺四环素诱导启动子(Chtarto 2003,Neurosci Lett.352:155–158)或雷帕霉素诱导系统(Sanftner 2006,MolTher.13:167–174)。
用于本公开内容的核酸构建体的多腺苷酸化序列
这些核酸构建体实施方案每个也可包括多腺苷酸化信号序列，连同或不连同其他任选的核苷酸元件。本文所使用的术语“多腺苷酸化信号”或“多(A)信号”是指在基因的3'未翻译区域(3'UTR)中的特定识别序列，其被转录为前体mRNA分子并引导基因转录的终止。多(A)信号作为在新形成的前体mRNA的3'端的内切核苷酸切割以及在此3'端增加仅由腺嘌呤碱基组成的RNA区段(多腺苷酸化过程；多(A)尾)的信号。多(A)尾对于mRNA的出核、翻译和稳定性是重要的。在本公开内容的情况下，多腺苷酸化信号为能够引导哺乳动物细胞中的哺乳动物基因和/或病毒基因的多腺苷酸化的识别序列。
多(A)信号通常由以下组成：a)共有序列AAUAAA，其已被证明对于3'端切割和前信使RNA(pre-mRNA)的多腺苷酸化是需要的并且促进下游转录终止，以及b)AAUAAA的上游和下游的额外元件，其控制利用AAUAAA作为多(A)信号的效率。在哺乳动物基因的这些基序中有相当的变异性。
在一个实施方案中，任选地组合如上述或下述的多种实施方案的一个或多个特征，本公开内容的核酸构建体的多腺苷酸化信号序列为哺乳动物基因或病毒基因的多腺苷酸化信号序列。适合的多腺苷酸化信号尤其包含SV40早期多腺苷酸化信号、SV40晚期多腺苷酸化信号、HSV胸腺核苷激酶多腺苷酸化信号、鱼精蛋白基因多腺苷酸化信号、腺病毒5EIb多腺苷酸化信号、生长激素多腺苷酸化信号、PBGD多腺苷酸化信号、在电脑中设计的多腺苷酸化信号(合成的)等。
在具体的实施方案中，核酸构建体的多腺苷酸化信号序列是基于人或牛生长激素基因的多腺苷酸化信号序列。在一个实施方案中，多腺苷酸化信号序列基于牛生长激素基因，并包含或由SEQ ID NO：3组成。在优选的实施方案中，多腺苷酸化信号序列基于人生长激素基因，并包含或由SEQ ID NO：28组成。
在具体实施方案中，优选用于根据本公开内容的用途的核酸构建体包含可操作地连接至GBA1基因的编码序列的GusB启动子和多腺苷酸化信号序列，其中GusB启动子包含或由SEQ ID NO：2或20组成，GBA1基因的编码序列选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19，多腺苷酸化信号序列包含或由SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：3组成，优选为SEQ ID NO：28。
在具体实施方案中，优选用于根据本公开内容的用途的核酸构建体包含可操作地连接至GBA1基因的编码序列的CAG启动子和多腺苷酸化信号序列，其中CAG启动子包含或由SEQ ID NO：9或21组成，GBA1基因的编码序列选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19，多腺苷酸化信号序列包含或由SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：3组成，优选为SEQ ID NO：28。
在具体实施方案中，优选用于根据本公开内容的用途的核酸构建体包含可操作地连接至GBA1基因的编码序列的hSyn 1启动子和多腺苷酸化信号序列，其中hSyn1启动子包含或由SEQ ID NO：13组成，GBA1基因的编码序列选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19，多腺苷酸化信号序列包含或由SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：3组成，优选为SEQ ID NO：28。
在另一个具体实施方案中，优选用于根据本公开内容的用途的核酸构建体包含可操作地连接至GBA1基因的编码序列的JeT启动子和多腺苷酸化信号序列，其中JeT启动子包含或由SEQ ID NO：27组成，GBA1基因的编码序列选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19，多腺苷酸化信号序列包含或由SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：3组成，优选为SEQ ID NO：28。
在另一个优选的实施方案中，核酸构建体包含：a)转基因，其包含编码人葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列；其中优选所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：19，并且其中人葡萄糖脑苷脂酶包含SEQ ID NO：5或8；b)可操作地连接至所述转基因的启动子，其中所述启动子优选为i.包含或由SEQ ID NO：9或21组成的CAG启动子，或ii.包含或由SEQ ID NO：13组成的hSyn启动子，或iii.包含或由SEQ ID NO：2或20组成的GusB启动子，或iv.包含或由SEQ IDNO：27组成的JeT启动子；以及c)多腺苷酸化信号序列，优选包含或由SEQ ID NO：28或SEQID NO：3组成、优选为SEQ ID NO：28的多腺苷酸化信号序列。
病毒载体
本公开内容的病毒载体通常至少包含：(i)核酸构建体，其包括转基因和其在以基因疗法治疗的宿主中表达所需的合适的核酸元件，以及(ii)全部或部分的病毒基因组，例如至少病毒基因组的反向重复序列(ITR)。
在一个实施方案中，根据本公开内容的病毒载体包含病毒的5'ITR和3'ITR。
在一个实施方案中，病毒载体包含病毒的5'ITR和3'ITR，病毒独立地选自细小病毒(特别是腺相关病毒)、腺病毒、甲病毒、反转录病毒(特别是γ反转录病毒和慢病毒)、疱疹病毒和SV40；在优选的实施方案中，病毒为腺相关病毒(AAV)、腺病毒(Ad)或慢病毒。
在一个实施方案中，病毒载体包含AAV的5'ITR和3'ITR。
AAV作为人基因疗法中潜在的载体引起极大的兴趣。病毒有利的特性包括：缺乏与任何人疾病的关联性、感染分裂和非分裂细胞的能力以及源自能够被感染的不同组织的一系列细胞系。AAV基因组由包含4681个碱基的线性单链DNA分子组成(Berns and Bohenzky,1987,Advances in Virus Research(Academic Press,Inc.)32:243-307)。基因组在每个末端包含反向重复序列(ITR)，其顺式用作DNA复制的起点和病毒的包装信号。ITR的长度约为145bp。
本发明的病毒载体中的AAV ITR可具有野生型核苷酸序列，或者可通过插入、缺失或置换一个或多个核苷酸而变化，通常与已知的AAV ITR相比，不超过5、4、3、2或1个核苷酸插入、缺失或置换。AAV载体的反向重复序列(ITR)的血清型可选自任何已知的人或非人的AAV血清型。
在具体实施方案中，病毒载体可通过使用任何AAV血清型的ITR来实现。已知的AAVITR包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3(包含3A型和3B型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、禽的AAV、牛的AAV、犬的AAV、马的AAV、绵羊的AAV。
在一个实施方案中，如上所述的核酸构建体包含在所述病毒载体中，所述病毒载体还包含血清型AAV2的AAV的5'ITR和3'ITR。在具体的实施方案中，病毒载体包含血清型AAV2的AAV的5'ITR和3'ITR，优选为SEQ ID NO：15和/或16的序列或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列。
因此，在更具体的实施方案中，本公开内容的病毒载体包括核酸构建体，核酸构建体包含SEQ ID NO：2或20的GusB启动子，GusB启动子可操作地连接至选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19的葡萄糖脑苷脂酶的编码序列，并且所述病毒载体还包括在所述核酸构建体两侧的AAV ITR，例如AAV2的5'和3'ITR，优选为SEQ ID NO：15和/或16的序列或者具有与SEQID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列。
在另一个具体实施方案中，本公开内容的病毒载体包括核酸构建体，核酸构建体包含可操作地连接至葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列的启动子，启动子选自包含或由SEQ IDNO：9或21组成的CAG启动子，葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19，并且病毒载体还包含在所述核酸构建体两侧的AAV ITR，例如AAV2的5'和3'ITR，优选为SEQ ID NO：15和/或16的序列或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列。
在另一个具体实施方案中，本公开内容的病毒载体包括核酸构建体，核酸构建体包含可操作地连接至葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列的启动子，启动子选自包含或由SEQ IDNO：13组成的hSyn 1启动子，葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19，并且病毒载体还包含在所述核酸构建体两侧的AAV ITR，例如AAV2的5'和3'ITR，优选为SEQ ID NO：15和/或16的序列或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列。
在另一个具体实施方案中，本公开内容的病毒载体包含核酸构建体，核酸构建体包含可操作地连接至葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列的启动子，启动子选自包含或由SEQ IDNO：27组成的JeT启动子，葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19，并且病毒载体还包含在所述核酸构建体两侧的AAV ITR，例如AAV2的5'和3'ITR，优选为SEQID NO：15和/或16的序列或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列。
在具体的实施方案中，本公开内容的病毒载体包含或由SEQ ID NO：4组成的序列或者具有与SEQ ID NO：4至少80％或至少90％同一性的序列。
在优选实施方案中，本公开内容的病毒载体包括核酸构建体，核酸构建体包含可操作地连接至葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列的启动子，启动子选自以下启动子：i.包含或由SEQ ID NO：2或20组成的GusB启动子；或ii.包含或由SEQ ID NO：9或21组成的CAG启动子；iii.包含或由SEQ ID NO：13组成的hSyn 1启动子；或iv.包含或由SEQ ID NO：27组成的JeT启动子，葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19，并且病毒载体还包括在所述核酸构建体两侧的AAV ITR，例如AAV2的5'和3'ITR，优选为SEQ ID NO：15和/或16的序列或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列，其中更优选5'ITR包含或由SEQ ID NO：15组成并且3'ITR包含或由SEQ ID NO：16组成；并且其中本公开内容的病毒载体包含或由SEQ ID NO：4组成或者包含具有与SEQ ID NO：4至少80％或至少90％同一性的序列。
另一方面，本公开内容的病毒载体可通过使用合成的5'ITR和/或3'ITR来实现；并且也可通过使用来自不同血清型的病毒的5'ITR和3'ITR来实现。病毒载体复制所需的所有其他病毒基因可被反式提供在下文描述的病毒生产细胞(包装细胞)中。因此，它们在病毒载体中的包含是任选的。
在一个实施方案中，病毒载体包含病毒的5'ITR和3'ITR。
病毒颗粒
如上所述的病毒载体可包装于衣壳中，衣壳由衣壳蛋白形成，从而构成下节所述的病毒颗粒。
在优选实施方案中，衣壳由腺相关病毒的衣壳蛋白形成，以下称作AAV载体颗粒。
本文所述的AAV载体颗粒至少包含AAV基因组的5'ITR和3'ITR以及腺相关病毒的衣壳蛋白。术语AAV载体颗粒涵盖任何重组的AAV载体颗粒(rAAV)或是由已知的rAAV的基因工程化所获得的突变体AAV载体颗粒。
腺相关病毒的病毒衣壳的蛋白质包括衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。多种AAV血清型的衣壳蛋白序列之间的差异造成使用不同的细胞表面受体用于细胞进入。结合替代的细胞内加工途径，这对每种AAV血清型产生不同的组织嗜性。
在具体的实施方案中，根据本公开内容的AAV病毒颗粒可通过将源自具体AAV血清型的AAV载体/基因组的病毒载体封装于由对应相同具体血清型的AAV的天然Cap蛋白质形成的病毒颗粒来制备。然而，已开发出若干种技术以修饰并改善自然存在的AAV病毒颗粒的结构或功能性质(Bünning H等人,J Gene Med 2008；10:717–733)。因此，在另一个实施方案中，根据本公开内容的AAV病毒颗粒包括核酸构建体，核酸构建体包含对两侧有给定AAV血清型的ITR的葡萄糖脑苷脂酶进行编码的基因，其中给定AAV血清型包装于例如：a)病毒颗粒，其是由源自相同或不同的AAV血清型的衣壳蛋白组成[例如AAV2 ITR和AAV9衣壳蛋白；AAV2 ITR和AAV TT衣壳蛋白或来自诸如AAV2-retro、AAVMNM004或AAVMNM008的AAVretro血清型的其他衣壳蛋白等]；b)镶嵌病毒颗粒，其由源自不同的AAV血清型或突变体的衣壳蛋白的混合物组成[例如具有由两种或多种AAV血清型形成的衣壳的AAV2 ITR]；c)嵌合病毒颗粒，其由通过在不同的AAV血清型或变体之间的结构域交换而被截短的衣壳蛋白组成[例如具有AAV5衣壳蛋白与AAV3结构域的AAV2 ITR]；或d)靶向病毒颗粒，其被工程化以显现出选择性结合结构域，从而使得能够与目标细胞特异性受体进行严格的相互作用。
在Pignataro D,Sucunza D,Rico AJ等人,J Neural Transm 2018；125:575-589中已综述靶向CNS的基于AAV的基因疗法。更具体而言，AAV颗粒可被选择和/或被工程化以至少靶向神经元细胞和小神经胶质细胞，并且具体地至少靶向大脑的黑质致密部(SNc)中的多巴胺能神经元和小神经胶质细胞。
在具体实施方案中，用于根据本公开内容的AAV病毒颗粒的衣壳蛋白的AAV血清型的实例包括AAV2、AAV5、AAV9、AAV2-retro、AAVMNM004、AAVMNM008和AAV TT。在更优选实施方案中，衣壳蛋白的所述AAV血清型选自AAV9和AAV TT血清型。
在具体的实施方案中，任选地组合如上述或如下述的多种实施方案的一个或多个特征，病毒颗粒为重组AAV病毒颗粒，重组AAV病毒颗粒包含如上所述的AAV病毒载体，AAV病毒载体优选包括选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19的核苷酸序列，并包含AAV9血清型或AAVTT血清型的衣壳蛋白，优选为包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列的AAV TT血清型的衣壳蛋白。
在另一个具体的实施方案中，病毒颗粒包含核酸构建体，核酸构建体包括在启动子的控制下的人葡萄糖脑苷脂酶的编码序列，所述启动子使人葡萄糖脑苷脂酶至少在多巴胺能神经元和小神经胶质细胞两者中表达，并且所述病毒颗粒选自至少靶向黑质致密部中的多巴胺能神经元和小神经胶质细胞的病毒颗粒，通常AAV颗粒包括选自AAV2、AAV5、AAV9、AAV2-retro、AAVMNM004、AAVMNM008和AAV TT血清型的衣壳蛋白，优选为AAV TT血清型的衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列。
在更具体的实施方案中，根据本公开内容的这种重组AAV病毒颗粒包括AAV9、AAV2-retro、AAVMNM004、AAVMNM008或AAV TT血清型的衣壳蛋白以及AAV病毒载体，所述AAV病毒载体包含(i)核酸构建体以及(ii)AAV ITR，所述核酸构建体包含可操作地连接至葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列的启动子，启动子选自以下启动子：包含或由SEQ ID NO：2或20组成的GusB启动子、包含或由SEQ ID NO：9或21组成的CAG启动子、包含或由SEQ ID NO：27组成的Jet启动子以及包含或由SEQ ID NO：13组成的hSyn启动子，葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19，所述AAV ITR例如为在所述核酸构建体两侧的AAV2的5'和3'ITR，优选为SEQ ID NO：15和/或16的5'和3'ITR或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列。
在更具体的实施方案中，根据本公开内容的这种重组AAV病毒颗粒包括AAV TT血清型的衣壳蛋白以及AAV病毒载体，所述AAV TT血清型的衣壳蛋白包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列，所述AAV病毒载体包含(i)核酸构建体以及(ii)AAV ITR，所述核酸构建体包含可操作地连接至葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列的GusB启动子，GusB启动子包含或由SEQ ID NO：2或20组成，葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19，所述AAV ITR例如为在所述核酸构建体两侧的AAV2的5'和3'ITR，优选为SEQ ID NO：15和/或16的5'和3'ITR或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列。
在更具体的实施方案中，根据本公开内容的这种重组AAV病毒颗粒包括AAV TT血清型的衣壳蛋白以及AAV病毒载体，所述AAV TT血清型的衣壳蛋白包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列，所述AAV病毒载体包含(i)核酸构建体以及(ii)AAV ITR，所述核酸构建体包含可操作地连接至葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列的CAG启动子，CAG启动子包含或由SEQ ID NO：9或21组成，葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19，所述AAV ITR例如为在所述核酸构建体两侧的AAV2的5'和3'ITR，优选为SEQ ID NO：15和/或16的5'和3'ITR或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列。
在更具体的实施方案中，根据本公开内容的这种重组AAV病毒颗粒包括AAV TT血清型的衣壳蛋白以及AAV病毒载体，所述AAV TT血清型的衣壳蛋白包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列，所述AAV病毒载体包含(i)核酸构建体以及(ii)AAV ITR，所述核酸构建体包含可操作地连接至葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列的hSyn启动子，hSyn启动子包含或由SEQ ID NO：13组成，葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19，所述AAV ITR例如为在所述核酸构建体两侧的AAV2的5'和3'ITR，优选为SEQ ID NO：15和/或16的5'和3'ITR或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列。
在更具体的实施方案中，根据本公开内容的这种重组AAV病毒颗粒包括AAV TT血清型的衣壳蛋白以及AAV病毒载体，所述AAV TT血清型的衣壳蛋白包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列，所述AAV病毒载体包含(i)核酸构建体以及(ii)AAV ITR，所述核酸构建体包含可操作地连接至葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列的JeT启动子，JeT启动子包含或由SEQ ID NO：27组成，葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19，所述AAV ITR例如为在所述核酸构建体两侧的AAV2的5'和3'ITR，优选为SEQ ID NO：15和/或16的5'和3'ITR或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列。
在一个优选的实施方案中，病毒颗粒包含核酸构建体，核酸构建体包含：
a)编码人葡萄糖脑苷脂酶的转基因；其中所述转基因包含SEQ ID NO：19或编码人葡萄糖脑苷脂酶的序列，其中人葡萄糖脑苷脂酶包含SEQ ID NO：5或8；
b)可操作地连接至所述转基因的启动子；其中所述启动子优选为包含或由SEQ IDNO：9或21组成的CAG启动子、或包含或由SEQ ID NO：2或20组成的GusB启动子、或包含或由SEQ ID NO：27组成的JeT启动子或包含或由SEQ ID NO：13组成的hSyn启动子；
c)多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：3组成的多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28组成的多腺苷酸化信号序列；
其中病毒颗粒是重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，优选包括AAV TT的衣壳蛋白，更优选包含SEQ ID NO：14的序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的序列；其中所述核酸构建体包含在病毒载体中，病毒载体还包含5'ITR和3'ITR序列，优选为腺相关病毒的5'ITR和3'ITR序列，更优选来自AAV2血清型的5'ITR和3'ITR序列，并且其中5’ITR和3’ITR序列各自独立地包含或由SEQ ID NO：15或16的序列或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列组成，其中优选5'ITR包含SEQ ID NO：15的序列并且3'ITR包含SEQ ID NO：16的序列。
重组AAV病毒颗粒的构建一般是本领域中已知的，并已描述于例如以下文献中：US5,173,414和US5,139,941；WO 92/01070,WO 93/03769,Lebkowski等人,(1988)Molec.Cell.Biol.8:3988-3996；Vincent等人,(1990)Vaccines 90(Cold Spring HarborLaboratory Press)；Carter,B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka,N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129；和Kotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5:793-801。具有血清型AAV TT的衣壳蛋白的病毒颗粒也已描述于Tordo J等人,Brain 2018；141:2014-2031。
具有逆向运输的病毒颗粒
在一些实施方案中，根据本公开内容的所述病毒颗粒选自具有逆向运输的病毒变异血清型(AAVretro)。
轴突运输(有时也称为轴浆运输或轴浆流)是指细胞器和蛋白质从给定神经元的细胞体朝向轴突末端的移动(称为顺向运输)。本文所使用的术语“逆向运输”是指在相反方向上颗粒的运输，即从轴突末端回到母细胞体。在此方面，嗜神经性病毒(最佳实例为狂犬病病毒)通常被轴突末端吸收并利用逆向运输递送到神经元的细胞体。
AAVretro颗粒的实例包括但不限于衣壳蛋白，优选为AAV2-retro、AAV-TT、AAV-MNM004和AAV-MNM008的衣壳蛋白，更优选为AAV2-retro、AAV-TT、AAV-MNM004和AAV-MNM008的VP1衣壳蛋白。
AAV2-retro衣壳蛋白已描述于WO2017/218842A1。
其他各种不同类型的经修饰的病毒衣壳例如AAV-TT、AAV-MNM004和AAV-MNM008也已被设计成通过病毒载体的逆向传播传导神经支配其中递送病毒载体的区域的神经元。
AAV-MNM004和AAV-MNM008描述于例如Davidsson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.Dec 9 2019doi:10.1073/pnas.1910061116和WO2019/158619中。
也被称为AAV2真型衣壳(AAV2 true-type capsid)的AAV-TT衣壳描述于例如WO2015/121501中。在一个实施方案中，AAV-TT VP1衣壳蛋白相对野生型AAV VP1衣壳蛋白(NCBI参考序列:YP_680426.1)在对应AAV2蛋白质序列中的以下一个或多个位置的位置包含至少一个氨基酸置换：125、151、162、312、457、492、499、533、546、548、585、588和/或593，更具体而言，AAV-TT相对野生型AAV2 VP1衣壳蛋白(NCBI参考序列:YP_680426.1)包含一个或多个以下氨基酸置换：V125I、V151A、A162S、T205S、N312S、Q457M、S492A、E499D、F533Y、G546D、E548G、R585S、R588T和/或A593S。在一个具体的实施方案中，AAV-TT相对野生型AAV2VP1衣壳蛋白在位置457、492、499和533包含四个或更多个突变。
在进一步实施方案中，AAV-TT衣壳可来自不同于AAV2的AAV血清型，并可源自例如AAV1、AAV3B、AAV-LK03、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9或AAV10衣壳蛋白。特别地，对应上述那些相对AAV2的位置可通过例如如图1和图2所提供的序列比对而易于识别。在一个实施方案中，本公开内容的AAV-TT VP1衣壳蛋白包含或由SEQ ID NO：14的氨基酸序列或者具有与SEQID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％的氨基酸序列组成。
在具体实施方案中，根据本公开内容的AAVretro病毒颗粒选自能够逆向地散布于大脑皮质的那些，优选如体内散布测定所确定在非人灵长类动物的尾状核或壳核进行实质内注射后至少散布至黑质致密部和大脑皮质。
在更具体的实施方案中，根据本公开内容的AAVretro病毒颗粒选自能够逆向地散布于大脑皮质的那些，优选在非人灵长类动物的尾状核或壳核进行实质内注射后至少散布至黑质致密部和大脑皮质，并且至少达到与如体内散布测定所确定的AAV-TT相同的水平。
本发明人确实设计出一种体内散布测定，其使得能够确定rAAV具有真正的逆向运输，以用于本文所述的治疗诸如帕金森病的突触核蛋白病变的基因疗法的用途，并能够例如与诸如AAV-TT rAAV-GFP的阳性对照比较。
散布测定的一个重要特征在于这是在非人灵长类动物的体内测定，其中在非人灵长类动物中将rAAV注射于不存在通道纤维的区域。因此，没有可通过通道纤维(即纤维通过注射区域朝向更远的目的地流去)获得的假阳性吸收。在非人灵长类动物中，尾状核和壳核为100％实质结构，因此不包含通道纤维。因此，有利地，根据本公开内容，可通过所提出的散布测定比较并选择具有逆向运输的适合的rAAV。
在优选实施方案中，所述AAVretro病毒颗粒包括AAV TT血清型衣壳蛋白，AAV TT血清型衣壳蛋白包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列，并且AAVretro病毒颗粒能够逆向散布于大脑皮质，优选如体内散布测定所确定在非人灵长类动物的尾状核或壳核进行实质内注射后至少散布至黑质致密部和大脑皮质。
在优选实施方案中，所述体内散布测定包括以下步骤：
a.通过所述rAAV-GFP的实质内注射，将包含编码GFP的转基因(rAAV-GFP)的测试rAAV注射至非人灵长类动物的连合后壳核，
b.在注射后约一个月，计数在大脑皮质中、优选在神经支配尾状壳核的脑区域中的表达GFP的神经元的数量。
编码GFP的转基因可由SEQ ID NO：10的编码GFP的核酸或者其具有最优化序列或截短形式的功能变体来制备。
表达GFP的神经元可使用抗GFP抗体通过免疫过氧化酶染色来视觉化。表达GFP的神经元有利地可在被注射的非人灵长类动物的整个大脑皮质中自动计数。预期GFP阳性的神经元的优先位置在大脑皮质的深层。除了皮质区域之外，表达GFP的神经元也可在神经支配被注射的连合后壳核或尾状壳核的所有脑部区域中，优选至少在黑质致密部、杏仁核和尾椎板内核中被定量。
在一个具体实施方案中，根据本公开内容的AAV-retro病毒颗粒选自如体内散布测定所确定的神经支配被注射位置的大脑皮质的深层V-VI中的神经元的至少50％、60％、70％、80％或至少90％表达GFP的那些。在优选实施方案中，所述AAVretro病毒颗粒包括AAVTT血清型衣壳蛋白，AAV TT血清型衣壳蛋白包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或具有与SEQID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列，其中如体内散布测定所确定，神经支配被注射位置的大脑皮质的深层V-VI中的神经元的至少50％、60％、70％、80％或至少90％表达GFP。
在更具体的实施方案中，如实施例所述进行散布测定。
在更具体的实施方案中，所述体内散布测定包括以下步骤：
a.通过所述rAAV-GFP的实质内注射，将包含GFP的转基因的测试rAAV注射至非人灵长类动物的连合后壳核，
b.在注射后约一个月，计数在大脑皮质中，优选在神经支配尾状壳核的脑区域中，更优选至少在大脑皮质、黑质、杏仁核和尾椎板内核中的表达GFP的神经元的数量，
c.与使用AAV-TT-GFP进行的对照实验比较在大脑皮质中被标记的神经元的百分比。
在其他实施方案中，所述AAVretro包括选自以下变异血清型的衣壳蛋白：AAV2-retro、AAV-MNM004、AAV-MNM008和AAV-TT。
在优选实施方案中，所述AAVretro病毒颗粒包括AAV TT血清型衣壳蛋白，AAV TT血清型衣壳蛋白包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列。
神经学家经典地定义多达5个阶段的帕金森病(参见https://www.parkinson.org/Understanding-Parkinsons/What-is-Parki nsons/Stages-of-Parkinsons)。最常用的临床评分量表为所谓的Hoehn和Yahr(H-Y)阶段，其对帕金森病的进展评估为5个阶段：1和2代表早期，2和3代表中期，4和5代表晚期。
有利地，具有逆向运输的病毒颗粒使病毒颗粒能够在晚期患者中具有散布的α-突触核蛋白聚集的整个脑区域中表达葡萄糖脑苷脂酶。
因此，AAVretro病毒颗粒，优选包含AAV TT血清型衣壳蛋白的AAVretro病毒颗粒，更优选AAV TT血清型衣壳蛋白包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的氨基酸序列，将被优选用于根据本公开内容的治疗晚期突触核蛋白病变(通常是至少H-Y 3期帕金森病)的患者的用途。
生产病毒颗粒的过程
携带如上所述的表达病毒载体的病毒颗粒的生产可通过常规的方法和步骤来进行，常规的方法和步骤通过考虑用于所需生产的病毒颗粒的实际实施方案而选择的结构特征来进行选择。
简言之，病毒颗粒可以在宿主细胞中生产，更优选在特定病毒生产细胞(包装细胞)中生产，其中在辅助载体、病毒或其他DNA构建体的存在下用待包装的核酸构建体或病毒载体转染宿主细胞。
本文所使用的术语“包装细胞”是指可以用本公开内容的病毒载体或核酸构建体转染并反式提供病毒载体完整复制和包装所需的所有缺失功能的细胞或细胞系。通常，包装细胞以连续的或诱导的方式表达一种或多种所述缺失的病毒功能。所述包装细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞。
通常，生产病毒颗粒的过程包括以下步骤：
a)在培养基中培养包含如上所述的病毒载体或核酸构建体的包装细胞；以及
b)收获来自细胞培养上清液和/或细胞内部病毒颗粒。
可使用常规方法生产AAV病毒颗粒的病毒颗粒，包括用携带编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因的核酸构建体或表达载体(例如质粒)；编码rep和cap基因但不携带ITR序列核酸构建体(例如AAV辅助质粒)；以及提供AAV复制所需的腺病毒功能的第三核酸构建体(例如质粒)共转染的瞬时细胞。AAV复制所需的病毒基因在本文中称为病毒辅助基因。通常，AAV复制所需的所述基因为腺病毒辅助基因，例如E1A、E1B、E2a、E4或VA RNA。优选地，腺病毒辅助基因为Ad5或Ad2血清型。
还可以例如通过以重组杆状病毒的组合感染昆虫细胞来进行根据本公开内容的AAV颗粒的大量生产(Urabe等人,Hum.Gene Ther.2002；13:1935-1943)。用分别表达待包装的AAV载体、AAV rep和AAV cap的两个或三个杆状病毒载体共同感染SF9细胞。重组杆状病毒载体会提供用于病毒复制和/或包装所需的病毒辅助基因功能。Smith等人,2009(Molecular Therapy,vol.17,no.11,pp 1888-1896)还描述了用于在昆虫细胞中大量生产AAV颗粒的双重杆状病毒表达系统。
适合的培养基会是本领域技术人员已知的。组成这样的培养基的成分可取决于待培养的细胞的类型而不同。除了营养成分之外，渗透压和pH也被认为是重要的培养基参数。细胞生长培养基包含本领域技术人员众所周知的许多成分，包括氨基酸、维生素、有机和无机盐、碳水化合物源、脂质、微量元素(CuS04、FeS04、Fe(N03)3、ZnS04......)，每种成分以支持细胞体外培养(即细胞的生存和生长)的量存在。成分也可包含不同的辅助物质，例如缓冲物质(如碳酸氢钠、Hepes、Tris或相似性能的缓冲液)、氧化稳定剂、抵抗机械应力的稳定剂、蛋白酶抑制剂、动物生长因子、植物水解物、抗凝集剂、抗发泡剂。细胞生长培养基的特征和组成根据具体细胞需求而不同。市售可得的细胞生长培养基的实例为：MEM(最小基本培养基)、BME(伊格尔基本培养基)、DMEM(杜氏改良伊格尔培养基)、伊斯科夫DMEM(杜氏培养基的伊斯科夫改良)、GMEM、RPMI 1640、Leibovitz L-15、McCoy’s、Medium 199、Ham(Ham培养基)F10和衍生物、Ham F12、DMEM/F12等。
用于根据本公开内容的用途的病毒载体的构建与制造的进一步说明可见于以下文献：Viral Vectors for Gene Therapy,Methods and Protocols.Series:Methods inMolecular Biology,Vol.737.Merten and Al-Rubeai(Eds.)；2011Humana Press(Springer)；Gene Therapy.M.Giacca.2010Springer-Verlag；Heilbronn R.and WegerS.Viral Vectors for Gene Transfer:Current Status of Gene Therapeutics.In:DrugDelivery,Handbook of Experimental Pharmacology 197；M.
Figure BDA0003546518920000361
(Ed.).2010Springer-Verlag；pp.143-170；Adeno-Associated Virus:Methods andProtocols.R.O.Snyder and P.Moulllier(Eds).2011Humana Press(Springer)；BünningH.等人,Recent developments in adeno-associated virus technology.J.GeneMed.2008；10:717-733；Adenovirus:Methods and Protocols.M.Chillón and A.Bosch(Eds.)；Third Edition.2014Humana Press(Springer)。
本公开内容还涉及包含如上所述的编码葡萄糖脑苷脂酶的病毒载体或核酸构建体的宿主细胞。更具体而言，根据本公开内容的宿主细胞为具体病毒生产细胞，也称为包装细胞，其在辅助载体、病毒或其他DNA构建体的存在下以如上所述的病毒载体或核酸构建体转染，并反式提供病毒颗粒完整复制和包装所需的所有缺失功能。所述包装细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞。
举例而言，包装细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞，包括猴、人、狗和啮齿动物细胞。人细胞的实例为PER.C6细胞(WO01/38362)、MRC-5(ATCC CCL-171)、WI-38(ATCCCCL-75)、HEK-293细胞(ATCC CRL-1573)、HeLa细胞(ATCC CCL2)和恒河猴胎儿肺细胞(ATCCCL-160)。非人灵长类动物细胞的实例为Vero细胞(ATCC CCL81)、COS-1细胞(ATCC CRL-1650)或COS-7细胞(ATCC CRL-1651)。狗的细胞的实例为MDCK细胞(ATCC CCL-34)。啮齿动物细胞的实例为诸如BHK21-F、HKCC细胞或CHO细胞的仓鼠细胞。
作为哺乳动物来源的替代者，用于生产病毒颗粒的包装细胞可源自禽类来源，例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑或雉。禽类细胞系的实例包括禽类胚胎干细胞(WO01/85938和WO03/076601)、永生的鸭视网膜细胞(WO2005/042728)和禽类胚胎干细胞衍生细胞，包括鸡细胞(WO2006/108846)或鸭细胞，例如EB66细胞系(WO2008/129058和WO2008/142124)。
在另一个实施方案中，细胞可以是允许杆状病毒感染和复制的任何包装细胞。在具体的实施方案中，细胞为昆虫细胞，例如SF9细胞(ATCC CRL-1711)、Sf21细胞(IPLB-Sf21)、MG1细胞(BTI-TN-MG1)或High FiveTM细胞(BTI-TN-5B1-4)。
因此，在具体的实施方案中，任选地组合如上述或下述的多种实施方案的一个或多个特征，宿主细胞包含：
-如上所述的包含编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因的核酸构建体或病毒载体(例如AAV载体)，
-不携带ITR序列的编码AAV rep和/或cap基因的核酸构建体，例如质粒；以及任选地
-包含病毒辅助基因的核酸构建体，例如质粒或病毒。
在另一方面，本公开内容涉及以本公开内容的病毒颗粒转导的宿主细胞，本文所使用的术语“宿主细胞”是指易于被感兴趣的病毒感染并且适合体外培养的任何细胞系。
药物组合物
本公开内容的另一方面涉及一种药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的本公开内容的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒或宿主细胞。
本文所使用的术语“药学上可接受”表示由管理机构或公认的药典诸如EuropeanPharmacopeia批准用于动物和/或人。术语“赋形剂”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、载体或媒介物。
任何适合的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂可用于药物组合物的制备(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Alfonso R.Gennaro(Editor)Mack Publishing Company,April 1997)。药物组合物在制造和保存的状态下通常为无菌并且稳定的。药物组合物可配制成溶液(例如盐水、右旋糖溶液、或缓冲溶液或药学上可接受的其他无菌液体)、微乳液、脂质体或适合容纳高产物浓度的其他有序结构(例如微颗粒或纳米颗粒)。载体可以是溶剂或分散介质(含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等))和其适合的混合物。可通过例如使用包衣诸如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需的颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等张剂例如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇、或氯化钠。
优选地，将所述药物组合物配制成溶液，更优选配制成任选地经缓冲的盐类溶液。补充的活性化合物也可并入本公开内容的药物组合物。可在例如Compendium ofPharmaceutical and Specialties(CPS)of the Canadian Pharmacists Association中找到关于额外治疗剂的共同施用的指南。
在一个实施方案中，药物组合物为适用于实质内、脑内、静脉内或鞘内施用的药物组合物。这些药物组合物仅为示例性的并且不限制适用于其他肠胃外和非肠胃外的施用途径。本文所述的药物组合物可以以单一单位剂量或多剂量的形式包装。
治疗用途
本公开内容还提供用于治疗的如本文所述的病毒颗粒。
在一个实施方案中，用于治疗的病毒颗粒为包含核酸构建体的病毒颗粒，核酸构建体包含：
a)编码人葡萄糖脑苷脂酶的转基因；其中所述转基因包含SEQ ID NO：1、7、11、12或19(优选SEQ ID NO：19)的序列或编码人葡萄糖脑苷脂酶的序列，其中人葡萄糖脑苷脂酶包含SEQ ID NO：5、6、8、17或18(优选SEQ ID NO：5或8)；
b)可操作地连接至所述转基因的启动子，并且其中所述启动子优选使所述转基因至少在黑质致密部(SNc)的神经细胞和小神经胶质细胞中表达；其中所述启动子优选为包含或由SEQ ID NO：9或21组成的CAG启动子、包含或由SEQ ID NO：2或20组成的GusB启动子、包含或由SEQ ID NO：27组成的JeT启动子或者包含或由SEQ ID NO：13组成的hSyn启动子；
c)多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：3组成的多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28组成的多腺苷酸化信号序列；
其中所述病毒颗粒为重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，优选包括AAV TT的衣壳蛋白，并且更优选包含SEQ ID NO：14的序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的序列；其中所述核酸构建体包含在病毒载体中，病毒载体还包含5'ITR和3'ITR序列，优选为腺相关病毒的5'ITR和3'ITR序列，更优选为来自AAV2血清型的5'ITR和3'ITR序列，并且其中5’ITR和3’ITR序列各自独立地包含或由SEQID NO：15或16的序列或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列组成，其中优选5'ITR包含SEQ ID NO：15的序列并且3'ITR包含SEQ ID NO：16的序列。
使用小鼠和非人灵长类动物的偶发性帕金森病的动物模型，本发明人惊讶地发现葡萄糖脑苷脂酶活性的AAV介导的增强：
-在黑质致密部的多巴胺能神经元中诱导α-突触核蛋白聚集体的清除；
-诱导多巴胺能神经元的神经保护；
-减轻由α-突触核蛋白聚集触发的小神经胶质细胞驱动的促发炎现象；以及
-阻碍α-突触核蛋白的跨神经元通道(朊病毒样扩散)
这些结果对于治疗人受试者的突触核蛋白病变、特别是偶发性突触核蛋白病变并且更具体而言为帕金森病的可能的治疗策略提供强烈的证据。
因此，在进一步方面，提供用于治疗突触核蛋白病变、优选为帕金森病并且更具体而言为偶发性帕金森病的如本文所述的病毒载体或病毒颗粒。
在一个实施方案中，用于治疗突触核蛋白病变、优选为帕金森病并且更具体而言为偶发性帕金森病的病毒颗粒是包含核酸构建体的病毒颗粒，核酸构建体包含：
a)编码人葡萄糖脑苷脂酶的转基因；其中所述转基因包含SEQ ID NO：1、7、11、12或19(优选SEQ ID NO：19)或编码人葡萄糖脑苷脂酶的序列，其中人葡萄糖脑苷脂酶包含SEQ ID NO：5、6、8、17或18(优选SEQ ID NO：5或8)；
b)可操作地连接至所述转基因的启动子，并且其中所述启动子优选使所述转基因至少在黑质致密部(SNc)的神经细胞和小神经胶质细胞中表达；其中所述启动子优选为包含或由SEQ ID NO：9或21组成的CAG启动子、包含或由SEQ ID NO：2或20组成的GusB启动子、包含或由SEQ ID NO：27组成的JeT启动子或者包含或由SEQ ID NO：13组成的hSyn启动子；
c)多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：3组成的多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28组成的多腺苷酸化信号序列；
其中所述病毒颗粒为重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，优选包括AAV TT的衣壳蛋白，并且更优选包含SEQ ID NO：14的序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的序列；其中所述核酸构建体包含在病毒载体中，病毒载体还包含5'ITR和3'ITR序列，优选为腺相关病毒的5'ITR和3'ITR序列，更优选为来自AAV2血清型的5'ITR和3'ITR序列，并且其中5’ITR和3’ITR序列各自独立地包含或由SEQID NO：15或16的序列或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列组成，其中优选5'ITR包含SEQ ID NO：15的序列并且3'ITR包含SEQ ID NO：16的序列。
此外，本公开内容涉及在有需要的受试者中治疗突触核蛋白病变、优选为帕金森病并且更具体而言为偶发性帕金森病的方法，所述方法包括将治疗有效量的如上所述的病毒颗粒或病毒载体施用至所述受试者。
在一个实施方案中，在有需要的受试者中治疗突触核蛋白病变、优选为帕金森病并且更具体而言为偶发性帕金森病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含核酸构建体的病毒颗粒，核酸构建体包含：
a)编码人葡萄糖脑苷脂酶的转基因；其中转基因包含SEQ ID NO：1、7、11、12或19(优选SEQ ID NO：19)或编码人葡萄糖脑苷脂酶的序列，其中人葡萄糖脑苷脂酶包含SEQ IDNO：5、6、8、17或18(优选SEQ ID NO：5或8)；
b)可操作地连接至所述转基因的启动子，并且其中所述启动子优选使所述转基因至少在黑质致密部(SNc)的神经细胞和小神经胶质细胞中表达；其中所述启动子优选为包含或由SEQ ID NO：9或21组成的CAG启动子、包含或由SEQ ID NO：2或20组成的GusB启动子、包含或由SEQ ID NO：27组成的JeT启动子或者包含或由SEQ ID NO：13组成的hSyn启动子；
c)多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：3组成的多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28组成的多腺苷酸化信号序列；
其中所述病毒颗粒为重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，优选包括AAV TT的衣壳蛋白，并且更优选包含SEQ ID NO：14的序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的序列；其中所述核酸构建体包含在病毒载体中，病毒载体还包含5'ITR和3'ITR序列，优选为腺相关病毒的5'ITR和3'ITR序列，更优选为来自AAV2血清型的5'ITR和3'ITR序列，并且其中5’ITR和3’ITR序列各自独立地包含或由SEQID NO：15或16的序列或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列组成，其中优选5'ITR包含SEQ ID NO：15的序列并且3'ITR包含SEQ ID NO：16的序列。
在具体的实施方案中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如上所述的病毒颗粒或病毒载体，其被递送至大脑皮质的神经元，优选大脑皮质的深层V-VI的神经元，优选为神经支配施用位置的大脑皮质的深层V-VI的神经元中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或至少90％。
在另一个具体的实施方案中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如上所述的病毒颗粒或病毒载体，其被递送至神经支配注射位置的脑区域中的神经元，优选至少递送至神经支配尾状壳核的脑区域(即至少黑质致密部、大脑皮质、杏仁核和丘脑的尾椎板内核)中的神经元，优选这些神经元的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或至少90％。
另一方面，本公开内容涉及如上所述的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物在有需要的受试者中用作为药物，更具体而言，在有需要的受试者中用于治疗突触核蛋白病变，优选为帕金森病，更具体为偶发性帕金森病。
又一方面，本公开内容涉及如上所述的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物在制造药物上的用途，优选用于治疗突触核蛋白病变，优选为帕金森病，更具体为偶发性帕金森病。
本文所使用的术语“受试者”或“患者”是指哺乳动物。可受益于本公开内容的治疗方法的哺乳动物种包括但不限于人、非人灵长类动物诸如猿猴、黑猩猩、猴子和红毛猩猩、家养动物包括狗和猫以及家畜诸如马、牛、猪、绵羊和山羊或者其他哺乳动物种包括但不限于小鼠、大鼠、天竺鼠、兔子、仓鼠等。在具体的实施方案中，所述受试者为新生儿、婴儿或儿童。
本文所使用的术语“治疗(treatment、treat或treating)”是指旨在改善患者的健康状况的任何动作，例如疾病的治疗、防止、预防或延缓。在某些实施方案中，这样的术语是指改善或根除疾病或与疾病相关的症状。在其他实施方案中，此术语是指因施用至患有这样的疾病的受试者的一种或多种治疗试剂而使疾病的扩散或恶化最小化。
本文所使用的术语“突触核蛋白病变”是指其中神经病理学特征以α-突触核蛋白的胞浆内聚集为代表的疾病。特别地，突触核蛋白病变包括神经退化性疾病，例如帕金森病、路易体失智症和多发性系统退化症。
本文所使用的帕金森病(PD)是指起源不明的中枢神经系统的渐进性神经退化性疾病。在PD的情况中，多巴胺生产神经元逐渐死亡，导致脑部缺乏被称为多巴胺的神经递质。由于脑中多巴胺的水平逐渐下降，控制随意运动的起始和执行的脑回路变得功能异常，因此导致通常代表PD的主要运动型症状的出现。初期诊断通常发生在生命的第六个十年(平均65岁)，并且特征表现是单侧的并且末端的。随着疾病进展，疾病影响身体的两侧(例如双侧的)并且症状随着时间变得更糟并且更明显。初期诊断后，大部分的患者面临一段可变的时期(大约5至7年)，其中可通过服用药物在药理上控制此疾病，药物例如为左旋多巴(多巴胺前体)的不同制剂和/或多种多巴胺能激动剂。随着疾病发展，药物剂量增加以抵抗无情的多巴胺能神经元损失，直到出现PD因长期摄取药物相关的开关现象和副作用(左旋多巴引起的运动障碍)而再也无法以多巴胺替代疗法控制的时间点。在此阶段，患者可以以功能性神经外科手术方法治疗，包括在基底神经节回路内双侧放置电极(称为深层脑刺激的手术)。无论治疗选择如何，可用的方法仅为对症治疗，即可缓和运动相关症状但对疾病进展速率没有任何影响。典型的症状性三联征包括震颤(颤抖)、运动迟缓(动作缓慢)和僵硬(因肌肉僵硬)。除了典型的三联征之外，通常注意到一些更多的症状，这些包括步态障碍、构音障碍(言语障碍)、疼痛以及大量非运动症状(便秘、尿失禁、REM睡眠障碍、嗅觉失调和起立性低血压等)。精神症状通常也与疾病进展同时出现并可包括认知、思维、情绪和行为失调。事实上，失智常在此疾病的较晚期出现。
PD的主要的病理学特征以被称为α-突触核蛋白的错误折叠蛋白质所致的胞浆内聚集为代表。α-突触核蛋白聚集体通常被视为被称为路易体的类球状结构以及异常的神经元结构(路易体神经突)。在被称为黑质致密部的脑区域中的多巴胺能神经元中路易体的出现是神经病理学证实PD的选择标准。PD的诊断是神经学家进行临床评估之后与临床表型平衡而完成的。与此同时，使用放射性示踪剂氯多巴(多巴胺类似物)的正子发射断层摄影(PET扫描)的神经影像研究也支持PD的初期诊断，并且作为随时间的疾病进展的神经影像关联确实非常有用。
上述方法特别适用于治疗偶发性突触核蛋白病变，具体为偶发性帕金森病。本文所使用的偶发性突触核蛋白病变(也称为特发性疾病)是指与已知的特定基因突变(家族案例)不相关的突触核蛋白病变。已知与家族突触核蛋白病变相关的此类基因突变包括在选自以下基因的基因突变：LRRK2、SNCA、VPS35、GCH1、ATXN2、DNAJC13、TMEM230、GIGYF2、HTRA2、RIC3、EIF4G1、UCHL1、CHCHD2、GBA1、PRKN、PINK1、DJ1、ATP13A2、PLA2G6、FBXO7、DNAJC6、SYNJ1、SPG11、VPS13C、PODXL、PTRHD1、RAB39B、DNAJC13、TMEM230、GIGYF2、HTRA2、RIC3、EIF4G1、UCHL1和CHCHD2。这些突变进一步更详细描述于Lunati等人,The geneticlandscape of Parkinson’s disease,Rev Neurol 2018；174:628-643。
如上所述的突触核蛋白病变可与溶酶体贮积缺陷、特别是戈谢病相关。因此，在另一个具体的实施方案中，上述方法也适合用于在有需要的受试者中治疗神经性戈谢病，更具体为II型或III型戈谢病，所述方法包括将治疗有效量的如上所述的病毒颗粒、病毒载体、宿主细胞或药物组合物施用至所述受试者。
戈谢病(GD)是指一种溶酶体贮积症，更具体为神经鞘脂质代谢障碍，其特征在于在巨噬细胞-单核细胞系统的细胞中葡萄糖脑苷脂的沉积。
本文所使用的术语“溶酶体贮积症”是指因溶酶体功能缺陷所致的遗传疾病和代谢疾病。溶酶体贮积症是由溶酶体功能失调所造成，溶酶体功能失调通常是脂质、糖蛋白或所谓的黏多糖的代谢所需的单一酶缺乏的结果，其诱导物质在溶酶体内异常累积。
戈谢病是由在编码葡萄糖脑苷脂酶的酶的基因中的隐性突变所造成。在β-葡萄糖苷酶中的不同突变决定酶的剩余活性，并在很大的程度上决定表型。戈谢病具有三种常见的临床亚型：非神经性I型，其为此疾病最常见的形式；急性神经性II型，在本文中也称为第二型；以及慢性神经性III型，在本文中也称为III型。II型戈谢病(急性神经性)或III型(亚急性神经性)的特征在于出现影响中枢神经系统的原发性神经性疾病。II型戈谢病可在儿童期的任何时期间始发生，最早在出生后6个月发生，大约每100,000个安全出生的婴儿中就有1例。其特征为严重的脑干神经受累，与器官巨大相关，并通常导致在2岁之前死亡。主要症状包含肿大的脾和/或肝、癫痫、协调性差、骨骼异常、眼睛运动异常、血液异常诸如贫血以及呼吸问题。III型戈谢病发生在儿童后期和青少年期，发病率约每100,000个安全出生的婴儿中就有1例。相较于II型，症状进展较缓慢，并且包含肿大的肝和脾、广泛并且进行性的大脑损伤、眼睛运动异常、痉挛、癫痫、肢体僵硬并且吸取和吞咽能力差。
另一方面，本公开内容涉及如上所述的病毒颗粒、病毒载体、宿主细胞或药物组合物在有需要的受试者中用作为药物，更具体而言，在有需要的受试者中用于治疗神经性戈谢病，更具体为II型或III型戈谢病。
又一方面，本公开内容涉及如上所述的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物于制造药物的用途，优选用于治疗神经性戈谢病，更具体为II型或III型戈谢病。
在一个实施方案中，用于治疗神经性戈谢病、更具体为II型或III型戈谢病的病毒颗粒是包含核酸构建体的病毒颗粒，核酸构建体包含：
d)编码人葡萄糖脑苷脂酶的转基因；其中所述转基因包含SEQ ID NO：1、7、11、12或19(优选SEQ ID NO：19)或编码人葡萄糖脑苷脂酶的序列，其中人葡萄糖脑苷脂酶包含SEQ ID NO：5、6、8、17或18(优选SEQ ID NO：5或8)；
e)可操作地连接至所述转基因的启动子，并且其中所述启动子优选使所述转基因至少在黑质致密部(SNc)的神经细胞和小神经胶质细胞中表达；其中所述启动子优选为包含或由SEQ ID NO：9或21组成的CAG启动子、包含或由SEQ ID NO：2或20组成的GusB启动子、包含或由SEQ ID NO：27组成的JeT启动子或者包含或由SEQ ID NO：13组成的hSyn启动子；
f)多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：3组成的多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28组成的多腺苷酸化信号序列；
其中所述病毒颗粒为重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，优选包括AAV TT的衣壳蛋白，并且更优选包含SEQ ID NO：14的序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的序列；其中所述核酸构建体包含在病毒载体中，病毒载体还包含5'ITR和3'ITR序列，优选为腺相关病毒的5'ITR和3'ITR序列，更优选为来自AAV2血清型的5'ITR和3'ITR序列，并且其中5’ITR和3’ITR序列各自独立地包含或由SEQID NO：15或16的序列或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列组成，其中优选5'ITR包含SEQ ID NO：15的序列并且3'ITR包含SEQ ID NO：16的序列。
此外，本公开内容涉及在有需要的受试者中治疗神经性戈谢病、更具体为II型或III型戈谢病的方法，此方法包括施用至所述受试者治疗有效量的如上所述的病毒颗粒或病毒载体。
在一个实施方案中，在有需要的受试者中用于治疗神经性戈谢病、更具体为II型或III型戈谢病的方法包括将治疗有效量的包含核酸构建体的病毒颗粒施用至所述受试者，核酸构建体包含：
a)编码人葡萄糖脑苷脂酶的转基因；其中所述转基因包含SEQ ID NO：1、7、11、12或19(优选SEQ ID NO：19)或编码人葡萄糖脑苷脂酶的序列，其中人葡萄糖脑苷脂酶包含SEQ ID NO：5、6、8、17或18(优选SEQ ID NO：5或8)；
b)可操作地连接至所述转基因的启动子，并且其中所述启动子优选使转基因至少在黑质致密部(SNc)的神经细胞和小神经胶质细胞中表达；其中所述启动子优选为包含或由SEQ ID NO：9或21组成的CAG启动子、包含或由SEQ ID NO：2或20组成的GusB启动子、包含或由SEQ ID NO：27组成的JeT启动子或者包含或由SEQ ID NO：13组成的hSyn启动子；
c)多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：3组成的多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28组成的多腺苷酸化信号序列；
其中所述病毒颗粒为重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，优选包括AAV TT的衣壳蛋白，并且更优选包含SEQ ID NO：14的序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的序列；其中所述核酸构建体包含在病毒载体中，病毒载体还包含5'ITR和3'ITR序列，优选为腺相关病毒的5'ITR和3'ITR序列，更优选为来自AAV2血清型的5'ITR和3'ITR序列，并且其中5’ITR和3’ITR序列各自独立地包含或由SEQID NO：15或16的序列或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列组成，其中优选5'ITR包含SEQ ID NO：15的序列并且3'ITR包含SEQ ID NO：16的序列。
本文所使用的术语“治疗有效量”是指在一段时间内达到期望治疗结果所需的剂量的有效量，治疗结果例如为以下治疗结果的一个或多个：
-在所述受试者的黑质致密部的多巴胺能神经元中，优选在显现出α-突触核蛋白聚集体的任何其他脑区域的神经元中，α-突触核蛋白负荷的显著降低；
-如在酪氨酸阳性神经元中死亡的显著减少所示，在黑质致密部的多巴胺能神经元中有显著神经保护效果；
-在显示α-突触核蛋白聚集体的任何其他脑区域的神经元中有显著保护效果；
-由α-突触核蛋白聚集所触发的小神经胶质细胞驱动的促发炎现象的显著减少；
-α-突触核蛋白的朊病毒样跨神经元通道的显著阻断。
所使用的“α-突触核蛋白的朊病毒样跨神经元通道”是指α-突触核蛋白从神经元轴突末端传播至被表达α-突触核蛋白的轴突末端神经支配的下一个神经元的能力。
α-突触核蛋白负荷(例如在黑质致密部的多巴胺能神经元中)的显著降低可对应在至少4周的治疗后在对应脑区域(例如黑质致密部)中α-突触核蛋白聚集的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或至少90％的减少。
在一些实施方案中，在至少52周(一年)的治疗后，相较于未治疗的患者，在经治疗的患者中多巴胺能神经元的显著神经保护效果可评估为至少10％、至少20％或至少30％改善的神经元存活。
在其他具体实施方案中，使用本公开内容的产物的治疗可抑制进展或延缓发作，或降低突触核蛋白病变或神经性戈谢病的一个或多个症状的严重性。举例而言，治疗可抑制进展、延缓发作或降低一个或多个以下症状的严重程度：
-多巴胺能神经元的变性(例如在黑质致密部中)，
-运动迟缓
-肌肉僵硬
-震颤、静止性颤抖，
-受损的平衡和步态障碍
-神经精神症状，
-α-突触核蛋白的累积)
-路易体的累积
-疾病进展率
-临床运动相关量表所获得的分数
-测量认知状态的测试中所获得的分数
-神经造影PET扫描中摄取的放射性示踪剂的水平(以结合潜力测量)
-嗅觉测试
-REM睡眠障碍
-非运动症状(便秘、尿失禁、REM睡眠障碍、嗅觉失调和起立性低血压等)
-构音障碍和语言流畅性
-认知(包括进展为失智)、思维、情绪和行为失调。
在一个实施方案中，有效量的如上所述的病毒颗粒(或病毒载体)通过实质内、脑内、脑室内(icv)、鞘内或静脉内施用途径施用至受试者或患者。
在一些实施方案中，对于帕金森病，特别是偶发性帕金森病，以显现出α-突触核蛋白的累积的任何大脑区域特别是黑质致密部和大脑皮质表示目标区域。因此，治疗有效量的病毒颗粒或病毒载体优选通过实质内施用途径施用，更优选施用至黑质致密部和/或尾状壳核的脑区域。在一个实施方案中，相较于脑的其他区域，实质内施用途径可促进对SNc的优选局部施用。
本文所使用的术语“对SNc的优选局部施用”并不表示所有病毒颗粒或病毒载体都施用至SNc，而是大部分例如至少50％、至少60％、至少70％或至少80％(vg)的病毒颗粒被施用至SNc的区域或被SNc神经元神经支配的任何其他脑区域。
在脑脊髓空间中施用时，神经元转导取决于脑脊髓液循环动力学，因此预期(1)发生于室周区域，即靠近脑室的区域；(2)通过非特异性方法发生，即神经元将通过从脑室或从蛛网膜下腔扩散而转导，并且预期在上皮质层I-IV中观察到强烈的标记(例如通过从蛛网膜下腔扩散)；以及(3)发生在脑部区域诸如不连接至壳核的小脑和海马体中。考虑黑质位于远离脑室的位置，来自深层脑部(例如黑质)的神经元的脑室系统的转导不太可能发生，因此难以通过被动扩散进行转染。
相较于在脑脊髓空间中施用，在尾状壳核施用至病毒载体显现出许多优势，例如位于神经支配注射位置的大脑皮质、丘脑、杏仁核、黑质致密部和中缝背核中的神经元的特异性转导，以及在已知神经支配壳核的脑部区域中例如在投射到壳核的皮质区域的V层中的回路特异性逆向传播，而没有逆向传播至非期望的区域(例如缺乏逆向运输到已知不神经支配壳核的区域)。
因此，实质内施用途径可促进病毒颗粒局部施用至尾状壳核，从而促进转基因逆向散布至神经支配注射位置的任何脑部区域。
在优选实施方案中，病毒颗粒可以以50至1000微升(μL)的范围内的体积通过实质内施用途径施用至人受试者或患者的尾状壳核，优选为每壳核200至700μL的体积，优选以1013-1014vg/mL(vg：病毒基因组)的范围内的浓度。在具体的实施方案中，所述病毒颗粒以包括在0.5至5μL/min的范围内的注射剂量(debit)优选在2至6小时内施用。病毒颗粒的这样的高注射流速增加病毒稳定性并允许患者的更好的处理。
在某些实施方案中，所述病毒颗粒选自rAAV颗粒，优选包含选自AAV2、AAV5、AAV9、AAV-MNM004、AAV-MNM008和AAV TT血清型的衣壳蛋白。
在某些实施方案中，所述病毒颗粒是AAVretro，其包含选自以下变体血清型中的衣壳蛋白：AAV2-retro、AAV-MNM004、AAV-MNM008和AAV-TT。
在一个实施方案中，AAV-TT颗粒可以以50至1000μL的范围内的体积(优选每壳核200至700μL)优选以1013-1014vg/mL(vg：病毒基因组)的范围内的浓度通过实质内施用途径施用至人受试者或患者至其尾状壳核。在具体的实施方案中，所述病毒颗粒以0.5至5μL/min的范围内的注射流速优选在2至6小时内施用。
在另一个实施方案中，AAV-9颗粒可以以50至1000μL的范围内的体积(优选每壳核200至700μL)优选以1013-1014vg/mL(vg：病毒基因组)的范围内的浓度通过实质内施用途径施用至人受试者或患者至其尾状壳核。在具体的实施方案中，所述病毒颗粒以0.5至5μL/min的范围内的注射流速优选在2至6小时内施用。
在一个实施方案中，实质内施用途径可促进AAV局部施用至尾状壳核，从而促进GBA1转基因逆向散布至神经支配注射位置的任何脑部区域。
本公开内容涉及病毒颗粒，优选根据本公开内容的包含GBA1转基因的AAV颗粒，用于治疗神经退化性疾病，例如突触核蛋白病变，其中所述病毒颗粒通过实质内施用途径施用至尾状壳核。
在优选实施方案中，根据本公开内容的AAV病毒颗粒可以以50至1000μL的范围内的体积(优选每壳核200至700μL)优选以1013-1014vg/mL(vg：病毒基因组)的范围内的浓度通过实质内施用途径施用至人受试者或患者至其尾状壳核，以治疗突触核蛋白病变，例如帕金森病或神经性戈谢病。在具体的实施方案中，所述病毒颗粒以0.5至5μL/min的范围内的注射流速优选在2至6小时内施用。
在具体的实施方案中，根据本公开内容的AAV-TT可通过实质内施用途径施用至人受试者或患者的尾状壳核，以治疗突触核蛋白病变，例如帕金森病或神经性戈谢病。
根据本公开内容的AAV-TT颗粒可以以50至1000μL的范围内的体积(优选每壳核200至700μL)优选以1013-1014vg/mL(vg：病毒基因组)的范围内的浓度通过实质内施用途径施用至人受试者或患者至其尾状壳核，以治疗突触核蛋白病变，例如帕金森病或神经性戈谢病。在具体的实施方案中，所述病毒颗粒以0.5至5μL/min的范围内的注射流速优选在2至6小时内施用。
在优选实施方案中，提供一种重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其包含含有转基因的核酸构建体，转基因包含选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19的核苷酸序列或编码人葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列，人葡萄糖脑苷脂酶包含SEQ ID NO：5、6、8、17或18，其中所述核酸构建体还包含可操作地连接至所述转基因的启动子，其中所述rAAV颗粒包含AAV-TT衣壳蛋白，AAV-TT衣壳蛋白包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的序列，以用于治疗神经退化性疾病，例如突触核蛋白病变，优选为戈谢病(例如神经性戈谢病)或PD(例如偶发性PD)，其中所述rAAV颗粒通过实质内施用途径施用至尾状壳核，优选以50至1000μL的范围内的体积，优选每壳核200至700μL的体积，优选以1013-1014vg/mL(vg：病毒基因组)的范围内的浓度施用。在具体的实施方案中，所述病毒颗粒以0.5至5μL/min的范围内的注射流速优选在2至6小时内施用。
在进一步优选实施方案中，本公开内容涉及包含核酸构建体的病毒颗粒，核酸构建体包含：
a)编码人葡萄糖脑苷脂酶的转基因；其中所述转基因包含SEQ ID NO：1、7、11、12或19(优选SEQ ID NO：19)或编码人葡萄糖脑苷脂酶的序列，其中人葡萄糖脑苷脂酶包含SEQ ID NO：5、6、8、17或18(优选SEQ ID NO：5或8)；
b)可操作地连接至所述转基因的启动子，并且其中所述启动子优选使所述转基因至少在黑质致密部(SNc)的神经细胞和小神经胶质细胞中表达；其中所述启动子优选为包含或由SEQ ID NO：9或21组成的CAG启动子、包含或由SEQ ID NO：2或20组成的GusB启动子、包含或由SEQ ID NO：27组成的JeT启动子或者包含或由SEQ ID NO：13组成的hSyn启动子；
c)多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：3组成的多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28组成的多腺苷酸化信号序列；
其中所述病毒颗粒为重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，优选包括AAV TT的衣壳蛋白，并且更优选包含SEQ ID NO：14的序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的序列；其中所述核酸构建体包含在病毒载体中，病毒载体还包含5'ITR和3'ITR序列，优选为腺相关病毒的5'ITR和3'ITR序列，更优选为来自AAV2血清型的5'ITR和3'ITR序列，并且其中5’ITR和3’ITR序列各自独立地包含或由SEQID NO：15或16的序列或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列组成，其中优选5'ITR包含SEQ ID NO：15的序列并且3'ITR包含SEQ ID NO：16的序列；其中所述病毒颗粒是用于治疗神经退化性疾病，例如突触核蛋白病变，优选为戈谢病(例如神经性戈谢病)或PD(例如偶发性PD)，其中所述rAAV颗粒通过实质内施用途径施用至尾状壳核，优选以50至1000μL的范围内的体积，优选每壳核200至700μL的体积，优选以1013-1014vg/mL(vg：病毒基因组)的范围内的浓度施用。
在具体的实施方案中，所述病毒颗粒以0.5至5μL/min的范围内的注射流速优选在2至6小时内施用。
此外，在进一步优选实施方案中，在有需要的受试者中提供一种治疗突触核蛋白病变，优选为戈谢病(例如神经性戈谢病)或PD(例如偶发性PD)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含核酸构建体的病毒颗粒，核酸构建体包含：
a)编码人葡萄糖脑苷脂酶的转基因；其中所述转基因包含SEQ ID NO：1、7、11、12或19(优选SEQ ID NO：19)或编码人葡萄糖脑苷脂酶的序列，其中人葡萄糖脑苷脂酶包含SEQ ID NO：5、6、8、17或18(优选SEQ ID NO：5或8)；
b)可操作地连接至所述转基因的启动子，并且其中所述启动子优选使所述转基因至少在黑质致密部(SNc)的神经细胞和小神经胶质细胞中表达；其中所述启动子优选为包含或由SEQ ID NO：9或21组成的CAG启动子、包含或由SEQ ID NO：2或20组成的GusB启动子、包含或由SEQ ID NO：27组成的JeT启动子或者包含或由SEQ ID NO：13组成的hSyn启动子；
c)多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：3组成的多腺苷酸化信号序列，优选为包含或由SEQ ID NO：28组成的多腺苷酸化信号序列；
其中所述病毒颗粒为重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，优选包括AAV TT的衣壳蛋白，并且更优选包含SEQ ID NO：14的序列或具有与SEQ ID NO：14至少95％、96％、97％、98％、优选98.5％、更优选99％或99.5％同一性的序列；其中所述核酸构建体包含在病毒载体中，病毒载体还包含5'ITR和3'ITR序列，优选为腺相关病毒的5'ITR和3'ITR序列，更优选为来自AAV2血清型的5'ITR和3'ITR序列，并且其中5’ITR和3’ITR序列各自独立地包含或由SEQID NO：15或16的序列或者具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列组成，其中优选5'ITR包含SEQ ID NO：15的序列并且3'ITR包含SEQ ID NO：16的序列；其中所述rAAV颗粒通过实质内施用途径施用至尾状壳核，优选以50至1000μL的范围内的体积，优选每壳核200至700μL的体积，优选以1013-1014vg/mL(vg：病毒基因组)的范围内的浓度施用。
在具体的实施方案中，所述病毒颗粒以0.5至5μL/min的范围内的注射流速优选在2至6小时内施用。在另一个实施方案中，根据本公开内容的AAV-9可通过实质内施用途径施用至人受试者或患者的尾状壳核，以治疗突触核蛋白病变，例如帕金森病或神经性戈谢病。
根据本公开内容的所述AAV-9颗粒可以以50至1000μL的范围内的体积(优选每壳核200至700μL)优选以1013-1014vg/mL(vg：病毒基因组)的范围内的浓度通过实质内施用途径施用至人受试者或患者至其尾状壳核，以治疗突触核蛋白病变，例如帕金森病或神经性戈谢病。在具体的实施方案中，所述病毒颗粒以0.5至5μL/min的范围内的注射流速优选在2至6小时内施用。
本公开内容的产物或包含其的药物组合物的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重的因素以及产物或药物组合物在个体中引导所需反应的能力而改变。可调整剂量方案以提供最优治疗反应。
治疗有效量通常还是其中治疗上有利作用超过产品或药物组合物的任何毒性或有害作用的量。
对于任何具体受试者，可根据个体需求以及施用或管理组合物的施用的人的职业判断而随时间调整具体剂量方案。本文所述的剂量范围仅为示例性的并且并不限制可由执业医师选择的剂量范围。
在一个实施方案中，根据本公开内容的AAV病毒颗粒可以以108-1014vg/kg(vg：病毒基因组；kg：受试者或患者的体重)的范围内的量或剂量施用至人受试者或患者，以治疗突触核蛋白病变，例如偶发性帕金森病或神经性戈谢病。在更具体的实施方案中，AAV病毒颗粒以109-1013vg/kg的范围内的量施用。在更具体的实施方案中，AAV病毒颗粒可以以至少1010-1012vg/kg的剂量施用至人受试者。
此外，多剂量的这种病毒颗粒可同时或依序施用至人受试者，特别以确保载体在整个递送区域例如黑质致密部和/或尾状壳核的均匀分布。通常，3、4、5或更多次注射的剂量的病毒颗粒可通过例如实质内施用途径在相同时间点施用至递送区域，例如人受试者的黑质致密部和/或尾状壳核。
试剂盒
在另一方面，本公开内容还涉及在一个或多个容器中包含如上所述的核酸构建体、病毒载体、宿主细胞、病毒颗粒或药物组合物的试剂盒。试剂盒可包含说明书或包装材料，其描述如何将包含在试剂盒中的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物施用至患者。试剂盒中的容器可以是任何适合的材料，例如玻璃、塑料、金属等，并可以是任何适合的尺寸、形状或构造。在某些实施方案中，此试剂盒可包含一个或多个安瓶或注射器，其包含适合的液体或溶液形式的本公开内容的产品。
以下实施例通过举例说明的方式提供，并且其不旨在限制本公开内容。
实施例
用于测试并比较具有逆向运输的AAV的体内散布测定
使用生产rAAV的标准方法制备测试rAAV-GFP。测试rAAV-GFP使用具有GFP编码序列并且在CAG启动子的控制下并且具有AAV2的ITR的核酸构建体作为转基因，所述核酸构建体与AAV血清型的衣壳蛋白一起被包装以测试其逆向运输性质。
体内散布测定包括第一步骤：通过所述rAAV-GFP的实质内注射将所述测试rAAV-GFP注射至非人灵长类动物的连合后壳核中。
随后，测定包括以下步骤：在注射后一个月，计数在大脑皮质、黑质、杏仁核和尾椎板内核中表达GFP的神经元的数量。细胞计数利用AiforiaTM来进行，AiforiaTM是为了在脑组织标本中的免疫过氧化酶染色的细胞进行自动无偏倚计数而设计的全切片数位成像和深度卷积神经网络(CNN)算法(Penttinen等人,European Journal of Neuroscience2018；48:2354-2361)。
使用抗GFP抗体通过免疫过氧化氢酶染色使表达GFP的神经元可视化。表达GFP的神经元在被注射的非人灵长类动物的整个脑中被自动计数。如图20和图23所示，GFP阳性的神经元的优先位置出现于大脑皮质的深层(例如V和VI层)。除了皮质区域，将在神经支配被注射的连合后壳核的所有大脑区域中，特别是在黑质致密部、杏仁核和尾椎板内核中的表达GFP的神经元定量(图20和图23)。
1.在小鼠中的研究：
使用重组AAV血清型9通过立体定位手术对野生型小鼠(n＝11)双侧注射至SNc，其中重组AAV血清型9编码在对突触蛋白神经元有特异性的启动子的控制下的人α-突触核蛋白的突变形式(rAAV2/9-SynA53T)。每个SNc接收1.0微升的1.36x 10E13个的病毒悬浮液。当神经退化性过程已经在进行中但在达到非返回点之前(例如递送rAAV2/9-SynA53T的4周后)，编码在连续启动子GusB的控制下的GBA1基因的重组AAV9(在实施例和附图中可互换地命名为rAAV9-GBA1或rAAV2/9-GBA1)被递送至右SNc(1.0微升的1.25x 10E13个的病毒悬浮液)，连同空的不编码转基因的对照rAAV9(在实施例和附图中可互换地命名为rAAV9-null或r-AAV2/9-null)被注射至左SNc。在4周后(例如在初次递送rAAV2/9-SynA53T后8周)，处死动物并处理以进行神经病理学分析。所进行的实验计划于下文概述(图3)。
在额外队列的5只小鼠中进行的蛋白印迹分析(参见图4)显示(i)在右SNc(例如注射有rAAV2/9-GBA1的)中增强的GCase蛋白质表达水平，以及(ii)在右SNc中α-突触核蛋白的蛋白质水平明显减少。
神经病理学数据：
所进行的深度神经病理学分析显示：(1)rAAV2/9-GBA1介导的GCase的增强导致α-突触核蛋白几乎完全清除(未示出数据)。(2)α-突触核蛋白的清除也包括α-突触核蛋白的磷酸化(例如聚集)形式，以及在维持GCase的增加的表达水平下对多巴胺能神经元有明显的神经保护作用(未示出数据)。(3)在比较左相对右SNc时，在SNc中酪氨酸阳性神经元的密度的无偏倚立体估计显示统计学上非常显著的差异。在将rAAV2/9-SynA53T递送至左SNc后8周的随访中，观察到大约55％的神经元死亡，相比之下右SNc(即以rAAV2/9-GBA1治疗的)观察到24％的神经元死亡(图5)。(4)在递送rAAV2/9-GBA1后，由右SNc中的小神经胶质细胞驱动的促发炎现象被减轻。一旦多巴胺能神经元开始表达α-突触核蛋白，小神经胶质细胞就改变表型并封装表达α-突触核蛋白的神经元，可能是试图将这些神经元与周围环境隔离开。在小神经胶质细胞的形态表型中的这种转变在AAV介导的GCase增强后回复为正常形态(未示出数据)。已使用针对离子钙结合衔接子分子1(Iba1)的抗体来进行通过比较SNc的经治疗和未治疗的侧的小神经胶质细胞表型的分析，其中离子钙结合衔接子分子为对小神经胶质细胞和巨噬细胞有特异性的钙结合蛋白，其参与在活化的小神经胶质细胞中的胞膜边缘波动和吞噬作用。
综上所述，即使考虑到治疗载体为与用于疾病建模目的的相同的血清型，所获得的数据仍显示AAV2/9-GBA1的积极治疗效果。换言之，所获得的治疗效果不受先前注射的具有相同血清型的载体病毒影响。
2.rAAV2/9-GBA1在非人灵长类动物(NHP)中的研究：
使用重组AAV血清型9通过立体定位手术对野生型非人灵长类动物(食蟹猴，n＝4)双侧注射至后半SNc，其中重组AAV血清型9编码在对突触蛋白神经元有特异性的启动子的控制下的人α-突触核蛋白的突变形式(rAAV2/9-SynA53T)。每个SNc接收各自5.0微升的1.36x10E13个的病毒悬浮液的两个沉积物，在头尾间方向上间隔2mm，以试图覆盖整个尾状SNc的范围。当神经退化性过程已经在进行中但在达到非返回点之前(例如递送rAAV2/9-SynA53T的4周后)，编码在组成型启动子GusB的控制下的GBA1基因的重组AAV9(rAAV2/9-GBA1)被递送至左SNc(1.0微升的1.25x10E13个的病毒悬浮液)，连同空的不编码转基因的对照rAAV9(r-AAV2/9-null)被注射至右SNc。8周后(例如在初次递送rAAV2/9-SynA53T后12周)，处死动物并处理以进行神经病理学分析。所进行的实验计划于下文概述(图6)。
神经影像microPET研究：
在所有动物中以固定间隔进行microPET研究，包括在基线进行一次扫描，随后在将rAAV2/9-SynA53T双侧递送至SNc后的一、二和三个月进行连续扫描(例如在rAAV2/9-GBA1和rAAv2/9-null病毒载体注射后一和两个月)。选择用于这些实验的放射性示踪剂为11c-二氢四苯喹嗪，其为一种允许以高再现性获得清晰的影像的选择性VMAT2配体。所获得的结果显示在左连合后壳核中所测量到的放射性示踪剂的结合潜力高于在右连合后壳核中所观察到的(如图7所示)。
神经病理学数据：
所进行的神经病理学分析显示：(1)rAAV2/9-GBA1介导的GCase的增强减少了α-突触核蛋白负荷并对SNc中的多巴胺(TH+)神经元发挥显著的神经保护作用，以及位于注射有rAAV2/9-GBA1的左SNc同侧的尾状连合后壳核的保留的神经支配，如使用酪氨酸羟化酶的免疫组织化学染色在连合后壳核和尾状核的水平和中脑拍摄的非人灵长类动物脑部的冠状切片所示(未示出数据)。(2)在比较左相对右SNc时，在SNc中酪氨酸阳性神经元的密度的无偏倚立体估计显示统计学上非常显著的差异。在将rAAV2/9-SynA53T递送至右SNc后12周的随访中，观察到大约39％的神经元死亡，相比之下，左SNc(即以rAAV2/9-GBA1治疗的)观察到15％的神经元死亡(图8)。(3)在右额皮质的多个脑区域中观察到突变的α-突触核蛋白的朊病毒样跨神经元扩散，其中在rAAV2/9-SynA53T递送后3个月后观察到中等量的表达α-突触核蛋白的锥体神经元。最重要的是，AAV介导的在左SNc中GCase活性的增强减少α-突触核蛋白负荷，从而阻碍α-突触核蛋白的跨神经元扩散。特别地，α-突触核蛋白的免疫组织化学检测显示3个月的AAV介导的突变的α-突触核蛋白的过表达造成α-突触核蛋白聚集体的跨神经元扩散。在rAAV2/9-SynA53T递送至右SNc时，高密度的突触核蛋白阳性纤维被观察到经过前脑内侧束，导致在整个额皮质的多个大脑区域出现中等量的显现α-突触核蛋白免疫反应性的椎体神经元。相比之下，在AAV介导的在左SNc中GCase活性的增强的2个月后，观察到通过前脑内侧束的突触核蛋白阳性纤维的密度明显减少，并且实际上未观察到在额皮质中的二级标记的神经元(未示出数据)。(4)在左SNc(即以rAAV2/9-GBA1治疗的)中小神经胶质细胞驱动的促发炎现象被减轻(未示出数据)。已使用针对II类主要组织相容性复合体(MHC-II)的抗体来进行通过比较SNc的经治疗和未治疗的侧的小神经胶质细胞表型的分析，其中II类主要组织相容性复合体为活化的小神经胶质细胞表型(例如静息的小神经胶质细胞缺乏MHC-II表达)的特异性标记。
如在小鼠研究中所述，即使考虑到治疗载体为与用于疾病建模目的的相同的血清型，非人灵长类动物的数据仍显示AAV2/9-GBA1的积极治疗效果。换言之，所获得的治疗效果不受先前注射的具有相同血清型的载体病毒影响。
3.在小鼠的整个大脑皮质中GCase的逆向散布造成磷酸化的α-突触核蛋白的清除
已推测α-突触核蛋白可能以朊病毒样的方式通过脑回路发展。此现象解释疾病的临床过程，首先特征在于因位于SNc的α-突触核蛋白聚集体所致的运动症状，之后因进行性突触核蛋白病变在除了SNc以外的脑区域特别是在大脑皮质中的出现，而发展成非运动症状(失智和神经精神症状)。在此方面，值得注意的是此进行性突触核蛋白病变在影响大脑皮质时是造成PD晚期出现失智和神经精神症状的主要驱动力，因此当设计改善疾病的治疗替代方法时，找到准确地靶向这种广泛的突触核蛋白病变的方法可能是关键。换言之，疾病晚期的PD患者在遍及许多脑区域特别是大脑皮质中展现出普遍的突触核蛋白病变，并且仍需要新的治疗途径使产物广泛散布于整个待治疗的脑区域。
当考虑不同于PD的突触核蛋白病变、例如DLB时，其中主要神经病理学特征以大脑皮质中存在路易体和路易体神经突为代表，也同样十分适用。
整体而言，目前主要尚未满足的医疗需求为开发针对PD和相关的突触核蛋白病变的改善疾病策略，旨在减缓或甚至理想上阻止这些破坏性脑疾病的无情的进行性进程。因此，任何成功的治疗方法优选应有效地在整个脑部中进行α-突触核蛋白清除，特别是在面对晚期疾病阶段的PD患者时，这些患者为最有可能受益于旨在使疾病进展率最小化的治疗的患者。
因此，本发明人首先测试具有逆向运输的AAV变异颗粒是否能够从注射区域有效散布至远端区域，特别包括皮质区域。
使用重组AAV2-retro通过立体定位手术对野生型小鼠双侧注射至纹状体，其中重组AAV2-retro编码在突触蛋白神经特异性的启动子的控制下的人α-突触核蛋白的突变形式(rAAV2retro-SynA53T)。每个纹状体接收2.0微升的3.71x10E12 vp/ml的病毒悬浮液，以在神经支配被注射的纹状体的整个大脑皮质区域中进一步产生广泛的突触核蛋白病变。四周后，编码在连续启动子GusB的控制下的GBA1基因的重组AAV2-retro(rAAV2retro-GBA1)被递送至左纹状体(2.0微升；3.71x10E12 vp/ml的病毒悬浮液)，连同空的不编码转基因的对照rAAV2-retro(rAAV2retro-null)被注射至右纹状体。四周后(例如在初次递送rAAV2retro-SynA53T后8周)，处死动物并处理以进行神经病理学分析。所进行的实验计划于下文概述(图9)。
神经病理学数据：
所进行的分析显示AAV2retro-GBA1介导的GCase的增强造成在左脑半球的水平的整个大脑皮质(例如与首先注射rAAV2retro-SynA53T再注射rAAV2retro-GBA1的纹状体位于同侧的)中几乎完全清除磷酸化的α-突触核蛋白。相比之下，明显的突触核蛋白病变仍持续存在于右脑半球的多个皮质区域(例如与首先注射rAAV2retro-SynA53T再注射对照载体rAAV2retro-null的纹状体位于同侧的)中(图10)。
4.rAAV-TT-GBA1在非人灵长类动物(NHP)中的研究：
使用重组AAV血清型9通过立体定位手术对野生型非人灵长类动物(食蟹猴，n＝4)双侧注射至后半SNc，其中重组AAV血清型9编码在对突触蛋白神经元有特异性的启动子的控制下的人α-突触核蛋白的突变形式(rAAV2/9-SynA53T)。每个SNc接收各自5.0微升的1.36x10E13个的病毒悬浮液的两个沉积物，在头尾间方向上间隔2mm，以试图覆盖整个尾状SNc的范围。当神经退化性过程已经在进行中但在达到非返回点之前(例如递送rAAV2/9-SynA53T的4周后)，编码在组成型启动子CAG的控制下的GBA1基因的重组AAV-TT(rAAV-TT-GBA1)被递送至左连合后壳核(2x10微升的1x10E13个的病毒悬浮液)。以0.5μL/min的脉冲实现压力注射。在非人灵长类动物中，剂量被调整为较低的范围。然而，在人体试验中，高注射速度可使病毒稳定，并且优选的患者管理和剂量可以是0.5μL至5μL/min的范围。8周后(例如在初次递送rAAV2/9-SynA53T后12周)，处死动物并处理以进行神经病理学分析。所进行的实验计划于下文概述(图11)。
神经影像microPET研究：
在所有动物中以固定间隔进行microPET研究，包括在基线进行一次扫描，随后在将rAAV2/9-SynA53T递送后的一、二和三个月进行连续扫描(例如在rAAV-TT-GBA1病毒载体注射后一和两个月)。选择用于这些实验的放射性示踪剂为11c-二氢四苯喹嗪(11C-DTBZ)，其为一种允许以高再现性获得清晰的影像的选择性VMAT2配体。所获得的结果显示在左连合后壳核中所测量到的放射性示踪剂的结合潜力高于在递送rAAV-TT-GBA1之前1.5个月所观察到的24.44％。所获得的结果于下文说明并如图12所示。
神经病理学数据：
所进行的神经病理学分析显示：(1)rAAV-TT-GBA1介导的GCase的增强减少了α-突触核蛋白负荷并对SNc中的多巴胺(TH+)神经元发挥显著的神经保护作用，以及位于注射有rAAV2/9-GBA1的左SNc同侧的尾状连合后壳核的保留的神经支配，如使用酪氨酸羟化酶的免疫组织化学染色在连合后壳核和尾状核的水平和中脑拍摄的非人灵长类动物脑部的冠状切片所示(未示出数据)。(2)在比较左相对右SNc时，在SNc中酪氨酸阳性神经元的数量的自动计数显示统计学上非常显著的差异。在将rAAV2/9-SynA53T递送至左和右SNc后12周的随访中(例如在rAAV-TT-GBA1递送至左连合后壳核后两个月)，在左SNc的酪氨酸阳性神经元的总数被发现高于右SNc(例如未以rAAV-TT-GBA1的壳核内递送治疗的)的酪氨酸阳性神经元的总数的22.3％(图13)。在注射rAAV-TT-GBA1至左连合后壳核的4个非人灵长类动物的左和右连合后壳核中的TH品系的光密度(OD)的自动测量显示在右连合后壳核的平均OD比在左连合后壳核的OD低27.42％(后者为经rAAV-TT-GBA1的壳核内递送治疗的)(图14)。(3)此外，在比较左相对右SNc时，在SNc中的α-突触核蛋白阳性神经元的数量的自动计数显示统计学上显著的差异。在将rAAV2/9-SynA53T递送至左和右SNc后9周的随访中(例如在rAAV-TT-GBA1递送至左连合后壳核后1.5个月)，在左SNc中的表达α-突触核蛋白的神经元的总数被发现比在右SNc中(例如未以rAAV-TT-GBA1的壳核内递送治疗的)的α-突触核蛋白阳性神经元的总数低48.33％(图15)。
在左SNc中(例如与以AAV-TT-GBA1治疗的连合后壳核位于同侧的)表达α-突触核蛋白的神经元的百分比始终低于在右SNc中的(未治疗侧)(图16)。
如在小鼠研究中所述，非人灵长类动物的数据显示rAAV-TT-GBA1的积极治疗效果。
5.AAV-TT-GFP和AAV9-GFP在非人灵长类动物脑部中的生物分布和比较性能
5.1进行的实验
对多达4只成年青年雄性食蟹猴灵长类动物(体重为3.0至3.4Kg之间)注射5μL的AAV-TT-GFP(1x1013vg/mL；2只动物)或5μ1的AAV9-GFP(1x1013vg/mL；2只动物)。AAV均编码在CAG启动子控制下的GFP。
利用Hamilton注射器通过心室造影辅助的立体定位手术施用AAV。以0.5μL/min的脉冲实现压力注射。在非人灵长类动物中，剂量被调整为较低的范围。然而，在人体试验中，高注射速度可使病毒稳定，并且优选的患者管理和剂量可以是0.5μL至5μL/min的范围。在AAV递送完成时，注射针头额外放置10分钟，以使通过注射道的AAV回流最小化(图17)。在手术即将进行之前，收集体液样品(血液和CSF)并存放于-80℃。
通过心内灌注的AAV递送后一个月处死动物。在处死之前，收集体液样品(血液和CSF)并存放于-80℃。灌注物是由盐Ringer溶液，以及随后的多聚甲醛的缓冲溶液(3,000ml/动物)和1,000ml的冷冻保护溶液所组成，其中冷冻保护溶液是由10％甘油和1％DMSO在磷酸盐缓冲液0.1M、pH7.3中制成。
在以Ringer溶液灌注期间，从许多周围器官获取新鲜组织样品(例如未固定的)，这些包括心脏、肺、肝、脾、胰、肾、睾丸和纹状体肌肉(striatal muscle)。在干冰上冷冻样品并存放于-80℃。
在灌注完成后，将脑从头骨中移出，并制作约1cm宽的脑区块并保存于冷冻保护溶液中，冷冻保护溶液由20％甘油和2％DMSO在磷酸盐缓冲液0.1M、pH7.3中制成(从所有脑区块中移除软脑膜)。获得来自固定的周围器官(心脏、肺、肝、脾、胰、肾、睾丸、腹膜后神经节、松果腺和纹状体肌肉)的样品，并进一步将样品包埋于石蜡中。
在冷冻保护溶液中至少48小时后，在切片机中制造10个系列的冷冻冠状脑部切片(40μm厚)并将其收集于冷冻保护溶液中。利用在兔子中产生的初级多克隆抗体处理整个系列的切片(例如包含猴脑的每个第十个切片)以用于GFP的免疫过氧化酶检测。在与生物素化的山羊抗兔IgG孵育后，随后使用ABC试剂盒孵育切片，最后使用H2O2-DAB溶液染色。在染色完成后，将自由漂浮的切片置于显微镜载玻片上，风干过夜并用entellan盖上盖片。使用Aperio CS2切片扫描器(Leica)扫描染色的切片并使用专用软件进行处理。
5.2结果
仅在已知神经支配连合后壳核的整个脑部区域发现AAV-TT-GFP或AAV9-GFP的标记，而在未神经支配注射位置的脑部区域(例如海马体、小脑等)甚至没有观察到单个标记的神经元。此外，所获得的逆向标记为“类高尔基体”形态，即神经标记不限于细胞体，并实际上延伸至远端的树突，特别是在整个大脑皮质的位置中。还值得注意的是有时甚至可看到小的树突过程，例如树突棘。
在注射位置的事件
AAV-TT-GFP的两次注射均准确并且适当地位于连合后壳核的边界内。AAV-TT-GFP的注射位置的所获得的尺寸始终小于AAV9-GFP，在动物M295和M296(注射有AAV-TT-GFP)中覆盖28.01％和21.83％，而在注射有AAV9-GFP的动物(M297和M298)中，在注射位置中分别包含32.46％和55.86％的连合后壳核(图18)。AAV-TT-GFP的两次注射均显示完全缺乏通过注射道的AAV摄取(例如这些均为非常干净的注射)。相比之下，使用AAV9-GFP进行的注射显示通过注射道的中至高的摄取，表示所获得的结果非常有可能因位于通过连合后壳核上的白质道摄取AAV9-GFP而被假阳性标记污染(在皮质区域中可能特别不佳)。图19示出与假阳性结果相关的问题。此外，在动物M297中AAV9-GFP的递送已散布超出连合后壳核的边界，并且还包含外侧苍白球(GPe)的实质部分。
逆向散布的潜力
逆向标记的神经元的总数和所观察到的强度均与注射位置的范围直接相关。换言之，从覆盖连合后壳核的较大区域的注射位置预期有较多数量的GFP+神经元。在此方面，除了提供在感兴趣的每个区域中所观察到的神经元的数量的准确的定量之外，还需要通过被注射位置覆盖的连合后壳核区域的范围来校正该最终数量。根据使用
Figure BDA0003546518920000651
进行的定量分析提供神经元的数量(标记为“原始”和“校正”数据)。为了试图适当地比较AAV-TT相对AAV9的性能，所获得的原始数据需要通过考虑注射位置的范围而标准化。因此，计算基于注射位置尺寸的校正因子以适当地估计每个AAV的预期的逆向散布。校正因子为对于M295的x3.57，对于M296的x4.58，对于M297的x3.08，对于M298的x1.79。校正因子被用于产生如图20-25中所示的数据。
显示最强标记的脑区域
在所有动物(AAV-TT-GFP和AAV9-GFP)中，在额上回和中枢前回中观察到最强的标记(图20-21)。始终显示GFP+神经元(尽管程度较低)的其他皮质区域为前扣带回皮质、中枢后回和岛回。在中额回、下额回、眶额皮质(前眶、外侧眶和内侧眶)、上、中和下颚脑回以及在顶上小叶和缘上回中观察到稀疏的神经元标记。此外，在对侧的皮质中发现GFP+神经元为同侧皮质的类镜像表达(明显包含少得多数量的GFP+神经元)。结果与所预期的结果完全一致并且事实上非常相关，在AAV递送于连合后壳核(运动相关的壳核区域)后，在中枢前回和额上回(分别包含主要运动皮质和辅助运动区域的皮质脑回)均观察到最强的标记。关于皮质下标记，有两个特别相关的结构，即黑质致密部(SNc)和中央-束旁复合体(CM-Pf)。此外，在CM-Pf中所观察到的GFP+神经元的数量相当可观，尽管已预期，但仍应注意CM-Pf丘脑复合物为丘脑纹状体投射的主要来源。除了CM-Pf以外，在腹前、腹外侧和腹后丘脑核、中央外侧和旁中央附近板内核和中缝背核(小脑干核已知为对壳核的血清素源性投射的主要来源)中也可发现稀疏的标记。此外，在杏仁核复合物的水平所观察到的标记低于两个AAV类型的最初预期。尽管杏仁核复合物常被视为传入壳核(以及皮质、丘脑和黑质)的另一来源，但使用AAV-TT和AAV9所获得的数据清楚地显示此解剖途径的重要性在早期解剖研究中可能被高估。
纹状体传入系统
尽管本公开内容不是为此目的而设计，但所进行的定量分析可在数字上估计每个不同的纹状体传入系统(即皮质纹状体途径(同侧和对侧)、丘脑纹状体和黑质纹状体投射)的“重量”。所获得的数据显示同侧的皮质纹状体投射目前为最丰富的(平均总纹状体传入的69.37％)，随后是对侧的皮质纹状体投射神经元(总纹状体传入的15.99％)，随后是黑质纹状体投射(平均7.99％)，最后是源自中央-束旁复合体的丘脑纹状体投射(6.67％)。在此方面，还值得注意的是尽管对侧的皮质纹状体途径在涉及基底神经节功能和功能障碍的大部分研究中常被忽略，但此投射大约表示总纹状体传入的多至16％，此百分比明显高于与丘脑纹状体和黑质纹状体投射相关的百分比。
与AAV9-GFP相比，所获得的结果支持AAV-TT-GFP的较优异的性能。结果的深入比较显示相较于AAV9而言，AAV-TT为优选的候选物。AAV-TT保有一些重要的优势，特别是当处理在逆向传播方面的较高的“效力”以及通过注射道的摄取的缺乏时。AAV-TT的使用呈现假阳性的完全缺乏。
6.AAV-TT-GBA1与AAV9-GBA1的性能的比较
6.1进行的实验
通过立体定位手术将AAV2/9-SynA53T注射至野生型非人灵长类动物(食蟹猴，n＝8)(体重为4.3至10.4kg之间)的左和右黑质致密部。每个SNc接收各自5.0微升的1.26x10E12 vg/mL的病毒悬浮液的两个沉积物，在头尾间方向上间隔1mm，以试图覆盖整个尾状SNc的范围(例如共4次注射/动物)。
在AAV2/9-SynA53T的递送后6周，将重组AAV-TT递送至左连合后壳核(2x10微升的1x10E13 vg/mL的病毒悬浮液；4只动物，在头尾间方向上彼此间隔1mm的注射)，其中重组AAV-TT编码在组成型启动子CAG的控制下的GBA1基因(AAV-TT-GBA1)。8周后(例如在初次递送AAV2/9-SynA53T后12周)，处死动物并处理以进行神经病理学分析。所进行的实验计划于图26概述。利用Hamilton注射器通过心室造影辅助的立体定位手术施用AAV。以0.5μL/min的脉冲实现压力注射。在非人灵长类动物中，剂量被调整为较低的范围。然而，在人体试验中，高注射速度可使病毒稳定，并且优选的患者管理和剂量可以是0.5μL至5μL/min的范围。在AAV递送完成时，注射针头额外放置10分钟，以使通过注射道的AAV回流最小化。
在编码GBA1的载体的递送之前和在处死时，在基线(例如在以AAV9-SynA53T进行手术之前)收集体液样品(血液和CSF)。
在注射AAV9-SynA53T后4、8和12周在基线进行使用11C-二氢四苯喹嗪(11C-DTBZ)的MicroPET扫描。
通过心内灌注在AAV9-SynA53T递送后12周处死动物(例如在AAV-tt-GBA1或AAV9-GBA1注射后6周)。在处死之前，收集体液样品(血液和CSF)并存放于-80℃。灌注物是由盐Ringer溶液，以及随后的多聚甲醛的缓冲溶液(3,000ml/动物)和1,000ml的冷冻保护溶液所组成，其中冷冻保护溶液是由10％甘油和1％DMSO在磷酸盐缓冲液0.1M、pH7.3中制成。
在以Ringer溶液灌注期间，从多个周围器官获取新鲜组织样品(例如未固定的)，这些包括心脏、肺、肝、脾、胰、肾、睾丸和纹状体肌肉。样品在干冰上冷冻并存放于-80℃。
在灌注完成后，将脑从头骨中移出，并制作约1cm宽的脑区块并保存于冷冻保护溶液中，冷冻保护溶液由20％甘油和2％DMSO在磷酸盐缓冲液0.1M、pH7.3中制成(从所有脑区块中移除软脑膜)。获得来自固定的周围器官(心脏、肺、肝、脾、胰、肾、睾丸、腹膜后神经节、松果腺和纹状体肌肉)的样品，并进一步将样品包埋于石蜡中(送至MOTAC)。
在冷冻保护溶液中至少48小时后，在切片机中制造10个系列的冷冻脑部冠状切片(40m厚)并将其收集于冷冻保护溶液中。利用在山羊中产生的初级多克隆抗体处理整个系列的切片(例如包含猴脑的每个第十个切片)以用于酪氨酸羟化酶(TH)的免疫过氧化酶检测。在与生物素化的驴抗山羊IgG孵育后，随后使用ABC试剂盒孵育切片，最后使用H2O2-DAB溶液染色。此外，利用在小鼠中产生的初级多克隆抗体处理另一整个系列的切片以用于α-突触核蛋白(α-syn)的免疫过氧化酶检测。在与生物素化的驴抗小鼠IgG孵育后，随后使用ABC试剂盒孵育切片，最后使用H2O2-DAB溶液染色。在染色完成后，将自由漂浮的切片置于显微镜载玻片上，风干过夜，并用entellan盖上盖片。使用Aperio CS2切片扫描器(Leica)扫描染色的切片并使用专用软件进行处理。
6.2结果
比较AAV-TT-GBA1相对AAV9-GBA1对于α-突触核蛋白清除的性能以及在黑质纹状体投射的多巴胺能神经元中GCase的增强和α-突触核蛋白的移除的可能的神经保护作用。
神经影像microPET研究
在基线和在注射AAV9-SynA53T后4、8和12周使用11C-DTBZ进行的MicroPET扫描。通过包含连合后壳核的整个头尾间范围的感兴趣的区域(其通常包含在5至9个不同切片之间所涵盖的范围)计算放射性示踪剂结合潜力的值(图27)。
在注射AAV-TT-GBA1的动物中，相较于在递送AAV-TT-GBA1的2周(例如在AAV9-SynA53T注射后正好6周)的结合值而言，在AAV-TT-GBA1递送后6周(例如AAV9-SynA53T递送后12周)有改善的放射性示踪剂结合。所观察到的增加为1％(M282)、15％(M280)、22％(M287)和53％(M283)。当与在基线的结合值相比(例如突触核蛋白病变的诱发之前)时，所有动物所获得的值维持低于基线水平(在M280为-22％，在M287为-24％，在M282为-25％，在M283为-32％)。对于动物M280和M282的右连合后壳核(非注射侧)所获得的值维持大致相似于基线，而在动物M283和M287中观察到中等下降。
对于注射有AAV9-GBA1的动物，在动物M281、M284和M285中发现放射性示踪剂摄取的最高水平，而对动物M286没有明显影响。M281的值并不意外，应注意此动物并没有适当注射AAV9-SynA53T(错误靶向左和右黑质)。尽管在随访期间的最后，M281、M284和M285相较于基线最终达到大致相似的水平，但仍值得注意的是在相同动物的右壳核中也观察到相似的增加。
黑质纹状体神经支配(光密度)
当解释为什么黑质致密部的多巴胺能神经元在帕金森病的情况下如此容易脆弱时，已假设黑质纹状体投射的大型并且复杂的轴突分支化的独特的结构(Matsuda等人,JNeurosci.2009Jan 14；29(2):444–453)将多巴胺能神经元置于高能量收支下，使其特别容易受到导致细胞死亡的因素的影响(Bolam and Pissadaki,Mov Disord.2012 Oct；27(12):1478-83)。事实上，值得注意的是，尽管纹状体的体积从大鼠(19.9mm3)至人(6,280mm3)增加约300倍，但多巴胺能神经元的数量仅增加32倍。综上，当进行神经保护的研究时，将黑质纹状体途径保存至何种程度值得引起高度重视。
为此，覆盖连合后壳核的整个范围的10至12个等距的头尾间冠状切片被针对TH染色，并进一步分析光密度(OD)。左和右连合后壳核水平的所获得的包含OD值的数据示于图28和29中。
在整个被注射AAV-TT-GBA1的动物的连合后壳核的整个头尾间范围中，反映治疗效益的左相对右OD差异被发现始终高于被注射AAV9-GBA1的动物。
编码GBA1的AAV对多巴胺能神经元的神经保护作用
进行的研究的主要目的之一是为了评估何种程度的AAV驱动的GCase增强可对多巴胺能神经元的黑质纹状体投射发挥神经保护作用。为此，针对TH染色并且覆盖黑质的整个头尾间范围的多达14个冠状切片进行分析，以用于多巴胺能细胞计数。使用深度学习算法
Figure BDA0003546518920000691
进行分析。所获得的数据示于图30和31中。
在被注射AAV-TT-GBA1的动物中，反映治疗效益的左相对右差异被发现始终高于在被注射AAV9-GBA1的动物中的。事实上，AAV-TT-GBA1的治疗效益维持于黑质的大部分头尾间范围。
编码GBA1的AAV对α-突触核蛋白清除的作用
为了评估GCase活性的何种程度的AAV介导的增强可有效进行α-突触核蛋白的显著清除，使用针对α-syn染色并且包含左和右黑质的整个头尾间范围的14个冠状切片。使用
Figure BDA0003546518920000701
进行分析。所获得的数据示于图32和33中。
在注射有AAV-TT-GBA1的动物中，反映治疗效益的左相对右差异被发现始终较在注射有AAV9-GBA1的动物中的高出许多。事实上，AAV-TT-GBA1的治疗效益维持于黑质的大部分头尾间范围。事实上，还值得注意的是对于所有动物，发现AAV9-GBA1在α-突触核蛋白清除上的作用极小(如果有的话)(由于使用AAV9-SynA53T的手术靶向错误而未考虑将动物M281用于分析)。
TH+/α-syn+的比例
为了试图评估以AAV9-SynA53T诱导的突触核蛋白病变的整体程度，图34显示所观察到的TH+细胞与α-syn+细胞之间的比例。从所观察到的数据，可推断诱导的突触核蛋白病变为中等程度。
这些数据在以下方面明显支持AAV-TT-GBA1相对AAV9-GBA1的优异性能：(1)更好地保留黑质纹状体神经支配，(2)对多巴胺能神经元的更好的神经保护作用，以及(3)对α-突触核蛋白清除的更好的效果。
7.用于实施本发明的序列
用于实施本发明的序列如下所述(非限制性列表)：
SEQ ID NO:1:人GBA1编码核苷酸序列:
ATGGCTGGCAGTCTTACAGGTCTCCTGCTCCTGCAAGCTGTCTCTTGGGCTTCTGGGGCCAGGCCCTGTATCCCCAAATCCTTTGGATACTCATCTGTGGTGTGTGTTTGTAATGCCACTTATTGTGATAGCTTTGACCCCCCCACCTTTCCTGCACTGGGCACCTTTTCAAGGTATGAATCTACCAGGTCTGGGAGGAGGATGGAGCTGAGTATGGGGCCCATCCAAGCAAACCATACTGGCACTGGCTTGCTGCTGACACTGCAACCTGAACAGAAGTTCCAGAAAGTGAAGGGCTTTGGAGGAGCCATGACTGATGCTGCTGCCCTCAATATTTTGGCCCTGAGCCCCCCTGCTCAGAATCTCCTTTTGAAATCATACTTCTCTGAGGAGGGAATTGGATACAATATCATCAGGGTGCCAATGGCCTCATGTGACTTTAGTATTAGGACTTACACCTATGCTGATACCCCTGATGATTTCCAGCTGCATAACTTCTCATTGCCTGAGGAGGATACCAAATTGAAGATCCCACTCATTCACAGGGCCCTGCAACTGGCTCAGAGACCAGTGTCATTGCTGGCCTCCCCCTGGACCTCCCCAACTTGGCTCAAAACCAATGGGGCTGTCAATGGTAAGGGCTCTCTTAAGGGGCAGCCTGGAGACATTTACCATCAGACCTGGGCCAGGTATTTTGTGAAGTTCCTGGATGCTTATGCTGAGCACAAATTGCAATTTTGGGCTGTTACAGCTGAGAATGAACCCTCTGCAGGACTGCTGTCTGGCTATCCTTTCCAGTGCCTGGGCTTTACCCCTGAGCATCAGAGGGATTTCATTGCCAGGGACCTGGGACCTACTCTTGCCAATAGCACACACCATAATGTGAGGCTTCTGATGCTTGATGACCAGAGACTTCTGCTGCCACACTGGGCCAAGGTTGTCCTGACAGATCCTGAGGCTGCCAAGTATGTTCATGGGATTGCTGTGCACTGGTATCTGGACTTCCTTGCTCCAGCTAAGGCCACCCTGGGAGAAACACACAGGTTGTTTCCCAATACAATGCTTTTTGCATCAGAGGCCTGTGTGGGCAGTAAATTTTGGGAGCAGTCTGTTAGGCTGGGGAGCTGGGATAGAGGAATGCAATACTCCCATTCTATCATCACCAATCTGCTCTACCATGTGGTGGGGTGGACTGACTGGAACCTTGCCCTTAACCCTGAGGGTGGCCCCAATTGGGTCAGGAATTTTGTGGATAGTCCCATCATTGTGGATATCACCAAGGACACATTCTATAAGCAACCAATGTTCTATCACCTGGGTCACTTTAGTAAGTTTATCCCTGAGGGGTCCCAGAGGGTGGGACTGGTGGCTTCCCAGAAGAATGATCTGGATGCTGTGGCCCTGATGCACCCTGATGGCAGTGCTGTGGTTGTTGTTCTCAATAGAAGCTCTAAAGATGTGCCCTTGACCATCAAAGATCCAGCTGTGGGATTTCTGGAAACAATTTCCCCTGGTTATAGCATCCACACTTACCTTTGGAGAAGGCAGTGA
SEQ ID NO:2:nGUSB启动子核苷酸序列
ATTCCTGCTGGGAAAAGCAAGTGGAGGTGCTCCTTGAAGAAACAGGGGGATCCCACCGATCTCAGGGGTTCTGTTCTGGCCTGCGGCCCTGGATCGTCCAGCCTGGGTCGGGGTGGGGAGCAGACCTCGCCCTTATCGGCTGGGGCTGAGGGTGAGGGTCCCGTTTCCCCAAAGGCCTAGCCTGGGGTTCCAGCCACAAGCCCTACCGGGCAGCGCCCGGCCCCGCCCCTCCAGGCCTGGCACTCGTCCTCAACCAAGATGGCGCGGATGGCTTCAGGCGCATCACGACACCGGCGCGTCACGCGACCCGCCCTACGGGCACCTCCCGCGCTTTTCTTAGCGCCGCAGACGGTGGCCGAGCGGGGGACCGGGAAGCATGGCCCGGGCT
SEQ ID NO:3:牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号
GCCCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCACT
SEQ ID NO:4:pAAV.nGUSB.GBA1核苷酸序列
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGAGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGGAGGGGTGGAGTCGTGACAGATCTGAATTCCTGCTGGGAAAAGCAAGTGGAGGTGCTCCTTGAAGAAACAGGGGGATCCCACCGATCTCAGGGGTTCTGTTCTGGCCTGCGGCCCTGGATCGTCCAGCCTGGGTCGGGGTGGGGAGCAGACCTCGCCCTTATCGGCTGGGGCTGAGGGTGAGGGTCCCGTTTCCCCAAAGGCCTAGCCTGGGGTTCCAGCCACAAGCCCTACCGGGCAGCGCCCGGCCCCGCCCCTCCAGGCCTGGCACTCGTCCTCAACCAAGATGGCGCGGATGGCTTCAGGCGCATCACGACACCGGCGCGTCACGCGACCCGCCCTACGGGCACCTCCCGCGCTTTTCTTAGCGCCGCAGACGGTGGCCGAGCGGGGGACCGGGAAGCATGGCCCGGGCTGCAGCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTCTCTCTTTTAGATTCCAACCTTTGGAACTCAATTCAGCCACCATGGCTGGCAGTCTTACAGGTCTCCTGCTCCTGCAAGCTGTCTCTTGGGCTTCTGGGGCCAGGCCCTGTATCCCCAAATCCTTTGGATACTCATCTGTGGTGTGTGTTTGTAATGCCACTTATTGTGATAGCTTTGACCCCCCCACCTTTCCTGCACTGGGCACCTTTTCAAGGTATGAATCTACCAGGTCTGGGAGGAGGATGGAGCTGAGTATGGGGCCCATCCAAGCAAACCATACTGGCACTGGCTTGCTGCTGACACTGCAACCTGAACAGAAGTTCCAGAAAGTGAAGGGCTTTGGAGGAGCCATGACTGATGCTGCTGCCCTCAATATTTTGGCCCTGAGCCCCCCTGCTCAGAATCTCCTTTTGAAATCATACTTCTCTGAGGAGGGAATTGGATACAATATCATCAGGGTGCCAATGGCCTCATGTGACTTTAGTATTAGGACTTACACCTATGCTGATACCCCTGATGATTTCCAGCTGCATAACTTCTCATTGCCTGAGGAGGATACCAAATTGAAGATCCCACTCATTCACAGGGCCCTGCAACTGGCTCAGAGACCAGTGTCATTGCTGGCCTCCCCCTGGACCTCCCCAACTTGGCTCAAAACCAATGGGGCTGTCAATGGTAAGGGCTCTCTTAAGGGGCAGCCTGGAGACATTTACCATCAGACCTGGGCCAGGTATTTTGTGAAGTTCCTGGATGCTTATGCTGAGCACAAATTGCAATTTTGGGCTGTTACAGCTGAGAATGAACCCTCTGCAGGACTGCTGTCTGGCTATCCTTTCCAGTGCCTGGGCTTTACCCCTGAGCATCAGAGGGATTTCATTGCCAGGGACCTGGGACCTACTCTTGCCAATAGCACACACCATAATGTGAGGCT TCTGATGCTTGATGACCAGAGACTTCTGCTGCCACACTGGGCCAAGGTTGTCCTGACAGATCCTGAGGCTGCCAAGTATGTTCATGGGATTGCTGTGCACTGGTATCTGGACTTCCTTGCTCCAGCTAAGGCCACCCTGGGAGAAACACACAGGTTGTTTCCCAATACAATGCTTTTTGCATCAGAGGCCTGTGTGGGCAGTAAATTTTGGGAGCAGTCTGTTAGGCTGGGGAGCTGGGATAGAGGAATGCAATACTCCCATTCTATCATCACCAATCTGCTCTACCATGTGGTGGGGTGGACTGACTGGAACCTTGCCCTTAACCCTGAGGGTGGCCCCAATTGGGTCAGGAATTTTGTGGATAGTCCCATCATTGTGGATATCACCAAGGACACATTCTATAAGCAACCAATGTTCTATCACCTGGGTCACTTTAGTAAGTTTATCCCTGAGGGGTCCCAGAGGGTGGGACTGGTGGCTTCCCAGAAGAATGATCTGGATGCTGTGGCCCTGATGCACCCTGATGGCAGTGCTGTGGTTGTTGTTCTCAATAGAAGCTCTAAAGATGTGCCCTTGACCATCAAAGATCCAGCTGTGGGATTTCTGGAAACAATTTCCCCTGGTTATAGCATCCACACTTACCTTTGGAGAAGGCAGTGAAAATGAAGGCCTGATAATTGCACCACCAGGCCTGATAGGCCCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCACTAGTCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGATCTAGATATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC
SEQ ID NO:5没有信号肽序列的人葡萄糖脑苷脂酶的氨基酸序列(由SEQ ID NO:1编码)
ARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPIQANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFSEEGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLKIPLIHRALQLAQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAYAEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHHNVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDFLAPAKATLGETHRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHSIITNLLYHVVGWTDWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRVGLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVVVLNRSSKDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSIHTYLWRRQ
SEQ ID NO:6包含短信号肽的人葡萄糖脑苷脂酶的完整氨基酸序列(由SEQ IDNO:1编码)
MAGSLTGLLLLQAVSWASGARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPIQANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFSEEGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLKIPLIHRALQLAQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAYAEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHHNVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDFLAPAKATLGETHRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHSIITNLLYHVVGWTDWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRVGLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVVVLNRSSKDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSIHTYLWRRQ
SEQ ID NO:7人GBA1(野生型)的编码序列的完整核苷酸序列人葡萄糖脑苷脂酶mRNA,完整cds,GenBank:M19285.1>M19285.1:123-1733人葡萄糖脑苷脂酶mRNA,完整cds
ATGGAGTTTTCAAGTCCTTCCAGAGAGGAATGTCCCAAGCCTTTGAGTAGGGTAAGCATCATGGCTGGCAGCCTCACAGGTTTGCTTCTACTTCAGGCAGTGTCGTGGGCATCAGGTGCCCGCCCCTGCATCCCTAAAAGCTTCGGCTACAGCTCGGTGGTGTGTGTCTGCAATGCCACATACTGTGACTCCTTTGACCCCCCGACCTTTCCTGCCCTTGGTACCTTCAGCCGCTATGAGAGTACACGCAGTGGGCGACGGATGGAGCTGAGTATGGGGCCCATCCAGGCTAATCACACGGGCACAGGCCTGCTACTGACCCTGCAGCCAGAACAGAAGTTCCAGAAAGTGAAGGGATTTGGAGGGGCCATGACAGATGCTGCTGCTCTCAACATCCTTGCCCTGTCACCCCCTGCCCAAAATTTGCTACTTAAATCGTACTTCTCTGAAGAAGGAATCGGATATAACATCATCCGGGTACCCATGGCCAGCTGTGACTTCTCCATCCGCACCTACACCTATGCAGACACCCCTGATGATTTCCAGTTGCACAACTTCAGCCTCCCAGAGGAAGATACCAAGCTCAAGATACCCCTGATTCACCGAGCCCTGCAGTTGGCCCAGCGTCCCGTTTCACTCCTTGCCAGCCCCTGGACATCACCCACTTGGCTCAAGACCAATGGAGCGGTGAATGGGAAGGGGTCACTCAAGGGACAGCCCGGAGACATCTACCACCAGACCTGGGCCAGATACTTTGTGAAGTTCCTGGATGCCTATGCTGAGCACAAGTTACAGTTCTGGGCAGTGACAGCTGAAAATGAGCCTTCTGCTGGGCTGTTGAGTGGATACCCCTTCCAGTGCCTGGGCTTCACCCCTGAACATCAGCGAGACTTCATTGCCCGTGACCTAGGTCCTACCCTCGCCAACAGTACTCACCACAATGTCCGCCTACTCATGCTGGATGACCAACGCTTGCTGCTGCCCCACTGGGCAAAGGTGGTACTGACAGACCCAGAAGCAGCTAAATATGTTCATGGCATTGCTGTACATTGGTACCTGGACTTTCTGGCTCCAGCCAAAGCCACCCTAGGGGAGACACACCGCCTGTTCCCCAACACCATGCTCTTTGCCTCAGAGGCCTGTGTGGGCTCCAAGTTCTGGGAGCAGAGTGTGCGGCTAGGCTCCTGGGATCGAGGGATGCAGTACAGCCACAGCATCATCACGAACCTCCTGTACCATGTGGTCGGCTGGACCGACTGGAACCTTGCCCTGAACCCCGAAGGAGGACCCAATTGGGTGCGTAACTTTGTCGACAGTCCCATCATTGTAGACATCACCAAGGACACGTTTTACAAACAGCCCATGTTCTACCACCTTGGCCACTTCAGCAAGTTCATTCCTGAGGGCTCCCAGAGAGTGGGGCTGGTTGCCAGTCAGAAGAACGACCTGGACGCAGTGGCACTGATGCATCCCGATGGCTCTGCTGTTGTGGTCGTGCTAAACCGCTCCTCTAAGGATGTGCCTCTTACCATCAAGGATCCTGCTGTGGGCTTCCTGGAGACAATCTCACCTGGCTACTCCATTCACACCTACCTGTGGCATCGCCAGTGA
SEQ ID NO:8包含长信号肽的人葡萄糖脑苷脂酶的完整氨基酸序列(NCBI参考:NP_001005742.1,溶酶体酸性葡萄糖神经酰胺酶同工型1前体)
MEFSSPSREECPKPLSRVSIMAGSLTGLLLLQAVSWASGARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPIQANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFSEEGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLKIPLIHRALQLAQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAYAEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHHNVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDFLAPAKATLGETHRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHSIITNLLYHVVGWTDWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRVGLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVVVLNRSSKDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSIHTYLWRRQ
SEQ ID NO:9 CAG启动子的核苷酸序列
ctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcg
SEQ ID NO:10 GFP编码核苷酸序列
Atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtga
SEQ ID NO:11人GBA1编码核苷酸序列(IDT优化序列)
atggagttctcatctccctcacgagaagaatgtccgaaacctctttcaagagtaagcatcatggccggcagcttgaccggtcttttgttgttgcaggccgtgtcctgggcctcaggtgctaggccatgcattcctaaatccttcggctatagtagcgtggtttgcgtctgcaacgccacatactgtgacagtttcgatccacctaccttcccagcgctgggtaccttctcacggtatgaatcaacgcgatcagggcgcagaatggaactttcaatggggccaatccaagctaaccacacgggaacgggtcttctgctgacgctccaaccggaacaaaagttccaaaaggtaaaaggctttggaggtgcgatgactgatgccgcagcactcaacatcctggcgctctcaccgccggcacaaaatttgctgttgaagagttatttctcagaagaagggatcggttacaacatcatacgggtcccgatggcgagctgtgacttttctataagaacatatacctatgcggatacgcccgacgatttccaacttcataattttagtctgcctgaggaagacacaaagttgaagataccgctgatacacagagcattgcagcttgctcaacgaccggtcagcttgcttgccagcccatggacaagtccaacatggcttaagaccaatggcgcggttaatggcaagggatccctgaagggccagccgggagacatctatcatcaaacttgggcgcggtattttgtcaagttcttggacgcctacgctgagcacaaactgcagttctgggccgttaccgccgaaaatgaaccatccgccggactgctttctggctaccctttccaatgtcttggctttacgcctgaacaccaaagagacttcattgctcgggaccttggtccaacgctcgcgaacagtactcatcataatgtacgactcttgatgctcgatgaccagcgactgttgcttccacattgggccaaggtagttctgaccgaccccgaagccgctaaatacgtccacggcattgctgtccattggtaccttgactttttggctcccgcaaaagccactctgggtgaaacacacagactctttccaaacacgatgcttttcgcatcagaagcctgcgtcggaagtaaattttgggaacagtcagtaaggttgggtagttgggatcgcgggatgcaatatagtcatagcattattaccaacttgctttatcacgtcgttgggtggacagattggaacctcgcgttgaatcctgaaggcggccctaattgggtaagaaactttgttgattcacctattatcgtcgacataaccaaggacacattctacaagcaaccgatgttctatcaccttgggcatttcagtaaattcataccagagggcagccagcgcgtcgggttggtagcctctcaaaaaaacgatttggatgcggtcgctctgatgcatcccgacgggagcgcagtagtcgttgtccttaaccgaagctccaaggatgtacccctcacgattaaggaccctgctgtcgggttccttgaaactataagtcccggctatagtattcatacttatctctggagaagacagtga
SEQ ID NO:12人GBA1编码核苷酸序列（GenScript优化序列）
ATGGAGTTTTCAAGCCCCTCACGGGAAGAGTGCCCTAAGCCCCTGTCACGGGTCTCAATTATGGCCGGGAGCCTGACTGGCCTGCTGCTGCTGCAGGCCGTGAGCTGGGCATCAGGAGCCAGGCCTTGCATCCCAAAGTCTTTCGGCTACAGCTCCGTGGTGTGCGTGTGCAACGCCACCTATTGTGACTCCTTCGATCCCCCTACCTTTCCCGCCCTGGGCACATTTTCTAGATACGAGTCTACACGCAGCGGCCGGAGAATGGAGCTGAGCATGGGCCCTATCCAGGCCAATCACACCGGAACAGGCCTGCTGCTGACCCTGCAGCCAGAGCAGAAGTTCCAGAAGGTGAAGGGCTTTGGAGGAGCAATGACAGACGCAGCCGCCCTGAACATCCTGGCCCTGTCCCCACCCGCCCAGAATCTGCTGCTGAAGTCCTACTTCTCTGAGGAGGGCATCGGCTATAACATCATCCGGGTGCCCATGGCCAGCTGCGACTTTTCCATCAGAACCTACACATATGCCGATACCCCTGACGATTTCCAGCTGCACAATTTTTCCCTGCCAGAGGAGGATACAAAGCTGAAGATCCCCCTGATCCACCGGGCCCTGCAGCTGGCACAGCGGCCCGTGAGCCTGCTGGCCAGCCCCTGGACCTCCCCTACATGGCTGAAGACCAACGGCGCCGTGAATGGCAAGGGCTCTCTGAAGGGACAGCCAGGCGACATCTACCACCAGACATGGGCCAGATATTTCGTGAAGTTTCTGGATGCCTACGCCGAGCACAAGCTGCAGTTCTGGGCCGTGACCGCAGAGAACGAGCCTTCTGCCGGCCTGCTGAGCGGCTATCCCTTCCAGTGCCTGGGCTTTACACCTGAGCACCAGCGGGACTTTATCGCCAGAGATCTGGGCCCAACCCTGGCCAACTCCACACACCACAATGTGAGGCTGCTGATGCTGGACGATCAGCGCCTGCTGCTGCCTCACTGGGCCAAGGTGGTGCTGACCGACCCAGAGGCCGCCAAGTACGTGCACGGCATCGCCGTGCACTGGTATCTGGATTTCCTGGCACCAGCAAAGGCCACCCTGGGAGAGACACACCGGCTGTTCCCTAACACCATGCTGTTTGCCAGCGAGGCCTGCGTGGGCTCCAAGTTTTGGGAGCAGTCCGTGAGGCTGGGATCTTGGGACAGGGGCATGCAGTACTCCCACTCTATCATCACCAATCTGCTGTATCACGTGGTGGGCTGGACAGACTGGAACCTGGCCCTGAATCCAGAGGGCGGCCCCAACTGGGTGAGAAATTTCGTGGATAGCCCCATCATCGTGGACATCACCAAGGATACATTCTACAAGCAGCCAATGTTTTATCACCTGGGCCACTTCTCTAAGTTTATCCCAGAGGGCAGCCAGAGGGTGGGCCTGGTGGCCAGCCAGAAGAACGACCTGGATGCCGTGGCCCTGATGCACCCTGATGGCTCCGCCGTGGTGGTGGTGCTGAATCGCTCTAGCAAGGACGTGCCTCTGACCATCAAGGATCCAGCCGTGGGCTTCCTGGAGACTATTTCCCCCGGCTATTCAATTCATACCTATCTGTGGAGAAGGCAGTGA
SEQ ID NO:13 hSyn启动子的核苷酸序列(NCBI ref.NG_008437.1)AGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAG
SEQ ID NO:14 AAV TT衣壳蛋白的氨基酸序列
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRILEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPAEPDSSSGTGKSGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMASGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTMSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTAADNNNSDYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKYFPQSGVLIFGKQDSGKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQSGNTQAATSDVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL
SEQ ID NO:15 AAV2的Flip ITR的核苷酸序列
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
SEQ ID NO:16 AAV2的Flop ITR的核苷酸序列
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
SEQ ID NO:17:人GBA1同工型2氨基酸序列(NCBI Ref.NP_001165282.1)
MELSMGPIQANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFSEEGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLKIPLIHRALQLAQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAYAEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHHNVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDFLAPAKATLGETHRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHSIITNLLYHVVGWTDWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRVGLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVVVLNRSSKDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSIHTYLWRRQ
SEQ ID NO:18:人GBA1同工型3氨基酸序列(NCBI ref.NP_001165283.1)
MEFSSPSREECPKPLSRVSIMAGSLTGLLLLQAVSWASGARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPIQANHTGTGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLKIPLIHRALQLAQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAYAEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHHNVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDFLAPAKATLGETHRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHSIITNLLYHVVGWTDWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRVGLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVVVLNRSSKDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSIHTYLWRRQ
SEQ ID NO:19:人GBA1基因的编码序列的完整核苷酸序列
atggagttttcaagtccttccagagaggaatgtcccaagcctttgagtagggtaagcatcatggctggcagcctcacaggattgcttctacttcaggcagtgtcgtgggcatcaggtgcccgcccctgcatccctaaaagcttcggctacagctcggtggtgtgtgtctgcaatgccacatactgtgactcctttgaccccccgacctttcctgcccttggtaccttcagccgctatgagagtacacgcagtgggcgacggatggagctgagtatggggcccatccaggctaatcacacgggcacaggcctgctactgaccctgcagccagaacagaagttccagaaagtgaagggatttggaggggccatgacagatgctgctgctctcaacatccttgccctgtcaccccctgcccaaaatttgctacttaaatcgtacttctctgaagaaggaatcggatataacatcatccgggtacccatggccagctgtgacttctccatccgcacctacacctatgcagacacccctgatgatttccagttgcacaacttcagcctcccagaggaagataccaagctcaagatacccctgattcaccgagccctgcagttggcccagcgtcccgtttcactccttgccagcccctggacatcacccacttggctcaagaccaatggagcggtgaatgggaaggggtcactcaagggacagcccggagacatctaccaccagacctgggccagatactttgtgaagttcctggatgcctatgctgagcacaagttacagttctgggcagtgacagctgaaaatgagccttctgctgggctgttgagtggataccccttccagtgcctgggcttcacccctgaacatcagcgagacttcattgcccgtgacctaggtcctaccctcgccaacagtactcaccacaatgtccgcctactcatgctggatgaccaacgcttgctgctgccccactgggcaaaggtggtactgacagacccagaagcagctaaatatgttcatggcattgctgtacattggtacctggactttctggctccagccaaagccaccctaggggagacacaccgcctgttccccaacaccatgctctttgcctcagaggcctgtgtgggctccaagttctgggagcagagtgtgcggctaggctcctgggatcgagggatgcagtacagccacagcatcatcacgaacctcctgtaccatgtggtcggctggaccgactggaaccttgccctgaaccccgaaggaggacccaattgggtgcgtaactttgtcgacagtcccatcattgtagacatcaccaaggacacgttttacaaacagcccatgttctaccaccttggccacttcagcaagttcattcctgagggctcccagagagtggggctggttgccagtcagaagaacgacctggacgcagtggcactgatgcatcccgatggctctgctgttgtggtcgtgctaaaccgctcctctaaggatgtgcctcttaccatcaaggatcctgctgtgggcttcctggagacaatctcacctggctactccattcacacctacctgtggcgtcgccagtga
SEQ ID NO:20:nGUSB启动子核苷酸序列#2
ATTCCTGCTGGGAAAAGCAAGTGGAGGTGCTCCTTGAAGAAACAGGGGGATCCCACCGATCTCAGGGGTTCTGTTCTGGCCTGCGGCCCTGGATCGTCCAGCCTGGGTCGGGGTGGGGAGCAGACCTCGCCCTTATCGGCTGGGGCTGAGGGTGAGGGTCCCGTTTCCCCAAAGGCCTAGCCTGGGGTTCCAGCCACAAGCCCTACCGGGCAGCGCCCGGCCCCGCCCCTCCAGGCCTGGCACTCGTCCTCAACCAAGATGGCGCGGATGGCTTCAGGCGCATCACGACACCGGCGCGTCACGCGACCCGCCCTACGGGCACCTCCCGCGCTTTTCTTAGCGCCGCAGACGGTGGCCGAGCGGGGGACCGGGAAGC
SEQ ID NO:21 CAG启动子#2的核苷酸序列
ctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgacgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacag
SEQ ID NO:22短型人泛素C(UbC)启动子的核苷酸序列
Ggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagacgaagggcgcagcgagcgtcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataagactcggccttagaaccccagtatcagcagaaggacattttaggacgggacttgggtgactctagggcactggttttctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagtagtcccttctcggcgattctgcggagggatctccgtggggcggtgaacgccgatgattatataaggacgcgccgggtgtggcacagctagttccgtcgcagccgggatttgggtcgcggttcttgtttgtggatcgctgtgatcgtcacttggt
SEQ ID NO:23长型人泛素C(UbC)启动子的核苷酸序列
ccggaggcgcggcccaaaaccgcggagggcgcccgcggggggaggagtgccgctcgcgacggtgcagtctgcttcccgcgtcgctcgcaggactaggaaggcgggcctgcgagtcctgtcgccgggcgacgagtattctgagccggaatcttggggtcatagtcgtcttcctgtaaaatcctgccctgaacccactgagatcccgtgaccaaaagaaaggtctctcgccttgtccgctccttttcatcagggaagagccgctaagacgcctccctagaggcaccccgccacttgcggctactaatatattcctgcgcggcccacaccgtgtcgatcaaggcagcgtcggccctaaacccagcgccaagaacaaacacctagcgacactagcagtgaaccactcatcgcccgacgacccgaccggccccgaaagcaccggcggcccggcgagccaccctgccttcgcacacctctctggcggttcccgacatcagacccaggcgctcgttccaacgggacttgacccccaacccccctcgcgtcgttttaccgccgacaagggctcagaacttaccttctgcgaacactccgcccgacactccagcaactttgttccaccccccgtaccacccgccgttcttgggttccagaactccggaagcgattacgccctttcgagaataagcccactctacccgaccccgtggtagacccctgggactgcacttcaaacagtgactgacctcttgagccaaacagcagacaacgcccccgccgtcaataccgccacggcaacccgtcacgtgggcatggaaaccctcgcgcgcgggagcagcacagcactgcagtgggcaagacaaccgaatattacgtcccaccccggtggacggccatccacacgccatccgaaaagaggcagcgtcctgcgtcccaagcccggatcccatccgagaggacttagctgtccgcggcctggagaccactcccctccctattcactccgcagtcaaagaaaccagccaaaatacatggatagaagaattcatcgacttcgaggccaaaacttgatacgcgagccccaaccgctcacacaaaacacttcaaaaaatccgtggaaaactttacattagtaaacccagttatacattaaaagtcacaatctgatcatttaacaggcgatttaagaccggcaaaaaccgaaaaaacaatctg
SEQ ID NO:24磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子的核苷酸序列
Gacccctctctccagccactaagccagttgctccctcggctgacggctgcacgcgaggcctccgaacgtcttacgccttgtggcgcgcccgtccttgtcccgggtgtgatggcggggtgtggggcggagggcgtggcggggaagggccggcgacgagagccgcgcgggacgactcgtcggcgataaccggtgtcgggtagcgccagccgcgcgacggtaacgagggaccgcgacaggcagacgctcccatgatcactctgcacgccgaaggcaaacagtgcaggccgtgcggcgcttggcgttccttggaagggctgaatccccgcctcgtccttcgcagcggccccccgggtgttcccatcgccgcttctaggcccactgcgacgcttgcctgcacttcttacacgctctgggtcccagccgcggcgacgcaaagggccttggtgcgggtctcgtcggcgcagggacgcgtttgggtcccgacggaaccttttccgcgttggggttgggg
SEQ ID NO:25 CBA/CBh启动子#1的核苷酸序列
AGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCGTAAGGTCATGTACTGGGCATAATGCCAGGCGGGCCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGTACTTGGCATATGATACACTTGATGTACTGCCAAGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCCATTGACGTCAATGGAAAGTCCCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAACCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCT
SEQ ID NO:26 CBA/CBh启动子#2的核苷酸序列
AGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCGTAAGGTCATGTACTGGGCATAATGCCAGGCGGGCCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGTACTTGGCATATGATACACTTGATGTACTGCCAAGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCCATTGACGTCAATGGAAAGTCCCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAACCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCAAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGTTTTACAGGCCTGAAATCACTTGGTTTTAGGTTGG
SEQ ID NO:27 JeT启动子的核苷酸序列
GAATTCGGGCGGAGTTAGGGCGGAGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTGGGCGGAGAATGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCCCTGTGATCGTCACTTGACA
SEQ ID NO:28人生长激素多A的核苷酸序列
ACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGA
序列表
<110> 应用医学研究基金会
<120> 用于通过基因疗法治疗诸如帕金森氏症的突触核蛋白病变的病毒颗粒
<130> BCT200202QT
<150> EP19382706
<151> 2019-08-12
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1551
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
atggctggca gtcttacagg tctcctgctc ctgcaagctg tctcttgggc ttctggggcc 60
aggccctgta tccccaaatc ctttggatac tcatctgtgg tgtgtgtttg taatgccact 120
tattgtgata gctttgaccc ccccaccttt cctgcactgg gcaccttttc aaggtatgaa 180
tctaccaggt ctgggaggag gatggagctg agtatggggc ccatccaagc aaaccatact 240
ggcactggct tgctgctgac actgcaacct gaacagaagt tccagaaagt gaagggcttt 300
ggaggagcca tgactgatgc tgctgccctc aatattttgg ccctgagccc ccctgctcag 360
aatctccttt tgaaatcata cttctctgag gagggaattg gatacaatat catcagggtg 420
ccaatggcct catgtgactt tagtattagg acttacacct atgctgatac ccctgatgat 480
ttccagctgc ataacttctc attgcctgag gaggatacca aattgaagat cccactcatt 540
cacagggccc tgcaactggc tcagagacca gtgtcattgc tggcctcccc ctggacctcc 600
ccaacttggc tcaaaaccaa tggggctgtc aatggtaagg gctctcttaa ggggcagcct 660
ggagacattt accatcagac ctgggccagg tattttgtga agttcctgga tgcttatgct 720
gagcacaaat tgcaattttg ggctgttaca gctgagaatg aaccctctgc aggactgctg 780
tctggctatc ctttccagtg cctgggcttt acccctgagc atcagaggga tttcattgcc 840
agggacctgg gacctactct tgccaatagc acacaccata atgtgaggct tctgatgctt 900
gatgaccaga gacttctgct gccacactgg gccaaggttg tcctgacaga tcctgaggct 960
gccaagtatg ttcatgggat tgctgtgcac tggtatctgg acttccttgc tccagctaag 1020
gccaccctgg gagaaacaca caggttgttt cccaatacaa tgctttttgc atcagaggcc 1080
tgtgtgggca gtaaattttg ggagcagtct gttaggctgg ggagctggga tagaggaatg 1140
caatactccc attctatcat caccaatctg ctctaccatg tggtggggtg gactgactgg 1200
aaccttgccc ttaaccctga gggtggcccc aattgggtca ggaattttgt ggatagtccc 1260
atcattgtgg atatcaccaa ggacacattc tataagcaac caatgttcta tcacctgggt 1320
cactttagta agtttatccc tgaggggtcc cagagggtgg gactggtggc ttcccagaag 1380
aatgatctgg atgctgtggc cctgatgcac cctgatggca gtgctgtggt tgttgttctc 1440
aatagaagct ctaaagatgt gcccttgacc atcaaagatc cagctgtggg atttctggaa 1500
acaatttccc ctggttatag catccacact tacctttgga gaaggcagtg a 1551
<210> 2
<211> 388
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
attcctgctg ggaaaagcaa gtggaggtgc tccttgaaga aacaggggga tcccaccgat 60
ctcaggggtt ctgttctggc ctgcggccct ggatcgtcca gcctgggtcg gggtggggag 120
cagacctcgc ccttatcggc tggggctgag ggtgagggtc ccgtttcccc aaaggcctag 180
cctggggttc cagccacaag ccctaccggg cagcgcccgg ccccgcccct ccaggcctgg 240
cactcgtcct caaccaagat ggcgcggatg gcttcaggcg catcacgaca ccggcgcgtc 300
acgcgacccg ccctacgggc acctcccgcg cttttcttag cgccgcagac ggtggccgag 360
cgggggaccg ggaagcatgg cccgggct 388
<210> 3
<211> 208
<212> DNA
<213> 牛（Bos taurus）
<400> 3
gccctgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga 60
ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt 120
gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg 180
attgggaaga caatagcagg catgcact 208
<210> 4
<211> 5295
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组构建体
<400> 4
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
tgcatctaga ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa 480
aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag 540
agggagtggc caactccatc actaggggtt cctggagggg tggagtcgtg acagatctga 600
attcctgctg ggaaaagcaa gtggaggtgc tccttgaaga aacaggggga tcccaccgat 660
ctcaggggtt ctgttctggc ctgcggccct ggatcgtcca gcctgggtcg gggtggggag 720
cagacctcgc ccttatcggc tggggctgag ggtgagggtc ccgtttcccc aaaggcctag 780
cctggggttc cagccacaag ccctaccggg cagcgcccgg ccccgcccct ccaggcctgg 840
cactcgtcct caaccaagat ggcgcggatg gcttcaggcg catcacgaca ccggcgcgtc 900
acgcgacccg ccctacgggc acctcccgcg cttttcttag cgccgcagac ggtggccgag 960
cgggggaccg ggaagcatgg cccgggctgc agctctaagg taaatataaa atttttaagt 1020
gtataatgtg ttaaactact gattctaatt gtttctctct tttagattcc aacctttgga 1080
actcaattca gccaccatgg ctggcagtct tacaggtctc ctgctcctgc aagctgtctc 1140
ttgggcttct ggggccaggc cctgtatccc caaatccttt ggatactcat ctgtggtgtg 1200
tgtttgtaat gccacttatt gtgatagctt tgaccccccc acctttcctg cactgggcac 1260
cttttcaagg tatgaatcta ccaggtctgg gaggaggatg gagctgagta tggggcccat 1320
ccaagcaaac catactggca ctggcttgct gctgacactg caacctgaac agaagttcca 1380
gaaagtgaag ggctttggag gagccatgac tgatgctgct gccctcaata ttttggccct 1440
gagcccccct gctcagaatc tccttttgaa atcatacttc tctgaggagg gaattggata 1500
caatatcatc agggtgccaa tggcctcatg tgactttagt attaggactt acacctatgc 1560
tgatacccct gatgatttcc agctgcataa cttctcattg cctgaggagg ataccaaatt 1620
gaagatccca ctcattcaca gggccctgca actggctcag agaccagtgt cattgctggc 1680
ctccccctgg acctccccaa cttggctcaa aaccaatggg gctgtcaatg gtaagggctc 1740
tcttaagggg cagcctggag acatttacca tcagacctgg gccaggtatt ttgtgaagtt 1800
cctggatgct tatgctgagc acaaattgca attttgggct gttacagctg agaatgaacc 1860
ctctgcagga ctgctgtctg gctatccttt ccagtgcctg ggctttaccc ctgagcatca 1920
gagggatttc attgccaggg acctgggacc tactcttgcc aatagcacac accataatgt 1980
gaggcttctg atgcttgatg accagagact tctgctgcca cactgggcca aggttgtcct 2040
gacagatcct gaggctgcca agtatgttca tgggattgct gtgcactggt atctggactt 2100
ccttgctcca gctaaggcca ccctgggaga aacacacagg ttgtttccca atacaatgct 2160
ttttgcatca gaggcctgtg tgggcagtaa attttgggag cagtctgtta ggctggggag 2220
ctgggataga ggaatgcaat actcccattc tatcatcacc aatctgctct accatgtggt 2280
ggggtggact gactggaacc ttgcccttaa ccctgagggt ggccccaatt gggtcaggaa 2340
ttttgtggat agtcccatca ttgtggatat caccaaggac acattctata agcaaccaat 2400
gttctatcac ctgggtcact ttagtaagtt tatccctgag gggtcccaga gggtgggact 2460
ggtggcttcc cagaagaatg atctggatgc tgtggccctg atgcaccctg atggcagtgc 2520
tgtggttgtt gttctcaata gaagctctaa agatgtgccc ttgaccatca aagatccagc 2580
tgtgggattt ctggaaacaa tttcccctgg ttatagcatc cacacttacc tttggagaag 2640
gcagtgaaaa tgaaggcctg ataattgcac caccaggcct gataggccct gtgccttcta 2700
gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 2760
ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 2820
attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 2880
gcaggcatgc actagtccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga 2940
ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 3000
agagagggat ctagatatcg gatcccgggc ccgtcgactg cagaggcctg catgcaagct 3060
tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac 3120
acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac 3180
tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc 3240
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 3300
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 3360
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 3420
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 3480
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 3540
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 3600
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 3660
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 3720
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 3780
gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 3840
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 3900
acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 3960
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 4020
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 4080
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 4140
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 4200
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 4260
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 4320
taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 4380
cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 4440
gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 4500
gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 4560
tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 4620
gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 4680
ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 4740
ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 4800
cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 4860
ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 4920
gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 4980
ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 5040
ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 5100
tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 5160
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 5220
cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca 5280
cgaggccctt tcgtc 5295
<210> 5
<211> 497
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys
1 5 10 15
Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro
20 25 30
Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg
35 40 45
Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly
50 55 60
Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly
65 70 75 80
Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu
85 90 95
Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu
100 105 110
Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe
115 120 125
Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu
130 135 140
His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu
145 150 155 160
Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala
165 170 175
Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn
180 185 190
Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr
195 200 205
Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys
210 215 220
Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu
225 230 235 240
Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln
245 250 255
Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr
260 265 270
His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu
275 280 285
Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr
290 295 300
Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala
305 310 315 320
Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu
325 330 335
Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val
340 345 350
Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile
355 360 365
Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala
370 375 380
Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser
385 390 395 400
Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met
405 410 415
Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln
420 425 430
Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala
435 440 445
Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser
450 455 460
Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu
465 470 475 480
Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg
485 490 495
Gln
<210> 6
<211> 516
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Ala Gly Ser Leu Thr Gly Leu Leu Leu Leu Gln Ala Val Ser Trp
1 5 10 15
Ala Ser Gly Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser
20 25 30
Val Val Cys Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro
35 40 45
Thr Phe Pro Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser Thr Arg Ser
50 55 60
Gly Arg Arg Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr
65 70 75 80
Gly Thr Gly Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys
85 90 95
Val Lys Gly Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile
100 105 110
Leu Ala Leu Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe
115 120 125
Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser
130 135 140
Cys Asp Phe Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp
145 150 155 160
Phe Gln Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys
165 170 175
Ile Pro Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser
180 185 190
Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly
195 200 205
Ala Val Asn Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr
210 215 220
His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala
225 230 235 240
Glu His Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser
245 250 255
Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro
260 265 270
Glu His Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala
275 280 285
Asn Ser Thr His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg
290 295 300
Leu Leu Leu Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala
305 310 315 320
Ala Lys Tyr Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu
325 330 335
Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn
340 345 350
Thr Met Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu
355 360 365
Gln Ser Val Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His
370 375 380
Ser Ile Ile Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp
385 390 395 400
Asn Leu Ala Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe
405 410 415
Val Asp Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys
420 425 430
Gln Pro Met Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu
435 440 445
Gly Ser Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp
450 455 460
Ala Val Ala Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu
465 470 475 480
Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val
485 490 495
Gly Phe Leu Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu
500 505 510
Trp Arg Arg Gln
515
<210> 7
<211> 1611
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
atggctggca gcctcacagg tttgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120
cgcccctgca tccctaaaag cttcggctac agctcggtgg tgtgtgtctg caatgccaca 180
tactgtgact cctttgaccc cccgaccttt cctgcccttg gtaccttcag ccgctatgag 240
agtacacgca gtgggcgacg gatggagctg agtatggggc ccatccaggc taatcacacg 300
ggcacaggcc tgctactgac cctgcagcca gaacagaagt tccagaaagt gaagggattt 360
ggaggggcca tgacagatgc tgctgctctc aacatccttg ccctgtcacc ccctgcccaa 420
aatttgctac ttaaatcgta cttctctgaa gaaggaatcg gatataacat catccgggta 480
cccatggcca gctgtgactt ctccatccgc acctacacct atgcagacac ccctgatgat 540
ttccagttgc acaacttcag cctcccagag gaagatacca agctcaagat acccctgatt 600
caccgagccc tgcagttggc ccagcgtccc gtttcactcc ttgccagccc ctggacatca 660
cccacttggc tcaagaccaa tggagcggtg aatgggaagg ggtcactcaa gggacagccc 720
ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780
gagcacaagt tacagttctg ggcagtgaca gctgaaaatg agccttctgc tgggctgttg 840
agtggatacc ccttccagtg cctgggcttc acccctgaac atcagcgaga cttcattgcc 900
cgtgacctag gtcctaccct cgccaacagt actcaccaca atgtccgcct actcatgctg 960
gatgaccaac gcttgctgct gccccactgg gcaaaggtgg tactgacaga cccagaagca 1020
gctaaatatg ttcatggcat tgctgtacat tggtacctgg actttctggc tccagccaaa 1080
gccaccctag gggagacaca ccgcctgttc cccaacacca tgctctttgc ctcagaggcc 1140
tgtgtgggct ccaagttctg ggagcagagt gtgcggctag gctcctggga tcgagggatg 1200
cagtacagcc acagcatcat cacgaacctc ctgtaccatg tggtcggctg gaccgactgg 1260
aaccttgccc tgaaccccga aggaggaccc aattgggtgc gtaactttgt cgacagtccc 1320
atcattgtag acatcaccaa ggacacgttt tacaaacagc ccatgttcta ccaccttggc 1380
cacttcagca agttcattcc tgagggctcc cagagagtgg ggctggttgc cagtcagaag 1440
aacgacctgg acgcagtggc actgatgcat cccgatggct ctgctgttgt ggtcgtgcta 1500
aaccgctcct ctaaggatgt gcctcttacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560
acaatctcac ctggctactc cattcacacc tacctgtggc atcgccagtg a 1611
<210> 8
<211> 536
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Met Glu Phe Ser Ser Pro Ser Arg Glu Glu Cys Pro Lys Pro Leu Ser
1 5 10 15
Arg Val Ser Ile Met Ala Gly Ser Leu Thr Gly Leu Leu Leu Leu Gln
20 25 30
Ala Val Ser Trp Ala Ser Gly Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe
35 40 45
Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser
50 55 60
Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu
65 70 75 80
Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln
85 90 95
Ala Asn His Thr Gly Thr Gly Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln
100 105 110
Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu
130 135 140
Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val
145 150 155 160
Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp
165 170 175
Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp
180 185 190
Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln
195 200 205
Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu
210 215 220
Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro
225 230 235 240
Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu
245 250 255
Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu
260 265 270
Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu
275 280 285
Gly Phe Thr Pro Glu His Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly
290 295 300
Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu
305 310 315 320
Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr
325 330 335
Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr
340 345 350
Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg
355 360 365
Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser
370 375 380
Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met
385 390 395 400
Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly
405 410 415
Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp
420 425 430
Val Arg Asn Phe Val Asp Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp
435 440 445
Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys
450 455 460
Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys
465 470 475 480
Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val
485 490 495
Val Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys
500 505 510
Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile
515 520 525
His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg Gln
530 535
<210> 9
<211> 644
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组构建体
<400> 9
ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 60
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 120
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 180
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 240
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 300
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 360
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 420
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 480
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 540
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 600
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcg 644
<210> 10
<211> 720
<212> DNA
<213> Aequorea victoria
<400> 10
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtga 720
<210> 11
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人GBA1编码核苷酸序列(IDT优化序列)
<400> 11
atggagttct catctccctc acgagaagaa tgtccgaaac ctctttcaag agtaagcatc 60
atggccggca gcttgaccgg tcttttgttg ttgcaggccg tgtcctgggc ctcaggtgct 120
aggccatgca ttcctaaatc cttcggctat agtagcgtgg tttgcgtctg caacgccaca 180
tactgtgaca gtttcgatcc acctaccttc ccagcgctgg gtaccttctc acggtatgaa 240
tcaacgcgat cagggcgcag aatggaactt tcaatggggc caatccaagc taaccacacg 300
ggaacgggtc ttctgctgac gctccaaccg gaacaaaagt tccaaaaggt aaaaggcttt 360
ggaggtgcga tgactgatgc cgcagcactc aacatcctgg cgctctcacc gccggcacaa 420
aatttgctgt tgaagagtta tttctcagaa gaagggatcg gttacaacat catacgggtc 480
ccgatggcga gctgtgactt ttctataaga acatatacct atgcggatac gcccgacgat 540
ttccaacttc ataattttag tctgcctgag gaagacacaa agttgaagat accgctgata 600
cacagagcat tgcagcttgc tcaacgaccg gtcagcttgc ttgccagccc atggacaagt 660
ccaacatggc ttaagaccaa tggcgcggtt aatggcaagg gatccctgaa gggccagccg 720
ggagacatct atcatcaaac ttgggcgcgg tattttgtca agttcttgga cgcctacgct 780
gagcacaaac tgcagttctg ggccgttacc gccgaaaatg aaccatccgc cggactgctt 840
tctggctacc ctttccaatg tcttggcttt acgcctgaac accaaagaga cttcattgct 900
cgggaccttg gtccaacgct cgcgaacagt actcatcata atgtacgact cttgatgctc 960
gatgaccagc gactgttgct tccacattgg gccaaggtag ttctgaccga ccccgaagcc 1020
gctaaatacg tccacggcat tgctgtccat tggtaccttg actttttggc tcccgcaaaa 1080
gccactctgg gtgaaacaca cagactcttt ccaaacacga tgcttttcgc atcagaagcc 1140
tgcgtcggaa gtaaattttg ggaacagtca gtaaggttgg gtagttggga tcgcgggatg 1200
caatatagtc atagcattat taccaacttg ctttatcacg tcgttgggtg gacagattgg 1260
aacctcgcgt tgaatcctga aggcggccct aattgggtaa gaaactttgt tgattcacct 1320
attatcgtcg acataaccaa ggacacattc tacaagcaac cgatgttcta tcaccttggg 1380
catttcagta aattcatacc agagggcagc cagcgcgtcg ggttggtagc ctctcaaaaa 1440
aacgatttgg atgcggtcgc tctgatgcat cccgacggga gcgcagtagt cgttgtcctt 1500
aaccgaagct ccaaggatgt acccctcacg attaaggacc ctgctgtcgg gttccttgaa 1560
actataagtc ccggctatag tattcatact tatctctgga gaagacagtg a 1611
<210> 12
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人GBA1编码核苷酸序列(GenScript优化序列)
<400> 12
atggagtttt caagcccctc acgggaagag tgccctaagc ccctgtcacg ggtctcaatt 60
atggccggga gcctgactgg cctgctgctg ctgcaggccg tgagctgggc atcaggagcc 120
aggccttgca tcccaaagtc tttcggctac agctccgtgg tgtgcgtgtg caacgccacc 180
tattgtgact ccttcgatcc ccctaccttt cccgccctgg gcacattttc tagatacgag 240
tctacacgca gcggccggag aatggagctg agcatgggcc ctatccaggc caatcacacc 300
ggaacaggcc tgctgctgac cctgcagcca gagcagaagt tccagaaggt gaagggcttt 360
ggaggagcaa tgacagacgc agccgccctg aacatcctgg ccctgtcccc acccgcccag 420
aatctgctgc tgaagtccta cttctctgag gagggcatcg gctataacat catccgggtg 480
cccatggcca gctgcgactt ttccatcaga acctacacat atgccgatac ccctgacgat 540
ttccagctgc acaatttttc cctgccagag gaggatacaa agctgaagat ccccctgatc 600
caccgggccc tgcagctggc acagcggccc gtgagcctgc tggccagccc ctggacctcc 660
cctacatggc tgaagaccaa cggcgccgtg aatggcaagg gctctctgaa gggacagcca 720
ggcgacatct accaccagac atgggccaga tatttcgtga agtttctgga tgcctacgcc 780
gagcacaagc tgcagttctg ggccgtgacc gcagagaacg agccttctgc cggcctgctg 840
agcggctatc ccttccagtg cctgggcttt acacctgagc accagcggga ctttatcgcc 900
agagatctgg gcccaaccct ggccaactcc acacaccaca atgtgaggct gctgatgctg 960
gacgatcagc gcctgctgct gcctcactgg gccaaggtgg tgctgaccga cccagaggcc 1020
gccaagtacg tgcacggcat cgccgtgcac tggtatctgg atttcctggc accagcaaag 1080
gccaccctgg gagagacaca ccggctgttc cctaacacca tgctgtttgc cagcgaggcc 1140
tgcgtgggct ccaagttttg ggagcagtcc gtgaggctgg gatcttggga caggggcatg 1200
cagtactccc actctatcat caccaatctg ctgtatcacg tggtgggctg gacagactgg 1260
aacctggccc tgaatccaga gggcggcccc aactgggtga gaaatttcgt ggatagcccc 1320
atcatcgtgg acatcaccaa ggatacattc tacaagcagc caatgtttta tcacctgggc 1380
cacttctcta agtttatccc agagggcagc cagagggtgg gcctggtggc cagccagaag 1440
aacgacctgg atgccgtggc cctgatgcac cctgatggct ccgccgtggt ggtggtgctg 1500
aatcgctcta gcaaggacgt gcctctgacc atcaaggatc cagccgtggg cttcctggag 1560
actatttccc ccggctattc aattcatacc tatctgtgga gaaggcagtg a 1611
<210> 13
<211> 448
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
agtgcaagtg ggttttagga ccaggatgag gcggggtggg ggtgcctacc tgacgaccga 60
ccccgaccca ctggacaagc acccaacccc cattccccaa attgcgcatc ccctatcaga 120
gagggggagg ggaaacagga tgcggcgagg cgcgtgcgca ctgccagctt cagcaccgcg 180
gacagtgcct tcgcccccgc ctggcggcgc gcgccaccgc cgcctcagca ctgaaggcgc 240
gctgacgtca ctcgccggtc ccccgcaaac tccccttccc ggccaccttg gtcgcgtccg 300
cgccgccgcc ggcccagccg gaccgcacca cgcgaggcgc gagatagggg ggcacgggcg 360
cgaccatctg cgctgcggcg ccggcgactc agcgctgcct cagtctgcgg tgggcagcgg 420
aggagtcgtg tcgtgcctga gagcgcag 448
<210> 14
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV TT衣壳蛋白
<400> 14
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Ala Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435 440 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Met Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450 455 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ala Ala Asp Asn Asn
485 490 495
Asn Ser Asp Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515 520 525
Asp Glu Glu Lys Tyr Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530 535 540
Gln Asp Ser Gly Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545 550 555 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565 570 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Ser Gly Asn Thr Gln Ala Ala Thr
580 585 590
Ser Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp
595 600 605
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr
610 615 620
Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys
625 630 635 640
His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn
645 650 655
Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln
660 665 670
Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys
675 680 685
Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr
690 695 700
Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr
705 710 715 720
Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 15
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV2的Flip ITR
<400> 15
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcct 145
<210> 16
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV2的Flop ITR
<400> 16
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145
<210> 17
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly
1 5 10 15
Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly
20 25 30
Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu
35 40 45
Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu
50 55 60
Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe
65 70 75 80
Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu
85 90 95
His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu
100 105 110
Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala
115 120 125
Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr
145 150 155 160
Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys
165 170 175
Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu
180 185 190
Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln
195 200 205
Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr
210 215 220
His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu
225 230 235 240
Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr
245 250 255
Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala
260 265 270
Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu
275 280 285
Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val
290 295 300
Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile
305 310 315 320
Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala
325 330 335
Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser
340 345 350
Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met
355 360 365
Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln
370 375 380
Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala
385 390 395 400
Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser
405 410 415
Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu
420 425 430
Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg
435 440 445
Gln
<210> 18
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly
1 5 10 15
Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly
20 25 30
Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu
35 40 45
Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu
50 55 60
Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe
65 70 75 80
Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu
85 90 95
His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu
100 105 110
Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala
115 120 125
Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr
145 150 155 160
Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys
165 170 175
Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu
180 185 190
Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln
195 200 205
Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr
210 215 220
His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu
225 230 235 240
Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr
245 250 255
Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala
260 265 270
Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu
275 280 285
Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val
290 295 300
Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile
305 310 315 320
Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala
325 330 335
Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser
340 345 350
Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met
355 360 365
Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln
370 375 380
Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala
385 390 395 400
Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser
405 410 415
Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu
420 425 430
Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg
435 440 445
Gln
<210> 19
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人GBA1基因变体
<400> 19
atggagtttt caagtccttc cagagaggaa tgtcccaagc ctttgagtag ggtaagcatc 60
atggctggca gcctcacagg attgcttcta cttcaggcag tgtcgtgggc atcaggtgcc 120
cgcccctgca tccctaaaag cttcggctac agctcggtgg tgtgtgtctg caatgccaca 180
tactgtgact cctttgaccc cccgaccttt cctgcccttg gtaccttcag ccgctatgag 240
agtacacgca gtgggcgacg gatggagctg agtatggggc ccatccaggc taatcacacg 300
ggcacaggcc tgctactgac cctgcagcca gaacagaagt tccagaaagt gaagggattt 360
ggaggggcca tgacagatgc tgctgctctc aacatccttg ccctgtcacc ccctgcccaa 420
aatttgctac ttaaatcgta cttctctgaa gaaggaatcg gatataacat catccgggta 480
cccatggcca gctgtgactt ctccatccgc acctacacct atgcagacac ccctgatgat 540
ttccagttgc acaacttcag cctcccagag gaagatacca agctcaagat acccctgatt 600
caccgagccc tgcagttggc ccagcgtccc gtttcactcc ttgccagccc ctggacatca 660
cccacttggc tcaagaccaa tggagcggtg aatgggaagg ggtcactcaa gggacagccc 720
ggagacatct accaccagac ctgggccaga tactttgtga agttcctgga tgcctatgct 780
gagcacaagt tacagttctg ggcagtgaca gctgaaaatg agccttctgc tgggctgttg 840
agtggatacc ccttccagtg cctgggcttc acccctgaac atcagcgaga cttcattgcc 900
cgtgacctag gtcctaccct cgccaacagt actcaccaca atgtccgcct actcatgctg 960
gatgaccaac gcttgctgct gccccactgg gcaaaggtgg tactgacaga cccagaagca 1020
gctaaatatg ttcatggcat tgctgtacat tggtacctgg actttctggc tccagccaaa 1080
gccaccctag gggagacaca ccgcctgttc cccaacacca tgctctttgc ctcagaggcc 1140
tgtgtgggct ccaagttctg ggagcagagt gtgcggctag gctcctggga tcgagggatg 1200
cagtacagcc acagcatcat cacgaacctc ctgtaccatg tggtcggctg gaccgactgg 1260
aaccttgccc tgaaccccga aggaggaccc aattgggtgc gtaactttgt cgacagtccc 1320
atcattgtag acatcaccaa ggacacgttt tacaaacagc ccatgttcta ccaccttggc 1380
cacttcagca agttcattcc tgagggctcc cagagagtgg ggctggttgc cagtcagaag 1440
aacgacctgg acgcagtggc actgatgcat cccgatggct ctgctgttgt ggtcgtgcta 1500
aaccgctcct ctaaggatgt gcctcttacc atcaaggatc ctgctgtggg cttcctggag 1560
acaatctcac ctggctactc cattcacacc tacctgtggc gtcgccagtg a 1611
<210> 20
<211> 376
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nGUSB启动子#2
<400> 20
attcctgctg ggaaaagcaa gtggaggtgc tccttgaaga aacaggggga tcccaccgat 60
ctcaggggtt ctgttctggc ctgcggccct ggatcgtcca gcctgggtcg gggtggggag 120
cagacctcgc ccttatcggc tggggctgag ggtgagggtc ccgtttcccc aaaggcctag 180
cctggggttc cagccacaag ccctaccggg cagcgcccgg ccccgcccct ccaggcctgg 240
cactcgtcct caaccaagat ggcgcggatg gcttcaggcg catcacgaca ccggcgcgtc 300
acgcgacccg ccctacgggc acctcccgcg cttttcttag cgccgcagac ggtggccgag 360
cgggggaccg ggaagc 376
<210> 21
<211> 1663
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAG启动子#2
<400> 21
ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 60
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 120
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 180
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 240
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 300
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 360
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 420
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 480
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 540
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 600
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgacgc 660
tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg 720
accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag 780
cgcttggttt aatgacggct tgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct tgaggggctc 840
cgggagggcc ctttgtgcgg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt gtgtgtgcgt 900
ggggagcgcc gcgtgcggcc cgcgctgccc ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg 960
gggctttgtg cgctccgcag tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1020
tgcggggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt gggggggtga 1080
gcagggggtg tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc ctgcaccccc ctccccgagt 1140
tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg cggggctcgc 1200
cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc cgcctcgggc 1260
cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct gtcgaggcgc 1320
ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg gacttccttt 1380
gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct ctagcgggcg 1440
cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc ttcgtgcgtc 1500
gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg gggacggctg 1560
ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag 1620
agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cag 1663
<210> 22
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 短型人泛素C(UbC)启动子
<400> 22
ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg 60
ccacgtcaga cgaagggcgc agcgagcgtc ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag 120
cggcccgctg ctcataagac tcggccttag aaccccagta tcagcagaag gacattttag 180
gacgggactt gggtgactct agggcactgg ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg 240
aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat 300
gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt 360
cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc gtcacttggt 400
<210> 23
<211> 1212
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 长型人泛素C(UbC)启动子
<400> 23
ccggaggcgc ggcccaaaac cgcggagggc gcccgcgggg ggaggagtgc cgctcgcgac 60
ggtgcagtct gcttcccgcg tcgctcgcag gactaggaag gcgggcctgc gagtcctgtc 120
gccgggcgac gagtattctg agccggaatc ttggggtcat agtcgtcttc ctgtaaaatc 180
ctgccctgaa cccactgaga tcccgtgacc aaaagaaagg tctctcgcct tgtccgctcc 240
ttttcatcag ggaagagccg ctaagacgcc tccctagagg caccccgcca cttgcggcta 300
ctaatatatt cctgcgcggc ccacaccgtg tcgatcaagg cagcgtcggc cctaaaccca 360
gcgccaagaa caaacaccta gcgacactag cagtgaacca ctcatcgccc gacgacccga 420
ccggccccga aagcaccggc ggcccggcga gccaccctgc cttcgcacac ctctctggcg 480
gttcccgaca tcagacccag gcgctcgttc caacgggact tgacccccaa cccccctcgc 540
gtcgttttac cgccgacaag ggctcagaac ttaccttctg cgaacactcc gcccgacact 600
ccagcaactt tgttccaccc cccgtaccac ccgccgttct tgggttccag aactccggaa 660
gcgattacgc cctttcgaga ataagcccac tctacccgac cccgtggtag acccctggga 720
ctgcacttca aacagtgact gacctcttga gccaaacagc agacaacgcc cccgccgtca 780
ataccgccac ggcaacccgt cacgtgggca tggaaaccct cgcgcgcggg agcagcacag 840
cactgcagtg ggcaagacaa ccgaatatta cgtcccaccc cggtggacgg ccatccacac 900
gccatccgaa aagaggcagc gtcctgcgtc ccaagcccgg atcccatccg agaggactta 960
gctgtccgcg gcctggagac cactcccctc cctattcact ccgcagtcaa agaaaccagc 1020
caaaatacat ggatagaaga attcatcgac ttcgaggcca aaacttgata cgcgagcccc 1080
aaccgctcac acaaaacact tcaaaaaatc cgtggaaaac tttacattag taaacccagt 1140
tatacattaa aagtcacaat ctgatcattt aacaggcgat ttaagaccgg caaaaaccga 1200
aaaaacaatc tg 1212
<210> 24
<211> 511
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 磷酸甘油酸激酶1 (PGK)启动子
<400> 24
gacccctctc tccagccact aagccagttg ctccctcggc tgacggctgc acgcgaggcc 60
tccgaacgtc ttacgccttg tggcgcgccc gtccttgtcc cgggtgtgat ggcggggtgt 120
ggggcggagg gcgtggcggg gaagggccgg cgacgagagc cgcgcgggac gactcgtcgg 180
cgataaccgg tgtcgggtag cgccagccgc gcgacggtaa cgagggaccg cgacaggcag 240
acgctcccat gatcactctg cacgccgaag gcaaacagtg caggccgtgc ggcgcttggc 300
gttccttgga agggctgaat ccccgcctcg tccttcgcag cggccccccg ggtgttccca 360
tcgccgcttc taggcccact gcgacgcttg cctgcacttc ttacacgctc tgggtcccag 420
ccgcggcgac gcaaagggcc ttggtgcggg tctcgtcggc gcagggacgc gtttgggtcc 480
cgacggaacc ttttccgcgt tggggttggg g 511
<210> 25
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CBA/CBh启动子
<400> 25
agatgtactg ccaagtagga aagtcccgta aggtcatgta ctgggcataa tgccaggcgg 60
gccatttacc gtcattgacg tcaatagggg gcgtacttgg catatgatac acttgatgta 120
ctgccaagtg ggcagtttac cgtaaatact ccacccattg acgtcaatgg aaagtcccta 180
ttggcgttac tatgggaaca tacgtcatta ttgacgtcaa tgggcggggg tcgttgggcg 240
gtcagccagg cgggccattt accgtaagtt atgtaacgcg gaactccata tatgggctat 300
gaactaatga ccccgtaatt gattactatt aaccacgttc tgcttcactc tccccatctc 360
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 420
gggggcgggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg 480
gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt 540
ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cggaactgaa 600
aaaccagaaa gttaactggt aagtttagtc tttttgtctt ttatttcagg tcctggtggt 660
gcaaatcaaa gaactgctcc tcagtggatg ttgcctttac ttctaggcct gtacggaagt 720
gttacttctg ctctaaaagc t 741
<210> 26
<211> 818
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CBA/CBh启动子
<400> 26
agatgtactg ccaagtagga aagtcccgta aggtcatgta ctgggcataa tgccaggcgg 60
gccatttacc gtcattgacg tcaatagggg gcgtacttgg catatgatac acttgatgta 120
ctgccaagtg ggcagtttac cgtaaatact ccacccattg acgtcaatgg aaagtcccta 180
ttggcgttac tatgggaaca tacgtcatta ttgacgtcaa tgggcggggg tcgttgggcg 240
gtcagccagg cgggccattt accgtaagtt atgtaacgcg gaactccata tatgggctat 300
gaactaatga ccccgtaatt gattactatt aaccacgttc tgcttcactc tccccatctc 360
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 420
gggggcgggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg 480
gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt 540
ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cggggagtcg 600
ctgcgttgcc ttcgccccgt gccccgctcc gcgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct 660
gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta 720
attagcaaga ggtaagggtt taagggatgg ttggttggtg gggtattaat gtttaattac 780
ctgttttaca ggcctgaaat cacttggttt taggttgg 818
<210> 27
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> JeT启动子的核苷酸序列
<400> 27
gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 60
atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 120
gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 180
gatcgtcact tgaca 195
<210> 28
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人生长激素多A的核苷酸序列
<400> 28
acgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc 60
cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt 120
ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga 180
caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt 240
ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt 300
tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac 360
ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac 420
cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtccttc 480
tgattttgta ggtaaccacg tgcggaccga 510

Claims (34)

1.一种病毒颗粒，其包含含有编码葡萄糖脑苷脂酶的转基因的核酸构建体。
2.根据权利要求1所述的病毒颗粒，其中所述转基因包含：
a)选自SEQ ID NO：1、7、11、12和19的核苷酸序列，或
b)编码人葡萄糖脑苷脂酶的核苷酸序列，其中人葡萄糖脑苷脂酶包含SEQ ID NO：5、6、8、17或18。
3.根据权利要求1或2所述的病毒颗粒，其中所述核酸构建体还包含可操作地连接至所述转基因的启动子，并且其中所述启动子优选使所述转基因至少在黑质致密部(SNc)的神经细胞和小神经胶质细胞中表达。
4.根据权利要求3所述的病毒颗粒，其中所述启动子是普遍存在的启动子，特别是选自包含或由SEQ ID NO：2或20组成的GusB启动子、包含或由SEQ ID NO：9或21组成的CAG启动子、包含或由SEQ ID NO：27组成的JeT启动子和包含或由SEQ ID NO：13组成的hSyn启动子的启动子。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒至少同时靶向神经细胞和小神经胶质细胞。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒至少同时靶向黑质致密部中的多巴胺能神经元和小神经胶质细胞。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，优选包括选自AAV2、AAV5、AAV9、AAV-MNM004、AAV-MNM008和AAV TT的衣壳蛋白。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含AAV TT衣壳蛋白，其优选包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或与SEQ ID NO：14至少98.5％、优选99％或99.5％同一性的序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的病毒颗粒，其中所述核酸构建体还包含多腺苷酸化信号序列，优选包含SEQ ID NO：28或3、更优选SEQ ID NO：28的多腺苷酸化信号序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的病毒颗粒，其中所述核酸构建体包含在病毒载体中，所述病毒载体还包含5'ITR序列和3'ITR序列，优选腺相关病毒的5'ITR序列和3'ITR序列，更优选来自AAV2血清型的5'ITR序列和3'ITR序列，其包含或由SEQ ID NO：15和/或16的序列或具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列组成。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的病毒颗粒，其中所述病毒载体包含SEQ ID NO：4或具有与SEQ ID NO：4至少80％或至少90％同一性的核酸序列。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的病毒颗粒，其中所述核酸构建体包含在启动子的控制下的人葡萄糖脑苷脂酶的编码序列，使所述人葡萄糖脑苷脂酶至少在多巴胺能神经元和小神经胶质细胞两者中表达，其中所述病毒颗粒选自至少靶向黑质致密部的多巴胺能神经元和小神经胶质细胞的病毒颗粒，通常是包括选自AAV2、AAV5和AAV9的衣壳蛋白的AAV颗粒。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的病毒颗粒，其中所述核酸构建体包含在启动子的控制下的人葡萄糖脑苷脂酶的编码序列，使所述人葡萄糖脑苷脂酶至少在多巴胺能神经元和小神经胶质细胞两者中表达，优选至少在黑质致密部和大脑皮质的神经元中表达，其中所述病毒颗粒选自具有逆向运输的病毒颗粒，通常是包括选自AAV-MNM004、AAV-MNM008和AAV-TT的AAVretro衣壳蛋白的病毒颗粒。
14.根据权利要求1-11或13中任一项所述的包含核酸构建体的病毒颗粒，所述核酸构建体包含：
a)编码人葡萄糖脑苷脂酶的转基因，其中所述转基因包含SEQ ID NO：19或编码人葡萄糖脑苷脂酶的序列，其中人葡萄糖脑苷脂酶包含SEQ ID NO：5或8；
b)可操作地连接至所述转基因的启动子，其中所述启动子优选使所述转基因至少在黑质致密部(SNc)的神经细胞和小神经胶质细胞中表达；其中所述启动子优选是包含或由SEQID NO：9或21组成的CAG启动子、包含或由SEQ ID NO：2或20组成的GusB启动子或包含或由SEQ ID NO：27组成的JeT启动子或包含或由SEQ ID NO：13组成的hSyn启动子；
c)多腺苷酸化信号序列，优选包含SEQ ID NO：28或3、优选SEQ ID NO：28的多腺苷酸化信号序列；
其中所述病毒颗粒是重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，优选包含AAV TT的衣壳蛋白，并且更优选包含SEQ ID NO：14或具有与SEQ ID NO：14至少98.5％、优选99％或99.5％同一性的序列；其中所述核酸构建体包含在病毒载体中，所述病毒载体还包含5'ITR序列和3'ITR序列，优选腺相关病毒的5'ITR序列和3'ITR序列，更优选来自AAV2血清型的5'ITR序列和3'ITR序列，并且其中所述5'ITR序列和所述3'ITR序列各自独立地包含或由SEQ ID NO：15或16的序列或具有与SEQ ID NO：15和/或16至少80％或至少90％同一性的序列组成，其中优选5'ITR包含SEQ ID NO：15和3'ITR包含SEQ ID NO：16。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含能够逆向运输的衣壳蛋白(AAVretro)。
16.根据权利要求15所述的病毒颗粒，其中如体内散布测定所确定的，在非人灵长类动物的尾状核或壳核中进行实质注射后所述病毒颗粒能够散布于大脑皮质中，优选至少散布至黑质致密部和大脑皮质。
17.一种体内散布测定，其包含以下步骤：
a)通过实质内注射将包含编码绿色荧光蛋白(GFP)的转基因的rAAV注射至非人灵长类动物的连合后壳核中，以及
b)在注射后约一个月，计数在大脑皮质中、优选在神经支配尾状壳核的脑区域中的表达GFP的神经元的数量。
18.根据权利要求17所述的体内散布测定，其还包含步骤c)：与通过将包含编码绿色荧光蛋白(GFP)的转基因的AAV-TT通过实质内注射注射至非人灵长类动物的连合后壳核中来进行的对照实验组比较在大脑皮质中、优选在神经支配尾状壳核的脑区域中表达GFP的神经元的数量。
19.根据权利要求1-16中任一项所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒选自如根据权利要求17-18中任一项所述的体内散布测定所测定的能够以与AAV-TT至少相同的水平散布于大脑皮质中、优选至少散布至黑质致密部和大脑皮质的AAVretro。
20.根据权利要求1-16和19中任一项所述的病毒颗粒，其中所述AAVretro选自AAV-MNM004、AAV-MNM008和AAV-TT。
21.根据权利要求1-16或19-20中任一项所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒包含AAVTT衣壳蛋白，其优选包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或与SEQ ID NO：14至少98.5％、优选99％或99.5％同一性的序列。
22.根据权利要求1-16或19-21中任一项所述的病毒颗粒，其用于治疗。
23.根据权利要求1-16或19-21中任一项所述的病毒颗粒，其用于在有需要的受试者中通过基因疗法治疗突触核蛋白病变。
24.根据权利要求23使用的病毒颗粒，其中所述突触核蛋白病变是人偶发性突触核蛋白病变。
25.根据权利要求23或24使用的病毒颗粒，其中所述突触核蛋白病变是帕金森病，通常是偶发性帕金森病。
26.根据权利要求23-25中任一项使用的病毒颗粒，其中待治疗的所述受试者选自患有晚期突触核蛋白病变、通常是至少H-Y 3期帕金森病的患者。
27.根据权利要求23-26中任一项使用的病毒颗粒，其中所述突触核蛋白病变不与选自LRRK2、SNCA、VPS35、GCH1、ATXN2、DNAJC13、TMEM230、GIGYF2、HTRA2、RIC3、EIF4G1、UCHL1、CHCHD2、GBA1、PRKN、PINK1、DJ1、ATP13A2、PLA2G6、FBXO7、DNAJC6、SYNJ1、SPG11、VPS13C、PODXL、PTRHD1、RAB39B、DNAJC13、TMEM230、GIGYF2、HTRA2、RIC3、EIF4G1、UCHL1和CHCHD2的基因中的至少一个突变相关。
28.根据权利要求23-27中任一项使用的病毒颗粒，其中通过实质内施用将所述病毒颗粒施用至所述受试者，优选施用至黑质致密部和/或尾状壳核的脑区域。
29.根据权利要求1-16或19-21中任一项所述的病毒颗粒，其用于治疗神经性戈谢病。
30.一种治疗有需要的受试者中的突触核蛋白病变、优选帕金森病并且更优选偶发性帕金森病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至16或19至21中任一项所述的病毒颗粒。
31.根据权利要求30所述的治疗突触核蛋白病变的方法，其中待治疗的所述受试者选自患有晚期突触核蛋白病变、通常是至少H-Y 3期帕金森病的患者。
32.根据权利要求30或31所述的治疗突触核蛋白病变的方法，其中所述突触核蛋白病变不与选自LRRK2、SNCA、VPS35、GCH1、ATXN2、DNAJC13、TMEM230、GIGYF2、HTRA2、RIC3、EIF4G1、UCHL1、CHCHD2、GBA1、PRKN、PINK1、DJ1、ATP13A2、PLA2G6、FBXO7、DNAJC6、SYNJ1、SPG11、VPS13C、PODXL、PTRHD1、RAB39B、DNAJC13、TMEM230、GIGYF2、HTRA2、RIC3、EIF4G1、UCHL1和CHCHD2的基因中的至少一个突变相关。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的治疗突触核蛋白病变的方法，其中通过实质内施用将所述病毒颗粒施用至所述受试者，优选施用至黑质致密部和/或尾状壳核的脑区域。
34.一种治疗有需要的受试者中的神经性戈谢病的方法，所述方法向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至16或19至21中任一项所述的病毒颗粒。
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