CN115029347A - 识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列、重组质粒、抑制病毒 - Google Patents

识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列、重组质粒、抑制病毒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列、重组质粒、抑制病毒。该分子监测序列中由5’端至3’端依次连接STAT3增强子和特异性最短启动子；特异性最短启动子为肝特异性最短启动子或肾特异性最短启动子。本发明的分子监测序列，只在指定器官中STAT3转录因子激活的细胞亚群体产生活性，不仅可以特异性对这类病变细胞亚群产生报告效应，也可帮助测试潜在有治疗功能的基因元件，提高了肝肾细胞纤维化研究的效率，实现智能精准识别肝肾细胞纤维化。

Description

识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列、重组质粒、抑制 病毒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列、重组质粒、抑制病毒。
背景技术
肝纤维化是肝炎长期慢性病变产生的病理反应，长期的肝纤维化进程会促进肝硬化，导致肝功能严重受损，并有进一步癌变的巨大风险；而长期的肾炎肾损伤也会诱导肾脏出现纤维化现象，导致肾器官缩小，肾功能逐渐丧失。尽管当前不少基因被发现具有阻碍肝肾器官纤维化进程的作用，但如何精确地在肝肾纤维化的病理细胞中高精度地表达这些纤维化抑制基因目前仍有待开发。同样，虽然现已发现STAT3信号通路的激活是主要的肝肾纤维化驱动性因素，也发现mir-122、mir-145是区分正常代谢肝细胞与纤维化代谢不良病变肝细胞的关键分子信号,mir-29、mir-200是区分正常肾细胞与纤维化病变肾细胞的关键分子信号。但是，目前尚无报道如何通过识别STAT3信号激活来区分肝肾纤维化病变组织细胞与正常健康细胞。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列、重组质粒、抑制病毒。
本发明提供一种识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，所述分子监测序列中，由5’端至3’端依次连接STAT3增强子和特异性最短启动子；所述特异性最短启动子为肝特异性最短启动子或肾特异性最短启动子。
本发明还可以通过以下进一步技术方案实现：
进一步，所述STAT3增强子的序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述肝特异性最短启动子的序列如SEQ ID NO.2所示；所述肾特异性最短启动子的序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述特异性最短启动子的3’端依次连接经过密码子优化的功能基因和细胞纤维化分子信号的互补靶向序列；所述功能基因受所述互补靶向序列的反向调控。
进一步，所述分子监测序列为识别肝细胞纤维化的分子监测序列，由5’端至3’端，依次连接5’反向末端重复序列、所述STAT3增强子、所述肝特异性最短启动子、所述经过密码子优化的功能基因、所述互补靶向序列、Poly(A)尾巴以及3’反向末端重复序列；
其中，所述互补靶向序列为mir-122和mir-145的互补靶向序列；
所述经过密码子优化的功能基因为mScarlet，SIRT1或PLAU基因中的一种。
进一步，所述mir-122的互补靶向序列如SEQ ID NO.4所示；所述mir-145的互补靶向序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步，所述分子监测序列为识别肾细胞纤维化的分子监测序列，由5’端至3’端，依次连接5’反向末端重复序列、所述STAT3增强子、所述肾特异性最短启动子、所述经过密码子优化的功能基因、所述互补靶向序列、Poly(A)尾巴以及3’反向末端重复序列；
所述互补靶向序列为mir-29和mir-200的互补靶向序列；
其中，所述经过密码子优化的基因为mScarlet、SIRT1或PLAU基因中的一种。
进一步，所述mir-29的互补靶向序列如SEQ ID NO.6所示；所述mir-200的互补靶向序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明提供一种用于识别和调控肝肾细胞纤维化的重组质粒，所述重组质粒包括上述的分子监测序列。
本发明提供一种用于识别和调控肝肾细胞纤维化的抑制病毒，所述抑制病毒含有如上述的重组质粒。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，能够智能精准识别肝肾细胞纤维化。通过人工合成的STAT3增强子，并将该增强子与肝肾最短特异性启动子结合，确保了该监测序列只在指定器官中STAT3转录因子激活的细胞亚群体产生活性，不仅可以特异性对这类病变细胞亚群产生报告效应，也可帮助测试潜在有治疗功能的基因元件，提高了肝肾细胞纤维化研究的效率。
(2)本发明的识别和调控肝细胞纤维化的分子监测序列，含有区分正常代谢肝细胞与纤维化代谢不良病变肝细胞的关键分子信号mir-122和mir-145的互补靶向序列，可以反向调控经过密码子优化的功能基因的基因表达，实现对肝细胞纤维化的调控。
(3)本发明的识别和调控肾细胞纤维化的分子监测序列，含有区分正常代谢肝细胞与纤维化代谢不良病变肝细胞的关键分子信号mir-29和mir-200c的互补靶向序列，可以反向调控经过密码子优化的功能基因的基因表达，实现对肾细胞纤维化的调控。
(4)本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，具有高效、精准的识别和调控效果。
(5)本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，可结合在质粒上，重组质粒以腺病毒为载体，组装为抑制病毒，该抑制病毒可以作为药物制剂得到广泛应用。
附图说明
图1为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例1中制备的含有优化的mScarlet基因的肝细胞纤维化分子监测序列；
图2为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例1中制备的含有优化的SIRT1基因的肝细胞纤维化分子监测序列；
图3为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例1中制备的含有优化的PLAU基因的肝细胞纤维化分子监测序列；
图4为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例4中制备的含有优化的SIRT1基因的肾细胞纤维化分子监测序列；
图5为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例4中制备的含有优化的PLAU基因的肾细胞纤维化分子监测序列；
图6为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例2中，红色荧光阳性组和红色荧光阴性组的ɑ平滑肌纤维蛋白(SMAα蛋白)相对表达量；
图7为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例2中，肝纤维化模型+mSirt1组，肝纤维化模型+mPlau组，肝纤维化模型+mSirt1/mPlau组，肝纤维化模型组，空质粒阴性对照组的ɑ平滑肌纤维蛋白(SMAα蛋白)相对表达量；
图8为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例3中，肝纤维化模型+mSirt1组，肝纤维化模型+mPlau组，肝纤维化模型+mSirt1/mPlau组，肝纤维化模型组，空质粒阴性对照组的ɑ平滑肌纤维蛋白(SMAα蛋白)相对表达量；
图9为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例4中，肾纤维化模型+mSirt1组，肾纤维化模型+mPlau组，肾纤维化模型+mSirt1/mPlau组，肾纤维化模型组，空质粒阴性对照组的ɑ平滑肌纤维蛋白(SMAα蛋白)相对表达量。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，含有能够特异性识别STAT3转录因子的STAT3增强子和特异性最短启动子；特异性最短启动子为肝特异性最短启动子或肾特异性最短启动子。
本发明的上述分子监测序列，能够智能精准识别肝肾细胞纤维化。通过人工合成的STAT3增强子，并将该增强子与肝肾最短特异性启动子结合，确保了该监测序列只在指定器官中STAT3转录因子激活的细胞亚群体产生活性，不仅可以特异性对这类病变细胞亚群产生报告效应，也可帮助测试潜在有治疗功能的基因元件，提高了肝肾细胞纤维化研究的效率。
上述STAT3增强子与最短特异性启动子连接方式为串联，并且最短特异性启动子连接在STAT3增强子的3’端。
优选的，STAT3增强子的序列如SEQ ID NO.1所示：
5'GTTCTGCCATTGACTTCTGCCATTTCGCTTCTGGGATTGACCTTCTGCCATTCTACTTCTGCCAATTCTCTTCTGCCATTTGCCTTCTGCCATTGTACTTCTGCCATT 3'。
优选的，肝特异性最短启动子的序列如SEQ ID NO.2所示：
5'CGGCAAACATTGCAAGCAGCCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCATTTAACTTGGTTAATATTCACCGGCCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTGGCAATTAACATCTCCTCAGCTTCAGGTGAGAATC3'。
肾特异性最短启动子的序列如SEQ ID NO.3所示：
5'AGCCTCACCTCACATGCTCCTGACCCATGGGGCCTCACCATCCTGCCCAGGGCCCTGCAGAGACTGAGGGGCCTCTGCCCATCCCTGGGTGTAGGTGACTCATGCACAGGAGCACAAGGTGCTCACACATGAGCAGAAGATGGGGACTCACAAGGTTTTGCCTTCCCATAGCAAAGATGACATCCAGGAAAACACAGAGATGACACCCTCAAAGACACCCCTCCTTGACCATCACCTGCATAGAGTTCACCCATCCAGGGTCTGTAGCTGGTGGGCTCTGGATGCCCACAAAAATGACCCACTTTGCTGTGGCCCCAAGCTCTCACCAATAGCCCATATGATGTCTTCATGTCCTTCCCTGCAGGGGACCTCAGTCTTGTCCTTCAAGCCCAGACCCTTTCTATGTGGCAGGAGATGGGGAAGGGATGAAAAAGCAGGTGTGTGCACACTCACACACACACATGCACACATAGACACTGAGACACAGACATACCAATCCC3'。
优选的，分子监测序列为识别肝细胞纤维化的分子监测序列，由5’端至3’端，依次连接STAT3增强子、肝特异性最短启动子、功能基因以及互补靶向序列；互补靶向序列为mir-122和mir-145的互补靶向序列，两者的顺序可以任意设置。
进一步优选的，功能基因经过密码子优化。具体而言，序列如下：
经过密码子优化的mScarlet基因序列如SEQ ID NO.10所示：
GTGAGCAAGGGCGAGGCCGTGATCAAGGAGTTCATGAGATTCAAGGTGCACATGGAAGGAAGCATGAATGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGAGAAGGCGAGGGCAGACCTTACGAAGGCACCCAAACAGCCAAGCTCAAGGTGACAAAGGGCGGCCCTCTGCCTTTTAGCTGGGACATCCTGAGCCCCCAGTTTATGTACGGCTCTAGAGCCTTCACCAAGCACCCCGCTGACATCCCTGACTACTACAAGCAAAGCTTTCCCGAAGGATTTAAGTGGGAACGGGTGATGAACTTCGAGGATGGAGGAGCCGTGACAGTGACCCAGGACACATCGCTGGAAGACGGAACCCTGATCTACAAGGTGAAGCTGAGAGGCACCAACTTCCCTCCAGACGGCCCTGTGATGCAGAAAAAAACCATGGGCTGGGAGGCCAGCACTGAGAGACTGTATCCTGAGGACGGCGTGCTGAAGGGCGATATCAAGATGGCCCTGAGACTGAAGGACGGTGGAAGATACCTGGCCGACTTTAAGACCACCTACAAAGCCAAGAAGCCAGTGCAGATGCCTGGCGCCTACAACGTGGACAGAAAGCTCGATATCACGAGCCACAACGAAGATTACACCGTCGTGGAACAGTACGAGCGGAGCGAAGGCAGACACAGCACAGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGA。
经过密码子优化的SIRT1基因序列如SEQ ID NO.11所示：
ATGGCCGATGAGGCCGCCCTCGCCCTACAGCCTGGAGGCAGCCCGAGCGCCGCCGGTGCTGACAGAGAAGCCGCCAGCTCACCTGCCGGAGAGCCTCTGCGCAAGCGGCCACGCAGAGATGGCCCCGGCCTGGAGCGGAGCCCCGGGGAGCCTGGCGGTGCCGCTCCTGAGAGAGAGGTGCCTGCCGCCGCTAGAGGTTGTCCTGGAGCCGCCGCCGCTGCCCTGTGGAGAGAGGCCGAGGCTGAAGCTGCCGCCGCCGGCGGCGAGCAGGAGGCCCAGGCCACCGCAGCTGCCGGCGAAGGCGATAATGGCCCTGGACTGCAGGGCCCTTCTAGAGAGCCCCCCCTGGCAGACAATCTGTATGACGAAGACGACGATGATGAAGGGGAGGAAGAAGAAGAAGCCGCCGCCGCTGCCATCGGCTACAGAGACAACCTGCTCTTTGGCGATGAGATCATTACAAACGGCTTCCACAGCTGTGAAAGCGACGAAGAGGATAGGGCCAGCCACGCCAGCTCTTCTGACTGGACCCCTCGTCCAAGAATCGGACCATACACATTCGTGCAGCAGCACCTGATGATCGGCACCGACCCTAGAACAATCCTGAAGGACTTACTGCCTGAAACAATCCCTCCTCCTGAACTGGACGACATGACCCTGTGGCAGATCGTGATAAACATCCTGAGCGAGCCTCCTAAGCGGAAAAAGAGAAAAGACATCAACACCATCGAGGACGCGGTGAAACTGCTGCAGGAGTGCAAAAAAATCATCGTGCTGACAGGAGCCGGCGTGTCCGTGTCTTGTGGCATCCCCGACTTCAGAAGCAGAGACGGAATCTATGCCAGACTGGCTGTGGACTTCCCTGACCTGCCCGACCCCCAAGCAATGTTCGATATCGAATACTTCCGGAAGGACCCTCGGCCTTTCTTCAAATTCGCCAAGGAAATCTACCCCGGCCAGTTCCAGCCTAGCCTGTGTCATAAGTTCATCGCCCTGTCCGATAAGGAAGGGAAGCTGCTTAGAAATTACACCCAGAACATCGACACCCTGGAACAAGTGGCCGGCATTCAGAGAATCATTCAATGCCATGGCTCTTTTGCTACCGCTTCTTGTCTGATCTGCAAGTACAAGGTGGACTGCGAGGCCGTGCGGGGCGATATCTTCAACCAGGTGGTCCCTAGGTGCCCCCGCTGCCCTGCCGACGAGCCTCTGGCCATCATGAAACCTGAGATCGTCTTCTTCGGCGAGAACCTGCCCGAGCAGTTCCACCGGGCCATGAAATATGACAAGGATGAAGTGGACCTGCTGATCGTGATCGGCTCTAGCCTGAAAGTGCGGCCCGTTGCTCTGATCCCCTCCAGCATCCCGCACGAGGTTCCACAGATCCTGATCAACCGGGAGCCTCTGCCACACCTGCACTTCGACGTTGAGCTGCTGGGCGATTGCGACGTGATCATTAACGAGCTGTGCCACAGACTGGGCGGCGAGTACGCCAAGCTGTGCTGCAACCCCGTGAAGCTGAGCGAAATCACAGAGAAGCCTCCTCGGACCCAGAAGGAGCTGGCTTATCTGAGCGAACTGCCACCCACCCCCCTGCACGTGAGCGAGGACAGCTCTTCTCCTGAAAGAACCAGCCCTCCCGATTCTTCCGTGATCGTGACCCTGCTGGACCAGGCCGCCAAAAGTAACGACGACCTGGACGTTAGCGAATCTAAGGGCTGCATGGAAGAAAAGCCCCAGGAGGTGCAGACCAGCAGAAACGTGGAGAGCATCGCCGAGCAGATGGAAAATCCCGACCTGAAGAACGTGGGCTCTAGCACCGGCGAAAAGAACGAGCGGACAAGCGTGGCTGGCACCGTCAGAAAATGTTGGCCTAACCGGGTGGCCAAGGAACAGATCAGCAGACGGCTGGATGGCAACCAATACCTGTTCCTGCCTCCTAATCGGTACATCTTCCACGGCGCCGAGGTCTACAGCGATAGCGAGGACGATGTGCTGTCTTCCAGCTCCTGCGGCAGCAATAGCGACTCCGGAACCTGCCAGAGCCCTAGCCTGGAAGAGCCTATGGAGGATGAGTCCGAGATTGAGGAGTTCTACAACGGCCTGGAGGACGAGCCTGACGTGCCTGAGAGAGCCGGCGGCGCGGGCTTTGGCACAGATGGCGATGACCAGGAAGCTATCAATGAGGCCATCAGCGTGAAGCAGGAGGTGACCGACATGAACTACCCCTCAAACAAGTCCTGA。
经过密码子优化的Plau基因序列如SEQ ID NO.12所示：
ATGGTGTTCCACCTGAGAACCAGATACGAGCAGGCCAACTGCGACTGCCTGAACGGCGGCACCTGCGTGTCCAACAAGTACTTCAGCAACATCCACTGGTGCAACTGTCCTAAGAAGTTTGGAGGCCAGCATTGCGAGATCGACAAGAGCAAGACCTGCTACGAAGGCAACGGTCATTTCTACAGAGGCAAGGCCTCCACCGACACCATGGGCCGGCCCTGCCTGCCCTGGAACAGCGCCACAGTGCTGCAACAAACATACCACGCCCACAGAAGCGACGCCCTGCAACTGGGCCTCGGCAAGCACAACTACTGCAGAAACCCTGACAACAGAAGAAGACCCTGGTGCTACGTGCAGGTGGGCCTCAAATTGCTGGTCCAGGAATGCATGGTCCACGACTGTGCCGATGGAAAGAAGCCCAGCTCTCCTCCAGAAGAACTGAAATTCCAGTGTGGACAGAAAACCCTGCGGCCTAGATTCAAGATCATCGGCGGCGAATTTACGACCATCGAGAACCAGCCTTGGTTCGCCGCTATCTACCGGCGGCACCGGGGCGGCAGCGTGACATACGTTTGTGGCGGAAGCCTGATCAGCCCTTGCTGGGTCATCAGCGCCACACACTGCTTCATCGATTACCCAAAGAAGGAGGACTATATCGTGTACCTCGGCCGCAGCAGACTGAACAGCAATACCCAGGGCGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTGATCCTGCACAAAGACTACAGCGCTGATACCCTGGCCCACCACAACGACATCGCCCTGCTGAAGATCAGATCTAAGGAAGGCCGGTGCGCCCAGCCAAGTAGAACAATCCAGACCATCTGCCTGCCCAGCATGTACAACGACCCCCAGTTCGGCACCAGCTGTGAAATCACCGGATTCGGCAAGGAAAACAGCACAGACTACCTGTACCCTGAGCAGCTGAAGATGACCGTGGTGAAGCTGATCTCTCACCGCGAGTGCCAGCAGCCGCACTATTACGGCTCGGAGGTGACCACAAAGATGCTGTGCGCTGCCGATCCTCAGTGGAAGACAGATTCTTGTCAGGGCGACAGCGGCGGCCCTCTGGTGTGCAGCCTGCAGGGAAGAATGACACTGACCGGTATCGTGTCTTGGGGCAGAGGTTGTGCCCTGAAGGACAAACCTGGAGTGTACACCCGGGTGTCCCACTTCCTGCCTTGGATCAGAAGCCACACCAAGGAAGAAAATGGACTGGCACTGTGA。
经过密码子优化的功能基因为mScarlet，SIRT1或PLAU基因中的一种。
mir-122和mir-145的互补靶向序列可以反向调控经过密码子优化的功能基因的基因表达。密码子优化是指人源密码子优化。
优选的，mir-122的互补靶向序列如SEQ ID NO.4所示:：
SEQ ID NO.4：5’TATTTAGTGTGATAATGGCGTT 3’。
mir-145的互补靶向序列如SEQ ID NO.5所示：
SEQ ID NO.5：5’AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC 3’。
在上述识别肝细胞纤维化的分子监测序列中，当功能基因为mScarlet、该监测序列主要用于监测细胞是否纤维化，当功能基因为SIRT1或PLAU基因时，该监测序列可以对纤维化的肝细胞进行调节，降低其中α平滑肌蛋白的表达量，改善肝细胞的纤维化情况。
优选的，分子监测序列为识别肾细胞纤维化的分子监测序列，由5’端至3’端，依次连接所述STAT3增强子、所述肾特异性最短启动子、经过密码子优化的功能基因以互补靶向序列；互补靶向序列为mir-29和mir-200的互补靶向序列，两者的顺序可任意设置；经过密码子优化的基因为mScarlet、SIRT1或PLAU基因中的一种。
优选的，mir-29的互补靶向序列如SEQ ID NO.6所示：
SEQ ID NO.6：5’CTGAACACCAAAAGAAATCAGT 3’。
mir-200的互补靶向序列如SEQ ID NO.7所示：
SEQ ID NO.7：5’TCCATCATTACCCGGCAGTATTA 3’。
本发明的用于智能精准识别和调控肝肾细胞纤维化的重组质粒，包括上述的分子监测序列。
本发明的用于智能精准识别和调控肝肾细胞纤维化的抑制病毒，含有上述的重组质粒。
优选的，本发明的抑制病毒的病毒载体可以为AAV腺相关病毒或腺病毒Ad5。
本发明的用于智能精准识别肝肾细胞纤维化的试剂，包括上述的抑制病毒的病毒液。
本发明的上述试剂可以用于制备抑制肝肾细胞纤维化的药物。
以下通过具体的实施例对本发明的效果进行举例说明：
实施例1
本实施例通过基因合成得到识别肝细胞纤维化的分子监测序列，并将该监测序列通过生物工程方法构建含有上述分子监测序列的质粒载体、含有该质粒载体的AAV腺相关病毒。
如图1～3所示，本实施例的分子监测序列中，由5’端至3’端依次连接有AAV腺相关病毒5’反向末端重复序列、STAT3增强子、肝特异性最短启动子、经过密码子优化的功能基因、互补靶向序列、Poly(A)尾巴以及AAV腺相关病毒3’反向末端重复序列。
互补靶向序列为mir-122和mir-145的互补靶向序列；经过密码子优化的功能基因为mScarlet，SIRT1或PLAU基因中的一种。
上述序列中，两端的反向末端重复序列可以使该序列连接在以AVV腺相关病毒为载体的质粒上。本实施例采用的病毒为AAV9病毒。
mScarlet、SIRT1或PLAU基因受表达3×mir-122/mir-145联合靶点序列的反向调控，通过AAV9病毒包装纯化工艺，使得包含肝细胞纤维化分子监测系统的AAV病毒滴度达到1E13。
本实施例含有上述分子监测序列的AAV腺相关病毒包装完整流程如下：
(1)基因克隆：采用引物对经过基因合成的分子监测序列进行扩增，并通过Gibson法安装到AAV载体骨架上。其中，引物为：
ITR-F:5’CTCCATCACTAGGGGTTCCTTCTAGACGGGAGCTAGGCTAGCCTTCTGGG3’(SEQ IDNO.8)；
ITR-R:5’GGTTCCTGCGGCCCTCCCCAGCATGCGAGCCAGACATGATAAGATACAT3’(SEQ IDNO.9)。
扩增体系如表1所示：
表1扩增体系
成分 50μL反应体系
5X Q5 PCR反应缓冲液 10μL
10mM dNTPs 1μL
10μM ITR-F正向引物 2.5μL
10μM ITR-R负向引物 2.5μL
DNA模板 10ng
Q5高保真DNA聚合酶 0.5μL
5X Q5高GC反应液 10μL
超纯水 to 50μL
扩增程序如表2所示：
表2扩增程序
Figure BDA0003639085650000101
Gibson片段连接反应体系如表3所示：
表3 Gibson片段连接反应体系
Figure BDA0003639085650000102
Gibson片段连接反应温度为50℃，反应时间15分钟。
完成后，得到含有分子监测序列的重组质粒。
(2)病毒包装：将含有分子监测序列的重组质粒与辅助质粒AdHelper Vector和pAAV-rep/cap Vector共转染进入HEK293T细胞，感染72h之后即包装完毕。
(3)收毒：反复冻融3次破碎上述细胞，分别收获培养基上清与细胞沉淀，PEG8000沉淀培养基上清中的病毒，培养基上清先用0.45μm滤膜过滤。
(4)纯化浓缩：通过碘克沙醇法对病毒进行纯化，一方面提高病毒滴度，另一方面，某些动物实验需要纯化之后才可进行。纯化完成后，再将收集到的病毒液置于超滤管中超高速离心进行浓缩。
(5)滴度和特异性检测：首先通过qPCR的方法来检测病毒滴度，利用PCR的方法进行病毒特异性检测，最后用银染方法核实病毒纯度。
本实施例中，图1的分子监测序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示：
GACGGATCGGGAGCTAGCGTTCTGCCATTGACTTCTGCCATTTCGCTTCTGGGATTGACCTTCTGCCATTCTACTTCTGCCAATTCTCTTCTGCCATTTGCCTTCTGCCATTGTACTTCTGCCATTCGGCAAACATTGCAAGCAGCCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCATTTAACTTGGTTAATATTCACCGGCCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTGGCAATTAACATCTCCTCAGCTTCAGGTGAGAATCCTTAAGGTCGACCGCCGCCACCGTGAGCAAGGGCGAGGCCGTGATCAAGGAGTTCATGAGATTCAAGGTGCACATGGAAGGAAGCATGAATGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGAGAAGGCGAGGGCAGACCTTACGAAGGCACCCAAACAGCCAAGCTCAAGGTGACAAAGGGCGGCCCTCTGCCTTTTAGCTGGGACATCCTGAGCCCCCAGTTTATGTACGGCTCTAGAGCCTTCACCAAGCACCCCGCTGACATCCCTGACTACTACAAGCAAAGCTTTCCCGAAGGATTTAAGTGGGAACGGGTGATGAACTTCGAGGATGGAGGAGCCGTGACAGTGACCCAGGACACATCGCTGGAAGACGGAACCCTGATCTACAAGGTGAAGCTGAGAGGCACCAACTTCCCTCCAGACGGCCCTGTGATGCAGAAAAAAACCATGGGCTGGGAGGCCAGCACTGAGAGACTGTATCCTGAGGACGGCGTGCTGAAGGGCGATATCAAGATGGCCCTGAGACTGAAGGACGGTGGAAGATACCTGGCCGACTTTAAGACCACCTACAAAGCCAAGAAGCCAGTGCAGATGCCTGGCGCCTACAACGTGGACAGAAAGCTCGATATCACGAGCCACAACGAAGATTACACCGTCGTGGAACAGTACGAGCGGAGCGAAGGCAGACACAGCACAGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGATCGAGCGGCCGCCAAACACCATTGTCACACTCCACAAACACCATTGTCACACTCCACAAACACCATTGTCACACTCCACAAACACCATTGTCACACTCCAAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACGCGGCCGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC。
本实施例中，图2的分子监测序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示：
GACGGATCGGGAGCTAGCGTTCTGCCATTGACTTCTGCCATTTCGCTTCTGGGATTGACCTTCTGCCATTCTACTTCTGCCAATTCTCTTCTGCCATTTGCCTTCTGCCATTGTACTTCTGCCATTCGGCAAACATTGCAAGCAGCCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCATTTAACTTGGTTAATATTCACCGGCCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTGGCAATTAACATCTCCTCAGCTTCAGGTGAGAATCCTTAAGGTCGACCGCCGCCACCATGGCCGATGAGGCCGCCCTCGCCCTACAGCCTGGAGGCAGCCCGAGCGCCGCCGGTGCTGACAGAGAAGCCGCCAGCTCACCTGCCGGAGAGCCTCTGCGCAAGCGGCCACGCAGAGATGGCCCCGGCCTGGAGCGGAGCCCCGGGGAGCCTGGCGGTGCCGCTCCTGAGAGAGAGGTGCCTGCCGCCGCTAGAGGTTGTCCTGGAGCCGCCGCCGCTGCCCTGTGGAGAGAGGCCGAGGCTGAAGCTGCCGCCGCCGGCGGCGAGCAGGAGGCCCAGGCCACCGCAGCTGCCGGCGAAGGCGATAATGGCCCTGGACTGCAGGGCCCTTCTAGAGAGCCCCCCCTGGCAGACAATCTGTATGACGAAGACGACGATGATGAAGGGGAGGAAGAAGAAGAAGCCGCCGCCGCTGCCATCGGCTACAGAGACAACCTGCTCTTTGGCGATGAGATCATTACAAACGGCTTCCACAGCTGTGAAAGCGACGAAGAGGATAGGGCCAGCCACGCCAGCTCTTCTGACTGGACCCCTCGTCCAAGAATCGGACCATACACATTCGTGCAGCAGCACCTGATGATCGGCACCGACCCTAGAACAATCCTGAAGGACTTACTGCCTGAAACAATCCCTCCTCCTGAACTGGACGACATGACCCTGTGGCAGATCGTGATAAACATCCTGAGCGAGCCTCCTAAGCGGAAAAAGAGAAAAGACATCAACACCATCGAGGACGCGGTGAAACTGCTGCAGGAGTGCAAAAAAATCATCGTGCTGACAGGAGCCGGCGTGTCCGTGTCTTGTGGCATCCCCGACTTCAGAAGCAGAGACGGAATCTATGCCAGACTGGCTGTGGACTTCCCTGACCTGCCCGACCCCCAAGCAATGTTCGATATCGAATACTTCCGGAAGGACCCTCGGCCTTTCTTCAAATTCGCCAAGGAAATCTACCCCGGCCAGTTCCAGCCTAGCCTGTGTCATAAGTTCATCGCCCTGTCCGATAAGGAAGGGAAGCTGCTTAGAAATTACACCCAGAACATCGACACCCTGGAACAAGTGGCCGGCATTCAGAGAATCATTCAATGCCATGGCTCTTTTGCTACCGCTTCTTGTCTGATCTGCAAGTACAAGGTGGACTGCGAGGCCGTGCGGGGCGATATCTTCAACCAGGTGGTCCCTAGGTGCCCCCGCTGCCCTGCCGACGAGCCTCTGGCCATCATGAAACCTGAGATCGTCTTCTTCGGCGAGAACCTGCCCGAGCAGTTCCACCGGGCCATGAAATATGACAAGGATGAAGTGGACCTGCTGATCGTGATCGGCTCTAGCCTGAAAGTGCGGCCCGTTGCTCTGATCCCCTCCAGCATCCCGCACGAGGTTCCACAGATCCTGATCAACCGGGAGCCTCTGCCACACCTGCACTTCGACGTTGAGCTGCTGGGCGATTGCGACGTGATCATTAACGAGCTGTGCCACAGACTGGGCGGCGAGTACGCCAAGCTGTGCTGCAACCCCGTGAAGCTGAGCGAAATCACAGAGAAGCCTCCTCGGACCCAGAAGGAGCTGGCTTATCTGAGCGAACTGCCACCCACCCCCCTGCACGTGAGCGAGGACAGCTCTTCTCCTGAAAGAACCAGCCCTCCCGATTCTTCCGTGATCGTGACCCTGCTGGACCAGGCCGCCAAAAGTAACGACGACCTGGACGTTAGCGAATCTAAGGGCTGCATGGAAGAAAAGCCCCAGGAGGTGCAGACCAGCAGAAACGTGGAGAGCATCGCCGAGCAGATGGAAAATCCCGACCTGAAGAACGTGGGCTCTAGCACCGGCGAAAAGAACGAGCGGACAAGCGTGGCTGGCACCGTCAGAAAATGTTGGCCTAACCGGGTGGCCAAGGAACAGATCAGCAGACGGCTGGATGGCAACCAATACCTGTTCCTGCCTCCTAATCGGTACATCTTCCACGGCGCCGAGGTCTACAGCGATAGCGAGGACGATGTGCTGTCTTCCAGCTCCTGCGGCAGCAATAGCGACTCCGGAACCTGCCAGAGCCCTAGCCTGGAAGAGCCTATGGAGGATGAGTCCGAGATTGAGGAGTTCTACAACGGCCTGGAGGACGAGCCTGACGTGCCTGAGAGAGCCGGCGGCGCGGGCTTTGGCACAGATGGCGATGACCAGGAAGCTATCAATGAGGCCATCAGCGTGAAGCAGGAGGTGACCGACATGAACTACCCCTCAAACAAGTCCTGATCGAGCGGCCGCCAAACACCATTGTCACACTCCACAAACACCATTGTCACACTCCACAAACACCATTGTCACACTCCACAAACACCATTGTCACACTCCAAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACGCGGCCGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC。
本实施例中，图3的分子监测序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示：
GACGGATCGGGAGCTAGCGTTCTGCCATTGACTTCTGCCATTTCGCTTCTGGGATTGACCTTCTGCCATTCTACTTCTGCCAATTCTCTTCTGCCATTTGCCTTCTGCCATTGTACTTCTGCCATTCGGCAAACATTGCAAGCAGCCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCATTTAACTTGGTTAATATTCACCGGCCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTGGCAATTAACATCTCCTCAGCTTCAGGTGAGAATCCTTAAGGTCGACCGCCGCCACCATGGTGTTCCACCTGAGAACCAGATACGAGCAGGCCAACTGCGACTGCCTGAACGGCGGCACCTGCGTGTCCAACAAGTACTTCAGCAACATCCACTGGTGCAACTGTCCTAAGAAGTTTGGAGGCCAGCATTGCGAGATCGACAAGAGCAAGACCTGCTACGAAGGCAACGGTCATTTCTACAGAGGCAAGGCCTCCACCGACACCATGGGCCGGCCCTGCCTGCCCTGGAACAGCGCCACAGTGCTGCAACAAACATACCACGCCCACAGAAGCGACGCCCTGCAACTGGGCCTCGGCAAGCACAACTACTGCAGAAACCCTGACAACAGAAGAAGACCCTGGTGCTACGTGCAGGTGGGCCTCAAATTGCTGGTCCAGGAATGCATGGTCCACGACTGTGCCGATGGAAAGAAGCCCAGCTCTCCTCCAGAAGAACTGAAATTCCAGTGTGGACAGAAAACCCTGCGGCCTAGATTCAAGATCATCGGCGGCGAATTTACGACCATCGAGAACCAGCCTTGGTTCGCCGCTATCTACCGGCGGCACCGGGGCGGCAGCGTGACATACGTTTGTGGCGGAAGCCTGATCAGCCCTTGCTGGGTCATCAGCGCCACACACTGCTTCATCGATTACCCAAAGAAGGAGGACTATATCGTGTACCTCGGCCGCAGCAGACTGAACAGCAATACCCAGGGCGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTGATCCTGCACAAAGACTACAGCGCTGATACCCTGGCCCACCACAACGACATCGCCCTGCTGAAGATCAGATCTAAGGAAGGCCGGTGCGCCCAGCCAAGTAGAACAATCCAGACCATCTGCCTGCCCAGCATGTACAACGACCCCCAGTTCGGCACCAGCTGTGAAATCACCGGATTCGGCAAGGAAAACAGCACAGACTACCTGTACCCTGAGCAGCTGAAGATGACCGTGGTGAAGCTGATCTCTCACCGCGAGTGCCAGCAGCCGCACTATTACGGCTCGGAGGTGACCACAAAGATGCTGTGCGCTGCCGATCCTCAGTGGAAGACAGATTCTTGTCAGGGCGACAGCGGCGGCCCTCTGGTGTGCAGCCTGCAGGGAAGAATGACACTGACCGGTATCGTGTCTTGGGGCAGAGGTTGTGCCCTGAAGGACAAACCTGGAGTGTACACCCGGGTGTCCCACTTCCTGCCTTGGATCAGAAGCCACACCAAGGAAGAAAATGGACTGGCACTGTGATCGAGCGGCCGCCAAACACCATTGTCACACTCCACAAACACCATTGTCACACTCCACAAACACCATTGTCACACTCCACAAACACCATTGTCACACTCCAAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACGCGGCCGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC。
实施例2
采用实施例1制备的抑制病毒对人肝星状细胞进行感染，验证其对纤维化肝细胞的监测和调控效果。
本实施例采用的人肝星状细胞购买于武汉普诺赛生命科技有限公司。
α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是肝星状细胞(HSC)活化的标志，α-平滑肌肌动蛋白的表达量越大，说明活化的肝星状细胞(HSC)越多，而肝星状细胞(HSC)的活化与肝细胞纤维化有重要的关系。因此，监测α-平滑肌肌动蛋白的表达可以实现对肝细胞纤维化的监测。
在本实施例中，向肝星状细胞添加10ng/mL的细胞因子TGFB1和10ng/mL PDGFB，并在培养基DMEM/F12+15％胎牛血清+非必需氨基酸的培养条件下处理14天，诱导其发生细胞纤维化转变。
使用如图1所示的带有红色荧光蛋白mScarlet的AAV肝细胞纤维化监测病毒，对人肝星状细胞进行病毒感染，3天后，通过流式细胞术对红色荧光蛋白阳性的细胞及红色荧光蛋白阴性的细胞进行区分。各组的ɑ平滑肌纤维蛋白(SMAα蛋白)相对表达量如表4和图6所示：
表4各组的ɑ平滑肌纤维蛋白(SMAα蛋白)相对表达量
红色荧光阳性组 红色荧光阴性组
No.1 2.65 1
No.2 3.08 1
No.3 2.91 1
平均值 2.88 1
标准差 0.176823829 0
通过实验数据可以看出，本实施例的肝细胞纤维化分子监测病毒对于阳性纤维化肝细胞与阴性纤维化肝细胞的相对表达量具有显著性差异。数据经非配对双尾Student’st检验,P value<0.01则标记**。
另取上述的肝星状细胞，添加10ng/mL的细胞因子TGFB1和10ng/mL的细胞因子PDGFB，并在培养基DMEM/F12+15％胎牛血清+非必需氨基酸的培养条件下处理14天，诱导其发生细胞纤维化转变。
使用如图2和3所示的具有hSIRT1、hPLAU表达功能的AAV肝细胞纤维化监测病毒进行病毒感染，并与未感染AAV肝细胞纤维化监测病毒的纤维化肝星状细胞及未感染AAV肝细胞纤维化监测系统的野生型肝星状细胞进行ɑ平滑肌纤维蛋白(ɑ-smooth muscle actin)的表达量比较。
其中，hSIRT1、hPLAU是指人源SIRT1和PLAU基因。
上述实验分为5组，分别为肝纤维化模型+hSirt1组，肝纤维化模型+hPlau组，肝纤维化模型+hSirt1/hPlau组，肝纤维化模型组，空质粒阴性对照组，每组进行10次平行实验。各组实验结果如表5和图7所示。数据经非配对双尾Student’s t检验,同肝纤维化模型组相比P value<0.01则标记**。
表5各组的ɑ平滑肌纤维蛋白(SMAα蛋白)相对表达量
Figure BDA0003639085650000191
通过实验结果可以看出，肝纤维化模型+hSirt1/hPlau组的α平滑肌纤维蛋白表达量显著的低于其他实验组，说明该组具有显著的肝细胞纤维化调控效果。
实施例3
本实施例通过动物试验验证本发明的分子监测序列在体内的监测效果。
使用酶切及Gibson连接技术，将人源STAT3可识别合成增强子及人源肝特异性合成启动子替换为鼠源Stat3可识别合成增强子及鼠源肝特异性合成启动子，并将SIRT1及PLAU进行鼠源密码子优化，得到mSIRT1及mPLAU。
本实施例设置5组实验对照组，分别为肝纤维化模型+mSirt1组，肝纤维化模型+mPlau组，肝纤维化模型+mSirt1/mPlau组，肝纤维化模型组，空质粒阴性对照组。
本实施例采用40只C57BL/6J小鼠，通过6周，每周两次腹腔注射四氯化碳构建肝纤维化小鼠模型。构建成功后，尾静脉注射AAV9包装的肝细胞纤维化分子监测系统，21天后，取各组小鼠的肝组织，检测其中ɑ平滑肌纤维蛋白(ɑ-smooth muscle actin)的表达，并比较各组间差异，SMAα蛋白相对表达量如表6和图8所示。数据经非配对双尾Student’s t检验,同肝纤维化模型组相比P value<0.01则标记**。
通过实验结果可以看出，肝纤维化模型+mSirt1/mPlau组的α平滑肌纤维蛋白表达量显著的低于其他实验组，说明该组具有显著的肝细胞纤维化调控效果。
表6各组的ɑ平滑肌纤维蛋白(SMAα蛋白)相对表达量
Figure BDA0003639085650000201
实施例4
本实施例通过生物工程方法构建肾细胞纤维化分子监测序列及含有该序列的抑制病毒，并通过动物试验验证其在体内的监测效果。具体步骤为：
通过基因合成构建基如图4～5所示的AAV骨架载体用于通过可识别Stat3蛋白的合成增强子及肾特异性最短合成启动子表达经过密码子优化的Sirt1或Plau基因，且Sirt1或Plau基因受3×mir-29/mir-200联合靶点序列的反向调控，通过AAV8病毒包装纯化工艺，使得包含肾纤维化细胞分子监测系统的AAV病毒滴度达到1E13。
本实施例使用酶切及Gibson连接技术，将人源STAT3可识别合成增强子及人源肾特异性合成启动子替换为鼠源Stat3可识别合成增强子及鼠源肾特异性合成启动子，并将SIRT1及PLAU进行鼠源密码子优化，并设置5组实验对照组，分别为肾纤维化模型+mSirt1组，肾纤维化模型+mPlau组，肾纤维化模型+mSirt1/mPlau组，肾纤维化模型组，空质粒阴性对照组。
本实施例采用40只C57BL/6J小鼠，通过单侧输尿管梗阻技术构建肾纤维化小鼠模型。构建成功后，尾静脉注射AAV8包装的肾纤维化分子监测系统，21天后，取各组小鼠的肾组织，检测其中ɑ平滑肌纤维蛋白(ɑ-smooth muscle actin)的表达，并比较各组间差异。结果如表7和图9所示。数据经非配对双尾Student’s t检验,同肾纤维化模型组相比P value<0.01则标记**。
表7各组的ɑ平滑肌纤维蛋白(SMAα蛋白)相对表达量
Figure BDA0003639085650000211
Figure BDA0003639085650000221
通过实验结果可以看出，肾纤维化模型+mSirt1/mPlau组的α平滑肌纤维蛋白表达量显著的低于其他实验组，说明该组具有显著的肾细胞纤维化调控效果。
本实施例中，图4的分子监测序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示：
GACGGATCGGGAGCTAGCTTCGAATTCCGATAGATACCTGGAATCCGTACCAGCTTGGACCGAATGAAGCGGTTTCCTCCAAGTTACAGCCATAGGAAATCCTCAGGAAGGTAAGCCTCACCTCACATGCTCCTGACCCATGGGGCCTCACCATCCTGCCCAGGGCCCTGCAGAGACTGAGGGGCCTCTGCCCATCCCTGGGTGTAGGTGACTCATGCACAGGAGCACAAGGTGCTCACACATGAGCAGAAGATGGGGACTCACAAGGTTTTGCCTTCCCATAGCAAAGATGACATCCAGGAAAACACAGAGATGACACCCTCAAAGACACCCCTCCTTGACCATCACCTGCATAGAGTTCACCCATCCAGGGTCTGTAGCTGGTGGGCTCTGGATGCCCACAAAAATGACCCACTTTGCTGTGGCCCCAAGCTCTCACCAATAGCCCATATGATGTCTTCATGTCCTTCCCTGCAGGGGACCTCAGTCTTGTCCTTCAAGCCCAGACCCTTTCTATGTGGCAGGAGATGGGGAAGGGATGAAAAAGCAGGTGTGTGCACACTCACACACACACATGCACACATAGACACTGAGACACAGACATACCAATCCCCTTAAGGTCGACCGCCGCCACCATGGCGGACGAGGTGGCGCTCGCCCTTCAGGCCGCCGGCTCCCCTTCCGCGGCGGCCGCCATGGAGGCCGCGTCGCAGCCGGCGGACGAGCCGCTCCGCAAGAGGCCCCGCCGAGACGGGCCTGGCCTCGGGCGCAGCCCGGGCGAGCCGAGCGCAGCAGTGGCGCCGGCGGCCGCGGGGTGTGAGGCGGCGAGCGCCGCGGCCCCGGCGGCGCTGTGGCGGGAGGCGGCAGGGGCGGCGGCGAGCGCGGAGCGGGAGGCCCCGGCGACGGCCGTGGCCGGGGACGGAGACAATGGGTCCGGCCTGCGGCGGGAGCCGAGGGCGGCTGACGACTTCGACGACGACGAGGGCGAGGAGGAGGACGAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGATCGGCTACCGAGACAACCTCCTGTTGACCGATGGACTCCTCACTAATGGCTTTCATTCCTGTGAAAGTGATGACGATGACAGAACGTCACACGCCAGCTCTAGTGACTGGACTCCGCGGCCGCGGATAGGTCCATATACTTTTGTTCAGCAACATCTCATGATTGGCACCGATCCTCGAACAATTCTTAAAGATTTATTACCAGAAACAATTCCTCCACCTGAGCTGGATGATATGACGCTGTGGCAGATTGTTATTAATATCCTTTCAGAACCACCAAAGCGGAAAAAAAGAAAAGATATCAATACAATTGAAGATGCTGTGAAGTTACTGCAGGAGTGTAAAAAGATAATAGTTCTGACTGGAGCTGGGGTTTCTGTCTCCTGTGGGATTCCTGACTTCAGATCAAGAGACGGTATCTATGCTCGCCTTGCGGTGGACTTCCCAGACCTCCCAGACCCTCAAGCCATGTTTGATATTGAGTATTTTAGAAAAGACCCAAGACCATTCTTCAAGTTTGCAAAGGAAATATATCCCGGACAGTTCCAGCCGTCTCTGTGTCACAAATTCATAGCTTTGTCAGATAAGGAAGGAAAACTACTTCGAAATTATACTCAAAATATAGATACCTTGGAGCAGGTTGCAGGAATCCAAAGGATCCTTCAGTGTCATGGTTCCTTTGCAACAGCATCTTGCCTGATTTGTAAATACAAAGTTGATTGTGAAGCTGTTCGTGGAGACATTTTTAATCAGGTAGTTCCTCGGTGCCCTAGGTGCCCAGCTGATGAGCCACTTGCCATCATGAAGCCAGAGATTGTCTTCTTTGGTGAAAACTTACCAGAACAGTTTCATAGAGCCATGAAGTATGACAAAGATGAAGTTGACCTCCTCATTGTTATTGGATCTTCTCTGAAAGTGAGACCAGTAGCACTAATTCCAAGTTCTATACCCCATGAAGTGCCTCAAATATTAATAAATAGGGAACCTTTGCCTCATCTACATTTTGATGTAGAGCTCCTTGGAGACTGCGATGTTATAATTAATGAGTTGTGTCATAGGCTAGGTGGTGAATATGCCAAACTTTGTTGTAACCCTGTAAAGCTTTCAGAAATTACTGAAAAACCTCCACGCCCACAAAAGGAATTGGTTCATTTATCAGAGTTGCCACCAACACCTCTTCATATTTCGGAAGACTCAAGTTCACCTGAAAGAACTGTACCACAAGACTCTTCTGTGATTGCTACACTTGTAGACCAAGCAACAAACAACAATGTTAATGATTTAGAAGTATCTGAATCAAGTTGTGTGGAAGAAAAACCACAAGAAGTACAGACTAGTAGGAATGTTGAGAACATTAATGTGGAAAATCCAGATTTTAAGGCTGTTGGTTCCAGTACTGCAGACAAAAATGAAAGAACTTCAGTTGCAGAAACAGTGAGAAAATGCTGGCCTAATAGACTTGCAAAGGAGCAGATTAGTAAGCGGCTTGAGGGTAATCAATACCTGTTTGTACCACCAAATCGTTACATATTCCACGGTGCTGAGGTATACTCAGACTCTGAAGATGACGTCTTGTCCTCTAGTTCCTGTGGCAGTAACAGTGACAGTGGCACATGCCAGAGTCCAAGTTTAGAAGAACCCTTGGAAGATGAAAGTGAAATTGAAGAATTCTACAATGGCTTGGAAGATGATACGGAGAGGCCCGAATGTGCTGGAGGATCTGGATTTGGAGCTGATGGAGGGGATCAAGAGGTTGTTAATGAAGCTATAGCTACAAGACAGGAATTGACAGATGTAAACTATCCATCAGACAAATCATAATCGAGCGGCCGCCTGAACACCAAAAGAAATCAGTCTGAACACCAAAAGAAATCAGTCTGAACACCAAAAGAAATCAGTCTGAACACCAAAAGAAATCAGTCCAAACACTGCTGGGTAAGACGCCAAACACTGCTGGGTAAGACGCCAAACACTGCTGGGTAAGACGCCAAACACTGCTGGGTAAGACGGCGGCCGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC。
本实施例中，图5的分子监测序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示：
GACGGATCGGGAGCTAGCTTCGAATTCCGATAGATACCTGGAATCCGTACCAGCTTGGACCGAATGAAGCGGTTTCCTCCAAGTTACAGCCATAGGAAATCCTCAGGAAGGTAAGCCTCACCTCACATGCTCCTGACCCATGGGGCCTCACCATCCTGCCCAGGGCCCTGCAGAGACTGAGGGGCCTCTGCCCATCCCTGGGTGTAGGTGACTCATGCACAGGAGCACAAGGTGCTCACACATGAGCAGAAGATGGGGACTCACAAGGTTTTGCCTTCCCATAGCAAAGATGACATCCAGGAAAACACAGAGATGACACCCTCAAAGACACCCCTCCTTGACCATCACCTGCATAGAGTTCACCCATCCAGGGTCTGTAGCTGGTGGGCTCTGGATGCCCACAAAAATGACCCACTTTGCTGTGGCCCCAAGCTCTCACCAATAGCCCATATGATGTCTTCATGTCCTTCCCTGCAGGGGACCTCAGTCTTGTCCTTCAAGCCCAGACCCTTTCTATGTGGCAGGAGATGGGGAAGGGATGAAAAAGCAGGTGTGTGCACACTCACACACACACATGCACACATAGACACTGAGACACAGACATACCAATCCCCTTAAGGTCGACCGCCGCCACCATGAAAGTCTGGCTGGCGAGCCTGTTCCTCTGCGCCTTGGTGGTGAAAAACTCTGAAGGTGGCAGTGTACTTGGAGCTCCTGATGAATCAAACTGTGGCTGTCAGAACGGAGGTGTATGCGTGTCCTACAAGTACTTCTCCAGAATTCGCCGATGCAGCTGCCCAAGGAAATTCCAGGGGGAGCACTGTGAGATAGATGCATCAAAAACCTGCTATCATGGAAATGGTGACTCTTACCGAGGAAAGGCCAACACTGATACCAAAGGTCGGCCCTGCCTGGCCTGGAATGCGCCTGCTGTCCTTCAGAAACCCTACAATGCCCACAGACCTGATGCTATTAGCCTAGGCCTGGGGAAACACAATTACTGCAGGAACCCTGACAACCAGAAGCGACCCTGGTGCTATGTGCAGATTGGCCTAAGGCAGTTTGTCCAAGAATGCATGGTGCATGACTGCTCTCTTAGCAAAAAGCCTTCTTCGTCTGTAGACCAACAAGGCTTCCAGTGTGGCCAGAAGGCTCTAAGGCCCCGCTTTAAGATTGTTGGGGGAGAATTCACTGAGGTGGAGAACCAGCCCTGGTTCGCAGCCATCTACCAGAAGAACAAGGGAGGAAGTCCTCCCTCCTTTAAATGTGGTGGGAGTCTCATCAGTCCTTGCTGGGTGGCCAGTGCCGCACACTGCTTCATTCAACTCCCAAAGAAGGAAAACTACGTTGTCTACCTGGGTCAGTCGAAGGAGAGCTCCTATAATCCTGGAGAGATGAAGTTTGAGGTGGAGCAGCTCATCTTGCACGAATACTACAGGGAAGACAGCCTGGCCTACCATAATGATATTGCCTTGCTGAAGATACGTACCAGCACGGGCCAATGTGCACAGCCATCCAGGTCCATACAGACCATCTGCCTGCCCCCAAGGTTTACTGATGCTCCGTTTGGTTCAGACTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGTCTGAAAGTGACTATCTCTATCCAAAGAACCTGAAAATGTCCGTCGTAAAGCTTGTTTCTCATGAACAGTGTATGCAGCCCCACTACTATGGCTCTGAAATTAATTATAAAATGCTGTGTGCTGCGGACCCAGAGTGGAAAACAGATTCCTGCAAGGGCGATTCTGGAGGACCGCTTATCTGTAACATCGAAGGCCGCCCAACTCTGAGTGGGATTGTGAGCTGGGGCCGAGGATGTGCAGAGAAAAACAAGCCCGGTGTCTACACGAGGGTCTCACACTTCCTGGACTGGATTCAATCCCACATTGGAGAAGAGAAAGGTCTGGCCTTCTGATCGAGCGGCCGCCTGAACACCAAAAGAAATCAGTCTGAACACCAAAAGAAATCAGTCTGAACACCAAAAGAAATCAGTCTGAACACCAAAAGAAATCAGTCCAAACACTGCTGGGTAAGACGCCAAACACTGCTGGGTAAGACGCCAAACACTGCTGGGTAAGACGCCAAACACTGCTGGGTAAGACGGCGGCCGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 珠海中科先进技术研究院有限公司
<120> 识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列、重组质粒、抑制病毒
<141> 2022-05-10
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 108
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttctgccat tgacttctgc catttcgctt ctgggattga ccttctgcca ttctacttct 60
gccaattctc ttctgccatt tgccttctgc cattgtactt ctgccatt 108
<210> 2
<211> 335
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggcaaacat tgcaagcagc ccctccctgc ctgctgacct tggagctggg gcagaggtca 60
gagacctctc tgggcccatg ccacctccaa catccactcg accccttgga atttcggtgg 120
agaggagcag aggttgtcct ggcgtggttt aggtagtgtg tggacacagg acgctgtggt 180
ttctgagcca gggggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt ttgctccatt 240
taacttggtt aatattcacc ggccagcagc ctcccccgtt gcccctctgg atccactgct 300
ggcaattaac atctcctcag cttcaggtga gaatc 335
<210> 3
<211> 500
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcctcacct cacatgctcc tgacccatgg ggcctcacca tcctgcccag ggccctgcag 60
agactgaggg gcctctgccc atccctgggt gtaggtgact catgcacagg agcacaaggt 120
gctcacacat gagcagaaga tggggactca caaggttttg ccttcccata gcaaagatga 180
catccaggaa aacacagaga tgacaccctc aaagacaccc ctccttgacc atcacctgca 240
tagagttcac ccatccaggg tctgtagctg gtgggctctg gatgcccaca aaaatgaccc 300
actttgctgt ggccccaagc tctcaccaat agcccatatg atgtcttcat gtccttccct 360
gcaggggacc tcagtcttgt ccttcaagcc cagacccttt ctatgtggca ggagatgggg 420
aagggatgaa aaagcaggtg tgtgcacact cacacacaca catgcacaca tagacactga 480
gacacagaca taccaatccc 500
<210> 4
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tatttagtgt gataatggcg tt 22
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<212> DNA/RNA
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgaacacca aaagaaatca gt 22
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<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tccatcatta cccggcagta tta 23
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<211> 50
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
<211> 49
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggttcctgcg gccctcccca gcatgcgagc cagacatgat aagatacat 49
<210> 10
<211> 696
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gtgagcaagg gcgaggccgt gatcaaggag ttcatgagat tcaaggtgca catggaagga 60
agcatgaatg gccacgagtt cgagatcgag ggagaaggcg agggcagacc ttacgaaggc 120
acccaaacag ccaagctcaa ggtgacaaag ggcggccctc tgccttttag ctgggacatc 180
ctgagccccc agtttatgta cggctctaga gccttcacca agcaccccgc tgacatccct 240
gactactaca agcaaagctt tcccgaagga tttaagtggg aacgggtgat gaacttcgag 300
gatggaggag ccgtgacagt gacccaggac acatcgctgg aagacggaac cctgatctac 360
aaggtgaagc tgagaggcac caacttccct ccagacggcc ctgtgatgca gaaaaaaacc 420
atgggctggg aggccagcac tgagagactg tatcctgagg acggcgtgct gaagggcgat 480
atcaagatgg ccctgagact gaaggacggt ggaagatacc tggccgactt taagaccacc 540
tacaaagcca agaagccagt gcagatgcct ggcgcctaca acgtggacag aaagctcgat 600
atcacgagcc acaacgaaga ttacaccgtc gtggaacagt acgagcggag cgaaggcaga 660
cacagcacag gcggcatgga cgagctgtac aagtga 696
<210> 11
<211> 2244
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
atggccgatg aggccgccct cgccctacag cctggaggca gcccgagcgc cgccggtgct 60
gacagagaag ccgccagctc acctgccgga gagcctctgc gcaagcggcc acgcagagat 120
ggccccggcc tggagcggag ccccggggag cctggcggtg ccgctcctga gagagaggtg 180
cctgccgccg ctagaggttg tcctggagcc gccgccgctg ccctgtggag agaggccgag 240
gctgaagctg ccgccgccgg cggcgagcag gaggcccagg ccaccgcagc tgccggcgaa 300
ggcgataatg gccctggact gcagggccct tctagagagc cccccctggc agacaatctg 360
tatgacgaag acgacgatga tgaaggggag gaagaagaag aagccgccgc cgctgccatc 420
ggctacagag acaacctgct ctttggcgat gagatcatta caaacggctt ccacagctgt 480
gaaagcgacg aagaggatag ggccagccac gccagctctt ctgactggac ccctcgtcca 540
agaatcggac catacacatt cgtgcagcag cacctgatga tcggcaccga ccctagaaca 600
atcctgaagg acttactgcc tgaaacaatc cctcctcctg aactggacga catgaccctg 660
tggcagatcg tgataaacat cctgagcgag cctcctaagc ggaaaaagag aaaagacatc 720
aacaccatcg aggacgcggt gaaactgctg caggagtgca aaaaaatcat cgtgctgaca 780
ggagccggcg tgtccgtgtc ttgtggcatc cccgacttca gaagcagaga cggaatctat 840
gccagactgg ctgtggactt ccctgacctg cccgaccccc aagcaatgtt cgatatcgaa 900
tacttccgga aggaccctcg gcctttcttc aaattcgcca aggaaatcta ccccggccag 960
ttccagccta gcctgtgtca taagttcatc gccctgtccg ataaggaagg gaagctgctt 1020
agaaattaca cccagaacat cgacaccctg gaacaagtgg ccggcattca gagaatcatt 1080
caatgccatg gctcttttgc taccgcttct tgtctgatct gcaagtacaa ggtggactgc 1140
gaggccgtgc ggggcgatat cttcaaccag gtggtcccta ggtgcccccg ctgccctgcc 1200
gacgagcctc tggccatcat gaaacctgag atcgtcttct tcggcgagaa cctgcccgag 1260
cagttccacc gggccatgaa atatgacaag gatgaagtgg acctgctgat cgtgatcggc 1320
tctagcctga aagtgcggcc cgttgctctg atcccctcca gcatcccgca cgaggttcca 1380
cagatcctga tcaaccggga gcctctgcca cacctgcact tcgacgttga gctgctgggc 1440
gattgcgacg tgatcattaa cgagctgtgc cacagactgg gcggcgagta cgccaagctg 1500
tgctgcaacc ccgtgaagct gagcgaaatc acagagaagc ctcctcggac ccagaaggag 1560
ctggcttatc tgagcgaact gccacccacc cccctgcacg tgagcgagga cagctcttct 1620
cctgaaagaa ccagccctcc cgattcttcc gtgatcgtga ccctgctgga ccaggccgcc 1680
aaaagtaacg acgacctgga cgttagcgaa tctaagggct gcatggaaga aaagccccag 1740
gaggtgcaga ccagcagaaa cgtggagagc atcgccgagc agatggaaaa tcccgacctg 1800
aagaacgtgg gctctagcac cggcgaaaag aacgagcgga caagcgtggc tggcaccgtc 1860
agaaaatgtt ggcctaaccg ggtggccaag gaacagatca gcagacggct ggatggcaac 1920
caatacctgt tcctgcctcc taatcggtac atcttccacg gcgccgaggt ctacagcgat 1980
agcgaggacg atgtgctgtc ttccagctcc tgcggcagca atagcgactc cggaacctgc 2040
cagagcccta gcctggaaga gcctatggag gatgagtccg agattgagga gttctacaac 2100
ggcctggagg acgagcctga cgtgcctgag agagccggcg gcgcgggctt tggcacagat 2160
ggcgatgacc aggaagctat caatgaggcc atcagcgtga agcaggaggt gaccgacatg 2220
aactacccct caaacaagtc ctga 2244
<210> 12
<211> 1245
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
atggtgttcc acctgagaac cagatacgag caggccaact gcgactgcct gaacggcggc 60
acctgcgtgt ccaacaagta cttcagcaac atccactggt gcaactgtcc taagaagttt 120
ggaggccagc attgcgagat cgacaagagc aagacctgct acgaaggcaa cggtcatttc 180
tacagaggca aggcctccac cgacaccatg ggccggccct gcctgccctg gaacagcgcc 240
acagtgctgc aacaaacata ccacgcccac agaagcgacg ccctgcaact gggcctcggc 300
aagcacaact actgcagaaa ccctgacaac agaagaagac cctggtgcta cgtgcaggtg 360
ggcctcaaat tgctggtcca ggaatgcatg gtccacgact gtgccgatgg aaagaagccc 420
agctctcctc cagaagaact gaaattccag tgtggacaga aaaccctgcg gcctagattc 480
aagatcatcg gcggcgaatt tacgaccatc gagaaccagc cttggttcgc cgctatctac 540
cggcggcacc ggggcggcag cgtgacatac gtttgtggcg gaagcctgat cagcccttgc 600
tgggtcatca gcgccacaca ctgcttcatc gattacccaa agaaggagga ctatatcgtg 660
tacctcggcc gcagcagact gaacagcaat acccagggcg agatgaagtt tgaggtggaa 720
aacctgatcc tgcacaaaga ctacagcgct gataccctgg cccaccacaa cgacatcgcc 780
ctgctgaaga tcagatctaa ggaaggccgg tgcgcccagc caagtagaac aatccagacc 840
atctgcctgc ccagcatgta caacgacccc cagttcggca ccagctgtga aatcaccgga 900
ttcggcaagg aaaacagcac agactacctg taccctgagc agctgaagat gaccgtggtg 960
aagctgatct ctcaccgcga gtgccagcag ccgcactatt acggctcgga ggtgaccaca 1020
aagatgctgt gcgctgccga tcctcagtgg aagacagatt cttgtcaggg cgacagcggc 1080
ggccctctgg tgtgcagcct gcagggaaga atgacactga ccggtatcgt gtcttggggc 1140
agaggttgtg ccctgaagga caaacctgga gtgtacaccc gggtgtccca cttcctgcct 1200
tggatcagaa gccacaccaa ggaagaaaat ggactggcac tgtga 1245
<210> 13
<211> 5312
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gacggatcgg gagctagcgt tctgccattg acttctgcca tttcgcttct gggattgacc 60
ttctgccatt ctacttctgc caattctctt ctgccatttg ccttctgcca ttgtacttct 120
gccattcggc aaacattgca agcagcccct ccctgcctgc tgaccttgga gctggggcag 180
aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc cactcgaccc cttggaattt 240
cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt agtgtgtgga cacaggacgc 300
tgtggtttct gagccagggg gcgactcaga tcccagccag tggacttagc ccctgtttgc 360
tccatttaac ttggttaata ttcaccggcc agcagcctcc cccgttgccc ctctggatcc 420
actgctggca attaacatct cctcagcttc aggtgagaat ccttaaggtc gaccgccgcc 480
accgtgagca agggcgaggc cgtgatcaag gagttcatga gattcaaggt gcacatggaa 540
ggaagcatga atggccacga gttcgagatc gagggagaag gcgagggcag accttacgaa 600
ggcacccaaa cagccaagct caaggtgaca aagggcggcc ctctgccttt tagctgggac 660
atcctgagcc cccagtttat gtacggctct agagccttca ccaagcaccc cgctgacatc 720
cctgactact acaagcaaag ctttcccgaa ggatttaagt gggaacgggt gatgaacttc 780
gaggatggag gagccgtgac agtgacccag gacacatcgc tggaagacgg aaccctgatc 840
tacaaggtga agctgagagg caccaacttc cctccagacg gccctgtgat gcagaaaaaa 900
accatgggct gggaggccag cactgagaga ctgtatcctg aggacggcgt gctgaagggc 960
gatatcaaga tggccctgag actgaaggac ggtggaagat acctggccga ctttaagacc 1020
acctacaaag ccaagaagcc agtgcagatg cctggcgcct acaacgtgga cagaaagctc 1080
gatatcacga gccacaacga agattacacc gtcgtggaac agtacgagcg gagcgaaggc 1140
agacacagca caggcggcat ggacgagctg tacaagtgat cgagcggccg ccaaacacca 1200
ttgtcacact ccacaaacac cattgtcaca ctccacaaac accattgtca cactccacaa 1260
acaccattgt cacactccaa gggattcctg ggaaaactgg acagggattc ctgggaaaac 1320
tggacaggga ttcctgggaa aactggacag ggattcctgg gaaaactgga cgcggccgca 1380
acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 1440
ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 1500
atcatgtctg gctctagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg 1560
gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc 1620
gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc 1680
gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct 1740
ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa 1800
aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc 1860
cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca 1920
ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttggggat ttcggcctat 1980
tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attaattctg tggaatgtgt 2040
gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccaggcag gcagaagtat gcaaagcatg 2100
catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt 2160
atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc 2220
ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt 2280
atttatgcag aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc 2340
ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcgga 2400
tctgatcagc acgtgttgac aattaatcat cggcatagta tatcggcata gtataatacg 2460
acaaggtgag gaactaaacc atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc 2520
gcgacgtcgc cggagcggtc gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg 2580
tggaggacga cttcgccggt gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc 2640
aggaccaggt ggtgccggac aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc 2700
tgtacgccga gtggtcggag gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca 2760
tgaccgagat cggcgagcag ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca 2820
actgcgtgca cttcgtggcc gaggagcagg actgacacgt gctacgagat ttcgattcca 2880
ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga 2940
tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg tttattgcag 3000
cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 3060
cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctgtatac 3120
cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 3180
gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 3240
gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 3300
cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 3360
tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 3420
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 3480
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 3540
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 3600
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 3660
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 3720
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 3780
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 3840
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 3900
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 3960
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 4020
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 4080
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 4140
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 4200
gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 4260
aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 4320
aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 4380
cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 4440
ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 4500
cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 4560
ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 4620
ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 4680
ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 4740
gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 4800
ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 4860
ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 4920
gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 4980
ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 5040
cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 5100
ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 5160
aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 5220
gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 5280
gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tc 5312
<210> 14
<211> 6860
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gacggatcgg gagctagcgt tctgccattg acttctgcca tttcgcttct gggattgacc 60
ttctgccatt ctacttctgc caattctctt ctgccatttg ccttctgcca ttgtacttct 120
gccattcggc aaacattgca agcagcccct ccctgcctgc tgaccttgga gctggggcag 180
aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc cactcgaccc cttggaattt 240
cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt agtgtgtgga cacaggacgc 300
tgtggtttct gagccagggg gcgactcaga tcccagccag tggacttagc ccctgtttgc 360
tccatttaac ttggttaata ttcaccggcc agcagcctcc cccgttgccc ctctggatcc 420
actgctggca attaacatct cctcagcttc aggtgagaat ccttaaggtc gaccgccgcc 480
accatggccg atgaggccgc cctcgcccta cagcctggag gcagcccgag cgccgccggt 540
gctgacagag aagccgccag ctcacctgcc ggagagcctc tgcgcaagcg gccacgcaga 600
gatggccccg gcctggagcg gagccccggg gagcctggcg gtgccgctcc tgagagagag 660
gtgcctgccg ccgctagagg ttgtcctgga gccgccgccg ctgccctgtg gagagaggcc 720
gaggctgaag ctgccgccgc cggcggcgag caggaggccc aggccaccgc agctgccggc 780
gaaggcgata atggccctgg actgcagggc ccttctagag agccccccct ggcagacaat 840
ctgtatgacg aagacgacga tgatgaaggg gaggaagaag aagaagccgc cgccgctgcc 900
atcggctaca gagacaacct gctctttggc gatgagatca ttacaaacgg cttccacagc 960
tgtgaaagcg acgaagagga tagggccagc cacgccagct cttctgactg gacccctcgt 1020
ccaagaatcg gaccatacac attcgtgcag cagcacctga tgatcggcac cgaccctaga 1080
acaatcctga aggacttact gcctgaaaca atccctcctc ctgaactgga cgacatgacc 1140
ctgtggcaga tcgtgataaa catcctgagc gagcctccta agcggaaaaa gagaaaagac 1200
atcaacacca tcgaggacgc ggtgaaactg ctgcaggagt gcaaaaaaat catcgtgctg 1260
acaggagccg gcgtgtccgt gtcttgtggc atccccgact tcagaagcag agacggaatc 1320
tatgccagac tggctgtgga cttccctgac ctgcccgacc cccaagcaat gttcgatatc 1380
gaatacttcc ggaaggaccc tcggcctttc ttcaaattcg ccaaggaaat ctaccccggc 1440
cagttccagc ctagcctgtg tcataagttc atcgccctgt ccgataagga agggaagctg 1500
cttagaaatt acacccagaa catcgacacc ctggaacaag tggccggcat tcagagaatc 1560
attcaatgcc atggctcttt tgctaccgct tcttgtctga tctgcaagta caaggtggac 1620
tgcgaggccg tgcggggcga tatcttcaac caggtggtcc ctaggtgccc ccgctgccct 1680
gccgacgagc ctctggccat catgaaacct gagatcgtct tcttcggcga gaacctgccc 1740
gagcagttcc accgggccat gaaatatgac aaggatgaag tggacctgct gatcgtgatc 1800
ggctctagcc tgaaagtgcg gcccgttgct ctgatcccct ccagcatccc gcacgaggtt 1860
ccacagatcc tgatcaaccg ggagcctctg ccacacctgc acttcgacgt tgagctgctg 1920
ggcgattgcg acgtgatcat taacgagctg tgccacagac tgggcggcga gtacgccaag 1980
ctgtgctgca accccgtgaa gctgagcgaa atcacagaga agcctcctcg gacccagaag 2040
gagctggctt atctgagcga actgccaccc acccccctgc acgtgagcga ggacagctct 2100
tctcctgaaa gaaccagccc tcccgattct tccgtgatcg tgaccctgct ggaccaggcc 2160
gccaaaagta acgacgacct ggacgttagc gaatctaagg gctgcatgga agaaaagccc 2220
caggaggtgc agaccagcag aaacgtggag agcatcgccg agcagatgga aaatcccgac 2280
ctgaagaacg tgggctctag caccggcgaa aagaacgagc ggacaagcgt ggctggcacc 2340
gtcagaaaat gttggcctaa ccgggtggcc aaggaacaga tcagcagacg gctggatggc 2400
aaccaatacc tgttcctgcc tcctaatcgg tacatcttcc acggcgccga ggtctacagc 2460
gatagcgagg acgatgtgct gtcttccagc tcctgcggca gcaatagcga ctccggaacc 2520
tgccagagcc ctagcctgga agagcctatg gaggatgagt ccgagattga ggagttctac 2580
aacggcctgg aggacgagcc tgacgtgcct gagagagccg gcggcgcggg ctttggcaca 2640
gatggcgatg accaggaagc tatcaatgag gccatcagcg tgaagcagga ggtgaccgac 2700
atgaactacc cctcaaacaa gtcctgatcg agcggccgcc aaacaccatt gtcacactcc 2760
acaaacacca ttgtcacact ccacaaacac cattgtcaca ctccacaaac accattgtca 2820
cactccaagg gattcctggg aaaactggac agggattcct gggaaaactg gacagggatt 2880
cctgggaaaa ctggacaggg attcctggga aaactggacg cggccgcaac ttgtttattg 2940
cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 3000
tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc 3060
tctagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc 3120
tggggctcta gggggtatcc ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg 3180
gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct 3240
ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg 3300
ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag 3360
ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg 3420
gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc 3480
tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttggggattt cggcctattg gttaaaaaat 3540
gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat taattctgtg gaatgtgtgt cagttagggt 3600
gtggaaagtc cccaggctcc ccaggcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag 3660
tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg 3720
catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact 3780
ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag 3840
gccgaggccg cctctgcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc 3900
ctaggctttt gcaaaaagct cccgggagct tgtatatcca ttttcggatc tgatcagcac 3960
gtgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga 4020
actaaaccat ggccaagttg accagtgccg ttccggtgct caccgcgcgc gacgtcgccg 4080
gagcggtcga gttctggacc gaccggctcg ggttctcccg ggacttcgtg gaggacgact 4140
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aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 5580
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 5640
cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 5700
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 5760
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 5820
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 5880
gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 5940
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 6000
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 6060
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 6120
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 6180
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 6240
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 6300
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 6360
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 6420
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 6480
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 6540
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 6600
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 6660
tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 6720
cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 6780
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 6840
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 6900
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 6960
aaagtgccac ctgacgtc 6978
<210> 17
<211> 6066
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
gacggatcgg gagctagctt cgaattccga tagatacctg gaatccgtac cagcttggac 60
cgaatgaagc ggtttcctcc aagttacagc cataggaaat cctcaggaag gtaagcctca 120
cctcacatgc tcctgaccca tggggcctca ccatcctgcc cagggccctg cagagactga 180
ggggcctctg cccatccctg ggtgtaggtg actcatgcac aggagcacaa ggtgctcaca 240
catgagcaga agatggggac tcacaaggtt ttgccttccc atagcaaaga tgacatccag 300
gaaaacacag agatgacacc ctcaaagaca cccctccttg accatcacct gcatagagtt 360
cacccatcca gggtctgtag ctggtgggct ctggatgccc acaaaaatga cccactttgc 420
tgtggcccca agctctcacc aatagcccat atgatgtctt catgtccttc cctgcagggg 480
acctcagtct tgtccttcaa gcccagaccc tttctatgtg gcaggagatg gggaagggat 540
gaaaaagcag gtgtgtgcac actcacacac acacatgcac acatagacac tgagacacag 600
acataccaat ccccttaagg tcgaccgccg ccaccatgaa agtctggctg gcgagcctgt 660
tcctctgcgc cttggtggtg aaaaactctg aaggtggcag tgtacttgga gctcctgatg 720
aatcaaactg tggctgtcag aacggaggtg tatgcgtgtc ctacaagtac ttctccagaa 780
ttcgccgatg cagctgccca aggaaattcc agggggagca ctgtgagata gatgcatcaa 840
aaacctgcta tcatggaaat ggtgactctt accgaggaaa ggccaacact gataccaaag 900
gtcggccctg cctggcctgg aatgcgcctg ctgtccttca gaaaccctac aatgcccaca 960
gacctgatgc tattagccta ggcctgggga aacacaatta ctgcaggaac cctgacaacc 1020
agaagcgacc ctggtgctat gtgcagattg gcctaaggca gtttgtccaa gaatgcatgg 1080
tgcatgactg ctctcttagc aaaaagcctt cttcgtctgt agaccaacaa ggcttccagt 1140
gtggccagaa ggctctaagg ccccgcttta agattgttgg gggagaattc actgaggtgg 1200
agaaccagcc ctggttcgca gccatctacc agaagaacaa gggaggaagt cctccctcct 1260
ttaaatgtgg tgggagtctc atcagtcctt gctgggtggc cagtgccgca cactgcttca 1320
ttcaactccc aaagaaggaa aactacgttg tctacctggg tcagtcgaag gagagctcct 1380
ataatcctgg agagatgaag tttgaggtgg agcagctcat cttgcacgaa tactacaggg 1440
aagacagcct ggcctaccat aatgatattg ccttgctgaa gatacgtacc agcacgggcc 1500
aatgtgcaca gccatccagg tccatacaga ccatctgcct gcccccaagg tttactgatg 1560
ctccgtttgg ttcagactgt gagatcactg gctttggaaa agagtctgaa agtgactatc 1620
tctatccaaa gaacctgaaa atgtccgtcg taaagcttgt ttctcatgaa cagtgtatgc 1680
agccccacta ctatggctct gaaattaatt ataaaatgct gtgtgctgcg gacccagagt 1740
ggaaaacaga ttcctgcaag ggcgattctg gaggaccgct tatctgtaac atcgaaggcc 1800
gcccaactct gagtgggatt gtgagctggg gccgaggatg tgcagagaaa aacaagcccg 1860
gtgtctacac gagggtctca cacttcctgg actggattca atcccacatt ggagaagaga 1920
aaggtctggc cttctgatcg agcggccgcc tgaacaccaa aagaaatcag tctgaacacc 1980
aaaagaaatc agtctgaaca ccaaaagaaa tcagtctgaa caccaaaaga aatcagtcca 2040
aacactgctg ggtaagacgc caaacactgc tgggtaagac gccaaacact gctgggtaag 2100
acgccaaaca ctgctgggta agacggcggc cgcaacttgt ttattgcagc ttataatggt 2160
tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct 2220
agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggctcta gcaggcatgc 2280
tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg gctctagggg 2340
gtatccccac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 2400
cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 2460
tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 2520
ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 2580
tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 2640
taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 2700
tgatttataa gggattttgg ggatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 2760
aaaatttaac gcgaattaat tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca 2820
ggctccccag gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg 2880
tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 2940
agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc 3000
ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc 3060
tgcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa 3120
aaagctcccg ggagcttgta tatccatttt cggatctgat cagcacgtgt tgacaattaa 3180
tcatcggcat agtatatcgg catagtataa tacgacaagg tgaggaacta aaccatggcc 3240
aagttgacca gtgccgttcc ggtgctcacc gcgcgcgacg tcgccggagc ggtcgagttc 3300
tggaccgacc ggctcgggtt ctcccgggac ttcgtggagg acgacttcgc cggtgtggtc 3360
cgggacgacg tgaccctgtt catcagcgcg gtccaggacc aggtggtgcc ggacaacacc 3420
ctggcctggg tgtgggtgcg cggcctggac gagctgtacg ccgagtggtc ggaggtcgtg 3480
tccacgaact tccgggacgc ctccgggccg gccatgaccg agatcggcga gcagccgtgg 3540
gggcgggagt tcgccctgcg cgacccggcc ggcaactgcg tgcacttcgt ggccgaggag 3600
caggactgac acgtgctacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc 3660
ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg 3720
gagttcttcg cccaccccaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 3780
agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 3840
aaactcatca atgtatctta tcatgtctgt ataccgtcga cctctagcta gagcttggcg 3900
taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 3960
atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 4020
ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 4080
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 4140
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 4200
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 4260
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 4320
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 4380
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 4440
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 4500
tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 4560
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 4620
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 4680
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 4740
tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 4800
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 4860
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 4920
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 4980
tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 5040
agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 5100
tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 5160
acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 5220
tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 5280
ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 5340
agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 5400
tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 5460
acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 5520
agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 5580
actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 5640
tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 5700
gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 5760
ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 5820
tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 5880
aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 5940
tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 6000
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 6060
gacgtc 6066

Claims (10)

1.一种识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，其特征在于，所述分子监测序列包括由5’端至3’端依次连接STAT3增强子和特异性最短启动子；
所述特异性最短启动子为肝特异性最短启动子或肾特异性最短启动子。
2.根据权利要求1所述一种识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，其特征在于，所述STAT3增强子的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述一种识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，其特征在于，所述肝特异性最短启动子的序列如SEQ ID NO.2所示；所述肾特异性最短启动子的序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1～3任意一项所述一种识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，其特征在于，所述特异性最短启动子的3’端还依次连接功能基因和细胞纤维化分子信号的互补靶向序列；
所述功能基因受所述互补靶向序列的反向调控。
5.根据权利要求4所述一种识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，其特征在于，所述分子监测序列为识别肝细胞纤维化的分子监测序列，包括由5’端至3’端依次连接的5’反向末端重复序列、所述STAT3增强子、所述肝特异性最短启动子、所述经过密码子优化的功能基因、所述互补靶向序列、Poly(A)尾巴以及3’反向末端重复序列；
其中，所述互补靶向序列为mir-122互补靶向序列和mir-145的互补靶向序列；
所述经过密码子优化的功能基因为mScarlet、SIRT1或PLAU基因中的一种。
6.根据权利要求5所述一种识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，其特征在于，所述mir-122的互补靶向序列如SEQ ID NO.4所示；所述mir-145的互补靶向序列如SEQ IDNO.5所示。
7.根据权利要求4所述一种识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，其特征在于，
所述分子监测序列为识别肾细胞纤维化的分子监测序列，包括由5’端至3’端依次连接的5’反向末端重复序列、所述STAT3增强子、所述肾特异性最短启动子、所述经过密码子优化的功能基因、所述互补靶向序列、Poly(A)尾巴以及3’反向末端重复序列；
所述互补靶向序列为mir-29互补靶向序列和mir-200的互补靶向序列；
其中，所述经过密码子优化的基因为mScarlet、SIRT1或PLAU基因中的一种。
8.根据权利要求7所述一种识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，其特征在于，
所述mir-29的互补靶向序列如SEQ ID NO.6所示；所述mir-200的互补靶向序列如SEQID NO.7所示。
9.一种用于识别和调控肝肾细胞纤维化的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括如权利要求1～8任意一项所述的分子监测序列。
10.一种用于识别和调控肝肾细胞纤维化的抑制病毒，其特征在于，所述抑制病毒含有如权利要求9所述的重组质粒。
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