CN102552935A - 肝细胞核因子1α治疗慢性肝病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肝细胞核因子1α治疗肝病。具体地，本发明涉及利用肝细胞核因子1α(Hepatocyte Nuclear Factor-1α，HNF1α)治疗肝纤维化和肝硬化。本发明的研究表明，通过调控HNF1α基因表达，可有效地对肝细胞因子的产生诱导作用，从而提供了一种治疗的新手段。

Description

肝细胞核因子1α治疗慢性肝病的用途

技术领域

本发明涉及分子生物学、细胞生物学、基因工程以及临床医学如疾病治疗领域。具体地，本发明涉及利用肝细胞核因子1α(HNF1α)治疗人慢性肝病、肝硬化。本发明还涉及将HNF1α基因和蛋白导入人慢性肝病、肝硬化肝脏组织和细胞的方法以及提高这些组织和细胞内HNF1α表达的手段。

背景技术

慢性肝病、肝硬化是临床常见的慢性疾病，治疗难度大，临床预后差，占用了巨大的医疗资源，是危害国民健康的重大疾病。肝纤维化(hepatic fibrosis)是各种慢性肝病发展至肝硬化的必经阶段，是肝脏对慢性损伤的一种修复反应，以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝内过多沉积为特征。目前认为，肝纤维化为一动态过程，属可逆性病变。因此，阻断、抑制或逆转肝纤维化是治疗慢性肝病的一个重要手段。肝纤维化发生的中心环节是肝星状细胞(hepaticstellate cell，HSC)激活并向肌成纤维样细胞(myofibroblasts，MFs)转化，抑制HSC激活、增殖与迁移、诱导凋亡是肝纤维化治疗的重要策略。上皮细胞间质转型(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)主要是指上皮细胞在细胞形态、细胞结构、细胞功能以及细胞粘附、迁移能力等方面获得间质细胞特性的过程。一系列研究表明，肝细胞、HSC、胆管上皮细胞也通过EMT转化为MFs，是肝纤维化进展过程中的重要环节。这些研究是肝纤维化机制与治疗领域新的突破。

肝细胞核因子1(hepatocyte nuclear factor，HNF1)属于POU-同源结构域家族，是调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能的重要转录蛋白，在分化成熟的肝细胞中高表达，其中HNF1α是HNF1的重要亚型。对HNF1α基因敲除小鼠研究发现：HNF1α是肝脏发生发育中必需的转录因子，与建立和维持胚胎肝脏的最终正常分化发育密切相关，HNF1α基因敲除小鼠可出现严重肝肾功能损害，多于出生后数天内死亡。HNF1α以同源或与HNF1β形成异源二聚体的形式与顺式作用元件结合，与一些转录激活蛋白相互作用来改变启动子或增强子附近的染色体结构，从而在转录水平实现对分化和功能基因表达的调控。尽管既往研究证实HNF1α在维持肝脏功能和肝脏发育过程中发挥重要作用，该转录因子与肝纤维化之间的关系尚不明确；其能否起到阻断或肝逆转纤维化仍未得到证实；对肝纤维化的治疗作用也不明确。国内外亦未将上调HNF1α表达作为抗肝纤维化治疗手段加以研究。我们研究的创新之处在于：利用基因工程技术体外调控HSC中HNF1α基因表达，证实其对HSC活化增殖以及EMT进程的抑制作用，同时进一步研究其可能的分子生物学机制；通过体内HNF1α腺病毒载体注射明确HNF1α表达上调对肝纤维化进程的阻断和逆转作用，这是利用转录因子治疗慢性肝病研究领域的全新探索。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人类HNF1α基因及其产物HNF1α蛋白作为治疗慢性肝病的用途；

本发明的另一个目的在于提供一种治疗慢性肝病的方法。

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：

本发明公开了人类HNF1α基因或其编码蛋白作为慢性肝病基因治疗药物的用途。

还提供了慢性肝病基因治疗的方法，包括将HNF1α基因导入肝脏实质细胞和间质细胞，使之表达，所述将HNF1α基因导入肝脏实质细胞和间质细胞的方法包括用质粒转染、腺病毒或腺相关病毒介导。

本发明还提供了一种用于药物治疗慢性肝病的药物组合物，包括人类HNF1α基因和/或其编码蛋白，和/或药用载体或赋形剂，和/或其他已知的治疗慢性肝病药物。

本发明还提供了一种治疗慢性肝病的方法，包括将有效量的上述药物组合物给药于需要这种治疗的患者。上述药物组合物通过口服，肌内，静脉内，皮下等途径来传送。

本发明所述的慢性肝病包括肝纤维化和肝硬化。

附图说明

附图1.免疫组化法及real-time PCR检测人肝硬化组织及相对正常肝组织中HNF1α蛋白及mRNA的表达。

附图2.HNF1α治疗DMN肝损伤大鼠模型示意图。

附图3.HNF1α治疗BDL肝损伤大鼠模型示意图。

附图4.表达HNF1α的重组腺病毒AdHNF1α经尾静脉注射导入不同类型肝纤维化大鼠体内对肝纤维化进程的抑制作用。

附图5.HNF1α抑制BDL纤维化大鼠体内α-SMA、TGF-β1表达，逆转EMT进程。

附图6.HNF1α抑制DMN纤维化大鼠体内α-SMA、TGF-β1表达，逆转EMT进程。

附图7.AdHNF1α感染大鼠HSC 48h后，抑制HSC活化及胶原合成，上调SHP1表达，抑制JAK-STAT通路。

附图8.HNF1α对HSC JAK-STAT信号转导通路的抑制作用。

附图9.利用siRNA下调SHP1表达，HNF1α抑制α-SMA、I型及III型胶原mRNA表达的作用被阻遏。

附图10.在DMN及BDL模型中，HNF1α可上调SHP1表达，促进SHP1膜转位，提高SHP1活性。

附图11.体内研究HNF1α抑制IL-6、TIMP-1及Jak2蛋白表达，抑制JAK-STAT通路。

附图12.体内研究HNF1α抑制IL-6、TIMP-1mRNA表达。

附图13.HNF1α促进miR-194表达，miR-194抑制下游靶基因SET及STAT5表达。

附图14.miR-194调控SET及STAT5蛋白表达，抑制miR-194后，HNF1α下调SET的作用被阻遏。

具体实施方式

本发明涉及人转录因子HNF1α的分离和功能研究，还包括HNF1α基因和蛋白导入HSC的方法和提高HSC内HNF1α表达的手段。HNF1α是调控肝脏分化和功能的重要转录蛋白，其以同源或与HNF1β形成异源二聚体的形式与顺式作用元件结合，与一些转录激活蛋白相互作用来改变启动子或增强子附近的染色体结构，从而在转录水平实现对基因表达的调控。我们在mRNA及蛋白水平检测了人肝硬化组织及相对正常肝组织中HNF1α的表达水平，证实了肝纤维化发展过程中，HNF1α表达下调；更为重要的是，上调HNF1α表达可抑制HSC活化及HSC胶原合成相关基因的表达；并在实验性肝纤维化大鼠体内发挥抑制肝纤维化进程的作用。因此，我们认为，HNF1α可能在肝纤维化发展进程中发挥重要作用，可能成为慢性肝病、肝纤维化治疗的重要靶点。

以下为本发明的基本思路：

1.对比测定人肝硬化组织和相对正常肝组织中HNF1α表达情况。

2.AdHNF1α经尾静脉注射导入不同类型肝纤维化大鼠体内，研究上调HNF1α表达对肝纤维化进程的抑制作用。

3.检测上调HNF1α对原代大鼠HSC活化及胶原合成相关基因表达的影响。

4.体外通过Real-time PCR等方法筛选HNF1α调控的肝纤维化相关信号转导通路中的重要基因，并用westen-blot检测其蛋白表达水平。

5.体内进一步验证及研究HNF1α调控的靶基因及肝纤维化相关信号通路。

6体外重组获取高纯度HNF1α蛋白，利用脂质体等非病毒载体介导，研发新型生物药物，开展HNF1α治疗慢性肝病的临床研究。

以下结合附图和实施例对本发明关于HNF1α治疗慢性肝病的应用作进一步说明，但本发明的范围并不仅限于下列实验所公开的范围。

实施例1

免疫组化法及Real-time PCR法检测正常人肝脏组织及肝硬化组织中HNF1α蛋白及mRNA的差异表达

1免疫组织化学方法检测肝组织中HNF1α蛋白变化。

人正常肝组织及肝硬化组织蜡块4mm连续切片，60℃烤箱中烘烤30min固定，脱蜡至水后，3％H₂O₂室温放置10min清除内源性过氧化物酶，柠檬酸缓冲液微波进行抗原修复，加1∶20正常兔血清室温封闭30min，滴加HNF1α抗体(1∶200)4℃过夜；次日PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤3次，每次5min；加二抗室温孵育30min；PBS洗涤后，加SABC(1∶100)室温孵育20min，DAB显色，常规树脂封片，光镜下观察。根据阳性染色范围，将免疫组化切片用图像分析仪行半定量分析，每张切片扫4个视野，用图像分析系统测量阳性染色面积并自动计算其与总面积的百分比。

2 Real-time PCR检测肝组织中HNF1αmRNA变化。

Trizol法抽提人正常肝组织及肝硬化组织RNA，以分光光度计测定其OD₂₆₀值，配成工作浓度(1μg/μl及0.1μg/μl)，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。取2μg RNA进行逆转录及Real-time PCR扩增。制备cDNA：

RT反应体系及步骤如下：

Random primer            1μl

RNA                      2μg

加DEPC水至总体积16.5μl，PCR仪上70℃，5min后快速置于冰上冷却5min，加入：

Inhibitor                1μl

5×buffer                5μl

dNTPmix                  1.5μl

M-MLV(逆转录酶)          1μl

混匀，37℃，2h，-20℃保存备用。

逆转录成cDNA后，beta-actin为内参照引物扩增反应，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪扫描成像，以检测逆转录情况。

Real-time PCR

反应体系如下：

反应条件为：94℃预变性30s，之后9410s，60℃30s，共进行40个循环后进行溶解曲线的检测。荧光本底信号和阈值一般采用仪器默认数值，每次运行结束以后自动生成，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数定义为Ct值；每对引物(基因)在每个模板中做3个重复管，得到的Ct值取平均值；每个目的基因的Ct平均值减去对应模板的内参基因(ACTB)的Ct平均值，得到ΔCt。实验组的ΔCt减去对照组的ΔCt，得到ΔΔCt值，对照组和实验组中的待测基因的倍数关系用2-ΔΔCt表示。Real-time PCR引物见附表1。

结果表明：肝硬化组织与相对正常肝组织相比，HNF1α蛋白及mRNA表达下调，说明HNF1α表达下调与肝纤维化发展相关。(附图1)

实施例2

上调HNF1α表达对大鼠肝纤维化进程的抑制作用。

1肝纤维化模型制备：

DMN损伤肝纤维化模型：将雄性SD大鼠随机分为4组，各组10只。普通饲料喂养，自由饮水，昼夜交替照明。第1组予生理盐水腹腔注射作为阴性对照组；第2～4组为肝纤维化模型组，予1％DMN溶液按照10μg/kg的剂量腹腔注射，每周连续注射3次，共注射4w，制备DMN诱导的大鼠肝纤维化模型。BDL肝纤维化模型：将雄性40只SD大鼠分成4组，每组10只。普通饲料喂养，自由饮水，昼夜交替照明。第1组为假手术组，第2～4组为BDL组。BDL大鼠予10％水合氯醛溶液按照35mg/kg体重的剂量腹腔注射麻醉后，将四肢固定于鼠板上。腹部碘伏消毒后，从腹部正中剑突下剪开约1.5-2cm的皮肤切口，沿腹肌白线剪开下面腹肌直至腹膜，暴露肝脏。用棉签将肝叶向大鼠的上方拨开，充分暴露肝门，可见与门静脉伴行的白色管道即为胆总管，钝性分离胆总管，用三根“0”丝线穿过胆总管，为防治胆汁淤积导致结扎线脱落，胆总管上端结扎两根线，上面两根尽量接近左右肝管汇合成胆总管处结扎，胆总管下端结扎一根，与上面两根线留取一段距离，在此中间剪断胆管。清理腹腔，4号线逐层关腹，即完成胆总管结扎模型的制备。假手术组仅开腹分离胆总管而不结扎切断就直接关腹。

2HNF1α体内导入肝纤维化动物模型

DMN组：将雄性SD大鼠随机分为4组，各组10只。普通饲料喂养，自由饮水，昼夜交替照明。第1组予生理盐水腹腔注射作为阴性对照组；第2～4组为肝纤维化模型组，予1％DMN溶液按照10μg/kg的剂量腹腔注射，每周连续注射3次，共注射4w，制备DMN诱导的大鼠肝纤维化模型。其中第2组设为模型对照组；第3组为空白病毒AdGFP对照组；第4组设为AdHNF1α导入组；于注射DMN注射2w后经尾静脉分别注入5×10⁹pfu AdGFP和5×10⁹pfuAdHNF1α，2w后处死，留取大鼠血清病本，同时取相同部位肝组织中性甲醛固定，备做石蜡切片；余肝组织液氮冻存(附图2)。BDL组：将雄性48只SD大鼠分成4组，每组12只。分别为：第1组为假手术组，2-4组为BDL模型组，依次设为PBS对照组、空白病毒AdGFP对照组和AdHNF1α导入组。BDL术后2d经尾静脉分别注入5×10⁹pfu AdGFP和5×10⁹pfu AdHNF1α；造模3w后处死大鼠，组织处理同DMN模型(附图3)。

3肝组织石蜡切片分别进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色、苦味酸-酸性品红(Van Gieson，VG)染色及Masson’s trichrome染色测定肝脏ECM沉积情况，结果表明：AdHNF1α治疗组大鼠肝脏ECM量较对照组明显减少。(DMN模型：AdHNF1α治疗组ECM为AdGFP组的57％；BDL模型：AdHNF1α治疗组ECM为AdGFP组的51％(附图4)。

4碱水解法测定各组肝组织羟脯氨酸含量

随机选取各组肝组织各6例，碱水解法测肝组织中羟脯氨酸含量(实验方法具体见南京凯基生物公司羟脯氨酸测定试剂盒说明书，CAT number：KGT030-2)，结果表明：AdHNF1α治疗组大鼠肝脏羟脯氨酸含量较对照组明显减少(附图4)。(DMN模型：AdHNF1α治疗组羟脯氨酸含量(163±42.57μg/g)较AdGFP组(259.33±57.95μg/g)明显减少；BDL模型：AdHNF1α治疗组羟脯氨酸(227.60±39.94μg/g)较AdGFP组(304.22±38.36μg/g)明显减少(P＜0.05，附图4)。

实施例3

Real-time PCR和免疫组织化学法证实：HNF1α在体内明显抑制HSC活化和细胞外基质沉积，并阻断肝纤维化组织EMT过程。

1提取DMN及BDL肝损伤模型各组大鼠肝组织总RNA：0.5～0.8g肝组织，加入TRizol试剂(1ml/100mg组织)，将组织碾碎至匀浆状，室温放置5min；加入氯仿0.2ml/ml TRizol，剧烈振荡15s后，室温下静置3min；4℃，12000rpm离心15min；取上层水相，加入异丙醇0.5ml/ml TRizol，颠倒混匀，室温静置10min；4℃，12000rpm离心10min；弃上清，加入无水乙醇1ml/ml TRizol，涡流混匀；4℃，7500rpm离心5min，弃去乙醇，室温下自然晾干；加50μl DEPC水溶解RNA；待RNA充分溶解后，各取1μl进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，并用紫外分光光度仪测定260nm、280nm波长处的光密度值，换算浓度。逆转录后Real-time PCR检测肝纤维化相关基因mRNA表达变化。结果显示，AdHNF1α导入组，HNF1α及SHP1表达明显上调；α-SMA、collagen I、IL-6及TIMP-1表达下调。BDL模型组结果与DMN模型组一致(附图5)。

2免疫组化检测DMN和BDL肝纤维化大鼠模型肝脏组织肝纤维化指标及相关通路逆转情况。

免疫组化结果表明，AdHNF1α导入后肝纤维化标志蛋白如α-SMA、TGF-β1表达随纤维化程度的改善而显著减少；上皮表型标志物E-cadherin表达明显增多，间质表型蛋白vimentin表达减少，EMT进程得到逆转；肝组织中Jak2、IL-6及TIMP-1表达明显减少，JAK-STAT通路明显抑制(附图6、7、8)。

3免疫组织荧光双标检测DMN和BDL肝纤维化大鼠模型肝脏组织SHP1与α-SMA表达情况及位置关系。

组织石蜡切片，60℃烘烤固片，30min；脱蜡至水；清除内源性过氧化物酶：3％H₂O₂，室温10min；PBS(0.01M，pH 7.4)洗3次，每次3min；抗原修复：柠檬酸缓冲液微波修复；PBS(0.01M，pH 7.4)洗3次，每次3min；封闭：5％马血清(PBS稀释)，放入湿盒，30℃封闭1h；，加一抗，4℃过夜(兔抗大鼠SHP1及小鼠抗大鼠α-SMA一抗浓度为1∶100)；PBS(0.01M，pH 7.4)洗3次，每次5min；加荧光二抗：37℃，30min；PBS(0.01M，pH 7.4)洗3次，每次5min；核DNA显色剂DAPI(4’6’-diamidino-2-phenylindole)用封闭液Mounting Solution 1∶1000稀释；取干净的载玻片一块，作上标记，滴上约30μlmounting solution(含DAPI)；用镊子取出盖玻片，边缘搭在吸水纸上吸去液体，细胞面朝下，盖在载玻片上；盖玻片的边缘四周刷上无色指甲油，待干；荧光显微镜或共聚焦显微镜观察。

免疫荧光结果表明，AdHNF1α导入后肝组织中SHP1蛋白表达明显增加，汇管区及窦周隙α-SMA表达明显减少，SHP1膜表达明显增多，因其底物主要分布在细胞膜附近，SHP1与底物结合后向细胞膜转移，提示其活性增强(附图9)。

实施例4

Real-time PCR检测AdHNF1α感染大鼠HSC后肝纤维化及相关通路基因变化。

1分离制备SD大鼠原代HSC：以戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，1％肝素钠1ml/kg使大鼠全身肝素化；固定，消毒，开腹，暴露门静脉，插管；以37℃无钙D-HanK’s灌流液预灌流；迅速剪断下腔静脉以备灌流液顺畅流出，灌流速度40～50ml/min，持续约10min；取出肝脏，剔除血管、筋膜，剪碎，倒入50ml离心管，加含0.05％Ⅳ胶原酶及0.1％链酶蛋白酶消化液40～50ml，37℃水浴，振荡消化30min；依次用100和200目筛过滤，滤液离心，1700rpm/min，7min；弃上清，用D-Hanks清洗离心2次，1700rpm/min，7min；弃上清，沉淀以1∶2体积的18％的Nycodenz混匀，行密度梯度离心，3400rpm/min，17min；取界面处细胞，用DMEM清洗2次，1700rpm/min，7min；取沉淀细胞悬浮于含10％小牛血清的DMEM中，用台盼蓝染色判存活率；将细胞以1×10⁵/cm²接种于35mm培养皿，置5％CO₂、37℃培养箱培养，24h细胞贴壁后换液，以后每隔2天换液1次；细胞鉴定：倒置显微镜下观察所分离的HSC形态和培养后的形态变化；在荧光显微镜328nm波长的紫外光激发下，观察HSC的自发荧光；免疫荧光测定desmin表达进一步证实。

2原代培养大鼠HSC培养72h后，用含10％FCS的DMEM换液后，以MOI300加入AdGFP及AdHNF1α感染HSC，培养48h后抽提总RNA，制备cDNA，real-time PCR检测各组肝纤维化及相关通路基因变化。

结果表明：Ad HNF1α可明显影响HSC肝纤维化相关基因表达：α-SMA、I型胶原、Ⅲ型胶原、TIMP-1和IL-6分别下调93％(P＜0.01)、81％(P＜0.01)、68％(P＜0.01)、29％(P＜0.05)和70％(P＜0.01)；MMP-9和MMP-13分别上调1.7倍和10.8倍。AdHNF1α可明显影响HSC活化增殖相关信号通路基因mRNA表达：JNK1、MKK4、gp130、STAT3、TGFR1、Smad2和Smad3分别下调56％(P＜0.05)、42％(P＜0.05)、77％(P＜0.01)、68％(P＜0.01)、59％(P＜0.05)、58％(P＜0.05)和59％(P＜0.05)；AdHNF1α可明显上调蛋白磷酸酶SHP1的mRNA表达(P＜0.01)。以上结果显示HNF1α可通过上调SHP1表达，阻遏JAK-STAT及相关MAPK通路，抑制HSC活化及胶原合成。(附图10)

实施例5

Westen-blot检测HNF1α对JAK-STAT相关蛋白表达的影响。

AdHNF1α分别感染HSC 48h，20％胎牛血清刺激0、1、2、4h后，细胞裂解液收取全细胞蛋白，蛋白标准定量后，各取10μg于10％SDS-PAGE电泳分离蛋白，将聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)ddH₂O冲洗，将电泳胶、PVDF膜、滤纸放于Transferring Buffer中平衡后，置于电转移槽中，300mA，70min。用5％BSA/PBST20ml室温封闭膜2h后，p-Jak2，Jak2，STAT5，SET等抗体(1∶200)4℃孵育过夜，次日PBST洗涤后，与驴抗兔荧光二抗(1∶2000)室温孵育30min，PBST洗涤2次后，经Odyssey红外激光成像系统检测荧光并进行灰度扫描。

结果显示：AdHNF1α可明显下调JAK-STAT通路相关磷酸化蛋白表达，阻遏JAK-STAT通路(附图11)。

实施例6

利用siRNA-SHP1下调SHP1表达，real-time PCR检测SHP1表达下调对HNF1α抑制肝纤维化作用的影响。

原代培养大鼠HSC72h后，取Lipofectamin 10μl，DMEM5ml，siRNA-SHP1及siRNA-NC 200pmol转染4-6小时后，更换为含10％FCS的DMEM过夜，分别加入AdGFP及AdHNF1α培养48h后抽提总RNA，制备cDNA，real-time PCR检测各组肝纤维化相关基因变化。

结果表明：AdHNF1α+siRNA-SHP1组与AdHNF1α+siRNA-NC组相比：α-SMA、I型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达分别上调58％(P＜0.05)、33％(P＜0.05)和122％(P＜0.05)，下调SHP1表达后，HNF1α抑制肝纤维化基因表达的作用明显下降，说明SHP1表达是HNF1α抑制肝纤维化的主要机制之一(附图12)。

实施例7

HNF1α上调miR-194表达，进而下调miR-194靶基因SET及STAT5表达，提高SHP1的催化活性。

1原代培养大鼠HSC 72h后，取Lipofectamin 10μl，DMEM5ml，miR-194mimics 200pmol转染4-6小时，更换为含10％FCS的DMEM培养48h及72h，收集蛋白及总RNA，real-time PCR及westen blot检测miR-194及其靶基因的表达。

结果表明：感染AdHNF1α48h及72h后，miR-194表达明显上升，miR-194mimics转染原代HSC 72h后，靶基因SET及STAT5蛋白表达明显下降。HNF1α通过上调miR-194抑制SET蛋白表达，激活SET-PP2A-SHP1通路，提高SHP1活性，并下调STAT5表达，抑制JAK-STAT通路(附图13、14)。

2原代培养大鼠HSC 72h后，取Lipofectamin 10μl，DMEM5ml，miR-194inhibitor 200pmol转染4-6h，更换为含10％FCS的DMEM培养过夜，分别加入AdGFP及AdHNF1α培养48h，提取总蛋白，westen-blot检测SET蛋白变化。

结果表明，AdHNF1α可明显下调HSC SET蛋白表达，miR-194 inhibitor抑制miR-194后，SET蛋白表达明显上升，逆向验证HNF1α通过上调miR-194抑制SET蛋白表达，提高SHP1活性。(附图14)

Claims (14)

1.人HNF1α的基因序列用于治疗慢性肝病的用途。

2.人HNF1α的基因序列用于制备治疗慢性肝病的药物的用途。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中慢性肝病包括肝纤维化和肝硬化。

4.人HNF1α基因序列编码的蛋白用于治疗慢性肝病的用途。

5.人HNF1α基因序列编码的蛋白用于制备治疗慢性肝病的药物的用途。

6.根据权利要求4或5所述的用途，其中慢性肝病包括肝纤维化和肝硬化。

7.用于治疗慢性肝病的药物组合物，其包括人HNF1α的基因序列和/或其编码的蛋白，和/或药用载体或赋形剂，和/或其他已知的治疗慢性肝病药物。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，通过口服，肌内，静脉内，皮下，局部，经皮途径来传送。

9.根据权利要求7或9所述的药物组合物，其中慢性肝病包括肝纤维化和肝硬化。

10.治疗慢性肝病的方法，包括将有效量的人HNF1α的基因序列和/或其编码的蛋白和/或权利要求7至9所述的药物组合物给药于患者。

11.根据权利要求10的治疗慢性肝病方法，其中慢性肝病包括肝纤维化和肝硬化。

12.慢性肝病的基因治疗方法，包括将HNF1α基因导入肝脏实质细胞和间质细胞，使之表达。

13.根据权利要求12的慢性肝病的基因治疗方法，所述将HNF1α基因导入肝脏实质细胞和间质细胞的方法包括用质粒转染、腺病毒或腺相关病毒介导。

14.根据权利要求12或13的慢性肝病的基因治疗方法，所述慢性肝病包括肝纤维化和肝硬化。

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