CN112501137A - 一种神经环路标记系统 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种神经环路标记系统、重组单纯疱疹病毒Hs06、重组单纯疱疹病毒Hs06的靶向载体pHs06及其构建方法、重组单纯疱疹病毒Hs06的应用、腺相关病毒As03的靶向载体pAs03、腺相关病毒As01的靶向载体pAs01、腺相关病毒As03或靶向载体pAs01的应用，其中，神经环路标记系统包括：重组单纯疱疹病毒Hs06、或者重组单纯疱疹病毒Hs06与腺相关病毒As03或腺相关病毒As01中的至少一种的组合。通过上述方式，包括重组单纯疱疹病毒Hs06的神经环路标记系统可以排除目前单纯疱疹病毒标记神经环路时出现的末梢吸收现象，具有高度特异性，且该神经环路标记系统的感染宿主范围广。

Description

一种神经环路标记系统
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一种神经环路标记系统、重组单纯疱疹病毒Hs06、重组单纯疱疹病毒Hs06的靶向载体pHs06及其构建方法、重组单纯疱疹病毒Hs06的应用、腺相关病毒As03的靶向载体pAs03、腺相关病毒As01的靶向载体pAs01、腺相关病毒As03或靶向载体pAs01的应用。
背景技术
病毒跨突触标记技术在近年来神经回路解析中得到了越来越广泛的应用。传统的神经网络标记方法，如染料、化合物标记剂、蛋白肽类等，能沿轴突转运但因不能跨突触，只能标记局部神经元形态。
发明内容
本申请主要解决的技术问题是如何解决传统的神经网络标记方法不能跨突触，只能标记局部神经元形态的技术问题，鉴于此，提出一种神经环路标记系统、重组单纯疱疹病毒Hs06、重组单纯疱疹病毒Hs06的靶向载体pHs06及其构建方法、重组单纯疱疹病毒Hs06的应用、腺相关病毒As03的靶向载体pAs03、腺相关病毒As01的靶向载体pAs01、腺相关病毒As03或靶向载体pAs01的应用。
为解决上述技术问题，本申请采用的第一个技术方案是：提出一种神经环路标记系统，神经环路标记系统包括：重组单纯疱疹病毒Hs06、或者重组单纯疱疹病毒Hs06与腺相关病毒As03或腺相关病毒As01中的至少一种的组合。
为解决上述技术问题，本申请采用的第二个技术方案是：提出一种如前述的重组单纯疱疹病毒Hs06，重组单纯疱疹病毒Hs06通过在敲除HSV-1H129病毒基因组中的gD基因之后，在被敲除的gD基因的位置上插入靶向Her2的单链抗体与gD基因的融合蛋白得到；其中，靶向Her2的单链抗体与gD基因的融合蛋白的序列为SEQ ID NO.3所示。
为解决上述技术问题，本申请采用的第三个技术方案是：提出一种用于构建如前述的重组单纯疱疹病毒Hs06的靶向载体pHs06，靶向载体pHs06的序列为SEQ ID NO.1所示。
为解决上述技术问题，本申请采用的第四个技术方案是：提出一种构建如前述的靶向载体pHs06的方法，该方法包括以下步骤：采用infusion融合技术将扩增后的UHA基因同源臂序列、DHA基因同源臂序列、荧光蛋白基因表达盒连入pcDNA3.1(+)载体，得到pcDNA3.1(+)-ΔgD；用NheI、XhoI双酶切pcDNA3.1(+)-ΔgD，并采用infusion融合技术将扩增后的红色荧光蛋白tDt基因表达盒连入酶切后的pcDNA3.1(+)-ΔgD，构建得到pH129ΔgD-tDt载体；采用infusion融合技术在pH129ΔgD-tDt载体的红色荧光蛋白tDt基因表达盒后面插入靶向Her2的单链抗体与gD基因的融合蛋白，其中，红色荧光蛋白tDt基因表达盒与靶向Her2的单链抗体与gD基因的融合蛋白之间通过P2A连接，得到靶向载体pHs06；其中，红色荧光蛋白tDt基因表达盒的序列为SEQ ID NO.10所示，P2A的序列为SEQ ID NO.11所示。
其中，采用infusion融合技术将扩增后的UHA基因同源臂序列、DHA基因同源臂序列、荧光蛋白基因表达盒连入pcDNA3.1(+)载体，得到pcDNA3.1(+)-ΔgD的步骤之前，该方法还包括：以HSV-1H129病毒基因组DNA为模板，扩增UHA基因同源臂序列以及DHA基因同源臂序列；其中，UHA基因同源臂序列的扩增引物为:UHA-F:GTACGGGCCAGATATACGCGTGCCCCACGACCCGACTCACCTCAAA,UHA-R:TATGCGGCCGCTCGTGCTAGCACCGGAACGCACCACACAAAAGAGA；DHA基因同源臂序列的扩增引物为：DHA-F:GCTAGCACGAGCGGCCGCATACCCCCCCTTAATGGGTGCG,DHA-R:GGTTTAAACGGGCCCTCTAGACGCCGGGATTTGGGGGGGGTGCTCG。
其中，红色荧光蛋白tDt基因表达盒的扩增引物为：F:GTGGTGCGTTCCGGTGCTAGCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGC,R:CCCATTAAGGGGGGGTATGCGGCCGCCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGC。
为解决上述技术问题，本申请采用的第五个技术方案是：提出一种前述的重组单纯疱疹病毒Hs06，或者，靶向载体pHs06所构建的重组单纯疱疹病毒Hs06在顺行标记V1神经环路或VTA输出神经环路中的应用。
为解决上述技术问题，本申请采用的第六个技术方案是：提出一种如前述的腺相关病毒As03的靶向载体pAs03，靶向载体pAs03通过Cre/loxP系统将密码子优化的gD基因和UL26.5p启动子插入到AAV载体中得到；其中，密码子优化的gD基因的序列为SEQ ID NO.4所示，UL26.5p启动子的序列为SEQ ID NO.5所示，靶向载体pAs03的序列为SEQ ID NO.6所示。
为解决上述技术问题，本申请采用的第七个技术方案是：提出一种腺相关病毒As01的靶向载体pAs01，靶向载体pAs01通过Cre/loxP系统将截短后的靶向Her2的单链抗体和绿色荧光蛋白插入到AAV载体中得到，其中，截短后的靶向Her2的单链抗体与绿色荧光蛋白之间通过T2A连接；其中，截短后的靶向Her2的单链抗体的序列为SEQ ID NO.7所示，绿色荧光蛋白的序列为SEQ ID NO.8所示，T2A的序列为SEQ ID NO.2所示，靶向载体pAs01的序列为SEQ ID NO.9所示。
为解决上述技术问题，本申请采用的第八个技术方案是：提出一种前述的靶向载体pAs03所构建的腺相关病毒As03，或者，如权利要求9的靶向载体pAs01所构建的腺相关病毒As01在神经环路标记或基因转导中的应用。
以上方案，包括重组单纯疱疹病毒Hs06的神经环路标记系统可以排除目前单纯疱疹病毒标记神经环路时出现的末梢吸收现象，具有高度特异性，且该神经环路标记系统的感染宿主范围广，应用对象不仅限于啮齿类动物大、小鼠，还适用于斑马鱼、雪貂、树鼩、非人灵长类猴等动物的脑科学研究、基因转导等领域。
附图说明
图1是本申请Hs01及Hs06基因组的结构示意图；
图2为Hs01及Hs06的构建过程示意图；
图3为Hs01及Hs06的病毒感染特性的体外实验现象图；
图4为Hs06的病毒感染特性的体内实验的操作示意图；
图5为Hs06在辅助病毒的辅助下的感染小鼠大脑的结果；
图6为Hs06直接感染小鼠大脑的结果；
图7为实施例5中重组单纯疱疹病毒Hs06顺行标记V1神经环路的体内实验的操作示意图；
图8为实施例5的V1脑区的实验结果；
图9为实施例5的上丘(superior colliculi，SC)脑区的实验结果；
图10为实施例5的膝状外侧腹侧(ventral lateral geniculate nucleus，LGNv)脑区的实验结果；
图11为实施例5的尾壳核(caudate putamen，CPu)的实验结果；
图12为实施例6中重组单纯疱疹病毒Hs06顺行标记VTA神经环路的体内实验的操作示意图；
图13为实施例6的VTA脑区的实验结果；
图14为实施例6的伏隔核(nucleus accumbens，NAc)脑区的实验结果；
图15为实施例6的外侧缰核(lateral habenula，LHB)脑区的实验结果；
图16为实施例6的中缝背侧核(dorsal raphe nucleus，DRN)脑区的实验结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本申请进行详细说明。
目前常用的嗜神经病毒主要有来源于α疱疹病毒科的伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)和单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)以及棒状病毒科的狂犬病毒(Rabies virus，RV)，其它还有水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)等，其中PRV Bartha株和RV是逆向跨突触感染，VSV两个方向都可以传播，相对能特异顺行跨突触传播的是单纯疱疹病毒1型毒株H129(HSV-1H129)，其与神经冲动传递的方向一致，非常适合于标记输出神经环路。但由于HSV能够感染神经元末梢，因此在中枢神经系统中的应用受到限制。开展对HSV-1H129的靶向特异性神经元的研究很有必要。
目前的HSV-1H129病毒标记系统都是对H129的复制相关基因进行改造，从而实现顺行跨突触标记的目的。然而HSV-1H129本身具有感染神经元末梢的能力，这些改造无法避免其所带来的逆向标记干扰，因此在中枢神经系统的环路标记应用中受到极大限制。
HSV的膜蛋白gD是HSV感染细胞的关键膜蛋白，将gD基因的识别受体的关键区域替换为特异性的单链抗体序列，可以实现对特异抗原的识别。因此，本申请旨在通过改造HSV-1H129的膜蛋白gD，从而改变其感染特性，使其靶向特定类型的受体，消除其感染神经元末梢的现象。配合辅助病毒表达的野生型gD以及受体，改造后的HSV-1H129可以实现特定类型神经元起始的顺行跨突触传播，为中枢神经系统的环路标记提出严谨的病毒工具。
在第一方面，本申请提出了一种神经环路标记系统，神经环路标记系统包括：单一的单纯疱疹病毒Hs06、重组单纯疱疹病毒Hs06与腺相关病毒As03的组合、重组单纯疱疹病毒Hs06与腺相关病毒As01的组合、或者重组单纯疱疹病毒Hs06、腺相关病毒As03与腺相关病毒As01三者的组合。上述腺相关病毒As03和/或腺相关病毒As01，用于辅助重组单纯疱疹病毒Hs06进行神经环路标记。
具体地，重组单纯疱疹病毒Hs06由重组单纯疱疹病毒Hs06的靶向载体pHs06构建得到，该靶向载体pHs06的序列为SEQ ID NO.1所示。
腺相关病毒As03由腺相关病毒As03的靶向载体pAs03构建得到，该靶向载体pAs03的序列为SEQ ID NO.6所示。
腺相关病毒As01由腺相关病毒As01的靶向载体pAs01构建得到，该靶向载体pAs01的序列为SEQ ID NO.9所示。
具体地，人表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2，Her2)基因为原癌基因，其编码产物Her2蛋白为185kD的跨膜精蛋白，简称p185，由1255个氨基酸组成，720—987位属于酪氨酸激酶区，Her2蛋白也是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，所以也属于EGFR家族成员之一。Her2蛋白通常只在胎儿时期表达，成年以后只在极少数组织内低水平表达，然而有研究表明30％以上的人类肿瘤中存在Her2基因的扩增过度表达，因此，Her2基因是临床治疗监测的预后指标，也是肿瘤靶向治疗药物选择的一个重要靶点。
由靶向载体pHs06构建得到单纯疱疹病毒Hs06，单纯疱疹病毒Hs06是特异性靶向Her2基因的HSV-1H129重组病毒，也就是说，单纯疱疹病毒Hs06具有靶向表达Her2基因的细胞的能力。本申请提出的单纯疱疹病毒Hs06可用于神经环路标记，因其具有靶向表达Her2基因的特异性，其标记结果非常严谨；另外本申请还构建了特殊结构的腺相关病毒As03和腺相关病毒As01，腺相关病毒As03和腺相关病毒As01可用于辅助单纯疱疹病毒Hs06进行神经环路标记。
以上方案，包括重组单纯疱疹病毒Hs06的神经环路标记系统可以排除目前单纯疱疹病毒标记神经环路时出现的末梢吸收现象，具有高度特异性，且该神经环路标记系统的感染宿主范围广，应用对象不仅限于啮齿类动物大、小鼠，还适用于斑马鱼、雪貂、树鼩、非人灵长类猴等动物的脑科学研究、基因转导等领域。
在第二方面，本申请提出一种重组单纯疱疹病毒Hs06，重组单纯疱疹病毒Hs06通过在敲除HSV-1H129病毒基因组中的gD基因之后，在被敲除的gD基因的位置上插入靶向Her2的单链抗体与gD基因的融合蛋白得到；其中，该靶向Her2的单链抗体与gD基因的融合蛋白的序列为SEQ ID NO.3所示。
在第三方面，本申请提出一种重组单纯疱疹病毒Hs06的靶向载体pHs06，靶向载体pHs06的序列为SEQ ID NO.1所示。
在第四方面，本申请提出一种用于构建前述的靶向载体pHs06的方法，该方法包括以下步骤：
S10：采用infusion融合技术将扩增后的UHA基因同源臂序列、DHA基因同源臂序列、荧光蛋白基因表达盒连入pcDNA3.1(+)载体，得到pcDNA3.1(+)-ΔgD。
S20：用NheI、XhoI双酶切pcDNA3.1(+)-ΔgD，并采用infusion融合技术将扩增后的红色荧光蛋白tDt基因表达盒连入酶切后的pcDNA3.1(+)-ΔgD，构建得到pH129ΔgD-tDt载体。
S30：采用infusion融合技术在pH129ΔgD-tDt载体的红色荧光蛋白tDt基因表达盒后面插入靶向Her2的单链抗体与gD基因的融合蛋白，其中，红色荧光蛋白tDt基因表达盒与靶向Her2的单链抗体与gD基因的融合蛋白之间通过编码连接肽P2A连接，得到靶向载体pHs06。
其中，红色荧光蛋白tDt基因表达盒的序列为SEQ ID NO.10所示，编码连接肽P2A的序列为SEQ ID NO.11所示。
在一实施例中，上述步骤S10之前，该方法还包括：以HSV-1H129病毒基因组DNA为模板，扩增UHA基因同源臂序列以及DHA基因同源臂序列；其中，UHA基因同源臂序列的扩增引物为:UHA-F:GTACGGGCCAGATATACGCGTGCCCCACGACCCGACTCACCTCAAA,UHA-R:TATGCGGCCGCTCGTGCTAGCACCGGAACGCACCACACAAAAGAGA；DHA基因同源臂序列的扩增引物为：DHA-F:GCTAGCACGAGCGGCCGCATACCCCCCCTTAATGGGTGCG,DHA-R:GGTTTAAACGGGCCCTCTAGACGCCGGGATTTGGGGGGGGTGCTCG。
在一实施例中，上述红色荧光蛋白tDt基因表达盒的扩增引物为：F:GTGGTGCGTTCCGGTGCTAGCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGC,R:CCCATTAAGGGGGGGTATGCGGCCGCCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGC。
在第五方面，本申请提出一种前述的重组单纯疱疹病毒Hs06，或者，前述的靶向载体pHs06所构建的重组单纯疱疹病毒Hs06在顺行标记初级视皮层(Visual Cortex 1，V1)神经环路或腹侧被盖区(ventral tegmental area，VTA)输出神经环路中的应用。
在第六方面，为了模拟野生型H129在神经系统中的复制，本申请还提出一种前述的腺相关病毒As03的靶向载体pAs03，靶向载体pAs03通过Cre/loxP系统将密码子优化的gD基因和UL26.5p启动子插入到AAV载体中得到。其中，密码子优化的gD基因的序列为SEQ IDNO.4所示，UL26.5p启动子的序列为SEQ ID NO.5所示，靶向载体pAs03的序列为SEQ IDNO.6所示。
在第七方面，本申请提出一种前述的腺相关病毒As01的靶向载体pAs01，靶向载体pAs01通过Cre/loxP系统将截短后的靶向Her2的单链抗体和绿色荧光蛋白插入到腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体中得到，其中，截短后的靶向Her2的单链抗体与绿色荧光蛋白之间通过编码连接肽T2A连接；其中，该截短后的靶向Her2的单链抗体的序列为SEQ ID NO.7所示，绿色荧光蛋白的序列为SEQ ID NO.8所示，T2A的序列为SEQ ID NO.2所示，靶向载体pAs01的序列为SEQ ID NO.9所示。其中，将靶向Her2的单链抗体截短，有利于AAV病毒包装。
在第八方面，本申请提出一种前述的靶向载体pAs03所构建的腺相关病毒As03，或者，前述的靶向载体pAs01所构建的腺相关病毒As01在神经环路标记或基因转导中的应用。
以下示出了本申请的一些其他示例性实施例，如未特别说明，均为本领域的常规技术。所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
重组单纯疱疹病毒Hs06的靶向载体pHs06的构建
(1)pH129ΔgD-tDt载体的构建
以HSV-1H129病毒基因组DNA为模板，设计扩增引物，扩增gD基因的UHA基因同源臂和DHA基因同源臂。采用infusion融合技术将扩增后的UHA基因同源臂序列、DHA基因同源臂序列以及荧光蛋白基因表达盒连入pcDNA3.1(+)载体，得到pH129ΔgD-tDt载体，其中，扩增后的UHA基因同源臂、DHA基因同源臂中间引入红色荧光蛋白tDt基因表达盒。
具体地，pH129ΔgD-tDt载体的构建步骤如下：
①设计第一对引物：
UHA-F:GTACGGGCCAGATATACGCGTGCCCCACGACCCGACTCACCTCAAA，
UHA-R:TATGCGGCCGCTCGTGCTAGCACCGGAACGCACCACACAAAAGAGA；
其中，在设计第一对引物时，在UHA-R中引入了Nhe1、Not1两个酶切位点。
②以HSV-1H129病毒基因组DNA为模板，扩增UHA基因同源臂。
③设计第二对引物：
DHA-F:GCTAGCACGAGCGGCCGCATACCCCCCCTTAATGGGTGCG，
DHA-R:GGTTTAAACGGGCCCTCTAGACGCCGGGATTTGGGGGGGGTGCTCG；
④以HSV-1H129病毒基因组DNA为模板，扩增DHA基因同源臂。
⑤使用Mlu1、Xba1双酶切pcDNA3.1(+)载体，回收。将pcDNA3.1(+)载体片段与扩增后的UHA基因同源臂片段、DHA基因同源臂片段进行多片段重组。其中，多片段重组使用的是来自南京诺唯赞公司的多片段Infusion试剂盒，得到pcDNA3.1(+)-ΔgD载体。
⑥设计第三对引物：
F:GTGGTGCGTTCCGGTGCTAGCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGC，
R:CCCATTAAGGGGGGGTATGCGGCCGCCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGC；
⑦以第三对引物对红色荧光蛋白tDt基因表达盒(hUbc-tDt-WPRE-PA)进行扩增。
⑧使用Nhe1、Not1双酶切pcDNA3.1(+)-ΔgD载体，回收。将pcDNA3.1(+)-ΔgD载体片段与扩增后的红色荧光蛋白tDt基因表达盒(hUbc-tDt-WPRE-PA)进行多片段重组。其中，多片段重组使用的是来自南京诺唯赞公司的多片段Infusion试剂盒，得到pH129ΔgD-tDt载体。
(2)携带scHer2::gD的靶向载体pHs06构建
采用infusion融合技术在pH129ΔgD-tDt载体中的红色荧光蛋白tDt基因表达盒(hUbc-tDt-WPRE-PA)的序列后面插入靶向Her2的单链抗体与gD基因的融合蛋白scHer2::gD，其中，hUbc-tDt-WPRE-PA与scHer2::gD之间通过编码连接肽P2A连接，得到靶向载体pHs06。
具体地，靶向载体pHs06的构建步骤如下：
①设计第四对引物：
F:ACGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCC，
R:ATCCAGAGGTTGATTTCTAGATTAGTAAAACAAGGGCTGGTGCGAG；
②以第四对引物对p2A-scHer2::gD序列进行扩增。
③使用BsrG1单酶切pH129ΔgD-tDt载体，回收。将pH129ΔgD-tDt载体片段与扩增后的p2A-scHer2::gD片段进行多片段重组。其中，多片段重组使用的是来自南京诺唯赞公司的多片段Infusion试剂盒，得到靶向载体pHs06。
实施例2：
重组单纯疱疹病毒Hs06的构建
(1)Hs01的构建
如图2所示，为了获得如图1所示的Hs01(其中，Hs01为gD基因缺失的单纯疱疹病毒1型毒株H129(HSV-1H129))，首先将pH129ΔgD-tDt载体与HSV-1H129病毒基因组DNA共转染到六孔板293T细胞中。待大部分细胞表现出细胞病变后，去除培养基，用PBS收集细胞。经多轮冷冻-震荡-涡旋过程后，用细胞裂解液感染六孔板的BHK-gD细胞。感染1小时后，去除裂解液，在细胞上覆盖含有2％胎牛血清、抗生素和1％琼脂糖的DMEM。2到3天后，取分离良好的表达红色荧光的嗜斑，再进行至少5轮蚀斑纯化，去除野生型H129病毒。
(2)Hs06的构建
如图2所示，为了获得如图1所示的Hs06(其中，Hs06为特异性靶向Her2基因的H129重组病毒)，首先将靶向载体pHs06转染至BHK-Her2细胞，并与Hs01进行同源重组，得到Hs06。其中，Hs06通过嗜斑实验进行纯化。纯化后的Hs06通过感染生长在平板上的BHK-Her2细胞进行批量化生产纯化。将Hs06按照MOI＝0.01感染BHK-Her2细胞，待细胞出现明显的病变之后，将含Hs06的上清液收集到离心管中，通过离心去除细胞碎片，上层清液使用0.22μm的滤膜过滤，最后使用离心机进行浓缩。将浓缩后的Hs06沉淀使用少量PBS(pH＝7.4)进行重悬，在0-4℃条件下过夜，并不断摇动。将溶解后的Hs06进行分装，冻存在-80℃冰箱中。使用BHK-Her2细胞进行标准嗜斑实验来测定浓缩后Hs06的滴度，滴度以每毫升的嗜斑形成单位(PFU/mL)表示。浓缩后的Hs06滴度约为1×108PFU/mL。
实施例3
腺相关病毒的设计与制备
(1)靶向载体pAs01和靶向载体pAs03的构建
通过Cre/loxP系统将截短的靶向Her2的单链抗体及绿色荧光蛋白插入腺相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)核心载体中，得到靶向载体pAs01，其中，截短的靶向Her2的单链抗体的序列与该绿色荧光蛋白的序列之间通过编码连接肽T2A连接。
通过Cre/loxP系统将密码子优化的gD基因及UL26.5p启动子插入AAV核心载体中，得到靶向载体pAs03。
(2)腺相关病毒As01和腺相关病毒As03的制备
使用常规的三质粒体系转染HEK293T来制备腺相关病毒。HEK293T在含有10％胎牛血清、1％青霉素和1％链霉素的DMEM培养基中培养，置于37℃、5％CO2培养箱中。HEK293T细胞转染前24小时在15个10cm培养皿中培养，用含2％胎牛血清的DMEM培养基培养，融合度约80％进行转染。将所有质粒和PEI转染试剂加入无血清DMEM培养基中，置于1.5mL EP管中。质粒DNA与转染试剂的比例为1:2。混合均匀后，将质粒DNA在室温下放置15到20分钟，一滴一滴地加入培养皿中。转染72小时后收集上清液和细胞。收集的含AAV的HEK293T细胞用细胞裂解液悬浮至1×107个细胞/mL。在液氮和水浴中反复冻融3次后，加入适量的核酸酶Benzonase(1uL/10mL)，充分混匀，37℃消化1h。收集上层清液，离心10分钟。将经核酸酶处理的裂解液上清和转染后的细胞培养上清与含有8％PEG8000和0.5mol/L NaCl的溶液混合，0-4℃放置过夜，0-4℃下离心90分钟。将沉淀用10mL PBS中溶解，得到腺相关病毒的初始浓缩液。然后采用碘克沙醇密度梯度离心进行二次浓缩。最后的腺相关病毒浓缩液经0.22微米过滤器过滤灭菌后-80℃保存。使用QPCR检测AAV的滴度，将核心质粒按10倍梯度稀释制成标准曲线。
得到的AAV滴度为：AAV-hSyn-Dio-EGFP-T2A-Her2ct9-Pa，1.3×1013GC/mL；AAV-UL26.5p-Dio-cmgD-WPRE-PA，1×1013GC/mL。
实施例4
重组单纯疱疹病毒Hs06的靶向特异性受体
(1)体外实验
为检测感染特性，用Hs01和Hs06分别感染BHK-gD细胞、原代神经元以及BHK细胞。请见图3，结果表明，Hs01只能在BHK-gD细胞中增殖，而Hs01虽能感染初级神经元(primaryneuron)和BHK细胞，但不能再次产生感染性子代病毒。Hs06则只能感染BHK-Her2细胞，说明Hs06具有靶向Her2基因的特异性，Hs06只能识别表达Her2基因的细胞，而动物中枢神经系统的初级神经元几乎不表达Her2基因，消除了H129感染轴突末端的能力。
(2)体内实验
请见图4-6。
对照组：将PBS缓冲液和辅助性病毒AAV-hSyn-Dio-EGFP-T2A-Her2CT9-PA注射到D2R-cre或C57BL/6小鼠伏隔核(nucleus accumbens，Nac)脑区。
实验组：将PBS缓冲液和辅助性病毒AAV-hSyn-Dio-EGFP-T2A-Her2CT9-PA注射到D2R-cre或C57BL/6小鼠伏隔核(Nac)脑区，并在2周后再次在原位注射Hs06，5天后收集脑切片观察。
结果表明：实验组的Her2CT9的小鼠脑内Nac及其邻近区域可见大量Hs06感染的神经元。对照组则未观察到红色神经元。因此，Hs06对Her2CT9有较高的亲和力，并能有效特异性感染表达Her2CT9的神经元。
实施例5
重组单纯疱疹病毒Hs06在顺行标记V1神经环路中的应用
请见图7-11。
在小鼠大脑初级视觉皮层(V1)进行标记实验以验证重组单纯疱疹病毒Hs06是否具有顺行传播的能力。
首先，将辅助病毒AAV-hSyn-Dio-EGFP-T2A-Her2CT9-PA和AAV-UL26.5p-Dio-cmgD-WPRE-PA与表达cre重组酶的病毒AAV-hSyn-cre-WPRE-PA混合后注射到V1区。14天后在同一部位注射Hs06。在注射Hs06 5天后，取大脑进行切片观察。由于Hs06荧光表达水平较低，对脑切片进行了免疫组化处理，便于成像和观察。在成像结果中，能够在接受V1神经元投射的脑区神经元中观察到红色荧光蛋白的表达。这些脑区包括上丘(superiorcolliculi，SC)、膝状外侧腹侧(ventral lateral geniculate nucleus，LGNv)和尾壳核(caudate putamen，CPu)。上述这些脑区已经被证明只接收V1的投射而不投射到V1。因此，这些脑区被标记到的神经元是被从V1传播过来的Hs06感染的。这就证明了重靶向单纯疱疹病毒Hs06具有顺行跨单突触传播的能力。
实施例6
重组单纯疱疹病毒Hs06在顺行标记VTA神经环路中的应用
请见图12-16。
为了进一步测试Hs06追踪系统的能力，利用重组单纯疱疹病毒Hs06对VTA的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)能神经元的输出网络进行了标记。VTA的GABA能神经元可投射到伏隔核(nucleus accumbens，NAc)、腹侧苍白球(ventral pallidum，VP)、外侧缰核(lateral habenula，LHB)、中缝背侧核(dorsal raphe nucleus，DRN)等多个脑区，在压力、奖励等动物行为中发挥重要作用。将标记系统应用于GAD2-Cre转基因小鼠的VTA脑区，可以观察到上述VTA的GABA能神经元投射脑区中被Hs06标记的神经元。本次实验再次验证了重组单纯疱疹病毒Hs06的顺行跨单突触能力，也表明该重组单纯疱疹病毒Hs06具有相对稳定的标记效果。
以上所述仅为本申请的实施方式，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳先进技术研究院
<120> 一种神经环路标记系统
<160> 11
<210> 1
<211> 12543
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_difference
<222> (1)…(12543)
<400> 1
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgtgccccac 240
gacccgactc acctcaaagg gacgaccctt ggttccgacg cctcaacata ccccgctgtt 300
ctcgttcctc actgcctccc ccgccctgga caccctcttc gtcgtcagca ccgtcatcca 360
caccttatcg tttttgtgta ttggtgcgat ggcgacacac ctgtgtggcg gttggtccag 420
acgcgggcga cgcacacacc ctagcgtgcg ttacgtgtgc ctgccgtccg aacgcgggta 480
gggtatgggg cgggggatgg ggagagccca cacgcggaaa gcaagaacaa taaaggcggt 540
ggtatctagt tgatatgcat ctctgggtgt ttttggggtg tggcggacgc ggggcggtca 600
ttggacgggg tgcagttaaa tacatgcccg ggacccatga agcatgcgcg acttccgggc 660
ctcggaaccc acccgaaacg gccaacggac gtctgagcca ggcctggcta tccggagaaa 720
cagcacacga cttggcgttc tgtgtgtcgc gatgtctctg cgcgcagtct ggcatctggg 780
gcttttggga agcctcgtgg gggctgttct tgccgccacc catcggggac ctgcggccaa 840
cacaacggac cccttaacgc acgccccagt gtcccctcac cccagccccc tggggggctt 900
tgccgtcccc ctcgtagtcg gtgggctgtg cgccgtagtc ctgggggcgg cgtgtctgct 960
tgagctcctg cgtcgtacgt gccgcgggtg ggggcgttac catccctaca tggacccagt 1020
tgtcgtataa ttcccccccc cttctccgca tgggtgatgt cgggtccaaa ctcccgacac 1080
caccagctgg catggtataa atcaccggtg cgccccccaa accatgtccg gcagggggat 1140
gggggggcga atgcggaggg cacccaacaa caccgggcta accaggaaat ccgtggcccc 1200
ggcccccaat aaagatcgcg gtagcccggc cgtgtgacac tatcgtccat accgaccaca 1260
ccgacgaatc ccctaagggg gaggggccat tttacgagga ggaggggtat aacaaagtct 1320
gtctttaaaa agcaggggtt agggagttgt tcggtcataa gcttcagcgc gaacgaccaa 1380
ctaccccgat catcagttat ccttaaggtc tcttttgtgt ggtgcgttcc ggtgctagcg 1440
cgccgggttt tggcgcctcc cgcgggcgcc cccctcctca cggcgagcgc tgccacgtca 1500
gacgaagggc gcaggagcgt tcctgatcct tccgcccgga cgctcaggac agcggcccgc 1560
tgctcataag actcggcctt agaaccccag tatcagcaga aggacatttt aggacgggac 1620
ttgggtgact ctagggcact ggttttcttt ccagagagcg gaacaggcga ggaaaagtag 1680
tcccttctcg gcgattctgc ggagggatct ccgtggggcg gtgaacgccg atgattatat 1740
aaggacgcgc cgggtgtggc acagctagtt ccgtcgcagc cgggatttgg gtcgcggttc 1800
ttgtttgtgg atcgctgtga tcgtcacttg gtgagttgcg ggctgctggg ctggccgggg 1860
ctttcgtggc cgccgggccg ctcggtggga cggaagcgtg tggagagacc gccaagggct 1920
gtagtctggg tccgcgagca aggttgccct gaactggggg ttggggggag cgcacaaaat 1980
ggcggctgtt cccgagtctt gaatggaaga cgcttgtaag gcgggctgtg aggtcgttga 2040
aacaaggtgg ggggcatggt gggcggcaag aacccaaggt cttgaggcct tcgctaatgc 2100
gggaaagctc ttattcgggt gagatgggct ggggcaccat ctggggaccc tgacgtgaag 2160
tttgtcactg actggagaac tcgggtttgt cgtctggttg cgggggcggc agttatgcgg 2220
tgccgttggg cagtgcaccc gtacctttgg gagcgcgcgc ctcgtcgtgt cgtgacgtca 2280
cccgttctgt tggcttataa tgcagggtgg ggccacctgc cggtaggtgt gcggtaggct 2340
tttctccgtc gcaggacgca gggttcgggc ctagggtagg ctctcctgaa tcgacaggcg 2400
ccggacctct ggtgagggga gggataagtg aggcgtcagt ttctttggtc ggttttatgt 2460
acctatcttc ttaagtagct gaagctccgg ttttgaacta tgcgctcggg gttggcgagt 2520
gtgttttgtg aagtttttta ggcacctttt gaaatgtaat catttgggtc aatatgtaat 2580
tttcagtgtt agactagtaa attgtccgct aaattctggc cgtttttggc ttttttgtta 2640
gacggtacca tggtgagcaa gggcgaggag gtcatcaaag agttcatgcg cttcaaggtg 2700
cgcatggagg gctccatgaa cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc 2760
ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg aaggtgacca agggcggccc cctgcccttc 2820
gcctgggaca tcctgtcccc ccagttcatg tacggctcca aggcgtacgt gaagcacccc 2880
gccgacatcc ccgattacaa gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg 2940
atgaacttcg aggacggcgg tctggtgacc gtgacccagg actcctccct gcaggacggc 3000
acgctgatct acaaggtgaa gatgcgcggc accaacttcc cccccgacgg ccccgtaatg 3060
cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc accgagcgcc tgtacccccg cgacggcgtg 3120
ctgaagggcg agatccacca ggccctgaag ctgaaggacg gcggccacta cctggtggag 3180
ttcaagacca tctacatggc caagaagccc gtgcaactgc ccggctacta ctacgtggac 3240
accaagctgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgagcgc 3300
tccgagggcc gccaccacct gttcctgggg catggcaccg gcagcaccgg cagcggcagc 3360
tccggcaccg cctcctccga ggacaacaac atggccgtca tcaaagagtt catgcgcttc 3420
aaggtgcgca tggagggctc catgaacggc cacgagttcg agatcgaggg cgagggcgag 3480
ggccgcccct acgagggcac ccagaccgcc aagctgaagg tgaccaaggg cggccccctg 3540
cccttcgcct gggacatcct gtccccccag ttcatgtacg gctccaaggc gtacgtgaag 3600
caccccgccg acatccccga ttacaagaag ctgtccttcc ccgagggctt caagtgggag 3660
cgcgtgatga acttcgagga cggcggtctg gtgaccgtga cccaggactc ctccctgcag 3720
gacggcacgc tgatctacaa ggtgaagatg cgcggcacca acttcccccc cgacggcccc 3780
gtaatgcaga agaagaccat gggctgggag gcctccaccg agcgcctgta cccccgcgac 3840
ggcgtgctga agggcgagat ccaccaggcc ctgaagctga aggacggcgg ccactacctg 3900
gtggagttca agaccatcta catggccaag aagcccgtgc aactgcccgg ctactactac 3960
gtggacacca agctggacat cacctcccac aacgaggact acaccatcgt ggaacagtac 4020
gagcgctccg agggccgcca ccacctgttc ctgtacggca tggacgagct gtacaaggga 4080
agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag caggctggag acgtggagga gaaccctgga 4140
cctgctagca tggggggggc tgccgccagg ttgggggccg tgattttgtt tgtcgtcata 4200
gtgggcctcc atggggtccg cggcaaatat gccttggcgg acatccagat gacccagagc 4260
cccagcagcc tgagcgccag cgtgggcgac agggtgacca tcacctgcag ggccagccag 4320
gacgtgaaca ccgccgtggc ctggtaccag cagaagcccg gcaaggcccc caagctgctg 4380
atctacagcg ccagcttcct gtactcgggc gtgcccagca ggttctcggg cagcaggagc 4440
ggcaccgact tcaccctgac catcagcagc ctgcagcccg aggacttcgc cacctactac 4500
tgccagcagc actacaccac cccccccacc ttcggccagg gcaccaaggt ggagatcaag 4560
agcgacatgc ccatggccga ccccaacagg ttcaggggca agaacctggt gttccacagc 4620
gagatcagcc ccctggagaa gagggaggcc gaggccgagg tgcagctcgt ggagagcggc 4680
ggcggcctgg tgcagcccgg cggcagcctg aggctgagct gcgccgcctc gggcttcaac 4740
atcaaggaca cctacatcca ctgggtgagg caggcccccg gcaagggcct ggagtgggtg 4800
gccaggatct accccaccaa cggctacacc aggtacgccg acagcgtgaa gggcaggttc 4860
accatcagcg ccgacaccag caagaacacc gcctacctgc agatgaacag cctgagggcc 4920
gaggacaccg ccgtgtacta ctgcagcagg tggggcggcg acggcttcta cgccatggac 4980
tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg agctcgagca gcggaggtgg aagtggtagt 5040
ggaggtagtc acatccaggc gggcctaccg gacccgttcc agccccccag cctcccgatc 5100
acggtttact acgccgtgtt ggagcgcgcc tgccgcagcg tgctcctaaa cgcaccgtcg 5160
gaggcccccc agattgtccg cggggcctcc gaagacgtcc ggaaacaacc ctacaacctg 5220
accatcgctt ggtttcggat gggaggcaac tgtgctatcc ccatcacggt catggagtac 5280
accgaatgct cctacaacaa gtctctgggg gcctgtccca tccgaacgca gccccgctgg 5340
aactactatg acagcttcag cgccgtcagc gaggataacc tggggttcct gatgcacgcc 5400
cccgcgtttg agaccgccgg cacgtacctg cggctcgtga agataaacga ctggacggag 5460
attacacagt ttatcctgga gcaccgagcc aagggctcct gtaagtacgc cctcccgctg 5520
cgcatccccc cgtcagcctg cctgtccccc caggcctacc agcagggggt gacggtggac 5580
agcatcggga tgctgccccg cttcatcccc gagaaccagc gcaccgtcgc cgtatacagc 5640
ttgaagatcg ccgggtggca cgggcccaag gccccataca cgagcaccct gctgcccccg 5700
gagctgtccg agacccccaa cgccacgcag ccagaactcg ccccggaaga ccccgaggat 5760
tcggccctct tggaggaccc cgtggggacg gtggcgccgc aaatcccacc aaactggcac 5820
ataccgtcga tccaggacgc cgcgacgcct taccatcccc cggccacccc gaacaacatg 5880
ggcctgatcg ccggcgcggt gggcggcagt ctcctggcag ccctggtcat ttgcggaatt 5940
gtgtactgga tgcgccgccg cactcaaaaa gccccaaagc gcatacgcct cccccacatc 6000
cgggaagacg accagccgtc ctcgcaccag cccttgtttt actaatctag aaatcaacct 6060
ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg 6120
ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc 6180
attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt 6240
gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc 6300
attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg 6360
gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact 6420
gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt 6480
gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg 6540
gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc 6600
cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc agggcccgtt taaacccgct 6660
gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc 6720
cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg 6780
catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca 6840
agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatgggcg 6900
gccgcatacc cccccttaat gggtgcgggg gggtcaggtc tgcggggttg ggatgggacc 6960
ttaactccat ataaagcgag tctggaaggg gggaaaggcg gacagtcgat aagtcggtag 7020
cgggggacgc gcacctgttc cgcctgtcgc acccacagct ttttttgcga accgtcccgt 7080
tccgggatgc cgtgccgccc gttgcagggc ctggtgctcg tgggcctctg ggtctgtgcc 7140
accagcctgg ttgtccgtgg ccccacggtc agtctggtat caaactcatt tgtggacgcc 7200
ggggccttgg ggcccgacgg cgtagtggag gaagacctgc ttattctcgg ggagcttcgc 7260
tttgtggggg accaggtccc ccacaccacc tactacgatg gggtcgtaga gctgtggcac 7320
taccccatgg gacacaaatg cccacgggtc gtgcatgtcg tcacggtgac cgcgtgccca 7380
cgtcgccccg ccgtggcatt cgccctgtgt cgcgcgaccg acagcactca cagccccgca 7440
tatcccaccc tggagctgaa tctggcccaa cagccgcttt tgcgggtccg gagggcgacg 7500
cgtgactatg ccggggtgta cgtgttacgc gtatgggtcg gggacgcacc aaacgccagc 7560
ctgtttgtcc tggggatggc catagccgcc aaagggactc tggcgtacaa cggctcggcc 7620
catggctcct gcgacccgaa actgcttccg tattcggccc cgcgtctggc cccggcgagc 7680
gtataccaac ccgcccctaa cccggcctcc accccctcga ccaccacctc caccccctcg 7740
accaccatcc ccgctcccca agcatcgacc acacccttcc ccacgggaga cccaaaaccc 7800
caacctcacg gggtcaacca cgaaccccca tcgaatgcca cgcgagcgac ccgcgactcg 7860
cgatacgcgc taacggtgac ccagataatc cagatagcca tccccgcgtc cattatagcc 7920
ctggtgtttc tggggagctg tatttgcttt atacacagat gtcaacgccg ctaccgacgc 7980
tcccgccgcc cgatttacag cccccagata cccacgggca tctcatgcgc ggtgaacgaa 8040
gcggccatgg cccgcctcgg agccgagctc aaatcgcatc cgagcacccc ccccaaatcc 8100
cggcgtctag agggcccgtt taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc 8160
agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 8220
ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta 8280
ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc 8340
atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc tggggctcta 8400
gggggtatcc ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc 8460
gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt 8520
cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag 8580
ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt 8640
cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt 8700
tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt 8760
cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt 8820
aacaaaaatt taacgcgaat taattctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc 8880
cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag 8940
gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta 9000
gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 9060
cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 9120
ctctgcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 9180
caaaaagctc ccgggagctt gtatatccat tttcggatct gatcaagaga caggatgagg 9240
atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga 9300
gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt 9360
ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 9420
gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg 9480
cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt 9540
gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 9600
tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 9660
gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 9720
tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg 9780
catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 9840
ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg 9900
ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc 9960
tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta 10020
tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg 10080
acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc 10140
ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg 10200
gagttcttcg cccaccccaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 10260
agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 10320
aaactcatca atgtatctta tcatgtctgt ataccgtcga cctctagcta gagcttggcg 10380
taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 10440
atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 10500
ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 10560
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 10620
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 10680
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 10740
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 10800
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 10860
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 10920
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 10980
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 11040
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 11100
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 11160
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 11220
tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 11280
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggttt ttttgtttgc 11340
aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 11400
gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 11460
aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 11520
atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 11580
gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 11640
atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 11700
ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 11760
cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 11820
agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 11880
cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 11940
tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 12000
agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 12060
gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 12120
gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 12180
ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 12240
tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 12300
tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 12360
gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 12420
caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 12480
atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac 12540
gtc 12543
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1)…(54)
<400> 2
gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg ccca 54
<210> 3
<211> 1896
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_difference
<222> (1)…(1896)
<400> 3
atgggcggag cagctgcacg cctcggcgct gtcatcctct tcgtggtgat cgtcggactg 60
cacggcgtga ggggaaagta cgctctcgcc gacatccaga tgacccagag ccccagcagc 120
ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc atcacctgca gggccagcca ggacgtgaac 180
accgccgtgg cctggtacca gcagaagccc ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc 240
gccagcttcc tgtactcggg cgtgcccagc aggttctcgg gcagcaggag cggcaccgac 300
ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag 360
cactacacca ccccccccac cttcggccag ggcaccaagg tggagatcaa gagcgacatg 420
cccatggccg accccaacag gttcaggggc aagaacctgg tgttccacag cgagatcagc 480
cccctggaga agagggaggc cgaggccgag gtgcagctcg tggagagcgg cggcggcctg 540
gtgcagcccg gcggcagcct gaggctgagc tgcgccgcct cgggcttcaa catcaaggac 600
acctacatcc actgggtgag gcaggccccc ggcaagggcc tggagtgggt ggccaggatc 660
taccccacca acggctacac caggtacgcc gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc 720
gccgacacca gcaagaacac cgcctacctg cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc 780
gccgtgtact actgcagcag gtggggcggc gacggcttct acgccatgga ctactggggc 840
cagggcaccc tggtgaccgt gagctcgagc agcggaggtg gaagtggtag tggaggtagt 900
catattcaag ctggattgcc agatcccttt cagcctccat ccctgccaat taccgtctat 960
tacgctgtcc tcgaaagagc ttgtcggagt gtcctgctca atgctccaag cgaagctcct 1020
cagatcgtga ggggcgcttc tgaggatgtg aggaagcagc cttataatct cacaattgcc 1080
tggttcagaa tgggcggaaa ttgcgccatc cctattaccg tgatggaata taccgagtgt 1140
agctacaata agtccctcgg agcttgccct atcagaaccc agcctagatg gaattattac 1200
gattccttta gcgctgtgtc cgaagacaac ctcggctttc tcatgcatgc tcctgccttc 1260
gaaacagctg gaacctatct gagactggtc aaaatcaatg attggaccga aatcacccag 1320
ttcattctcg aacatagggc taaaggaagc tgcaaatatg ctctgcctct caggattcct 1380
ccaagcgctt gtctcagtcc tcaggcttat cagcaaggcg tcaccgtcga ttccattgga 1440
atgctgccta ggtttattcc tgaaaatcag agaacagtgg ctgtgtattc cctgaaaatt 1500
gctggctggc atggccctaa agctccttat acctccacac tcctccctcc agaactcagc 1560
gaaacaccta atgcaactca gcctgagctg gctccagagg atccagaaga ctccgctctg 1620
ctcgaagatc cagtcggcac tgtcgccccc cagattcctc ccaattggca tatcccaagc 1680
attcaggatg cagccacccc atatcaccct ccagcaacac ccaataacat ggggctcatt 1740
gcaggagccg tcggagggtc cctgctcgcc gcactcgtga tctgtggcat cgtctattgg 1800
atgaggagac ggacccagaa ggctcccaaa agaatccggc tgccacatat tcgcgaggat 1860
gaccaaccaa gttcccacca acctctcttc tattaa 1896
<210> 4
<211> 1185
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_difference
<222> (1)…(1185)
<400> 4
atgggcggcg ccgccgccag gctgggcgcc gtgatcctgt tcgtggtgat cgtgggcctg 60
cacggcgtga ggggcaagta cgccctggcc gacgccagcc tgaagatggc cgaccccaac 120
aggttcaggg gcaaggacct gcccgtgctg gaccagctga ccgacccccc cggcgtgagg 180
agggtgtacc acatccaggc cggcctgccc gaccccttcc agccccccag cctgcccatc 240
accgtgtact acgccgtgct ggagagggcc tgcaggagcg tgctgctgaa cgcccccagc 300
gaggcccccc agatcgtgag gggcgccagc gaggacgtga ggaagcagcc ctacaacctg 360
accatcgcct ggttcaggat gggcggcaac tgcgccatcc ccatcaccgt gatggagtac 420
accgagtgca gctacaacaa gagcctgggc gcctgcccca tcaggaccca gcccaggtgg 480
aactactacg acagcttcag cgccgtgagc gaggacaacc tgggcttcct gatgcacgcc 540
cccgccttcg agaccgccgg cacctacctg aggctggtga agatcaacga ctggaccgag 600
atcacccagt tcatcctgga gcacagggcc aagggcagct gcaagtacgc cctgcccctg 660
aggatccccc ccagcgcctg cctgagcccc caggcctacc agcagggcgt gaccgtggac 720
agcatcggca tgctgcccag gttcatcccc gagaaccaga ggaccgtggc cgtgtacagc 780
ctgaagatcg ccggctggca cggccccaag gccccctaca ccagcaccct gctgcccccc 840
gagctgagcg agacccccaa cgccacccag cccgagctgg cccccgagga ccccgaggac 900
agcgccctgc tggaggaccc cgtgggcacc gtggcccccc agatcccccc caactggcac 960
atccccagca tccaggacgc cgccaccccc taccaccccc ccgccacccc caacaacatg 1020
ggcctgatcg ccggcgccgt gggcggcagc ctgctggccg ccctggtgat ctgcggcatc 1080
gtgtactgga tgaggaggag gacccagaag gcccccaaga ggatcaggct gccccacatc 1140
agggaggacg accagcccag cagccaccag cccctgttct actaa 1185
<210> 5
<211> 915
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_difference
<222> (1)…(915)
<400> 5
gcagccgatg ccccgggaga ccggatggag gagcccctac cagacagggc cgtgcccatt 60
tacgtggctg ggtttttggc cctgtatgac agcggggact cgggcgagtt ggcattggat 120
ccggatacgg tgcgggcggc cctgcctccg gataacccac tcccgattaa cgtggaccac 180
cgcgctggct gcgaggtggg gcgggtgctg gccgtggtcg acgacccccg cgggccgttt 240
tttgtgggac tgatcgcctg cgtgcaactg gagcgcgtcc tcgagacggc cgccagcgct 300
gcgattttcg agcgccgcgg gccgccgctc tcccgggagg agcgcctgtt gtacctgatc 360
accaactacc tgccctcggt ctccctggcc acaaaacgcc tggggggcga ggcgcacccc 420
gatcgcacgc tgttcgcgca cgtcgcgctg tgcgcgatcg ggcggcgcct cggcactatc 480
gtcacctacg acaccggtct cgacgccgcc atcgcgccct ttcgccacct gtcgccggcg 540
tctcgcgagg gggcgcggcg actggccgcc gaggccgaaa tcgcgctgtc cgggcgcacc 600
tgggcgcccg gcgtggaggc gctgacccac acgctgcttt ccaccgccgt taacaacatg 660
atgctgcggg accgctggag cctggtggcc gagcggcggc ggcaggccgg gatcgccgga 720
cacacctacc tccaggcgag cgaaaaattc aaaatgtggg gggcggagcc tgtttccgcg 780
ccggcgcgcg ggtataagaa cggggccccg gagtccacgg acataccgcc cggctcgatc 840
gctgccgcgc cgcagggtga ccggtgccca atcgtccgtc agcgcggggt cgcctcgccc 900
ccggtactgc ccccc 915
<210> 6
<211> 9034
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_difference
<222> (1)…(9034)
<400> 6
cccgtagtgg ctatggcagg gcttgccgcc ccgacgttgg ctgcgagccc tgggccttca 60
cccgaacttg ggggttgggg tggggaaaag gaagaaacgc gggcgtattg gtcccaatgg 120
ggtctcggtg gggtatcgac agagtgccag ccctgggacc gaaccccgcg tttatgaaca 180
aacgacccaa cacccgtgcg ttttattctg tctttttatt gccgtcatag cgcgggttcc 240
ttccggtatt gtctccttcc gtgtttcagt tagcctcccc catctcccgg tacctccgga 300
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 360
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtc 420
ctgcaggcag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 480
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 540
ctccatcact aggggttcct gcggccgcac gcgtaagctt tgcaaagatg gataaagttt 600
taaacagaga ggaatctttg cagctaatgg accttctagg tcttgaaagg agtgggaatt 660
ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 720
ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcagcc gatgccccgg gagaccggat ggaggagccc 780
ctaccagaca gggccgtgcc catttacgtg gctgggtttt tggccctgta tgacagcggg 840
gactcgggcg agttggcatt ggatccggat acggtgcggg cggccctgcc tccggataac 900
ccactcccga ttaacgtgga ccaccgcgct ggctgcgagg tggggcgggt gctggccgtg 960
gtcgacgacc cccgcgggcc gttttttgtg ggactgatcg cctgcgtgca actggagcgc 1020
gtcctcgaga cggccgccag cgctgcgatt ttcgagcgcc gcgggccgcc gctctcccgg 1080
gaggagcgcc tgttgtacct gatcaccaac tacctgccct cggtctccct ggccacaaaa 1140
cgcctggggg gcgaggcgca ccccgatcgc acgctgttcg cgcacgtcgc gctgtgcgcg 1200
atcgggcggc gcctcggcac tatcgtcacc tacgacaccg gtctcgacgc cgccatcgcg 1260
ccctttcgcc acctgtcgcc ggcgtctcgc gagggggcgc ggcgactggc cgccgaggcc 1320
gaaatcgcgc tgtccgggcg cacctgggcg cccggcgtgg aggcgctgac ccacacgctg 1380
ctttccaccg ccgttaacaa catgatgctg cgggaccgct ggagcctggt ggccgagcgg 1440
cggcggcagg ccgggatcgc cggacacacc tacctccagg cgagcgaaaa attcaaaatg 1500
tggggggcgg agcctgtttc cgcgccggcg cgcgggtata agaacggggc cccggagtcc 1560
acggacatac cgcccggctc gatcgctgcc gcgccgcagg gtgaccggtg cccaatcgtc 1620
cgtcagcgcg gggtcgcctc gcccccggta ctgcccccct ctagagtcga ctccggaata 1680
acttcgtata ggatacttta tacgaagtta tgcagaatgg tagctggatt gtagctgcta 1740
ttagcaatat gaaacctctt aataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatggcgc 1800
gccttagtag aacaggggct ggtggctgct gggctggtcg tcctccctga tgtggggcag 1860
cctgatcctc ttgggggcct tctgggtcct cctcctcatc cagtacacga tgccgcagat 1920
caccagggcg gccagcaggc tgccgcccac ggcgccggcg atcaggccca tgttgttggg 1980
ggtggcgggg gggtggtagg gggtggcggc gtcctggatg ctggggatgt gccagttggg 2040
ggggatctgg ggggccacgg tgcccacggg gtcctccagc agggcgctgt cctcggggtc 2100
ctcgggggcc agctcgggct gggtggcgtt gggggtctcg ctcagctcgg ggggcagcag 2160
ggtgctggtg tagggggcct tggggccgtg ccagccggcg atcttcaggc tgtacacggc 2220
cacggtcctc tggttctcgg ggatgaacct gggcagcatg ccgatgctgt ccacggtcac 2280
gccctgctgg taggcctggg ggctcaggca ggcgctgggg gggatcctca ggggcagggc 2340
gtacttgcag ctgcccttgg ccctgtgctc caggatgaac tgggtgatct cggtccagtc 2400
gttgatcttc accagcctca ggtaggtgcc ggcggtctcg aaggcggggg cgtgcatcag 2460
gaagcccagg ttgtcctcgc tcacggcgct gaagctgtcg tagtagttcc acctgggctg 2520
ggtcctgatg gggcaggcgc ccaggctctt gttgtagctg cactcggtgt actccatcac 2580
ggtgatgggg atggcgcagt tgccgcccat cctgaaccag gcgatggtca ggttgtaggg 2640
ctgcttcctc acgtcctcgc tggcgcccct cacgatctgg ggggcctcgc tgggggcgtt 2700
cagcagcacg ctcctgcagg ccctctccag cacggcgtag tacacggtga tgggcaggct 2760
ggggggctgg aaggggtcgg gcaggccggc ctggatgtgg tacaccctcc tcacgccggg 2820
ggggtcggtc agctggtcca gcacgggcag gtccttgccc ctgaacctgt tggggtcggc 2880
catcttcagg ctggcgtcgg ccagggcgta cttgcccctc acgccgtgca ggcccacgat 2940
caccacgaac aggatcacgg cgcccagcct ggcggcggcg ccgcccatgc tagcataact 3000
tcgtataaag tatcctatac gaagttattt gccttaaccc agaaattatc actgttattc 3060
tttagaatgg tgcaaagaat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atgaattcga 3120
tatcaagctt atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat 3180
tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca 3240
tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc 3300
tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc 3360
tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt 3420
cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg 3480
gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc 3540
ctttccttgg ctgctcgcct atgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta 3600
cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg 3660
gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc 3720
cccgcatcga taccgagcgc tgctcgagag atctacgggt ggcatccctg tgacccctcc 3780
ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata 3840
aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct ataatattat ggggtggagg 3900
ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct gtagggcctg cggggtctat 3960
tgggaaccaa gctggagtgc agtggcacaa tcttggctca ctgcaatctc cgcctcctgg 4020
gttcaagcga ttctcctgcc tcagcctccc gagttgttgg gattccaggc atgcatgacc 4080
aggctcagct aatttttgtt tttttggtag agacggggtt tcaccatatt ggccaggctg 4140
gtctccaact cctaatctca ggtgatctac ccaccttggc ctcccaaatt gctgggatta 4200
caggcgtgaa ccactgctcc cttccctgtc cttctgattt tgtaggtaac cacgtgcgga 4260
ccgagcggcc gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 4320
cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 4380
cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc aggggcgcct gatgcggtat tttctcctta 4440
cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtaac tagagcctgc 4500
agtctcgaca agcttgtcga gaagtactag aggatcataa tcagccatac cacatttgta 4560
gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg 4620
aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 4680
agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 4740
aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atctgatcac tgcttgagcc taggagatcc 4800
gaaccagata agtgaaatct agttccaaac tattttgtca tttttaattt tcgtattagc 4860
ttacgacgct acacccagtt cccatctatt ttgtcactct tccctaaata atccttaaaa 4920
actccatttc cacccctccc agttcccaac tattttgtcc gcccacagcg gggcattttt 4980
cttcctgtta tgtttttaat caaacatcct gccaactcca tgtgacaaac cgtcatcttc 5040
ggctactttt tctctgtcac agaatgaaaa tttttctgtc atctcttcgt tattaatgtt 5100
tgtaattgac tgaatatcaa cgcttatttg cagcctgaat ggcgaatggg acgcgccctg 5160
tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc 5220
cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg 5280
ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg 5340
gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg 5400
atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt 5460
ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt 5520
gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt 5580
taacaaaata ttaacgttta caatttcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac 5640
ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc 5700
ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt 5760
cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct 5820
ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga 5880
tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag 5940
cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca 6000
actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga 6060
aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag 6120
tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc 6180
ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa 6240
tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt 6300
gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg 6360
gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt 6420
tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg 6480
gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat 6540
ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact 6600
gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa 6660
aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 6720
ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 6780
ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 6840
tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 6900
gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 6960
agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 7020
taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 7080
gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 7140
gagataccta cagcgtgagc attgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 7200
caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 7260
aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 7320
tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 7380
acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 7440
ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 7500
gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct 7560
ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg cagaccagcc gcgtaacctg gcaaaatcgg 7620
ttacggttga gtaataaatg gatgccctgc gtaagcgggt gtgggcggac aataaagtct 7680
taaactgaac aaaatagatc taaactatga caataaagtc ttaaactaga cagaatagtt 7740
gtaaactgaa atcagtccag ttatgctgtg aaaaagcata ctggactttt gttatggcta 7800
aagcaaactc ttcattttct gaagtgcaaa ttgcccgtcg tattaaagag gggcgtggcc 7860
aagggcatgg taaagactat attcgcggcg ttgtgacaat ttaccgaaca actccgcggc 7920
cgggaagccg atctcggctt gaacgaattg ttaggtggcg gtacttgggt cgatatcaaa 7980
gtgcatcact tcttcccgta tgcccaactt tgtatagaga gccactgcgg gatcgtcacc 8040
gtaatctgct tgcacgtaga tcacataagc accaagcgcg ttggcctcat gcttgaggag 8100
attgatgagc gcggtggcaa tgccctgcct ccggtgctcg ccggagactg cgagatcata 8160
gatatagatc tcactacgcg gctgctcaaa cctgggcaga acgtaagccg cgagagcgcc 8220
aacaaccgct tcttggtcga aggcagcaag cgcgatgaat gtcttactac ggagcaagtt 8280
cccgaggtaa tcggagtccg gctgatgttg ggagtaggtg gctacgtctc cgaactcacg 8340
accgaaaaga tcaagagcag cccgcatgga tttgacttgg tcagggccga gcctacatgt 8400
gcgaatgatg cccatacttg agccacctaa ctttgtttta gggcgactgc cctgctgcgt 8460
aacatcgttg ctgctgcgta acatcgttgc tgctccataa catcaaacat cgacccacgg 8520
cgtaacgcgc ttgctgcttg gatgcccgag gcatagactg tacaaaaaaa cagtcataac 8580
aagccatgaa aaccgccact gcgccgttac caccgctgcg ttcggtcaag gttctggacc 8640
agttgcgtga gcgcatacgc tacttgcatt acagtttacg aaccgaacag gcttatgtca 8700
actgggttcg tgccttcatc cgtttccacg gtgtgcgtca cccggcaacc ttgggcagca 8760
gcgaagtcga ggcatttctg tcctggctgg cgaacgagcg caaggtttcg gtctccacgc 8820
atcgtcaggc attggcggcc ttgctgttct tctacggcaa ggtgctgtgc acggatctgc 8880
cctggcttca ggagatcggt agacctcggc cgtcgcggcg cttgccggtg gtgctgaccc 8940
cggatgaagt ggttcgcatc ctcggttttc tggaaggcga gcatcgtttg ttcgcccagg 9000
actctagcta tagttctagt ggttggccta cgta 9034
<210> 7
<211> 2058
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_difference
<222> (1)…(2058)
<400> 7
atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc 60
gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag 120
acccacctgg acatgctccg ccacctctac cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg 180
gaactcacct acctgcccac caatgccagc ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg 240
cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg 300
attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac aactatgccc tggccgtgct agacaatgga 360
gacccgctga acaataccac ccctgtcaca ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg 420
cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag 480
ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct 540
ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag 600
ggctcccgct gctggggaga gagttctgag gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt 660
gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt 720
gctgccggct gcacgggccc caagcactct gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac 780
agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag 840
tccatgccca atcccgaggg ccggtataca ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc 900
tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa 960
gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga 1020
gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttg cgagaggtga gggcagttac cagtgccaat 1080
atccaggagt ttgctggctg caagaagatc tttgggagcc tggcatttct gccggagagc 1140
tttgatgggg acccagcctc caacactgcc ccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt 1200
gagactctgg aagagatcac aggttaccta tacatctcag catggccgga cagcctgcct 1260
gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagta atccggggac gaattctgca caatggcgcc 1320
tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatc agctggctgg ggctgcgctc actgagggaa 1380
ctgggcagtg gactggccct catccaccat aacacccacc tctgcttcgt gcacacggtg 1440
ccctgggacc agctctttcg gaacccgcac caagctctgc tccacactgc caaccggcca 1500
gaggacgagt gtgtgggcga gggcctggcc tgccaccagc tgtgcgcccg agggcactgc 1560
tggggtccag ggcccaccca gtgtgtcaac tgcagccagt tccttcgggg ccaggagtgc 1620
gtggaggaat gccgagtact gcaggggctc cccagggagt atgtgaatgc caggcactgt 1680
ttgccgtgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag tgacctgttt tggaccggag 1740
gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc 1800
cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag 1860
ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct gtgtggacct ggatgacaag 1920
ggctgccccg ccgagcagag agccagccct ctgacgtcca tcatctctgc ggtggttggc 1980
attctgctgg tcgtggtctt gggggtggtc tttgggatcc tcatcaagcg acggcagcag 2040
aagatccgga agtactaa 2058
<210> 8
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_difference
<222> (1)…(717)
<400> 8
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717
<210> 9
<211> 7010
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_difference
<222> (1)…(7010)
<400> 9
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcac gcgtgtgtct agactgcaga gggccctgcg tatgagtgca 180
agtgggtttt aggaccagga tgaggcgggg tgggggtgcc tacctgacga ccgaccccga 240
cccactggac aagcacccaa cccccattcc ccaaattgcg catcccctat cagagagggg 300
gaggggaaac aggatgcggc gaggcgcgtg cgcactgcca gcttcagcac cgcggacagt 360
gccttcgccc ccgcctggcg gcgcgcgcca ccgccgcctc agcactgaag gcgcgctgac 420
gtcactcgcc ggtcccccgc aaactcccct tcccggccac cttggtcgcg tccgcgccgc 480
cgccggccca gccggaccgc accacgcgag gcgcgagata ggggggcacg ggcgcgacca 540
tctgcgctgc ggcgccggcg actcagcgct gcctcagtct gcggtgggca gcggaggagt 600
cgtgtcgtgc ctgagagcgc agtcgagaag gtaccggatc ctctagagtc gactccggaa 660
taacttcgta taggatactt tatacgaagt tatgcagaat ggtagctgga ttgtagctgc 720
tattagcaat atgaaacctc ttaataactt cgtatagcat acattatacg aagttatggc 780
gcgccttagt acttccggat cttctgctgc cgtcgcttga tgaggatccc aaagaccacc 840
cccaagacca cgaccagcag aatgccaacc accgcagaga tgatggacgt cagagggctg 900
gctctctgct cggcggggca gcccttgtca tccaggtcca cacaggagtg ggtgcagttg 960
atggggcaag gctggcatgc gccctcctca tctggaaact tccagatggg catgtaggag 1020
aggtcaggtt tcacaccgct ggggcagcgg gccacgcaga agggagggtc cttatagtgg 1080
gcacaggcca cacactggtc agcctccggt ccaaaacagg tcactgagcc attctggggc 1140
tgacactcag ggtggcacgg caaacagtgc ctggcattca catactccct ggggagcccc 1200
tgcagtactc ggcattcctc cacgcactcc tggccccgaa ggaactggct gcagttgaca 1260
cactgggtgg gccctggacc ccagcagtgc cctcgggcgc acagctggtg gcaggccagg 1320
ccctcgccca cacactcgtc ctctggccgg ttggcagtgt ggagcagagc ttggtgcggg 1380
ttccgaaaga gctggtccca gggcaccgtg tgcacgaagc agaggtgggt gttatggtgg 1440
atgagggcca gtccactgcc cagttccctc agtgagcgca gccccagcca gctgatgccc 1500
agcccttgca gggtcagcga gtaggcgcca ttgtgcagaa ttcgtccccg gattacttgc 1560
aggttctgga agacgctgag gtcaggcagg ctgtccggcc atgctgagat gtataggtaa 1620
cctgtgatct cttccagagt ctcaaacact tggagctgct ctggctggag cggggcagtg 1680
ttggaggctg ggtccccatc aaagctctcc ggcagaaatg ccaggctccc aaagatcttc 1740
ttgcagccag caaactcctg gatattggca ctggtaactg ccctcacctc tcgcaagtgc 1800
tccatgccca gaccatagca cactcgggca cagggcttgc tgcacttctc acaccgctgt 1860
gttccatcct ctgctgtcac ctcttggttg tgcagggggc agacgagggt gcaggatccc 1920
acgtccgtag aaaggtagtt gtagggacag gcagtcacac agctggcgcc gaatgtatac 1980
cggccctcgg gattgggcat ggactcaaac gtgtctgtgt tgtaggtgac cagggctggg 2040
cagtgcagct cacagatgcc actgtggttg aagtggaggc aggccaggca gtcagagtgc 2100
ttggggcccg tgcagccggc agcacactgc tcatggcagc agtcagtggg cagtggcccc 2160
ttgcagcggg cacagccacc ggcacagaca gtgcgcgtca ggctctgaca atcctcagaa 2220
ctctctcccc agcagcggga gcccttacac atcggagaac aggggtggca ggcccgagag 2280
cggttggtgt ctatcagtgt gagagccagc tggttgttct tgtggaagat gtccttccac 2340
aaaatcgtgt cctggtagca gagctggggg ttccgctgga tcaagacccc tcctttcaag 2400
atctctgtga ggcttcgaag ctgcagctcc cgcaggcctc ctggggaggc ccctgtgaca 2460
ggggtggtat tgttcagcgg gtctccattg tctagcacgg ccagggcata gttgtcctca 2520
aagagctggg tgcctcgcac aatccgcagc ctctgcagtg ggacctgcct cacttggttg 2580
tgagcgatga gcacgtagcc ctgcacctcc tggatatcct gcaggaagga caggctggca 2640
ttggtgggca ggtaggtgag ttccaggttt ccctgcacca cctggcagcc ctggtagagg 2700
tggcggagca tgtccaggtg ggtctcggga ctggcaggga gccgcagctt catgtctgtg 2760
ccggtgcaca cttgggtgct cgcggctccg gggggcaaga gggcgaggag gagcccccag 2820
cggcacaagg ccgccagctc catgctagct gggccaggat tctcctcgac gtcaccgcat 2880
gttagcagac ttcctctgcc ctccttgtac agctcgtcca tgccgagagt gatcccggcg 2940
gcggtcacga actccagcag gaccatgtga tcgcgcttct cgttggggtc tttgctcagg 3000
gcggactggg tgctcaggta gtggttgtcg ggcagcagca cggggccgtc gccgatgggg 3060
gtgttctgct ggtagtggtc ggcgagctgc acgctgccgt cctcgatgtt gtggcggatc 3120
ttgaagttca ccttgatgcc gttcttctgc ttgtcggcca tgatatagac gttgtggctg 3180
ttgtagttgt actccagctt gtgccccagg atgttgccgt cctccttgaa gtcgatgccc 3240
ttcagctcga tgcggttcac cagggtgtcg ccctcgaact tcacctcggc gcgggtcttg 3300
tagttgccgt cgtccttgaa gaagatggtg cgctcctgga cgtagccttc gggcatggcg 3360
gacttgaaga agtcgtgctg cttcatgtgg tcggggtagc ggctgaagca ctgcacgccg 3420
taggtcaggg tggtcacgag ggtgggccag ggcacgggca gcttgccggt ggtgcagatg 3480
aacttcaggg tcagcttgcc gtaggtggca tcgccctcgc cctcgccgga cacgctgaac 3540
ttgtggccgt ttacgtcgcc gtccagctcg accaggatgg gcaccacccc ggtgaacagc 3600
tcctcgccct tgctcaccat gctagcataa cttcgtataa agtatcctat acgaagttat 3660
ttgccttaac ccagaaatta tcactgttat tctttagaat ggtgcaaaga ataacttcgt 3720
ataatgtatg ctatacgaag ttatgaattg atctacgggt ggcatccctg tgacccctcc 3780
ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata 3840
aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct ataatattat ggggtggagg 3900
ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct gtagggcctg cggggtctat 3960
tgggaaccaa gctggagtgc agtggcacaa tcttggctca ctgcaatctc cgcctcctgg 4020
gttcaagcga ttctcctgcc tcagcctccc gagttgttgg gattccaggc atgcatgacc 4080
aggctcagct aatttttgtt tttttggtag agacggggtt tcaccatatt ggccaggctg 4140
gtctccaact cctaatctca ggtgatctac ccaccttggc ctcccaaatt gctgggatta 4200
caggcgtgaa ccactgctcc cttccctgtc cttctgattt tgtaggtaac cacgtgcgga 4260
ccgagcggcc gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 4320
cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 4380
cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc aggggcgcct gatgcggtat tttctcctta 4440
cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag 4500
cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag 4560
cgccttagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt 4620
tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca 4680
cctcgacccc aaaaaacttg atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata 4740
gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca 4800
aactggaaca acactcaact ctatctcggg ctattctttt gatttataag ggattttgcc 4860
gatttcggtc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa 4920
caaaatatta acgtttacaa ttttatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc 4980
atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 5040
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 5100
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt 5160
ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa 5220
tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 5280
gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca 5340
acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca 5400
cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 5460
catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt 5520
tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc 5580
cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc 5640
accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc 5700
cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa 5760
ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga 5820
accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat 5880
ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 5940
attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 6000
ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 6060
tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag 6120
tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa 6180
gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca 6240
tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc 6300
ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 6360
ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 6420
agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 6480
cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 6540
caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 6600
tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 6660
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 6720
ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 6780
gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 6840
gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 6900
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 6960
cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 7010
<210> 10
<211> 3493
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_difference
<222> (1)…(3493)
<400> 10
gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg ctgccacgtc 60
agacgaaggg cgcaggagcg ttcctgatcc ttccgcccgg acgctcagga cagcggcccg 120
ctgctcataa gactcggcct tagaacccca gtatcagcag aaggacattt taggacggga 180
cttgggtgac tctagggcac tggttttctt tccagagagc ggaacaggcg aggaaaagta 240
gtcccttctc ggcgattctg cggagggatc tccgtggggc ggtgaacgcc gatgattata 300
taaggacgcg ccgggtgtgg cacagctagt tccgtcgcag ccgggatttg ggtcgcggtt 360
cttgtttgtg gatcgctgtg atcgtcactt ggtgagttgc gggctgctgg gctggccggg 420
gctttcgtgg ccgccgggcc gctcggtggg acggaagcgt gtggagagac cgccaagggc 480
tgtagtctgg gtccgcgagc aaggttgccc tgaactgggg gttgggggga gcgcacaaaa 540
tggcggctgt tcccgagtct tgaatggaag acgcttgtaa ggcgggctgt gaggtcgttg 600
aaacaaggtg gggggcatgg tgggcggcaa gaacccaagg tcttgaggcc ttcgctaatg 660
cgggaaagct cttattcggg tgagatgggc tggggcacca tctggggacc ctgacgtgaa 720
gtttgtcact gactggagaa ctcgggtttg tcgtctggtt gcgggggcgg cagttatgcg 780
gtgccgttgg gcagtgcacc cgtacctttg ggagcgcgcg cctcgtcgtg tcgtgacgtc 840
acccgttctg ttggcttata atgcagggtg gggccacctg ccggtaggtg tgcggtaggc 900
ttttctccgt cgcaggacgc agggttcggg cctagggtag gctctcctga atcgacaggc 960
gccggacctc tggtgagggg agggataagt gaggcgtcag tttctttggt cggttttatg 1020
tacctatctt cttaagtagc tgaagctccg gttttgaact atgcgctcgg ggttggcgag 1080
tgtgttttgt gaagtttttt aggcaccttt tgaaatgtaa tcatttgggt caatatgtaa 1140
ttttcagtgt tagactagta aattgtccgc taaattctgg ccgtttttgg cttttttgtt 1200
agacggtacc atggtgagca agggcgagga ggtcatcaaa gagttcatgc gcttcaaggt 1260
gcgcatggag ggctccatga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg 1320
cccctacgag ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt 1380
cgcctgggac atcctgtccc cccagttcat gtacggctcc aaggcgtacg tgaagcaccc 1440
cgccgacatc cccgattaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt 1500
gatgaacttc gaggacggcg gtctggtgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg 1560
cacgctgatc tacaaggtga agatgcgcgg caccaacttc ccccccgacg gccccgtaat 1620
gcagaagaag accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc gcgacggcgt 1680
gctgaagggc gagatccacc aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact acctggtgga 1740
gttcaagacc atctacatgg ccaagaagcc cgtgcaactg cccggctact actacgtgga 1800
caccaagctg gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggaac agtacgagcg 1860
ctccgagggc cgccaccacc tgttcctggg gcatggcacc ggcagcaccg gcagcggcag 1920
ctccggcacc gcctcctccg aggacaacaa catggccgtc atcaaagagt tcatgcgctt 1980
caaggtgcgc atggagggct ccatgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga 2040
gggccgcccc tacgagggca cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg gcggccccct 2100
gcccttcgcc tgggacatcc tgtcccccca gttcatgtac ggctccaagg cgtacgtgaa 2160
gcaccccgcc gacatccccg attacaagaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga 2220
gcgcgtgatg aacttcgagg acggcggtct ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca 2280
ggacggcacg ctgatctaca aggtgaagat gcgcggcacc aacttccccc ccgacggccc 2340
cgtaatgcag aagaagacca tgggctggga ggcctccacc gagcgcctgt acccccgcga 2400
cggcgtgctg aagggcgaga tccaccaggc cctgaagctg aaggacggcg gccactacct 2460
ggtggagttc aagaccatct acatggccaa gaagcccgtg caactgcccg gctactacta 2520
cgtggacacc aagctggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta 2580
cgagcgctcc gagggccgcc accacctgtt cctgtacggc atggacgagc tgtacaagta 2640
atctagaaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta 2700
tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc 2760
ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga 2820
ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac 2880
ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc 2940
cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc 3000
tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg 3060
gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc 3120
ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc 3180
gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcaggg 3240
cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt 3300
tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa 3360
taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg 3420
gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg 3480
gtgggctcta tgg 3493
210> 11
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1)…(66)
<400> 11
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66

Claims (10)

1.一种神经环路标记系统，其特征在于，所述神经环路标记系统包括：重组单纯疱疹病毒Hs06、或者所述重组单纯疱疹病毒Hs06与腺相关病毒As03或腺相关病毒As01中的至少一种的组合。
2.一种如权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒Hs06，其特征在于，所述重组单纯疱疹病毒Hs06通过在敲除HSV-1H129病毒基因组中的gD基因之后，在被敲除的所述gD基因的位置上插入靶向Her2的单链抗体与所述gD基因的融合蛋白得到；
其中，所述靶向Her2的单链抗体与所述gD基因的融合蛋白的序列为SEQ ID NO.3所示。
3.一种用于构建如权利要求2所述的重组单纯疱疹病毒Hs06的靶向载体pHs06，其特征在于，所述靶向载体pHs06的序列为SEQ ID NO.1所示。
4.一种构建如权利要求3所述的靶向载体pHs06的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
采用infusion融合技术将扩增后的UHA基因同源臂序列、DHA基因同源臂序列、荧光蛋白基因表达盒连入pcDNA3.1(+)载体，得到pcDNA3.1(+)-ΔgD；
用NheI、XhoI双酶切所述pcDNA3.1(+)-ΔgD，并采用infusion融合技术将扩增后的所述红色荧光蛋白tDt基因表达盒连入酶切后的所述pcDNA3.1(+)-ΔgD，构建得到pH129ΔgD-tDt载体；
采用infusion融合技术在所述pH129ΔgD-tDt载体的所述红色荧光蛋白tDt基因表达盒后面插入所述靶向Her2的单链抗体与所述gD基因的融合蛋白，其中，所述红色荧光蛋白tDt基因表达盒与所述靶向Her2的单链抗体与所述gD基因的融合蛋白之间通过P2A连接，得到所述靶向载体pHs06；
其中，所述红色荧光蛋白tDt基因表达盒的序列为SEQ ID NO.10所示，所述P2A的序列为SEQ ID NO.11所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述采用infusion融合技术将扩增后的UHA基因同源臂序列、DHA基因同源臂序列、荧光蛋白基因表达盒连入pcDNA3.1(+)载体，得到pcDNA3.1(+)-ΔgD的步骤之前，所述方法还包括：
以HSV-1H129病毒基因组DNA为模板，扩增所述UHA基因同源臂序列以及所述DHA基因同源臂序列；
其中，所述UHA基因同源臂序列的扩增引物为:
UHA-F:GTACGGGCCAGATATACGCGTGCCCCACGACCCGACTCACCTCAAA，
UHA-R:TATGCGGCCGCTCGTGCTAGCACCGGAACGCACCACACAAAAGAGA；
所述DHA基因同源臂序列的扩增引物为：
DHA-F:GCTAGCACGAGCGGCCGCATACCCCCCCTTAATGGGTGCG，
DHA-R:GGTTTAAACGGGCCCTCTAGACGCCGGGATTTGGGGGGGGTGCTCG。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述红色荧光蛋白tDt基因表达盒的扩增引物为：
F:GTGGTGCGTTCCGGTGCTAGCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGC，
R:CCCATTAAGGGGGGGTATGCGGCCGCCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGC。
7.如权利要求2所述的重组单纯疱疹病毒Hs06，或者，如权利要求3所述的靶向载体pHs06所构建的重组单纯疱疹病毒Hs06在顺行标记V1神经环路或VTA输出神经环路中的应用。
8.一种如权利要求1所述的腺相关病毒As03的靶向载体pAs03，其特征在于，所述靶向载体pAs03通过Cre/loxP系统将密码子优化的gD基因和UL26.5p启动子插入到AAV载体中得到；
其中，所述密码子优化的gD基因的序列为SEQ ID NO.4所示，所述UL26.5p启动子的序列为SEQ ID NO.5所示，所述靶向载体pAs03的序列为SEQ ID NO.6所示。
9.一种如权利要求1所述的腺相关病毒As01的靶向载体pAs01，其特征在于，所述靶向载体pAs01通过Cre/loxP系统将截短后的靶向Her2的单链抗体和绿色荧光蛋白插入到AAV载体中得到，其中，所述截短后的靶向Her2的单链抗体与所述绿色荧光蛋白之间通过T2A连接；
其中，所述截短后的靶向Her2的单链抗体的序列为SEQ ID NO.7所示，所述绿色荧光蛋白的序列为SEQ ID NO.8所示，所述T2A的序列为SEQ ID NO.2所示，所述靶向载体pAs01的序列为SEQ ID NO.9所示。
10.如权利要求8所述的靶向载体pAs03所构建的腺相关病毒As03，或者，如权利要求9所述的靶向载体pAs01所构建的腺相关病毒As01在神经环路标记或基因转导中的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113969287A (zh) * 2021-10-22 2022-01-25 中国科学院深圳先进技术研究院 重组单纯疱疹病毒的亲和筛选细胞系及其构建方法和应用
CN114085816A (zh) * 2021-10-26 2022-02-25 四川大学华西医院 一种标记临近星形胶质细胞的方法
CN114107231A (zh) * 2021-12-13 2022-03-01 重庆大学 实现全脑突触后神经元胞体标记的重组腺相关病毒及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110318268A1 (en) * 2008-05-29 2011-12-29 Gabriella Campadelli Herpes simplex virus (hsv) with modified tropism, uses and process of preparation thereof
CN105567618A (zh) * 2015-12-31 2016-05-11 中国科学院武汉病毒研究所 Hsv1-h129-bac及其变体的构建方法与应用
CN108570455A (zh) * 2017-03-09 2018-09-25 厦门大学 一种重组单纯疱疹病毒及其用途
CN108841796A (zh) * 2017-06-15 2018-11-20 杭州睿可特生物科技有限公司 重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用
CN109266682A (zh) * 2018-09-29 2019-01-25 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法及应用
CN109563489A (zh) * 2016-06-09 2019-04-02 大学之母博洛尼亚大学 具有经修饰的糖蛋白d的疱疹病毒
CN110117577A (zh) * 2018-02-05 2019-08-13 中国科学院武汉物理与数学研究所 低毒单纯疱疹病毒系统及其构建方法和应用
US20190300862A1 (en) * 2016-06-09 2019-10-03 Alma Mater Studiorum Universita Di Bologna Herpesvirus with Modified Glycoprotein H for Propagation in a Cell

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110318268A1 (en) * 2008-05-29 2011-12-29 Gabriella Campadelli Herpes simplex virus (hsv) with modified tropism, uses and process of preparation thereof
CN105567618A (zh) * 2015-12-31 2016-05-11 中国科学院武汉病毒研究所 Hsv1-h129-bac及其变体的构建方法与应用
CN109563489A (zh) * 2016-06-09 2019-04-02 大学之母博洛尼亚大学 具有经修饰的糖蛋白d的疱疹病毒
US20190300862A1 (en) * 2016-06-09 2019-10-03 Alma Mater Studiorum Universita Di Bologna Herpesvirus with Modified Glycoprotein H for Propagation in a Cell
CN108570455A (zh) * 2017-03-09 2018-09-25 厦门大学 一种重组单纯疱疹病毒及其用途
CN108841796A (zh) * 2017-06-15 2018-11-20 杭州睿可特生物科技有限公司 重组单纯疱疹病毒及其制备方法和应用
CN110117577A (zh) * 2018-02-05 2019-08-13 中国科学院武汉物理与数学研究所 低毒单纯疱疹病毒系统及其构建方法和应用
CN109266682A (zh) * 2018-09-29 2019-01-25 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAO，X.ET AL: "ACCESSION NO.KM016462，Synthetic construct anti-HER2 single chain antibody variable region gene，partial cds", 《GENBANK》 *
LAURA MENOTTI ET AL: "A Herpes Simplex Virus Recombinant That Exhibits a Single-Chain Antibody to HER2/neu Enters Cells through the Mammary Tumor Receptor, Independently of the gD Receptors", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
MINAYA,M.A.ET AL: "ACCESSION NO. ARO37990，glycoprotein D [Human alphaherpesvirus 1]", 《GENBANK》 *
钟鑫: "逆行嗜神经工具病毒的改造与应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113969287A (zh) * 2021-10-22 2022-01-25 中国科学院深圳先进技术研究院 重组单纯疱疹病毒的亲和筛选细胞系及其构建方法和应用
WO2023065502A1 (zh) * 2021-10-22 2023-04-27 中国科学院深圳先进技术研究院 重组单纯疱疹病毒的亲和筛选细胞系及其构建方法和应用
CN113969287B (zh) * 2021-10-22 2024-05-28 中国科学院深圳先进技术研究院 重组单纯疱疹病毒的亲和筛选细胞系及其构建方法和应用
CN114085816A (zh) * 2021-10-26 2022-02-25 四川大学华西医院 一种标记临近星形胶质细胞的方法
CN114085816B (zh) * 2021-10-26 2023-05-26 四川大学华西医院 一种标记临近星形胶质细胞的方法
CN114107231A (zh) * 2021-12-13 2022-03-01 重庆大学 实现全脑突触后神经元胞体标记的重组腺相关病毒及其应用
CN114107231B (zh) * 2021-12-13 2023-08-18 重庆大学 实现全脑突触后神经元胞体标记的重组腺相关病毒及其应用

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