CN114085816A - 一种标记临近星形胶质细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种标记临近星形胶质细胞的方法，用于解决现有技术双重荧光标记效率低、技术难度大，不易推广使用的问题，同时还能够进一步实现多重荧光标记；其步骤主要有质粒构建和病毒包装、病毒注射、图像采集，其中质粒构建是将不同的荧光蛋白接入骨架质粒中，随后将含目的基因的质粒与AAV5的pHelper质粒共转染进入人胚肾细胞系（AAV‑293）中完成病毒包装，病毒注射时，采用的是P0或P1的野生型小鼠，待病毒表达2~4周，在进行灌注取材等操作，从而到达多脑区，高效地完成对临近星形胶质细胞的标记。

Description

一种标记临近星形胶质细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种标记临近星形胶质细胞的方法。
背景技术
星形胶质细胞（星胶）广泛分布于哺乳动物的中枢神经性系统中，具有多级、海绵样的复杂形态，星胶的精细分枝能与临近的神经元、少突胶质细胞及血管等相互接触，进而参与脑功能的调控，临近星胶的精细分枝也能相互接触，通过缝隙链接进行细胞间的物质交换和信号交流。Bushong, E.A等报道了海马CA1中，临近的星胶具有独立、无重叠的空间领域，如图1所示，此后的多项研究还在人类及果蝇的中枢神经系统中报道了类似的现象，提示具有进化上的保守。此后，这一理论持续占据了学术主流地位，在近二十年来未曾有重大更新。
现有的标记临近星胶的方法包括染料导入法和双重荧光标记的嵌合体分析。其中，染料导入法是在福尔马林或多聚甲醛固定的脑组织中，在明场显微镜下找到一组毗邻的星胶胞体，通过尖端非常细的玻璃电极将荧光染料（如Alexa568、Alexa488或荧光黄二锂盐）导入星胶内。由于在明场显微镜下准确识别星胶的难度较大，故该方法的标记效率较低，不适用于细胞密度较高、各类细胞的胞体大小相近的脑区，因而难以进行量化分析。如图2所示，双重荧光标记的嵌合体分析则需将不同荧光蛋白的编码序列拆分，其后插入到细胞DNA的双链上，通过Cre-loxp系统诱导同源重组，从而使得细胞有丝分裂后，可随机获得表达不同荧光蛋白的细胞。但该方法操作难度大，转基因动物的繁育成本高，且表达不同荧光蛋白的细胞大多分散分布，用于临近星胶双重荧光标记的效率较低。综上，还需要更加简便且高效的方法进行临近星胶的双重或多重荧光标记。
有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种标记临近星形胶质细胞的方法，用于解决现有技术双重荧光标记效率低、技术难度大，不易推广使用的问题。
本发明的实施例是这样实现的：
一种标记临近星形胶质细胞的方法，包括如下步骤：质粒构建、病毒包装、病毒注射、图像采集所述病毒注射是将含有两种不同荧光蛋白的病毒稀释成低滴度并混合，再注射进实验材料的特定脑区。
进一步地，质粒构建是通过将不同的荧光蛋白分别接入含有GfaABC1D启动子的骨架质粒中，形成带有目的基因的质粒；所述病毒包装步骤中，将含目的基因的质粒与对星胶亲和力较高的5型腺相关病毒病AAV5的pHelper质粒共转染进入人胚肾细胞系AAV-293中完成病毒包装，裂解细胞并收集病毒颗粒。
进一步地，病毒颗粒包括第一病毒样本、第二病毒样本，所述第一病毒样本的荧光蛋白包括EBFP，所述第二病毒样本的荧光蛋白包括EGFP。
进一步地，含有所述荧光蛋白的病毒注射前稀释到2~5 × 1011vg/mL的滴度，以1~2:1的体积比进行混合。
进一步地，病毒颗粒包括第一病毒样本、第二病毒样本，所述第一病毒样本的荧光蛋白包括EGFP，所述第二病毒样本的荧光蛋白包括mCherry。
进一步地，所述第一病毒样本注射前稀释到2~5× 1011vg/mL的滴度，再与第二病毒样本以2:1的体积比进行混合。
进一步地，实验材料是出生48小时内的小鼠。
进一步地，小鼠注射病毒后，须待病毒表达2~4周，再进行取材。
进一步地，病毒注射时，以小鼠后囟作为xy平面的零点，以进针点处的头顶皮肤为z轴零点形成坐标系，通过上述坐标系对注射点的进行定位。
本发明实施例的技术方案的有益效果包括：
（1）创造性的选择了新生小鼠作为实验对象，由于新生小鼠脑内的星胶增殖和迁移能力较强，同时AAV5对星胶的亲和力高，病毒的表达范围广，因而可以在同一个体上，实现多个脑区的临近星胶双重荧光标记，极大提高了标记效率，而且成像效果更好且成本更低。
（2）病毒注射的过程是通过冰冻麻醉新生鼠，在立体脑定位仪的引导下进行病毒注射，病毒表达2~4后即可取材进行成像，以上操作简便，技术难度低，利于推广，也降低了时间和技术成本。
（3）利用相同血清型、相同启动子的AAV在感染星胶时存在一定竞争关系，将携带有不同荧光蛋白的AAV稀释到较低的滴度，形成不同的两个荧光蛋白组，再注射到新生（P0~P1）小鼠脑内，即可实现临近星胶的双重荧光标记，还可以进一步地引入其他激发波段的荧光蛋白或其他类型的标记物，从而实现临近星胶的多重荧光标记。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为通过现有技术的荧光染料导入法标记的一组临近星形胶质细胞的荧光图像；
图2为现有技术中双标嵌合分析技术的技术路线示意图；
图3为本发明实施例提供的技术路线示意图；
图4为本发明实验例1中荧光标记的星形胶质细胞在小鼠冠状位脑片上的分布图；
图5为本发明实验例2中小鼠视交叉上核中荧光标记的一组星形胶质细胞。
其中：GfaABC1D为星胶特异性启动子，EBFP为增强型蓝色荧光蛋白，EGFP为增强型绿色荧光蛋白，mCherry为红色荧光蛋白，AAV为腺相关病毒，pA为多聚A尾，ITR为重复末端序列。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
如图3所示的是一种标记临近星形胶质细胞的方法，用于解决现有技术双重荧光标记效率低、技术难度大，不易推广使用的问题，同时还能够进一步实现多重荧光标记；其步骤主要有质粒构建和病毒包装、病毒注射、图像采集，其中质粒构建是将不同的荧光蛋白接入骨架质粒中，随后将含目的基因的质粒与AAV5的pHelper质粒共转染进入人胚肾细胞系（AAV-293）中完成病毒包装，病毒注射时，采用的是P0或P1的野生型小鼠，待病毒表达2~4周，在进行灌注取材等操作，从而到达多脑区，高效地完成对临近星形胶质细胞的标记。
质粒的构建与病毒包装步骤中，通过将不同的荧光蛋白分别接入含有GfaABC1D启动子的骨架质粒中，GfaABC1D启动子为人源胶质源性酸性蛋白启动子，即星胶特异性启动子，能够驱动增强型蓝色荧光蛋白（Enhanced blue fluorescent protein, EBFP）、增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein, EGFP）或红色荧光蛋白mCherry的表达，形成带有目的基因的质粒；再将含目的基因的质粒与对星胶亲和力较高的5型腺相关病毒病（Adeno-associated virus, AAV5）的pHelper质粒（携带腺病毒来源的基因）共转染进入人胚肾细胞系（AAV-293）中完成病毒包装，裂解细胞并收集病毒颗粒，通过氯化铯（CsCl）梯度离心法及超滤纯化病毒，最后通过qPCR法测定病毒滴度。
病毒注射中使用的实验材料是采用出生当天或一天（P0或P1）的野生型小鼠，新生小鼠脑内的星胶增殖和迁移能力较强，同时AAV5对星胶的亲和力高，病毒的表达范围广，因而可以在同一个体上，实现多个脑区的临近星胶双重荧光标记，极大提高了标记效率，将病毒注射到小鼠的特定脑区，让病毒表达一定时间；另外，由于现有的新生鼠的前囟难以辨认，再进行注射时，以后囟作为xy平面的零点，以进针点处的头顶皮肤为z轴零点，通过上述坐标系对注射点的进行定位。
需要说明的是：在病毒注射前，对搭载有目的基因的病毒进行稀释。
图像采集是对通过对小鼠灌注取材、共聚焦成像，最终得到具有荧光标记的星形胶质细胞的三维图像。
实施例1
质粒构建和病毒包装。
骨架质粒：pAAV2-GfaABC1D-mRuby3-WPRE-pA（上海泰儿图生物科技有限公司，编号S0790-P），其中GfaABC1D启动子为人源胶质源性酸性蛋白启动子，即星胶特异性启动子；mRuby3为红色荧光蛋白；WPRE为转录后调控原件，可增强目的基因的表达；pA为多聚A尾，可增强目的基因在细胞中的稳定性。
质粒构建：以BamHI和NotI双酶切骨架质粒：pAAV2-GfaABC1D-mRuby3-WPRE-pA（编号S0790-P)，回收线性化载体，以S0254-P(pAAV2-CAG-EBFP-WPRE-pA)质粒为模板，扩增EBFP序列片段，将EBFP序列通过无缝克隆接入线性载体中构建pAAV2-GfaABC1D-EBFP-WPRE-pA质粒。采用相似同的方法，以pAAV2-hSyn-EGFP-WPRE-pA（编号S0237-P）为模板扩增EGFP序列片段，并构建出pAAV2-GfaABC1D-EGFP-WPRE-pA。
病毒包装：将含目的基因的质粒与AAV5的pHelper质粒共转染进入人胚肾细胞系（AAV-293）中完成病毒包装，裂解细胞并收集病毒颗粒，通过氯化铯（CsCl）梯度离心法及超滤纯化病毒，最后通过qPCR法测定病毒滴度。最终的病毒表示为AAV5-GfaABC1D-EBFP、AAV5-GfaABC1D-EGFP。
病毒注射：将AV5-GfaABC1D-EBFP及AAV5-GfaABC1D-EGFP稀释到2~5 × 1011vg/mL的滴度，以2：1的体积比进行混合。
采用出生当天或一天（P0或P1）的野生型小鼠（C57BL/6），将幼鼠置于PE手套中，在冰块中冰冻10~15 min达到麻醉效果，其后将幼鼠通过胶带固定于冰盒上，确保头顶处于水平位置；在立体脑定位仪的引导下，通过微量注射器将AAV5-GfaABC1D-EBFP加AAV5-GfaABC1D-EGFP注射到幼鼠特定脑区，病毒表达30天即可取材、成像并进行细胞的形态重建。
注射的位置是以后囟作为xy平面的零点，以进针点处的头顶皮肤为z轴零点，小鼠皮质的注射坐标为xyz = (+1.5 mm，-1.5 mm，-0.6~0.7 mm)，下丘脑注射坐标为xyz = (+0.2 mm，-1.5 mm， -4.3 mm)，每个注射点的病毒量为0.5 μL，注入速度为0.1 μL/min，注射完毕后，针尖在原位置停留5 min再取针。为减少组织损伤并避免注射病毒的外漏，需采用5μL或10 μL的微量注射针，在其针头套一根尖端打磨后的玻璃电极（规格：外径1.0 mm，内径0.58 mm，长度10 mm），采用硅脂封闭玻璃电极与注射针头之间的空隙。
图像采集：小鼠经深度麻醉后，先后以磷酸盐缓冲液（PBS）及10%中性福尔马林经左心室灌注，取出脑组织后，继续以10%中性福尔马林在4℃后固定过夜，通过振动切片机切取厚度为120~150μm的脑片，在共聚焦显微镜下进行成像，从而获得荧光标记的星胶三维图像，即图4。
实验例1
采用实施例1的方式进行星形胶质细胞进行标记，得到如图4所示的图像。
如图4所示，在小鼠冠状位脑片上存在被标记的星形胶质细胞，其中皮质、丘脑及下丘脑中有大量被EBFP（紫色）、EGFP（绿色）及EBFP/EGFP双阳性（白色）标记的星胶，在图4中的白色箭头指示了被EBFP和EGFP分别标记的临近星胶，说明通过实施例1的方式能够对临近星形胶质细胞进行有效标记。
实施例2
本实施例采用与实施例1相同的实验方法，不同之处在于：本实施例中使用的荧光蛋白组合是EGFP和mCherry，由于mCherry的光稳定性较高，但易于聚集，不利于显示星胶的精细形态，因此现有技术很少将其用在对星形胶质细胞的标记上，在本实施例中，将经过质粒构建以及病毒包装的AAV5-GfaABC1D-EGFP及AAV5-GfaABC1D-mCherry的稀释到2~5 ×1011 vg/mL，以2:1的体积比混合后联合注射。
实验例2
采用实施例2的方式进行星形胶质细胞进行标记，得到如图5所示的图像。
本实施例得到的荧光图像如图5所示，从图5中可以看出，在进行病毒稀释后，mcherry荧光蛋白并没有出现聚集，EGFP和mCherry标记的星胶精细分枝相互渗透，共同包绕神经纤维和细胞的胞体，荧光图像的质量较高。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种标记临近星形胶质细胞的方法，包括如下步骤：质粒构建、病毒包装、病毒注射、图像采集；其特征在于，
所述病毒注射是将含有两种不同荧光蛋白的病毒稀释成低滴度并混合，再注射进实验材料的特定脑区。
2.根据权利要求1所述的一种标记临近星形胶质细胞的方法，其特征在于，所述质粒构建是通过将不同的荧光蛋白分别接入含有GfaABC1D启动子的骨架质粒中，形成带有目的基因的质粒；所述病毒包装步骤中，将含目的基因的质粒与对星胶亲和力较高的5型腺相关病毒病AAV5的pHelper质粒共转染进入人胚肾细胞系AAV-293中完成病毒包装，裂解细胞并收集病毒颗粒。
3.根据权利要求2所述的一种标记临近星形胶质细胞的方法，其特征在于，所述病毒颗粒包括第一病毒样本、第二病毒样本，所述第一病毒样本的荧光蛋白包括EBFP，所述第二病毒样本的荧光蛋白包括EGFP。
4.根据权利要求3所述的一种标记临近星形胶质细胞的方法，其特征在于，含有所述荧光蛋白的病毒注射前稀释到2~5 × 1011vg/mL的滴度，以1~2:1的体积比进行混合。
5.根据权利要求2所述的一种标记临近星形胶质细胞的方法，其特征在于，所述病毒颗粒包括第一病毒样本、第二病毒样本，所述第一病毒样本的荧光蛋白包括EGFP，所述第二病毒样本的荧光蛋白包括mCherry。
6.根据权利要求5所述的一种标记临近星形胶质细胞的方法，其特征在于，含有所述第一病毒样本注射前稀释到2~5× 1011vg/mL的滴度，再与第二病毒样本以1~2:1的体积比进行混合。
7.根据权利要求1所述的一种标记临近星形胶质细胞的方法，其特征在于，所述实验材料是出生48小时内的小鼠。
8.根据权利要求7所述的一种标记临近星形胶质细胞的方法，其特征在于，所述小鼠注射病毒后，须待病毒表达2~4周，再进行取材。
9.根据权利要求1所述的一种标记临近星形胶质细胞的方法，其特征在于，所述病毒注射时，以小鼠后囟作为xy平面的零点，以进针点处的头顶皮肤为z轴零点形成坐标系，通过上述坐标系对注射点的进行定位。
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