CN109797194A - 标记细胞膜表面及研究细胞-细胞相互作用的酶和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种标记细胞膜表面及研究细胞‑细胞相互作用的酶和方法，涉及经过基因工程进化的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体，这类突变体可以实现临近效应介导的标记反应，基于此可以实现未经基因改造的细胞膜表面的标记，并且可以体内和体外对细胞‑细胞相互作用进行精准捕捉与标记。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别涉及酶促标记技术，具体涉及酶促的细胞膜标记方法，以及利用酶促反应研究、发现细胞-细胞相互作用的方法。
背景技术
细胞膜的标记是研究细胞功能的一项重要手段，通常要完成细胞膜的标记需要对细胞进行基因改造，这也大大限制了细胞膜标记技术的应用。另外，细胞-细胞的相互作用对于生命过程有至关重要的作用，其介导了许多重要的生命过程。然而发现细胞与细胞间的相互作用是相对困难的一件事情，因此开发可以研究/检测细胞-细胞相互作用的技术对于揭示生命过程中的一些信号传导具有很高的意义。
金黄色葡萄球菌分选酶A(Sa-SrtA)是革兰氏阳性菌中普遍存在的一类半胱氨酸转肽酶，典型的，其可以催化底物LPXTG(X代表任意氨基酸)与α-Glyn(寡聚甘氨酸)之间的连接反应，这一反应因此被命名为分选酶介导的连接反应(Sortase-Mediated Ligation，SML)。同时，分选酶A还可以催化LPXTG与α-Gly之间的反应，然而，相对于其催化α-Glyn的反应，反应活性更低。
利用分选酶A介导的连接反应，可以实现各种蛋白质的定点标记与偶合。由于野生型分选酶A催化效率较低，基于高通量筛选的定向进化以及理性设计的方法提升分选酶A的活性成为一种必要。Chen等发现了5个点突变P94R、D160N、D165A、K190E和K196T(Chen I.etal.ProcNatl AcadSci USA 2011,108,11399-11404)，可以在一定程度上提升其活性。中国发明专利申请公开文本CN106191015A中发现了另外4个点突变D124G、Y187L、E189R和F200L，获得了金黄色葡萄球菌分选酶A高效突变体。此外，野生型金黄色葡萄球菌分选酶A是一个包含206个氨基酸残基的蛋白酶，截掉氮端25个氨基酸残基的截短体可以在大肠杆菌中高水平、可溶性的表达(Ton-That H.et al.ProcNatl AcadSci USA 1999,96,12424–12429)，因此在现有研究中分选酶A基本上都以这种截短体的形式存在。
发明内容
本发明的目的是基于金黄色葡萄球菌分选酶A的突变体，实现对于未基因改造的细胞膜表面的标记，将金黄色葡萄球菌分选酶A的突变体表达于感兴趣的细胞表面，进而可以实现临近效应介导的标记反应，利用这些特性可以实现对细胞-细胞之间相互作用的检测与发现。
具体的，本发明所提供的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体包含以下突变中的一种或多种：P94R、E105K、E108A或E108Q、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T、F200L。这些突变体可以更好的催化LPXTG与α-Gly或α-Glyn之间的连接反应，特别是大大提升了分选酶A催化LPXTG与非典型底物α-Gly的连接效率。
本发明优选的分选酶A突变体是下述突变体之一：
突变体1：P94R/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L
突变体2：P94R/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L
突变体3：
P94R/E105K/E108Q/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L
突变体4：
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突变体5：
P94R/E105K/E108A/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L
突变体6：
P94R/E105K/E108A/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L
通过以上的突变体，首先可以实现细胞膜表面的标记(图1中(a))，同时，通过将以上分选酶A突变体展示到感兴趣的细胞膜表面(展示的方法包括基因改造的方法或者其他非基因改造的方法)，可以实现与其相互作用的细胞临近标记，从而记录-检测两种细胞之间的相互作用。图1中(b)展示了在配体-受体介导的细胞-细胞相互作用下，金黄色葡萄球菌分选酶A突变体基于临近效应介导的标记反应。本发明所述细胞-细胞相互作用包括配体-受体介导的细胞-细胞相互作用，但不仅限于此。
本发明提供的细胞膜标记方法，利用金黄色葡萄球菌分选酶A的突变体将带有LPXTG序列(X代表任意氨基酸)的标记分子连接到细胞膜表面(见图1中(a))。所述标记分子可以是小分子或生物大分子，例如：生物素(Biotin)、荧光染料、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、其他功能蛋白、核酸等。
具体的，所述细胞膜标记方法是将所述金黄色葡萄球菌分选酶A突变体、带有LPXTG序列的标记分子与待标记细胞在pH 5～9的缓冲液(优选为pH 6.5～7.5的缓冲液，例如pH 7.4左右的PBS缓冲液或Tris缓冲液)中混匀，室温下反应一定时间，然后用缓冲液清洗细胞，得到表面标记了所述标记分子的细胞。
本发明还提供了一种细胞-细胞相互作用的检测方法，将所述金黄色葡萄球菌分选酶A的突变体展示在第一种细胞的表面，共孵育第一种细胞和第二种细胞，并加入带有LPXTG序列的标记分子进行标记，一定时间后清洗细胞，检测第二种细胞表面是否被标记分子标记，若是，说明第一种细胞和第二种细胞之间发生了相互作用。
上述细胞-细胞相互作用的检测方法中，优选的，将两种细胞和带有LPXTG序列的标记分子在PBS缓冲液中室温共孵育一段时间，如30分钟。当所述标记分子是生物素时，将清洗后的细胞与链霉亲和素-荧光色素偶联物(如Streptavidin PE)在冰上孵育一定时间，然后利用流式细胞分选仪进行表征。
本发明使用的分选酶A为金黄色葡萄球菌分选酶A(GenBank登录号：BA000018，ORFID:SA2316)，本发明涉及的分选酶A的突变体可以是截去氮端25～59个氨基酸残基的任一截短体。其中，突变体1-6的氨基酸序列分别对应SEQ ID No：1至SEQ ID No：6，其中突变体1、3、5包含181个氨基酸残基，对应截去氮端25个氨基酸残基的序列；突变体2、4、6包含147个氨基酸残基，对应截去氮端59个氨基酸残基的序列。上述突变体位点是相对于全长野生型金黄色葡萄球菌分选酶A而言。本发明中涉及的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体统一命名为mgSrtA。
序列表中SEQ ID No：1至SEQ ID No：6所示氨基酸序列对应的基因序列依次可以分别如SEQ ID No：7至SEQ ID No：12所示，当然，根据密码子的简并性，也可以是利用同一氨基酸的不同密码子而获得的编码相同蛋白质的其他核苷酸序列。
含有这些基因序列的载体、细胞和宿主菌也在本发明的保护范围内。
细胞膜表面本身寡聚甘氨酸很少，存在的基本是都是单甘氨酸，本发明利用经过基因工程进化的金黄色葡萄球菌分选酶A(Staphylococcus aureus Sortase A，Sa-SrtA)突变体，大大提高对于单甘氨酸残基的标记效率，基于临近效应介导的标记反应，可以实现未经基因改造的细胞膜表面的标记，并且可以对细胞-细胞相互作用进行精准捕捉与标记。本发明提供的细胞-细胞相互作用的检测方法既可以在体外实现，也可以用于活体内细胞-细胞相互作用的检测。
附图说明
图1是本发明的细胞膜表面标记方法和细胞-细胞相互作用检测方法的示意图，其中：
(a)是利用本发明涉及的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体进行细胞膜标记的示意图，其中mgSrtA为本发明涉及的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体，target molecule为带有LPXTG序列的标记分子，标记分子可以是小分子或生物大分子；
(b)显示了利用本发明涉及的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体进行细胞-细胞相互作用检测的示意图，其中：Cell of Interest代指我们感兴趣的细胞，Interacting Cell代指与我们感兴趣的细胞存在相互作用的细胞。
图2显示了实施例一利用本发明的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体mgSrtA对细胞膜标记eGFP-LPETG后流式细胞分选仪表征结果。
图3是实施例二利用mgSrtA介导的临近标记实现HER2阳性细胞与表达HER2配体ZHER细胞间的相互作用的记录与检测的示意图。
图4显示了实施例二的流式细胞分选仪表征结果。
图5显示了实施例二中流式细胞分选仪的细胞分选全图。
图6是实施例三利用mgSrtA介导的临近标记实现细胞-细胞相互作用的记录与检测的示意图。
图7显示了实施例三中的流式细胞分选仪的细胞分选全图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施方式。虽然附图中显示了本发明的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例一、细胞膜的标记
利用克隆的方法分别在pet28a载体上同时表达eGFP-LPETG和本发明中涉及的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体，利用6×His标签进行蛋白纯化。细胞膜标记反应在PBS缓冲液或Tris缓冲液(30mM Tris，150mM NaCl，5mM CaCl2，pH 7.4)中进行，反应条件如下：20μMmgSrtA，20μM eGFP-LPETG，室温1小时,细胞密度2×107cells/mL。反应完成后使用缓冲液清洗三遍，然后利用流式细胞分选仪进行表征。结果如图2所示，可以看出在加入mgSrtA(+mgSrtA)后与只加eGFP-LPETG(-mgSrtA)相比，细胞eGFP荧光强度更强，证明eGFP-LPETG被标记到细胞表面。序列表中SEQ ID No：1至6所示的六个突变体的实验结果一致。
实施例二、模型HER2阳性细胞-细胞相互作用的记录与检测
首先，利用基因改造的方式将ZHER和/或mgSrtA展示到HEK293T细胞的表面，并标记eFluor670作为后期分选的信号。MDA-MB-231细胞通过慢病毒转染的方法稳转HER2受体(人表皮生长因子受体-2)作为Her2阳性细胞(Her2+cells)。将以上两种细胞(细胞密度2×107cells/mL)在PBS缓冲液中室温共孵育30分钟，并加入100μM的biotin-LPETG进行标记，同时以MDA-MB-231细胞本身为Her2阴性细胞(Her2-cells)作为对照。标记完成后使用PBS清洗三次，然后在冰上与Streptavidin PE孵育15min，最后利用流式细胞分选仪进行表征。
本实验中，Her2阳性细胞与表达Her2配体ZHER的细胞之间发生相互作用，使得mgSrtA能够将生物素标记到Her2阳性细胞表面(如图3所示)，从而利用mgSrtA介导的临近标记可以实现细胞-细胞相互作用的记录与检测。流式细胞分选仪的表征结果如图4和图5所示，由图4看出，只有Her2阳性细胞可以被同时表达ZHER和mgSrtA的HEK293T细胞标记，证明只有两个相互作用的细胞才能实现mgSrtA介导的标记。图5展示的是图4中细胞分选的全图，Q2代表被Biotin标记的Her2阳性或阴性细胞。图4和图5结果说明只有相互作用的细胞能够被mgSrtA介导的标记记录。序列表中SEQ ID No：1至6所示的六个突变体都得到了相类似的实验结果。
实施例三、模型Raji细胞-细胞相互作用的检测
首先，利用基因改造的方式将CD40L(或CD40L*或CTLA4)与mgSrtA展示到HEK293T细胞的表面，表达CD40L或CTLA4的细胞可以通过与Raji细胞表面的CD40或B7配对诱导HEK293T与Raji细胞的相互作用，CD40L*为CD40L的突变体，不与CD40L相互作用，作为阴性对照。将上述表达不同配体的HEK293T细胞与Raji细胞(Raji细胞预先标记eFluor670)在PBS缓冲液中室温共孵育30分钟，同时加入100μM的biotin-LPETG进行标记。标记完成后使用PBS清洗三次，然后在冰上与Streptavidin PE孵育15min，最后利用流式细胞分选仪进行表征。
本实验中，表达CD40L、CD40L*或CTLA4的细胞与表达CD40和B7的Raji细胞之间发生相互作用，使得mgSrtA能够将生物素标记到Raji细胞表面(如图6所示)。流式细胞分选仪的细胞分选全图如图7所示，Q2代表被Biotin标记的Raji细胞，可以看出只有同时表达CD40L(或CTLA4)与mgSrtA时Raji细胞才能被标记，而无论是同时表达CD40L*与mgSrtA或同时表达ZHER与mgSrtA的HEK293T细胞都无法诱导Raji细胞的标记。说明只有相互作用的细胞能够被mgSrtA介导的标记记录。序列表中SEQ ID No：1至6所示的六个突变体都得到了相类似的实验结果。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
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<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
caagctaaac ctcaaattcc gaaagataaa tcgaaagtgg caggctatat tgaaattcca 60
gatgctgata ttaaagaacc agtatatcca ggaccagcaa cacgtgaaca attaaataga 120
ggtgtaagct ttgcaaaaga aaatgcttca ctagatgatc aaaatatttc aattgcagga 180
cacactttca ttggccgtcc gaactatcaa tttacaaatc ttaaagcagc caaaaaaggt 240
agtatggtgt actttaaagt tggtaatgaa acacgtaagt ataaaatgac aagtataaga 300
aatgttaagc ctacagctgt aggagttcta gatgaacaaa aaggtaaaga taaacaatta 360
acattaatta cttgtgatga tcttaatcgg gagacaggcg tttgggaaac acgtaaaatc 420
ttggtagcta cagaagtcaa a 441
Claims (10)
1.一种细胞膜表面的标记方法，利用金黄色葡萄球菌分选酶A突变体将带有LPXTG序列的标记分子连接到细胞膜表面，其中X代表任意氨基酸，所述金黄色葡萄球菌分选酶A突变体包含以下突变中的一种或多种：P94R、E105K、E108A、E108Q、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T、F200L。
2.如权利要求1所述的标记方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌分选酶A突变体是下述突变体之一：
突变体1：P94R/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；
突变体2：P94R/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；
突变体3：P94R/E105K/E108Q/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；
突变体4：P94R/E105K/E108Q/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；
突变体5：P94R/E105K/E108A/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；
突变体6：P94R/E105K/E108A/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L。
3.如权利要求1所述的标记方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌分选酶A突变体是包含序列表中SEQ ID No：1至SEQ ID No：6中任意一个所示氨基酸序列的蛋白质。
4.如权利要求1所述的标记方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌分选酶A突变体是截去氮端25～59个氨基酸残基的任一截短体。
5.如权利要求1所述的标记方法，其特征在于，将所述金黄色葡萄球菌分选酶A突变体、带有LPXTG序列的标记分子与待标记细胞在pH 5～9的缓冲液中混匀，室温下反应一定时间，然后用缓冲液清洗细胞，得到表面标记了所述标记分子的细胞。
6.一种细胞-细胞相互作用的检测方法，将金黄色葡萄球菌分选酶A突变体展示在第一种细胞的表面，共孵育第一种细胞和第二种细胞，并加入带有LPXTG序列的标记分子进行标记，其中X代表任意氨基酸，所述金黄色葡萄球菌分选酶A突变体包含以下突变中的一种或多种：P94R、E105K、E108A、E108Q、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T、F200L；孵育一定时间后清洗细胞，检测第二种细胞表面是否被标记分子标记，若是，说明第一种细胞和第二种细胞之间发生了相互作用。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌分选酶A突变体是下述突变体之一：
突变体1：P94R/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；
突变体2：P94R/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；
突变体3：P94R/E105K/E108Q/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；
突变体4：P94R/E105K/E108Q/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；
突变体5：P94R/E105K/E108A/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L；
突变体6：P94R/E105K/E108A/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L。
8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌分选酶A突变体是包含序列表中SEQ ID No：1至SEQ ID No：6中任意一个所示氨基酸序列的蛋白质。
9.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌分选酶A突变体是截去氮端25～59个氨基酸残基的任一截短体。
10.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，通过基因改造的方法使所述金黄色葡萄球菌分选酶A突变体展示到第一种细胞表面，将两种细胞和带有LPXTG序列的标记分子在PBS缓冲液中室温共孵育一定时间，然后检测第二种细胞表面是否被标记分子标记。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020247510A1 (en) * | 2019-06-03 | 2020-12-10 | The Scripps Research Institute | A chemoenzymatic method for the detection of cell-cell proximity interaction and isolation of tumor-specific antigen reactive t cells for immune therapy |
| WO2021185360A1 (en) * | 2020-03-20 | 2021-09-23 | Westlake Therapeutics (Hangzhou) Co., Limited | Novel truncated sortase variants |
| CN114085816A (zh) * | 2021-10-26 | 2022-02-25 | 四川大学华西医院 | 一种标记临近星形胶质细胞的方法 |
| WO2024088213A1 (en) * | 2022-10-24 | 2024-05-02 | Westlake Therapeutics (Shanghai) Co., Limited | Combination to induce specific immune tolerance |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106191015A (zh) * | 2016-08-25 | 2016-12-07 | 北京大学 | 金黄色葡萄球菌分选酶a高效突变体 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106191015A (zh) * | 2016-08-25 | 2016-12-07 | 北京大学 | 金黄色葡萄球菌分选酶a高效突变体 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ATSUSHI TABATA等: "Investigation on the Reaction Conditions of Staphylococcus aureus Sortase A for Creating Surface-modified Liposomes as a Drug-delivery System Tool", 《ANTICANCER RESEARCH》 * |
| HEE-JIN JEONG等: "Generation of Ca2+-independent sortase A mutants with enhanced activity for protein and cell surface labeling", 《PLOS ONE》 * |
| JOHN M ANTOS等: "Recent advances in sortase-catalyzed ligation methodology", 《CURRENT OPINION IN STRUCTURAL BIOLOGY》 * |
| NOVALIA PISHESHA等: "Sortase A: A Model for Transpeptidation and Its Biological Applications", 《ANNU. REV. CELL DEV. BIOL.》 * |
| VARIANTS TOBIAS HECK等: "Sortase A catalyzed reaction pathways: a comparative study with six SrtA", 《CATAL. SCI. TECHNOL.》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020247510A1 (en) * | 2019-06-03 | 2020-12-10 | The Scripps Research Institute | A chemoenzymatic method for the detection of cell-cell proximity interaction and isolation of tumor-specific antigen reactive t cells for immune therapy |
| WO2021185360A1 (en) * | 2020-03-20 | 2021-09-23 | Westlake Therapeutics (Hangzhou) Co., Limited | Novel truncated sortase variants |
| WO2021185359A1 (en) * | 2020-03-20 | 2021-09-23 | Westlake Therapeutics (Hangzhou) Co. Limited | Modified red blood cells and uses thereof for delivering agents |
| CN115335064A (zh) * | 2020-03-20 | 2022-11-11 | 西湖生物医药科技(杭州)有限公司 | 修饰的红细胞及其用于递送药剂的用途 |
| CN114085816A (zh) * | 2021-10-26 | 2022-02-25 | 四川大学华西医院 | 一种标记临近星形胶质细胞的方法 |
| CN114085816B (zh) * | 2021-10-26 | 2023-05-26 | 四川大学华西医院 | 一种标记临近星形胶质细胞的方法 |
| WO2024088213A1 (en) * | 2022-10-24 | 2024-05-02 | Westlake Therapeutics (Shanghai) Co., Limited | Combination to induce specific immune tolerance |
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