CN110499330A - 重组腺相关病毒载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及重组腺相关病毒载体及其应用。本发明提供的重组腺相关病毒载体只在黑质区的多巴胺能神经元内表达，星形胶质细胞、少突胶质细胞内未见表达；且AAV‑MANFHIS的黑质注射可有效提高大鼠的行为学功能，能够特异性治疗动物神经退行性疾病。

Description

重组腺相关病毒载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及重组腺相关病毒载体及其应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是由于中脑黑质的多巴胺神经元变性、坏死，导致黑质、纹状体内多巴胺递质减少所引起的神经系统退行性疾病，主要症状包括运动迟缓、静止性震颤、肌肉僵直、姿势不稳定等，严重影响患者的生活质量。目前，PD临床治疗主要依赖于多巴胺替代疗法，包括多巴类制剂或多巴胺受体兴奋剂等。该手段并不能从根本上挽救逐步丧失的多巴胺神经元，其疗效会随着多巴胺神经元的进行性丢失而逐步丧失，还可能导致异动症等严重不良反应。神经营养因子在脊椎动物神经元生存及分化中具有重要作用，长期以来在神经保护及神经再生研究中被寄予厚望。其中，胶质细胞源性神经营养因子(GlialCell Derived Neurotrophic Factor，GDNF)既具有神经保护作用还具有促进多巴胺能神经元损伤后修复作用。中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(Mesencephalic Astropcyte-derived Neurotrophic Factor，MANF)是2003年被发现的能促进多巴胺神经元存活的高度保守的神经营养因子。然而，这些神经生长因子在药物研究中均未表现出良好的药物开发前景，其不利因素主要包括：1)给药困难。神经营养因子作为大分子蛋白质，不能透过血脑屏障，立体定向脑内注射技术要求高，风险大；2)代谢时间短，生物利用度差；3)引起并发症；4)非特异扩散存在潜在的至瘤性。可见，寻找具有更高选择性和生物相容性的先导物，建立便捷、安全的给药途径，以及对剂量的实时控制，降低致瘤性和并发症是PD药物研发的核心问题。

基因治疗手段的兴起以及新型转基因载体的涌现为神经营养因子在神经退行性疾病中的应用开拓了新的途径。通过目标基因的与基因组的整合，使目标蛋白在脑内形成持续性的表达，从而避免频繁的脑立体定向注射带来的损伤和风险。

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是中枢神经系统疾病基因治疗中的首选载体，在递送目标基因时不影响人体正常基因的功能，而且能够高效表达异源蛋白质。目前在欧美约有40多个临床试验采用了AAV作为运载载体，以AAV作为载体将谷氨酸脱羧酶和氨基酸脱羧酶基因导入丘脑底核治疗帕金森病的研究显示出良好的安全性，且治疗3个月后患者运动功能改善25％～30％。目前有报道公开了一种使用以腺相关病毒(AAV)为基础的基因传递系统来传递神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)到患有神经退行性病症(例如帕金森氏病)的患者的方法。还有报道公开了一种利用四环素调控腺相关病毒载体在体内表达GDNF的方法。此外，还公开了一种利用病毒表达构建体在体内表达neruturin的方法。基因治疗方法相对于蛋白的定向注射具有药效持续时间长的优势，但是生物安全性，尤其是非特异性的组织分布依然具有潜在的风险。因此，选择合适的基因以及病毒载体是提高成药性的关键因素。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种重组腺相关病毒载体及其应用。该重组腺相关病毒载体只在黑质区的多巴胺能神经元内表达，星形胶质细胞、少突胶质细胞内未见表达；且AAV-MANFHIS的黑质注射可有效提高大鼠的行为学功能，能够特异性治疗动物神经退行性疾病。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种重组腺相关病毒载体，包含：

I、具有编码星形胶质源性神经营养因子(MANF)多肽的核苷酸序列；

II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

III、与如I所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得多肽序列为星形胶质源性神经营养因子的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；

IV、如I、II或III所示序列的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述腺相关病毒载体包括:AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8或AAV9。

在本发明的一些具体实施方案中，所述核苷酸序列还包括位于5’位而且符合编码MANF多肽序列的读框的分泌序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述分泌序列为病毒启动子，所述病毒启动子包括MLP、CMV或RSV LTR。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组腺相关病毒载体包括表达载体，所述表达载体从5’到3’端依次包括：

V、上游ITR、CMV启动子、MANF基因和下游ITR；或

VI、上游ITR、CMV启动子、MANF基因、HIS序列、polyA和下游ITR。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组腺相关病毒载体还包括辅助功能载体和/或附属功能载体；

所述辅助功能载体包括反式提供具有AAV复制和/或包装功能的蛋白Rep和/或Cap；

所述附属功能载体包括含有腺病毒VA RNA编码区域、腺病毒E4ORF6编码区域、腺病毒E2A 72kD编码区域、腺病毒E1A编码区域、缺少完整的E1B 55k编码区域的腺病毒E1B区域或辅助病毒Ad5的重要元件E1a、E1b、E2a或E4。

在本发明的一些具体实施方案中，所述核苷酸序列具有VII、VIII、IX或X所示的核苷酸序列中任意一个：

VII、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

VIII、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

IX、与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得多肽序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；

X、如VII、VIII或IX所示序列的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体具有XI、XII、XIII或XIV所示的核苷酸序列中任意一个：

XI、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

XII、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

XIII、与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

XIV、如XI、XII或XIII所示序列的互补序列。

本发明还提供了所述重组腺相关病毒载体在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述神经退行性疾病为帕金森病。

在本发明的一些具体实施方案中，所述帕金森病包括轻度黑质纹状体多巴胺(DA)损伤和/或中度黑质纹状体多巴胺(DA)损伤。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组腺相关病毒载体特异性作用于动物的神经元。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组腺相关病毒载体特异性作用于动物的纹状体和/或黑质。

本发明提供了一种重组腺相关病毒载体，包含：

I、具有编码星形胶质源性神经营养因子(MANF)多肽的核苷酸序列；

II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

III、与如I所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得多肽序列为星形胶质源性神经营养因子的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；

IV、如I、II或III所示序列的互补序列。

本发明提供的重组腺相关病毒载体只在黑质区的多巴胺能神经元内表达，星形胶质细胞、少突胶质细胞内未见表达；且AAV-MANFHIS的黑质注射可有效提高大鼠的行为学功能，能够特异性治疗动物神经退行性疾病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示AAV载体质粒pAAV2-MANF-HIS图谱；

图2(A)示点杂交检测AAV8-调控-MANF病毒滴度，以目标基因质粒梯度稀释，作标准曲线，样品换算滴度1×1011v.g/ml；

图2(B)示荧光定量PCR检测AAV8-调控-MANF病毒滴度，以目标基因质粒梯度稀释，作标准曲线，样品滴度换算1.33×1011v.g/ml；

图3示荧光定量PCR检测AAV8-MANF病毒感染细胞后MANF基因mRNA转录水平以未感染病毒细胞中MANF的mRNA转录水平作为1.0，其他样品与未感染病毒细胞中MANF的mRNA转录水平进行比较；

图4示AAV8-MANF-his目标基因靶向性研究；

图5示AAV8-MANF对6-OHDA诱导大鼠PD模型TH形态学实验；

图6示AAV8-MANF对6-OHDA诱导大鼠行为学实验；

图7示目标基因主要在多巴胺神经元表达，星形胶质细胞及少突胶质细胞未见明显表达；

图8示AAV8衣壳蛋白在各脏器中的分布。

具体实施方式

本发明公开了一种重组腺相关病毒载体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种用于治疗神经退行性疾病的重组腺相关病毒(AAV)载体治疗神经退行性疾病的重组腺相关病毒(AAV)载体，

(a).所述病毒载体包含编码星形胶质源性神经营养因子(MANF)多肽的多核苷酸，

该多核苷酸与包括启动子的表达控制元件有效连接。

(b).所述病毒载体用于特异性感染哺乳动物神经元或使MANF多肽在哺乳动物神经

元中特异性表达。

作为优选，所述的重组腺相关病毒为AAV8。

作为优选，所述多核苷酸还包括位于5’位而且符合编码MANF多肽序列的读框的分泌序列。

作为优选，所述核苷酸编码人MANF。

作为优选，重组腺相关病毒(AAV)载体的启动子是有病毒启动子；更优选的，所述启动子为MLP、CMV或RSV LTR。

作为优选，所述病毒采用三种载体系统制备，三种载体构成如下：

(a).AAV辅助功能载体：反式提供具有AAV复制和包装功能的蛋白Rep和Cap

(b).AAV表达载体：从5’到3’端构成为AAV2型的上游ITR、CMV启动子、人MANF

基因序列、下游ITR或上游ITR、CMV启动子、人MANF基因序列、HIS序列、polyA、下游ITR

(c).附属功能载体：含有辅助毒Ad5的重要元件E1a、E1b、E2a、E4等

作为优选，所述AAV表达载体的核苷酸序列如Seq NO.4所示。

本发明还提供了所述病毒载体在治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

作为优选，神经退行性疾病为帕金森病。

作为优选，所述帕金森病包括轻度到中度黑质纹状体多巴胺(DA)损伤。

作为优选，所述病毒给到患者的纹状体和(或)黑质中。

作为优选，所述AAV病毒体利用强力输送系统(CED)给药到纹状体。

作为优选，所述重组腺相关病毒(AAV)载体给药用渗透泵完成。

作为优选，所述重组腺相关病毒(AAV)载体给药用输液泵完成。

除非另有说明，实施本发明应用本领域技术范围内病毒学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法来进行。所述技术在文献中有充分地解释。参见，例如Sambrook等Molecular Cloning:A Laboratory Manual(最近版本)；DNA Cloning:A PracticalApproach,第I&II卷(D.Glover，编辑)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait，编辑，最近版本)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins，编辑，最近版本)；Transcriptionand Translation(B.Hames&S.Higgins，编辑，最近版本)；CRC Handbook ofParvoviruses，第I&II卷(P Tijssen，编辑)；Fundamental Virology，第2版，第I&II卷(B.N.Fields and D.M.Knipe，编辑)；Freshney Culture of Animal Cells,A Manual ofBasic Technique(Wi1ey-Liss，第3版)；以及Ausubel等(1991)Current Protocols inMoleular Biology(Wiley Interscience,NY)。

除非本文另有清楚的说明，在本说明书和附件权利要求中所使用的单数形式"一个"、"一种"和"其(该，所述)"包括复数含义。

定义

在本发明的描述中，将使用下列术语，特此简要说明定义如下:

本文使用的术语"中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MesencephalicAstropcyte-derived Neurotrophic Factor，MANF)"或"MANF"是指任何来源的神经营养因子，是与任何多种已知MANF基本同源和功能相当。哺乳动物有代表性的MANF蛋白质之间的同源度是大约93％，所有哺乳动物MANF具有相似高度同源性。所述MANF以单体、二聚体或其他多聚体的生物活性形式存在。因此，本文使用的术语"MANF多肽"包括活性单体MANF以及活性多聚体MANF、活性糖基化和非糖基化形式的MANF和活性截短形式的分子。

本文使用的"功能相当"是指MANF多肽保留部分或全部神经营养的特性，但是与天然的MANF分子的程度不一定相同。

"同源"是指两个多核苷酸或两个多肽部分之间相似的百分数。当两个多核苷酸或两个多肽序列至少大约50％相似，优选至少75％，更优选至少80-85％，优选至少90％，更优选至少95-99％或在规定的分子长度内更多序列相似或序列相同，则所述序列彼此"基本同源"。本文使用的基本同源还指与特定的多核苷酸或多肽序列完全相同的序列。

"同一性"通常是指两个多核苷酸或多肽序列分别准确的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的对应。同一性百分率可通过两个分子之间序列信息的直接对比来测定，通过排列序列，计算两列序列之间匹配的准确数，除以最短序列，结果乘以100。

此外，同源性可通过多核苷酸在下列条件下杂交来测定，所述条件是在同源的区域形成稳定的双链，然后用单链特异性核酸酶消化，消化片段的大小测定。在例如针对特殊系统定义的严格条件下通过DNA印迹杂交实验来确定DNA序列是基本同源的。定义的适合杂交条件是本领域的技术。参见，例如，Sambrook等，同上；DNA Cloning,同上；Nucleic Acidhybridization，同上。

"MANF变体"是指参照MANF分子有生物活性的衍生物，或所述衍生物保留想要的活性的片段，例如本文所述实验中的神经营养活性。一般地说，术语"变体"指具有天然多肽序列和结构、而相对于天然分子一个或多个氨基酸插入、取代(通常是保守的)和/或缺失的化合物，只要所述改变不破坏神经营养活性。优选所述变体具有至少与天然分子相同的神经营养活性。用于制造编码MANF变体的多核苷酸的方法是本领域已知的并在下面进一步描述。对于MANF缺失变体，通常缺失范围是大约1-30个残基，更通常为大约1-10个残基，典型的是大约1-5个临近的残基，或在所述范围内的任何整数。设想存在N-末端、c-末端和内部缺失。为了保持最大的生物活性，通常选择缺失以保持MANF蛋白产物在受影响的区域的三级结构，例如，半胱氨酸交联。缺失变体的非限制性实施例包括缺失MANF1-40N-未端氨基酸的截短的MANF蛋白质产物，或缺失MANF C-末端残基的变体或其结合物。

对于MANF插入变体，氨基酸序列插入通常包括N-和/或C-未端融合，融合范围从一个残基到包含一百个或更多残基的多肽的长度，以及内部加入单个或多个氨基酸残基。内部插入通常范围是大约1-10个残基，通常为大约1-5个残基，常常是1-3个氨基酸残基，或在所述范围内的任何整数。N-末端插入变体的实例包括异源N-未端信号序列与MANFN-末端的融合，以及其它神经营养因子序列衍生的氨基酸序列的融合。

MANF取代变体有至少一个MANF氨基酸序列的氨基酸残基除去，由一个不同的残基插入到它的位置。所述取代变体包括等位基因的变体，其特征在于在单种种群中自然发生的核苷酸序列的改变，它可能导致或不导致氨基酸改变。特别优选的取代是保守的，即这些取代是在与它们的侧链相关的氨基酸家族内的取代。具体地说，氨基酸通常分为4种:(1)酸性的－天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性的－赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的－甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸；以及(4)不带电的极性的－色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时分类为芳香族氨基酸。例如，可以预见的是用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸、或用结构相关的氨基酸取代相似的保守的氨基酸，这些取代不会对生物活性有大的影响。例如，该MANF分子可以包括直至大约5-10个保守的或非保守的氨基酸取代，或甚至大约15-25个保守的或非保守的氨基酸取代，或5-25之间任何整数，只要保持想要的分子功能完整。本领域技术人员应用本领域众所周知的技术可以很容易地测定目的分子允许改变的区域。MANF氨基酸序列的特定突变可以包括糖基化位点的修饰(例如，丝氨酸、苏氨酸、或天冬氨酸)。在任何天冬氨酸连接的糖基化识别位点或通过插入O-联糖类修饰的分子的任何位点的氨基酸取代或缺失导致失去糖基化或部分糖基化。天冬氨酸连接的糖基化识别位点包括适当的细胞糖基化酶特异性识别的三肽序列。这些三肽序列是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser，其中Xaa可以是除了Pro外的任何氨基酸。在糖基化识别位点的第一或第三个氨基酸位置的一个或两个位点上的氨基酸取代或缺失的改变(和/或在第二位直上氨基酸缺失)导致在修饰的三肽序列非糖基化。因此适当改变的核苷酸序列的表达产生不在该位点糖基化的变体。或者，MANF氨基酸序列可以修饰以加上糖基化位点。识别突变MANF氨基酸残基或区域的方法是本领域众所周知的。一种已知所述方法是"丙氨酸扫描突变"。参见例如，Cunningham和Wells,Science(1989)244:1081-10850在这个方法中，鉴别氨基酸残基或目标残基组(例如，带电的残基如Arg、Asp、His、Lys以及Glu)并用中性或带负电氨基酸(最优选丙氨酸和多聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与细胞内外周围水环境之间的相互作用。通过在取代的位点引入另外的或替代的残基精确定位对取代敏感的功能的结构域。因此，测定引入氨基酸序列变异的靶位点，在相应的靶密码子或DNA序列的区域上进行丙氨酸扫描或随机诱变，筛选表达的MANF变体以对需要的活性和活性程度进行最优组合。

诱变最关键的位点包括在侧链体积、电荷、和/或疏水性的方面不同物种MANF蛋白的氨基酸明显不同的位点。其它的目标位点是那些来自不同物种的在MANF-样蛋白的特定残基上是同样的位点。所述位置通常对蛋白质的生物活性是重要的。这些位点起初是以相关的保守方式取代的。如果所述取代导致生物活性的改变，那么引入更大改变(典型取代)，和/或制造其它插入或缺失，并筛选所得产物的活性。MANF活性的测定是本领域已知的，包括增强中脑神经元培养物中多巴胺的吸收的能力和增强交感神经节神经元的存活的能力。参见例如，美国专利号6,362,319。

"帕金森病样症状"包括肌肉颤抖、肌肉无力、僵硬、运动徐缓、姿势和平衡的改变、痴呆和相似症状，通常是帕金森病或其它神经变性的疾病伴有的。

"载体"是指任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒体等，当与适当的控制因子连接时它们能够复制并能在细胞之间转运基因序列。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。"AAV载体"是指由腺相关病毒血清型衍生的载体，非限制性包括:AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8和AAV9。AAV载体可以具有全部或部分缺失一个或多个AAV野生型基因，优选rep和/或cap基因，但是保留功能性侧接ITR序列。功能性ITR序列对AAV病毒体的拯救、复制和包装是必须的。因此，本文定义的AAV载体包括至少病毒复制和包装顺式需要的那些序列(例如，功能性ITR)。所述ITR不必是野生型核苷酸序列，可以是经改变的，例如，经过核苷酸的插入、缺失或取代，只要该序列提供功能性拯救、复制和包装。

"AAV辅助功能"是指可以表达提供AAV基因产物的AAV衍生的编码序列，所述产物再对生产性AAV复制反式起作用。因此，AAV辅助功能包括两个主要AAV可读框(ORF)，即rep和cap。所述Rep表达产物经证实具有多种功能，其中包括:AAV DNA复制起点的识别、结合和产生切口；DNA解旋酶活性；以及由AAV(或其它异源的)启动子转录的调节。所述Cap表达产物提供必要的包装功能。本文使用AAV辅助功能来补充AAV载体失去的反式AAV功能。

术语"AAV辅助构建物"通常是指包括提供AAV载体缺失的AAV功能的核苷酸序列的核酸分子，它用于产生转导载体来传递目标核苷酸序列。AAV辅助构建物通常用于提供AAVrep和/或cap基因的瞬时表达来补充失去的细胞裂解性AAV复制必须的AAV功能；但是辅助构建物缺少AAV ITR并且不能自我复制和自我包装。AAV辅助构建物可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒体。描述了许多AAV辅助构建物，例如常用的编码Rep和Cap表达产物的质粒pAAV/Ad和pIM29+45。参见例如，Samulski等(1989)J.Virol.63:3822-3828；以及McCarty等(1991)J.Virol.65:2936-2945.已有许多其它编码Rep和Cap表达产物的载体的介绍。参见例如，美国专利号5,139,941和6,376,237。

术语"附属功能"是指非AAV衍生的病毒和/或细胞的功能(AAV依赖其进行复制)。因此，该术语包括在AAV复制中需要的蛋白和RNA包括那些涉及AAV基因转录活化、时期专一的AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物的合成和AAV衣壳装配的部分。基于病毒的附属功能可由任何已知的辅助病毒如腺病毒、疱疹病毒(除了1型单纯疱疹病毒)和牛痘病毒衍生。

术语"附属功能载体"通常是指包含提供附属功能的核苷酸的核酸分子。附属功能载体可以转染适合的宿主细胞，然后所达载体在宿主细胞中能够支持AAV病毒体产生。从该术语中特别排除在外的是自然存在的传染性病毒休，例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒体。因此，附属功能载体可以是质粒、噬菌体、转座子或粘粒的形式。

特别证明了完全补充的腺病毒基因不需要附属的辅助功能。具体地说，不能DNA复制和晚期基因合成的腺病毒突变体表明是AAV复制许可的。

特别优选附属功能载体包括腺病毒VARNA编码区域、腺病毒E4ORF6编码区域、腺病毒E2A72kD编码区域、腺病毒E1A编码区域、和缺少完整E1B 55k区域的腺病毒E1B编码区域。"能够支持有效的rAAV病毒体产生"是指附属功能载体或系统在特定的宿主细胞中，能够提供与腺病毒辅助病毒感染该宿主细胞能获得的大体相当的或更高水平的rAAV病毒体产生的辅助功能。因此，附属功能载体或系统支持有效的rAAV病毒体产生的能力可以通过比较应用附加载体或系统获得的rAAV病毒体滴度与应用传染性腺病毒感染获得的滴度来确定。更具体地说，如果相同数量的宿主细胞获得的病毒体量少于用腺病毒感染的量的不大于200倍，更优选不大于100倍，最优选相等或高于用腺病毒感染获得的量，则附属功能载体或系统支持有效的rAAV病毒体产生与用传染性腺病毒获得的大致相当或更高。

"重组病毒"是指经过遗传改变的病毒，例如，通过添加或插入异源核酸构建物到粒子中。

"AAV病毒体"是指完整病毒体，如野生型(wt)AAV病毒体(包括与AAV衣壳蛋白外壳结合的线性单链AAV核酸基因组)。在这点上，任何互补单链AAV核酸分子，例如有意义链或无意义链，都可以包装到任何AAV病毒体中，并且两条链同样地具有传染性。

"重组AAV病毒体"或"rAAV病毒体"本文定义为有传染性的复制缺陷病毒，包括AAV蛋白衣壳，封装着侧接AAV ITR的目的异源核苷酸序列。rAAV病毒体是在具有AAV载体的、AAV辅助功能和引入其中的附属功能合适的宿主细胞中产生的。如此，所述宿主细胞具有编码AAV多肽的能力，为了以后的基因传递，这就需要将AAV载体(包括目的重组核苷酸序列)包装到传染性重组病毒体中。

术语"转染"是用于指细胞吸收外源DNA，当外源DNA导入到细胞膜内时即转染了该细胞。许多转染技术通常是本领域已知的。所述技术可以用于将一个或多个外源DNA部分(如核苷酸整合载体和其它核酸分子)引入到合适的宿主细胞中。

术语"宿主细胞"表示例如微生物、酵母细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细胞，它们能够或已经用于接受AAV辅助构建物、AAV载体质粒、附属功能载体、或其它转运DNA。术语包括转染的原始细胞的子代。因此，本文使用的"宿主细胞"通常是指用外源DNA序列转染的细胞。可以理解由于自然、偶然或有目的的突变，单一亲代细胞的子代在形态学或遗传或总DNA互补上与原始的亲代不需要完全一致。

本文使用的术语"细胞系"是指在体外能够继续或延长生长和分裂的细胞群体。通常，细胞系是由单一的祖代细胞衍生的无性(繁殖)系的群体。本领域深知在所述无性(繁殖)系的群体的保存或转运中染色体组型可能发生自友的或诱导的改变。因此，细胞系衍生的细胞是指可以不与祖代细胞或培养物准确一致，所述细胞系包括所述变体。

术语"异源的"涉及核酸序列如编码序列和控制序列，表示通常不连接在一起的序列，和/或通常不是特定的细胞具有的序列。因此，核酸构建物或载体的"异源"区域是在另一个核酸分子中或与另一个核酸分子相连的核酸节段，而在自然中与所述另外的分子无关。例如，核酸构建物的异源区域可以包括编码序列和非天然的编码序列侧翼序列。异源编码序列的另一个例子是编码序列本身是自然中不存在的构建物(例如，具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。同样地，本发明的目的认为用不是细胞中正常存在的构建物转化的细胞是异源的。等位基因的变异或自然发生的突变事件不会产生本文使用的异源DNA。

"编码序列"或"编码"特定蛋白的序列是，当处于合适的调节序列的控制下在体外或体内转录(在DNA的情况)和翻译(在mRNA的情况)成多肽的核酸序列。编码序列的边界是由5'未端(氨基)的起始密码子和3'末端(羧基)的终止密码子决定的。编码序列可以包括，但不限于，来自原核的或真核的mRNA的cDNA、来自原核的或真核的DNA的基因组DNA序列、甚至合成的DNA序列。转录终止序列通常是位于编码序列的3'端。"核酸"序列是指DNA或RNA序列。该术语包括合任何已知DNA和RNA碱基类似物的序列

术语DNA"控制序列"是指启动子序列、多聚腺苷酸信号、转录终止序列、上游调节区域、复制起点、内部核糖体进入位，是("IRES")、增强子等的集合，它们共同提供在受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译。不是所有的这些控制序列都需要存在，只要选定的编码序列在合适的宿主细胞中能够复制、转录并翻译。

本文使用的术语"启动子"通常意义是指包括DNA调节序列的核苷酸区域，其中所述调节序列是由能够结合RNA聚合酶和启动子下游(3’-方向)编码序列的转录的基因衍生来的。转录启动子包括"诱导型启动子"(有效连接启动子的多核苷酸序列表达是通过分析物、辅因子、调节蛋白等诱导的)和"组成型启动子"。

"有效连接"是指元件的排列，其中所描述的成分配置成得以执行它们通常的功能。因此，控制序列可操作地连接到编码序列能影响编码序列的表达。控制序列不需要与编码序列邻近，只要它们能控制编码序列的表达。因此例如，间插不可翻译但可转录的序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，仍然可以认为启动子序列是"有效连接"到编码序列。

"分离(的)"当就核苷酸序列而言，是指所述分子在基本上没有其它同型的生物学大分子的情况下存在。因此，"编码特定的多肽的分离的核酸分子"是指基本没有其它不编码所述多肽的核酸分子的核酸分子；但是所述分子可以包括一些对所述组分基本特征没有有害影响的其它碱基或部分。在整个申请中描述特定核酸分子中核苷酸序列的相应位置时，例如，当特定核苷酸序列描述成位于相对于另一序列的"上游"、"下游"、"3’"或"5’"或"编码"链中的位置，这是本领域通用的。

特定AAV多肽的"功能同系物"或"功能等同物"包括由天然多肽序列衍生的分子，以及以与参考AAV分子相似的方式发挥作用以达到需要结果的重组产生或化学合成的多肽。因此，AAV Rep68或Rep78功能同系物包括那些多肽的衍生物和类似物-包含内部或其氨基或羧基未端的单一或多个氨基酸添加、取代和/或缺失，只要保留完整的活性。

特定腺病毒核苷酸区域"功能同系物"或"功能等同物"包括由异源腺病毒血清型衍生的相似的区域、由另一个病毒或细胞来源的核苷酸区域、以及以与参考核苷酸区域相似方式发挥作用以达到预期结果的重组产生或化学合成的多核苷酸。因此，腺病毒VARNA基因区域或腺病毒E2a基因区域的功能同系物包含所述基因区域的衍生物和类似物一包括在该区域内单一的或多个核苷酸碱基的添加、取代和/或缺失，只要同系物保留以背景以丰可检测到的水平提供其固有的支持AAV病毒体产生的附属功能。

"强力输送系统"是指药物的任何非手动传递。本发明中，AAV的强力输送系统(CED)的实例可以通过输液泵或渗透泵来实现。下面有CED的更详细的描述。

术语"中枢神经系统"或"CNS"包括脊椎动物的大脑和脊髓的所有细胞和组织。因此，该术语包括但不限于神经元细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、脑脊髓液(CSF)、胞间隙、骨、软骨等。CNS的各区域与不同行为和/或功能相关。例如，大脑的基底神经节与运动功能，尤其是自主运动有关。基底神经节是由6对神经核组成:尾状核、壳核、苍白球、伏隔核、丘脑底部的核、以及黑质。尽管被内囊分开，但尾状核和壳核共有细胞结构学、化学和生理学特性，通常是称为纹状体。在帕金森病患者中退化的黑质提供主要的多巴胺能的输入基底神经节。

本文可交换的使用术语"对象"、"个体"或"患者"是指脊椎动物，优选哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于鼠科动物、猿、人、畜牧动物、运动动物和宠物。"有效量"是足够起到有益的或需要作用的剂量。有效量可以-次或多次给药、应用或剂量。

常规方法

本发明的基础是意外发现AAV载体介导的MANF基因传递以延迟方式逆转多巴胺能(DA)神经元的进行性退化，同时保存功能性黑质纹状体的通路。如在实施例中特别描述，帕金森病的可接受的动物模型接受表达HIS肽标记的MANF(AAV-MANFhis)或GFP(AAV-EGFP)的AAV载体注射到病变纹状体中。HIS免疫染色证明MANFhis可在中脑部位显著表达。在AAV-MANFhis组中，纹状体中酪氨酸羟化酶(TH)-阳性DA纤维的密度和SN中的TH阳性的神经元的数量比假手术组明显的增加。与假手术组相比，AAV-MANFhis组纹状体中多巴胺水平及其代谢物显著高于假手术组。AAV-MANFhis注射后观察到一致的解剖学的和生物化学的改变，显著的行为恢复。这些数据出乎意料地显示应用以AAV为基础的传递系统延迟传递的MANF基因即使是在进行性退化开始以后也是有效的。

因此，本发明提供治疗神经退行性疾病和其它神经损伤已经发生后的神经疾病的方法。在优选实施方案中，神经损伤是由于帕金森病或损害或非正常功能的多巴胺能的神经细胞。因此，本发明可以用于将编码MANF多肽的多核苷酸传递给患有任何严重神经退行性疾病的患者，包括但不限于，帕金森病(PD)、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化(ALS)、癫痫症、阿尔茨海默氏病等。此外，本发明可以用于将MANF传递给以下疾病患者:由于暂时的或永久的血流向部分神经系统的停止引起的神经损伤，如中风；或由于接触神经毒素引起的神经损伤，如癌症的化疗剂紫杉酵、顺式铂氨或长春花新碱和AIDS化疗剂ddI或ddC，以及慢性代谢性疾病引起的神经损伤，如糖尿病或肾功能疾病。

如上解释，MANF是可以由神经胶质细胞鉴别出或获得的蛋白质并具有神经营养的活性。更详细地说，MANF是多巴胺能的神经营养蛋白质，其特征部分在于它能增加黑质多巴胺能神经元的胚胎前体吸收多巴胺，此外它能促进副交感神经和交感神经细胞的存活。

中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derivedneurotrophic factor,MANF)是一种新型保守的神经营养因子，其结构和作用形式与传统的神经营养因子存在差异。MANF是由182个氨基酸组成的约20kDa蛋白质，其中包括由24个氨基酸组成的信号肽。MANF具有独特的三维结构，包含N端的saposin结构域和C端的螺旋-环-螺旋结构。MANF在哺乳动物体内表达广泛，特别是在神经系统中，MANF在大脑皮层、海马和小脑浦肯野细胞等部位相对高表达。同时，MANF作为一种分泌蛋白质，不仅具有保护和促进多巴胺能神经元修复的功能，对包括胰岛β细胞、心肌细胞、视网膜神经节细胞等其他细胞类型也具有保护作用。

已知人MANF多核苷酸和氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

AAV-传递MANF多核苷酸的功效可以用任何本领域已知的多种上述疾病的动物模型测试。例如，帕金森病的最广泛应用的动物模型通常通过给予毒素来复制多巴胺能神经元的神经退行性病变。单侧注射6-羟基多巴(6-OHDA)到小鼠或大鼠的纹状体中导致同侧纹状体和黑质致密部神经元损失，对侧半球很少改变。同样地，脱氧麻黄碱诱导的神经毒素导致多巴胺能神经元和5-羟色胺能神经元的神经退行性病变，本领域技术人员认为它与人类疾病紧密相连。治疗药物的功效可以通过应用脱水吗啡诱导旋转行为的行为结果来评价。另一个帕金森病模型是用神经毒素N-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)来构建。MPTP给予哺乳动物，如小鼠、大鼠和猴。将MPTP给予猴的结果是不仅损失黑质致密部和纹状体中的多巴胺能神经元和5-羟色胺能神经元，还在行为上与人帕金森病患者表现相似，如运动不能和姿势僵硬。参见例如，美国专利号6,362,319。

对比上述帕金森病的动物模型，许多近交品系小鼠的获得证明多巴胺能细胞数量是逐步下降的。例如，D2受体缺陷小鼠可以通过同源重组产生，其行为特征类似其患有帕金森病患者。

其它神经退行性疾病的动物模型，其可用于在除了PD外的神经退行性疾病的治疗中评价AAV传递MANF多核苷酸的治疗功效。

包含MANF编码序列的重组AAV病毒体可以应用以下充分描述的本领域公认的技术产生。野生型AAV和辅助病毒可以用于提供产生rAAV病毒体的必要的复制功能。或者，包含辅助功能基因的质粒结合一个众所周知的辅助病毒感染可用作复制功能来源。同样地，包含附属功能基因的质粒可以结合野生型AAV感染使用，以提供必要的复制功能。当与rAAV病毒体联合应用时，这三种方法都足以产生rAAV病毒体。本领域众所周知的其它方法也可以由技术人员用来产生rAAV病毒体。

在本发明的优选实施方案中，三重转染方法用于产生rAAV病毒体，因为该方法不需要应用传染性辅助病毒，在没有任何可检测的辅助病毒存在下，启动rAAV病毒体产生。这是通过三种载体用于rAAV病毒体的产生来实现:AAV辅助功能载体、AAV附属功能载体、以及AAV表达载体。但是本领域的技术人员意识到，这些载体编码的核酸序列可以以不同结合的两个或多个载体提供。如本文解释，AAV辅助功能载体编码"AAV辅助功能"序列(即rep和cap)，其反式作用用于生产性AAV复制和包衣壳。优选AAV辅助功能载体支持有效的AAV载体产生，不产生任何可检测的wtAAV病毒体(即，AAV病毒体包括功能性rep和cap基因)。AAV辅助功能载体的rep和cap基因可以由任何已知AAV血清型衍生，如上述解释。例如，AAV辅助功能载体可以具有由AAV-2衍生的rep基因和由AAV-6衍生的cap基因；本领域的技术人员可以意识到可能有其它rep和cap基因组合，限定特征是有能力支持rAAV病毒体产生。

附属功能载体编码核苷酸序列用于AAV赖以复制的非AAV衍生病毒和/或细胞功能(即"附属功能")。附属功能包括AAV复制需要的功能，包括但不限于与AAV基因转录活化有关的部分、时期专一的AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成、以及AAV衣壳的组装。以病毒为基础的附属功能可由任何众所周知的辅助病毒如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒1型)和牛痘病毒衍生。在优选实施方案中，使用附属功能质粒pLadeno5。该质粒提供用于AAV载体产生的全套腺病毒附属功能，但是缺少形成能复制的腺病毒必须的成分。

为了更进一步理解本发明，下面提供了关于重组AAV表达载体、AAV辅助和附属功能、包含AAV病毒体的组合物、以及病毒体的传递的更详细的讨论。

重组AAV表达载体

重组AAV(rAAV)表达载体应用已知技术构建，以便至少提供在转录方向上有效连接成分、控制元件(包括转录起始区域)、目的MANF多核苷酸以及转录终止区域。控制元件选择在哺乳动物肌肉细胞中有功能的。包含有效连接成分的最终构建物以功能性AAV ITR序列为边界(5'和3')。

AAV ITR区域的核苷酸序列是己知的。。用于本发明载体的AAV ITR不需要有野生型核苷酸序列，并且是可以改变的，例如，核苷酸的插入、缺失或取代。此外，AAV ITR可由任何多种AAV血清型衍生，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8和AAV-9等。此外，AAV表达载体侧接选择核苷酸序列的5'和3'ITR的不必一致或由相同的AAV血清型分离株衍生，只要它们功能是想要的，即允许由宿主细胞基因组或载体切除和挽救在目的序列，并且当AAV Rep基因产物存在于细胞中时允许整合DNA分子进入到受体细胞基因组。

用于AAV载体的合适的MANF多核苷酸分子的大小是546bp。选定的多核苷酸序列与指导在患者体内转录或其表达的控制元件有效连接。所述控制元件可以包括通常与选择基因连接的控制序列。或者，可以使用异源控制序列。可用的异源控制序列通常包括那些由哺乳动物或病毒基因的编码序列衍生的。实例包括，但不限于，神经元-特异性烯醇化酶启动子、GFAP启动子、SV40早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(从Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子区域(CMVIE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、合成启动子、杂合启动子等。此外，本文也使用由非病毒基因衍生的序列，如鼠科的金属硫蛋白基因。所述启动子序列可由例如Stratagene市售获得(San Diego,CA)。

具有以AAV ITR为边界的目的MANF多核苷酸分子的AAV表达载体可以通过直接插入选定的序列到从其切除AAV主要可读框(ORF)处的AAV基因组中。AAV基因组的其它部分也可以缺失，只要保留足够部分ITR以允许复制和包装功能。所述构建物可以应用本领域众所周知的技术来设计。

或者，AAV ITR可以由病毒基因组或由包含它的AAV载体切出获得，所述AAV载体包含相同的和应用标准连接技术将其与存在于另一个载体的选定核酸构建物的5'和3'端融合，例如那些描述于Sambrook等，同上的技术。例如，可在20mM Tris-ClpH7.5、10mMMgCl₂、10mM DDT、33μg/ml BSA、10mM-50mM NaCl，和40μM ATP、0.01-0.02(Weiss)单位T4DNA连接酶在0℃(用于"粘性末端"连接)或1μM ATP、0.3-0.6(Weiss)单位T4DNA连接酶在14℃(用于"平端"连接)下完成连接。分子间的"粘性末端"连接通常是在30-100μg/ml总DNA浓度(5-10nM总的终浓度)下进行。其中特别介绍了几种AAV载体，其可从美国典型培养物保藏中心("ATCC")中可获得，保藏号为53222、53223、53224、53225和53226。

此外，嵌合基因可以合成产生，包括安排一个或多个选定的核酸序列5'和3'端的AAVITR序列。可以使用哺乳动物肌肉细胞中用于表达嵌合基因序列的优选密码子。完全嵌合序列由通过标准方法制备的重叠寡聚核苷酸装配。

关于本发明的目的，用于从AAV表达载体产生rAAV病毒体的合适的宿主细胞包括微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，它们可以是或已经是用作异源DNA分子的受体。该术语包括已经转染的原始细胞的子代。因此，本文使用的"宿主细胞"通常是指经外源DNA序列转染的细胞。稳定的人细胞系的细胞HEK293(通过例如美国典型培养物保藏中心保藏号ATCC CRL1573容易获得)是本发明的实践中优选的。详细地说，人细胞系HEK293是用腺病毒5型DNA片段转化的人胚肾细胞系，并表达腺病毒E1a和E1b基因。所述HEK293细胞系是容易转染的，并提供特别方便的产生rAAV病毒体的平台。

AAV辅助功能

包含上述AAV表达载体的宿主细胞必须有能力提供AAV辅助功能，为了复制和使侧接AAV ITR的核苷酸序列包衣壳以产生rAAV病毒体。AAV辅助功能通常是可以表达产生AAV基因产物的AAV-衍生的编码序列，AAV基因产物再反式作用用于生产性AAV复制。本文使用AAV辅助功能以补充AAV表达载体失去的必要的AAV功能。因此，AAV辅助功能包括一个或两个AAV主要ORF，称作Rep和cap编码区域，或其功能性同系物。"AAV Rep编码区域"是指本领域公认的编码复制蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的AAV基因组的区域。这些Rep表达产物拥有多种功能，包括识别、结合并切断AAV DNA复制的起始点、DNA解旋酶活性和调节AAV(或其它异源的)启动子转录。Rep表达产物共同需要用于复制AAV基因组。

"AAV cap编码区域"是指本领域意公认的编码衣壳蛋白VPl、VP2和VP3或其功能性同系物的AAV基因组的区域。这些Cap表达产物提供用于包装病毒基因组共同需要的包装功能。关于AAV cap编码区域的描述参见例如，Muzyczka,N.和Kotin，R.M.(同上)。

AAV辅助功能通过用AAV辅助构建物在用AAV表达载体转染宿主细胞之前或同时导入宿主细胞。因此，AAV辅助构建物提供至少瞬时表达AAV Rep和/或cap基因以补充失去的生产性AAV感染必须的AAV功能。AAV辅助构建物缺少AAV ITR并且不能自我复制和包装。

这些构建物可以是质粒、噬茵体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒体的形式。

AAV表达载体和AAV辅助构建物可以构建成包含一个或多个可随意选择的标记。合适的标记包括当细胞培养在合适的选择性培养基中，使用包含可选择标记的核酸构建物转染的细胞赋予抗生素抗性或敏感性、赋予颜色、荧光或改变其抗原特性的基因。在本发明的实践中可用的多种可选择的标记基因包括潮霉素B抗性基因(编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH))，通过赋予抗G418抗性可以筛选哺乳动物细胞(可由Sigma获得，St.Louis,Mo.)。本领域的技术人员知道其它合适的标记。

AAV附属功能

宿主细胞(或包装细胞)必须也是具有提供非AAV-衍生功能或"附属功能"的能力，生产rAAV病毒体。附属功能是非AAV-衍生的病毒和/或细胞的功能，依靠该功能AAV可以复制。因此，附属功能至少包括那些AAV复制需要的非AAV蛋白质和RNA，包括那些涉及AAV基因转录的活化、时期专一的AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物的合成和AAV衣壳装配。以病毒为基础的附属功能可以由任何已知的辅助病毒衍生的。具体地说，附属功能可以通过本领域技术人员已知的方法导入并继而在宿主细胞中表达。通常，附属功能通过用无关的辅助病毒感染宿主细胞来提供。已知许多合适的辅助病毒，包括腺病毒；疱疹病毒如单纯疱疹病毒1和2型；和牛痘病毒。本文还使用非病毒附属功能，例如通过应用任何不同的已知因子使细胞同步提供的那些。

或者，附属功能可以应用以上定义的附属功能载体提供。参见例如，美国专利号6,004,797和国际公开号WO 01/83797。提供附属功能的核酸序列可以由天然来源获得，如由腺病毒体的基因组获得，或应用本领域已知的重组或合成方法来构建。如上解释，证明附属辅助功能不需要完全补充腺病毒基因。具体地说，没有DNA复制和晚期基因合成能力的腺病毒突变体证明允许AAV复制。同样，在E2B和E3区域内的突变证明支持AAV复制，表明E2B和E3区域可能不涉及提供附属功能。

特别优选的附属功能载体包括腺病毒VA RNA编码区域、腺病毒E4ORF6编码区域、腺病毒E2A 72kD编码区域、腺病毒E1A编码区域、缺少完整的E1B 55k编码区域的腺病毒E1B区域。所述载体描述于国际公开号WO 01/83797。

作为用辅助病毒感染宿主细胞或用附属功能载体转染宿主细胞的结果，附属功能表达反式激活AAV辅助构建物以产生AAV Rep或Cap蛋白。Rep表达产物从AAV表达载体中除去重组DNA(包括目的DNA)。Rep蛋白还用于复制AAV基因组。表达的Cap蛋白组装成衣壳，并将重组AAV基因组包装到所述衣壳中。因此，接着生产性AAV复制，并将DNA包装成rAAV病毒体。

重组AAV复制后，rAAV病毒体可用多种常规的纯化方法从宿主细胞中纯化，例如，柱层析、CsCl梯度等。例如，可以使用多个柱纯化步骤，如通过阴离子交换柱、亲合柱和/或阳离子交换柱纯化。例如，腺病毒可通过加热到大约60℃如20分钟或更长时间来灭活。由于AAV走对热非常稳定的，而辅助腺病毒是热不稳定的，所以这样的处理仅对辅助病毒有效的灭活。所得的包括目的MANF核苷酸序列的rAAV病毒体之后可以利用下这技术用于基因传递。

组合物

组合物包括足够的遗传物质以生产治疗有效量的目的MANF，即足够减少或改善所述疾病的症状的量或足够获得想要的益处的量。该组合物也包含药学上可接受的赋形剂。所述赋形剂包括任何其本身对接受所述组合物的个体不产生有害抗体的药用物质，并且使用时可以没有不适当的毒性。药学上可接受的赋形剂包括，但不限于，山梨糖醇、任何不同TWEEN化合物、液体例如水、盐水、甘油和乙醇。药学上可接受的盐可以包括，例如无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；有机酸盐如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。此外，辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物等，可以存在于所述介质中。

一个特别有用的制剂包括重组AAV病毒体和一个或多个二羟基的或多羟基的醇，以及任选去污剂如山梨聚糖醋。根据本说明书的教导，本领域技术人员是显而易见的是，可以经验性确定必须加入的病毒载体的有效量。有代表性的剂量在下面详述。在治疗过程中可以一剂性、连续或间断地给药。测定最有效的平均值和给药剂量的方法是本领域技术人员众所周知的，并随病毒载体、治疗的组合物、靶细胞、以及患者而改变。可以用治疗医师选择的剂量水平和模式来完成单次或多次给药。

可以理解通过传递重组病毒体表达一个以上转基因。或者，如本文描述也可以将分别表达一个或多个不同转基因的载体传递到CNS。此外，还企图通过本发明的方法传递所述病毒载体联合其它合适的组合物和疗法。例如，可以通过共同给予表达MANF到CNS(例如，到纹状体尾状核或壳核)中的重组AAV病毒体和其它药物如AADC、多巴胺前体(例如，左旋多巴)、多巴胺合成抑制剂(例如，卡比多巴)、多巴胺代谢抑制剂(例如，MaOB抑制剂)、多巴胺兴奋剂或拮抗剂可以先于或接着或同时与编码MANF的重组病毒体给药来治疗帕金森病病。例如，编码AADC的基因可以与编码MANF的基因一起给药到CNS。同样，左旋多巴和任选的卡比多巴可系统给药。这样，显然通过能将左旋多巴转换成多巴胺的AADC可恢复PD患者中自然失去的多巴胺。转基因在诱导启动子的控制下，为了调节所述转基因的表达可以给予某些系统传递的化合物如幕黎甾酮、松甾酮、四环素或aufin。

AAV病毒体的传递

应用体内或体外(也称活体外)转导技术可以将重组AAV病毒体导入CNS细胞以治疗已经存在的神经元损伤。如果在体外转导，想要的受体细胞可以从患者中取出，用rAAV病毒体转导并再引入到患者。或者，可以使用同系或异种细胞，那些细胞在患者中不会产生不适当的免疫反应。此外，神经祖细胞可以在体外转导并随后传递到CNS。

描述了合适的转导细胞传递和导入到患者的方法。例如，通过混合重组AAV病毒体与细胞以在合适的介质中转导，细胞可在体外转导，包含目的DNA的那些细胞可以应用常规技术如DNA印迹和/或PCR，或应用可检测的标记来筛选。然后可以将转导细胞配制到药用组合物中，如上所述，通过如下所述的多种技术将所述组合物以一个剂量或多剂量导入到患者中。

对于体内传递，可将rAAV病毒体配制到药用组合物中，并且可以直接以规定方式给予一个剂量或多个剂量。治疗有效量可包括大约从10⁶到10¹⁵的rAAV病毒体，更优选10⁷到10¹²，甚至更优选大约10⁸到10¹⁰的rAAV病毒体(或病毒基因组，也称"vg")，或在这些范围内的任何值。通常，可传递0.01-1ml的组合物，优选0.01-约0.05ml，优选大约0.05-0.3m1，如0.08、0.09、0.1、0.2等，在这些范围内的任何整数的组合物都可传递。

体外转导的重组AAV病毒体或细胞可通过应用本领域已知的神经外科学的技术如立体定位注射，用针、导管或相关的装置注射直接传递到CNS或大脑，例如脑室区，以及纹状体(例如，纹状体的尾状核或壳核)，脊髓和神经肌肉连接，或小脑小叶。由于事实上立体定位坐标不能正好对准注射位点，所以小脑注射是复杂的；在小脑小叶的大小以及它们的完全三维方向上存在着动物与动物的变异。因此，霍乱毒素亚单位b(CTb)可以用于确定注射的精确位置，并揭示注射位点可转导的神经元的集合体。可注射到分子层，浦肯野细胞层，颗粒细胞层和小脑活树的白质，但是不延伸到深层小脑核。

给药到CNS的一种模式使用强力输送系统(CED)。这样，可将重组病毒体传递到大脑大区域的许多细胞。此外，传递的载体有效地在CNS细胞(例如，神经元或神经胶质细胞)中表达转基因。任何强力输送装置可适用于病毒载体的传递。在优选实施方案中，该装置是渗透泵或输液泵。渗透泵和输液泵可由多个供应商处市售获得，(例如Alzet公司、Hamilton公司、Alza,Inc.、Palo Alto、California)。病毒载体通常通过下面的CED装置传递。将导管、套管或其它注射装置插入到选定患者的CNS组织中。本领域的技术人员可以容易地测定适合作为靶的CNS的常规区域。例如，当传递AAV-MANF来治疗PD时，纹状体是大脑的靶合适区域。例如从ASI Instruments.Warren,MI可获得立体定位图和定位装置。也可用由患者大脑的CT和/或MRI成像获得的解剖图来完成定位，以帮助操纵注射装直到选定的靶位点。此外，因为本文描述的方法可以实施使得相关的较大大脑区域接受病毒载体，需要较少的灌输套管。因此外科的并发症与穿入次数有关，这个模式的传递系统比常规传递技术所见的副作用减少。关于CED传递的详细描述参见美国专利号6,309,6340。

在PD的情况下，传递给证明存在黑质纹状体多多巴胺(DA)去神经的患者，例如中度到重度去神经。通常当患者表现出可见的PD症状时，就发生了中度到重度去神经，至少大约60％-70％到超过90％的现有的神经元已经失去。因此，"中度"去神经是指失去至少大约60％-70％的神经元，而"重度"去神经是指失去至少大约90％的神经元。

一种神经元失去的测量是通过CNS中多巴胺活性的水平。因此，"中度"去神经是指一个或两个纹状体半球中失去至少大约60％-70％的多巴胺含量，而"重度"去神经的反应是一个或两个纹状体半球中至少失去大约90％。为了测量多巴胺量，给予患者标记的示踪物。标记的探测说明多巴胺的活性。标记的示踪物优选可在整体动物的大脑中体内观察到的，例如，正电子放射X光断层(PET)扫描或其它CNS成像技术。用于选择示踪物的合适的标记包括任何可由光谱、光化学、免疫化学、电、光学或化学方法检测的组分。本发明有用的标记包括放射标记(例如，¹⁸F、³H、¹²⁵I、³⁵S、³²P等)、酶、比色标记、荧光染色等。在优选实施方案中，标记¹⁸F和DOPA用于多巴胺活性的量化。因此，在这个实施方案中，神经元丢失程度用[¹⁸p]-氟-DOPA作为示踪物来测量。另一个多巴胺活性的测量应用标记示踪物6-[¹⁸F]-氟-L-m-酪氨酸(¹⁸F-FMT)。FMT与利用多巴胺的细胞结合。参见例如，美国专利号6,309,634测量体内多巴牍含量的方法。

神经元的再生和由此疾病的治疗也可以通过如上所述测量多巴胺的水平来监测。本文使用的疾病的治疗是指减轻或消除所述疾病的症状，以及神经元的再生。因此，可以由比较治疗前后的多巴胺的水平来衡量神经元再生。或者，用可以看到的疾病症状作为治疗的测量指标。

神经组织分析和生化分析

组织可由治疗的患者获得，并用常规的程序来处理坪价神经元退化、再生和分化。在本发明中，它可用于评价例如，多种纹状体和黑质(SN)的细胞，例如检测纹状体和SN的冠状切片。随着时间的过去进行测量可以表明远离载体给药位点的细胞改正的增加。

多巴胺及其代谢物HVA和DOPAC的水平可以应用以前描述的高效液相层析法HPLC)来测定(Shen，Y.,Hum.Gene Ther.(2000)11:1509-1519)。尤其是如果载体编码可分泌型MANF，也可收集CSF并用于评价蛋白质水平或酶活性。

也可通过腹膜内注射脱水吗啡-HCl测试患者的周期性转动行为。

本发明提供的重组腺相关病毒载体及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1重组AAV载体的设计与构建

本发明涉及外源MANF基因在体内的表达，为区分外源导入基因和内源MANF，区别转基因表达的MANF和内源MANF对评价基因传递的作用是必要的。本实施例将HIS标记至重组AAV载体目标基因MANF，重组AAV载体如下构建(图1)。

AAV载体质粒pAAV2-MANF-HIS是由p AAV-LacZ粒衍生的。在AAV-2基因组的反向未端重复区(ITR)之间，用人巨细胞病毒(CMV)启动子启动转录，将用HIS标签(SEQ ID No.3)标记了人MANF羧基未端基因序列插入到这个质粒中。获得AAV表达载体序列如SEQ ID No.4所示。

AAV辅助功能载体包括两个主要AAV可读框(ORF)，rep和cap即编码Rep和Cap表达产物的质粒pAAV/Package。AAV辅助构建物通常用于提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达来补充失去的细胞裂解性AAV复制必须的AAV功能；但是辅助构建物缺少AAV ITR并且不能自我复制和自我包装。

AAV附属功能质粒pAAV/Help包括腺病毒VA RNA编码区域、腺病毒E4 ORF6编码区域、腺病毒E2A 72kD编码区域、腺病毒E1A编码区域、和缺少完整E1B 55k区域的腺病毒E1B编码区域。

pAAV2-MANF-HIS同辅助质粒和辅属质粒共转染293细胞，转染72小时后，收获细胞和上清。细胞通过三次冷冻和解冻循环使细胞溶解，离心后上清与原上清合并。用交联AAV-8壳蛋白抗体的柱材通过亲和层析纯化病毒，通过定量DNA斑点杂交以及荧光定量PCR分析来评价病毒效价。

SEQ ID No.1.人Manf序列：

ATGAGGAGGATGTGGGCCACGCAGGGGCTGGCGGTGGCACTGGCTCTGAGCGTGCTGCCGGGCAGCCGGGCGCTGCGGCCGGGCGACTGCGAAGTTTGTATTTCTTATCTGGGAAGATTTTACCAGGACCTCAAAGACAGAGATGTCACATTCTCACCAGCCACTATTGAAAACGAACTTATAAAGTTCTGCCGGGAAGCAAGAGGCAAAGAGAATCGGTTGTGCTACTATATCGGGGCCACAGATGATGCAGCCACCAAAATCATCAATGAGGTATCAAAGCCTCTGGCCCACCACATCCCTGTGGAGAAGATCTGTGAGAAGCTTAAGAAGAAGGACAGCCAGATATGTGAGCTTAAGTATGACAAGCAGATCGACCTGAGCACAGTGGACCTGAAGAAGCTCCGAGTTAAAGAGCTGAAGAAGATTCTGGATGACTGGGGGGAGACATGCAAAGGCTGTGCAGAAAAGTCTGACTACATCCGGAAGATAAATGAACTGATGCCTAAATATGCCCCCAAGGCAGCCAGTGCACGGACCGATTTG

SEQ ID No.2.人Manf氨基酸序列：

MRRMWATQGLAVALALSVLPGSRALRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATIENELIKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL

SEQ ID No.3:His标签序列

HHHHHH

SEQ ID No.4:AAV表达载体序列

GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACTTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCCCGGCTAGAGCTTCCCGGGGGTACCGAATTCGTCGAATGAGGAGGATGTGGGCCACGCAGGGGCTGGCGGTGGCACTGGCTCTGAGCGTGCTGCCGGGCAGCCGGGCGCTGCGGCCGGGCGACTGCGAAGTTTGTATTTCTTATCTGGGAAGATTTTACCAGGACCTCAAAGACAGAGATGTCACATTCTCACCAGCCACTATTGAAAACGAACTTATAAAGTTCTGCCGGGAAGCAAGAGGCAAAGAGAATCGGTTGTGCTACTATATCGGGGCCACAGATGATGCAGCCACCAAAATCATCAATGAGGTATCAAAGCCTCTGGCCCACCACATCCCTGTGGAGAAGATCTGTGAGAAGCTTAAGAAGAAGGACAGCCAGATATGTGAGCTTAAGTATGACAAGCAGATCGACCTGAGCACAGTGGACCTGAAGAAGCTCCGAGTTAAAGAGCTGAAGAAGATTCTGGATGACTGGGGGGAGACATGCAAAGGCTGTGCAGAAAAGTCTGACTACATCCGGAAGATAAATGAACTGATGCCTAAATATGCCCCCAAGGCAGCCAGTGCACGGACCGATTTGCATCACCATCACCATCATTGATCGACAGATCTGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTAT

实施例2体外表达AAV-MANFhis

为了检测体外表达的MANFhis融合蛋白，将HEK293和Hep G2细胞用AAV MANFhis或AAV-EGFP转导(5000载体基因组拷贝数/细胞)。转染后36小时，细胞匀浆，通过荧光定量PCR检测细胞中产生的MANF mRNA转录水平。在AAV MANFhis转导的HEK293和Hep G2细胞的裂解产物中检测到MANF mRNA转录水平提高，而在没有感染的细胞中没有发现MANF mRNA转录水平变化(图3、表1)。

表1图3原始数据

注：**表示实验组和control组相比差异极其显著(P<0.01)。

实施例3在黑质纹状体中表达MANFHIS

在AAV-MANFHIS注射2、4、8和20周后检测中脑MANFHIS转基因的表达。腹腔注射2％的戊巴比妥钠将大鼠麻醉后固定于脑立体定位仪上。将双侧耳杆尖端插入外耳道，并使得头部两侧位于水平位置。常规消毒后，切开头皮，剥离骨膜，参照Paxinos等所著的大鼠脑立体定位图谱，确定右侧黑质致密部(substanianigta parscompacta,SNc)坐标为前囟后5.5mm、矢状缝右侧2.2mm、硬脑膜下8.2mm。颅骨钻小心钻透颅骨，按照坐标将微量注射器垂直入颅，缓慢进针达到预定位置。利用微量注射泵将1x10⁹、3x10⁹、1x10¹⁰、3x10¹⁰四个滴度的AAV-MANFHIS(体积分别为1μl、3μl、1μl、3μl)注入S-D大鼠右侧黑质致密部。注射速度为1μl/min，留针10min后缓慢退针。常规缝合伤口后，置于加热垫上至大鼠苏醒。AAV-MANFHIS注射后两周，将大鼠进行灌流、固定、取脑。经20％及30％蔗糖脱水后进行全脑冰冻切片，切片厚度为10μm。将脑组织切片进行序列挑片，常温晾干后加入免疫染色封闭液，室温封闭1h。弃去封闭液，加入针对HIS标签的一抗，4℃孵育过夜。次日，弃去一抗，用PBS清洗3次，每次10min。加入荧光二抗后，置于37℃恒温水浴箱中孵育1h。弃去二抗，用PBS洗涤3次，每次5min。滴加含有DAPI的封片液，封片后利用激光共聚焦显微镜进行观察、拍照。结果显示目标基因均在注射测的黑质纹状体表达，其余脑区未见显著表达(图4)且在对侧未注射黑质纹状体区也未见表达。

实施例4恢复中脑黑质纹状体多巴胺神经元活性

如实施例3所述方法将3x10¹⁰滴度的AAV-MANFHIS注入大鼠的右侧黑质致密部，注射液体量为3μl。对照组于右侧黑质致密部注入3μl PBS。2周后，利用脑立体定位注射技术将20μg 6-OHDA注入右侧纹状体区，坐标为前囟后0mm、矢状缝右侧3.5mm、硬脑膜下5.0mm。注射速度为1μl/min，留针10min后缓慢退针。3周后将大鼠进行灌流、固定、取脑、切片。将脑组织切片室温晾干后加入封闭液，室温封闭1h后弃去封闭液，加入针对含有抗TH抗体的一抗稀释液，4℃孵育过夜。次日，弃去组织上液体，使用PBS清洗3次，每次10min。加入荧光并置于37℃恒温水浴箱中孵育1h。弃去组织上液体后用PBS洗涤3次，每次5min。滴加含有DAPI的封片液，封片后利用激光共聚焦显微镜进行观察、拍照。将双侧黑质区的TH阳性细胞进行形态学观察并计数。结果显示：在6-OHDA损伤组及注射AAV空载组，6-OHDA注射侧的TH阳性细胞数较对侧显著减少；而AAV-MANFHIS组的注射侧TH阳性细胞数较6-OHDA损伤组及AAV空载组显著增多，与未损伤侧的TH阳性细胞数相接近。(图5、表2)

表2图5原始数据

注：△△表示6－OHDA与Control组相比差异极其显著(P<0.01)，**表示

6-OHDA+AAV-MANF与6-OHDA组相比差异极其显著(P<0.01)。

实施例5对行为学的恢复

如实施例3所述方法将3x10¹⁰滴度的AAV-MANFHIS注入大鼠的右侧黑质致密部，注射液体量为3μl。对照组于右侧黑质致密部注入3μlPBS。2周后，利用脑立体定位注射技术将20μg 6-OHDA注入右侧纹状体区。注射3周后，利用转棒仪记录大鼠落棒的时间，对大鼠进行行为学检测。结果表明：模型组大鼠的在棒时间较对照组显著减少，提示单侧纹状体区注射6-OHDA可显著降低大鼠的运动能力；AAV空载组大鼠的在棒时间较模型组未见明显增加，运动能力较模型组未见显著改善；AAV-MANFHIS注射组大鼠的在棒时间较AAV空载组显著增加，提示AAV-MANFHIS的黑质注射可有效提高大鼠的行为学功能。(图6、表3)

表3图6的原始数据

注：##表示6－OHDA与Control组相比差异极其显著(P<0.01)，**表示6-OHDA+AAV-MANF与6-OHDA组相比差异极其显著(P<0.01)。

实施例6目标基因的组织特异性表达

为研究目标基因是否有非特异的表达与扩散，通过抗TH、GFAP和MBP抗体分别对多巴胺神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞进行复染。如实施例3所述方法将3x10¹⁰滴度的AAV-MANFHIS注入大鼠的右侧黑质致密部，2周后进行灌流、固定、取材、切片。将脑组织切片室温晾干后加入封闭液，室温封闭1h后弃去封闭液，分别加入针对含有抗HIS、TH、GFAP和MBP抗体的一抗稀释液，4℃孵育过夜。次日，弃去组织上液体，使用PBS清洗3次，每次10min。加入荧光二抗并置于37℃恒温水浴箱中孵育1h。弃去组织上液体后用PBS洗涤3次，每次10min。滴加含有DAPI的封片液，封片后利用激光共聚焦显微镜进行观察、拍照。结果显示：HIS与TH存在细胞内共定位，而与GFAP、MBP未见共定位现象。提示MANFHIS只在黑质区的多巴胺能神经元内表达，星形胶质细胞、少突胶质细胞内未见表达(图7)。

实施例7衣壳蛋白的组织分布

为研究AAV衣壳蛋白是否存在组织分布扩散的问题，本发明利用AAV8衣壳蛋白抗体对心、脾、肺、肾等主要组织进行了免疫组化染色。结果表明注射病毒组与注射PBS组向比较未发现显著差异(图8)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海市同济医院

<120> 重组腺相关病毒载体及其应用

<130> MP1808648

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 546

<212> DNA

<213> 人Manf(Human Manf sequence)

<400> 1

atgaggagga tgtgggccac gcaggggctg gcggtggcac tggctctgag cgtgctgccg 60

ggcagccggg cgctgcggcc gggcgactgc gaagtttgta tttcttatct gggaagattt 120

taccaggacc tcaaagacag agatgtcaca ttctcaccag ccactattga aaacgaactt 180

ataaagttct gccgggaagc aagaggcaaa gagaatcggt tgtgctacta tatcggggcc 240

acagatgatg cagccaccaa aatcatcaat gaggtatcaa agcctctggc ccaccacatc 300

cctgtggaga agatctgtga gaagcttaag aagaaggaca gccagatatg tgagcttaag 360

tatgacaagc agatcgacct gagcacagtg gacctgaaga agctccgagt taaagagctg 420

aagaagattc tggatgactg gggggagaca tgcaaaggct gtgcagaaaa gtctgactac 480

atccggaaga taaatgaact gatgcctaaa tatgccccca aggcagccag tgcacggacc 540

gatttg 546

<210> 2

<211> 182

<212> PRT

<213> 人Manf(Human Manf sequence)

<400> 2

Met Arg Arg Met Trp Ala Thr Gln Gly Leu Ala Val Ala Leu Ala Leu

1 5 10 15

Ser Val Leu Pro Gly Ser Arg Ala Leu Arg Pro Gly Asp Cys Glu Val

20 25 30

Cys Ile Ser Tyr Leu Gly Arg Phe Tyr Gln Asp Leu Lys Asp Arg Asp

35 40 45

Val Thr Phe Ser Pro Ala Thr Ile Glu Asn Glu Leu Ile Lys Phe Cys

50 55 60

Arg Glu Ala Arg Gly Lys Glu Asn Arg Leu Cys Tyr Tyr Ile Gly Ala

65 70 75 80

Thr Asp Asp Ala Ala Thr Lys Ile Ile Asn Glu Val Ser Lys Pro Leu

85 90 95

Ala His His Ile Pro Val Glu Lys Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys

100 105 110

Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser

115 120 125

Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu

130 135 140

Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr

145 150 155 160

Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala

165 170 175

Ser Ala Arg Thr Asp Leu

180

<210> 3

<211> 6

<212> DNA

<213> His标签序列(His tag sequence)

<400> 3

hhhhhh 6

<210> 4

<211> 1516

<212> DNA

<213> AAV表达载体序列(AAV expression vector sequence)

<400> 4

gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt attttacggt aaactgccca cttggcagta 240

catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300

cctggcatta tgcccagtac atgactttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360

tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420

agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480

tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540

aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 600

gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc 660

gatccagcct ccccggctag agcttcccgg gggtaccgaa ttcgtcgaat gaggaggatg 720

tgggccacgc aggggctggc ggtggcactg gctctgagcg tgctgccggg cagccgggcg 780

ctgcggccgg gcgactgcga agtttgtatt tcttatctgg gaagatttta ccaggacctc 840

aaagacagag atgtcacatt ctcaccagcc actattgaaa acgaacttat aaagttctgc 900

cgggaagcaa gaggcaaaga gaatcggttg tgctactata tcggggccac agatgatgca 960

gccaccaaaa tcatcaatga ggtatcaaag cctctggccc accacatccc tgtggagaag 1020

atctgtgaga agcttaagaa gaaggacagc cagatatgtg agcttaagta tgacaagcag 1080

atcgacctga gcacagtgga cctgaagaag ctccgagtta aagagctgaa gaagattctg 1140

gatgactggg gggagacatg caaaggctgt gcagaaaagt ctgactacat ccggaagata 1200

aatgaactga tgcctaaata tgcccccaag gcagccagtg cacggaccga tttgcatcac 1260

catcaccatc attgatcgac agatctgcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg 1320

ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 1380

cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 1440

gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 1500

atgcggtggg ctctat 1516

Claims (13)

1.重组腺相关病毒载体，其特征在于，包含：

I、具有编码星形胶质源性神经营养因子多肽的核苷酸序列；

II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

III、与如I所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得多肽序列为星形胶质源性神经营养因子的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；

IV、如I、II或III所示序列的互补序列。

2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体包括:AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8或AAV9。

3.如权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述核苷酸序列还包括位于5’位而且符合编码MANF多肽序列的读框的分泌序列。

4.如权利要求3所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述分泌序列为病毒启动子，所述病毒启动子包括MLP、CMV或RSV LTR。

5.如权利要求1至4任一项所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，包括表达载体，所述表达载体从5’到3’端依次包括：

V、上游ITR、CMV启动子、MANF基因和下游ITR；或

VI、上游ITR、CMV启动子、MANF基因、HIS序列、polyA和下游ITR。

6.如权利要求5所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，还包括辅助功能载体和/或附属功能载体；

所述辅助功能载体包括反式提供具有AAV复制和/或包装功能的蛋白Rep和/或Cap；

所述附属功能载体包括含有腺病毒VA RNA编码区域、腺病毒E4ORF6编码区域、腺病毒E2A 72kD编码区域、腺病毒E1A编码区域、缺少完整的E1B 55k编码区域的腺病毒E1B区域或辅助病毒Ad5的重要元件E1a、E1b、E2a或E4。

7.如权利要求1至6任一项所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述核苷酸序列具有VII、VIII、IX或X所示的核苷酸序列中任意一个：

VII、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

VIII、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

IX、与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得多肽序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；

X、如VII、VIII或IX所示序列的互补序列。

8.如权利要求5至7任一项所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述表达载体具有XI、XII、XIII或XIV所示的核苷酸序列中任意一个：

XI、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

XII、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

XIII、与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

XIV、如XI、XII或XIII所示序列的互补序列。

9.如权利要求1至8任一项所述的重组腺相关病毒载体在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述神经退行性疾病为帕金森病。

11.如权利要求9或10所述的应用，其特征在于，所述帕金森病包括轻度黑质纹状体多巴胺损伤和/或中度黑质纹状体多巴胺损伤。

12.如权利要求9至11任一项所述的应用，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体特异性作用于动物的神经元。

13.如权利要求9至12任一项所述的应用，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体特异性作用于动物的纹状体和/或黑质。