CN102083456B - 神经退行性障碍 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗神经病的方法和组合物。

Description

神经退行性障碍

交叉参考

本申请涉及2002年3月2日提交的序列号为10/102265的申请，其要求2001年3月20日提交的临时申请序列号60/277,516，本文中公开通过完整引入其作为参考，并根据35 USC§120和§119要求该申请的优先权。

发明背景

本发明涉及提高神经元的存活的组合物和方法。外周和中枢神经系统(分别为PNS和CNS)中的神经元的生长、存活和分化部分地依赖于源自目标的、旁分泌和自分泌的神经营养因子。相反，缺乏神经营养因子被认为在神经退行性疾病(如帕金森氏病、阿尔茨海默氏症和肌萎缩侧索硬化症(ALS或葛雷克氏症(Lou Gehrig′s disease))的病因中发挥作用。在神经细胞培养中，通过与星形胶质细胞共培养或通过提供由星形胶质细胞制备的条件培养基(CM)提供神经营养支持。与来自CNS的其他区域(如新纹状体(neostriatum)和大脑皮质)的星形胶质细胞相比，腹侧中脑源的星形胶质细胞在促进腹侧中脑多巴胺能神经元的存活方面发挥更大的效能。在21天体外(DIV)或更长时间的慢性中脑培养中，多巴胺能神经元的百分比从20％提高至60％，与星形胶质细胞的单层的增殖相一致。相反，在星形胶质细胞的增殖受到抑制的情况下，多巴胺能神经元而不是GABA能神经元几乎从5DIV的培养中消除。这些结果证明同型来源的星形胶质细胞对于邻近多巴胺能神经元的存活和发育的重要性，并表明中脑星形胶质细胞是中脑多巴胺能神经元的生理、旁分泌神经营养因子的可能的来源。

星形胶质细胞分泌促进神经细胞存活的分子的反复证明使得星形胶质细胞成为治疗神经退行性疾病的治疗的研究焦点。许多实验室试图分离星形胶质细胞源性神经营养因子，但受到重大技术问题的阻碍：血清是用于培养中原代星形胶质细胞最佳生长的培养基的关键组分，但血清的存在干扰了分泌到条件培养基中的因子的后续纯化。

因此，仍然需要涉及治疗神经病性疾病的组合物和方法。

发明概述

在本发明的各个方面中，提供了涉及治疗神经障碍的组合物和方法。在某些实施方式中，向受试者施用MANF和/或其生物功能片段以治疗神经障碍。在一个实施方式中，神经障碍是帕金森氏病。

在本发明的另一方面中，向受试者共同施用MANF和/或其生物功能片段与一种或多种治疗剂。在某些实施方式中，一种或多种治疗剂是神经营养因子。

在一个实施方式中，提供了用于提高黑质(substantia niagra)的GABA能神经末端的GABA释放的神经障碍治疗方法，包括向患有帕金森氏病的受试者施用有效量的MANF。在另一个实施方式中，治疗神经障碍的治疗方法包括向患有神经障碍的受试者施用有效量的MANF，导致拮抗谷氨酸对多巴胺神经元的兴奋性毒性(excitotoxic)作用。在进一步的实施方式中，神经障碍是帕金森氏病。

通过引用引入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用引入本文，如同各单个出版物、专利或专利申请具体和单独地表明通过引用引入。

附图说明

在所附的权利要求中详细地提出本发明的新特点。通过参考下面的详细说明(其给出了利用本发明的原理的说明性实施方式)和以下附图可以获得对于本发明的特点和优势的更好的理解：

图1说明苯异丙胺(aphetamine)给药之后大鼠的渐增的身体同侧转向行为；A＝VEH+VEH；B＝VEH+6OHDA；C＝GDNF+6OHDA；D＝MANF+6OHDA；E＝GDNF+VEH；F＝MANF+VEH。

图2说明在各种组织(包括成年和发育中的小鼠脑组织)中MANF1表达的RT-PCR分析。

发明详述

虽然本发明的优选实施方式中已被显示和描述，但对于本领域技术人员显而易见的是：这些实施方式只是以举例的方式来提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下容易想到许多变化、更改和替换。应该理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代方案可以用于实施本发明。下列权利要求意图限定本发明的范围，并从而涵盖这些权利要求及其等值范围内的方法和结构。

本发明一般涉及使用中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)提高神经元存活的组合物和方法。MANF是一种在体外选择性保护DA神经细胞并在体内纠正大脑一侧的多巴胺能神经元(DA)神经细胞退化造成的神经缺损的新的神经营养因子。MANF的作用表明，它可用于治疗帕金森氏病(PD)。此外，MANF在腹侧中脑(在PD中死亡的DA神经元所在的同一大脑区域)高水平地表达。MANF也增加黑质(substantia nigra)中GABA能神经末端的GABA释放。GABA拮抗谷氨酸对于DA神经元的兴奋性毒性作用。本文的公开表明，在PD患者的大脑中存在MANF的两个靶标：1)DA神经元的细胞体；2)黑质中的突触前GABA能神经末端。

在一个方面中，本发明特征在于治疗患有神经系统疾病或障碍的患者的方法。该方法包括向患者施用促进多巴胺能神经元存活量的基本上纯化的MANF多肽的步骤。

在第二方面中，本发明特征在于防止哺乳动物中的多巴胺能神经细胞死亡的方法。这种方法包括向哺乳动物施用促进多巴胺能神经元存活量的基本上纯化的MANF多肽。

在第三方面中，将细胞移植到哺乳动物(例如，人)的神经系统中的方法包括：(i)将细胞移植到哺乳动物的神经系统中；和(ii)在移植细胞前的2到4小时至移植细胞后的2到4小时的时间窗口内，向哺乳动物施用促进多巴胺能神经元存活量的MANF多肽。

在第四方面中，本发明特征在于将细胞移植到哺乳动物(例如，人)的神经系统中的另一种方法。该方法包括如下步骤：(a)将细胞与MANF多肽接触；和(b)将步骤(a)的细胞移植到哺乳动物的神经系统中。在一个实施方式中，需要步骤(a)和步骤(b)在彼此相差4个小时之内进行。

如本文所证明的，通过施用MANF多肽增强了多巴胺能神经元的保持、存活或生长。在患有帕金森氏病的患者中中脑的多巴胺能神经元死亡。因此，本发明提供了对于帕金森氏病的治疗方法。此外，本发明包括MANF多肽在治疗其中存在或预期有多巴胺能神经元损失的神经系统的障碍或疾病中的用途。

MANF涉及多巴胺能神经元存活的发现使得MANF用于各种诊断测试和鉴别促进多巴胺能神经元存活的药物的分析(assay)中。MANF的表达还可以作为用于确定个人是否具有神经退行性障碍的风险的诊断工具。这种诊断方法可以导致根据患者的基因型定制药物治疗(称为药物基因组学)，包括预测患者的反应(例如，在施用化合物或药物时增加疗效或降低不希望的副作用)。

本发明的第五方面特征在于通过与一种或多种另外的治疗剂结合施用MANF来增强多巴胺能神经元的存活的方法。在某些实施方式中，这种治疗剂是CDNF、GDNF、MANF2或其组合。在一个实施方式中，向人的大脑黑质区域施用MANF。在进一步的实施方式中，在将细胞移植到大脑之前、其过程中或之后，向人类大脑黑质区域施用MANF。在另外的实施方式中，如本文所述与一种或多种额外的治疗剂结合施用MANF。黑质是中脑的异质部分，其将大脑脚(足(foot))与被盖(tegmentum)(覆盖物(covering))分开，且是基底神经节系统的主要部分。它由差异很大的两个神经集合(致密部(pars compacta)和邻近的多巴胺能神经团)及另一个由网状部(pars reticulata)和外侧部(parslateralis)构成的集合组成。后两者连同苍白球核(pallidal nuclei)是基底神经节核的部分。黑质致密部和周围组织负责大脑中多巴胺的产生。

在再另一方面，本发明特征在于用于确定候选化合物是否调节MANF介导的促进多巴胺能神经元存活的活性的方法，包括：(a)提供MANF多肽；(b)将MANF多肽与候选化合物接触；和(c)测量MANF生物活性，其中，相对于没有与该化合物接触的MANF多肽的生物活性，MANF生物活性的改变表明候选化合物调节MANF生物活性。MANF多肽可以在细胞中或在无细胞分析系统中。

在另一方面，本发明特征在于确定候选化合物是否可用于减少神经变性的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供MANF多肽；(ii)将多肽与候选化合物接触；和(c)测量MANF多肽的结合，其中，MANF多肽的结合表明该候选化合物可用于减少神经变性。

本发明特征还在于用于识别加强或模拟MANF生物活性的因子的筛选方法。在这些增强剂的筛选方法中，使用标准技术测试候选化合物增加MANF表达的能力、稳定性或生物活性。结合MANF的候选化合物可以作为增效剂发挥作用。模拟物(例如，结合MANF受体的化合物)是能够在缺乏MANF多肽的情况下发挥作用的化合物。

“基本上纯化的”指多肽(例如，MANF多肽)已经与其天然伴随的组分分离。通常情况下，当多肽为至少60重量％不含与其天然伴随的蛋白质和自然存在的有机分子时，该多肽是基本上纯化。优选地，多肽是至少75重量％，更优选至少90重量％，和最优选至少99重量％纯的。例如，可以通过天然来源(例如，神经细胞)提取，通过编码多肽的重组核酸的表达，或通过化学合成该蛋白质获得基本上纯化的多肽。可以通过任何适当的方法，例如，柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析测量纯度。

当多肽与在其自然状态伴随的那些污染物分离时，该多肽基本上不含天然关联的组分。因此，化学合成的或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中产生的多肽基本上不含其天然关联的组分。因此，基本上纯化的多肽包括那些在真核生物中天然存在但在大肠杆菌或其他原核生物中合成的多肽。

“多肽”或“蛋白质”指任何两个以上氨基酸的链，无论是否翻译后修饰(如糖基化或磷酸化)。

“药学上可接受的赋形剂”指所治疗的哺乳动物生理上可接受的而同时保持与它一起施用的多肽的治疗性能的赋形剂、载体或稀释剂。一种示例性的药学上可接受的载体是生理盐溶液。其他生理上可接受的载体及其制剂是本领域技术人员已知的，且在例如，Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，(第20版)主编A.R.Gennaro A R.，2000，Lippencott Williams & Wilkins中有描述。

化合物具有“促进多巴胺能神经元存活的活性”是，相对于不存在该化合物的情况下的多巴胺能神经元的存活，该化合物的存在在多巴胺能神经元存活检测(如本文描述的这一种)中增加多巴胺能神经元存活至少两倍。多巴胺能神经元的存活的增加可以是至少3倍，更优选至少4倍，最优选至少5倍。该检测可以是体外检测或体内检测。

如前所示(Commissiong等人，美国申请公布2002/0182198或序列号10/102265)，中脑源的细胞系(称为“VMCL-1”)分泌随之促进多巴胺能神经元分化和存活的因子。这种细胞系在无血清的培养基中健壮地生长。此外，由这些细胞制备的CM包含一种或多种多巴胺能神经元存活因子，其增加中脑多巴胺能神经元的存活至少3倍，并且也促进其发育。

Commissiong等人还说明了由VMCL-1细胞系纯化MANF。如下分离蛋白质。制备3升体积的VMCL-1条件培养基，并进行柱色谱的5个连续步骤。在各个纯化步骤，在上文提到的生物检测中测试各柱级分(fraction)的生物活性。在5天时间内，以24小时的间隔完成各个级分对于多巴胺能神经元存活的效应的评估，并评为1-10分。第五纯化步骤之后，通过SDS-PAGE分析生物活性级分和相邻的非活性级分。SDS-PAGE的分析结果显示了活性级分的泳道中20kDa的范围内明显的蛋白带。切取“活性”带，并使其经受胰蛋白酶消化，通过质谱分析确定上述背景的各肽的分子量和序列。对下面的两个肽序列进行识别：DVTFSPATIE和QIDLSTVDL。数据库的检索确认了人的富含精氨酸的蛋白质与其小鼠种间同源体(orthologue)的匹配。小鼠EST序列编码的预测蛋白质与预测的人类蛋白质大约95％相同。大鼠EST数据库的检索发现两个序列，一个(dbEST Id：4408547；EST名称：EST348489)在氨基酸水平具有与人类和小鼠蛋白质显著的同源性。该全长大鼠序列不在GenBank数据库中。

此外，Commissiong等人发现，人类ARP经切割以使得富含精氨酸的氨基末端与羧基末端分离，从而产生人原MANF。切割的羧基末端片段包含信号肽，导致人类MANF从细胞分泌。

蛋白质治疗

在本发明的一个方面中，向受试者施用MANF或其生物功能片段以预防性地治疗受试者或治疗患有神经病的受试者。例如，在某些实施方式中，治疗受试者以提高多巴胺能神经元的保持和/或促进其生长。本文在下文中公开了设想用于本发明方法中的各种剂量制剂。

在各种不同的实施方式中，本发明中的治疗途径包括将重组MANF多肽直接施用到潜在的或实际的细胞损失的位点(例如，通过注射)或全身性施用(例如，通过任何常规重组蛋白质施用技术)。

在一个实施方式中，施用是向大脑黑质区域和/或腹侧中脑区域。

本发明的另外的实施方式涉及结合药学上可接受的载体施用药物组合物以获得上面讨论的任何治疗效果。这种药物组合可以由MANF多肽、MANF多肽的抗体和/或MANF多肽的模拟物和激动剂组成。

在本发明的各种实施方式中，向受试者施用分泌和/或未分泌形式的MANF以提高多巴胺神经元的生长或存活。分泌形式和未分泌形式的MANF(统称为MANF多肽)具有神经营养活性，并可用作治疗神经退行性疾病(如帕金森氏病)和用于在向人类移植期间或之后提高多巴胺能神经元的存活的神经营养因子。MANF多肽也可以用来提高用于移植的神经元的体外产生。在另一种用途中，MANF多肽可用于鉴别调节或模拟MANF的促进多巴胺能神经元存活的活性的化合物。MANF多肽也可以用来鉴别MANF受体。如下更详细描述这些用途中的每一种。

发现MANF作为促进多巴胺能神经元存活的神经营养因子使得其能够用于神经退行性疾病(如帕金森氏病)的药物治疗。

在一个实施方式中，提供了通过增加黑质的GABA能末端的GABA释放治疗帕金森氏病的方法，该方法包括向患有帕金森氏病的受试者施用有效量的MANF。在进一步的实施方式中，施用包括共施用本文所述的一种或多种另外的治疗剂。在更进一步的实施方式中，提供了通过拮抗谷氨酸对于DA神经元的兴奋性毒性作用治疗帕金森氏病的方法，包括向患有帕金森氏病的受试者施用有效量的MANF，或者MANF和本文公开的一种或多种另外的治疗药物。

在另一实施方式中，在细胞移植的位点向受试者施用MANF多肽。可以在细胞移植之前、其过程中或之后施用MANF多肽。优选地，这两个步骤是在彼此间隔的大约4小时之内进行。如果合适的话，可以在细胞移植之前和/或之后，以各种不同时间间隔向受试者重复施用MANF多肽。这种保护性的MANF多肽施用可以在细胞移植后几个月甚至几年进行。用于本发明的各个方面的移植方法和组合物包括美国专利申请公布20080058221、20080050728、20080014246、2007027593中所公开的那些。

例如，向帕金森氏病的动物模型(脑损伤诱导的啮齿类动物)施用MANF导致显著的治疗效果。脑的多巴胺能神经元被神经毒素6-羟基多巴胺(6-OHDA)损害，所述神经毒素接近黑质中的多巴胺能神经元注射，并通过多巴胺转运蛋白(DAT)选择性地摄取进入多巴胺能神经元。6-OHDA选择性地破坏大脑注射侧的多巴胺能神经元。DA的释放产生的不平衡导致动物向大脑的完整侧旋转(Mendez和Finn，1975)。表1显示载体(VEH)和用GDNF或MANF治疗之间的旋转(turn)圈数的区别：

表1：

组 120分钟内的圈数

VEH+VEH 20±45

VEH+6-OHDA 950±150

GDNF+6-OHDA 50±75

MANF+6-OHDA 150±55

结果表明，施用MANF减少了监测的120分钟内的累计旋转。旋转越多，纹状体中脑诱导损伤的效应越严重。

除了向人或其他哺乳动物的施用，MANF多肽也可以用于在神经元移植前的任何时间的生产过程中提高它们的存活的培养中。在一个例子中，将待移植的细胞悬浮于也包括促进存活量的MANF多肽的药物载体中。也可以在该过程的较早时候(例如，因为神经元是首先分化的)向培养物施用MANF多肽。可以理解，神经元不必是原代多巴胺能神经元。可以在神经元的产生和保持过程中，在MANF多肽的存在下培养在体外或体内由干细胞分化的神经元(例如，多巴胺能神经元)或能够产生神经元的其他细胞。

为了向细胞加入MANF多肽以防止神经细胞死亡，优选从可以表达该蛋白质的培养细胞系统获得足够量的重组MANF多肽。优选的MANF多肽是人MANF，但也可以使用来自其他动物(如猪、大鼠、小鼠、狗、狒狒、母牛等)的MANF多肽。然后可以使用适当的包装或施用系统实现该蛋白质向受影响的组织的递送。或者，可以使用和施用小分子类似物以作为MANF激动剂发挥作用并以这种方式产生所需的生理效应。

基因治疗

从广义上讲，基因治疗寻求将新的遗传物质向患者的细胞转移，由此对患者产生治疗益处。这些益处包括对大范围的各种疾病、障碍或其他状况的治疗或预防。

本发明提供了一种通过施用包含转基因的重组嗜神经病毒载体向受试者的CNS递送转基因的方法，其中，输送在远离施用位点的位点处有利于转基因表达的条件下进行。输送也可以导致施用位点的转基因表达。例如，美国专利申请号20090069261公开了本领域已知的基因治疗方法，本文通过引用完整引入。

除非特别表明相反，转基因的表达不限于多肽或蛋白质的翻译，且还包括转基因多核苷酸的复制和/或转录。

在另一方面中，本发明提供了向患诸如帕金森氏病的障碍的哺乳动物中CNS的靶细胞(其为神经元或神经胶质细胞)输送治疗性转基因产物的方法。

体外基因治疗方法包括分离细胞的修饰，其然后经注入、嫁接或以其他方式移植到患者中。参见，例如，美国专利4,868,116、5,399,346和5,460,959。体内基因治疗寻求在体内直接靶向于患者宿主组织。

可用作基因转移载体的病毒包括乳多空病毒、腺病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和逆转录病毒。适当的逆转录病毒包括HIV、SIV、FIV、EIAV、MoMLV。

优选的用于治疗中枢神经系统的障碍的病毒是慢病毒和腺相关病毒。这两种类型的病毒都能够无需细胞分裂整合进入基因组，并且这两种类型已经在对于神经系统、特别是中枢神经系统的适应症的临床前动物研究中测试。

AAV的制备方法在本领域中已有描述，例如，美国专利5,677,158、美国专利6,309,634和美国专利6,451,306描述向中枢神经系统递送MV的例子。

在本发明的方法中，可以使用任何血清型的AAV。在某些实施方式中，可以使用任何血清型的AAV，只要载体能够在因疾病受损的大脑中发生逆行轴突运输(retrograde axonal transport)或在非损伤大脑中发生轴突运输。用于本发明的某些实施方式中的病毒载体的血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、MV5、AAV6、AAV7和AAV8(参见，例如，Gao等人(2002)PNAS，99：11854-11859；和Viral Vectors for GeneTherapy：Methods and Protocols，ed.Machida，Humana Press，2003)。可以使用在本文所列出的这些以外的其他血清型。此外，准型AAV载体也可以用于本文所述的方法中。准型AAV载体是那些在第二AAV血清型的衣壳中含有一个AAV血清型的基因组的AAV载体；例如，包含AAV2衣壳和AAV1基因组的AAV载体，或包含AAV5衣壳和AAV2基因组的AAV载体(Auricchio等人，(2001)Hum.Mol.Genet.，10(26)：3075-81)。

AAV载体源自对于哺乳动物非致病的单链(ss)DNA细小病毒(在Muzyscka(1992)Curr.Top.Microb.Immunol.，158：97-129中综述)。简言之，基于AAV的载体除去占基因组的96％的rep和cap病毒基因，从而留下两个侧翼145碱基对(bp)的反向末端重复序列(ITR)，其用于启动病毒DNA复制、包装和整合。在缺乏辅助病毒的情况下，野生型AAV以优先的位点特异性在染色体19q13.3整合到人类宿主细胞基因组中，或它可以保持游离地(episomally)表达。单一的AAV颗粒可以容纳最高5kb的ssDNA，因此为转基因和调控元件留下大约4.5kb，这通常是足够的。但是，例如，美国专利6,544,785描述的反式剪接系统(trans-splicing system)可能接近此限制的两倍。

特殊和优选的逆转录病毒类型包括可以转导细胞并且无需细胞分裂整合进入其基因组中的慢病毒。因此，优选地，载体是复制缺陷型慢病毒颗粒。这样的慢病毒颗粒可以由包含5′慢病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、可操作地与编码所述融合蛋白的多核苷酸信号连接的启动子、第二链DNA合成的起源和3′慢病毒LTR的慢病毒载体产生。US 20020037281(使用慢病毒载体转导神经细胞的方法)和US20020037281(对于神经退行性疾病的慢病毒介导的生长因子基因疗法)描述了用于制备和体内施用慢病毒至神经细胞的方法。

可以使用不需要向本领域普通技术人员进行详细解释的常规技术完成用于本发明的MANF的重组表达的载体构建。然而，为了回顾，普通技术人员可能希望参考Maniatis等人，in Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，(NY 1982)。

可以产生用于本发明的嵌合表达构建体，例如，通过PCR扩增所需的片段(信号序列和MANF编码序列)并在重叠PCR中将它们融合。因为几种优选的信号序列相对较短，用于扩增MANF编码序列的5′PCR引物可能包括编码信号序列的序列以及TATA盒和其他调控元件。

简单地说，重组表达载体的构建采用标准连接(ligation)技术。对于确认构建的载体中的准确序列的分析，基因使用例如，Messing等人的方法(Nucleic Acids Res.，9：309-，1981)，Maxam等人的方法(Methodsin Enzymology，65：499，1980)，或本领域的技术人员已知的其他合适的方法测序。

基因的表达在转录、翻译或翻译后水平进行控制。转录启始是基因表达中的早期和重要事件。这取决于启动子和增强子序列，且受与这些序列相互作用的特定细胞因子的影响。许多基因的转录单位由启动子和在某些情况下由增强子或调控元件组成(Banerji等人，Cell 27：299(1981)；Corden等人，Science 209：1406(1980)；及Breathnach和Chambon，Ann.Rev.Biochem.50：349(1981))。对于逆转录病毒，参与逆转录病毒基因组复制的控制元件位于长末端重复序列(LTR)中(Weiss等人，编著，The molecular biology of tumor viruses：RNA tumor viruses，ColdSpring Harbor Laboratory，(NY 1982))。鼠莫洛尼氏白血病毒(MLV)和劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR含有启动子和增强子序列(Jolly等人，Nucleic Acids Res.11：1855(1983)；Capecchi等人，Enhancer andeukaryotic gene expression，Gulzman and Shenk，编著，第101-102页，Cold Spring Harbor Laboratories(NY 1991))。显示长期活性并且为组织特异性甚至细胞特异性的启动子用于某些具体实施方式。启动子的非限制性的例子包括但不限于，巨细胞病毒(CMV)启动子(Kaplitt等人(1994)Nat.Genet.8：148-154)、CMV/人β3-球蛋白启动子(Mandel等人(1998)J.Neurosci.18：4271-4284)、GFAP启动子(Xu等人(2001)Gene Ther.8：1323-1332)、1.8kb的神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子(Klein等人(1998)Exp.Neurol.150：183-194)、鸡β肌动蛋白(CBA)启动子(Miyazaki(1989)Gene 79：269-277)、β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)启动子(Shipley等人(1991)Genetics 10：1009-1018)和泛素启动子(如美国专利6,667,174中描述的那些由人泛素A、人泛素B和人泛素C分离的那些)。为了延长表达，其他调控元件可能另外可操作地与转基因连接，例如，土拨鼠肝炎病毒后调控元件(WPRE)(Donello等人(1998)J.Virol.72：5085-5092)或牛生长激素(BGH)多腺苷酸化位点。

也描述了许多非病毒启动子的启动子和增强子区域(Schmidt等人，Nature 314：285(1985)；Rossi和decrombrugghe，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5590-5594(1987))。保持和提高静止细胞中转基因的表达的方法包括使用启动子，包括胶原蛋白I型(1和2)(Prockop和Kivirikko，N.Eng.J.Med.311：376(1984)；Smith和Niles，Biochem.19：1820(1980)；de Wet等人，J.Biol.Chem.，258：14385(1983))、SV40和LTR启动子。

根据本发明的一个实施方式，启动子是选自泛素启动子、CMV启动子、JeT启动子(美国专利6,555,674)、SV40启动子和延伸因子1α启动子(EF1-α)的组成型启动子。诱导型/阻抑启动子的例子包括：Tet-On、Tet-Off、雷帕霉素诱导启动子、Mx1。

除了使用病毒和非病毒启动子来驱动转基因表达外，增强子序列可以用来提高转基因表达的水平。增强子不仅可以提高其原始基因的转录活性，也可以提高某些外源基因的转录活性(Armelor，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 70：2702(1973))。例如，在本发明中，胶原蛋白增强子序列可以与胶原蛋白启动子2(I)一起使用以提高转基因表达。此外，SV40病毒中发现的增强子元件可用于提高转基因表达。这种增强子序列由Gruss等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：943(1981)；Benoist和Chambon，Nature 290：304(1981)，及Fromm和Berg，J.Mol.Appl.Genetics，1：457(1982)所描述的72个碱基对重复序列构成，本文通过引用引入所有这些文献。当这种重复序列与各种启动子串联存在时，它可以增加许多不同的病毒和细胞基因的转录(Moreau等人，Nucleic Acids Res.9：6047(1981))。

进一步的表达增强序列包括但不限于土拨鼠肝炎病毒后转录调控元件、WPRE、SP163、大鼠胰岛素(Insulinil)内含子或其他内含子、CMV增强子和鸡[β]-球蛋白绝缘子(insulator)或其他绝缘子。

为了长期稳定的表达，也可以使用细胞因子调节启动子活性而增加转基因表达。已报告几种细胞因子调节胶原蛋白2(I)和LTR启动子的转基因表达(Chua等人，connective Tissue Res.，25：161-170(1990)；Elias等人，Annals N.Y.Acad.Sci.，580：233-244(1990))；Seliger等人，J.Immunol.141：2138-2144(1988)及Seliger等人，J.Virology 62：619-621(1988))。例如，转化生长因子(TGF)、白细胞介素(IL)-I和干扰素(INF)下调各种启动子(如LTR)驱动的转基因的表达。肿瘤坏死因子(TNF)和TGF 1上调，并可能用于控制，由启动子驱动的转基因的表达。可能证明有用的其他细胞因子包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)。

具有胶原蛋白增强子序列的胶原蛋白启动子(Coll(E))也可用于通过进一步抑制对于可能在治疗的大脑中产生的载体的任何免疫反应(无论其免疫保护状态)来提高转基因表达。此外，可以在载体组合物递送后立即向治疗的宿主施用抗炎药物包括类固醇类(如地塞米松)，并优选继续施用直至任何细胞因子介导的炎性反应消退。也可以施用免疫抑制剂(如环孢菌素)以降低下调LTR启动子和Coll(E)启动子-增强子并降低转基因表达的干扰素的产生。

载体可以包括进一步的序列(例如，编码Cre重组酶蛋白质的序列)和LoxP序列。确保neublastin的临时表达的进一步方式是通过使用Cre-LoxP系统，其在向细胞施用Cre重组酶(Daewoong等人，NatureBiotechnology 19：929-933)时或通过将编码重组酶的基因整合进入病毒构建体中(Pluck，Int J Exp Path，77：269-278)导致插入的DNA序列部分的切除。与LoxP位点和结构基因(在本案中为neublastin)一起在病毒构建体中并入重组酶基因经常导致结构基因的表达持续大约5天的时间。

在说明性的实施方式中，AAV是AAV2或AAV1。许多血清型(特别是AAV2)的腺相关的病毒已被广泛研究，并鉴定为基因治疗载体。本领域的技术人员熟悉功能性的基于AAV的基因治疗载体的制备。可以在公开文献的广泛部分中发现用于向人类受试者施用的AAV生产、纯化和制备的各种方法的众多说明(参见，例如，Viral Vectors for GeneTherapy：Methods and Protocols，编著Machida，Humana Press，2003)。另外，美国专利6,180,613和6,503,888描述了靶向于CNS细胞的基于AAV的基因疗法。另外的示例性的AAV载体是编码人类蛋白质的重组AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7和AAV2/8血清型载体。

对于一些CNS基因治疗的应用，可能需要控制转录活性。为此，可以通过包括例如如在Haberma等人(1998)Gene Ther.5：1604-16011；和Ye等人(1995)Science 283：88-91中描述的各种调控元件和药物响应启动子而获得用病毒载体的基因表达的药理调节。

在本发明的方法中，可以通过将神经元的终端轴突端与包含携带转基因的病毒载体的组合物接触来施用病毒载体，从而使病毒颗粒被细胞吞噬并在细胞内沿轴突向转运(逆行地)到神经元的细胞体；允许治疗性的转基因产物进行表达，其中治疗性的转基因产物因而缓解受试者的病状。在某些实施方式中，组合物中的载体浓度至少为：(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(10¹²gp/ml)；(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(X10⁹tu/ml)；或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(X10¹⁰iu/ml)。

在本发明的另外的方法中，可以通过将神经元的细胞体与包含携带转基因的病毒载体的组合物接触来施用病毒载体，从而使病毒颗粒被细胞吞噬，允许治疗性的转基因产物表达并在细胞内顺行地沿轴突向神经元的轴突末端转运，其中治疗性的转基因产物因而缓解受试者的病状。在某些实施方式中，组合物中的载体浓度至少为：(a)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(10¹²gp/ml)；(b)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(X10⁹tu/ml)；或(c)5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(10¹⁰iu/ml)。

对人大脑中的结构的确认，参见，例如，The Human Brain：Surface，Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI，and Blood Supply，第2版，Deuteron等人主编，Springer Vela，1999；Atlas of the Human Brain，Mai等人主编，Academic Press；1997；和Co-Planar Sterotaxic Atlas of theHuman Brain：3-Dimensional Proportional System：An Approach toCerebral Imaging，Tamarack等人主编，Thyme Medical Pub.，1988。对于小鼠大脑中的结构的确认，参见，例如，The Mouse Brain in SterotaxicCoordinates，第2版，Academic Press，2000。图1示意地显示脊髓和它的四个亚部：颈椎、胸椎、腰椎和骶椎。

另外的重要参数是输送进入靶组织的MANF的剂量。在这方面，“单位剂量”一般指MANF组合物的Neurturin/毫升的浓度。对于病毒载体，MANF浓度可以由病毒颗粒数/毫升神经营养组合物定义。理想情况下，为了使用病毒表达载体递送MANF，各单位剂量的MANF包含2.5至25μL的MANF组合物，其中，该组合物包括在药学上可接受的流体中的病毒表达载体，并提供每毫升MANF组合物10¹⁰直至10¹⁵的MANF表达病毒颗粒。这种高效价尤其可用于腺相关病毒。对于慢病毒，效价一般较低，例如，如在实施例中所述确定的每毫升10⁸至10¹⁰转导单位(TU/毫升)。

在优选的实施方式中，施用位点是大脑的纹状体，特别是尾状核(caudate)和/或壳核(putamen)。进入壳核的注射可以标记位于大脑的各种距离区域的目标位点，例如，苍白球、杏仁核、底丘脑核或黑质。苍白球中细胞的转导通常导致丘脑中细胞的逆行标记。在优选的实施方式中，目标位点或(其中一个)是黑质。注射也可以进入纹状体和黑质。

在给定的目标位点，载体系统可以转导目标细胞。目标细胞可能是在神经组织中发现的细胞，如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞或室管膜细胞。在优选的实施方式中，目标细胞是神经元，尤其是TH阳性神经元。

优选地通过直接注射施用载体系统。注射到大脑(尤其是纹状体)的方法是本领域公知的(Bilang-Bleuel等人(1997)Proc.Acad.Natl.Sci.USA 94：8818-8823；Choi-Lundberg等人(1998)Exp.Neurol.154：261-275；Choi-Lundberg等人(1997)Science 275：838-841；及Mandel等人(1997))Proc.Acad.Natl.Sci.USA 94：14083-14088)。可以给予立体定位注射。

如上所述，对于组织(如大脑)中的传导，有必要使用非常小的体积，所以通过超离心浓缩病毒制剂。产生的制剂应该具有至少10⁸t.u./ml，优选10⁸至10¹⁰t.u./ml，更优选至少10⁹t.u./ml。(如实施例2所述，效价表示为每毫升的转导单位(t.u./ml))。已发现，可以通过增加注射位点的数量并降低注射速度获得改善的转基因表达的分散(Horellou和Mallet(1997)，如上)。通常使用1至10个注射位点，更通常为2至6个。对于包含1-5X10⁹t.u./ml的剂量，注射速度通常为0.1至10μl/分钟，通常为大约1μl/分钟。

通过微注射、输注、划痕标记(scrape loading)、电穿孔或其他适于通过手术切口直接将组合物输送直接进入输送位点组织的方法，向目标组织中的各个输送细胞位点输送MANF组合物。缓慢完成输送，如经过大约5-10分钟的时间(取决于待输送的MANF组合物的总体积)。

修饰

在本发明的另一方面中，在向受试者施用之前修饰MANF。

本发明的修饰蛋白质可能具有氨基酸的缺失和/或替换；因此，具有缺失的蛋白质、具有替换的蛋白质和具有缺失和替换的蛋白质是修饰的蛋白质。在某些实施方式中，这些修饰的蛋白质可能进一步包括插入或添加的氨基酸，如具有融合蛋白或具有连接物(linker)的蛋白质。

替换或取代变体通常包含在蛋白质内的一个或多个位点一种氨基酸替换或取代另一种氨基酸，并可经设计以调节多肽的一种或多种性能，特别是降低其免疫原性/抗原性，减少在受试者中的任何副作用，或增加其疗效。这种替换优选是保守的，也就是说，一种氨基酸被一种类似形状和电荷的氨基酸取代。保守的替换是本领域公知的，且包括，例如，以下变化：丙氨酸变为丝氨酸，精氨酸变为赖氨酸，天冬酰胺(asparagine)替换为谷氨酰胺(glutamine)或组氨酸，天冬氨酸(aspartate)替换为谷氨酸(glutamate)，半胱氨酸替换为丝氨酸，谷氨酰胺替换为天冬酰胺，谷氨酸替换为天冬氨酸，甘氨酸替换为脯氨酸，组氨酸替换为天冬酰胺或谷氨酰胺，异亮氨酸替换为亮氨酸或缬氨酸，亮氨酸替换为缬氨酸或异亮氨酸，赖氨酸替换为精氨酸，蛋氨酸替换为亮氨酸或异亮氨酸，苯丙氨酸替换为酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸，丝氨酸替换为苏氨酸，苏氨酸替换为丝氨酸，色氨酸替换为酪氨酸，酪氨酸替换为色氨酸或苯丙氨酸，和缬氨酸替换为异亮氨酸或亮氨酸。多肽的抗原区域可能被取代为较低抗原性的区域；较低抗原性的区域可能含有与天然蛋白质中相应的残基相同的残基，但也包含一些保守替换和/或非保守替换。

除了缺失或替换，修饰的蛋白质可能具有残基插入，其通常包括在多肽中添加至少一个残基。这可能包括靶向肽或多肽或只是单一残基的插入。如下讨论称为融合蛋白的末端添加。

术语“生物学功能相当的”在本领域很容易理解，并在本文进一步详细定义。因此，倘若蛋白质的生物活性得到保持，可以包括具有大约70％至大约80％、或大约81％至大约90％，或甚至大约91％至大约99％的与天然多肽的氨基酸相同或功能相当的氨基酸的序列。修饰的蛋白质可能与其天然对应物是生物学功能相当的。在各种实施方式中，以治疗有效量施用MANF的生物学功能等价物。

也可以理解，氨基酸和核酸序列可能包括额外的残基，如另外的N-或C-末端氨基酸或5′或3′序列，但仍然基本上是本文公开的一个序列所示的，只要该序列符合上文提出的标准，包括保持与蛋白表达有关的生物学蛋白活性。末端序列的添加特别适用于可能例如包括位于编码区的5′或3′部分侧翼的各种非编码序列或可能包括已知出现于基因中的各种内部序列(即内含子)的核酸序列。

以下是基于蛋白质氨基酸的改变以产生等价物、或甚至是改进的第二代分子的讨论。例如，特定氨基酸可以替换蛋白质结构中的其他氨基酸，而没有与结构(如底物分子的结合位点)的相互作用的结合能力方面明显的损失。由于是蛋白质的相互作用能力和性质限定蛋白质的生物学功能活性，可以在蛋白质序列和其基础的DNA编码序列中进行某些氨基酸替换，但仍然产生具有相似性质的蛋白质。因此，发明人设想可以如下讨论的在基因的DNA序列中进行各种变化而生物学效用或活性方面没有明显的损失。表1显示编码特定氨基酸的密码子。如果满足下面的“同源性标准”之一，则蛋白质性分子(proteinaceous molecule)与第二蛋白质分子具有“同源性”，或被认为与第二蛋白质分子“同源”：1)蛋白质性分子的至少30％与第二蛋白质性分子在相同位置具有序列一致性；2)在与第二蛋白质性分子的相同位置和相对于第二蛋白质性分子在不相同的残基处(如本文所述的，其中至少30％是保守性差异)存在某些序列一致性；或3)蛋白质性分子的至少30％与第二蛋白质性分子具有序列一致性，但在相同的残基之间具有可能的非相同残基的间隙。本文中所使用的，术语“同源的”可能同样适用于蛋白质性分子的区域而不是整个分子。如果术语“同源性”或“同源的”由数值来限定，例如“50％同源性”或“50％同源的”，那么对于1)、2)和3)的同源性标准，由“至少30％”调整为“至少50％”。因此，可以设想在两种蛋白质性分子或蛋白质性分子的部分之间可能存在至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同源性。

在作出这样的改变时，可以考虑亲水指数(hydropathic index)。本领域中通常理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能方面的重要性(Kyte & Doolittle，1982)。现在公认，氨基酸的相对亲水性质对所获得的蛋白质的二级结构有影响，蛋白质的二级结构随之限定蛋白质与其他分子(例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。

本领域中也可以理解，可以有效地基于亲水性进行相似氨基酸的替换。本文通过引用引入的美国专利4,554,101表明，受其相邻氨基酸的亲水性控制的蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学性质相关。如美国专利4,554,101中详细描述的，将以下亲水值分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)，赖氨酸(+3.0)，天冬氨酸(+3.0±0.1)，谷氨酸(+3.0±0.1)，丝氨酸(+0.3)，天冬酰胺(+0.2)，谷氨酰胺(+0.2)，甘氨酸(0)，苏氨酸(-0.4)，脯氨酸(-0.5±0.1)，丙氨酸(-0.5)，组氨酸(-0.5)，半胱氨酸(-1.0)，蛋氨酸(-1.3)，缬氨酸(-1.5)，亮氨酸(-1.8)，异亮氨酸(-1.8)，酪氨酸(-2.3)，苯丙氨酸(-2.5)，色氨酸(-3.4)。

可以理解，氨基酸可以替换为具有类似亲水性值的另一种氨基酸，且仍然产生生物学等效和免疫等效的蛋白质。在这样的变化中，优选亲水性值在±0.2以内的氨基酸的替换，特别优选那些在±0.1以内的氨基酸的替换，甚至更特别优选在±0.5以内的氨基酸的替换。

如上所述，氨基酸替换一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种上述特征的示例性的替换是本领域的技术人员公知的，且包括：精氨酸与赖氨酸，谷氨酸与天冬氨酸、丝氨酸和苏氨酸，谷氨酰胺与天冬酰胺，及缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸。

制备本发明的修饰多肽的另一个实施方式是使用肽模拟物。模拟物是模拟蛋白质二级结构元件的含肽分子。参见，例如，Johnson(1993)。使用肽模拟物的根本理由是蛋白质的肽骨架主要定向氨基酸侧链以促进分子间的相互作用(如抗体和抗原的相互作用)。预计肽模拟物允许类似于天然分子的分子相互作用。可以结合上述概述原理使用这些原理，以工程设计具有天然蛋白质的许多自然属性但在某些情况下具有改变的甚至提高的特征的第二代修饰蛋白质分子。

a.融合蛋白

一种特别种类的插入变体是包含MANF或其生物学功能变体的融合蛋白。这种分子一般具有在N-或C-末端与第二多肽的全部或部分连接的天然分子的全部或基本部分。例如，融合通常采用来自其他物种的前导序列，以允许异源宿主中的蛋白质的重组表达。另一种有用的融合包括添加免疫活性的功能域(如抗体表位或其他标记)，以促进融合蛋白的靶定或纯化。6xHis和GST(谷胱甘肽S转移酶)作为标记的用途是公知的。在融合接合点(fusion junction)或其附近包含切割位点有助于在纯化后除去外来的多肽。其他有用的融合包括功能域(例如来自酶如水解酶、糖基化功能域、细胞靶向信号或跨膜区域的活性位点)的连接。

b.结合的(conjugated)蛋白质

在本发明的一个方面中，将MANF或其生物功能片段结合。例如，在各种实施方式中，本发明还提供了结合的多肽，例如连接至少一种物质以形成偶联物的翻译的蛋白质、多肽和肽。特别有用的是抗体偶联物，其中，抗体部分将所述物质靶向于特定的位点。为了提高抗体分子作为诊断或治疗剂的效力，通常连接或共价结合或复合至少一个所需的分子或部分。这样的分子或部分可能是但不限于至少一种效应物或报告分子。效应物分子包括具有需要的活性(如细胞生长活性或细胞毒性活性)的分子。已连接到抗体上的效应物分子的非限制的例子包括生长剂、毒素、抗肿瘤剂、治疗性的酶、放射标记的核苷酸、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡核苷酸或多核苷酸。相比之下，报告分子被定义为可以使用分析方法检测到的任何部分。已偶联到抗体上的报告分子的非限制性的例子包括酶、放射性标记(radiolabel)、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、荧光分子、光亲和分子、有色微粒或配体(如生物素)。

抗体偶联物的某些例子是其中抗体与可检测的标记连接的那些偶联物。“可检测的标记”是由于其特定的功能性质和/或化学特征可检测的化合物和/或成分，它们的使用使得其连接的抗体可被检测和/或如果需要的话进一步定量。另一个这样的例子是形成包含与细胞毒性或抗细胞剂连接的抗体，并可以被称为“免疫毒素”。

i.连接剂/偶合剂

在本发明的另一方面中，MANF或一种或多种其生物功能性片段在如上所述的融合中或通过如下的连接剂或耦合剂结合。可用于结合MANF的连接剂类型的例子包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽连接剂。可以选择例如，容易被低pH值切割或容易被蛋白酶如组织蛋白酶(如组织蛋白酶B、C和D)切割的连接剂。例如，多个肽或多肽可通过生物可释放的键(如可选择性切割的连接剂或氨基酸序列)结合。例如，设想包括优先位于或在肿瘤环境中具有活性的酶的切割位点的肽连接剂。这种肽连接剂的示例性的形式是指那些被尿激酶、血纤维蛋白溶酶、凝血酶，因子IXa、因子Xa或金属蛋白酶(metallaproteinase)(如胶原酶、明胶酶或基质降解素(stromelysin)切割的肽连接剂。可选择地，肽或多肽可以与辅剂结合。氨基酸(如可选择性切割的连接剂、合成连接剂或其他氨基酸序列)可用于分离蛋白质性部分。

4.蛋白质纯化

虽然本发明的某些实施方式包括重组蛋白，但本发明也涉及用于纯化蛋白质(包括内源性多肽和肽及重组多肽和肽)的方法和过程。一般来说，这些技术在一个层面上包括多肽和非多肽成分的细胞环境的粗分级分离。在已经将该多肽与其他蛋白质分离后，可以使用色谱和电泳技术进一步纯化目标多肽以实现部分或完全纯化(或均质性的纯化)。尤其适合于纯肽制备的分析方法为离子交换色谱法、排阻色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦。纯化肽的特别有效的方法是快速蛋白液相色谱或甚至高效液相色谱法。此外，实施这种技术的条件可能影响纯化分子的特性如功能活性。

本发明的某些方面涉及编码的蛋白质或肽的纯化，且在特别的实施方式中，涉及编码的蛋白质或肽的实质纯化。本文所用的术语“纯化的蛋白质或肽”意图指可与其他组分分离的组合物，其中，相对于其天然获得的状态的蛋白质或肽被以任何水平纯化。因此，纯化的蛋白质或肽也指脱离其可能自然存在的环境的蛋白质或肽。“基本上纯化的”蛋白质或肽

一般来说，“纯化的”指已经经过分级分离以除去各种其他组分的蛋白质或肽的组合物，且该组合物基本上保留其表达的生物活性。使用术语“基本上纯化的”的情况下，此名称指其中该蛋白质或肽形成组合物的主要组分的组合物，如构成组合物中的蛋白质的大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％、大约99.2％、大约99.4％、大约99.6％、大约99.8％、大约99.9％或更多。

根据本公开，本领域的技术人员了解各种定量蛋白质或肽的纯化程度的方法。这些包括，例如，通过SDS/PAGE分析确定活性级分的特定活性或评估级分中的多肽的量。评估级分纯度的优选方法是计算该级分的特定活性，从而将它与初始提取物的活性进行比较，并由此计算纯度水平，本文由“-倍纯化数”评估。当然，用于表示活性的量的实际单位取决于选择在纯化后进行的特定分析方法以及表达的蛋白质或肽是否显示可检测的活性。

适用于蛋白质纯化的各种技术是本领域的技术人员公知的。这些包括，例如，用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀或通过热变性接着离心，色谱步骤如离子交换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲合色谱法的，等电聚焦，凝胶电泳及这些和其他技术的组合。如本领域中一般所知的，据信可以改变进行各种纯化步骤的顺序，或者可以省略某些步骤，且仍然导致制备基本上纯化的蛋白质或肽的合适方法。

一般不要求蛋白质或肽总是以其最纯化的状态提供。事实上，预期低于基本纯化的产物在某些实施方式中具有效用。可以通过结合使用较少的纯化步骤或通过利用相同的通用纯化方案的不同形式完成部分纯化。例如，可以理解，利用高效液相仪进行的阳离子交换柱色谱通常会导致比利用低压色谱系统的同样技术更大“倍”的纯化。显示出较低的相对纯化程度的方法可能在蛋白质产物的总体回收或在保持表达蛋白质的活性方面具有优势。

已知多肽的迁移可以随SDS/PAGE的不同条件变化，有时是显著地变化(Capaldi等人，1977)。因此，可以理解，在不同的电泳条件下，纯化或部分纯化的表达产物的表观分子量可能发生变化。

本发明还考虑肽标签结合本发明的方法和组合物使用。标签利用了两个多肽之间的相互作用。参与相互作用的多肽之一的一部分可以用作标签。例如，谷胱甘肽S转移酶(GST)的结合区域可以用作标签，以使得谷胱甘肽珠可用于富集含有该GST标签的化合物。也可以使用表位标签(其为由抗体或T细胞受体识别的氨基酸区域)。该标记可以由可操作地连接编码修饰蛋白质的核酸片段以使得融合蛋白质由该核酸分子编码的核酸片段编码。其他合适的融合蛋白是那些具有β-半乳糖苷酶、泛素、六聚组氨酸(hexahistidine)(6xHis)等的融合蛋白。此外，在某些实施方式中，用荧光标签(例如，GFP、eGFP)标记MANF或其生物功能片段，它们是常规已知的且用于蛋白质的检测和监测中。

药物组合物

本文所述的治疗性蛋白质的药物组合物在本发明的范围之内。在本发明的一个方面中，向受试者施用包含MANF或MANF和一种或多种另外的治疗剂的药物组合物以发挥预防或治疗效果。这种组合物包含治疗或预防有效量的MANF或其功能片段。这种另外的一种或多种治疗药物的例子包括但不限于作为“神经营养因子”的蛋白质或编码作为“神经营养因子”的蛋白质的核酸。神经营养因子是促进分化，保持成熟的表型和提供营养支持的生长因子，从而促进神经元的生长和存活。神经营养因子位于神经系统中或受神经支配的组织中。以下已被描述为神经营养因子：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经胶质源性神经营养因子(GDNF)、神经营养素(neurotrophin)-3(NT3)、NT4/5、胰岛素样生长因子(IGF-1)、IGF-II、NT-4、IL-1β、TNFα、转化生长因子β(TGF-β、TGF-β1)、MANF(NTN)、persephin(PSP)、artemin和AL-1。神经营养因子的用途是本领域的技术人员公知的，且可以在例如，美国专利申请公布20010011126、美国专利6,284,540、6,280,732、6,274,624、6,221,676中发现，本文通过引用引入。如在美国专利6,111,075中所公开的，Par4的用途是本领域的技术人员公知的，本文通过引用引入。在各种实施方式中，预期治疗神经障碍的方法在本发明的范围内，其中，与一种或多种神经营养因子一起向受试者共同施用MANF或其功能片段。

在本发明的各种实施方式中，包含MANF或其功能片段的药物组合物可能进一步包含用于修饰、维持或保留例如组合物的pH值、克分子渗透压浓度、粘性、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、解离或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。合适的制剂材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸)、抗菌剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲剂(如硼酸、重碳酸、Tris-HCl、柠檬酸、磷酸、其他有机酸)、填充剂(如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂[如乙二胺四乙酸(EDTA)]、络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精)、填料、单糖、二糖和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、颜料、调味剂和稀释剂、乳化剂、亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成盐的抗衡离子(如钠)、防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、洗必泰、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或润湿剂(如pluronics、PEG、山梨聚糖酯、聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、三硝基甲苯(triton)、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、tyloxapal)、稳定性促进剂(蔗糖或山梨醇)、张性促进剂(如碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露醇、山梨醇)、输送载体、稀释剂、赋形剂和/或药物佐剂(Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版，A.R.Gennaro编辑，Mack Publishing Company，1990)。

药物组合物可以包含一种或多种惰性赋形剂，其中包括水、缓冲水溶液、表面活性剂、挥发性液体、淀粉、多元醇、成粒剂、微晶纤维素、稀释剂、润滑剂、酸、碱、盐、乳剂(如油/水乳剂)、油(如矿物油和植物油)、润湿剂、螯合剂、抗氧化剂、无菌溶液、络合剂、崩解剂等。缓冲溶液通常处于生理pH值，更特别地通常被缓冲到目标组织的pH值。

优选的赋形剂有：水、磷酸缓冲盐溶液、商品名为Miglyol 840(来自Huls America，Inc.Piscataway，N.J.)的中链脂肪酸丙二醇二酯、商品名为Miglyol 812(来自Huls)的中链脂肪酸甘油三酯、商品名为Vertrel 245(来自E.I.DuPont de Nemours and Co.Inc.Wilmington，Del.)的全氟二甲基环丁烷、商品名为八氟环丁烷(octafluorocyclobutane)(来自PCRGainsville，Fla.)的全氟环丁烷、商品名为EG 400(来自BASF Parsippany，N.J.)的聚乙二醇、薄荷醇(来自Pluess-Stauffer International Stanford，Conn.)、商品名为lauroglycol(来自Gattefosse)的丙二醇单月桂酸酯、商品名为Transcutol(来自Gattefosse)的二甘醇单乙醚、商品名为Labrafac Hydro WL 1219(来自Gattefosse)的中链脂肪酸的聚二醇化的甘油酯、醇类(如乙醇、甲醇和异丙醇)、可获得的桉树油(来自Pluses-Stauffer International)及其混合物。

本发明的化合物包括氨基酸衍生物。优选的表面活性剂可以是化合物的钠盐形式，其可以包括单钠盐形式。可以基于需要的性能(包括聚合的高速度、适于输送的小的最终微粒大小、良好的聚合产率、稳定性(包括冻融和保存期稳定性)、改善的表面张力性质和润滑性质)选择合适的钠盐表面活性剂。

可用于形成本发明的药物组合物和剂型的表面活性剂包括但不限于亲水性表面活性剂、亲脂性表面活性剂及其混合物。也就是说，可使用亲水性表面活性剂的混合物，可使用亲脂性表面活性剂的混合物，或可使用至少一种亲水性表面活性剂和至少一种亲脂性表面活性剂的混合物。

其他合适的水性载体包括但不限于林格氏溶液(Ringer′s solution)和等渗氯化钠。水性悬浮液可以包括悬浮剂(如纤维素衍生物、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和黄蓍胶)和润湿剂剂(如卵磷脂)。用于水性悬浮液的合适的防腐剂包括对羟基苯甲酸乙酯和正丙酯。

可用于形成本发明的药物组合物和剂型的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸二钠、依地酸钙二钠、乙二胺四乙酸三钠、白蛋白、转铁蛋白、去铁敏(desferoxamine)、得斯芬(desferal)、甲磺酸去铁胺(deferoxamine Mesylate)、乙二胺四乙酸四钠和乙二胺四乙酸二钾、偏硅酸钠或其中任何螯合剂的组合。

可用于形成本发明的药物组合物和剂型的润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他二醇类、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、滑石粉、氢化植物油(如花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂或其混合物。

可用于形成本发明的药物组合物和剂型的增稠剂包括但不限于肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、新戊酸异癸酯(isodecyl neopentanoate)、角鲨烯、矿物油、C₁₂-C₁₅苯甲酸酯和氢化聚异丁烯。特别优选的是那些不会破坏最终产品中的其他化合物的试剂，如非离子型增稠剂。本领域的技术人员容易选择另外的增稠剂。

也可以加入其他物质，如抗菌剂，以防止储存过程中的变质，即抑制如酵母菌和霉菌的微生物的生长。合适的抗菌剂一般选自对羟基苯甲酸的甲基酯和丙基酯(即尼泊金甲酯和尼泊金丙酯)、苯甲酸钠、山梨酸、咪唑烷脲(imidurea)、purite、过氧化物、过硼酸盐及其组合。

可用于形成本发明的药物组合物和剂型的防腐剂包括但不限于purite、过氧化物、过硼酸盐、咪唑烷基脲、双咪唑烷基脲(diazolidinylurea)、苯氧乙醇、alkonium chlorides(包括苯扎氯铵)、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯。

制剂

在各种实施方式中，本文公开的一种或多种治疗药物的制剂在本发明的范围之内。例如，在各种实施方式中，肠胃外制剂可以是液体溶液或悬浮液的形式；对于口服施用，制剂可以是片剂或胶囊的形式；和对于鼻内制剂，可以为粉末、滴鼻剂或气溶胶的形式。

本领域中公知的用于制剂制备的方法可以在以下文献中发现，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy(第20版)，编辑A.R.Gennaro AR.，2000，Lippencott Williams & Wilkins。例如，用于肠胃外给药的制剂可包含作为赋形剂的无菌水或盐水，聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油或氢化萘、生物相容性生物降解性交酯聚合物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制本发明的药物的释放。用于因子的其他潜在可用的肠胃外给药系统包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注系统和脂质体。用于吸入的制剂可包含赋形剂(例如乳糖)，或可以是包含例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘氨胆酸盐(glycocholate)和脱氧胆酸盐(deoxycholate)的水溶液，或可以是用于以鼻滴剂形式施用的油性溶液或作为鼻内应用的凝胶。

本发明的因子可以作为唯一的活性剂使用，或可以与他活性成分(例如可能有助于神经疾病中的多巴胺能神经元存活的其他生长因子、或肽酶或蛋白酶抑制剂)结合使用。

本发明制剂中存在的因子的浓度随多种要素(包括待施用的剂量和施用途径)变化。

一般来说，可以在用于肠胃外施用的含有大约0.1％至10％w/v的多肽的水性生理缓冲溶液中提供本发明的因子。一般剂量范围为每天大约1mg/kg至大约1g/kg体重。

在某些实施方式中，剂量范围为每天大约0.01mg/kg至100mg/kg体重。待施用的优选剂量可能取决于待处理的病理生理状态的类型和发展程度、患者的总体健康情况、制剂的构成和给药途径。

短语“药学上的或药理学上可接受的”指当在合适的情况下向动物(例如，人类)施用时不产生有害反应、过敏反应或其他不良反应的分子实体和组合物。包含至少一种IL-1受体拮抗剂或另外的活性成分的药物组合物的制备是本领域的技术人员根据本公开已知的，如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版Mack Printing Company，1990(本文通过引用引入)中例示的。此外，对于动物(如人类)的施用，可以理解，制备应该满足FDA的生物标准局(FDA Office ofBiological Standards)规定的无菌性、致热性、一般安全性和纯度标准。

本文所用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、芳香剂、染料、诸如此类的物质及其组合，这是本领域的技术人员已知的(参见，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版.Mack Printing Company，1990，第1289-1329页，通过引用引入)。除非任何常规的载体与活性成分不相容，否则可设想其在治疗或药物组合物中使用。

治疗剂可能包含不同类型的载体，取决于它是否以固体、液体或气溶胶的形式施用，以及它是否需要无菌以用于如注射的施用途径。

在各种实施方式中，本发明的治疗性组合物可以经以下途径施用：眼内、静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、颅内、局部、肌肉内、腹膜内、皮下、囊内、经粘膜、口服、局部、本地、吸入(例如，气溶胶吸入)、注射、输注、连续输注、直接浸浴目标细胞的局部灌注、通过导管、通过灌洗、以乳膏形式(in cremes)、以液体组合物(如脂质体)、或通过本领域的技术人员已知的其他方法或前述方法的任何组合(参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，18版Mack Printing Company，1990，本文引入作为参考)。

通过将合适溶剂中的所需量的活性化合物与所需要的上面列举的各种其他成分合并，接着过滤消毒来制备无菌注射溶液。一般地，通过将各种灭菌活性成分掺入其中包含基本分散介质和/或其他成分的无菌载体中制备分散系。在用于制备无菌注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，制备的优选方法是真空干燥或冷冻干燥技术，其由其先前的无菌过滤液体介质产生活性成分加任何另外的所需成分的粉末。如果必要，液体介质应该适当地缓冲，且液体稀释剂在注射之前首先用足够的盐水或葡萄糖赋予等渗性。还考虑制备用于直接注射的高度浓缩的组合物，其中，设想使用二甲亚砜作为溶剂以产生极快速的渗透，从而向小的区域递送高浓度活性剂。

组合物在制造和储存条件下必须是稳定的，并防止微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。可以理解，内毒素污染应在安全水平下保持最小，例如，低于0.5ng/mg的蛋白质。

用于稳定本发明的固体蛋白质制剂的方法是增加纯化的(如冻干的)蛋白质的物理稳定性。这会抑制通过疏水相互作用以及通过共价键路径(其可能随蛋白质展开而增加)的聚集。在这种情况下的稳定制剂通常包括聚合物基的制剂，例如可生物降解的水凝胶制剂/递送系统。如上所述，水在蛋白质结构、功能和稳定性中的关键作用是公知的。通常情况下，蛋白质在除去大量水的固态中是相对稳定的。然而，固体治疗性蛋白制剂可能在高湿度下储存时或在由缓释组合物或装置递送的过程中成为水合的。蛋白质的稳定性一般会随着水化增加而降低。水在固体蛋白质聚集中也可以发挥重要作用，例如，通过增加导致反应基团的更高易接近性的蛋白质柔性，通过为反应物提供流动相和通过在几种有害过程(如β-消除和水解)中作为反应物。

包含大约6％至28％的水的蛋白质制剂是最不稳定的。低于这个水平，结合水的活动性和蛋白质内部运动低。超过这个水平，水流动性和蛋白质活动接近完全水化的水平。在几种系统中已观察到随水化增加而提高的对于固相聚集的敏感性，直到某一点。然而，在较高的水含量下，由于稀释效应而观察到较少的聚集。

在特别的实施方式中，通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝、明胶或其组合)可以导致可注射组合物的延长的吸收。

在各种实施例中，包含本发明的治疗剂的制剂包含稳定或递送载体。本文中的术语“载体(vehicle)”指防止降解和/或增加半衰期、降低毒性、降低免疫原性或增加治疗性蛋白的生物活性的分子。示例性的载体包括Fc域以及线型聚合物(如聚乙二醇(PEG)、聚赖氨酸、葡聚糖等)、支链聚合物(例如，参见，1981年9月15日授权的Denkenwalter等人的美国专利4,289,872；1993年7月20日授权的Tam的美国专利5,229,490；1993年10月28日公布的Frechet等人的WO 93/21259)、脂质、胆固醇类(如类固醇)、碳水化合物或寡糖、或结合补救受体(salvage receptor)的任何天然或合成的蛋白质、多肽或肽。

在一个实施方式中，本发明提供通过肽的N-末端、C-末端或一个氨基酸残基的侧链连接到至少一种载体(F₁，F₂)上的至少一种肽。也可使用多种载体，例如，在各个末端的多个Fc，或在一个末端的Fc和另一末端或侧链的PEG基团。

Fc域是优选的载体。Fc域可以与肽的N或C末端或同时与N和C末端融合。参见，例如WO 97/34631和WO 96/32478。在这种Fc变体中，可以除去天然Fc上提供不是本发明的融合分子所需的结构特征或功能活性的一个或多个位点。可以通过例如，替换或删除残基，向该位点插入残基，或截除包含该位点的部分而除去这些位点。插入的或替换的残基也可以是改变的氨基酸，如肽模拟物或D-氨基酸。Fc变体可能由于许多原因而是需要的，下面描述其中的几种。

可选择的载体是能够结合目标细胞上的受体或目标分子的蛋白质、多肽、肽、抗体、抗体片段或小分子(如，肽模拟化合物)。例如，可以使用1998年4月14日授权的Presta等人的美国专利5,739,277中描述的多肽作为载体。也可以通过结合FcRn补救受体的噬菌体展示选择肽。这种补救受体结合的化合物也包括在“载体”的含义之内，并在本发明的范围之内。为了增加半衰期(例如，通过避免蛋白酶识别的序列)和降低免疫原性(例如，如在抗体人化中发现的，通过有利于非免疫原性的序列)应选择这种载体。

在某些实施方式中，载体是聚乙二醇(PEG)。PEG可以具有任何合宜的分子量，且可能是直链的或分支的。PEG的平均分子量范围优选为大约2千道尔顿(“kDa”)至大约100kDa，更优选大约5kDa至大约50kDa，最优选大约5kDa至大约10kDa。在另一实施方式中，PEG的平均分子量为大约10kDa至大约20kDa，或20kDa至30kDa或30kDa至40kDa或40kDa至50kDa。PEG基团一般通过PEG部分的反应性基团(如醛基、氨基、巯基或酯基)与本发明化合物上的反应性基团(如醛基、氨基或酯基)的酰化或还原烷基化反应连接到本发明的化合物上。

合成肽的聚乙二醇化的有用策略包括通过在溶液中形成结合键而将各携带彼此相互反应的特定官能团的肽和PEG部分结合。可以使用本领域已知的常规固相合成方法很容易地制备肽。肽在特定的位点用合适的官能团“预活化”。在与PEG部分反应前，纯化并完全鉴定前体。肽与PEG的连接通常发生在水相中，并可以很容易地通过反相分析高效液相色谱进行监测。可以通过制备高效液相色谱很容易地纯化聚乙二醇化的肽，并通过分析高效液相色谱、氨基酸分析和激光解吸质谱鉴定。

多糖聚合物是可用于蛋白质修饰的另一种水溶性聚合物类型。葡聚糖是由主要通过a1-6键连接的单个葡萄糖亚单位组成的多糖聚合物。可获得许多分子量范围的葡聚糖本身，并可以容易地获得大约1kDa至大约70kDa的分子量。葡聚糖是本身作为载体或与另一种载体(例如，Fc)组合用于本发明中的合适的水溶性聚合物。参见，例如，WO 96/11953和WO 96/05309。已报告了结合治疗性或诊断性免疫球蛋白的葡聚糖的用途，参见，例如，欧洲专利公布0 315 456，本文通过引用引入。当葡聚糖根据本发明用作载体时，优选大约1kDa至大约20kDa的葡聚糖。

剂量

向动物施用的本发明的组合物的实际剂量可以通过身体和生理因素确定，如体重、状况的严重性、治疗的疾病种类、以前或同时存在的治疗性干预、患者的特发病和给药途径。负责用药的医生在任何情况下确定组合物中的活性成分的浓度和用于受试者个人的适当剂量。

在某些实施方式中，药物组合物可包含，例如，至少大约0.1％的活性化合物。在其他实施方式中，活性化合物可能占单位重量的大约2％至大约75％、或大约25％至大约60％，例如，其中可导出的任何范围。在其它非限制的例子中，剂量还可能包含每次给药大约1纳克/千克/体重、大约5纳克/千克/体重、大约10纳克/千克/体重、大约50纳克/千克/体重、大约100纳克/千克/体重、大约200纳克/千克/体重、大约350纳克/千克/体重、大约500纳克/千克/体重、1微克/千克/体重、大约5微克/千克/体重、大约10微克/千克/体重、大约50微克/千克/体重、大约100微克/千克/体重、大约200微克/千克/体重、大约350微克/千克/体重、大约500微克/千克/体重、大约1毫克/千克/体重、大约5毫克/千克/体重、大约10毫克/千克/体重、大约50毫克/千克/体重、大约100毫克/千克/体重、大约200毫克/千克/体重、大约350毫克/千克/体重、大约500毫克/千克/体重至大约1000毫克/千克/体重或更多，及其中可导出的任何范围。在从本文的列出的数值可导出的范围的非限制性的例子中，可以根据上述的数值施用大约5毫克/千克/体重至大约100毫克/千克/体重、大约5微克/千克/体重至大约500毫克/千克/体重等。

在进一步的实施方式中，组合物可能包括各种抗氧化剂以延缓一种或多种成分的氧化。此外，可以通过防腐剂(如各种抗菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(如尼泊金甲酯、尼泊金丙酯)、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合)产生对微生物作用的预防。

在本发明的另外的实施方式中，治疗方法包括在特定时间段(如治疗有效时间段)施用本发明的治疗剂(例如，MANF，或MANF与一种或多种另外的神经营养因子的组合)。在某些实施方式中，特别考虑本发明的施用制剂或编码MANF或其生物功能片段的核酸。在某些实施方式中，设想该时间段是脊髓损伤时间的1小时至脊髓损伤后的72小时内的时间。在另外的实施方式中，该时间段在脊髓损伤后的1小时至72小时开始。在再进一步的实施方式中，该时间段在长度上为24小时至72小时或在长度上为3至6天。设想治疗可以在损伤发生的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时或1、2、3、4、5、6、7天或1、2、3、4、5周或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月之内或之后实施。此外，设想治疗可以为持续实施1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时或1、2、3、4、5、6、7天或1、2、3、4、5周或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长时间。设想长期施用持续5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时或更长。还设想多次施用。在某些实施方式中，给予施用至少两次(重复至少一次)。

可以向受试者施用不同量的治疗剂。在某些实施方式中，所施用的本发明的制剂(例如，蛋白质或核酸)的量为每小时每千克体重1至1000纳克。在其他实施方式中，该量为每小时每千克体重1至100纳克或每小时每千克体重1至10纳克。设想剂量可以是每小时每千克体重1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000纳克(纳克/千克/小时)。也设想剂量还可能是至少和/或不超过那些相同的量。

基因转移

如上所述，基因疗法是另一种潜在的治疗途径，其中将编码MANF多肽的基因的正常拷贝(或编码MANF有义RNA的多核苷酸)引入细胞中以成功地产生MANF多肽。必须以其中基因可以被吸收并编码足够的蛋白质以提供有效的促进多巴胺能神经元存活的活性的形式将基因输送到那些细胞中。

具有对于神经细胞合适的趋向性的逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或其他病毒载体可以用作治疗性MANF构建体的基因转移系统。许多用于此目的的有用载体通常是已知的(Miller，HumanGene Therapy 15-14，1990；Friedman，Science 244：1275-1281，1989；Eglitis和Anderson，BioTechniques 6：608-614，1988；Tolstoshev和Anderson，Curr.Opin.Biotech.1：55-61，1990；Sharp，The Lancet 337：1277-1278，1991；Cometta等人，Nucl.Acid Res.and Mol.Biol.36：311-322，1987；Anderson，Science 226：401-409，1984；Moen，Blood Cells 17：407-416，1991；Miller等人，Biotech.7：980-990，1989；Le Gal La Salle等人，Science 259：988-990，1993；及Johnson，Chest 107：77S-83S，1995)。逆转录病毒载体尤其得到充分发展，并已用于临床环境(Rosenberg等人，N.Engl.J.Med.323：370，1990；Anderson等人，美国专利5,399,346)。非病毒的方法也可用于将治疗性的DNA引入所需的细胞中。例如，可以通过以下方法将编码MANF的多核苷酸引入细胞中：脂质转染法(Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413，1987；Ono等人，Neurosci.Lett.117：259，1990；Brigham等人，Am.J.Med.Sci.298：278，1989；Staubinger等人，Meth.Enzymol.101：512，1983)、脱唾液酸血清类粘蛋白(asialorosonucoid)-聚赖氨酸偶联(Wu等人，J.Biol.Chem.263：14621，1988；Wu等人，J.Biol.Chem.264：16985，1989)或较不优选地，手术条件下的微注射(Wolff等人，Science 247：1465，1990)。

也可以使用在体外感染需要的非病毒方式实现基因转移。这包括磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合。脂质体也可能对于递送DNA进入细胞是潜在有益的。虽然这些方法是可用的，但其中很多是低效率的。

在所描述的构建体中，MANF或前MANF cDNA表达可由任何合适的启动子(例如，人类巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)或金属硫蛋白启动子)引导，并受任何合适的哺乳动物调控元件调节。例如，如果需要，已知优先引导神经细胞中的基因表达的增强子可用于引导MANF肽的表达。可使用的增强子可以包括但不限于那些鉴定为在其表达中为组织或细胞特异性的增强子。

可以修饰RNA分子以增加细胞内的稳定性和半衰期。可能的修饰包括但不限于，在分子的5′和/或3′末端添加侧翼序列或在分子骨架内使用硫代磷酸酯(phosphorothioate)或2′O-甲基而不是磷酸二酯酶连接。通过包含不易被内源性核酸内切酶识别的非传统的碱基(如肌苷、Q核苷(queosine)和怀丁苷(wybutosine)以及腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷的乙酰基、甲基、硫代和类似修饰形式)可以将这一概念扩展至所有这些分子。

组合的

此外，任何基于MANF的治疗剂与一种或多种另外的治疗剂结合，包括但不限于MANF2(参见美国专利申请公布20060084619)、CDNF、干扰素γ、神经生长因子、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经原素(neurogenin)、脑源性神经营养因子(BDNF)、甲状腺激素、骨形态发生蛋白(BMP)、白血病抑制因子(LIF)、音猬因子(sonic hedgehog)、神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素、干扰素、干细胞因子(SCF)、活化素(activin)、抑制素、趋化因子、视黄酸(retinoic acid)和睫状神经营养因子(CNTF)或其组合。美国专利申请公布20080057028、20070082848、20070077649公开了用于本发明的方法和组合物的另外的治疗剂和方法的例子。

组合物可以单独施用或与至少一种其他试剂(如稳定化合物)结合施用，其可在任何无菌、生物相容性药用载体(包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水)中施用。可以向患者单独施用该组合物，或结合其他试剂、药物或激素施用。

虽然人类MANF优选用于本文所述的方法中，但已经在许多物种(包括大鼠、小鼠和牛)中鉴定了MANF。本领域的技术人员可以认识到，可以使用标准方法很容易地进行来自其他动物的MANF的鉴定。任何具有促进多巴胺能神经细胞的存活的活性的并且由与编码人ARP的cDNA杂交的核酸编码的蛋白质被认为是本发明的一部分。

下面的实施例是为了举例说明本发明。它们并不以任何方式限制本发明。

实施例1：VMCL-1细胞的产生和分析

如下制备VMCL-1细胞系。在含有10％(v/v)胎牛血清的培养基中培养其中大约2-3％是成神经胶质细胞的大鼠E14中脑细胞12小时，随后在包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为有丝分裂原的无血清培养基扩增。超过15 DIV后，观察到几个增殖的、神经胶质样细胞的岛。在分离和传代后，该细胞(本文称为VMCL-1细胞)在无血清或含血清的生长培养基中快速增殖。随后的免疫细胞化学分析表明，它们对于两种星形细胞标记物(GFAP和波形蛋白)染色为阳性，并对于少突胶质细胞或神经细胞系(包括A2B5、O4、GalC和MAP2)的标记物为阴性。我们已在ATCC保藏了该VMCL-1细胞系(保藏号：PTA-2479；保藏日期：2000年9月18日)。

由VMCL-1细胞制备的无血清CM，导致培养物中的E14中脑多巴胺能神经元的存活和分化增加。这些作用类似于由原代中脑1型星形胶质细胞获得的CM施加的作用。中脑区域特异性的基因(例如，wnt-1、en-1、en-2、pax-2、pax-5和pax-8)的表达在VMCL-1细胞和E14腹侧中脑源的原代1型星形胶质细胞之间是类似的。在这二者中，Wnt-1表达强烈，而en-1较不强烈，从而支持其预期的中脑源表达模式。染色体分析表明，70％细胞为异倍体，且其中50％为四倍体。在超过25次传代后，观察到增殖能力没有明显下降。该细胞系的性质与永生的1型星形胶质细胞是一致的。

VMCL-1细胞具有明显的非神经元的、神经胶质样形态，但缺乏培养中的1型星形胶质细胞典型的大的扁平形状。免疫细胞化学分析表明，它们对于GFAP和波形蛋白染色为阳性，并对于MAP2、A2B5和O4为阴性。因此，这些细胞不是少突胶质细胞谱系。基于与A2B5的阴性反应及其形态特征，它们也不是2型星形胶质细胞。虽然，如上所述，这些细胞缺乏培养中的原代1型星形胶质细胞的典型形态特征，但由免疫细胞化学证据支持的分类是1型星形胶质细胞。

实施例2：VMCL-1CM对于培养中的E14多巴胺能神经元的作用

以0、5、20和50％v/v的比率测试VMCL-1CM影响培养中的E14中脑多巴胺能神经元的存活和发育的能力。用10％胎牛血清(FBS)启动(prime)培养12小时，然后在无血清培养基中生长，直到它们在7DIV后染色并分析。CM对于多巴胺能神经元存活的提高具有剂量依赖性的作用。CM增加存活5倍。相反，非多巴胺能神经元存活没有显著增加。这种假定因子的生物学作用的特征完全不同于源自B49胶质瘤细胞系的CM(GDNF源)的特征(Lin等人，Science 260：1130-1132)。

实施例3：VMCL-1细胞的基因表达分析

为进一步研究VMCL-1细胞系和原代培养的星形胶质细胞之间的相似性，我们测量了作为中脑区域的特征的6种标记基因的表达。wnt-1、en-1、en-2、pax-2、pax-5和pax-8的分析显示，除pax-2外，所有基因在E13和E14腹侧中脑神经组织中表达，pax-2在E13神经组织中表达但不在E14神经组织中。原代星形胶质细胞和VMCL-1细胞以相当于E13和E14腹侧中脑神经组织中的表达水平来表达wnt-1。虽然相对于E13和E14腹侧中脑神经组织中的表达为较低的水平，但en-1的表达程度在原代星形胶质细胞和VMCL-1细胞中是相似的。相反，在原代星形胶质细胞或VMCL-1中en-2、pax-5和pax-8不表达。Pax-2在E13而不是E14腹侧中脑中和在原代星形胶质细胞而不是在VMCL-1中表达。

实施例4：VMCL-1细胞的染色体分析

在34个细胞中进行染色体计数。其中，9个具有42的计数，这对于大鼠是二倍体的数目。在25个为异倍体的细胞中，12/25或48％是在四倍体范围之内。超二倍体(43-48的计数)和亚二倍体(39-41的计数)细胞各占群体的20％，而12％的细胞具有结构重排的染色体。

VMCL-1 CM增加培养中的多巴胺能神经元的存活的选择性作用提供了对于这种细胞系产生的分子的潜在的临床用途。在50％v/v的浓度下缺乏VMCL-1 CM的毒性作用表明活性的、假定的神经营养因子没有毒性。VMCL-1 CM发挥的作用几乎精确地与由中脑原代1型星形胶质细胞制备的CM的作用对应。由以下观察强烈地表明来自VMCL-1的假定因子对于多巴胺能神经元的高度特异性：没有显著增加总体神经元存活率，而多巴胺能神经元的存活率提高5倍。这表明，原代1型星形胶质细胞表达GDNF mRNA，但没有通过蛋白质印迹在CM中以50pg的灵敏度检测到GDNF蛋白。此外，它表明，在本实验条件下，由最佳浓度的GDNF介导的多巴胺能神经元存活率的增加从来没有超过2倍。这些观察单独地表明，造成VMCL-1 CM的神经营养作用的因子不是GDNF。

实施例5：1型星形胶质细胞-条件培养基的产生

过滤E16 1型星形胶质细胞CM(10L)，并施加到先前用pH值7.6的含有0.2M氯化钠的20mM Tris-HCl(Mallinckrodt Chemical Co.Paris，Ky.)平衡的肝素琼脂糖CL-6B柱(床体积80毫升)上。用平衡缓冲液冲洗后，用20mM Tris-HCl pH 7.6中的0.2M-2M NaCl的线性梯度(400毫升总体积，流速为100毫升/小时)从柱洗脱结合的蛋白质。使用Pharmacia LKB级分收集器收集级分，并在280nm(Sargent-WelchPU 8600UV/VIS分光光度计)测量吸光度。从各个级分采集1mL的等分试样，汇集为4个等分试样的组(4毫升总体积)，并使用Centricon-10.RTM膜浓缩器(Millipore，Bedford，Mass)脱盐。用确定成分的培养基按1∶4稀释样品，并生物测试多巴胺能活性。汇集活性级分(80毫升总体积)，然后施加到已用pH值7.4的50mM甲酸铵预平衡的G-75 Sephadex.RTM柱(70x2.5cm，Pharmacia Biotechnology Ltd.，Cambridge，UK)上。用同样的缓冲液(流速75毫升/小时)分离蛋白质，并在280nm处测量吸光度。从各级分采集1mL的等分试样，汇集为4个等分试样的组(4毫升总体积)，通过冻干法浓缩，并在1mL蒸馏水体积中重构。然后用确定成分的培养基按1∶4稀释样品用于多巴胺能生物测试。那些具有神经营养活性的样品进一步按单个级分进行生物测试。

VMCL-1CM的重要区别特征在于与培养中存在的GABA能、5-羟色胺能和其他神经元表型的存活相比，它主要促进多巴胺能神经元的存活。GDNF也具有这种特异性。但是，大量测试结果表明，该VMCL-1源的化合物不是GDNF。

实施例6：具有促进多巴胺能神经元存活活性的蛋白质的分离和纯化

如下进行纯化方案。所用的所有的盐具有最高纯度，并由SigmaChemical Co获得。所有的缓冲液为新鲜制备，并通过0.2μM的过滤器(来自Millipore的GP快速真空驱动系统)过滤。

第1步：肝素琼脂糖柱色谱法(4℃)

在室温下用等体积的pH值7.2的磷酸钠缓冲液稀释3升VMCL-1条件培养液，过滤，并用5K PREP/SCALE-TFF 2.5平方英尺筒(Millipore)浓缩至550毫升体积。将浓缩的材料加载到由2x5mLHiTrap Heparin柱(Pharmacia Biotech)装配并用至少100mL的10mM的pH值7.2的磷酸钠缓冲液(缓冲液A)预平衡的10毫升肝素琼脂糖柱上。加载完成后，用100mL缓冲液A冲洗柱。以各大约3毫升体积用缓冲液B(缓冲液A加1M氯化钠)洗脱总共10个级分。取出300L的样品用于分析。

步骤2：Superose 12柱色谱(4℃)

汇集第1步的所有级分，然后使用Centricon Plus-20浓缩器(5,000MWCO，Millipore)浓缩至4.5mL，加载到用Superose 12介质(制备级，Sigma Chemical Co.)填充的16x600mm凝胶过滤柱上，并用至少300mL的含有0.6M氯化钠的pH值7.2的20mM磷酸钠缓冲液(GF缓冲液)预平衡。在GF缓冲液进行蛋白质洗脱。收集2毫升级分，并分析活性。在84毫升GF缓冲液通过柱之后，活性蛋白质在15毫升有体积中洗脱，并且根据用蛋白质标准物(Bio-Rad)获得的柱校准数据，对应于大约20-30kDa的洗脱区域。

第3步：陶瓷羟基磷灰石柱色谱(室温；FPLC系统)

汇集步骤2中对应于20-30kDa的洗脱区域的活性级分，并使用Centricon Plus-20浓缩器(5,000 MWCO)浓缩至7.5毫升，在4℃下相对于2升pH值7.2的10mM磷酸钠缓冲液(缓冲液A)渗析过夜，并加载(通过Superloop)到用缓冲液A平衡的1mL预填充陶瓷羟基磷灰石柱(I型，Bio-Rad)上。在用缓冲液A冲洗掉过量的未结合蛋白质(通流(flow-through))之后，应用0至100％的含有1.0M NaCl的线性梯度缓冲液A。收集1毫升的级分并分析活性。在对应于0.4-0.8M氯化钠浓度的梯度区域内活性蛋白质洗脱为宽峰。

步骤4：阴离子交换柱色谱(室温；FPLC系统)

汇集对应于宽峰的级分(总体积＝15毫升)，并使用CentriconPlus-20浓缩器(5,000 MWCO)浓缩至6毫升，在4℃下相对于2升的pH值7.5的20mM Tris HCl缓冲液(缓冲液A)渗析过夜，加载(通过Superloop)到1毫升的阴离子交换FPLC柱(Uno，Bio-Rad)上，并用缓冲液A平衡。在用缓冲液A冲洗掉过量的未结合蛋白质之后，应用0至100％的1M NaCl(于缓冲液A中)的线性梯度。收集1毫升的级分，并分析活性。在通流(即未结合蛋白质的级分)中发现活性蛋白质。

步骤5：BioSil 125柱色谱法(室温；HPLC系统)

使用Centricon Plus-20浓缩器(5,000 MWCO)将步骤4的活性蛋白质级分(7毫升的总体积)浓缩至接近零体积(大约1μL)，并在0.6毫升的pH值7.2的10mM磷酸钠缓冲液中重构。将重构的材料(70μL，分析试验)加载到用pH值7.2的20mM磷酸钠缓冲液(GF缓冲液)平衡的BioSil 125高效液相色谱凝胶过滤柱(Bio-Rad)上。使用HP 1100系列HPLC系统(Hewlett-Packard)进行色谱法。以120μL级分收集洗脱液，并分析活性和蛋白质含量(SDS-PAGE)。在与从柱洗脱的280nm的主吸收峰相关的级分中发现活性，根据SDS-PAGE分析所述级分代表45kDa的蛋白质。然而，在45-kDa的蛋白质峰的旁边级分(side fraction)中没有发现活性，从而表明活性可能是由于与45kDa蛋白质共洗脱的另一种蛋白质的存在，但浓度为可能在12％的SDS-PAGE银染凝胶中无法检测到的非常低的浓度。因此，使用Centricon-3浓缩器(Millipore)进一步浓缩来自第5步的剩余浓缩物质至80μL的体积，且加载60μL，并在与上述的分析试验相同的条件下在柱上分离。从各120μL的洗脱液级分取出8μL的等分试样，并通过与银染相结合的SDS-PAGE(12％凝胶)进行分析。这一分析表明，另外两种其他蛋白质(具有大约18和20kDa的分子量)与活性级分相关联，并与主要的45-kDa蛋白质共洗脱。活性级分相对于1L的pH值8.0的醋酸铵缓冲液(4℃)渗析，并合并以产生两个集合(pool)P-1和P-2，使得P-1包含20kDa的蛋白质和45kDa的蛋白质，和P-2包含18kDa的蛋白质和45kDa的蛋白质。用SpeedVac真空浓缩器(Savant)干燥各个集合，并分别在pH 6.9的15μL的0.1M醋酸铵缓冲液中重构。从各个样品取出等分试样，并测试活性。此外，1μL等分试样进行12％的SDS-PAGE分析接着进行银染。

上述分析的结果清楚地表明了P-1而不是P-2包含所需的促进存活的活性。在接下来的步骤中，在SpeedVac上干燥P-1和P-2，(各)在10μL的新制备SDS-PAGE还原性样品缓冲液(Bio-Rad)中重构，在沸水浴中孵育1分钟，并加载到12％的SDS-PAGE凝胶上。电泳完成后，在室温下将凝胶于甲醇/醋酸/水溶液(50∶10∶40)中固定40分钟，用超纯水(nanopure water)清洗3次，并在室温下用GelCode蓝染色试剂(Pierce)染色过夜。染色完成后，用超纯水从凝胶洗掉GelCode溶液，用刀片从凝胶切除对应于45kDa蛋白质(P-1和P-2)和20kDa蛋白质(仅P-1)的可见蛋白质带。含有相应带的各凝胶片被放置在1.5ml的离心管中直到胶内消化的时间。μ

实施例7：通过nESI-MS/MS对胶内酶切片段(In-Gel Digested Fragments)的分析

在室温下，用30％的乙腈(aq.)中的100mM的碳酸氢铵孵育蛋白质凝胶带1小时，以去除胶状考马斯亮蓝染色。多次更换脱色溶液，直至完全除去染料。然后，用去离子水(大约200μL)覆盖凝胶块，并振摇10分钟。在乙腈中对凝胶块脱水，并在去除过量液体后，用离心蒸发器完全干燥。用含有200ng改性胰蛋白酶(Promega，Madison，Wis.)的20μL的50mM碳酸氢铵(pH 8.3)对凝胶带再水化。用pH 8.3的50mM碳酸氢铵(大约50μL)覆盖凝胶块，并在37℃下孵育过夜。然后将消化溶液转移到干净的Eppendorf管中，并在50-100μL的5％醋酸(aq.)中超声处理凝胶块30分钟。提取溶液与消化溶液合并，并用离心蒸发器蒸发至干燥。

首先使用Voyager Elite STR MALDI-TOFMS仪(Applied BiosystemsInc.，Framingham，Mass.)，通过的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)分析胶内消化提取物。将提取物溶解于5μL的50％乙腈、1％醋酸中。二羟基苯甲酸用作基质，并以正离子、反射模式获得图谱。各样品的大约五分之一用于这一分析。这些图谱提供了消化提取物中肽的质量，其然后用来搜索内部、非冗余蛋白质序列数据库，这一过程称为肽质量指纹识别。样品的剩余部分用于通过纳电喷雾电离(nanoelectrospray ionization)-串联质谱(nESI-MS/MS)的肽序列分析。首先使用C18 ZipTips(Millipore)对提取物脱盐，并重新溶于75％甲醇(aq.)、0.1％醋酸(5μL)中。大约一半的样品被加载到纳电喷雾玻璃毛细管(Micromass)中。使用Q-Star-四极管飞行时间混合质谱仪(PESCIEX，Concord，ON)进行nESI-MS/MS分析。以正离子模式进行所有的MS/MS分析。碰撞气为氮气和碰撞能量为40-60eV。通常在两分钟的时间内每秒获得MS/MS图谱。MS/MS图谱用来使用部分序列标签检索内部的非冗余蛋白质序列数据库(即，只有肽质量和一些碎片离子用于检索数据库)。如果蛋白质没有通过该程序鉴定，那么尽可能完全地从MS/MS谱图确定两种或多种肽的氨基酸序列。这些序列用于在NCBI的蛋白质、核酸和EST序列数据库中进行BLAST检索。

实施例8：MANF(ARP的分泌形式)的鉴定

为了使ARP成为对于产生所观察的VMCL-1 CM神经营养活性的至少一部分的因子，必须从细胞释放蛋白质。但是，预测的ARP的氨基端具有碱性负荷(basic charge)(一种有利于在细胞核内保留的性质)。尽管如此，我们假设也存在分泌形式。

在Goo等人(Molecules and Cells 9：564-568，1999)的出版物中，确认了编码果蝇(Drosophila melanogaster)的ARP样蛋白的基因，同时使用酵母信号序列捕获技术筛选cDNA文库。这种cDNA编码的推定的ARP样蛋白质缺乏富含精氨酸的氨基末端。分泌果蝇的ARP样蛋白，使用SignalP程序，我们鉴定了果蝇的ARP样蛋白质的信号肽(残基1-22)和丙氨酸22和亮氨酸23之间的信号肽酶切割位点，从而提供了另外的证据。

基于人类ARP和果蝇ARP样蛋白之间的比对，我们推测，人类ARP具有信号序列和信号肽酶切割位点。因此，我们使用SignalP程序来分析缺乏富含精氨酸的氨基末端(氨基酸1-55)的人类ARP；这种多肽现在被称为前MANF。在该实施例中，位置56的蛋氨酸为起始密码子。SignalP程序预测了由SEQ ID NO：2的残基1-21构成的信号肽及丙氨酸21和亮氨酸22之间的切割位点，其与从果蝇的ARP样蛋白得到的分析结果一致。

部分基于我们对果蝇的ARP样蛋白(GenBank登录号AF13291_--1)和人类的ARP的分析，我们预测，翻译可以在人类ARP的1位的蛋氨酸或56位的蛋氨酸开始。在后一种情况下，含有信号肽的蛋白质(前MANF)能够以MANF的形成从细胞分泌，其中，该蛋白质作为神经营养因子发挥作用。但是，我们关于MANF存在的发现没有排除含有富含精氨酸的氨基末端区域的ARP的细胞内功能。

实施例9：大肠杆菌中表达的MANF的生物活性

使用含有编码人MANF的pTriEx的核苷酸，在大肠杆菌细菌细胞中进行重组蛋白的表达。从350毫升细菌细胞培养物中获得总共4毫克纯化的重组MANF，其鉴定通过质谱测序确认。测试这种蛋白质保护多巴胺神经元的能力。在大肠杆菌中表达的MANF能够以VMCL-1条件培养基同样的程度保护多巴胺神经元免于细胞死亡。

实施例10：对于HEK293细胞中表达的真核MANF的剂量-反应

使用含有20％的多巴胺能神经元的多巴胺能细胞培养分析系统测试人MANF(99％纯，在HEK293细胞中产生)相对于多巴胺能神经元的存活的剂量关系。通过二氧化碳麻醉处死E14怀孕大鼠。将躯干浸泡在70％乙醇中，进行剖腹手术(laporatomy)，除去子宫囊，并转移至含有20毫升冷HBSS(pH 7.4)的50毫升管中。依次将各子宫囊转移到含有15毫升冷HBSS的10厘米的皮氏培养皿中。完整除去胎儿，完整分离各个大脑，并转移到含有15毫升冷HBSS的新10厘米皮氏培养皿中。在中脑曲的顶部切开中央腹侧中脑(VM)，以获得堆积密度为1.0x1细胞/mm³的1.0mm³的组织块。将VM组织转移到含有10毫升冷PCM10的15毫升管中。用PCM10(具有2mM谷氨酰胺、5毫克/毫升胰岛素、5毫克/毫升转铁蛋白、5毫克/毫升亚硒酸钠的DMEM/F12，20nM孕酮，30nM甲状腺素，10％胎牛血清)清洗汇集的VM组织(三次清洗)，接着在无血清培养基(PCM0；除了缺乏胎牛血清之外，与PCM10相同)中单次洗涤，并在37℃下在含有木瓜蛋白酶(10U/mL)的2.0毫升PCM0中消化15分钟。然后用PCM10冲洗组织(3x5毫升)以灭活蛋白酶的活性。使用设置为500μL的P-1000，在2.0毫升PCM0中进行研磨。终点是没有组织团块迹象的乳状悬浮液。将分散的细胞离心(1,000rpm，2分钟，4℃)，计数，然后以6.25x10⁵细胞/mL的密度再悬浮于PCM10中。在这个阶段测试细胞存活率，通常是＞95％。

将细胞作为25μL的微岛(MI)小滴(1.56x10⁴细胞/MI)接种在涂有聚D-赖氨酸的8孔腔室培养玻片上。25μL的MI小滴占据12.5mm²的面积。MI的平均、最终平均细胞密度因此为1.25x10⁵细胞/cm²。MI中心的平均细胞密度大约是2.0x10⁵/cm²，在MI边缘落到＜1.0x10⁴的水平。在37℃、5％CO₂中在100％湿度下孵育MI45分钟，以使细胞附着在涂覆的表面上。附着之后，向每孔中加入375μL的PCM10，并细胞进行血清启动4小时。在启动结束时，吸取100％的PCM10，并用不含血清的PCM0取代。

如下制备MANF。将人前-MANF克隆到pTriEx表达载体中。在HEK293细胞中进行重组蛋白的表达。从800毫升HEK293细胞条件培养基获得20微克纯化的缺乏信号序列的重组MANF。其鉴定通过质谱测序分析确认。

在第一、第三和第五天用标示量的MANF处理培养物。固定培养物，并使用载体ABC法或间接免疫荧光在DIV6或DIV7进行染色。

早在DIV3时，在测试的MANF的不同浓度之间存在显著性的差异(ANOVA，P＜0.001)。使用Tukey分析方法的配对比较表明250和500pg/ml及1.0和10ng/nL的MANF显著不同于对照(P＜0.05)。

实施例11：BDNF、GDNF和MANF之间效力的次序

当测试BDNF、GDNF和MANF的3个等效剂量时，效力的次序为：MANF＞GDNF＞BDNF，表明MANF的两个较低浓度相对于低剂量的BDNF或GDNF对多巴胺神经元更具有选择性。在最高剂量下，效力的次序为：GDNF＞MANF＞BDNF。一般来说，BDNF往往效力最强，但保护多巴胺神经元的特异性最低。在较低浓度时，MANF往往对于保护多巴胺神经元最具有选择性。但是，在一个实施方式中，设想MANF与GDNF和/或BDNF共同施用，以实现增强的有益效果。

实施例12：对MANF的响应的选择性

测试MANF保护其他脑区的神经元的能力。没有观察到对大鼠小脑颗粒神经元、结节感觉神经元或交感去甲肾上腺素能神经元的保护作用。同样，在腹侧中脑培养中，在MANF证明对多巴胺神经元有保护作用的培养中似乎没有对于GABA能和5-羟色胺能神经元的活性。与上述结果相反，MANF对培养中的背根神经节细胞亚群有保护作用。背根神经节由至少3个神经元的亚群组成。已经证明，NGF、BDNF和NT-3，神经营养因子家族的所有神经营养素成员，各对于这些神经元的不同亚群发挥作用。因此，MANF对于背根神经节神经元的这一亚群的作用是与神经营养因子的一般神经保护性质一致。

实施例13：MANF多克隆抗体的产生

如下制备多克隆抗体。在大肠杆菌中制备His标记的全长MANF。每只兔每次注射200ug的纯化MANF蛋白质进行6次抗原注射(在第1、21、35、49、63和70天各一次)。在第84天收集血清(100毫升血清/兔)。

蛋白质印迹分析用于测试MANF-pAb的活性。相对较高量的MANF(720ng)用于MANF-pAb活性的初步测试，其在1∶12,800的稀释度时保持活性。在接下来的测试中，MANF的稀释度固定为5000，且MANF的量在1,000至15.6ng之间变化。很容易检测到最低15.6ng的MANF量。在BDNF和GDNF的交叉反应性的测试中，结果表明，即使以3倍的MANF量(32ng)，MANF-pAb仍不与BDNF或GDNF交叉反应。

用以下方法获得上述结果。

中脑培养

如前所述(Shimoda等人，Brain Res.586：319-323，1992；Takeshima等人，J.Neurosci.14：4769-4779，1994；Takeshima等人，Neuroscience.60：809-823，1994；Takeshima等人，J.Neurosci.Meth.67：27-41，1996)，从定时怀孕的Sprague-Dawley大鼠(Taconic Farms；Germantown，N.Y.)制备中脑神经细胞培养物。收集切开的组织，并根据实验目的汇集于加氧的冷(4℃)HBSS中或包含10％胎牛血清(Biofluids Laboratories，Rockville，Md.)的培养基中。在妊娠第14天(即E14)，通过暴露于二氧化碳中处死怀孕大鼠，用70％乙醇清洁腹部区域，进行剖腹手术，收集胎鼠，并汇集于冷的无Ca²⁺或Mg²⁺的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(pH7.4)中。然后除去完整大脑，在间脑和中脑之间进行切开，从中央切开顶盖并横向展开。分离包括中脑多巴胺能区域的1.0mm³的中间组织块。切开的组织块集中于冷的(4℃)、加氧的培养基中。无需预先消化磨碎组织。可选择地，在37℃下，在含有10U/mL的木瓜蛋白酶(Sigma Chemical Co.)的L-15生长培养基中孵育细胞15分钟，用培养基(3x2mL)清洗，并仅使用针和注射器磨碎。将分散的细胞转移到1.5毫升Eppendorf管中(1.0毫升/管)，并以600g离心2分钟。使用较长时间的较高离心速度导致培养物的碎片污染，从而导致细胞的亚最佳生长。仔细吸取培养基，且细胞再悬浮于新鲜培养基中并使用血球计计数。在2小时内完成从剖腹手术至接种的所有程序。在典型的实验中，10-15胎鼠的一窝产生1.0x10⁵细胞/胎或1.0x10⁶-1.5x10⁶细胞/窝。

中脑微岛培养

为了制备中脑微岛培养物，如上所述制备细胞，并以5.0x10⁵mL的最终密度再悬浮。使用100μL吸液管将悬浮液的25uL小滴(1.56x10⁴细胞)接种在涂有聚-D-赖氨酸(50ug/mL)的8孔腔室培养玻片上。小滴的面积为大约12.5mm²，达到最终的平均细胞密度1.0x10⁵/cm²。均匀地分散小滴，垂直撤回吸液管尖端，以免拖尾。微岛培养物占据的面积在培养过程中保持均一。在37℃、5％CO₂中在100％湿度下孵育培养物30分钟，以使细胞粘附，然后向每孔添加375uL的生长培养基。在第一个12小时后更换培养基，之后每隔一天更换大约一半的培养基。

细胞存活力测试

双色荧光细胞存活力检测试剂盒(活的/死的存活力/细胞毒性检测试剂盒，#L-3224，Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oreg.)用于在接种之前和在培养中鉴定活的和死的细胞。活的和死的细胞分别发出绿色和红色荧光，从而给出存活力的两种阳性指标。用DPBS稀释溴乙啡锭同型二聚体(ethidium homodimer)和钙黄绿素-AM，以分别给出3.8μM和2.0μM的最终浓度。在接种之前完成细胞存活力的评价。室温下在盖有盖玻片的黑暗的湿润容器中，在载玻片上与等体积的染料(通常是20μL)一起孵育细胞悬浮液15分钟，然后使用FITC光学器件以荧光光学显微镜检查。恰在接种前细胞存活率为大约95％。

培养基

使用的无血清培养基由等体积的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)和Ham′s F-12(Gibco，Grand Island，N.Y.；320-1320AJ)、1.0毫克/毫升牛白蛋白部分V(Sigma Chemical Co.；A4161)、0.1μg/毫升载脂-转铁蛋白(apo-transferrin)(Sigma；T-7786)、5μg/毫升胰岛素(Sigma；I-1882)、30nM的L-甲状腺素(Sigma；T-0397)、20nM孕酮(Sigma；P-6149)、30nM亚硒酸钠(Sigma；S-5261)、4.5mM谷氨酰胺(Gibco，320-5039AF)、100U/mL的青霉素和100μg/mL链霉素(Gibco；P-100-1-91)组成。

由VMCL-1细胞系制备条件培养基

在由VMCL-1细胞系制备条件培养基时，将2.0x10⁶细胞接种于15厘米未涂覆的培养皿中，20毫升含有1.0％胎牛血清的培养基中。在80％汇合时，吸取培养基并用无血清培养基清洗细胞一次。加入20毫升无白蛋白的无血清N2培养基，并且使得适应继续48小时。在这段时间内，细胞通常扩增到100％汇合。吸取培养基，汇集于50毫升的管中，离心(15,000rpm进行20分钟)，且随后汇集在1.0升塑料瓶中。通常每批5mL的CM经使用0.22μm过滤器过滤消毒，在-70℃下储存5毫升的等分试样，并用于在与较大存储的CM汇集之前测定神经营养效力。如果需要，VMCL-1CM可以使用本领域的技术人员已知的标准工业细胞培养技术大批量制备。

1型星形胶质细胞的条件培养基的产生

如下制备1类星形胶质细胞。在冷的DPBS中切开E16大鼠胚胎脑干，并将中脑区域转移到星形胶质细胞培养基(DMEM/Ham′s F-12，1∶1，15％FBS，4.0mM的谷氨酰胺，30nM亚硒酸钠，青霉素和链霉素)中。使用配备注射器的18号针头通过在2毫升的新鲜培养基中研磨分散细胞。在离心机中以2,000rpm离心细胞5分钟，再悬浮于培养基中，且再次研磨。分散最后的细胞团，并在15毫升的培养基中以1x10⁶细胞/75cm²的密度接种。在37℃下在5％二氧化碳和95％空气的气氛中孵育细胞24小时，并通过吸取除去未粘附的细胞。培养细胞另外9天，然后剧烈摇动培养瓶16小时，以除去任何污染的细胞类型。用DPBS洗涤星形胶质细胞单层三次，用胰酶消化并重新接种(1x10⁶细胞/瓶的密度)。这时，将一小部分的细胞接种到8孔腔室玻片(Nunc Inc.，Naperville，Ill.)上；如对于烧瓶培养所述对这些同类培养进行处理。在汇合时，用含有7.5％FBS的培养基更换培养基，且细胞孵育48小时。在下一步交换中，添加确定的无血清培养基(DMEM/Ham′s F-12，1∶1，4.0mM谷氨酰胺，30nM亚硒酸钠，青霉素100U/ml和链霉素100U/ml)，且细胞孵育另外的48个小时。更换培养基，且5天后收获条件培养基，并与亮肽素(10mM：Bachem，Torrance，Calif.)和4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟化盐酸盐(1.0mM：ICN Biochemicals，Aurora，Ohio)混合，以抑制蛋白水解。在收获的时间，对在腔室玻片上培养的星形胶质细胞单层进行免疫染色以评估培养表型。

VMCL-1细胞的培养

在培养VMCL-1和制备VMCL-1CM时，将2.0x10⁶细胞接种于15厘米的未涂覆的培养皿中，20毫升的最初包含10％胎牛血清的生长培养基中。在80％汇合时，吸取培养基，并用无血清培养基洗涤细胞一次。通常加入20毫升无白蛋白的无血清培养基，并且使得适应继续48小时。N2培养基被证明特别适合用于收集条件培养基。在这48小时过程中，细胞通常会扩增到100％汇合。吸取培养基，汇集于50毫升的管中，离心(15,000rpm进行20分钟)，并汇集在1.0升塑料瓶中。大约5mL的各批CM使用0.22mm过滤器除菌，在-70℃下储存5毫升的等分试样，并用于在与较大存储的CM汇集之前测定神经营养效力。VMCL-1细胞系现已传代超过50次。

免疫细胞化学

对于MAP2和TH免疫细胞化学，用冷DPBS洗涤培养物(2x250uL)，使用PBS中的4％甲醛固定10分钟，在-20℃下使用1％CH₃COOH/95％EtOH渗透(permeabilize)5分钟，然后用PBS洗涤(3x250uL)。用PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA-PBS)阻断非特异性结合15分钟。将抗TH抗体(50uL)(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，Ind.)或抗MAP2抗体(Boehringer-Mannheim)应用于各孔，并在室温下在黑暗的潮湿盒中孵育载玻片2小时。使用小鼠血清以与抗TH抗体相同的稀释度进行对照染色。用PBS清洗(2x250uL)后，应用抗鼠IgG-FITC(50uL)，并孵育载玻片另外的1小时。用PBS清洗(2x250uL)后，吸取过量的液体，除去腔室壁，并应用单滴的VectaShield封固介质(Vector Laboratories，Burlingame，Calif.)，接着应用覆盖玻璃，其用指甲油密封。在一些实验中，使用生物素化的二级抗体识别TH，并使用生物素化的过氧化物酶-抗生物素蛋白复合物(ABC试剂盒；VectorLaboratories)开发镍增强的二氨基联苯胺(DAB)反应。

对于胶质纤维酸性蛋白(GFAP，Boehringer-Mannheim，#814369)，在-20℃下使用5％ CH₃COOH/95％ C₂H₅OH一步完成固定和渗透。后续过程与那些用于显现TH的过程相同。对于A2B5和O4，用冷DPBS洗涤(2x250uL)培养物，并用1％BSA-PBS封闭10分钟。将A2B5抗体(50uL)应用于各孔，并孵育1小时。在用DPBS洗涤(2x250uL)后，应用二级抗体(抗-IgM-FITC)30分钟。然后用DPBS(2x250uL)洗涤细胞。为了反染色细胞核，在室温下，细胞与在10mM碳酸氢钠中的0.5μg/毫升的核酸染料H33258(Hoechst，Kansas City，Mo.)一起孵育15分钟，然后在PBS中冲洗2x10分钟。在最后用冷的DPBS(2x250uL)洗涤之后，如上所述封固。

RT-PCR分析

使用RNA-STAT试剂(TelTest，University of Maryland，Baltimore，Md.)从大鼠E13或E14腹侧中脑组织或从1x10⁹星形胶质细胞或1x10⁹VMCL-1细胞提取总RNA。从RNA生成第一链cDNA，并使用制造商的程序通过聚合酶链反应扩增。

通过2％琼脂糖凝胶电泳解析反应产物，以确定片段的大小和相对丰度。包括b-肌动蛋白和GAPDH的PCR结果作为对照，以证实cDNA的相等加载。

染色体分析

在以1∶100稀释的补充有2.5％FBS、D-葡萄糖(2.5g/L)和ITS补充剂的DMEM/F-12 1∶1培养基中培养细胞。24小时后，用秋水仙碱(10μg/毫升)抑止分裂中期阶段的亚培养。细胞用胰酶消化，并进行低渗休克(75mM氯化钾)。然后细胞经3次MeOH/CH₃COOH(3∶1)的更换固定，并空气干燥。然后使用4％Geisma对细胞染色并显微检查。

实施例14：帕金森氏病的6-羟多巴胺(6-OHDA)模型

接下来在帕金森氏病的啮齿动物模型中测试MANF，其中，通过神经毒素6-羟多巴胺(6-OHDA)损伤大脑一侧的多巴胺能神经元，6-羟多巴胺靠近黑质中的多巴胺能神经元注射，并通过多巴胺转运蛋白(DAT)选择性地摄取到多巴胺能神经元中。6-OHDA选择性地破坏在大脑的注射侧多巴胺能神经元。以两周的间隔，通过全身注射D-安非他命或阿朴吗啡(这两者都导致大脑中多巴胺的释放)激发实验动物。在大脑的无损伤侧释放更多的多巴胺。DA释放的这种不平衡导致动物向大脑的完整侧旋转(Mendez和Finn，1975)。该行为效应可以是剧烈的。动物有时可能沿封闭的圆圈高速地旋转，相当于追逐自己的尾巴。每分钟的旋转数是DA释放失衡的指标，从而表明实验侧的损伤程度。保护和诱导多巴胺能神经元再生的药物(如MANF、CDNF和GDNF)减少每分钟旋转次数，这是大脑损伤侧的DA释放恢复的迹象。DA释放的增加反过来表明大脑损伤侧的多巴胺神经元的再生。

在MANF公开之后，赫尔辛基大学(University of Helsinki)发现了MANF同系物MANF2(也称为保守多巴胺能神经营养因子或CDNF)。

MANF在成体脑的腹侧中脑中的表达

使用定量RT-PCR确定成年哺乳动物大脑的10个区域中的MANF表达：嗅球、海马、大脑皮层、纹状体、丘脑(Thalamus)、腹侧中脑、丘(Colliculus)、脑桥、延髓和小脑。在腹侧中脑发现MANF的最高水平表达，这是帕金森氏病中死亡的多巴胺能神经元所处的相同大脑区域。这一结果表明，MANF可能是成人大脑中的生理神经营养因子。

在黑质中MANF释放GABA

由黑质中的多巴胺能神经元记录微小抑制性突触后电流(mIPSC)。荷包牡丹碱(bicuculine)(10μM)完全阻断mIPSC，这表明mIPSC是通过GABA-A受体机制介导的。MANF(5ng/ml)导致mIPSC频率的可逆地增加(Zhou等人，2006)，表明MANF增加与DA神经元形成突触的黑质中的突触前GABA能末端的GABA释放。

对帕金森氏病提出的成因之一是谷氨酸对黑质中的多巴胺能神经元的兴奋性毒性作用。此外，mGluR涉及多巴胺能神经元的机能和神经保护药物在大脑中的作用。这些结果表明，MANF在帕金森氏病治疗中的第二靶标是黑质中的突触前GABA能末端，由抑制性递质GABA的释放介导，抑制性递质GABA拮抗谷氨酸对黑质中的多巴胺能神经元的兴奋性毒性作用。

保藏

申请人已经将包含细胞系VMCL-1的至少25个瓶保藏于美国典型培养物保藏中心，弗吉尼亚州马纳萨斯，美国20110，ATCC保藏号PTA-2479。在2000年9月18日，在ATCC保藏了这些细胞。VMCL-1的这一保藏将在ATCC保藏库(这是公共保藏库)保持30年或在最近的请求之后5年或专利的有效期间，以时间最长的一个为准，且如果在此期间保藏失活，则进行更换。另外，申请人已符合C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求，包括提供样品的存活指标。申请人对于ATCC的保藏材料的可获得性没有限制。但是，申请人没有权力免除法律规定的对生物材料的转移或其商业运输的任何限制。申请人并没有放弃追究对于授权专利权利的任何侵害。

其他的实施方式

本文通过引用引入上面说明书提到的所有出版物和在专利。在不背离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修饰和变化对于本领域的技术人员显而易见的。

实施例15：帕金森氏病(PD)的大鼠模型中的神经移植

在这个实施例中，在帕金森氏病(PD)大鼠模型中测试MANF分子。如实施例14中所描述的，在大鼠群体中建立单侧6-OHDA损伤。在神经切除术3个星期之内，标准的行为学测试用于确定成功损伤的大鼠的数目。

使用标准化的解剖技术和程序，从定时怀孕的大鼠收获用于移植的E14黑质组织。在下列时间，测试黑质组织中细胞的存活力百分比：1.解剖后立即和2.恰好移植前。使用Molecular Probes的活细胞-死细胞试剂盒(目录号L-3224)对分散的细胞进行存活力测试。作出用于移植的黑质组织中的多巴胺能神经元的比例的评估。

将切除神经的大鼠将分为3组(N≥6)。在含有不同量的MANF的溶液中激发等量的E14黑质组织，持续预定的时间段(Sortwell等人，2000)。每个小瓶含有500μl待测试的化合物。实验将在接受测试物质的7天内进行。编码的瓶用铝箔包裹在大约4℃下保存在冰箱中，直到使用。激发之后，将这些细胞移植到切除神经的新纹状体中。

经过在该工作的神经移植阶段后的4-8周时间，测试动物的机能、行为恢复。然后处死这些动物，以下源自3个实验组的数据：1.移植的神经元的存活百分比；2.移植的多巴胺能神经元的存活百分比；和3.移植的多巴胺能神经元的发育程度，通过以下进行评估：a)多巴胺能神经元的大小(直径)和b)神经轴突长出。

实施例16：通过RT-PCR分析成年小鼠中的MANF表达

在不同的解剖结构中，以及在发育的不同点分析小鼠组织(包括小鼠大脑)中的MANF表达。使用扩增MANF片段的引物通过定量RT-PCR分析MANF表达。使用本领域公知的标准方案，包括用于PCR循环的标准物和温度。生成引物以扩增MANF的部分而产生长度大于500bp的带。结果如图2显示。成年小鼠大脑中的MANF表达的最高水平是在黑质致密部(SNc)。这是大脑中的多巴胺神经元定位的位点。

Claims (6)

1.MANF在制备向大脑的黑质区域施用从而治疗帕金森氏病的药物中的用途。

2.根据权利要求1的用途，还包括一种或多种另外的选自以下的治疗剂在制备治疗帕金森氏病的药物中的用途：MANF2、干扰素γ、神经生长因子、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经原素、脑源性神经营养因子(BDNF)、甲状腺激素、骨形态发生蛋白(BMP)、白血病抑制因子(LIF)、音猬因子、神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素、干扰素、干细胞因子(SCF)、活化素、抑制素、趋化因子、视黄酸和睫状神经营养因子(CNTF)及其组合。

3.根据权利要求1的用途，还包括神经干细胞在制备向所述区域施用的药物中的用途。

4.病毒表达载体在制备向大脑的黑质区域施用从而治疗帕金森氏病的药物中的用途，其中所述病毒表达载体包括包含能够引导可操作地连接的编码多肽的核酸序列的表达的启动子序列的多核苷酸序列，所述多肽包括MANF多肽和能够在哺乳动物细胞发挥功能的信号肽。

5.根据权利要求4的用途，所述载体选自HIV、SIV、FIV、EIAV、AAV、腺病毒、逆转录病毒和疱疹病毒。

6.根据权利要求4的用途，其中，所述载体是复制缺陷型慢病毒颗粒。