JPH07500968A - 組み換え型骨形態形成蛋白ヘテロダイマー、組成物および使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２９、該単−のＤＮＡ分子が、該１つ目のＢＭＰまたはフラグメントをコードし ている該遺伝子の複数のコピーおよび該２つ目のＢＭＰまたはフラグメントをコ ードしている該遺伝子の複数のコピーを含む単一の転写単位からなる請求項２６ 記載の方法。

３０１つ目の選択ＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしている配列および２ つ目の選択ＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしている配列であって、それ ぞれのＢＭＰまたはそのフラグメントを同時発現させることができる少な（とも １つの適当な調節配列の支配下にある配列からなるＤＮＡ分子。

３１１つ目のＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしている遺伝子を含む１つ 目の転写単位および２つ目のＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしている遺 伝子を含む２つ目の転写単位からなる請求項３０記載の分子。

３２、該１つ目のＢＭＰまたはフラグメントをコードしている該遺伝子の複数の コピーおよび該２つ目のＢＭＰまたはフラグメントをコードしている該遺伝子の 複数のコピーを含む単一の転写単位からなる請求項３０記載の分子。

３３、該１つ目のＢＭＰがＢＭＰ−２であって、該２つ目のＢＭＰがＢＭＰ−６ である請求項２３記載の蛋白。

３４、イー・コリにおいて生成される骨刺激活性を有する組み換え型ＢＭＰ−２ ホモダイマー。

３５、イー・コリ宿主細胞を培養し、得られた培養基からホモダイマーＢＭＰ− ２を単離、精製することからなる、骨刺激活性を有するホモダイマーＢＭＰ−２ 蛋白の製法。

３６、ＢＭＰ−２である２つ目の蛋白またはそのフラグメントに会合したＢＭＰ −２である１つ目の蛋白またはそのフラグメントからなる、骨刺激活性を有する 組み換え型ヘテロダイマー蛋白。

明細書 組み換え型骨形態形成蛋白ヘテロダイマー、組成物および使用法発明の分野 本発明は、骨欠損の治療、骨損傷の治療および一般的な傷の治療に有用な一連の 新規組み換え型へテロダイマー蛋白に関する。また本発明は、これらのへテロダ イマーを得る方法、それらを遺伝子組み換え法により製造する方法、およびそれ らを含有する組成物に関する。

発明の背景 近年、骨または軟骨成長誘導特性により特徴づけられる蛋白性因子が単離、同定 された。例えば、米国特許第５，０１３，６４９号、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９０／ １１３６６号、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９１１０５８０２号およびそれらに引用され た種々の文献参照。実質的にヒト・ＢＭＰ−７と同じであり、骨形成活性を有す ると報告されている０Ｐ−１と命名された蛋白配列を開示しているＰ　ＣＴ／Ｕ 　Ｓ９０１０５９０３号も参照。

ＢＭＰ−２ないしＢＭＰ−９と命名された個々の骨形成蛋白（ＢＭＰ）の族が単 離、同定されている。これらの蛋白およびその製法を開示するために、共同出願 で同時係属の米国特許出願第７２１，８４７号およびその前文に引用された関連 出願を、出典明示により本明細書の一部とする。上記出願に示されたＢＭＰ−２ およびＢＭＰ−４と命名された蛋白、米国特許出願第４３８．９１９号に開示さ れたＢＭＰ−７、第３７０，５４７号および第３５６，０３３号に開示されたＢ ＭＰ−５、および第３７０．５４４号および第３４７，５５９号に開示されたＢ ＭＰ−６、ならびに第５２５，３５７号に開示されたＢＭＰ−８は、特に興味深 い。

さらに、米国特許出願第６５５，５７８号に開示されたＢＭＰ−１、第７２０， ５９０号に開示されたＢＭＰ−９，第１７９，１９７号およびＰＣＴ公開８９１ ０１４６４号に開示されたＢＭＰ−３も興味深い。これらの出願を出典明示によ り本明細書の一部とする。

当該分野においては、骨および傷の治療の分野で有用な他の蛋白および組成物が 必要とされている。

発明の概要 １の態様において本発明は、１つ目に選択したＢＭＰまたはそのフラグメントお よび２つ目に選択したＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしているポリクレ オチド配列を含む選択宿主細胞を培養することからなる、組み換え型ヘテロダイ マー蛋白の製法を提供する。得られた同時発現した生物学的に活性のあるヘテロ ダイマーを培養基から単離する。

本発明の１の具体例によれば、宿主細胞を、１種またはそれ以上のＢＭＰのコー ド配列を有する１種またはそれ以上のベクターで同時形質転換してもよい。個々 のＢＭＰポリヌクレオチド配列が、細胞中に導入される同一のベクターまたは別 々のベクター上に存在していてもよい。別法として、ＢＭＰまたはそのフラグメ ントを宿主細胞染色体中に取り込ませてもよい。さらに、単一の転写単位が、異 なるＢＭＰをコードしている２つの遺伝子の単一コピーをコードしていてもよい 。

本発明のもう１つの具体例によれば、２つのポリペプチドのコード配列を含む選 択宿主細胞は、１つ目または２つ目のＢＭＰあるいはそれらのフラグメントをコ ードしているポリクレオチド配列で形質転換され、これを安定に発現できる２種 の安定な選択宿主細胞を融合させることにより得られるハイブリッド細胞系であ る。

それゆえ、本発明のもう１つの態様において、２つ目のＢＭＰ蛋白またはそのフ ラグメントと会合した１つ目のＢＭＰ蛋白またはそのフラグメントからなる組み 換え型ヘテロダイマー蛋白が提供される。ヘテロダイマーを、骨刺激活性により 特徴づけてもよい。ヘテロダイマーが、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７ま たはＢＭＰ−８いずれかの蛋白またはそのフラグメントと会合したＢＭＰ−２蛋 白またはそのフラグメント、あるいはＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７また はＢＭＰ−８いずれかの蛋白またはそのフラグメントと会合したＢＭＰ−４蛋白 またはそのフラグメントからなっていてもよい。さらなる具体例において、ヘテ ロダイマーがＢＭＰ−１、ＢＭＰ−３、またはＢＭＰ−４いずれかの蛋白または そのフラグメントと会合したＢＭＰ−２蛋白またはそのフラグメントからなって いてもよい。ＢＭＰ−４が、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２またはそのフラグメントと 会合したヘテロダイマーの形態であってもよい。さらなる具体例が、ＢＭＰ−５ 、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−８の組み合わせからなるヘテロダイマ ーからなっていてもよい。例えば、ヘテロダイマーが、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７ またはＢＭＰ−８に会合したＢＭＰ−５からなっていてもよく、あるいはＢＭＰ −７、またはＢＭＰ−８に会合したＢＭＰ−６からなっていてもよく、もしくは ＢＭＰ−８に会合したＢＭＰ−７からなっていてもよい。これらのへテロダイマ ーを、選択宿主細胞で個々の蛋白を同時発現させることにより得て、該ヘテロダ イマーを培養基から単離してもよい。

本発明のさらなる態様として、１つ目のＢＭＰまたはそのフラグメントをコード している１つ目のポリヌクレオチド配列および２つ目のＢＭＰまたはそのフラグ メントをコードしている２つ目のポリヌクレオチド配列（これらの配列は、ＢＭ Ｐをヘテロダイマーとして同時発現されることのできる１つまたはそれ以上の発 現制御系のコントロール下にある）を含む細胞系が提供される。細胞系を１種ま たはそれ以上のポリヌクレオチド分子で形質転換してもよい。別法として、細胞 系が、上記細胞融合により作られたハイブリッド細胞系であってもよい。

本発明の別の態様は、１つ目の選択ＢＭＰまたはそのフラグメントをコードして いるポリヌクレオチド配列および２つ目の選択ＢＭＰまたはそのフラグメントを コードしているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子またはプラ スミドベクターである。該配列は、個々の蛋白またはフラグメントを同時発現さ せることのできる少なくとも１つの適当な調節配列の制御下にある。該分子が、 両方の遺伝子のコピーを含む単一の転写単位または単一遺伝子のコピーをそれぞ れに含む１個以上の転写単位を有していてもよい。

本発明のさらに別の態様として、１つ目の選択ＢＭＰまたはそのフラグメントを コードしているポリヌクレオチド配列を有する選択宿主細胞を培養し、２つ目の 選択ＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしているポリヌクレオチド配列を有 する選択宿主細胞を培養し、個々のモノマー形態のＢＭＰ蛋白を培養基から単離 してモノマー形態の１番目の蛋白とモノマー形態の２番目の蛋白とを会合させる ことからなる、骨刺激活性のある組み換え型ダイマーあるいはへテロダイマー蛋 白を真核細胞中で製造する方法が提供される。１つ目の蛋白および２つ目の蛋白 は、同じＢＭＰであっても異なるＢＭＰであってもよい。そして、得られた生物 学的に活性のあるダイマーまたはヘテロダイマーを混合物から単離する。好まし い細胞はイー・コリ（Ｅ、　ｃａｌｆ）である。

したがって、本発明のさらなる態様は、適当なベクターまたはプラスミド、およ びかかる製法において有用な選択形質転換細胞のみならず、真核細胞中で生産さ れた組み換え型ＢＭＰダイマーまたはヘテロダイマーである。

さらに本発明の他の態様および利点を、以下の本発明具体例の詳細な説明に記載 する。

図面の簡単な説明 図１は、ヒト・ＢＭＰ−２（配列番号：１および２）のＤＮＡおよびアミノ酸配 列を示す。

図２は、ヒト・ＢＭＰ−４（配列番号：３および４）のＤＮＡおよびアミノ酸配 列を示す。

図３は、ヒト・ＢＭＰ−７（配列番号：５および６）のＤＮＡおよびアミノ酸配 列を示す。

図４は、ヒト・ＢＭＰ−６（配列番号＝７および８）のＤＮＡおよびアミノ酸配 列を示す。

図５は、ヒト・ＢＭＰ−５（配列番号：９および１０）のＤＮＡおよびアミノ酸 配列を示す。

図６は、ヒト・ＢＭＰ−８（配列番号：１１および１２）のＤＮＡおよびアミノ 酸配列を示す。

図７は、ＢＭＰ−２成熟蛋白遺伝子（配列番号；１３および１４）を含むベクタ ーｐＡＬＢ２−７８１のＤＮＡ配列を示す。

図８は、Ｗ２０アルカリホスファターゼのアッセイにおけるＣＨＯａＭＰ−２と ＣＨＯＢＭＰ−２／７の活性の比較である。

図９は、ＢＧＰ　（オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）　）のアッセ イにおけるＣＨＯＢＭＰ−２とＣＨＯＢＭＰ−２／７の活性の比較である。

図１０は、イー・コリにより生産されたＢＭＰ−２とＢＭＰ−２／７ヘテロダイ マーのＷ−２０活性の比較である。

図１１は、ＢＭＰ−３のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。

図１２は、Ｗ−２０アツセイにおけるＢＭＰ−２とＢＭＰ−２／６の比較を示す 。

図１３は、ＢＭＰ−２／６とＢＭＰ−２のインビボ活性の比較を示す。

図１４は、インビボ活性におけるＢＭＰ−２、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−２／６ 比較を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、組み換え型へテロダイマー自体のみならず骨刺激活性を有する組み換 え型へテロダイマー蛋白の製法、およびそれらを含有する骨刺激用または骨治療 用組成物を提供する。

本明細書全体を通して、「ヘテロダイマー」を、少なくとも１個の共有結合また はジスルフィド結合により会合した２種の異なるＢＭＰ蛋白モノマーまたはそれ らの活性フラグメントからなる生物学的に活性のある蛋白構築物と定義する。

２種のＢＭＰ構成成分間の１〜７個のジスルフィド結合の存在により本発明へテ ロダイマーを特徴づけてもよい。

それゆえ本発明によれば、本発明の組み換え型ＢＭＰヘテロダイマーの製法は、 １つ目の選択ＢＭＰまたはその生物学的に活性のあるフラグメントをコードして いるポリヌクレオチド配列および２つ目の選択ＢＭＰまたはその生物学的に活性 のあるフラグメントをコードしているポリヌクレオチド配列を有する選択宿主細 胞を培養することからなる。同時発現した生物学的に活性のあるヘテロダイマー は、宿主細胞中に生産され、それより分泌され、培養基から単離される。本発明 ヘテロダイマー蛋白の製法の好ましい具体例を、以下に、そして後記実施例に詳 細に記載する。本発明の好ましい方法は、既知の遺伝子組換法を包含する（例え ば、サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、［モレキュラー・クローニング、ア ・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　Ｊ第２版、ニューヨークのコールド・スプ リングｊハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）のコールド・スプ リング＋ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８９年）参照）。しかしながら、慣用的な化学合 成のごとき他の方法も、本発明へテロダイマーの調製に有用である。

本発明方法により得られたＢＭＰヘテロダイマーは、ホモダイマーとヘテロダイ マーの混合物中に生成される。古典的な蛋白生化学的方法またはへテロダイマー を形成するＢＭＰの１つに特異的なアフィニティーカラムのごとき本質的に慣用 的な方法により、このホモダイマーとへテロダイマーの混合物を、培養基中の汚 染物質から分離してもよい。さらに、所望ならば、ヘテロダイマーを、混合物中 のホモダイマーから分離してもよい。かかる分離方法により、ヘテロダイマ一種 の活性の明確な測定が可能になる。実施例４は、この目的のために現に用いられ る１つの精製方法を示す。

好ましくは、これらの方法により生産される本発明の組み換え型へテロダイマー が、ヒト・ＢＭＰ−２、ヒト・ＢＭＰ−４、ヒト・ＢＭＰ−５、ヒト・ＢＭＰ− ６、ヒト・ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−８と命名されたＢＭＰを包含するものとす る。しかしながら、ＢＭＰ−３もまたＢＭＰ−２と一緒になって活性へテロダイ マーを形成することがわかっている。上で特に示したＢＭＰのみならずこれらの ＢＭＰの他の種も、獣医学、診断または研究用に用いることができる。しかしな がら、以下に特に示すヒト・蛋白が、ヒトの医薬用に好ましい。

ヒト・ＢＭＰ−２を、図１に開示するアミノ酸配列およびＤＮＡ配列の全配列ま たはフラグメントを実質的に含んでいることにより特徴づける。さらにヒト・Ｂ ＭＰ−２を、成熟ＢＭＰ−２サブユニットのジスルフィド結合したダイマーまた はホモダイマーとして特徴づける。遺伝子組換えにより発現したＢＭＰ−２サブ ユニツトは、異種のアミノ末端を有する蛋白種を含んでいる。あるＢＭＰ−２サ ブユニツトを、図１（配列番号：１および２）のアミノ酸＃２４９　（Ｓｅｒ） 〜＃３９６　（Ａｒｇ）からなることによって特徴づける。別のＢＭＰ−２サブ ユニツトを、図１のアミノ酸＃２６６　（Ｔｈｒ）　〜＃３９６　（Ａｒｇ）か らなることによって特徴づける。さらに別のＢＭＰ−２サブユニツトを、図１の アミノ酸＃２９６　（Ｃｙｓ）〜＃３９６　（Ａｒｇ）からなることによって特 徴づける。成熟ＢＭＰ−２を、図１のアミノ酸＃２８３　（Ｇｉｎ）　〜＃３９ ６　（Ａｒｇ）からなることによって特徴づける。この後者のサブユニットが、 実際には、組換法による発現で得られるＢＭＰ−２の最も多い蛋白種である（図 １）。しかしながら、得られるある種のＢＭＰ−２の特性を、培養条件を操作す ることにより変化させてもよい。ＢＭＰ−２が、図１の配列において、例えば＃ ２４１〜２８０のアミノ酸の欠失および＃２４５ＡｒｇのＩｌｅへの変化、また は他の変化のごとき修飾を有していてもよい。

米国特許第７２１．８４７号（出典明示により本明細書の一部とする）に詳細に 記載されているように、図１の＃３５６ないし＃１５４３のヌクレオチドコード 配列からなるＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養し、−緒に生産される他の 蛋白性物質を実質的に含まない１種またはそれ以上の上記蛋白種を培養基から回 収し、精製することにより、ヒト・ＢＭＰ−２を製造してもよい。ヒト・ＢＭＰ −２蛋白を骨形成誘導能力により特徴づけてもよい。また、ヒト・ＢＭＰ−２は 、Ｗ２０アッセイにおいてインビトロ活性を有している。さらにヒト・ＢＭＰ− ２を軟骨形成誘導能力により特徴づけてもよい。さらにヒト・ＢＭＰ−２を上で 参照した出願に記載されたラット・骨形成アッセイにおいて軟骨および／または 骨形成活性を示す能力により特徴づけてもよい。

ヒト・ＢＭＰ−４を、図２（配列番号＝３および４）に開示したアミノ酸配列お よびＤＮＡ配列の全配列またはフラグメントを実質的に有することにより特徴づ ける。さらにヒト・ＢＭＰ−４を、成熟ＢＭＰ−４サブユニットのジスルフィド 結合したダイマーおよびホモダイマーとして特徴づける。遺伝子組み換えにより 発現したＢＭＰ−４サブユニツトが、異種のアミノ末端を有する蛋白種を含んで いてもよい。ヒト・ＢＭＰ−４の成熟サブユニットを、図２のアミノ酸＃２９３ 　（Ｓｅｒ）〜＃４０８　（Ｓｅｔ）からなることにより特徴づける。ＢＭＰ− ４の他のアミノ末端を、図２の配列から選択してもよい。また、さらにアミノま たはカルボキン末端で切形された蛋白をはじめとするＢＭＰ−４の修飾バージョ ンを、慣用的な変異法により構築してもよい。

上で本明細書の一部とした米国特許出願第７２１，８４７号に開示されているよ うに、図２の＃４０３から＃１６２６のヌクレオチドコード配列からなるＤＮＡ 配列で形質転換した細胞を培養し、−緒に生産される他の蛋白性物質を実質的に 含まない、図２の＃２９３から＃４ｏ８のアミノ酸配列からなる蛋白を培養基か ら回収し、精製することにより、ＢＭＰ−４を生産してもよい。ＢＭＰ−４蛋白 は、骨形成を誘導する能力がある。ＢＭＰ−４蛋白は、軟骨形成誘導能力がある 。さらにＢＭＰ−４蛋白を、ラット・骨形成アッセイにおいて軟骨および／また は骨形成活性を示す能力により特徴づけてもよい。

ヒト・ＢＭＰ−７を、図３に開示したアミノ酸配列およびＤＮＡ配列の全配列ま たはフラグメントを実質的に含むことにより特徴づける。さらにヒト・ＢＭＰ− ７蛋白を、成熟ＢＭＰ−７サブユニツトのジスルフィド結合したダイマーおよび ホモダイマーとして特徴づける。遺伝子組み換えで発現したＢＭＰ−７サブユニ ツトは、異種のアミノ末端を有する蛋白種を含んでいる。ヒト・ＢＭＰ−７のあ る成熟サブユニットを、図３（配列番号：５および６）のアミノ酸＃２９３（Ｓ ｅｒ）〜＃４３１（Ｈｉｓ）からなることにより特徴づける。このサブユニット が、ＢＭＰ−７の組換え発現により最も多く生産される蛋白である。別のＢＭＰ −７サブユニツトを、図３のアミノ酸＃３００　（Ｓｅｒ）　〜＃４３１　（Ｈ ｉ　ｓ）からなることにより特徴づける。さらに別のＢＭＰ−７サブユニツトを 、図３のアミノ酸＃３１６（Ａｌａ）〜＃４３１　（Ｈｉｓ）からなることによ り特徴づける。ＢＭＰ−７の他のアミノ末端を、図３の配列から選択してもよい 。同様に、さらにＢＭＰ−７のアミノまたはカルボキシ末端を切形した蛋白をは じめとする修飾バージョンを、慣用的な変異法により構築してもよい。

上で本明細書の一部とした米国特許出願第４３８．９１９号に開示されているよ うに、図３のヌクレオチド＃９７からヌクレオチド＃１３８９のヌクレオチドコ ード配列からなるＤＮＡ配列で形質転換した細胞を培養し、−緒に生産される他 の蛋白性物質を実質的に含まない、図３の＃２９３から＃４３１のアミノ酸配列 からなる蛋白を培養基から回収し、精製することにより、ＢＭＰ−７を生産して もよい。これらの蛋白は、軟骨および／または骨の形成を刺激、促進、あるいは 誘導する能力を有する。

ヒト・ＢＭＰ−６を、図４のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列の全配列またはフラ グメントを含むことによって特徴づける。さらにヒト・ＢＭＰ−６蛋白を、成熟 ＢＭＰ−６サブユニツトのジスルフィド結合したダイマーとして特徴づける。

組換えにより発現したＢＭＰ−６サブユニツトが、異種のアミノ末端を有する蛋 白種を含んでいてもよい。あるＢＭＰ−６サブユニツトを、図４（配列番号ニア および８）のアミノ酸＃３７５　（Ｓｅｔ）〜＃５１３　（Ｈｉｓ）からなるこ とにより特徴づける。ＢＭＰ−６の他のアミノ末端を、図４の配列から選択して もよい。さらにアミノまたはカルボキシ末端を切形したＢＭＰ−６の修飾バージ ョンを、慣用的変異法により構築してもよい。

米国特許出願第４９０，０３３号（出典明示により本明細書の一部とする）に詳 細に記載されているように、図４のヌクレオチド＃１６０から＃１６９８のヌク レオチドコード配列からなるＤＮＡ配列で形質転換した細胞を培養し、−緒に生 産される他の蛋白性物質を実質的に含まない、図４の＃３７５から＃５１３のア ミノ酸配列からなる蛋白を培養基から回収し、精製することにより、ヒト・ＢＭ Ｐ−６を生産してもよい。さらにヒト・ＢＭＰ−６を、ラット・骨形成アッセイ において軟骨および／または骨形成活性を示す能力により特徴づけてもよい。

ヒト・ＢＭＰ−５を、図５（配列番号：９および１０）に開示したアミノ酸配列 およびＤＮＡ配列の全配列またはフラグメントを含むことにより特徴づける。

さらにヒト・ＢＭＰ−５蛋白を、成熟ＢＭＰ−５サブユニットのジスルフィド結 合したダイマーとして特徴づける。組換発現したＢＭＰ−５サブユニツトが、異 種のアミノ末端を有する蛋白種を含んでいてもよい。あるＢＭＰ−５サブユニツ トを、図５のアミノ酸＃３２９　（Ｓｅｒ）〜＃４５４　（Ｈｉｓ）からなるこ とにより特徴づけてもよい。アミノまたはカルボキン末端を切形したＢＭＰ−５ の修飾バージョンを、慣用的変異法により構築してもよい。

米国特許出願第５８８．２２７号（出典明示により本明細の一部とする）に詳細 に記載されているように、図５のヌクレオチド＃７０１から＃２０６０のヌクレ オチドコード配列からなるＤＮＡ配列で形質転換した細胞を培養し、−緒に生産 される他の蛋白性物質を実質的に含まない、図５の＃３２９から＃４５４のアミ ノ酸配列からなる蛋白を培養基から回収し、精製することにより、ヒト・ＢＭＰ −５を生産してもよい。さらにヒト・ＢＭＰ−５を、上で参照した出願に記載さ れているラット・骨形成アッセイにおいて軟骨および／または骨形成活性を示す 能力により特徴づけてもよい。

ヒト・ＢＭＰ−８を、図６に開示したアミノ酸配列およびＤＮＡ配列の全配列ま たはフラグメントを含むことにより特徴づける。さらにヒト・ＢＭＰ−８蛋白を 、成熟ＢＭＰ−８サブユニットのジスルフィド結合したダイマーとして特徴づけ てもよい。組換え発現したＢＭＰ−８サブユニツトが、異種のアミノ末端を有す る蛋白種を含んでいてもよい。あるＢＭＰ−配列またはサブユニット配列は、図 ６（配列番号：１１および１２）のアミノ酸＃１４３　（Ａｈａ）　〜＃２８１ （Ｈｉｓ）からなる。ＢＭＰ−８の他のアミノ末端を、図６の配列から選択して もよい。アミノまたはカルボキシ末端を切形したＢＭＰ−８の修飾バージョンを 、慣用的変異法により構築してもよい。

米国特許出願第５２５．３５７号（出典明示により本明細の一部とする）に詳細 に記載されているように、図６のヌクレオチド＃１から＃８５０のヌクレオチド コード配列からなるＤＮＡ配列で形質転換した細胞を培養し、−緒に生産される 他の蛋白性物質を実質的に含まない、図６の＃１４３から＃２８１のアミノ酸配 列、あるいは異種のＮ−末端を有する同様のアミノ酸配列からなる蛋白を培養基 から回収し、精製することにより、ヒト・ＢＭＰ−８を生産してもよい。また、 アミノ酸＃１４３の前にＭｅｔを挿入した＃１４３から＃２８１のアミノ酸（図 ６）をコードしている配列をベクター中に挿入することにより、イー・コリ中で 、このＢＭＰ−８を生産させてもよい。さらにヒト・ＢＭＰ−８を、ラット・骨 形成アッセイにおいて軟骨および／または骨形成活性を示す能力により特徴づけ てもよい。

未修飾で非還元型の上記それぞれのＢＭＰ蛋白を、１２％レムリ（Ｌａｅｍｍｌ ｉ）ゲル上の約２８ｋＤないし約４０ｋＤの間の範囲の見掛けの分子量により特 徴づけてもよい。後記実施例９記載のラット・骨形成アッセイにおいて骨の刺激 または修復活性を示す蛋白あるいは活性フラグメントを提供する本明細書記載の ＤＮＡおよびアミノ酸配列の類似または修飾バージョンも、本発明で使用するの 適当なりＭＰに分類される。ただしジスルフィド結合に関与する１個またはそれ 以上のＣｙｓを有する蛋白またはフラグメントを有することが条件である。これ らの配列の有用な修飾を、当業者に知られた遺伝子組換え法により行ってもよい 。これらのＢＭＰ配列は、哺乳動物における生産の際、ホモダイマー（普通は、 異種のＮ末端を有するホモダイマー混合物）として生産される。イー・コリ中の これらのＢＭＰ配列からは、モノマー蛋白種が生産される。

したがって、本発明によれば、本発明の１の組み替え型へテロダイマーは、例え ば上記成熟ＢＭＰ−５サブユニットのモノマー部分またはその活性フラグメント を含めたヒト・ＢＭＰ−５に１ないし７個までの共有ジスルフィド結合により結 合した、例えば上記成熟ＢＭＰ−２サブユニットのモノマー部分またはその活性 フラグメントを含めたヒト・ＢＭＰ−２の会合物からなる。本発明のもう１つの 組み換え型ヘテロダイマーは、例えば上記成熟ＢＭＰ−６サブユニツトのモノマ ー部分またはその活性フラグメントを含めたヒト・ＢＭＰ−６に１ないし７個ま での共有ジスルフィド結合により結合した、上記ヒト・ＢＭＰ−２の会合物から なる。本発明の別の組み換え型へテロダイマーは、例えば上記成熟ＢＭＰ−７サ ブユニツトのモノマー部分またはその活性フラグメントを含めたヒト・ＢＭＰ− ７に１ないし７個までの共有ジスルフィド結合により結合した、上記ヒト・ＢＭ Ｐ−２の会合物からなる。本発明のまた別の組み換え型へテロダイマーは、例え ば上記成熟ＢＭＰ−８サブユニットのモノマー部分またはその活性フラグメント を含めたヒト・ＢＭＰ−８に１ないし７個までの共有ジスルフィド結合により結 合した、上記ヒト・ＢＭＰ−２の会合物からなる。

本発明のさらに別の組み換え型へテロダイマーは、例えば上記成熟ＢＭＰ−５サ ブユニットのモノマー部分またはその活性フラグメントを含めたヒト・ＢＭＰ− ５に１ないし７個までの共有ジスルフィド結合により結合した、例えば上記成熟 ＢＭＰ−４サブユニットのモノマー部分またはその活性フラグメントを含めたヒ ト・ＢＭＰ−４の会合物からなる。本発明のもう１つの組み換え型ヘテロダイマ ーは、１ないし７個までの共有ジスルフィド結合により、上記ヒト・ＢＭＰ−６ に結合した、上記ヒト・ＢＭＰ−４の会合物からなる。本発明の別の組み換え型 へテロダイマーは、１個またはそれ以上の共有ジスルフィド結合により、上記ヒ ト・ＢＭＰ−６に結合した、上記ヒト・ＢＭＰ−４の会合物からなる。さらにも う１つの本発明の組み換え型ヘテロダイマーは、１個またはそれ以上の共有ジス ルフィド結合により、上記ヒト・ＢＭＰ−７に結合した、上記ヒト・ＢＭＰ−４ の会合物からなる。さらに別の本発明組み換え型へテロダイマーは、１個または それ以上の共有ジスルフィド結合により、上記ヒト・ＢＭＰ−８に結合した、上 記ヒト・ＢＭＰ−４の会合物からなる。本発明のさらなる組み換え型へテロダイ マーは、例えば上記成熟ＢＭＰ−３サブユニットのモノマー部分またはその活性 フラグメントを含めたヒト・ＢＭＰ−３に少なくとも１個のジスルフィド結合に より結合した、例えば上記成熟ＢＭＰ−２サブユニットのモノマー部分またはそ の活性フラグメントを含めたヒト・ＢＭＰ−２の会合物からなる。本発明の別の 組み換え型へテロダイマーは例えば上記成熟ＢＭＰ−４サブユニ、ソトのモノマ ー部分またはその活性フラグメントを含めたヒト・ＢＭＰ−４に少なくとも１個 のジスルフィド結合により結合した、上記ヒト・ＢＭＰ−２の会合物からなる。

本発明もう１つの組み換え型ヘテロダイマーは、例えば上記成熟ＢＭＰ−６サブ ユニツトのモノマー部分またはその活性フラグメントを含めたヒト・ＢＭＰ−６ に少なくとも１個のジスルフィド結合により結合した、上記ヒト・ＢＭＰ−５の 会合物からなる。本発明の別の組み換え型へテロダイマーは、例えば上記成熟Ｂ ＭＰ−７サブユニツトのモノマー部分またはその活性フラグメントを含めたヒト ・ＢＭＰ−７に少なくとも１個のジスルフィド結合により結合した、上記ヒト・ ＢＭＰ−５の会合物からなる。さらに、少なくとも１個のジスルフィド結合によ り、ヒト・ＢＭＰ−５が、ヒト・ＢＭＰ−８サブユニツトまたはその活性フラグ メントに結合していてもよい。

本発明のさらにもう１つの組み換え型ヘテロダイマーは、少なくとも１個のジス ルフィド結合により、上記ヒト・ＢＭＰ−７に結合した、例えば上記成熟ＢＭＰ −６サブユニツトのモノマー部分またはその活性フラグメントを含めたヒト・Ｂ ＭＰ−６の会合物からなる。本発明の別の組み換え型ヘテロダイマーは、１個ま たはそれ以上の共有またはジスルフィド結合により、上記ヒト・ＢＭＰ−８に結 合した上記ヒト・ＢＭＰ−６の会合物からなる。本発明のもう１つの組み換え型 ヘテロダイマーは、１個またはそれ以上の共有またはジスルフィド結合により、 上記ヒト・ＢＭＰ−８に結合した上記ヒト・ＢＭＰ−７の会合物からなる。

酸成分上の１個のＣｙｓ間で形成されてもよい。ジスルフィド結合が、各ＢＭＰ 上の２個のＣｙｓ間で形成されてもよい。ジスルフィド結合が、各ＢＭＰ上の３ 個のＣｙｓ間で形成されてもよい。ジスルフィド結合が、各ＢＭＰ上の４個のＣ ｙｓ間で形成されてもよい。ジスルフィド結合が、各ＢＭＰ上の５個のＣｙｓ間 で形成されてもよい。ジスルフィド結合が、各ＢＭＰ上の６個のＣｙｓ間で形成 されてもよい。ジスルフィド結合が、各ＢＭＰ上の７個のＣｙｓ間で形成されて もよい。これらのジスルフィド結合が、各ＢＭＰ上の隣接したＣｙｓ間または個 々の蛋白配列中に散在する選択されたＣｙｓのみの間で形成されてもよい。同じ ＢＭＰ構成成分を有する種々のへテロダイマーが、異なる数のジスルフィド結合 で形成されてもよい。同じＢＭＰ成分を有する種々のヘテロダイマーが、異なる Ｃｙｓの位置におけるジスルフィド結合で形成されてもよい。本発明に包含され る同じＢＭＰ成分を有する異なるヘテロダイマーが、哺乳動物細胞、細菌細胞、 昆虫細胞または酵母細胞における組換え生産に起因して異なっていてもよい。

これらの組み換え型ヘテロダイマーを、個々のＢＭＰホモダイマー（その構成成 分の１つがそれぞれのヘテロダイマーを形成する）と比較するＷ２０マウス・基 質細胞系アッセイ（実施例８）におけるアルカリホスファターゼの上昇により特 徴づけてもよい。さらに、これらのヘテロダイマーを、Ｗ２０バイオアッセイに おける、個々のＢＭＰダイマーの単なる混合物よりも高い活性により特徴づけて もよい。Ｗ２０バイオアッセイで調べられるヘテロダイマーの予備的特徴により 、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７とＢＭＰ−２とのヘテロダイマーは 非常に活性が高いことが示された。同様に、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭ Ｐ−７とＢＭＰ−４とのへテロダイマーもＷ２０バイオアッセイにおいて活性が 高い。

本発明へテロダイマーを、骨成長および刺激アッセイにおける活性により特徴づ けてもよい。例えば、本発明ヘテロダイマーは、実施例９記載のラット・骨形成 アッセイにおいても活性がある。本発明ヘテロダイマーは、実施例８記載のオス テオカルシンのバイオアッセイにおいても活性がある。本発明へテロダイマーの 他の特徴は、ウェスタンプロット、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）お よび２次元ゲル（還元条件下および非還元条件下）のみならず、２種の異なる構 成成分ＢＭＰに対する抗ＢＭＰ抗体との共沈も包含される。

ＢＭＰヘテロダイマーを製造する本発明方法の１の具体例は、適当な細胞系を培 養し、既知調節配列の調節下で、１つ目のＢＭＰまたはそのフラグメントをコー ドしているＤＮＡ配列と２つ目のＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしてい るＤＮＡ配列とで同時形質転換させることを包含する。該形質転換した宿主細胞 を培養し、ヘテロダイマー蛋白を回収し、ついで培養基から精製する。

現在のところ本発明ヘテロダイマーの好ましい発現法であるこの方法のもう１つ の具体例において、例えばＣＨＯＤＵＫＸ細胞のごとき単一宿主細胞を、１のＢ ＭＰをコードしているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子と、次に選択されたＢＭＰを コードしているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子とで同時トランスフェクションする 。一方または両方のプラスミドは、ＢＭＰを発現する適当な細胞系を確立するの に用いることができる選択マーカーを有している。別々のＢＭＰ遺伝子を別々の 転写単位上に含むこれらの別々のプラスミドを混合し、慣用的プロトコールを用 いてＣＨＯ細胞にトランスフェクションさせる。Ｗ２０アッセイにおいて活性を 最大に発現させるプラスミドの割合（通常１１）を調べる。

例えば、実施例３に詳述するように、リン酸カルシウム共沈およびトランスフェ クション、エレクトロポーレーノコン、マイクロインジェクンコン、プロトプラ スト融合またはりポフェクシコンによって、等しい割合の、１つ目のＢＭＰおよ びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）マーカー遺伝子を含むプラスミドと、 ２つ目のＢＭＰおよびＤＨＦＲマーカーを含むプラスミドとを、ＤＨＰＲ欠損Ｃ ＩＯ細胞であるＤＵＫＸ−ＢＩ　Ｉに同時導入できる。それぞれのＤＨＦＲＨＦ 形質転換体を、慣用的手段により透析した子ウシ・胎児血清を含むアルファ培地 での増殖に関して選択する。遺伝子コピーの増加したＤＨＰＲ’″細胞を、メト トレキセート（ＭＸＴ）濃度を増加させていった場合（例えば段階的に０．０２ ．０．１．０．５および２．０重Ｍ　ＭＸＴ）の増殖に関して選択できる（カウ フマン（Ｋａｕｆｍａｎ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）　、ジャーナル・オフ ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、輩ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）第１５９巻・６ ０１〜６２９頁（１９８２年）；およびカウフマンら、モレキュラー・アンド・ セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　）第５巻：１７５０頁（１９８３年）の方法による）　。ＤＨＦＲ に結合したヘテロダイマーまたは少なくとも１種のＢＭＰの発現は、ＭＴＸ耐性 レベルの上昇に伴い増加するはずである。ＢＭＰ／ＤＨＦＲ遺伝子のいずれかま たは両方を安定に発現する細胞が生き残るであろう。いかに高頻度であっても、 細胞系は、両方のプラスミド（最初のトランスフェクションの間存在していた） を安定に取り込み、発現する。その後、調整培地から収穫を行い、ヘテロダイマ ーを慣用的方法により単離し、活性測定する。このアプローチ法を、ＤＨＦＲ欠 損細胞に用いることができる。

末法の別の具体例としては、１の選択ＢＭＰ遺伝子を含んでいるＤＮＡ分子を、 すでに別の選択されたＢＭＰ遺伝子を発現するようになっている細胞系にトラン スフェクションさせてもよい。例えば後記実施例３に詳述するように、ＢＭＰ− ７を発現する安定なＣＨＯ細胞系（ＤＨＰＲマーカーを有する）［ジエネテイク ス・インスティチュート、インク（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　 Ｉｎｃ）　］を、ＢＭＰ−２および２番目の選択マーカー遺伝子（例えばネオマ イシン耐性（Ｎｅｏ））を含むプラスミドでトランスフェクションしてもよい。

トランスフェクション後、細胞を培養し、ＭＴＸおよび抗生物質Ｇ−４１８で処 理することにより適当な細胞を選択する。ついで、生き残った細胞を、ヘテロダ イマーの発現に関してスクリーニングる。この発現系は、単一ステップでの選択 ができるという利点を有している。

異なる細胞系または異なるマーカーを用いる別の２段階選択法も使用できる。

例えば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）マーカーを用いて、ＤＨＦＲマーカ ーと一緒に異なるＢＭＰを発現する安定なＣＨＯ細胞系における２つ目のＢＭＰ 遺伝子を増幅することは好ましいといえる。なぜならば、デオキシコホルマイシ ン（ＤＣＦ）による遺伝子増幅を用いて発現レベルを増加させることができるか らである（実施例１記載のＡＤＡを含むプラスミド参照）。別法として、最初に このマーカーを用いて細胞系を作り、ついで、異なるマーカーを含むベクターに 対してレシピエンドな状態にし、２重の耐性およびＢＭＰ同時発現に関して選択 することができる。

本発明のへテロダイマーを発現させる方法のさらに別の具体例は、単一の転写単 位上または別々の転写単位上いずれかの上にある発現に関する複数の遺伝子をコ ードしている単一のＤＮＡ分子で宿主細胞をトランスフェクションすることを包 含する。多シストロン発現は、例えばＥＭＣウィルス、ポリオウィルスまたは他 の慣用的なリーダー配列の源に由来するリーダー配列のごときリーダー配列を用 いてベクターから有効に翻訳されうる単一の転写単位中にコードされている複数 のポリペプチドを含む。２個のＢＭＰ遺伝子および選択マーカーは、単一の転写 単位中で発現されつる。例えば、ＢＭＰｘ−ＥＭＣ−ＢＭＰｙ−ＤＨＦＲまたは ＢＭＰｘ−ＥＭＣ−ＢＭＰｙ−ＥＭＣ−ＤＨＦＲの配置を含むベクターをＣＩ（ ０細胞中ヘトランスフエクンヨンさせ、ＤＨＦＲマーカーを用いて選択し、増幅 する。２種の異なるＢＭＰ、１種またはそれ以上のマーカー遺伝子および適当な リーダーあるいは調節配列を単一転写単位上に有するプラスミドを構築してもよ い。

同様に、各ＢＭＰに関する別々の転写単位を含む単一のプラスミドで宿主細胞を トランスフェクションしてもよい。例えば、ＤＨＦＲのごとき選択マーカーが、 別の転写単位上に含まれていてもよく、あるいはＢＭＰ遺伝子の一方または両方 の上の２番目のラストロンとして含まれていてもよい。ヘテロダイマーを発現さ せるために、これらのプラスミドを、選択宿主細胞中にトランスフェクションさ せ、ヘテロダイマーを該細胞または培養基から上記のごとく単離してもよい。

この発現法の別の具体例は細胞融合を包含する。実施例１および本明細書の−部 とした前記米国出願に記載されているように、ＤＨＦＲ／ＭＸＴ遺伝子増幅シス テムおよび高レベルのＢＭＰ発現系を用いて開発された、選択ＢＭＰを発現する ２種の安定な細胞系（例えばＢＭＰ−２を発現する細胞系（例２ＥＧ５）および ＢＭＰ−７を発現する細胞系（例７ＭＢ９）’）を、数個の優勢なマーカー遺伝 子のうちの１つ（例えばｎｅｏ’、ヒグロマイシン’、ＧＰＴ）でトランスフェ クションすることができる。同時培養において十分な時間（約１日）経過後、得 られた１種のＢＭＰおよび１つの優勢なマーカーを発現する細胞系を、ポリエチ レングリコール、センダイウィルスあるいは他の知られた試薬のごとき融合剤を 用いて別のＢＭＰおよび好ましくは別のマーカーを発現する細胞系と融合させる ことができる。

得られた優勢マーカーおよびＤＨＰＲを発現する細胞ハイブリッドを、適当な培 養条件を用いて選択し、ＢＭＰまたはそれらのフラグメントの同時発現に関して スクリーニングする。選択されたハイブリッド細胞は、両方の選択ＢＭＰをコー ドしている配列を含んでおり、細胞中にヘテロダイマーが生成され、ついで分泌 される。ヘテロダイマーを調整培地から得、慣用的方法（実施例４参照）により 、そこから単離、精製する。得られたヘテロダイマーを本明細書記載の方法によ り特徴づけてもよい。　゛ 上記アプローチにより得られた細胞系を用いて、同時発現されるヘテロダイマー ＢＭＰポリペプチドを生産することができる。慣用的精製法により、宿主細胞中 に存在する他の夾雑物質のみならず同時生産される他の蛋白が実質的にない該ヘ テロダイマー蛋白を細胞培養物から単離する。実際上好ましい生産方法は、ＣＨ Ｏ細胞中への異なるベクターの同時トランスフェクションおよびメトトレキセー トによる遺伝子増幅である。安定な細胞系を用いて組み換え型ＢＭＰを含有する 調整培地を得、該組み換え型ＢＭＰを精製し、インビトロおよびインビボ活性を 測定する。例えば、本明細書記載のいずれかの方法により得られたヘテロダイマ ー生産細胞を、実施例８および９記載の分析による活性、ＲＮＡ発現、およびド デシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による蛋白発現に関し てスクリーニングする。

本発明のへテロダイマーを同時発現させる上記方法は、宿主細胞または細胞系を 用いる。適当な細胞は、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細 胞のごとき哺乳動物細胞を含む。適当な宿主細胞の選択および形質転換、培養、 増幅、スクリーニングならびに生成物の生産と精製に関する方法は、当該分野に おいて公知である。例えば、ゲシング（Ｇｅｔｈｉｎｇ）およびサムプルツク（ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）　、ネイチ’ｒ　（Ｎａｔｕｒｅ）第２９３巻＝６２０〜６ ２５頁（１９８１年）、あるいはカウフマンら、モレキュラー・アンド・セルラ ー・バイオロジー。

第５巻第７号：１７５０〜１７５９頁（１９８５年）、またはハウリー（Ｈｏｗ ｌｅｙ）らの米国特許第４．４１９．４４６号参照。他の適当な哺乳動物細胞系 は、Ｃ■−１細胞系、ＢＨＫ細胞系および２９３細胞系である。サル・ＣＯ５− １細胞系は、現在のところＢＭＰへテロダイマー生産には不適と考えられている 。

当業者に知られた多くの酵母細胞も、本発明ポリペプチド発現宿主細胞として利 用できる（例えば、サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ 　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））。

さらに、所望ならば、昆虫細胞を、本発明方法に用いることができる。例えば、 ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、ンエネティック・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉ ｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）第８巻：２７７〜２９８頁（ブレナム・プレス（ Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）　１９８６年）およびそこに引用されている文献参 照。本発明の生物学的に活性のあるヘテロダイマー蛋白を生産する別の方法を、 宿主細胞が微生物細胞、好ましくは、細菌細胞、詳細にはイー・コリである場合 に用いてもよい。例えば、種々のイー・コリ株（例えばＨＢＩＯＩ、ＭＣ１０６ １）が、バイオテクノロジーの分野では宿主細胞としてよく知られている。ビー ・ズブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、ンユードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ）　、他のバチルス等の種々の株も本発明に使用できる。

モノマーおよびダイマー（ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両方）を生産す るために用いられてもよいこの方法は、欧州特許出願第４３３，２２５号（出典 明示により本明細書の一部とする）に記載されている。簡単に説明すると、この 方法は、蛋白発現を可能にする発現調節配列に対する正当なリーディングフレー ムに連結された所望のＢＭＰ蛋白をコードしているヌクレオチド配列を有する微 生物宿主を培養し、モノマー型の可溶性蛋白を回収することを包含する。宿主細 胞中で蛋白が不溶性である場合、該水不溶性蛋白画分を宿主細胞から単離し、つ いで蛋白を可溶化させる。クロマトグラフィー精製の後、可溶化した蛋白を選択 された条件に付して生物学的に活性のある該蛋白のダイマー配置を得る。本発明 のヘテロダイマーを生産するのに用いられてもよいこの方法を、ＢＭＰ−２ホモ ダイマーの生産に関して、特に実施例７に記載しである。

本発明のもう１つの態様は、これらの組み換え型へテロダイマーの発現に用いる ＤＮＡ分子またはプラスミドベクターを提供する。これらのプラスミドベクター を、当業者に知られた方法および利用可能なエレメントを用いて構築してもよい 。一般的には、本発明方法に有用なベクターを得るためには、所望のＢＭＰをコ ードしているＤＮＡを、選択した宿主細胞に適する１個またはそれ以上の適当な 発現ベクター中に導入する。

哺乳動物細胞において有効ないかなる発現ベクターを用いても、哺乳動物細胞中 で本発明組み換え型へテロダイマーを生産させることができると現在考えられて いる。好ましくは、ベクターが、上記し、図示した選択ＢＭＰのＤＮＡ配列を含 んでおり、選択されたヘテロダイマーの構成成分をコードしているものとする。

別法として、上で参照した特許出願記載の、修飾配列を取り込んだベクターもま た本発明の具体例であり、ベクターの構築に有用である。

実施例１記載の特定のベクター以外に、当業者は、図１〜６の配列または図１〜 ６のコード配列（配列番号、１．３．５．７．９および１１）を含む他のＤＮＡ 配列、あるいは他の修飾配列およびｐＣＤ　［オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）ら、 モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロン−第２巻・１６１〜１７０頁（１ ９８２年）］ならびにｐＪＬ３、ｐＪＬ４［ボッ（Ｇｏｕｇｈ）ら、エムボー・ ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、　）第４巻、６４５〜６５３頁（１９８５年）コのご とき既知ベクターを用いることにより、哺乳動物発現ベクターを構築できる。コ ード領域の５°および３゛末端の非コードヌクレオチドを除去することにより、 ＢＭＰのＤＮＡ配列を修飾できる。

なくなった非コード領域を、発現に有益であることが知られている他の配列で置 き換えても、置き換えな（てもよい。上記の適当な宿主細胞中へのこれらのベク ターの形質転換により、所望のへテロダイマーを得ることができる。

当業者ならば、コード配列の横にある哺乳動物の調節配列を除去、あるいは例え ば酵母または昆虫の調節配列と置換することにより、図１〜６の配列を処理して 酵母または昆虫細胞による細胞内もしくは細胞外発現用ベクターを作ることがで きよう［昆虫細胞における発現については、例えば欧州特許出願第１５５，４７ ６号記載の方法を、酵母細胞における発現についてはＰＣＴ出願公開ＷＯ３６１ ０Ｏ６３９号および欧州特許出願ＥＰＡ１２３，２８９号記載の方法を参照］。

同様に、細菌の配列および好ましいコドンを、記載、例示した哺乳動物ベクター の代わりに用いて上記方法のＢＭＰモノマーの生産に用いる適当な発現系を構築 してもよい。例えば、コード配列をさらに処理することができる（例えば、他の 既知リンカ−に連結、あるいはそこから非コード領域を除去、またはその中のヌ クレオチドを他の既知方法により変更）。ついで、ティー・タニグチ（Ｔ。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ）ら、プロシーデインダス・オフ・ナショナル・アカデミ− ・オフ・サイエンシズ・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＬＩＳ＾）第７７巻：５２３０〜５２３３頁（１９８０年）記載のごと き方法を用いて、修飾されたＢＭＰコード配列を既知ベクター中に挿入できる。

ついで、典型的な細菌ベクターで細菌宿主細胞を形質転換させ、そのことにより ＢＭＰヘテロダイマーを発現させる。典型的な微生物用（例えば細菌用）発現ベ クターを後記実施例７に記載する。

本発明方法に有用な他のベクターが、単一の転写単位中に複数の遺伝子を含んで いてもよい。例えば、提案されたプラスミドｐ７Ｅ２Ｄが、ＢＭＰ−７遺伝子、 そのうしろにＥＭＣリーダー配列、そのうしろにＢＭＰ−２遺伝子、そのうしろ にＤＨＦＲマーカー遺伝子を含んでいてもよい。別の例はプラスミドｐ７Ｅ２Ｅ Ｄであり、これはＢＭＰ−７遺伝子、ＥＭＣリーダー、ＢＭＰ−２遺伝子、もう １つのＥＭＣリーダー配列およびＤＨＦＲマーカー遺伝子を含んでいる。別法と して、ベクターが、１個以上の転写単位を含んでいてもよい。−例として、プラ スミドＩ）２ＥＤ７ＥＤは、ＢＭＰ−２に関する転写単位およびＢＭＰ−７に関 する別の転写単位、すなわちＢＭＰ−２−ＥＭＣ−ＤＨＦＲおよびＢＭＰ−７− ＥＭＣ−ＤＨＦＲを含んでいる。別法として、プラスミド上の個々の転写単位が 異なるマーカー遺伝子を含んでいてもよい。例えば、プラスミドｐ２ＥＮ７ＥＤ は、ＢＭＰ−２−ＥＭＣ−ＮｅｏおよびＢＭＰ−７−ＥＭＣ−ＤＨＦＲを含んで いる。

さらにまた、ベクターが、選択宿主細胞における複製およびＢＭＰ発現を支配で きる適当な発現調節配列を含んでいる。かかるベクターにとり有用な調節配列は 当業者に知られており、選択宿主細胞に応じて選択できる。かかる選択はよく行 われることであって、本発明の一部ではない。同様に、ベクターが、１種または それ以上の選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子、ＮｅｏまたはＤＨＦＲお よびＡＤＡのような選択可能なマーカーのごときもの）を含んでいてもよい。

目下好ましいマーカーはＤＨＦＲである。これらの遺伝子は当業者により選択さ れうる。

上記方法のうちの１つによりベクターが発現しまた場合、本発明へテロダイマー を、種々のアッセイおよび方法により同定し、特徴づけることができる。ヘテロ ダイマーを形成している個々のＢＭＰに対する抗体による共沈（免疫沈降）アッ セイを行ってもよい。一般的には、例えば、選択ＢＭＰ、そのフラグメントまた は合成りＭＰペプチドを抗原として、慣用的手段により、この用途の抗体を得る 。

一般的に、アッセイに使用する抗体は、古典的方法によりウサギに注射された個 々のＢＭＰペプチドまたは蛋白から作られる。このアッセイを慣用的に行い、ヘ テロダイマーの両方のＢＭＰ構成成分に対する抗体により沈澱するヘテロダイマ ーの同定を行う。対照的に、当該ヘテロダイマー生産法において得られるすべて のホモダイマーに対しては、２種の抗体のうちの１種のみが沈澱を生じる。

特徴づけのためのもう１つのアッセイは、沈澱を生じる抗体、プローブとなる抗 体および検出用抗体を用いるウェスタンアッセイである。ダイマーを沈澱させる ＢＭＰのうちの１つに対する抗体を用い、ウェスタン分析用の還元５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ上でこのアッセイを慣用的に行ってもよい。２つ目のＢＭＰに対する抗体を 用いてウェスタンゲル上のヘテロダイマーに関する沈澱を捜し当てる。ついで、 セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したヤギ・抗ウサギ抗体の ごとき検出用抗体を適用し、ヘテロダイマーの構成成分のサブユニットの１つの 存在を明らかにする。

最終的には、ヘテロダイマーの比活性を、実施例６記載のごと（定量してもよい 。簡単に説明すると、個々のＢＭＰホモダイマーおよびヘテロダイマーの試料中 の個々のＢＭＰ量を、ウェスタンプロット分析またはパルスラベリングおよび５ ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により定量する。詳細には実施例８記載のごとく、Ｗ２０活 性も測定する。相対的な比活性を次式により計算してもよい：Ｗ２０アルカリホ スファターゼ活性／ウェスタンプロットまたはフルオログラフィーによるＢＭＰ 量。−例として、この式をＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーに用い、該ヘテロダイ マーが、見掛は上ＢＭＰ−２ホモダイマーよりも５ないし５０倍高い比活性を有 することが示された。

本発明へテロダイマーが、種々の治療上および医薬上の用途（例えば、傷の治療 用、組織の修復用の組成物中に用いられ、また個々のＢＭＰの用途について指示 された同様の組成物中に用いられる）を有していてもよい。個々のＢＭＰに優る ヘテロダイマーの増大した能力により、単一のＢＭＰのみを含有する組成物の用 量と比較すると、ヘテロダイマー含有組成物の患者に投与すべき用量は少量でよ い。本発明のヘテロダイマー蛋白は、骨が正常に成長しない環境下における軟骨 および／または骨の成長を誘導し、ヒトや他の動物の骨折および軟骨欠損の治療 に適用できる。本発明へテロダイマー蛋白を用いるかかる調製物には、解放骨折 のみならず閉鎖骨折の減少おける、また人工関節の良い状態での固定における用 途がある。骨形成剤により誘導される骨のデノボ合或は、先天性の、または外傷 による、あるいは腫瘍切除による頭蓋と顔の欠損の修復に貢献し、また美容整形 術にも有用である。

本発明のへテロダイマー蛋白を、歯周病およびその他の歯の修復法に用いてもよ い。かかる薬剤は、骨形成細胞を引き寄せ、骨形成細胞の成長を刺激し、あるい は骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘導する。また本発明のヘテロダイマーポキベ ブチドは、骨粗鬆症の治療にも有用である。種々の骨形成性、軟骨誘導性、およ び骨誘導性因子が記載されている。それらを議論するには、例えば、欧州特許出 願筒１４８．１５５号および第１６９，０１６号参照。

本発明蛋白を、傷の治療および関連組織の修復に用いてもよい。傷のタイプは、 熱傷、切り傷および潰瘍を含むが、これらに限定しない（ＰＣＴ公開ＷＯ３４１ ０１１０６号参照、傷の治療および関連組織の修復について議論するために、出 典明示により本明細書の一部とする）。

さらに、本発明蛋白は、神経の生存率を増加させることができるので、移植およ び神経の生存率の低下を示す症状の治療に有用である。

それゆえ本発明へテロダイマーの有用性の見地からすると、本発明のさらなる態 様は、骨折および軟骨および／または骨の欠損あるいは歯周病に関連した他の症 状の治療法および治療組成物である。さらに、本発明は、傷の治療および組織修 復の赳めの治療法ならびに組成物からなる。かかる組成物は、医薬上許容される 賦形剤、担体またはマトリックスとの混合物となっている治療上有効量の本発明 ヘテロダイマー蛋白からなる。ｐＨ１等張性、安定性等についての正当性を有す るかかる生理学上許容される蛋白組成物は、当該分野の技術的範囲内に属する。

本発明の蛋白が、他の関連蛋白および成長因子と共同して作用することが予想さ れる。それゆえ、本発明治療法および組成物は、治療に用いる量の少なくとも１ 種の他のＢＭＰ蛋白（共有かつ同時出願の前記米国特許出願に開示）と−緒に治 療に用いる量のヘテロダイマー蛋白からなる。かかる混合物は、個々のＢＭＰ蛋 白分子または本発明の他のへテロ分子からなっていてもよい。

さらなる組成物において、本発明ヘテロダイマー蛋白が、骨および／または軟骨 欠損、傷または問題となる組織の治療に有益な他の薬剤と混合されていてもよい 。これらの薬剤には、上皮成長因子（ＥＧＦ）　、血小板由来成長因子（ＰＤＧ Ｆ）、腫瘍成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）およびインスリン様成長因 子（ＩＧＦ）のごとき種々の成長因子が包含される。

ＢＭＰ蛋白は種特異性を欠くので、該治療組成物は、目下、獣医用にも価値があ る。詳細には、ヒトの他に家畜およびサラブレッド馬が、本発明ヘテロダイマー 蛋白でかかる治療をする対象として望ましい。

該治療方法は、移植片または器具による該組成物の局所的、全身的あるいは局部 的投与を包含する。投与の際には、本発明で使用する該治療用組成物は、勿論、 発熱原がな（生理学的に許容される形態である。さらに、該組成物を、望ましく は、カプセルに入れるか、または粘性のある形態として注入して骨、軟骨あるい は組織損傷部位に到達させる。局所的投与は傷の治療および組織修復に適するで あろう。本発明ヘテロダイマー蛋白以外の治療上有用な薬剤を、所望により上記 組成物に含有させてもよ（、本発明方法において、別法としであるいは付加的に 該ＢＭＰ組成物とともに同時または連続的に投与してもよい。好ましくは、骨お よび／または軟骨形成のためには、該組成物が、骨および／または軟骨損傷部位 にヘテロダイマー蛋白含有組成物を送達し、骨および軟骨の成長に適した構造を 提供し、最適に体内に再吸収されるマトリックスを含有するものとする。かかる マトリックスを、他の体内移植用外用薬に直ちに使用できる材料形態としてもよ い。

マトリックス材料の選択を、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容的外観お よび界面特性に基づいて行う。ヘテロダイマー含有組成物の特殊な応用は。

適当な処方を決定するであろう。当該組成物に都合のよいマトリックスは、生分 解性であり化学的に性質の分かっている硫酸カルシウム、りん酸三カルシウム、 ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物である。他の都合のよい材料 は、骨または皮膚コラーゲンのごとき生分解性であり生物学的に性質のよく分か っているものである。さらに、マトリックスは純粋な蛋白または細胞外マトリッ クス成分からなる。他の都合のよいマトリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト 、バイオグラス、アルミン酸塩あるいは他のセラミックスのごとき非生分解性で あり化学的に性質の分かっているものである。マトリックスが、ポリ乳酸および ヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンおよびりん酸三カルシウムのごとき上 述したいずれかの形態の材料の混合物からなっていてもよい。カルシウム−アル ミン酸塩−りん酸中のごとき組成物中においてバイオセラミックスを変更し、孔 のサイズ、粒子のサイズ、粒子の形態および生分解性を変化させてもよい。

１５０ないし８００ミクロンの範囲の直径の多孔性粒子に形態の乳酸およびグリ コール酸の５０：５０（重量モル）のコポリマーが、本発明に好ましい。ある適 用法においては、カルボキノメチルセルロースまたは自己由来の血餅のごとき放 散防止剤を用いてＢＭＰ組成物がマトリックスから解離するのを防止するのが便 利である。

担当医師は、ヘテロダイマー蛋白の作用を調節する種々の因子、例えば、形成さ れることが望まれる骨の重量、骨の損傷部位、損傷した骨の状態、傷の大きさ、 損傷組織の形態、患者の年令、性別、食事、何等かの感染症の重篤性、投薬期間 および他の医療上の因子を考慮したうえで、ヘテロダイマー蛋白含有組成物の投 薬規則を決定する。再構成に使用するマトリックスの形態およびヘテロダイマー 中のＢＭＰ蛋白、医薬組成物中の何等かの付加的なりＭＰまたは他の蛋白によっ ても薬用量を変更しつる。例えばＩＧＦ−１（インシュリン様成長因子Ｉ）のご とき他の知られた成長因子の最終組成物への添加もまた、薬用量に影響しうる。

骨の成長および／または修復を、例えば、Ｘ線、組織形態的分析およびテトラサ イクリン標識のごとき定期的な分析により、経過をモニターする。

以下の実施例は、本発明の説明であって、その範囲を限定するものではない。

実施例１−ＢＭＰベクターの構築および細胞系Ａ、ＢＭＰ−２ベクター 哺乳動物の発現ベクターｐＭＴ２　ＣＸＭは、ｐ９１０２３　［ウォング（ｌｏ ｎｇ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２２８巻：８１０〜８１５頁（１９ ８５年）］の誘導体であるが、前者は、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔ） の代わりにアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）を含んでおり、さらにｃＤＮＡク ローン挿入用にＸｈｏ１部位を有していることで後者と異なる。ｐＭＴ２　ＣＸ Ｍの機能的エレメントが記載されており［アイール・ジエイ・カウフマン（Ｒ， Ｊ、　Ｋａｕｆｍａｎ）　、ブロシーデインダス・オフ・ナショナル・アカデミ −・オフ・サイエンシズ・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）第８２巻：６８９−６９３頁（１９８５年）参照］、アデノ ウィルスＶＡ遺伝子、７２ｂｐのエンハンサ−を含むＳＶ４０複製開始点、５° スプライソング部位を有するアデノウィルス大後期プロモーター、およびアデノ ウィルス後期ｍＲＮＡ上に存在するアデノウィルス三分節リーダー配列の大部分 、３゛スプライシング受容部位、ＤＨＦＲ挿入遺伝子、ＳＶ４０初期ポリアデニ ル化部位（ＳＶ４０）、ならびにイー・コリ中で増殖するのに必要なｐＢＲ３’ ２２配列を含んでいる。

ｐＭＴ２−ＶＷＦ　（米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、受託番号ＡＴＣＣ６７１２２のもと寄 託された）を、ＥｃｏＲＩ消化により切形し、ｐＭＴ２−ＶＷＦ中に存在してい たｃＤＮＡ挿入部位を切除し、線形のｐＭＴ２を得る。プラスミドｐＭＴ２を連 結し、イー・コリＨＢＩＯＩまたはＤＨ−５をアンピシリン耐性に形質転換させ るのに用いることができる。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡを慣用的方法で調製する ことができる。

ついで、プラスミドｐＭＴ２　ＣＸＭを、ループアウト／イン変異法［モリナガ （Ｍｏｒｉｎａｇａ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） 第８４巻二６３６頁（１９８４年）］を用いて構築する。これにより、ＳＶ４０ 複製開始点およびｐＭＴ２のエンハンサ−配列の近くのＨｉｎｄＩＩＩ部位に対 して１０７５ないし１１４５番目の塩基を除去する。さらに、以下の配列：５’ ＰＯ４−ＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧ−３°　（配列番号：１５）を１１４ ５番目のヌクレオチド部位に挿入する。この配列は、制限エンドヌクレアーゼＸ ｈｏｌ認識部位を含んでいる。ｐＭＴ２３と命名したｐＭＴ２誘導体は、制限エ ンドヌクレアーゼＰｓ　ｔ　Ｌ　ＥｃｏＲＩＳＳａ　Ｉ　ＩおよびＸｈｏｌ認識 部位を含んでいる。全長にわたるＢＭＰ−２ｃＤＮＡ　（図１）（配列番号＝１ ）を、ＥｃｏＲＩ消化によりλＧＴ１０ベクターから切除し、これをｐＳＰ６５ 　［ウィスコンシン州マデイソンのプロメガ・バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂ ｉｏｔｅｃｈ）社製］中に両方向にサブクローン化し、ｐＢＭＰ−２＃３９−３ またはｐＢＭＰ−２１３９−４を得る。

ＢＭＰ−２ｃＤＮＡの非翻訳領域の大部分を以下の方法により除去する。ＢＭＰ −２ｃＤＮＡを含むｐＳＰ６５プラスミドを５ａｌｌで消化し、再連結すること により、アダプター中の５＃１１部位（はじめのｃＤＮＡクローニングの時から 存在）およびイニンエータ−ＡＴＧから７塩基対上流の５＃１１部位との間で、 ５°側の配列を除去する。３°側の非翻訳部位を、オリゴヌクレオチド：５°Ｇ ＡＧＧＧＴＴＧＴＧＧＧＴＧＴＣＧＣ工ΔＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣＴＡＣＡ終止　 ５ａｌＩ ＧＣＡＡＡＡＴＴ３’　（配列番号・１６）を用いるヘテロ二重鎖変異法を用い て除去する。該配列は、ＢＭＰ−２ｃＤＮＡの末端３°コード領域とそれにすぐ に続＜５ａｌｌ認識部位を含む。該配列は、終止（ＴＡＧ）コドンの次に５＃１ １部位を有する。

このクローンの５ａｉｌフラグメントを、発現ベクターｐＭＴ２３中にサブクロ ーン化し、ｐＭＴ２３−ＢＭＰ２ΔＵＴを得る。配列Ｐｓ　ｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ 　−３ａｌｌ−ＢＭＰ−２ｃＤＮＡ−Ｓａｉｌ−ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ中のＢＭ Ｐ−２コード領域に制限酵素切断部位が隣接している。

発現プラスミドｐＥＤ４　［カウフマンら、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ （Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　）第１９巻：４４８５〜４４９０頁（１９ ９１年）］を、ＥｃｏＲＩで消化し、子ウシ・腸ホスファターゼで処理すること により線形にする。ＥｃｏＲＩで消化することにより、ＢＭＰ−２ｃＤＮＡ遺伝 子をｐＭＴ２３−ＢＭＰ２ΔＵＴから切除し、１．０％低融点アガロースゲルに よる電気泳動により１．２ｋｂのフラグメントを回収する。線形にたったｐＥＤ ４ベクターとＥｃｏＲＩ　ＢＭＰ−２フラグメントとを連結し、ＢＭＰ−２発現 プラスミドルＢＭＰ２Δ−ＥＭＣを得た。

もう１つのベクターｐＢＭＰ−２Δ−ＥＮは、慣用的方法によりＤＨＰＲ遺伝子 がＴｎ５トランスポゾン由来のネオマイシン耐性遺伝子で置き換えられているこ と以外は、ベクターｐＢＭＰ２Δ−ＥＭＣに含まれるのと同じ配列を含んでいる 。

Ｂ、ＢＭＰ４ベクター ３゛非翻訳領域が除去されたＢＭＰ−４ｃＤＮＡ　（図２（配列番号：３）に示 す）を、変異原オリゴヌクレオチド。

５″ＧＧＡＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＧＣＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧ終止 を用いるヘテロ二重鎖変異法により調製する。これによりＢＭＰ−４ｃＤＮＡの 翻訳終結コドンに対する３°側のすべての配列が除去され、この終結コドンとベ クターのポリリンカー配列が並ぶ。このステップを５Ｐ６５ベクター［プロメガ ・バイオチク社製］において行うが、前記ＢＭＰ２ベクターと同様にＢＭＰ−４ ｃＤＮＡを含んでいるｐＭＴ２誘導体において行ってもよい。制限エンドヌクレ アーゼＢｓｍＩ　（ＢＭＰ−４ｃＤＮＡの８番目のコドンを開裂する）を用いて ５゛非翻訳領域を切除する。

はじめの８つのコドンの再構築を、以下のオリゴヌクレオチド：ＥｃｏＲＩ　イ ニシェーク−Ｂｓｍｌ ５’ＡＡＴＴＣＡＣＣΔ工ＧＡＴＴＣＣＴＧＧＴＡＡＣＣＧＡＡＴＧＣＴ３’（ 配列番号＝１８） および ３’ＧＴＧＧＴＡＣＴＡＡＧＧＡＣＣＡＴＴＧＧＣＴＴＡＣ５′（配列番号：１ ９） を連結することによって行う。これらのオリゴヌクレオチドは、Ｂｓｍ１で切断 されたＢＭＰ−４ｃＤＮＡに連結可能なりｓｍｌ相補的粘着末端を有する二重鎖 を形成する。また該二重鎖は、ＥｃｏＲＩで切断されたベクターｐＭＴ２に連結 可能なＥｃｏＲＩ相補的粘着末端を有している。よって、５゛および３′非翻訳 領域が除去されているが全コード配列を保持しているＢＭＰ−４に対するｃＤＮ Ａが、約１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ制限フラグメント中に含まれる。

このＢＭＰ−４配列を含むｐＭＴ２　ＣＸＭプラスミドをｐＸＭＢＭＰ−４ΔＵ Ｔと命名する。これをＥｃｏＲＩで消化して該ベクター由来の挿入フラグメント を含むＢＭＰ−４ｃＤＮＡを遊離させる。この挿入フラグメントを、哺乳動物の 発現ベクターｐＥＤ４のＥｃｏＲ１部位中にサブクローン化する。

Ｃ，ＢＭＰ−５ベクター 図５（配列番号＝９）の＃６９９ないし＃２０７０のヌクレオチド由来の配列を 含むＢＭＰ−５ｃＤＮＡ配列を、以下のごとく特異的に増幅する。オリゴヌクレ オチドＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＧＴＡ　（配 列番号：２０）およびＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＴＡＡＴＡＴＴＡＧＴＧＧＣＡＧ Ｃ（配列番号＝２１）をプライマーとして用いてλ−ＺＡＰクローンＵ２−１６ ［ＡＴＣＣ＃６８１０９コのＢＭＰ−５挿入フラグメント由来の＃６９９ないし ＃２０７０のヌクレオチド配列（図５）を増幅する。この方法により、ヌクレオ チド＃６９９１７）すぐ前二ヌクレオチド配列ＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣ （Ｒ列番号＝２２）が、そしてヌクレオチド＃２０７０のすぐ後にヌクレオチド 配列ＣＴＧＣＡＧＧＣＡが導入される。これらの配列の付加により、増幅された ＤＮＡフラグメントの両方の末端にＰｓｔｌ制限エンドヌクレアーゼ部位かでき る。

この方法で得られた増幅ＤＮＡ産物を、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化 し、ｐＭＴ２の誘導体であるｐＭＴ２１［カウフマン、ヌクレイツク・アシッズ ・リサーチ第１９巻：４４８５〜４４９０頁（１９９１年）］のＰｓｔ１部位中 にサブクローン化する。得られたクローンを８５１５／ｐＭＴと命名する。

Ｈ５１５／ｐＭＴの挿入フラグメントをＰｓｔｌ消化で切除し、プラスミドベク ターｐｓＰ６５　（プロメガ・バイオチク社製）のＰｓｔ１部位中にサブクロー ン化し、プラスミドＢＭＰ５／ＳＰ６を得る。ＢＭＰ５／ｓｐ６およびＵ２−１ ６を制限エンドヌクレアーゼＮ５ｉＩおよびＮｄｅＩで消化してそれらの挿入フ ラグメントの一部（図５の＃７０４から＃１８７６のヌクレオチドに対応）を切 除する。得られた１１７３個のヌクレオチドからなるクローンＵ１２−１６のＮ ５ｉＩ−ＮｄｅＩフラグメントを、ＢＭＰ５／ＳＰ６のＮ５ｉｌ−Ｎｄｅ１部位 （ここから対応する１１７３個のヌクレオチドからなるＮ５ｉｌ−Ｎｄｅｌフラ グメントが除去された）中に連結する。得られたクローンをＢＭＰ５ｍｉｘ／５ Ｐ６５と命名する。

ＢＭＰ５ｍｉ　ｘ／５Ｐ６５の直接ＤＮＡ配列分析を行って、増幅により得られ たヌクレオチド配列の図５に示す配列に対する同一性を確認する。クローンＢＭ Ｐ５ｍｉｘ／５Ｐ６５を制限エンドヌク゛レアーゼＰｓｔＩで消化し、図５のヌ クレオチド＃６９９から＃２０７０および上記Ｐｓｔｌ認識部位を含むさらなる 配列からなる挿入フラグメントを切除する。得られた１３８２個のヌクレオチド からなるＰｓｔｌフラグメントを、ｐＭＴ２誘導体であるｐＭＴ２１のＰｓｔ１ 部位中にサブクローン化する。このクローンをＢＭＰ５ｍｉ　ｘ／ｐＭＴ２１＃ ２と命名する。

また、同じフラグメントをｐＥＤ４のＰｓｔＩ部位中にサブクローン化してＢＭ Ｐ５ｍｉｘ−ＥＭＣ−１１と命名されるベクターを得る。

Ｄ、ＢＭＰ−６ベクター 図４（配列番号、７）のヌクレオチド＃１６０から＃１７０６のヌクレオチド配 列からなるＢＭＰ−６ｃＤＮＡ配列を、当業者に知られた一連の方法により得る 。クローンＢＭＰ６Ｃ３５［ＡＴＣＣ６８２４５］を制限エンドヌクレアーゼＡ ｐａｌおよびＴａｑＩで消化し、１４７６個のヌクレオチドからなる挿入フラグ メントの一部（図４のヌクレオチド＃２３１から＃１７０３からなる）を切除す る。１４７６個のヌクレオチドからなるＢＭＰ−６ｃＤＮＡ配列のＡｐａＩ−Ｔ ａｑＩフラグメントには含まれていない＃１６０から＃２３０および＃１７０４ から＃１７０６に対応するヌクレオチドに置き換わるように５ａｌｌ制限工ンド ヌクレアーゼ部位コンバーターを伴う合成ヌクレオチを設計する。

なくなった配列 ５　’　（ＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＡＧＧ ＧＣＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣ ＡＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＧＣＣ（配列番号：２−３）およびＣＧＣＡＧＣＡＧＣ ＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣＧ ＣＣＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＧにＣＡＴＧＧＴＧＧＧ）　（配列番号： ２４）およびｊ　３／　（ＴＣＧＡＣＴＧＧＴＴＴ（配列番号：２５）ならびに ＣＧＡＡＡＣＣＡＧ　（配列番号＋２６））に置き換わると考えられるオリゴヌ クレオチド／５ａｌＩコンバーターを互いにアニーリングする。ついでアニリン グした５′および３゛コンバーターを、上記１４７６個のヌクレオチドからなる ＡｐａＩ−Ｔａｑｌに連結し、図４の＃１６゜から＃１７０６のヌクレオチド配 列および両方の末端に５ａｌｌ制限工ンドヌクレアーゼ部位を生じるように工夫 された付加的な配列からなる１５６３個のヌクレオチドからなるフラグメントを 得る。得られた１５６３個のヌクレオチドからなるフラグメントを、ｐＳＰ６４ ［ウィスコンシン州マディソンのプロメガ・バイオチク社製］の５ａｌｌ部位中 にサブクローン化する。このクローンをＢＭＰ６／５Ｐ６４＃１５と命名する。

ＢＭＰ６／５Ｐ６４＃１５のＤＮＡ分析を行い、コンバーターにより置き換わっ た図４に示す配列に対する５′および３°配列の同一性を確認する。ＢＭＰ６／ ５Ｐ６４＃１５の挿入フラグメントを制限エンドヌクレアーゼ５ａｌＩで消化す ることにより切除する。得られた１５６３個のヌクレオチドからなる５ａｌＩフ ラグメントを、ｐＭＴ２１のＸｈｏｌ制限エンドヌクレアーゼ部位中にサブクロ ーン化し、ＢＭＰ６／ｌ）ＭＴ２１と命名する。

該プラスミドをＰｓｔＩで消化し、ｐＥＤ４のＰｓｔ１部位を以下のコンバータ ーヌクレオチド： ５’−ＴＣＧＡＣＡＧＧＣＴＣＧＣＣＴＧＣＡ−３’　（配列番号＋２７）オ、 Ｊ−び３’−ＧＴＣＣＧＡＧＣＧＧ−５°　（配列番号：２８）に連結すること により、５ａｌｌ部位に変換する。上記１５６３個のヌクレオチドからなる５ａ ｌｌフラグメントもｐＥＤ４ベクターの５ａｌｌ部位中にサブクローン化し、発 現ベクターＢＭＰ６／ＥＭＣを得る。

Ｅ、ＢＭＰ−７ベクター 図３（配列番号　５）のヌクレオチド＃９７から＃１４０２のヌクレオチド配列 配列からなるＢＭＰ−７配列を以下のようにして特異的に増幅する。オリゴヌク レオチドＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＧＴＧＣＧＣＴＣＡ　（配 列番号　２９）およびＴＣＴＧＴｃＧＡｃｃＴｃＧＧＡＧＧＡＧｃＴＡＧＴＧＧ Ｃ（配列番号　３０）をプライマーとして用いてクローンＰＥＨ７−９［ＡＴＣ Ｃ＃６８１８２］の挿入フラグメント由来の図３の＃９７がら＃１４０２のヌク レオチド配列を増幅する。この方法により、ヌクレオチド＃９７のすぐ前に配列 ＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣ，＋しテヌクレオチド＃１４０２のすぐ後にヌク レオチド配列ＧＴＣＧＡＣＡＧＡの挿入フラグメントを生じる。これらの配列の 付加により、増幅されたＤＮＡフラグメントの各末端に５ａｌＩ制限工ンドヌク レアーゼ認識部位を生じる。この方法で得られた増幅ＤＮＡ産物を制限エンドヌ クレアーゼ５ａｉｌで消化し、プラスミドベクターｐＳＰ６４　［ライスコンシ ン州マディンンのプロメガ・バイオチク社製］の５ｉＩ１部位にサブクローン化 し、ＢＭＰ　７／Ｓ　Ｐ　６　＃　２を得る。

クローンＢＭＰ７／ＳＰ６＃２およびＰＥＨ７−９を制限エンドヌクレアーゼＮ ｃｏ１および５ｔｕｌで消化して、図３のヌクレオチド＃３６３から＃１ｏ８１ に対応する挿入フラグメント部分を切除する。得られた７１９ヌクレオチドから なるＰＥＨ７−９のＮｃｏＩ−３ｔｕｌフラグメントを、ＢＭＰ　７／Ｓ　Ｐ　 ６　＃２（これより７１９ヌクレオチドからなるヌクレオチドフラグメントが除 去されている）のＮｃｏＩ−８ｔｕｌ部位中に連結する。得られたクローンをＢ ＭＰ　７ｍ　ｉ　ｘ　／　Ｓ　Ｐ　６と命名する。

ＢＭＰ７ｍｉ　ｘ／ＳＰ６の直接ＤＮＡ配列決定により、その３゛領域の、図３ の＃１０８２から＃１４０２のヌクレオチド配列に対する同一性が確認されるが 、５′領域には１個の異なるヌクレオチドが含まれている。

ＰＥＨ７−９を鋳型として用いるヌクレオチド配列（図３の＃９７がら＃１４０ ２）の増幅を上記のごと（繰り返す。この方法で得られた増幅ＤＮＡ産物を制限 エンドヌクレアーゼ５ａｉｌおよびＰｓｔｌで消化する。この消化により、図３ のヌクレオチド＃９７から＃８３３および前記５ａｉｌ制限工ンドヌクレアーゼ 認識部位を作るのに用いた５゛側のプライマーオリゴヌクレオチドの付加的配列 からなる７４７個のヌクレオチドからなるフラグメントが切形される。この７４ ７個のヌクレオチドからなるＳａ　１Ｉ−Ｐｓ　ｔ　Ｉフラグメントを、５ａｌ ｌ−ＰｓｔＩ消化したｐＳＰ６５　［ウィスコンシン州マディソンのプロメガ・ バイオチク社製］ベクター中にサブクローン化し、５’　ＢＭＰ　７／Ｓ　Ｐ　 ６５を得る。ＤＮＡ配列決定により、５’　ＢＭＰ　７／Ｓ　Ｐ　６５　＃　１ の挿入部位が図３のヌクレオチド＃９７から＃３６２と同じ配列からなることが 示される。

クローンＢＭＰ７ｍｉｘ／ＳＰ６および５’　ＢＭＰ　７／Ｓ　Ｐ　６５を制限 エンドヌクレアーゼ５ａ１１およびＮｃｏｌで消化する。図３のヌクレオチド＃ ３６３から＃１４０２のヌクレオチドからなる得られたＢＭＰ７ｍｉｘ／ＳＰ６ の３゜ＮｃｏＩ−３ａｉｌフラグメントと、図３のヌクレオチド＃９７から＃３ ６２からなるＢＭＰ７．’５Ｐ６５の５°５ａｉｌ−Ｎｃｏｌフラグメントとを Ｎｃｏｌ制限部位で連結して１３１７個のヌクレオチドフラグメント（図３のヌ クレオチド＃９７から＃１４０２からなる１３１７個のヌクレオチドフラグメン トおよびこのフラグメント（１３１７個のヌクレオチドフラグメント）の両末端 に５ａｌｌ制限工ンドヌクレアーゼ部位を作るための５゛および３′オリゴヌク レオチドブライマー由来の付加的配列からなる）を得る。

この１３１７個のヌクレオチドからなる５ａｉｌフラグメントを、ｐＭＴ２由来 のｐＭ７２ｃＩａ−２のＳｃｉ１部位中に連結する。ｐＭＴ２１をＥｃｏＲＶお よびＸｈｏＩで消化し、この消化したＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼのフレノウフ ラグメントで処理し、ついでＣｏａｌリンカ−（ネビオ・ラブダ（ＮＥＢｉｏ　 Ｌａｂｓ）社製、ＣＡＴＣＧＡＴＧ）を連結することにより、ｐＭ７２ｃＩａ− ２を構築する。これにより、ＳＶ４０複製開始点近傍のＨｊｎｄＩＩＩ部位から 始まる２１７１から２４２０番目の塩基およびｐＭＴ２のエンハンサ−配列が除 去され、唯一のＣ］ａＩ部位が導入されるが、アデノウィルスのＶＡＩ遺伝子は そのまま残る。

かくしてｐＭＴ２ｃ］ａ−２が得られる。このクローンをＢＭＰ−７−ｐＭＴ２ と命名する。

ＢＭＰ−７−ｐＭＴ２の挿入フラグメントを、制限エンドヌクレアーゼ５ａｌＩ で消化することにより切除する。得られた１３１７個のヌクレオチドからなる５ ａｌＩフラグメントをｐＭＴ２１のＸｈｏｌ制限エンドヌクレアーゼ部位中にサ ブクローン化してクローンＢＭＰ−７／ｐＭＴ２１を得る。この５ａｉｌフラグ メントもｐＥＤ４ベクター（上記のごと＜Ｐｓｔ１部位を５ａ１１部位に変換し である）のＳｃｉ１部位中にサブクローン化し、ｐＢＭＰ７／ＥＭＣ＃４を得る 。

現在のところ、哺乳動物のＢＭＰ−８ベクターは構築されていない。しかしなが ら、図６（配列番号、１１）の配列を用いれば、他のＢＭＰについて上記したも のと同様なベクターを容易に構築できると考えられる。実施例７に詳述したＢＭ Ｐ−２ベクターと同様な細菌の発現ベクターを、図６のアミノ酸＃２８４の前に Ｍｅｔを導入することにより構築してもよい。このＢＭＰ−８配列を、ＢＭＰ− ２配列の代わりにベクターｐＡＬＢＰ２−７８１中に挿入する。実施例７参照。

Ｇ、アデノシンデアミナーゼ（Ａｄａ）マーカーを有するＢＭＰベクターＢＭＰ 遺伝子をベクターｐＭＴ３ＳＶ２Ａｄａ　［アール・ジェイ・カウフマン。

メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　）第１８５巻：５ ３７〜５６６頁（１９９０年）コ中に挿入して、ＢＭＰ　ｃＤＮＡ遺伝子および 選択マーカー（Ａｄａ）それぞれの転写単位を含む発現プラスミドを得る。ｐＭ Ｔ３ＳＶ２Ａｄａは、哺乳動物細胞における遺伝子（例えばＢＭＰ）の挿入およ び発現に使用可能なＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｓａ　ｌ　ＩおよびＸｂａｌ認識部 位を有するポリリンカーを含んでいる。さらに、該ベクターは、哺乳動物細胞に おける主要かつ増幅可能なマーカーとして役立つＡｄａをコードしている２番目 の転写単位を有している。

ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７それぞれの発現ベクターを構築するために 、同一の一般的方法を用いる。ＢＭＰ−’５（図５）、６（図４）または７（図 ３）に対する遺伝子を、ｐＥＤ４ベクターについて本質的に前記したポリリンカ ー中に挿入する。これらのベクターを、ＣＨＯＤＵＫＸ細胞中へのトランスフェ クション、ついで上記Ａｄａマーカーを用いた選択および増幅［カウフマンら。

プロ／−ディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ・ニ ーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）第８３ 巻・３１３６〜３１４０頁（１９８６年）］に用いることができる。各ベクター はＤＨＦＲ遺伝子を含んでおらず、得られる形質転換細胞はＤＨＦＲ陰性のまま であるので、ＤＨＦＲと連結された異なるＢＭＰを含む２番目のベクターでトラ ンスフェクションし、メトトレキセートで増幅することができる。

別法として、ｐＭＴ３ＳＶ２Ａｄａ／ＢＭＰベクターを用いて、安定なＣＨＯ細 胞系（前もって異なるＢＭＰ遺伝子でトランスフェクションしである）をトラン スフェクションし、ついでＤＨＦＲ／メトトレキセート系を用いて増幅すること ができる。ついで、得られた形質転換体をＡｄａ系を用いて増幅し、２種の異な るＢＭＰ遺伝子を同時発現し、ＤＨＦＲおよびＡｄａマーカー双方を用いて増幅 される細胞系を得る。

Ｈ，ＢＭＰ−発現哺乳動物細胞系 現在のところ、本発明の組み替え型ホモダイマーおよびヘテロダイマーの製造に 用いる最も望ましい細胞系は以下のものである。

上記ベクターを用いる慣用的な形質転換により、これらの細胞系を調製した。

ＢＭＰ−２発現細胞系２ＥＧ５は、ベクターｐＢＭＰ２ｄｅ　］　ｔａ−ＥＭＣ で安定に形質転換されたＣＨＯ細胞である。

ＢＭＰ−４発現細胞系４Ｅ９は、ベクターｐＢＭＰ４ｄｅｌｔａ−ＥＭＣで安定 に形質転換されたＣＨＯ細胞である。

ＢＭＰ−５発現細胞系５Ｅ１０は、ベクターＢＭＰ５ｍｉｘ−ＥＭＣ−１１（増 幅レベルは２マイクロモラーのＭＸＴ）で安定に形質転換されたＣＨＯ細胞であ る。

ＢＭＰ−６発現細胞系６ＨＧ８は、ベクターＢＭＰ６／ＥＭＣで安定に形質転換 されたＣＨＯ細胞である。

ＢＭＰ−７発現細胞系７ＭＢ９は、ベクターＢＭＰ７／ｐＭＴ２１で安定に形質 転換されたＣＨＯ細胞である。

実施例２−ＢＭＰへテロダイマーの一時的発現以下の２つの異なる方法により、 実施例８のアッセイのスクリーニングのための一時的発現系における同時発現に よって本発明へテロダイマーを調製してもよい。

１番目の方法において、実施例１記載のｐＭＴ２由来およびＥＭＣ由来の発現プ ラスミドならびに同様にして誘導されたベクター（それぞれＢＭＰ−２からＢＭ Ｐ−７および腫瘍増殖因子（ＴＧＦβ１）をコードしている）を構築した。すべ てのプラスミド対の組み合わせを等しい割合で混合し、ＤＥＡＥ−デキストラン 法［ソムペイラク（Ｓｏｍｐａｙｒａｃ）およびダンナ（Ｄａｎｎａ）　、ブロ シーデインダス・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ・ニーニ スエイ第７８巻ニア５７５〜７５７８頁（１９８１年）；ルスマン（Ｌｕｔｈｍ ａｎ）およびマグヌソン（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ）　、ヌクレイツク・アシッズ・ リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）第１１巻：１２９５〜１３０ ８頁（１９８３年）コを用いるＣＨＯ細胞の同時トランスフェクションに用いた 。１０％ウシ胎児血清、アデノシン、デオキシアデノシン、チミジン（各１００ μｇ／ｍｌＬペニシリン／ストレプトマイシンおよびグルタミン（１ｍＭ）を添 加したアルファ最少必須培地（α−ＭＥＭ）で細胞を増殖させる。

ヘパリン、スラミン、デキストラン硫酸のごとき化合物の増殖培地への添加は望 ましく、ＣＨＯ細胞調整培地中に存在するＢＭＰ−２の量を増加させる。同様に 、ＢＭＰ−５もかかる化合物に応答する。それゆえ、これらのＢＭＰ構成成分を 含むすべてのヘテロダイマーのためにこれらの化合物を添加することが考えられ る。他のＢＭＰも、これらの化合物の効果に応答するかもしれず、その効果は、 成熟ＢＭＰと細胞表面との相互作用を抑制することであると考えられている。

翌日、１００μｇ／ｍｌヘパリン添加あるいは無添加新鮮培地を添加した。２４ 時間後、培養物を収穫した。いくつかの実験系において、トランスフェクション 後２４〜４８時間のヘパリン無添加培養物を集め、ついで同じプレートを用いて トランスフェクノコン後４８〜７２時間のヘパリン存在下での培養物を得た。

対照系は、ＢＭＰ配列を欠く発現プラスミドを有する形質転換細胞、ただ１つの ＢＭＰ配列を含むプラスミドを有する形質転換細胞、または単−ＢＭＰ形質転換 細胞による培養物と異なるＢＭＰ形質転換細胞による培養物の混合物を含んでい る。

粗調整培地中に同時発現された（あるいは未精製の）ヘテロダイマーＢＭＰを特 徴づけすることにより、以下の結果を得た。一時的に同時発現したＢＭＰを、実 施例８記載のＷ２０基質細胞に対するアルカリホスファターゼ活性に関してアッ セイした。

以下に示すように、ＢＭＰ−２とＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７との 同時発現、ＢＭＰ−４とＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７との同時発現 は、Ｗ２０アッセイにおいて、個々のヘテロダイマーのみあるいはホモダイマー ａ合物のいずれよりも強いアルカリホスファターゼ誘導活性を示した。ＢＭＰ− ２とＢＭＰ−７が同時発現した場合に最大活性が得られた。ヘテロダイマーＢＭ Ｐ−２１５；ＢＭＰ−２／６　：ＢＭＰ−４１５、ＢＭＰ−４／６およびＢＭＰ −４／７も活性が高かった。

調整培地 ＴＧＦ−β　ＢＭＰ−７ＢＭＰ−６ＢＭＰ−５ＢＭＰ−４ＢＭＰ−３ＢＭＰ−２ 日ＭＰ−２３３２４０９９８９５３９２９ＢＭＰ−３−−−−１４− ＢＭＰ−４１２１１５２５２２２４ 調整培地＋ヘパリン ＴＧＦ−β　ＢＭＰ−７聞Ｐ−６ＢＭＰ−５ＢＭＰ−４ＢＩＩＰ−３ＢＩＪＰ− ２日ＭＰ−２８８４５４１３２１２７７０７７１６９ＢＭＰ−３−−−−７− ＢＭＰ−４７１１９３０４１３７ 単位：活性１単位は、ｌｎｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ−２に相当する。

−、アッセイの検出限界以下の活性を示す。

ついで、ＣＨＯ細胞の一時的トランスフェクションの間、種々の比率の発現プラ スミド（９：１．３；１．１：１．１：３．１：９）を用いてこれらのＢＭＰの 組み合わせを発現させた。９：１ないし１・９の範囲のプラスミド数の比で、Ｂ ＭＰ−２を含むプラスミドとＢＭＰ−７を含むプラスミドとを用いてこの方法を 行い、個々のＢＭＰのプラスミドが大体同数の場合に、Ｗ２０アッセイにおいて 最大活性が得られた。単一のＢＭＰを含むプラスミドでトランスフェクションし た宿主細胞と比較すると、ＢＭＰ−２のＢＭＰ−７に対する比がそれぞれ３ｚ１ ないし１：３の場合にもＷ２０アッセイにおける活性が増大した。しかしながら 、これら後者の比較においては１：１の比よりも活性が低かった。

ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７以外からなるヘテロダイマーに関する同様な比率が 当業者により決定されつる。例えば、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６間で形成され るヘテロダイマーに関する予備実験により、同時トランスフェクションに好まし い比率は３：１であることが示されている。この方法に関する好ましい比率の決 定は、当該分野の技術的範囲内である。

同時発現したＢＭＰを一時的に得るための別法として、それぞれＢＭＰ−２、Ｂ ＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７を発現する実施例１で確認 された安定なＣＨＯ細胞系を１日間間時培養し、ついで４６．７％ポリエチレン グリコール（ＰＥＧ）で融合させる。融合１日後、新鮮培地を添加し、２４時間 後にＷ２０アッセイ（実施例８に記載）用に収穫する。そのアッセイの結果は、 実質的に上記結果と同様であった。

それゆえ、ＢＭＰ−５，６または７とともに同時発現したＢＭＰ−２または４と の組み合わせのすべては、いかなる単独ＢＭＰホモダイマーよりも高い活性を示 した。個々のＢＭＰホモダイマーのみが発現される対照実験および収穫後混合さ れた調整培地においては、活性は常に個々のＢＭＰの中間値であり、同時発現さ れたヘテロダイマーＢＭＰは、個々に発現されたＢＭＰホモダイマーの組み合わ せよりも高い活性を示すことがわかった。

実施例２の一時的な分析の結果に基づき、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７を同時発 現する安定な細胞系を作った。

好ましい安定な細胞系２Ｅ７Ｅ−１０を以下のようにして得た。プラスミドＤＮ Ａ　（ｐＢＭＰ−７−ＥＭＣおよびｐＢＭＰ−２−ＥＭＣの１：１混合物、実施 例１に記載）を、エレクトロポーレーンコン［ノイマン（Ｎｅｕｍａｎ）ら、エ ムポー・ジャーナル第１巻＝８４１〜８４５頁（１９８２年）］によりＣＨＯ細 胞中へトランスフェクションさせた。

２日後、細胞を、１０％透析済みウシ胎児血清を含み、ヌクレオシド不含選択培 地に移した。１０〜１４日後にＤＨＦＲを発現するコロニーを数えた。各コロニ ーまたはコロニーのプールを培養し、標準的方法を用いて、各ヘテロダイマーＢ ＭＰ構成成分のＲＮＡおよび蛋白の発現について分析し、ついでＭＴＸを増加さ せた場合の増殖により、その増幅に関して選択を行った。好ましいクローン（２ Ｅ７Ｅと命名）の段階的選択を、ＭＴＸ濃度０．　５μＭまで行った。ついで得 られた細胞系を増殖させ、ヘテロダイマー２／７発現についてアッセイした。

かかる分析法には、構成成分のＤＮＡの存在を検出するウェスタンプロット分析 、代謝的に標識された蛋白の定量および５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ならびに部位の 異なるラット・骨形成アッセイを用いた軟骨および／または骨形成活性の分析（ 実施例９）が包含される。現在のところ、好ましいクローン的に誘導された細胞 系は２Ｅ７Ｅ−１０であると確認されている。この細胞系は、０．５μＭ　ＭＴ Ｘ含有培地中にＢＭＰ−２／７ヘテロダイマー蛋白を分泌する。

ＣＨＯ細胞系２Ｅ７Ｅ−１０を、１０％ウシ胎児血清を含むダルベツコの改変イ ーグル培地（Ｄａｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’　ｓ　 ｍｅｄｉｕｍ）　（ＤＭＥＭ）　／　／’ムの（Ｈａｍ’　ｓ）栄養混合物Ｆ− １２の１　＋　１　（ｖ／ｖ）混合培地中で増殖させる。細胞が８０ないし１０ ０％集密的になった場合、培地を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２に置換する。４日に わたり２４時間おきに培養物を収穫する。蛋白生産および精製のために細胞を無 血清下で培養する。

同時発現細胞系２Ｅ７Ｅ−１０が、最初は実施例２記載のＢＭＰ−２発現細胞系 ２ＥＧ５よりも少量のＢＭＰ蛋白を生産するように見えるが、推定ヘテロダイマ ーの比活性が、少なくともＢＭＰ−ホモダイマーの５倍であることがわかる（実 施例６参照）。

別のヘテロダイマー生産細胞を構築するために、安定な細胞系７ＭＢ９　（前も ってｐＢＭＰ−７−ｐＭＴ２でトランスフェクションされ、ＢＭＰ−７を発現す る）を用いる。７ＭＢ９を増幅し、ＤＨＦＲ／ＭＴＸ系を用いて２μＭメトトレ キセート耐性により選択する。安定な同時発現細胞系を得るために、ＢＭＰ−２ およびＴｎ５）ランスボゾン由来のネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクター ｐＢＭＰ−２Δ−ＥＮ　（ＥＭＣ−Ｎｅｏ）で、細胞系７ＭＢ９をトラ：／　７ ．７　ｓクシコンする。得られた形質転換された安定細胞系を、Ｇ−４１８およ びＭＴＸ耐性に関して選択する。個々のクローンを拾い、前記したようにＢＭＰ 発現について分析する。

一時的同時発現により上昇した活性を示すＢＭＰの他の組み合わせを同時発現す る安定な細胞系は、安定な発現においても同様に高い活性を示すことが予想され る。

Ｂ、ＢＭＰ−２／６ 実施例２の一時的アッセイの結果に基づいて、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６を同 時発現する安定な細胞系を作った。

好ましい細胞系１２ＣＯ７を以下のようにして得たニブラスミドＤＮＡ　（ｐＢ ＭＰ−６−ＥＭＣおよびｐＢＭＰ−２−ＥＭＣの１：３混合物）を、エレクトロ ポーレーシコン［ノイマンら、エムボー・ジャーナル第１巻＝８４１〜８４５頁 （１９８２年）コによりＣＨＯ細胞中にトランスフェクションさせた。

２日後、細胞を選択培地（１０％透析済みウソ胎児血清含有、ヌクレオシド不含 ）に移した。ＤＨＦＲを発現するコロニーを１０〜１４日後に得た。個々のコロ ニーあるいはコロニーのプールを広げ、標準的方法を用いて個々のヘテロダイマ ーＢＭＰ構成成分のＲＮＡおよび蛋白の発現を分析し、ついでＭＴＸ濃度を増加 させて増殖させることにより、増幅に関して選択した。ＭＴＸ濃度２．０μＭに 至るまで、好ましいクローン（１２−Ｃと命名）の段階的選択を行った。ついで 細胞系を増殖させ、ヘテロダイマー２／６発現についてアッセイした。

かかるアッセイ方法には、構成成分のＤＮＡの存在を検出するウェスタンプロッ ト分析、代謝的に標識された蛋白の定量および５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ならびに 部位の異なるラット・骨形成アッセイを用いた軟骨および／または骨形成活性の 分析（実施例９）が包含される。現在のところ、好ましいクローン的に誘導され た細胞系は１２ＣＯ７であると確認されている。この細胞系は、２．０μＭＭＴ Ｘ含有培地中にＢＭＰ−２／６ヘテロダイマー蛋白を分泌する。

ＣＨＯ細胞系１２ＣＯ７を、１０％ウシ胎児血清を含むダルベツコの改変イーグ ル培地（Ｄａｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉ ｕｍ）　（ＤＭＥＭ）　／ハムの（Ｈａｍ’　ｓ）栄養混合物Ｆ−１２の１　： 　１　（Ｖ／Ｖ）混合培地中で増殖させる。細胞が８０ないし１００％集密的に なった場合、培地を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２に置換する。４日にわたり２４時 間おきに培養物を収穫する。蛋白生産および精製のために細胞を無血清下で培養 する。

同時発現細胞系１２ＣＯ７が、最初は実施例２記載のＢＭＰ−２発現細胞系２Ｅ Ｇ５よりも少量のＢＭＰ蛋白を生産するように見えるが、推定へテロダイマーの 比活性が、少なくともＢＭＰ−ホモダイマーの３〜５倍であることがわかる（実 施例６参照）。

別のへテロダイマー生産細胞を構築するために、安定な細胞系２ＥＧ５　（前も ってｐＢＭＰ−２−ＥＭＣでトランスフェクションされ、ＢＭＰ−２を発現する ）を用いる。２ＥＧ５を増幅し、ＤＨＦＲ／ＭＴＸ系を用いて２μＭＴＸメトト レキセート耐性により選択する。安定な同時発現細胞系を得るために、ＢＭＰ− ６およびＡＤＡ耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＢＭＰ−５−ａｄａ　（ａｄａ デアミナーゼ）で、細胞系２ＥＧ５をトランスフェクションする。得られた形質 転換された安定細胞系を、ＤＣＦおよびＭＴＸ耐性に関して選択する。個々のク ローンを拾い、前記したようにＢＭＰ発現について分析する。

一時的同時発現により上昇した活性を示すＢＭＰの他の組み合わせを同時発現す る安定な細胞系は、安定な発現においても同様に高い活性を示すことが予想され る。

実施例４−ＢＭＰ２／７およびＢＭＰ２／６ヘテロダイマーの精製ＢＭＰ−２／ ６ヘテロダイマーおよびＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーに関するのと同じ精製法 を用いた。組換えによりＢＭＰヘテロダイマー２／７または２／６を生産するよ うになった細胞系２Ｅ７Ｅ−１０または１２ＣＯ７を含む培養物を、付着または 懸濁いずれかの培養により得た。同時発現したＢＭＰを小スケールの培養で得る たまに、付着培養物をローラーボトル中に接種し、１０％透析済み熱失活ウシ胎 児血清［ペンフルバニア州デンバーのハズレトン（Ｈａｚｌｅｔｏｎ）社製］含 有アルファ最少イーグル培地［α−ＭＥＭ、ニューヨークのグランドアイランド （Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ）のギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製］中で集密的になる まで培養した。ついで培地を無血清、無アルブミン、低蛋白培地（ダルベツコの 改変イーグル培地およびハムのＦ−１２培地の５０：５０混合物を基礎とし、所 望により１００マイクログラム／ｍｌのデキストラン硫酸を補足）に切り替えた 。４〜５日間毎日収穫してプールしておき、組み換え型蛋白の精製に用いた。

上記のごとくローラーボトル培養で得られた培養物を室温でゆっくりと融解し、 プールした。プールした培養物のｐＨを、ＩＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０を用いて ８．０に合わせた。カラムにマドレックス・セルファイン・サルフェート（Ｍａ ｔｒｅｘＣｅｌｌｆｉｎｅ　５ｕｌｆａｔｅ）　［アミコン社製］を入れ、５０ ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０で平衡化した。

培養物の負荷が完了した後、カラムを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、０．４Ｍ　ＮａＣｌ を含む緩衝液（ｐＨ８，０）で、２８０ｎｍのベースラインが安定化するまで洗 浄した。ついでカラムを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０で洗浄して緩衝液から ＮａＣｌを除去した。ついで樹脂を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ　ＮａＣｌ 、４Ｍ尿素（ｐＨ８，０）で、ピークが溶出するまで洗浄した。ついでカラムを 、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，Ｏて洗浄して尿素を除去した。

ついで、結合したＢＭＰ−２／７またはＢＭＰ−２／６を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ 、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．５Ｍアルギニン（ｐＨ８，０）を用いて溶出した。

溶出液を１つに集め、所望ならばさらなる精製まで凍結してもよい。このセルフ ァイン・サルフェート溶出物を、１４倍体積の６Ｍ尿素で希釈し、ついで試料の ｐＨを６．０にした。ヒドロキシアパタイトーウシトロゲル（Ｈｙｄｒｏｘｙａ ｐａｔｉｔｅ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）　［アイビーエフ（ＩＢＦ）社製］をカラム に注入し、８０ｍＭリン酸カリウム、６Ｍ尿素（ｐＨ６，０）で平衡化した。

試料負荷完了後、ベッド体積の１０倍の平衡化緩衝液で洗浄した。結合している ＢＭＰ−２／７あるいはＢＭＰ−２／６ヘテロダイマーは、ベッド体積の５倍の １００ｍＭリン酸カリウム、６Ｍ尿素（ｐＨ７，４）で溶出された。この溶出物 を、ビダック（Ｖｙｄａｃ）　Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラム（水−０，１％ＴＦＡで 平衡化）に直接負荷した。ＢＭＰ−２／７あるいはＢＭＰ−２／６ヘテロダイマ ーを、水−０，１％トリフルオロ酢酸中３０〜５０％アセトニトリルのグラジェ ントで溶出した。ＢＭＰ−含有フラクションを、還元剤の存在または不存在下の ５ＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。ホモダイマ一対ヘテロダイマーに関するＢＭ Ｐ−の同定を２次元ＰＡＧＥ　（還元剤の存在または不存在下）により行った。

ヘテロダイマー含有フラクションのバンドは２個のスポットに減少し、ホモダイ マーのバンドは各ＢＭＰ種の１個のスポットに減少した。ＢＭＰ−２／６ヘテロ ダイマーサブユニツトを蛋白シーケネーターで分析した。以下の種のＢＭＰ−２ ／６ヘテロダイマーが存在する二アミノ酸＃２８３　Ｇｉｎ−Ａｈａ−Ｌｙｓま たは＃２４９　５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓから始まるＢＭＰ−２サブユニツトに結 合した、アミノ酸＃３７５　５ｅｒ−Ａｈａ−８ｅｒ−８ｅｒから始まるＢＭＰ −６サブユニツト。しかしより少量の他の種も存在しつる。

本発明のいかなる組み替え型ＢＭＰについても同一または実質的に同様な精製法 を用いることができると考えられる。本発明のＢＭＰ−２／７あるいはＢＭＰ− ２／６もしくは他のヘテロダイマーに関しては、ハイドロキシアバタイトーウル トロゲル力ラムが不要であるかもしれず、その場合、セルファイン・サルフェー ト溶出物を直接Ｃ１逆相ＨＰＬＣカラムに負荷することにより精製スキームを変 更してもよい（ハイドロキンアパタイトーウルトロゲル力ラムを用いず）。

実施例５−蛋白の特徴づけ ３５Ｓメチオニン標識後、同時発現細胞系から分泌される全蛋白をウェスタンプ ロット分析（例えばＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７のへテロダイマーの両方のＢＭ Ｐに対する抗体を用いる）により分析する。アルカリホスファターゼのアッセイ も一緒に行い、データによりヘテロダイマーの存在およびその比活性が示される 。

以下の詳細な説明は、ＢＭＰ−２／７およびＢＭＰ−２／６ヘテロダイマーにつ いて集めたデーターに対するものである。しかしながら、同様の方法を本明細書 記載の他のヘテロダイマーに適用することにより、同様の結果が得られる。

Ａ、”Ｓ−Ｍｅｔ標識 ＢＭＰ２Δ−ＥＭＣおよびＢＭＰ７Δ−ＥＭＣ発現ベクターの同時トランスフェ クションにより誘導された細胞系に３ＩＳ−メチオニンを１５分間パルスし、無 血清培地（ヘパリン存在または不存在）で６時間チェイスした。ＰＡＧＥおよび フルオログラフィーにより、還元条件下で全分泌蛋白を分析した。その結果によ り、いくつかの細胞系がＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７蛋白を分泌することが示さ れた。

アルカリホスファターゼ活性と同時発現した蛋白量との間には良い相関関係があ る。

いくつかの細胞系は、ＢＭＰ−２のみを分泌する細胞系２ＥＧ５　（１０μｇ／ ｍｌのＢＭＰ−２を生産）よりも少量のＢＭＰ−２および７を分泌する。細胞系 ２Ｅ７Ｅ−１０（０，５ｍＭ　ＭＴＸのレベルで増幅）は、細胞系２ＥＧ５と同 じレベルでＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７を等しい割合で分泌する。細胞系２Ｅ７ Ｅ−１０は、ある分析において６００マイクログラム／ｍｌのＢＭＰ−２ホモダ イマー活性に相当する量を生産する。

全標識蛋白を２次元非運元／還元ゲル系で分析してヘテロダイマーが生成してい るかどうかを確認した。予備実験結果により、ＢＭＰ−２のみまたはＢＭＰ−７ のみを発現するいずれかの細胞系においては見られない独自のスポットがこのゲ ル中に存在することが示され、２／７ヘテロダイマーの存在が示唆された。精製 物質を用いた同じゲルは、２／７ヘテロダイマーの存在を示す同じ結果（ゲル上 の２つの特有のスポット）を示した。

組み換え型ＢＭＰ−２／７の精製とは対照的に、ＢＭＰ−２ホモダイマーはＢＭ Ｐ−２／６調製物中には検出されなかった。しかしながら、有意な量のＢＭＰ− ６ホモダイマーが見られた。さらに、有意な量のＮ−末端アミノ酸が２０個切除 されているＢＭＰ−６が見られた。細胞培養中、プロテアーゼインヒビターを添 加することにより、この種を除去できた。ＢＭＰ−２／６は、Ｃ４逆相ＨＰＬＣ において、ＢＭＰ−２／７よりも２ないし３フラクション遅れて溶出することが わかった。

主要なりＭＰ−２／７ヘテロダイマ一種が、成熟ＢＭＰ−２サブユニット［アミ ノ酸＃２８３　（Ｇｉｎ）　〜＃３９６　（Ａｒｇ）］および］ＢＭＰ−７成熟 サブユニット＃２９３　（Ｓｅｒ）　〜＃４３１　（Ｈｉｓ）］からなることが アミノ酸配列決定により示される。ＢＭＰ−２／６ヘテロダイマーは、成熟ＢＭ Ｐ−２サブユニット（＃２８３〜３９６）および成熟ＢＭＰ−６サブユニツト［ ＃３７５（Ｓｅｔ）〜＃５１３　（Ｈｉｓ）コからなッテイル。

Ｂ、ウェスタンプロット分析と組み合わせた免疫沈降ＢＭＰ−２のみ（２ＥＧ５ ）　、ＢＭＰ−７のみ（７ＩＳ９）または２Ｅ７Ｂ−１０同時発現細胞系による 調整培地を、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−７抗体（いずれもウサギで得た慣用的な ポリクローナル抗体）いずれかとともに免疫沈降反応に付し、ついで抗ＢＭＰ− ２または抗ＢＭＰ−７抗体いずれかをプローブとするウェスタンプロットで分析 した。２／７ヘテロダイマーは沈澱し、ウェスタンプロットにおいてＢＭＰ−２ およびＢＭＰ−７両抗体と反応した。一方、いずれのＢＭＰもそれ自身はその特 異的抗体と反応するが、相対する抗体とは反応しない。

抗ＢＭＰ−７抗体Ｗ３３［マサチューセッツ州ケンブリッジのジェネティクス・ インスティチュート、インク社製］により沈澱し、ウェスタンプロット上で抗Ｂ ＭＰ−２抗体Ｗ１２またはＷｌｏ［ジェネティクス・インスティチュート、イン ク社製］と反応する、同時発現細胞系中の蛋白は、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−７ のみを発現する細胞系には存在しないことがこの方法を用いて示された。この実 験により、この蛋白量がヘテロダイマー蛋白であることが示される。逆に、Ｗ１ ２との沈澱およびＷＢ２でのプローブにおいては同じ結果が得られた。

実施例６−へテロダイマーの比活性 Ａ　インビトロでのアッセイ 安定な細胞系２Ｅ７Ｅ−１０と２ＥＧ５との、および１２ＣＯ７と２ＥＧ５との 増殖培地中に分泌されるＢＭＰ−２／７またはＢＭＰ−２／６ヘテロダイマー、 およびＢＭＰ−２ホモダイマーそれぞれの比活性を以下のごと（測定した。

ウェスタンプロット分析またはＰＡＧＥおよびフルオロメトリーによる０３メチ オニン標識細胞から分泌される蛋白を分析することにより、調整培地中のＢＭＰ 蛋白量を測定した。ついで、同じ細胞系によりＷ２０細胞に対して生産されるア ルカリホスファターゼまたは骨カルシウム沈着誘導の活性を測定した。増殖培地 中に分泌された蛋白に対する活性の比からＢＭＰ比活性を計算した。

ある実験において、ＰＡＧＥおよびフルオロメトリーによれば、２Ｅ７Ｅ−１０ および２ＥＧ５は同程度の量の全ＢＭＰ蛋白を分泌した。２Ｅ７Ｅ−１０は２Ｅ Ｇ５の約５０倍のアルカリホスファターゼ誘導活性を示し、該ヘテロダイマーの 比活性がそのホモダイマーの約５０倍であることが示された。

別の実験において、２ＥＧ５により分泌されたＢＭＰ−２蛋白量は、２Ｅ７Ｅ− １０により分泌されたＢＭＰ−２／７よりも約５０％多かった。しかしながら、 ２Ｅ７Ｅ−１０は、２ＥＧ５の約１０倍の骨カルシウム沈着誘導活性を示した。

このタイプのいくつかの異なる実験から、ＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーの比活 性は、ＢＭＰ−２ホモダイマーの５ないし５０倍であると評価された。

図８および図９は、Ｗ２０アルカリホスファターゼおよびＢＧＰ　（骨Ｇｌａ蛋 白、オステオカルシン）アッセイにおけるＢＭＰ−２およびＢＭＰ−２／７の活 性の比較である。ＢＭＰ−２／７は比活性がＢＭＰ−２よりもずっと高い（図８ ）。

図８かられかるように、Ｗ−２０細胞において最大ホスファターゼ応答の５０％ を誘導するには約１．３　ｎ　ｇ／ｍ　ｌのＢＭＰ−２／７で十分であった。ア ルカリホスファターゼ応答が極大化しないため、ＢＭＰ−２の対応する値は計算 が困難である。しかし最大の半分の応答には３０ｎｇ／ｍ１以上が必要である。

よって、ＢＭＰ−２／７は、Ｗ−２０アツセイにおいて、ＢＭＰ−２の２０ない し３０倍の比活性を有する。

図９かられかるように、この実験においてＢＭＰ−２／７は、ＢＧＰ　（骨Ｇｌ ａ蛋白、骨カルシウム沈着）生成において、ＢＭＰ−２よりも効果的な刺激剤で あった。ＢＭＰ−２／７でＷ−２０−１７細胞を４日間処理すると５２ｎｇ／ｍ ｌで最大ＢＧＰ応答が得られ、１１　ｎ　ｇ／ｍ　Ｉで最大ＢＧＰの５０％が誘 発される。対照的に、４６８ｎｇ／ｍｌの蛋白を与えるまではＢＭＰ−２による ＢＧＰ合成に対する最大刺激が見られなかった。Ｗ−２０−１７細胞によるＢＧ Ｐ応答を誘発するのに必要なりＭＰ−２／７の最少量は３．９　ｎ　ｇ／ｍ　＋ であり、ＢＭＰ−２所要量２９ｎｇ／ｍ＋の約７分の１であった。これらの結果 は、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−２／７について得られたＷ−２０−１７アルカリ ホスフアターゼアツセイにおいて得られたデータと矛盾しなかった。

予備分析により、ＢＭＰ−２／６がインビトロにおいてＢＭＰ−２／７と同等の 比活性を有することが示される。Ｗ−２０におけるＢＭＰ−２およびＢＭＰ−２ ／６のアルカリホスファターゼ誘導能力を比較すると、図１２に示すように、こ のアッセイ系においては、ＢＭＰ−２／６はＢＭＰ−２よりも高い比活性を有し ている。このデータは、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−２／６のインビボでのア・ソ セイにより得られた値とよく一致している。

Ｂ、インビボでのアッセイ （ｉ）ＢＭＰ−２／７ 精製ＢＭＰ−２／７およびＢＭＰ−２／７を、ラットの異なる部位における骨形 成アッセイにおいて試験した。一連の異なる量のＢＭＰ〜２／７またはＢＭＰ− ２を、３系並列してラットに移植した。５および１０日後、移植物を取り出し、 骨または軟骨の存在について組織学的に試験した。新たに形成された軟骨および 骨の量についての組織学的スコアを表Ａにまとめである。

表Ａ １０　Ｃ１士士　士士±　２２２　１１±Ｂ　−−−−一−２３３１１± ５．０　Ｃ２２１１±１　１１２　１２１Ｂ　±−１−−−，４４３２３２ ２５゜ＯＣ士±２　２２２ Ｂ　４４３　３３３ ラツトの異なる部位における軟骨および骨誘導アッセイに要したＢＭＰ−２／７ の量はＢＭＰ−２よりも少量である。組織学的には、ＢＭＰ−２／７およびＢＭ Ｐ−２により誘導された軟骨または骨の外観は同じである。

（ｉｉ）　ＢＭＰ−２／６ 種々の量のそれぞれのＢＭＰをラットの異なる部位に１０日間移植することによ り、ＢＭＰ−２／６のインビボ活性をＢＭＰ−２のそれと比較した。この実験結 果（表Ｂ１図１３）により、ＢＭＰ−２／７同様ＢＭＰ−２／６もＢＭＰ−２に と比べてインビボ活性が上昇したことが示される。ＢＭＰ−２／７、ＢＭＰ−６ およびＢＭＰ−２／６の比活性を、蛋白をラットの異なる部位に１ｏ日間移植し た後比較する。これらの実験結果を表Ｃおよび図１４に示す。ＢＭＰ−２／６は 、ＢＭＰ−２／６またはＢＭＰ−６よりも、強力な骨形成誘導剤である。ＢＭＰ −２／６で観察された骨形成は、等量のＢＭＰ−２／７で観察された結果と比肩 しうる。ＢＭＰ−２／６移植物の外観は、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−２／７含有 移植物の外観と全く同じである。

表Ｂ ラットの異なる部位でのアッセイにおけるＢＭＰ−２／６およびＢＭＰ−２移植 物の組織学的スコア（１０日間移植） ５．０　Ｃ２２２１２２ Ｂ　２３３　２２２ ２５、ＯＣ１１１２２１ 表Ｃ ラットの異なる部位でのアッセイにおけるＢＭＰ−２、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ −２／６移植物の組織学的スコア（１０日間移植）１、ＯＣ−士±　２１１　１ １１ Ｂ　−士±　１±±　３３２ ５．０　Ｃ２２１３１３士±Ｉ Ｂ　１１１　２±１　４５４ ２５゜ＯＣ士士士　士士士　士士士 Ｂ　５４５　４４５　４５３ 欧州特許出願第４３３．２５５号の記載をわずかに改変した方法により、生物学 的に活性のあるホモダイマー形態のＢＭＰ−２をイー・コリ中で発現させた。

上記欧州特許出願中に開示されている他の方法を用いて本発明ヘテロダイマーを イー・コリから生産させてもよい。本発明ヘテロダイマーにこれらの方法を適用 することは、イー・コリから活性ＢＭＰヘテロダイマー蛋白を生産させることを ＢＭＰ−遺伝子の成熟部分（配列番号　１４）および以下に詳述する他の配列を 含んでいる発現プラスミドｐＡＬＢＰ−７８１（図７）（配列番号　１３）を構 築した。下記のごとく、このプラスミドにより、イー・コリ宿主株ＧＩ７２４に おいてＢＭＰ−２が全蛋白の５〜１０にまで蓄積した。

プラスミドｐＡＬＢＰ−７８１は以下の基本的特徴を有する。ヌクレオチド１〜 ２０６０は、宿主イー・コリにおいて抗生物質アンピシリン耐性を付与するβ− ラクタマーゼ遺伝子を含むｐＵＣ−１８由来の配列、およびｃｏｌＥ１由来の複 製開始点を含んでいる。ヌクレオチド２０６１〜２２２１は、３つのオペレータ ー配列ＯＬ１、ＯＬ２および○Ｌ３を有するバクテリオファージλの主要なレフ トワードプロモーター（ｌｅｆｔｗａｒｄ　ｐｒｏｍｏｔｏｒ）　（ｐＬ　）の ＤＮＡ配列［サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、ジャーナル・オフ・モレキュラー・ バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）第１６２巻＝７２９〜７７３頁 （１９８２年）］を含んでいる。オペレーターはλＣ１リプレッサー蛋白の結合 部位であり、その細胞内レベルはｐＬによる転写開始量を制御している。ヌクレ オチド２２２２〜２７２３は、サンガーら、ジャーナル・オフ・モレキュラー・ バイオロジー第１６２巻＝７２９〜７７３頁（１９８２年）記載のバクテリオフ ァージλ由来のヌクレオチド３５５６６ないし３５４７２および３８１３７ない し３８３６１に由来する配列上に含まれる強力なりボゾーム結合配列を含んでい る。ヌクレオチド２７２４〜３１３３は、さらに６２ヌクレオチドからなる３° −非翻訳配列を伴った成熟ＢＭＰ−２をコードしているＤＮＡ配列を含んでいる 。

ヌクレオチド３１３４〜３１４９は、制限エンドヌクレアーゼ部位を有する「リ ンカ−Ｊ　ＤＮＡを提供する。ヌクレオチド３１５０〜３２１８は、イー・コリ ａｓｐＡ遺伝子の転写終結配列［タカギ（Ｔａｋａｇｉ）ら、ヌクレイツク・ア シッズ・リサーチ第１３巻＋２０６３〜２０７４頁（１９８５年）］に基づく転 写終結配列を提供する。ヌクレオチド３２１９〜３６２３はｐＵＣ−１８由来の ＤＮＡ配列である。

後記するように、イー・コリ宿主株を適当な条件下で培養した場合、ｐＡＬＢＰ ２−７８１により高レベル（全細胞蛋白の約１０％）のＢＭＰ−２蛋白が生産さ れうる。

ダゲルト（Ｄａｇｅｒｔ）およびエールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）　、ジーン（ Ｇｅｎｅ）第６巻２３頁（１９７９年）の方法により、ｐＡＬＢＰ２−７８１を イー・コリ宿主株Ｇ１７２４　（Ｆ、　１ａｃｅａ、　１ａｃＰ”、ａｍｐｃ： ・１ｃＩＤ中に形質転換した。［形質転換されない宿主株イー・コリＧＩ７２４ を、適用可能な法律および規則に従い、特許目的のだめに受託番号ＡＴＣＣ５５ １５１の下、１９９１年１月３１日に、メリーランド州ロックビルのバークロー ンドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託 した］形質転換株を、０，５％（Ｗ／Ｖ）グルコース、０．２％（Ｗ／Ｖ）カザ ミノ酸および１００μｇ／ｍ１アンピシリンを補足したＭ９培地［ミラー（Ｍｉ ｌｌｅｒ）　、　ｒエクスペリメンツ・イン・モレキュラ一番ジェネティクス（ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｊ、ｃｓ）　 Ｊ　、ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９７ ２年）コからなる１゜５％（Ｗ／Ｖ）寒天プレート上で選択した。ＧＩ７２４は 、ａｍｐＣの位置の染色体中に安定に組み込まれた野生型λｃＩリプレッサー遺 伝子のコピーを含んでいる。この位置で該遺伝子はサルモネラ・ティフィムリウ ム（Ｓａｌｍｏｎａｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のｔｒｐプロモータ／オペ レーター配列の支配を受ける。ＧＩ７２４において、λｃｌ蛋白は、トリブトフ ァン不含培地中（最少培地または上記ＩＭＣのごときカザミノ酸を補足した最少 培地）で増殖している間のみ生産される。ＧＩ７２４の培地へのトリプトファン 添加により±ｒｐプロモーターを抑制し、λｃ１合成のスイッチを切り、徐々に ｐＬプロモーター（細胞中に存在するならば）からの転写誘導を引き起こす。

ｐＡＬＢＰ２−７８１で形質転換されたＧＩ７２４を、Ａｓ５ｏ　（５５０ｎｍ における吸光度）がＯ１５になるまでＩＭＣ培地中で３７℃で増殖させる。トリ プトファンを最終濃度１００μｇ／ｍｌになるよう添加し、さらに４時間培養し た。

この期間中、ＢＭＰ−２蛋白が、細胞の全蛋白の約１０％になるまで蓄積し、す べて「封入体」画分となる。

ＢＭＰ−を以下のごと（不溶性モノマー形態として回収する。細胞破壊および回 収を４℃で行う。約９ｇの培養済み湿イー・コリＧＩ　７２４／ｐＡＬＢＰ２− ７８１細胞を３０ｍ１の０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、ｐＨ８，３（破壊用 緩衝液）に懸濁する。細胞を、細胞破壊器に４回通し、破壊用緩衝液で体積を１ ００ｍ１にする。懸濁物を２０分遠心分離（１５０００ｘ　ｇ）する。得られた ペレットを、ＩＭＮａＣＩ含有破壊用緩衝液（５０ｍｌ）に懸濁し、上記のごと く１０分間遠心分離する。ペレットを、１％　Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎ　Ｘ−１００（ ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社製）含有破壊用緩衝液（５０ｍｌ）に懸濁し、再度 上記のごとく遠心分離する。ついで洗浄したペレットを、２５ｍ１の２ＱｍＭ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、１％　ＤＴＴ、ｐＨ ８，３に懸濁し、ガラス製ホモジナイザーでホモジナイズする。得られた懸濁液 に、不溶型の粗モノマーＢＭＰ−２が含まれている。

上記のごとく得た１０ｍ１の該ＢＭＰ−２懸濁液を、１０％酢酸で酸性にしてｐ Ｈ２，５とし、エッペンドルフ遠心管に入れ室温で１０分間遠心分離する。上清 をクロマトグラフィーに付した。１％酢酢酸上セファクリルＳ−１００ＨＲカラ ムファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）クロマトグラフィーを行った（流 速１．４ｍｌ／分）。モノマーＢＭＰ−２含有フラクションをプールする。これ を用いて生物学的活性のあるホモダイマーＢＭＰ−２を得る。

上記可溶化および精製により得られたモノマーＢＭＰ−２から、生物学的活性の あるホモダイマーＢＭＰ−２を下記のようにして得ることができる。

０．１．０．５または２．５ｒｎｇのＢＭＰ−２をそれぞれ２０．１００または ５００　ｕ　ｇ／ｍ　］となるよう、５５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８， ０、ＩＭ　Ｎａｃｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭ還元型グルタチオン、１ｍＭ酸 化型グルタチオンおよび３３ｍＭ　ＣＨＡＰＳ　［カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏ ｃｈｅｍ）社製］に溶解する。４℃または２３℃で４日おいた後、該混合物を０ １％ＴＦＡで５〜１０倍に希釈する。透析した該混合物をビダックＣ４２１４Ｔ Ｐ５４カラム（２５ＸＯ，４６Ｃｍ）［米国のザ・ネスト・グループ（Ｔｈｅ　 Ｎｅ５ｔ　Ｇｒｏｕｐ）社製］上の逆相ＨＰＬＣ（流速１ｍｌ／分）に付すこと により、生物学的に活性のあるＢＭＰ−２の精製を行う。緩衝液Ａは０．１％Ｔ ＦＡである。緩衝液Ｂは９０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡである。直 線的グラジェントは、０から５分で緩衝液Ｂ２０％、５から１０で緩衝液Ｂ２０ から３０％、１０から４０分で緩衝液Ｂ３０から６０％：４０から５０分で緩衝 液Ｂ６０から１００％とした。ホモダイマーＢＭＰ−２をＨＰＬＣカラムから溶 出し、集める。

ＨＰＬＣフラクションをコン乾燥し、試料用緩衝液（１，５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ、ｐＨ８，４５，１２％グリセロール、４％　ＳＤＳ、０．００７５％５ｅｒ ｖａ　Ｂｌｕｅ　Ｇ、０．００２５％フェノールレッド、１００ｍＭジチオスレ イトール添加または無添加）に再溶解し、９５℃で５分間加熱する。泳動用緩衝 液は、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１００ｍＭトリシン（１６％トリシンゲル）［ノ ペックス（Ｎｏｖｅｘ）社製］、０．１％　ＳＤＳ　（ｐＨ８，３）である。該 ５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、１２５ボルトで２．５時間通電する。ゲルを、２００ ｍ１の０５％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０，２５％イソプロパツー ル、１０％酢酸中、６０℃に加熱して１時間染色する。ついで、ゲルを、１０％ 酢酸、１０％イソプロパツールでバックグラウンドが透明になるまで脱色する。

還元型物質は約１３ｋＤのところまで泳動した。非還元型物質は約３０ｋＤまで 泳動した。このことはＢＭＰ−２ダイマーであることを示す。この物質は、後の Ｗ２０アッセイ（実施例６）において活性を示した。

Ｂ、ＢＭＰ−７発現ベクター ＢＭＰ−７を高レベル発現させるためにプラスミドｐＡＬＢＰ７−９８１を構築 した。ｐＡＬＢＭＰ７−９８１は、２つの例外を除いてはｐＡＬＢＭＰ２−７８ １と同じである。ＢＭＰ−２遺伝子（ｐＡＬＢＰ２−７８１の２７２４〜３１３ ３番目の残基）がＢＭＰ−７成熟蛋白の遺伝子で置き換えられており、成熟ＢＭ Ｐ−７蛋白配列・ ＴＣＣＴＣＣＧＡＧＡ　ＡＴＴＣＡＧＡＣＣＣｍＧＧＧＧＣＣＡ　ＡＧｍＴＴＣ ＴＧ　ＧＡＴＣＣＴの初めの７個の残基をコードしている配列が除去されており 、ｐＡＬＢＰ２−７８１の２７０７および２７２３番目の残基間に見られるリボ ゾーム結合部位が別のりボゾーム結合部位（Ｔ７フアージの遺伝子１０に先行す る配列５°−ＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴ−３’に基づく）に置き換 えられている。ＢＭＰ−７生産に用いた宿主株および増殖条件はＢＭＰ−２に関 して記載したものと同じであった。

Ｃ，ＢＭＰ−３発現ベクター ＢＭＰ−３を高レベル発現させるためにプラスミドｐＡＬＢ７−７８２を構築し た。このプラスミドは、ＢＭＰ−２遺伝子（ｐＡＬＢＰ２−７８１の２７２４〜 ３１３３番目の残基）が成熟ＢＭＰ−３の形態をコードしている遺伝子に置き換 えられていること以外は、プラスミドｐＡＬＢＰ２−７８１と同じである。この ＢＭＰ−３遺伝子の配列は： ＡＧＡＡＣｒＣＡＴＴＴＧＡＡＴＧＣＴｒＡＡＴＴＣＡＡＴである。

ＢＭＰ−３の生産に用いた宿主株および増殖条件は、ＢＭＰ−２に関して記載し たものと同じであった。

Ｄ　イー・コリにおけるＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーの発現前記のごとく、酸 性化およびゲル濾過により、精製した変性ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７モノマー をイー・コリ封入体ペレットから単離した。１２５μｇの各ＢＭＰ　（１％酢酸 中）を混合し、急速真空乾燥した。得られた物質を、２．５ｍ１の５０ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ、１．ＯＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、３３ｍＭＣＨＡＰＳ、２ｍＭ グルタチオン（還元型）、１ｍＭグルタチオン（酸化型）。

ｐＨ８，０に再懸濁した。この試料を２３℃で１週間インキュベーションした。

ＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーを、ビグツク０４カラム（２５ｘＯ，４６ｃｍ） 上のＨＰＬＣにより単離した。該試料を微量遠心機で５分間遠心分離し、上清を ２２．５ｍｌの０．１％ＴＦＡで希釈した。

Ａ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ Ｂ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、９５％アセトニトリル１．０ｍｌ／分 ０〜５分　２０％Ｂ ５〜１０分　２０〜３０％Ｂ １０〜９０分　３０〜５０％Ｂ ９０〜１００分　５０〜１００％Ｂ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると、ＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーは約２３分で溶 出した。

図１０は、イー・コリＢＭＰ−２およびＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーのＷ２０ 活性を比較したもので、ヘテロダイマーのほうが活性が高いことを示す。

ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−３モノマーを以下のようしして得た：１．Ｏｇの凍結 した収穫細胞（ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−３を発現する）に、３．３ｍｌの１０ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，３を添加した。細胞を激しく ポルテックスすることにより再懸濁した。３３μｍのイソプロパツール中１００ ｍＭ　ＰＭＳＦを添加し、細胞を、フレンチプレスに１回かけることにより溶解 させた。溶解物を微量遠心機にて４℃で２０分遠心分離しこ。上清を捨てた。封 入体ペレットを８，０Ｍグアニジン塩酸塩、０．２５Ｍ　ＤＴＴ、０．５Ｍ　Ｔ ｒｉｓ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，５中に取り、３７℃で１時間暖めた。

還元され変性したＢＭＰモノマーを、以下のようにしてスベルコ（Ｓｕｐｅｌｃ ｏ）Ｃ４ガードカラム上のＨＰＬＣにより単離した。

Ａ緩衝液：０．１％ＴＦＡ Ｂ緩衝液＝０．１％ＴＦＡ、９５％アセトニトリル１．０ｍｌ／分 ０〜５分　１％Ｂ ５〜４０分　１〜７０％Ｂ ４０〜４５分　７０〜１００％Ｂ モノマーＢＭＰは２８〜３０分で溶出した。Ａ２８０および適当な吸光係数によ り蛋白濃度を測定した。

１０ＭｇのＢＭＰ−２およびＢＭＰ−３を合一し、急速真空乾燥した。これに５ ０ｕ１の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１．０Ｍ　ＮａＣ］、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、３３ｍ Ｍ　ＣＨＡＰＳ、２ｍＭ還元型グルタチオン、１ｍＭ酸化型グルタチオン、ｐＨ ８，５を添加した。得られた試料を２３℃で３日間インキュベーションした。

該試料を、１６％トリシンゲル上の５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（還元または非還元条件 下）により分析した。ＢＭＰ−２／３ヘテロダイマーは非還元条件下で約３５ｋ Ｄの位置まで移動し、還元条件下では、ＢＭＰ−２モノマーは１３ｋＤまで、Ｂ ＭＰ−３は２１ｋＤまで移動した。

イー・コリにおいて生産されたＢＭＰ−２／３ヘテロダイマーを、インビボ活性 について試験する。１０日間にわたり、２０Ｍｇを用いてＢＭＰ−２／３とＢＭ Ｐ−２のインビボ活性を比較する。ＢＭＰ−２／３移植物は軟骨または骨形成活 性を示さなかったが、対象のＢＭＰ−２移植物は、予想どおりの量の骨および軟 骨形成を示した。ＢＭＰ−２／３に関して得られたインビボでのデーターは、Ｗ −２０アツセイにより得られたインビトロでのデータと矛盾しない。

指示細胞系としてのＷ−２０骨髄基質細胞の使用は、ＢＭＰ−２で処理した後、 これらの細胞が骨芽細胞様細胞へ転換することに基づ（［アール・ニス・シース （Ｒ，Ｓ、Ｔｈ１ｅｓ）ら、「ボーン・モルホジェネティック・プロティン・オ ルターズ・Ｗ−２０・ストロマル・セル・ディファレンシエーシコン・イン・ビ トロ（Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｌｔｅｒｓ 　Ｗ−２０ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ狽奄盾■ ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）　Ｊ　、ジャーナル・オフ・ボーン・アンド・ミネラル・リ サーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｏｎｅ　ａｎｄ　Ｍｉｎｅｒａｌ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ）第５巻（２）：３０５頁（１９９０年）；およびアール・ニス・シー スら、「リコンビナント・ヒユーマン・ボーン・モルホジェニック・プロティン 　２　インデューシズ・オステオプラスティック・ディファレンシエーシコン・ イン・Ｗ−２０−１７・ストローマル・セルズ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕ ｍａｎ　Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　２　Ｉｎｄ ｕｃｅｓ　０ｓｔｅｏｂｌ≠唐狽奄■ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｗ−２０−１７Ｓｔｒｏｍａｌ　Ｃｅ １ｌｓ）　Ｊ　、エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）印刷中（ １９９２年）］。詳細には、Ｗ−２０細胞は、ディー・ナタン（Ｄ、　Ｎａｔｈ ａｎ）博士（マサチューセッツ州ボストンのチルドレンズ・ホスピタル（Ｃｈｉ ｌｄｒｅｎ’ｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ）　）の研究室の研究者により成長したマウ スから誘導された骨髄基質細胞系クローンである。Ｗ−２０細胞のＢＭＰ−２処 理により、（１）アルカリホスファターゼ生産が増大する、（２）ＰＴＨ刺激に よるｃＡＭＰの誘導、および（３）該細胞によるオステオカルシン合成の誘導が 起こる。（１）および（２）は骨芽細胞の表現形に関連するが、オステオカルシ ン合成能は、成熟骨芽細胞によってのみ示される表現形の特徴である。さらに、 現在に至るまで、ＢＭＰでの処理によってのみＷ−２０基質細胞の骨芽細胞様細 胞への転換が観察された。この方法において、ＢＭＰ−処理されたＷ−２０細胞 によるインビトロ活性は、ＢＭＰ−について知られているインビボ骨形成活性と 相関を有している。

新規骨誘導性分子のＢＭＰ活性の比較に有用な２種のインビトロでのアッセイを 以下に記載する。

Ｂ、Ｗ−２０アルカリホスフアターゼのアッセイプロトコールＷ−２０細胞を、 ウェルあたり１００００個（培地２００μｍ）の密度で９６ウ工ル組織培養用プ レートに撒く。培地は１０％０％熱失活ラン血清、２ｍＭグルタミンおよび１０ ０Ｕ／ｍｌ＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有ＤＭＥである。９５％空 気、５％ＣＯＺ中、３７℃のインキュベーター中に細胞を一装置いて付着させる 。

各ウェルから２００μｍの培地をマルチチャンネルピペッタ−で除去し、１゜に 熱失活ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイ シンを含有する同体積のＤＭＥ中の試験試料で置換する。試験物質を３系で分析 する。

試験試料および標準物質を、Ｗ−２０指示細胞とともに２４時間インキュベーシ ョンする。２４時間後、プレーを３７℃のインキュベーターから出し、細胞から 試験培地を除去する。

Ｗ−２０細胞層を、ウェル当たり２００μｍのカルシウム／マグネシウム不含リ ン酸緩衝化生理食塩水で３回洗浄し、これらの洗液を捨てる。

ガラス容器で蒸留した５０μｍの水を各ウェルに添加し、ついで該アッセイプレ ートをドライアイス／エタノール浴で急速冷凍する。冷凍したらすぐにアッセイ プレートをドライアイス／エタノール浴から除去し、３７℃で融解する。このス テップを２回以上繰り返し、合計３回の凍結−融解工程を行う。この工程が終了 したならば、膜結合アルカリホスファターゼを測定に用いる。

５０μｌのアッセイ混合物（５０ｍＭグリシン、０，０５％　ＴｒｉｔｏｎＸ− １００，４ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５ｍＭｐ−ニトロフェノールホスフェート。

ｐＨ＝１０．３）を各アッセイウェルに添加し、ついで該アッセイプレートを、 １分間に６０回振盪する水浴中、３７℃で３０分インキュベーションする。

３０分間のインキュベーションが終了したとき、１００μｍの０．２ＮＮａＯＨ を各ウェルに添加して反応停止し、該アッセイプレートを氷上に置く。

各ウェルの分光学的吸光度を４０５ナノメーターにおいて読む。ついで、これら の値を既知標準と比較して各試料のアルカリホスファターゼ活性を評価する。

例えば、既知量のｐ−ニトロフェノールホスフェートを用いて吸光度値を得る。

これを表１に示す。

表Ｉ ｐ−二トロフェノールホスフエート既知試料の吸光度値ｏ、ｏｏｏ　。

Ｏ，００６０，２６１±０．０２４ ０、０１２　０．５２１±０．０３１ ０．０１８　０．７９７±０．０６３ ０、０２４　１．０７４±０．０６１ 既知量のＢＭＰ−２についての吸光度値を決定し、表ＩＩに示すように、単位時 間当たり開裂されたｐＨ−二トロフェノールホスフエートのμモル数に換算でき る。

表ＩＩ ＢＭＰ−２処理したＷ−２０細胞のアルカリホスファターゼ値ＢＭＰ−２濃度　 ４０５ナノメーターの　１時間あたりの１．５６　０．６９６　０．０２６ ３．１２　０．７６５　０．０２９ ６．２５　０．９２３　０．０３６ １２．５０　１．１２１　０．０４４ ２５．０　１．４５７　０．０５８ ５０、０　１．６６２　０．０６７ ついで、これらの値を用いて、既知量のＢＭＰ−へテロダイマーとＢＭＰ−２ホ モダイマーの活性を比較する。

Ｃ，オステオカルシンＲＩＡプロトコールＷ−２０細胞を、２４ウ工ル組織培養 ディツシュにウェルあたり１０６個撒く（ウェルあたり１０％熱失活ウシつ児血 清、２ｍＭグルタミンを含有する２ｍｌのＤＭＥ中）。９５％空気、５％Ｃ０２ の下、３７℃で一晩細胞を付着させる。

翌日、培地を１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび試験物質を含有する ＤＭＥ　（総体積２ｍ１）に交換する。試験物質をそれぞれ３系のウェルに入れ る。試験物質をＷ−２０細胞とともに合計９６時間培養する（４８時間で同じ培 地と交換）。

９６時間後、５０μｍの試験培地を各ウェルから除去し、マウス・オステオカル シンに関するラジオイムノアッセイを用いてオステオカルシン生成をアッセイす る。アッセイの詳細は、マサチューセッツ州０２０７２スタウトンのペイシスト リート３７８　（３７８Ｐａｇｅ　５ｔｒｅｅｔ、　Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、　Ｍ ＾０２０７２）のバイオメディカル・チクノロシーズ・インク（Ｂｉｏｍｅｄｉ ｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、　）により製造されているキット において述べられている。アッセイ用試薬は、製品番号ＢＴ−４３１（マウス・ オステオカルシン標準物質）　、ＢＴ−４３２（ヤギ・抗マウス・オステオカル シン）、ＢＴ−４３２Ｒ（ヨウ素化マウス・オステオカルシン）　、ＢＴ−４１ ５（正常ヤギ・血清）およびＢＴ−４１４（ロバ・抗ヤギ・ＩｇＧ）である。

ＢＭＰ処理に応答してＷ−２０細胞により合成されたオステオカルシンについて のＲＩＡを、製造者により示されたプロトコール中に記載のごとく行う。

試験化合物について得られた値を、マウス・オステオカルシンの既知標準につい ての値、およびＢＭＰ−２の既知量に応答してＷ−２０細胞により生成されたオ ステオカルシン量と比較する。ＢＭＰ−２により誘導されたＷ−２０細胞による オステオカルシン合成に関する値を表ＩＩＩに示す。

表ＩＩＩ Ｗ−２０細胞によるオステオカルシン合成２５０　８．２ ５００　９・４ １０００　１０．０ 割Ｖ主ゴ≧竺ビ億杢ヒス」ゲ土−ｊ工」坪す妙旦暁堕翌断Ｒｅｄｄｉ　ａｓｓｅ ｙ） サンバスおよびレディ、プロシーディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミ−・ オフ・サイエンシズ・ニーニスエイ、第８０巻：　６９５１〜６５９５頁（１９ ８３年）記載のラット・骨形成アッセイを用いて、ＢＭＰ蛋白の骨および／また １ま軟骨活性を評価する。この改変法を本明細書ではローゼン改変すムノくスー レディアッセイと呼ぶ。サムパス−レディ法のエタノール沈澱ステ・ツブを、分 析すべきフラクションを水に対して透析（組成物が溶液の場合）または限外濾過 （組成物が懸濁液の場合）することに置き換える。ついで溶液または懸濁液を０ ．１％ＴＦＡに溶解し、得られた溶液を２０ｍｇのう・ノド・マド１ルツクスに 添加する。蛋白処理しない模擬ラット・マトリックスは対照として役立つ。この 物質を凍結し、凍結乾燥し、得られた粉末を＃５ゼラチンカプセル中に封入する 。カプセルを２１〜４９日齢のオスのロング・エバンズ（Ｌｏｎｇ　Ｅｖａｎｓ ）　・う・ソトの腹胸部１こ移植する。７〜１４日後に移植物を取り出す。各移 植物の半分をアルカリホスファターゼ分析［エイ・エイチ・レディ（Ａ、　Ｈ， Ｒｅｄｄｉ）ら、プロシーディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・ サイエンシズ・ニーニスエイ第６９巻＝１０６１頁（１９７２年）］に用いる。

移植物のもう半分を固定し、組織学的分析用に処理する。１μｍｇのグリコール メタクリレート切片をフォノ・コッサ（Ｖｏｎ４ｏｓｓａ）および酸ツクシン染 色して、各移植物に存在する誘導された骨および軟骨形成量を評価する。＋１か ら＋５は、新たな骨および／または軟骨細胞およびマトリックスにより占められ た移植物の各組織学的切片の面積を表す。＋５のスコアは、移植物の５０％以上 が、移植物中の蛋白の直接的な結果として生成した新たな骨および／または軟骨 であることを示す。＋４、＋３、＋２および＋１のスコアは、それぞれ移植物の ４０％、３０％、２０％および１０％以上が新たな軟骨および／または骨を含ん でいることを示す。

本発明のヘテロダイマーＢＭＰ蛋白をこのアッセイに関して評価してもよい。

本発明の実施に際しての多くの改変および変法が当業者により行われるであろう 。かかる改変および変法は以下の請求の範囲の包含される。

配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：イスラエル、ディピッド（Ｉｓｒａｅｌ、　Ｄａｖｉｄ）ウォル フマン、ニール・エム（Ｉｏｌｆｍａｎ、　Ｎ１ｅｌ　Ｍ、　）（ｉ　ｉ）発明 の名称二組み換え型骨形態形成蛋白へテロダイマー、組成物および使用法 （ｉｉｉ）配列の数＝３０ （ｉｖ）連絡先。

（Ａ）名称：ジエネティクス・インスティチュートインク（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　 Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｉｎｃ） （Ｂ）通り名：リーガル・アフェアーズ（Ｌｅｇａｌ　Ａｆｆａｉｒｓ）−ケン ブリッジパーク・ドライブ（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＰａｒｋ　Ｄｒｉｖｅ）　８７ 番地（Ｃ）都市名：ケンブリッジ（ＣａＩＩｌｂｒｉｄｇｅ）（Ｄ）州名：マサ チューセッツ州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号＋　０２１４０−２３８７（Ｖ）コンピューター・リーダプル・ フオーム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｒｅａｄａｂｌｅ　Ｆｏｒｍ）　：（Ａ）媒体形 態：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティングンステ ム　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース （ＰａｔｅｎｔＩｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ）＃　１．０゜（Ａ）出願番号　ＵＳ （Ｂ）受理口。

（Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報 （Ａ）氏名：カピノス、エレン・ノエイ（Ｃａｐｉｎｏｓ、　Ｅｌｌｅｎ　Ｊ、 　）（Ｂ）登録番号：３２，２４５ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＩ　５１９２Ｂ（ｉｘ）テレコミュニケー ションの情報：（Ａ）電話番号＋　（６１７）８７６−１１７０（Ｂ）ファック ス番号：　（６１７）８７６−５８５１（２）配列番号＝１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１６０７塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数、二本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：３５６．．１５４３ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： （２）配列番号、２に関する情報： （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ：３９６アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類・蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号、２： Ｍｅセ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｑ　ＣＹ！ｌ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ 　Ａｌａ　Ｌ＠ｕ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｖａ■ ｌ　５　１０　１５ しａｕ　１．ｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｈａ　入１ａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ 　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇａｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｙ■ Ｐｈｅ　Ａｌａ　入１ａ　Ａｌａ　ｓｅｒ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　 Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕコ５　４０　４５ Ｖａｎ　ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　 Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｍａｔ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｌ＠ｕ　Ｌｙｓｓ　ｏ　５５　６０ Ｃ，ｌｎ　Ａｒｑ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｌａ 　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｌｅ■ ６５　７０　７５　Ｂｏ ＡＳＰ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｒｑ　Ａｒｇ　Ｈｉｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ＡｓｐＨｌｓ　１（ｉｓ　 にｌｕ　Ｇｌｕ　５＠ｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　 Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｈ■ １１ｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｐｈ＠Ａ ｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　ＡｌａＬｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓ ｎ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈｉ　Ｈｌｓ　Ｈｌｓ　Ａｒｇｒｌｅ　Ａｓｎ 工ｌａ　Ｔｙｒ　Ｇ、ｌｕ　工１ａユ６５　１７０　１７５ Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　 Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　ＧｉｎＡｒｇ　Ｐ：　ｋｒ ｑ　Ｌｉｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　：：：　ＣｙＳ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｈｌｓ　富 Ｌ４ｕ　Ｔｙｒ　ＶａｌＡｓｐＰｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｔｒ ｐ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ工１＠Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　 Ｔｙｒコ０５　３１０　３１５　コ２゜ Ｚｌａ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　 Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ｖａｘ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｉ、”ｌｌｓ　`ｓｎ コア０　３７５　３８０ Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　 Ｇａｙ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ３８５　コ９ｏ　コ９５ （２）配列番号二３に関する情報＝ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１９５４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：４０３．．１６２６ （ｘｉ）配列の記載：配列番号、３： ＴＡＴ　ＧＡＴ　入ＡＧ　ＧＴＧ　ＧＴＡ　ＣＴＧ　入入Ａ　ＡＡＴ　ＴＡＴ　 ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＧＴＡ　ＧＴＡ　ＧＡＧ　ＧＧ入@１６１４ Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　 Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｍａｔ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ａｘｙ（２）配列番号・４ に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４０８アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー；直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号、４゜ Ｍｅｔ　ｒｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｍａｔ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　 Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＬＲｕ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｖａｌｌ　５　１０　１ｓ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｓａｒ　 Ｉａｕ工ｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ２０　２５　コ０ Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ｖａｌ　八ｌａ　Ｇｌｕ　工１ｅ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　 Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙコ５　４０　４５ Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　八ｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　 Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　工１ａ　Ｐｒ。

Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　 Ｇｉｎ　Ｓｅｔ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＢ５　９０　９５ Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　工ｌ＠　Ｈｌｓ　５ｔａｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ 　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　ｃｌｕ　Ａｒｇ　ｐｒｏ　Ａｌａ　５ａ■ （２）配列番号＝５に関する情報； （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１４４８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：９７．．１３８９ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５： （２）配列番号＝６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４３１アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号二〇二 Ｐｒｏ　）ｌｉｓ　Ａｒｑ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ 　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　ＰｒB Ｂ＠ｒ　Ｌｙｍ　ＸＬ＠Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔ ｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｈｉ　Ａｒｇ工１ｅ’ｒｙｒ　ＬＹＩＩ　Ａ ｌ１ｐ　Ｔｙｒ　工ｌ＠　Ａｌ”ｑ　Ｇｌｕ　入ｒｇ　Ｐｈｅ　＾ｓｓｐ　Ａｇ ｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｒ■@工１ａ ｌＢ０　１８５　１９０ Ｓ＠ｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｈｌｓ　 Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　ＩａｕＰｈ＠Ｌ＠ｕ　Ｌａ ｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｒｑ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｓａｒ　Ｇｌ ｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　ＬａｕＶａｌ　Ｐｈ＠Ａｓｐ工１ｍ　Ｔｈ’ｒ　 Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｈｌｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　 Ｐｒｏ　Ａｒｇ２２５　２コｏ　２コ５　２４゜ Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　 Ｇｌｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　５ａｒＩＩ＠Ａｓｎ　Ｐｒ ｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　ＩＩｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｈｌ ｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ＡｓｎＬｙｓ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ 　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｉ　Ｐｈ＠Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　 Ｈｉｓ　Ｐｈｅ２７５　２Ｂ０　２８５ Ａｒ９　ｓｅｒ　ｘ１＠　ｋｒｑ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　ＧＩＹ　ｓａｒ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　ＳｅｒＬｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐ ｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｍａｔ　Ａ ｌａ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ３０５　コ１０　３１５　３２０ Ａｓｎ　Ｓｓｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　 Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ３２５　コ３０　３ コ５ Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　 Ａｓｐ　Ｔｒｐ工１ｅ工ｌｅ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ＧｌｕＧｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｌａ 　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　ＧＡＹ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ａｌａ 　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｓｎコ５５　コロ０　コロ５ Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｍ＠ｔ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　 工１ｅ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓコア０　コア５　コ ８゜ Ｐｈｅ　工１ｅ　入ｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　 Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇ１ｎ３８５　３９０　： １９５　４００ （２）配列番号ニアに関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：　２９２３塩基対 （Ｂ）配列の型二核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二環状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティ カル配列：なしくｖｉ）起源： （Ａ）生物芯：ヒト （Ｆ）組織の種類：ヒト・胎盤 （ｖｉｉ）直接の起源： （Ａ）ライブラリー二ストラタジーン・カタログ＃９３６２０３ヒト・胎盤ｃＤ ＮＡライブラリー （Ｂ）クローン：ＢＭＰ６Ｃ３５ （ｖｉｉｉ）ゲノム内での位置： （Ｃ）単位＝ｂｐ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：１６０．．１７０１ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）存在位置：１２８２．． １６９８（ｊｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍＲＮＡ （Ｂ）存在位置：　１．．２９２３ （ｘｉ）配列の記載：配列番号ニア： ＣＧＡＣＣＡＴＧＡＧ　ＡＧＡＴＡＡＧＧＡＣＴＧＡＧＧＧＣＣＡＧ　ＧＭＧＧ ＧＧＡＡＧ　ＣＧＡＧＣＣＣＧＣＣＧＡＧＡＧＧＴＧＧＣ６O 、　ＧＧＧ入ＡＧＧＣＡＡ　ＴＴＴＣ入ＴＡＣＴ入　入ＡＣＴＧＡＴＴ入Ａ　入 ＴＡＡＴＡＣＡＴＴ　ＴＡＴＡＡＴＣＴＡＣ入ＡＣＴＧＴＴsにＣ２７Ｂ８ ＣＧＴＧＴＧＧＧＣＧ　ＧＧＣＧＧ　２９２ユ（２）配列番号＝８に関する情報 ： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ二５１３アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝８＝ Ｍｅ乞Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｔ ｒｐ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｔｒｐ　Ｔｒｐ　ＧｌｙＡｌａ　Ａｌａ　Ａｌ ａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　、Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌ ｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌ■ −］４０　−ココ５　−コ３０ ＧＩＹ　ｐｈｅ　Ｌｅｕ　’ｒｙｒ　ｋｒｑ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ 　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｇｌ■ −３１０−３０５−：ｌＯＯ−２９５ Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＡｒｇＬ＠ｕ　Ｌｙｓ　Ｓ ｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＭａｔ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌ＠ｕ　Ｔｙ ｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌ＠ｕ　５ｅｒＡｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ 　Ａｓ’ｐ　ＧＡＹ　八ｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＧＬｕ　Ａｒｑ　Ｇｉ ｎ　Ｇｉｎ　Ｓ＠■ −２コＯ−２２５−２２０−２１５ Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　八ｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　５ｅｒ−１９，Ｓ　−１９ ０−１８５ Ｇｌｙ　ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　 Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　ＰｈｅＬｅｕ　Ａｓｎ　Ａ ｓｐ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｔ　Ａ ｓｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＴｙｒＡｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ｉｌ ｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　八１ａ　八ｌ ａ　ｃｌｕ　Ｐｈｅ（２）配列番号　９に関する情報。

（ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２１５３塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセティカル配列；なしくｖｉ）起源： （Ａ）生物名：ヒト （Ｈ）細胞系：Ｕ２−Ｏ３骨肉腫 （ｖｉｉ）直接の起源： （Ａ）ライブラリー：Ｕ２−ＯＳヒト・骨肉腫ｃＤＮＡライブラリー（Ｂ）クロ ーン：Ｕ２−１６ （ｖ　ｉ　ｉ　ｉ）ゲノム内での位置：（Ｃ）単位＝ｂｐ （ｉｘ）配列の特徴。

（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　６９９．．２０６３（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）存在位置：１６４７．． ２０６０（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍＲＮＡ （Ｂ）存在位置：１．．２１５３ （ｘｉ）配列の記載：配列番号・９： ”ＭＴＧにＧ入λＣＴ　ＡＣＡＧＴＴＴＡＴＣＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡ　ＣＴＴＴ ＴＧＣＴＡＡ　ＴＴＣＡＡＡＴＡＣＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＡ@コロ。

ＴＴＡＴＣＡＴＡＡＡ　ＴＴＣＡＴＡＴＡＧＧ　ＡＡＴＣＣＡＴＡＧＧ　ＴＣＡ ＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＡＡＴＡＴＴ　ＡＧＣＣＧＴＣＴＴb＜２０ ＴＧＣＴＡＣＡＴＣＡ　ＡＴｃＣＡＧＣＡＡＡ　ＡＡＣＴＣＴＴＡＡＣＡＡＣＴ ｅＴＧＧＡＴ八ＡＴＴＧＧＡＡＡへ　ＣＴＧ＾ＧＴ口’ＣＡ@４８０ ＧＣＴＴＴＣＴＴｋＧ　ＡＡＡＴＡＡＣＴＡＣＴｍＡＣＡＴＡ　ＴＴＣＣＭＴＡ 　Ｔ’ｌ’？ＡＡ入入ＴＡＧ　ＧＡＣｋＧＧＡＪｖＬＡ　４S０ ＾ＴＴ　ＡＡＧ　ＡＴＴ　ＡＧＣＡＴＡ　丁入ＴＣ入入　ＡＴＣＡＴＣ入ＡＧＧ 入Ａ　ＴＡＣＡＣＡ　ＡＡＴ　ＡＧＧ　ＧＡＴ　１コＢ５１１ａ　Ｌｙｓ　Ｉｌ ａ　Ｓａｒ　ＩＬｅ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　１Ｌｔ　工Ｌ＠　Ｌｙｓ　ＧＬｕ　Ｔｙ ｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　λ５ｐＧＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＴＴＣＴＴＧ　 ＴＴＡ　ＧＡＣＡＣＡ　ＡＣＡ　入入Ｇ　ＧＣＣＣ入入　ＧＣＴ　ＴＴＡ　ＧＡ Ｔ　ＧＴＧ　１４F１１ Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｐｈａ　Ｌｅｕ　Ｌ４ｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　 Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　入１ａ　Ｌ４ｕ　入ｓｐ　ＶａｌＧＧＴ　ＴＧＧ　Ｃ ＴＴ　ＧＴＣＴＴＴ　ＧＡＴ　ＡＴＣＡＣＴ　ＧＴＧ　ＡＣＣＡＧＣＡＡＴ　Ｃ ＡＴ　丁ＧＧ　ＧＴｅ　ＡＴＴ　１４８P Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｈａ　Ａｓｐ　工ｌａ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　 Ｔｈｒ　Ｓｉｒ　Ａｓｎ　Ｈｌｓ　丁ｒｐ　Ｖａｌ　工１ｅ人ＡＴ　ＣＣＣＣＡ Ｇ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＴＴＧ　ＧＧＣＴＴＡ　ＣＡＧ　ＣＴＣＴＧＴ　ＧＣＡ　 ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＧＧＧ　ＧＡＴ　１５Q９ 八ｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　 Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ＡｓｐＣにＣＡＡＴ　ＡＡ Ａ　ＴＣＣＡＧＣＴＣＴ　ＣＡＴ　ＣＡＧ　ＧＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＡ　ＡＴＧ 　ＴＣＣＡＧＴ　ＧＴＴ　１７２１＾ｒ９　八ｓｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　 ５ｅｒ　）ｌｉｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　’Ｂａｒ　Ｓ＠ｒ　Ａｒｇ　Ｍａｔ　Ｂａ ｒ　Ｓａｒ　Ｖ≠■ ｌｏ　１５　２０　２５ ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＴＡＣＧＣＴ　ＧＣＡ　Ｔ’ｎ　ＴＡＴ　ＴＧＴ　Ｇ Ａ’Ｉ’　ＧＧＡ　ＧＡＡ　’ｊ’ＧＴ　’１”Ｃ？　ｆｆ戟@ＣＣＡ　ＩＢ６ ５ Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈ＠　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　 Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ｃｙｓ　Ｓａｒ　Ｐｈａ　Ｐｒ。

ＧＴＴ　ＣＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＧ　ＴＴＴ　ＣＣＴ　ＧＡＣＣＡＣＧＴＡ　ＣＣ Ａ　入ＡＧ　ＣＣＴ　ＴＧＴ　ＴＧＴ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　１X６１ Ｖａｌ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｍａｔ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｈｌｓ　Ｖａｌ　 Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒ。

９０　９５　’　１００　１０５ ＣＡＣＴ入ＡＴ入ＴＴ入入ＡＴ入へＴλＴＴＧ入Ｔ　入ＡＴ入ＡＣ入入Ａ＾　へ Ｇへ丁ＣＴＧＴＡＴ　Ｔ入為ＧＧＴＴＴＡＴ　２１ＬりＨｌｓ ＧＧＣＴＧＣｋｋＴ＾ＡＡＡＡＧＣＡＴＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＡＡＡＣＡＧＡノ １八ＡＡ＾＾ノＬ＾２１５コ（２）配列番号＝１０に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４５４アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 ＣＤ）トポロジー：直鎖状 （］ｉ）配列の種類：蛋白 （Ｘｌ）配列の記載・配列番号：１０・Ｍｅｔ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａ ｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｈ ｅ　Ｌｅｕ　ＴｒｐＳｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ 　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｎ ＪＯＯ−２９５−２９０−２１６５ Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＶａｌＡｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａ ｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　ＡｌａＶａｌ　Ａｓｎ　Ｌｅ ｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒｑ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｈｉ ｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｑ　Ａｒｇ　Ｈｌｓ（２）配列番号：１１に関する情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ・１００３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、二本鎖 （Ｄ）トポロジー・環状 （ｉ　ｉ）配列の種類　ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテイ カル配列　なし（ｖ　ｉ）起源： （Ａ）生物芯、ヒト （Ｈ）組織の種類：ヒト・心臓 （ｖｉｉ）直接の起源： （Ａ）ライブラリｍ：ヒト・心臓ｃＤＮＡライブラリー・ストラタジーン・カタ ログ＃９３６２０８ （Ｂ）クローン・ｈＨ３８ （ｖ　ｉ　ｉ　ｉ）ゲノム内での位置：（Ｃ）単位・ｂｐ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置・８．．８５０ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号＋ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）存在位置：４２７．．８ ４３ （ｉ　ｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号＋ｍＲＮＡ （Ｂ）存在位置：１．．９９７ （ｘｌ）配列の記載；配列番号−１１−ＣＴＴＣＴＧＧＣＡＡ　ＴＴＣλ００３ （２）配列番号＝１２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・２８１アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類、蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号・１２：Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　Ｔｒｐ　Ｌｙ ｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｐｈｓ　Ｍｐ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ工ｌａ　 Ｐｒｏ　Ａｌａ−１コ９　−１３５　−１３０　−１２５Ｉｌｌ　Ｈｌｓ　Ｌｅ ｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｒｑ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　ＶａＩＳ＠ｒ　Ｍａｔ 　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　ＶａｌＧｉｎ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　入ｉｎ　 Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　入ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｎτｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｙ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　、Ｔｈｒ　八１■ Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　 Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　ＡｒｑＬｅｕ　Ｔｙｒ　Ｖ ａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａ ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ−４０−３５−コ０ Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　 Ｓｅｔ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｖａｉ〜２５　−２０　− １５ Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ工 １ａ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｌａ　ＶａｌＡｒｑ　Ｐｒｏ　Ｌｅ ｕ　Ａｒｇ　Ａｒｑ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｇ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　ＡＳ ｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇ１ｎＡｌａ　八ｓｎ　Ａｒｑ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ 　）ｌｉｓ　Ｇｌ■ ２５　〕０　コ５ Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　１１ｅ　八ｌａ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　入１ａ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ八ｓｎ　Ｈｉｓ　Ａ ｌａ　工１ｅ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｍ ｅｔ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｌａｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｃｙ ｓ　ＣｙｇＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ 　Ｓｅｒ　Ｖａ１Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｔ：　Ｓｅｒ　Ａｓｎ 　Ａｓｎ　ＶａＩＩＬｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ａｒｑ　Ａｓｎ（ ２）配列番号：１３に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３６２３塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数、二本鎖 （Ｄ）トポロンー：直鎖状 （百）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｖｉｉ）直接の起源： ＣＢ）クローン＋　ｐＡＬＢＰ２−７８１（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置　２７２４．．３０７１（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）存在位置＋３１５０．． ３２１８（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＲＢＳ （Ｂ）存在位置：２２２２．．２７２３（ｘｉ）配列の記載　配列番号・１３： ＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧ　ＣＣＴＣにＴＧＡＴＡ　ＣＧＣＣＴＡＴＴＴＴ　ＴＡＴ Ｍ；ＧＴＴＡＡ　ＴＧＴＣ八ＴＧへＴ八　へへ入ＡＴＧＧＴs丁　６０ ＣＴＴＡＧ八ＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴ　ＴＴＴＣＧＧＧＧＡＡ　ＡＴＧＴ ＧＣＧＣＧＧ　ＭＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴ　P２０ ＴＣＴＡＡＡＴＡＣＡ　ＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧ　ＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡ　ＴＧＡ ＧＡＣＡＡＴＡ　ＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡ　ＡＴＧＣＴＴＣＡ`Ｔ　１８０ 入Ａ丁＾ＴＴＧへ＾Ａ　入ＡＧＯＡＡＣＡＩＩ；Ｔ　ＡＴＧＡＧＴＡＴｒＣ入Ａ ＣＡＴＴｒＣＣＧ　ＴＧ丁ＣＧＣＣＣＴＴ　ＡＴＴＣＣＣＴsｒＴ　２４０ ＴＴＡＣＣＧＣＣＴＴ　ＴＧＡにＴＧＡＧＣＴ　ＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＣＣＧ ＣＡＧＣＣＧ　ＡＡＣＧＡＣＣＧＡＧ　ＣＧＣＡＧＣＧＡＧs　１９Ｂ０ ＣＧＡＴＴＣＡＴＴＡ　ＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴ　ＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＴＡＣ ＣＡＡＡＣＡ　ＡＴＧＣＣＣＣＣＣＴ　ＧＣＡＡＡＡＡＡＴ`　２１００ ＡＧＴＡＡＴＣＧＴＡ　ＣＡＧＧＧＴＡＧＴＡ　ＣＡＡＡＴＡＡＡＡＡ　ＡＧＧ ＣＡＣＧＴＣＡ　ＧＡＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴs　コ２０８ ＧＴＧＡＧＣＡＧＴＡ　ＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴ　ＴＴＴＡ ＣＡＡＣＧＴ　ＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧ　ＡＡＡＡＣＣＣＴＧf　コ２６８ ＣＣＴＴＡＣＣＣＡＡ　ＣＴＴＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＡ　ＴＣＣＣ ＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡ　Rコ２８ ＡＣＡＣ；ＧＣＣＣＧＣ八ＣＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡ　ＧＴＴ（ 、ＣＧＣＡＧＣＣＴＧ入八ＴへＧＣＧ　ＡＡＴＧＧＣＧＣＣs　１８Ｂ （２）配列番号＝１４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１５アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・直鎮状 （ｉ　ｉ）配列の種類、蛋白 （ｘｉ）配列の記載、配列番号：１４：（２）配列番号：１５に関する情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ；１４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎮の数ニー水銀 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類二ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｌ）配列の記載；配列番号：１ ５：ＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧＡＧ　１４ （２）配列番号：１６に関する情報： （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝４１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー水銀 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載：配列番号＝１６゜ ＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧ　ＧＧＴＧＴＣＧＣＴＡ　ＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣＴＡＣＡ ＧＣＡＡＡＴ　Ｔ　４１ （２）配列番号　１７に関する情報： （１）配列の特徴； （Ａ）配列の長さ：３８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数　−水銀 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類、ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載：配列番号、１７ ゜ＧＧＡＴＧＴＧＧＧＴ　ＧＣＣＧＣＴＧＡＣＴ　ＣＴＡＧＡＧＴＣＧ、ＡＣＧ ＧＡＡＴＴＣ３８ （２）配列番号・１８に関する情報 （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ：３１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１８ ：ＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴ　ＧＡＴＴＣＣＴＧＧＴＡＡＣＣＧＡＡＴＧＣＴ　３１ （２）配列番号：１９に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２５塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎮の数・−末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載：配列番号・１９ ：ＧＴＧＧＴＡＣＴＡＡ　ＧＧＡＣＣＡＴＴＧＧ　ＣＴＴＡＣ２５（２）配列番 号：２０に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎮の数ニー末鎖 （Ｄ）トポ日直鎖状直鎮状 （ｉ　ｉ）配列の種類・ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載・配列番号：２ ０・特表平マー５００９６８　（２７） ＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧ　ＣＣＡＴＧＣＡＴＣＴ　ＧＡＣＴＧＴＡ　２７（２）配 列番号＝２１に関する情報： （ｉ）配列の特徴； （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘ　ｉ）配列の記載：配列番号＝２ １＝ＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴ　ＴＴＡＡＴＡＴＴＡＧ　ＴＧＧＣＡＧＣ２７（２） 配列番号：２２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載：配列番号＝２２＝ ＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧ　ＣＣＡＣＣ１５（２）配列番号：２３に関する情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ：８１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロジー、ｉ！！鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載：配列番号、２３ ：ＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＡＧＧＧＣＧＣ ＡＧＴＧＧ　ＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴ　ｃｃＴｃｃｃｃｃｃＴ　６０ＧＴＧＣＴＧ ＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＧＣＣ８１（２）配列番号：２４に関する情報： （ｊ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さニア３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載：配列番号　２４ ：ＣＧＣＡＧＣＡＧＣＴ　ＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡ ＣＡＧＣＣＡ　ＣＴＧＣＧＣＣＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣ６０ＣＣＧＧＣＡＴ ＧＧＴ　ＧＧＧ　７３ （２）配列番号：２５に関する情報。

（１）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ・１］塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎮の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロンー：直鎮状 （１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（Ｘｌ）配列の記載・配列番号、２５゜ ＴＣＧＡＣＴＧＧＴ　Ｔ　１１ （２）配列番号：２６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｊ）配列の記載・配列番号・２６ ：ＣＧＡＡＡＣＣＡＧ　９ （２）配列番号＝２７に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡＣゲノム）（ｘ　ｉ）配列の記載：配列番号：２ ７：ＴＣＧＡＣＡＧＧＣＴ　ＣＧＣＣＴＧＣＡ　１８（２）配列番号：２８に関 する情報： （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー８直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（Ｘｌ）配列の記載：配列番号　２８： ＧＴＣＣＧＡＧＣＧＧ　１０ （２）配列番号＝２９に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２９ ；ＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＧＴＧＣＧＣＴＣＡ　１９（２） 配列番号：３０に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡＣゲノム）（Ｘｌ）配列の記載：配列番号：３０ ：ＴＣＴＧＴＣＧＡＣＣＴＣＧＧＡＧＧＡＧＣＴＡＧＴＧＧＣ２７ＦＩＧＵＲＥ ＩＡ ＦＩＧ［ＩＢ ＦＩＧＵＲＥＩＣ 入Ａ入Ａ ＦＩＧＵＲＥ２Ａ ＦＩＧＵＲＥ２Ｂ ＦＩＧＵＲＥ２Ｃ １１１０６１８１６１１１２６１１１３６１Ｊ４６　１１１５６　１８６６Ａτ ＴＣＡＣＣＴＴＧ　ＡＣＣＴｒＡＴＴＴＡ　ＴＧＡＣＴＴＴＡＣＧ　ＴＧＣ入Ａ ＡＴＧＴＴ　ＴＴＧＡＣＣＡＴＡＴ　ＴＧＡＴＣＡＴＡsＡ　ＴＴＴＴＧＡＣＡ ＡＡ ＦＩＧＵＲＥ３Ａ ＦＩＧＵＲＥ３Ｂ ＦＩＧＵＲＥ３Ｃ ＦＩＧＵＲＥ４Ａ ＦＩＧＵＲＥ　４Ｂ ＦＩＧＵＲＥ４Ｃ ＦＩＧＵＲＥ４Ｄ ＦＩＧＵＲＥ４Ｅ ＦＩＧＵＲＥ５Ａ ＦＩＧＵＲＥ５Ｂ ＦＩＧＵＲＥ５Ｃ ＦＩＧＵＲＥ５Ｄ Ｆｉｇｕｒ＠６ Ｆｉｇｕｒｅ　６　（Ｃｏｎ’ｔ） ＣＣＴＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＴＣＴＣＡＴ　ＣＴＧＧＡＴＣＧＧＧＣＣ ＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＴＡＡＡＴＧＣsＧＴＣＡＣＡＧ ＣＴＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＧＴＣＡＧＧＧＧＣＣＣＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＴＧ ＣＣ？ＡＣＴ’ｒＣＣＴＧＴＣＡＧＧＣＴ？Ｃ？ＧＧＧＡＡsＴＣ ＦＸＱ田１７ ａｅｔｏａｃｃ’ｒデＴ　チクＣ？ｅＪｅ＾デ＠　ＴデＣＴｍ圏Ｏｃａｍｘｒｃ ｃｃｃ　ＨＡ丁ｒｃデＧτ０　り＾Ｔ＾ＡｅＣＤ？Ａ　１９Q０ ｒＸＧｔｍＥ　７　（ｃｏｎｔ’ｄ） ＾１：（Ｍ？（Ｊ？ｅＡ　ＣｏりＬ＆＾（ＡＣＯＣＭｋ　コロ２コＦＩＧＴＪＲ Ｅ　８ Ｗ−２０７／ｌ、カリホスファターゼ：　ＢＭＰ−２対ＢＭＰ−２／７ＢＭＰ　 （ｎｇ／ｍｌ） ＦＩＧ［９ Ｗ−２０細胞によるＢＧＰ合成に対するＢＭＰ−２およびＢＭＰ２／７の影響 ０．０１　０．ＬＯ１，００１０，００１００，００１０００，００ＢＭＩ’　 （ｎｇ／ｍ１） ＦＩＧＩＪＲＥｌｏ イー・コリのＢＭＰ−２およびＢＭＰ−２／７の比較：Ｗ−２０−１７アルカリ ホスフアターゼ０．００１　０．０１０　（１，１００１，ＯＱＯ１０，０００ １００，０００１０００，（Ｘ）０ンｓ　度　（ｎｇ／ｍｌ） ＦＩＧＵＲＥＩＩＡ ＭＥＴ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ＩｐｕＦ’ｎｑ　 Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　’Ｌｅｓｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｆｈｅ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｓａ ｒ　シ叫Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒ■@’Ｆ’ｒｏ　Ｉｙｓ　Ｐｒ 。

ＦＩＧＵＲＥＩＩＣ Ｆｉｇｕｒｅ　１２ Ｗ−２０フルカリホスファターゼ：ＣＨＯＢＭＰ−２／６対ＣＩ−（ＯＢＭＰ− ２０，１１，０１０，０１００，０１０００，０ＦＩＧＵＲＥ１３Ａ 軟骨 ＦＩＧＵＲＥ１３Ｂ 骨 μｇ　ＢＭＰ ＦＩＧＵＲＥ１４Ａ μｇ　ＢＡｆＰ ＦＩＧＵＲＥ　１４Ｂ 骨 μｇＢＭＰ 悶協謹審輻牛 １□Ｉ＋−一＋−ρＣＴ／ＵＳ　９２７０９４３０フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９　 ＺＮＡ ／／Ａ６１Ｋ　３８１００　ＡＢＪ （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ ＣＬ　２　Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｎ　１５１０９　ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ１：９１） ８３１４−４Ｃ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　 ＡＵ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、ＫＲ，Ｎｏ、ＲＵ ＦＩ Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＢＪ （Ｃｌ２Ｎ　１５１００　ＺＮＡ　Ａ Ｃ１２Ｒ１：９１）

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．１つ目の選択ＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしている配列および２ つ目の選択ＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしている配列であって、それ ぞれ、蛋白を同時発現させることのできる適当な調節配列の支配下にある配列を 含む選択宿主細胞を培養し、該ヘテロダイマー蛋白を培養基から単離することか らなる、骨刺激活性を有するヘテロダイマー蛋白の製法。
2. ２．該１つ目のＢＭＰまたはそのフラグメントが該宿主細胞中にトランスフェク ションされる１つ目のベクター上に存在し、該２つ目のＢＭＰまたはそのフラグ メントが該宿主細胞中にトランスフェクションされる２つ目のベクター上に存在 する請求項１記載の方法。
3. ３．両方の該ＢＭＰまたはそのフラグメントが該宿主細胞の染色体中に組み込ま れる請求項１記載の方法。
4. ４．両方のＢＭＰまたはそのフラグメントが単一ベクター上に存在する請求項１ 記載の方法。
5. ５．それぞれの該ＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしている遺伝子の単一 より多いコピーが各ベクター上に存在する請求項２記載の方法。
6. ６．該宿主細胞が、２種の融合した選択された安定な宿主細胞であって、それぞ れ、宿主細胞は、各蛋白またはフラグメントを発現させることができる適当な調 節配列の支配下にある選択された１つ目あるいは２つ目のＢＭＰまたはそのフラ グメントをコードしている配列でトランスフェクションされている宿主細胞を培 養することにより調製されるハイブリッド細胞である請求項１記載の方法。
7. ７．該宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項１記載の方法。
8. ８．該宿主細胞が昆虫細胞である請求項１記載の方法。
9. ９．該宿主細胞が酵母細胞である請求項１記載の方法。
10. １０．可溶性モノマー蛋白の生成に適した条件下において、蛋白または蛋白フラ グメントを発現させることのできる適当な調節配列の支配下にある１つ目の選択 ＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしている配列を含む選択宿主細胞を培養 し；該条件下において、蛋白または蛋白フラグメントを発現させることのできる 適当な調節配列の支配下にある２つ目の選択ＢＭＰまたはそのフラグメントをコ ードしている配列を含む選択宿主細胞を培養して２つ目の可溶性モノマー蛋白を 生成させ；ついで、少なくとも１個の共有ジスルフィド結合により会合したダイ マー蛋白を生成させる条件下で該可溶性モノマー蛋白を混合し；混合物からヘテ ロダイマー蛋白を単離することからなる、骨刺激活性を有するヘテロダイマー蛋 白を細菌細胞において生産する方法。
11. １１．該宿主細胞がイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である請求項１０記載の方法。
12. １２．該条件が、該蛋白を可溶化剤で処理することからなる請求項１０記載の方 法。
13. １３．ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−８からなる群より選 択される２つ目の蛋白またはそのフラグメントに会合したＢＭＰ−２である１つ 目の蛋白またはそのフラグメントからなる骨刺激活性を有する組み換え型ヘテロ ダイマー蛋白。
14. １４．該２つ目の蛋白がＢＭＰ−５である請求項１３記載の蛋白。
15. １５．該２つ目の蛋白がＢＭＰ−６である請求項１３記載の蛋白。
16. １６．該２つ目の蛋白がＢＭＰ−７である請求項１３記載の蛋白。
17. １７．該２つ目の蛋白がＢＭＰ−８である請求項１３記載の蛋白。
18. １８．ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−８からなる群より選 択される２つ目の蛋白またはそのフラグメントに会合したＢＭＰ−４である１つ 目の蛋白またはそのフラグメントからなる骨刺激活性を有する組み換え型ヘテロ ダイマー蛋白。
19. １９．該２つ目の蛋白がＢＭＰ−５である請求項１８記載の蛋白。
20. ２０．該２つ目の蛋白がＢＭＰ−６である請求項１８記載の蛋白。
21. ２１．該２つ目の蛋白がＢＭＰ−７である請求項１８記載の蛋白。
22. ２２．該２つ目の蛋白がＢＭＰ−８である請求項１８記載の蛋白。
23. ２３．選択宿主細胞において該蛋白を同時発現させることにより生成する、２つ 目のＢＭＰ蛋白またはそのフラグメントに会合した１つ目のＢＭＰ蛋白またはそ のフラグメントからなる骨刺激活性を有する組み換え型ヘテロダイマー蛋白。
24. ２４．該１つ目のＢＭＰがＢＭＰ−２であって、該２つ目のＢＭＰがＢＭＰ−７ である請求項２３記載の蛋白。
25. ２５．適当な発現調節系であって、ＢＭＰまたはそのフラグメントを同時発現さ せ、ヘテロダイマー蛋白を生成させることができる発現調節系の支配下にある１ つ目のＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしているヌクレオチド配列、およ び適当な発現調節系であって、ＢＭＰまたはそのフラグメントを同時発現させ、 ヘテロダイマー蛋白を生成させることができる発現調節系の支配下にある２つ目 のＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしているヌクレオチド配列を含む細胞 系。
26. ２６．該１つ目および２つ目のＢＭＰ蛋白をコードしている該ヌクレオチド配列 が、単一ＤＮＡ分子中に存在する請求項２５記載の細胞系。
27. ２７．該１つ目のＢＭＰをコードしている該ヌクレオチド配列が１つ目のＤＮＡ 分子上に存在し、該２つ目のＢＭＰをコードしている該ヌクレオチド配列が２つ 目のＤＮＡ分子上に存在する請求項２５記載の細胞系。
28. ２８．該単一のＤＮＡ分子が、１つ目のＢＭＰまたはそのフラグメントをコード している遺伝子を含む１つ目の転写単位および２つ目のＢＭＰまたはそのフラグ メントをコードしている遺伝子を含む２つ目の転写単位からなる請求項２６記載 の細胞系。
29. ２９．該単一のＤＮＡ分子が、該１つ目のＢＭＰまたはフラグメントをコードし ている該遺伝子の複数のコピーおよび該２つ目のＢＭＰまたはフラグメントをコ ードしている該遺伝子の複数のコピーを含む単一の転写単位からなる請求項２６ 記載の方法。
30. ３０．１つ目の選択ＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしている配列および ２つ目の選択ＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしている配列であって、そ れぞれのＢＭＰまたはそのフラグメントを同時発現させることができる少なくと も１つの適当な調節配列の支配下にある配列からなるＤＮＡ分子。
31. ３１．１つ目のＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしている遺伝子を含む１ つ目の転写単位および２つ目のＢＭＰまたはそのフラグメントをコードしている 遺伝子を含む２つ目の転写単位からなる請求項３０記載の分子。
32. ３２．該１つ目のＢＭＰまたはフラグメントをコードしている該遺伝子の複数の コピーおよび該２つ目のＢＭＰまたはフラグメントをコードしている該遺伝子の 複数のコピーを含む単一の転写単位からなる請求項３０記載の分子。
33. ３３．該１つ目のＢＭＰがＢＭＰ−２であって、該２つ目のＢＭＰがＢＭＰ−６ である請求項２３記載の蛋白。
34. ３４．イー・コリにおいて生成される骨刺激活性を有する組み換え型ＢＭＰ−２ ホモダイマー。
35. ３５．イー・コリ宿主細胞を培養し、得られた培養基からホモダイマーＢＭＰ− ２を単離、精製することからなる、骨刺激活性を有するホモダイマーＢＭＰ−２ 蛋白の製法。
36. ３６．ＢＭＰ−２である２つ目の蛋白またはそのフラグメントに会合したＢＭＰ −２である１つ目の蛋白またはそのフラグメントからなる、骨刺激活性を有する 組み換え型ヘテロダイマー蛋白。