KR101744763B1 - Bmp 유래 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Bmp 유래 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101744763B1
KR101744763B1 KR1020140184274A KR20140184274A KR101744763B1 KR 101744763 B1 KR101744763 B1 KR 101744763B1 KR 1020140184274 A KR1020140184274 A KR 1020140184274A KR 20140184274 A KR20140184274 A KR 20140184274A KR 101744763 B1 KR101744763 B1 KR 101744763B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
present
composition
bone
polynucleotide
Prior art date
Application number
KR1020140184274A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160074959A (ko
Inventor
정용지
김은미
Original Assignee
(주)케어젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)케어젠 filed Critical (주)케어젠
Priority to KR1020140184274A priority Critical patent/KR101744763B1/ko
Priority to PCT/KR2014/012659 priority patent/WO2016098935A1/ko
Publication of KR20160074959A publication Critical patent/KR20160074959A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101744763B1 publication Critical patent/KR101744763B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/28—Bones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 골형성 촉진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 펩타이드는 골유착 및 골 형성을 촉진시킴으로써 조골세포의 분화 및 치수 조직의 증식을 증가시켜 임플란트 시술 및 구강 박테리아에 의한 염증작용 억제에 사용될 수 있으며, 섬유아세포의 성장 및 이동을 촉진시킴으로써, 피부 노화 및 상처치유에도 응용할 수 있다.

Description

BMP 유래 펩타이드 및 이의 용도{Peptide from bone matrix protein and use thereof}
본 발명은 BMP 유래 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
골조직은 끊임없이 골형성(Bone formation/Osteoblast differentiation)과 골흡수(Bone resorption/Osteoclast differentiation)이 일어나는 동적인 조직이다. 파골 세포는 뼈를 흡수하는 반면, 조골세포는 뼈 기질을 합성하고 채우는 역할을 한다. 따라서 골량은 이러한 세포의 상대적인 기능에 의존하게 된다. 정상 성인에서 골흡수 양과 골형성 양은 항상 균형이 유지되고 있다.
최근 10~20년동안, 인간의 수명 연장과 삶의 질 향상에 따라, 국내외의 임플란트 시장은 크게 성장하였고, 대중화되었다. 임플란트는 인공 치아 또는 제3의 치아로서, 치아의 결손/부식이 있는 부위나 치아를 뽑은 자리의 턱뼈에 골 이식, 골 신장술 등의 부가적인 수술을 통하여, 충분히 감쌀 수 있도록 부피를 늘린 턱뼈에 생체 적합적인 임플란트 본체를 심어서 자연치의 기능을 회복시켜주는 치과 치료 술이다. 정상적인 기능이 유지되고 있는 턱뼈와 식립이 된 임플란트 본체 표면과의 형태적, 생리적, 직접적 결합인 골유착(osteo-integration)이 이루어진 후 임플란트 주위 턱뼈의 골 개조의 과정을 거치게 된다. 이 골유착은 임플란트의 성공을 결정짓는 가장 중요한 지표라고 할 수 있다. 짧은 기간 내에 골유착이 되지 않을 경우에는, 초기 골유착의 실패로 인하여 임플란트의 시술 성공률이 떨어지게 된다. 따라서, 임플란트 식립의 성공을 위해서는, 골유착 및 골형성 능력을 증진 시키는 것이 필요하다.
임플란트의 성공율은 임플란트 식립 소재와 골세포간의 초기 골융합이 잘 되는 것에 좌우된다. 최근, 조골세포의 증식과 분화를 촉진시키는 TGF-β family에 속하는 단백질인 BMP(Bone matrix protein)과 같은 생리활성물질을 임플란트 식립 시 임플란트 표면에 직접 도포하거나 수술부위 주변에 유포시키는 방법이 사용되고 있다. BMP계열의 단백질이 조골세포의 분화와 성장에 중요한 역할을 하는 것은 널리 보고되어 있기 때문이다. BMP계열 단백질이 골 형성 및 골분화, 치조골의 형성에 중요한 기능을 하는 것이 보고된 이후, 많은 실험이 진행되었으며, 동물뿐만 아니라, 인간에서도 BMP 계열의 단백질이 골형성과 분화에 관여하여, 뼈를 재생시키고, 강화해 준다는 결과가 발표된 바 있다. 그러나, BMP는 가격이 비쌀 뿐만 아니라, 체내에 존재하는 효소 등에 의하여 빠르게 분해되어 사라지므로, 효과적인 적용이 어려운 실정이다. 시술비용이 상승하며, 효과적으로 잔류하지 못하므로 적용이 어렵고, 반감기가 짧고, 표준화가 이루어 지지 않은 실정이다.
치주 질환은 흔히 풍치라고도 하는데, 병의 진행 정도에 따라 치은염(gingivitis)과 치주염(periodontitis)로 분류된다. 비교적 증상이 약하고 회복이 빠른 형태의 치주질환을 치은염이라고 하고, 이러한 염증이 잇몸과 잇몸 뼈 주변까지 진행되었을 때를 치주염이라고 한다. 잇몸과 치아 사이에는 V자 모양의 틈이 있는데, 이 틈의 잇몸 아래 부분을 구강 박테리아가 공격하여, 치주인대와 인근 조직을 손상시키는 것이 치주 질환이며, 초기 치료가 적절히 이루어지지 않았을 경우, 심한 경우에는 치아 소실까지 일어나게 된다.
충치는 어린이부터 성인까지, 치아 질병의 대부분을 차지하고 있는 질병으로서, 대한 치과의사협회의 보고에 따르면, 현재 우리나라 아동의 90% 이상이 치아 우식(dental caries)을 경험했다고 한다. 또한, 성인의 80% 이상이 치주염(periodontitis)을 갖고 있다고 한다.
충치와 치주염의 발생 원인은 다양하나, 일반적으로 구강 내에 상주하는 세균의 발효 작용에 의하여 치아에 부착된 음식찌꺼기의 당분이나 전분 등의 탄수화물이 분해되어 생기는 젖산이 치아 경조직의 석회를 탈각시켜 충치가 발생한다. 이에 따라, 혐기성 병원균체들이 대량 증식하게 되고, 치주염 균주들에 의해 발생되는 독소성분으로 인해 잇몸조직이 파괴되어, 결국 치아가 흔들리고 탈락되는 현상이 일어나게 된다. 이러한 충치와 치주염을 일으키는 병원성 미생물로 대표적인 것이 Streptococcus mutans와 Porphyromonas gingivalis이다.
현재 이러한 충치 및 치주염을 억제하기 위해 사용되는 방법으로서, 각종 항생물질을 이용하는 방법이나, 불소에 의한 병원 성 세균의 억제 방법 등이 이용되고 있으나, 항생물질을 이용하는 방법은, 미생물이 내성을 갖게 되거나, 설사, 구토 등의 부작용을 유발할 수 있을 뿐 아니라, 구강 내 상재균들의 생육이 저해되는 문제점이 있다. 현재까지 알려진 천연물 유래 항균 물질들은 대부분 항균 활성이 떨어지고, 열 안정성이 좋지 않아, 항균 활성이 급격히 저하되는 문제점이 지적되고 있다.
이에, 본 발명자는 골 형성을 위한 조성물을 개발하기 위하여 펩타이드를 연구하던 중, LYLDENEKVVLKN로 구성된 펩타이드가 뛰어난 골 형성 효과를 갖는 것을 실험을 통하여 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 BMP 유래 골형성 촉진용 펩타이드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 펩타이드로 구성된 골형성 촉진용 조성물, 치주질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 항염증용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 BMP 유래 골형성 촉진용 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 펩타이드로 구성된 골형성 촉진용 조성물, 치주질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 BMP 유래 펩타이드는 골유착 및 골 형성을 촉진시킴으로써 조골세포의 분화 및 치수 조직의 증식을 증가시켜 임플란트 시술 및 구강 박테리아에 의한 염증작용 억제에 사용될 수 있으며, 섬유아세포의 성장 및 이동을 촉진시킴으로써, 피부 노화 및 상처치유에도 응용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 펩타이드의 BMP 수용체 결합능을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 펩타이드의 세포 성장 촉진율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 펩타이드의 ALP 염색법을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 펩타이드의 ALP 효소 활성도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 펩타이드의 조골세포 후기 분화 관련 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 펩타이드의 조골세포 세포 외 기질의 석회화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 펩타이드의 조골세포 부착 관련 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 펩타이드의 충치균에 의한 조골세포 초기 분화 억제 회복 효과를 ALP 염색법으로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 펩타이드의 염증성 사이토카인 증가 억제 효과를 RT-PCR을 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 골형성 촉진용 조성물을 제공한다.
자연계 아미노산에는 글리신(Glycine), 알라닌(alanine), 세린(serine), 아스파틱산(aspartic acid), 글루타믹산(glutamic acid), 발린(valine), 트레오닌(threonine), 알지닌(arginine), 라이신(lysine), 프롤린(proline), 루신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 이소루신(isoleucine), 히스티딘(histidine), 티로신(tyrosine), 메타오닌(methionine), 시스테인(cystein), 트립토판(tryptopane) 아스파라진(asparagine), 글루타민(glutamine) 등이 있다. 본 발명의 상기 펩타이드는 LYLDENEKVVLKN(서열번호 1)로 구성되며, 이는 당 업계에서 통상적으로 사용하는 고체상 펩타이드 합성법(Solid phase peptide synthesis; Merrifield, Biochemistry 3 (1964) 1385)으로 합성 될 수 있다.
상기 펩타이드의 L, Y, D, E, N, K 및 V는 각각 루신(leucine), 티로신(thyrosine), 아스파틱산(aspartic acid), 글루타믹산(glutamic acid), 아스파라진(Asparagine) 및 리신(Lysine)을 나타내므로 본 발명의 펩타이드의 아미노산 서열은 하기와 같다.
Leu-Tyr-Leu-Asp-Glu-Asn-Glu-Lys-Val-Val-Leu-Lys-Asn
통상적으로 사용하는 아미노산은 N-말단이 보호된 형태 그리고, 반응성 측쇄가 보호된 형태로 사용된다. N-말단을 보호하는 보호기로는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc)가 사용될 수 있고, 반응성 측쇄를 보호하기 위한 보호기로는 트리페닐메틸, t-부틸에스테르, 부틸옥시카르보닐, 펜타메틸크로만-6-술포닐 등이 사용될 수 있다. 반응을 위하여 사용되는 고체상 수지는 2-클로로 트리틸 클로라이드(2-Chlorotrityl chloride, CTC), 4-벤질옥시벤질알콜(Wang) 또는 트리알콕시벤즈하이드릴아민(Rink Amide) 등의 수지가 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 C-말단에서부터 N-말단 방향으로 합성된다. 커플링시 아미노산의 카르복실기를 HATU(N-[(dimethylamino-)-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)와 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(1-hydroxy-7-azabenzotriazole, HOAt) 또는 HBTU(N-[(1H-benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)와 1-히드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole, HOBt)에 DIEA(N,N-diisopropylethylamine)를 함께 첨가하거나, N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC)와 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 또는 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)를 첨가하여 활성화시킨 뒤 사용한다. 커플링 후에는 N-말단의 보호기를 피페리딘(Piperidine)으로 제거하고, 다음 아미노산의 커플링 반응이 수행된다. 이렇게 합성된 펩티딜 레진(Peptidyl Resin)은 트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid: TFA)을 포함하는 절단용액에 의하여 펩타이드가 고체 수지로부터 분리되고 또한 측쇄에 결합된 보호기가 제거된다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다. 이는 당업계에 공지된 가혹 조건 (stringent conditions) 하에서, 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
또한 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파아지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
상기와 같이 합성된 펩타이드는 BMP 수용체에 특이적으로 결합하는 펩타이드로서 BMP 수용체에 대한 강한 결합력을 보이며, 조골세포 및 섬유아세포의 성장과 분화를 통해 골유착 및 골 형성을 촉진시키고, 구강 세균으로부터 보호 작용을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 상기 펩타이드, 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 골형성 촉진용 조성물, 치주질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 항염증용 조성물을 제공한다.
상기 치주질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적 조성물 또는 의약외품 조성물을 포함하며, 상기 의약외품 조성물은 예를 들어, 치약이나 구강세정액의 형태일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 치주질환은 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 치주낭(periodontal pocket) 또는 치주농양(periodontal abscess)을 포함하며, 이에 한정하지 않는다.
상기 치주질환은 구강 박테리아에 의한 것으로, 바람직하게는 s.mutans 또는 P.gingivalis에 의한 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 조성물은 상기 펩타이드, 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 주사액제, 환약, 캡슐, 과립, 산제 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 분야의 적정한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science(최근판) 또는 Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 해당 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 0.05~0.1㎎/㎏/day, 바람직하게는 0.01~0.1㎎/㎏/day 내지 의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드, 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터를 포함하는 골형성 촉진용 조성물이 표면에 코팅된 골이식재 및 조직공학용 지지체를 제공한다.
본 발명에서 사용가능한 골이식재 및 지지체에는 당해분야에서 사용하는 모든 종류 및 형태의 골이식재 및 고분자 지지체를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 자가골, 소뼈 및 돼지뼈에서 기인한 생물유래 골미네랄 분말 및 다공성 블록, 합성 수산화아파타이트 분말 및 다공성 블록, 트리칼슘인산 분말 및 다공성 블록, 모노칼슘인산 분말 및 다공성 블럭, 이산화 규소(실리카)로 이루어진 골이식재, 실리카와 고분자의 혼합체로 이루어진 골충진 이식재, 키토산, 폴리락트산을 포함하는 생체적합성 고분자로 이루어진 미립자 및 다공성 지지체, 티타늄 및 3차원적 다공성 지지체 등이 있으나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 상기 골이식재 및 지지체의 표면은 활성 펩타이드의 부착이 용이하도록 표면을 개질하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 골형성 촉진용 조성물을 골이식재 및 지지체의 표면에 화학적으로 결합시켜 표면에 ㎠당 0.01 ~ 1 μM이 코팅되도록 하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 골이식재 및 지지체의 표면 ㎠당 0.05 ~ 0.5 μM을 코팅하는 것이며, 가장 바람직하게는 골이식재 및 지지체의 표면 ㎠당 0.1 μM을 코팅하는 것이지만, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.
상기와 같이 골이식재 및 지지체 또는 차폐막이나 임플란트의 표면에 본 발명의 조성물을 고정하여 술식에 이용하는 경우, 원하는 농도의 조성물이 국소에서 존재하면서 활성을 나타내어 치료효과가 증진될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드, 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 항노화 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화장료 조성물은 피부 노화 방지 및 피부주름 개선을 위하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 스킨, 로션, 크림, 에센스, 연고, 젤, 스틱, 파우더, 스프레이 등의 형태일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 시료의 준비
본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 제조하기 위하여, 고체상 펩타이드 합성법(Solid phase peptide synthesis; Merrifield, Biochemistry 3 (1964) 1385)을 수행하였다.
먼저, 클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분 동안 교반한 후 용액을 제거하고, 이에 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분 동안 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 그 후 상기 반응용기에 10 ml의 디클로로메탄(DCM) 용액을 넣고 Fmoc-Asn(Trt)-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM에 녹여 10분 동안 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하고 용액을 제거하였으며, DMF를 10 ml 넣어 3분 동안 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 그 후 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ml를 상기 반응용기에 넣고 10분 동안 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분 동안 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Asn-CTL 레진을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Lys(Boc)-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 녹인 후 상기 반응기에 400 mmole DIEA(N,N-Diisopropylethylamine)를 분획으로 2번에 걸쳐 넣고 모든 고체가 녹을 때까지 최소 5분 동안 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 상기 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 용액을 다시 제거한 후, 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 그 후 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일한 방법으로 2번 탈보호 반응시켜 Lys-Asn-CTL 레진을 제조하였다. 제조된 레진을 DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일한 방법으로 아래의 아미노산 부착을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Val, Fmoc-Val, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Glu(OtBt), Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Tyr(tBu) 및 Fmoc-Leu(tBu) 순으로 연쇄반응을 시키고, Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 세척하여 제거하였다. 그 후 무수초산과 DIEA, HoBt(Hydroxybenzotriazole)를 넣어 1시간 동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, 오산화인(Phosphorus pentoxide, P2O5) 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[TFA(Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 동안 반응을 유지하고, 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 이를 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 NH2-Leu-Tyr-Leu-Asp-Glu-Asn-Glu-Lys-Val-Val-Leu-Lys-Asn-OH 펩타이드 1을 0.09 g 합성하였다(수율: 91.9%). 상기 펩타이드를 분자량 측정기를 이용하여 측정한 결과 분자량 1574(이론값 : 1576.8Da)임을 확인하였다.
실험예 1. BMP 수용체 특이적 결합능 확인
상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드의 BMP 수용체와의 결합능을 측정기 위하여 BMP 수용체 결합 측정법(BMP receptor binding assay)을 수행하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 음성대조군과 비교하여 BMP 수용체에 특이적으로 결합함을 확인하였다. 이는 본 발명의 펩타이드가 BMP 수용체에 결합하여 BMP 수용체의 하위 신호전달 체계를 활성화시킬 수 있음을 나타낸다.
실험예 2. 치수조직 세포, 조골세포 성장 촉진 확인 실험
상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드의 치수조직 섬유아세포(HPLF, Human periodontal ligament fibroblast) 및 조골세포(C2C12, murine osteoblast)의 성장 촉진효능을 시험하였다.
먼저, 96-웰 플레이트의 웰에 각 세포를 2x103 cell/웰 (final media volume 100ml)로 넣고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고, 새로운 무혈청 배지로 갈아주었다. 각각의 웰에 상기 펩타이드를 농도 별로 처리한 후, 인큐베이터에서 72시간 배양하였다. 배양이 끝난 후, 10 ml의 MTT 용액 (5mg/ml in DW)을 각 웰에 넣고 4시간 더 배양 한 뒤, 배양액을 제거하고, 100 ml의 DMSO 용액을 넣어 생성된 포마진(Formazin)을 녹였다. 분광광도계를 이용하여 상기 용액의 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때, 시료 대신 증류수를 처리한 음성대조군을 기준으로 각 세포주의 세포생존율(%)을 하기 [수학식 1]에 의하여 환산하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
[수학식 1]
세포생존률(%) = [(ODsample)/ODcontrol] x 100
본 발명의 펩타이드는 치수인대 섬유아세포 및 조골세포의 성장을 증가시켰음을 확인하였다.
실험예 3. 조골세포 분화 촉진능 확인
3-1. 조골세포 초기 골분화 촉진능 확인
상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드의 조골세포 초기 분화 촉진능을 확인하기 위해 골형성 세포의 분화 초기 마커 단백질인 ALP(Alkaline phosphatase) 염색 및 활성도를 측정하였다. 먼저 조골세포(C2C12)를 24-well plate에 2x104 개씩 분주하여 1일간 배양하고 배지(10% FBS포함)를 교체함과 동시에 상기 펩타이드를 처리하여 37℃, 5% CO2의조건에서 3일간 배양하였다. ALP 염색을 위하여, 세포를 고정용액 (25mM citrate buffer, 3% formaldehyde, 65% acetone)으로 고정한 뒤, 염색 시약(sigma 85C-1kit)을 200 ml씩 넣어 37℃에서 30분간 반응시켰다. 염색 여부를 광학 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
ALP 효소 활성도를 측정하기 위하여, 펩타이드를 넣고 3일간 배양한 뒤, 세포용해 완충액(10mM Tris, pH8.0, 1mM MgCl2, 0.5% Triton X-100)으로 용해 한 뒤, ALP의 기질인 포스파타아제 기질(phosphatase substrate) 10mM를 넣어 반응시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 펩타이드가 음성대조군에 비하여 ALP 염색과 효소 활성도를 현저히 증가시킴을 확인하였다.
3-2. 조골세포 후기 골분화 촉진능 확인
상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드의 조골세포 후기 분화 촉진능을 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하여 골형성 세포의 분화 후기 마커 세포 외 기질 단백들의 mRNA 생성량을 비교하였다.
상기 실험예 3-1과 동일한 조건으로 배양하였고, 배양 5일째에 세포를 회수하여, Trizol® 시약(Intron 社)를 이용하여 RNA를 추출하였다. RNA로부터 cDNA 합성을 위하여, 5 mg RNA, random hexamer 1 ml와 DEPC-treated water를 첨가하여 65℃에서 5분간 반응시킨 뒤, 5x first strand buffer, 0.1M DTT, 10mM dNTP, 역전사효소를 넣어 총 30 ml 부피로 42℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응의 종결을 위해, 마지막으로 5분간 95℃로 가열하여 cDNA를 얻었다. 그 후 2 ml의 cDNA를 주형으로 하여, 각 유전자에 특이적인 프라이머를 10 pmole로 넣고, 10x taq buffer, 10mM dNTP, i-taq DNA 중합효소를 혼합하여 PCR을 시행하였다. 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 30회 증폭하고, PCR 생성물은 1% 아가로오스 겔(agarose gel)에 로딩하여 20분간 전기영동하고 자외선 조사기(UV illuminator)를 이용하여 확인하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 펩타이드가 음성대조군과 비교하여 조골세포 후기 분화 세포 외 기질 마커인 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase), 오스테오폰틴(Osteopontin) 및 오스테오칼신(Osteocalcin)의 발현을 현저히 증가시킴을 확인하였다. 증가 정도는 양성대조군인 BMP2와 비교하였을 때에도 상당한 증가임을 확인하였다.
3-3. 조골세포 석회화 촉진능 확인
상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드의 조골세포의 골분화가 잘 진행되었는지를 확인하기 위하여 Alizarin red S 염색법을 수행하여 조골세포 세포 외 기질의 석회화 정도를 확인하였다.
상기 실험예 3-1과 동일한 조건으로 배양하였고, 배양 7일째에 세포를 70% 에탄올을 이용하여 1시간동안 고정시키고, 2% Alizarin Red S 용액 (pH 4.1~4.3)을 넣어 염색하였다. 이를 PBS로 충분히 세척한 뒤, 현미경을 이용하여 관찰하고, 그 정도를 정량하기 위하여, 10% 세틸피리디늄클로라이드(Cetylpyridinium chloride, in 10mM sodium phosphate, pH7.0) 용액을 녹여 562nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 펩타이드에 의한 골분화가 개선된 양태로 진행되고 있음을 확인하였다.
실험예 4. 조골세포 부착 촉진능 확인
상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드가 조골세포의 부착 관련 유전자의 발현을 증가시키는지 확인하기 위하여, 상기 실험예 3-2에 명시된 방법과 동일하게 RT-PCR을 수행하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 펩타이드가 조골세포의 부착 관련 유전자인 프로콜라겐 타입 1(Procollagen Type 1), 콜라겐 1(Collagen 1), 오스테오아드헤린(Osteoadherin), 인테그린 α3(Integrin α3)의 발현을 음성대조군 대비 현저히 증가시킴을 확인하였다. 이는 본 발명의 펩타이드가 조골세포의 부착 관련 유전자의 발현을 촉진함으로써 조골세포의 부착능을 촉진시킴을 나타낸다.
실험예 5. 치주질환 치료 및 항염증 효과
상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드가 치주질환 치료 효과 및 항염증 효과를 갖는지 여부를 확인하기 위해 충치 및 치주질환을 일으키는 대표적인 구강 박테리아인 s.mutans를 이용하여 치수 세포에 염증 환경을 조성하고, 상기 펩타이드를 처리하였다.
5-1. s.mutans 균에 의한 조골세포 초기 분화 억제 회복 효과
조골세포의 초기 분화 억제 회복 여부를 확인하기 위해 상기 실험예 3-1과 동일한 방법으로 ALP(Alkaline phosphatase) 염색을 통해 측정하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, s.mutans균에 의하여 조골세포의 분화가 감소하는 반면, 상기 펩타이드가 함께 처리된 군에서는 s.mutans균에 의한 조골세포 초기 분화 억제가 다시 증가함을 확인하였다.
5-2. s.mutans 균에 의한 조골세포 염증 억제 효과
s.mutans균에 의하여 조골세포의 염증 관련 사이토카인(cytokine)의 증가가 일어난다. 이의 증가는 골조직의 형성에도 영향을 주어 치주조직 전체가 무너지는데 있어 크게 영향을 미친다고 알려져 있다. 조골세포의 염증 억제 여부를 확인하기 위해 상기 실험예 3-2와 동일한 방법으로 RT-PCR시험법을 수행하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, s.mutans균에 의해 염증성 사이토카인인 COX2, IL-1β, IL-8 및 TNF-α가 증가하였으나, 상기 펩타이드에 의하여 염증성 인자들이 현저히 감소함을 확인하였다. 이는 본 발명의 펩타이드가 염증 반응을 억제함으로써 치주질환의 예방 및 치료에 도움이 될 수 있음을 나타낸다.
이하 본 발명의 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 약학적 제제
1-1. 산제의 제조
본 발명의 펩타이드 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1-2. 정제의 제조
본 발명의 펩타이드 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1-3. 캡슐제의 제조
본 발명의 펩타이드 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1-4. 주사제의 제조
본 발명의 펩타이드 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4·2H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1-5. 액제의 제조
본 발명의 펩타이드 10 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 2. 화장품 제제
2-1. 유연화장수의 제조
본 발명의 펩타이드 10 mg
글리세린 30 g
부틸렌 글리콜 20 g
프로필렌 글리콜 20 g
카복시비닐폴리머 10 g
에탄올 100 g
트리에탄올아민 10 g
미량향료 적량
미량정제수 적량
2-2. 영양크림의 제조
본 발명의 펩타이드 10 mg
밀납 100 g
폴리소르베이트60 15 g
소르비탄세스퀴올레이트 50 g
유동파라핀 100 g
스쿠알란 50 g
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 50 g
트리에탄올아민 20 g
미량향료 적량
미량정제수 적량
<110> CAREGEN CO., LTD. <120> Peptide from bone matrix protein and use thereof <130> 1-2 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Bone matrix protein <400> 1 Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn 1 5 10

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 골형성 촉진용 조성물.
  5. 제4항의 조성물이 표면에 코팅된, 골이식재.
  6. 제4항의 조성물이 표면에 코팅된, 조직공학용 지지체.
  7. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S.Mutans)균에 의한 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 치주낭(periodontal pocket) 및 치주농양(periodontal abscess)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 치주질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 치약 조성물.
  11. 삭제
KR1020140184274A 2014-12-19 2014-12-19 Bmp 유래 펩타이드 및 이의 용도 KR101744763B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140184274A KR101744763B1 (ko) 2014-12-19 2014-12-19 Bmp 유래 펩타이드 및 이의 용도
PCT/KR2014/012659 WO2016098935A1 (ko) 2014-12-19 2014-12-22 Bmp 유래 펩타이드 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140184274A KR101744763B1 (ko) 2014-12-19 2014-12-19 Bmp 유래 펩타이드 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160074959A KR20160074959A (ko) 2016-06-29
KR101744763B1 true KR101744763B1 (ko) 2017-06-09

Family

ID=56126806

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140184274A KR101744763B1 (ko) 2014-12-19 2014-12-19 Bmp 유래 펩타이드 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101744763B1 (ko)
WO (1) WO2016098935A1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190063611A (ko) 2017-11-30 2019-06-10 (주) 케이제이 메디텍 생체활성물질을 이용한 고분자 임플란트
KR20200104122A (ko) 2019-02-26 2020-09-03 (주) 케이제이 메디텍 정형외과용 생체이식 임플란트와 이의 제조방법
KR20230058226A (ko) 2021-10-22 2023-05-03 고려대학교 산학협력단 Bmp 유래 신규 펩타이드 및 이의 용도

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230122899A (ko) * 2022-02-15 2023-08-22 주식회사 나이벡 항균, 항염증 또는 조직재생능을 구비하는 펩타이드 및 이의 용도

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100987731B1 (ko) 2008-06-20 2010-10-13 전남대학교산학협력단 골형성촉진용 합성펩타이드, 상기 합성 펩타이드를 포함하는 약학조성물 및 배지조성물
JP2012082180A (ja) 2010-10-14 2012-04-26 Nagoya Univ 骨再生用自己組織化ペプチドハイドロゲル

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0612348B1 (en) * 1991-11-04 2003-04-23 Genetics Institute, LLC Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use
KR100736826B1 (ko) * 2005-12-26 2007-07-09 (주) 코웰메디 재조합 골형성 촉진 단백질을 도포한 치과용 임플란트 및그 도포 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100987731B1 (ko) 2008-06-20 2010-10-13 전남대학교산학협력단 골형성촉진용 합성펩타이드, 상기 합성 펩타이드를 포함하는 약학조성물 및 배지조성물
JP2012082180A (ja) 2010-10-14 2012-04-26 Nagoya Univ 骨再生用自己組織化ペプチドハイドロゲル

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190063611A (ko) 2017-11-30 2019-06-10 (주) 케이제이 메디텍 생체활성물질을 이용한 고분자 임플란트
KR20200104122A (ko) 2019-02-26 2020-09-03 (주) 케이제이 메디텍 정형외과용 생체이식 임플란트와 이의 제조방법
KR20230058226A (ko) 2021-10-22 2023-05-03 고려대학교 산학협력단 Bmp 유래 신규 펩타이드 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016098935A1 (ko) 2016-06-23
KR20160074959A (ko) 2016-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100214740B1 (ko) 골유도조성물
US5411941A (en) Heterodimeric osteogenic factor
JP6420459B2 (ja) 線維症抑制活性を有するペプチド及びこれを含む組成物
KR101772449B1 (ko) 신규한 펩타이드
KR101744763B1 (ko) Bmp 유래 펩타이드 및 이의 용도
JP2008106076A (ja) ＩＩ型ＴＧＦ−βレセプター／免疫グロブリン定常領域融合タンパク質
CN102369212B (zh) 具有降低的bmp拮抗剂敏感性的骨形成蛋白2(bmp2)变体
US11905337B2 (en) Peptide
KR101637497B1 (ko) 골형성 펩타이드 및 이의 용도
KR101948238B1 (ko) 미녹시딜과 펩타이드의 결합체
KR102006862B1 (ko) 신규한 펩타이드
KR101684287B1 (ko) 골형성 촉진 펩타이드 및 이의 용도
CN106794220B (zh) 具有成骨分化促进能力及牙周韧带成纤维细胞活性促进能力的肽及其用途
KR102037969B1 (ko) 신규한 펩타이드
KR101595063B1 (ko) 세포결합 서열, 헤파린 결합 도메인 및 오스테오칼신 도메인을 포함하는 융합단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물
KR102160566B1 (ko) 미녹시딜과 펩타이드의 결합체
AU759409B2 (en) Preventives and/or remedies for obesity
KR101590150B1 (ko) 줄기세포 생착율 증강 약학 조성물 및 이의 제조 방법
JP2005281225A (ja) 新規塩基性抗菌ペプチド及びその利用
MXPA97008493A (en) Factor 15 of fibroblas growth
JP2003052387A (ja) 線維芽細胞増殖因子１３

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200102

Year of fee payment: 4